ES2630654T3 - Uso de GSTP1 - Google Patents

Abstract

Glutatión S-transferasa P1 (GSTP1) para su uso en la prevención o tratamiento de miocardiopatías.

Description

DESCRIPCION

Uso de GSTP1.

5 La presente invencion se refiere al uso de Glutation-S-transferasa P1.

Las glutation S-transferasas (GST) son una familia multigenica de isozimas que catalizan el ataque nucleofilo del atomo de azufre del glutation (GSH) en los grupos electrofilos de moleculas de sustrato. Las GST se conocen como enzimas desintoxicantes que conjugan sustancias toxicas con GSH para ser mas productos solubles en agua que 10 puedan metabolizarse en el hfgado y excretarse fuera del cuerpo. En base a la secuencia aminoacfdica, Las GST de

mamffero se dividen en seis clases: alfa, mu, omega, pi, theta y zeta. Entres estas isozimas, la glutation S-

transferasa P1 (GSTP1; GST-pi, GSTP1-1) es la mas frecuente en las celulas mamfferas. La GSTP1 tambien ha generado interes como un marcador neoplasico, ya que se sobreexpresa en una diversidad de neoplasias humanas diferentes, incluyendo cancer de pulmon, de colon, de estomago, de esofago, de boca, de rinon, de ovario y

15 testicular. La mayorfa de los tipos de cancer de prostata contienen niveles reducidos de polipeptido GSTP1 con

respecto al tejido de prostata normal debido a la hipermetilacion del promotor GSTP1 que da como resultado la transcripcion disminuida de GSTP1 (documento US 2009/0186360 A1). GSTP1 es determinante en la respuesta celular al estres oxidativo y protege a las celulas tumorales de la apoptosis provocada por una diversidad de agentes citotoxicos, tales como H2O2, UV, cisplatino, adriamicina, etoposido, tiotepa, clorambucilo, acido etacrfnico y trioxido 20 arsenico. Por lo tanto, la GSTP1 es considerada como una diana prometedora en la medicina tumor, tanto como una diana para la accion del farmaco y como un marcador tumoral.

La GSTP1 tambien participa en la regulacion de la senalizacion de estres y protege las celulas contra la apoptosis mediante los mecanismos relacionados con sus actividades no catalfticas y de union a ligando. Por ejemplo, la 25 GSTP1 impide la produccion excesiva inducida por LPS de factores pro-inflamatorios tiene una funcion antiinflamatoria en respuesta a LPS. La expresion de GSTP1, tanto a nivel de transcripcion como traduccional, se aumenta por la estimulacion de LPS. La GSTP1 tambien funciona como un inhibidor endogeno de JNK (c-Jun NH2- terminal cinasa), a traves de la interaccion con el C-terminal. Tambien se pudo demostrar que la protefna GSTP1 exogena (recombinante) puede administrarse en macrofagos y suprime la expresion de iNOS y COX-2 en las 30 celulas. Ademas, la protefna GSTP1 administrada por via intraperitoneal a los ratones redujo la mortalidad del choque anafilactico significativamente e inhibio la lesion pulmonar aguda y la peritonitis (Luo y col., Mol. Immunol. 46 (2009), 848-857).

El documento EP 1 500 709 A1 sugiere GSTP1 como uno de los 22 marcadores de la inflamacion.

35

Tambien se han encontrado relevantes diversas isoformas de GSTP1 para el asma y enfermedades alergicas de la ninez debido a la interaccion de GSTP1 con la contaminacion del aire del trafico (y humo de tabaco) en el sistema respiratorio, asf como la asociacion con la hipertension en el embarazo (Ohta y col., Sem. Thr. Hem. 29 (2003), 653659).

40

Las miocardiopatfas (CMP) son un grupo heterogeneo de enfermedades, incluyendo las formas dilatada (DCM), la entidad mas frecuente entre las miocardiopatfas, y e isquemica (ICM). Aunque la farmacoterapia y las intervenciones quirurgicas se han mejorado con beneficios de supervivencia en las CMP, el tratamiento causal sigue siendo un objetivo vago. Por lo tanto, la identificacion de mecanismos desconocidos que medien la CMP podrfa ser 45 beneficiosa. Los resultados del trabajo de la ultima decada claramente proporcionan evidencia de que la inflamacion y la mejor liberacion de citocinas proinflamatorias, especialmente el factor de necrosis tumoral (TNF)-a podrfan desempenar un papel en la patogenesis de la CMP. Sin embargo, los ensayos clfnicos han indicado paradojicamente un papel mas complicado para el TNF-a en CMP que ha puesto en duda que TNF-a sea una diana terapeutica viable para CMP. La patologfa de la IHD esta inmediatamente relacionada con el desarrollo de CMP, los 50 pacientes reciben actualmente medicamentos, tales como los betabloqueantes o bloqueadores de la enzima convertidora de angiotensina (ACE) con el objetivo de mejorar los sfntomas del paciente y para prevenir o retrasar el desarrollo de CMP (isquemica) debida a IHD. Por lo tanto, es comun el uso de terapias para CMP tambien para IHD. Es importante destacar que los pacientes que desarrollan CMP en base a IHD, en particular, CMP en fase terminal, actualmente han limitado unicamente las opciones terapeuticas (por ejemplo, el trasplante cardfaco o el uso de 55 dispositivos de asistencia ventricular, que puede a su vez ofrecerse unicamente a un numero limitado de pacientes).

Todavfa existe la necesidad insatisfecha de nuevas dianas farmaceuticas y un regimen de tratamiento para la prevencion y el tratamiento de manera eficiente de CMP e IHD y una de sus principales causas, es decir, las enfermedades cardiacas isquemicas (tambien conocidas como cardiopatfas coronarias, que pueden dar lugar a un

infarto de miocardio), especialmente en CMP inducida por presion sangufnea elevada y CMP inducida por volumen.

Las miocardiopatfas dan lugar a la exacerbacion recurrente que conduce a la hospitalizacion o la muerte. Por lo tanto, tambien se requieren una estrecha vigilancia y pruebas clfnicas exhaustivas para lograr el optimo tratamiento 5 de la cardiomiopatfa adaptado en estos pacientes, asociado a enormes costes del cuidado de la salud. Por lo tanto, es muy deseable un biomarcador que podrfa identificar la evolucion de la miocardiopatfa y ayudar a optimizar la monitorizacion del tratamiento y el resultado. Idealmente, tal prueba deberfa ser sensible, especffica, no invasiva, rapida y economica. Aunque se han indicado varios factores neurohumorales y citocinas inflamatorias como biomarcadores de diagnostico en cardiomiopatfa, el peptido natriuretico de tipo cerebral (BNP) y su fragmento N- 10 terminal inactivo (proBNP) han ganado la aceptacion mas amplia en el diagnostico clfnico y el seguimiento de los pacientes con CMP cronica establecida o sospechada. Sin embargo, los niveles circulantes de BNP y proBNP se ven afectados drasticamente por la funcion renal y son dependientes de la edad y el genero. Ademas, aun se desconoce si proBNP podrfa ser beneficioso en el diagnostico de CMP de la fraccion de eyeccion (FE) conservada en oposicion a reducida.

15

Por lo tanto, es tambien un objeto de la presente invencion proporcionar medios de diagnosticos para las miocardiopatfas.

Por lo tanto, la invencion proporciona Glutation S-transferasa P1 (GSTP1) para su uso en la prevencion o 20 tratamiento de miocardiopatfas (CMP). Con la presente invencion se pudo demostrar sorprendentemente que la GSTP1 es beneficiosa en el tratamiento de CMP. La GSTP1 se ha descrito como una protefna relevante en medicina contra el cancer (por ejemplo, los documentos US 5.427.917 A, US 5.552.277 A y WO 98/21359 A1) y en enfermedades alergicas, tales como asma, especialmente en relacion con la contaminacion del aire relacionada con el trafico (por ejemplo, Melen y col., Env. Health Persp. 116 (2008), 1077-1084). La GSTP1 tambien se ha sugerido 25 para disminuir la mortalidad de choque anafilactico y la inhibicion de la lesion pulmonar aguda y la peritonitis (Luo y col., Mol. Immunol. 46 (2009), 848-875). Se indico que GSTP1 interactua con TRAF2 (factor asociado al receptor de necrosis tumoral 2) como una funcion de union a ligando novedosa de GSTP1 en la regulacion de la senalizacion de cinasa (Wu y col., Oncogene 25 (2006), 5787-5800). Aunque esto proporciono una nueva perspectiva para analizar el mecanismo utilizado por GSTP1 para proteger las celulas contra diferentes estfmulos de lesion, tales como 30 citocinas, UV o H2O2, y esta ensenanza se considero como concebible de que GSTP1 funciona como un factor general de supervivencia mediante la formacion del complejo GSTP1-TRAF2 en las celulas tumorales, la inhibicion de este complejo fue considerada como limitada con respecto a la terapia antitumoral.

De acuerdo con la presente invencion, se descubrio sorprendentemente que GSTP1 aumenta especfficamente en 35 pacientes de CMP en comparacion con los controles. Se descubrio adicionalmente que la GSTP1 recombinante medio la asociacion de GSTP1-TRAF2, disminuyo la activacion proinflamatoria de JNK1 y p38 y la expresion de TRAF2 dependiente de su dosis y la forma subyacente de CMP. Esto permitio la creacion de una nueva estrategia de terapia para CMP mediante la administracion de GSTP1. Dado que GSTP1 mejora la activacion mediada por TNF -a de JNK1/p38 proinflamatorio por asociacion a TRAF2, GSTP1 no es unicamente beneficios en el tratamiento 40 de CMP, sino tambien para la prevencion de CMP, especialmente en pacientes de riesgo, tales como pacientes hipertensos.

La presente invencion proporciona el uso de GSTP1 para la fabricacion de un medicamento para la prevencion o el tratamiento de CMP. El tratamiento de CMP de acuerdo con la presente invencion implica la administracion de una 45 cantidad eficaz de GSTP1 a un individuo en necesidad de tal tratamiento, por ejemplo, pacientes de CMP humanos. Por estas razones y en base al hecho de que la patologfa de IHD esta inmediatamente relacionada con el desarrollo de CMP, los pacientes reciben actualmente medicamentos tales como betabloqueantes o bloqueantes de la enzima convertidora de angiotensina (ACE) con el objetivo de mejorar los sfntomas del paciente y prevenir o retrasar el desarrollo de CMP (isquemica) debido a IHD. La estrecha relacion de la patologfa de IHD con CMP que se basa en 50 la remodelacion miocardica en pacientes con IHD, especialmente en pacientes que desarrollan infarto de miocardio debido a IHD, que a su vez conduce a la remodelacion de las camaras cardfacas y, posteriormente, a la alteracion de la funcion de bombeo del corazon, una afeccion patologica que es comun a CMP e IHD, especialmente en pacientes con infarto de miocardio, muestra la eficacia de la presente invencion para la prevencion o el tratamiento de CMP.

55

Con la presente invencion, pueden tratarse todas las formas y fases de CMP, formas agudas y cronicas de la misma, independientemente de la genesis de la CMP. Por supuesto, el termino "tratamiento" incluye preferiblemente la mejora de la enfermedad y la prevencion o ralentizacion del avance de la enfermedad. Por ejemplo, las CMP pueden estar causadas por infarto de miocardio, pueden dilatadas idiopaticas o estar causadas por hipertension. Todas

estas formas pueden tratarse con GSTP1 de acuerdo con la presente invencion. Las CMP isquemicas especfficamente, por ejemplo, causadas por infarto de miocardio, pueden tratarse con GSTP1, sin embargo, pueden tratarse tambien las formas no isquemicas (por ejemplo, CMP dilatadas idiopaticas o CMP inducidas por hipertension o volumen). Dado que en todas estas CMP estan implicados procesos inflamatorios, esto las hace aptas para el 5 tratamiento con GSTP1 de acuerdo con la presente invencion (incluyendo formas raras de CMP, si estan implicados dichos procesos inflamatorios).

Por lo tanto, las CMP preferidas de acuerdo con la presente invencion son miocardiopatfa dilatada, especialmente miocardiopatfa congestiva; miocardiopatfa hipertrofica obstructiva, especialmente estenosis subaortica hipertrofica; 10 otras miocardiopatfas hipertroficas, especialmente miocardiopatfa hipertrofica no obstructiva; enfermedad endomiocardica (eosinofila), especialmente fibrosis endomiocardica (tropical) o endocarditis de Loffler; fibroelastosis endocardica, especialmente miocardiopatfa congenita; otras miocardiopatfas restrictivas, especialmente miocardiopatfa constrictiva SAI (sin especificar de otro modo (de acuerdo con ICD-10)); miocardiopatfa alcoholica, miocardiopatfas debido a farmacos y otros agentes externos, miocardiopatfas sin especificar, especialmente 15 miocardiopatfa (primaria)(secundaria) SAI; miocardiopatfa en enfermedades infecciosas y parasitarias, especialmente miocardiopatfa en difteria; miocardiopatfa en enfermedades metabolicas, especialmente amiloidosis cardiaca; miocardiopatfa en enfermedades nutricional, especialmente miocardiopatfa nutricional SAI; tofos gotosos de enfermedad cardiaca o enfermedad cardiaca tirotoxica.

20 Las formas especfficamente preferidas de CMP a tratar (o prevenir) de acuerdo con la presente invencion son CMP causadas por isquemia, especialmente por infarto de miocardio; por hipertension, o por miocarditis. Por lo tanto, el tratamiento con GSTP1 de acuerdo con la presente invencion se aplica preferiblemente en pacientes con miocarditis aguda, preferiblemente miocarditis infecciosa, especialmente miocarditis septica; miocarditis aislada, miocarditis en una enfermedad bacteriana, especialmente miocarditis difterica, gonococica, meningococica, sifilftica o tuberculosa; 25 miocarditis en una enfermedad vfrica, especialmente miocarditis por influenza o miocarditis por paperas; miocarditis aguda o cronica en enfermedad de Chagas, miocarditis en toxoplasmosis, miocarditis reumatica o miocarditis sarcoide.

Por lo tanto, las indicaciones preferidas de acuerdo con la presente invencion son las enumeradas en el Capftulo IX 30 de ICD-10 (I11-I15, especialmente I21, I22 y I23; I20-I25, especialmente I21 y I22; I40-I43, especialmente I42; I50- I57, especialmente I50 y I57).

El objetivo principal de la presente invencion es el tratamiento de pacientes humanos; sin embargo, en base a los presentes hallazgos, tambien es evidente que la CMP animal (mamffera) en la que esta implicada inflamacion puede 35 tratarse con exito por GSTP1 de acuerdo con la presente invencion. Esto puede ser importante para animales de granja y zoologico (especialmente crfa de animales de granja, tales como (anteriormente) caballos de carreras) o animales domesticos, por ejemplo, perros, gatos y caballos.

