ES2630226T3 - Un agente agotador de células B para el tratamiento de la aterosclerosis - Google Patents

Un agente agotador de células B para el tratamiento de la aterosclerosis Download PDF

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Abstract

Un anticuerpo anti-CD20 para utilizarlo en el tratamiento o la prevención del infarto de miocardio.

Description

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Un agente agotador de celulas B para el tratamiento de la aterosclerosis Campo de la invencion
La presente invencion se refiere a la prevencion o el tratamiento del infarto de miocardio, en particular a un anticuerpo anti-CD20 para la prevencion o el tratamiento del infarto de miocardio.
Antecedentes de la invencion
La aterosclerosis es la causa de mortalidad mas comun en las sociedades occidentales y se ha pronosticado que se convertira en la causa principal de enfermedades cardiovasculares en el mundo en un plazo de dos decadas.
La aterosclerosis contribuye al desarrollo de enfermedades vasculares ateroscleroticas (AVD) que pueden afectar a las arterias coronarias (causando cardiopatfa isquemica), a la circulacion cerebral (causando enfermedad cerebrovascular), a la aorta (produciendo aneurismas que son propensos a trombosis y ruptura) y a vasos sangumeos perifericos, normalmente en las piernas (causando enfermedad vascular periferica y claudicacion intermitente). La cardiopatfa isquemica (IHD) incluye la angina de pecho (dolor toracico causado por un riego sangumeo insuficiente del musculo cardfaco) y el infarto de miocardio (muerte del musculo cardfaco), y la enfermedad cerebrovascular incluye el ictus y ataques isquemicos transitorios. Uno de cada tres hombres y una de cada cuatro mujeres moriran de IHD y la tasa de mortalidad por IHD fue de 58 por 100.000 en 1990.
Las placas ateroscleroticas comienzan como estnas grasas subyacentes al endotelio de grandes arterias. El reclutamiento de macrofagos y su posterior absorcion de colesterol derivado de LDL (lipoprotemas de baja densidad) son los principales eventos celulares que contribuyen a la formacion de estnas grasas. Muchos elementos de prueba sugieren que modificaciones oxidantes o no oxidantes en los componentes lipfdicos y de apolipoprotema B (apo B) de las LDL impulsan la formacion inicial de estnas grasas. Las propiedades espedficas de las LDL oxidadas (oxLDL), estudiadas normalmente despues de la oxidacion de LDL nativas in vitro, dependen de la magnitud de la modificacion. Esta puede ir desde una modificacion "mmima" (mmLDL), en donde la partmula de LDL puede seguir siendo reconocida por receptores de LDL, hasta una oxidacion extensa, en donde el componente apo B esta fragmentado y hay residuos de lisina modificados de forma covalente con productos de degradacion reactivos de lfpidos oxidados. Estas partmulas no se unen al receptor de LDL, sino mas bien a, asf llamados, receptores de depuradores expresados en macrofagos y celulas de musculos lisos. A las mmLDL y oxLDL y a sus componentes se les ha atribuido una gran cantidad de propiedades proinflamatorias y proaterogenicas. Por ejemplo, la lisofosfatidilcolina o los fosfolfpidos oxidados aumentan la adhesion de monocitos, la quimiotaxia de monocitos y celulas T, y pueden inducir expresion genetica proinflamatoria. Aunque el reclutamiento de monocitos en la pared arterial y su posterior diferenciacion en macrofagos puede cumplir inicialmente una funcion retirando partmulas de oxLDL citotoxicas y proinflamatorias o celulas apoptoticas, la acumulacion progresiva de macrofagos y su absorcion de oxLDL conduce finalmente al desarrollo de lesiones ateroscleroticas.
La transicion desde la estna grasa relativamente simple hasta la placa mas compleja se caracteriza por la migracion de celulas de musculos lisos desde la tunica media de la pared arterial hasta la lamina elastica interna y hasta el espacio de la mtima o subendotelial, o por el reclutamiento de precursores de celulas de musculos lisos. Las celulas de musculos lisos de la mtima pueden proliferar y recoger lipoprotemas modificadas, contribuyendo asf a la formacion de celulas espumosas, y sintetizar protemas de matriz extracelular que conducen al desarrollo de la capa fibrosa. Por lo tanto, la placa aterosclerotica avanzada se divide esquematicamente en dos partes: la capa fibrosa, que constituye la capa superficial, y un nucleo lipfdico, que constituye la capa profunda. Esta matriz extracelular (ECM) esta compuesta por macromoleculas sumamente diferentes, incluyendo colageno, elastina, glicoprotemas y proteoglicanos. En la capa fibrosa se depositan grandes cantidades de ECM, con lo que se mantiene la resistencia de la placa, mientras que en el nucleo lfpidico, ademas de la deposicion de lfpidos, se produce una mayor degradacion de ECM, lo que conduce a una mayor fragilidad del tejido. Esta fragilidad de la placa da lugar a una vulnerabilidad de la placa, que a su vez se convierte en una causa de rotura de placa.
Esta fase del desarrollo de la placa esta influida por interacciones entre monocitos/macrofagos y celulas T que conducen a una amplia gama de respuestas celulares y humorales y a la adquisicion de muchas caractensticas de un estado inflamatorio cronico. Al parecer, entre los elementos celulares de lesiones en desarrollo se producen interferencias significativas. Las celulas T de lesiones parecen ser activadas y expresar citoquinas tanto Th1 como Th2. De modo similar, los macrofagos, las celulas endoteliales y las celulas de musculos lisos parecen ser activadas sobre la base de su expresion de moleculas del MHC de clase II y numerosos productos inflamatorios tales como TNF, IL-6 y MCP 1.
Por lo tanto, en la tecnica existe una necesidad reconocida y permanente de nuevos metodos fiables para tratar el infarto de miocardio
Una estrategia existente para el tratamiento de la aterosclerosis se basa en los indicios de que las rutas de Th1 y Th2 parecen desempenar un papel clave. Por consiguiente, un tratamiento inmunomodulador que promueva una
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inmunidad reguladora puede representar una herramienta atractiva para el tratamiento y/o la prevencion de la aterosclerosis. Esto se puede llevar a cabo promoviendo la generacion de celulas T reguladoras (Treg) tales como celulas Tr1, celulas CD4+CD25+ o celulas Th3. En este contexto, se ha demostrado que las celulas T reguladoras CD4(+)CD25(+) originadas de forma natural, que mantienen activamente la tolerancia inmunologica a antigenos propios y extranos, son potentes inhibidores de la aterosclerosis en varios modelos de raton.
Por otro lado, un estudio reciente sugiere que una deficiencia de celulas B aumenta la aterosclerosis en un modelo de raton (Major al. 2002). Otro estudio reciente ha demostrado que las celulas B confieren proteccion contra la aterosclerosis (Caligiuri et al., 2002). En consecuencia, la tecnica anterior sugiere que el agotamiento de celulas B no es un metodo prometedor para el tratamiento de la aterosclerosis, al contrario de lo descrito, pero no demostrado, en las siguientes solicitudes de patente: US2004/202658, US2005/186206, US2008/260641, WO2007/053661 y US2004/167319. Mas particularmente, estos documentos ensenan el uso de anticuerpos anti-CD20 (y antagonistas de CD20 en el caso de los documentos US2004/202658 y US2005/186206) para tratar enfermedades autoinmunes o canceres, pero no sugieren el uso de anticuerpos anti-CD20 para la prevencion o el tratamiento del infarto de miocardio.
Compendio de la invencion
La presente invencion se refiere a un anticuerpo anti-CD20 para el tratamiento o la prevencion del infarto de miocardio. En particular, la presente invencion esta definida por las reivindicaciones.
La presente descripcion tambien se refiere a una composicion farmaceutica para el tratamiento o la prevencion de la aterosclerosis.
Descripcion detallada de la invencion
Los inventores han demostrado que la administracion de un agente agotador de celulas B (es decir, un anticuerpo anti-CD20) permite reducir de forma significativa el tamano de la placa aterosclerotica en un modelo de raton.
En la patogenesis de trastornos (auto)inmunes intervienen respuestas dependientes de celulas B y el agotamiento de celulas B reduce significativamente la carga de diversas enfermedades mediadas por el sistema inmunitario. Sin embargo, la activacion de celulas B se ha asociado hasta ahora con una proteccion contra la aterosclerosis (Caligiuri et al., 2002; Major et al., 2002; Binder et al., 2004; Miller et al., 2008), sugiriendo que las terapias de agotamiento de celulas B aumentana el riesgo cardiovascular.
Aqrn, los inventores demuestran inesperadamente que el agotamiento de celulas B maduras utilizando un anticuerpo monoclonal de CD20 induce una reduccion significativa de la aterosclerosis en diversos modelos de raton de la enfermedad. Este tratamiento preserva la produccion de anticuerpos de IgM antilipoprotema de baja densidad oxidada (oxLDL) naturales y potencialmente protectores sobre anticuerpos anti-oxLDL de tipo IgG, y reduce notablemente la activacion de celulas T patogenas. Los mecanismos ateroprotectores del agotamiento de celulas B implican un cambio de la respuesta inmunitaria hacia una disminucion de la secrecion de interferon-gamma derivado de celulas T y un aumento de la produccion de interleuquina 17, cuya neutralizacion anula la ateroproteccion mediada por anticuerpos CD20.
