ES2691296T3 - Micropartículas de células madre - Google Patents

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Lara Stevanato
Randolph Corteling
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Abstract

Una micropartícula de células madre neurales, que comprende uno, dos, tres o cuatro de hsa-miR-1246, hsa-miR- 4492, hsa-miR-4488 y hsa-miR-4532.

Description

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DESCRIPCION
Micropartículas de células madre Campo de la invención
Esta invención se refiere a micropartículas de células madre, su uso y producción de las mismas, en particular micropartículas de células madre neurales y su uso en terapia.
Antecedentes de la invención
Las células madre tienen la capacidad de autorrenovarse y diferenciarse en tipos de células funcionalmente diferentes. Tienen el potencial de ser una herramienta poderosa en el creciente campo de la Medicina Regenerativa, en particular la terapia regenerativa que requiere reemplazo, regeneración o reparación del tejido (Banerjee et al., 2011). Sin embargo, existen inconvenientes en el uso de células madre en terapia: existe la necesidad de un suministro constante y sustancial de células madre con estabilidad funcional y fenotípica y los altos costos asociados y el retraso causado por la generación, el almacenamiento, el transporte y la manipulación celular; existe un requisito de compatibilidad inmunológica para evitar el rechazo de las células madre por parte del receptor; y existen problemas regulatorios complejos relacionados con los posibles riesgos de seguridad de la formación de tejido tumoral o ectópico. Además, a pesar de la eficacia terapéutica del trasplante de células madre, no hay evidencia convincente de un efecto directo a largo plazo de las células madre trasplantadas, por ejemplo a través del injerto y la diferenciación en células reparadoras o de reemplazo.
Las células madre neurales (NSC) son células madre multipotentes autorrenovables que generan neuronas, astrocitos y oligodendrocitos (Kornblum, 2007). El potencial médico de las células madre neurales está bien documentado. El tejido dañado del sistema nervioso central (CNS) tiene una capacidad regenerativa muy limitada, por lo que la pérdida de la función neurológica suele ser crónica y progresiva. Las células madre neurales (NSC) han mostrado resultados prometedores en la terapia basada en células madre de una lesión o enfermedad neurológica (Einstein et al., 2008). Se ha demostrado que la implantación de células madre neurales (NSC) en los cerebros de los animales después de un accidente cerebrovascular va seguida de una recuperación significativa en pruebas motoras y cognitivas (Stroemer et al., 2009). No se entiende completamente cómo las NSC pueden restaurar la función en tejidos dañados, pero ahora se reconoce cada vez más que las NSC tienen propiedades reparadoras multimodales, que incluyen diferenciación celular apropiada para el sitio, actividad proangiogénica y neurotrófica e inmunomodulación que promueven la reparación tisular por el sistema inmune nativo y otras células huésped (Miljan & Sinden, 2009, Horie et al., 2011). Es probable que muchos de estos efectos dependan de la señalización transitoria desde las células madre neurales implantadas al entorno del huésped, por ejemplo, las NSC expresan transitoriamente marcadores proinflamatorios cuando se implantan en el daño del tejido muscular isquémico que dirige y amplifica la respuesta inmune natural proangiogénica y reguladora para promover la curación y la reparación (Hicks et al., datos no publicados). En cerebro de accidente cerebrovascular crónico, las NSC también tienen un efecto neurotrófico sustancial. Por ejemplo, promueven la repoblación del tejido cerebral estriado dañado por el accidente cerebrovascular con neuroblastos positivos de doblecortina derivados del cerebro del huésped (Hassani, O'Reilly, Pearse, Stroemer et al., PLoS One. 2012; 7 (11)).
Además, con base en un gran cuerpo de efectos regenerativos de NSC en modelos animales con accidente cerebrovascular crónico, ReNeuron Limited (Surrey, Reino Unido) lleva a cabo un ensayo clínico con células madre neurales para probar el tratamiento de pacientes discapacitados por accidente cerebrovascular que usan sus células madre neurales derivadas de corteza condicionalmente inmortalizada "CTX0E03" (Identificador de Clinicaltrials.gov: NCT01151124).
Las células madre mesenquimales (MSC) son células madre restringidas por linaje que tienen el potencial de diferenciarse en tipos de células mesenquimales solamente, a saber, de los linajes adipocítico, condrocítico y osteocítico (Pittenger et al. 1999, Ding et al., 2011). Las MSC (también denominadas células estromales mesenquimales y células progenitoras mesenquimales) se derivan de una variedad de fuentes que incluyen médula ósea, sangre, tejido adiposo y otros tejidos somáticos. El potencial terapéutico de las MSC, sin embargo, está más dirigido hacia la aplicación de sus propiedades proangiogénicas e inmunomoduladoras como células indiferenciadas. La producción de MSC humanas está limitada por la incapacidad de estas células para expandirse en números estables más allá de aproximadamente 15-20 duplicaciones de población.