Aunque la presente invencion puede usarse tambien para la prevencion de CMP, es evidente que el objetivo 40 principal de la presente invencion reside en el tratamiento de pacientes de CMP humanos que ya han sido diagnosticados con CMP o que tienen un alto riesgo de desarrollar CMP, por ejemplo pacientes con hipertension (por ejemplo, pacientes de Fase 2 con presion sistolica de 160 mm Hg o mas y/o con presion diastolica de 100 mm Hg o mas). Otra realizacion preferida del aspecto preventivo de la presente invencion es para pacientes de angina de pecho, por lo que un infarto de miocardio podrfa o no haber ocurrido en este conjunto de pacientes; e puede estar 45 presente o no una insuficiencia cardiaca o fallo cardfaco (Mc Murray y col., Lancet 365 (2005), 1877-1889). Aquf, esta indicada incluso la administracion intravenosa continua o administracion continua al musculo del corazon.

Las rutas preferidas de administracion de la GSTP1 que contiene medicamento de acuerdo con la presente invencion son las rutas parenterales, preferiblemente administracion intraperitoneal o intravenosa, prefiriendose 50 especfficamente administracion intravenosa. La administracion intravenosa puede realizarse, por ejemplo, a traves de inyeccion en bolo o por administracion intravenosa continua durante un periodo de tiempo mas largo (por ejemplo, de 30 min a 6 h, especialmente de 1 a 3 h). En el proceso de la cirugfa de corazon tambien se prefiere la administracion directamente al corazon (inyeccion intramiocardiaca). Con esta ruta, la actividad GSTP1 puede administrarse directamente y en altas concentraciones al area de necesidad, por ejemplo, a una region de infarto. 55 Otra ruta de administracion preferida es la administracion al seno coronario (por ejemplo, a traves de un cateter insertado en el seno coronario). Las rutas oral o mucosa (aunque se describen en principio para GSTP1; vease, por ejemplo el documento US 5.976.528 A) son menos preferidas, ya que GSTP1 es una protefna y para esta ruta son necesarias medidas especfficas de proteccion (recubrimiento enterico, encapsulacion, etc.), asf como una optimizacion significativa con respecto a la fabricacion galenica.

Las dosificaciones preferidas para la administration son dosificaciones de 0,001 a 100 mg de GSTP1/kg, preferiblemente de 0,01 a 10 mg de GSTP1/kg, especialmente de 0,1 a 1 mg de GSTP1/kg, a un ser humano individual, preferiblemente a traves de administracion intravenosa; o dosificaciones de 0,1 a 10000 U de GSTP1/kg, 5 preferiblemente de 1 a 1000 U de GSTP1/kg, especialmente de 10 a 100 U de GSTP1/kg, a un ser humano individual, preferiblemente a traves de administracion intravenosa. Se prefieren dosificaciones a diario para la aplicacion intravenosa ("kg" se refiere a kg de peso corporal de la persona a tratar). Durante la cirugfa, estas dosificaciones tambien pueden aplicarse, como un conjunto o incluso mas de una dosificacion; o unicamente parte de la dosificacion (teniendo en cuenta que la GSTP1 se puede aplicar directamente durante la cirugfa en el area 10 necesaria). Las formas de dosificaciones diarias "listas para usar" (por ejemplo, para un individuo humano de 80 kg y/o 60 kg) pueden prefabricarse y pueden hacerse estables al almacenamiento por liofilizacion o congelation (y mantenimiento a, por ejemplo, -20 °C). Despues, la dosificacion puede consumirse completa o unicamente parcialmente (por ejemplo, en base al peso corporal de la persona que se va a tratar).

15 La GSTP1 de acuerdo con la presente invention tambien se denomina como "GSTP1-1", "GST clase pi", "DFN7", "GST3", "GST n", etc. y conjuga el glutation reducido con un amplio numero de electrofilos hidrofobos exogenos y endogenos (EC 2.5.1.18; Actividad catalftica: RX + glutation = HX + R-S-glutation). La secuencia humana (Seq. ID. No. 1) se enumera como "GSTP1_HUMAN, P09211" en la base de datos UniProtKB/SwissProt (HGNC: 4638, Entrez Gene: 2950).

20

SEQ.ID.NO. 1:

1 mppytvvyfp vrgrcaalrm lladqgqswk eevvtvetwq egslkascly gqlpkfqdgd

61 ltlyqsntil rhlgrtlgly gkdqqeaalv dmvndgvedl rckyisliyt nyeagkddyv

121 kalpgqlkpf etllsqnqgg ktfivgdqis fadynlldll lihevlapgc ldafpllsay

181 vgrlsarpkl kaflaspeyv nlpingngkq

25 Existen varias variantes de esta protefna humana (homocigotas, asf como heterocigotas), las variantes mas importantes son un intervalo de Ile a Val en la position 105 y un intercambio de Ala a Val en la position 114 (Melen y col., 2008). Otras variantes incluyen un intercambio de Gly a Glu en la posicion 78, un intercambio de Thr a Ser en la posicion 110, un intercambio Gly a Glu en la posicion 139, un intercambio de Asp a Tyr en la posicion 147 y un intercambio de Asp a His en la posicion 158. Se conocen varios SNP diferentes sin afectar a la secuencia 30 aminoacfdica.

Si el paciente de CMP que se va a tratar con GSTP1 de acuerdo con la presente invencion tiene tal alelo que da como resultado un intercambio aminoacfdico (heterocigoto u homocigoto) comparado con la SEQ.ID.No. 1, puede ser recomendable administrar a tal paciente la forma alelica de esta protefna. Esto se prefiere especfficamente para 35 pacientes que son homocigotos para esta alelo, por ejemplo, paciente con el alelo homocigoto 105Val o 114Val (que despues pueden recibir la variante GSTP1 de 105Val o 114Val, respectivamente). En tales casos, el riesgo de desarrollar reacciones adversas, especialmente reacciones inmunitarias adversas (que es siempre un topico para los medicamentos protefnicos), se mantiene bajo. De todos modos, cualquiera de los ingredientes en la preparation farmaceutica que contiene GSTP1 acuerdo con la presente invencion que provoca o potenciar una reaction 40 inmunitaria en el paciente debe mantenerse al mfnimo, si es posible.

Se conocen ortologos de mamfferos, por ejemplo, de chimpance (Pan troglodytes; NCBI accesos: 745954, XM_001152516.1, XP_001152516.1) y raton (Mus musculus; NCBI accesos: 148701, NM_013541.11, NP_038569.11, AK0791445, BC0020485), pero tambien de animales no mamfferos, tales como pez cebra (Danio 45 rerio) y gusano (Caenorhabditis elegans).

La presente invencion se refiere tambien a una composition farmaceutica que comprende GSTP1, preferiblemente GSTP1 humana recombinante o GSTP1 de placenta humana, y un vehfculo farmaceuticamente aceptable para la prevention o tratamiento de miocardiopatfas o enfermedades cardiacas isquemicas.

50

De acuerdo con una realization preferida, la composicion de acuerdo con la presente invencion contiene de 1 a 100000 U de GSTP1, preferiblemente de 10 a 10000 U de GSTP1, especialmente de 10 a 1000 U de GSTP1. Una unidad de actividad de GSTP1 conjuga 1,0 micromoles de 1-cloro-2,4-dinitrobenceno con glutation reducido por minuto a pH 6,5 a 25 °C.

Una composicion preferida de acuerdo con la presente invencion tambien contiene un tampon. Los sistemas de tampon tfpicos son el sistema de acido carbonico/HCO3 (pH 6,2 a 8,6; neutro), tampon de acido carbonico/silicato (pH 5,0 a 6,2; debilmente acido), tampon de acido acetico/acetato (pH 3,7 a 5,7), tampon fosfato (NaH2PO4 + 5 Na2HPO4; pH 5,4 a 7,8), tampon de amoniaco (NH3 + H2O + NH4Cl; pH 8,2 a 10,2), TRIS/HCl (Tris(hidroximetil)- aminometano; pH 7,2 a 9,0), HePES (acido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinetanosulfonico; pH 6,8 a 8,2), HEPPS (acido 4-(2-hidroxietil)-piperazin-1-propano sulfonico; pH 7,3 a 8,7) o MeS (acido 2-(N-morfolino)etanosulfonico; pH 5,2 a 6,7). Los tampones preferidos de acuerdo con la presente invencion son un tampon fosfato, un tampon Tris-HCl o un tampon HEPES, con un pH de 5,5 a 9,0, preferiblemente de 6,0 a 8,5, especialmente de 6,5 a 8,0. Las 10 concentraciones de tampon pueden ajustarse preferiblemente de 1 mM a 1 M, especialmente de 10 mM a 0,5 M. Otros ingredientes adicionales preferidos incluyen estabilizadores, quelantes, sales, etc., tales como glicerol, glucosa, sacarosa, maltosa, EDTA o sustancias similares, NaCl, KCl, NH4Cl y sales similares utiles en preparaciones farmaceuticas. Por supuesto, todos los ingredientes en una preparacion farmaceutica tienen que ser de calidad farmaceutica.

15

Los vehmulos farmaceuticamente aceptables usados preferiblemente son solucion salina fisiologica, aceites vegetales, aceite mineral, carboximetilcelulosa sodica acuosa o polivinilpirrolidona acuosa; sin embargo, tambien puede usarse agua esteril.

20 La GSTP1 que se va a usar de acuerdo con la presente invencion puede proporcionarse de diversas maneras. Como se ha mencionado anteriormente, la GSTP1 de placenta humana es una de las fuentes naturales preferidas de GSTP1. Otras fuentes preferidas son cultivos de celulas que (sobre)expresan GSTP1. Las preparaciones de GSTP1 tambien estan disponibles en el mercado. La ruta de produccion industrial preferida de acuerdo con la presente invencion es, sin embargo, la produccion recombinante de GSTP1. La produccion recombinante de GSTP1 25 esta bien establecida, asf como su purificacion a partir de dichas fuentes (por ejemplo, Luo y col., 2009, Wu y col., 2006; documento WO 98/21359 A1; documento US 5.976.528; etc.). Los vectores de expresion (por ejemplo, documento WO 98/21359 A1, Parte D (paginas 40 a 51) que contienen las secuencias codificantes de GSTP1 se transfieren en celulas huesped adecuadas (tales como celulas COS, HEK 293, HeLa, VERO, W138, BHK o MDCK, pero tambien levadura, celulas vegetales, de insecto y bacterianas (S. cerevisiae, E. coli, etc.). Despues, se expresa 30 GSTP1 y se purifica de acuerdo con metodos convencionales. La produccion de GSTP1 recombinante tambien puede usar formas variantes de GSTP1 con secuencias adicionales que facilitan la purificacion, tales como peptidos quelantes de metal, dominios de protema A, etiquetas de purificacion por afinidad, etc. (por ejemplo, documento US 5,976,528 A, columna 16). Dichas variantes pueden eliminarse - despues de la purificacion o en el transcurso de la purificacion - por ejemplo, a traves de secuencias enlazadoras escindibles (proteasa, entereocinasa, etc.). Las 35 preparaciones en lote purificadas de GSTP1 pueden contener, por ejemplo, de 1 a 200 U de actividad de GSTP1 por mg de protema total. Las composiciones de GSTP1 farmaceuticas adecuadas contienen de 5 a 200 U/mg de protema, especialmente de 10 a 150 U/mg de protema. La preparacion farmaceutica de acuerdo con la presente invencion tambien se proporciona como un producto marcado apropiadamente que es esteril y util para su administracion a pacientes humanos de acuerdo con la presente invencion.

40

De acuerdo con otro aspecto, la presente invencion se refiere a GSTP1 como una diana de diagnostico para CMP. La presente invencion proporciona el uso de GSTP1 para el diagnostico de CMP. Aunque GSTP1 es un marcador conocido y establecido en el diagnostico tumoral, fue sorprendente que GSTP1 es un biomarcador para CMP que es incluso superior al actual "estandar de oro", pro-BNP, con respecto a sensibilidad y especificidad.

45

Las miocardiopatfas a las que se ha hecho referencia anterior para el uso terapeutico de GSTP1 tambien pueden diagnosticarse de acuerdo con la presente invencion.

Por lo tanto, la presente invencion se refiere a un metodo para diagnosticar CMP, especialmente las indicaciones 50 que se han mencionado anteriormente, determinando la cantidad de GSTP1 o ARNm de GSTP1 en una muestra biologica y comparando esta cantidad con la cantidad de GSTP1 o ARNm de GSTP1 en una muestra biologica con un estado de CMP definido y conocido, especialmente de un individuo humano sano o un paciente. Esta comparacion puede hacerse de forma practica, es decir, dado que una muestra real se ensaya de la misma manera que la muestra biologica (de forma directa), tambien puede ser una comparacion virtual de manera que el valor 55 determinado se compare con un valor conocido de una muestra sana o enferma.

Las tecnicas preferidas para la determinacion de la cantidad de GSTP1 incluyen tecnicas tipo anticuerpo, tales como ELISA, combinadas opcionalmente con tecnicas de electroforesis o radioinmunoesnsayo (RIA). Las tecnicas de electroforesis tambien se pueden combinar con las tecnicas MALDI.

Como alternativa, el ARNm de GSTP1 puede determinarse, por ejemplo, por RT-PCR cuantitativa en tiempo real.

La diana de diagnostico preferida es un paciente humano que se sospecha que tienen CMP, un paciente humano 5 que esta en riesgo de desarrollar CMP o un paciente humano que tiene CMP (del cual se ha controlado el avance de la enfermedad

Las muestras biologicas preferidas de acuerdo con la presente invention incluyen muestras de sangre, plasma o suero humano o muestras de biopsia de miocardio humano. Estas muestras tambien pueden ensayarse mediante 10 procedimientos rutinarios.

Tfpicamente, una alta concentration de GSTP1 en suero es indicativa de CMP. En personas sanas, las concentraciones en suero de GSTP1 se encuentran por debajo de 50 ng/ml o, preferiblemente, incluso por debajo de 10 ng/ml. Un estado de enfermedad de CMP puede diagnosticarse a un nivel en suero de 50 ng/ml o superior, 15 preferiblemente a 100 ng/ml o superior. Las formas graves de CMP pueden diagnosticarse a 200 ng/ml o superior. Por supuesto, estos niveles siempre dependen de la tecnica utilizada para el ensayo de la protefna GSTP1. Como alternativa, el estado de enfermedad de CMP se puede diagnosticar si el nivel en suero de GSTP1 se eleva en al menos el factor 2, preferiblemente en al menos el factor de 5, en comparacion con un estado sano, especialmente el estado sano del mismo paciente.