Estos resultados ponen en duda el paradigma actual de que la activacion de celulas B desempena un papel protector global en la aterogenesis, identifican nuevas estrategias antiaterogenicas basadas en la modulacion de celulas B, y sugieren que pacientes actualmente tratados con agentes agotadores de celulas B, tales como anticuerpos de CD20, para otras enfermedades mediadas por el sistema inmunitario tambien se pueden beneficiar de una reduccion del riesgo cardiovascular a traves de la limitacion del desarrollo de lesiones ateroscleroticas o inflamaciones.
Los inventores tambien han demostrado que el agotamiento de celulas B es beneficioso en el infarto de miocardio. Definiciones
El concepto "celula B" tiene su significado general en la tecnica. Las celulas B son linfocitos que desempenan un gran papel en la respuesta inmunitaria humoral (a diferencia de la respuesta inmunitaria mediada por celulas, que esta dirigida por celulas T).
Un "agente agotador de celulas B" es una molecula que agota o destruye celulas B en un paciente y/o que interfiere con una o mas funciones de las celulas B, por ejemplo reduciendo o previniendo una respuesta humoral provocada por la celula B. El agente agotador de celulas B se une preferiblemente a un marcador de superficie de celulas B. El agente agotador de celulas B preferiblemente puede agotar las celulas B (es decir, reducir los niveles de celulas B en circulacion) en un paciente tratado con el mismo. Dicho agotamiento se puede lograr a traves de diversos mecanismos tales como citotoxicidad dependiente de anticuerpos mediada por celulas (ADCC) y/o citotoxicidad dependiente de complemento (CDC), inhibicion de la proliferacion de celulas B y/o induccion de muerte de celulas B (por ejemplo a traves de apoptosis). Los agentes agotadores de celulas B incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos, peptidos de secuencia sintetica o nativa y antagonistas de moleculas pequenas que preferiblemente se unen al
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marcador de superficie de celulas B, opcionalmente conjugados con un agente citotoxico o fusionados con el mismo. El agente agotador de celulas B preferido comprende un anticuerpo, mas preferiblemente un anticuerpo agotador de celulas B.
En una realizacion preferida, el agente agotador de celulas B no tiene la capacidad de agotar celulas plasmaticas. En otra realizacion preferida, el agente agotador de celulas B no tiene la capacidad de agotar celulas Bio (o celulas Breg). En otra realizacion preferida, el agente agotador de celulas B no tiene la capacidad de agotar celulas B1. En consecuencia, en una realizacion preferida particular, el agente agotador de celulas B no tiene la capacidad de agotar celulas plasmaticas ni celulas B10. En consecuencia, en una realizacion preferida particular, el agente agotador de celulas B no tiene la capacidad de agotar celulas plasmaticas, celulas B10 ni celulas B1.
El concepto "citotoxicidad dependiente de complemento" o "CDC" se refiere a la lisis de una celula diana en presencia de complemento. La activacion de la ruta de complemento clasica se inicia mediante la union del primer componente del sistema del complemento a anticuerpos que estan nidos a su antfgeno afrn. Para evaluar la activacion de complemento se puede llevar a cabo un ensayo de CDC, por ejemplo tal como se describe en Gazzano-Santoro et al. (1997).
El concepto "citotoxicidad dependiente de anticuerpos mediada por celulas" o "ADCC" se refiere a una forma de citotoxicidad en la que anticuerpos segregados unidos sobre receptores Fc (FcR) presentes sobre determinadas celulas citotoxicas (por ejemplo celulas asesinas naturales (NK), neutrofilos, monocitos y macrofagos) permiten que estas celulas efectoras citotoxicas se unan espedficamente a una celula diana portadora de antfgeno y posteriormente maten la celula diana. Para evaluar la actividad de ADCC de una molecula de interes se puede llevar a cabo un ensayo de ADCC in vitro, tal como el descrito en la Patente de los EE.UU. n° 5,500,362 o 5,821,337.
Un "marcador de superficie de celulas B" o "diana de celulas B" o "antfgeno de celulas B" es aqu un antfgeno expresado sobre la superficie de una celula B que puede ser fijada como diana con un agente agotador de celulas B que se une a la misma. Algunos marcadores de superficie de celulas B ejemplares incluyen, pero no se limitan a, los marcadores de superficie de leucocito CD10, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD37, CD53, CD72, CD73, CD74, CDw75, CDw76, CD77, CDw78, CD79a, CD79b, CD80, CD81, CD82, CD83, CDw84, CD85 y CD86. El marcador de superficie de celulas B que presenta un interes particular es expresado preferentemente sobre celulas B en comparacion con otros tejidos que no son de celulas B de un mairnfero y puede ser expresado tanto sobre celulas B precursoras como sobre celulas B maduras. En una realizacion, el marcador es uno como CD20 o CD19, que se encuentra sobre celulas B a lo largo de toda la diferenciacion de la genesis desde la etapa de celula madre hasta un punto justo antes de la diferenciacion terminal en celulas plasmaticas.
Un antfgeno "CD20" es una fosfoprotema de 35 kDa no glicosilada, que se encuentra en la superficie de mas de un 90% de celulas B procedentes de sangre periferica o de organos linfoides. El CD20 es expresado durante el desarrollo temprano previo a la celula B y permanece hasta la diferenciacion en celulas plasmaticas. El CD20 esta presente tanto sobre celulas B normales como sobre celulas B malignas. Otros nombres para el CD20 en la literatura incluyen "antfgeno restringido a linfocitos B" y "Bp35". El antfgeno CD20 esta descrito, por ejemplo, en Clark et al. PNAS (EE.UU.) 82:1766 (1985).
De acuerdo con la presente invencion, "anticuerpo" o "inmunoglobulina" tienen el mismo significado y se utilizan por igual en la presente invencion. El termino "anticuerpo" como se emplea en esta memoria se refiere a moleculas de inmunoglobulina y a porciones inmunologicamente activas de moleculas de inmunoglobulina, es decir, moleculas que contienen un sitio de union de antfgeno que se une inmunoespedficamente a un antfgeno. Como tal, el termino "anticuerpo" no solo incluye moleculas de anticuerpo completas, sino tambien fragmentos de anticuerpo asf como variantes (incluyendo derivados) de anticuerpos y fragmentos de anticuerpo. En anticuerpos naturales, dos cadenas pesadas estan enlazadas entre sf mediante enlaces de disulfuro y cada cadena pesada esta enlazada con una cadena ligera mediante un enlace de disulfuro. Existen dos tipos de cadena ligera, lambda (l) y kappa (k). Existen cinco clases (o isotipos) principales de cadena pesada que determinan la actividad funcional de una molecula de anticuerpo: IgM, IgD, IgG, IgA e IgE. Cada cadena contiene distintos dominios de secuencia. La cadena ligera incluye dos dominios, un dominio variable (VL) y un dominio constante (CL). La cadena pesada incluye cuatro dominios, un dominio variable (VH) y tres dominios constantes (CH1, CH2 y CH3, designados colectivamente como CH). Las regiones variables tanto de las cadenas ligeras (VL) como de las cadenas pesadas (VH) determinan el reconocimiento de union y la especificidad con respecto al antfgeno. Los dominios de region constante de las cadenas ligeras (CL) y pesadas (CH) confieren importantes propiedades biologicas tales como asociacion de cadenas de anticuerpo, secrecion, movilidad transplacentaria, union de complemento, y union a receptores Fc (FcR). El fragmento Fv es la parte N-terminal del fragmento Fab de una inmunoglobulina y consiste en las porciones variables de una cadena ligera y una cadena pesada. La especificidad del anticuerpo reside en la complementariedad estructural entre el sitio de combinacion de anticuerpos y el determinante antigenico. Los sitios de combinacion de anticuerpos estan formados por residuos que proceden principalmente de las regiones hipervariables o determinantes de la complementariedad (CDR). Ocasionalmente, residuos de regiones no hipervariables o de armazon (FR) influyen en la estructura de dominio global y por lo tanto en el sitio de combinacion. Las regiones determinantes de la complementariedad o CDR se refieren a secuencias de aminoacidos que definen juntas la afinidad de union y la especificidad de la region Fv natural de un sitio de union de
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inmunoglobulina nativa. Las cadenas ligeras y pesadas de una inmunoglobulina tienen en cada caso tres CDR, designadas L-CDR1, L-CDR2, L-CDR3 y H-CDR1, H-CDR2, H-CDR3, respectivamente. Por consiguiente, un sitio de union de antigeno incluye seis CDR, que comprenden la CDR establecida tanto desde una region V de cadena pesada como desde una region V de cadena ligera. Las regiones de armazon (FR) se refieren a secuencias de aminoacidos interpuestas entre CDR.
El concepto "anticuerpo quimerico" se refiere a un anticuerpo que comprende un dominio VH y un dominio VL de un anticuerpo de la invencion, y un dominio CH y un dominio CL de un anticuerpo humano.
