ES2601359T3

ES2601359T3 - Composiciones y procesos para un mejor análisis de espectrometría de masas

Info

Publication number: ES2601359T3
Application number: ES09702741.1T
Authority: ES
Inventors: Thomas Becker
Original assignee: Agena Bioscience Inc
Current assignee: Agena Bioscience Inc
Priority date: 2008-01-15
Filing date: 2009-01-14
Publication date: 2017-02-14
Anticipated expiration: 2029-01-14
Also published as: JP5400799B2; US20160319346A1; AU2009205404A1; EP3138623A1; JP5651842B2; CN106404879B; KR20110008158A; EA017342B1; EP2242561A4; US20110172124A1; KR101733248B1; JP2011510272A; WO2009091841A2; AU2014203336B2; US7888127B2; WO2009091841A3; EP2242561B1; CN106404879A; US10329612B2; EP2242561A2

Abstract

Un método para el análisis de un ácido nucleico por espectrometría de masas, que comprende: (a) introducir una muestra en un espectrómetro de masas, en el que la muestra comprende un ácido nucleico y ácido ascórbico, o una sal, tautómero o análogo del mismo; y (b) analizar el ácido nucleico por espectrometría de masas, en el que el análogo del ácido ascórbico es de acuerdo a la siguiente fórmula:**Fórmula** en la que: R1 y R2 son independientemente OH, halógeno, R3, OR3, azido, ciano, CH2R3, CHR3R4, SR3, NR3R4; y R3 y R4 son independientemente H, alquilo, acetileno o ciano, o un anillo carbocíclico de arilo, anillo heterocíclico de arilo, anillo carbocíclico no arilo o anillo heterocíclico no arilo opcionalmente sustituidos.

Description

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DESCRIPCION

Composiciones y procesos para un mejor analisis de espectrometna de masas

La invencion se refiere, en general, a composiciones y metodos para su uso con espectrometna de masas.

La espectrometna de masas es una poderosa herramienta analftica utilizada para la medicion de la masa molecular de los analitos en una muestra. Cuando se utiliza un espectrometro de masas de tiempo de vuelo, la velocidad de vuelo de los iones es de aproximadamente 107 veces mas rapida que la velocidad de migracion de las moleculas en un gel electroforetico, por lo tanto, la espectrometna de masas ofrece un metodo de analisis extremadamente rapido, incluso cuando la medicion del espectro se repite de 10 a 100 veces para lograr una buena relacion senal-ruido.

El analisis por espectrometna de masas normalmente comienza con la ionizacion de las muestras por cualquiera de una serie de medios, por ejemplo, desorcion/ionizacion laser asistida por matriz (MALDI) o ionizacion por electropulverizacion (ES). Los procedimientos de preparacion y medicion MALDI consisten en primer lugar en la imbibicion de las moleculas de analito en un soporte de muestras en una matriz solida o lfquida absorbente de radicacion IR o UV que generalmente es un acido organico. El soporte de la muestra que comprende la matriz y el analito se coloca en la fuente de iones de un espectrometro de masas. La matriz se vaporiza por un pulso de laser corto y por lo tanto la molecula de analito se transporta a la fase gaseosa en un estado no fragmentado. La molecula de analito se ioniza por el choque y reacciona con los iones de la matriz generados al mismo tiempo. Se aplica una tension que acelera los iones en un tubo de vuelo de campo libre. Debido a sus diferentes masas, los iones en la fuente de iones se aceleran a diferentes velocidades con los iones mas pequenos que llegan al detector antes que los iones mas grandes. Los tiempos de vuelo variables se convierten en las diferentes masas de los iones.

Un metodo alternativo para ionizar un analito es la electropulverizacion (o ES). Como el MALDI, la electropulverizacion permite la ionizacion/vaporizacion de moleculas polares. Inicialmente, la muestra de interes se disuelve en un disolvente que, en cierta medida, existira en una forma ionizada. En ES convencionales, la solucion se bombea a traves de un capilar fino que se eleva a un alto potencial. Las pequenas gotas cargadas se pulverizan desde el capilar ES en un gas de bano a presion atmosferica y descienden por un gradiente de presion y potencial hacia un orificio en el sistema de alto vacfo del espectrometro de masas. A medida que las gotas atraviesan este camino, se desolvatan y reducen su tamano de tal manera que las fuerzas de Coulomb superficiales superan las fuerzas de tension superficial. Como resultado, las gotitas se rompen en gotitas mas pequenas hasta que un ion se desorbe de la gotita o el disolvente se elimina por completo. El mecanismo exacto de la formacion de iones no es del todo claro, pero el resultado es un haz de iones, que se muestrean por el espectrometro de masas. Una descripcion mas detallada del proceso de ES se proporciona en Electrospray Ionization Mass Spectrometry: Fundamentals, Instrumentation and Applications editado por Cole (John Wiley and Sons, Nueva York).

Cualquiera que sea el metodo de ionizacion utilizado, la formacion de aductos no deseados durante la ionizacion puede comprometer la calidad y la resolucion de los espectros generados por espectrometna de masas. Mas espedficamente, la presencia de aductos no deseados puede hacer que un analito sea diffcil de detectar y analizar, especialmente los analitos de baja masa o en baja cantidad.

O'Brien (Actas de la 50a Conferencia ASMS sobre Espectrometna de Masas y Temas Afines, Orlando, Florida, 2-6 de Junio de 2002) describe la deteccion por espectrometna de masas de aductos de protemas polifenolicos. Ayorinde et al. (Rapid Communications in Mass Spectrometry 2003; 17: 1735-1742) describe la deteccion de azucares, acidos ascorbicos, acido cftrico y benzoato de sodio en bebidas no alcoholicas por espectrometna de masas de desorcion/ionizacion laser asistida por matriz-tiempo de vuelo.

La presente invencion se define en las reivindicaciones. Se describen procesos y composiciones para mejorar el analisis por espectrometna de masas. En el presente documento se proporcionan metodos de preparacion de muestras de espectros de masa que reduzcan o minimicen la formacion de aductos de manera rentable y facil de poner en practica que por lo demas no altere la ionizacion, el analisis de masas o la deteccion de iones de la muestra. Los metodos y composiciones mejorados de la invencion permiten la identificacion y cuantificacion faciles de los picos de analitos, lo que aumenta el numero de llamadas correctas. Estas mejoras resultan particularmente utiles para muestras contaminadas con sal de sodio y/o amoniaco, asf como muestras con concentraciones bajas de analito. En ciertas realizaciones, se describe a continuacion el uso de acido ascorbico, o una sal, tautomero o analogo del mismo, como aditivo aducto reductor que disminuye la presencia de aductos en los espectros de masas, y aumenta la relacion senal a ruido (s/r). Aunque las realizaciones de la invencion se refieren en lo sucesivo al uso de "acido ascorbico", se entiende que la persona experta en la tecnica puede utilizar el acido ascorbico, ascorbato, una sal del mismo, un tautomero del mismo o un analogo del mismo (descrito mas adelante) en metodos y composiciones descritos en el presente documento.

Se describe un metodo para reducir la formacion de aductos en una muestra que comprende un analito a ser analizado por espectrometna de masas que comprende la etapa de anadir un aditivo reductor de aducto, que comprende acido ascorbico, a la muestra antes del analisis del analito por espectrometna de masas. En una realizacion relacionada, el aditivo reductor de aducto puede comprender ademas oxalato de amonio. El aditivo reductor de aducto se puede utilizar en combinacion con otros aditivos reductores de aducto (aditivos reductores de

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aducto conocidos o aun no descubiertos). El aditivo reductor de aducto se puede utilizar en combinacion con una o mas resinas.

El analito es un acido nucleico tal como el acido desoxirribonucleico o acido ribonucleico. Las mejoras descritas en el presente documento se pueden aplicar a una variedad de formatos de espectrometna de masas como procedimientos de manipulacion de muestras antes de que el analisis de masas pueda generar aductos indeseables. Ejemplos de formatos de espectrometna de masas incluyen, pero no se limitan a, espectrometna de masas (MS) de desorcion/ionizacion laser asistida por matriz-tiempo de vuelo (MALDI-TOF), espectrometna de masas por desorcion laser (LDMS), MS con electropulverizacion (ES), MS de resonancia con ion ciclotron (ICR), y MS por transformada de Fourier. Las mejoras descritas en el presente documento son facilmente aplicables a los formatos de espectrometna de masas en los que se el analito se volatiliza y se ioniza ("MS de ionizacion", por ejemplo, MS MALDI-TOF, LDMS, ESMS).

Tambien se describe un metodo para reducir la formacion de aductos en una muestra que comprende un analito a ser analizado por espectrometna de masas que comprende la etapa de anadir un aditivo reductor de aducto, que comprende acido ascorbico, a una matriz antes del analisis del analito por espectrometna de masas. El metodo tambien puede comprender la etapa adicional de anadir el aditivo reductor de aducto al analito (asf como la matriz) antes del analisis del analito por espectrometna de masas. El aditivo reductor de aducto puede comprender ademas oxalato de amonio. En algunas realizaciones, la composicion de matriz comprende acido 3-hidroxipicolmico (3-HPA), citrato de diamonio (DAC), o una combinacion de los mismos. El analito es un acido nucleico tal como el acido desoxirribonucleico o acido ribonucleico. El aditivo reductor de aducto tambien se puede anadir al analito.

Se describen metodos para la preparacion de un sustrato adecuado para su uso en la espectrometna de masas que comprende la etapa de depositar un material matriz que comprende un aditivo reductor de aducto sobre el sustrato, en el que el aditivo reductor de aducto comprende acido ascorbico. El aditivo reductor de aducto puede comprender ademas oxalato de amonio. El metodo puede comprender ademas la etapa de sellar el sustrato. Los metodos de sellado de un sustrato incluyen, pero no se limitan a, las condiciones influidas por procesos de envasado, tales como sellado al vacro y sellado por calor, por ejemplo. El metodo puede comprender ademas la etapa de tratar el sustrato con un agente o gas para minimizar la oxidacion. El sustrato se puede lavar con un gas inerte, por ejemplo argon, antes del sellado. El sustrato se puede sellar y/o empaquetar para limitar o eliminar la exposicion a la luz o la radiacion UV antes del analisis por espectrometna de masas. El sustrato se puede sellar y/o empaquetar para mantener un pH dado. Los sustratos se pueden empaquetar en un recipiente, incluyendo sin limitacion, un recipiente de polfmero (por ejemplo, recipiente de polietileno, polipropileno, poliestireno). El sustrato puede comprender sflice o dioxido de silicio.

Tambien se describen composiciones para ser analizadas por espectrometna de masas que comprenden un analito y un aditivo reductor de aducto. El aditivo reductor de aducto comprende acido ascorbico. El aditivo reductor de aducto puede comprender ademas oxalato de amonio.

Se describe una composicion adecuada para el analisis por espectrometna de masas que comprende un analito y un aditivo reductor de aducto, en el que el aditivo comprende el acido ascorbico. La composicion tambien puede comprender oxalato de amonio.

Se describe un sitio diana para la espectrometna de masas que comprende un sustrato y un aditivo reductor de aducto que comprende acido ascorbico. El sitio diana tambien puede comprender oxalato de amonio. El sitio diana puede comprender ademas un material de matriz. El material de matriz se puede pre-cargar en el sustrato. El sitio diana puede comprender ademas un analito. La composicion se puede sellar. Los metodos de sellado de sustratos incluyen, pero no se limitan a, sellado al vacro y sellado por calor. La composicion se puede tratar con un agente o gas para minimizar la oxidacion. La composicion se puede lavar con un gas inerte, por ejemplo argon, antes del sellado. La composicion se puede sellar y/o empaquetar para limitar o eliminar la exposicion a la luz o radiacion UV. La composicion se puede sellar y/o empaquetar para mantener un pH dado.

