ES2596402T3 - Proteasas estabilizadas para su uso en el cuidado de la piel - Google Patents

Proteasas estabilizadas para su uso en el cuidado de la piel Download PDF

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Abstract

Producto de proteasa estabilizada que comprende una proteasa reticulada a un carbómero, en el que las aminas primarias de la proteasa están reticuladas a grupos carboxilo del carbómero y en el que las aminas de dicha proteasa están reticuladas adicionalmente a través de un agente de reticulación reactivo con amina.

Description

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DESCRIPCION
Proteasas estabilizadas para su uso en el cuidado de la piel Prioridad
Esta solicitud reivindica prioridad sobre la solicitud provisional estadounidense n.° 61/296.052, presentada el 19 de enero de 2010.
Sumario
Se da a conocer una invención que se refiere a sintetizar proteasas Inmovilizadas y retlculadas derivadas de plantas para su uso como agentes para el cuidado de la piel. La proteasa estabilizada resultante penetrará mínimamente en la piel debido a su naturaleza Inmovilizada. Conservará la actividad debido a su naturaleza reticulada y, en determinadas realizaciones, debido a su estabilización a través de aditivos físicos. La presente invención se refiere en particular a un producto de papaína unida usado en aplicaciones tópicas para la piel.
Antecedentes
La actividad de las proteasas es importante en la homeostasis epidérmica. Por tanto, las proteasas tienen diversos beneficios potenciales cuando se aplican a la piel, pero están sometidas a determinadas limitaciones. La papaína es una proteasa potente derivada de la papaya y de otras plantas determinadas. Sin embargo, pierde actividad rápidamente en un estado en disolución. Esto se debe a que la papaína, de manera similar a todas las proteasas, se digiere a sí misma al mismo tiempo que experimenta desnaturalización. Además, pueden encontrarse otras dificultades con los productos de papaína convencionales cuando se usan estos productos de papaína como agentes tópicos para el cuidado de la piel en relación con la penetración en la piel y la irritación de la piel. Es altamente deseable desarrollar productos de proteasa, y más particularmente, un producto de papaína, para su uso en el cuidado de la piel que no tenga tales limitaciones.
Answar et al. en Biocatalysis and Biotransformation 2007, 25(6), págs. 453-458 se refiere a la reticulación de la proteasa bromelaína de tallo y a su uso en la industria textil. El documento WO 92/03543 A1 se refiere a un derivado de acetolactato decarboxilasa (ALDC) producida tratando ALDC con glutaraldehído y a su uso en la fermentación de cerveza. Por otra parte, el documento WO 91/06287 A1, se refiere a microesferas proteicas biodegradables para la
liberación in vivo de un agente biológicamente activo.
Para superar las dificultades mencionadas anteriormente en la técnica convencional, realizaciones a modo de ejemplo de la presente invención proporcionan un producto de proteasa reticulada estable modificada a través de las técnicas expuestas descritas en el presente documento y, particularmente, un producto de proteasa reticulada estable modificada.
Por ejemplo, en algunas realizaciones de la presente Invención, con el fin de obtener un producto de papaína reticulada estable, se inmoviliza la papaína en un polímero como, por ejemplo, un carbómero o carbopol en una reacción de reticulación primaria y entonces se realiza posteriormente una reacción de reticulación secundaria mediante la adición de un reactivo de reticulación homobifuncional de bajo peso molecular que es reactivo con amina tal como, por ejemplo, adipimidato de dimetilo (DMA), suberato de bis(sulfosuccinimidilo) (BS3), suberimidato de dimetilo (DMS), pimelimidato de dimetilo (DMP) y suberato de disuccinimidilo (DSS).
En otras realizaciones a modo de ejemplo de la presente invención, se realizan la reacción de reticulación primaria y la reacción de reticulación secundaria para obtener un producto de papaína reticulada estable y, entonces, la papaína reticulada estable se estabiliza adlclonalmente usando estabilizadores físicos tales como, por ejemplo, azúcares o polímeros de azúcar. Por ejemplo, puede usarse alginato de sodio como estabilizador físico según realizaciones a modo de ejemplo de la presente invención.
El producto de papaína estabilizada reticulada anterior todavía puede estabilizarse incluso adicionalmente incluyendo el producto de papaína estabilizada anterior en determinados sistemas conservantes o en una formulación de aceite en agua.
Los beneficios del complejo de proteasa (por ejemplo, papaína) inmovilizada, reticulada y estabilizada según realizaciones a modo de ejemplo de la presente invención incluyen:
1) mínima penetración en la piel,
2) conservación de actividad proteásica en disolución o forma seca
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3) mínima irritación de la piel, y
4) facilidad de formulación
Todavía en otras realizaciones de la presente invención, se describen composiciones cosméticas para el cuidado personal y farmacéuticas que comprenden proteasas estabilizadas.
Breve descripción de las figuras
Las siguientes figuras se presentan únicamente para fines de Ilustración.
La figura 1 ¡lustra reacciones de reticulación para formar una proteasa reticulada estable según la presente invención.
La figura 2 ilustra un producto de papaína reticulada estable según una realización a modo de ejemplo de la presente Invención que ha experimentado las reacciones de reticulación ¡lustradas en la figura. 1.
La figura 3 ¡lustra el porcentaje de actividad del día 0 tras almacenar muestras de una papaína estabilizada según una realización a modo de ejemplo de la presente invención a diversas temperaturas durante hasta 12 semanas.
La figura 4 ¡lustra el porcentaje de actividad del día 0 tras almacenar las muestras sin DMA a diversas temperaturas durante hasta 12 semanas.
La figura 5 ilustra una curva patrón de papaína sigma
La figura 6(a) ilustra el porcentaje de actividad del día 0 conservada tras almacenar muestras de papaína estabilizada a diversas temperaturas durante hasta 12 semanas según una realización a modo de ejemplo de la presente invención.
La figura 6(b) ¡lustra el porcentaje de actividad del día 0 conservada tras almacenar las muestras sin DMA a diversas temperaturas durante hasta 12 semanas.
La figura 7 es un diagrama que ¡lustra que no se encontró papaína activa libre en un producto de papaína reticulada estable según una realización a modo de ejemplo de la presente invención.
La figura 8 es un diagrama que ¡lustra el porcentaje de actividad tras 1 semana a diferentes temperaturas de muestras que contienen el 0,2% de BS3 y muestras de control que no contienen BS3.
La figura 9 es un diagrama que ¡lustra el porcentaje de actividad conservada tras 4 semanas de muestras de papaína estabilizada con y sin alginato al 0,1%.
La figura 10 es una curva patrón de papaína sigma.
La figura 11 es un diagrama que ¡lustra el efecto del azúcar o polímeros de azúcar sobre la estabilidad de la papaína libre tras 10 días a 25°C y 40°C.
La figura 12 es un diagrama que ¡lustra el porcentaje de actividad conservada tras 2 semanas de papaína al 0,4%.
La figura 13(a) ilustra un producto de papaína reticulada estable que se ha reticulado mediante DMA y se ha hecho reaccionar adicionalmente con alginato de sodio.
La figura 13(b) es un diagrama que ilustra el porcentaje de actividad conservada tras almacenar muestras de DMA al 1% a diversas temperaturas durante hasta 12 semanas.
La figura 13 (c) es un diagrama que ¡lustra el porcentaje de actividad del día 0 tras almacenar muestras sin DMA a diversas temperaturas durante hasta 12 semanas.
La figura 14 es un gráfico que ilustra el efecto de DMA sobre la conservación de actividad de papaína unida.
La figura 15 es un diagrama que ilustra la actividad en muestras de papaína unida tras 12 semanas a diferentes temperaturas.
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La figura 16 es una curva patrón de papaína sigma.
La figura 17 es un diagrama que ilustra la actividad de papaína unida (con DMA) conservada en la formulación.
La figura 18 es un diagrama que ilustra la actividad de papaína unida (sin DMA) conservada en la formulación.
La figura 19 es un gráfico que ilustra la actividad de papaína unida conservada dentro de de formulaciones La figura 20 es una curva patrón para papaína sigma en la formulación de placebo,
La figura 21 es un diagrama que ilustra la actividad de papaína unida conservada en una formulación en aceite y agua.
Descripción detallada
A menos que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que entiende comúnmente un experto habitual en la técnica a la que pertenece esta invención.