De acuerdo con la descripcion, el termino "anticuerpo humanizado" se refiere a un anticuerpo que tiene un armazon de region variable y regiones constantes procedentes de un anticuerpo humano, pero que conserva las CDR del anticuerpo de la descripcion.
El termino "Fab" indica un fragmento de anticuerpo que tiene un peso molecular de aproximadamente 50.000 y actividad de union de antfgeno, en el que aproximadamente la mitad del lado N-terminal de la cadena H y toda la cadena L, entre fragmentos obtenidos tratando IgG con una proteasa, papama, estan unidas entre sf a traves de un enlace de disulfuro.
El termino "F(ab')2" se refiere a un fragmento de anticuerpo que tiene un peso molecular de aproximadamente 100.000 y actividad de union de antfgeno, que es ligeramente mas grande que el Fab unido a traves de un enlace de disulfuro de la region bisagra, entre fragmentos obtenidos tratando IgG con una proteasa, pepsina.
El termino "Fab'" se refiere a un fragmento de anticuerpo que tiene un peso molecular de aproximadamente 50.000 y actividad de union de antfgeno, que se obtiene cortando un enlace de disulfuro de la region bisagra del F(ab')2.
Un polipeptido Fv de cadena sencilla ("scFv") es un heterodfmero VH::VL enlazado de forma covalente que normalmente se expresa a partir de una fusion genica, incluyendo genes codificadores de VH y VL enlazados mediante un enlazador codificador de peptido. "dsFv" es un heterodfmero VH::VL estabilizado mediante un enlace de disulfuro. Los fragmentos de anticuerpo divalentes y multivalentes se pueden formar espontaneamente mediante asociacion de scFv monovalentes o se pueden generar por copulacion de scFv monovalentes mediante un enlazador peptfdico, tal como sc(Fv)2 divalente.
El termino "diacuerpos" se refiere a pequenos fragmentos de anticuerpo con dos sitios de union de antfgeno, comprendiendo dichos fragmentos un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado con un dominio variable de cadena ligera (VL) en la misma cadena polipeptfdica (VH-VL). Mediante el uso de un enlazador que es demasiado corto para posibilitar un apareamiento entre dos dominios de la misma cadena, los dominios estan forzados a aparearse con los dominios complementarios de otra cadena y crear dos sitios de union de antfgeno.
Los "anticuerpos agotadores de celulas B" se definen como aquellos anticuerpos que se unen a un marcador de superficie de celulas B sobre la superficie de celulas B y median en la destruccion o el agotamiento de estas cuando se unen a dicho marcador de superficie celular. El concepto incluye fragmentos de anticuerpo. Dichos anticuerpos incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos anti-CD20, anti-CD 19, anti-CD22, anti- CD21, anti-CD23, anti-CD28, anti- CD37, anti-CD40, anti-CD52. Un ejemplo de un anticuerpo anti-CD20 es el RITUXAN® (rituximab). Los anticuerpos agotadores de celulas B tambien incluyen anticuerpos que destruyen celulas B a traves de otros mecanismos. Por ejemplo, incluyen anticuerpos radiomarcados que facilitan la destruccion de celulas B mediante la union a la superficie de las celulas B y el suministro de una dosis de radiacion letal. Estos incluyen 131 I-Lym-1 (anti-HLA-D), 131 I-tositumomab (BEXXAR®), ibritumomab tiuxetan (Y-90, In-I 1 1 ZEVALIN®) y 90 Y-epratuzumab.
En el contexto de la invencion, el termino "tratar" o "tratamiento", como se emplea en esta memoria, significa invertir, aliviar o inhibir el progreso del trastorno o la enfermedad a los que se aplica dicho termino, o uno o mas smtomas de dicho trastorno o enfermedad. El concepto "cantidad terapeuticamente eficaz" esta previsto para una cantidad minima de agente activo que es necesaria para otorgar un beneficio terapeutico a un individuo. Por ejemplo, una "cantidad terapeuticamente eficaz" para un paciente es una cantidad tal que induce, mejora o causa de otro modo una mejona de los smtomas patologicos, la progresion de la enfermedad o las condiciones fisiologicas asociadas con un trastorno o con la resistencia a sucumbir a un trastorno.
En su sentido mas amplio, el termino "prevenir" o "prevencion" se refiere a prevenir que se produzca la enfermedad o trastorno en un individuo que todavfa no ha sido diagnosticado como paciente de la misma.
El termino "paciente" se refiere a cualquier individuo (preferiblemente humano) aquejado de aterosclerosis o susceptible de padecer aterosclerosis.
"Farmaceuticamente" o "farmaceuticamente aceptable" se refiere a entidades moleculares y composiciones que no producen una reaccion adversa, alergica u otra reaccion inapropiada cuando son administradas a un mairnfero, en especial un humano, segun corresponda. Un vehmulo o excipiente farmaceuticamente aceptable se refiere a un material de carga, diluyente o encapsulante, o a una formulacion auxiliar de cualquier tipo, solidos, semisolidos o lfquidos no toxicos.
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Metodos de tratamiento
La presente descripcion se refiere a un metodo para prevenir o tratar la aterosclerosis en un paciente que lo requiera, que comprende la etapa de agotar la poblacion de celulas B de dicho paciente.
Mas particularmente, la presente invencion se refiere a un metodo para prevenir o tratar el infarto de miocardio en un paciente que lo requiera, que comprende la etapa de administrar un anticuerpo anti-CD20 a dicho paciente.
El metodo de acuerdo con la presente invencion puede ser suministrado a un paciente al que se le han diagnosticado trastornos isquemicos con necrosis miocardica, tales como infarto de miocardio con elevacion del segmento ST o infarto de miocardio sin elevacion del segmento ST.
De hecho, dichas patologfas son complicaciones de la aterosclerosis y por lo tanto son consideradas como indicativas de aterosclerosis.
En una realizacion particular, el agente agotador de celulas B puede consistir en un anticuerpo agotador de celulas B.
Los anticuerpos dirigidos contra un marcador de superficie de celulas B se pueden obtener de acuerdo con metodos conocidos administrando el antfgeno o epftopo apropiado a un animal huesped seleccionado, por ejemplo, entre cerdos, vacas, caballos, conejos, cabras, ovejas y ratones, entre otros. Es posible utilizar diversos adyuvantes conocidos en la tecnica para mejorar la produccion de anticuerpos. Aunque los anticuerpos utiles en la practica de la invencion pueden ser policlonales, son preferibles los anticuerpos monoclonales.
Los anticuerpos monoclonales se pueden preparar y aislar utilizando cualquier tecnica que proporcione la produccion de moleculas de anticuerpo mediante lmeas celulares continuas en cultivo. Las tecnicas de produccion y aislamiento incluyen, pero no se limitan a, la tecnica de hibridoma, la tecnica de hibridoma de celulas B humanas y la tecnica de higridoma-EBV. Alternativamente, algunas tecnicas descritas para la produccion de anticuerpos de cadena sencilla (vease, por ejemplo, la Patente de los EE.UU. n° 4.946.778) se pueden adaptar para producir anticuerpos de cadena sencilla contra un marcador de superficie de celulas B. Los anticuerpos utiles de acuerdo con la invencion tambien incluyen fragmentos de anticuerpo incluyendo, pero sin limitarse a, fragmentos F(ab')2, que se pueden generar mediante digestion de pepsina de una molecula de anticuerpo intacta, y fragmentos Fab, que se pueden generar reduciendo los puentes de disulfuro de los fragmentos F(ab')2. Alternativamente se pueden construir bibliotecas de expresion de Fab y/o scFv para posibilitar una identificacion rapida de fragmentos que tengan la especificidad deseada con respecto al marcador de superficie de celulas B.
Tambien es posible preparar, de acuerdo con tecnicas conocidas, anticuerpos humanizados de acuerdo con la presente descripcion y fragmentos de anticuerpo de los mismos. Los "anticuerpos humanizados" son formas de anticuerpos quimericos no humanos (por ejemplo de roedor) que contienen una secuencia minima derivada de inmunoglobulina no humana. En su mayona, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las que residuos de una region hipervariable (CDR) del receptor estan sustituidos por residuos de una region hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donante), tal como raton, rata, conejo o primate no humano, con la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, residuos de region de armazon (FR) de la inmunoglobulina humana son sustituidos por residuos no humanos correspondientes. Ademas, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentran en el anticuerpo receptor o en el anticuerpo donante. Estas modificaciones se realizan para perfeccionar adicionalmente el rendimiento de los anticuerpos. En general, el anticuerpo humanizado comprendera sustancialmente todos los, al menos uno y normalmente dos, dominios variables, en los que todos o sustancialmente todos los bucles hipervariables corresponden a los de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las FR son las de una secuencia de inmunoglobulina humana. Opcionalmente, el anticuerpo humanizado tambien comprendera al menos una porcion de una region constante (Fc) de inmunoglobulina, normalmente la de una inmunoglobulina humana. Por ejemplo, Winter (Patente de los EE.UU. n° 5.225.539) y Boss (Celltech, Patente de los EE.UU. n° 4.816.397) describen metodos para producir anticuerpos humanizados.