Tambien se describe un metodo para la preparacion de un analito para el analisis por espectrometna de masas, que comprende: (a) poner en contacto una solucion que comprende un analito con una composicion que comprende acido ascorbico, o una sal, tautomero o analogo del mismo, preparando de este modo una muestra para el analisis por espectrometna de masas; y (b) la introduccion de la muestra a un espectrometro de masas. La composicion tambien puede comprender oxalato de amonio. El analito a veces es un acido nucleico, incluyendo, pero no limitado a un acido desoxirribonucleico, un acido ribonucleico y similar, o una combinacion de los mismos. El analisis por espectrometna de masas se puede seleccionar del grupo que consiste de: espectrometna de masas por desorcion/ionizacion laser asistida por matriz-tiempo de vuelo (MALDI-TOF), espectrometna de masas por desorcion laser (LDMS), espectrometna de masas por electropulverizacion (ES), espectrometna de masas de resonancia con ion ciclotron (ICR), y espectrometna de masas por transformada de Fourier. La composicion puede comprender acido ascorbico, y la composicion puede no comprender un analogo del acido ascorbico.

En el presente documento tambien se proporciona un metodo para el analisis de un analito mediante espectrometna de masas, que comprende: (a) introducir una muestra en un espectrometro de masas, en el que la muestra comprende un analito y acido ascorbico, o una sal, tautomero o analogo del mismo; y (b) el analisis de la muestra

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mediante espectrometna de masas, en el que dicho analogo es como se define en las reivindicaciones. En algunas realizaciones, la muestra comprende, ademas, oxalato de amonio. El analito es un acido nucleico, incluyendo, pero no limitado a un acido desoxirribonucleico, un acido ribonucleico y similar, o una combinacion de los mismos. En algunas realizaciones, la muestra comprende un analito y acido ascorbico.

En el presente documento tambien se proporciona un sustrato que comprende una matriz de puntos, en el que cada punto comprende (i) espectrometna de masas por desorcion/ionizacion laser asistida por matriz (MALDI) y (ii) acido ascorbico, o una sal, tautomero o analogo del mismo, matriz y analogo que son tal como se define en las reivindicaciones. En algunas realizaciones, cada punto comprende ademas oxalato de amonio, y en ciertas realizaciones, uno o mas de los puntos comprenden, ademas, un analito. El analito es un acido nucleico, incluyendo, pero no limitado a un acido desoxirribonucleico, un acido ribonucleico y similar, o una combinacion de los mismos. En algunas realizaciones, la matriz comprende acido 3-hidroxipicolmico (3-HPA), u otra matriz adecuada para el analisis de un acido nucleico mediante espectrometna de masas MALDI. Las composiciones de puntos que incluyen acido ascorbico y una matriz (por ejemplo, 3-HPA) pueden absorber la luz ultravioleta (por ejemplo, absorben la luz UV de aproximadamente 220 nm a aproximadamente 300 nm (por ejemplo, de aproximadamente 260 nm a aproximadamente 270 nm; 266 nm)). La matriz puede comprender un componente adecuado para la protema o peptido por espectrometna de masas MALDI, incluyendo, pero no limitado a, acido ferulico, acido sinapico, acido alfa-ciano-3-hidroxi-cinamico, y acido alfa-ciano-4-hidroxi-cinamico. En ciertas realizaciones, el sustrato es un chip (por ejemplo, un chip de silicio). Cada punto puede comprender acido ascorbico, y cada punto puede no comprender un analogo del acido ascorbico.

Ejemplos del analisis por espectrometna de masas que se pueden mejorar por los metodos y composiciones de la invencion incluyen, pero no se limitan a, secuenciacion, genotipado o analisis por metilacion de acidos nucleicos. El analisis puede ser un analisis cualitativo o cuantitativo realizado por espectrometna de masas.

La FIG. 1 muestra un espectro de masas generado utilizando un oligonucleotido sintetico de 17 meros (GTG GTG GTG GTG GTG GT) detectado directamente sobre la matriz convencional sin modificar. En la figura, se identifico la presencia de un aducto de amoniaco (la altura del pico es de aproximadamente el 12% del pico principal a 5335 Da).

La FIG. 2 muestra un espectro de masas generado utilizando el mismo oligonucleotido sintetico de 17 meros (GTG GTG GTG GTG gTg GT) detectado directamente sobre la matriz modificada con acido ascorbico. Como se ve en la figura, el aducto de amoniaco ya no esta presente.

La FIG. 3 muestra un espectro de masas generado a partir de un producto de extension del gen RhD visto sobre una matriz convencional sin modificar que resulta en un pico de extension a 7571 Da y un pico del aducto + 55 Da (NH3 + K) a 7626 Da. El pico del aducto genera una llamada de insercion falso positivo (RSR: 2; Probabilidad: 88 %).

La FIG. 4 muestra un espectro de masas generado a partir de un producto de extension del gen RhD visto sobre la matriz modificada con acido ascorbico que resulta en un pico de extension a 7571 Da, pero sin ningun pico de aducto + 55 Da. Se elimina la llamada de insercion falso positivo (RSR: 0; Probabilidad: 0 %).

La espectrometna de masas ofrece una forma muy precisa y sensible para medir la masa molecular de analitos tales como acidos nucleicos y peptidos. La espectrometna de masas de esta manera proporciona una herramienta poderosa para el analisis de moleculas de otro modo diffciles de medir. Sin embargo, la presencia de productos de aductos no deseados puede hacer que un analito sea difmil de detectar y analizar con precision, especialmente analitos de baja masa o en baja cantidad. El problema se agrava aun mas cuando se detectan varios analitos en un solo espectro de masas como parte de la reaccion de multiplexado.

Los aductos se forman cuando los iones, normalmente cationes, se asocian a biomoleculas en condiciones de espectrometna de masas, creando asf picos de masa no deseados. Cualquier parte del procesamiento de la muestra (por ejemplo, la bioqmmica, la manipulacion de la muestra, la dispensacion de muestra, etc.), la limpieza de la muestra (por ejemplo, la adicion de resina), la ionizacion de la muestra, o la deteccion de la muestra puede contribuir a la formacion de aductos.

En el caso de espectrometna de masas de desorcion/ionizacion laser asistida por matriz (MALDI), el propio material de la matriz puede servir como fuente de formacion de aductos. Por ejemplo, a menudo se utiliza una mezcla de acido 3-hidroxipicolmico (3-HPA) y citrato de diamonio (DAC) como matriz UV eficaz para el analisis de acidos nucleicos basado en MALDI. Las sales de amonio (por ejemplo, DAC) se anaden a las matrices, y al 3-HPA en particular, porque se sabe que reducen aun mas la formacion de aducto cationico a ADN de cadena sencilla (ssDNA) (Wu, JK, et al., Rapid Comm. Mass Spectrom 1993, 7, 191.; Pieles, et al., Nucleic Acid Research, 1993, 21, 14, 3191). Sin embargo, los resultados proporcionados en el presente documento indican que el DAC es la principal fuente para la formacion de aductos de amoniaco (NH3). Por ejemplo, la Figura 1 muestra la presencia de un pico de masa de aducto de NH3 a + 17 Da de los espectros de masas.

Otro factor que contribuye a la formacion de aducto de amoniaco es la resina de intercambio cationico amoniacal, que se puede utilizar para desalar el analito antes del analisis MALDI (Nordhoff, E., et al., Rapid Comm. Mass Spectrom. 1992, 6, 771). Como se describe en los Ejemplos a continuacion, los aductos de amoniaco se forman

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predominantemente con bases de guanina y timina. Por lo tanto, estos aductos son mas pronunciados en ensayos en los que los analitos de acido nucleico son ricos en estas bases.

Ademas, la resina de intercambio cationico con amoniaco puede no eliminar por completo todos los iones de sodio de la cadena principal del ADN. Esta falta de eliminacion da lugar a un pico de masa de aducto de iones de sodio a + 22 Da. Otros aductos se pueden formar a partir del material de la matriz, y pueden ser mas comunes en presencia de bases de timina. Por ejemplo, cuando como matriz se utiliza el acido 3-hidroxipicolmico, se encuentran picos de masa de aducto a 94, 138, y 188 Da. Juntos, todos estos picos de aductos pueden dar lugar a una mala interpretacion de los resultados de la espectrometna de masas. Por lo tanto composiciones y procesos que reducen en gran medida la cantidad y frecuencia de los aductos, en especial aductos alcalinos y de amoniaco, son utiles para mejorar la precision, la sensibilidad y el rendimiento del analisis basado en espectrometna de masas. La presencia de un aditivo reductor de aducto puede reducir, o abrogar, un pico de aducto presente en una muestra analizada sin aditivo reductor de aducto. Como se muestra en el presente documento, se ha demostrado que la adicion de acido ascorbico reduce la puntuacion promedio de formacion de aductos (definido en el presente documento) en hasta un 40 % en comparacion con una matriz convencional tratada con resina a intensidades de productos de extension comparables (veanse los Ejemplos 1-3). Ademas, la matriz modificada con aditivo de acido ascorbico ha demostrado ser ffsica y qmmicamente estable durante un penodo de 6 meses (vease el Ejemplo 4) que permite que los sustratos se traten previamente con acido ascorbico durante la fabricacion.

Analito

Se describe la mejora del analisis basado en espectrometna de masas de analitos tales como acidos nucleicos, (por ejemplo, oligonucleotidos y polinucleotidos), protemas, peptidos y lfpidos, incluyendo sus analogos y conjugados particulares, tales como glicoprotemas o lipoprotemas. Otras sustancias que pueden ser susceptibles de analisis MALDI dentro de las presentes ensenanzas son moleculas pequenas, metabolitos, productos naturales y productos farmaceuticos. Los metodos y composiciones de la presente invencion son particularmente utiles para polinucleotidos que comprenden una mayona de guaninas y timinas ya que estos polinucleotidos son mas susceptibles a la formacion de aducto de amoniaco.

Tal como se utiliza en el presente documento, el termino "acido nucleico" se refiere a polinucleotidos de cadena sencilla y/o de doble cadena, tales como acido desoxirribonucleico (ADN) y acido ribonucleico (ARN), asf como analogos o derivados del ARN o ADN. Tambien se incluye en el termino "acido nucleico" analogos de acidos nucleicos tales como acido nucleico peptfdico (PNA), ADN fosforotioato, nucleotidos adclicos y otros de dichos analogos y derivados o combinaciones de los mismos.