Aunque pueden usarse métodos y materiales similares a o equivalentes a los descritos en el presente documento en la práctica o pruebas de la presente invención, a continuación se describen métodos y materiales adecuados. Todas las publicaciones, solicitudes de patente, patentes y otras referencias mencionadas en el presente documento se incorporan como referencia en su totalidad. En caso de conflicto, dominará la presente memoria descriptiva, incluyendo las definiciones. Además, los materiales, métodos y ejemplos son únicamente ilustrativos.
Otras características y ventajas de la invención resultarán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada y de las reivindicaciones. Tal como resultará evidente para un experto en la técnica, las características y realizaciones específicas descritas en el presente documento pueden combinarse con cualquier otra característica o realización.
La epidermis está compuesta por varios estratos o capas. La capa más exterior, el estrato córneo, está constituida por células muertas que han migrado hacia fuera a lo largo del transcurso de varios días desde los estratos inferiores. Estas células muertas normalmente se desprenden de la superficie de la piel a través de un proceso denominado descamación epidérmica que estimula el crecimiento de nuevas células a un nivel más profundo. La piel más joven es más eficaz en este proceso que la piel envejecida o dañada. Como resultado, la piel envejecida tiene un aspecto mate, grueso y menos tonificado. Esto puede agravarse por factores medioambientales, tales como exposición a la luz del sol; influencias hormonales, tales como andrógenos, estrógenos y factor de crecimiento epidérmico; y deficiencias de vitaminas, tales como deficiencias en vitaminas A y D. La actividad proteasa es un factor clave en el proceso de descamación. Por tanto, es deseable la aplicación de proteasas a la piel para efectos cosméticos, tales como antienvejecimiento y alisado de la piel. Sin embargo, se sabe que el uso de proteasas en aplicaciones cosméticas y otras tiene tres limitaciones principales: inestabilidad, posibilidad de alergenicidad y penetración en la piel.
La invención se basa, al menos en parte, en el descubrimiento de que las proteasas pueden estabilizarse a través de determinadas reacciones de reticulación para formar un copolímero de proteasa-carbómero, también denominado en el presente documento como proteasa “estabilizada”. Tales proteasas estabilizadas comprenden una proteasa reticulada a un carbómero, en las que las aminas primarias de la proteasa están reticuladas a los grupos carboxilo del carbómero y en las que las aminas de la proteasa están reticuladas adicionalmente mediante un agente de reticulación reactivo con amina. En una realización de la invención, la proteasa estabilizada comprende además un estabilizador físico, por ejemplo, un azúcar o polímero de azúcar.
También se da a conocer un método de formación de un producto de proteasa estabilizada de este tipo en el que se realiza una reacción de reticulación primaria para reticular las aminas primarias de la proteasa a los grupos carboxilo de un carbómero y se realiza una reacción de reticulación secundaria a través de un agente de reticulación reactivo con amina.
Proteasas
Las proteasas son enzimas que catalizan la ruptura de las proteínas. Las proteasas, que son proteínas ellas mismas, tienen tendencia a experimentar autodegradación y son de naturaleza inestable. Esta naturaleza proteica también las convierte en alergénicas. Además, debido a su capacidad para degradar proteínas, pueden penetrar en las capas más profundas de la epidermis y producir daño en los estratos subyacentes. Las proteasas adecuadas para su uso en la presente invención incluyen papaína, ficina, bromelaína y actinidaína.
La ficina es una sulfhidrilo proteasa no específica aislada del látex del higo, el fruto del árbol del Ficus. La ficina se
obtiene lo más comúnmente de Ficus carica y Ficus glabatra. Sin embargo, la ficina también puede aislarse de los frutos de otras especies de Ficus, tales como Ficus elástica y Ficus insípida. La bromelaína es una sulfhidrilo proteasa aislada del tallo y/o el fruto de la piña (Ananas comosus). La actinidaína, también conocida como actinidina es una cisteína proteasa obtenida del fruto del kiwi (Actinidia deliciosa). La papaína es una cisteína proteasa 5 obtenida de la papaya (Carda papaya) y la papaya de montaña (Vasconcellea cundinamarcensis), lo más a menudo del látex del fruto verde, inmaduro. Las proteasas están presentes en una concentración de entre aproximadamente el 0,1% y el 5% en peso.
Carbómeros
En primer lugar se inmoviliza la proteasa en un carbómero. Los carbómeros son homopolímeros de ácido acrílico 10 que tienen un alto peso molecular que se retícula con cualquiera de varios alil éteres de pollalcohol (por ejemplo, allí éter de pentaeritritol, alil éter de sacarosa o alil éter de proplleno). Ejemplos de carbómeros adecuados son Carbómero 910, Carbómero 934, Carbómero 934p, Carbómero 940 y Carbómero 941, en los que el sufijo numérico indica el peso molecular promedio de las cadenas poliméricas. Tal como se usa en el presente documento, una proteasa “inmovilizada” o proteasa “unida” se refiere a una proteasa que se ha hecho reaccionar con el carbómero a 15 través de la reacción de reticulación primaria. Agentes de reticulación adecuados para esta reacción de reticulación primaria son reactivos que pueden acoplar grupos carboxilo a aminas primarias. Un ejemplo de un reactivo de reticulación adecuado es la carbodiimida soluble en agua 1-etil-3-(3-dimetil-aminopropil)carbod¡¡m¡da. La EDC es un agente se reticulación de longitud cero usado para acoplar grupos carboxilo a aminas primarias. La EDC reacciona con grupos de ácido carboxílico para dar grupos O-acilisourea, que forman reticulaciones tras la reacción con grupos 20 amina libres. La EDC es un agente de reticulación primario en esta realización que se convierte en una urea disustituida durante el transcurso de la reacción. La NHS es un éster de ácido y un catalizador que aumenta la velocidad de reticulación y permanece sin cambios durante la reacción de reticulación.
Agentes de reticulación químicos
Una vez inmovilizada en el carbómero, se hace reaccionar la proteasa inmovilizada con un agente de reticulación 25 reactivo con amina en una reacción de reticulación secundaria para formar un copolímero de proteasa-carbómero, también denominado en el presente documento “proteasa estabilizada”. El reactivo de reticulación es preferiblemente un agente de reticulación de bajo peso molecular de manera que el agente de reticulación reaccionará completamente o reaccionará casi completamente en la reacción de reticulación secundaria. Los ejemplos de agentes de reticulación adecuados que pueden usarse incluyen agentes de reticulación de imidoéster 30 tales como adipimidato de dimetilo (DMA), pimelimidato de dimetilo (DMP), suberimidato de dimetilo (DMS), 3,3- ditiobis de dimetilo. Los agentes de reticulación reactivos con amina pueden facilitarse en diversas concentraciones que oscilan entre aproximadamente el 0,05% y aproximadamente el 5% en peso, preferiblemente entre aproximadamente el 1% y el 5%. En determinadas realizaciones, se utiliza DMA.
Estabilizadores físicos
35 Tras la reticulación química, se estabiliza además opcionalmente la proteasa inmovilizada y reticulada con un estabilizador físico, por ejemplo, azúcar o polímeros de azúcar. Ejemplos de azúcares o polímeros de azúcar adecuados son alginato de sodio, trehalosa, manitol, glicerol y xantana. En una realización, se utiliza alginato de sodio. Tales estabilizadores físicos pueden incluirse en concentraciones de entre aproximadamente el 0,1% y el 5% en peso.
40 En la figura 1 se muestra una ilustración de reacción de reticulación para formar una realización de las proteasas estabilizadas de la presente invención. En la figura 2 se muestra una ilustración de un producto de papaína estabilizada.
Aplicaciones/formulaciones
Las proteasas estabilizadas de la presente invención tienen mínima penetración en la piel, conservan la actividad 45 proteásica en disolución o forma seca, tienen mínima irritación de la piel y son relativamente fáciles de proporcionar en una formulación. Por consiguiente, las realizaciones a modo de ejemplo de la presente invención proporcionan productos de proteasa más estables y mucho más seguros en comparación con los productos de proteasa de la técnica convencional, particularmente realizaciones de productos de papaína estabilizada.
Las proteasas estabilizadas son adecuadas para su uso en formulaciones cosméticas y para el cuidado personal, 50 por ejemplo, preparaciones exfoliantes, preparaciones anti-arrugas y/o antienvejecimiento, aditivos de baño, preparaciones para el cuidado del cabello, jabones líquidos y sólidos, disoluciones de limpieza, toallitas limpiadoras húmedas, aceites o polvos, preparaciones antiacné. Las proteasas estabilizadas son particularmente adecuadas para tratar cosméticamente la piel seca, envejecida o dañada aplicando una o más de las proteasas estabilizadas de la presente invención a piel seca, envejecida o dañada que necesita tratamiento cosmético.