20

Con la presente invencion, la determination de la cantidad de GSTP1 o ARNm de GSTP1 es una muestra puede realizarse en un periodo de tiempo muy corto mediante metodos de ensayo convencionales, tales como ELISA o PCR. En base al AdN y la secuencia aminoacfdica de acuerdo con la SEQ.ID.NO.2

25

atgccgccct

acaccgtggt ctatttccca gttcgaggcc gctgcgcggc cctgcgcatg 60

ctgctggcag

atcagggcca gagctggaag gaggaggtgg tgaccgtgga gacgtggcag 120

gagggctcac

tcaaagcctc ctgcctatac gggcagctcc ccaagttcca ggacggagac 180

ctcaccctgt

accagtccaa taccatcctg cgtcacctgg gccgcaccct tgggctctat 240

gggaaggacc

agcaggaggc agccctggtg gacatggtga atgacggcgt ggaggacctc 300

cgctgcaaat

acgtctccct catctacacc aactatgagg cgggcaagga tgactatgtg 360

aaggcactgc

ccgggcaact gaagcctttt gagaccctgc tgtcccagaa ccagggaggc 420

aagaccttca

ttgtgggaga ccagatctcc ttcgctgact acaacctgct ggacttgctg 480

ctgatccatg

aggtcctagc ccctggctgc ctggatgcgt tccccctgct ctcagcatat 540

gtggggcgcc

tcagcgcccg gcccaagctc aaggccttcc tggcctcccc tgagtacgtg 600

aacctcccca

tcaatggcaa cgggaaacag tga 633

y la SEQ.ID.NO.1 (y las entradas de bases de datos que se han mencionado anteriormente para el gen GSTP1 y la protefna GSTP1), la presente invencion tambien proporciona, por ejemplo, un ensayo PCR para la identification de infecciones por S. aureus o un ensayo ELISA sandwich. En un ELISA adecuado de acuerdo con la presente 30 invencion, la GSTP1 puede capturarse de una muestra biologica con un anticuerpo especffico de GSTP1 y detectarse y cuantificarse con un segundo anticuerpo dirigido contra un epftopo diferente de GSTP1 o un anticuerpo que es especffico para el evento de union anterior.

La detection de transcritos de GSTP1 (ARNm) es posible por medio de pruebas de acido nucleicos cuantitativas 35 estandares, tales como RT-PCR cuantitativa. Por lo tanto, la presente invencion tambien proporciona un kit para determinar la cantidad de ARNm de GSTP1 en un mfnimo de dos secuencias de acidos nucleicos sinteticas para amplificar al menos una secuencia de acido nucleico que codifica GSTP1 o partes de la misma, en el que al menos de una de las secuencias de acido nucleico sinteticas en el kit se selecciona del grupo que consiste en: (a) un par de cebadores adecuados, siendo los cebadores una secuencia de acido nucleico que comprende 10-30 nucleotidos 40 consecutivos de al menos uno de los siguientes: (i) el ARNm de GSTP1 de acuerdo con la SEQ.ID. NO. 2 o la secuencia complementaria de la misma; o (ii) a partir de la region no codificante 5' o 3' del gen GSTP1 (por ejemplo, en regiones que se extienden hasta 500, preferiblemente hasta 200, especialmente hasta 100, nucleotidos en la direction 5' o 3 o secuencias complementarias de las mismas; tales secuencias estan presentes en las entradas de la biblioteca de secuencias que se han mencionado anteriormente); siendo dichos cebadores utiles para la

polimerizacion de una secuencia nucleotfdica ubicada entre los cebadores en el gen GSTP1 o su region 5' o 3' (siendo dicha secuencia nucleotfdica de GSTP1 polimerizable detectable por PCR y preferiblemente de hasta 1000 pb, mas preferiblemente de hasta 500 pb, aun mas preferiblemente de hasta 300 pb de longitud; por otro lado, los cebadores se pueden seleccionar tambien para polimerizar (con PCR) todo el ARNm de GSTP1; y (b) reactivos 5 adecuados para una reaccion en cadena de la polimerasa (PCR). Preferiblemente, el kit comprende adicionalmente: (c) instrucciones de uso y (d) opcionalmente, un control positivo y/o negativo para la determinacion y/o cuantificacion de ARNm de GSTP1, especialmente un acido nucleico que codifica GSTP1 o un fragmento del mismo. Los ejemplos de reactivos de PCR adecuados incluyen tampon de reaccion de PCR, Mg2+ (por ejemplo, MgCh), dNTP, ADN polimerasas (tales como transcriptasas inversas y ADN polimerasas termoestables (por ejemplo, ADN polimerasas 10 relacionadas con Taq y ADN polimerasas relacionadas con Pfu)), RNasa, potenciadores o inhibidores de la reaccion de PCR, agentes de control de reaccion de PCR (por ejemplo, tinte de ADN bicatenario (tales como SYBRTM verde), sondas TaqMan™, balizas moleculares, y Scorpions™), y agua de calidad para PCR.

Los cebadores descritos en el presente documento son particularmente utiles en un ensayo de reaccion en cadena 15 de la polimerasa (PCR). La PCR es un sistema practica para la amplificacion in vitro de una secuencia de bases de ADN. Por ejemplo, un ensayo PCR puede usar una polimerasa termoestable y dos cebadores de aproximadamente 10 a 30 bases: uno complementario a la cadena (+) en un extremo de la secuencia a amplificar, y el otro complementario a la cadena (-) en el otro extremo. Puesto que la muestra biologica recientemente sintetizada, que comprende: (a) un conjunto de cebadores que comprende en las cadenas de ADN, puede servir posteriormente 20 como plantillas adicionales para las mismas secuencias de cebadores, las rondas sucesivas de hibridacion de cebadores, la elongacion de hebras, y la disociacion pueden producir una amplificacion rapida y altamente especffica de la secuencia deseada. La PCR tambien puede usarse para detectar la existencia de una secuencia definida en una muestra que contiene ARNm de GSTP1.

25 A modo de ejemplo, un ensayo PCR tfpico de acuerdo con la presente invencion puede comenzar - opcionalmente despues de la transcripcion inversa del ARNm en ADN - con dos cebadores oligonucleotfdicos sinteticos que se unen especffica y complementariamente a dos regiones del ADN diana o sus hebra complementaria, respectivamente, que codifica GSTP1 o su region 5' y/o 3' (un para cada hebra) que se va a amplificar. Estos pueden anadirse al ADN diana (que no tiene que ser puro) en presencia de exceso de desoxinucleotidos (dNTP) y una ADN 30 polimerasa termoestable (por ejemplo, Taq polimerasa). En una serie (tfpicamente 20-40) de ciclos de temperatura, el ADN diana puede desnaturalizarse repetidamente (aproximadamente 80-100 °C, por ejemplo, 90 °C), hibridarse a los cebadores (tfpicamente a 40-65 °C), y una hebra de combinacion puede extenderse desde los cebadores (tfpicamente a 65-80 °C, por ejemplo, 72 °C). Dado que las propias hebras de combinacion actuan como plantillas para los ciclos posteriores, los fragmentos de ADN que coinciden con ambos cebadores se ilustran 35 exponencialmente, en lugar de linealmente. El ADN diana no necesita ni ser puro ni abundante; por lo tanto, la PCR es especfficamente adecuada en los diagnosticos clfnicos de acuerdo con la presente invencion.

Estas pruebas pueden emplear preferiblemente etiquetas que tambien son adecuados para la cuantificacion, tales como biotina, moleculas fluorescentes, moleculas radiactivas, sustratos cromogenicos, marcadores de 40 quimioluminiscencia, y similares. Los metodos para la biotinilacion de acidos nucleicos se conocen bien en la tecnica, ya que son metodos para introducir moleculas fluorescentes y moleculas radiactivas en oligonucleotidos y nucleotidos. Los metodos de deteccion se conocen bien para etiquetas fluorescentes, radioactivas, quimioluminiscentes, cromogenicas, asf como otras etiquetas usadas comunmente. En resumen, la quimioluminiscencia puede identificarse y cuantificarse mas directamente por sus longitudes de onda de emision y la 45 intensidad. Cuando se emplea biotina, se detecta mediante avidina, estreptavidina o similares, que se conjuga con un marcador detectable, tal como una enzima (por ejemplo peroxidasa de rabano picante). La estreptavidina se une con gran afinidad a la biotina, la estreptavidina no unida se elimina por lavado, y despues se detecta la presencia de la enzima peroxidasa de rabano picante usando un sustrato de emision de luminiscencia en presencia de peroxido y tampones apropiados.

50

La determinacion de la cantidad de GSTP1 en una muestra incluye preferiblemente ELISA, RIA y FACS. La deteccion y la cuantificacion de GSTP1 usando anticuerpos anti-GSTP1 esta bien establecida en la tecnica (especialmente en medicina tumoral) y puede aplicarse facilmente con el fin de diagnosticar CMP de acuerdo con la presente invencion (por ejemplo, los documentos WO 98/21359 A1 ("F. Antibodies"); US 5.976.528 A, US 5.427.917 55 A). Los valores normales o estandar para la expresion de GSTP1 se establecen mediante la combinacion de fluidos corporales o extractos celulares que se toman de sujetos mamfferos normales, preferiblemente seres humanos, con anticuerpo para GSTP1 en condiciones adecuadas para la formacion de complejos. La cantidad de formacion de complejo estandar puede cuantificarse por diversos metodos, preferiblemente por medios fotometricos. Las cantidades de GSTP1 expresadas en un sujeto, las muestras, el control y la enfermedad, de los tejidos biopsiados

se comparan con los valores estandar. La desviacion entre los valores estandar y del sujeto establece los parametros para diagnosticar la enfermedad. Como ya se ha indicado anteriormente, las muestras mas preferidas son de las biopsias de corazon humano y muestras derivadas de la sangre humana de pacientes humanos individuales que tienen CMP, que se sospecha que tienen CMP o IHD o que estan en riesgo de desarrollar CMP.

5

La presente invencion se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos y las dibujas de dibujo, pero sin limitarse a las mismas.

La figura 1 muestra un aumento de GSTP1 y TRAF2 en pacientes de DCM e ICM. (A) Las imagenes de matrices 10 genicas representativas muestran la hibridacion aumentada en secuencias de matriz de GSTP1 y TRAF2 (flechas) de sondas de ADNc marcadas. (B) Imagenes de matrices de protefnas representativas que demuestran una mejor tincion Cy5 (rojo) para las protefnas GSTP1 y TRAF2 cardiacas en pacientes de DCM e iCm en comparacion con la tincion Cy3 (verde) de los controles. (C) Cuantificacion de expresiones de ARNm de GSTP1 y TRAF2 de miocardio por RT-PCR en tiempo real. La expresion de GSTP1 (*P<0,0001) y TRAF2 (P<0,0001) aumenta significativamente 15 en pacientes con insuficiencia cardiaca en comparacion con los controles. (D) Imagenes de transferencia de Western representativas y cuantificacion de expresiones de protefna de GSTP1 y TRAF2 de miocardio corregidas para los niveles de control de carga de protefna. Los niveles de expresion de protefna de miocardio se elevaron en DCM e ICM para GSTP1 (P<0,0001, P = 0,0019) y TRAF2 (P<0,0001, P = 0,005) en comparacion con los controles. No se encontraron diferencias significativas en ARNm de GSTP1 y la expresion de protefnas cuando se compararon DCM 20 e ICM; aunque los niveles de expresion de ARNm de TRAF2 (tP = 0,001) y protefna (fP <0,0001) eran significativamente mayores en DCM en comparacion con ICM. *, significativamente diferente frente a controles.

La figura 2 muestra la interaccion GSTP1-TRAF2 y la activacion de JNK y p38 en DCM e ICM. (A) Imagenes de transferencia de Western representativas y cuantificacion de formacion del complejo GSTP1-TRAF2 de miocardio en 25 DCM, ICM y controles. Los lisados de miocardio VI se inmunoprecipitaron (IP) y los precipitados se analizaron en transferencias Western. Se encontro una asociacion de GSTP1-TRAF2 significativamente inferior en DCM en comparacion con ICM y los controles (*P <0,008). (B) Imagenes de transferencia de Western representativas y cuantificacion de expresion de protefna de JNK1 y p38 activa de miocardio en DCM, ICM y controles. Tanto en la expresion de protefna cardiaca de DCM como de ICM de JNK activa, asf como p38 (P<0,0001) se aumento 30 significativamente en comparacion con los controles. Ademas, los pacientes de DCM revelan una expresion de protefna de JNK y p38 cardiaca significativamente mayor (fP<0,0001) en comparacion con ICM. Todas las expresiones de protefna se corrigieron para los niveles de control de carga de protefna. *, significativamente diferente frente a control.

35 La figura 3 muestra que GSTP1 modula el sistema TRAF2-JNK1/p38 cardiaco en cultivos de tejido cardiaco. (A) Imagenes de transferencia de Western representativas de expresiones de protefna de TRAF2, GSTP1, JNK activa y p38 activa en cultivos de tejido cardiaco tratados con 5 pg/ml de GSTP1 recombinante. (B) Cuantificacion de expresiones de protefna de TRAF2, JNK activa y p38 activa en cultivos de tejido cardiaco de DCM, ICM y control tratados con GSTP1 recombinante (2,5, 5, 10 pg/ml) durante 24 h. La expresion de protefna de TRAF2 se redujo 40 significativamente en comparacion con los tratados dependientes de la concentracion usada (DCM: P = 0,011 para 2,5 pg/ml, P = 0,014 para 5 pg/ml, P = 0,003 para 10 pg/ml; ICM: P = 0,006 para 2,5 pg/ml, P = 0,003 para 5 pg/ml, P = 0,0001 para 10 pg/ml; controles: P = 0,19 para 2,5 pg/ml, P = 0,0003 para 5 pg/ml, P = 0,03 para 10 pg/ml). Tras el tratamiento con GSTP1, la expresion de JNK activa disminuyo en tejido cardiaco de DCM, ICM y control en comparacion con el grupo no tratado dependiente de la concentracion usada (DCM: P = 0,0009 para 2,5 pg/ml, P = 45 0,01 para 5 pg/ml, P = 0,0003 para 10 pg/ml; ICM: P = 0,0005 para 2,5 pg/ml, P = 0,007 para 5 pg/ml, P<0,0001

para 10 pg/ml; controles: P = 0,001 para 2,5 pg/ml, P = 0,69 para 5 pg/ml, P = 0,71 para 10 pg/ml). Asimismo, la

expresion de p38 activa disminuyo en respuesta al tratamiento con GSTP1 en tejido cardiaco de DCM, ICM y control en comparacion con los tratados dependientes de la concentracion usada (DCM: P = 0,004 para 2,5 pg/ml, P<0,0001 para 5 pg/ml, P = 0,0009 para 10 pg/ml; ICM: P = 0,03 para 2,5 pg/ml, P = 0,0001 para 5 pg/ml, P = 0,008 50 para 10 pg/ml; controles: P = 0,008 para 2,5 pg/ml, P = 0,0004 para 5 pg/ml y 10 pg/ml). La comparacion de las concentraciones de GSTP1 aplicadas con respecto a la reduccion de TRAF2, jNk y p38 indico que en DCM e ICM, pero no en los controles, las diferentes entre 2,5 pg/ml y 5 pg/ml, asf como 10 pg/ml, fueron significativas. TRAF2: (DCM: P = 0,01 para 2,5 frente a 5 pg/ml y frente a 10 pg/ml, P = 0,62 para 5 frente a 10 pg/ml; ICM: P = 0,0007 para 2,5 frente a 5 pg/ml, P = 0,0004 para 2,5 frente a 10 pg/ml, P = 0,35 para 5 frente a 10 pg/ml; control: P = 0,07 55 para 2,5 frente a 5 pg/ml, P = 0,06 para 2,5 frente a 10 pg/ml, P = 0,15 para 5 frente a 10 pg/ml). JNK: (DCM: P =

0,0006 para 2,5 frente a 5 pg/ml, P = 0,003 para 2,5 frente a 10 pg/ml, P = 0,48 para 5 frente a 10 pg/ml; ICM: P =

0,004 para 2,5 frente a 5 pg/ml, P = 0,01 para 2,5 frente a 10 pg/ml, P = 0,88 para 5 frente a 10 pg/ml; control: P = 0,02 para 2,5 frente a 5 pg/ml, P = 0,05 para 2,5 frente a 10 pg/ml, P = 0,97 para 5 frente a 10 pg/ml). p38 (DCM: P = 0,0002 para 2,5 frente a 5 pg/ml, P = 0,04 para 2,5 frente a 10 pg/ml, P = 0,76 para 5 frente a 10 pg/ml; ICM: P =

0,0006 para 2,5 frente a 5 pg/ml, P = 0,02 para 2,5 frente a 10 pg/ml, P = 0,41 para 5 frente a 10 pg/ml; control: P = 0,06 para 2,5 frente a 5 pg/ml, P = 0,08 para 2,5 frente a 10 pg/ml, P = 0,29 para 5 frente a 10 pg/ml). (C) Imagenes de transferencia de Western representativas de complejos de GSTP1-TRAF2 de miocardio de cultivos de tejido cardiaco de DCM, ICM y controles tratados con GSTP1 recombinante (5 pg/ml) y sometidos a inmunoprecipitacion 5 (IP). Se hizo la asociacion de los cultivos de tejido cardiaco tratados con GSTP1 entre GSTP1 y TRAF2 de independiente de la enfermedad y significativamente mayor (P = 0,02 para 5 pg/ml de concentracion de GSTP1; resultados para 2,5 y 10 pg/ml de concentracion de GSTP1 no mostrados) en comparacion con las muestras no tratadas. *, significativamente diferente frente a control. f, significativamente diferente frente a cultivos de tejido tratados con 2,5 pg/ml de GSTP1. t, significativamente diferente frente a tejido tratado con 5 pg/ml y 10 pg/ml de 10 GSTP1.