Los analogos de nucleotidos contenidos en un polinucleotido pueden ser, por ejemplo, los nucleotidos de masa modificada, que permiten la diferenciacion de la masa de los polinucleotidos; nucleotidos que contienen un marcador detectable tal como un marcador fluorescente, radiactivo, luminiscente o quimioluminiscente, que permite la deteccion de un polinucleotido; o nucleotidos que contienen un grupo reactivo, tal como biotina o un grupo tiol, que facilita la inmovilizacion de un polinucleotido a un soporte solido. Un polinucleotido tambien puede contener uno o mas enlaces a la cadena principal que se pueden escindir selectivamente, por ejemplo, qrnmica, enzimatica o fotolfticamente. Por ejemplo, un polinucleotido puede incluir uno o mas desoxirribonucleotidos, seguidos de uno o mas ribonucleotidos, que pueden ir seguidos por uno o mas desoxirribonucleotidos, una secuencia de este tipo que se puede escindir en la secuencia de ribonucleotidos por hidrolisis basica. Un polinucleotido tambien puede contener uno o mas enlaces que son relativamente resistentes a la escision, por ejemplo, un cebador de oligonucleotido quimerico, que puede incluir nucleotidos unidos por enlaces de acidos nucleicos peptfdicos y al menos un nucleotido en el extremo 3', que esta unido por un enlace fosfodiester, o similar, y se puede extender por una polimerasa.

Muestra

Tal como se usa en el presente documento, "muestra" se refiere a una composicion que contiene un analito a analizar. En ciertas realizaciones, la muestra es de una "muestra biologica". Un material biologico en general se considera cualquier material obtenido de una fuente viva (por ejemplo, un ser humano, animal, planta, bacteria, hongo, protista, virus). La muestra biologica puede estar en cualquier forma, incluyendo materiales solidos (por ejemplo, tejidos, sedimentos celulares y biopsias) y fluidos biologicos (por ejemplo, orina, sangre, saliva, lfquido amniotico y lavado de la boca (que contienen celulas bucales)). Preferentemente los materiales solidos se mezclan con un fluido.

Matriz

El material de la matriz se utiliza en ciertas formas de espectrometna de masas, como la espectrometna MALDI, por ejemplo. El material de la matriz sirve para separar entre sf las moleculas de analito, para absorber la energfa conferida por los fotones laser, y para transferir la energfa a las moleculas de analito, lo que resulta en su desorcion e ionizacion. Una vez que se ioniza el analito, se puede utilizar un espectrometro de masas tal como un analizador tiempo de vuelo (TOF) para medir masas de iones.

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La eleccion de un material de matriz para el analisis por espectrometna de masas a menudo depende del tipo de biomoleculas analizadas. Por ejemplo, para el analisis de acidos nucleicos por espectrometna de masas, una matriz que se utiliza a menudo es una mezcla de acido 3-hidroxipicolmico (3-HPA) y citrato de diamonio (DAC). Otro material de matriz utilizado para facilitar la ionizacion de analitos de la muestra es el acido 2,5-dihidroxibenzoico (DHB). El DHB tambien sufre de la formacion de aductos y la generacion de ruido qmmico que interfiere con el analisis de la muestra. El acido alfa-ciano-4-hidroxicinamico (a-CHCA) es un ejemplo de una matriz ampliamente utilizada para la ionizacion de analitos de protemas y peptidos en espectrometna de masas laser asistida por matriz- tiempo de vuelo. Sin embargo, los aductos de alfa-CHCA son comunes y pueden interferir con la capacidad para detectar con precision analitos de baja masa y en bajas cantidades. Se describen matrices adicionales que se pueden utilizar con aditivos captadores de radicales libres descritos en el presente documento para el mejor analisis por espectrometna de masas por Li et al. (Rapid Comm. Mass Spectrom. 12:993-998 (1998), M.C. Fitzgerald y L.M. Smith (Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struc. 1995. 24: 117-40), y Nordhoff et al. (Mass Spectrometry Reviews, 1996, 15, 67-138; todos los cuales se incorporan en el presente documento como referencia), y los ejemplos de matrices incluyen, sin limitacion, 2,4,6-trihidroxiacetofenona (THAP), acido antramlico, acido nicotmico, salicilamida, 1- isoquinolinol, T-2-(3-(4-t-butil-fenil)-2-metil-2-propenilideno) malononitrilo (DCTB), acido sinapico (SA), ditranol (DIT), 3-aminoquinolina, acido trans-3-indolacnlico (IAA), acido 2-(4-hidroxifenilazo) benzoico (HABA), acido succmico, 2,6- dihidroxiacetofenona, acido ferulico, acido cafeico, glicerol y nitroanilina.

El material de matriz puede combinarse con aditivo(s) o analito(s) antes o despues de que la matriz se deposite sobre un sustrato. Cuando los analitos estan embebidos en una matriz de material absorbente de la luz, la matriz generalmente esta presente en exceso con respecto al analito. La incorporacion de moleculas de analito en una cierta forma en materiales de matriz normalmente cristalinos durante su cristalizacion, o al menos en las superficies lfmite entre los pequenos cristales de la matriz, es ventajosa para el proceso MALDI. El aditivo se puede mezclar primero con el material de la matriz en solucion, y la solucion de material de matriz/aditivo combinado se deposita sobre el sustrato donde cristaliza.

La matriz se puede depositar sobre el sustrato para formar puntos discretos mediante la disolucion de la matriz en una solucion que comprende acido ascorbico y un disolvente adecuado, tal como agua. La solucion resultante se deposita sobre el sustrato MALDI y el sustrato se puede colocar en una camara de vado de tal manera que la solucion de matriz/acido ascorbico se seca al vado. El acido ascorbico puede servir como material de la matriz -solo o en combinacion con otras matrices.

Para depositar la matriz, el aditivo o el analito a un sustrato se pueden utilizar varios metodos. En una realizacion, la aplicacion de cada elemento se realiza en pasos separados. Por ejemplo, el material de la matriz se puede precargar sobre un sustrato y el analito se puede anadir en un momento posterior usando un aparato de dispensacion de lfquido apropiado (por ejemplo, dispositivos de dispensacion de una herramienta pin piezoelectrica). Los elementos se pueden depositar en combinacion. Por ejemplo, la matriz y el aditivo se pueden combinar primero (es decir, disueltos en un disolvente) y se pueden depositar juntos sobre el sustrato, seguido de la adicion de un analito. Se puede permitir que una matriz o deposito de matriz/aditivo se seque sobre un sustrato, formando cristales de matriz a medida que se evapora el disolvente. La deposicion subsiguiente de la solucion de analito en la parte superior de la matriz seca da lugar a la disolucion parcial del deposito de matriz seca y la co-cristalizacion de la matriz re-disuelta con el analito.

El aditivo reductor de aducto se puede utilizar directamente como material de matriz, y en algunas realizaciones, el aditivo reductor de aducto se utiliza como componente de un material de matriz. El material de la matriz puede incluir aditivo reductor de aducto y uno o mas de los materiales de matriz de espectrometna de masas descritos en el presente documento (por ejemplo, uno o mas de 3-HPA, DAC, DHB, CHcA, THAP, DCTB, DIT, SA, IAA, HABA). Cuando se utiliza aditivo reductor de aducto con uno o mas materiales de matriz de espectrometna de masas, el aditivo reductor de aducto oscila entre el 99 % y el 1 % en peso del peso total del material de matriz (por ejemplo, aproximadamente el 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 % 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % o 95 % en peso del peso total del material de matriz), y algunas veces el aditivo reductor de aducto se encuentra en una relacion molar (es decir, moles de aditivo a moles de matriz de espectrometna de masa) de aproximadamente 1:20, 1:19, 1:18, 1:17, 1:16, 1:15, 1:14, 1:13, 1:12, 1:11, 1:10, 1:9, 1:8, 1:7, 1:6, 1:5, 1:4, 1:3 o 1:2, por ejemplo.

Aditivo

Tal como se utiliza en el presente documento, el termino "aditivo reductor de aducto" es una sustancia anadida a uno cualquiera o mas de los componentes o reactivos necesarios para el analisis por espectrometna de masas. Estos componentes o reactivos incluyen la muestra, el analito, el material de la matriz, el sustrato o combinaciones de los mismos. En ciertas realizaciones, el aditivo reductor de aducto es acido ascorbico, o cualquier derivado del mismo con esencialmente el mismo efecto reductor de aducto.

El aditivo reductor de aducto puede ser un captador de radicales libres. Se puede utilizar cualquier captador de radicales libres adecuado para su uso en el analisis por espectrometna de masas, y, en ciertos casos, adecuado para su uso en el analisis por espectrometna de masas de acidos nucleicos. Ejemplos de captadores de radicales

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libres incluyen, sin limitacion, acido ascorbico, retinol, tocotrienol, tocoferol, la coenzima Q10, la melatonina, el licopeno, la lutema, el alfa-caroteno, el beta-caroteno, la zeaxantina, la astaxantina, la cantaxantina, flavonas (por ejemplo, luteolina, apigenina, tangeritin), favonoles (por ejemplo, la quercetina, el kaempferol, la miricetina, la isorhamnetina, proantocianidinas), favanonas (por ejemplo, hasperetina, naringenina, eriodictiol), los fitoestrogenos de isoflavonas (por ejemplo, la genistema, la daidzema, la glicitema), estilbenoides (por ejemplo, el resveratrol, el pterostilbeno), antocianinas (por ejemplo, cianidina, delfinidina, malvidina, pelargonidina, peonidina, petunidina), acidos y esteres fenolicos (por ejemplo, acido elagico, acido galico, acido salidlico, acido rosmarmico, acido cinamico, acido clorogenico, acido chicorico, galotaninos, elagitaninos), fenolicos no flavonoides (por ejemplo, la curcumina, xantonas, la silimarina, el eugenol) y antioxidantes organicos (por ejemplo, acido dtrico, acido oxalico, acido fftico, lignanos, acido urico, N-acetilcistema). La persona experta en la tecnica puede identificar facilmente captadores de radicales libres que son adecuados como aditivo o matriz para espectrometna de masas mediante pruebas rutinarias de tales captadores en analisis en paralelo, como se muestra en los Ejemplos en el presente documento.

El aditivo puede estar esencialmente libre de impurezas y por lo tanto no necesita su purificacion. Si el aditivo reductor de aducto no es esencialmente puro, se puede purificar por metodos conocidos en la tecnica para eliminar las impurezas, por ejemplo, por purificacion en resina de intercambio ionico.

El aditivo se puede disolver en forma lfquida (por ejemplo, disuelto en agua) y a continuacion se puede depositar sobre la matriz precargada o se puede depositar directamente sobre el sustrato sin matriz precargada. Como alternativa, el aditivo puede combinarse con la matriz antes de depositarla sobre el sustrato. El aditivo y la matriz se pueden combinar para obtener una concentracion de la matriz de 1 a aproximadamente 20 mg/ml y una concentracion de aditivo de aproximadamente 5 a aproximadamente 50 mM. El uso de cantidades insuficientes de aditivo no reducira significativamente la formacion de aductos, mientras que el uso de demasiado aditivo puede suprimir las senales originales en los espectros de masas. Los expertos en la tecnica son capaces de determinar sin excesiva experimentacion la cantidad apropiada de aditivo para optimizar el analisis de un analito en particular mediante la variacion de la cantidad de aditivo y determinar el efecto sobre las caractensticas espectrales.

El aditivo reductor de aducto se puede utilizar solo o en combinacion con otras sustancias que reducen o eliminan la presencia de aductos no deseados. El aditivo de acido ascorbico se puede combinar con otros aditivos capaces de reducir el ruido de fondo en los espectros de masas. Otros aditivos adecuados conocidos incluyen resina, sales de amonio volatiles, particularmente sales volatiles de amonio monobasico, dibasico o tribasico. Preferentemente, los aditivos de sal no son demasiado basicos como para que interfieran con la muestra que se analiza. Los aditivos pueden ser fosfatos y sulfatos monobasicos (por ejemplo, fosfato de amonio monobasico), y citratos dibasicos (por ejemplo, citrato de amonio dibasico), y citratos tribasicos (por ejemplo, citrato de amonio tribasico).