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Las formulaciones cosméticas y/o para el cuidado personal pueden estar en forma, por ejemplo, de una emulsión de agua en aceite o de aceite en agua, una formulación alcohólica o que contiene alcohol, una dispersión vesicular de un lípido anfífilo no iónico o iónico, o un gel. Las formulaciones cosméticas y/o para el cuidado personal a modo de ejemplo comprenden entre aproximadamente el 0,5% y el 5% de proteasa estabilizada, en peso, preferiblemente entre aproximadamente el 1% y el 3%.
Las proteasas estabilizadas de la presente invención también son adecuadas para aplicaciones farmacéuticas, por ejemplo, aplicaciones de desbridamiento. El desbridamiento es la eliminación de tejido muerto o dañado de heridas, por ejemplo, heridas ulcerosas o quemaduras con el fin de ayudar en su curación. En una realización de la invención, se aplica una o más de las proteasas estabilizadas de la presente invención a heridas o quemaduras de la piel que necesitan desbridamiento. Las formulaciones y productos que comprenden proteasas estabilizadas para el tratamiento cosmético de heridas o quemaduras incluyen, a modo de ejemplo, vendajes/apósitos, parches, disoluciones de lavado, pomadas o geles, o tejidos sintéticos. En determinadas realizaciones, las composiciones de desbridamiento, por ejemplo, vendajes, apósitos o parches, pueden incluir opcionalmente agentes antimicrobianos. Para las aplicaciones de desbridamiento, la cantidad de proteasa estabilizada incluida en las composiciones farmacéuticas será una cantidad que desbride eficazmente el tejido necrótico y licué la pus en las heridas, y que efectúe la eliminación en un tiempo razonable (por ejemplo, a lo largo de un periodo de siete días) sustancial mente de todos estos materiales.
Además de las aplicaciones para el cuidado de la piel, las proteasas estabilizadas de la presente invención también pueden ser adecuadas en otras aplicaciones conocidas en la técnica en las que se desearía una forma estable de una proteasa. Una aplicación a modo de ejemplo son las composiciones para el cuidado bucal.
Las composiciones tópicas que comprende proteasas estabilizadas pueden comprender además una variedad de otros componentes que se usan de manera conveniente en cosmética, cuidado personal o formulaciones farmacéuticas, siempre que no alteren de manera inaceptable los beneficios de la invención. Los ejemplos de clases de componentes convencionales opcionales incluyen fragancias, pigmentos, agentes colorantes/de tinción, aceites esenciales, astringentes, agentes antienvejecimiento, agentes antiacné, agentes antiapelmazamiento, agentes antiespumantes, agentes antimicrobianos, antioxidantes, aglutinantes, agentes de ajuste del pH, blanqueantes de la piel y agentes iluminadores, agentes de acondicionamiento de la piel, protectores solares, conservantes, agentes antiinflamatorios, hidratantes, espesantes y vitaminas.
Para determinadas realizaciones de aplicaciones cosméticas, para el cuidado personal y/o farmacéuticas, es deseable incluir además un sistema conservante con la proteasa estabilizada. Se conocen enzimas que desnaturalizan en condiciones rigurosas como altas temperaturas y la presencia de productos químicos incompatibles como fuertes emulsionantes. Dos sistemas conservantes de ejemplo adecuados para su uso con proteínas estabilizadas y particularmente adecuados para papaína estabilizada, son:
(a) Fenoxietanol + ácido benzoico
(b) Diocida (combinación de fenoxietanol + caprilglicol + hexilengicol)
Ejemplos
La invención se describe adicionalmente en los siguientes ejemplos.
Ejemplo 1
Se produjo un producto de papaína estable que conserva su actividad proteásica y es más seguro que productos de papaína convencionales que contienen papaína libre llevando a cabo una reacción de reticulación primaria en la que se retículo papaína al 1% con Carbopol usando carbodiimida, clorhidrato de 1-etil-3-(3- dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC), junto con N-hidroxisulfosuccinimida (NHS). A continuación, se llevó a cabo una reacción de reticulación secundaria en la que se hace reaccionar la papaína inmovilizada con adipimidato de dimetilo (DMA) para reticular adicionalmente la papaína reticulada para así formar un producto de papaína reticulada estable. Se proporcionó DMA a una concentración del 1% y se proporcionó la papaína a una concentración del 1% en peso.
Se realizaron tres (3) lotes de laboratorio experimentales del producto de papaína estabilizada anterior para determinar el efecto que tiene el 1% de DMA sobre la actividad/estabilidad enzimática de la papaína reticulada primaria a lo largo de un periodo de almacenamiento de más de 12 semanas. En la tabla 1 se exponen las condiciones de reacción para realizar los experimentos.
Tabla 1
Protocolo de ensayo usando el kit E6639 EnzChek® de Invitrogen para determinar la actividad enzimática Curva patrón de papaína________________________________________________________________
N.° de patrón
| Disolución madre (U/ml) Disolución de reserva (1 U/ml) | Tampón de ensayo
1
1
1000 0
2
0,5 500 500
3
0,25 250 750
4
0,1 100 900
5
0,05 50 950
6
0,01 10 990
7
0,005 5 995
8
0 0 1000
Preparar disolución madre de 1 unidad/ml de papaína 10 mg de papaína de Sigma
__________________25 mi di IXtampón de digestión___________________________________________
Requisito de material y tampón:______________
Bicarbonato de sodio 0,1 M, pH 8,3
1x Tampón de digestión: PBS pH 6 + 50 ul de TX-100
Disolución de reserva 1 mg/ml de caseína de BODIPY TRX = 1 vial de sustrato y disolver en 0,2 mi de tampón de bicarbonato
Disolución de trabajo 10 ug/ml de caseína de BODIPY:
Añadir 0,2 mi de disolución de reserva de sustrato en 19,8 mi de tampón de digestión en un frasco de 50 mi
Ensayo:__________| 20 ul de patrón/muestra
80 ul de IXtampón de digestión
________________ 100 ul de disolución de trabajo 10 ug/ml de caseína de BODIPY__________________
Muestras: 50 ul de papaína unida mezclados con 150 ul de 1X tampón de digestión que
__________________contiene Tritón X-100 al 0,1%_____________________________________________
Procedimiento:
Incubar la placa a temperatura ambiente durante una hora con agitación moderada. Proteger la placa de la luz. Leer la fluorescencia en un lector de microplacas de fluorescencia. Usar filtros de fluoresceína convencionales con excitación a 530/25 nm, emisión a 620/40 nm._________________________________
A continuación en las tablas 2(a)-5(b) se exponen los resultados de los tres lotes de laboratorio independientes para determinar la actividad conservada de papaína inmovilizada con DMA al 1% y sin DMA a diversas temperaturas a lo largo de un periodo de 12 semanas. La tabla 2(a) representa el porcentaje de actividad conservada de papaína 5 inmovilizada unida en las muestras experimentales que también contienen DMA al 1%. La tabla 2(b) representa el porcentaje de actividad conservada de papaína inmovilizada en las muestras de control que no incluyen DMA. Las muestras experimentales y las muestras de control eran esencialmente las mismas excepto porque las muestras de control no contenían nada de DMA.