El medio acondicionado por células madre mesenquimales (MSC-CM) tiene una eficacia terapéutica similar a la de las propias MSC, lo que sugiere un mecanismo paracrino de la terapia basada en MSC (Timmers et al., 2007). El documento WO-A-2009/105044 divulga que las partículas conocidas como exosomas, secretadas por las MSC, comprenden al menos una propiedad biológica de las MSC y sugiere el uso de estas partículas de MSC en terapia, mientras que Théry et al. 2011 proporciona una revisión general de los exosomas y otras vesículas secretadas similares. Mientras que algunos de los inconvenientes de utilizar células madre directamente como agentes terapéuticos se superan mediante el uso de exosomas derivados de células madre mesenquimales (por ejemplo, almacenamiento, transporte y manipulación), sigue existiendo el problema de proporcionar un suministro consistente
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y sustancial de células madre funcional y fenotípicamente estables para producir los exosomas. Para uso terapéutico, los exosomas preferiblemente deben producirse a gran escala. En ausencia de una línea de células madre, se requiere el reabastecimiento de las células mediante la derivación repetida de una fuente de células madre, lo que genera costos recurrentes para las pruebas y la validación de cada nuevo lote. Además, las enfermedades y trastornos que pueden ser tratados por MSC pueden ser limitados.
KR20100081003 (SNU R & D Foundation) describe un exosoma que se deriva de una célula madre neuronal humana y que activa la modulación inmune. Los ejemplos describen la separación de exosomas de células HB1.F3. Kang et al, J. Proteome Res., 2008, 7 (8), páginas 3475-3480, describe el análisis proteómico de exosomas de células madre neurales humanas HB1.F3 mediante fraccionamiento del flujo de campo de flujo y cromatografía líquida de nanoflujo-espectroscopía de masas en tándem.
Sigue existiendo la necesidad de terapias mejoradas basadas en células madre.
Sumario de la invención
La presente divulgación se basa en el hallazgo sorprendente de que las células madre neurales contienen micropartículas que son terapéuticamente útiles.
También se ha descubierto que es posible alterar la producción de micropartículas por las células madre mediante la adición de componentes al medio de cultivo, cultivando las células madre en condiciones hipóxicas, o mediante cocultivo con otros tipos de células, proporcionando de ese modo un método mejorado para producir micropartículas de células madre.
Un primer aspecto de la invención proporciona una micropartícula de células madre neurales, que comprende uno, dos, tres o cuatro de hsa-miR-1246, hsa-miR-4492, hsa-miR-4488 y hsa-miR-4532. La micropartícula puede ser un exosoma, microvesícula, partícula de membrana, vesícula de membrana, vesícula de tipo exosoma, vesícula de tipo ectosoma, ectosoma o exovesícula. Típicamente, la micropartícula es un exosoma. La micropartícula puede derivarse de una célula madre neural que se ha cultivado en un entorno que permite la diferenciación de células madre. La micropartícula se puede aislar a partir de células madre neurales parcialmente diferenciadas. En una realización, un entorno que permite la diferenciación de células madre es un biorreactor de múltiples compartimientos, típicamente donde las células se cultivan durante más de siete días. La micropartícula puede derivarse de una línea de células madre neurales. En algunas realizaciones, la línea de células madre neurales puede ser la línea celular "CTX0E03", la línea celular "STR0C05", la línea celular "HPC0A07" o la línea de células madre neurales descrita en Miljan et al. Stem Cells Dev. 2009. En algunas realizaciones, la micropartícula se deriva de una línea de células madre que no requiere que el suero se mantenga en cultivo. La micropartícula puede tener un tamaño de entre 30 nm y 1.000 nm, o entre 30 y 200 nm, o entre 30 y 100 nm, según se determina por microscopía electrónica; y/o una densidad en sacarosa de 1,1-1,2 g/mL. La micropartícula puede comprender aRn. El ARN puede ser ARNm, miARN y/o cualquier otro ARN pequeño. La micropartícula puede comprender uno, dos, tres o cuatro de hsa-miR-1246, hsa-miR-4492, hsa-miR-4488 y hsa-miR-4532. La micropartícula puede comprender uno o más lípidos, típicamente seleccionados de ceramida, colesterol, esfingomielina, fosfatidilserina, fosfatidilinositol, fosfatidilcolina. La micropartícula puede comprender una o más tetraspaninas, típicamente CD63, CD81, CD9, CD53, CD82 y/o CD37. La micropartícula puede comprender uno o más de TSG101, Alix, CD109, thy-1 y CD133. La micropartícula puede comprender al menos 10 de las proteínas presentes en la Tabla 19 o la Tabla 21. La micropartícula puede comprender al menos una actividad biológica de una célula madre neural o un medio acondicionado con células madre neurales. Al menos una actividad biológica puede ser una actividad regenerativa tisular. La micropartícula de la invención típicamente está aislada o purificada.
