ES2673721T3 - Modulación antisentido de la expresión de GCGR - Google Patents

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Abstract

Un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado monocatenario que consiste en la secuencia de bases nucleotídicas de la SEQ ID NO: 11, en la que el oligonucleótido comprende: un segmento separador que consiste en diez desoxinucleósidos unidos; un segmento del ala en 5' que consiste en tres nucleósidos unidos; un segmento del ala en 3' que consiste en cuatro nucleósidos unidos; en el que el segmento separador está colocado entre el segmento de ala en 5' y el segmento de ala en 3', en el que cada nucleósido de cada segmento de ala comprende un azúcar modificado 2'-O-metoxietilo, en el que cada enlace internucleosídico de dicho oligonucleótidos modificado es un enlace fosforotioato y en el que cada resto de citosina de dicho oligonucleótido modificado es una 5-metilcitosina.

Description

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Modulación antisentido de la expresión de GCGR
DESCRIPCIÓN
Campo
En el presente documento se proporcionan compuestos y composiciones para reducir la expresión del ARNm y la proteína del GCGR en un animal. Dichos compuestos y composiciones son útiles, por ejemplo, para tratar, prevenir, retrasar o mejorar enfermedades asociadas con trastornos metabólicos, particularmente trastornos asociados con la diabetes.
Antecedentes
La insulina y el glucagón son dos hormonas pancreáticas que intervienen en la regulación de la homeostasis y el metabolismo de la glucosa. El glucagón se secreta a partir de las células a de los islotes pancreáticos y regula la homeostasis de la glucosa a través de la modulación de la producción de glucosa hepática (Quesada y col., J. Endocrinol. 2008. 199: 5-19). La función principal del glucagón es contrarrestar las acciones de la insulina.
La alteración de la regulación del metabolismo de la glucosa puede deberse a una secreción y/o acción defectuosa de la insulina o a una alteración de la supresión del glucagón posprandial (Shah y col., Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 1999. 277: E283-E290). Se ha demostrado que la inhibición de la secreción de glucagón posprandial en sujetos diabéticos reduce sustancialmente la glucosa en sangre, lo que sugiere que el glucagón contribuye significativamente a la hiperglucemia observada en sujetos con diabetes mellitus de tipo 2 (Shah y col., J. Clin. Endocrinol. Metab. 2000. 85: 4053-4059).
La diabetes tipo 2 se caracteriza por la alteración de la secreción y/o acción de la insulina, y muchos sujetos también exhiben niveles inapropiados de glucagón circulante en el estado de ayuno y posprandial. Un aumento en la relación glucagón/insulina es, probablemente, un determinante importante de la hiperglucemia observada en pacientes con diabetes de tipo 2 (Baron y col., Diabetes. 1987. 36: 274-283). La falta de supresión de la secreción de glucagón posprandial en sujetos con DMT2 también desempeña un papel importante en la patogenia de la hiperglucemia posprandial (Henkel y col., Metabolism. 2005. 54: 1168-1173).
El glucagón ejerce su acción sobre los tejidos diana mediante la activación de su receptor, GCGR. El receptor del glucagón es una proteína de 62 kDa que es un miembro de la familia de receptores acoplados a la proteína G de clase B (Brubaker y col., Recept. Channels. 2002. 8: 179-88). La activación del GCGR conduce a la transducción de señal por las proteínas G (Gsa y Gq), mediante el cual Gsa activa la adenilato ciclasa, que causa la producción de AMPc, lo que da como resultado un aumento de los niveles de proteína quinasa A. La señalización del GCGR en el hígado da como resultado un aumento de la producción de glucosa hepática por inducción de la glucogenolisis y la gluconeogénesis junto con inhibición de la glucogénesis (Jiang y Zhang. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 2003. 284: E671-E678). El GCGR también se expresa en tejidos extrahepáticos, que incluyen corazón, músculo liso intestinal, riñón, cerebro y tejido adiposo (Hansen y col., Peptides. 1995. 16: 1163-1166).
La inhibición antisentido del GCGR proporciona una ventaja única sobre los inhibidores tradicionales de molécula pequeña en que los inhibidores antisentido no dependen de la unión competitiva del compuesto a la proteína e inhiben la actividad directamente al reducir la expresión del GCGR. Una patente de Estados Unidos representativa que enseña inhibidores antisentido del GCGR incluye la patente de Estados Unidos n.° 7.750.142. La tecnología antisentido está emergiendo como un medio eficaz para reducir la expresión de ciertos productos génicos y, por lo tanto, puede resultar especialmente útil en una serie de aplicaciones terapéuticas, diagnósticas y de investigación para la modulación del GCGR.
El documento WO 01/77384 describe la detección de polimorfismos de un solo nucleótido y metilaciones de citosina.
El documento US 2007/031843 describe un grupo de oligonucleótidos reguladores bacterianos y asociados a bacterias.
El documento WO 2007/134014 describe compuestos y procedimientos para modular la expresión de GCGR.
Los documentos WO 2007/035771, WO 2004/096996 y US 2007/238690 describen la modulación de la expresión del receptor de glucagón.
Actualmente hay una falta de opciones aceptables para tratar trastornos metabólicos. Por lo tanto, un objeto de la presente invención es proporcionar compuestos y composiciones para usar en el tratamiento de tales enfermedades y trastornos. La presente invención se refiere al descubrimiento de nuevos inhibidores altamente potentes de la expresión génica de GCGR.
Sumario
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La invención proporciona un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado monocatenario que consiste en la secuencia de bases nucleotídicas de la SEQ ID NO: 11, en la que el oligonucleótido comprende:
un segmento separador que consiste en diez desoxinucleósidos unidos; un segmento del ala en 5' que consiste en tres nucleósidos unidos; un segmento del ala en 3' que consiste en cuatro nucleósidos unidos;
en el que el segmento separador está situado inmediatamente adyacente a y entre el segmento del ala 5' y el segmento del ala 3', en el que cada nucleósido de cada segmento de ala comprende un azúcar modificado 2'-O- metoxietilo, en el que cada enlace internucleosídico es un enlace de dicho oligonucleótido modificado es un enlace fosforotioato y en el que cada resto de citosina de dicho oligonucleótido modificado es una 5-metilcitosina.
La invención también proporciona una composición que comprende el compuesto de la invención o una sal del mismo y al menos uno de un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.
La invención también proporciona un compuesto de la invención o una composición de la invención para su uso en terapia.
La invención también proporciona un compuesto de la invención o una composición de la invención para su uso en el tratamiento o prevención de una enfermedad metabólica en un ser humano, opcionalmente en el que la enfermedad metabólica es diabetes.
En el presente documento se desvelan procedimientos, compuestos y composiciones para modular la expresión de GCGR y tratar, prevenir, retrasar o mejorar enfermedades asociadas con trastornos metabólicos, particularmente trastornos asociados con diabetes y/o un síntoma de los mismos.
Descripción detallada
Debe entenderse que tanto la descripción general anterior como la descripción detallada siguiente son ejemplos y explicaciones únicamente y no son restrictivas como se describe en el presente documento, según lo reivindicado. En el presente documento, el uso del singular incluye el plural a menos que específicamente se indique lo contrario. Como se usa en el presente documento, “o” significa “y/o”, a menos que se indique lo contrario. Además, el uso del término “que incluye”, así como otras formas, tales como "incluye" e "incluido" no es limitante. Asimismo, términos tales como “elemento” o “componente” abarcan tanto elementos como componentes que comprenden una unidad y elementos y componentes que comprenden más de una subunidad, menos que específicamente se indique lo contrario.
Los títulos de las secciones usadas en el presente documento son sólo para propósitos de organización y no deben interpretarse como una limitación del objeto descrito.
Definiciones
A menos que se proporcionen definiciones específicas, la nomenclatura usada en relación con la química analítica, la química orgánica sintética y la química medicinal y farmacéutica descritas en el presente documento y los procedimientos y técnicas de las mismas descritos en el presente documento son los bien conocidos y usados habitualmente en la técnica. Se pueden usar técnicas estándar para síntesis química y análisis químico.
A menos que se especifique lo contrario, los siguientes términos tienen los significados siguientes:
"2'-O-metoxietilo" (también 2'-MOE y 2'-O (CH2)2-OCH3) se refiere a una modificación de O-metoxi-etilo de la posición 2' de un anillo de furosilo. Un azúcar modificado 2'-O-metoxietilo es un azúcar modificado.
"Nucleótido 2'-O-metoxietilo" significa un nucleótido que comprende un resto de azúcar modificado con 2'-O- metoxietilo.
“Sitio diana en 3'" se refiere al nucleótido de un ácido nucleico diana que es complementario al nucleótido más en 3' de un compuesto antisentido concreto.
“Sitio diana en 5'" se refiere al nucleótido de un ácido nucleico diana que es complementario al nucleótido más en 5' de un compuesto antisentido concreto.
"5-metilcitosina" significa una citosina modificada con un grupo metilo unido a la posición 5'. Una 5-metilcitosina es una base nucleotídica modificada.
"Aproximadamente" significa dentro de ± 10 % de un valor. Por ejemplo, si se indica, "un marcador puede aumentarse en aproximadamente un 50 %", se da a entender que el marcador puede aumentarse entre un 45 % -55 %.
"Agente farmacéutico activo" significa la sustancia o sustancias en una composición farmacéutica que proporcionan un beneficio terapéutico cuando se administran a un individuo. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, un oligonucleótido antisentido dirigido al GCGR es un agente farmacéutico activo.
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"Región diana activa" o "región diana" significan una región a la que se dirigen uno o más compuestos antisentido activos. "Compuestos antisentido activos" significa compuestos antisentido que reducen los niveles de ácido nucleico diana o los niveles de proteína.
Adiposidad" u "Obesidad" se refiere al estado de estar obeso o a una cantidad excesivamente alta de grasa corporal o tejido adiposo en relación con la masa corporal magra. La cantidad de grasa corporal incluye la preocupación por la distribución de grasa en todo el cuerpo y el tamaño y la masa de los depósitos de tejido adiposo. La distribución de la grasa corporal se puede estimar mediante medidas de los pliegues cutáneos, las relaciones de la circunferencia cintura-cadera o técnicas tales como obtención de imágenes por ultrasonidos, tomografía computarizada o resonancia magnética. De acuerdo con el Centro para el Control y Prevención de Enfermedades, las personas con un índice de masa corporal (IMC) de 30 o más se consideran obesos. El término "Obesidad", tal como se usa en el presente documento, incluye afecciones en las que existe un aumento en la grasa corporal más allá de los requisitos físicos como resultado de la acumulación excesiva de tejido adiposo en el cuerpo. El término "obesidad" incluye, aunque sin limitaciones, las siguientes afecciones: obesidad de inicio en el adulto; obesidad alimentaria; obesidad endógena o inflamatoria; obesidad endocrina; obesidad familiar; obesidad hiperinsulinar; obesidad hiperplásica-hipertrófica; obesidad hipogonadal; obesidad hipotiroidea; obesidad de por vida; obesidad mórbida y obesidad exógena.
"Administrado de forma concomitante" se refiere a la administración conjunta de dos agentes de cualquier manera en la que los efectos farmacológicos de ambos se manifiesten en el paciente al mismo tiempo. La administración concomitante no requiere que ambos agentes se administren en una única composición farmacéutica, en la misma forma de dosificación, o por la misma vía de administración. Los efectos de ambos agentes no necesitan manifestarse al mismo tiempo. Los efectos solo necesitan superponerse durante un período de tiempo y no necesitan ser coextensos,
“Administrar" significa proporcionar un agente a un animal e incluye, entre otros, la administración por un profesional médico y la autoadministración.
"Agente" significa una sustancia activa que puede proporcionar un beneficio terapéutico cuando se administra a un animal. "Primer agente" significa un compuesto terapéutico proporcionado en el presente documento. Por ejemplo, un primer agente puede ser un oligonucleótido antisentido dirigido a GCGR. "Segundo agente" significa un segundo compuesto terapéutico descrito en el presente documento (por ejemplo, un segundo oligonucleótido antisentido dirigido al GCGR) y/o un compuesto terapéutico no GCGR.
“Mejoría" se refiere a una disminución de al menos un indicador, signo o síntoma de una enfermedad, trastorno o afección asociada. La gravedad de los indicadores se puede determinar mediante medidas subjetivas u objetivas que son conocidas para los expertos en la técnica.
“Animal” se refiere a un animal humano o no humano, incluidos, entre otros, ratones, ratas, conejos, perros, gatos, cerdos y primates no humanos, incluidos, entre otros, monos y chimpancés.
Actividad antisentido" significa cualquier actividad detectable o mensurable atribuible a la hibridación de un compuesto antisentido con su ácido nucleico diana. En ciertas realizaciones, la actividad antisentido es una disminución en la cantidad o expresión de un ácido nucleico diana o proteína codificada por dicho ácido nucleico diana.
"Compuesto antisentido" significa un compuesto oligomérico que es capaz de sufrir hibridación con un ácido nucleico diana a través de enlaces de hidrógeno.
"Inhibición antisentido" significa reducción de niveles de ácido nucleico diana o niveles de proteína diana en presencia de un compuesto antisentido complementario de un ácido nucleico diana en comparación con niveles de ácido nucleico diana o niveles de proteína diana en ausencia del compuesto antisentido.
"Oligonucleótido antisentido" significa un oligonucleótido monocatenario que tiene una secuencia de bases nucleotídicas que permite la hibridación a una región o segmento correspondiente de un ácido nucleico diana. "Azúcar bicíclico" significa un anillo de furosilo modificado por el puente de dos átomos en el anillo no geminal. Un azúcar bicíclico es un azúcar modificado.
"Ácido nucleico bicíclico" o "BNA" se refiere a un nucleósido o nucleótido en el que la porción de furanosa del nucleósido o nucleótido incluye un puente que conecta dos átomos de carbono en el anillo de furanosa, formando así un sistema de anillo bicíclico.
"Estructura de caperuza" o "resto de caperuza terminal" significa modificaciones químicas, que se han incorporado en cualquiera de los extremos de un compuesto antisentido.
"Región químicamente distinta" se refiere a una región de un compuesto antisentido que de alguna manera es químicamente diferente de otra región del mismo compuesto antisentido. Por ejemplo, una región que tiene 2'-O- metoxietil nucleótidos es químicamente distinta de una región que tiene nucleótidos sin modificaciones de 2'-O- metoxietilo.
"Compuesto antisentido quimérico" significa un compuesto antisentido que tiene al menos dos regiones químicamente distintas.
"Coadministración" significa la administración de dos o más agentes a un individuo. Los dos o más agentes pueden estar en una única composición farmacéutica o pueden estar en composiciones farmacéuticas distintas. Cada uno de los dos o más agentes se puede administrar a través de las mismas vías de administración u otras diferentes. La coadministración abarca la administración en paralelo o secuencial.
El "colesterol" es una molécula de esterol que se encuentra en las membranas celulares de todos los tejidos animales. El colesterol debe ser transportado en el plasma sanguíneo de un animal por las lipoproteínas, incluidas lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL), lipoproteínas de densidad intermedia (IDL), lipoproteínas de baja densidad (LDL) y lipoproteínas de alta densidad (HDL). El "colesterol plasmático" se refiere a la suma del
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colesterol esterificado y/o no esterificado en las lipoproteínas (VDL, IDL, LDL, HDL) presente sen el plasma o suero.
"Complementariedad" significa la capacidad de apareamiento entre bases nucleotídicas de un primer ácido nucleico y un segundo ácido nucleico.
"Bases nucleotídicas contiguas" significa bases nucleotídicas inmediatamente adyacentes entre sí. “Desoxirribonucleótido” quiere decir un nucleótido que tiene un hidrógeno en la posición 2' de la porción azúcar del nucleótido. Los desoxirribonucleótidos pueden estar modificados con cualquiera de diversos sustituyentes. "Diabetes mellitus" o "diabetes" es un síndrome caracterizado por un metabolismo desordenado y niveles anormalmente altos de azúcar en la sangre (hiperglucemia) como resultado de niveles insuficientes de insulina o sensibilidad reducida a la insulina. Los síntomas característicos son producción excesiva de orina (poliuria) debido a niveles altos de glucosa en sangre, sed excesiva y aumento de la ingesta de líquidos (polidipsia) que intentan compensar el aumento de la micción, visión borrosa debido a los altos niveles de glucosa en la papila ocular, pérdida de peso inexplicable y letargo.
"Dislipidemia diabética" o "diabetes de tipo 2 con dislipidemia" significa una afección caracterizada por diabetes de tipo 2, niveles reducidos de HDL-C, niveles elevados de triglicéridos elevados y niveles elevados de las pequeñas LDL densas.
“Diluyente" significa un ingrediente en una composición que carece de actividad farmacológica, pero es farmacéuticamente necesario o deseable. Por ejemplo, el diluyente en una composición inyectada puede ser un líquido, por ejemplo, solución salina.
"Dislipidemia" se refiere a un trastorno del metabolismo de los lípidos y/o las lipoproteínas, incluyendo la sobreproducción o deficiencia de lípidos y/o lipoproteínas. Las dislipidemias pueden manifestarse por elevación de lípidos, tales como colesterol y triglicéridos, así como lipoproteínas, tales como colesterol de lipoproteínas de baja densidad (LDL).
“Dosis" significa una cantidad especificada de un agente farmacéutico proporcionada en una sola administración, o en un período de tiempo específico. En ciertas realizaciones, una dosis se puede administrar en uno, dos o más bolos, comprimidos o inyecciones. Por ejemplo, en ciertas realizaciones en las que se desea la administración subcutánea, la dosis deseada requiere un volumen no acomodado fácilmente por una única inyección, por lo tanto, se pueden usar dos o más inyecciones para alcanzar la dosis deseada. En ciertas realizaciones, el agente farmacéutico se administra por infusión durante un período prolongado de tiempo o continuamente. Las dosis se pueden indicar como la cantidad de agente farmacéutico por hora, día, semana o mes.
"Cantidad eficaz" o “cantidad terapéuticamente eficaz” significan la cantidad de agente farmacéutico activo suficiente para efectuar un resultado fisiológico deseado en un individuo que necesita el agente. La cantidad efectiva puede variar entre individuos dependiendo de la salud y la condición física del individuo a tratar, el grupo taxonómico de los individuos a tratar, la formulación de la composición, la evaluación de la afección médica del individuo y otros factores relevantes.
"Completamente complementario" o "10 0% complementario" significa que cada base nucleotídica de una secuencia de bases nucleotídicas de un primer ácido nucleico tiene una base nucleotídica complementaria en una segunda secuencia de bases nucleotídicas de un segundo ácido nucleico. En ciertas realizaciones, un primer ácido nucleico es un compuesto antisentido y un ácido nucleico diana es un segundo ácido nucleico. "Gapmero" significa un compuesto antisentido quimérico en el que una región interna que tiene una pluralidad de nucleósidos que soportan la escisión de ARNasa H está situada entre regiones externas que tienen uno o más nucleósidos, en el que los nucleósidos que comprenden la región interna son químicamente distintos del nucleósido o nucleósidos que comprenden las regiones externas. La región interna se puede denominar "segmento separador" y las regiones externas se pueden denominar "segmentos del ala”.
"Receptor del glucagón" o "GCGR" significa cualquier ácido nucleico o proteína del GCGR. "Expresión del GCGR" significa el nivel de ARNm transcrito del gen que codifica el GCGR o el nivel de proteína traducida del ARNm. La expresión del GCGR puede determinarse por procedimientos conocidos en la técnica, tales como una transferencia Northern o Western.
“Ácido nucleico del GCGR” significa cualquier ácido nucleico que codifica el GCGR. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, un ácido nucleico de GCGR incluye, una secuencia de ADN que codifica el GCGr, una secuencia de ARN transcrita a partir de ADN que codifica el GCGR (incluyendo ADN genómico que comprende intrones y exones) y una secuencia de ARNm que codifica GCGR. “ARNm de GCDR” significa un ARNm que codifica una proteína de GCGR.
"Glucosa" es un monosacárido utilizado por las células como fuente de energía e intermediario inflamatorio. "Glucosa plasmática" se refiere a la glucosa presente en el plasma.
"Hibridación" significa la reunión de moléculas de ácido nucleico complementarias. En ciertas realizaciones, las moléculas de ácido nucleico complementarias incluyen un compuesto antisentido y un ácido nucleico diana. Hiperlipidemia" o "hiperlipemia" es una afección caracterizada por niveles elevados de lípidos séricos o lípidos circulantes (en plasma). Esta afección se manifiesta por una concentración anormalmente alta de grasas. Las fracciones de lípidos en la sangre circulante son colesterol, lipoproteínas de baja densidad, lipoproteínas de muy baja densidad y triglicéridos.
"Hipertrigliceridemia" significa una afección caracterizada por niveles elevados de triglicéridos.
"Identificar" o "seleccionar un animal con una afección metabólica" significa identificar o seleccionar a un sujeto al que se ha diagnosticado una enfermedad metabólica o un trastorno metabólico; o, identificar o seleccionar un sujeto que tenga cualquier síntoma de una enfermedad metabólica, incluyendo, pero sin limitaciones, síndrome
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metabólico, hiperglucemia, hipertrigliceridemia, hipertensión, resistencia aumentada a la insulina, sensibilidad a la insulina disminuida, peso corporal y/o grasa corporal por encima de lo normal o cualquier combinación de los mismos. Dicha identificación puede lograrse mediante cualquier procedimiento, incluyendo, pero sin limitaciones, pruebas o evaluaciones clínicas estándar, tales como la medición de la glucosa en sangre (en plasma) o en suero, la medición de triglicéridos en suero o circulantes (plasma), la medición de la presión arterial, la medición de la grasa corporal, la medición del peso corporal y similares.
"Inmediatamente adyacente" significa que no hay elementos intermedios entre los elementos inmediatamente adyacentes.
"Individuo" o “sujeto” o “animal” significa un animal humano o no humano seleccionado para tratamiento o terapia.
"Inhibir la expresión o actividad" se refiere a una reducción o bloqueo de la expresión o actividad de un ARN o proteína y no necesariamente indica una eliminación total de la expresión o actividad.
La "resistencia a la insulina" se define como la afección en la cual las cantidades normales de insulina son inadecuadas para producir una respuesta normal a la insulina de las células grasas, musculares y hepáticas. La resistencia a la insulina en las células grasas da como resultado la hidrólisis de los triglicéridos almacenados, que eleva los ácidos grasos libres en el plasma sanguíneo. La resistencia a la insulina en el músculo reduce la captación de glucosa, mientras que la resistencia a la insulina en el hígado reduce el almacenamiento de glucosa y ambos efectos sirven para elevar la glucosa en sangre. Los altos niveles plasmáticos de insulina y glucosa debido a la resistencia a la insulina a menudo conducen al síndrome metabólico y a diabetes de tipo 2.
La "sensibilidad a la insulina" es una medida de la eficacia con que un individuo procesa la glucosa. Un individuo con alta sensibilidad a la insulina procesa la glucosa de forma eficaz, mientras que un individuo con baja sensibilidad a la insulina no procesa la glucosa de manera eficaz.
Enlace internucleosídico" se refiere al enlace químico entre nucleósidos.
“Administración intravenosa” significa administración en una vena.
"Nucleósidos unidos" significa nucleósidos adyacentes que están unidos entre sí.
"Terapia hipolipemiante" o "agente reductor de lípidos" significa un régimen terapéutico proporcionado a un sujeto para reducir uno o más lípidos en un sujeto. En ciertas realizaciones, se proporciona una terapia hipolipemiante para reducir uno o más de ApoB, colesterol total, LDL-C, VLDL-C, IDL-C, no-HDL-C, triglicéridos, partículas de LDL pequeñas densas y Lp (a) en un sujeto. Los ejemplos de terapia hipolipemiante incluyen estatinas, fibratos e inhibidores de MTP.
“Factores principales de riesgo” se refiere a factores que contribuyen a un alto riesgo de una enfermedad o afección concreta. En ciertas realizaciones, los factores principales de riesgo de cardiopatía coronaria incluyen, entre otros, tabaquismo, hipertensión, niveles bajos de HDL-C, antecedentes familiares de cardiopatía coronaria, la edad y otros factores desvelados en el presente documento.
“Enfermedad metabólica” o “trastorno metabólico” se refiere a una afección caracterizada por una alteración o interrupción de la función metabólica. “Metabólica/o” y “metabolismo” son términos bien conocidos en la técnica y generalmente incluyen toda la gama de procesos bioquímicos que se producen dentro de un organismo vivo. Enfermedades o trastornos metabólicos incluyen, entre otros, obesidad, diabetes, hiperglucemia, prediabetes, enfermedad del hígado graso no alcohólico (NAFLD), síndrome metabólico, resistencia a la insulina, dislipidemia diabética o hipertrigliceridemia o una combinación de los mismos.
“Síndrome metabólico” significa una afección caracterizada por una combinación de factores de riesgo cardiovascular lipídicos y no lipídicos de origen metabólico. En ciertas realizaciones, el síndrome metabólico se identifica por la presencia de cualquiera de los 3 factores siguientes: circunferencia de la cintura mayor de 102 cm en varones o mayor de 88 cm en mujeres; triglicéridos séricos de al menos 150 mg/dl; HDL-C menor de 40 mg/dl en varones o menos de 50 mg/dl en mujeres; presión arterial de al menos 130/85 mmHg; y glucosa en ayunas de al menos 110 mg/dl. Estos determinantes se pueden medir fácilmente en la práctica clínica (JAMA, 2001, 285: 2486-2497).
"Apareamiento erróneo" o "base nucleotídica no complementaria" se refiere al caso en el que una base nucleotídica de un primer ácido nucleico no es capaz de aparearse con la base nucleotídica correspondiente de un segundo ácido nucleico diana.
“Dislipidemia mixta" significa una afección caracterizada por niveles elevados de colesterol y niveles elevados de triglicéridos.
“Enlace internucleosídico modificado" se refiere a una sustitución o cualquier cambio de un enlace internucleosídico de origen natural (es decir, un enlace internucleosídico fosfodiéster).
"Base nucleotídica modificada" se refiere a cualquier base nucleotídica que no sea adenina, citosina, guanina, timidina o uracilo. Una "base nucleotídica no modificada" significa las bases de purina adenina (A) y guanina (G), y las bases pirimidínicas timina (T), citosina (C) y uracilo (U).
Un "nucleósido modificado" significa un nucleósido que tiene, independientemente, un resto de azúcar modificado o una base nucleotídica modificada.
"Nucleótido modificado" significa un nucleótido que tiene, independientemente, un resto de azúcar modificado, un enlace internucleosídico modificado o una base nucleotídica modificada. Un "nucleósido modificado" significa un nucleótido que tiene, independientemente, un resto de azúcar modificado o una base nucleotídica modificada. "Oligonucleótido modificado" significa un oligonucleótido que comprende al menos un nucleótido modificado. "Azúcar modificado" se refiere a una sustitución o cambio de un azúcar natural.
"Motivo" significa el patrón de regiones químicamente distintas en un compuesto antisentido.
"Enlace internucleosídico que se produce de forma natural" significa un enlace fosfodiéster de 3'a 5'.
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"Resto de azúcar natural" significa un azúcar que se encuentra en el ADN (2'-H) o ARN (2'-OH).
“Enfermedad del hígado graso no alcohólico (“NAFLD”) se refiere a una afección caracterizada por la inflamación grasa del hígado que no se debe a un abuso del consumo de alcohol (por ejemplo, consumo de alcohol de más de 20 g/día). En ciertas realizaciones, la NAFLD está relacionada con la resistencia a la insulina y el síndrome metabólico. La NAFLD abarca un espectro de enfermedades que van desde la simple acumulación de triglicéridos en los hepatocitos (esteatosis hepática) hasta la esteatosis hepática con inflamación (esteatohepatitis), fibrosis y cirrosis.
“Esteatohepatitis no alcohólica” (NASH)” se produce a partir de la progresión de NAFLD más allá del depósito de triglicéridos. Para el desarrollo de NASH se requiere un "segundo desencadenante" capaz de inducir necrosis, inflamación y fibrosis. Los candidatos para el segundo desencadenante se pueden agrupar en amplias categorías: factores que causan un aumento en el estrés oxidativo y factores que promueven la expresión de citocinas proinflamatorias.
"Ácido nucleico" se refiere a moléculas compuestas de nucleótidos monoméricos. Un ácido nucleico incluye ácidos ribonucleicos (ARN), ácidos desoxirribonucleicos (ADN), ácidos nucleicos monocatenarios, ácidos nucleicos bicatenarios, ácidos ribonucleicos pequeños de interferencia (ARNip) y microARN (miARN). Un ácido nucleico también puede comprender una combinación de estos elementos en una sola molécula.
"Base nucleotídica" significa un resto heterocíclico capaz de aparearse con una base de otro ácido nucleico. "Secuencia de bases nucleotídicas" significa el orden de las bases nucleotídicas contiguas independientemente de cualquier modificación de azúcares, enlaces o bases nucleotídicas.
"Nucleósido" significa una base nucleotídica unida a un azúcar.
“Nucleótido" significa un nucleósido que tiene un grupo fosfato unido covalentemente a la porción de azúcar del nucleósido.
Mimético de nucleótido incluye aquellas estructuras usadas para reemplazar el nucleósido y el enlace en una o más posiciones de un compuesto oligomérico tal como, por ejemplo, ácidos nucleicos peptídicos o morfolinos (morfolinos unidos por -N (H) -C (= O) -O- u otro enlace no fosfodiéster).
“Compuesto oligomérico” u “oligómero” se refiere a una estructura polimérica que comprende dos o más subestructuras y que es capaz de hibridar con una región de una molécula de ácido nucleico. En ciertas realizaciones, los compuestos oligoméricos son oligonucleósidos. En ciertas realizaciones, los compuestos oligoméricos son oligonucleótidos. En ciertas realizaciones, los compuestos oligoméricos son compuestos antisentido. En ciertas realizaciones, los compuestos oligoméricos son oligonucleótidos antisentido. En ciertas realizaciones, los compuestos oligoméricos son oligonucleótidos quiméricos.
"Oligonucleótido" significa un polímero de nucleósidos unidos cada uno de los cuales puede ser modificado o no modificado, uno independiente del otro.
"Administración parenteral" significa la administración a través de inyección o infusión. La administración parenteral incluye administración subcutánea, administración intravenosa, administración intramuscular, administración intraarterial, administración intraperitoneal o administración intracraneal, por ejemplo, administración intratecal o intracerebroventricular. La administración puede ser continua, crónica, corta o intermitente.
"Péptido" significa una molécula formada uniendo al menos dos aminoácidos por enlaces amida. Péptido se refiere a polipéptidos y proteínas.
"Agente farmacéutico" significa una sustancia que proporciona un beneficio terapéutico cuando se administra a un individuo. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, un oligonucleótido antisentido dirigido al GCGR es un agente farmacéutico.
"Composición farmacéutica" significa una mezcla de sustancias adecuadas para administrar a un individuo. Por ejemplo, una composición farmacéutica puede comprender agentes farmacéuticos y una solución acuosa estéril. “Vehículo farmacéuticamente aceptable" significa un medio o diluyente que no interfiere con la estructura del oligonucleótido. Ciertos de dichos vehículos permiten formular las composiciones farmacéuticas en forma de, por ejemplo, comprimidos, píldoras, grageas, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, suspensiones espesas, suspensiones y pastillas para ingestión por un sujeto. Por ejemplo, un vehículo farmacéuticamente aceptable puede ser una solución acuosa estéril.