Tabla 2fa) - Papaína inmovilizada reticulada con DMA al 1%
Tiempo
4°C 25°C 40°C 50°C
100 100 100 100
2 semanas
103,927 106,806 92,670 75,654
4 semanas
101,832 98,168 69,372 26,70
6 semanas
97,906 95,812 55,236 13,089
0 semanas
96,073 92,670 36,911 2,356
12 semanas
95,812 84,296 12,923 2,068
Tabla 2(b) - Papaína inmovilizada (sin DMA) - Control
Tiempo
4°C 25°C 40°C 50°C
0 semanas
100 100 100 100
2 semanas
96,419 68,286 53,708 25,064
4 semanas
91,049 57,545 47,826 8,440
6 semanas
90,537 45,013 26,087 2,558
8 semanas
85,166 27,877 12,788 0,256
12 semanas
78,772 21,043 6,115 0,305
Tabla 3(a) - Papaína inmovilizada reticulada con DMA al 1%
Tiempo
4°C 25°C 40°C 50°C
0 semanas
100 100 100 100
2 semanas
107,320 110,000 87,530 65,430
4 semanas
95,620 92,650 65,430 29,76
6 semanas
91,420 87,210 56,540 10,430
8 semanas
87,240 84,320 30,120 1,340
12 semanas
85,350 80,460 10,870 1,000
Tabla 3(b) - Papaína inmovilizada (sin DMA) - Control
Tiempo
4°C 25°C 40°C 50°C
0 semanas
100 100 100 100
2 semanas
92,340 63,450 62,870 20,870
4 semanas
88,010 53,450 44,620 5,670
6 semanas
84,320 44,670 28,980 1,650
8 semanas
81,760 22,970 10,960 0,430
12 semanas
72,350 17,650 4,300 0,010
Tabla 4(a) -Papaína inmovilizada reticulada con DMA al 1%
Tiempo
4°C 25°C 40°C 50°C
0 semanas
100 100 100 100
2 semanas
99,000 99,980 92,670 68,520
4 semanas
97,620 96,210 62,650 22,01
6 semanas
96,420 92,510 52,980 10,650
8 semanas
90,610 82,100 31,000 2,420
12 semanas
88,010 80,110 10,650 0,890
Tabla 4(b)- Papaína inmovilizada (sin DMA) - Control
Tiempo
4°C 25°C 40°C 50°C
0 semanas
100 100 100 100
2 semanas
98,870 71,820 50,980 27,870
4 semanas
86,340 52,340 41,620 5,750
6 semanas
80,730 40,210 22,320 1,230
8 semanas
81,530 20,410 11,876 0,910
12 semanas
75,610 15,620 3,110 0,030
5 Tabla 5(a) - Valor medio para el % de actividad conservada de papaína inmovilizada reticulada con DMA al 1% del
lote 1 (tabla 3), lote 2 (tabla 4) y lote 3 (tabla 5)
Tiempo
4°C 25°C 40°C 50°C
0 semanas
100 100 100 100
2 semanas
103,4 105,6 91,0 69,9
4 semanas
98,4 95,7 65,8 26,2
6 semanas
95,2 91,8 54,9 11,4
8 semanas
91,3 86,4 32,7 2,0
12 semanas
89,7 81,6 11,5 1,3
Tabla 5(b) -Valor medio para el % de actividad conservada de papaína inmovilizada (sin DMA) del lote 1 (tabla 3)
lote 2 (tabla 4) y lote 3 (tabla 5)
Tiempo
4°C 25°C 40°C 50°C
0 semanas
100 100 100 100
2 semanas
95,88 67,85 55,85 55,85
4 semanas
88,47 54,44 44,69 44,69
6 semanas
85,20 43,30 25,80 25,80
8 semanas
82,82 23,75 11,87 11,87
12 semanas
75,58 18,10 4,51 4,51
Tal como puede observarse a partir de los resultados de las tablas 2(a)-5(b), la actividad de papaína Inmovilizada que se retículo con DMA al 1% en las muestras experimentales fue significativamente mayor a lo largo de una variedad de temperaturas que la actividad de papaína inmovilizada en las muestras de control que no se hizo reaccionar con DMA. Por consiguiente, la papaína que ha experimentado una reacción de reticulación primarla para 5 reticular la papaína con un carbómero y después ha experimentado una reacción de reticulación secundaria con DMA al 1% es significativamente más estable que muestras de control de papaína que ha experimentado la reacción de reticulación primaria pero no ha experimentado una reacción de reticulación secundaria con DMA. Además, las figuras 3 y 4 ilustran los resultados de las tablas 2(a)-5(b) de que la actividad de papaína inmovilizada que se ha reticulado con DMA al 1% es significativamente mayor a lo largo de una variedad de temperaturas que la actividad 10 de papaína inmovilizada en las muestras de control que no se ha hecho reaccionar con DMA.
Tal como se expone a continuación en las tablas 6 y 7, se determinó la actividad de papaína en las muestras experimentales y las muestras de control basándose en el cambio de fluorescencia por muestra unitaria de la papaína inmovilizada. Se desarrolló una curva patrón de la actividad de papaína de Sigma tal como se muestra en la figura 5 para ayudar en la cuantificación de la actividad de papaína inmovilizada reticulada con DMA al 1% según el 15 presente ejemplo. Tal como se indicó anteriormente, se usó un kit de ensayo de proteasa EnzChek® (E-6639) para obtener la curva patrón y el cambio de fluorescencia por muestra unitaria del experimento de la presente invención.
Tabla 6 - Valores de fluorescencia para papaína inmovilizada con DMA al 1% v sin DMA (control)
Muestras de papaína unida con o sin DMA al 1% (muestras de 12 semanas)
4°C
1
LP-DMA al 1% 1:8 5674 5432 5876 5660,7 4415 0,458
2
LP-Control 1:8 4598 5165 5120 4961,0 3715 0,385
25°C
1
LP-DMA al 1% 1:8 5432 4987 4976 5131,7 3886 0,403
2
LP-Control 1:8 2204 2252 2359 2271,7 1026 0,103
40°C
1
LP-DMA al 1% 1:8 1903 1885 1849 1879,0 633 0,062
2
LP-Control 1:8 1580 1571 1575 1575,3 329 0,030
50°C
1
LP-DMA al 1% 1:8 1334 1345 1474 1384,3 138 0,010
2
LP-Control 1:8 1274 1315 1324 1304,3 58 0,001
Tabla 7- Actividad de papaína inmovilizada al 1% con DMA al 1% v papaína inmovilizada sin DMA (control) medida
en unidades/ml.
Actividad, unidades/ml Unidades/ml
0 semanas
LP-DMA al 1% 3,82 3,82 3,82 3,82
datos 041608
LP-Control 4,91 4,91 4,91 4,91
4°C 25°C 40°C 50°C
2 semanas
LP-DMA al 1% 3,97 4,08 3,54 2,89
datos 043008
LP-Control 3,77 2,67 2,1 0,98
4 semanas
LP-DMA al 1% 3,89 3,75 2,65 1,02
datos 051408
LP-Control 3,56 2,25 1,87 0,33
6 semanas
LP-DMA al 1% 3,74 3,66 2,11 0,5
datos 052808
LP-Control 3,54 1,76 1,02 0,1
8 semanas
LP-DMA al 1% 3,67 3,54 1,41 0,09
datos 061108
LP-Control 3,33 1,09 0,5 0,01
12 semanas
LP-DMA al 1% 3,66 3,22 0,49 0,08
datos 070208
LP-Control 3,08 0,82 0,24 0,01
20 En otros experimentos, se almacenó papaína al 1% reticulada con DMA al 1% y se almacenó papaína al 1% reticulada sin DMA a las temperaturas de 4°C, 25°C y 45°C a lo largo de un periodo de 12 semanas para determinar la estabilidad de estas muestras de papaína a estas temperaturas. Los resultados de este experimento se obtuvieron mediante un ensayo de la actividad de papaína usando el kit de ensayo EnzChek® de Invitrogen, N=3.
Tal como se muestra en las figuras 6(a)-6(b), la reticulación de papaína inmovilizada con DMA mejoró 25 significativamente la estabilidad del producto a 25°C y 45°C en comparación con la muestra de control en la que no
se almacenó papaína unida con DMA. La figura 6(a) ilustra el porcentaje de actividad conservada tras almacenar muestras durante hasta 12 semanas que contenían papaína unida reticulada con DMA. La figura 6(b) ¡lustra muestras de control que se almacenaron durante hasta 12 semanas que contenían papaína unida sin DMA. Se observa además que tal como se ¡lustra en la figura 6(a), se determinó que el producto de papaína unida reticulada 5 con DMA conserva más de aproximadamente el 80% de actividad a 4°C y 25°C durante 12 semanas y aproximadamente el 50% a 45°C.
En todavía otros experimentos, tal como se muestra en la figura 7, se llevó a cabo una determinación de papaína activa libre en papaína estabilizada. Los resultados del experimento fueron que se determinó que no se encontró nada de papaína activa libre en la papaína que se había retículado con EDC/NHS en una reacción de reticulación 10 primaria y después retículado adicionalmente con DMA al 1% en una reacción de reticulación secundaria según una realización a modo de ejemplo de la presente invención. Por otro lado, había actividad significativa de papaína libre en la papaína de las muestras de control que no estaban reticuladas.