Un segundo aspecto de la invención proporciona la micropartícula de células madre neurales del primer aspecto, para uso en terapia. La terapia puede ser una terapia regenerativa que requiere el reemplazo, regeneración o reparación del tejido, por ejemplo, cuando la terapia requiere angiogénesis, neurogénesis y/o neuroprotección. La terapia puede ser para una enfermedad neurológica, trastorno o déficit. La terapia puede mejorar la recuperación funcional y/o cognitiva. La terapia puede ser de accidente cerebrovascular, enfermedad arterial periférica, neuropatía o cualquier otra enfermedad o trastorno que requiera regeneración tisular, revascularización o acción antiinflamatoria local, que incluye:
(i) Trastorno, enfermedad o déficit neurológico, tal como enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, accidente cerebrovascular o ALS;
(ii) Trastornos de almacenamiento lisosomal;
(iii) Trastornos cardiovasculares, tales como infarto de miocardio, insuficiencia cardíaca congestiva, enfermedad arterial periférica, úlceras diabéticas, cicatrización de heridas;
(iv) Enfermedades del pulmón, que incluyen fibrosis pulmonar idiopática, síndrome de dificultad respiratoria, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, hipertensión pulmonar idiopática, fibrosis quística y asma;
(v) Trastornos metabólicos o inflamatorios, como diabetes (I o II), artritis reumatoide, osteoartritis, lupus, enfermedad de Crohn, enfermedad inflamatoria intestinal o enfermedad de injerto contra huésped;
(vi) Trastornos psiquiátricos, tales como depresión, trastorno bipolar, esquizofrenia o un trastorno del síndrome
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autista tal como autismo, síndrome de Asperger o síndrome de Rett;
(vii) Enfermedades de la retina que causan ceguera, tales como la degeneración macular relacionada con la edad, enfermedad de Stargardt, retinopatía diabética, retinitis pigmentosa; y
(viii) Enfermedades desmielinizantes, como esclerosis múltiple, parálisis cerebral, mielinólisis central pontina, tabes dorsal, mielitis transversa, enfermedad de Devic, leucoencefalopatía multifocal progresiva, neuritis óptica, leucodistrofias, síndrome de Guillain-Barre, neuropatía periférica anti-MAG y enfermedad de Charcot-Marie-Tooth.
En una realización, la micropartícula es un exosoma y la terapia es de una enfermedad o afección que requiere el reemplazo, regeneración o reparación del tejido. En otra realización, la micropartícula es una microvesícula y la terapia es una enfermedad que requiere angiogénesis o una enfermedad, trastorno o déficit neurológico.
La terapia también puede ser una terapia profiláctica para inducir tolerancia, típicamente inmunotolerancia, en un huésped que posteriormente, concurrentemente o simultáneamente recibe las células madre de las que deriva la micropartícula. La administración de una o más dosis de micropartículas de la invención a un paciente, antes o concurrentemente con la administración de una terapia con células madre, puede usarse para reducir el riesgo de una respuesta inmune adversa, es decir, "rechazo", de la terapia de células madre.
Un tercer aspecto de la invención proporciona un método para producir una micropartícula de célula madre, típicamente una micropartícula de células madre neurales, que comprende aislar una micropartícula de un medio acondicionado de células madre, en el que:
(i) el medio acondicionado con células madre comprende uno o más componentes que inducen la liberación de micropartículas por las células madre en el medio, en el que uno o más componentes se seleccionan entre: factor de crecimiento transformante beta (TGF-p), interferón gamma (INF-y) y factor de necrosis tumoral alfa (TNF-a);
(ii) las células madre se cultivaron en condiciones hipóxicas;
(iii) las células madre se cocultivaron con un tipo de célula diferente, opcionalmente en el que el tipo de célula diferente es una célula endotelial; y/o
(iv) las células madre se cultivaron en un biorreactor de múltiples compartimientos.
El método puede comprender cultivar las células madre en un entorno que permite la diferenciación de células madre y la recolección de las micropartículas que son producidas por las células. Las micropartículas se pueden aislar a partir de células madre neurales parcialmente diferenciadas. Las células madre se pueden cultivar en condiciones que permitan la eliminación eficiente de los desechos metabólicos. En una realización, un entorno que permite la diferenciación de células madre es el cultivo en un biorreactor de múltiples compartimientos, típicamente durante un período de tiempo prolongado (por ejemplo, más de siete días). El método comprende aislar una micropartícula de un medio acondicionado con células madre. El medio acondicionado con células madre puede comprender uno o más componentes aditivos o agentes que estimulan la liberación de micropartículas por las células madre en el medio, en el que los uno o más componentes se seleccionan del factor de crecimiento transformante beta (TGF-p), interferón gamma (IFN-y) y/o factor de necrosis tumoral alfa (TNF-a). Las micropartículas se pueden aislar a partir de un medio acondicionado con células madre en el que las células madre se cultivaron en condiciones hipóxicas. Las micropartículas se pueden aislar del medio acondicionado con células madre producido por células madre cocultivadas con un tipo de célula diferente, típicamente células endoteliales, para crear el entorno del nicho de NSC.