"Derivado farmacéuticamente aceptable" abarca sales, conjugados, profármacos o isómeros farmacéuticamente aceptables de los compuestos descritos en el presente documento.
"Sales farmacéuticamente aceptables" significa sales fisiológica y farmacéuticamente aceptables de compuestos antisentido, es decir, sales que retienen la actividad biológica deseada del oligonucleótido precursor y no imparten efectos toxicológicos indeseados a los mismos.
"Enlace de fosforotioato" significa un enlace entre nucleósidos en el enlace fosfodiéster se modifica reemplazando uno de los átomos de oxígeno que no forman un puente por un átomo de azufre. Un enlace fosforotioato es un enlace internucleosídico modificado.
"Porción" significa un número definido de bases nucleotídicas contiguas (es decir, unidas) de un ácido nucleico. En ciertas realizaciones, una porción es un número definido de bases nucleotídicas contiguas de un ácido nucleico diana. En ciertas realizaciones, una porción es un número definido de bases nucleotídicas contiguas de un compuesto antisentido.
"Prevenir" se refiere a retrasar o prevenir el inicio o desarrollo de una enfermedad, trastorno o afección durante un período de tiempo de minutos a indefinidamente. Prevenir también significa reducir el riesgo de desarrollar una enfermedad, trastorno o afección.
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“Profármaco” significa un agente terapéutico que se preparar en forma inactiva que se convierte en una forma activa dentro del cuerpo o las células del mismo por acción de enzimas endógenas u otros productos químicos y/o condiciones.
""Efectos secundarios" significa respuestas fisiológicas atribuibles a un tratamiento diferente a los efectos deseados. En ciertas realizaciones, los efectos secundarios incluyen reacciones en el sitio de la inyección, anomalías en las pruebas de función hepática, anomalías en la función renal, toxicidad hepática, toxicidad renal, anomalías en el sistema nervioso centra, miopatías y malestar general. Por ejemplo, incrementos en los niveles de aminotransferasas en suero pueden indicar toxicidad hepática o anomalías en la función hepática. Por ejemplo, incrementos en los niveles de bilirrubina pueden indicar toxicidad hepática o anomalías en la función hepática.
"Oligonucleótido monocatenario" significa un oligonucleótido que no está hibridado con una cadena complementaria.
"Específicamente hibridable" se refiere a un compuesto antisentido que tiene un grado suficiente de complementariedad entre un oligonucleótido antisentido y un ácido nucleico diana para inducir un efecto deseado, mientras que exhibe efectos mínimos o nulos sobre ácidos nucleicos no diana en condiciones en las que se desea unión específica, es decir, en condiciones fisiológicas en el caso de ensayos in vivo y tratamientos terapéuticos.
"Estatina" significa un agente que inhibe la actividad de la HMG-CoA reductasa.
"Administración subcutánea" significa administración justo debajo de la piel.
"De dirección" o "dirigido" significa el proceso de diseño y selección de un compuesto antisentido que se hibridará específicamente con un ácido nucleico diana e inducirá un efecto deseado.
"Ácido nucleico diana", "ARN diana" y "transcrito de ARN diana" se refieren todos a un ácido nucleico capaz de ser el objetivo de los compuestos antisentido.
"Segmento diana" significa la secuencia de nucleótidos de un ácido nucleico diana al que se dirige un compuesto antisentido. El "sitio diana en 5'" se refiere al nucleótido más en 5' de un segmento diana. El "sitio diana en 3'" se refiere al nucleótido más en 3' de un segmento diana.
"Cantidad terapéuticamente eficaz" significa una cantidad de un agente que proporciona un beneficio terapéutico a un individuo.
"Cambio terapéutico del estilo de vida" significa cambios en la dieta y el estilo de vida destinados a reducir la masa de grasa/tejido adiposo y/o el colesterol. Tal cambio puede reducir el riesgo de desarrollar enfermedades cardíacas y puede incluir recomendaciones para la ingesta en la dieta de calorías diarias totales, grasa total, grasas saturadas, grasas poliinsaturadas, grasas monoinsaturadas, carbohidratos, proteínas, colesterol, fibra insoluble, así como recomendaciones para la salud física.
"Triglicérido" o "TG" significa un lípido o grasa neutra que consiste en glicerol combinado con tres moléculas de ácido graso.
"Diabetes de tipo 2" (también conocida como "diabetes mellitus de tipo 2" o "diabetes mellitus, tipo 2", anteriormente llamada "diabetes mellitus de tipo 2", "diabetes no insulinodependiente (DMNID)", "diabetes relacionada con la obesidad" o "diabetes de inicio en el adulto ") es un trastorno metabólico que se caracteriza principalmente por resistencia a la insulina, deficiencia relativa de insulina e hiperglucemia.
"Tratar" se refiere a administrar una composición farmacéutica a un animal para efectuar una alteración o mejora de una enfermedad, trastorno o afección.
"Nucleótido no modificado" significa un nucleótido compuesto por bases nucleotídicas naturales, restos de azúcar y enlaces internucleosídicos. En ciertas realizaciones, un nucleótido no modificado es un nucleótido de ARN (es decir, p-D-ribonucleósidos) o un nucleótido de ADN (es decir,. p-D-desoxirribonucleósido).
Ciertas realizaciones
Ciertas realizaciones de la divulgación son compuestos y composiciones para inhibir la expresión de GCGR.
Ciertas realizaciones divulgan compuestos antisentido dirigidos a un ácido nucleico del GCGR. En ciertas realizaciones, el ácido nucleico del GCGR es cualquiera de las secuencias indicadas en el número de acceso en GENBANK NM_000160.3 (incorporado en el presente documento como SEQ ID NO: 1) o número de acceso en GENBANK: NW_926918.1 truncado desde los nucleótidos 16865000 a 16885000 (incorporado en el presente documento como SEQ ID NO: 2). En ciertas realizaciones, el GCGR tiene la secuencia del mono rhesus como se expone en la SEQ ID NO: 3.
En ciertas realizaciones, los compuestos o composiciones desvelados en el presente documento comprenden un oligonucleótido modificado que consiste en de 12 a 30 nucleósidos que tienen una secuencia de bases nucleotídicas complementarias a una porción de igual longitud de cualquiera de las SEQ ID NO: 1-3.
En ciertas realizaciones, los compuestos o composiciones desvelados en el presente documento consisten en de 12 a 30 nucleósidos unidos y tienen una secuencia de bases nucleotídicas que comprende al menos 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, o 20 bases nucleotídicas contiguas de cualquiera de las SEQ ID NO: 4-115.
En la invención, el compuesto o composición es o comprende ISIS NO: 449884.
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En ciertas realizaciones, los compuestos o composiciones proporcionados en el presente documento comprenden una sal del oligonucleótido modificado.
En ciertas realizaciones, los compuestos o composiciones proporcionados en el presente documento comprenden además un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.
En ciertas realizaciones de la divulgación, los siguientes compuestos antisentido están dirigidos a una región de la SEQ ID NO 2, un ácido nucleico que codifica el GCGR humano y que demuestran al menos un 90 % de inhibición de una secuencia del gen del GCGR: NO ISIS: 449823, 398457, 449883, 449884, 449885, 449894, 449895, 449906, 398486, 449917, 449938, 449945, 448806, 450061, 449951, 398504, 449952, 449953, 449954, 448817, 449955, 449958, 449960, 448819, 448848, 450074, 449859, 459157, 459010, 459087, 459086, 459083, 459082, 459158, 436140, 398503, 398507, 304535, 304538, 304539, 436141 y 436164.
En ciertas realizaciones de la divulgación, los siguientes compuestos antisentido están dirigidos a una región de la SEQ ID NO 2, un ácido nucleico que codifica el GCGR humano y que demuestran al menos un 90 % de inhibición de una secuencia del gen del GCGR: NO ISIS: 398457, 449883, 398486, 448806, 448817, 448819, 459010, 459087, 459086, 398507, 304535 y 304538.
En ciertas realizaciones de la divulgación, los siguientes compuestos antisentido están dirigidos a una región de la SEQ ID NO 2, a un ácido nucleico que codifica el GCGR humano y demuestran un valor de CI50 de menos de 0,2 |JM: NO ISIS: 304538, 398457, 398486, 398504, 398506, 398507, 448730, 448802, 448819, 448848, 448850, 448890, 449884, 459010, 459011, 459040, 459076, 459082, 459083, 459157 y 459158.
En ciertas realizaciones de la divulgación, los siguientes compuestos antisentido están dirigidos a una región de la SEQ ID NO 2, a un ácido nucleico que codifica el GCGR humano y demuestran un valor de CI50 de menos de 0,1 jM: NO ISIS: 398457, 398507, 448819,448848, 448850, 459010, 459011, 459083, 459157 y 459158.
En ciertas realizaciones de la divulgación, las secuencias de bases nucleotídicas enumeradas en las siguientes SEQ ID NO muestran al menos un 90 % de inhibición de un ácido nucleico del GCGR: 5, 9, 10, 11, 12, 14, 15, 19, 24, 26, 38, 42, 43, 44, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 55, 57, 58, 62, 67, 76, 85, 86, 91, 92, 93, 95, 96, 102, 107, 109, 111, 112, 113, 114 y 115.
En ciertas realizaciones de la divulgación, las secuencias de bases nucleotídicas enumeradas en las siguientes SEQ ID NO muestran al menos un 95 % de inhibición de un ácido nucleico del GCGR: 9, 10, 24, 43, 52, 58, 86, 91, 92, 109, 111 y 112.
En ciertas realizaciones de la divulgación, los compuestos proporcionados en el presente documento tienen un potencial terapéutico mayor que los NO, ISIS: 315163, 325568 y 310457 (desvelados en la patente de Estados Unidos n.° 7.399.853 y la solicitud de patente publicada de Estados Unidos n.° US2007-0087987). En ciertas realizaciones, los compuestos proporcionados en el presente documento tienen una mejor inhibición in vivo con respecto a los NO. ISIS: 315163, 325568 y 310457En ciertas realizaciones, los compuestos proporcionados en el presente documento tienen un perfil de tolerabilidad mejor que los NO. ISIS: 315163, 325568 y 310457.
En ciertas realizaciones, el compuesto proporcionado en el presente documento consiste en un oligonucleótido modificado monocatenario.
En ciertas realizaciones, al menos un enlace internucleosídico del oligonucleótido modificado es un enlace internucleosídico modificado. En ciertas realizaciones, cada enlace internucleosídico es un enlace internucleosídico fosforotioato.
En ciertas realizaciones, al menos un nucleósido de dicho oligonucleótido modificado comprende una base nucleotídica modificada. En ciertas realizaciones, la base nucleotídica modificada es una 5-metilcitosina.
En ciertas realizaciones, el oligonucleótido modificado comprende: a) un segmento separador que consiste en desoxinucleósidos unidos; b) un segmento de ala en 5' que consiste en nucleósidos unidos; y c) un segmento de ala en 3' que consiste en nucleósidos unidos. El segmento separador está situado entre el segmento de ala 5' y el segmento de ala 3' y cada nucleósido de cada segmento de ala comprende un azúcar modificado.
En ciertas realizaciones, el oligonucleótido modificado consiste en 17 nucleósidos unidos, en el que el segmento separador consiste en diez desoxinucleósidos unidos, el segmento de ala 5' consiste en tres nucleósidos unidos, el segmento de ala 3' consiste en cuatro nucleósidos unidos, cada nucleósido de cada segmento de ala comprende un azúcar modificado 2'-O-metoxietilo, cada enlace internucleosídico es un enlace fosforotioato y cada citosina es una 5-metilcitosina.
En ciertas realizaciones, los compuestos o composiciones desvelados en el presente documento comprenden un oligonucleótido modificado que consiste en 17 nucleósidos unidos que tienen una secuencia de bases nucleotídicas
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que comprende al menos 16 bases nucleotídicas contiguas de SEQ ID NO: 11, en la que el oligonucleótido modificado comprende: a) un segmento separador que consiste en diez desoxinucleósidos unidos; b) un segmento de ala en 5' que consiste en cuatro nucleósidos unidos; y c) un segmento de ala en 3' que consiste en cuatro nucleósidos unidos. El segmento separador está situado inmediatamente adyacente a y entre el segmento del ala 5' y el segmento del ala 3', en el que cada nucleósido de cada segmento de ala comprende un azúcar modificado 2'-O- metoxietilo, cada enlace internucleosídico es un enlace fosforotioato y cada resto de citosina es una 5-metilcitosina.
Ciertas realizaciones de la divulgación son compuestos y composiciones para inhibir la expresión de GCGR.
Ciertas realizaciones de la divulgación son procedimientos para reducir la expresión de GCGR en un animal que comprende administrar al animal un compuesto como se describe en el presente documento. En ciertas realizaciones, el compuesto comprende un oligonucleótido modificado de 17 nucleósidos unidos de longitud dirigido al GCGR.
Ciertas realizaciones de la divulgación son procedimientos para prevenir, mejorar o tratar una enfermedad metabólica en un animal que comprende administrar al animal un compuesto como se describe en el presente documento. En ciertas realizaciones, el compuesto comprende un oligonucleótido modificado de 17 nucleósidos unidos de longitud dirigido al GCGR. Ejemplos de enfermedades o trastornos metabólicos incluyen, entre otros, diabetes, hiperglucemia, prediabetes, obesidad, enfermedad del hígado graso no alcohólico (NAFLD), síndrome metabólico, resistencia a la insulina, dislipidemia diabética o hipertrigliceridemia o una combinación de los mismos.
Ciertas realizaciones de la divulgación son procedimientos para prevenir, mejorar o tratar la obesidad en un animal que comprende administrar al animal un compuesto como se describe en el presente documento. En ciertas realizaciones, el compuesto comprende un oligonucleótido modificado de 17 nucleósidos unidos de longitud dirigido al GCGR. En ciertas realizaciones, el compuesto o composición comprende el compuesto de ISIS NO: 449884.
Ciertas realizaciones de la divulgación son procedimientos para prevenir, mejorar o tratar la diabetes en un animal que comprende administrar al animal un compuesto como se describe en el presente documento. En ciertas realizaciones, el compuesto comprende un oligonucleótido modificado de 17 nucleósidos unidos de longitud dirigido al GCGR. En ciertas realizaciones, el compuesto o composición comprende el compuesto de ISIS NO: 449884.
Ciertas realizaciones de la divulgación son procedimientos para reducir el peso corporal en un animal que comprende administrar al animal un compuesto como se describe en el presente documento. En ciertas realizaciones, el compuesto comprende un oligonucleótido modificado de 12 a 30 nucleósidos unidos de longitud dirigido al GCGR. En ciertas realizaciones, el compuesto comprende un oligonucleótido modificado de 17 nucleósidos unidos de longitud dirigido al GCGR. En ciertas realizaciones, la reducción del peso corporal en un animal previene, mejora o trata una enfermedad metabólica. En ciertas realizaciones, la reducción del peso corporal en un animal previene, mejora o trata la diabetes. En ciertas realizaciones, la reducción del peso corporal en un animal previene, mejora o trata la obesidad. En ciertas realizaciones, la reducción del peso corporal en un animal previene, mejora o trata el síndrome metabólico. En ciertas realizaciones, la reducción del peso corporal en un animal previene, mejora o trata la resistencia a la insulina. En ciertas realizaciones, la reducción del peso corporal en un animal previene, mejora o trata la hiperglucemia. En ciertas realizaciones, la reducción del peso corporal en un animal previene, mejora o trata la NAFLD. En ciertas realizaciones, la reducción del peso corporal en un animal previene, mejora o trata la dislipidemia diabética. En ciertas realizaciones, los niveles de glucosa se reducen en al menos 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 100 %.
Ciertas realizaciones de la divulgación son procedimientos para reducir los niveles de glucosa en un animal que comprende administrar al animal un compuesto como se describe en el presente documento. En ciertas realizaciones, el compuesto comprende un oligonucleótido modificado de 17 nucleósidos unidos de longitud dirigido al GCGR. En ciertas realizaciones, la reducción de los niveles de glucosa en un animal previene, mejora o trata una enfermedad metabólica. En ciertas realizaciones, la reducción de los niveles de glucosa en un animal previene, mejora o trata la diabetes. En ciertas realizaciones, la reducción de los niveles de glucosa en un animal previene, mejora o trata la obesidad. En ciertas realizaciones, la reducción de los niveles de glucosa en un animal previene, mejora o trata el síndrome metabólico. En ciertas realizaciones, la reducción de los niveles de glucosa en un animal previene, mejora o trata la resistencia a la insulina. En ciertas realizaciones, la reducción de los niveles de glucosa en un animal previene, mejora o trata la hiperglucemia. En ciertas realizaciones, la reducción de los niveles de glucosa en un animal previene, mejora o trata la NAFLD. En ciertas realizaciones, la reducción de los niveles de glucosa en un animal previene, mejora o trata la dislipidemia diabética. En ciertas realizaciones, el nivel de glucosa se reducen en al menos 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 100 %.
En ciertas realizaciones, el GCGR tiene la secuencia humana, tal como se expone en cualquiera de los números de acceso en GENBANK: número de acceso en GENBANK NM_000160.3 (incorporado en el presente documento como SEQ ID NO: 1) o número de acceso en GENBANK: NW_926918.1 truncado desde los nucleótidos 16865000 a
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16885000 (incorporado en el presente documento como SEQ ID NO: 2). En ciertas realizaciones, el GCGR tiene la secuencia del mono rhesus como se expone en la SEQ ID NO: 3.
En ciertas realizaciones, los compuestos o composiciones proporcionados en el presente documento comprenden una sal de los mismos además un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable. En ciertas realizaciones, la composición comprende un oligonucleótido modificado que consiste en de 17 a 35 nucleósidos unidos y que tiene una secuencia de bases nucleotídicas que comprende al menos 17 bases nucleotídicas contiguas de una secuencia de bases nucleotídicas citadas en la SEQ ID NO: 11 o una sal de las mismas y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.
Ciertas realizaciones de la divulgación son procedimientos para tratar un animal con una enfermedad o afección relacionada con el GCGR, que comprenden: a) identificar dicho animal con una enfermedad o afección relacionada con el GCGR, y b) administrar a dicho animal una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que consiste en de 12 a 30 nucleósidos unidos y que tiene una secuencia de bases nucleotídicas al menos un 90% complementaria de cualquiera de las SEQ ID NOs: 1-3 as medido sobre la totalidad de dicho oligonucleótido modificado. En ciertas realizaciones, la cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto administrado al animal trata o reduce la enfermedad o afección relacionada con el GCGR, o un síntoma de la misma, en el animal. En ciertas realizaciones, la enfermedad o afección relacionada con el GCGR es obesidad. En ciertas realizaciones, la enfermedad o afección relacionada con el GCGR es diabetes.
Ciertas realizaciones de la divulgación son procedimientos para tratar un animal con una enfermedad o afección relacionada con el GCGR, que comprenden: a) identificar dicho animal con una enfermedad o afección relacionada con el GCGR, y b) administrar a dicho animal una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que consiste en de 17 nucleósidos unidos y que tiene una secuencia de bases nucleotídicas al menos un 100 % complementaria de cualquiera de las SEQ ID NOs: 1-3 as medido sobre la totalidad de dicho oligonucleótido modificado. En ciertas realizaciones, la cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto administrado al animal trata o reduce la enfermedad o afección relacionada con el GCGR, o un síntoma de la misma, en el animal. En ciertas realizaciones, la enfermedad o afección relacionada con el GCGR es obesidad. En ciertas realizaciones, la enfermedad o afección relacionada con el GCGR es diabetes.
Ciertas realizaciones de la divulgación son procedimientos para tratar, prevenir o mejorar una enfermedad metabólica. En ciertas realizaciones, la enfermedad metabólica es obesidad, diabetes, hiperglucemia, prediabetes, enfermedad del hígado graso no alcohólico (NAFLD), síndrome metabólico, resistencia a la insulina, dislipidemia diabética o hipertrigliceridemia o una combinación de los mismos.
Ciertas realizaciones de la divulgación son procedimientos que comprenden administrar a un animal un compuesto como se describe en el presente documento. En ciertas realizaciones, el procedimiento comprende administrar a un animal un oligonucleótido modificado que consiste en de 17 a 35 nucleósidos unidos y que tiene una secuencia de bases nucleotídicas seleccionada entre las secuencias de bases nucleotídicas citadas en la SEQ ID NO: 11.
En ciertas realizaciones, el animal es un ser humano.
En ciertas realizaciones, la administración previene, trata, mejora o ralentiza la progresión de una enfermedad metabólica como se describe en el presente documento.
En ciertas realizaciones, la administración previene, trata, mejora o ralentiza la progresión de la obesidad como se describe en el presente documento.
En ciertas realizaciones, la administración previene, trata, mejora o ralentiza la progresión de la diabetes como se describe en el presente documento.
En ciertas realizaciones, el compuesto se coadministra con un segundo agente.
En ciertas realizaciones, el compuesto y el segundo agente se administran de forma concomitante.
En determinadas realizaciones, la administración es administración parenteral.
Ciertas realizaciones de la divulgación son procedimientos para reducir la expresión de ARNm o proteína del GCGR en un animal que comprende administrar al animal un compuesto o composición como se describe en el presente documento para reducir la expresión de ARNm o proteína del GCGR en el animal. En ciertas realizaciones, el animal es un ser humano. En ciertas realizaciones, la reducción de la expresión de ARNm o proteína del GCGR previene, trata, mejora o ralentiza la progresión de la enfermedad metabólica. En ciertas realizaciones, la afección o enfermedad metabólica es diabetes. En ciertas realizaciones, la afección o enfermedad metabólica es obesidad.
Ciertas realizaciones de la divulgación son procedimientos para tratar a un ser humano con una enfermedad metabólica que comprenden identificar al ser humano con la enfermedad y administrar al ser humano una cantidad
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terapéuticamente eficaz de un compuesto o composición como se describe en el presente documento. En ciertas realizaciones, el tratamiento reduce un síntoma seleccionado del grupo que consiste en síndrome metabólico, hiperglucemia, hipertrigliceridemia, hipertensión, aumento de los niveles de glucosa, aumento de la resistencia a la insulina, disminución de la sensibilidad a la insulina, peso corporal por encima de lo normal y/o grasa corporal por encima de lo normal o cualquier combinación de los mismos.
Ciertas realizaciones de la divulgación son procedimientos para tratar a un ser humano con obesidad que comprenden identificar al ser humano con la enfermedad y administrar al ser humano una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto o composición como se describe en el presente documento. En ciertas realizaciones, el tratamiento reduce un síntoma seleccionado del grupo que consiste en síndrome metabólico, hiperglucemia,
hipertrigliceridemia, hipertensión, aumento de los niveles de glucosa, aumento de la resistencia a la insulina,
disminución de la sensibilidad a la insulina, peso corporal por encima de lo normal y/o grasa corporal por encima de lo normal o cualquier combinación de los mismos.
Ciertas realizaciones de la divulgación son procedimientos para tratar a un ser humano con diabetes que comprenden identificar al ser humano con la enfermedad y administrar al ser humano una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto o composición como se describe en el presente documento. En ciertas realizaciones, el tratamiento reduce un síntoma seleccionado del grupo que consiste en síndrome metabólico, hiperglucemia,
hipertrigliceridemia, hipertensión, aumento de los niveles de glucosa, aumento de la resistencia a la insulina,
disminución de la sensibilidad a la insulina, peso corporal por encima de lo normal y/o grasa corporal por encima de lo normal o cualquier combinación de los mismos.
Se divulga adicionalmente un procedimiento para reducir o prevenir la enfermedad metabólica que comprende administrar a un ser humano una cantidad terapéuticamente eficaz humana de un compuesto o composición tal como se describe en el presente documento, reduciendo o previniendo de este modo la enfermedad metabólica.
Se divulga adicionalmente un procedimiento para reducir o prevenir la obesidad que comprende administrar a un ser humano una cantidad terapéuticamente eficaz humana de un compuesto o composición tal como se describe en el presente documento, reduciendo o previniendo de este modo la diabetes.
Se divulga adicionalmente un procedimiento para reducir o prevenir la diabetes que comprende administrar a un ser humano una cantidad terapéuticamente eficaz humana de un compuesto o composición tal como se describe en el presente documento, reduciendo o previniendo de este modo la diabetes.
Se desvela adicionalmente un procedimiento para mejorar un síntoma de enfermedad metabólica, que comprende administrar a un ser humano que lo necesite un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que consiste en de 17 a 35 nucleósidos unidos, en el que dicho oligonucleótido modificado hibrida específicamente con la SEQ ID NO: 1, 2 o 3, mejorando de este modo un síntoma de enfermedad metabólica en el ser humano.
También se desvela un procedimiento para mejorar un síntoma de diabetes, que comprende administrar a un ser humano que lo necesite un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que consiste en de 17 a 35 nucleósidos unidos, en el que dicho oligonucleótido modificado hibrida específicamente con la SEQ ID NO: 1, 2 o 3, mejorando de este modo un síntoma de diabetes en el ser humano.
Se desvela adicionalmente un procedimiento para mejorar un síntoma de enfermedad metabólica, que comprende administrar a un ser humano que lo necesite un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que consiste en de 17 nucleósidos unidos, en el que dicho oligonucleótido modificado hibrida específicamente con la SEQ ID NO: 1,2 o 3, mejorando de este modo un síntoma de enfermedad metabólica en el ser humano.
Se desvela adicionalmente un procedimiento para mejorar un síntoma de diabetes, que comprende administrar a un ser humano que lo necesite un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que consiste en de 17 nucleósidos unidos, en el que dicho oligonucleótido modificado hibrida específicamente con la SEQ ID NO: 1, 2 o 3, mejorando de este modo un síntoma de diabetes en el ser humano.
Se desvela adicionalmente un procedimiento para reducir la velocidad de progresión de un síntoma asociado con enfermedad metabólica, que comprende administrar a un ser humano que lo necesite un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que consiste en de 17 nucleósidos unidos, en el que dicho oligonucleótido modificado hibrida específicamente con la SEQ ID NO: 1, 2 o 3, reduciendo de este modo la velocidad de progresión de un síntoma de enfermedad metabólica en el ser humano.
Se desvela adicionalmente un procedimiento para reducir la velocidad de progresión de un síntoma asociado con diabetes, que comprende administrar a un ser humano que lo necesite un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que consiste en de 17 nucleósidos unidos, en el que dicho oligonucleótido modificado hibrida específicamente con la SEQ ID NO: 1, 2 o 3, reduciendo de este modo la velocidad de progresión de un síntoma de diabetes en el ser humano.
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También se desvelan procedimientos y compuestos prevención o mejora de la enfermedad metabólica.
También se desvelan procedimientos y compuestos prevención o mejora de la obesidad.
También se desvelan procedimientos y compuestos prevención o mejora de la diabetes.
También se desvelan procedimientos y compuestos prevención o mejora del síndrome metabólico.
para la preparación de un medicamento para el tratamiento,
para la preparación de un medicamento para el tratamiento,
para la preparación de un medicamento para el tratamiento,
para la preparación de un medicamento para el tratamiento,
Ciertas realizaciones proporcionan el uso de un compuesto como se describe en el presente documento en la fabricación de un medicamento para tratar, mejorar o prevenir la enfermedad metabólica.
Ciertas realizaciones proporcionan el uso de un compuesto como se describe en el presente documento en la fabricación de un medicamento para tratar, mejorar o prevenir la obesidad.
Ciertas realizaciones proporcionan el uso de un compuesto como se describe en el presente documento en la fabricación de un medicamento para tratar, mejorar o prevenir la diabetes.
Ciertas realizaciones proporcionan el uso de un compuesto como se describe en el presente documento en la fabricación de un medicamento para tratar, mejorar o prevenir el síndrome metabólico.
Ciertas realizaciones proporcionan un compuesto como se describe en el presente documento para su uso en el tratamiento, prevención o mejora de la enfermedad metabólica como se describe en el presente documento mediante terapia de combinación con un agente o terapia adicional como se describe en el presente documento. Los agentes o terapias pueden coadministrarse o administrarse de forma concomitante.
Ciertas realizaciones proporcionan un compuesto como se describe en el presente documento para su uso en el tratamiento, prevención o mejora de la diabetes como se describe en el presente documento mediante terapia de combinación con un agente o terapia adicional como se describe en el presente documento. Los agentes o terapias pueden coadministrarse o administrarse de forma concomitante.
Ciertas realizaciones proporcionan el uso de un compuesto como se describe en el presente documento en la fabricación de un medicamento para el tratamiento, prevención o mejora de la enfermedad metabólica como se describe en el presente documento mediante terapia de combinación con un agente o terapia adicional como se describe en el presente documento. Los agentes o terapias pueden coadministrarse o administrarse de forma concomitante.
Ciertas realizaciones proporcionan el uso de un compuesto como se describe en el presente documento en la fabricación de un medicamento para el tratamiento, prevención o mejora de la obesidad como se describe en el presente documento mediante terapia de combinación con un agente o terapia adicional como se describe en el presente documento. Los agentes o terapias pueden coadministrarse o administrarse de forma concomitante.
Ciertas realizaciones proporcionan el uso de un compuesto como se describe en el presente documento en la fabricación de un medicamento para el tratamiento, prevención o mejora de la diabetes como se describe en el presente documento mediante terapia de combinación con un agente o terapia adicional como se describe en el presente documento. Los agentes o terapias pueden coadministrarse o administrarse de forma concomitante.
Ciertas realizaciones proporcionan el uso de un compuesto como se describe en el presente documento en la fabricación de un medicamento para el tratamiento, prevención o mejora de la diabetes como se describe en el presente documento mediante terapia de combinación con un agente o terapia adicional como se describe en el presente documento. Los agentes o terapias pueden coadministrarse o administrarse de forma concomitante.
Ciertas realizaciones proporcionan el uso de un compuesto como se describe en el presente documento en la fabricación de un medicamento para el tratamiento, prevención o mejora de la enfermedad metabólica como se describe en el presente documento en un paciente al que se administra después un agente o terapia adicional como se describe en el presente documento.
Ciertas realizaciones proporcionan el uso de un compuesto como se describe en el presente documento en la fabricación de un medicamento para el tratamiento, prevención o mejora de la obesidad como se describe en el presente documento en un paciente al que se administra después un agente o terapia adicional como se describe en el presente documento.
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Ciertas realizaciones proporcionan el uso de un compuesto como se describe en el presente documento en la fabricación de un medicamento para el tratamiento, prevención o mejora de la diabetes como se describe en el presente documento en un paciente al que se administra después un agente o terapia adicional como se describe en el presente documento.
Ciertas realizaciones proporcionan el uso de un compuesto como se describe en el presente documento en la fabricación de un medicamento para el tratamiento, prevención o mejora del síndrome metabólico como se describe en el presente documento en un paciente al que se administra después un agente o terapia adicional como se describe en el presente documento.
En el presente documento se divulga un kit para tratar, prevenir o mejorar la enfermedad metabólica como se describe en la presente, en donde el kit comprende:
(i) un compuesto como se describe en el presente documento; y, como alternativa,
(ii) un agente o terapia adicional como se describe en el presente documento.
En el presente documento se divulga un kit para tratar, prevenir o mejorar la diabetes como se describe en la presente, en donde el kit comprende:
(i) un compuesto como se describe en el presente documento; y, como alternativa,
(ii) un agente o terapia adicional como se describe en el presente documento.