La figura 4 muestra que TNF-a anula la sensibilidad de la cascada de TRAF2-JNK1/p38 con respecto a GSTP1 en cultivos cardiacos de DCM. (A) Imagenes de transferencia de Western representativas y cuantificacion (B) de cultivos de tejido cardiaco de DCM, ICM y control tratados con TNF-a (50 ng/ml) y GSTP1 (5 pg/ml). La cascada de 15 JNK (P = 0,08) y p38 (P = 0,75) activada por TNF-a, asf como la expresion de protefna de TRAF2 (P = 0,18) no se vieron afectadas por la GSTP1 recombinante en cultivos de tejido cardiaco de DCM. En ICM y los controles, las expresiones de protefna de JNK activa (P<0,001; P<0,002), p38 activa (P<0,0002; P<0,0001) y TrAF2 (P<0,001; P = 0,003) se redujeron notablemente en respuesta a la estimulacion de GSTP1. La comparacion de los cultivos de tejido cardiaco de ICM y DCM tratados con GSTP indica expresiones de protefna de TRAF2, JNK y p38 activas 20 (fP<0,001) significativamente menores en ICM en comparacion con las de DCM. (C) Imagenes de transferencia de Western representativas de lisados de tejido cardiaco inmunoprecipitado tratados con TNF-a (50 ng/ml) y GSTP1 (5 pg/ml). El fallo de GSTP1 en la asociacion a TRAF2 tras la estimulacion de TNF-a en tejido cardiaco de DCM estuvo presente, a diferencia del tejido cardiaco de ICM y control.

25 La figura 5 muestra que las concentraciones de GSTP1 mayores rescatan la disminucion de JNK1/p38 mediada por TRAF2 tras el tratamiento con TNF-a. (A) Imagenes de transferencia de Western representativas y cuantificaciones (B) de cultivos de tejido cardiaco de DCM, ICM y control tratados con TNF-a (50 ng/ml) y GSTP1 (10 pg/ml). (B) Los resultados demuestran que los cultivos de tejido cardiaco de DCM tratados con GSTP1 a 10 pg/ml y TNF-a expresan una activacion de JNK y p38 notablemente reducida, asf como una expresion de protefna de TRAF2 30 reducida (*P<0,0001) en comparacion con controles tratados con TNF-a. (C) Los inmunoprecipitados de lisados de tejido cardiaco de DCM demuestran un aumento significativo (P<0,035) de la asociacion GSTP1-TRAF2 en 10 pg/ml de GSTP1 en comparacion con 5 mg/ml de GSTP1.

La figura 6 muestra que la GSTP1 serica y cardiaca esta asociada a CMP. (A) Las imagenes de matriz de protefnas 35 en suero representativas demuestran una mejor tincion Cy3 (verde) y Cy5 (rojo) para la protefna GSTP1 en suero en pacientes con insuficiencia cardiaca en fase terminal (HF) (FE<35 %; n = 40) en comparacion con los controles (FE>65 %; n = 40). (B) Las mediciones ELISA indican una elevacion significativa (*P<0,0001) de la concentracion de GSTP1 en suero en pacientes de HF en fase terminal con (FE<35 %; n = 40) frente a controles con (FE>65 %; n = 40). (C) Las imagenes de matriz de protefnas de tejido cardiaco representativas demuestran una mejor tincion Cy3 40 (verde) y Cy5 (roja) para protefna GSTP1 cardiaca en pacientes de HF en fase terminal (FE<35 %; n = 40) en comparacion con los controles (FE>65 %; n = 20). (D) Imagenes de transferencia de Western representativas y cuantificacion de expresion de protefna GSTP1 de miocardio corregida para los niveles de control de carga de protefna. Los niveles de protefna GSTP1 se elevaron significativamente en pacientes de HF en fase terminal con FE<35 % frente a tejido de injerto cardiaco de control (*P<0,001).

45

La figura 7 muestra la asociacion de GSTP1 y proBNP en suero con la fraccion de eyeccion (FE) y la correlacion entre GSTP1 y proBNP. (A) Los pacientes con insuficiencia cardiaca con FE<22 % tienen concentraciones de GSTP1 en suero significativamente mayores en comparacion con todos los demas grupos de FE. Los pacientes con FE33-42 %, FE23-32 % y FE<22 % tienen una concentracion de GSTP1 en suero significativamente mayor en 50 comparacion con aquellos con FE>52 % y FE 43-52 %. (B) Los pacientes con FE<22 % tienen una concentracion de proBNP en suero significativamente mas alta en comparacion con todos los demas grupos de FE. No se observaron diferencias significativas en proBNP en suero entre todos los demas grupos de FE. (C) Grafico de correlacion de las mediciones de GSTP1 en suero y proBNP en suero para todos los sujetos de estudio. Se aprecio una relacion significativamente positiva entre GSTP1 y proBNP en suero (r = 0,47; P<0,0001). *P<0,001 frente a control, 55 tP<0,0001 frente a FE>52 %, tP<0,0001 frente a FE 43-52 %, §P<0,0001 frente a FE 33-92 %, //P<0,0001 frente a FE 23-32 %.

La figura 8 muestra la correlacion de GSTP1 y proBNP en suero con respecto a la funcion cardiaca. (A) Correlacion

de las concentraciones en suero de GSTP1 y proBNP con respecto a la fraccion de eyeccion cardiaca (FE) en sujetos de estudio. El analisis indica una correlacion negativa significativamente mayor de FE GSTP1 en suero (r = - 0,74; P<0,0001) en comparacion con la concentracion de proBNP en suero (r = -0,27; P = 0,0006). (B) El analisis de la curva ROC indica en el plano de corte optimo de >226 ng/ml (lfnea de color negro; AUC = 0,891, P<0,0001) una 5 sensibilidad del 81 % y una especificidad del 82 % para GSTP1 en suero y en el plano de corte optimo de >527 pg/ml (lfnea de color rojo; AUC = 0,624, P = 0,0039) una sensibilidad del 97 % y una especificidad del 26 % para proBNP en suero para identificar FE<22 %. (C) El analisis de la curva ROC indica en el plano de corte optimo de >76 ng/ml (AUC = 0,974, P = 0,0008) una sensibilidad del 93 % y una especificidad del 100 % para GSTP1 en suero para identificar FE<42 %.

10

La figura 9 muestra que GSTP1 inhibe las citocinas inflamatorias en un modelo de MI agudo de rata. (A) La inmunoprecipitacion con transferencia de Western no revelo ninguna diferencia en la formacion del formacion del complejo GSTP1-TRAF2 entre animales tratados con GSTP1 y de control; (B) la GSTP1 disminuyo los niveles de expresion de protefna JNK1 activada segun se analizo por transferencia de Western; (C) la GSTP1 inhibe la 15 expresion de ARNm de tejido de miocardio de varias citocinas inflamatorias. *; p<0,01.

La figura 10 muestra que GSTP1 mejora la inflamacion en el corazon danado de rata. (A) Los animales tratados con GSTP1 tuvieron niveles significativamente mayores de formacion de complejo entre GSTP1-TRAF2, GSTP1-JNK1 y GSTP1-p38, como se muestra por inmunoprecipitacion y los analisis de transferencia de Western; (B) la expresion 20 de protefnas de JNK1 activada, p38 y NF-kB es significativamente inferior en animales tratados con GSTP1 en comparacion con los controles como se muestra por los analisis de transferencia de Western; (C) la GST-P1 inhibe la expresion de ARNm de las citocinas inflamatorias TGF-B, IL-1B, IL-2 e IL-17; y aumenta la expresion de ARNm de la citocina antiiflamatoria IL-10 en miocardio danado en comparacion con los controles. *; p<0,001.

25 La figura 11 muestra que GSTP1 atenua la remodelacion del miocardio en un modelo inducido de isquemia de rata de insuficiencia cardiaca. (A) La tincion de colageno tricromica de Goldner revela una remodelacion tisular significativamente inferior en el corazon de animales tratados con GSTP1 en comparacion con los controles; (B) el espesor de la pared ventricular izquierda (infarto) es significativamente mayor en ratas tratadas con GSTP1 en comparacion con los controles; (C) Imagenes del ensayo Tunnel representativas de corazones de rata tratados con 30 GSTP1 o un vehfculo de control. Barra = 25 pm; (D) Las ratas tratadas con GSTP1 tuvieron un fndice apoptotico significativamente inferior en comparacion con los controles. *; p<0,01.

La figura 12 muestra que GSTP1 mejora la funcion ventricular izquierda en un modelo de rata de insuficiencia cardiaca inducida por isquemia. (A) Las ratas tratadas con GSTP1 tuvieron una fraccion de eyeccion ventricular 35 izquierda significativamente mayor 21 dfas posteriores al infarto de miocardio; (B) el volumen diastolico final ventricular izquierdo es significativamente mayor en los controles en comparacion con animales tratados con GSTP1. *; p<0,05.

Ejemplos:

40

1.: GSTP1 mejora la inflamacion en la miocardiopatfa (CMP) y enfermedad cardiaca isquemica (IHD) Pacientes y muestreo de tejido

45 Este estudio se aprobo por el Comite de Etica de la Universidad de Medicina de Viena. Para los analisis de matriz iniciales se usaron muestras de tejido cardiaco de 70 pacientes con CMP que dieron su consentimiento informado para su inclusion (miocardiopatfa dilatada idiopatica (DCM), n = 35; miocardiopatfa isquemica (ICM), n = 35). Despues, se incluyeron un total de 100 pacientes con CMP (DCM, n = 50; ICM, n = 50) entre enero de 2004 y julio de 2008. La Tabla 1 resume las caracterfsticas demograficas, clfnicas y hemodinamicas mas importantes y el 50 tratamiento de los pacientes. Todos los pacientes tenfan un tratamiento para la insuficiencia cardiaca optimizado y se programaron para el trasplante cardiaco segun los criterios de la American Heart Association. T odos los pacientes fueron sometidos a ecocardiograffa, angiograffa coronaria, la cateterizacion cardiaca derecha y resonancia magnetica para la evaluacion de la funcion ventricular, la viabilidad miocardica y los parametros hemodinamicos estandar por cardiologos independientes. La historia clfnica, los resultados de pruebas clfnicas, y el tratamiento se 55 documentaron y se codificaron y se ocultaron a los investigadores de las biopsias cardfacas. El grupo control consistio en 20 donantes de corazon, sin antecedentes de enfermedad cardiaca cuyos corazones no pudieron trasplantarse debido a razones de calidad.

Tabla 1: Datos demograficos, parametros hemodinamicos y medicacion de los pacientes del estudio

ICM DCM P

Varones, %

50 48 0,4300

Edad (anos)

58 + 6 55 + 7 0,1521

IMC (kg/m2)

26 + 3 25 + 4 0,6688

ASC (m2)

1,9 + 0,2 1,9 + 0,2 0,5883

PAP (mmHg)

30 + 10 32 + 8 0,2817

PECP (mmHg)

21 + 9 22 + 7 0,5264

RVP (unidades Wood)

2,5 + 1,2 2,6 + 1,7 0,8185

FEVI (%)

19 + 6 18 + 6 0,3755

Gasto cardiaco (L/min)

4,0 + 0,8 4,4 + 1,5 0,1647

Indice cardiaco (L/min/m2)

2,1 + 0,4 2,3 + 0,8 0,1952

Inhibidores de ACE (sf/no)

23/4 24/11 0,1299

Antagonistas del receptor de la angiotensina II, %

21 31 0,2494

Betabloqueante, %

96 83 0,0973

Prostaglandina E2, %

22 20 0,8312

Amiodarona, %

26 29 0,8169

Levosimendan, %

19 20 0,6959

ACE, enzima convertidora de la angiotensina; IMC, mdice de masa corporal; ASC, area de superficie corporal; DCM, miocardiopatfa dilatada; ICM, miocardiopatfa isquemica; FEVI, fraccion de eyeccion ventricular izquierda; PAP, 5 presion arterial pulmonar; PECP, presion de enclavamiento capilar pulmonar; RVP, resistencia vascular pulmonar.

Matriz de ADNc

Se aislo Poli(A+)-ARN con el kit Oligotex-dT (Quiagen, Valencia CA) y la smtesis de la primera hebra de ADNc se 10 realizo con transcriptasa inversa del virus de la mieloblastosis aviar (Promega, Madison, WI) en 2 pg de poli(A+) ARN. La cadena de ARN dentro del duplex de ADN-ARN se degrado y los productos se purificaron en una columna de centrifugacion Sephadex G-50 (Pharmacia, Uppsala, Suecia). Para el cebado de cadena inversa, se uso la primera cadena de ADNc para generar la segunda cadena de ADNc de marcada con [a-32P]dCTP para las matrices de ADNc (GEArray Q Human Apoptosis Gene Array, SuperArray Bioscience, Frederick, MD) como se describe 15 (Schafer y col., Circulation 108 (2003), 1585-1591). Las senales de hibridacion de ADNc en combinacion se cuantificaron usando el software ImageQuant (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA).