El aditivo reductor de aducto es acido ascorbico, ascorbato, una sal del mismo, un tautomero del mismo, o un analogo del acido ascorbico (incluyendo sales y tautomeros de analogos), que tiene una estructura de acuerdo con la siguiente formula:

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en la que:

R1 y R2 son independientemente OH, halogeno, R3, OR3, azido, ciano, CH2R3, CHR3R4, SR3, NR3R4; y R3 y R4 son independientemente H, alquilo, acetileno o ciano, o un anillo carbodclico de arilo, un anillo heterodclico de arilo, un anillo carbodclico no arilo o un anillo heterodclico no arilo opcionalmente sustituidos. Los analogos del acido ascorbico usados tal como se usa en el presente documento generalmente son agentes de captacion de radicales libres, y la actividad de captacion de radicales libres de un analogo del acido ascorbico se puede determinar por la persona experta en la tecnica (por ejemplo, valoracion con un agente de oxidacion tal como 2,6-diclorofenol-indofenol (DCPlP), yodo, mezcla de yodato y yoduro o N-bromosuccinimida).

El termino "opcionalmente sustituido" como se usa en el presente documento indica que el grupo o grupos particulares descritos pueden no tener sustituyentes distintos del hidrogeno, o el grupo o grupos pueden tener uno o mas sustituyentes que no son hidrogeno. Si no se especifica lo contrario, el numero total de tales sustituyentes que pueden estar presentes es igual al numero de atomos de H presentes en la forma no sustituida del grupo que se describe. Cuando un sustituyente opcional esta unido a traves de un doble enlace, tal como un oxfgeno de carbonilo

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(=O), el grupo ocupa dos valencias disponibles, por lo que el numero total de sustituyentes que pueden estar incluidos se reduce de acuerdo con el numero de valencias disponibles.

El acido ascorbico y sus analogos pueden tener grupos ionizables a fin de poder prepararse en forma de sales. En ese caso, cuando se haga referencia al compuesto, se entiende en la tecnica que tambien se puede utilizar una sal farmaceuticamente aceptable. Estas sales pueden ser sales de adicion de acido que implican acidos inorganicos u organicos o, en el caso de las formas acidas de los compuestos de la invencion, las sales pueden prepararse a partir de bases inorganicas u organicas. Con frecuencia, los compuestos se preparan o utilizan como sales farmaceuticamente aceptables preparadas como productos de adicion de acidos o bases farmaceuticamente aceptables. Los acidos y bases farmaceuticamente aceptables adecuados son bien conocidos en la tecnica, tales como los acidos clortudrico, sulfurico, bromtudrico, acetico, lactico, cftrico, o tartarico para formar sales de adicion de acido, y el hidroxido de potasio, hidroxido de sodio, hidroxido de amonio, la cafema, varias aminas, y similares para formar sales basicas. Los metodos para la preparacion de las sales apropiadas estan bien establecidos en la tecnica. En algunos casos, los compuestos pueden contener tanto un acido como un grupo funcional basico, en cuyo caso se pueden tener dos grupos ionizados y, sin embargo, no tener carga neta.

Los analogos del acido ascorbico a menudo contienen uno o mas centros quirales. La invencion incluye cada una de las formas estereoisomericas aisladas, asf como mezclas de estereoisomeros en diversos grados de pureza quiral, incluyendo mezclas racemicas. Tambien abarca los diversos diastereomeros y tautomeros que se pueden formar. Tambien pueden existir los compuestos de la invencion en mas de una forma tautomerica; la representacion en el presente documento de un tautomero es solo por conveniencia, y tambien se entiende que abarca otros tautomeros de la forma mostrada.

Tal como se utiliza en el presente documento, los terminos "alquilo", "alquenilo" y "alquinilo" incluyen radicales hidrocarbilo monovalentes de cadena lineal, de cadena ramificada y dclica, y combinaciones de estos, que contienen solo C y H cuando estan sin sustituir. Los ejemplos incluyen metilo, etilo, isobutilo, ciclohexilo, ciclopentiletilo, 2-propenilo, 3-butinilo, y similares. El numero total de atomos de carbono en cada uno de estos grupos a veces se describe en el presente documento, por ejemplo, cuando el grupo puede contener hasta diez atomos de carbono que pueden representarse por C1-10 o como C1-C10 o C1-10. Cuando se permiten heteroatomos (normalmente N, O y S) para sustituir atomos de carbono, como en los grupos heteroalquilo, por ejemplo, los numeros que describen el grupo, aunque todavfa escrito por ejemplo como C1-C6, representan la suma del numero de atomos de carbono en el grupo mas el numero de dichos heteroatomos que se incluyen como sustitutos de los atomos de carbono en la cadena principal del anillo o de la cadena descritos.

Normalmente, los sustituyentes alquilo, alquenilo y alquinilo de la invencion contienen un 10C (alquilo) o dos 10C (alquenilo o alquinilo). Preferentemente contienen un 8C (alquilo) o dos 8C (alquenilo o alquinilo). A veces contienen un 4C (alquilo) o dos 4C (alquenilo o alquinilo). Un solo grupo puede incluir mas de un tipo de enlace multiple, o mas de un enlace multiple; tales grupos se incluyen dentro de la definicion del termino "alquenilo" cuando contienen al menos un doble enlace carbono-carbono, y se incluyen dentro del termino "alquinilo" cuando contienen al menos un triple enlace un carbono-carbono.

Los grupos alquilo, alquenilo y alquinilo con frecuencia estan opcionalmente sustituidos en la medida en que dicha sustitucion tenga sentido qmmicamente. Los sustituyentes tfpicos incluyen, pero no se limitan a, halo, =O, =N-CN, =N-OR, =NR, OR, NR2, SR, SO2R, SO2NR2, NRSO2R NRCONR2, NRCOOR, NRCOR, CN, COOR, CONR2, OOCR, COR, y NO2, en las que cada R es independientemente H, alquilo C1-C8, heteroalquilo C2-C8, acilo C1-C8, heteroacilo C2-C8, alquenilo C2-C8, heteroalquenilo C2-C8, alquinilo C2-C8, heteroalquinilo C2-C8, arilo C6-C10 o heteroarilo C5-C10, y cada R esta opcionalmente sustituido con halo, =O =N-CN, =N-OR', =NR', OR', NR'2, SR', SO2R', SO2NR2, NR'SO2R' NR'CONR'2, NR'COOR', NR'COR', CN, COOR', CONR'2, OOCR', COR', y NO2, en las que cada R' es independientemente H, alquilo C1-C8, heteroalquilo C2-C8, acilo C1-C8, heteroacilo C2-C8, arilo C6-C10 o heteroarilo

C5-C10. Los grupos alquilo, alquenilo y alquinilo tambien pueden estar sustituidos con acilo C1-C8, heteroacilo C2-C8, arilo C6-C10 o heteroarilo C5-C10, cada uno de los cuales puede estar sustituido con los sustituyentes que son apropiados para el grupo particular.

Los sustituyentes "acetileno" son grupos alquinilo C2-10 que estan opcionalmente sustituidos, y son de la formula - C=C-Ra, en el que Ra es H o alquilo C1-C8, heteroalquilo C2-C8, alquenilo C2-C8, heteroalquenilo C2-C8, alquinilo C2- C8, heteroalquinilo C2-C8, acilo C1-C8, heteroacilo C2-C8, arilo C6-C10, heteroarilo C5-C10, arilalquilo C7-C12, o

heteroarilalquilo C6-C12, y cada grupo Ra esta opcionalmente sustituido con uno o mas sustituyentes seleccionados entre halo, =O, =N-CN, =N-OR', =NR', OR', NR'2, SR', SOZR', SO2NR'2, NR'SO2R', NR'CONR'2, NR'COOR', NR'COR', CN, COOR', CONR'2, OOCR', COR', y NO2, en las que cada R' es independientemente H, alquilo C1-C6, heteroalquilo C2-C6, acilo C1-C6, heteroacilo C2-C6, arilo C6-C10, heteroarilo C5-C10, arilalquilo C7-12, o

heteroarilalquilo C6-12, cada uno de los cuales esta opcionalmente sustituido con uno o mas grupos seleccionados entre halo, alquilo C1-C4, heteroalquilo C1-C4, acilo C1-C6, heteroacilo C1-C6, hidroxi, amino, y =O; y en el que dos R' pueden estar unidos para formar un anillo de 3-7 miembros que contiene opcionalmente hasta tres heteroatomos seleccionados entre N, O y S. En algunas realizaciones, Ra de -C=C-Ra es H o Me.

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"Heteroalquilo", "heteroalquenilo", y "heteroalquinilo" y similares se definen de manera similar a los grupos hidrocarbilo correspondientes (alquilo, alquenilo y alquinilo), pero los terminos "hetero" se refieren a grupos que contienen de uno a tres heteroatomos de O, So No combinaciones de los mismos dentro del resto de la cadena principal; por lo tanto al menos un atomo de carbono de un alquilo, alquenilo, o alquinilo correspondiente se sustituye con uno de los heteroatomos especificados para formar un grupo heteroalquilo, heteroalquenilo, o heteroalquinilo. Los tamanos tfpicos y preferidos para las heteroformas de los grupos alquilo, alquenilo y alquinilo generalmente son las mismas que para los grupos hidrocarbilo correspondientes, y los sustituyentes que pueden estar presentes sobre las heteroformas son los mismos que los descritos anteriormente para los grupos hidrocarbilo. Por razones de estabilidad qrnmica, tambien se entiende que, a menos que se especifique lo contrario, tales grupos no incluyen mas de dos heteroatomos contiguos, excepto cuando un grupo oxo esta presente sobre No S como en un grupo nitro o sulfonilo.

Aunque "alquilo" como se usa en el presente documento incluye grupos cicloalquilo y cicloalquilalquilo, el termino "cicloalquilo" se puede usar tal como se usa en el presente documento para describir un grupo carbodclico no aromatico que esta conectado a traves de un atomo de carbono anular, y "cicloalquilalquilo" se puede utilizar para describir un grupo carbodclico no aromatico que esta conectado a la molecula a traves de un enlazador alquilo. Del mismo modo, "heterociclilo" se puede usar para describir un grupo dclico no aromatico que contiene al menos un heteroatomo como miembro del anillo y que esta conectado a la molecula a traves de un atomo del anillo, que puede ser Co N; y "heterociclilalquilo" se puede usar para describir un grupo tal que esta conectado a otra molecula a traves de un enlazador. Los tamanos y sustituyentes que son adecuados para el grupo cicloalquilo, cicloalquilalquilo, heterociclilo, y heterociclilalquilo son los mismos que los descritos anteriormente para los grupos alquilo. Tal como se usa en el presente documento, estos terminos tambien incluyen anillos que contienen uno o dos dobles enlaces, siempre que el anillo no sea aromatico.

Tal como se usa en el presente documento, "acilo" incluye grupos que comprenden un grupo alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo o arilalquilo unido en una de las dos posiciones de valencia disponibles de un atomo de carbono carbomlico, y heteroacilo se refiere a los grupos correspondientes en los que al menos un carbono que no sea el carbono carbomlico se ha reemplazado por un heteroatomo seleccionado entre N, O y S. Por lo tanto heteroacilo incluye, por ejemplo, -C(=O)OR y -C(=O)NR2, asf como -C(=O)-heteroarilo.