Un kit como se describe en el presente documento puede incluir además instrucciones para usar el kit para tratar, prevenir o mejorar la enfermedad metabólica como se describe en el presente documento mediante terapia de combinación como se describe en el presente documento. En ciertas realizaciones, la enfermedad metabólica es la obesidad. En ciertas realizaciones, la enfermedad metabólica es diabetes.
Compuestos antisentido
Los compuestos oligoméricos incluyen, entre otros, oligonucleótidos, oligonucleósidos, análogos de oligonucleótidos, miméticos de oligonucleótidos, compuestos antisentido, oligonucleótidos antisentido y ARNip. Un compuesto oligomérico puede ser "antisentido" de un ácido nucleico diana, lo que significa que es capaz de sufrir hibridación con un ácido nucleico diana mediante enlaces de hidrógeno.
En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido tiene una secuencia de bases nucleotídicas que, cuando se escribe en la dirección 5' a 3', comprende el complementario inverso del segmento diana de un ácido nucleico diana al que está dirigido. En ciertas de estas realizaciones, un oligonucleótido antisentido tiene una secuencia de bases nucleotídicas que, cuando se escribe en la dirección 5' a 3', comprende el complementario inverso del segmento diana de un ácido nucleico diana al que está dirigido.
En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico de GCGR tiene una longitud de 10 a 30 nucleótidos. En otras palabras, tales compuestos antisentido tienen de 10 a 30 bases nucleotídicas unidas. En otras realizaciones, el compuesto antisentido comprende un oligonucleótido modificado que consiste en de 8 a 80, de 10 a 50, de 15 a 30, de 18 a 21, de 20 a 80, de 20 a 35, de 20 a 30, de 20 a 29, de 20 a 28, de 20 a 27, de 20 a 26, de 20 a 25, de 20 a 24, de 20 a 23, de 20 a 22, de 20 a 21 o 20 base nucleotídicas unidas. En ciertas de tales realizaciones, el compuesto antisentido comprende un oligonucleótido modificado que consiste en 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 u 80 bases nucleotídicas de longitud, o un intervalo definido por cualquiera de los dos valores anteriores.
Es posible aumentar o disminuir la longitud de un compuesto antisentido, tal como un oligonucleótido antisentido, y/o introducir bases apareadas erróneamente sin eliminar la actividad. Por ejemplo, en Woolf y col. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7305-7309, 1992), se analizó una serie de oligonucleótidos antisentido de 13-25 bases nucleotídicas de longitud su capacidad para inducir la escisión de un ARN diana en un modelo de inyección de oocitos. Los oligonucleótidos antisentido de 25 bases nucleotídicas de longitud con 8 u 11 apareamientos erróneos de bases cerca de los extremos de los oligonucleótidos antisentido fueron capaces de dirigir la escisión específica del ARNm diana, aunque en menor medida que los oligonucleótidos antisentido que no contenían apareamientos erróneos. De un modo similar, se consiguió una escisión específica de la diana usando oligonucleótidos antisentido de 13 bases nucleotídicas, incluidos aquéllos con 1 o 3 apareamientos erróneos.
Gautschi y col., (J. Natl. Cancer Inst. 93:463-471, March 2001) demostraron la capacidad de un oligonucleótido que tiene una complementariedad del 100 % con el ARNm de bcl-2 y que tiene 3 apareamientos erróneos con el ARNm de bcl-xL para reducir la expresión tanto de bcl-2 como de bcl-xL in vitro e in vivo. Además, este oligonucleótido demostró una potente actividad antitumoral in vivo.
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Maher y Dolnick (Nuc. Acid. Res. 16:3341-3358,1988) analizaron en una serie de oligonucleótidos antisentido de 14 bases nucleotídicas en tándem y oligonucleótidos antisentido de 28 y 42 bases nucleotídicas compuestos por la secuencia de dos o tres de los oligonucleótidos antisentido en tándem, respectivamente, su capacidad para detener la traducción de DHFR humano en un ensayo de reticulocitos de conejo. Cada uno de los tres oligonucleótidos antisentido de 14 bases nucleotídicas pudo inhibir la traducción, aunque a un nivel más modesto que los oligonucleótidos antisentido de 28 o 42 bases nucleotídicas.
Motivos de compuestos antisentido
En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido dirigidos a un ácido nucleico del GCGR tienen subunidades químicamente modificadas dispuestas en patrones, o motivos, para conferir a los compuestos antisentido propiedades tales como potenciación de la actividad inhibidora, afinidad de unión incrementada por un ácido nucleico diana o resistencia a la degradación por nucleasas in vivo.
Los compuestos antisentido quiméricos normalmente contienen al menos una región modificada de modo que confieren un incremento de la resistencia a la degradación por nucleasas, incremento de la captación celular y/o incremento de la afinidad de unión por el ácido nucleico diana y/o una actividad inhibidora incrementada. Una segunda región de un compuesto antisentido quimérico puede servir opcionalmente como sustrato para la endonucleasa ARNasa H celular, que escinde la cadena de aRn de un dúplex de ARN:ADN.
Los compuestos antisentido que tienen un motivo gapmero se consideran compuestos antisentido quiméricos. En un gapmero, una región interna que tiene una pluralidad de nucleótidos que soporta la escisión de ARNasaH se coloca entre regiones externas que tienen una pluralidad de nucleótidos que son químicamente distintos de los nucleósidos de la región interna. En el caso de un oligonucleótido antisentido que tiene un motivo gapmero, el segmento separador generalmente sirve como sustrato para la escisión con endonucleasa, mientras que los segmentos de ala comprenden nucleósidos modificados. En ciertas realizaciones, las regiones de un gapmero se diferencian por los tipos de restos de azúcar que comprenden cada región distinta. Los tipos de restos de azúcar que se usan para diferenciar las regiones de un gapmero pueden, en algunas realizaciones, incluir p-D-ribonucleósidos, p-D- desoxirribonucleósidos, nucleósidos modificados en 2' (tales nucleósidos modificados en 2' pueden incluir 2'-MOe y 2-O-CH3, entre otros), y los nucleósidos modificados con azúcar bicíclico (tales nucleósidos modificados con azúcar bicíclico pueden incluir los que tienen un etilo restringido). En ciertas realizaciones, las alas pueden incluir varios restos de azúcar modificados, incluyendo, por ejemplo, 2'-MOE y etilo restringido. En ciertas realizaciones, las alas pueden incluir varios restos de azúcar modificados y no modificados. En ciertas realizaciones, las alas pueden incluir diversas combinaciones de nucleósidos 2'-MOE, nucleósidos de etilo restringidos y 2'-desoxinucleósidos.
Cada región distinta puede comprender restos azúcar uniformes, variantes o restos de azúcar alternos. El motivo de ala-separador-ala se describe con frecuencia como "X-Y-Z", en el que "X" representa la longitud de la región del ala en 5', "Y" representa la longitud de la región separadora y "Z" representa la longitud de la región del ala en 3'. "X" y "Z" pueden comprender restos de azúcar uniformes, variantes o alternos. En ciertas realizaciones, "X" e "Y" pueden incluir uno o más 2'-desoxinucleósidos. "Y" puede comprender 2'-desoxinucleósidos. Como se usa en el presente documento, un gapmero descrito como "X-Y-Z" tiene una configuración tal que el hueco se coloca inmediatamente adyacente a cada uno del ala en 5' y el ala en 3'. Por lo tanto, no existen nucleótidos intermedios entre el ala en 5' y el hueco, o el hueco y el ala en 3'. Cualquiera de los compuestos antisentido descritos en el presente documento puede tener un motivo de gapmero. En ciertas realizaciones, "X" y "Z" son iguales, en otras realizaciones son diferentes. En ciertas realizaciones, "Y" está entre 8 y 15 nucleótidos. X, Y o Z pueden ser cualquiera de 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30 o más nucleósidos.
Ácidos nucleicos diana, regiones diana y secuencias de nucleótidos
En ciertas realizaciones, el ácido nucleico del GCGR es cualquiera de las secuencias indicadas en el número de acceso en GENBANK NM_000160.3 (incorporado en el presente documento como SEQ ID NO: 1), número de acceso en GENBANK NW_926918.1 truncado de los nucleótidos 16865000 a 16885000, (incorporado en el presente documento como SEQ ID NO: 2); y la secuencia del mono rhesus como se expone en la SEQ ID NO: 3.
Se entiende que la secuencia indicada en cada SEQ ID NO en los Ejemplos contenidos en el presente documento es independiente de cualquier modificación de un resto azúcar, un enlace internucleosídico o una base nucleotídica. Como tales, los compuestos antisentido definidos por una SEQ ID NO pueden comprender, de forma independiente, una o más modificaciones en un resto azúcar, un enlace internucleosídico o una base nucleotídica. Los compuestos antisentido descritos por el número Isis (n.° Isis) indican una combinación de secuencia de bases nucleotídicas y motivo.
En ciertas realizaciones, una región diana es una región estructuralmente definida del ácido nucleico diana. Por ejemplo, una región diana puede abarcar una 3' UTR, una 5' UTR, un exón, un intrón, una unión exón/intrón, una región codificadora, una región de inicio de la traducción, una región de terminación de la traducción u otra región de ácido nucleico definida. Las regiones estructuralmente definidas para el GCGR pueden obtenerse por número de acceso de bases de datos de secuencias, tales como NCBI. En ciertas realizaciones, una región diana puede
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abarcar la secuencia desde un sitio diana en 5' de un segmento diana dentro de la región diana hasta un sitio diana en 3' de otro segmento diana dentro de la misma región diana.
El direccionamiento incluye la determinación de al menos un segmento diana al que se hibrida un compuesto antisentido, de manera que se produce un efecto deseado. En ciertas realizaciones, el efecto deseado es una reducción de los niveles de ácido nucleico diana de ARNm. En ciertas realizaciones, el efecto deseado es la reducción de los niveles de proteína codificada por el ácido nucleico diana o un cambio fenotípico asociado con el ácido nucleico diana.
Una región diana puede contener uno o más segmentos diana. Múltiples segmentos diana dentro de una región diana pueden estar superpuestos. Como alternativa, pueden no superponerse. En ciertas realizaciones, los segmentos diana dentro de una región diana están separados en no más de aproximadamente 300 nucleótidos. En ciertas realizaciones, los segmentos diana dentro de una región diana están separados por un número de nucleótidos que es, es aproximadamente, no es más que, no es más que aproximadamente, 250, 200, 150, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20 o 10 nucleótidos en el ácido nucleico diana, o es un intervalo definido por dos cualesquiera de los valores precedentes. En ciertas realizaciones, los segmentos diana dentro de una región diana están separados por no más de, o no más de aproximadamente, 5 nucleótidos en el ácido nucleico diana. En ciertas realizaciones, los segmentos diana son contiguos. Se contemplan las regiones diana definidas por un intervalo que tiene un ácido nucleico de partida que es cualquiera de los sitios diana en 5'o los sitios diana en 3' enumerados en el presente documento.
Se pueden encontrar segmentos diana adecuados dentro de una UTR 5', una región de codificación, una 3' UTR, un intrón, un exón o una unión exón/intrón. Los segmentos diana que contienen un codón de iniciación o un codón de terminación también son segmentos diana adecuados. Un segmento diana adecuado puede excluir específicamente una cierta región definida estructuralmente, tal como el codón de iniciación o el codón de terminación.
La determinación de segmentos diana adecuados puede incluir una comparación de la secuencia de un ácido nucleico diana con otras secuencias en todo el genoma. Por ejemplo, el algoritmo BLAST puede usarse para identificar regiones de similitud entre diferentes ácidos nucleicos. Esta comparación puede evitar la selección de secuencias de compuestos antisentido que pueden hibridar de una manera no específica con secuencias distintas de un ácido nucleico diana seleccionado (es decir, secuencias no diana o fuera de la diana).
Puede haber variación en la actividad (por ejemplo, como se define por el porcentaje de reducción de los niveles de ácido nucleico diana) de los compuestos antisentido dentro de una región diana activa. En ciertas realizaciones, las reducciones en los niveles de ARNm del GCGR son indicativas de la inhibición de la expresión del GCGR. Las reducciones en los niveles de una proteína del GCGR también son indicativas de la inhibición de la expresión del ARNm diana. Además, los cambios fenotípicos son indicativos de la inhibición de la expresión del GCGR. En ciertas realizaciones, niveles de glucosa reducidos, niveles de lípidos reducidos y peso corporal reducido pueden ser indicativos de la inhibición de la expresión de GCGR. En ciertas realizaciones, la mejora de los síntomas asociados con la enfermedad metabólica puede ser indicativa de la inhibición de la expresión de GCGR. En ciertas realizaciones, la mejora de los síntomas asociados con la diabetes puede ser indicativa de la inhibición de la expresión de GCGR. En ciertas realizaciones, la reducción de la resistencia a la insulina es indicativa de la inhibición de la expresión de GCGR. En ciertas realizaciones, la reducción de biomarcadores de diabetes es indicativa de la inhibición de la expresión de GCGR.
Hibridación
En algunas realizaciones, la hibridación se produce entre un compuesto antisentido descrito en el presente documento y un ácido nucleico del GCGR. El mecanismo más común de hibridación implica enlaces de hidrógeno (por ejemplo, enlaces de Watson-Crick, Hoogsteen o enlaces de hidrógeno invertidos de Hoogsteen) entre bases nucleotídicas complementarias de las moléculas de ácido nucleico.
La hibridación se puede producir en diferentes condiciones. Las condiciones rigurosas dependen de la secuencia y están determinadas por la naturaleza y la composición de las moléculas de ácido nucleico a hibridar.
Los procedimientos para determinar si una secuencia es específicamente hibridable con un ácido nucleico diana son bien conocidos en la técnica. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido proporcionados en el presente documento son específicamente hibridables con un ácido nucleico del GCGR.
Complementariedad
Un compuesto antisentido y un ácido nucleico diana son complementarios entre sí cuando un número suficiente de bases nucleotídicas del compuesto antisentido puede unirse por hidrógeno con las bases nucleotídicas correspondientes del ácido nucleico diana, de modo que se producirá un efecto deseado (por ejemplo, inhibición antisentido de un ácido nucleico diana, tal como un ácido nucleico del GCGR).
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Un compuesto antisentido puede hibridarse sobre uno o más segmentos de un ácido nucleico del GCGR de manera que los segmentos intermedios o adyacentes no están implicados en el acontecimiento de hibridación (por ejemplo, una estructura de bucle, apareamiento erróneo o estructura en horquilla).
En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido descritos en el presente documento, o una porción específica de los mismos, son, o son al menos, 70 %, 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % complementarios de un ácido nucleico del GCGR, una región diana, segmento diana, o una porción especificada de los mismos. El porcentaje de complementariedad de un compuesto antisentido con un ácido nucleico diana puede determinarse usando procedimientos rutinarios.
El porcentaje de complementariedad de un compuesto antisentido con una región de un ácido nucleico diana se puede determinar rutinariamente usando programas BLAST (herramientas de búsqueda de alineación local básica) y programas PowerBLAST conocidos en la técnica (Altschul y col., J. Mol. Biol., 1990, 215, 403 410; Zhang y Madden, Genome Res., 1997, 7, 649 656). El porcentaje de homología, identidad de secuencia o complementariedad, puede determinarse mediante, por ejemplo, el programa Gap (Wisconsin Sequence Analysis Package, Versión 8 para Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, Madison Wis.), utilizando la configuración predeterminada, que utiliza la algoritmo de Smith y Waterman (Adv. Appl. Math., 1981, 2, 482 489).
En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido descritos en el presente documento, o partes específicas de los mismos, son completamente complementarios (es decir, 100 % complementarios) de un ácido nucleico diana, o una parte específica de los mismos.
La ubicación de una base nucleotídica no complementaria puede estar en el extremo 5'o en el extremo 3' del compuesto antisentido. Como alternativa, la base nucleotídica o bases nucleotídicas no complementarias puede estar en una posición interna del compuesto antisentido. Cuando dos o más bases nucleotídicas no complementarias están presentes, pueden ser contiguas (es decir, unidas) o no contiguas.
Los compuestos antisentido desvelados en el presente documento también incluyen aquellos que son complementarios a una porción de un ácido nucleico diana. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido son complementarios de al menos una porción de 8 bases nucleotídicas de un segmento diana. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido son complementarios de al menos una porción de 12 bases nucleotídicas de un segmento diana. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido son complementarios de al menos una porción de 13 bases nucleotídicas de un segmento diana. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido son complementarios de al menos una porción de 14 bases nucleotídicas de un segmento diana. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido son complementarios de al menos una porción de 15 bases nucleotídicas de un segmento diana. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido son complementarios de al menos una porción de 16 bases nucleotídicas de un segmento diana. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido son complementarios de al menos una porción de 17 bases nucleotídicas de un segmento diana. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido son complementarios de al menos una porción de 18 bases nucleotídicas de un segmento diana. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido son complementarios de al menos una porción de 19 bases nucleotídicas de un segmento diana. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido son complementarios de al menos una porción de 20 bases nucleotídicas de un segmento diana. También se contemplan compuestos antisentido que son complementarios a al menos 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, o más porciones de base nucleotídica de un segmento diana, o un intervalo definido por cualquiera de estos dos valores.
Identidad
Los compuestos antisentido desvelados en el presente documento también pueden tener un porcentaje de identidad definido para una secuencia de nucleótidos en particular, SEQ ID NO, o compuesto representado por un número Isis específico, o una porción del mismo. Como se usa en el presente documento, un compuesto antisentido es idéntico a la secuencia desvelada en el presente documento si tiene la misma capacidad de apareamiento de bases nucleotídicas. Por ejemplo, un ARN que contiene uracilo en lugar de timidina en una secuencia de ADN desvelada se consideraría idéntico a la secuencia de ADN, ya que tanto el uracilo como la timidina se aparean con adenina. Se contemplan versiones acortadas y alargadas de los compuestos antisentido descritos en el presente documento, así como también compuestos que tienen bases no idénticas en relación con los compuestos antisentido desvelados en el presente documento. Las bases no idénticas pueden estar adyacentes o dispersas por el oligonucleótido por todo el compuesto antisentido. El porcentaje de identidad de un compuesto antisentido se calcula de acuerdo con el número de bases que tienen idéntico apareamiento de bases con respecto a la secuencia con la que se está comparando.
En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido, o porciones de los mismos, son al menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98 %, 99 % o 100 % idénticos de uno o más de los compuestos antisentido o las SEQ ID NOs, o una porción de los mismos, desvelados en el presente documento.
Modificaciones
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Las modificaciones de los compuestos antisentido abarcan sustituciones o cambios en los enlaces internucleosídicos, restos de azúcar o bases nucleotídicas. Los compuestos antisentido modificados a menudo se prefieren sobre las formas nativas debido a propiedades deseables tales como, por ejemplo, captación celular potenciada, afinidad potenciada por el diana de ácido nucleico, estabilidad aumentada en presencia de nucleasas o actividad inhibidora incrementada.
Los nucleósidos modificados químicamente también pueden emplearse para aumentar la afinidad de unión de un oligonucleótido antisentido acortado o truncado por su ácido nucleico diana. En consecuencia, a menudo se pueden obtener resultados comparables con compuestos antisentido más cortos que tienen tales nucleósidos modificados químicamente.
Enlaces intemudeosídicos modificados
enlace internucleosídico de origen natural de ARN y ADN es un enlace fosfodiéster 3' a 5'. Los compuestos antisentido que tienen uno o más enlaces internucleosídicos modificados, es decir, no naturales se seleccionan a menudo sobre compuestos antisentido que tienen enlaces internucleosídicos naturales debido a las propiedades deseables tales como, por ejemplo, captación celular potenciada, afinidad potenciada por ácidos nucleicos diana y aumento de la afinidad estabilidad en presencia de nucleasas.
Los oligonucleótidos que tienen enlaces internucleosídicos modificados incluyen enlaces internucleosídicos que retienen un átomo de fósforo así como enlaces internucleosídicos que no tienen un átomo de fósforo. Enlaces internucleósidos representativos que contienen fósforo incluyen, entre otros, fosforodiésteres, fosforotriésteres, metilfosfonatos, fosforoamidato y fosforotioatos. Los procedimientos de preparación de enlaces que contienen fósforo y que no contienen fósforo son bien conocidos.
En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido dirigidos a un ácido nucleico del GCGR comprenden uno o más enlaces internucleosídicos modificados. En ciertas realizaciones, los enlaces internucleosídicos modificados son enlaces fosforotioato. En ciertas realizaciones, cada enlace internucleosídico de un compuesto antisentido es un enlace internucleosídico fosforotioato.
Restos de azúcar modificados
Los compuestos antisentido desvelados en el presente documento pueden contener, opcionalmente, uno o más nucleósidos en los que el grupo azúcar ha sido modificado. Dichos nucleósidos modificados con azúcar pueden impartir estabilidad de nucleasa potenciada, afinidad de unión aumentada o alguna otra propiedad biológica beneficiosa a los compuestos antisentido. En ciertas realizaciones, los nucleósidos comprenden restos de anillo de ribofuranosa modificados químicamente. Los ejemplos de anillos de ribofuranosa modificados químicamente incluyen sin limitación, la adición de grupos sustituyentes (incluyendo grupos sustituyentes 5' y 2', puente de átomos del anillo no geminales para formar ácidos nucleicos bicíclicos (BNA), reemplazo del átomo de oxígeno del anillo ribosilo con S, N (R) o C (R1) (R) 2 (R = H, alquilo C1-C12 o un grupo protector) y combinaciones de los mismos. Ejemplos de azúcares químicamente modificados incluyen nucleósido 2'-F-5'-metilo sustituido (véase la solicitud internacional de PCT WO 2008/101157, publicada el 21/08/08 para otros nucleósidos 5',2'-bis sustituidos desvelados), sustitución del átomo de oxígeno del anillo de ribosilo por S con sustitución adicional en la posición 2' (véase la solicitud de patente de Estados Unidos publicada US2005-0130923, publicada el 16 de junio de 2005) o, como alternativa, sustitución en 5' de un BNA (véase la solicitud de patente internacional PCT Wo 2007/134181, publicada el 22/11/07, en la que el LNA está sustituido con, por ejemplo, un grupo 5'-metilo o un grupo 5'-vinilo).
Los ejemplos de nucleósidos que tienen restos de azúcar modificados incluyen, sin limitación, nucleósidos que comprenden grupos sustituyentes 5'-vinilo, 5'-metilo (R o S), 4'-S, 2'-F, 2'-OCH3 y 2'-O(CH2)2OCH3 grupos sustituyentes. El sustituyente en la posición 2 'también se puede seleccionar de alilo, amino, azido, tio, O-alilo, Oalquilo C1-C10, -OCF3, O-(CH2)2-O-CH3, 2'-O(CH2)2SCH3, O-(CH2)2-O-N(Rm)(Rn), y O-CH2-C(=O)-N(Rm)(Rn), en las que cada Rm y Rn es, de forma independiente, H o alquilo C1-C10 sustituido o no sustituido.
Como se usa en el presente documento, "nucleósidos bicíclicos" se refiere a nucleósidos modificados que comprenden un resto de azúcar bicíclico. Los ejemplos de nucleósidos bicíclicos incluyen, sin limitación, nucleósidos que comprenden un puente entre los átomos del anillo ribosilo 4' y 2'. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido desvelados en el presente documento incluyen uno o más nucleósidos bicíclicos en los que el puente comprende un nucleósido bicíclico de 4' a 2'. Los ejemplos de dichos nucleósidos bicíclicos de 4 'a 2' incluyen, pero no están limitados a, una de las fórmulas: 4'-(CH2)-O-2' (LNA); 4'-(CH2)-S-2'; 4'-(CH2)2-O-2' (ENA); 4'-CH(CH3)- O-2' y 4'-CH(CH2OCH3)-O-2', y análogos del mismo (véase la patente de Estados Unidos 7.399,845, presentada el 15 de julio de 2008); 4'-C(CH3)(CH3)-O-2', y análogos del mismo (véase la solicitud internacional de PCT publicada WO2009/006478, publicada el 8 de enero de 2009); 4'-CH2-N(oCh3)-2', y análogos del mismo (véase la solicitud internacional de PCT publicada WO2008/150729, publicada el 11 de diciembre de 2008); 4'-CH2-O-N(CH3)-2' (véase la patente de Estados Unidos publicada US2004/0171570, publicada el 2 de septiembre de 2004); 4-CH2- N(R)-O-2', en la que R es H, alquilo C1-C12 o un grupo protector (véase la patente de Estados Unidos 7.427,672,
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presentada el 23 de septiembre de 2008); 4'-CH2-C(H)(CH3)-2' (véase, Chattopadhyaya, y col., J. Org. Chem., 2009, 74, 118-134); y 4'-CH2-C(=CH2)-2', y análogos del mismo (véase la solicitud internacional de PCT publicada WO 2008/154401, publicada el 8 de diciembre de 2008). Véase también, por ejemplo: Singh y col., Chem. Commun., 1998, 4, 455-456; Koshkin y col., Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630; Wahlestedt y col., Proc.Natl. Acad. Sci. U.S.A., 2000, 97, 5633-5638; Kumar y col., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1998, 8, 2219-2222; documento WO 94/14226; documento WO 2005/021570; Singh y col., J. Org. Chem., 1998, 63, 10035-10039; Srivastava y col., J. Am. Chem. Soc., 129(26) 8362-8379 (Jul. 4, 2007); Elayadi y col., Curr. Opinion Invens. Drugs, 2001, 2, 558-561; Braasch y col., Chem. Biol., 2001, 8, 1-7; Orum y col., Curr. Opinion Mol. Ther., 2001, 3, 239-243; las patentes de Estados Unidos U.S. 6.670.461, 7.053.207, 6.268,490, 6.770.748, 6.794.499, 7.034.133, 6.525.191, 7.399.845; las solicitudes internacionales de PCT publicadas WO 2004/106356, WO 94/14226, WO 2005/021570, y WO 2007/134181; la publicación de patente de Estados Unidos n.° US2004/0171570, US2007/0287831 y US2008/0039618; y las patentes de Estados Unidos con n.° de serie 12/129.154, 60/989.574, 61/026.995, 61/026.998, 61/056.564, 61/086.231, 61/097.787 y 61/099.844; y las solicitudes internacionales de PCT N.° PCT/US2008/064591, PCT/US2008/066154 y PCT/US2008/068922. Cada uno de los nucleósidos bicíclicos anteriores puede prepararse de modo que tengan una o más configuraciones estereoquímicas del azúcar, incluyendo, por ejemplo, a-L- ribofuranosa y p-D-ribofuranosa (véase la solicitud internacional PCT PCT/DK98/00393, publicada el 25 de marzo de 1999 como el documento WO 99/14226).
En ciertas realizaciones, los restos de azúcares bicíclicos de nucleósidos de BNA incluyen, pero no se limitan a, compuestos que tienen al menos un puente entre la posición 4' y la posición 2' del resto de azúcar de pentofuranosilo en el que tales puentes comprenden independientemente 1 o de 2 a 4 grupos unidos seleccionados independientemente de
-[C(Ra)(Rb)]n-, -C(Ra)=C(Rb)-, -C(Ra)=N-, -C(=NRa)-, -C(=O)-, -C(=S)-, -O-, -Si(Ra)2-, -S(=O)x-, and -N(Ra)-;
en la que:
x es 0, 1o 2;; n es 3, 1, 2 o 4;
cada Ra y Rb es, de forma independiente, H, un grupo protector, hidroxilo, alquilo C1-C12, alquilo C1-C12 sustituido, alquenilo C2-C12, alquenilo C2-C12 sustituido, alquinilo C2-C12, alquinilo C2-C12 sustituido, arilo C5-C20, arilo C5-C20 sustituido, radical heterociclo, radical heterociclo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, radical alicíclico C5- C7, radical alicíclico C5-C7 sustituido, halógeno, OJ1, NJ1J2, SJ1, N3, COOJ1, acilo (C(=O)-H), acilo sustituido, CN, sulfonilo (S(=O)2-J1 o sulfoxilo (S(=O)-J-i); y
y cada J1 y J2 es, de forma independiente, H, alquilo C1-C12, alquilo C1-C12 sustituido, alquenilo C2-C12, alquenilo C2-C12 sustituido, alquinilo C2-C12, alquinilo C2-C12 sustituido, arilo C5-C20, arilo C5-C20 sustituido, acilo (C(=O)-H), acilo sustituido, un radical heterociclo, un radical heterociclo sustituido, aminoalquilo C1-C12, aminoalquilo C1-C12 sustituido o un grupo protector.
En ciertas realizaciones, el puente de un resto de azúcar bicíclico es -[C(Ra)(Rb)]n-, -[C(Ra)(Rb)]n-O-, -C(RaRb)- N(R)-O- o -C(RaRb)-O-N(R)-. En ciertas realizaciones, el puente es 4'-Ch2-2', 4'-(CH2)2-2', 4'-(Ch2)3-2', 4-CH2- O-2', 4'-(CH2)2-O-2', 4'-CH2-O-N(R)-2' y 4'-CH2-N(R)-O-2'-, en el que cada R es, independientemente, H, un grupo protector o alquilo C1-C12.
En ciertas realizaciones, los nucleósidos bicíclicos se definen adicionalmente por la configuración isomérica. Por ejemplo, un nucleósido que comprende un puente 4'-2 'metileno-oxi, puede estar en la configuración a-L o en la configuración p-D. Anteriormente, los alfa-L-metilenoxi(4'-CH2-O-2') BNA se incorporaron en oligonucleótidos antisentido, que mostraron una actividad antisentido (Frieden y col., Nucleic Acids Research, 2003, 21,6365-6372).
En ciertas realizaciones, los nucleósidos bicíclicos incluyen, pero no se limitan a, (A) a-L-Metilenoxi (4'-CH)2-O-2 ') BNA, (B) p-D-Metilenoxi (4'-CH2-O-2 ') BNA, (C) Etilenoxi (4' - (CH2)2-O-2 ') BNA, (D) Aminooxi (4'-CH2-O-N (R) -2 ') BNA, (E) Oxiamino (4'-CH2-N (R) -O-2 ') BNA, (F) Metilo (metilenoxi) (4'-CH (CH3) -O-2 ') BNA, (G) metilen-tio (4'- CH2-S-2 ') BNA, (H) metilen-amino (4'-CH2-N (R) -2') BNA, (I) metilcarbociclico (4'-CH2-CH (CH3) -2 ') BNA, y (J) propileno carbocíclico (4' - (CH2)3-2 ') BNA como se representa a continuación.
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en el que Bx es el resto de base y R es, independientemente, H, un grupo protector o alquilo C1-C12. En ciertas realizaciones, el nucleósido bicíclico que tiene la Fórmula I:
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en la que:
Bx es un resto base heterocíclica;
-Qa-Qb-Qc- es -CH2-N(Rc)-CH2-, -C(=O)-N(Rc)-CH2-, -CH2-O-N(Rc)-, -CH2-N(Rc)-O- o -N(Rc)-O-CH2;
Rc es alquilo C1-C12 o un grupo protector de amino; y
Ta y Tb cada uno, independientemente, H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado, un grupo fósforo reactivo, un resto de fósforo o una unión covalente a un medio de soporte.