Matriz de protemas de tejido cardiaco

20 La matriz de protemas se realizo en una Antibody Microarray 500 (Clontech, Mountain View, CA; 507 protemas) como se describe (Aharinejad y col., Circulation 120 (2009a), 11 Supp1: S198-205). Las protemas en cada muestra se marcaron con 2 tintes fluorescentes diferentes y se incubaron en portaobjetos recubiertos con anticuerpos de micromatriz. Las senales fluorescentes de protemas de ambos portamuestras se detectaron por el escaner GenePix 4000B (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA). La cuantificacion de la senal se realizo calculando una relacion 25 normalizada internacional (INR), produciendo la abundancia de un antfgeno en una muestra de CMP con respecto a la de las muestras de control usando el Microarray Analysis Workbook automatizado (
http://bioinfo.clontech.com). Las protemas con valores de INR fuera del intervalo umbral se consideraron expresadas diferencialmente.

Aislamiento de ARNm y RT-PCR en tiempo real cuantitativa 30

El ARN total se aislo de biopsias de miocardio usando TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA). El tejido se homogenizo en un sistema MagNA Lyser (Roche, Mannheim, Alemania) usando perlas verdes del lisador MagNA durante 2030 segundos a 6000 rpm. Despues, las muestras homogeneizadas se mezclaron con 200 pl de cloroformo, se incubaron durante 2-3 minutos a temperatura ambiente y se centrifugaron a 12000 g durante 15 minutos a 4 °C. El 35 ARN se recogio y el ADNc se sintetizo usando 2 pg de ARN total y el kit M-MuLV-RT (Fermentas, St. Leon- Rot, Alemania). Se realizo RT-PCR en tiempo real en un instrumento LightCycler (Roche) como se describe (Aharinejad y col., Am J Transplant. 5 (2005), 2185-2192). Las secuencias de cebador eran de sentido/antisentido: GSTP1: 5'- GGCAACTGAAGCCTTTTGAG-3'/5'-TCATGGATCAGCAGCAAGTC-3'; TRAF2: 5'-GCAGAAGGTCTTGGAGATGG- 3'/5'-GGT GGAGCAGC ATT AAGGT C-3'; y p2-microglobulina: 5'-GAT GAGT AT GCCT GCCGT GT G-3'/5'-

40 CAATCCAAAT-GCGGCATCT-3', las unidades de expresion de ARNm se determinaron despues de la normalizacion en la expresion del gen de mantenimiento p2-microglobulina como se ha descrito previamente (Aharinejad y col.,

2009a y 2005; Pfaffl, Nucleic Acids Res. 29 (2001): e45) y se representaron para pacientes con CMP como un porcentaje con respecto a las de los controles. Las mediciones se realizaron tres veces. El valor medio de las tres mediciones de PCR en cada muestra se uso para el analisis de datos.

5 Co-inmunoprecipitacion y transferencia de Western

El tejido cardiaco humano se liso en el tampon de lisis que contenfa Tris 20 mM (pH 7,5), NaCl 135 mM, acido etilendiaminetetraacetico 2 mM (EDTA), ditiotreitol 2 mM (DTT), p-glicerofosfato 25 mM, pirofosfato sodico 2 mM, glicerol al 10 %, Triton X-100 al 1 %, ortovanadato sodico 1 mM, NaF 10 mM y fluoruro de fenilmetilsulfonilo 1 mM 10 (PMSF) complementado con un coctel del inhibidor de proteasa completo (Roche Applied Science, Indianapolis, IN, Estados Unidos) a 4 °C como se describe (Aharinejad y col., 2005). Los lisados se centrifugaron (15 000 g) a 4 °C durante 15 min. Para identificar la formacion de complejos de GSTP1-TRAF2, las protefnas (500 pg) se inmunoprecipitaron con el anticuerpo TRAF2 (0,5 pg, BD Pharmingen, San Diego, CA). La protefna predepurada A/G PLUS-perlas de agarosa (Santa Cruz Biotechnology) se incubaron con los inmunocomplejos durante 2 h mas y se 15 lavaron cuatro veces con el tampon de lisis. Los inmunoprecipitados se sometieron adicionalmente a SDS-PAGe y se presidieron con el analisis de transferencia de Western usando el anticuerpo monoclonal anti-GSTP1 (Bethyl, Montgomery, TX).

Los lisados de protefnas (50 pg/carril) se separaron por SDS-PAGE (10 %) antes de la transferencia electroforetica 20 sobre una membrana de nitrocelulosa (Bio-Rad, Hercules, CA) como se describe (Aharinejad y col., 2005). Las transferencias se incubaron con anticuerpo anti-GSTP1 monoclonal humano primario (Bethyl, Montgomery, TX), anti- TRAF2 monoclonal humano (BD Pharmingen, San Diego, CA), phospho-p38 policlonal humano (Promega, Madison, WI), phosphor-JNK policlonal humano (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), anti-JNK policlonal humano (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), anti-p38 policlonal humano (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, 25 CA), antes de la incubacion con anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rabano picante (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). La carga de protefnas se evaluo por tincion de Ponceau S y la inmunodeteccion se realizo por quimioluminiscencia (Supersig-nal-West-Pico, Pierce, Rockford, IL). Las bandas se cuantificaron mediante el software ImageQuant y las senales de protefnas especfficas se normalizaron con respecto a los controles de carga y se expresaron como unidades arbitrarias. Se uso el valor medio de tres mediciones en cada 30 muestra para el analisis de datos.

Experimentos de cultivo de tejido cardiaco

El miocardio recien aislado de pacientes de control, DCM o ICM (2 a 3 mm3) se incubo (100 piezas por placa de 6 35 pocillos) en DMEM que contenfa suero fetal bovino al 10 % (Gibco, Carlsbad, CA), 50 U/ml de penicilina y 250 pg/ml de estreptomicina (pH 7,2) a 37 °C en una atmosfera de aire complementa humidificado que contenfa CO2 al 5 % como se describe (Schafer y col., 2003). Despues de 6 horas, se trataron los pocillos con GSTP1 recombinante (2,5, 5 o 10 pg/ml; Assay Design, Ann Arbor, MC) y/o TNF-a (50 ng/ml; eBioscience, San Diego, CA) (Wu y col., 2006). Tras la incubacion durante 24 horas, el medio se cambio y los lisados de cultivo de tejido cardiaco se analizaron. Los 40 experimentos se realizaron por triplicado.

Analisis estadfstico

Los parametros clfnicos, las caracterfsticas de los pacientes, los niveles de expresion de ARNm de GSTP1 y TRAF2, 45 y los niveles de expresion de protefnas de GSTP1, TRAF2, p38 activa, y JNK activa se compararon entre los grupos mediante la prueba %2 y un analisis unidireccional de varianza (ANOVA unidireccional; prueba de Tukey) de acuerdo con la escala de la variable (continua o categorica). Todos los analisis estadfsticos se realizaron usando el sistema SAS para Windows, version 9.1.3 y la Enterprise Guide, version 4.1 (SAS Institute, Inc., Cary, NC). El significado estadfstico se ajusto a P<0,05. Los resultados se expresan como media + desviacion estandar (DE).

50

Resultados

GSTP1 y TRAF2 se sobreexpresan en miocardio danado

55 Las matrices de perfil de tejido de cribado identificaron mayores niveles de expresion genica cardiaca de GSTP1 y TRAF2, asf como niveles de expresion de protefnas en pacientes seleccionados aleatoriamente tanto con DCM como ICM en comparacion con los individuos de control (figuras 1A, 1B). Para verificar los resultados obtenidos en las matrices de cribado, la expresion miocardica de GSTP1 y TRAF2 se examino entonces de forma prospectiva por RT-PCR en tiempo real y transferencia de Western en la cohorte de estudio. Estos analisis indicaron niveles de

expresion de ARNm de miocardio significativamente elevados en DCM e ICM tanto para GSTP1 (P<0,0001) como TRAF2 (P<0,0001) en comparacion con los controles (figura 1C). Asimismo, los niveles de expresion de protefnas de miocardio se elevaron en DCM e ICM para GSTP1 (P<0,0001, P = 0,0019) y TRAF2 (P<0,0001, P = 0,005) en comparacion con los controles (figura 1D). No se encontraron diferencias significativas en la expresion de ARNm de 5 GSTP1 y de protefnas al comparar DCM e ICM; aunque los niveles de expresion de ARNm de TRAF2 (P = 0,001) y de protefnas (P<0,0001) eran significativamente mayores en DCM en comparacion con ICM (figuras 1C, 1D).

Interaccion GSTP1-TRAF2 en la activacion de JNK/p38

10 Dado que GSTP1 esta asociada ffsicamente a TRAF2 y forma complejos intracelulares en las celulas tumorales, se determino si esta ruta esta activa en el miocardio danado. Los presentes analisis en cultivos de tejido cardiaco mostraron que GSTP1 se asocia a TRAF2 en tejido cardiaco de iCm y de control, mientras que esta asociacion fue significativamente menos (P<0,0001) detectable en DCM (figura 2A). Dado que TRAF2 activa presuntamente dos MAP cinasas principales, se sabe que JNK y p38 median la inflamacion en el miocardio danado, se examino la 15 expresion miocardica de la protefna p38 y jNk activa en los pacientes del estudio. Los resultados muestran que tanto la expresion de protefnas cardiacas de DCM e ICM de JNK activa como de p38 (P<0,0001) se aumento significativamente en comparacion con los controles. Ademas, los pacientes de DCM revelaron una expresion de protefna de JNK y p38 cardiaca significativamente mayor (P<0,0001) en comparacion con ICM (figura 2B). Estos resultados muestran que la asociacion GSTP1-TRAF2 se regula de forma diferente en DCM e ICM y que esto puede 20 afectar a la activacion de MAPK.

GSTP1 modula la activacion de JNK/p38 mediada por TRAF2 cardiaca

Para determinar si GSTP1 modula la activacion de JNK y p38 mediada por TRAF2, los cultivos de tejido cardiaco de 25 los corazones danados y los controles se trataron con GSTP1 recombinante a tres concentraciones diferentes. El resultado muestra que en los cultivos de tejido tratados con GSTP1 obtenidos de DCM, ICM y controles, las expresiones de protefna de TRAF2 se redujeron significativamente en comparacion con los no tratados. De forma similar, tras el tratamiento con GSTP1, la expresion de JNK y p38 activa disminuyo en el tejido cardiaco de DCM, ICM y control en comparacion con el grupo no tratado. La comparacion de las concentraciones de GSTP1 aplicadas 30 con respecto a la reduccion de TRAF2, JNK y p38 muestra que en DCM e ICM, pero no en los controles, las diferentes entre 2,5 pg/ml y 5 pg/ml, asf como 10 pg/ml fueron significativas (figuras 3A, 3B).

Para probar si la GSTP1 complementada de forma exogena afecta a la formacion del complejo GST-P1-TRAF2, los lisados de tejido cardiaco tratado con GSTP1 se inmunoprecipitaron con el anticuerpo TRAf2 y los inmunogranulos 35 se sometieron a transferencia de Western. Los resultados muestran que en la asociacion de los cultivos de tejido cardiaco tratado con GSTP1 entre GSTP1 y TRAF2 era independiente de la dosis y la enfermedad y significativamente mayor (P = 0,07 para 5 pg/ml de concentracion de GSTP1) en comparacion con las muestras sin tratar (figura 3C).

40 Estos resultados muestran que en cultivos de tejido cardiaco, la GSTP1 afecta a la expresion de protefna de TRAF2 y actua como un regulador negativo de la activacion de JNK1 y p38 a traves de la formacion del complejo GSTP1- TRAF2.

TNF-a anula la sensibilidad de la cascada TRAF2/JNK/p38 a GST-P1 en DCM 45

Para determinar si GSTP1 interactua con la activacion de JNK y p38 inducida por TNF-a indicada en miocardio danado, los tejidos de cultivo cardiaco aislados de DCM, ICM y controles se trataron con TNF-a recombinante seguido de GSTP1 a 5 pg/ml. Estos experimentos demuestran que la cascada de JNK (P = 0,08) y p38 (P = 0,75) activada por TNF-a, asf como la expresion de protefna TRAF2 (P = 0,18) no se ven afectados por la GSTP1 50 recombinante en cultivos de tejido cardiaco de dCm. Sin embargo, en cultivos aislados de ICM y de controles, las expresiones de protefnas de jNk (P<0,001; P<0,002), p38 (P<0,0002; P<0,0001) y TRAF2 (P<0,001; P = 0,003) se reducen notablemente en respuesta a la estimulacion de GSTP1 (figura 4A). Para entender los resultados divergentes obtenidos para el grupo DCM frente al grupo ICM, los lisados de tejido cardiaco tratados con TNF-a y GSTP1 se inmunoprecipitaron y los inmunogranulos se sometieron a transferencia de Western. Estos analisis 55 muestran el fallo de GSTP1 para asociarse a TRAF2 tras la estimulacion de TNF-a en tejido cardiaco de DCM (figura 4B). Este efecto, sin embargo, no estaba presente en el tejido cardiaco de ICM y de control (figura 4C). Estos datos muestran el fallo de la union de TRAF2 mediada por TNF-a a GSTP1 en cultivos de tejido cardiaco de DCM en 5 pg/ml de GSTP1.

GSTP1 rescata la disminucion de JNK1/p38 mediada por TRAF2 tras el tratamiento con TNF-a a mayores concentraciones

5 Teniendo en cuenta que la expresion de protemas del tejido cardiaco de TRAF2 en DCM era aproximadamente dos veces mayor en comparacion con ICM y los controles, y considerando los resultados que se han descrito anteriormente, se ensayo el efecto de una mayor concentracion de GSTP1 tras el tratamiento con TNF-a. Los resultados demuestran que los cultivos de tejido cardiaco de DCM tratados con GSTP1 a 10 pg/ml y TNF-a a 50 ng/ml expresan una activacion de JNK y p38 notablemente reducida, asf como una expresion de protema de 10 TRAF2 reducida (P<0,0001; figuras 5A, 5B). De manera importante, los inmunoprecipitados de lisados de tejido cardiaco de DCM demuestran un aumento significativo (P<0,035) de la asociacion GSTP1-TRAF2 en 10 pg/ml en comparacion con 5 mg/ml de GSTP1.

Estos datos muestran que mayores concentraciones de GSTP1 inhiben la activacion de JNK y p38 inducida por 15 TNF-a en DCM a traves de la formacion del complejo GSTP1-TRAF2 y tambien afectan a la expresion de TRAF2.

En el presente ejemplo, GSTP1 y TRAF2 se identificaron como mediadores novedosos de CMP. La interaccion entre GSTP1 y TRAF2 se ha identificado previamente en neoplasias (Wu y col. 2006), sin embargo, la conexion con CMP no se ha sugerido antes. De forma interesante, la capacidad de GSTP1 para asociarse a TRAF2 difena entre DCM e 20 ICM de una manera dependiente de TNF-a. Aunque el papel proinflamatorio devastador de la senalizacion de TNF-a en CMP esta bien establecido, los ensayos clmicos han indicado paradojicamente una funcion mas complicada para TNF-a en CMP. Por lo tanto, las rutas espedficas del direccionamiento relacionadas con la senalizacion de TNF-a pueden proporcionar un enfoque mas selectivo en el tratamiento de CMP. TRAF2 es un regulador central de la senalizacion de TNF-a que media la activacion de MAPK. Al mismo tiempo, GSTP1 puede anular la activacion de 25 MAPK a traves de la asociacion a TRAF2 y, en consecuencia, suprimir la senalizacion de TNF-a. Los presentes datos muestran una elevacion significativa de JNK y p38 activas en miocardio de DCM en comparacion con ICM y los controles.