Un cuarto aspecto de la invención proporciona una composición que comprende una micropartícula de células madre neurales de acuerdo con el primer aspecto y un excipiente, vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.
Un quinto aspecto de la invención proporciona un método de selección para un agente que altera la producción de una micropartícula por una célula madre, que comprende poner en contacto una célula madre con un agente candidato y observar si la tasa de producción de micropartículas por contacto con la célula madre aumenta o disminuye en comparación con un control.
En la medida en que las células madre embrionarias mencionadas en la descripción de la invención se obtienen directa o indirectamente mediante la destrucción de un embrión humano, no forman parte de la invención reivindicada y se mencionan solo con fines de referencia.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 representa micrografías electrónicas de células madre neurales inmortalizadas condicionalmente CTX0E03 que producen micropartículas. Los paneles A-E muestran cuerpos multivesiculares intracelulares (MVB) que contienen exosomas entre 30 nm y 50 nm de diámetro y el Panel F muestra microvesículas > 100 nm de diámetro liberadas de células madre neurales a través de un proceso de gemación en la membrana celular.
La Figura 2 es un protocolo esquemático para la identificación, caracterización y producción de micropartículas a partir de células madre.
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La Figura 3 muestra la lectura de la densidad óptica de la tira de ELISA de angiogénesis humana realizada en un medio acondicionado y no acondicionado de CTX0E03.
La Figura 4A muestra la cantidad de proteína (medida mediante ensayo BCA) extraída de 15 mL de medio que contiene micropartículas purificadas del sistema Integra en comparación con las condiciones de cultivo normales (T175 durante 3 días). La Figura 4B muestra la detección por FACS (a razón de 2 pg/mL, 1:250) de (i) CD63 en exosomas cultivados Integra CTX0E03 (panel superior izquierdo) y microvesículas (panel superior derecho) y (ii) CD81 en exosomas cultivados Integra CTX0E03 (panel inferior izquierdo) y microvesículas (panel inferior derecho).
La Figura 5 muestra la cantidad de ARN total aislado medido a 260/280 nm extraído de 15 mL de medio que contiene micropartículas purificadas por filtración del sistema Integra en comparación con las condiciones de cultivo normales (T175 durante 3 días).
La Figura 6A muestra los resultados de un ensayo de cierre/raspado de la herida que representa la actividad de migración de fibroblastos dérmicos humanos normales (NHDF) cultivados en medio acondicionado con CTX0E03 o tras la adición de exosomas CTX0E03 purificados. La Figura 6B muestra los resultados de un ensayo de raspado después de 72 horas, comparando el efecto de 10 pg de exosomas CTX0E03 con condiciones basales (sin exosomas). La Figura 6C muestra el % de áreas curadas para afecciones basales, 2 pg/mL de exosomas, 6 pg/mL de exosomas, 20 pg/mL de exosomas y un control positivo de LSGS (complemento para bajo crecimiento en suero). El panel superior de la Figura 6C muestra exosomas aislados de células CTX0E03 cultivadas durante 2 semanas en el sistema CELLine de Integra y el panel inferior de la Figura 6C muestra exosomas aislados de células CTX0E03 cultivadas durante 6 semanas en el sistema CELLine de Integra. La Figura 6D compara las células CTX0E03 con un control negativo (solución salina) en un ensayo de curación de heridas por inyección in vivo.
La Figura 7 muestra la cantidad de exosomas purificados obtenidos por medio de cultivo a partir de cultivos estándar de CTX0E03 (T175) frente al sistema CELLine de Integra en el punto de tiempo de 3 semanas.
La Figura 8A muestra la concentración de exosomas recogidos de dos matraces diferentes después de 1 semana, 2 semanas y 3 semanas del sistema de cultivo CELLine de Integra CTX0E03. La Figura 8B muestra la concentración de exosomas recogidos de un solo matraz de CELLine de Integra durante un cultivo continuo de 6 semanas de células CTX0E03.
La Figura 9 muestra el cambio en los niveles de expresión de diversos marcadores de ARNm medidos en células CTX0E03 cultivadas durante 3 semanas en el sistema CELLine de Integra en comparación con cultivos de CTX0E03 (T175) estándar ("control").
La Figura 10 muestra cuanto cambia la sobrerregulación y subregulación de diversos miARN en exosomas obtenidos de células CTX0E03 cultivadas durante 3 semanas en cultivos de biorreactor Integra y micropartículas obtenidas de cultivos estándar de CTX0E03 (T175), evaluados frente a un nivel de expresión basal en células CTX0E03 en un cultivo estándar (T175 ).
La Figura 11 representa los perfiles de miARN obtenidos a partir de la secuenciación profunda de miARN de células CTX0E03 ("CTX"), microvesículas ("MV") y exosomas ("EXO") cultivados en condiciones estándar (T175). Las Figuras 11a y 11b muestran los resultados de dos cultivos.