En ciertas realizaciones, el nucleósido bicíclico que tiene la Fórmula II:
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en la que:
Bx es un resto base heterocíclica;
Ta y Tb cada uno, independientemente, H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado, un grupo fósforo reactivo, un resto de fósforo o una unión covalente a un medio de soporte;
Za es alquilo C1-C6, alquenilo C2-C6, alquinilo C2-C6, alquilo C1-C6 sustituido, alquenilo C2-C6 sustituido, alquinilo C2-C6 sustituido, acilo, acilo sustituido o amida sustituida, tiol o tiol sustituido.
En una realización, cada uno de los grupos sustituidos está, de forma independiente, mono o polisustituido con grupos sustituyentes seleccionados de forma independiente de halógeno, oxo, hidroxilo, OJc, NJJd, SJc, N3, OC(=X)Jc, y NJeC(=X)NJcJd,, en los que cada Jc, Jd,Je es, de forma independiente, H, alquilo C1-C6 o alquilo C1-C6 sustituido y X es O o NJc..
En ciertas realizaciones, el nucleósido bicíclico que tiene la Fórmula III:
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en la que:
Bx es un resto base heterocíclica;
Ta y Tb cada uno, independientemente, H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado, un grupo fósforo reactivo, un resto de fósforo o una unión covalente a un medio de soporte;
Zb es alquilo C1-C6, alquenilo C2-C6, alquinilo C2-C6, alquilo C1-C6 sustituido, alquenilo C2-C6 sustituido, alquinilo C2-C6 sustituido o acilo (C(=O)-).sustituido.
En ciertas realizaciones, el nucleósido bicíclico que tiene la Fórmula IV:
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en la que:
Bx es un resto base heterocíclica;
Ta y Tb cada uno, independientemente, H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado, un grupo fósforo reactivo, un resto de fósforo o una unión covalente a un medio de soporte;
Rd es alquilo C1-C6, alquilo C1-C6 sustituido, alquenilo C2-C6, alquenilo C2-C6 sustituido, alquinilo C2-C6 o
alquinilo C2-C6 sustituido;
cada qa, qb, qc y qd es, independientemente, H, halógeno, alquilo C1-C6, alquilo C1-C6 sustituido, alquenilo C2- Ca, alquenilo C2-C6 sustituido, alquinilo C2-C6 o alquinilo C2-C6 sustituido, alcoxilo C1-C6, alcoxilo C1-C6
sustituido, acilo, acilo sustituido, aminoalquilo C1-Ca o aminoalquilo C1-Ca sustituido;
En ciertas realizaciones, el nucleósido bicíclico que tiene la Fórmula V:
en la que:
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Bx es un resto base heterocíclica;
Ta y Tb cada uno, independientemente, H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado, un grupo fósforo reactivo, un resto de fósforo o una unión covalente a un medio de soporte;
qa, qb, qe y qf son cada uno, independientemente, hidrógeno, halógeno, alquilo C1-C12, alquilo C1-C12 sustituido, alquenilo C2-C12, alquenilo C2-C12 sustituido,, alquinilo C2-C12, alquinilo C2-C12 sustituido, alcoxi C1-C12, alcoxi C1-C12 sustituido C1-C12, OJj, SJj, SOJj, SO2J NJJk, N3, CN, C(=O)OJj, C(=O)NJJk, C(=O)Jj, O-C(=O)NJJk, N(H)C(=NH)NJjJk, N(H)C(=O)NJjJk o N(H)C(=S)NJjJk; o qe y qf juntos son =C(qg)(qh);
qg y qh son cada uno, independientemente, H, halógeno, alquilo C1-C12 o alquilo C1-C12 sustituido.
Se han descrito la síntesis y preparación de los monómeros de metilenoxi(4'-CH2-O-2') BNA adenina, citosina, guanina, 5-metilcitosina, timina y uracilo, junto con su oligomerización y las propiedades de reconocimiento de ácidos nucleicos (véase Koshkin y col., Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630). También se han descrito BNA y su preparación en los documentos wO 98/39352 y WO 99/14226.
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También se han preparado análogos de metilenoxi(4'-CH2-O-2') BNA, metilenoxi(4'-CH2-O-2') BNA y 2'-tio-BNA (véase Kumar y col., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1998, 8, 2219-2222). También se ha descrito la preparación de análogos nucleosídicos bloqueados que comprenden dúplex de oligodesoxirribonucleótidos como sustratos para las ácido nucleico polimerasas (véase, por ejemplo, Wengel y col., documento WO 99/14226). Además, en la técnica se ha descrito la síntesis de 2'-amino-BNA, un nuevo análogo oligonucleotídico de alta afinidad restringido por conformación (véase, por ejemplo, Singh y col., J. Org. Chem., 1998, 63, 10035-10039). Además, se han preparado 2'-amino y 2'-metilamino-BNA y anteriormente se ha comunidad la estabilidad térmica de otros dúplex con hebras de ARN y ADN complementarias.
En ciertas realizaciones, el nucleósido bicíclico que tiene la Fórmula VI:
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en la que:
Bx es un resto base heterocíclica;
Ta y Tb cada uno, independientemente, H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado, un grupo fósforo reactivo, un resto de fósforo o una unión covalente a un medio de soporte;
cada qi, qj, qk y ql es, independientemente, H, halógeno, alquilo C1-C12, alquilo C1-C12 sustituido, alquenilo C2- C12, alquenilo C2-C12 sustituido,, alquinilo C2-C12, alquinilo C2-C12 sustituido, alcoxi C1-C12, alcoxi C1-C12
sustituido C1-C12, OJj, SJj, SOJj, SOJj, NJjJk, N3, CN, C(=O)OJj, C(=O)NJ C(=O)Jj, O-C(=O)NJjJk,
N(H)C(=NH)NJ N(H)C(=O)NJjJk o N(H)C(=S)NJjJk; y
qi y qj o ql y qk juntos son =C(qg)(qh), en la que qg y qh son cada uno, independientemente, H, halógeno, alquilo C1-C12 o alquilo C1-C12 sustituido.
Se han descrito Un nucleósido bicíclico carbocíclico que tiene un puente 4'-(CH2)3-2' y el análogo de alquenilo, puente 4'-CH=CH-CH2-2', (véase, por ejemplo, Freier y col., Nucleic Acids Research, 1997, 25(22), 4429-4443 y Albaek y col., J. Org. Chem., 2006, 71, 7731-7740). La síntesis y preparación de nucleósidos bicíclicos carbocíclicos junto con sus estudios de oligomerización y bioquímicos también se han descrito (véase, por ejemplo, Srivastava y col., J. Am. Chem. Soc. 2007, 129(26), 8362-8379).
Como se usa en el presente documento, "nucleósido bicíclico 4'-2'" o "nucleósido bicíclico 4' a 2'" se refiere a un nucleósido bicíclico que comprende un anillo de furanosa que comprende un puente que conecta el átomo de carbono 2 'y el átomo de carbono 4'.
Como se usa en el presente documento, "nucleósidos monocíclicos" se refiere a nucleósidos que comprenden restos de azúcar modificados que no son restos de azúcar bicíclicos. En ciertas realizaciones, el resto de azúcar, o análogo de resto de azúcar, de un nucleósido se puede modificar o sustituir en cualquier posición.
Como se usa en el presente documento, "azúcar modificado en 2'" significa un azúcar de furanosilo modificado en la posición 2'. En ciertas realizaciones, tales modificaciones incluyen sustituyentes seleccionados entre: un haluro, que incluye, pero no se limita a, alcoxi sustituido y no sustituido, tioalquilo sustituido y no sustituido, aminoalquilo sustituido y no sustituido, alquilo sustituido y no sustituido, alilo sustituido y no sustituido y alquinilo sustituido y no sustituido. En ciertas realizaciones, las modificaciones en 2' se seleccionan de sustituyentes que incluyen, pero no se limitan a: O[(CH2)nO]mCH3, O(CH2)nNH2, O(CH2)nCH3, O(CH2)nONH2, OCH2C(=O)N(H)CH3 y O(CH2)nON[(CH2)nCH3]2, en las que n y m son de 1 a aproximadamente 10. Otros grupos sustituyentes en 2' también se pueden seleccionar entre: alquilo C1-C12; alquilo sustituido; alquenilo; alquinilo; alcarilo; aralquilo; O- alcarilo u O-aralquilo; SH; SCH3; OCN; Cl; Br; CN; CF3; OCF3; SOCH3; SO2CH3; ONO2; NO2; N3; NH2; heterocicloalquilo; heterocicloalcarilo; aminoalquilamino; polialquilamino; sililo sustituido; un grupo de escisión de ARN; un grupo reportero; un intercalador; un grupo para mejorar las propiedades farmacocinéticas; y un grupo para mejorar las propiedades farmacodinámicas de un compuesto antisentido y otros sustituyentes que tienen propiedades similares. En ciertas realizaciones, los nucleósidos modificados comprenden una cadena lateral 2'- MOE (véase, por ejemplo, Baker y col., J. Biol. Chem., 1997, 272, 11944-12000). Tal sustitución 2'-MOE se ha descrito como que tiene una afinidad de unión mejorada en comparación con los nucleósidos no modificados y con otros nucleósidos modificados, tales como 2'-0-metilo, O-propilo, y O-aminopropilo. También se ha demostrado que los oligonucleótidos que tienen el sustituyente 2'-MOE son inhibidores antisentido de la expresión génica con características prometedoras para su uso in vivo (véase, por ejemplo, Martin, P., Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486504; Altmann y col., Chimia, 1996, 50, 168-176; Altmann y col., Biochem. Soc. Trans., 1996, 24, 630-637; y Altmann y col., Nucleosides Nucleotides, 1997, 16, 917-926).
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Como se usa en el presente documento, un "nucleósido de tetrahidropirano modificado" o "nucleósido de THP modificado" significa un nucleósido que tiene un "azúcar" de tetrahidropirano de seis miembros sustituido en el residuo de pentofuranosilo en nucleósidos normales (un sustituto de azúcar). Los nucleósidos de THP modificado incluyen, pero no se limitan a, lo que se denomina en la técnica ácido nucleico de hexitol (HNA), ácido nucleico de anitol (ANA), ácido nucleico de manitol (MNA) (véase Leumann, CJ. Bioorg. & Med. Chem. (2002) 10:841-854), fluoro HNA (F-HNA), o aquellos compuestos que tienen Fórmula X:
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en la que independientemente para cada uno de dichos al menos un análogo de nucleósido de tetrahidropirano de Fórmula X:
Bx es un resto base heterocíclica;
T3 y T4 son cada uno, independientemente, un grupo de unión internucleosídico que une el análogo de nucleósido de tetrahidropirano al compuesto antisentido o uno de T3 y T4 es un grupo de unión internucleosídico que une el análogo de nucleósido de tetrahidropirano con el compuesto antisentido y el otro de T3 y T4 es H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado unido, o un grupo terminal 5' o 3';
q-i, q2, q3, q4, q5, q6 y q7 son cada uno independientemente, H, alquilo C1-C6, alquilo C1-C6 sustituido, alquenilo C2-C6, alquenilo C2-C6 sustituido, alquinilo C2-C6, o alquinilo C2-C6 sustituido; y
uno de R1 y R2 es hidrógeno y el otro se selecciona de halógeno, alcoxi sustituido o no sustituido, NJ1J2, SJ1, N3, OC(=X)J1, OC(=X)NJj2, NJ3C(=X)NJJ2, y CN, en el que X es O, S, o NJ1, y cada uno J1, J2, y J3 es, independientemente, H o alquilo C1-C6.
En ciertas realizaciones, se proporcionan los nucleósidos de THP modificados de Fórmula X en la que qm, qn, qp, qr, qs, qt, y qu son cada uno H. En ciertas realizaciones, al menos uno de qm, qn, qp, qr, qs, qt, y qu es diferente de H. En ciertas realizaciones, al menos uno de qm, qn, qp, qr, qs, qt y qu es metilo. En ciertas realizaciones, se proporcionan nucleósidos de THP de Fórmula X en la que R1 y R2 es F. En ciertas realizaciones, R1 es flúor y R2 es H, R1 es metoxi y R2 es H y R1 es metoxietoxi y R2 es H.
Como se usa en el presente documento, "2'-modificado" o "2'-sustituido" se refiere a un nucleósido que comprende un azúcar que comprende un sustituyente en la posición 2 'distinta de H u OH. Los nucleósidos modificados en 2' incluyen, pero sin limitaciones, nucleósidos bicíclicos en los que el puente que conecta dos átomos de carbono del anillo de azúcar conecta el carbono 2' y otro carbono del anillo de azúcar y los nucleósidos con sustituyentes 2' que no forman puentes, tales como alilo, amino, azido, tio, O-alilo, O-alquilo C1-C10, -OCF3, O-(CH2)2-O-CH3, 2'-O(CH2)2SCH3, O-(CH2)2-O-N(Rm)(Rn), o O-CH2-C(=O)-N(Rm)(Rn), en las que cada Rm y Rn es, de forma independiente, H o alquilo C1-C10 sustituido o no sustituido. Los nucleósidos modificados en 2' pueden comprender además otras modificaciones, por ejemplo, en otras posiciones del azúcar y/o en la base nucleotídica.
También se conocen en la técnica muchos otros sistemas de anillo sustituto de azúcar biciclo y triciclo que pueden usarse para modificar nucleósidos para la incorporación en compuestos antisentido (véase, por ejemplo, el artículo de revisión: Leumann, J. C, Bioorganic & Medicinal Chemistry, 2002, 10, 841-854).
Dichos sistemas de anillos pueden sufrir varias sustituciones adicionales para mejorar la actividad.
Los procedimientos para las preparaciones de los azúcares modificados son bien conocidos para los expertos en la técnica.
En los nucleótidos que tienen restos de azúcar modificados, los restos de bases nucleotídicas (naturales, modificados o una combinación de los mismos) se mantienen para la hibridación con un diana de ácido nucleico apropiada.
En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido comprenden uno o más nucleótidos que tienen restos de azúcar modificados. En ciertas realizaciones, el resto de azúcar modificado es 2'-MOE. En ciertas realizaciones, los nucleótidos modificados con 2'-MOE están dispuestos en un motivo gapmero.
Bases nucleotídicas modificadas
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Las modificaciones o sustituciones de bases nucleotídicas (o bases) son estructuralmente distinguibles, aunque funcionalmente intercambiables, de las bases nucleotídicas naturales o sintéticas no modificadas. Las bases nucleotídicas naturales y modificadas son capaces de participar en enlaces de hidrógeno. Tales modificaciones de bases nucleotídicas pueden impartir estabilidad de nucleasa, afinidad de unión aumentada o alguna otra propiedad biológica beneficiosa a los compuestos antisentido. Las bases nucleotídicas modificadas incluyen bases nucleotídicas sintéticas y naturales tales como, por ejemplo, 5-metilcitosina (5-me-C). Ciertas sustituciones de bases nucleotídicas, que incluyen sustituciones de 5-metilcitosina, son particularmente útiles para aumentar la afinidad de unión de un compuesto antisentido por un ácido nucleico diana. Por ejemplo, se ha demostrado que las sustituciones de 5-metilcitosina aumentan la estabilidad dúplex del ácido nucleico en 0,6-1,2 °C (Sanghvi, Y.S., Crooke, S.T. y Lebleu, B., eds., Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pág. 276278).
Las bases nucleotídicas no modificadas adicionales incluyen 5-hidroximetil citosina, xantina, hipoxantina, 2- aminoadenina, 6-metil y otros derivados alquílicos de adenina y guanina, 2-propilo y otros derivados alquílicos de adenina y guanina, 2-tiouracilo, 2-tiotimina y 2 -tiocitosina, 5-halouracilo y citosina, 5-propinilo (-CEC-CH3) uracilo y citosina y otros derivados alquinílicos de bases de pirimidina, 6-azo-uracilo, citosina y timina, 5-uracilo (pseudouracilo), 4-tiouracilo, 8-halo, 8-amino, 8-tiol, 8-tioalquilo, 8- hidroxilo y otras adeninas y guaninas 8- sustituidas, 5-halo particularmente 5-bromo, 5-trifluorometilo y otros 5-sustituidos uracilos y citosinas, 7-metilguanina y 7-metiladenina, 2-F-adenina, 2-aminoadenina, 8- azaguanina y 8-azaadenina, 7-deazaguanina y 7-deazaadenina y 3-deazaguanina y 3-deazaadenina.
Los restos de bases heterocíclicas también pueden incluir aquellos en los que la base de purina o pirimidina se reemplaza con otros heterociclos, por ejemplo 7-deaza-adenina, 7-deazaguanosina, 2-aminopiridina y 2-piridona. Las bases nucleotídicas que son particularmente útiles para aumentar la afinidad de unión de los compuestos antisentido incluyen pirimidinas 5-sustituidas, 6-azapirimidinas y purinas N-2, N-6 y O-6 sustituidas, que incluyen 2 aminopropiladenina, 5-propiniluracilo y 5-propinilcitosina.
En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido dirigidos a un ácido nucleico del GCGR comprenden una o más bases nucleotídicas modificadas. En ciertas realizaciones, la base nucleotídica modificada es una 5-metilcitosina. En ciertas realizaciones, cada citosina es una 5-metilcitosina.
Composiciones y procedimientos para formular composiciones farmacéuticas
Los oligonucleótidos antisentido pueden mezclarse con sustancias activas o inertes farmacéuticamente aceptables para la preparación de composiciones farmacéuticas o formulaciones. Las composiciones y procedimientos para la formulación de composiciones farmacéuticas dependen de una serie de criterios, que incluyen, pero no se limitan a, la vía de administración, la extensión de la enfermedad o la dosis a administrar.
Un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico del GCGR se puede utilizar en composiciones farmacéuticas combinando el compuesto antisentido con un diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable adecuado. Un diluyente farmacéuticamente aceptable incluye solución salina tamponada con fosfato (PBS). PBS es un diluyente adecuado para usar en composiciones que se administran por vía parenteral. Por consiguiente, en una realización, se emplea en los procedimientos descritos en el presente documento una composición farmacéutica que comprende un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico del GCGR y un diluyente farmacéuticamente aceptable En ciertas realizaciones, el diluyente farmacéuticamente aceptable es PBS. En ciertas realizaciones, el compuesto antisentido es un oligonucleótido antisentido.
Las composiciones farmacéuticas que comprenden compuestos antisentido abarcan cualquier sal, éster o sales de dichos ésteres farmacéuticamente aceptables, o cualquier otro oligonucleótido que, tras la administración a un animal, incluido un ser humano, puede proporcionar (directa o indirectamente) el metabolito biológicamente activo o un residuo del mismo. De acuerdo con esto, por ejemplo, la divulgación también se extiende a sales farmacéuticamente aceptables de compuestos antisentido, profármacos, sales farmacéuticamente aceptables de dichos profármacos, y otros bioequivalentes. Las sales farmacéuticamente aceptables adecuadas incluyen, pero sin limitación, sales de sodio y potasio.
Las sales farmacéuticamente aceptables de los compuestos descritos en el presente documentos e pueden preparar por procedimientos bien conocidos en la técnica. Para una revisión de las sales farmacéuticamente aceptables, véase Stahl y Wermuth, Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection and Use (Wiley-VCH, Weinheim, Alemania, 2002). Las sales de sodio de los oligonucleótidos antisentido son útiles y bien aceptadas para administración terapéutica a seres humanos. Por consiguiente, en una realización, los compuestos descritos en el presente documento están en forma de una sal de sodio.
Un profármaco puede incluir la incorporación de nucleósidos adicionales en uno o ambos extremos de un compuesto antisentido que se escinden mediante nucleasas endógenas dentro del cuerpo, para formar el compuesto antisentido activo.
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Compuestos antisentido conjugados
Los compuestos antisentido se pueden unir covalentemente a uno o más restos o conjugados que potencian la actividad, distribución celular o captación celular de los oligonucleótidos antisentido resultantes. Los grupos conjugados típicos incluyen restos de colesterol y restos lipídicos. Los grupos conjugados adicionales incluyen carbohidratos, fosfolípidos, biotina, fenazina, folato, fenantridina, antraquinona, acridina, fluoresceínas, rodaminas, cumarinas y colorantes.
Los compuestos antisentido también pueden modificarse para que tengan uno o más grupos estabilizadores que están generalmente unidos a uno o a ambos extremos de compuestos antisentido para potenciar propiedades tales como, por ejemplo, estabilidad de nucleasas. Incluidas en los grupos estabilizadores se encuentran las estructuras de caperuza. Estas modificaciones terminales protegen el compuesto antisentido que tiene ácido nucleico terminal de la degradación por exonucleasa, y pueden ayudar a la administración y/o localización dentro de una célula. La caperuza puede estar presente en el extremo 5'(5'-caperuza), o en el extremo 3' (3'-caperuza), o puede estar presente en ambos extremos. Las estructuras de caperuza son bien conocidas en la técnica e incluyen, por ejemplo, caperuzas desoxiabásicas invertidas. Adicionalmente, los grupos estabilizadores 3'y 5' que pueden usarse para cubrir uno o ambos extremos de un compuesto antisentido para impartir estabilidad a la nucleasa incluyen los desvelados en el documento WO 03/004602 publicado el 16 de enero de 2003.
Cultivo celular y tratamiento con compuestos antisentido
Los efectos de los compuestos antisentido sobre el nivel, la actividad o la expresión de los ácidos nucleicos del GCGR pueden probarse in vitro en diversos tipos de células Los tipos de células utilizadas para tales análisis están disponibles en proveedores comerciales (por ejemplo, la Colección americana de cultivos tipo, Manassus, VA; Zen- Bio, Inc., Research Triangle Park, Carolina del Norte; Clonetics Corporation, Walkersville, MD) y las células se cultivan de acuerdo con las instrucciones del proveedor utilizando reactivos disponibles en el mercado (por ejemplo, Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA). Los tipos de células ilustrativos incluyen, pero no se limitan a, células HepG2 y hepatocitos primarios.
Prueba in vitro de oligonucleótidos antisentido
En el presente documento se divulgan procedimientos para el tratamiento de células con oligonucleótidos antisentido, que se pueden modificar de forma apropiada para el tratamiento con otros compuestos antisentido
En general, las células se tratan con oligonucleótidos antisentido cuando las células alcanzan aproximadamente un 60-80 % de confluencia en cultivo.
Un reactivo usado habitualmente para introducir oligonucleótidos antisentido en células cultivadas incluye el reactivo de transfección de lípidos catiónicos LIPOFECTIN (Invitrogen, Carlsbad, CA). Los oligonucleótidos antisentido se mezclan con LIPOFECTIN® en OPTI-MEM® 1 (Invitrogen, Carlsbad, CA) para lograr la concentración final deseada de oligonucleótido antisentido y una concentración de LIPOFECTIN que típicamente varía de 2 a 12 ug/ml por 100 nM de oligonucleótido antisentido.
Otro reactivo utilizado para introducir oligonucleótidos antisentido en células cultivadas incluye LIPOFECTAMINE 2000® (Invitrogen, Carlsbad, CA). El oligonucleótido antisentido se mezcla con LIPOFECTAMINE 2000® en medio de suero reducido OPTI-MEM® 1 (Invitrogen, Carlsbad, CA) para lograr la concentración deseada de oligonucleótido antisentido y una concentración de LIPOFECTAMINE® que típicamente varía de 2 a 12 ug/ml por 100 nM de oligonucleótido antisentido.
Otro reactivo utilizado para introducir oligonucleótidos antisentido en células cultivadas incluye Cytofectin® (Invitrogen, Carlsbad, CA). El oligonucleótido antisentido se mezcla con Cytofectin® en medio de suero reducido OPTI-MEM® 1 (Invitrogen, Carlsbad, CA) para lograr la concentración deseada de oligonucleótido antisentido y una concentración de Cytofectin® que típicamente varía de 2 a 12 ug/ml por 100 nM de oligonucleótido antisentido.
Otra técnica utilizada para introducir oligonucleótidos antisentido en células cultivadas incluye electroporación.
Las células se tratan con oligonucleótidos antisentido por procedimientos de rutina. Las células se recogen típicamente 16-24 horas después del tratamiento con oligonucleótidos antisentido, momento en el que se miden los niveles de ARN o proteína de los ácidos nucleicos diana mediante procedimientos conocidos en la técnica y descritos en el presente documento. En general, cuando los tratamientos se realizan en múltiples repeticiones, los datos se presentan como el promedio de los tratamientos duplicados.
La concentración del oligonucleótido antisentido usado varía de una línea celular a otra línea celular. Los procedimientos para determinar la concentración óptima de oligonucleótidos antisentido para una línea celular particular son bien conocidos en la técnica. Los oligonucleótidos antisentido se usan típicamente a concentraciones que varían de 1 nM a 300 nM cuando se transfectan con LIPOFECTAMINE2000®, Lipofectin o Cytofectin. Los
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oligonucleótidos antisentido se usan a concentraciones más altas que varían de 625 a 20,000 nM cuando se transfectan usando electroporación.
Aislamiento de ARN
El análisis del ARN se puede realizar sobre ARN celular total o poli(A) + ARNm. Los procedimientos de aislamiento de ARN son bien conocidos en la técnica. El ARN se prepara usando procedimientos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, usando el reactivo TRIZOL® (Invitrogen, Carlsbad, CA) de acuerdo con los protocolos recomendados por el fabricante.
Análisis de la inhibición de niveles o expresión diana
La inhibición de los niveles o la expresión de un ácido nucleico del GCGR se pueden analizar de varias maneras conocidas en la técnica. Por ejemplo, los niveles de ácido nucleico diana se pueden cuantificar mediante, por ejemplo, análisis de transferencia de tipo Northern, reacción en cadena de la polimerasa competitiva (PCR) o PCR cuantitativa en tiempo real. El análisis del ARN se puede realizar sobre ARN celular total o poli(A) + ARNm. Los procedimientos de aislamiento de ARN son bien conocidos en la técnica. El análisis de transferencia de tipo Northern también es una rutina en la técnica. La PCR cuantitativa en tiempo real se puede llevar a cabo convenientemente usando el sistema de detección de secuencia ABI PRISM® 7600, 7700 o 7900 disponible comercialmente, disponible en PE-Applied Biosystems, Foster City, CA y utilizado de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Análisis con PCR cuantitativa en tiempo real de los niveles de ARNm diana
La cuantificación de los niveles de ARN diana se realizó mediante PCR cuantitativa en tiempo real usando el sistema de detección de secuencias ABI PRISM® 7600, 7700, o 7900 (PE-Applied Biosystems, Foster City, CA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los procedimientos de PCR cuantitativa en tiempo real son bien conocidos en la técnica.
Antes de la PCR en tiempo real, el ARN aislado se somete a una reacción de transcriptasa inversa (RT), que produce ADN complementario (ADNc) que luego se usa como sustrato para la amplificación por PCR en tiempo real. Las reacciones de RT y PCR en tiempo real se realizan secuencialmente en la misma muestra. La RT y los reactivos de PCR en tiempo real se obtienen en Invitrogen (Carlsbad, CA). Las reacciones de PCR en tiempo real con RT se llevan a cabo por procedimientos bien conocidos por los expertos en la técnica.
Las cantidades diana de genes (o ARN) obtenidas por PCR en tiempo real se normalizan usando el nivel de expresión de un gen cuya expresión es constante, tal como ciclofilina A, o cuantificando EL ARN total utilizando RIBOGREEN® (Invitrogen, Inc. Carlsbad, CA). La expresión de de ciclofilina A SE cuantifica mediante PCR en tiempo real realizada simultáneamente con la diana, multiplexando o por separado. El ARN total se cuantifica usando reactivo de cuantificación de ARN RRIBOGREEN® (Invitrogen, Inc. Eugene, OR) Los procedimientos de cuantificación de ARN por RIBOGREEN® se enseñan en Jones, L.J., y col., (Analytical Biochemistry, 1998, 265, 368-374). Se usa un instrumento CYTOFLUOR® 4000 (PE Applied Biosystems) para medir la fluorescencia de RIBOGREEN®.
Las sondas y los cebadores están diseñados para hibridar con un ácido nucleico del GCGR. Los procedimientos para diseñar sondas y cebadores de PCR en tiempo real son bien conocidos en la técnica y pueden incluir el uso de software tal como PRIMER EXPRESS (Applied Biosystems, Foster City, CA).
Análisis de los niveles de proteína
La inhibición antisentido de ácidos nucleicos del GCGR puede evaluarse midiendo los niveles de proteína del GCGR. Los niveles de proteína del GCGR pueden evaluarse o cuantificarse de diversas formas bien conocidas en la técnica, tales como inmunoprecipitación, análisis de transferencia de tipo Western (inmunotransferencia), ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), ensayos cuantitativos de proteínas, ensayos de actividad de proteínas (para ejemplo, ensayos de actividad de caspasa), inmunohistoquímica, inmunocitoquímica o clasificación celular activada por fluorescencia (FACS). Los anticuerpos dirigidos a un diana pueden identificarse y obtenerse a partir de diversas fuentes, tales como el catálogo de anticuerpos MSRS (Aerie Corporation, Birmingham, MI) o pueden prepararse por procedimientos convencionales de generación de anticuerpos monoclonales o policlonales bien conocidos en la técnica. Los anticuerpos útiles para la detección de GCGR de ser humano y de rata están disponibles comercialmente.
Pruebas in vivo de compuestos antisentido
Los compuestos antisentido, por ejemplo, oligonucleótidos antisentido, se prueban en animales para evaluar su capacidad para inhibir la expresión del GCGR y producir cambios fenotípicos. Las pruebas se pueden realizar en animales normales o en modelos experimentales de enfermedades. Para la administración a animales, los
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oligonucleótidos antisentido se formulan en un diluyente farmacéuticamente aceptable, tal como solución salina tamponada con fosfato. La administración incluye vías de administración parenteral. Después de un período de tratamiento con oligonucleótidos antisentido, se aísla el ARN del tejido y se miden los cambios en la expresión del ácido nucleico del GCGR. También se miden los cambios en los niveles de la proteína GCGR.
Ciertas indicaciones
En ciertas realizaciones, en el presente documento se divulgan procedimientos de tratar a un individuo, que comprende administrar una o más composiciones farmacéuticas como se describe en la presente invención. En ciertas realizaciones, el individuo tiene una enfermedad metabólica relacionada.
Como se muestra en los ejemplos a continuación, los compuestos dirigidos al GCGR, como se describe en el presente documento, han demostrado reducir la gravedad de los síntomas fisiológicos de enfermedades metabólicas relacionadas, incluyendo síndrome metabólico, diabetes mellitus, resistencia a la insulina, dislipidemia diabética, hipertrigliceridemia, obesidad y aumento de peso. En algunos de los experimentos, los compuestos redujeron los niveles de glucosa en sangre, por ejemplo, los animales continuaron experimentando síntomas, pero los síntomas fueron menos graves en comparación con los animales no tratados. En otros experimentos, sin embargo, los compuestos parecen reducir los síntomas de la diabetes; por ejemplo, los animales tratados durante un período de tiempo más largo experimentaron síntomas menos graves que aquellos a los que se administraron los compuestos durante un período de tiempo más corto. En otros experimentos, sin embargo, los compuestos parecen inhibir el aumento de peso; por ejemplo, los animales tratados durante un período de tiempo más largo experimentaron síntomas menos graves que aquellos a los que se administraron los compuestos durante un período de tiempo más corto. En otros experimentos, sin embargo, los compuestos parecen inhibir la hipertrigliceridemia; por ejemplo, los animales tratados durante un período de tiempo más largo experimentaron signos y/o síntomas menos graves que aquellos a los que se administraron los compuestos durante un período de tiempo más corto. La capacidad de los compuestos ilustrados como ejemplo a continuación para restaurar la función, por lo tanto, demuestra que los síntomas de la enfermedad pueden revertirse mediante el tratamiento con un compuesto como se describe en el presente documento.