De forma importante, se demostro que el reabastecimiento de las reservas intracelulares de GSTP1 con protema 30 GSTP1 recombinante suprime de forma eficaz las respuestas inflamatorias sistemicas y localizadas a traves de la inhibicion de la senalizacion de MAPK. Misteriosamente, a diferencia de los hallazgos observados en el miocardio de DCM nativo en este estudio, la GSTP1 recombinante indujo la inhibicion de las actividades de JNK y p38, si como la disminucion de expresion de protema TRAF2 total en cultivos de tejido cardiaco. Este efecto se acompano de un aumento considerable en la asociacion de GSTP1-TRAF2 en todos los cultivos de celulas cardiacas tratados con 35 GSTP1. Ademas, se observaron los efectos maximos de la atenuacion de GSTP1 en el sistema TRAF2-JNK/p38 en 5 pg/ml y no vieron afectados por los aumentos adicionales de concentracion. Estos resultados contradicen los obtenidos con el tejido cardiaco. Sin embargo, despues del tratamiento con, los niveles de expresion de JNK/p38 y TRAF2 activa eran mas altos en los cultivos de pacientes con DCM. Dado que no se observo ninguna diferencia en la formacion del complejo GSTP1-TRAF2 tras la incubacion de GSTP1 en DCM en comparacion con tejidos de 40 cultivo cardiaco de iCm y de control, factores adicionales pueden contribuir a una regulacion intracelular de la asociacion de GSTP1-TRAF2 en CMP. La discrepancia entre los datos obtenidos por el analisis de muestras miocardicas y experimentos in vitro puede explicarse por la presencia de un factor circulante soluble normalmente presente en el miocardio nativo, pero no en cultivos de tejido cardiaco. Ya que TNF-a se eleva en gran medida en el suero de pacientes con CMP y se ha visto implicado en la patologfa subyacente, los cultivos de tejido cardiaco se 45 preincubaron antes de la administracion de GSTP1 recombinante para introducir los efectos de TNF-a en el modelo in vitro. Notablemente, la incubacion de cultivos de tejido cardiaco estimulados TNF-a con 5 pg/ml de GSTP1 no afecto a la asociacion de GSTP1-TRAF2 en cultivos cardiacos de ICM, mientras que en los cultivos cardiacos de DCM, la formacion del complejo GSTP1-TRAF2 se anulo completamente. Ademas, la alta expresion inalterada de JNK/p38 activa, asf como TRAF2 se observo exclusivamente en cultivos de tejido cardiaco de DCM. Estos 50 resultados estan en consonancia con los obtenidos por el analisis de biopsias miocardicas y apoyan completamente que la interaccion alterada de GSTP1-TRAF2 en pacientes con DCM dio como resultado un aumento de la actividad de MAPK.

Estos datos muestran que los aumentos adicionales de la concentracion de GSTP1 restauran la asociacion de 55 GSTP1-TRAF2 e inhiben la actividad de JNK1 y p38 en cultivos de tejido cardiaco de DCM tras la estimulacion de TNF-a. Estos resultados muestran que la atenuacion inducida por TNF-a de la union de GSTP1-TRAF2 que esta unicamente asociada a la patologfa de DCM, puede anularse por mayores concentraciones de GSTP1. Ademas, se demostro que en los cultivos de tejido cardiaco de ICM tanto la actividad de JNK1 como de p38 se inhibe por la

GSTP1 recombinante de una manera independiente de la dosis y de TNF-a. Estos resultados muestran que la accion de GSTP1 en ICM puede ocurrir, aunque de una manera independiente de TRAF2.

En conclusion, estos resultados muestran que la funcion novedosa de GST-P1 en la modulacion de TNF-a/TRAF2 5 causo la activacion de JNK1/p38 en DCM. Ademas, la asociacion GSTP1-TRAF2 se protege por la estimulacion de TNF-a en DCM pero no el miocardio de ICM o control de una manera dependiente de la concentracion de GSTP1. Estos hallazgos muestran (vease tambien: resumen publicado posteriormente Aharinejad y col., Circulation 120 (noviembre de 2009), S905; enhancement of cardiovascular sensitivity to cyclophosphamide: Haberzettl y col., Circulation 120 (noviembre de 2009), S718) la funcionalidad de la presente invencion como una estrategia 10 terapeutica avanzada y fiable que dirige la actuacion inflamatoria de GSTP1.

2.: GSTP1 en suero es un marcador sensible de CMP

Pacientes y metodos 15

Pacientes

Este estudio fue aprobado por el Comite de Etica de la Universidad de Medicina de Viena. Las muestras en suero de pacientes con CMP (FE<35 %; n = 40) y voluntarios sanos (FE>65 %; n = 40) se usaron para los analisis de matrices 20 iniciales. Despues, un total de 161 pacientes que dieron su consentimiento informado para su inclusion se incluyeron de forma prospectiva. La cohorte de estudio incluyo 141 pacientes con CMP en fase terminal programados para trasplante cardiaco y 20 pacientes con FE conservada que se sometieron a una cirugfa de la valvula aortica o mitral aislada convencional. Todos los pacientes fueron sometidos a ecocardiograffa, angiograffa coronaria, y la cateterizacion cardiaca derecha para la evaluacion de la funcion ventricular y los parametros hemodinamicos 25 estandar por dos cardiologos independientes. La historia clfnica, los resultados de pruebas clfnicas, y el tratamiento se documentaron, se codificaron y se ocultaron a los investigadores de las muestras en suero.

Los pacientes del estudio se subdividieron en grupos en base a su FE ventricular izquierda evaluada por ecocardiograffa como se indica a continuacion: FE>52 %; FE 52-43 %; FE 42-33 %, FE 32-23 % y FE<22 % como 30 se describe (Lee y col., Circulation 119 (2009) 3070-3077). El grupo de control (n = 20) consistio en 10 hombres y 10 mujeres, con edades entre 30-61 anos (51,8 + 3,2 anos).

Recogida en suero y tejido cardiaco

35 Las muestras en sangre venosa periferica se recogieron en el diagnostico de CMP o poco antes del trasplante (Aharinejad y col., Am. J. Transplant. 9 (2009b), 199-159). Las muestras en suero se codificaron y se concentraron en nitrogeno lfquido hasta el analisis. Se obtuvieron multiples biopsias miocardicas de la pared ventricular izquierda anterior (VI) de los corazones explantados de pacientes de trasplante (FE<35 %; n = 40) y de 20 corazones de donantes que no pudieron trasplantarse por motivos de calidad (FE>65 %, edad media 45 + 10, 12 hombres, 8 40 mujeres), se codificaron y se congelaron instantaneamente en nitrogeno lfquido.

Matrices de protefnas en suero y tejido cardiaco

Para la matriz de protefnas se obtuvieron muestras en suero seleccionadas aleatoriamente de pacientes con CMP 45 en fase terminal poco antes del trasplante y de voluntarios sanos y se agruparon para cada grupo. Para la matriz de protefnas de tejido cardiaco, se usaron lisados tisulares (Abraham y col., Circ. Res. 87 (2000), 644-647) de biopsias miocardicas VI de corazones explantados en pacientes de trasplante (n = 40) y corazones de control de donantes (n = 20). La matriz de protefnas se realizo en Antibody Microarray 500 (Clontech, Mountain View, CA; 507 protefnas), de acuerdo con el protocolo del fabricante. Las protefnas en cada muestra se marcaron con 2 tintes fluorescentes 50 diferentes (Cy3 y Cy5) y se incubaron en portaobjetos recubiertos con anticuerpos de micromatrices. Las senales fluorescentes de protefnas de ambos portaobjetos se detectaron por escaner GenePix 4000B (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA). La cuantificacion de la senal se realizo calculando una relacion normalizada internacionalmente (INR) usando el Microarray Analysis Workbook automatizado (
http://bioinfo.clontech.com).

55 Ensayos de GSTP1 y pro BNP

Se realizo un ensayo inmunoabsorbente ligando a enzimas (ELISA) para GSTP1 (HEPKIT™-Pi, Biotrin International Ltd., Dublin, Irlanda) de acuerdo con el protocolo del fabricante. La reaccion de sustrato se cuantifico espectrofotometricamente usando un lector de microplacas automatizado de 96 pocillos (Anthos, Salzburg, Austria) a

450 nm. Se midio proBNP N-terminal en suero sin diluir automaticamente por un ELISA no competitive quimioluminiscente (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) en un analizador Roche Elecsys 2010.

Aislamiento de ARNm y RT-PCR en tiempo real cuantitativa 5

Se aislo el ARNm total de biopsias de VI usando TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA) con un sistema MagNA Lyser (Roche, Mannheim, Alemania). El analisis por RT-PCR en tiempo real se realizo en un instrumento LightCycler (Roche) como se describe (Aharinejad y col., 2009b, Abraham y col., 2000). Las secuencias de cebador eran de sentido/antisentido: GSTP1: 5'-CCAAAGGT GGTGAGCTT CAT-3'/5'-T CT ACCCAGCAT GGAGGAAC-3'; y p2

10 microglobulina: 5'-GATGAGTATGCCTGCCGTGTG-3'/5'-CAATCCAAATGCG-GCATCT-3'. Los niveles de expresion de ARNm de GSTP1 se normalizaron con respecto a la senal de p2-microglobulina como un gen de mantenimiento (Aharinejad y col., 2009b, Abraham et al, 2000). El valor medio de tres mediciones de PCR en cada muestra se uso para el analisis de datos.

15 Analisis por transferencia de Western

Se prepararon lisados tisulares (Aharinejad y col., 2009b) y se analizo la expresion de GSTP1 mediante transferencia de Western usando anticuerpo anti-GSTP1 monoclonal humano primario (Bethyl, Montgomery, TX). Las bandas de protefnas se cuantificaron mediante el software ImageQuant y las senales de protefnas especfficas 20 se normalizaron con respecto a los controles de carga. El valor medio de tres mediciones en cada muestra se uso para el analisis de datos.

Analisis estadfstico

25 Las concentraciones en suero de GSTP1 y proBNP se compararon entre los grupos de pacientes mediante el analisis de la varianza (ANOVA unidireccional; prueba de Tukey). Para investigar la relacion entre GSTP1 y proBNP, asf como la relacion de GSTP1 con respecto a la edad, PAP, PECP, RVP, fndice cardiaco y creatinina, se computaron los coeficientes de correlacion por rangos de Spearman (rS). Se uso la regresion logfstica univariada para describir la utilidad de GSTP1 y proBNP como predictores de FE. Se usaron analisis de la curva caracterfstica 30 operativa del receptor (ROC) correspondientes para encontrar niveles de corte optimos. La sensibilidad y la especificidad de los cortes de GSTP1 y proBNP se calcularon por un analisis de tablas. Todos los analisis estadfsticos se realizaron usando el sistema SAS para Windows, version 9.1.3 y Enterprise Guide, version 4.1 (SAS Institute, Inc., Cary, NC). El significado estadfstico se ajusto a P<0,05. Los resultados se expresan como media + desviacion estandar.

35

Resultados

GSTP1 esta asociada a CMP

40 Los datos demograficos, caracterfsticas clfnicas y la medicacion mas relevante para CMP de los pacientes del estudio se muestran en la Tabla 2.

Tabla 2: Datos demograficos, caracterfsticas clfnicas y la medicacion mas relevante para CMP de los pacientes del

estudio.

Caracterfstica Edad (anos) Hombre/Mujer Diabetes mellitus

Valor 53 + 13 119/42 (74 %/26 %) 34 (21 %)

IDDM

22 (14 %)

NIDDM

12 (7 %)

Clasificacion funcional de NYHA

II

25 (15 %)

III

94 (59 %)

IV

42 (26 %)

Diagnostico

Enfermedad Valvular

20 (12 %)

ICM

43 (27 %)

DCM

86 (53 %)

Otros

12 (8 %)

Parametros hemodinamicos

FE (%)

24+14

PAP (mmHg)

31 + 9

PECP (mmHg)

21 + 8

RVP (unidades Wood)

2,58 + 1,41

Indice cardiaco (l/min/m2)

2,20 + 0,69

Hallazgos en laboratorio Creatinina (mg/dl)

1,32 + 0,44

GSTP1 (ng/ml)

271 +173

proBNP (pg/ml)

1200+630

Medicacion

Bloqueante de ACE Antagonistas del receptor de la angiotensina II Betabloqueante Levosimendan (Simpax)

111 (69 %) 39 (24 %) 131 (81 %) 21 (13 %)

DCM = miocardiopatfa dilatada; FE = fraccion de eyeccion ventricular izquierda; ICM = miocardiopatfa isquemica; IDDM = diabetes mellitus insulinodependiente; NIDDM = diabetes mellitus no insulinodependiente; NYHA = New York Heart association; PAP = presion arterial pulmonar; PECP = presion de enclavamiento capilar pulmonar; RVP = resistencia vascular pulmonar

En la deteccion de matriz de protefnas dirigida de muestras en suero agrupadas en pacientes con CMP seleccionados la GSTP1 se identifico como una protefna novedosa que se asociara a CMP. La figura 6A muestra las imagenes de matrices de GSTP1 e indica que sus niveles de protefna en suero aumentan en pacientes con CMP en comparacion con voluntarios sanos. Tras estos analisis de cribado, la concentracion de GSTP1 en suero se 5 determino en la misma cohorte de pacientes seleccionada para los analisis de cribado por ELISA especffico de GSTP1. Estos resultados muestran que las concentraciones de GSTP1 en suero aumentan significativamente en pacientes de HF en fase terminal en comparacion con las muestras de control (figura 6B, P<0,001).

Para aprender acerca de los niveles de protefna de GSTP1 de miocardio, se inicio una caracterizacion de protefnas 10 en tejido usando las muestras miocardicas VI de los mismos pacientes de HF en fase terminal analizados por matrices en suero y se usaron biopsias miocardicas VI de corazones donados como controles. Los resultados de la caracterizacion tisular indican niveles de expresion de GSTP1 elevados en el miocardio de pacientes de HF en fase terminal en comparacion con los controles (figura 6C). Para validar estos hallazgos, se realizaron analisis de transferencia de Western en tejidos cardiacos y se encontraron niveles de expresion de protefna de GSTP1 15 aumentados en pacientes con HF en fase terminal en comparacion con los controles (P<0,001; figura 6D).