Los grupos acilo y heteroacilo estan unidos a cualquier grupo o molecula a la que se unen a traves de la valencia abierta del atomo de carbono carbomlico. Normalmente, son grupos acilo C1-C8, que incluyen formilo, acetilo, pivaloilo, y benzoilo, y grupos heteroacilo C2-C8, que incluyen metoxiacetilo, etoxicarbonilo, y 4-piridinoilo. Los grupos hidrocarbilo, grupos arilo, y heteroformas de tales grupos que comprenden un grupo acilo o heteroacilo pueden estar sustituidos con los sustituyentes descritos en el presente documento como sustituyentes adecuados en general para cada uno de los componentes correspondientes del grupo acilo o heteroacilo.

Resto "aromatico" o resto "arilo" se refiere a un resto monodclico o bidclico condensado que tiene las caractensticas conocidas de aromaticidad; los ejemplos incluyen fenilo y naftilo. Del mismo modo, "heteroaromatico" y "heteroarilo" se refieren a tales sistemas de anillos bidclicos condensados que contienen como miembros del anillo monodclico uno o mas heteroatomos seleccionados entre O, S y N. La inclusion de un heteroatomo permite la aromaticidad en anillos de 5 miembros asf como en anillos de 6 miembros. Los sistemas heteroaromaticos tfpicos incluyen grupos aromaticos C5-C6 monodclicos tales como piridilo, pirimidilo, pirazinilo, tienilo, furanilo, pirrolilo, pirazolilo, tiazolilo, oxazolilo, e imidazolilo y los restos bidclicos condensados formados por la fusion de uno de estos grupos monodclicos con un anillo de fenilo o con cualquiera de los grupos monodclicos heteroaromaticos para formar un grupo bidclico C8-C10 tal como indolilo, bencimidazolilo, indazolilo, benzotriazolilo, isoquinolilo, quinolilo, benzotiazolilo, benzofuranilo, pirazolopiridilo, quinazolinilo, quinoxalinilo, cinolinilo, y similares. En esta definicion esta incluido cualquier sistema de anillo monodclico o bidclico condensado que tenga las caractensticas de aromaticidad en terminos de distribucion de electrones a lo largo del sistema de anillo. Tambien incluye grupos bidclicos en los que al menos el anillo que esta unido directamente al resto de la molecula tiene las caractensticas de aromaticidad. Por lo general, los sistemas de anillos contienen anillos de 5-12 atomos. Preferentemente, los heteroarilos monodclicos contienen de 5-6 miembros en el anillo, y los heteroarilos bidclicos contienen de 8-10 miembros en el anillo.

Los restos arilo y heteroarilo pueden estar sustituidos con una variedad de sustituyentes que incluyen alquilo C1-C8, alquenilo C2-C8, alquinilo C2-C8, arilo C5-C12, acilo C1-C8, y heteroformas de los mismos, cada uno de los cuales puede estar a su vez adicionalmente sustituido; otros sustituyentes para restos arilo y heteroarilo incluyen halogeno, OR, NR2, SR, SO2R, SO2NR2 NRSO2R NRCONR2, NRCOOR, NRCOR, CN, COOR, CONR2, OOCR, COR, y NO2, en el que cada R es independientemente H, alquilo C1-C8, heteroalquilo C2-C8, alquenilo C2-C8, heteroalquenilo C2- C8, alquinilo C2-C8, heteroalquinilo C2-C8, arilo C6-C10, heteroarilo C5-C10, arilalquilo C7-C12, o heteroarilalquilo C6-C12, y cada R esta opcionalmente sustituido como se ha descrito anteriormente para los grupos alquilo. Los grupos sustituyentes en un grupo arilo o heteroarilo, por supuesto, pueden estar sustituidos adicionalmente con los grupos descritos en el presente documento como adecuados para cada tipo de dichos sustituyentes o para cada componente del sustituyente. Asi, por ejemplo, un sustituyente arilalquilo puede estar sustituido en la porcion arilo con sustituyentes descritos en el presente documento como tfpicos para grupos arilo, y puede estar adicionalmente

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sustituido en la porcion alquilo con sustituyentes descritos en el presente documento como tipicos o adecuados para los grupos alquilo.

Del mismo modo, "arilalquilo" y "heteroarilalquilo" se refieren a sistemas de anillos aromaticos y heteroaromaticos que estan unidos a su punto de union a traves de un grupo de union tal como un grupo alquileno, incluyendo enlazadores sustituidos o no sustituidos, saturados o insaturados, dclicos o adclicos. Normalmente, el enlazador es alquilo C1-C8 o una forma hetero del mismo. Estos enlazadores tambien pueden incluir un grupo carbonilo, lo que los hace capaces de proporcionar los sustituyentes como un resto acilo o heteroacilo. Un anillo de arilo o heteroarilo en un grupo arilalquilo o heteroarilalquilo puede estar sustituido con los mismos sustituyentes descritos anteriormente para los grupos arilo. Preferentemente, un grupo arilalquilo incluye un anillo fenilo opcionalmente sustituido con los grupos definidos anteriormente para los grupos arilo y un alquileno C1-C4 que no esta sustituido o esta sustituido con uno o dos grupos alquilo C1-C4 o grupos heteroalquilo, en los que los grupos alquilo o heteroalquilo opcionalmente se pueden ciclar para formar un anillo tal como ciclopropano, dioxolano, u oxaciclopentano. Del mismo modo, un grupo heteroarilalquilo incluye, preferentemente, un grupo heteroarilo monodclico C5-C6 que esta opcionalmente sustituido con los grupos descritos anteriormente como sustituyentes tfpicos en los grupos arilo y un alquileno C1-C4 que no esta sustituido o esta sustituido con uno o dos grupos alquilo C1-C4 o grupos heteroalquilo, o incluye un anillo fenilo opcionalmente sustituido o un heteroarilo monodclico C5-C6 y un heteroalquileno C1-C4 que no esta sustituido o esta sustituido con uno o dos grupos alquilo o heteroalquilo C1-C4, en los que los grupos alquilo o heteroalquilo opcionalmente se pueden ciclar para formar un anillo tal como ciclopropano, dioxolano, u oxaciclopentano.

Cuando un grupo arilalquilo o heteroarilalquilo se describe como opcionalmente sustituido, los sustituyentes pueden estar sobre la porcion alquilo o heteroalquilo o sobre la porcion arilo o heteroarilo del grupo. Los sustituyentes opcionalmente presentes sobre la porcion alquilo o heteroalquilo son los mismos que los descritos anteriormente para grupos alquilo en general; los sustituyentes opcionalmente presentes sobre la porcion arilo o heteroarilo son los mismos que los descritos anteriormente para los grupos arilo en general.

Grupos "arilalquilo" como se usa en el presente documento son grupos hidrocarbilo, si estan sin sustituir, y se describen por el numero total de atomos de carbono en el anillo y el enlazador alquileno o similar. Asf, un grupo bencilo es un grupo arilalquilo C7, y feniletilo es un arilalquilo C8.

"Heteroarilalquilo", como se ha descrito anteriormente se refiere a un resto que comprende un grupo arilo que esta unido a traves de un grupo de union, y se diferencia de "arilalquilo", en que al menos un atomo del anillo del resto arilo o un atomo en el grupo de union es un heteroatomo seleccionado entre N, O y S. Los grupos heteroarilalquilo se describen en el presente documento de acuerdo con el numero total de atomos en el anillo y el enlazador combinados, e incluyen grupos arilo unidos a traves de un enlazador heteroalquilo; grupos heteroarilo unidos a traves de un enlazador de hidrocarbilo tal como un grupo alquileno; y grupos heteroarilo unidos a traves de un enlazador heteroalquilo. Asf, por ejemplo, heteroarilalquilo C7 incluina piridilmetilo, fenoxi, y N-pirrolilmetoxi.

"Alquileno" tal como se utiliza en el presente documento se refiere a un grupo hidrocarbilo divalente; debido a que es divalente, puede unir otros dos grupos juntos. Normalmente se refiere a -(CH2V en la que n es 1-8 y preferentemente n es 1-4, aunque cuando se especifique, un alquileno tambien puede estar sustituido con otros grupos, y puede tener otras longitudes, y las valencias abiertas no tienen que estar en extremos opuestos de una cadena. De este modo -CH(Me)- y -C(Me)2- tambien se pueden denominar alquilenos, al igual que un grupo dclico tal como ciclopropano-1,1-diilo. Cuando se sustituye un grupo alquileno, los sustituyentes incluyen aquellos normalmente presentes en los grupos alquilo como se describe en el presente documento.

En general, cualquier grupo alquilo, alquenilo, alquinilo, acilo, o arilo o arilalquilo o cualquier heteroforma de uno de estos grupos que este contenida en un sustituyente puede a su vez estar opcionalmente sustituida con sustituyentes adicionales. La naturaleza de estos sustituyentes es similar a los indicados en relacion a los propios sustituyentes primarios si los sustituyentes no se describen de otra manera. Por lo tanto, cuando una forma de realizacion de, por ejemplo, R7 es alquilo, este alquilo puede estar opcionalmente sustituido con los sustituyentes restantes que figuran como realizaciones de R7, cuando esto tenga sentido qrnmico, y siempre que ello no menoscabe el lfmite de tamano proporcionado para el alquilo per se; por ejemplo, alquilo sustituido con alquilo o alquenilo simplemente ampliana el ifmite superior de atomos de carbono para estas realizaciones, y no se incluye. Sin embargo, alquilo sustituido con arilo, amino, alcoxi, =O, y similares estanan incluidos dentro del alcance de la invencion, y los atomos de estos grupos sustituyentes no se cuentan en el numero que se utiliza para describir los grupos alquilo, alquenilo, etc. que se estan describiendo. Cuando no se especifica ningun numero de sustituyentes, cada uno de dichos grupos alquilo, alquenilo, alquinilo, acilo, o arilo puede estar sustituido con un numero de sustituyentes de acuerdo con sus valencias disponibles; en particular, cualquiera de estos grupos puede estar sustituido con atomos de fluor en cualquiera o todas sus valencias disponibles, por ejemplo.

"Heteroforma" tal como se utiliza en el presente documento se refiere a un derivado de un grupo tal como un grupo alquilo, arilo o acilo, en el que al menos un atomo de carbono del grupo carbodclico designado ha sido reemplazado por un heteroatomo seleccionado entre N, O y S. Por lo tanto las heteroformas de alquilo, alquenilo, alquinilo, acilo, arilo, y arilalquilo son heteroalquilo, heteroalquenilo, heteroalquinilo, heteroacilo, heteroarilo, y heteroarilalquilo,

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respectivamente. Se entiende que ordinariamente no estan conectados secuencialmente mas de dos atomos de N,

0 o S, excepto cuando un grupo oxo esta unido a No S para formar un grupo nitro o sulfonilo.