Ejemplo 2
En el ejemplo 2, en lugar de usarse DMA como agente de reticulación secundario, se usó el 0,2% del agente de 15 reticulación BS3 para reticular el producto de papaína inmovilizada en una reacción de reticulación secundaria. El protocolo, los reactantes, las condiciones de reacción y los resultados para determinar el porcentaje de actividad de las muestras experimentales de papaína inmovilizada almacenadas con BS3 al 0,2% y las muestras de control de papaína inmovilizada almacenadas sin BS3 se ilustran en las tablas 8-10 y se comentan a continuación.
Tabla 8
Protocolo de ensayo usando el kit E6639 EnzChek de Invitrogen para determinar la actividad enzimática
Curva patrón de papaína
n.° de patrón
Disolución madre (U/ml) Disolución de reserva (1 U/ml) Tampón de ensayo
1
1
1000 0
2
0,5 500 500
3
0,25 250 750
4
0,1 100 900
5
0,05 50 950
6
0,01 10 990
7
0,005 5 995
8
0 0 1000
Preparar disolución madre de 1 unidad/ml de papaína
10 mq de papaína de Sigma 25 mi di IXtampón de digestión
Requisito de material y tampón: Bicarbonato de sodio 0,1 M, pH 8,3
1x Tampón de digestión: PBS pH 6 + 50 ul de TX-100
Disolución de reserva 1 mg/ml de caseína de BODIPY TRX = 1 vial de sustrato y disolver en 0,2 mi de tampón de bicarbonato_____________________________________________________________________
Disolución de trabajo 10 ug/ml de caseína de BODIPY:__________________________________________
Añadir 0,2 mi de disolución de reserva de sustrato en 19,8 mi de tampón de digestión en un frasco de 50 mi
Ensayo:______20 ul de patrón/muestra________________________________
____________80 ul de IXtampón de digestión_________________________
____________100 ul de disolución de trabajo 10 uq/ml de caseína de BODIPY
Muestras: 50 ul de papaína unida mezclados con 150 ul de 1X tampón de digestión que contiene Tritón X- 100 al 0,1%____________________________________________________
Procedimiento:
Incubar la placa a temperatura ambiente durante una hora con agitación moderada. Proteger la placa de la luz. Leer la fluorescencia en un lector de microplacas de fluorescencia. Usar filtros de fluorescencia convencionales con excitación a 530/25 nm, emisión a 620/40 nm.
N.° de tubo
ID de muestra, muestras de papaína unida
Filtro de dilución
Muestra
IXtampón
de
Protocolo de ensayo usando el kit E6639 EnzChek de Invitrogen para determinar la actividad enzlmátlca
digestión
1
LP-BS3 4°C 1:4 50 150
2
LP-BS3 25°C 1:4 50 150
3
LP-BS3 40°C 1:4 50 150
4
LP-BS3 50°C 1:4 50 150
5
LP-sin BS3 4°C 1:4 50 150
6
LP-sin BS3 25°C 1:4 50 150
7
LP-sin BS3 40°C 1:4 50 150
8
LP-sin BS3 50°C 1:4 50 150
1:4 50 150
Se prepararon muestras de papaína unida con o sin BS3 al 0,2%
Tabla 9
N.° de tubo
ID de muestra Factor de dilución Lectura 1 Lectura 2 Lectura 3 Promedio promedio- negativo unidades/ml unidades/ml
1
LP - BS3 4°C 1:4 10954 10883 12916 11584,3 10231 1,034 4,14
2
LP - BS3 25°C 1:4 12196 12865 12959 12673,3 11320 1,156 4,62
3
LP - BS3 40°C 1:4 13135 13636 14267 13679,3 12326 1,268 5,07
4
LP - BS3 50°C 1:4 11009 11025 11031 11021,7 9668 0,971 3,89
5
LP - sin BS3 4°C 1:4 8174 19586 12 9257,3 7904 0,775 3,10
6
LP - sin BS3 25°C 1:4 5345 12494 13 5950,7 4597 0,406 1,62
7
LP - sin BS3 40°C 1:4 3191 7654 12 3619,0 2265 0,146 0,58
8
LP - sin BS3 50°C 1:4 2383 5583 14 2660,0 1306 0,039 0,16
Tabla 10
Actividad conservada tras 1 semana - % de actividad a 4°C
Sin BS3 BS3 al 0,2%
4°C
99,957 99,912
25°C
52,389 111,643
40°C
18,847 122,479
50°C
5,052 93,851
Tal como puede verse a partir de los resultados de la tabla 10 y la figura 8, la actividad de papaína al 1% Inmovilizada que se ha retlculado adlclonalmente con BS3 al 0,2% fue significativamente mayor a lo largo de una 5 variedad de temperaturas que la actividad de papaína Inmovilizada en las muestras de control que no se había hecho reaccionar con BS3.
Ejemplo 3
En este ejemplo, se combinaron papaína estabilizada al 1% y alginato de sodio al 0,1%. El protocolo, los reactantes, las condiciones de reacción y los resultados para determinar el % de actividad de muestras experimentales de 10 papaína estabilizada almacenada con alginato de sodio al 0,1% y muestras de control de producto de papaína estabilizada almacenadas sin alginato de sodio tal como se comenta a continuación.
Tabla 11
Curva patrón de papaína
Preparar disolución madre de 5 unidades/ml de papaína___________________
10 mq de papaína de Sigma______________5 mi di IXtampón de digestión
Curva patrón de papaína
Requisito de material y tampón:____________________________________________________
1x tampón de ensayo: borato 50 mM, pH 8,5_________________________________________
Sustrato: caseína succinilada 2 mg/ml en 1X tampón de ensayo, disolver 1 vial (10 mg) en 5 mi de tampón de ensayo. Disolución de trabajo de TNBSA: 100 ul de disolución de reserva de TNBSA con 14,9 mi de tampón de ensayo___________________________________________
Ensayo:_____________________________________________50 ul de patrón/muestra_______
100 ul de sustrato (2 mg/ml), incubar la placa durante 20 min
________________________________________________________aJA_______________________
50 ul de disolución de TNBSA, incubar la placa durante 20 min
____________________________________________________a temp. ambiente___________
Leer la absorbancla a 450 nm
Muestras sometidas a prueba (muestras de papaína unida de 4 semanas - preparadas con una concentración de papaína 101607 al 1%) _______________________________________
Sin tratamiento a 4°C Alqinato al 0,1% a 4°C
Sin tratamiento a 25°C Alginato al 0,1% a 25°C
Sin tratamiento 50°C Alginato al 0,1% a 50°C
Tabla 12
patrón de papaína
valor 1 valor 2 promedio negativo absorbancia prom-neg a 450 nm
3 1,636 1,677 1,6565 0,676 0,9805
2 1,161 1,16 1,1605 0,427 0,7335
1 0,554 0,55 0,552 0,232 0,32
0,5 0,245 0,245 0,245 0,12 0,125
0,25 0,123 0,127 0,125 0,071 0,054
0,1 0,073 0,075 0,074 0,049 0,025
0,05 0,06 0,06 0,06 0,042 0,018
0 0,054 0,061 0,0575 0,031 0,0265
Tabla 13
muestras sometidas a prueba (muestras de papaína unida de 4 semanas - preparadas con concentración
papaína 101607 al 1%)
valor 1 valor 2 promedio negativo prom-neg unidades/ml
Sin
tratamiento
1,455 1,15 1,3025 0,7145 0,588 1,75493954 6
a 4°C
Alginato al 0,1% a4°C
1,328 1,329 1,3285 0,6123 0,7162 2,13299911 5
Sin
tratamiento a 25°C Alginato al
0,758 0,629 0,6935 0,5605 0,133 0,41315246 2
0,1% a
0,936 0,9 0,918 0,563 0,355 1,0678266
25°C
Sin
tratamiento
0,691 0,778 0,7345 0,734 0,0005 0,02241226 8
a 50°C Alginato al
0,791 0,746 0,7685 0,6776 0,0909 0,28900029 5
muestras sometidas a prueba (muestras de papaína unida de 4 semanas — preparadas con concentración de papaína 101607 al 1%)
0,1% a 50°C
semana 1
unidades/ml % de actividad de la semana 0
semana 0, unidades/ml semana, 1- 4°C semana 1- 25°C semana 1 - 50°C semana 1- 4°C semana 1- 25°C semana 1 - 50°C
Sin tratamiento
2,690 2,292 0,777 0,143 85,22 28,9 5,31
alginato
2,795 2,581 semana 2 1,546 0,986 92,36 55,32 35,26
unidades/ml % de actividad de la semana 0
semana 0 unidades/ml semana 2- 4°C semana 2- 25°C semana 2 - 50°C semana 2- 4°C semana 2- 25°C semana 2 - 50°C
Sin tratamiento
2,690 2,113 0,673 0,032 78,56 25 1,2
alginato
2,795 2,550 semana 3 1,258 0,894 91,23 45 32
unidades/ml % de actividad de la semana 0
semana 0 unidades/ml semana 3- 4°C semana 3- 25°C semana 3 - 50°C semana 3- 4°C semana 3- 25°C semana 3 - 50°C
Sin tratamiento
2,6902 1,89 0,60 0,03 70,24 22,32 1,03
alginato
2,7950 2,24 semana 4 1,13 0,59 80,23 40,32 21,01
unidades/ml % de actividad de la semana 0
semana 0 unidades/ml semana 4- 25°C semana 4 - 50°C semana 4- 4°C semana 4- 25°C semana 4 - 50°C
Sin tratamiento
2,690 1,7549 0,4132 0,0224 65,2394 15,3588 0,8332
alginato
2,795 2,1330 1,0678 0,2890 76,3148 38,2049 10,3399
% de actividad de la semana 0
semana 4- semana 4- semana 4 -
4°C 25°C 50°C
Sin tratamiento
65,239 15,359 0,833
Alginato al 0,1%
76,315 38,205 10,340
Tal como puede observarse a partir de los resultados de tabla 13, la actividad de papaína estabilizada que se almacenó con alginato de sodio al 0,1% es significativamente mayor a lo largo de una variedad de temperaturas a lo largo de 4 semanas que la actividad de papaina estabilizada en las muestras de control que no se almacenaron con alginato de sodio. Por consiguiente, la papaína unida que se hace reaccionar con alginato de sodio al 0,1% es 5 significativamente más estable que las muestras de control de papaína mencionadas anteriormente que no incluyen alginato de sodio. Además, la figura 9 ¡lustra los resultados de tabla 13 de que la actividad de papaína estabilizada con alginato de sodio fue significativamente mayor a lo largo de una variedad de temperaturas a lo largo de 4 semanas que la actividad de papaína reticulada en las muestras de control que no incluyeron alginato de sodio.