La diabetes mellitus se caracteriza por numerosos signos y/o síntomas físicos y fisiológicos. Cualquier síntoma conocido por un experto en la técnica que se asocia con la diabetes de tipo 2 se puede mejorar o modificar de otro modo tal como se ha establecido anteriormente en los procedimientos descritos anteriormente. En ciertas realizaciones, el síntoma o signo es un síntoma o signo físico, tal como aumento de los niveles de glucosa, aumento de peso, micción frecuente, sed inusual, hambre extrema, fatiga extrema, visión borrosa, infecciones frecuentes, hormigueo o entumecimiento en las extremidades, sequedad y picazón en la piel, pérdida de peso, llagas de cicatrización lenta y encías hinchadas. En ciertas realizaciones, el síntoma o signo es un síntoma o signo fisiológico seleccionado del grupo que consiste en aumento de la resistencia a la insulina, aumento de los niveles de glucosa, aumento de la masa grasa, disminución de la tasa metabólica, disminución del aclaramiento de glucosa, disminución de la tolerancia a la glucosa, disminución de la sensibilidad a la insulina, disminución de la sensibilidad a la insulina hepática, aumento del tamaño y peso del tejido adiposo, aumento de la grasa corporal y aumento del peso corporal.
En ciertas realizaciones, el síntoma o signo físico es un aumento de los niveles de glucosa. En ciertas realizaciones, el signo o síntoma es aumento de peso. En ciertas realizaciones, el síntoma es micción frecuente. En ciertas realizaciones, el síntoma es sed inusual. En ciertas realizaciones, el síntoma es hambre extrema. En ciertas realizaciones, el síntoma es fatiga extrema. En ciertas realizaciones, el síntoma es visión borrosa. En ciertas realizaciones, el síntoma es infecciones frecuentes. En ciertas realizaciones, el síntoma es hormigueo o entumecimiento en las extremidades. En ciertas realizaciones, el síntoma es piel seca y con picor. En ciertas realizaciones, el signo o síntoma es pérdida de peso. En ciertas realizaciones, el síntoma son llagas de cicatrización lenta. En ciertas realizaciones, el síntoma es inflamación de las encías. En ciertas realizaciones, el signo o síntoma es resistencia a la insulina aumentada. En ciertas realizaciones, el síntoma o signo es un aumento de los niveles de glucosa. En ciertas realizaciones, el síntoma o signo es aumento de la masa grasa. En ciertas realizaciones, el síntoma o signo es una tasa metabólica disminuida. En ciertas realizaciones, el síntoma o signo es disminución del aclaramiento de glucosa. En ciertas realizaciones, el síntoma o signo es disminución de la tolerancia a la glucosa. En ciertas realizaciones, el síntoma o signo es disminución de la sensibilidad a la insulina. En ciertas realizaciones, el síntoma o signo es disminución de la sensibilidad a la insulina hepática. En ciertas realizaciones, el síntoma o signo es aumento del tamaño y peso del tejido adiposo. En ciertas realizaciones, el signo o síntoma es aumento de la grasa corporal. En ciertas realizaciones, el signo o síntoma es aumento del peso corporal.
En ciertas realizaciones, se divulgan procedimientos de tratar a un individuo, que comprende administrar una o más composiciones farmacéuticas como se describe en el presente documento. En ciertas realizaciones, el individuo tiene una enfermedad metabólica relacionada.
En ciertas realizaciones, la administración de un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico del GCGR da como resultado la reducción de la expresión del GCGR en al menos aproximadamente 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 99 %, o un intervalo definido por cualquiera de estos dos valores.
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En ciertas realizaciones, las composiciones farmacéuticas que comprenden un compuesto antisentido dirigido al GCGR se usan para la preparación de un medicamento para tratar un paciente que padece una enfermedad metabólica relacionada o es susceptible a sufrirla.
En ciertas realizaciones, los procedimientos descritos en el presente documento incluyen administrar un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado que tiene una porción de bases nucleotídicas contiguas como se describe en el presente documento de una secuencia citada en la SEQ ID NO: 11 (ISIS 449884).
Ciertas terapias de combinación
En ciertas realizaciones, una o más composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento se administran conjuntamente con uno o más agentes farmacéuticos distintos. En ciertas realizaciones, dichos uno más agentes farmacéuticos distintos están diseñados para tratar la misma enfermedad, trastorno o afección distinta a la de las una o más composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento. En ciertas realizaciones, dichos uno más agentes farmacéuticos distintos están diseñados para tratar una enfermedad, trastorno o afección distinta a la de las una o más composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento. En ciertas realizaciones, dichos uno más agentes farmacéuticos distintos están diseñados para tratar un efecto secundario indeseado de las una o más composiciones farmacéuticas como se describe en el presente documento. En ciertas realizaciones, una o más composiciones farmacéuticas se administran conjuntamente con otro agente farmacéutico para tratar un efecto indeseado de dicho otro agente farmacéutico. En ciertas realizaciones, una o más composiciones farmacéuticas se administran conjuntamente con otro agente farmacéutico para producir un efecto combinado. En ciertas realizaciones, una o más composiciones farmacéuticas se administran conjuntamente con otro agente farmacéutico para producir un efecto sinérgico.
En ciertas realizaciones, un primer agente y uno o más segundos agentes se administran al mismo tiempo. En ciertas realizaciones, el primer agente y uno o más segundos agentes se administran a tiempos diferentes. En ciertas realizaciones, el primer agente y uno o más segundos agentes se preparan juntos en una única formulación farmacéutica. En ciertas realizaciones, el primer agente y uno o más segundos agentes se preparan por separado.
En ciertas realizaciones, el segundo compuesto se administra antes de la administración de una composición farmacéutica descrita en el presente documento. En ciertas realizaciones, el segundo compuesto se administra después de la administración de una composición farmacéutica descrita en el presente documento. En ciertas realizaciones, el segundo compuesto se administra al mismo tiempo que una composición farmacéutica descrita en el presente documento. En ciertas realizaciones, la dosis de un segundo compuesto coadministrado es la misma que la dosis que se administraría si el segundo compuesto se administrara solo. En ciertas realizaciones, la dosis de un segundo compuesto coadministrado es menor que la dosis que se administraría si el segundo compuesto se administrara solo. En ciertas realizaciones, la dosis de un segundo compuesto coadministrado es mayor que la dosis que se administraría si el segundo compuesto se administrara solo.
En ciertas realizaciones, la administración conjunta de un segundo compuesto potencia el efecto de un primer compuesto, de manera que la administración conjunta de los compuestos da como resultado un efecto que es mayor que el efecto de administrar el primer compuesto solo. En ciertas realizaciones, la administración conjunta da como resultado efectos que son aditivos de los efectos de los compuestos cuando se administran solos. En ciertas realizaciones, la administración conjunta da como resultado efectos que son supraaditivos de los efectos de los compuestos cuando se administran solos. En ciertas realizaciones, el primer compuesto es un compuesto antisentido. En ciertas realizaciones, el segundo compuesto es un compuesto antisentido.
En ciertas realizaciones, los segundos agentes incluyen, pero sin limitación, un agente hipoglucemiante. El agente hipoglucemiante puede incluir, pero sin limitaciones, un cambio de estilo de vida terapéutico, agonista de PPAR, un inhibidor de la dipeptidil peptidasa (IV), un análogo de GLP-1, insulina o un análogo de insulina, un secretagogo de insulina, un inhibidor de SGLT2, un análogo de amilina humana, una biguanida, un inhibidor de alfa-glucosidasa o una combinación de los mismos. El agente hipoglucemiante puede incluir, pero sin limitación, metformina, sulfonilurea, rosiglitazona, meglitinida, tiazolidindiona, inhibidor de alfa-glucosidasa o una combinación de los mismos. La sulfonilurea puede ser acetohexamida, clorpropamida, tolbutamida, tolazamida, glimepirida, una glipizida, una gliburida o una gliclazida. La meglitinida puede ser nateglinida o repaglinida. La tiazolidindiona puede ser pioglitazona o rosiglitazona. La alfa-glucosidasa puede ser acarbosa o miglitol.
En algunas realizaciones, la terapéutica hipoglucemiante es un análogo de GLP-1. En algunas realizaciones, el análogo de GLP-1 es exendina-4 o liraglutida.
En otras realizaciones, la terapéutica hipoglucemiante es una sulfonilurea. En algunas realizaciones, la sulfonilurea es acetohexamida, clorpropamida, tolbutamida, tolazamida, glimepirida, una glipizida, una gliburida o una gliclazida.
En algunas realizaciones, el fármaco hipoglucemiante es una biguanida. En algunas realizaciones, la biguanida es metformina y en algunas realizaciones los niveles de glucosa se disminuyen sin incremento de la acidosis láctica en comparación con la acidosis láctica observada tras el tratamiento con metformina sola.
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En algunas realizaciones, el fármaco hipoglucemiante es una meglitinida. En algunas realizaciones, la meglitinida es nateglinida o repaglinida.
En algunas realizaciones, el fármaco hipoglucemiante es tiazolidindiona. En algunas realizaciones, la tiazolidindiona es pioglitazona, rosiglitazona o troglitazona. En algunas realizaciones, los niveles de glucosa en sangre se disminuyen sin mayor ganancia de peso que la observada con el tratamiento con rosiglitazona sola.
En algunas realizaciones, el fármaco hipoglucemiante es un inhibidor de la alfa-glucosidasa. En algunas realizaciones, el inhibidor de la alfa-glucosidasa es acarbosa o miglitol.
En una cierta realización, un agente hipoglucemiante coadministrado es ISIS 113715.
En una cierta realización, la terapia hipoglucemiante es un cambio terapéutico del estilo de vida.
En ciertas realizaciones, los segundos agentes incluyen, pero sin limitación, agentes hipolipemiantes. El agente hipolipemiante puede incluir, entre otros, atorvastatina, simvastatina, rosuvastatina y ezetimiba. En ciertas de dichas realizaciones, el agente hipolipemiante se administra antes de la administración de una composición farmacéutica descrita en el presente documento. En ciertas de dichas realizaciones, el agente hipolipemiante se administra después de la administración de una composición farmacéutica descrita en el presente documento. En ciertas de dichas realizaciones, el agente hipolipemiante se administra al mismo tiempo que la composición farmacéutica descrita en el presente documento. En ciertas de dichas realizaciones, la dosis de un agente hipolipemiante coadministrado es la misma que la dosis que se administraría si el agente hipolipemiante se administrara solo. En ciertas de dichas realizaciones, la dosis de un agente hipolipemiante coadministrado es menor que la dosis que se administraría si el agente hipolipemiante se administrara solo. En ciertas de dichas realizaciones, la dosis de un agente hipolipemiante coadministrado es mayor que la dosis que se administraría si el agente hipolipemiante se administrara solo.
En ciertas realizaciones, un agente hipolipemiante coadministrado es un inhibidor de la HMG-CoA reductasa. En ciertas de dichas realizaciones, el inhibidor de la HMG-CoA reductasa es una estatina. En ciertas de dichas realizaciones, la estatina se selecciona de atorvastatina, simvastatina, pravastatina, fluvastatina y rosuvastatina.
En ciertas realizaciones, un agente hipolipemiante coadministrado es un inhibidor de la absorción de colesterol. En ciertas de dichas realizaciones, el inhibidor de la absorción de colesterol es ezetimiba.
En ciertas realizaciones, un agente hipolipemiante coadministrado es un inhibidor de la HMG-CoA reductasa formulado conjuntamente con un inhibidor de la absorción de colesterol. En ciertas de dichas realizaciones, el agente hipolipemiante formulado conjuntamente es ezetimiba/simvastatina.
En ciertas realizaciones, un agente hipolipemiante coadministrado es un inhibidor de la proteína de transferencia de triglicéridos microsomal.
En ciertas realizaciones, un agente hipolipemiante coadministrado es un oligonucleótido dirigido a ApoB.
En ciertas realizaciones, los segundos agentes incluyen, pero sin limitación, un agente o fármaco anti-obesidad. Dichos agentes antiobesidad incluyen, pero sin limitación, orlistat, sibutramina o rimonabant, y se pueden administrar como se ha descrito anteriormente, como agentes adiposos o reductores del peso corporal. En ciertas realizaciones, el compuesto antisentido puede coadministrarse con supresores del apetito. Dichos supresores del apetito incluyen, pero sin limitación, tenuato de dietilpropion, mazindol, orlistat, fendimetrazina, fentermina y sibutramina, y pueden administrarse como se describe en el presente documento. En cierta realización, los agentes antiobesidad están basados en el SNC, tales como, pero sin limitación, sibutramina, o basados en GLP-1 tales como, pero sin limitación, liraglutida.
Formulaciones
Los compuestos proporcionados en el presente documento también pueden mezclarse, conjugarse o asociarse de otro modo con otras moléculas, estructuras moleculares o mezclas de compuestos, como, por ejemplo, liposomas, moléculas dirigidas a receptores u otras formulaciones, para ayudar en la captación, distribución y/o absorción. Las patentes representativas de Estados Unidos que enseñan la preparación de tales formulaciones de captación,
distribución y/o absorción incluyen, pero sin limitaciones, los documentos US: 5.108,921; 5.354,844; 5.416,016;
5.459,127; 5.521,291; 5.543,158; 5.547,932; 5.583,020; 5.591,721; 4.426,330; 4.534,899; 5.013,556; 5.108,921;
5.213,804; 5.227,170; 5.264,221; 5.356,633; 5.395,619; 5.416,016; 5.417,978; 5.462,854; 5.469,854; 5.512,295;
5.527,528; 5.534,259; 5.543,152; 5.556,948; 5.580,575; y 5.595,756.
Los compuestos antisentido proporcionados en el presente documento pueden incluirse en una composición o formulación farmacéutica. La composición farmacéutica que puede incluir cualquier sal, éster o sales de dichos
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ésteres farmacéuticamente aceptables, o cualquier otro compuesto que, tras la administración a un animal, incluido un ser humano, puede proporcionar (directa o indirectamente) el metabolito biológicamente activo o un residuo del mismo.
La expresión “sales farmacéuticamente aceptables” se refiere a sales fisiológica y farmacéuticamente aceptables de los compuestos proporcionados en el presente documento: es decir, sales que conservan la actividad biológica deseada del compuesto parental y que no producen efectos toxicológicos indeseados en el mismo. La expresión “sal farmacéuticamente aceptable” incluye una sal preparada a partir de bases o ácidos inocuos farmacéuticamente aceptables, incluyendo bases y ácidos inorgánicos y orgánicos. Para los oligonucleótidos, los ejemplos preferidos de sales farmacéuticamente aceptables y sus usos se describen adicionalmente en la patente de Estados Unidos n.° 6.287.860. Se ha demostrado que las sales de sodio son formas adecuadas de fármacos oligonucleotídicos.
La expresión "derivado farmacéuticamente aceptable" abarca, pero sin limitación, sales, solvatos, hidratos, ésteres, profármacos, polimorfos, isómeros farmacéuticamente aceptables, variantes marcadas isotópicamente de los compuestos descritos en el presente documento.
Las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento se pueden administrar de diversos modos dependiendo de si se desea tratamiento local o sistémico y del área que se va a tratar. La administración puede ser parenteral. La administración parenteral incluye, pero sin limitación, inyección o infusión subcutánea, intravenosa o intramuscular.
Se prefiere que la administración parenteral esté dirigida a la expresión de GCGR dirigida en el hígado y el plasma. Se cree que los oligonucleótidos con al menos una modificación 2'-O-metoxietilo son particularmente útiles para administración parenteral.
Las formulaciones farmacéuticas descritas en la presente invención, que se pueden presentar de forma conveniente en forma de monodosis, se pueden preparar de acuerdo con técnicas convencionales bien conocidas en la industria farmacéutica. Dichas técnicas incluyen la etapa de poner en contacto los ingredientes activos con el(los) transportador(es) farmacéutico(s) o excipiente(s). En general, las formulaciones se preparan mezclando de forma uniforme e íntima los principios activos con vehículos líquidos o vehículos sólidos finamente divididos o ambos.
Las composiciones descritas en el presente documento también se pueden formular en forma de suspensiones en medio acuoso, no acuoso o mixto. La suspensión también puede contener estabilizantes.
Las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento incluyen, entre otras, soluciones, emulsiones y formulaciones que contienen liposomas. Las composiciones y formulaciones farmacéuticas descritas en el presente documento pueden comprender uno o más potenciadores de la penetración, vehículos, excipientes u otros principios activos o inactivos
Las formulaciones incluyen formulaciones liposomales. Como se usa en la presente invención, el término "liposoma" significa una vesícula compuesta por lípidos anfifílicos dispuestos en una bicapa o bicapas esféricas. Los liposomas son vesículas unilaminares o multilamelares que tienen una membrana formada a partir de un material lipófilo y un interior acuoso que contiene la composición que se va a administrar. Los liposomas catiónicos son liposomas cargados positivamente que se cree que interaccionan con moléculas de ADN cargadas negativamente para formar un complejo estable. Se cree que los liposomas que son sensibles al pH o están cargados negativamente atrapan ADN en lugar de formar complejos con él. Se han usado liposomas catiónicos y no catiónicos para suministrar ADN a las células.
Los liposomas también incluyen liposomas “estabilizados estéricamente”, un término que, como se usa en el presente documento, se refiere a liposomas que comprenden uno o más lípidos especializados que, cuando se incorporan a liposomas, dan como resultado tiempos de vida en circulación mejorados con respecto a liposomas que carecen de tales lípidos especializados. Los liposomas y sus usos se describen con más detalle en la patente de Estados Unidos 6.287.860.
En otra realización, las formulaciones incluyen formulaciones salinas. En ciertas realizaciones, una formulación consiste en los compuestos descritos en el presente documento y solución salina. En ciertas realizaciones, una formulación consiste esencialmente en los compuestos descritos en el presente documento y solución salina. ciertas realizaciones, la solución salina es solución salina de calidad farmacéuticamente aceptable. En ciertas realizaciones, la solución salina es solución salina tamponada. En ciertas realizaciones, la solución salina es solución salina tamponada con fosfato (PBS).
En ciertas realizaciones, una formulación excluye liposomas. En ciertas realizaciones, la formulación excluye liposomas estabilizados estéricamente. En ciertas realizaciones, una formulación excluye fosfolípidos. En ciertas realizaciones, una formulación consiste esencialmente en los compuestos descritos en el presente documento y solución salina y excluye liposomas.
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Las formulaciones y composiciones farmacéuticas también pueden incluir tensioactivos. Los Tensioactivos y sus usos se describen con más detalle en la patente de Estados Unidos 6.287.860.
En una realización, la presente invención emplea diversos potenciadores de la penetración para afectar la administración eficiente de ácidos nucleicos, particularmente oligonucleótidos. Los potenciadores de la penetración y sus usos se describen con más detalle en la patente de Estados Unidos 6.287.860.
Un experto en la técnica reconocerá que las formulaciones se diseñan rutinariamente de acuerdo con su uso pretendido, es decir, vía de administración.
Las composiciones y formulaciones para administración parenteral, incluyendo inyección o infusión subcutánea, intravenosa e intramuscular, pueden incluir soluciones acuosas estériles que pueden también contener tampones, diluyentes y otros aditivos adecuados, tales como, entre otros, potenciadores de la penetración, compuestos vehículo y otros vehículos o excipientes farmacéuticamente aceptables.
En otra realización relacionada, las composiciones proporcionadas en el presente documento pueden contener uno o más compuestos antisentido, particularmente oligonucleótidos, dirigidos a un primer ácido nucleico y uno o más compuestos antisentido dirigidos a un segundo ácido nucleico diana. Como alternativa, las composiciones proporcionadas en el presente documento pueden contener dos o más compuestos antisentido dirigidos a diferentes regiones del mismo ácido nucleico diana. En la técnica se conocen numerosos ejemplos de compuestos antisentido. Se pueden usar dos o más compuestos combinados juntos o secuencialmente.
Dosificación
La dosificación depende de la gravedad y la capacidad de respuesta del estado de enfermedad que se va a tratar y el curso de tratamiento que dura de varios días a varios meses o hasta que se efectúa una cura y se consigue una disminución del estado de la enfermedad. Pautas de dosificación óptimas se pueden calcular a partir de mediciones de la acumulación del fármaco en el cuerpo del paciente. Las dosis óptimas pueden variar dependiendo de la potencia relativa de los oligonucleótidos individuales y generalmente se pueden estimar basándose en las CE50 que se ha descubierto que son eficaces en modelos animales in vitro e in vivo. En general, las dosificaciones varían de 0,01 |jg a 100 g por kg de peso corporal y pueden administrase una o más veces diariamente, semanalmente, mensualmente o anualmente, o en los intervalos deseados. Tras un tratamiento exitoso, puede ser deseable hacer que el paciente se somete a terapia de mantenimiento para prevenir la recurrencia del estado de enfermedad, en el que el oligonucleótido se administra en dosis de mantenimiento, que varían de 0,01 jg a 100 g por kg de peso corporal, una o más veces al día.
Aunque la presente invención se ha descrito con especificidad de acuerdo con algunas de sus realizaciones preferentes, los ejemplos siguientes solo sirven para ilustrar los compuestos de la invención y no se pretende que limiten la misma.
Ciertos compuestos
Se analizaron aproximadamente setecientos setenta y siete compuestos antisentido recientemente diseñados y desvelados anteriormente de diversas longitudes, motivos y composición de la cadena principal para determinar su efecto sobre el ARNm de GCGR in vitro en varios tipos de células (Ejemplo 1). Los nuevos compuestos se compararon con compuestos diseñados previamente, incluyendo ISIS 310457, ISIS 315163 e ISIS 325568 que se han determinado previamente como algunos de los compuestos antisentido más potentes in vitro (véase, por ejemplo, la publicación de patente de Estados Unidos, la patente de Estados Unidos n.° 7.399.853 y la solicitud de patente publicada de Estados Unidos n.° US2007-0087987). De los aproximadamente setecientos setenta y siete compuestos antisentido diseñados recientemente y diseñados previamente, solo se presentan aquellos compuestos que fueron seleccionados para un estudio adicional basado en la potencia in vitro. Los compuestos seleccionados se analizaron para determinar la inhibición dependiente de la dosis en hepatocitos primarios de mono cinomolgo y células HepG2 (Ejemplos 5-13). De los 120 compuestos analizados por los ensayos de respuesta a la dosis, se seleccionaron 33 oligonucleótidos antisentido para los ensayos de tolerabilidad in vivo.
Los 33 oligonucleótidos seleccionados finales ISIS 304538 (SEQ ID NO: 112), ISIS 304539 (SEQ ID NO: 113), ISIS 325568 (SEQ ID NO: 4), ISIS 398457 (SEQ ID NO: 9), ISIS 398471 (SEQ ID NO: 17), ISIS 398486 (SEQ ID NO: 24), ISIS 398491 (SEQ ID NO: 105), ISIS 398506 (SEQ ID NO: 108), ISIS 398507 (SEQ ID NO: 109), ISIS 398508 (SEQ ID NO: 110), ISIS 436034 (SEQ ID NO: 35), ISIS 436140 (SEQ ID NO: 102), ISIS 436141 (SEQ ID NO: 114), ISIS 448718 (SEQ ID NO: 99), ISSI 448730 (SEQ ID NO: 100), ISIS 448754 (SEQ ID NO: 98), ISIS 448766 (SEQ ID NO: 31), ISIS 448817 (SEQ ID NO: 52), ISIS 448818 (SEQ ID NO: 56), ISIS 448819 (SEQ ID NO: 58), ISIS 448848 (SEQ ID NO: 62), ISIS 448860 (SEQ ID NO: 65), ISIS 448890 (SEQ ID NO: 68), ISIS 449884 (SEQ ID NO: 11), ISIS 449954 (SEQ ID NO: 51), ISIS 449956 (SEQ ID NO: 54), ISIS 459014 (SEQ ID NO: 80), ISIS 459024 (SEQ ID NO: 89), ISIS 459032 (SEQ ID NO: 81), ISIS 459040 (SEQ ID NO: 82), ISIS 459046 (SEQ ID NO: 83), ISIS 459076 (SEQ ID NO: 84) y ISIS 459157 (SEQ ID NO: 85), se analizaron para determinar la tolerabilidad en un modelo de ratón CD1, así como un modelo de rata Sprague-Dawley. Los compuestos son complementarios a las regiones 548-567,
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2016-2035 y 2018-2037 de las SEQ ID NO: 1, y 6682-6698, 7267-7283, 7270-7286, 7292-7308, 7295-7311, 7316-7332, 7317-7333, 7319-7335, 7341-7357, 7344-7360, 7365-7381, 7368-7384, 7389-7405, 7392-7408, 7416-7432, 7437-7453, 7440-7456, 7783-7799, 8030-8049, 8133-8152, 8141-8160, 8144-8160, 9002-9021, 9008-9027, 9245-9264, 9246-9262, 9804-9823, 10676-10695, 10718-10734, 12030-12049, 12031-12050, 12031-12047, 12032-12051, 12033-12052, 12033-12049, 12036-12055, 12175-12194, 12178-12194, 1349013509, 14138-14157, 15075-15094, 15743-15762.15744-15763, 15745-15764, y 15746-15765 de la SEQ ID NO:2.
En los modelos in vivo se midieron los pesos corporales y los pesos de los órganos, los marcadores de la función hepática (tales como alanina transaminasa, aspartato transaminasa y bilirrubina) y los marcadores de función renal (tal como BUN y creatinina). En el modelo de ratón, ISIS 304538, ISIS 325568, ISIS 398457, ISIS 398471, ISIS 398491, ISIS 436140, ISIS 448754, ISIS 448766, ISIS 448818, ISIS 449884, ISIS 449956, ISIS 459014, ISIS
459024, ISIS 459032, ISIS 459040, ISIS 459046, ISIS 459076 e ISIS 459157 fueron tolerables en términos de
niveles de transaminasas (Ejemplo 11). En el modelo de rata Sprague-Dawley, ISIS 304538, ISIS 325568, ISIS 398457, ISIS 398471, ISIS 398491, ISIS 436140, ISIS 448754, ISIS 448766, ISIS 448818, ISIS 449884, ISIS
449956, ISIS 459014, ISIS 459024, ISIS 459032, ISIS 459040, ISIS 459046, ISIS 459076 e ISIS 459157 se
consideraron tolerables en términos de niveles de función hepática y marcadores de la función renal (Ejemplo 12).
Se seleccionaron nueve compuestos, ISIS 325568 (SEQ ID NO:4), ISIS 398471 (SEQ ID NO:17), ISIS 436140 (SEQ ID NO:102), ISIS 448766 (SEQ ID NO:31), ISIS 449884 (SEQ ID NO:11), ISIS 459014 (SEQ ID NO:80), ISIS 459032 (SEQ ID NO:81), ISIS 459040 (SEQ ID NO:82) e ISIS 459157 (SEQ ID NO:85), a partir de los modelos de tolerabilidad y se analizaron los efectos a largo plazo sobre la tolerabilidad en un modelo de rata CD/1GS durante 13 semanas (Ejemplo 13). Se midieron los pesos corporales y los pesos de los órganos, los marcadores de la función hepática (tales como alanina transaminasa, aspartato transaminasa y bilirrubina) y los marcadores de función renal (tal como BUN y creatinina). Los nueve compuestos también se analizaron para determinar su viscosidad, que se encontró que era óptima para todos los oligonucleótidos (Ejemplo 14).
ISIS 449884, que demostró una tolerabilidad muy buena en los tres modelos in vivo, se analizó para determinar su semivida en el hígado de ratón CD1 (Ejemplo 15). La semivida de ISIS 449884 se calculó en 15 días.
La evaluación final de estos estudios (Ejemplos 11-15) condujo a la selección de ocho oligonucleótidos que tienen una secuencia de bases nucleotídicas de SEQ ID NO: 17 (ISIS 398471), 102 (ISIS 436140), 31 (ISIS 448766), 11 (ISIS 449884), 80 (ISIS 459014), 81 (ISIS 459032), 82 (ISIS 459040) o 85 (ISIS 459157). Los compuestos son complementarios a las regiones 7267-7283, 7270-7286, 7292-7308, 7295-7311, 7316-7332, 7319-7335, 73417357, 7344-7360, 7437-7453, 7365-7381, 7368-7384, 7389-7405, 7392-7408, 7416-7432, 7440-7456, 77837799, 8133-8152, 8144-8160, 9804-9823, 10718-10734, 15743-15762 de SEQ ID NO: 2. En ciertas realizaciones, los compuestos dirigidos a las regiones enumeradas, como se describe adicionalmente en el presente documento, comprenden un oligonucleótido modificado que tiene alguna porción de base nucleotídica de la secuencia indicada en las SEQ ID NO, como se describe adicionalmente en el presente documento. En ciertas realizaciones, los compuestos dirigidos a las regiones enumeradas o que tienen una porción de base nucleotídica de una secuencia enumerada en las SEQ ID Nos pueden ser de diversa longitud, como se describe adicionalmente en el presente documento, y puede tener uno de varios motivos, como se describe adicionalmente en el presente documento. En ciertas realizaciones, un compuesto dirigido a una región o que tiene una porción de base nucleotídica de una secuencia enumerada en las SEQ ID NOs listadas tiene la longitud y el motivo específicos, como se indica mediante los números ISIS: 398471,436140, 448766, 449884, 459014, 459032, 459040, y 459157.
Estos ocho compuestos se analizaron para determinar su actividad, perfil farmacocinético y tolerabilidad en monos cinomolgos (Ejemplo 16). El tratamiento con algunos de los compuestos causó la reducción de la expresión de ARNm del GCGR en tejido hepático. Específicamente, el tratamiento con ISIS 449884, ISIS 459157 e ISIS 325568 causó una reducción significativa de la expresión de ARNm de GCGR en el tejido hepático, en comparación con el control de PBS. Se observó que ISIS 449884 causó la mayor reducción de expresión de ARNm de GCGR en comparación con el control de PBS. El aumento de los niveles de glucagón es una consecuencia de la inhibición de los niveles de ARNm de GCGR. El tratamiento con ISIS 325568, ISIS 448766, ISIS 459157 e ISIS 449884 causó aumentos significativos en los niveles de glucagón en plasma, causando ISIS 449884 el mayor aumento. Por lo tanto, en términos de actividad, ISIS 449884 fue el más eficaz en el estudio de los monos. El tratamiento con los compuestos fue bien tolerado en los monos, en particular, el tratamiento con ISIS 449884.