La Figura 12 muestra el efecto de las microvesículas de hNSC sobre la angiogénesis de HUVEC. La Figura 12A es una fotografía que muestra el claro aumento en la formación de tubos observado cuando se añaden microvesículas (paneles de la derecha) en comparación con las HUVEC basales. Las Figuras 12B y 12C muestran el aumento en la longitud total del tubo proporcionado por las microvesículas de hNSC a diversas concentraciones (0,05 pg, 0,1 pg, 0,3 pg - Figura 12B y 0,6 pg/mL - Figura 12C).
La Figura 13 muestra el efecto de las microvesículas de hNSC sobre la excrecencia de neuritas en células PC-12.
La Figura 14 es un electroferograma que muestra el perfil de contenido de ARN total en células CTX0E03, exosomas y microvesículas según se determina mediante un bioanalizador de ARN Agilent.
La Figura 15 es una presentación esquemática del porcentaje de genes codificantes que se solapan completamente con exones, y transcritos no codificantes localizados con secuencias intrónicas o intergénicas (producidas ejecutando archivos NGS BAM contra el conjunto de datos de secuencia GENCODE).
La Figura 16 representa la categoría superior de miARN novedosos preferencialmente transportados en exosomas y MV en comparación con las células productoras CTX0E03.
La Figura 17 muestra los resultados del análisis NanoSight realizado para determinar el tamaño de partícula y la concentración de exosomas de CTX0E03 (Figura 17A) y microvesículas (Figura 17B) cultivados en el sistema
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CELLine de Integra durante 1, 2, 3, 4, 5 y 6 semanas.
La Figura 18 muestra diagramas de Venn que comparan los datos proteómicos de exosomas y microvesículas de CTX0E03 (18A y 18B), y la comparación de exosomas de células madre neurales con exosomas de células madre mesenquimales (18C y 18D). La Figura 18A ilustra el número de proteínas únicas dentro de los exosomas y microvesículas de CTX0E03, aisladas a partir del sistema de cultivo de Integra de la semana 2. La Figura 18B compara los procesos biológicos asociados con las proteínas identificadas dentro de los exosomas y microvesículas de CTX0E03. La Figura 18C compara el proteoma del exosoma de células madre neurales CTX0E03 con un proteoma del exosoma de células madre mesenquimales, y la Figura 18D compara los procesos biológicos asociados con las proteínas identificadas en los exosomas derivados de MSC con los exosomas derivados de células madre neurales.
La Figura 19 muestra los 30 procesos biológicos que se encontró que estaban asociados con exosomas derivados de NSC y no con exosomas de células madre mesenquimales.
Descripción detallada de la invención
Los presentes inventores sorprendentemente han identificado micropartículas en células madre neurales. Estas micropartículas retienen algunas de las funciones de las células madre neurales de las que se derivan y son típicamente terapéuticamente útiles para los mismos tratamientos que las células madre neurales. Las micropartículas son ventajosas con respecto a las células madre correspondientes porque son más pequeñas y menos complejas, por lo que son más fáciles de producir, mantener, almacenar y transportar, y tienen el potencial de evitar algunos de los problemas regulatorios que rodean a las células madre. Las micropartículas se pueden producir de forma continua, mediante aislamiento de medios acondicionados, por ejemplo en un biorreactor tal como un biorreactor de múltiples compartimientos, que permite la producción a gran escala y la provisión de una terapia "lista para uso". El biorreactor de múltiples compartimientos es típicamente un biorreactor de dos compartimentos.
Se ha encontrado además que, sorprendentemente, el cultivo de células madre (de cualquier tipo, no limitadas a células madre neurales) en un entorno que permite que las células madre comiencen a diferenciarse, aumenta drásticamente el rendimiento de micropartículas producidas.
Los inventores han observado sorprendentemente que el cultivo de células madre (de cualquier tipo, no limitadas a células madre neuronales) en un biorreactor de múltiples compartimentos, da como resultado la diferenciación parcial de las células madre, en células madre en una forma más diferenciada. Esta diferenciación en cultivo no requiere la adición de un agente para inducir la diferenciación. Esta diferenciación típicamente requiere un período de cultivo de al menos una semana, al menos dos semanas o al menos tres semanas. Los cambios en las células madre que se producen en cultivo en un biorreactor de múltiples compartimientos se reflejan en las micropartículas producidas por las células madre cultivadas. Por lo tanto, cultivando células madre en un biorreactor de múltiples compartimentos, es posible inducir la diferenciación de las células. Por consiguiente, las micropartículas de células madre parcialmente diferenciadas pueden producirse recolectando micropartículas de células madre cultivadas en un biorreactor de múltiples compartimientos, típicamente durante al menos una semana, al menos dos semanas, al menos tres semanas, al menos cuatro semanas, al menos cinco semanas o al menos seis semanas. Opcionalmente, las NSC se han cultivado durante no más de diez semanas. En una realización, la invención proporciona un método para producir micropartículas aislando las micropartículas de células madre neurales parcialmente diferenciadas.