Despues de producir anticuerpos dirigidos contra un marcador de superficie de celulas B tal como se ha descrito mas arriba, los expertos en la tecnica pueden seleccionar facilmente aquellos que agotan celulas B, por ejemplo aquellos que agotan celulas B a traves de citotoxicidad dependiente de anticuerpos mediada por celulas (ADCC), citotoxicidad dependiente de complemento (CDC), inhibicion de la proliferacion de celulas B o induccion de muerte de celulas B (por ejemplo a traves de apoptosis).
En una realizacion particular, el anticuerpo agotador de celulas B puede consistir en un anticuerpo dirigido contra un marcador de superficie de celulas B que esta conjugado con un agente citotoxico o un agente inhibidor del crecimiento.
Por consiguiente, la invencion preve el uso de inmunoconjugados que comprenden un anticuerpo contra un marcador de superficie de celulas B conjugado con un agente citotoxico o un agente inhibidor del crecimiento.
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Un "agente inhibidor del crecimiento", cuando se utiliza en la presente memoria, se refiere a un compuesto o a una composicion que inhibe el crecimiento de una celula, en especial una celula B, bien in vitro, bien in vivo. Los ejemplos de agentes inhibidores del crecimiento incluyen agentes que bloquean la progresion del ciclo celular, tales como agentes que inducen una detencion de G1 y una detencion de la fase M. Los bloqueadores de fase M clasicos incluyen las vincas (vincristina y vinblastina), taxanos, e inhibidores de la topoisomerasa II tales como doxorrubicina, epirrubicina, daunorrubicina, etoposido, y bleomicina. Estos agentes que detienen G1 tambien se extienden a una detencion de la fase S, por ejemplo agentes alquilantes de ADN tales como tamoxifeno, prednisona, dacarbazina, mecloretamina, cisplatino, metotrexato y 5-fluorouracilo.
El concepto "agente citotoxico", como se emplea en esta memoria, se refiere a una sustancia que inhibe o previene la funcion de celulas y/o que provoca la destruccion de celulas. El concepto incluye isotopos radiactivos (por ejemplo, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, e isotopos radiactivos de Lu), agentes quimioterapeuticos, por ejemplo metotrexato, adriamicina, alcaloides vinca (vincristina, vinblastina, etoposido), doxorrubicina, melfalan, mitomicina C, clorambucilo, daunorrubicina u otros agentes intercalantes, enzimas y fragmentos de las mismas tales como enzimas nucleoltticas, antibioticos, y toxinas tales como toxinas de moleculas pequenas o toxinas enzimaticamente activas de origen bacteriano, fungico, vegetal o animal, incluyendo fragmentos y/o variantes de las mismas, por ejemplo gelonina, ricina, saporina, y los diversos agentes antitumorales o anticancerosos descritos mas abajo. Mas abajo se describen otros agentes citotoxicos. Un agente tumoricida causa destruccion de celulas tumorales.
La conjugacion de los anticuerpos de la invencion con agentes citotoxicos o agentes inhibidores del crecimiento se puede realizar utilizando una variedad de agentes de copulacion protemica bifuncional, incluyendo, pero sin limitarse a, (2-piridilditio) propionato de N-succinimidilo (SPDP), (N-maleimidometil) ciclohexano-1-carboxilato de succinimidilo, iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoesteres (tal como adipimidato de dimetilo HCL), esteres activos (tal como suberato de disuccinimidilo), aldetndos (tal como glutaraldetndo), compuestos bis-azido (tal como bis (p-azidobenzofl) hexanodiamina), derivados de bis-diazonio (tal como bis-(p-diazoniobenzoM)- etilenodiamina), diisocianatos (tal como 2,6-diisocianato de tolieno), y compuestos de fluor bis-activos (tal como 1,5- difluoro-2,4-dinitrobenceno). Por ejemplo, se puede preparar una inmunotoxina de ricino tal como se describe en Vitetta et al. (1987). El acido 1-isotiocianatobencil metildietileno triaminopenta-acetico marcado con carbono (MX- DTPA) es un ejemplo de agente quelante para conjugacion de radionucleotidos con el anticuerpo (WO 94/11026).
Alternativamente se puede preparar una protema de fusion que comprende el anticuerpo y agente citotoxico o agente inhibidor del crecimiento, mediante tecnicas recombinantes o smtesis de peptidos. La longitud del ADN puede comprender regiones respectivas codificadoras de las dos porciones del conjugado, bien adyacentes entre sf, bien separadas por una region codificadora de un peptido enlazador que no destruye las propiedades deseadas del conjugado.
En una realizacion particular, el marcador de superficie de celulas B es CD20.
Por lo tanto, en una realizacion preferida de la invencion, el agente agotador de celulas B es un anticuerpo anti- CD20.
Los ejemplos de anticuerpos agotadores previstos por la invencion incluyen anticuerpos que se unen al antfgeno CD20: "C2B8", que es "rituximab" ("RITuXaN®") (Patente de los EE.UU. n° 5,736,137, incorporada expresamente en esta memoria por referencia); el anticuerpo murido 2138 marcado con itrio-[90] designado "Y2B8" (Patente de los EE.UU. n° 5,736,137, incorporada expresamente en esta memoria por referencia); IgG2a murida "131" marcada opcionalmente con 1311 para generar el anticuerpo "1311-B1" (BEXxArTM®) (Patente de los EE.UU. n° 5,595,721, incorporada expresamente en esta memoria por referencia); anticuerpo monoclonal murido "1F5" (Press et al. Blood 69(2): 584-591 (1987)); anticuerpo "quimerico 2H7" (Patente de los EE.UU. n° 5.677.180 incorporada expresamente en esta memoria por referencia); y anticuerpos monoclonales L27, G28-2, 93-1133, B-C1 o NU-B2 disponibles de International Leukocyte Typing Workshop (Valentine et al., en: Leukocyte Typing III (M cMichael, Ed., p. 440, Oxford University Press (1987)).
Los terminos "rituximab" o "RITUXAN®" se refieren aqrn al anticuerpo monoclonal quimerico murido/humano producido por ingeniena genetica dirigido contra el antfgeno CD20 y designado "C2B8" en la Patente de los EE.UU. n° 5.736.137, incorporada expresamente en esta memoria por referencia. El anticuerpo es una inmunoglobulina kappa IgG que contiene secuencias de region variable de cadena ligera y cadena pesada muridas y secuencias de region constante humanas. El rituximab tiene una afinidad de union por el antfgeno CD20 y de aproximadamente 8,0 nM. Esta comercialmente disponible, por ejemplo de Genentech (South San Francisco, CA).
El agente agotador de celulas B de la invencion se puede administrar en forma de una composicion farmaceutica, tal como se describe mas abajo.
Preferiblemente, dicho agente agotador de celulas B se administra en una cantidad terapeuticamente eficaz.
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Una "cantidad terapeuticamente eficaz" quiere decir una cantidad suficiente del agente agotador de celulas B para tratar o prevenir la aterosclerosis con una relacion beneficio/riesgo razonable aplicable a cualquier tratamiento medico.
Se entendera que el uso periodico total de los compuestos y las composiciones de la presente invencion sera decidido por el medico tratante dentro del alcance del buen juicio medico. El nivel de dosis terapeuticamente eficaz espedfico para cualquier paciente particular dependera de diversos factores, incluyendo el trastorno tratado y la gravedad del mismo; la actividad del compuesto espedfico empleado; la composicion espedfica empleada, la edad, el peso corporal, la salud general, el sexo y la dieta del paciente; el tiempo de administracion, la via de administracion, y la tasa de excrecion del compuesto espedfico empleado; la duracion del tratamiento; los farmacos utilizados en combinacion o de forma coincidente con el polipeptido espedfico empleado; y factores similares notoriamente conocidos en la tecnica medica. Por ejemplo, es muy conocido por el experto comenzar con dosis del compuesto en niveles menores de los requeridos para alcanzar el efecto terapeutico deseado y aumentar gradualmente la dosis hasta alcanzar el efecto deseado. No obstante, la dosis diaria de los productos puede variar dentro de un amplio margen desde 0,01 hasta 1.000 mg por adulto al dfa. Preferiblemente, las composiciones contienen 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1,0, 2,5, 5,0, 10,0, 15,0, 25,0, 50,0, 100, 250 y 500 mg del ingrediente activo para el ajuste sintomatico de la dosis para el paciente que se ha de tratar. Un medicamento contiene normalmente desde aproximadamente 0,01 mg hasta aproximadamente 500 mg del ingrediente activo, preferiblemente desde 1 mg hasta aproximadamente 100 mg del ingrediente activo. Una cantidad eficaz del farmaco se suministra generalmente en un nivel de dosis desde 0,0002 mg/kg hasta aproximadamente 20 mg/kg de peso corporal al dfa, en especial desde aproximadamente 0,001 mg/kg hasta 7 mg/kg de peso corporal al dfa.
Composiciones farmaceuticas
El agente agotador de celulas B de la presente descripcion se puede combinar con excipientes farmaceuticamente aceptables, y opcionalmente matrices de liberacion prolongada, tales como polfmeros biodegradables, para formar composiciones terapeuticas.