De acuerdo con esto, se proporcionan en el presente documento compuestos antisentido con una o más de las características mejoradas. En ciertas realizaciones, los compuestos como se describen en el presente documento son eficaces en virtud de tener al menos uno de una CI50 in vitro inferior a 0,1 pM, inferior a 0,2 pM, inferior a 0,4 pM, inferior a 0,35 pM, inferior a 0,3 pM, inferior a 2,5 pM, inferior a 2,0 pM, inferior a 1,5 pM, inferior a 1,0 pM, cuando se libera en una línea celular HepG2 usando electroporación como se describe en los Ejemplos 8-11. En algunas de tales realizaciones, los compuestos son complementarios a una o más de las regiones 548-567, 2016-2035 y 20182037 de la SEQ ID NO: 1, y 6682-6698, 7267-7283, 7270-7286, 7292-7308, 7295-7311, 7316-7332, 7317-7333, 7319-7335, 7341-7357, 7344-7360, 7365-7381, 7368-7384, 7389-7405, 7392-7408, 7416-7432, 7437-7453, 7440-7456, 7783-7799, 8030-8049, 8133-8152, 8141-8160, 8144-8160, 9002-9021, 9008-9027, 9245-9264,
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
9246-9262, 9804-9823, 10676-10695, 10718-10734, 12030-12049, 12031-12050, 12031-12047, 12032-12051, 12033-12052, 12033-12049, 12036-12055, 12175-12194, 12178-12194, 13490-13509, 14138-14157, 1507515094, 15743-15762, 15744-15763, 15745-15764, y 15746-15765 de la SEQ ID NO:2.
En ciertas realizaciones, los compuestos como se describen en el presente documento son altamente tolerables, como se demuestra al tener al menos uno de un aumento de un valor de ALT o AST de no más de aproximadamente 100 veces, aproximadamente 60 veces, aproximadamente 50 veces, aproximadamente 40 veces, aproximadamente 30 plegar, aproximadamente 25 veces, aproximadamente 10 veces, aproximadamente 5 veces, aproximadamente 4 veces, aproximadamente 3 veces, o aproximadamente 2 veces sobre los animales tratados con solución salina; o un aumento del peso del hígado, bazo o riñón de no más de aproximadamente 30 %, aproximadamente 20 %, aproximadamente 15 %, aproximadamente 12 %, aproximadamente 10 %, aproximadamente 5 % o aproximadamente 2 % como se describe en los Ejemplos. En ciertas de tales realizaciones, los compuestos son complementarios a una o más de las regiones 7267-7283, 7270-7286, 7292-7308, 7295-7311, 7316-7332, 7319-7335, 7341-7357, 7344-7360, 7437-7453, 7365-7381, 7368-7384, 7389-7405, 7392-7408, 7416-7432, 7440-7456, 7783-7799, 8133-8152, 8144-8160, 9804-9823, 10718-10734, 15743-15762 de la SEQ ID NO:2.
Ejemplos
Divulgación no limitante
Aunque en el presente documento se han descrito ciertos compuestos, composiciones y procedimientos con especificidad de acuerdo con ciertas realizaciones, los ejemplos siguientes sólo sirven para ilustrar los compuestos descritos en el presente documento y no se pretende que limiten la misma.
Ejemplo 1: Inhibición antisentido del receptor de glucagón humano (GCGR) en células HepG2
Se diseñaron oligonucleótidos antisentido dirigidos a un ácido nucleico de GCGR y se analizaron sus efectos sobre el ARNm de GCGR in vitro. ISIS 310457, que se describió en una publicación anterior (WO 2007/035771) también se analizó. Las células HepG2 cultivadas a una densidad de 40.000 células por pocillo se transfectaron usando electroporación con oligonucleótido antisentido 4.000 nM. Tras un periodo de tratamiento de aproximadamente 24 horas se aisló el ARN de las células y se midieron los niveles de ARNm del GCGR mediante PCR cuantitativa en tiempo real. El conjunto de sonda de cebador humano RTS1508 (secuencia directa GACACCCCCGCCAATACC, designado en el presente documento como SEQ ID NO: 116; secuencia inversa CCGCATCTCTTGAACACGAA, incorporada en el presente documento como SEQ ID NO: 117; secuencia de la sonda TTGGCACCACAAAGT, incorporada en el presente documento como SEQ ID NO: 118) se usó para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de GCGr se ajustaron de acuerdo con un contenido de ARN total medido mediante RIBOGREEN®. Los resultados se presentan en forma del porcentaje de inhibición de GCGR respecto a las células control sin tratar. Se aisló un total de 309 oligonucleótidos. Solo los oligonucleótidos que se seleccionaron para los ensayos de respuesta a la dosis se muestran en la Tabla 1.
Los oligonucleótidos antisentido quiméricos recientemente diseñados en la Tabla 1 se diseñaron como gapmeros 310-4 MOE o gapmeros 5-10-5 MOE. Los gapmeros 3-10-4 MOE tienen 17 nucleósidos de longitud, en los que el segmento del hueco central comprende diez desoxinucleósidos 2' y está flanqueado por un segmento de ala en la dirección 5' que comprende tres nucleósidos y por un segmento de ala en la dirección 3' que comprende cuatro nucleósidos. Los gapmeros 5-10-5 MOE tienen 20 nucleósidos de longitud, en los que el segmento del hueco central comprende diez desoxinucleósidos 2' y está flanqueado por segmentos de ala en la dirección 5' y en la dirección 3' que comprende cinco nucleósidos cada uno. Cada nucleósido en el segmento de ala en 5' y cada nucleósido en el segmento de ala 3' tiene una modificación de 2'-MOE. Los enlaces internucleosídicos a lo largo de cada gapmero son enlaces fosforotioato (P = S). Todos los restos de citosina a lo largo de cada gapmero son 5-metilcitosinas. El "sitio de inicio” indica el nucleótido más 5' al que se dirige el gapmero en la secuencia génica humana. El "sitio de terminación” indica el nucleótido más 3' al que se dirige el gapmero en la secuencia génica humana. Cada gapmero enumerado en la Tabla 1 está dirigido al ARNm de GCGR humano, designado en el presente documento como SEQ ID NO: 1 (N.° de acceso de GENBANK NM_000160.3) o la secuencia genómica de GcGR humano, designada en el presente documento como SEQ ID NO: 2 (N.° de acceso en GENBANK NW_926918.l truncado de 19598000 a 16865000). 'n/a' indica que el oligonucleótido antisentido no se dirige a esa secuencia génica particular.
Tabla 1
Inhibición de los niveles de ARNm del GCGR humano por oligonucleótidos antisentido quiméricos dirigidos a la SEQ
ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 2
No. ISIS
Sitio de inicio de la SEQ ID NO:1 Sitio de terminación de la SEQ ID NO:1 Secuencia % de inhibición Motivo Sitio de inicio de la SEQ ID NO:2 Sitio de terminación de la SEQ ID NO:2 SEQ ID NO
310457
548 564 GCACTTTGTGGTGCCAAGGC 88 5—10— 5 n/a n/a 4
449823
1098 1114 GCACCCCAGCCGATGCC 91 3—10— 4 n/a n/a 5
450035
n/a n/a AGCCCTGGCCGGTCCTT 82 3—10— 4 6691 6707 6
449881
n/a n/a TCCCGAGGTGCCCAATG 89 3-10 4 7267 7283 7
7292
7308
7316
7332
7341
7357
7365
7381
7389
7405
7437
7453
449882
n/a n/a TTCCCGAGGTGCCCAAT 87 3-10 4 7268 7284 8
7293
7309
7317
7333
7342
7358
7366
7382
7390
7406
7414
7430
7438
7454
398457
n/a n/a GGGTTCCCGAGGTGCCCAAT 95 3-10 4 7268 7287 9
7293
7312
7317
7336
7342
7361
7366
7385
7390
7409
7414
7433
7438
7457
No. ISIS
Sitio de inicio de la SEQ ID NO:1 Sitio de terminación de la SEQ ID NO:1 Secuencia % de inhibición Motivo Sitio de inicio de la SEQ ID NO:2 Sitio de terminación de la SEQ ID NO:2 SEQ ID NO
449883
n/a n/a GTTCCCGAGGTGCCCAA 98 3-10- 7269 7285 10
4 7294 7310
7318 7334
7343 7359
7367 7383
7391 7407
7415 7431
7439 7455
449884
n/a n/a GGTTCCCGAGGTGCCCA 94 3-10- 7270 7286 11
4 7295 7311
7319 7344 7335 7360
7368 7384
7392 7408
7416 7432
7440 7456
449885
n/a n/a GGGTTCCCGAGGTGCCC 93 3-10- 7271 7287 12
4 7296 7312
7320 7336
7345 7361
7369 7385
7393 7409
7417 7433
7441 7457
450039
n/a n/a TGATCTCACCCAGCCCT 88 3-10 4 7740 7756 13
449894
n/a n/a AAGGTGACACCAGCCTG 92 3-10 4 7782 7798 14
449895
n/a n/a CTGAAGGTGACACCAGC 90 3-10 4 7785 7801 15
450040
n/a n/a TTCCAGCTGAGCACCCA 84 3-10 4 7897 7913 16
398471
n/a n/a TCCACAGGCCACAGGTGGGC 80 5-10 5 8133 8152 17
449905
n/a n/a GCATCCACAGGCCACAG 85 3-10 4 8139 8155 18
No. ISIS
Sitio de inicio de la SEQ ID NO:1 Sitio de terminación de la SEQ ID NO:1 Secuencia % de inhibición Motivo Sitio de inicio de la SEQ ID NO:2 Sitio de terminación de la SEQ ID NO:2 SEQ ID NO
449906
n/a n/a AGCATCCACAGGCCACA 90 3—10— 4 8140 8156 19
449907
n/a n/a CAGCATCCACAGGCCAC 85 3—10— 4 8141 8157 20
449908
n/a n/a CTCAGCATCCACAGGCC 84 3—10— 4 8143 8159 21
449910
n/a n/a AGCCACTGGGAGCACCC 85 3—10— 4 8386 8402 22
449912
n/a n/a GGCTCTGCCCCAACTCT 82 3—10— 4 8448 8464 23
398486
n/a n/a GTGAGCAGCCATGCAGGCTT 95 5—10— 5 9002 9021 24
449916
n/a n/a GAGCAGCCATGCAGGCT 86 3—10— 4 9003 9019 25
449917
n/a n/a TGAGCAGCCATGCAGGC 90 3—10— 4 9004 9020 26
449922
n/a n/a GCCAGGTGAGCAGCCAT 86 3—10— 4 9010 9026 27
450049
n/a n/a AGGGACAGGCACCTGCG 87 3—10— 4 9130 9146 28
450050
n/a n/a GCCTGGATTTTAGCCTC 84 3—10— 4 9249 9265 29
448762
n/a n/a CGGGGTGGCAACAGCTACAC 80 5—10— 5 9592 9611 30
448766
n/a n/a GCAAGGCTCGGTTGGGCTTC 86 5—10— 5 9804 9823 31
450054
n/a n/a TGCAAGGCTCGGTTGGG 82 3—10— 4 9808 9824 32
449759
176 192 GCAGAGCAGCAGAGCCT 80 3—10— 4 10667 10683 33
449760
177 193 GGCAGAGCAGCAGAGCC 88 3—10— 4 10668 10684 34
436034
185 204 GGCAGCTGAGTGGCAGAGCA 72 5—10— 5 10676 10695 35
450059
281 297 GCATGCCTCTGGGCAGC 88 3—10— 4 10772 10788 36
448799
n/a n/a AGGCACAGGCTGAAAGGCTC 80 5—10— 5 11667 11686 37
No. ISIS
Sitio de inicio de la SEQ ID NO:1 Sitio de terminación de la SEQ ID NO:1 Secuencia % de inhibición Motivo Sitio de inicio de la SEQ ID NO:2 Sitio de terminación de la SEQ ID NO:2 SEQ ID NO
449938
n/a n/a AGGCCAGGCACAGGCTG 92 3—10— 4 11675 11691 38
448802
n/a n/a GCTGAGGCCAGGCACAGGCT 87 5—10— 5 11676 11695 39
398585
n/a n/a GGCTGCATAAGCACCCAGGA 87 5—10— 5 11724 11743 40
449944
n/a n/a CTGCATAAGCACCCAGG 84 3—10— 4 11725 11741 41
449945
n/a n/a CCCAGCTCTGTGGCTCA 90 3—10— 4 11819 11835 42
448806
n/a n/a GTCCCCAGCTCTGTGGCTCA 96 5—10— 5 11819 11838 43
450061
n/a n/a GCAAGTCCCCAGCTCTG 91 3—10— 4 11826 11842 44
449948
n/a n/a CGCCCTGGCACTGTCTG 88 3—10— 4 11962 11978 45
449949
n/a n/a GTGTCCAGGCCATGATA 88 3—10— 4 12026 12042 46
449951
n/a n/a AAGTGTCCAGGCCATGA 93 3—10— 4 12028 12044 47
398504
n/a n/a CCCAAGTGTCCAGGCCATGA 91 5—10— 5 12028 12047 48
449952
n/a n/a CAAGTGTCCAGGCCATG 90 3—10— 4 12029 12045 49
449953
n/a n/a CCAAGTGTCCAGGCCAT 91 3—10— 4 12030 12046 50
449954
n/a n/a CCCAAGTGTCCAGGCCA 92 3—10— 4 12031 12047 51
448817
n/a n/a CACCCCAAGTGTCCAGGCCA 98 5—10— 5 12031 12050 52
449955
n/a n/a CCCCAAGTGTCCAGGCC 94 3—10— 4 12032 12048 53
449956
n/a n/a ACCCCAAGTGTCCAGGC 89 3—10— 4 12033 12049 54
449958
n/a n/a GCACCCCAAGTGTCCAG 93 3—10— 4 12035 12051 55
448818
n/a n/a CCCTGCACCCCAAGTGTCCA 83 5—10— 5 12036 12055 56
No. ISIS
Sitio de inicio de la SEQ ID NO:1 Sitio de terminación de la SEQ ID NO:1 Secuencia % de inhibición Motivo Sitio de inicio de la SEQ ID NO:2 Sitio de terminación de la SEQ ID NO:2 SEQ ID NO
449960
n/a n/a AAACCTGTGGCTGCCAC 93 3—10— 4 12175 12191 57
448819
n/a n/a GCCAAACCTGTGGCTGCCAC 95 5—10— 5 12175 12194 58
449797
733 749 GGACAGGCTGTAGCCCA 83 3—10— 4 13034 13050 59
448840
n/a n/a GGCTCACTCCATCACTGAGC 82 5—10— 5 13314 13333 60
449967
n/a n/a CCACCTGCCTGGCTGCC 89 3—10— 4 13366 13382 61
448848
1024 1043 GTGCAGGTACAGGCCCTCCA 92 5—10— 5 13490 13509 62
448850
1049 1068 GGAGGGTGGCCAGGCCCAGC 80 5—10— 5 13515 13534 63
449819
1093 1109 CCAGCCGATGCCCAGGT 82 3—10— 4 13559 13575 64
448860
n/a n/a GGCCAGTGTCCTGGTGTCCT 79 5—10— 5 14138 14157 65
449836
1467 1483 GCCACCAGCAGGCCCTG 87 3—10— 4 14779 14795 66
450074
n/a n/a GGGCTGAGGCCAACCTG 91 3—10— 4 15007 15023 67
448890
n/a n/a GCCACCCAGCATCGCCACGG 86 5—10— 5 15075 15094 68
448897
n/a n/a CCCTGCTGGGCACAGCTATG 83 5—10— 5 15094 15113 69
448901
n/a n/a CACAAGCTCCCTGCTGGGCA 82 5—10— 5 15102 15121 70
448903
n/a n/a GAGCGACACAAGCTCCCTGC 86 5—10— 5 15108 15127 71
448905
n/a n/a GGTGCAGAGCGACACAAGCT 81 5—10— 5 15114 15133 72
449851
1646 1662 GGCTGCCACCACCCCTC 88 3—10— 4 15374 15390 73
449856
2016 2032 CTTTATTGTTGGAGGAC 85 3—10— 4 15744 15760 74
449858
2018 2034 CTCTTTATTGTTGGAGG 85 3—10— 4 15746 15762 75
5
10
15
20
25
30
35
40
No. ISIS
Sitio de inicio de la SEQ ID NO:1 Sitio de terminación de la SEQ ID NO:1 Secuencia % de inhibición Motivo Sitio de inicio de la SEQ ID NO:2 Sitio de terminación de la SEQ ID NO:2 SEQ ID NO
449859
2019 2035 GCTCTTTATTGTTGGAG 91 3—10— 4 15747 15763 76
449860
2020 2036 AGCTCTTTATTGTTGGA 88 3—10— 4 15748 15764 77
449861
2021 2037 GAGCTCTTTATTGTTGG 81 3—10— 4 15749 15765 78
Ejemplo 2: Inhibición antisentido del receptor de glucagón humano (GCGR) en células HepG2
Se diseñaron oligonucleótidos antisentido adicionales dirigidos a un ácido nucleico de GCGR y se analizaron sus efectos sobre el ARNm de GCGR in vitro. También se analizó ISIS 315163 (ACCTGGAAGCTGCTGTACAT (SEQ ID NO 79); el sitio de iniciación en la SEQ ID NO:1 es 702; el sitio de iniciación en la SEQ ID NO:2 es 13003), que se describió en una publicación anterior (documento WO 2004/096016). Las células HepG2 cultivadas a una densidad de 40.000 células por pocillo se transfectaron usando electroporación con oligonucleótido antisentido 1.000 nM. Tras un periodo de tratamiento de aproximadamente 24 horas se aisló el ARN de las células y se midieron los niveles de ARNm del GCGR mediante PCR cuantitativa en tiempo real usando el conjunto de sonda de cebador humano RTS1508. Los niveles de ARNm de GCGR se ajustaron de acuerdo con un contenido de ARN total medido mediante RIBOGREEN®. Los resultados se presentan en forma del porcentaje de inhibición de GCGR respecto a las células control sin tratar. Se aisló un total de 156 oligonucleótidos antisentido. Solo los oligonucleótidos que se seleccionaron para los ensayos de respuesta a la dosis se muestran en la Tabla 2.
Los oligonucleótidos antisentido quiméricos recientemente diseñados en la Tabla 2 se diseñaron como los gapmeros 3-10-3 MOE, 3-10-4 MOE 4-10-4 MOE, 4-10-5 MOE o 5-10-6 MOE. Los gapmeros 3-10-3 MOE tienen 16 nucleósidos de longitud, en los que el segmento del hueco central comprende diez desoxinucleósidos 2' y está flanqueado por segmentos de ala en la dirección 5' y en la dirección 3' que comprende tres nucleósidos cada uno. Los gapmeros 3-10-4 MOE tienen 17 nucleósidos de longitud, en los que el segmento del hueco central comprende diez desoxinucleósidos 2' y está flanqueado por un segmento de ala en la dirección 5' que comprende tres nucleósidos y por un segmento de ala en la dirección 3' que comprende cuatro nucleósidos. Los gapmeros 4-10-4 MOE tienen 18 nucleósidos de longitud, en los que el segmento del hueco central comprende diez desoxinucleósidos 2' y está flanqueado por segmentos de ala en la dirección 5' y en la dirección 3' que comprende cuatro nucleósidos cada uno. Los gapmeros 4-10-5 MOE tienen 19 nucleósidos de longitud, en los que el segmento del hueco central comprende diez desoxinucleósidos 2' y está flanqueado por un segmento de ala en la dirección 5' que comprende cuatro nucleósidos y por un segmento de ala en la dirección 3' que comprende cinco nucleósidos. Los gapmeros 5-10-6 MOE tienen 21 nucleósidos de longitud, en los que el segmento del hueco central comprende diez desoxinucleósidos 2' y está flanqueado por un segmento de ala en la dirección 5' que comprende cinco nucleósidos y por un segmento de ala en la dirección 3' que comprende seis nucleósidos. Cada nucleósido en el segmento de ala en 5' y cada nucleósido en el segmento de ala 3' tiene una modificación de 2'-MOE. Los enlaces internucleosídicos a lo largo de cada gapmero son enlaces fosforotioato (P = S). Todos los restos de citosina a lo largo de cada gapmero son 5-metilcitosinas. El "sitio de inicio” indica el nucleótido más 5' al que se dirige el gapmero en la secuencia génica humana. El "sitio de terminación” indica el nucleótido más 3' al que se dirige el gapmero en la secuencia génica humana. Cada gapmero enumerado en la Tabla 2 está dirigido al ARNm de GCGR humano, designado en el presente documento como SEQ ID NO: 1 (N.° de acceso de GENBANK NM_000160.3) o la secuencia genómica de GCGR humano, designada en el presente documento como SEQ ID NO: 2 (N.° de acceso en GENBANK NW_926918.l truncado de 19598000 a 16865000). 'n/a' indica que el oligonucleótido antisentido no se dirige a esa secuencia génica particular.
Tabla 2
Inhibición de los niveles de ARNm del GCGR humano por oligonucleótidos antisentido quiméricos dirigidos a la SEQ
ID NO: y la SEQ ID NO: 2
No. ISIS
Sitio de inicio de la SEQ ID NO:1 Sitio de terminación de la SEQ ID NO:1 Secuencia % de inhibición Motivo Sitio de inicio de la SEQ ID NO:2 Sitio de terminación de la SEQ ID NO:2 SEQ ID NO
315163
702 721 ACCTGGAAGCTGCTGTACAT 38 5-10-5 13003 13022 79
459014
227 243 GGGCAATGCAGTCCTGG 62 3-10-4 10718 10734 80
459032
n/a n/a GAAGGTGACACCAGCCT 83 3-10-4 7783 7799 81
459040
n/a n/a GCTCAGCATCCACAGGC 63 3-10-4 8144 8160 82
459046
n/a n/a TGGATTTTAGCCTCCTC 73 3-10-4 9246 9262 83
459076
n/a n/a GCCAAACCTGTGGCTGC 84 3-10-4 12178 12194 84
459157
n/a n/a GGGTTCCCGAGGTGCCCAATG 92 5-10-6 7267 7287 85
7292 7312
7316 7336
7341 7361
7365 7385
7389 7409
7437 7457
459010
n/a n/a GGTTCCCGAGGTGCCC 100 3-10-3 7271 7286 86
7296 7311
7320 7335
7345 7360
7369 7384
7393 7408
7417 7432
7441 7456
459011
n/a n/a GGGTTCCCGAGGTGCC 89 3-10-3 7272 7287 87
7297 7312
7321 7336
7346 7361
7370 7385
7394 7409
7418 7433
7442 7457
459058
n/a n/a GAGGCCAGGCACAGGCT 75 3-10-4 11676 11692 88
459024
n/a n/a CGGTCCTTGGAGGATGC 63 3-10-4 6682 6698 89
No. ISIS
Sitio de inicio de la SEQ ID NO:1 Sitio de terminación de la SEQ ID NO:1 Secuencia % de inhibición Motivo Sitio de inicio de la SEQ ID NO:2 Sitio de terminación de la SEQ ID NO:2 SEQ ID NO
459088
n/a n/a GTTCCCGAGGTGCCCAATG 89 4-10-5 7267 7285 90
7292
7310
7316
7334
7341
7359
7365
7383
7389
7407
7437
7455
459087
n/a n/a GGTTCCCGAGGTGCCCAAT 95 4-10-5 7268 7286 91
7293
7311
7317
7335
7342
7360
7366
7384
7390
7408
7414
7432
7438
7456
459086
n/a n/a GGGTTCCCGAGGTGCCCAA 96 4-10-5 7269 7287 92
7294
7312
7318
7336
7343
7361
7367
7385
7391
7409
7415
7433
7439
7457
459083
n/a n/a GGTTCCCGAGGTGCCCAA 91 4-10-4 7269 7286 93
7294
7311
7318
7335
7343
7360
7367
7384
7391
7408
7415
7432
7439
7456
459009
n/a n/a GTTCCCGAGGTGCCCA 61 3-10-3 7270 7285 94
7295 7310
7319 7334
7344 7359
7368 7383
7392 7407
7416 7431
5
10
15
20
25
No. ISIS
Sitio de inicio de la SEQ ID NO:1 Sitio de terminación de la SEQ ID NO:1 Secuencia % de inhibición Motivo Sitio de inicio de la SEQ ID NO:2 Sitio de terminación de la SEQ ID NO:2 SEQ ID NO
7440 7455
459082
n/a n/a GGGTTCCCGAGGTGCCCA 91 4-10-4 7270 7287 95
7295
7312
7319
7336
7344
7361
7368
7385
7392
7409
7416
7433
7440
7457
459158
n/a n/a GGGTTCCCGAGGTGCCCAATA 94 5-10-6 7413 7433 96
459063
n/a n/a CCAGCTCTGTGGCTCAG 62 3-10-4 11818 11834 97
Ejemplo 3: Inhibición antisentido del receptor de glucagón humano (GCGR) en células HepG2
Se diseñaron oligonucleótidos antisentido adicionales dirigidos a un ácido nucleico de GCGR y se analizaron sus efectos sobre el ARNm de GCGR in vitro. También se analizó ISIS 315163. También se analizó ISIS 325568, que se ha descrito en una publicación anterior (documento WO 2007/035771). Las células HepG2 cultivadas a una densidad de 40.000 células por pocillo se transfectaron usando electroporación con oligonucleótido antisentido 2.000 nM. Tras un periodo de tratamiento de aproximadamente 24 horas se aisló el ARN de las células y se midieron los niveles de ARNm del GCGR mediante PCR cuantitativa en tiempo real usando el conjunto de sonda de cebador humano RTS1508. Los niveles de ARNm de GCGR se ajustaron de acuerdo con un contenido de ARN total medido mediante RIBOGREEN®. Los resultados se presentan en forma del porcentaje de inhibición de GCGR respecto a las células control sin tratar. Se aisló un total de 78 oligonucleótidos antisentido. Solo los oligonucleótidos que se seleccionaron para los ensayos de respuesta a la dosis se muestran en la Tabla 3.
Los oligonucleótidos antisentido quiméricos recién designados en la Tablas 3 se diseñaron como gapmeros 5-10-5 MOE. También se analizó ISIS 315163 (ACCTGGAAGCTGCTGTACAT (SEQ ID NO 79); el sitio de iniciación en la SEQ ID NO:1 es 702; el sitio de iniciación en la SEQ ID NO:2 es 13003), que se describió en una publicación anterior (documento WO 2004/096016). Cada nucleósido en el segmento de ala en 5' y cada nucleósido en el segmento de ala 3' tiene una modificación de 2'-MOE. Los enlaces internucleosídicos a lo largo de cada gapmero son enlaces fosforotioato (P = S). Todos los restos de citosina a lo largo de cada gapmero son 5-metilcitosinas. El "sitio de inicio” indica el nucleótido más 5' al que se dirige el gapmero en la secuencia génica humana. El "sitio de terminación” indica el nucleótido más 3' al que se dirige el gapmero en la secuencia génica humana. Cada gapmero enumerado en la Tabla 3 está dirigido al ARNm de GCGR humano, designado en el presente documento como SEQ ID NO: 1 (N.° de acceso de GENBANK NM_000160.3) o la secuencia genómica de GcGR humano, designada en el presente documento como SEQ ID NO: 2 (N.° de acceso en GENBANK NW_926918.l truncado de 19598000 a 16865000). 'n/a' indica que el oligonucleótido antisentido no se dirige a esa secuencia génica particular.
5
10
15
20
25
30
35
Tabla 3
Inhibición de los niveles de ARNm del GCGR humano mediante oligonucleótidos antisentido quiméricos dirigidos a la
SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 2
No. ISIS
Sitio de inicio de la SEQ ID NO:1 Sitio de terminación de la SEQ ID NO:1 Secuencia % de inhibición Motivo Sitio de inicio de la SEQ ID NO:2 Sitio de terminación de la SEQ ID NO:2 SEQ ID NO
315163
702 721 ACCTGGAAGCTGCTGTACAT 42 5-10-5 13003 13022 79
325568
548 567 GCACTTTGTGGTGCCAAGGC 58 2-16-2 n/a n/a 4
448754
n/a n/a CCTGGATTTTAGCCTCCTCC 79 5-10-5 9245 9264 98
448718
n/a n/a TGGGTCTCTGATAGTGAGGC 81 5-10-5 8030 8049 99
448730
n/a n/a GCTCAGCATCCACAGGCCAC 74 5-10-5 8141 8160 100
448738
n/a n/a GCCAAGCCTGGCTCTGCCCC 76 5-10-5 8454 8473 101
Ejemplo 4: Inhibición antisentido del receptor de glucagón humano (GCGR) en células HepG2
Se diseñaron oligonucleótidos antisentido adicionales dirigidos a un ácido nucleico de GCGR y se analizaron sus efectos sobre el ARNm de GCGR in vitro. También se analizaron ISIS 315163 e ISIS 325568. Las células HepG2 cultivadas a una densidad de 40.000 células por pocillo se transfectaron usando electroporación con oligonucleótido antisentido 5.000 nM. Tras un periodo de tratamiento de aproximadamente 24 horas se aisló el ARN de las células y se midieron los niveles de ARNm del GCGR mediante PCR cuantitativa en tiempo real usando el conjunto de sonda de cebador humano RTS1508. Los niveles de ARNm de GCGR se ajustaron de acuerdo con un contenido de ARN total medido mediante RIBOGREEN®. Los resultados se presentan en forma del porcentaje de inhibición de GCGR respecto a las células control sin tratar. Se aisló un total de 234 oligonucleótidos antisentido. Solo los oligonucleótidos que se seleccionaron para los ensayos de respuesta a la dosis se muestran en la Tabla 4.
Los oligonucleótidos antisentido quiméricos recién designados en la Tablas 4 se diseñaron como gapmeros 5-10-5 MOE. También se analizó ISIS 315163 (ACCTGGAAGCTGCTGTACAT (SEQ ID NO 79); el sitio de iniciación en la SEQ ID NO:1 es 702; el sitio de iniciación en la SEQ ID NO:2 es 13003), que se describió en una publicación anterior (documento WO 2004/096016). Cada nucleósido en el segmento de ala en 5' y cada nucleósido en el segmento de ala 3' tiene una modificación de 2'-MOE. Los enlaces internucleosídicos a lo largo de cada gapmero son enlaces fosforotioato (P = S). Todos los restos de citosina a lo largo de cada gapmero son 5-metilcitosinas. El "sitio de inicio” indica el nucleótido más 5' al que se dirige el gapmero en la secuencia génica humana. El "sitio de terminación” indica el nucleótido más 3' al que se dirige el gapmero en la secuencia génica humana. Cada gapmero enumerado en la Tabla 4 está dirigido al ARNm de GCGR humano, designado en el presente documento como SEQ ID NO: 1 (N.° de acceso de GENBANK NM_000160.3) o la secuencia genómica de GcGR humano, designada en el presente documento como SEQ ID NO: 2 (N.° de acceso en GENBANK NW_926918.l truncado de 19598000 a 16865000). 'n/a' indica que el oligonucleótido antisentido no se dirige a esa secuencia génica particular.