"Halo", como se usa en el presente documento incluye fluor, cloro, bromo y yodo. A menudo se prefieren el fluor y el cloro. "Amino" tal como se utiliza en el presente documento se refiere a NH2, pero cuando un amino se describe como "sustituido" u "opcionalmente sustituido", el termino incluye NR'R" en la que cada R' y R" es independientemente H, o es un grupo alquilo, (un grupo alquenilo, alquinilo, acilo, arilo, o arilalquilo o una heteroforma de uno de estos grupos, y cada uno de los grupos alquilo, alquenilo, alquinilo, acilo, arilo, o arilalquilo o heteroformas de uno de estos grupos esta opcionalmente sustituido con los sustituyentes descritos en el presente documento como adecuados para el grupo correspondiente). El termino tambien incluye formas en las que R' y R" estan unidas entre sf para formar un anillo de 3-8 miembros que puede estar saturado, insaturado o ser aromatico y que contiene 1-3 heteroatomos seleccionados independientemente entre N, o y S como miembros del anillo, y que esta opcionalmente sustituido con los sustituyentes descritos como adecuados para los grupos alquilo o, si NR'R" es un grupo aromatico, que esta opcionalmente sustituido con los sustituyentes descritos como tfpicos para grupos heteroarilo.

Tal como se utiliza en el presente documento, el termino "carbociclo" se refiere a un compuesto dclico que contiene solamente atomos de carbono en el anillo, mientras que un "heterociclo" se refiere a un compuesto dclico que comprende un heteroatomo. Las estructuras carbodclicas y heterodclicas comprenden compuestos que tienen sistemas de anillo monodclico, bidclico o multiples. Tal como se utiliza en el presente documento, el termino "heteroatomo" se refiere a cualquier atomo que no sea carbono o hidrogeno, tal como nitrogeno, oxfgeno o azufre. Los ejemplos ilustrativos de heterociclos incluyen, pero no se limitan a tetrahidrofurano, 1,3-dioxolano, 2,3- dihidrofurano, pirano, tetrahidropirano, benzofurano, isobenzofurano, 1,3-dihidro isobenzofuran, isoxazol, 4,5- dihidroisoxazol, piperidina, pirrolidina, pirrolidin-2-ona, pirrol, piridina, pirimidina, octahidro pirrolo [3,4-b] piridina, piperazina, pirazina, morfolina, tiomorfolina, imidazol, imidazolidina-2,4-diona, 1,3-dihidrobenzimidazol-2-ona, indol, tiazol, benzotiazol, tiadiazol, tiofeno, dioxido de 1,1-tetrahidrotiofeno, diazepina, triazol, guanidina, diazabiciclo [2.2.1] heptano, 2,5-diazabiciclo [2.2.1] heptano, 2,3,4,4a,9,9a-hexahidro-1H-beta-carbolina, oxirano, oxetano, tetrahidropirano, dioxano, lactonas, aziridina, azetidina, piperidina, lactamas, y tambien pueden abarcar heteroarilos. Otros ejemplos ilustrativos de heteroarilos incluyen, pero no estan limitados a furano, pirrol, piridina, pirimidina, imidazol, bencimidazol y triazol.

Sustrato

Tal como se usa en el presente documento, "sustrato" se refiere a un soporte insoluble sobre el que se deposita y se analiza un analito. Los sustratos pueden incluir, pero no se limitan a, sflice, vidrio (por ejemplo vidrio, vidrio de poros controlados (CPG)), nailon, resina Wang, resina Merrifield, Sephadex, Sepharose, celulosa, perlas magneticas, Dynabeads, una superficie metalica (por ejemplo, acero, oro, plata, aluminio, silicio y cobre), un material plastico (por ejemplo, polietileno, polipropileno, poliamida, poliester, difluoruro de polivinilideno (PVDF)), o pins (por ejemplo, matrices de pins adecuados para la smtesis combinatoria o el analisis de perlas en pozos de superficies planas tales como obleas (por ejemplo, obleas de silicio) con o sin placas. El soporte solido puede estar en cualquier forma deseada, incluyendo, pero no limitado a: una perla, chip, capilar, placa, membrana, oblea, peine, alfiler, una oblea con pozos, una superficie esencialmente plana, una matriz de pozos o pocillos de nanolitros y otras geometnas y formas conocidas por los expertos en la tecnica. Los soportes preferidos son superficies planas disenadas para recibir o unir muestras en loci discretos. Las mas preferidas son superficies planas con regiones hidrofobicas que rodean loci hidrofilos para recibir, contener o unir una muestra. Los materiales de sustrato pueden ser inertes al funcionamiento del dispositivo o de los reactivos a utilizar en el procedimiento, incluyendo los materiales de matriz y los disolventes tfpicos de espectrometna de masas MALDI.

Sobre el substrato, los puntos de la matriz o matriz/aditivo o matriz/analito/aditivo a menudo tienen ciertas caractensticas. Cada punto sobre un sustrato puede ser de aproximadamente 200 micrometros a aproximadamente

1 mm de diametro. El diametro del punto a menudo es esencialmente uniforme y la variacion de diametro de punto a punto con frecuencia es minima (por ejemplo, una variacion de aproximadamente 20 micrometros). Se puede utilizar cualquier distancia de centro a centro de los puntos sobre un sustrato util para la espectrometna de masas, por ejemplo, distancias de centro a centro de 2,25 mm o de 1,125 mm, por ejemplo, y la distancia de centro a centro entre los puntos en un sustrato a menudo es esencialmente uniforme. Los puntos en el sustrato pueden tener un espesor que oscila entre aproximadamente 10 micrometros y aproximadamente 100 micrometros. El espesor de cada punto sobre un sustrato a menudo es esencialmente uniforme y la variacion de espesor de punto a punto con frecuencia es minima (por ejemplo, aproximadamente 30 micrometros).

Sitio diana

Tal como se utiliza en el presente documento, el termino "sitio diana" se refiere a un locus espedfico sobre un sustrato sobre el que se puede depositar y retener material, tal como material de la matriz, material de la matriz con aditivo, o analito. Un sustrato puede contener uno o mas sitios diana, que se pueden disponer aleatoriamente o en matriz ordenada u otro patron. Cuando se utiliza para los analisis por espectrometna de masas, tales como analisis de MALDI, un sitio diana o el sitio resultante con material depositado, preferentemente es igual o menor que el

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tamano del punto laser que se centrara sobre el sustrato para efectuar la desorcion. Por lo tanto, un sitio diana puede ser, por ejemplo, un pocillo o pozo, un alfiler o una perla, o una barrera ffsica que se coloca sobre una superficie del soporte solido, o combinaciones de los mismos tales como granos en un chip, chips en pocillos, o similar. Un sitio diana se puede colocar ffsicamente sobre el sustrato, se puede atacar qmmicamente sobre una superficie del sustrato, puede ser una "torre" que queda despues de atacar qmmicamente en torno a un locus, o puede estar definido por parametros ffsico-qmmicos, tales como la hidrofilia relativa, la hidrofobicidad, o cualquier otra caractenstica qmmica de superficie que retiene un lfquido en o sobre ellas.

Plataforma

Los metodos y composiciones de la presente invencion se pueden usar junto con cualquier fuente de ionizacion, incluyendo la ionizacion qmmica a presion atmosferica (APCI), ionizacion qmmica (CI), impacto electronico (EI), ionizacion por electropulverizacion (ESI o ES), bombardeo atomico rapido (FAB), desorcion de campo/ionizacion de campo (FD/FI), desorcion/ionizacion laser asistida por matriz (MALDI) y ionizacion por termopulverizacion (TSP). En ciertas realizaciones, la fuente de ionizacion es MALDI o ES.

Los metodos y composiciones de la invencion se pueden usar junto con cualquier analizador de masas. Hay una serie de analizadores de masas disponibles en la actualidad, el mas conocido de los cuales incluye analizadores cuadripolares de tiempo de vuelo (TOF), sectores magneticos, y trampas de iones tanto de transformada de Fourier como cuadripolares. Ademas, los analizadores pueden usarse en tandem como espectrometros de masas en tandem (MS-MS). El analizador de masas puede ser un analizador de TOF.

Los analitos se pueden analizar por analisis por espectrometna de masas y no analizarse por un metodo espectroscopico. Los analitos pueden no analizarse por espectroscopia de infrarrojos (por ejemplo, espectroscopfa infrarroja por transformada de Fourier), que en general mide la frecuencia de vibracion de ciertas moleculas, y generalmente no incluye la ionizacion de analitos y la medicion de la masa de los analitos ionizados.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos son no limitantes e ilustran ciertas realizaciones de la invencion.

Ejemplo 1: Aditivo al analito

En el siguiente ejemplo, el analito de una reaccion Sequenom IPLEX™ se mezclo bien con agua nanopura o con un aditivo de acido ascorbico para determinar el efecto del aditivo sobre la formacion de aductos. Las placas se procesaron en paralelo siguiendo el protocolo Sequenom IPLEX™ como se describe por Jurinke, C., Oeth, P., van den Boom, D., MALDI-TOF mass spectrometry: a versatile tool for high-performance DNA analysis. Mol. Biotechnol. 26, 147-164 (2004); y Oeth, P. et al., iPLEX™ Assay: Increased Plexing Efficiency and Flexibility for MassARRAY® System through single base primer extension with mass-modified Terminators. SEQUENOM Application Note (2005), ambos que se incorporan en el presente documento por referencia. Durante la etapa de dilucion/acondicionado, 9 pl de la solucion de analito se mezclo con 25 pl de agua nanopura como dicta el protocolo convencional, mientras que la otra placa tambien se mezclo con acido ascorbico para dar una concentracion final de acido ascorbico de 20 mM.

Para eliminar cationes residuales del acido ascorbico, y para excluir cualquier posible inferencia de la resina de intercambio cationico amoniacal, se desalaron soluciones madre de acido ascorbico con 1 g/ml de resina protonada. Dependiendo del flujo de trabajo, el aditivo se puede mezclar directamente con el analito o se diluye mas y despues se anade a la muestra. En este ejemplo particular, la etapa de dilucion se completo en un manipulador de lfquidos automatizado, con la solucion de dilucion almacenada en una bandeja de 50 ml a una relacion de volumen de 1/25 antes de su adicion a la solucion de analito.

Despues de las respectivas etapas de dilucion/acondicionado, ambas placas se dispensaron a 10 nl/dominio en un SpectroCHIP™ (3-HPA 300 mM/MDAC 25m) pre-matricial convencional utilizando un Sequenom Nanodispenser, y se analizaron en un analizador compacto Sequenom MassARRAY®.

Resultados: el uso de acido ascorbico dio lugar a un numero de llamadas mas alto del 8 % para las muestras tratadas con acido ascorbico. Los aducto de sodio y amoniaco se suprimieron al lfmite de deteccion en las muestras tratadas con acido ascorbico. Esto dio como resultado la ausencia de llamadas de falsos positivos debido a aductos de amoniaco y/o de sodio para las muestras tratadas con acido ascorbico, mientras que los aductos de amoniaco en muestras acondicionadas en agua provocaron un ensayo que se debe asignar repetidamente a heterocigoto (una llamada de falsos positivos).

Ejemplo 2: Aditivo para la Matriz

En el siguiente ejemplo, se muestra una nueva composicion de matriz que comprende acido ascorbico (AA) para reducir la formacion de aductos, mejorando asf la calidad del espectro.

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Soluciones de matriz

Se prepararon combinaciones de matriz a partir de las siguientes soluciones madre y agua nanopura (soluciones madre de los diferentes componentes de la matriz se trataron con resina de intercambio cationico de acuerdo con el grupo funcional de los componentes - acidos con resina de intercambio en forma H+, y de sales de amoniaco con la resina en forma NH4+):

3-HPA: 350 mM en acetonitrilo acuoso al 30 %.

AA: 1 M en solucion acuosa.

DAC: 226mg en solucion acuosa 1 M.