Además, tal como se muestra en la figura 10, se desarrolló una curva patrón de la actividad de papaína de Sigma 10 usando absorbancia frente a unidades/ml para ayudar en la cuantificación de la actividad de papaína al 1% unida junto con alginato de sodio al 0,1%.
En otros experimentos, tal como se muestra en la figura 11, se llevó a cabo el efecto del azúcar y polímeros de azúcar sobre la estabilidad de la papaína libre tras días a 25°C y 40°C. El azúcar o polímeros de azúcar incluidos fueron alginato de sodio al 0,1%, trehalosa al 5%, manitol al 5%, glicerol al 5%, goma xantana al 0,1%, HA al 0,1%, 15 sacarosa al 5%, sorbitol al 5% y un control sin azúcar. A partir de los resultados se observa que se encontró que alginato de sodio al 0,1% tenía un efecto estabilizante sobre papaína libre. Este efecto estabilizante de alginato de sodio al 0,1% también se observó con la papaína estabilizada de la presente invención.
En todavía otros experimentos, tal como se muestra en la figura 12, se determinó el porcentaje de la actividad conservada tras 2 semanas de papaína estabilizada preparada con papaína al 0,4%. En algunas muestras de estos 20 experimentos, se trató la papaína unida con alginato de sodio, en algunas muestras se trató la papaína unida con anhídrido, en algunas muestras se trató la papaína unida con anhídrido y alginato de sodio y en algunas muestras
5
10
15
20
25
no se trató la papaína unida en absoluto con nada de lo anterior. Tal como puede deducirse a partir de la figura 12, las muestras que se trataron tanto con alglnato de sodio como con anhídrido tenían el mayor % de actividad conservada tras cada una de las dos semanas y las muestras que no se trataron en absoluto tenían el menor % de actividad conservada tras cada una de las dos semanas.
Ejemplo 4
En ejemplo 4, se hizo reaccionar papaína inmovilizada con DMA al 1% para la reticulación secundarla y con alglnato de sodio al 0,1% para la estabilidad adicional y se Incluyó como parte de un sistema conservante que comprendía fenoxletanol al 1,2% + ácido benzoico al 0,2%. El protocolo, los reactantes, las condiciones de reacción y los resultados para determinar el % de actividad de muestras experimentales de papaína estabilizada según una realización de la presente invención y muestras de control de un producto de papaína unida (sin DMA o alginato de sodio) se muestran en la tabla 14 y se comentan a continuación.
Tabla 14
Protocolo de ensayo usando el kit E6639 EnzChek de Invitrogen para determinar la actividad enzimática Curva patrón de papaína
de patrón
Disolución madre (U/ml) Disolución de reserva (1 U/ml) Tampón de ensayo
1
1
1000 0
2
0,5 500 500
3
0,25 250 750
4
0,1 100 900
5
0,05 50 950
6
0,01 10 990
7
0,005 5 995
8
0 0 1000
Preparar disolución madre de 1 unidad/ml de papaína 10 mg de papaína de Sigma 25 mi di IXtampón de digestión
Requisito de material y tampón:
Bicarbonato de sodio 0,1 M, pH 8,3
1x Tampón de digestión: PBS pH 6 + 50 ul de TX-100
Disolución de reserva 1 mg/ml de caseína de BODIPY TRX = 1 vial de sustrato y disolver en 0,2 mi de tampón de bicarbonato
Disolución de trabajo 10 ug/ml de caseína de BODIPY:
Añadir 0,2 mi de disolución de reserva de sustrato en 19,8 mi de tampón de digestión en un frasco de 50 mi Ensayo: 20 ul de patrón/muestra
80 ul de IXtampón de digestión
100 ul de disolución de trabajo 10 ug/ml de caseína de BODIPY
Las muestras sometidas a prueba contienen muestras de DMA al 1%
papaína al 1% 600 (ESP)
DMA al 1% alginato al 0,1% fenoxietanol al 1,2% ácido benzoico al 0,2%
control
papaína al 1% 600 (ESP) sin DMA alginato al 0,1% fenoxietanol al 1,2% ácido benzoico al 0,2%
Muestras: 25 ul de papaína unida mezclados con 150 ul de 1X tampón de digestión que contiene Tritón X-100 al
0,1%
Procedimiento:
Incubar la placa a temperatura ambiente durante una hora con agitación moderada. Proteger la placa de la luz. Leer la fluorescencia en un lector de microplacas de fluorescencia. Usar filtros de fluoresceína convencionales con excitación a 590/25 nm, emisión a 620/40 a nm.