Asociacion de GSTP1 y proBNP con FE

Para entender la asociacion de GSTP1 con CMP, sus niveles en suero se analizaron en todos los pacientes del 20 estudio y se representaron estos resultados en relacion con la FE del paciente. Seleccionado este tipo de analisis, que permite la diferenciacion entre FE conservada y reducida, se encontraron concentraciones de GSTP1 en suero significativamente mayores en pacientes con FE<22 % en comparacion con todos los demas grupos de FE (figura 7A; P<0,0001). Ademas, los pacientes con CMP con una FE entre el 23-32 % y una FE del 33-42 % tuvieron concentraciones en suero de GSTP1 significativamente mayores en comparacion con los de una FE entre el 4325 52 % o >52 % (figura 7A; P<0,0001). El mismo tipo de analisis para proBNP en suero revelo que en la presente cohorte de pacientes unicamente aquellos con una FE<22 % tuvieron concentraciones de proBNP en suero significativamente mayores (P<0,0001) en comparacion con todos los demas grupos de FE, excepto para los pacientes con una fE entre el 33-42 % (figura 7B). No se observaron diferencias significativas para la proBNP circulante cuando se compararon otros grupos de FE. En toda la poblacion, se aprecio una relacion positiva 30 significativa entre GSTP1 y proBNP (r = 0,47, P<0,0001; figura 7C).

Valor diagnostico de GSTP1 en suero en comparacion con proBNP en CMP

Para ilustrar la correlacion entre GSTP1 y proBNP en suero con FE se realizo un analisis de diagrama de dispersion 35 que incluyo todos los pacientes del estudio (figura 8A). Estos analisis revelaron una correlacion negativa significativa (r = -0,74; P<0,0001) entre GSTP1 y FE que era mayor que la correlacion entre proBNP y FE (r = -0,27; P = 0,0006). Al introducir las mediciones de GSTP1 en suero en la curva ROC, el analisis para la FE<22 %, que se identifico como significativamente diferente tanto para GSTP1 como proBNP en analisis de regresion logfstica univariados, a un nivel de corte optimo de >226 ng/ml de GSTP1 en suero, tenia una sensibilidad del 81 % y una especificidad del

82 % para identificar una FE<22 % (AUC = 0,891, P<0,0001). El mismo tipo de analisis a un nivel de corte de >527 pg/ml revelo una sensibilidad del 97 % y una especificidad del 26 % para proBNP en suero para diagnosticar pacientes con CMP con una FE<22 % (AUC = 0,624, P = 0,0039) (figura 8B). Despues, se analizo la capacidad de los niveles en suero de GSTP1 para diagnosticar grupos de pacientes de FE mayor, como se indica por los analisis 5 univariados que se han mostrado anteriormente (proBNP no fue significativamente diferente entre los grupos de pacientes con FE>22 %). Los analisis de la curva ROC indicaron que GSTP1 a un nivel de corte optimo de >76 ng/ml diagnostica pacientes con CMP con FE<42 % con una sensibilidad del 93 % y una especificidad del 100 % (AUC = 0,974, P = 0,0008) (figura 8C).

10 Correlacion de GSTP1 y proBNP con parametros demograficos y clfnicos

Las asociaciones entre GSTP1 y proBNP y las caracterfsticas clfnicas de los pacientes del estudio se ilustran en la Tabla 3.

15 Tabla 3: Analisis de correlacion de Spearman entre GSTP1 y proBNP y variables clfnicas de los pacientes del

estudio

GSTP proBNP

Covariables

rs P rs P

GSTP1 ng/ml

0,4690 <0,0001

FE

-0,7442 <0,0001 -0,2666 0,0006

Edad (anos)

-0,1375 0,0241 0,1756 0,0259

PECP (mmHg)

0,0577 0,5027 -0,0451 0,6039

RVP (Unidades Wood)

-0,0620 0,4682 -0,0594 0,4908

Indice cardiaco (l/min/m2)

-0,1103 0,2534 0,1531 0,1153

Creatinina (mg/dl)

-0,1560 0,0686 -0,0649 0,4543

FE = fraccion de eyeccion; PAP = presion arterial pulmonar; PECP = presion de enclavamiento capilar pulmonar; RVP = resistencia vascular pulmonar.

Tanto para GSTP1 en suero (r = -0,137; P = 0,0241) como proBNP en suero (r = 0,175; P = 0,0259) unicamente se descubrio una ligera, pero no relevante, correlacion con la edad de los pacientes entre los pacientes del estudio. No 20 se observo una correlacion significativa entre la concentracion de GSTP1 en suero y la presion arterial pulmonar, la presion de enclavamiento capilar pulmonar, la resistencia vascular pulmonar, el nivel de creatinina en suero y el fndice cardiaco. Asimismo, no se observo ninguna asociacion al genero y la diabetes mellitus (P>0,408) ni para GSTP1 en suero ni para proBNP en suero.

25 Persisten brechas de tratamiento significativas en el uso de la gestion basada en la evidencia a pesar de los resultados optimistas de los ensayos clfnicos aleatorios. La aparicion de los biomarcadores cardfacos como herramientas clfnicas cada vez mas eficaces sugiere el potencial para dirigir con exito la terapia y reducir la carga de enfermedad. Estudios innovadores han identificado una diversidad de marcadores moleculares novedosos de valor diagnostico y pronostico en CMP. ProBNP se acepta actualmente como un parametro sustituto en el control de CMP, 30 sin embargo, el trabajo de la rutina clfnica indica resultados divergentes en pacientes con CMP. El proposito del presente estudio fue, por tanto, encontrar un marcador en suero de CMP no invasivo y que responda rapidamente que permita la monitorizacion de los pacientes con CMP tanto con FE reducida como conservada. La deteccion dirigida de acuerdo con la presente invencion mostro que GSTP1 se asocia con la CMP en fase terminal. Las concentraciones sericas de GSTP1 diagnosticaron especfficamente CMP con asociacion significativa a FE 35 independientemente de las caracterfsticas demograficas y clfnicas en esta cohorte de pacientes. Cabe destacar que los coeficientes de correlacion notablemente mas altos se mostraron para la asociacion de GSTP1 en suero a FE en comparacion con proBNP. Ademas, la GSTP1 en suero muestra un mejor poder de diagnostico en pacientes con CMP con FE<22 % en comparacion con proBNP. De manera mas importante, la GSTP1 diagnostico una FE<42 %, mientras que proBNP no pudo.

40

Esta bien establecido que la FE es un determinante del riesgo cardiaco en pacientes con CMP. La relacion de riesgo para la mortalidad por todas las causas aumento en un 39 % por cada reduccion del 10 % en la FE por debajo del 45 %. Sin embargo, las caracterfsticas clfnicas de CMP pueden aparecer en pacientes con una FE> 45 % denominada como CMP con FE conservada. Por lo tanto, el presente hallazgo de que GSTP1 es capaz de 45 discriminar pacientes con CMP con una FE<42% es de gran importancia diagnostica y pronostica. Aunque proBNP es una herramienta establecida para el diagnostico de CMP y se correlaciona con Fe, los valores indicados con respecto a proBNP son bastante divergentes y, evidentemente, son elevados tanto en CMP con FE conservada

como FE reducida, dando como resultado su uso clfnico limitado. Por otra parte se recomienda usar proBNP principalmente para la exclusion de CMP con FE normal en pacientes con sintomas atribuidos a CMP. Sin embargo, dado que el genero y la edad avanzada se asocian a mayores niveles de proBNP (Costello-Boerrigter y col., J. Am. Coll. Cardiol. 47 (2006), 345-353), las propiedades de diagnostico propuestas de proBNP podrfan ser demasiado 5 inespecfficas para diferenciar la CMP con FE conservada en pacientes de edad avanzada.

Aparentemente, proBNP puede predecir una FE<30 % con una sensibilidad y una especificidad del 90 % y del 71 %, respectivamente en una poblacion de CMP con una FE<45 %. Otros estudios indicaron que proBNP en plasma detecta una FE<28 % con un 77 % de sensibilidad y un 69 % de especificidad en una cohorte de pacientes con una 10 FE<50 %, y se descubrio que proBNP puede predecir una FE <40 % con area bajo la curva de 0,69. En el presente estudio, proBNP tenia una sensibilidad del 97 % pero unicamente una especificidad del 26 % para diagnosticar una FE<22 % con un area bajo la curva de 0,62. La especificidad inferior de proBNP en el presente estudio puede explicarse por el hecho de que el nivel de corte se selecciono para identificar FE inferiores en comparacion con otros estudios. Este criterio se selecciono para demostrar la utilidad de GSTP1 para diagnosticar una FE<22 %. Ademas, 15 el presente estudio no tenia ningun criterio de exclusion para FE y esto podrfa haber influido en las caracterfsticas del ensayo con respecto a proBNP que se habfa mostrado previamente que variaba en pacientes con CMP con FE conservada.

La razon de la elevacion de GSTP1 en suero en pacientes con CMP no esta clara. Sin embargo, se estan 20 acumulando pruebas de que GSTP1 participa en la regulacion de la senalizacion del estres y protege las celulas contra la apoptosis a traves de su actividad de union a ligando no catalftica.

Los resultados del presente estudio muestran que la GSTP1 es un marcador serico sensible, especffico, economico y rapidamente medible superior a proBNP en CMP. Es importante destacar que, la GSTP1 discrimina entre FE 25 conservada y reducida con una alta sensibilidad y especificidad y, por lo tanto, puede servir como una herramienta novedosa en la orientacion de los ensayos clfnicos en pacientes con CMP.

3.: Modelo animal de IHD y CMP para tratamiento con GSTP1

30 Con el fin de tener un modelo que imite tanto la IHD como CMP en seres humanos, el modelo de ligadura de la ramificacion anterior de la arteria coronaria izquierda en la rata se ha seleccionado para probar adicionalmente el principio de la presente invencion. En este modelo, la IHD se induce tras la ligadura de dicha ramificacion de la arteria coronaria, y con el tiempo, los animales desarrollaran posteriormente CMP. Por lo tanto, el modelo el mas adecuado para mostrar la eficacia de la invencion sugerida para la prevencion o el tratamiento tanto de IHD como de 35 CMP.

Los siguientes experimentos se realizaran de acuerdo con el protocolo publicado por Aharinejad y col. (Cardiovasc. Res. 79 (2008), 395-404). La investigacion se adaptara a la Guide for the Care and Use of Laboratory Animals publicada por US National Institutes of Health (Publicacion del NIH n.° 85-23, revisada 1996) y se confirmara por el 40 Institutional Ethics Committee at the Medical University of Vienna. El Prof. Dr. Seyed-hossein Aharinejad, MD, PhD estara al cargo del diseno y supervision de la realizacion del estudio.

Se codificaron ratas Sprague Dawley macho (Harlan, Borchen, Alemania) para los experimentos. Debido al comprimido hemodinamico esperado, la fibrilacion ventricular, la ruptura miocardica y la hemorragia tras un infarto de 45 miocardio (MI), se espera que el numero de animales supervivientes sea de aproximadamente el 60-70 %. Por lo tanto, en cada grupo con infarto de miocardio, se incluiran un total de 18 animales. Las ratas se anestesiaran con inyeccion por intraperitoneal de Ketasol (100 mg/kg de peso corporal) y Rompun (10 mg/kg de peso corporal), se intubaran por via traqueal usando un cateter de calibre 14 y se ventilaran con Isoflurano al 1,5 % a 55 ciclos por minuto (volumen tidal: 2,5 ml) antes de someterlas a toracotomfa lateral izquierda. La ramificacion anterior de la 50 arteria coronaria izquierda (ACI) se ligara con un lazo de polipropileno 7-0 (Ethicon, Somerville, NJ) o se dejara intacta en un procedimiento simulado. El dfa (d) 7 posterior al MI, la funcion ventricular izquierda (VI) se evaluara por ecocardiograffa. Despues, los animales con una funcion cardiaca inicial comparable se codificaran y se asignaran a los grupos 1-8 como se muestra en la Tabla 4. Para tratar el dolor esperado tras MI, los animales recibiran inmediatamente despues de la induccion de MI, y el primer dfa posterior al MI, 0,6 mg/100 g de peso corporal de 55 Piritramid (Dipidolor® en una solucion de glucosa al 5 %) s.c. Ademas, los animales recibiran Piritramid a traves de su agua para beber durante 3 dfas a 0,6 mg/100 g de peso corporal (250 ml de agua mas 20 ml de solucion de glucosa al 5 %) y los dfas 4-7 posteriores al MI a 0,3 mg/100 g de peso corporal.

El d7, inmediatamente despues de la induccion del MI, el tratamiento comenzara en los grupos 1-4 como se indica a

continuacion. El grupo 1 recibira a diario inyecciones por via intraperitoneal de solucion de Ringer durante dos semanas (control), mientras que los grupos 2-4 recibiran inyecciones diarias de GSTP1 recombinante a una dosis de 10, 20 y 40 mg/peso corporal durante dos semanas, respectivamente. El d21, el tratamiento comenzara en los grupos 5-8 como se indica a continuacion. El grupo 5 recibira inyecciones por via intraperitoneal a diario de solucion 5 de Ringer durante dos semanas (control), mientras que los grupos 6-8 recibiran inyecciones diarias de GSTP1 recombinante a una dosis de 10, 20 y 40 mg/peso corporal durante dos semanas, respectivamente. El grupo 9 incluye 10 animales con procedimiento simulado. El d52 y d86, la funcion VI se evaluara de nuevo, y los animales se sacrificaran el dfa 88 posterior al MI.

10 ____________Tabla 4: Grupos de animales y su tratamiento____________

Grupo

Tratamiento Sacrificio N.° de animales Aplicacion y dosis

1

Ringer d88 18 i.p.

2

GSTP1 d88 18 i.p., 10 mg/kg de pc, 2 semanas

3

GSTP1 d88 18 i.p., 20 mg/kg de pc, 2 semanas

4

GSTP1 d88 18 i.p., 40 mg/kg de pc, 2 semanas

5

Ringer d88 18 i.p.

6

GSTP1 d88 18 i.p., 10 mg/kg de pc, 2 semanas

7

GSTP1 d88 18 i.p., 20 mg/kg de pc, 2 semanas

8

GSTP1 d88 18 i.p., 40 mg/kg de pc, 2 semanas

9

Simulado d88 10 -

N.° total de animales

154 154

pc: peso corporal

Grupo

Tratamiento Sacrificio N.° de animales Aplicacion y dosis

1

Ringer d88 18 i.p.

2

GSTP1 d88 18 i.p., 10 mg/kg de pc, 2 semanas

3

GSTP1 d88 18 i.p., 20 mg/kg de pc, 2 semanas

4

GSTP1 d88 18 i.p., 40 mg/kg de pc, 2 semanas

5

Ringer d88 18 i.p.