La matriz convencional se preparo con 3HPA 300 mM y DAC 25 mM, mientras que la nueva matriz se prepara con 3HPA 300 mM, oxalato de NH4 20 mM y acido ascorbico 20 mM. Vease Tabla 1. Las matrices finales se dispensaron en un SpectroCHIP en 15-20 nl, utilizando un Gesim Nanoplotter.

TABLA 1

Tipo de matriz: Composicion de la matriz (concentraciones en [mM])

Convencional, sin resina: 300 HPA/25 DAC

Convencional, con resina: 300 HPA/25 DAC

Nueva matriz: 300 HPA/20 AA/20 oxalato de NH4

Muestras de oligonucleotidos sinteticos

Se realizaron dos experimentos utilizando oligonucleotidos sinteticos puestos directamente sobre las matrices de la Tabla 1. En un primer experimento, un oligonucleotido sintetico de 17 meros (GTG GTG GTG GTG GTG GT) se puso a prueba tanto en la matriz "vieja" tratada con resina como en la matriz "nueva" modificada con acido ascorbico. En la Figura 1 (matriz vieja), hay claramente presente un aducto de amoniaco (la altura del pico es de aproximadamente el 12 % del pico principal a 5335 Da), mientras que el aducto de amoniaco no esta presente en la Figura 2 (matriz nueva). La nueva matriz como alternativa se puede denominar "Matriz 63C".

En un segundo experimento, un oligonucleotido sintetico de 17 meros de baja masa (5044 Da) y el oligonucleotido sintetico de 28 meros de alta masa (8436 Da) se analizaron para la formacion de aductos y la despurinacion. En ambos experimentos, los analitos de oligonucleotidos sinteticos se dispensaron sobre las matrices de la Tabla 1 a 10 nl por punto, utilizando un nanoplotter Gesim. Los resultados para los oligonucleotidos de masas bajas y de masas altas se muestran en las Tablas 2 y 3, respectivamente.

TABLA 2A: Aductos de 17 meros

Aductos de 17 meros, 5044 Da tamano de la muestra: 48: Matriz convencional, resina no tratada Matriz convencional, resina tratada Nueva matriz

NH3 (+ 17 Da): 0,4*2,3 = 0,9 3 % 0 0

HPA (+ 138 Da): 0,17*1,8 = 0,3 3 % 0 0

HPA descarboxilado 1 (+ 94 Da): 0,48*2,4 = 1,2 4 % 0 0,13*1,6 = 0,2 2 %

HPA descarboxilado 2 (+ 188 Da): 0,98*5 = 4,9 7 % 1*10,2 = 10,2 9 % 1*8,9 = 8,9 11 %

Potasio (+ 38 Da): 0,46*2,5 = 1,2 4 % 0 0

Sodio (+ 22 Da): OO II CM LO cT 0 0

Acido carbonico (+ 62 Da): 0 0 OO 10 -i #"■* II 0 0 0,06*1,3 = 0,08 2 %

Puntuacion media de formacion de aductos: 1,5 1,5 1,3

Despurinacion: 0 0 0

TABLA 2B: Altura de la sonda de 17 meros y ^ relacion senal-ruido (RSR)

Sonda: Matriz convencional, resina no tratada Matriz convencional, resina tratada Nueva matriz

Altura de la sonda (med./D.T.): 69/19 110/24 79/26

RSR de la sonda (med./D.T.): 241/57 388/71 313/77

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TABLA 3A: Aductos de 28 meros

Aductos de 28 meros, 8436 Da tamano de la muestra: 48: Matriz convencional, resina no tratada Matriz convencional, resina tratada Nueva matriz

NH3 (+ 17 Da): 1*3,8 = 3,8 19 % 1*3,9 = 3,9 14 % 0,46*2,1 = 1 7 %

HPA (+ 138 Da): 0,35*1,2 = 0,42 6 % 0,6*1,6 = 1 6 % 0,67*1,1 = 0,74 4 %

HPA descarboxilado 1 (+ 94 Da): 0,35*1,3 = 0,46 7 % 0,6*1,7 = 1 6 % 0,46*1,7 = 0,78 6 %

HPA descarboxilado 2 (+ 188 Da): 0,35*1,3 = 0,46 7 % 0,65*2,6 = 1,7 9 % 1*3,5 = 3,5 11 %

Potasio (+ 38 Da): 0,39*1,3 = 0,5 7 % 0,58*0,58 = 1 4 % 0,4*0,9 = 0,36 3 %

Sodio (+ 22 Da): 0,46*2,4 = 1,1 12 % 0,6*1,8 = 1,1 6 % 0,46*1,1 = 0,51 4 %

Acido carbonico (+ 62 Da): 0,31*0,8 = 0,2 4 % 0,31*0,8 = 0,2 3 % 0,17*0,8 = 0,14 3 %

Puntuacion media de formacion de aductos: 1 1,4 1

Despurinacion sustitucion G: -133 Da eliminacion G: -150 Da Una substitucion: -117 Da: 0,29*0,6 = 0,2 0 0 0,46*0,8 = 0,4 0 0 0,46*1,2 = 0,6 0 0

TABLA 3B: Altura de la sonda de 28 meros y relacion senal-ruido (RSR)

Sonda

Altura de (med./D.T.): la sonda 20/5 28/7 31/7

RSR de (med./D.T.): la sonda 93/19 134/27 164/31

Las comparaciones de la matriz se basan en las alturas relativas de los picos del aducto y de despurinacion, y en las alturas de la sonda y las RSR. Se introdujo una puntuacion de la formacion de aductos para tener en cuenta la frecuencia relativa de rellenos que superen el valor umbral de puntuacion de pico en el analisis:

Puntuacion de formacion de aducto = (frecuencia relativa de rellenos que superan el valor umbral)*(altura promedio del pico de aducto)

El termino "rellenos" y "puntos" en un sustrato son intercambiables. Las desviaciones tfpicas para las alturas promedio de los picos de aducto eran bajas y comparables para todas las matrices y no se presentan en las tablas.

Para el oligomero sintetico de 17 meros, la puntuacion media de formacion de aducto fue del 13 % mas baja en la nueva matriz (Tabla 2A), y para el oligomero sintetico de 28 meros, la puntuacion media de formacion de aducto fue del 29 % mas baja en la nueva matriz (Tabla 3A) en comparacion con la matriz convencional tratada con resina.

Muestras de extension del cebador

Se realizaron experimentos adicionales usando ensayos de genotipado Sequenom validados dirigidos a polimorfismos en los genes RhD y AMG. Estos ensayos se realizaron utilizando el ensayo de IPLEX™ y la tecnologfa MassARRAY® (Jurinke, C., Oeth, P., van den Boom, D., MALDI-TOF mass spectrometry: a versatile tool for high-performance DNA analysis. Mol. Biotechnol. 26, 147-164 (2004); y Oeth, P. et al., iPLEX™ Assay: Increased Plexing Efficiency and Flexibility for MassARRAY® System through single base primer extension with mass-modified Terminators. SEQUENOM Application Note (2005), ambos de los cuales se incorporan en el presente documento como referencia). En resumen, la region diana que rodea el SNP se amplifica primero mediante PCR. Posteriormente un cebador de oligonucleotido se hibrida con el producto de PCR y se extiende espedficamente para el alelo por un unico nucleotido utilizando una mezcla de 4 nucleotidos terminadores y una ADN polimerasa. Los productos de extension se transfieren a una matriz de chip miniaturizado y se analizan mediante espectrometna de masas MALDI-TOF. La determinacion de la masa molecular de los productos de extension permite la identificacion

inequvoca del alelo SNP presente en la muestra. La relacion de area del pico de las senales de masas permite la estimacion de la abundancia relativa de los alelos en una muestra dada.

En este experimento, se utilizo una energfa del laser un 20 % mas alta (en comparacion con los experimented de 5 oligonucleotidos sinteticos anteriores) en productos de extension del cebador aMg de 7316 Da puestos sobre las matrices de la Tabla 1. Como se muestra en las Tablas 4 y 5, hay una puntuacion media de formacion de aducto reducida para los productos de extension dispensados en la nueva matriz en comparacion con la matriz convencional (40-50 % de disminucion), y el aumento de energfa del laser no tuvo ningun efecto negativo sobre la formacion de aductos.

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TABLA 4A: Ensayo AMG de aductos (7316 Da) - Energia laser convencional

Aductos cuantificadores fetales de sonda a 7316 Da tamano de la muestra: 96: Matriz convencional, resina no tratada Matriz convencional, resina tratada Nueva matriz

NH3 (+ 17 Da): 1*2,5 = 2,5 16 % 1*2,1 = 2,1 11 % 0,94*0,94 = 1 6 %

Sodio (+ 22 Da): 0,91*1,7 = 1,5 11 % 0,98*0,9 = 0,9 5 % 0,25*0,5 = 0,13 3 %

Potasio (+ 38 Da): 0,9*1,2 = 1,1 8 % 0,96*1,1 = 1,1 6 % 0,89*0,8 = 0,7 4 %

Acido carbonico (+ 62 Da): 0,9*1,2 = 1,1 8 % 0,98*1,3 = 1,3 7 % 0,98*1,4 = 1,4 8 %

Puntuacion media de formacion de aductos: 1,6 1,4 0,8

TABLA 4B: Ensayo de altura de AMG (7316 Da) y relacion de senal a ruido (RSR)

Sonda

Altura de (med./D.T.): la sonda 16/4 19/5 18/6

RSR de (med./D.T.): la sonda 54/11 65/14 66/19

15 _____________TABLA 5: Ensayo de aductos de AMG (7316 Da) - Aumento de la energia del laser

Aductos cuantificadores fetales de sonda a 7316 Da tamano de la muestra: 96: Matriz convencional, resina tratada 20 % mas de energia laser nueva matriz energetica aumentado laser 20 %

NH3 (+ 17 Da): 1*1,7 = 1,7 11 % 0,55*0,85 = 0,47 5 %

Sodio (+ 22 Da): 0,98*1,1 = 1,1 7 % 0,06*0,51 = 0,03 3 %

Potasio (+ 38 Da): 0,1*0,4 = 0,04 0,3 % 0,41*0,75 = 0,31 3 %

Acido carbonico (+ 62 Da): 0,98*1,5 = 1,5 9 % 0,97*1,6 = 1,6 8 %

Puntuacion media de formacion de aductos: 1,1 0,6

Sonda

Altura de la sonda (med./D.T.): 16/4 19/4

RSR de la sonda (med./D.T.): 65/14 69/13

Para analizar la eficacia de la nueva matriz en presencia de cantidades mas altas de analito, se analizaron cantidades crecientes (10, 15 y 20 nl) de productos de extension del cebador AMG de 7528 Da sobre las matrices de la Tabla 1. Vease Tabla 6 a continuacion. Las puntuaciones medias de formacion de aductos de la nueva matriz son 20 mas bajas en el volumen de analito de 10 y 15 nl; mientras que a 20 nl, se observo la misma puntuacion (0,6) tanto ambas matrices.