En las composiciones farmaceuticas de la presente descripcion, el principio activo, solo o en combinacion con otro principio activo, puede ser administrado en una forma de administracion unitaria, como una mezcla con soportes farmaceuticos convencionales, a animales y seres humanos. Las formas de administracion unitarias adecuadas comprenden formas de administracion por via oral tales como comprimidos, capsulas de gel, polvos, granulos y suspensiones o soluciones orales, formas de administracion sublinguales y bucales, aerosoles, implantes, formas de administracion subcutanea, transdermica, topica, intraperitoneal, intramuscular, intravenosa, subdermica, transdermica, intratecal e intranasal, y formas de administracion rectal.
Preferiblemente, las composiciones farmaceuticas contienen vehnculos que son farmaceuticamente aceptables para una formulacion apta para ser inyectada. Estos pueden ser, en particular, soluciones salinas esteriles isotonicas (fosfato monosodico o disodico, cloruro de sodio, potasio, calcio o magnesio y similares, o mezclas de estas sales), o composiciones secas, en especial liofilizadas, que despues de la adicion, dependiendo del caso, de agua esterilizada o solucion salina fisiologica, permiten la constitucion de soluciones inyectables.
Las formas farmaceuticas adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones o dispersiones acuosas esteriles; formulaciones que incluyen aceite de sesamo, aceite de cacahuete o propilenglicol acuoso; y polvos esteriles para la preparacion extemporanea de soluciones o dispersiones inyectables esteriles. En todos los casos, la forma ha de ser esteril y ha de ser suficientemente fluida para poder ser inyectada facilmente con jeringuilla. Ha de ser estable bajo las condiciones de fabricacion y almacenamiento y se ha de preservar contra la accion contaminante de microorganismos tales como bacterias y hongos.
Las soluciones que comprenden compuestos de la presente descripcion en forma de base libre o sales farmacologicamente aceptables se pueden preparar en agua mezclada adecuadamente con un agente tensioactivo, tal como hidroxipropilcelulosa. Tambien se pueden preparar dispersiones en glicerol, polietilenglicoles lfquidos, y mezclas de los mismos, y en aceites. Bajo condiciones de almacenamiento y uso normales, estas preparaciones contienen un conservante para prevenir el crecimiento de microorganismos.
El agente agotador de celulas B de la presente descripcion se puede formular en una composicion en una forma neutra o forma de sal. Las sales farmaceuticamente aceptables incluyen las sales de adicion de acido (formadas con los grupos amino libres de la protema) y que se forman con acidos inorganicos tales como, por ejemplo, acidos clorhndricos o fosforicos, o acidos organicos tales como acetico, oxalico, tartarico, mandelico y similares. Las sales formadas con los grupos carboxilo libres tambien se pueden derivar de bases inorganicas tales como, por ejemplo, hidroxidos de sodio, potasio, amonio, calcio o ferricos, y bases organicas tales como isopropilamina, trimetilamina, histidina, procama y similares.
El vehfculo tambien puede ser un disolvente o medio de dispersion que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol lfquido, y similares), mezclas adecuadas de los mismos, y aceites vegetales. La fluidez apropiada se puede mantener, por ejemplo, mediante el uso de un revestimiento, tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamano de partfcula requerido en caso de dispersion, y mediante el
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uso de agentes tensioactivos. La prevencion de la accion de microorganismos se puede lograr mediante varios agentes antibacterianos y antifungicos, por ejemplo parabenos, clorobutanol, fenol, acido sorbico, timerosal y similares. En muchos casos sera preferible incluir agentes isotonicos, por ejemplo azucares o cloruro de sodio. La absorcion prolongada de las composiciones inyectables se puede lograr utilizando en las composiciones agentes retardadores de la absorcion, por ejemplo monoestearato de aluminio y gelatina.
Las soluciones inyectables esteriles se preparan mediante incorporacion de los polipeptidos activos en la cantidad requerida en el disolvente apropiado con varios de los otros ingredientes arriba enumerados, en caso necesario, seguida de esterilizacion filtrada. Por regla general, las dispersiones se preparan incorporando los diversos ingredientes activos esterilizados en un vehfculo esteril que contiene el medio de dispersion basico y los otros ingredientes requeridos entre los arriba enumerados. En el caso de los polvos esteriles para la preparacion de soluciones inyectables esteriles, los metodos de preparacion preferidos son las tecnicas de secado al vado y liofilizacion, que proporcionan un polvo del ingrediente activo mas cualquier ingrediente deseado adicional a partir de una solucion del mismo previamente filtrada de forma esteril.
Despues de la formulacion, las soluciones se administraran de un modo compatible con la formulacion de dosificacion y en una cantidad que sea terapeuticamente eficaz. Las formulaciones se administran facilmente en diversas formas de dosificacion, tal como el tipo de soluciones inyectables arriba descritas, pero tambien se pueden emplear capsulas de liberacion de farmaco y similares.
Para la administracion parenteral en una solucion acuosa, por ejemplo, la solucion se debena tamponar adecuadamente en caso necesario y el diluyente lfquido primero se debena volver isotonico con suficiente solucion salida o glucosa. Estas soluciones acuosas particulares son especialmente adecuadas para administracion intravenosa, intramuscular, subcutanea e intraperitoneal. A este respecto, los expertos en la tecnica conoceran medios acuosos esteriles que pueden ser empleados segun la presente descripcion. Por ejemplo, una dosis se podna disolver en un 1 ml de solucion isotonica de NaCl y bien anadir a 1.000 ml de fluido de hipodermoclisis, bien inyectar en el sitio de infusion propuesto. Necesariamente se producira alguna variacion de la dosis dependiendo del estado del individuo tratado. En todo caso, la persona responsable de la administracion determinara la dosis apropiada para el paciente individual.
El agente agotador de celulas B de la presente descripcion puede ser formulado dentro de una mezcla terapeutica para que comprenda aproximadamente de 0,0001 a 1,0 miligramos, o aproximadamente de 0,001 a 0,1 miligramos, o aproximadamente de 0,1 a 1,0 o incluso aproximadamente 10 miligramos por dosis mas o menos. Tambien se pueden administrar dosis multiples.
Ademas de los compuestos de la invencion formulados para administracion parenteral, tal como inyeccion intravenosa o intramuscular, otras formas farmaceuticamente aceptables incluyen, por ejemplo, comprimidos u otros solidos para administracion oral; formulaciones liposomales; capsulas de liberacion temporizada; y cualquier otra forma actualmente utilizada.
La invencion se ilustrara adicionalmente con referencia a las siguientes figuras y ejemplos.
Figuras
Figura 1: Agotamiento de celulas B en la sangre despues de 3 meses de tratamiento CD20 antimurido, una inyeccion intraperitoneal (200 |jg) cada 3 semanas.
Figura 2: Agotamiento de celulas B en el bazo despues de 3 meses de tratamiento anti-CD20, una inyeccion intraperitoneal (200 jg) cada 3 semanas. Las Figuras 2A y 2B representan el agotamiento de celulas B en 2 experimentos diferentes.
Figura 3: Agotamiento de celulas B (B220 alto) en medula osea despues de 3 meses de tratamiento anti-CD20, una inyeccion intraperitoneal (200 jg) cada 3 semanas.
Figura 4: El agotamiento de celulas B induce una disminucion de la expresion de CD69 por celulas CD4 T esplenicas, lo que parece indicar una desactivacion de celulas CD4 T.
Figura 5: El agotamiento de celulas B induce una disminucion de la expresion de CD44 alto por celulas CD4 T esplenicas, lo que parece indicar una desactivacion de celulas CD4 T.
Figura 6: El agotamiento de celulas B induce una disminucion de la incorporacion de BrdU in vivo por celulas CD4 T esplenicas, lo que indica una disminucion de la proliferacion de celulas cD4 T in vivo.
Figura 7: Produccion de citoquinas por celulas CD4+ T esplenicas purificadas, estimuladas in vitro con anticuerpo anti-CD3 en presencia de celulas dendnticas CD11c+ purificadas.
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Figura 8: El recuento de celulas de neutrofilo (Ly6G+ CD11b+) y el recuento de celulas de monocito (CD11b+/Ly6G- /Ly6C alto, bajo o neg.) se evaluo utilizando citometna de flujo (primer conjunto de experiments). Los inventores encontraron un mayor recuento de celulas de neutrofilo y monocito despues de 3 meses de tratamiento anti-CD20.
Figura 9: El recuento de celulas de neutrofilo (Ly6G+ CD11b+) y el recuento de celulas de monocito (CD11b+/Ly6G- /Ly6C alto, bajo o neg.) se evaluo utilizando citometna de flujo (segundo conjunto de experiments). Los inventores encontraron un mayor recuento de celulas de neutrofilo y monocito despues de 3 meses de tratamiento anti-CD20.
Figura 10: El peso y los niveles de colesterol en plasma eran similares entre los grupos despues de 3 meses de tratamiento.
Figura 11: Reduccion significativa en el tamano de lesion de seno aortico en los grupos de ratones tratados con anticuerpo anti-CD20 (MB20-11) despues de 6 o 12 semanas de tratamiento.