Los inventores también han encontrado que es posible inducir la secreción de micropartículas a partir de células madre. Este hallazgo, que tampoco está limitado a las células madre neurales y puede usarse para la producción de micropartículas de cualquier célula madre, permite obtener un rendimiento mejorado de micropartículas a partir de un cultivo de células madre. Se han identificado varios agentes que potencian la secreción de micropartículas en diferentes grados, lo que tiene la ventaja adicional de poder controlar la cantidad de micropartículas que se secretan. Cultivar células madre en condiciones hipóxicas también mejora la producción de micropartículas. Además, se ha descubierto que el cocultivo de una célula madre con un tipo de célula diferente, en particular un tipo de célula endotelial puede alterar beneficiosamente las micropartículas producidas por la célula madre.
En una realización adicional, la divulgación proporciona micropartículas, típicamente exosomas, producidos por células madre libres de suero. Se requiere suero para el cultivo exitoso de muchas líneas celulares, pero contiene muchos contaminantes, incluidos sus propios exosomas. Como se describe a continuación, los inventores han producido micropartículas a partir de células madre que no requieren suero para un cultivo exitoso.
Micropartículas de células madre neurales
La invención proporciona, en un aspecto, micropartículas que pueden obtenerse a partir de una célula madre neural. Una micropartícula de células madre neurales es una micropartícula producida por una célula madre neural. La micropartícula de células madre neurales de la invención comprende uno, dos, tres o cuatro de hsa-miR-1246, hsa- miR-4492, hsa-miR-4488 y hsa-miR-4532. Típicamente, la micropartícula es secretada por la célula madre neural. Más típicamente, la micropartícula es un exosoma o una microvesícula. Las micropartículas de otras células, tales
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como las células madre mesenquimales, son conocidas en la técnica.
Una "micropartícula" es una vesícula extracelular de 30 a 1.000 nm de diámetro que se libera de una célula. Está limitada por una bicapa lipídica que encierra moléculas biológicas. El término "micropartícula" es conocido en la técnica y abarca varias especies diferentes de micropartículas, que incluyen una partícula de membrana, una vesícula de membrana, una microvesícula, una vesícula de tipo exosoma, un exosoma, una vesícula de tipo ectosoma, un ectosoma o una exovesícula. Los diferentes tipos de micropartículas se distinguen en función del diámetro, origen subcelular, su densidad en sacarosa, forma, velocidad de sedimentación, composición lipídica, marcadores proteicos y modo de secreción (es decir, siguiendo una señal (inducible) o espontáneamente (constitutiva)). Cuatro de las micropartículas comunes y sus características distintivas se describen en la Tabla 1, a continuación.
Tabla 1: Diversas micropartículas
Micropartícula
Tamaño Forma Marcadores Lípidos Origen
Microvesículas
100-1.000 nm Irregular Integrinas, selectinas, ligando CD40 Fosfatidilserina Membrana plasmática
Vesículas tipo exosoma
20-50 nm Irregular TNFRI Balsas no lipídicas MVB a partir de otros organelos
Exosomas
30-100 nm; (< 200 nm) Forma de copa Tetraspaninas (por ejemplo, CD63, CD9), Alix, TSG101, ESCRT Colesterol, esfingomielina, ceramida, balsas de lípidos, fosfatidilserina Endosomas multivesiculares
Partículas de membrana
50-80 nm Redonda CD133, no CD63 Desconocidos Membrana plasmática
Se cree que las micropartículas desempeñan un papel en la comunicación intercelular actuando como vehículos entre una célula donadora y una receptora a través de mecanismos directos e indirectos. Los mecanismos directos incluyen la captación de la micropartícula y sus componentes derivados de células donantes (tales como proteínas, lípidos o ácidos nucleicos) por la célula receptora, teniendo los componentes una actividad biológica en la célula receptora. Los mecanismos indirectos incluyen la interacción de la superficie celular de la célula receptora de la microvesícula y la modulación de la señalización intracelular de la célula receptora. Por lo tanto, las micropartículas pueden mediar en la adquisición de una o más propiedades derivadas de células donantes por parte de la célula receptora. Se ha observado que, a pesar de la eficacia de las terapias con células madre en modelos animales, las células madre no parecen injertarse en el huésped. En consecuencia, el mecanismo por el cual las terapias con células madre son efectivas no está claro. Sin pretender imponer ninguna teoría, los inventores creen que las micropartículas secretadas por células madre neurales desempeñan un papel en la utilidad terapéutica de estas células y, por lo tanto, son terapéuticamente útiles por sí mismas.