TABLA 6: Ensayo de aductos de AMG (7528 Da) - Aumento de la muestra de analito en la matriz

Aductos cuantificadores fetales de sonda a 7316 Da tamano de la muestra: 24: Matriz convencional, resina tratada Nueva matriz

Volumen de la sonda [nll: 10 15 20 10 15 20

NH3 (+ 17 Da): 0,92*1,3 = 1,2 8 % 0,92*0,8 = 0,7 3 8 % 0,92*0,6 = 0,5 5 10 % 0,96*0,9 = 0, 86 4 % 0,88*0,6 = 0,5 3 4 % 0,88*0,3 = 0,2 6 4 %

Sodio (+ 22 Da): 0,92*0,92 = 1 6 % 0,92*0,7 = 0,6 4 7 % 0,92*0,6 = 0,5 5 10 % 0 0,21*0,3 = 0,0 6 2 % 0,5*0,3 = 0,15 4 %

Potasio (+ 38 Da): 0,67*0,8 = 0,5 5 % 0,92*0,7 = 0,6 4 7 % 0,92*0,7 = 0,6 4 12 % 0,83*1,2 = 1 6 % 1*1,1 = 1,1 7 % 1*1,2 = 1,2 15 %

Acido carbonico (+ 62 Da): 1*1,6 = 1,6 10 % 1*1,2 = 1,2 12 % 0,92*0,7 = 0,6 4 12 % 1*1,9 = 1,9 9 % 0,96*1,3 = 1,2 5 9 % 1*0,8 = 0,8 10 %

Puntuacion media de la formacion de aductos: 1,1 0,8 0,6 0,9 0,7 0,6

Sonda

Altura de la sonda (med./D.T.): 16/4 10/3 6/3 21/5 15/5 8/3

RSR de la sonda (med./D.T.): 85/19 56/17 30/14 103/21 68/22 37/10

Reduccion relativa de la RSR: 34 % 46 % 34 % 46 %

Mejora de los espectros de masas

5 La importancia de la formacion reducida de aductos para eliminar llamadas de falsos positivos se ilustra claramente en las Figuras 3 y 4, que muestran los resultados para el ensayo de genotipado RHD-4-psi 3-i. El pico a 7626 Da no es una insercion como la indicada para la matriz convencional (Figura 3), sino un aducto de 55 Da (NH3 + K) para el producto de extension a 7571 Da. Este aducto se elimina claramente en la nueva matriz (Figura 4).

10 Ejemplo 3: Aditivo para la matriz y el analito

La nueva matriz modificada con acido ascorbico tambien se analizo en combinacion con acido ascorbico anadido a una solucion de analito (producto de extension del cebador AMG a 8289 Da). Como se ve en el Ejemplo 1 y las Tablas 2-6 del Ejemplo 2, el acido ascorbico anadido al analito o en combinacion con la matriz convencional redujo

15 enormemente los aductos de amoniaco y de sodio. Vease la Tabla 7 a continuacion. Hubo una disminucion del 43 % para el analito tratado con acido ascorbico sobre la matriz convencional, y una disminucion del 57 % para el analito tratado con acido ascorbico dispensado en la nueva matriz (en comparacion con el analito sin tratamiento dispensado en matriz sin tratar).

20 ___________________TABLA 7: Acido ascorbico anadido al analito y a la matriz_____________________

Concentracion final de inhibidor en el analito: 0 20 mM 0 20 mM

NH3 (+ 17 Da): 1*1.4 = 1.4 18% 1*0.6 = 0.6 10% 1*0.6 = 0.6 8% 0,92*0,5 = 0,46 8 %

Sodio (+ 22 Da): 0,96*0,7 = 0,67 9 % 0,63*0,3 = 0,19 5 % 0,17*0,3 = 0,05 4 % 0,29*0,1 = 0,03 2 %

Potasio (+ 38 Da): 0,21*0,3 = 0,06 4 % 0,13*0,1 = 0,01 2 % 0,17*0,2 = 0,03 % 3 0,17*0,2 = 0,03 % 3

Acido carbonico (+ 62 Da): 0,96*0,8 = 0,77 10 % 1*0.7 = 0.7 12% 1*0.9 = 0.9 11 % 0,96*0,8 = 0,77 13 %

Puntuacion media de la formacion de aductos: 0,7 0,4 (43 %) 0,4 0,3 (25%)

Sonda

Altura de la sonda (med./D.T.): 8/2.3 6/3 8/3 6/2

RSR de la sonda (med./D.T.): 35/8 32/11 36/12 30/7

Ejemplo 4: Ensayos de estabilidad

Durante un penodo de seis meses, se realizaron cuatro ensayos de estabilidad para determinar las propiedades de 5 reduccion de aducto del acido ascorbico en el tiempo. No habfa indicacion de que las matrices analizadas disminuyen su rendimiento durante el transcurso del tiempo. En cambio, las relaciones RSR obtenidas y unas puntuaciones de formacion de aductos consistentes para aductos de amoniaco y alcalinos confirmaron la estabilidad del 3-HPA y sus aditivos DAC, oxalato de NH4 en combinacion con el acido ascorbico.

10 La citacion de las patentes, solicitudes de patentes, publicaciones y documentos anteriores no es una admision de que cualquiera de los anteriores sea una tecnica anterior pertinente, ni constituye admision alguna en cuanto al contenido o fecha de estas publicaciones o documentos.

El termino "un" o "una" puede referirse a uno o una pluralidad de los elementos que modifica (por ejemplo, "un 15 dispositivo" puede significar uno o mas dispositivos) a menos que sea contextualmente claro que se describe uno de los elementos o mas de uno de los elementos. El termino "aproximadamente" tal como se utiliza en el presente documento se refiere a un valor dentro del 10 % del parametro subyacente (es decir, mas o menos el 10 %), y el uso del termino "aproximadamente" al principio de una cadena de valores modifica cada uno de los valores (es decir, "aproximadamente 1, 2 y 3" es aproximadamente 1, aproximadamente 2 y aproximadamente 3). Por ejemplo, un 20 peso de "aproximadamente 100 gramos" puede incluir pesos entre 90 gramos y 110 gramos.

Las realizaciones de la invencion se exponen en las reivindicaciones que siguen.

Claims

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

REIVINDICACIONES

1. Un metodo para el analisis de un acido nucleico por espectrometna de masas, que comprende:

(a) introducir una muestra en un espectrometro de masas, en el que la muestra comprende un acido nucleico y acido ascorbico, o una sal, tautomero o analogo del mismo; y

(b) analizar el acido nucleico por espectrometna de masas, en el que el analogo del acido ascorbico es de acuerdo a la siguiente formula:

imagen1

en la que:

R1 y R2 son independientemente OH, halogeno, R3, OR3, azido, ciano, CH2R3, CHR3R4, SR3, NR3R4; y

R3 y R4 son independientemente H, alquilo, acetileno o ciano, o un anillo carbodclico de arilo, anillo

heterodclico de arilo, anillo carbodclico no arilo o anillo heterodclico no arilo opcionalmente sustituidos.
2. El metodo de la reivindicacion 1, en el que la muestra comprende acido ascorbico.
3. El metodo de la reivindicacion 1 o 2, en el que la muestra comprende, ademas, oxalato de amonio.
4. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el acido nucleico es acido desoxirribonucleico.
5. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el acido nucleico es acido ribonucleico.
6. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la espectrometna de masas se selecciona del grupo que consiste en: espectrometna de masas desorcion/ionizacion laser asistida por matriz-tiempo de vuelo (mAlDI-TOF), espectrometna de masas por desorcion laser (LDMS), espectrometna de masas por electropulverizacion (ES), espectrometna de masas de resonancia ciclotron de iones (ICR) y espectrometna de masas por transformada de Fourier.
7. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la muestra comprende una matriz para la espectrometna de masas de desorcion/ionizacion laser asistida por matriz (MALDI).
8. El metodo de la reivindicacion 7, en el que la matriz comprende acido 3-hidroxi-picolmico (3-HPA).
9. El metodo de la reivindicacion 7, en el que la matriz comprende citrato de diamonio (DAC).
10. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que la muestra comprende de aproximadamente 5 mM a aproximadamente 50 mM de acido ascorbico, o una sal, tautomero o analogo del mismo.
11. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que la muestra comprende de aproximadamente 5 mM a aproximadamente 50 mM de acido ascorbico.
12. Un sustrato, que comprende una matriz de puntos, en la que cada punto comprende (i) una matriz para espectrometna de masas de desorcion/ionizacion laser asistida por matriz (MALDI), en el que la matriz se selecciona entre acido 3-hidroxipicolmico (3-HPA), citrato de diamonio (DAC), una mezcla de 3-HPA y DAC, acido 2,5- dihidroxibenzoico (DHB), acido alfa-ciano-4-hidroxicinamico (CHCA), 2,4,6-trihidroxiacetofenona (THAP), T-2-(3-(4-t- butil-fenil)-2-metil-2-propenilideno) malononitrilo (DCTB), trans-2-(3-(4-t-butilfenil)-2-metil-2-propenilideno) malononitrilo (DCTB), ditranol (DIT), acido sinapico (SA), acido trans-3-indolacnlico (IAA), acido 2-(4-hidroxifenilazo) benzoico (HABA), acido antramlico, acido nicotmico, salicilamida, 1 -isoquinolinol, 3-aminoquinolina, acido sucdnico, 2,6-dihidroxiacetofenona, acido ferulico, acido cafeico, glicerol y nitroanilina; y (ii) acido ascorbico, o una sal, tautomero o analogo del mismo, en el que el analogo del acido ascorbico es de acuerdo a la siguiente formula:

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

imagen2

en la que:

R1 y R2 son independientemente OH, halogeno, R3, OR3, azido, ciano, CH2R3, CHR3R4, SR3, NR3R4; y

R3 y R4 son independientemente H, alquilo, acetileno o ciano, o un anillo carbodclico de arilo, anillo

heterodclico de arilo, anillo carbodclico no arilo o anillo heterodclico no arilo opcionalmente sustituidos
13. El sustrato de la reivindicacion 12, en el que cada punto tiene de 200 micrometros a 1 milfmetro de diametro.
14. El sustrato de la reivindicacion 12 o 13, en el que una distancia de centro a centro entre los puntos es de 2,25

milfmetros.
15. El sustrato de la reivindicacion 12 o 13, en el que una distancia de centro a centro entre los puntos es 1,125 milfmetros.
16. El sustrato de una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 15, en el que cada punto tiene un espesor de aproximadamente 10 micrometros a aproximadamente 100 micrometros.
17. El sustrato de una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 16, en el que uno o mas de los puntos incluye un analito de acido nucleico.
18. El sustrato de la reivindicacion 17, en el que el acido nucleico es acido desoxirribonucleico.
19. El sustrato de la reivindicacion 17, en el que el acido nucleico es acido ribonucleico.
20. El sustrato de una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 19, en el que cada punto comprende de aproximadamente 5 mM a aproximadamente 50 mM de acido ascorbico.
21. El sustrato de una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 20, en el que la matriz comprende acido 3- hidroxipicolmico (3-HPA).
22. El sustrato de una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 21, en el que la matriz comprende citrato de diamonio (DAC).
23. El sustrato de una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 22, en el que el sustrato comprende un soporte solido seleccionado del grupo que consiste en una perla, un chip, un capilar, una placa, una membrana, una oblea, un peine, un alfiler, una oblea con pozos, una serie de pozos o pocillos de nanolitros, y una superficie esencialmente plana.
24. El sustrato de una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 23, en el que el soporte es una oblea de silicio.
25. El sustrato de una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 24, en el que el soporte es una superficie esencialmente plana con regiones hidrofobas que rodean loci hidrofilos, conteniendo todos los loci un punto.
26. El uso de un sustrato de una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 25 junto con cualquier analizador de masas.
27. El sustrato de una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 25, en el que cada punto comprende ademas oxalato de amonio.