Tabla 15
Muestras de papaína unida con conc. variable de otro agente de reticulación (muestras de 12 semanas) 4°C
1 2
LP - DMA al 1% LP-control 1:8 1:8 25 25 175 175
1
25°C LP - DMA al 1% 1:8 25 175
2
LP-control 1:8 25 175
1
45°C LP - DMA al 1% 1:8 25 175
2
LP-control 1:8 25 175
Muestras de papaína unida con o sin DMA al 1% (muestras de 12 semanas) 4°C
1
LP - DMA al 1% 1:8 5321 5467 5562 5450,0 4223 0,580 4,64
2
LP-control 1:8 4578 4879 5098 4851,7 3625 0,485 3,88
25°C
1
LP - DMA al 1% 1:8 5098 5291 5120 5169,7 3943 0,535 4,28
2
LP-control 1:8 2789 2908 2871 2856,0 1629 0,169 1,35
45°C
1
LP - DMA al 1% 1:8 2987 2871 3091 2983,0 1756 0,189 1,51
2
LP-control 1:8 1765 1775 1879 1806,3 579 0,002 0,02
datos de 12 4°C 25°C 45°C
semanas
LP - DMA al 1% 4,638 4,283 1,511
LP-control 3,880 1,350 0,019
4°C 25°C 45°C
actividad, unidades
unidades/ml /mi
datos de 0
LP - DMA al 1% 4,87 4,87 4,87
semanas
LP-control 4,61 4,61 4,61
datos de 2
LP - DMA al 1% 5,01 5,25 4,31
semanas
LP-control 4,81 2,67 2,1
datos de 4
LP- 1%DMA 5,12 4,98 3,11
semanas
LP-control 4,67 2,01 1,87
datos de 6
LP - DMA al 1% 4,98 4,61 2,31
semanas
LP-control 4,18 1,76 1,02
datos de 8
LP - DMA al 1% 4,81 4,44 1,98
semanas
LP-control 4,01 1,35 0,5
datos de 12
LP - DMA al 1% 4,64 4,28 1,51
semanas
LP-control 3,88 1,35 0,02
% de actividad conservada tras almacenamiento
4°C 25°C 45°C
datos de 2
LP - DMA al 1% 102,87 107,80 88,50
semanas
LP-control 104,34 57,92 45,55
datos de 4
LP - DMA al 1% 105,13 102,26 63,86
semanas
LP-control 101,30 43,60 40,56
datos de 6
LP - DMA al 1% 102,26 94,66 47,43
semanas
LP-control 90,67 38,18 22,13
5
10
15
20
25
Muestras de papaína unida con o sin DMA al 1% (muestras de 12 semanas)
datos de 8
LP - DMA al 1% 98,77 91,17 40,66
semanas
LP-control 86,98 29,28 10,85
datos de 12
LP - DMA al 1% 95,24 87,94 31,02
semanas
LP-control 84,16 29,28 0,43
Tal como se indicó anteriormente, las muestras experimentales según una realización a modo de ejemplo de la presente invención incluyen DMA al 1%, papaína al 1% 600 (ESP), alginato de sodio al 0,1%, fenoxietanol al 1,2 + ácido benzoico al 0,2%. Todas las muestras de control incluyeron los mismos componentes que la muestra de formulación experimental, excepto porque las muestras de control no incluyeron DMA. A continuación se exponen los resultados para el efecto de DMA sobre la conservación de la actividad de papaína unida a lo largo de un periodo de 12 semanas a diversas temperaturas. Además, en la figura 13(a) se ilustra la química de DMA, papaína unida y alginato de sodio.
Tal como puede deducirse a partir de los datos anteriores y las figuras 13(b), 13(c), 14 y 15, la reticulación de papaína unida con DMA al 1% mejoró significativamente la estabilidad del producto de papaína unida a lo largo de una variedad de temperaturas a lo largo de un periodo de 12 semanas en comparación con las muestras de control que no contenían nada de DMA.
Además, tal como se expuso anteriormente en la tabla 15, se determinó la actividad de papaína en la muestra experimental y el control basándose en el cambio de fluorescencia por muestra unitaria de la papaína unida. Se desarrolló una curva patrón de papaína de Sigma tal como se muestra en la figura 16 para ayudar en la cuantificación de la actividad de papaína al 1% inmovilizada que se retículo adicionalmente con DMA al 1% según la presente realización. Tal como se indicó anteriormente, se usó un kit de ensayo de proteasa EnzChek® (E-6639) para obtener la curva patrón y el cambio de fluorescencia por muestra unitaria de las muestras experimentales de papaína inmovilizada con DMA según la presente realización a modo de ejemplo y las muestras de control sin DMA.
Ejemplo 5
En otra realización a modo de ejemplo, se hizo reaccionar papaína inmovilizada con DMA al 5% para la reticulación adicional y con alginato de sodio al 0,1% y se incluyó como parte del sistema conservante que comprendía fenoxietanol al 1,2% + ácido benzoico al 0,2%. A continuación se exponen el protocolo y los resultados para esta realización. La formulación de placebo contiene todos los componentes de la formulación experimental, excepto por DMA.
Tabla 16
Muestras de formulación de 11
semanas
4°C
963030/1
963030/3
25°C
963030/1
963030/3
45°C
963030/1
963030/3
Muestras
de
formulación de 11 semanas 963030/1 963030/3
Factor de dilución
Lectura 1 Lectura 2 Lectura 3 Promedio promedio- negativo unidades/ml unidades/ml
1:4
1245 1342 1290 1292,3 151 0,055 0,22
1:4
1677 1549 1682 1636,0 495 0,244 0,97
1:4
1245 1232 1310 1262,3 121 0,039 0,15
1:4
1581 1621 1590 1597,3 456 0,222 0,89
1:4
1245 1154 1167 1188,7 48 -0,002 -0,01
1:4 4°C
1576 25°C CN O OO o LO LO 1501 1553,0 412 0,198 0,79
0,22
0,15 -0,01
0,97
0,89 0,79
número
4°C 25°C 45°C
de
fórmula
muestras de 0
placebo 963030 /1 0,98 0,98 0,98
semanas
muestra de DMA al 5% 963030 /3 1,09 1,09 1,09
muestras de 2
placebo 963030 /1 4°C 0,85 25°C 0,82 45°C 0,41
semanas
muestra de DMA al 5% 963030 /3 1,12 1,21 1,05
muestras de 4
placebo 963030 /1 4°C 0,61 25°C 0,71 45°C 0,31
semanas
muestra de DMA al 5% 963030 /3 1,02 1,02 0,92
muestras de 8
placebo 963030 /1 4°C 0,44 25°C 0,31 45°C 0,15
semanas
muestra de DMA al 5% 963030 /3 1,00 0,95 0,85
muestras de 11
placebo 963030 /1 4°C 0,22 25°C 0,15 45°C -0,01
semanas
muestra de DMA al 5% 963030 /3 0,97 0,89 0,79
muestras de 2
placebo 963030 /1 % de actividad de la semana 0 4°C 25°C 86,73 83,67 45°C 41,84
semanas
muestra de DMA al 5% 963030 /3 102,75 111,01 96,33
muestras de 4
placebo 963030 /1 4°C 62,24 25°C 72,45 45°C 31,63
semanas
muestra de DMA al 5% 963030 /3 93,58 93,58 84,40
muestras de 8
placebo 963030 /1 4°C 44,90 25°C 31,63 45°C 15,31
semanas
muestra de DMA al 5% 963030 /3 91,74 87,16 77,98
4°C 25°C 45°C
muestras de 11 semanas
placebo 963030 /1 22,47 15,75 -0,74
muestra de DMA al 5% 963030 13 89,38 81,60 72,67
Tal como puede deducirse a partir de la tabla de datos anterior y las figuras 17-19, la reticulación de papaína Inmovilizada con DMA al 5% mejoró significativamente la estabilidad del producto de papaína Inmovilizada a lo largo de una variedad de temperaturas a lo largo de un periodo de 12 semanas en comparación con las muestras de control que no contenían nada de DMA.
5 Además, tal como se expone en las tablas de datos anteriores, se determinó la actividad de papaína en la muestra experimental y el control basándose en el cambio de fluorescencia por muestra unitaria de la papaína inmovilizada. Se desarrolló una curva patrón para papaína de Sigma en formulación de placebo tal como se muestra en la figura 20 para ayudar en la cuantificación de la actividad de papaína al 1% inmovilizada reticulada con DMA al 5% según la presente realización. Tal como se indicó anteriormente, se usó un kit de ensayo de proteasa EnzChek® (E-6639) 10 para obtener la curva patrón y el cambio de fluorescencia por muestra unitaria de la muestra experimental de papaína unida con DMA según la presente realización a modo de ejemplo y la muestra de control sin DMA.
Ejemplos 6-8
A continuación se representan ejemplos de formulaciones que pueden prepararse usando una o más proteasas estabilizadas. En la técnica se conoce una amplia variedad de formulaciones similares en las que pueden 15 incorporarse fácilmente una o más proteasas estabilizadas a diversas concentraciones.