Las micropartículas y las células madre de la invención están aisladas. El término "aisladas" indica que la micropartícula, la población de micropartículas, la célula o población de células a la que se refiere no está dentro de su entorno natural. La micropartícula, población de micropartículas, célula o población de células se ha separado sustancialmente del tejido circundante. En algunas realizaciones, la micropartícula, población de micropartículas, célula o población de células está sustancialmente separada del tejido circundante si la muestra contiene al menos aproximadamente 75%, en algunas realizaciones al menos aproximadamente 85%, en algunas realizaciones al menos aproximadamente 90% y en algunas realizaciones al menos aproximadamente 95% de micropartículas y/o células madre. En otras palabras, la muestra se separa sustancialmente del tejido circundante si la muestra contiene menos de aproximadamente 25%, en algunas realizaciones menos de aproximadamente 15%, y en algunas realizaciones menos de aproximadamente 5% de materiales distintos de las micropartículas y/o células madre. Dichos valores porcentuales se refieren al porcentaje en peso. El término abarca células o micropartículas que se han eliminado del organismo del que se originaron y existen en cultivo. El término también abarca células o micropartículas que se han removido del organismo del que se originaron, y posteriormente se reinsertaron en un organismo. El organismo que contiene las células reinsertadas puede ser el mismo organismo del que se extrajeron las células, o puede ser un organismo diferente.
Las células madre neurales producen micropartículas de forma natural mediante una variedad de mecanismos, incluida la gemación de la membrana plasmática (para formar vesículas de membrana y microvesículas) y como resultado de la fusión de cuerpos multivesiculares intracelulares (que contienen micropartículas) con la membrana celular y la liberación de las micropartículas en el compartimiento extracelular (para secretar exosomas y vesículas similares a exosomas).
La célula madre neural que produce las micropartículas de la invención puede ser una célula madre neural fetal, embrionaria o adulta, tal como se ha descrito en los documentos US5851832, US6777233, US6468794, US5753506 y WO-A-2005121318. El tejido fetal puede ser tejido de corteza fetal humana. Las células pueden seleccionarse como células madre neuronales a partir de la diferenciación de células madre pluripotentes inducidas (iPS), como ha sido descrito por Yuan et al. (2011) o una célula madre neural inducida directamente producida a partir de células somáticas tales como fibroblastos (por ejemplo induciendo constitutivamente a Sox2, Klf4 y c-Myc mientras limita
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estrictamente la actividad de Oct4 a la fase inicial de reprogramación como recientemente por Theiret al, 2012). Las células madre embrionarias humanas pueden obtenerse mediante métodos que conservan la viabilidad del embrión del donante, como se conoce en la técnica (por ejemplo, Klimanskaya et al., 2006 y Chunget al. 2008). Dichos métodos no destructivos de obtención de células madre embrionarias humanas se pueden usar para proporcionar células madre embrionarias a partir de las cuales se pueden obtener micropartículas de la invención. Alternativamente, las micropartículas de la invención se pueden obtener a partir de células madre adultas, células iPS o células madre neurales inducidas directamente. En consecuencia, las micropartículas de la invención se pueden producir mediante múltiples métodos que no requieren la destrucción de un embrión humano o el uso de un embrión humano como material de base.
Típicamente, la población de células madre neurales a partir de la cual se producen las micropartículas es sustancialmente pura. El término "sustancialmente pura" como se usa en este documento, se refiere a una población de células madre que es al menos aproximadamente 75%, en algunas realizaciones al menos aproximadamente 85%, en algunas realizaciones al menos aproximadamente 90% y en algunas realizaciones al menos aproximadamente 95% pura, con respecto a otras células que componen una población total de células. Por ejemplo, con respecto a poblaciones de células madre neurales, este término significa que hay al menos aproximadamente 75%, en algunas realizaciones al menos aproximadamente 85%, en algunas realizaciones al menos aproximadamente 90% y en algunas realizaciones al menos aproximadamente 95% células madre neurales puras en comparación con otras células que componen una población total de células. En otras palabras, el término "sustancialmente pura" se refiere a una población de células madre de la presente invención que contiene menos de aproximadamente 25%, en algunas realizaciones menos de aproximadamente 15%, y en algunas realizaciones menos de aproximadamente 5% de células comprometidas en el linaje en la población original no amplificada y aislada antes del cultivo y la amplificación posterior.
Una micropartícula de células madre neurales comprende al menos una bicapa lipídica que típicamente encierra un medio que comprende lípidos, proteínas y ácidos nucleicos. Los ácidos nucleicos pueden ser ácido desoxirribonucleico (ADN) y/o ácido ribonucleico (ARN). El ARN puede ser ARN mensajero (ARNm), micro ARN (miARN) o cualquier precursor de miARN, tal como pri-miARN, pre-miARN y/o ARN nuclear pequeño (ARNnp).
Una micropartícula de células madre neurales conserva al menos una función biológica de la célula madre de la que se deriva. Las funciones biológicas que pueden retenerse incluyen la capacidad de promover la angiogénesis y/o la neurogénesis, la capacidad de efectuar una mejoría cognitiva en el cerebro de un paciente que ha sufrido un accidente cerebrovascular o la capacidad de acelerar la recuperación del flujo sanguíneo en la enfermedad arterial periférica. Por ejemplo, se sabe que las células CTX0E03 inhiben la activación de células T en un ensayo de PBMC y, en una realización, las micropartículas de la invención conservan esta capacidad para inhibir la activación de células T en un ensayo de PBMC. Los ensayos de PBMC son bien conocidos por la persona experta y los kits para realizar el ensayo están disponibles en el mercado.