Tabla 4
Inhibición de los niveles de ARNm del GCGR humano por oligonucleótidos antisentido quiméricos dirigidos a la SEQ
ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 2
No. ISIS
Sitio de inicio de la SEQ ID NO:1 Sitio de terminación de la SEQ ID NO:1 Secuencia % de inhibición Motivo Sitio de inicio de la SEQ ID NO:2 Sitio de terminación de la SEQ ID NO:2 SEQ ID NO
315163
702 721 ACCTGGAAGCTGCTGTACAT 71 5-10-5 13003 13022 79
325568
548 567 GCACTTTGTGGTGCCAAGGC 79 2-16-2 n/a n/a 4
5
10
15
20
25
436140
2015 2034 CTCTTTATTGTTGGAGGACA 93 5-10-5 15743 15762 102
398455
2014 2033 TCTTTATTGTTGGAGGACAT 89 5-10-5 15742 15761 103
398470
n/a n/a CCACAGGCCACAGGTGGGCT 85 5-10-5 8132 8151 104
398491
n/a n/a AGCCAGGTGAGCAGCCATGC 81 5-10-5 9008 9027 105
398501
n/a n/a AAGTGTCCAGGCCATGATAT 84 5-10-5 12025 12044 106
398503
n/a n/a CCAAGTGTCCAGGCCATGAT 92 5-10-5 12027 12046 107
398506
n/a n/a ACCCCAAGTGTCCAGGCCAT 89 5-10-5 12030 12049 108
398507
n/a n/a GCACCCCAAGTGTCCAGGCC 97 5-10-5 12032 12051 109
398508
n/a n/a TGCACCCCAAGTGTCCAGGC 87 5-10-5 12033 12052 110
304535
1988 2007 GCACATGGGACGTGCCGACA 98 5-10-5 15716 15735 111
304538
2016 2035 GCTCTTTATTGTTGGAGGAC 95 5-10-5 15744 15763 112
304539
2018 2037 GAGCTCTTTATTGTTGGAGG 92 5-10-5 15746 15765 113
436141
2017 2036 AGCTCTTTATT GTTGGAGGA 93 5-10-5 15745 15764 114
436164
n/a n/a GGTTCCCGAGGTGCCCAATG 92 5-10-5 7267 7286 115
7292 7311
7316 7335
7341 7360
7365 7384
7389 7408
7437 7456
Ejemplo 5: Inhibición antisentido dependiente de la dosis del GCGR humano en hepatocitos primarios de mono cinomolgo
Los gapmeros del Ejemplo 1 que exhiben inhibición significativa in vitro del GCGR humano se analizó en diversas condiciones en hepatocitos primarios de cinomolgo. Las células se sembraron a una densidad de 24.000 células por pocillo y se transfectaron mediante electroporación con concentraciones de oligonucleótido antisentido de 0,4 jM, 1,1 jM, 3,3 jM y 10,0 jM, como se especifica en la Tabla 5. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 16 horas, el ARN aislado de las células y los niveles de ARNm del GCGR se midieron mediante PCR cuantitativa en tiempo real. El conjunto de sonda de cebador DE GCGR humano RTS1508 se usó para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de GCGR se ajustaron de acuerdo con un contenido de ARN total medido mediante RIBOGREEN®. Los resultados se presentan en forma del porcentaje de inhibición de GCGR respecto a las células control sin tratar.
La concentración inhibitoria semimáxima (CI50) de cada oligonucleótido también se presenta en la Tabla 5 y se calculó representando las concentraciones de oligonucleótidos utilizadas frente al porcentaje de inhibición de la expresión de ARNm de GCGR logrado en cada concentración, y observando la concentración de oligonucleótido a la que se logró una inhibición del 50 % en comparación con el control. Como se ilustra en la Tabla 5, los niveles de ARNm del GCGR se redujeron significativamente de una manera dependiente de la dosis en células tratadas con oligonucleótidos antisentido
Tabla 5
Inhibición antisentido dependiente de la dosis del GCGR humano en hepatocitos primarios de mono cinomolgo
usando electroporación
ISIS No
0,4 pM 1,1 pM 3,3 pM 10,0 pM CI50 (pM)
315163
23 39 73 88 2,0
398457
64 69 71 68 <0,3
449759
24 47 75 85 1,3
449760
43 49 77 86 0,7
449797
38 54 69 93 0,8
449819
30 36 56 85 1,7
ISIS No
0,4 pM 1,1 pM 3,3 pM 10,0 pM CI50 (pM)
449823
29 31 43 82 2,5
449836
29 37 62 85 1,6
449851
14 36 73 93 1,6
449856
0 39 70 88 2,1
449858
16 27 65 86 2,1
449859
57 76 92 96 <0,3
449860
41 66 86 91 0,5
449881
27 49 67 70 1,5
449882
33 33 53 71 2,3
449883
63 66 75 76 <0,3
449884
64 77 74 71 <0,3
449885
67 74 71 76 <0,3
449894
55 56 74 78 <0,3
449895
44 60 71 72 0,5
449905
47 59 65 69 0,4
449906
52 66 75 80 <0,3
449907
35 36 62 70 1,8
449908
21 48 67 69 1,8
449910
7 16 51 61 4,8
449912
21 45 66 60 2,3
449916
16 40 55 55 3,9
449917
45 67 72 71 0,3
449922
39 48 60 67 1,3
449938
5 22 44 41 >10,0
449944
6 0 25 62 7,0
449945
22 36 57 64 2,8
449948
0 19 45 60 5,2
449949
0 16 41 52 7,8
449951
26 40 55 61 2,9
449952
21 28 52 62 3,8
449953
15 22 49 59 4,8
449954
0 53 60 58 3,4
449955
30 43 61 66 1,9
449956
10 40 52 64 3,3
449958
17 46 54 67 2,6
449960
10 22 46 63 4,7
449967
0 16 36 49 9,8
450035
0 35 41 60 5,0
450039
18 30 51 60 4,2
450040
0 21 41 66 4,7
450049
22 27 59 68 2,9
450050
28 22 49 61 4,7
450054
0 11 22 25 >10,0
5
10
15
20
25
30
35
ISIS No
0,4 pM 1,1 pM 3,3 pM 10,0 pM CI50 (pM)
450059
11 41 64 78 2,1
450061
13 29 49 60 4,4
450074
15 27 40 61 5,4
Ejemplo 6: Inhibición antisentido dependiente de la dosis del GCGR humano en células HepG2
Los gapmeros del ejemplo 5 que exhiben inhibición significativa in vitro del ARNm del GCGR se analizaron a diversas dosis en células HepB2. Las células se sembraron a una densidad de 40.000 células por pocillo y se transfectaron mediante electroporación con concentraciones de oligonucleótido antisentido de 0,12 jM, 0,37 jM, 1,11 jM, 3,33 jM y 10,00 jM como se especifica en la Tabla 6. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 16 horas, el ARN aislado de las células y los niveles de ARNm del GCGR se midieron mediante PCR cuantitativa en tiempo real. El conjunto de sonda de cebador DE GCGR humano RTS1508 se usó para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de GCGR se ajustaron de acuerdo con un contenido de ARN total medido mediante RIBOGREEN®. Los resultados se presentan en forma del porcentaje de inhibición de GCGR respecto a las células control sin tratar.
La concentración inhibitoria semimáxima (CI50) de cada oligonucleótido se presenta también en la Tabla 6. Como se ilustra en la Tabla 6, los niveles de ARNm de GCGR se redujeron significativamente de una manera dependiente de la dosis en células tratadas con oligonucleótidos antisentido.
Tabla 6
Inhibición antisentido dependiente de la dosis del GCGR humano en células HepG2 usando electroporación
ISIS No
0,12 pM 0,37 pM 1,11 pM 3,33 pM 10,00 pM CI50 (pM)
315163
0 3 26 62 88 2,2
398457
47 81 94 97 97 <0,1
449760
0 26 64 91 97 0,8
449797
0 16 42 84 95 1,2
449819
0 17 40 79 93 1,3
449851
4 28 65 94 97 0,7
449859
36 51 89 95 95 0,2
449860
30 53 77 86 94 0,3
449882
0 19 57 85 97 1,0
449883
7 49 84 92 96 0,5
449884
67 87 95 94 97 <0,1
449885
44 83 77 97 95 <0,1
449894
1 34 78 87 98 0,7
449895
0 31 29 84 95 1,1
449906
12 26 67 93 95 0,7
Ejemplo 7: Inhibición antisentido dependiente de la dosis del GCGR humano en células HepG2
Los gapmeros del ejemplo 5 que exhiben inhibición significativa in vitro del ARNm del GCGR se seleccionaron analizaron adicionalmente a diversas dosis en células HepB2. Las células se sembraron a una densidad de 40.000 células por pocillo y se transfectaron mediante electroporación con concentraciones de oligonucleótido antisentido de 0,04 |jM, 0,12 |jM, 0,37 |jM, 1,11 |jM, 3,33 |jM y 10,00 |jM como se especifica en la Tabla 7. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 16 horas, el ARN aislado de las células y los niveles de ARNm del GCGR se midieron mediante PCR cuantitativa en tiempo real. El conjunto de sonda de cebador DE GCGR humano RTS1508 se usó para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de GCGR se ajustaron de acuerdo con un contenido de ARN total medido mediante RIBOGREEN®. Los resultados se presentan en forma del porcentaje de inhibición de GCGR respecto a las células control sin tratar.
La concentración inhibitoria semimáxima (CI50) de cada oligonucleótido se presenta también en la Tabla 7. Los niveles de ARNm de GCGR se redujeron significativamente de una manera dependiente de la dosis en células tratadas con oligonucleótidos antisentido. 'n/a' indica que no hay datos para el oligonucleótido ISIS para dicha
5
10
15
20
25
concentración en particular. ISIS 398457, ISIS 449884 e ISIS 449954, que causaron una reducción significativa de los niveles de ARNm de GCGR, se seleccionaron para estudios adicionales. Significativamente, ISIS 449884 demostró una CI50 de diez a cincuenta veces más baja que el ISIS 315163 de referencia en estudios comparativos presentados en los ejemplos 5-7.
Tabla 7
Inhibición antisentido dependiente de la dosis del GCGR humano en células HepG2 usando electroporación
ISIS No
0,04 pM 0,12 pM 0,37 pM 1,11 pM 3,33 pM 10,00 pM CI50 (pM)
315163
22 9 22 45 67 93 1,5
398457
36 62 88 99 99 100 0,1
449856
8 24 49 73 92 95 0,4
449858
28 27 41 80 93 97 0,3
449859
16 40 72 89 97 98 0,2
449860
32 38 46 78 94 98 0,2
449883
25 27 68 92 98 100 0,2
449884
42 59 93 99 100 n/a <0,04
449885
18 60 84 97 98 n/a 0,1
449894
8 31 44 83 96 99 0,3
449951
0 32 62 86 98 99 0,4
449954
9 40 57 86 99 99 0,2
Ejemplo 8: Inhibición antisentido dependiente de la dosis del GCGR humano en hepatocitos primarios de mono cinomolgo
Los gapmeros de los estudios descritos en los Ejemplos 1-7 se analizaron adicionalmente a varias dosis en hepatocitos primarios de cinomolgo. Las células se sembraron a una densidad de 35.000 células por pocillo y se transfectaron usando electroporación con concentraciones de 750 nM, 1.500 nM, 3.000 nM, 6.000 nM y 12.000 del oligonucleótido antisentido, como se especifica en la Tabla 8. Tras un periodo de tratamiento de aproximadamente 16 horas, el ARN se aisló de las células y los niveles de ARNm de GCGR se midieron mediante PCR cuantitativa en tiempo real. El conjunto de sonda de cebador DE GCGR humano RTS1508 se usó para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de GCGR se ajustaron de acuerdo con un contenido de ARN total medido mediante RIBOGREEN®. Los resultados se presentan en forma del porcentaje de inhibición de GCGR respecto a las células control sin tratar. Como se ilustra en la Tabla 8, los niveles de ARNm del GCGR se redujeron significativamente en células tratadas con oligonucleótidos antisentido
Tabla 8
Inhibición antisentido dependiente de la dosis del GCGR humano en hepatocitos primarios de mono cinomolgo
usando electroporación
N° ISIS
750,0 nM 1500,0 nM 3000,0 nM 6000,0 nM 12000,0 nM
398457
85 89 92 89 85
398471
78 85 87 85 87
436140
81 93 96 97 96
448754
44 59 80 80 81
448766
79 90 88 87 83
448818
19 13 58 64 76
449884
89 92 89 87 90
459014
51 63 79 82 84
459032
78 85 88 88 87
459040
70 77 81 89 83
459046
34 38 65 61 80
459076
31 39 67 79 77
5
10
15
20
25
30
35
40
45
459157
89 87 88 88 86
Ejemplo 9: Inhibición antisentido dependiente de la dosis del GCGR humano en hepatocitos primarios de mono cinomolgo
Los gapmeros del ejemplo 8 que exhiben inhibición significativa in vitro del GCGR humano se seleccionaron y analizaron adicionalmente a diversas dosis en hepatocitos primarios de cinomolgo. También se analizó ISIS 325568 (GCACTTTGTGGTGCCAAGGC (SEQ ID NO:4), el sitio de iniciación diana 548 en la SEQ ID NO:1), que se describió en una publicación anterior (BIOL066USL). Las células se sembraron a una densidad de 35.000 células por pocillo y se transfectaron mediante electroporación con concentraciones de oligonucleótido antisentido de 0,006 |jM, 0,020 |jM, 0,063 |jM, 0,200 |jM, 0,632 |jM, 2,000 |jM, 6,325 |jM, y 20,000 |jM como se especifica en la Tabla 9. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 16 horas, el ARN aislado de las células y los niveles de ARNm del GCGR se midieron mediante PCR cuantitativa en tiempo real. El conjunto de sonda de cebador DE GCGR humano RTS 1508 se usó para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de GCGR se ajustaron de acuerdo con un contenido de ARN total medido mediante RIBOGREEN®. Los resultados se presentan en forma del porcentaje de inhibición de GCGR respecto a las células control sin tratar.
La concentración inhibitoria semimáxima (CI50) de cada oligonucleótido se presenta también en la Tabla 9. Los niveles de ARNm de GCGR se redujeron significativamente de una manera dependiente de la dosis en células tratadas con oligonucleótidos antisentido.
Tabla 9
Inhibición antisentido dependiente de la dosis del GCGR humano en hepatocitos primarios de mono cinomolgo
usando electroporación
N° ISIS
0,006 pM 0,020 pM 0,063 pM 0,200 pM 0,632 pM 2.000 pM 6.325 pM 20.000 pM CI50 (pM
325568
0 0 0 0 0 42 75 93 3,1
398471
0 4 7 24 62 65 65 59 0,4
448766
5 0 0 2 28 51 57 34 0,6
449884
0 12 61 59 71 68 72 62 0,1
459014
1 0 2 23 15 47 69 74 2,6
459032
0 6 4 33 55 68 72 61 0,5
459157
0 12 29 69 69 72 73 62 0,1
En base a los datos de inhibición, se seleccionaron ISIS 398471, ISIS 448766, ISIS 449884, ISIS 459014, ISIS 459032 e ISIS 459157 para las pruebas in vivo en un modelo de ratón.
Ejemplo 10: Inhibición antisentido dependiente de la dosis del GCGR humano en células HepG2
Los gapmeros de los estudios descritos en los Ejemplos 1, 4 y 9 se analizaron adicionalmente a varias dosis en células HepG2. Las células se sembraron a una densidad de 40.000 células por pocillo y se transfectaron mediante electroporación con concentraciones de oligonucleótido antisentido de 0,12 pM, 0,37 pM, 1,11 pM, 3,33 pM y 10,00 |jM como se especifica en la Tabla 10. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 16 horas, el ARN aislado de las células y los niveles de ARNm del GCGR se midieron mediante PCR cuantitativa en tiempo real. El conjunto de sonda de cebador DE GCGR humano RTS1508 se usó para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de GCGR se ajustaron de acuerdo con un contenido de ARN total medido mediante RIBOGREEN®. Los resultados se presentan en forma del porcentaje de inhibición de GCGR respecto a las células control sin tratar. Como se ilustra en la Tabla 10, los niveles de ARNm del GCGR se redujeron significativamente en células tratadas con oligonucleótidos antisentido
Tabla 10
Inhibición antisentido dependiente de la dosis del GCGR humano en células HepG2 usando electroporación
N° ISIS
0,12 pM 0,37 pM 1,11 pM 3,33 pM 10,00 pM CI50 (pM
398455
35 57 81 94 94 0,2
398457
33 79 91 97 98 0,1
398470
37 48 86 92 96 0,2
398471
33 50 86 92 87 0,2
5
10
15
20
25
30
35
398486
50 47 85 91 98 0,1
398491
25 61 73 96 92 0,3
398501
35 43 85 98 98 0,3
398503
21 58 80 97 99 0,3
398504
51 57 91 92 98 0,1
398506
40 71 96 98 99 0,1
398507
59 85 97 98 n/a <0,1
398508
22 48 90 94 98 0,3
398585
25 57 84 88 93 0,3
436034
34 56 61 81 92 0,3
En base a los resultados de inhibición, se seleccionaron ISIS 398457, ISIS 398471, ISIS 398486, ISIS 398491, ISIS 398506, ISIS 398507, ISIS 398508 e ISIS 436034 para analizar en un modelo de ratón.
Ejemplo 11: Inhibición antisentido dependiente de la dosis del GCGR humano en células HepG2
Los gapmeros del estudio descrito en el Ejemplo 4 se analizaron adicionalmente a varias dosis en células HepG2. Las células se sembraron a una densidad de 40.000 células por pocillo y se transfectaron mediante electroporación con concentraciones de oligonucleótido antisentido de 0,04 pM, 0,12 pM, 0,37 pM, 1,11 pM, 3,33 pM y 10,00 pM como se especifica en la Tabla 11. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 16 horas, el ARN aislado de las células y los niveles de ARNm del GCGR se midieron mediante PCR cuantitativa en tiempo real. El conjunto de sonda de cebador DE GCGR humano RTS1508 se usó para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de GCGR se ajustaron de acuerdo con un contenido de ARN total medido mediante RIBOGREEN®. Los resultados se presentan en forma del porcentaje de inhibición de GCGR respecto a las células control sin tratar. Los niveles de ARNm de GCGR se redujeron significativamente en las células tratadas con oligonucleótido antisentido.
Tabla 11
Inhibición antisentido dependiente de la dosis del GCGR humano en células HepG2 usando electroporación
N° ISIS
0,04 pM 0,12 pM 0,37 pM 1,11 pM 3,33 pM 10,00 pM CI50 (pM
304535
21 31 55 90 99 96 0,2
304538
27 42 73 91 100 95 0,1
304539
15 33 56 87 95 93 0,3
436140
4 27 57 85 94 95 0,3
436141
19 27 64 84 92 95 0,3
436164
12 37 75 94 94 96 0,2
En base a los resultados de la inhibición, se seleccionaron ISIS 304538, ISIS 304539, ISIS 436140 e ISIS 436141 para analizar en un modelo de ratón.
Ejemplo 12: Inhibición antisentido dependiente de la dosis del GCGR humano en células HepG2
Los gapmeros del estudio descritos en los Ejemplos 1, 3, 8 y 9 se analizaron adicionalmente a varias dosis en células HepG2. Las células se sembraron a una densidad de 40.000 células por pocillo y se transfectaron mediante electroporación con concentraciones de oligonucleótido antisentido de 0,12 |jM, 0,37 |jM, 1,11 |jM, 3,33 |jM y 10,00 |jM como se especifica en la Tabla 12. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 16 horas, el ARN aislado de las células y los niveles de ARNm del GCGR se midieron mediante PCR cuantitativa en tiempo real. El conjunto de sonda de cebador DE GCGR humano RTS1508 se usó para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de GCGR se ajustaron de acuerdo con un contenido de ARN total medido mediante RIBOGREEN®. Los resultados se presentan en forma del porcentaje de inhibición de GCGR respecto a las células control sin tratar. Los niveles de ARNm de GCGR se redujeron significativamente en las células tratadas con oligonucleótido antisentido.
Tabla 12
Inhibición antisentido dependiente de la dosis del GCGR humano en células HepG2 usando electroporación
N° ISIS
0,12 pM 0,37 pM 1,11 pM 3,33 pM 10,00 pM CI50 (pM
448718
35 64 74 90 92 0,2
448730
44 67 87 94 85 0,1
448738
31 52 75 95 97 0,3
448754
40 47 81 95 96 0,3
448762
43 62 75 96 97 0,2
448766
36 59 88 94 85 0,2
448799
42 53 92 96 99 0,2
448802
43 70 88 97 93 0,1
448806
39 60 82 97 96 0,2
448817
35 62 95 88 92 0,2
448818
29 52 74 97 98 0,3
448819
73 89 97 n/a 93 <0,1
448840
31 58 80 83 98 0,3
448848
71 92 98 98 99 <0,1
448850
54 60 74 88 94 <0,1
448860
41 58 73 92 98 0,2
448890
49 60 83 94 99 0,1
448897
50 52 80 92 97 0,2
448901
29 58 81 91 99 0,3
448903
32 48 73 91 99 0,3
448905
43 49 76 89 97 0,2
5
En base a los resultados de inhibición, se ISIS 448718, ISIS 448730, ISIS 448754, ISIS 448766, ISIS 448817, ISIS 448818, ISIS 448819, ISIS 448848, ISIS 448860 e ISIS 448890 para analizar en un modelo de ratón.
Ejemplo 13: Inhibición antisentido dependiente de la dosis del GCGR humano en células HepG2
10
Los gapmeros del estudio descritos en los Ejemplos 1, 2, 8 y 9 se analizaron adicionalmente a varias dosis en células HepG2. Las células se sembraron a una densidad de 40.000 células por pocillo y se transfectaron mediante electroporación con concentraciones de oligonucleótido antisentido de 0,12 pM, 0,37 pM, 1,11 pM, 3,33 pM y 10,00 |jM como se especifica en la Tabla 13. Después de un período de tratamiento de aproximadamente 16 horas, el 15 ARN aislado de las células y los niveles de ARNm del GCGR se midieron mediante PCR cuantitativa en tiempo real. El conjunto de sonda de cebador DE GCGR humano RTS1508 se usó para medir los niveles de ARNm. Los niveles de ARNm de GCGR se ajustaron de acuerdo con un contenido de ARN total medido mediante RIBOGREEN®. Los resultados se presentan en forma del porcentaje de inhibición de GCGR respecto a las células control sin tratar. Los niveles de ARNm de GCGR se redujeron significativamente en las células tratadas con oligonucleótido antisentido.
20
Tabla 13
Inhibición antisentido dependiente de la dosis del GCGR humano en células HepG2 usando electroporación
N° ISIS
0,12 pM 0,37 pM 1,11 pM 3,33 pM 10,00 pM CI50 (pM
398457
62 84 95 98 97 <0,1
459009
26 47 80 96 97 0,3
459010
56 90 96 98 97 <0,1
459011
46 81 97 95 96 <0,1
459024
29 56 74 89 95 0,3
5
10
15
20
25
30
459032
40 61 74 97 98 0,2
459040
48 65 84 96 95 0,1
459046
36 54 77 96 98 0,2
459058
21 46 88 95 98 0,3
459063
34 42 79 97 99 0,3
459076
32 72 84 98 99 0,1
459082
46 71 92 97 97 0,1
459083
53 71 90 96 97 <0,1
459086
24 72 92 96 97 0,2
459087
23 67 94 97 98 0,2
459088
34 61 86 95 98 0,2
459157
50 74 92 97 97 <0,1
459158
54 81 94 97 99 <0,1
En base a los resultados de la inhibición, se seleccionaron ISIS 459024, ISIS 459032, ISIS 459040, ISIS 459046, ISIS 459076, e ISIS 459157 para analizar en un modelo de ratón.
Ejemplo 14: Tolerabilidad de oligonucleótidos antisentido dirigidos al GCGR humano en ratones CD1
Los ratones CD1® (Charles River, MA) son un modelo de ratón multipropósito, frecuentemente utilizado para pruebas de seguridad y eficacia. Los ratones se trataron con oligonucleótidos antisentido ISIS seleccionados de los estudios descritos anteriormente y se evaluaron los cambios en los niveles de diversos marcadores de química plasmática.
Tratamiento
A grupos de ratones CD1 machos de seis semanas se inyectó por vía subcutánea dos veces por semana durante 6 semanas 50 mg/kg de ISIS 304538, ISIS 304539, ISIS 325568, ISIS 398457, ISIS 398471, ISIS 398486, ISIS

398491, ISIS 398506, ISIS 398507, ISIS 398508, ISIS 436034, ISIS 436140, ISIS 436141, ISIS 448718, ISSI

448730, ISIS 448754, ISIS 448766, ISIS 448817, ISIS 448818, ISIS 448819, ISIS 448848, ISIS 448860, ISIS

448890, ISIS 449884, ISIS 449954, ISIS 449956, ISIS 459014, ISIS 459024, ISIS 459032, ISIS 459040, ISIS
459046, ISIS 459076 e ISIS 459157. Se inyectó a un grupo de ratones CD1 macho de seis semanas de edad por vía subcutánea dos veces a la semana durante 6 semanas con PBS. Se sacrificó a los ratones 48 horas después de la última dosis, y los órganos y el plasma se recogieron para un análisis posterior. Marcadores de química plasmática
Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos ISIS sobre la función hepática y renal, se midieron los niveles plasmáticos de transaminasas, bilirrubina, albúmina y BUN usando un analizador químico clínico automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Los resultados se presentan en la Tabla 14. Los oligonucleótidos ISIS que causaron cambios en los niveles de cualquiera de los marcadores de función hepática o renal fuera del intervalo esperado para los oligonucleótidos antisentido se excluyeron en estudios posteriores.
Tabla 14
Efecto del tratamiento con oligonucleótidos antisentido en marcadores de química plasmática en plasma de ratones
CD 1 en la semana 6
ALT (UI/l) AST (UI/l) Bilirrubina (mg/dl) Albúmina (mg/dl) BUN (mg/dl)
PBS
26 37 0,20 3,2 24
ISIS 304538
71 93 0,18 3,4 24
ISIS 304539
151 126 0,21 3,4 22
ISIS 325568
47 67 0,20 3,1 18
ISIS 398457
26 45 0,28 3,6 25
ISIS 398471
33 46 0,21 3,6 28
ISIS 398486
447 381 0,22 3,5 28
ALT (UI/l) AST (UI/l) Bilirrubina (mg/dl) Albúmina (mg/dl) BUN (mg/dl)
ISIS 398491
56 54 0,20 3,3 28
ISIS 398506
884 823 0,35 3,4 25
ISIS 398507
2381 895 0,28 3,9 24
ISIS 398508
643 227 0,20 3,4 25
ISIS 436034
1481 696 0,38 3,4 23
ISIS 436140
40 62 0,20 3,0 25
ISIS 436141
232 163 0,20 3,3 21
ISIS 448718
378 221 0,20 2,9 25
ISIS 448730
852 398 1,40 3,5 27
ISIS 448754
71 84 0,20 3,4 28
ISIS 448766
47 46 0,26 3,5 23
ISIS 448817
211 144 0,25 3,6 24
ISIS 448818
33 52 0,17 3,1 23
ISIS 448819
196 188 0,25 3,5 23
ISIS 448848
1677 855 0,61 3,1 17
ISIS 448860
951 536 0,22 3,3 20
ISIS 448890
402 345 0,17 3,0 18
ISIS 449884
38 51 0,23 3,5 23
ISIS 449954
1465 1229 0,28 3,7 23
ISIS 449956
55 63 0,17 2,9 21
ISIS 459014
27 50 0,17 3,2 22
ISIS 459024
52 54 0,23 3,3 22
ISIS 459032
50 55 0,22 3,2 21
ISIS 459040
37 70 0,14 3,1 22
ISIS 459046
41 81 0,19 3,0 20
ISIS 459076
33 50 0,21 3,0 22
ISIS 459157
25 43 0,21 3,2 21
Ejemplo 15: Tolerabilidad de oligonucleótidos antisentido dirigidos al GCGR humano en ratas Sprague- Dawley
5 Las ratas Sprague-Dawley son un modelo multipropósito utilizado para evaluaciones de seguridad y eficacia. Se trató a las ratas con oligonucleótidos antisentido ISIS seleccionados el estudio descrito en el ejemplo 14 y se evaluaron los cambios en los niveles de diversos marcadores de química plasmática.
Tratamiento
10
Se mantuvieron las ratas macho Sprague-Dawley de siete semanas de edad en un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas y se alimentaron ad libitum con pienso normal para ratas Purina, dieta 5001. A grupos de cuatro ratas Sprague-Dawley se inyectó por vía subcutánea dos veces a la semana durante 4 semanas con 50 mg/kg de ISIS

304538, ISIS 304539, ISIS 325568, ISIS 398457, ISIS 398471, ISIS 398486, ISIS 398491, ISIS 398506, ISIS

15 398507, ISIS 398508, ISIS 436034, ISIS 436140, ISIS 436141, ISIS 448718, ISSI 448730, ISIS 448754, ISIS

448766, ISIS 448817, ISIS 448818, ISIS 448819, ISIS 448848, ISIS 448860, ISIS 448890, ISIS 449884, ISIS
449954, ISIS 449956, ISIS 459014, ISIS 459024, ISIS 459032, ISIS 459040, ISIS 459046, ISIS 459076 e ISIS 459157. Cuarenta y ocho horas después de la última dosis, se sacrificó a las ratas y se extrajeron los órganos y el plasma para su posterior análisis.
Función hepática
Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos ISIS sobre la función hepática, se midieron los niveles plasmáticos de transaminasas, usando un analizador químico clínico automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Se 5 midieron los niveles plasmáticos de ALT (alanina transaminasa) y AST (aspartato transaminasa) y los resultados se presentan en la Tabla 16 expresados en UI/l. Los niveles plasmáticos de bilirrubina también se midieron usando el mismo analizador de química clínica y los resultados también se presentan en la Tabla 16. ALT y AST también se expresaron como aumento de veces sobre el control de PBS y se presentan en la Tabla 17. Los oligonucleótidos ISIS que causaron cambios en los niveles de cualquier marcador de función hepática fuera del intervalo esperado 10 para los oligonucleótidos antisentido se excluyeron en estudios posteriores.
Tabla 16
Efecto del tratamiento con oligonucleótidos antisentido sobre la función hepática en ratas Sprague-Dawley
ALT (UI/l) AST (UI/l) Bilirrubina (mg/dl)
PBS
49 74 0,13
ISIS 304538
127 206 0,17
ISIS 304539
48 70 0,10
ISIS 325568
66 89 0,13
ISIS 398457
59 98 0,10
ISIS 398471
57 78 0,10
ISIS 398486
778 734 0,28
ISIS 398491
121 211 0,13
ISIS 398506
236 287 0,57
ISIS 398507
424 231 0,25
ISIS 398508
305 302 0,31
ISIS 436034
338 385 0,30
ISIS 436140
58 92 0,13
ISIS 436141
55 108 0,15
ISIS 448718
99 115 0,13
ISIS 448730
92 110 0,13
ISIS 448754
131 79 0,10
ISIS 448766
70 102 0,10
ISIS 448817
102 169 0,16
ISIS 448818
92 188 0,19
ISIS 448819
261 211 0,11
ISIS 448848
105 125 0,14
ISIS 448860
203 248 0,79
ISIS 448890
224 204 0,22
ISIS 449884
134 121 0,15
ISIS 449954
548 706 1,19
ISIS 449956
100 133 0,21
ISIS 459014
64 138 0,16
ISIS 459024
150 182 2,38
ISIS 459032
109 109 0,11
ISIS 459040
67 95 0,11
ISIS 459046
60 127 0,09
ISIS 459076
57 114 0,14
ISIS 459157
52 85 0,15
Tabla 17
Aumento sobre el control de PBS de ALT y AST en grupos de tratamiento de ratas Sprague-Dawley
NO. ISIS
ALT AST
304538
4,1 3,6
304539
0,8 0,8
325568
1,2 1,4
398457
0,9 1,1
398471
0,9 0,9
398486
12,2 8,3
398491
1,9 2,4
398506
7,6 5,0
398507
13,6 4,0
398508
9,8 5,3
436034
10,8 6,7
436140
1,9 1,6
436141
1,8 1,9
448718
3,2 2,0
448730
1,4 1,2
448754
2,1 0,9
448766
1,1 1,2
448817
2,0 2,4
448818
1,9 2,4
448819
5,0 3,0
448848
2,0 1,8
448860
4,1 3,2
448890
4,5 2,6
449884
2,6 1,7
449954
11,1 9,0
449956
2,0 1,7
459014
1,3 1,8
459024
3,1 2,3
459032
2,1 1,6
459040
1,3 1,4
459046
1,1 1,8
459076
1,2 1,5
459157
1,0 1,2
5
Función renal
Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos ISIS sobre la función renal, se midieron los niveles plasmáticos de nitrógeno ureico en sangre (BUN) y creatinina, usando un analizador químico clínico automatizado (Hitachi Olympus 10 AU400e, Melville, NY). Los resultados se presentan en la Tabla 18, expresados en mg/dl.