6

GSTP1 d88 18 i.p., 10 mg/kg de pc, 2 semanas

7

GSTP1 d88 18 i.p., 20 mg/kg de pc, 2 semanas

8

GSTP1 d88 18 i.p., 40 mg/kg de pc, 2 semanas

9

Simulado d88 10

° total de animales

154

Se evaluaron los siguientes parametros (1-11): 1. Fraccion de eyeccion VI (FE), volumen sistolico final VI (VSF), volumen diastolico final VI (VDF) usando ecocardiograffa

2. Relacion corazon con respecto al peso corporal

3. Histologfa e inmunocitoqufmica para tamano de infarto, espesor de la pared de infarto y fibrosis, asf como angiogenesis, protefnas inflamatorias, incluyendo p38, jun cinasa e interleucinas (unicamente se mencionan ejemplos para las rutas inflamatorias)

4. Rutas de senalizacion

5. Ensayos de union a promotor

6. Ensayo TUNEL para evaluacion de la apoptosis

7. RT-PCR cuantitativa, asf como transferencia de Western, e inmunoprecipitacion para la evaluacion de GSTP1 y relacionada con sus rutas, TRAF, TNF-a y sus receptores; MMP y sus inhibidores TIMP, VEGF-A y sus receptores (unicamente se mencionan ejemplos aquf)

8. ELISA de niveles de GSTp1 en suero y protefnas relacionadas__________________________________________

Todos los datos se codificaran y se almacenaran usando Microsoft ACCESS. El analisis de varianza (ANOVA; prueba de t o ANOVA no parametrico) y la prueba chi2 se usaran basandose en la dependencia del parametro a 15 analizar (numerico o alfanumerico, distribucion normal o no) para comparar los datos entre los grupos. La prueba de correlacion de Spearmans y el analisis de regresion logfstica se usaran para evaluar la correlacion entre los

parametros evaluados. Se usara SAS version 9.1.3 para los analisis estadfsticos.

4.: Efecto del tratamiento con GSTP1 sobre la inflamacion, morfologfa cardiaca y funcion en un modelo de rata de infarto de miocardio agudo e insuficiencia cardiaca inducida por isquemia.

5

El siguiente experimento demuestra el principio, si el tratamiento con glutation S-transferasa P1-1 (GSTP1) es beneficioso para contrarrestar las cascadas inflamatorias activadas tras un infarto de miocardio agudo y en el proceso de la insuficiencia cardiaca inducida por isquemia resultado en un modelo de rata experimental aceptado.

10 Materiales y metodos

Animales y modelo de infarto de miocardio

Todos los experimentos se aprobaron por el Institutional Animal Care and Use Committee at the Vienna Medical 15 University. Se codificaron para los experimentos un numero total de 60 ratas macho Sprague Dawley (Harlan, Borchen, Alemania). Debido al compromiso hemodinamico, la fibrilacion ventricular, la ruptura miocardica y la hemorragia tras un infarto de miocardio, el numero de animales supervivientes con funcion cardiaca inicial comparable fue de 48. Las ratas se anestesiaron, se intubaron por via traqueal y se ventilaron con una mezcla de oxfgeno/isoflurano antes se someterse a una toracotomfa lateral izquierda. Despues, la ramificacion de la arteria 20 coronaria izquierda se ligo con un lazo de polipropileno 7-0 (Ethicon, Somerville, NJ, Estados Unidos). Se aplico una inyeccion de dosis individual intraperitoneal de GSTP1 recombinante (1 mg/kg disuelto en 1 ml de solucion salina tamponada con fosfato (PBS); n = 24) (Assay Design, Ann Arbor, MI) o 1 ml de PBS (n = 24), 1 h despues de la induccion del infarto de miocardio. La funcion ventricular izquierda (VI) se evaluo mediante ecocardiograffa un dfa (n = 48) y tres semanas (n = 24) despues de la induccion del infarto de miocardio como se describe a continuacion. 25 Despues, se sacrificaron un total de 12 animales en cada grupo un dfa despues del tratamiento; y los 12 animales restantes en cada grupo se sacrificaron 3 semanas despues de la induccion del infarto de miocardio (Aharinejad y col., 2008) .

Mediciones hemodinamicas por ecocardiograffa 30

En ratas anestesiadas, se midieron las longitudes del eje largo VI maximas (L) y el trazado del area endocardica usando una cabeza de exploracion de matriz lineal de 15 MHz para calcular el volumen diastolico final VI (VDFVI) y sistolica final VI (VSFVI) y la fraccion de eyeccion VI (FEVI = VdFVI-VSFVI/VDFVI). Las mediciones utilizaron tres ciclos cardiacos consecutivos (Aharinejad y col., 2008).

35

Histologfa e inmunoqufmica

Los ventrfculos se cortaron en seccion transversal en el punto medio de su eje largo, antes de que fueran congelados o fijados por inmersion en formalina. Las muestras incluidas en parafina se usaron para H&E, ensayo 40 Tunnel, asf como tincion de colageno tricromica de Goldner. Los ensayos TUNEL (kit de deteccion de muerte celular in situ) se realizaron por triplicado de acuerdo con el protocolo del fabricante (Roche Molecular Biochemicals, Basel, Suiza). Los portaobjetos se contratineron con 4,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI, Molecular Probes, Eugene, OR) y se incluyeron en antifadent AF1 (Citifluor, Leicester, Reino Unido). Se obtuvieron imagenes digitales por microscopfa de fluorescencia (Nikon, Melville, NY). La morfometrfa se realizo como se describe (Aharinejad y col., 2008).

45

Aislamiento de ARNm y RT-PCR en tiempo real cuantitativa

Se aislo ARN total de tejidos de miocardio usando TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA) y el sistema MagNA Lyser (Roche, Mannheim, Alemania) como se describe (Aharinejad y col., 2008). Las mediciones por RT-PCR en tiempo 50 real por triplicado se realizaron en un instrumento LightCycler (Roche) como se describe (Aharinejad y col., 2008). Las secuencias de cebador eran de sentido/antisentido: GsTp1: 5'-GGCAACtGaAGcCtTTTGAG-3'/5'- TCATGGATCAGCAGCAAGTC-3'; factor 2 asociado al receptor del factor de la necrosis tumoral (TRAF2): 5'- GCAGAAG-GT CTT GGAGAT GG-3'/5'-GGT GGAGC AGCATT AAGGT C-3'; y p2-microglobulina: 5'-

GATGAGTATGCCTGCCGTGTG-3'/5'-CAATCCAAATGCG-GCATCT-3'. La expresion de ARNm se calculo y se 55 represento para animales tratados como porcentaje con respecto al de los controles.

Co-inmunoprecipitacion y transferencia de Western

Los lisados de tejido cardiaco se prepararon como se describe (Schafer y col., 2003). Para la deteccion de los complejos GSTP1-TRAF2, GSTP1-JNK1 y GSTP1-p38, las protemas (500 pg) se inmunoprecipitaron con 0,5 pg de 5 anticuerpos correspondientes contra TRAF2 (bD Pharmingen, San Diego, CA), jNK1 y p38 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). Los inmunocomplejos se incubaron con A/G PLUS-perlas de agarosa (Santa Cruz Biotechnology) y se precipitaron mediante transferencia de Western usando el anticuerpo GSTP1 (Bethyl, Montgomery, TX) como se describe (Schafer y col., 2003). Las transferencias se incubaron con anticuerpos GSTP1 monoclonales humanos primarios (Bethyl) y TRAF2 (BD Pharmingen) o phospho-p38 policlonales (Promega, 10 Madison, WI), phospho-JNK1, JNK1 y p38 (Santa Cruz Biotechnology) antes de la incubacion con anticuerpos secundarios (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). Todos los experimentos se realizaron por triplicado y los niveles de expresion se corrigieron para la protema de carga de control.

Analisis estadfstico 15

Todos los parametros se compararon entre los grupos por la prueba %2 y un analisis de varianza unidireccional (ANOVA unidireccional; prueba de Tukey) de acuerdo con la escala de la variable (continua o categorica). Todos los analisis estadfsticos se realizaron usando el sistema SAS para Windows, version 9.1.3 y la Enterprise Guide, version 4.1 (SAS Institute, Inc., Cary, NC). El significado estadfstico se ajusto a P<0,05. Los resultados se expresan como 20 media + desviacion estandar (DE).

Resultados

GSTP1 mejora la sobreexpresion miocardica de citocinas inflamatorias tras un MI agudo 25

La inmunoprecipitacion y los analisis de transferencia de Western revelaron que en el modelo de infarto de miocardio agudo, el tratamiento con GSTP1 no cambio la formacion de los complejos GSTP1-TRAF2 (figura 9A). La transferencia de Western revelo que, aunque GSTP1 puede reducir los niveles de protema de tejido cardiaco de JNK1 activada (p<0,01; figura 9B), no hubo ninguna diferencia en los niveles de expresion de protemas de P38 y 30 NF-kB activadas en comparacion con los controles. Ademas, la GSTP1 inhibio las expresiones de tejido cardiaco de las citocinas inflamatorias, incluyendo TGF-p, IL-1 p, IL-2 e IL-17 (p<0,01; figura 9C) en comparacion con los controles; aunque los niveles de expresion de IL-10 no cambiaron significativamente tras el tratamiento con GSTP1 (figura 9C).

35 GSTP1 mejora la expresion miocardica de las citocinas proinflamatorias a traves de la senalizacion de NF-kB regulada por TRAF2 en el miocardio danado

La inmunoprecipitacion y los analisis de transferencia de Western revelaron que las ratas tratadas con GSTP1 tuvieron una formacion significativamente aumentada de complejos GST-P1-TRAF2, GSTP1-JNK1 y GSTP1-p38 en 40 su tejido cardiaco danado 3 semanas posteriores al MI en comparacion con los controles (p<0,001; figura 10A). Ademas, las ratas tratadas con GSTP1 tuvieron una expresion de protemas significativamente reducida de JNK1 y p38 activadas en su tejido de miocardio danado en comparacion con los controles (p<0,001; figura 10B). Ademas, las ratas tratadas con GSTP1 tuvieron menores expresiones de ARNm de tejido cardiaco de TGF-p, IL-1 p, IL-2 e IL- 17 en comparacion con los controles (P<0,001; figura 10C). Por el contrario, la expresion de ARNm de tejido 45 cardiaco de la citocina antiinflamatoria IL-10 se aumento significativamente en animales tratados con GSTP1 en comparacion con los controles (p<0,001; figura 10C). Estos resultados muestran que el tratamiento con GSTP1 inhibe la senalizacion proinflamatoria de JNK1, p38 y NF-kB mediada por TRAF2 y mejora la expresion de citocinas miocardicas en la insuficiencia cardiaca inducida por isquemia.

50 GSTP1 mejora la remodelizacion en el miocardio danado de rata

Los analisis morfometricos revelaron que el espesor de la pared VI se aumento en ratas tratadas con GSTP1 (2,2 + 0,4 mm) en comparacion con las ratas de control (1,3 + 0,5 mm; figuras 11A y 11B). Para analizar el efecto del tratamiento con GSTP1 sobre el tejido miocardico de rescate en las zonas infartadas y periinfartadas, se realizo un 55 ensayo TUNEL. Los resultados de estos ensayos muestran una reduccion significativa de los eventos apoptoticos en la zona infartada y periinfartada de los animales tratados con GSTP1 en comparacion con los animales de control (figura 11C y 11D). Estos datos muestran que el tratamiento con GSTP1 reduce significativamente la remodelacion miocardica y la apoptosis tisular miocardica posterior al MI en el corazon danado de rata.

Claims (9)

1. REIVINDICACIONES

   I. Glutation S-transferasa P1 (GSTP1) para su uso en la prevencion o tratamiento de miocardiopatfas.

   5 2. GSTP1 para su uso de acuerdo con la reivindicacion 1, caracterizada por que la miocardiopatfa es

   miocardiopatfa dilatada, especialmente miocardiopatfa congestiva; miocardiopatfa hipertrofica obstructiva, especialmente estenosis subaortica hipertrofica; otra miocardiopatfa hipertrofica, especialmente miocardiopatfa hipertrofica no obstructiva; miocardiopatfa isquemica, enfermedad endomiocardica (eosinofila), especialmente fibrosis endomiocardica (tropical) o endocarditis de Loffler; fibroelastosis endocardica, especialmente miocardiopatfa 10 congenita; otra miocardiopatfa restrictiva, especialmente miocardiopatfa constrictiva SAI; miocardiopatfa alcoholica, miocardiopatfa debida a farmacos y otros agentes externos, miocardiopatfas sin especificar, especialmente miocardiopatfa (primaria)(secundaria) SAI; miocardiopatfa en enfermedades infecciosas y parasitarias, especialmente miocardiopatfa en difteria; miocardiopatfa en enfermedades metabolicas, especialmente amiloidosis cardiaca; miocardiopatfa en enfermedades nutricional, especialmente miocardiopatfa nutricional SAI; tofos gotosos 15 de enfermedad cardiaca o enfermedad cardiaca tirotoxica.
2. 3. GSTP1 para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, caracterizada por que se usa en un medicamento que se administra por via parenteral, preferiblemente, por via intraperitoneal o intravenosa, especialmente por via intravenosa.

   20
3. 4. GSTP1 para su uso de acuerdo con la reivindicacion 3, caracterizada por que el medicamento se administra en una dosificacion de 0,001 a 100 mg de GSTP1/kg, preferiblemente de 0,01 a 10 mg de GSTP1/kg, especialmente de 0,1 a 1 mg de GSTP1/kg, a un ser humano individual, preferiblemente a traves de administracion intravenosa.

   25
4. 5. GSTP1 para su uso de acuerdo con la reivindicacion 3 o 4, caracterizada por que el medicamento se administra en una dosificacion de 0,1 a 10000 U de GSTP1/kg, preferiblemente de 1 a 1000 U de GSTP1/kg, especialmente de 10 a 100 U de GSTP1/kg, a un ser humano individual, preferiblemente a traves de administracion intravenosa.

   30
5. 6. Composicion farmaceutica que comprende GSTP1, preferiblemente GSTP1 humana recombinante o GSTP1 de placenta humana, y un vehfculo farmaceuticamente aceptable para la prevencion o tratamiento de miocardiopatfas.

   35 7. Composicion de acuerdo con la reivindicacion 6, caracterizada por que contiene de 1 a 100000 U de

   GSTP1, preferiblemente de 10 a 10000 U de GSTP1, especialmente de 10 a 1000 U de GSTP1.
6. 8. Composicion de acuerdo con la reivindicacion 6 o 7, caracterizada por que contiene un tampon, preferiblemente un tampon fosfato, un tampon Tris-HCl o un tampon HEPES, con un pH de 5,5 a 9,0,

   40 preferiblemente de 6,0 a 8,5, especialmente de 6,5 a 8,0.
7. 9. Uso de GSTP1 o ARNm de GSTP1 para el diagnostico in vitro de miocardiopatfa.
8. 10. Uso de acuerdo con la reivindicacion 9, caracterizado por que la miocardiopatfa es una 45 miocardiopatfa de acuerdo con la reivindicacion 2.

   II. Un metodo in vitro para diagnosticar miocardiopatfas, especialmente una miocardiopatfa de acuerdo con la reivindicacion 2, caracterizado por que la cantidad de GSTP1 o ARNm de GSTP1 en una muestra biologica se determina y se compara con una muestra biologica con una miocardiopatfa definida, especialmente con una

   50 muestra biologica de un individuo sano.
9. 12. Un metodo in vitro de acuerdo con la reivindicacion 11, caracterizado por que la muestra biologica es

   una sangre humana, plasma o muestra serica o una muestra humana de biopsia de miocardio.