Figura 12: El tratamiento con mAb CD20 (a-CD20) agota celulas B y reduce el desarrollo de la aterosclerosis. Los cuadros A a D muestran una reduccion del desarrollo de aterosclerosis despues de una terapia a-CD20 en 4 experimentos diferentes utilizando ratones Apoe-' o Ldlr-' alimentados bien con dieta chow (CD) (alimento equilibrado para roedeores), bien con dieta occidental (WD). Por cada configuracion experimental se muestran microfotograffas representativas de senos aorticos con coloracion Oil red O junto con cuantificacion del tamano de lesion en la mtima. Las barras indican valores medianos.
Figura 13: El tratamiento con mAb CD20 (a-CD20) reduce el desarrollo de aterosclerosis en la aorta toracica. Analisis cuantitativo de la extension de coloracion Oil red O en aortas toracicas de ratones Apoe-' alimentados con una dieta occidental durante 12 semanas y tratados con a-CD20 o con un anticuerpo de control. Los datos (valores medios + e.e.m.) son representativos de 9 (control) a 10 ratones (a-CD20) por grupo.
Figura 14: Agotamiento de celulas B despues de infarto de miocardio. Se muestra la funcion cardfaca cuantitativa. Ejemplo 1: Agotamiento de celulas B y aterosclerosis Resultados y discusion
El desarrollo de la aterosclerosis esta asociado con signos de activacion de celulas B, en particular manifestados por una produccion incrementada de (auto)anticuerpos antilipoprotema de baja densidad oxidada (oxLDL) de tipo IgM natural y de tipos IgG adaptativos (Caligiuri et al., 2002; Shaw et al., 2000). Sin embargo, a diferencia de otras enfermedades mediadas por el sistema inmunitario, es decir, artritis reumatoide y lupus eritematoso sistemico, a las celulas B se les ha asignado un papel protector en la aterosclerosis (Caligiuri et al., 2002; Major et al., 2002; Binder et al., 2004; Miller et al., 2008). Aunque los anticuerpos anti-ox-LDL de tipos IgG muestran una asociacion variable con riesgo vascular, los niveles de anticuerpos anti-ox-LDL de tipo IgM en circulacion se han relacionado mas frecuentemente con un riesgo vascular reducido en humanos (Karvonen et al., 2003; Tsimikas et al., 2007). En ratones, efectos ateroprotectores mediados por IL-5 e IL-33 se han asociado indirectamente con una activacion de celulas B1 espedfica y una produccion incrementada de anticuerpos anti-oxLDL de tipo IgM natural (Binder CJ et al, 2004; Miller Am et al, 2005). Por otro lado, la esplenectoirna o la transferencia de medula osea con deficiencia de |jMT (deficiencia de celulas B) a ratones susceptibles de aterosclerosis irradiados letalmente resultaba en una reduccion profunda de IgG o de la produccion total de anticuerpos anti-oxLDL y estaba asociada con la aceleracion del desarrollo de lesiones.
Estos estudios condujeron al paradigma actual de que la activacion de celulas B global es ateroprotectora.
Sin embargo, sorprendentemente, todavfa no se ha investigado si un agotamiento de celulas B maduras acelera el desarrollo de lesiones ateroscleroticas en ratones inmunocompetentes, como es de esperar a partir de los estudios previos. Esta es una cuestion cntica dado el riesgo potencialmente important de complicaciones cardiovasculares que pueden surgir del uso clmico de inmunoterapia dirigida a CD20 agotadora de celulas B en pacientes con artritis reumatoide severa o lupus eritomatoso sistemico, que presentan un riesgo particularmente alto de enfermedades cardiovasculares.
Con el fin de evaluar directamente el papel de las celulas B en la aterosclerosis, los inventores han examinado el desarrollo de lesiones en ratones con o sin agotamiento de celulas B. Primero utilizaron ratones Apoe-/' alimentados con una dieta occidental rica en materia grasa, un modelo previamente conocido y asociado con una activacion significativa de celulas B y una alta produccion de anticuerpos anti-ox-LDL, y previamente utilizado para evaluar el papel protector de las celulas B en la aterosclerosis. Para agotar las celulas B, los ratones fueron tratados cada 3 semanas con un anticuerpo CD20 monoclonal de raton previamente validado (Uchida et al., Int Immunol, 2004; Uchida et al., J Exp Med, 2004) durante 6 o durante 12 semanas. Los ratones de control recibieron un anticuerpo monoclonal de control (mAb). Como era de esperar, el tratamiento con mAb CD20 condujo a una reduccion mantenida y profunda de la cantidad de celulas B maduras en la sangre (Figura 1), el bazo (Figura 2), el peritoneo y la medula osea. Las celulas B220alto IgM+ se agotaron en gran medida (del 92% al 100%) en todos los sitios estudiados. Las celulas B220bajo IgM+ de bazo tambien mostraron una reduccion notable (~ 80%), pero, como ya se
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habfa observado previamente, las celulas B220bajo (IgM+) de medula osea inmaduras (Figura 3) eran menos susceptibles al agotamiento mediado por mAb CD20. El tratamiento con mAb CD20 durante 6 semanas no afecto a los niveles de colesterol en plasma (6,4 + 0,9 frente a 6,3 + 0,8 g/l en el grupo de control y el grupo tratado con mAb CD20, respectivamente, P = 0,88), pero inesperadamente condujo a una reduccion significativa, no a una aceleracion, del desarrollo de lesiones ateroscleroticas (Figura 12A). Los inventores analizaron a continuacion los experimentos de ratones Apoe-' tratados durante 12 semanas bajo una dieta rica en materia grasa y todavfa encontraron una reduccion significativa de la aterosclerosis en 2 sitios vasculares diferentes (Figura 12B y Figura 13), a pesar de niveles similares de colesterol en plasma (18,7 + 1,1 frente a 17,9 + 1,0 g/l en el grupo IgG de control y el grupo tratado con anti-CD20, respectivamente, P = 0,68). Con el fin de descartar la posibilidad de que el efecto ateroprotector del tratamiento con mAb CD20 se debiera al uso de un modelo de raton que generara una inflamacion excesiva en respuesta a una sobrecarga de lfpidos muy alta, el efecto de un agotamiento de celulas B se examino en ratones Apoe-' alimentados con una dieta chow. El tratamiento de estos ratones con anticuerpo CD20 durante 12 semanas tambien condujo a una reduccion significativa del desarrollo de lesiones (Figura 12C), a pesar de niveles similares de colesterol en plasma (5,5 + 0,6 frente a 5,7 + 0,8 g/l en el grupo IgG de control y el grupo tratado con anti-CD20, respectivamente, P = 0,96). Los niveles elevados de colesterol en plasma en ratones Apoe-' son en su mayona del subtipo de lipoprotema de muy baja densidad (VLDL), mientras que un nivel elevado de LDL es el principal factor de riesgo de aterosclerosis en humanos. Por lo tanto, los inventores examinaron los efectos del agotamiento de celulas B en el modelo de raton con deficiencia de receptor de LDL (LDLr-'). De nuevo, el tratamiento de ratones LDLr-' con mAb CD20 condujo a un agotamiento notable de celulas B y a una reduccion significativa de la aterosclerosis (Figura 12D).
En conjunto, estos estudios proporcionan una prueba solida de un papel proaterogenico insospechado de celulas B en tres modelos de raton de aterosclerosis.
Los inventores abordaron a continuacion los mecanismos potenciales responsables de la ateroproteccion despues del agotamiento de celulas B. Comprobaron que el tratamiento con anticuerpo agotador de CD20 resultaba en una reduccion profunda de anticuerpos anti-oxLDL de tipo IgG tanto despues de 6 como despues de 12 semanas de tratamiento, lo que era coherente con el agotamiento profundo de celulas B220alto en sangre, bazo y medula osea. Se podna argumentar que la reduccion de IgG anti-oxLDL podna haber limitado las consecuencias potencialmente perjudiciales de la formacion de inmunocomplejos en la aterosclerosis. Sin embargo, en otros estudios, y en particular despues de una esplenectoirna, se observo una profunda reduccion de niveles de IgG anti-oxLDL en asociacion con una aceleracion, no una reduccion, de la aterosclerosis. Por lo tanto, en ausencia de estudios que aborden directamente el papel de los anticuerpos anti-oxLDL de tipo IgG en la aterosclerosis, los cambios en los niveles de IgG anti-oxLDL despues de tratamiento con mAb CD20 no podfan ser considerados como responsables de la reduccion de lesiones. Los niveles de anticuerpos de tipo IgM bien contra LDL oxidadas con cobre, bien contra LDL modificadas con dialdetndo malonico, tambien se redujeron despues de 6 o 12 semanas de terapia dirigida CD20. Los anticuerpos de tipo IgM estan dotados de propiedades ateroprotectoras y su reduccion despues de terapia con mAB CD20 no podfa explicar la ateroproteccion, sino que, en lugar de ello, podna haber obstaculizado la reduccion de la aterosclerosis. No obstante, es interesante senalar que los anticuerpos anti-oxLDL de tipo IgM y los anticuerpos IgM T15id+ mostraban una reduccion mucho menor en comparacion con anticuerpos de tipo IgG, que podnan haber preservado una ruta ateroprotectora. Los anticuerpos de tipo IgM dominan la respuesta humoral a oxLDL en ratones Apoe-/' y aumentan incluso a una edad temprana (antes del inicio del tratamiento con mAb CD20 en este estudio), lo que podna explicar, al menos en parte, la persistencia de un nivel de IgM significativo despues de inmunoterapia de CD20, un tratamiento que no afecta drasticamente a tttulos de anticuerpos preexistentes. La persistencia de IgM tambien puede estar relacionada con el retraso requerido para agotar de forma notable las celulas B1 peritoneales utilizando mAb CD20.