Ejemplo 6
Un gel de crema elástico a modo de ejemplo tiene, por ejemplo, la composición mostrada en la siguiente tabla:
FASE
% PROVEEDOR MATERIA PRIMA NOMENCLATURA INCI
A
63,300 Local Agua desionizada Agua
A
0,050 Local EDTA de disodio Disodio EDTA
A
1,100 Clariant Aristoflex AVC/USA Copolímero de acriloildimetiltaurato de amonio / VP
A
0,150 Clariant Aristoflex HMB Polímero reticulado de acriloildimetiltaurato de amonio / metacrilato de beheneth-25
A
3,000 Local Butilenglicol Butilenglicol
A
2,000 Local Glicerina Glicerina
B
15,000 Momentive Velvesil DM Polímero reticulado de dimeticona y cetearil-dimeticona
B
3,000 Dow Corning Dow Corning 1413 Dimeticona
C
1,200 Seppic Simulgel NS Copolímero de acrilato dehidroxietilo / acriloildimetiltaurato de sodio y escualano y polisorbato 60
D
3,000 BASF Papaína estabilizada de la presente invención
D
1,000 BASF Germazide PSB Fenoxietanol, clorfenesina, ácido benzoico, butilenglicol, ácido sórbico
E
2,000 Alzo CUPL PIC Acetato de ¡soceteth-20 de PPG-2
E
2,000 Firmenich, Inc. Hedione Dihidrojasmonato de metilo
F
0,100 BASF Cloisonne Red 424C Mica y dióxido de titanio y carmín
F
0,100 BASF Timica Silver Sparkle 5500 Mica y dióxido de titanio
F
3,000 Local Agua Agua
En un recipiente principal, combinar fase A. Mezclar de manera homogénea y mezclar con barrido hasta que se hidrata el polvo y el lote es uniforme. Cuando la fase A es uniforme, añadir la fase B al recipiente principal mientras 20 se mezcla de manera homogénea. Mezclar hasta que es uniforme. Añadir la fase C al recipiente principal mientras
se mezcla de manera homogénea. Mezclar hasta que es uniforme. Añadir la fase D al recipiente principal mientras
se mezcla de manera homogénea. Mezclar hasta que es uniforme. Calentar los componentes de la fase E hasta de
150 a 40°C hasta que se funden. Realizar un mezclado previo de la fase E y añadirla al recipiente principal mientras se mezcla de manera homogénea. Realizar un mezclado previo de la fase F. Mezclar hasta que todas las perlas están en suspensión y no hay grumos. Seguir mezclando durante la adición. Añadir la fase F al recipiente principal mientras se mezcla de manera homogénea. Apagar la mezcladora-homogeneizadora tras la adición y mezclar con 5 barrido hasta que es uniforme.
Ejemplo 7
Una loción a modo de ejemplo tiene, por ejemplo, la composición mostrad en la siguiente tabla
FASE
% PROVEEDOR MATERIA PRIMA NOMENCLATURA INCI
A
85,50 Local Aqua deslonlzada Aqua
A
0,050 Local EDTA de dlsodlo EDTA de disodio
A
3,0 Local 1,3-Butllengllcol Butilenglicol
A
1,0 Clariant Aristoflex AVC/USA Copolímero de acriloildimetiltaurato de amonio / VP
B
8,0 Inolex Lexol GT 865 Triqlicérido caprílico / cáprico
B
0,25 Arlacel 165V Croda Estearato de glicerilo y estearato de PEG-100
C
3,0 Papaína estabilizada de la presente Invención
D
1,2 BASF Germazlde PSB Fenoxietanol y clorfenesina y ácido benzoico y butilenglicol y ácido sórbico
F
3,000 Local Agua Agua
Mezclar la fase A hasta que es homogénea mientras se callenta hasta 65-70°C. En un recipiente distinto, realizar el mezclado previo de la fase B. Calentar hasta 70-75°C o hasta que es homogénea. Cuando ambas fases Ay B están 10 a la temperatura deseada, añadir la fase B a la fase A y mezclar de manera homogénea hasta que es uniforme. Cuando la fase AB es uniforme, comenzar a enfriar y añadir la fase C a 35-30°C y mezclar con una mezcladora de hélice hasta que es uniforme. Añadir la fase D previamente mezclada a la fase ABC con mezcladora homogenelzadora. Mezclar hasta que es uniforme.
Ejemplo 8
15 En esta realización, la estabilidad de papaína unida a diversas temperaturas durante hasta 12 semanas en una formulación de O/W. Los resultados se obtuvieron mediante un ensayo de la actividad de papaína usando un kit de ensayo EnzChek de Invitrogen tras suspender la formulación en Tritón X-100 al 0,1%, n=3.
Tal como se muestra en la figura 21, el producto de papaína unida se estabiliza adiclonalmente mediante una formulación de aceite en agua. Se conserva aproximadamente el 75% de actividad tras 12 semanas a 45°C. Se 20 encontró que la formulación era estable a todas las temperaturas sometidas a prueba. Estos resultados indican que cuando se incluyen productos de papaína reticulada en una formulación de aceite y agua este producto se estabiliza incluso más.

Claims (20)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    REIVINDICACIONES
    1. Producto de proteasa estabilizada que comprende una proteasa reticulada a un carbómero, en el que las aminas primarias de la proteasa están reticuladas a grupos carboxilo del carbómero y en el que las aminas de dicha proteasa están reticuladas adicionalmente a través de un agente de reticulación reactivo con amina.
  2. 2. Proteasa estabilizada según la reivindicación 1, en la que la proteasa estabilizada comprende además un estabilizador físico, en la que el estabilizador físico es preferiblemente un azúcar o polímero de azúcar.
  3. 3. Proteasa estabilizada según la reivindicación 2, en la que la proteasa estabilizada comprende entre el 0,1% y el 5% del estabilizador físico y en la que el estabilizador físico es un azúcar o polímero de azúcar.
  4. 4. Proteasa estabilizada según la reivindicación 2, en la que el azúcar o polímero de azúcar se selecciona del grupo que consiste en alginato de sodio, trehalosa, manitol, glicerol, goma xantana, sacarosa y sorbitol, preferiblemente alginato de sodio.
  5. 5. Proteasa estabilizada según la reivindicación 1, en la que la proteasa se selecciona del grupo que consiste en papaína, ficina, bromelaína y actinidina.
  6. 6. Proteasa estabilizada según la reivindicación 5, en la que la proteasa es papaína.
  7. 7. Proteasa estabilizada según la reivindicación 5, que comprende entre el 0,1% y el 5% de la proteasa.
  8. 8. Proteasa estabilizada según la reivindicación 1, en la que el agente de reticulación reactivo con amina se selecciona del grupo que consiste en adipimidato de dimetilo (DMA), suberato de bis(sulfosuccinimidilo) (BS3), suberimidato de dimetilo (DMS), pimelimidato de dimetilo (DMP) y suberato de disuccinimidilo (DSS).
  9. 9. Proteasa estabilizada según la reivindicación 1, en la que la proteasa es papaína y el agente de reticulación reactivo con amina es DMA.
  10. 10. Producto de proteasa estabilizada según la reivindicación 1, que comprende además un sistema conservante.
  11. 11. Producto de proteasa estabilizada según la reivindicación 10, en el que el sistema conservante comprende fenoxietanol y ácido benzoico.
  12. 12. Producto de proteasa estabilizada según la reivindicación 10, en el que el sistema conservante comprende diocida.
  13. 13. Método de formación de una proteasa estabilizada que comprende:
    realizar una reacción de reticulación primaria para reticular aminas primarias de la proteasa a los grupos carboxilo de un carbómero; y
    realizar una reacción de reticulación secundaria en la proteasa a través de un agente de reticulación reactivo con amina.
  14. 14. Método según la reivindicación 13, en el que la reacción de reticulación primaria se lleva a cabo usando los agentes de reticulación carbodiimida, clorhidrato de 1-etil-3(3-dimetilaminopropil)carbodiimida y N- hidroxisulfosuccinimida.
  15. 15. Método según la reivindicación 13, en el que el reactivo de reticulación para realizar la reacción de reticulación secundaria es uno seleccionado del grupo que consiste en adipimidato de dimetilo (DMA), suberato de bis(sulfosuccinimidilo) (BS3), suberimidato de dimetilo (DMS), pimelimidato de dimetilo (DMP) y suberato de disuccinimidilo (DSS), y es preferiblemente DMA.
  16. 16. Método según la reivindicación 13, en el que la reacción de reticulación secundaria se realiza mediante del 1% al 5% en peso del agente de reticulación reactivo con amina.
  17. 17. Método según la reivindicación 13, que comprende además añadir un estabilizador físico tras realizar la reacción de reticulación secundaria, en el que el estabilizador físico es preferiblemente alginato de sodio.
  18. 18. Método para el tratamiento cosmético de piel seca, envejecida o dañada que comprende la aplicación a la piel de una composición que comprende una o más proteasas estabilizadas según la reivindicación 1.
  19. 19. Composición que comprende una o más proteasas estabilizadas según la reivindicación 1 para su uso en desbridamiento de heridas o quemaduras mediante aplicación tópica.
  20. 20. Uso de una composición que comprende una o más proteasas estabilizadas según la reivindicación 1 para la preparación de un medicamento para su uso en un método de desbridamiento de heridas o quemaduras, en el que
    5 la composición se administra por vía tópica.
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