Tabla 18
Efecto del tratamiento con oligonucleótidos antisentido sobre los marcadores de función renal (mg/dl) en ratas
Sprague-Dawley
BUN (mg/dl) Creatinina (mg/dl)
PBS
16 0,27
ISIS 304538
18 0,35
ISIS 304539
21 0,32
ISIS 325568
15 0,31
ISIS 398457
18 0,32
ISIS 398471
19 0,33
ISIS 398486
20 0,34
ISIS 398491
21 0,32
ISIS 398506
18 0,44
ISIS 398507
16 0,33
ISIS 398508
18 0,41
ISIS 436034
17 0,33
ISIS 436140
16 0,42
ISIS 436141
25 0,42
ISIS 448718
17 0,4
ISIS 448730
21 0,35
ISIS 448754
23 0,36
ISIS 448766
21 0,35
ISIS 448817
17 0,33
ISIS 448818
20 0,52
ISIS 448819
16 0,31
ISIS 448848
19 0,34
ISIS 448860
25 0,38
ISIS 448890
19 0,39
ISIS 449884
16 0,34
ISIS 449954
19 0,45
ISIS 449956
30 0,52
ISIS 459014
20 0,45
ISIS 459024
25 0,59
ISIS 459032
13 0,22
ISIS 459040
21 0,33
ISIS 459046
19 0,3
ISIS 459076
21 0,39
ISIS 459157
17 0,31
5
Ejemplo 16: Tolerabilidad de oligonucleótidos antisentido dirigidos al GCGR humano en ratas CD/IGS
Las ratas CD/IGS son un modelo multipropósito utilizado para evaluaciones de seguridad y eficacia. Se trató a las ratas con oligonucleótidos antisentido ISIS seleccionados el estudio descrito en los ejemplos 14 y 15 y se evaluaron 10 los cambios en los niveles de diversos marcadores de química plasmática.
5
10
15
20
25
30
35
Tratamiento
Se mantuvieron ratas CD/IGS macho de diez y doce semanas de edad en un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas y se alimentaron ad libitum con pienso normal para ratas Purina, dieta 5001. A grupos de cuatro ratas CD/IGS se inyectó por vía subcutánea dos veces a la semana durante 13 semanas 30 mg/kg de ISIS 325568, ISIS 398471, ISIS 436140, ISIS 448766, ISIS 449884, ISIS 459014, ISIS 459032, ISIS 459040 e ISIS 459157. Se extrajeron muestras de sangre a varios puntos de tiempo. Cuarenta y ocho horas después de la última dosis, se tomaron los pesos corporales, se sacrificó a las ratas y se extrajeron los órganos y el plasma para su posterior análisis.
Pesos de los órganos
Se midieron los pesos del hígado, corazón, pulmones, bazo y riñón al final del estudio, y se presentan en la Tabla 19. Los oligonucleótidos ISIS que causaron cualquier cambio en el peso de los órganos fuera del intervalo esperado para los oligonucleótidos antisentido se excluyeron de estudios posteriores.
Tabla 19
Peso de los órganos de ratas CD/IGS después del tratamiento con oligonucleótidos antisentido en la semana 13
expresado en gramos (g)
Corazón Hígado Pulmón Bazo Riñón
PBS
1,8 21,3 1,9 1,0 4,1
ISIS 325568
1,3 16,9 2,6 2,1 3,6
ISIS 398471
1,6 19,8 2,1 1,6 3,3
ISIS 436140
1,4 22,7 2,4 2,4 4,9
ISIS 448766
1,5 22,6 2,2 2,3 3,4
ISIS 449884
1,6 19,0 2,0 1,3 3,3
ISIS 459014
1,6 16,4 1,9 1,0 3,2
ISIS 459032
1,6 33,3 2,8 6,1 4,0
ISIS 459040
1,5 18,7 2,7 2,3 4,5
ISIS 459157
1,4 19,4 2,1 1,5 3,3
Función hepática
Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos ISIS sobre la función hepática, se midieron los niveles de diversos marcadores de química plasmática en la semana 8,5 (día 57) y la semana 13 (día 90) usando un analizador químico clínico automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Se midieron los niveles plasmáticos de ALT (alanina transaminasa) y AST (aspartato transaminasa) y los resultados se presentan en las Tabla 20 y 21 expresados en UI/l. Los niveles plasmáticos de bilirrubina y BUN también se midieron usando el mismo analizador de química clínica y los resultados también se presentan en las Tablas 20 y 21. Los oligonucleótidos ISIS que causaron cambios en los niveles de cualquier marcador de función hepática fuera del intervalo esperado para los oligonucleótidos antisentido se excluyeron en estudios posteriores.
Tabla 20
Efecto del tratamiento con oligonucleótidos antisentido sobre los marcadores de función hepática en ratas CD/IGS el
día 57
ALT UI/l AST UI/l Bilirrubina mg/dl BUN mg/dl
Solución salina
28 48 0,12 12,7
325568
38 59 0,09 16,7
398471
29 49 0,10 10,4
436140
28 45 0,08 11,0
448766
31 64 0,08 13,2
449884
45 55 0,11 12,1
459014
27 44 0,13 23,2
459032
98 172 0,23 14,6
5
10
15
20
25
459040
25 43 0,08 14,1
459157
26 48 0,09 15,8
Tabla 21
Efecto del tratamiento con oligonucleótidos antisentido sobre los marcadores de función hepática en ratas CD/IGS el
día 80
ALT AST Bilirrubina BUN
PBS
47 71 0,22 17,9
ISIS 325568
57 102 0,15 19,6
ISIS 398471
59 88 0,18 18,8
ISIS 436140
43 70 0,19 23,3
ISIS 448766
77 168 0,18 22,3
ISIS 449884
95 105 0,23 20,1
ISIS 459014
58 108 0,26 21,4
ISIS 459032
221 422 0,53 18,3
ISIS 459040
56 98 0,16 14,1
ISIS 459157
67 138 0,34 19,4
Función renal
Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos de ISIS sobre la función renal, se midieron los niveles de proteínas totales en orina y de creatinina en la orina, y se evaluó la relación entre la proteína total de la orina y la creatinina. Los resultados se presentan en la tabla 22.
Tabla 22
Efecto del tratamiento con oligonucleótidos antisentido sobre la proporción proteína/creatinina en la orina en el riñón
de ratas CD/iGs
pre-dosis Semana 8 Semana 12
PBS
1,1 0,7 0,7
ISIS 325568
1,1 3,6 5,2
ISIS 398471
0,8 4,4 4,6
ISIS 436140
1,1 5,4 15,6
ISIS 448766
0,9 5,4 7,0
ISIS 449884
0,9 3,2 3,7
ISIS 459014
1,0 3,6 3,3
ISIS 459032
1,0 4,5 6,0
ISIS 459040
0,8 4,8 5,6
ISIS 459157
1,2 3,3 4,1
Ejemplo 17: Determinación de la viscosidad de los oligonucleótidos antisentido ISIS dirigidos al GCGR humano
La viscosidad de los oligonucleótidos antisentido seleccionados del estudio descrito en el Ejemplo 16 se midió con el objetivo de seleccionar oligonucleótidos antisentido que tienen una viscosidad superior a 40 cP. Los oligonucleótidos que tienen una viscosidad superior a 40 cP serían demasiado viscosos para ser administrados a cualquier sujeto.
Se pesaron los oligonucleótidos ISIS (32 - 35 mg) en un vial de vidrio, se añadieron 120 pl de agua y el oligonucleótido antisentido se disolvió en solución calentando el vial a 50 °C. Parte de (75 jl) la muestra precalentada se pipeteó a un micro-viscosímetro (Cambridge). La temperatura del microcomponedor se ajustó a 25 °C y se midió la viscosidad de la muestra. Otra parte (20 jl) de la muestra precalentada se pipeteó en 10 ml de agua para lectura de UV a 260 nM a 85 °C (instrumento Cary UV). Los resultados se presentan en la Tabla 23 e indican
5
10
15
20
25
30
35
40
45
que todas las soluciones de oligonucleótidos antisentido son óptimas en su viscosidad según el criterio indicado anteriormente.
Tabla 23
Viscosidad y concentración de los oligonucleótidos antisentido ISIS dirigidos al GCGR humano
N.° ISIS
Motivo Viscosidad (cP) Concentración (mg/ml)
398471
5-10-5 27 173
436140
5-10-5 6 162
448766
5-10-5 4 142
449884
3-10-4 4 145
459014
3-10-4 9 167
459032
3-10-4 7 154
459040
3-10-4 11 157
459157
5-10-6 5 144
Ejemplo 18: Farmacocinética del oligonucleótido antisentido en hígado de ratón CD1
Se trató a los ratones CD1 con ISIS 449884 y se evaluó la semivida de los oligonucleótidos, así como el tiempo transcurrido para la degradación y eliminación del oligonucleótido del hígado.
Tratamiento
Se inyectó a un grupo de diez ratones CD1 por vía subcutánea dos veces a la semana durante 2 semanas con 50 mg/kg de ISIS 449884. Se sacrificó a grupos de cinco ratones cada uno 3 días y 56 días después de la dosis final. Se extrajeron los hígados para su análisis.
Determinación de la concentración de oligonucleótidos
Se midió la concentración del oligonucleótido de longitud completa así como la concentración total de oligonucleótidos (incluida la forma degradada). El procedimiento utilizado es una modificación de procedimientos previamente publicados (Leeds y col., 1996; Geary y col., 1999) que consisten en una extracción en fenol-cloroformo (líquido-líquido), seguido de una extracción en fase sólida. Se añadió un patrón interno (ISIS 355868, un oligonucleótido de fosforotioato modificado con 2'-O-metoxietilo 27-mer, GCGTTTGCTCTTCTTCTTGCGTTTTTT, designado aquí como SEQ ID NO: 119) antes de la extracción. Las concentraciones de la muestra de tejido se calcularon usando curvas de calibración, con un límite inferior de cuantificación (LLOQ) de aproximadamente 1,14 |jg/g. Las semividas se calcularon después utilizando el software WinNonlin (PHARSIGHT).
Los resultados se presentan en la Tabla 24, expresados como jg/g de tejido hepático. La semivida de ISIS 449884 se calculó como 15,1 días.
Tabla 24
Concentración de oligonucleótidos de ISIS 449884 en el hígado de ratones CD1
Concentración de la longitud completa (pg/g)
Día 3
118,7
Día 56
10,9
Ejemplo 19: Efecto de oligonucleótidos antisentido de ISIS sobre el GCGR humano en monos cinomolgos
Los monos cinomolgos se trataron con oligonucleótidos antisentido ISIS seleccionados de los estudios descritos en los Ejemplos 14-18. Se evaluaron la eficacia y tolerabilidad de los oligonucleótidos antisentido, así como su perfil farmacocinético en el hígado y el riñón. Los oligonucleótidos antisentido humanos analizados también tienen reactividad cruzada con la secuencia genómica de rhesus (designada aquí como SEQ ID NO: 3). Cuanto mayor es la complementariedad entre el oligonucleótido humano y la secuencia del mono rhesus, más probable es que el oligonucleótido humano pueda reaccionar de forma cruzada con la secuencia del mono rhesus. Los sitios de iniciación y terminación de cada oligonucleótido para la SEQ ID NO: 3 se presentan en la Tabla 25. El "sitio de iniciación” indica el nucleótido más 5' al que se dirige el gapmero en la secuencia génica del mono rhesus,
5
10
15
20
25
30
35
Tabla 25
Oligonucleótidos antisentido complementarios de la SEQ ID NO: 3
Sitio de iniciación
Secuencia NO. ISIS Motivo SEQ ID NO
1495
TCCACAGGCCACAGGTGGGC 398471 5-10-5 17
8857
CTCTTTATTGTTGGAGGACA 436140 5-10-5 102
3196
GCAAGGCTCGGTTGGGCTTC 448766 5-10-5 31
639
GGTTCCCGAGGTGCCCA 449884 3-10-4 11
666
716
744
799
826
4131
GGGCAATGCAGTCCTGG 459014 3-10-4 80
1142
GAAGGTGACACCAGCCT 459032 3-10-4 81
1506
GCTCAGCATCCACAGGC 459040 3-10-4 82
636
GGGTTCCCGAGGTGCCCAATG 459157 5-10-6 85
663
713
741
796
823
Tratamiento
Antes del estudio, se mantuvo a los monos en cuarentena durante un período de 5 semanas, durante el cual los animales fueron observados diariamente para vigilar la salud general. Los monos tenían 2-3 años y pesaban entre 2 y 5 kg. A cada uno de nueve grupos de cinco monos cinomolgos macho asignados al azar se inyectó subcutáneamente el oligonucleótido ISIS o PBS utilizando una aguja dosificadora de acero inoxidable y una jeringa de tamaño apropiado en la región intracapsular y el muslo externo de los monos. Los monos recibieron la dosis cuatro veces a la semana durante la primera semana (días 1, 3, 5 y 7) como dosis de carga, y, posteriormente, una vez a la semana durante semanas 2-13, con 40 mg/kg de ISIS 325568, ISIS 398471, ISIS 436140, ISIS 448766, ISIS 449884, ISIS 459014, ISIS 459032, ISIS 459040, o ISIS 459157. Se inyectó un grupo de control de 8 monos cinomolgos con PBS por vía subcutánea tres veces por semana durante la primera semana (días 1, 3, 5)., y 7), y posteriormente una vez por semana durante semanas 2-13.
Durante el período de estudio, se observó a los monos dos veces al día en busca de signos de enfermedad o angustia. Cualquier animal que experimente más que un dolor momentáneo o leve o angustia debido al tratamiento, lesión o enfermedad fue tratado por el personal veterinario con analgésicos o agentes aprobados para aliviar el dolor después de consultar con el Director del estudio. Cualquier animal con mala salud o en una posible condición moribunda se identificó para un seguimiento adicional y posible eutanasia. Por ejemplo, un animal del grupo tratado con ISIS 436140 se sacrificó el día 86, y un animal del grupo tratado con ISIS 459040 se sacrificó el día 71. La eutanasia programada de los animales se realizó el día 93 mediante exanguinación después de administración de ketamina/xilazina como anestesia inducida y administración de pentobarbital sódico. Los protocolos descritos en el Ejemplo fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC).
Reducción de la diana hepática
Análisis de ARN
El día 93, se extrajo el ARN del tejido hepático para el análisis PCR en tiempo real del GCGR usando el conjunto de sonda de cebador humano RTS1508. Los análisis también se realizaron usando el conjunto de sonda de cebador de mono rhesus humano RTS1479 (secuencia directa ATCTCCTGCCCCTGGTACCT, designada en el presente documento como SEQ ID NO: 120; secuencia inversa GGTCCACGCACCCACTGA, incorporada en el presente
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documento como SEQ ID NO: 121; secuencia de la sonda ACCGCTTCGTGTTCAAGAGATGCG, designada en el presente documento como SEQ ID NO: 122). Los resultados se presentan como el porcentaje de inhibición del ARNm de GCGR, en relación con el control de PBS, normalizado para el gen de mantenimiento, ciclofilina. Se obtuvieron resultados similares en la normalización con RIBOGREEN®. Como se muestra en la Tabla 26, el tratamiento con los oligonucleótidos antisentido ISIS dio como resultado una reducción significativa del ARNm del GCGR 1 en comparación con el control con PBS. Específicamente, el tratamiento con ISIS 449884 dio como resultado la reducción más significativa de la expresión de ARNm de GCGR.
Tabla 26
Porcentaje de inhibición del ARNm del GCGR en el hígado de monos cinomolgos en relación con el control de PBS
NO. ISIS
RTS1508/Ribogreen RTS1479/Ribogreen RTS1508/Cidofilma RTS1479/Ciclofilina
325568
59 49 68 59
398471
27 16 39 30
448766
49 37 55 42
449884
78 75 79 75
459014
25 21 39 32
459157
63 62 72 69
Análisis de los niveles de glucagón
Los niveles de glucagón en plasma se midieron antes de la dosificación, y en las semanas 3, 6, 7 y 10 del tratamiento. Dado que los niveles de glucagón cambian en función del nivel de estrés en los animales, se sedó a los monos con ketamina administrada por inyección intramuscular antes de la obtención de muestras sangre. Los animales ayunaron durante la noche antes de la extracción de sangre. Los animales se dejaron en ayunas durante la noche previa a la cirugía. Se extrajeron aproximadamente 1,8-2,0 ml de sangre de la vena femoral y se introdujeron en tubos con K2-EDTA que contenían 10 pl/ml del inhibidor de DPP-IV y 250 KIU/ml aprotinina. Los tubos se invirtieron para mezclar la sangre con las soluciones y luego se colocaron en agua helada. Las muestras de sangre se centrifugaron a 3.000 g durante 15 minutos a 4-8 °C dentro de los 30 minutos de la obtención de sangre.
El aumento de los niveles de glucagón es una consecuencia de la inhibición de los niveles de GCGR. Los niveles de glucagón se midieron usando un analizador químico clínico automatizado (Hitachi Olympus AU400e, Melville, NY). Los resultados se presentan en la Tabla 27, e indican que la inhibición de los niveles del receptor de glucagón por el tratamiento con oligonucleótidos antisentido da como resultado un aumento significativo en los niveles de glucagón en plasma. Específicamente, el tratamiento con ISIS 449884 dio como resultado un aumento dependiente del tiempo en los niveles de glucagón.
Tabla 27
Niveles de glucagón en el hígado de mono cinomolgo después del tratamiento antisentido (pg/ml)
Pre-dosis Semana 3 Semana 6 Semana 7 Semana 10
PBS
268 231 248 170 304
ISIS 325568
271 759 726 760 850
ISIS 398471
322 317 279 132 220
ISIS 448766
404 560 572 313 411
ISIS 449884
257 439 631 716 1018
ISIS 459014
348 281 245 122 180
ISIS 459157
369 471 486 538 828
Estudios de tolerabilidad
Determinaciones de los pesos corporales y de órganos
Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos ISIS sobre la salud general de los animales, se midieron los pesos corporales y de los órganos el día 93. Se midieron los pesos corporales y se presentan en la Tabla 28. Se midieron los pesos de los órganos y los datos se presentan también en la Tabla 28. Los resultados indican que el efecto del tratamiento con oligonucleótidos antisentido sobre los pesos del cuerpo y de los órganos estaba dentro del intervalo
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esperado para los oligonucleótidos antisentido. Específicamente, el tratamiento con ISIS 448994 fue bien tolerado en términos del peso corporal y de los órganos de los monos.
Tabla 28
Pesos finales del cuerpo y del órgano en el mono cinomolgo en relación con los niveles previos a la dosis
Peso corporal (kg) Bazo (g) Riñón (g) Hígado (g)
PBS
2,6 4 12 60
ISIS 325568
2,6 8 16 69
ISIS 398471
2,6 5 13 71
ISIS 436140
2,7 13 23 98
ISIS 448766
2,7 9 18 80
ISIS 449884
2,6 5 14 70
ISIS 459014
2,6 5 12 65
ISIS 459032
2,5 5 13 65
ISIS 459040
2,7 5 13 69
ISIS 459157
2,5 7 12 68
Función hepática
Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos de ISIS en la función hepática, se tomaron muestras de sangre de todos los grupos de estudio. Las muestras de sangre se recogieron mediante venopunción femoral el día 95, 48 horas después de la dosificación. Los monos se dejaron en ayunas durante la noche previa a extracción de sangre. La sangre fue recolectada en tubos que contenían anticoagulante K2-EDTA, que se centrifugaron para obtener plasma. Los niveles de diversos marcadores de función hepática se midieron usando un analizador de química Toshiba 200FR NEO (Toshiba Co., Japón). Se midieron los niveles plasmáticos de ALT y AST y los resultados se presentan en la Tabla 29, expresados en UI/l. La bilirrubina, un marcador de función hepática, se midió de manera similar y se presenta en la Tabla 29, expresado en mg/dl.. Los resultados indican que los oligonucleótidos antisentido no tuvieron ningún efecto sobre la función hepática fuera del intervalo esperado para los oligonucleótidos antisentido. Específicamente, el tratamiento con ISIS 448994 fue bien tolerado en términos de la función hepática en monos.
Tabla 29
Efecto del tratamiento con oligonucleótidos antisentido sobre los marcadores de función hepática en plasma de
mono cinomolgo
ALT (UI/l) AST (UI/l) Bilirrubina (mg/dl)
PBS
42 42 0,18
ISIS 325568
31 31 0,14
ISIS 398471
56 39 0,16
ISIS 448766
89 43 0,14
ISIS 449884
44 43 0,14
ISIS 459014
24 39 0,16
ISIS 459157
47 34 0,18
Función renal
Para evaluar el efecto de los oligonucleótidos de ISIS en la función renal, se tomaron muestras de sangre de todos los grupos de estudio. Las muestras de sangre se recogieron mediante venopunción femoral el día 95, 48 horas después de la dosificación. Los monos se dejaron en ayunas durante la noche previa a extracción de sangre. La sangre fue recolectada en tubos que contenían anticoagulante K2-EDTA, que se centrifugaron para obtener plasma. Los niveles de BUN y creatinina se midieron usando un analizador de química Toshiba 200FR NEO (Toshiba Co., Japón). Los resultados se presentan en la Tabla 30, expresados en mg/dl.
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Los datos de la química en plasma indican que la mayoría de los oligonucleótidos ISIS no tenían ningún efecto sobre la función renal fuera del intervalo esperado para los oligonucleótidos antisentido. Específicamente, el tratamiento con ISIS 449884 fue bien tolerado en términos de la función renal de los monos.
Tabla 30
Efecto del tratamiento con oligonucleótidos antisentido sobre los niveles de BUN plasmático y creatinina (mg/dl)
en monos cinomolgos
BUN Creatinina
PBS
17 0,60
ISIS 325568
16 0,52
ISIS 398471
16 0,50
ISIS 448766
13 0,54
ISIS 449884
17 0,59
ISIS 459014
18 0,60
ISIS 459157
17 0,58
Hematología
Para evaluar cualquier efecto de los oligonucleótidos ISIS en monos cinomolgos sobre los parámetros hematológicos, se extrajeron muestras de sangre de aproximadamente 1,3 ml de sangre la semana 11 de cada uno de los animales de estudio disponibles en tubos que contenían K2-EDTA. Las muestras se analizaron para determinar el recuento de glóbulos rojos (RBC), recuento de glóbulos blancos (WBC), recuentos de glóbulos blancos individuales, tales como el de monocitos, neutrófilos, linfocitos, así como para el recuento de plaquetas, el contenido de hemoglobina y el hematocrito, usando un analizador de hematología ADVIA120 (Bayer, EE. UU.). Los datos se presentan en las Tabla 31 y 32.
Los datos indican que los oligonucleótidos no causaron ningún cambio en los parámetros hematológicos fuera del intervalo esperado para los oligonucleótidos antisentido a esta dosis. Específicamente, el tratamiento con ISIS 448994 fue bien tolerado en términos de los parámetros hematológicos de los monos.
Tabla 31
Efecto del tratamiento con oligonucleótidos antisentido sobre varias células sanguíneas en monos cinomolgos
GR Plaquetas WBC Neutrófilos Linfocitos Monocitos
(x 106/|jl) (x 103/jl) (x 103/jl) (x 103/jl) (x 103/jl) (x 103/jl)
PBS
5,4 499 11,5 5,8 5,2 0,28
ISIS 398471
5,4 568 9,1 2,9 5,8 0,21
ISIS 448766
4,9 422 8,6 4,1 3,9 0,34
ISIS 449884
5,2 415 10,0 4,4 5,1 0,25
ISIS 459014
5,1 433 9,8 4,6 4,7 0,26
ISIS 459157
5,3 357 8,0 3,8 3,8 0,26
ISIS 325568
5,1 376 11,7 5,2 5,7 0,55
Tabla 32
Efecto del tratamiento con oligonucleótidos antisentido sobre los parámetros hematológicos
en monos cinomolgos
Hemoglobina (g/dl) HCT (%)
PBS
13,1 43
ISIS 398471
13,1 44
ISIS 448766
12,3 41
ISIS 449884
12,6 41
ISIS 459014
13,2 44
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40
45
50
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ISIS 459157
13,2 43
ISIS 325568
13,3 44
En general, los resultados del estudio indican que ISIS 449884 es el compuesto más potente y bien tolerado de los que se analizaron para inhibir el receptor de glucagón y es un candidato importante para el tratamiento de enfermedades metabólicas, tales como diabetes, obesidad, resistencia a la insulina y deficiencia de insulina.
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35
LISTADO DE SECUENCIAS
<110> Isis Pharmaceuticals, Inc.
Susan M. Freier Sanjay Bhanot
<120> MODULACIÓN ANTISENTIDO DE LA EXPRESIÓN DE GCGR
<130> BIOL0161WO
<150> 61/537.007 <151>2011-09-20
<160> 122
<170> FastSEQ para Windows Versión 4,0
<210> 1 <211> 2051 <212> ADN <213> Homo sapiens
<400> 1
agtttgcacc
cgagcgcgcc
ctgaggctca
ctgctgctct
ccccagctgt
cctgccagcc
tcccctccgc
gtcaccacaa
acaagtattc
ggtacctgcc
acggtcagtg
tggatggcga
tgatgtacac
tggggggcct
ccttcgtgct
gccagaaaat
gctgccgtgt
tggtggaggg
tcttcagcct
cagtggtcaa
tctggtggat
tccgcatcgt
acaagttccg
tggtcttcgc
tcttcgacct
tcaacaagga
tgctatggga
ctcccagcaa
cccccttggc
cccagctagg
cccagctgag
tgtggctgtc
gtgagcagag
ccacgtatgt
tggtcaccgt
<210> 2 <211> 20001 <212>ADN <213> Homo sapiens
<220>
<221> misc_feature <222> (1)...(20001)
<223> n = A,T,C o G
gaccccgatc tggcagcgcc cagaggacgg cggggagcca gaggggcagc ttcaggggag gccactcagc tgccctcgga gcagcccctg ccagatgtgg acagcgaccc ctgctgctgt tcaggtgatg gacttcctgt cctgagcctg ctgccccctc ctgctggccg gacacccccg ttggcaccac aaagtgcaac ggtgcgtgga ccccgggggc ggagattgag gtccagaagg agtgggctac agcctgtccc cagcaagctg cactgcaccc gaaagccagc tccgtgctgg tggcgacgac ctcagtgtca ggccgcggtg ttcatgcaat cctgtacctg cacaacctgc ctacctgggc atcggctggg gtgtctgttc gagaacgtcc cctgcggttc cccgtcttcc tcagctgctc gtggccaagc gctggccaag tccacgctga cttcgtgacg gacgagcacg cttcctcagc tccttccagg ggtgcagtcg gagctgcggc ggagcggaac accagcaacc ggagctgcag tttgggaggg tggtggcctc cctagattgg gctggactct ggcacccaga gctgggggcg ggggagccaa tgcgagattg ggcctcctct gagtccaggg cgggagtggg cggcacgtcc catgtgcatg
g
gcgaagacga
agccgacccc
gacaccccac
ggagcgtaca
gaggcagcta
tgctgctgct
ttgagaagtg
ccacggagct
ccaataccac
accgcttcgt
agccttggcg
aggtggccaa
tgggggccct
gcaatgccat
tcattgatgg
gcacctggct
atggcatcgt
tgggcctggc
gtgcccccat
agtgctggac
tggccatcct
tgcgggcacg
ccctcatccc
cccagggcac
gcctgctggt
ggcgttggca
acagggcctc
gtggtggcag
ctgagagccc
gggcgtcgct
cagcagcccc
ccctgcacct
ggctgtgccg
gaaatgtcct
gcggtcaccg cgagcagcgc tggccaggac cacccaccag gctgcccaga gctggcctgc gaagctctac ggtgtgcaac ggccaacatc gttcaagaga tgatgcctcc gatgtacagc gctcctcgcc ccacgcgaat gctgctcagg cagtgatgga ggccaactac caccctcccc gctgttcgtc cagcaatgac gatcaacttc gcagatgcac tctgctgggc cctgcgctcc ggctgtcctc ccgctggcgc atcttcgccc ccaggattca cttctgaacc ggacaaccca cacctacccc gccttgtccc tgaactgcgt ccaacaataa
gcgcccgacc
cgcgcggacc
gccccaggct
gactgcattg
ggcatgcccc
cagccacagg
ggtgaccagt
agaaccttcg
tcctgcccct
tgcgggcccg
cagtgccaga
agcttccagg
ttggccatcc
ctgtttgcgt
acccgctaca
gcggtggctg
tgctggctgc
gagaggagct
gtcccctggg
aacatgggct
ttcatcttcg
cacacagact
gtccacgaag
gccaagctct
tactgcttca
ctgggcaaag
ggccacggcc
tctgcggaga
ctgctgggac
gaactggacg
ccacccccag
tggtgcagag
gccagtgtcc
agagctcaag
60
120
180
240
300
360
420
480
540
600
660
720
780
840
900
960
1020
1080
1140
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1260
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1620
1680
1740
1800
1860
1920
1980
2040
2051

Claims (7)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    55
    60
    65
    REIVINDICACIONES
    1. Un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado monocatenario que consiste en la secuencia de bases nucleotídicas de la SEQ ID NO: 11, en la que el oligonucleótido comprende:
    un segmento separador que consiste en diez desoxinucleósidos unidos; un segmento del ala en 5' que consiste en tres nucleósidos unidos; un segmento del ala en 3' que consiste en cuatro nucleósidos unidos;
    en el que el segmento separador está colocado entre el segmento de ala en 5' y el segmento de ala en 3', en el que cada nucleósido de cada segmento de ala comprende un azúcar modificado 2'-O-metoxietilo, en el que cada enlace internucleosídico de dicho oligonucleótidos modificado es un enlace fosforotioato y en el que cada resto de citosina de dicho oligonucleótido modificado es una 5-metilcitosina.
  2. 2. El compuesto de la reivindicación 1, en el que el compuesto está en forma de una sal de sodio.
  3. 3. El compuesto de la reivindicación 1, en el que el compuesto está en forma de una sal de potasio.
  4. 4. El compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que el compuesto antisentido está conjugado.
  5. 5. Una composición que comprende un compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, o una sal del
    mismo y al menos uno de un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.
  6. 6. El compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o la composición de la reivindicación 5 para su uso en terapia.
  7. 7. El compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o la composición de la reivindicación 5 para su uso en el tratamiento o prevención de una enfermedad metabólica en un ser humano, opcionalmente en el que la enfermedad metabólica es diabetes.
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