Los inventores examinaron despues la composicion de lesiones ateroscleroticas para comprender mejor los mecanismos de la ateroproteccion. De forma interesante, el tratamiento con mAb CD20 estaba asociado con una reduccion significativa y espedfica de la acumulacion de linfocitos T dentro de las lesiones, lo que sugiere que las celulas B desempenan una funcion en el avance de inflamaciones de lesiones dependientes de celulas T. Como era de esperar en esta etapa de formacion de lesiones, se detectaron muy pocas celulas B dentro de las placas o dentro de la capa adventicia sin tener en cuenta el grupo de tratamiento, lo que sugiere que lo mas probable es que la modulacion de celulas T de lesion por la terapia con mAb CD20 se produjera como consecuencia de una modulacion sistemica de la funcion de celulas T despues de un agotamiento de celulas B sistemico. Para abordar esta hipotesis, los inventores examinaron la activacion y proliferacion de celulas T. De forma interesante, los inventores encontraron sistematicamente reducciones notables en la expresion de CD69 y CD44alto en celulas T CD4+ derivadas de bazo de ratones tratados con anticuerpo CD20 en comparacion con los controles tanto despues de 6 semanas como despues de 12 semanas de dieta rica en materia grasa, lo que indicaba una activacion de celulas T reducida. El agotamiento de celulas B tambien condujo a una reduccion significativa de la tincion con BrdU in vivo de celulas T CD4+CD25- efectoras, lo que sugiere una proliferacion reducida. Una activacion de celulas T reducida en ratones tratados con mAb CD20 tambien era coherente con la reduccion notable de expresion de CD40 en celulas dendnticas CD11c+. Por lo tanto, una consecuencia principal del agotamiento de celulas B utilizando anticuerpo CD20 es una reduccion notable de la activacion de celulas T in vivo, que podna explicar potencialmente su efecto ateroprotector.
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Las citoquinas derivadas de celulas T cambian significativamente el desarrollo de lesiones. Por consiguiente, los inventores examinaron las consecuencias del agotamiento de celulas B en la produccion de citoquinas por celulas T purificadas. Los inventores descubrieron una reduccion notable del IFN-y proaterogenico mediante celulas T purificadas recuperadas de ratones tratados con mAb CD20 en comparacion con controles. Se ha de senalar que esto estaba asociado con una desviacion de la respuesta inmunitaria hacia un aumento significativo de la produccion de IL-17A derivada de celulas T en animales tratados con mAb CD20. En estudios recientes en el laboratorio de los inventores se identifico un papel regulador y protector inesperado para la produccion de IL-17A en la aterosclerosis. Tambien se ha demostrado que la IL-17A modula la polarizacion de Th1. Con el fin de examinar si los cambios inducidos por mAb CD20 en el perfil de citoquinas de celulas T (Th1 reducido e IL17 aumentada) podnan ser responsables de la ateroproteccion dependiente de mAb CD20, se administro mAb CD20 a ratones Apoe-' (sometidos a dieta rica en materia grasa durante 6 semanas) en presencia de control o anticuerpo neutralizador anti- IL17A. La neutralizacion de IL17 condujo a un aumento de la produccion de IFN-y en las aortas ateroscleroticas y anulo por completo los efectos ateroprotectores de la terapia con mAb CD20, a pesar de unos niveles similares de colesterol en circulacion y a pesar de no haber cambios significativos en los niveles de anticuerpos anti-oxLDL.
Colectivamente, estos resultados identifican un papel hasta ahora inesperado de las celulas B en la direccion del desarrollo de la aterosclerosis a traves de la modulacion de la activacion de celulas T y la produccion de citoquinas. Los presentes resultados pueden parecer ir en contra de estudios previos que muestran que tanto la deficiencia de |jMT como la esplenectoirna aceleran la aterosclerosis en ratones. Sin embargo, estos estudios no abordan directamente el papel del agotamiento de celulas B maduras en la aterosclerosis en ratones inmunocompetentes. Otras diversas disfunciones de inmunocitos concomitantes pueden haber contribuido a un incremento del desarrollo de lesiones en animales con deficiencia de jMT. Ademas, la limitacion notificada de la aceleracion de la aterosclerosis en ratones esplenectomizados despues de reconstitucion con celulas B purificadas podna haber sido confundida por la reduccion significativa de los niveles de colesterol en plasma en ratones reconstituidos con celulas B y podna no ser atribuida selectivamente a celulas B ya que la reconstitucion de celulas T tambien dio como resultado una ateroproteccion. Por ultimo se ha de senalar que, aunque el agotamiento de celulas B ha limitado significativamente el desarrollo de lesiones en los presentes estudios, los papeles de subtipos espedficos de celulas B en la direccion o el control de la aterosclerosis merece una investigacion mas exhaustiva. Mas particularmente, sera importante abordar los papeles respectivos de celulas B reguladoras frente a celulas B no reguladoras en estos procesos.
En conclusion, los inventores proporcionan una prueba solida de que el agotamiento de celulas B maduras reduce el desarrollo de aterosclerosis en ratones. Estos resultados ponen en duda el paradigma de que la funcion general de las celulas B es ateroprotectora y muestran que un papel principal de las celulas B en la aterosclerosis consiste en dirigir la activacion de celulas T hacia un aumento de la respuesta inmunitaria de Th1 proaterogenica y una produccion limitada de IL-17 ateroprotectora. Aunque en las etapas tempranas de la aterosclerosis se puede detectar una infiltracion vascular de celulas B limitada, la acumulacion de celulas B aumenta sustancialmente con el tiempo dentro y alrededor de lesiones coronarias ateroscleroticas avanzadas y aneurismas aorticos abdominales ateroscleroticos, tanto en ratones como en humanos, y es incluso prominente en inflamaciones vasculares asociadas con otras enfermedades mediadas por el sistema inmunitario. La inhibicion de una activacion excesiva de celulas B a traves de agotamiento o inmunomodulacion puede limitar sustancialmente la inflamacion vascular y el desarrollo de lesiones ateroscleroticas.
Metodos
Animales. Todos los ratones se basaban en la variedad C57B1/6. Los ratones Apoe-' eran machos de 10 semanas de edad mantenidos con una dieta chow durante 12 semanas o sometidos a una dieta occidental (20% grasa, 0,15% colesterol, 0% colato) durante 6 o durante 12 semanas. Los ratones Ldlr-/' eran machos de 10 semanas de edad sometidos a una dieta occidental durante 6 semanas. A las 10 semanas de edad, los ratones fueron tratados por via intraperitoneal (i.p.) con un anticuerpo CD20 monoclonal de raton previamente validado (Uchida et al., Int Immunol, 2004; Uchida et al., J Exp Med, 2004) o con una IgG de control (200 jg cada 3 semanas), durante 6 o durante 12 semanas. En algunos experimentos, los ratones recibieron una inyeccion i.p. de anticuerpo espedfico anti-IL-17A neutralizador purificado (200 jg/raton, dos veces por semana) (Uyttenhove et al., 2006 y 2007; Wang et al., 2009) o de IgG de control durante 6 semanas. Los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices veterinarias francesas y las formuladas por la Comunidad Europea para el uso de animales en experimentacion (L358-86/609CEE), y fueron aprobados por la institucion Inserm de los inventores.
Extension y composicion de lesiones ateroscleroticas. La cuantificacion del tamano y la composicion de las lesiones se llevo a cabo tal como se ha descrito anteriormente (Taleb et al., 2007).
Recuperacion y purificacion de celulas, cultivo, proliferacion y ensayos de citoquinas. Unas celulas CD11c+ y CD4+ se purificaron y procesaron para ensayos de proliferacion celular y produccion de citoquinas tal como se ha descrito anteriormente de forma detallada (Taleb et al., 2007). Las producciones de IL-17 e IFN-y en los sobrenadantes se midieron utilizando ELISA espedficos (BD Biosciences y R&D Systems).
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Citometria de flujo. Anti-CD3g conjugado con APC (145-2C11), anti-CD4 conjugado con FITC- o PE-Cy7 (RM4-5), anti-CD25 conjugado con APC (PC61.5), anti-CD69 conjugado con PE (H1.2F3), anti-IgM conjugado con ApC (II/41), anti-CD86 conjugado con FlTC (GLl), anti-CD80 conjugado con PE (16-10A1), anti-CD40 conjugado con APC (lC10), anti-CD11c conjugado con PE-Cy7 (N418), anti-CD11b conjugado con PE-Cy7 (M 1/70) y anti-CD45R conjugado con PE (B220)(RA3-6B2) eran de eBioscience. Anti-CD5 conjugado con FiTc (53-7.3), anti-CD44 conjugado con biotina seguido por estreptavidina conjugada con APC, anti-CD45R conjugado con APC-Cy7 (B220) (RA3-6B2), anti-IFNy conjugado con APC (XMG1.2) y anti-IL17A conjugado con PE (TC11-18H10) eran de BD Biosciences. Para la tincion de sangre, los eritrocitos se sometieron a lisis utilizando solucion de lisis BD FACS (BD Biosciences). Para la tincion de citoquinas intracelulares, los linfocitos se estimularon in vitro con coctel de activacion de leucocitos (BD Biosciences) de acuerdo con las instrucciones del fabricante durante 4 horas. Antes de la permeabilizacion se llevo a cabo una tincion superficial utilizando un kit de tincion intracelular (eBioscience). Se emplearon una dispersion directa (FSC) y una dispersion lateral (SSC) para dar entrada a celulas vivas excluyendo eritrocitos, residuos y agregados celulares en poblaciones totales de esplenocitos, nodos linfaticos, medula osea y peritoneo. Las celulas se analizaron utilizando un citometro analttico BD Cantoll o BD LSRII (Becton Dickinson).
Marcado con bromodeoxiuridina (BrdU) y analisis celular. El marcado con BrdU se llevo a cabo tal como se ha descrito anteriormente (Fisson et al., 2007). Unas bombas miniosmoticas (ALZET1007D; Charles River Laboratories), que suministraban 1,2 mg de BrdU al dfa (Sigma-Aldrich) durante 7 dfas, fueron trasplantadas a ratones subcutaneamente bajo anestesia con isoflurano una semana antes del sacrificio. Las celulas de nodos linfaticos y los esplenocitos se tineron con un anti-CD4 conjugado con PE-Cy7 (RM4-5) y un anti-CD25 conjugado con APC (PC61.5). La deteccion de BrdU se llevo a cabo utilizando el kit FITC BrdU Flow (BD Pharmingen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las celulas se analizaron utilizando un citometro analttico BD CantoII o BD LSRII (Becton Dickinson).
Reaccion en cadena de la polimerasa en tiempo real cuantitativa. La PCR en tiempo real cuantitativa se llevo a cabo en un ABI prizm 7700 por triplicado. Para normalizar la expresion genetica se utilizo CT para GAPDH. La PCR en tiempo real cuantitativa se llevo a cabo para las siguientes protemas: IL10, TGF-p e IFN-y.
Determinacion de anticuerpos en circulacion. Los tftulos de anticuerpos espedficos para antfgenos dados en plasma se determinaron mediante ELISA quimioluminiscente tal como se ha descrito anteriormente (Friguet et al., 1985; Binder et al., 2003; Chou et al., 2009).
Analisis estad^stico. Los valores se expresan como valores medios + e.e.m. Las diferencias entre valores se examinaron utilizando pruebas no parametricas de Mann-Whitney o Kruskal-Wallis y se consideraban significativas en caso de P < 0,05.
Ejemplo 2: El agotamiento de celulas B esta asociado con un aumento del acortamiento fraccional en un modelo de infarto de miocardio
En ratones C57BL6J macho de 8 semanas de edad se indujo un infarto de miocardio mediante ligacion de la arteria coronaria descendente anterior izquierda. Una hora despues de la lesion isquemica miocardica, los ratones fueron tratados o no mediante inyeccion peritoneal de un anticuerpo CD20 monoclonal de raton (160 |jg). Los inventores mostraron que las celulas B se infiltraron en el area de infarto. Los niveles de celulas B se analizaron mediante citometna de flujo los dfas 1, 3, 7 y 14 despues del infarto de miocardio. El porcentaje de IgM + B220 + celulas B se habfa reducido notablemente despues del tratamiento con anticuerpo CD20. Los ratones fueron sacrificados el dfa 14 despues del infarto de miocardio y la funcion cardfaca se midio mediante ecocardiograffa (Figura 14). Este tratamiento estaba asociado con un aumento de acortamiento fraccional, lo que sugiere que dicho tratamiento puede ser beneficioso para el tratamiento del infarto de miocardio.
Ejemplo 3: Efectos del agotamiento de celulas B en el aneurisma aortico abdominal
En primer lugar, los inventores utilizan un modelo de formacion de aneurisma de raton validado. Los ratones Apoe-/- alimentados con una dieta chow o una dieta rica en materia grasa desarrollan un aneurisma aortico abdominal cuando son sometidos a infusion con angiotensina (Ang) II durante 28 dfas (Daugherty A et al, 2000). Este modelo reproduce la acumulacion de celulas inflamatorias, incluyendo celulas B, dentro y alrededor del vaso aneurismatico.
Para unos resultados mas precisos, los inventores tambien pueden utilizar un nuevo modelo de aneurisma aortico con una alta incidencia de ruptura de aneurisma, descrito en la solicitud de patente WO2009056419. El modelo utiliza ratones Apoe+/+ o Apoe-/-, y asocia tanto la infusion de AngII como la neutralizacion de la actividad de TGF-p, dos factores con una alta relevancia para la enfermedad humana. En este modelo, la neutralizacion sistemica de la actividad de TGF-p conduce a un aumento notable e inesperado de la susceptibilidad de estos ratones al aneurisma aortico inducido por AngII (92,5%), y a un alto nivel de mortalidad por diseccion y ruptura aortica (65%).
El agotamiento de celulas B utilizando mAb anti-CD20 se iniciara en el momento de la induccion de aneurisma con el fin de evaluar su efecto en el desarrollo de aneurismas. Una primera infusion de 200 jg i.p. se realiza una hora despues de la induccion del aneurisma y una segunda dos semanas mas tarde.
Los ratones son sacrificados cuatro semanas despues. Se evaluan el aneurisma aortico abdominal y la respuesta inmunitaria, y se realiza una ecograffa.
Referencias
A lo largo de esta solicitud, diversas referencias describen el estado de la tecnica a la que pertenece la presente 5 descripcion. Las descripciones de estas referencias se incorporan por referencia en la presente descripcion.
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Friguet, B., Chaffotte, A.F., Djavadi-Ohaniance, L. & Goldberg, M.E. Measurements of the true affinity constant in solution of antigen-antibody complexes by enzyme-linked immunosorbent assay. J Immunol Methods 77, 305-19 (1985).
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Claims (2)

1. Un anticuerpo anti-CD20 para utilizarlo en el tratamiento o la prevencion del infarto de miocardio.
2. Un anticuerpo anti-CD20 para utilizarlo de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde el anticuerpo anti- CD20 es rituximab.
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Figura 1
04-06-08 APOE CD20-CTRL /'
%B220+
14
imagen1
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CTRL
anti CD20
APC-A
04-06-08 AP06 CD20-ant CD201
imagen3
%B220+
60 -
50-
imagen4
j.
1
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cinetica
10
° • • • • •
0 1 3 6 9 12
Anti-CD20
CTL
semanas
anti* C020 4-P 2
imagen5
imagen6
imagen7
Recuento
imagen8
Recuento
Figura 4
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10° 101 102 103 104 FL3-H: CD69 Cy5
, Anti-CD20
10 1--------TJ
imagen10
FL3-H: CD69 Cy5
imagen11
CTR anti CD20
% CD44alto entre CD4+
90 i 80 706050 403020100
imagen12
imagen13
% BrdU entre CD4+CD25-
201 181614 12 - 1086
4
2
0-
imagen14
CTRL
T
*
imagen15
anti CD20
Figura 7
CD4+ DC
6 de junio de 2008
7 de junio de 2008
□ CTR
ianti-CD20
□ CTR Eanti-CD20
imagen16
imagen17
relacion IL17/IFN
relacion IL17/IFN
SSC-H: SSC-Alto
imagen18
CTL Anti-CD20
imagen19
monocitos
—r
1000
Figura 9
CTRL2-CD11 b* ♦
imagen20
imagen21
anti CD20 4-06-08
imagen22
SO SOO 550 2O0 250
FSC-A^ ,-0l5°)
»nti CD20 4-06-08
imagen23
TVS !ji Jil jil !ij :i !i ji
56 100 150 200 250
FSC-M* 'W
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CTRL
anti CD20
CTRL
anti CD2D
to
On
(Q
C
0)
o
3G-
20-
10-
0
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CTR
T
anti-CD20
20-
16-
12-
8-
4-
0-
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i
imagen27
CTR
anti-CD20
6 semanas de ttt
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CTR
antiCD20
q 12 semanas de ttt
3500001 300000-
250000 ■
| i i •5 .. .. 8 •:: -.ft
200000 -
iilili | |
150000
| £ '■ W: iii:: ii :iit 1
100000-
£ I .............. ...............5
50000 -
: I • g
0-
'• ............ ...............s
imagen29
P = 0,01
imagen30
imagen31
CTR
anti-CD20
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Apoe~~ WD 6w
imagen33
Figura 12A
imagen34
Apoe~f~ WD 12w
imagen35
imagen36
Figura 12C
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Ldlr - WD 6w
imagen38
Figura 12D
u>
o
Figura 13
a-CD20
Extension de lesion (% aorta toracica)
o
00 ro 20
1 1 ■ ■ |
imagen39
imagen40
"0
II
o
CD
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Analisis ecocardiografico el dia 14 despues de infarto de miocardio
imagen42
PBS CD20 mAb
Funcion cardiaca
Figura 14
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