El Ejemplo 8, la Tabla 2 y la Figura 6 demuestran que los exosomas de células madre CTX0E03 retienen la capacidad de cerrar una herida en un modelo de "raspado" de curación de heridas. Los resultados en la Figura 6A muestran que la actividad de migración de fibroblastos dérmicos humanos normales (NHDF) cultivados en medios acondicionados con CTX0E03 es casi la misma que la actividad de migración observada en la adición de exosomas purificados. Por consiguiente, una función biológica que las micropartículas de la invención pueden retener es la capacidad de estimular la actividad de migración de fibroblastos dérmicos humanos normales (NHDF).
El ejemplo 8 también muestra que las microvesículas de la invención son capaces de estimular la angiogénesis de las HUVEC primarias y de estimular la excreción de neuritas de las células PC-12. Por consiguiente, una función biológica que las micropartículas de la invención pueden retener es la capacidad de estimular la angiogénesis de las HUVEC primarias y/o estimular le excreción de neuritas de las células PC-12.
El análisis proteómico en el Ejemplo 13 indica que los exosomas de células madre neurales comprenden funciones biológicas asociadas con la producción, empaquetamiento, función y degradación del material genético. Por consiguiente, en una realización, los exosomas de la invención conservan estas funciones, típicamente una o más de las funciones de la ARN polimerasa, función de degradación del ARN, función del ribosoma y función del espliceosoma.
La micropartícula obtenida de la célula madre neural tiene un diámetro de 1.000 nm o menos. Típicamente, la micropartícula de la invención tendrá un diámetro de 200 nm o menos, por ejemplo 100 nm o menos. Como se observa en la Tabla 1 anterior, las microvesículas tienen un diámetro de 100 nm a 1.000 nm. Los exosomas se definen típicamente como que tienen un diámetro de 30-100 nm, pero estudios más recientes confirman que los exosomas también pueden tener un diámetro entre 100 nm y 200 nm (por ejemplo, Katsuda et al., Proteomics 2013 y Katsuda et al., Scientific Reports 2013). En consecuencia, los exosomas típicamente tienen un diámetro entre 30 nm y 150 nm. Las partículas de membrana tienen un diámetro de 50 nm a 80 nm y las partículas de tipo exosoma tienen un diámetro de 20 nm a 50 nm. El diámetro puede determinarse mediante cualquier técnica adecuada, por ejemplo, microscopía electrónica o dispersión de luz dinámica. El término micropartícula incluye, pero no se limita a: partícula de membrana, vesícula de membrana, microvesícula, vesícula de tipo exosoma, exosoma, vesícula de tipo
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ectosoma, ectosoma o exovesícula.
Los paneles A-E de la Figura 1 muestran la presencia en células madre neuronales de MVB que contienen exosomas entre 30-50 nm de diámetro, mientras que el panel F muestra microvesículas > 100 nm de diámetro. La Tabla 20 y la Figura 17 (a continuación) muestran que los exosomas de células madre neurales típicas se midieron con un diámetro que varía de aproximadamente 70 nm a aproximadamente 150 nm, que es consistente con el tamaño de exosomas (de células madre mesenquimales) descritos en la técnica. En consecuencia, los exosomas de la invención típicamente tienen un diámetro entre 30 nm y 200 nm, más típicamente entre 50 nm y 150 nm. Como se indicó anteriormente, los exosomas son típicamente positivos para el marcador Alix (número de acceso UNIPROT Q8WUM4).
La Figura 1F y la Tabla 20 muestran el tamaño observado de microvesículas de células madre neurales típicas, con un diámetro de modo de aproximadamente 150 nm a 200 nm, o un diámetro medio de aproximadamente 180 nm a 350 nm. En consecuencia, las microvesículas de la invención típicamente tienen un diámetro entre 100 y 1.000 nm, más típicamente entre 150 nm y 350 nm.
Algunas micropartículas de la invención expresan el marcador de superficie CD133. Otras micropartículas de la invención no expresan el marcador de superficie CD133.
"Marcador" se refiere a una molécula biológica cuya presencia, concentración, actividad o estado de fosforilación puede detectarse y usarse para identificar el fenotipo de una célula.
Los exosomas son micropartículas de lípidos derivados de endosomas, típicamente de 30-100 nm de diámetro y a veces entre 100 nm y 200 nm de diámetro, que se liberan de la célula mediante exocitosis. La liberación de exosomas se produce constitutivamente o tras la inducción, de una manera regulada y funcionalmente relevante. Durante su biogénesis, los exosomas incorporan una amplia gama de proteínas citosólicas (que incluyen proteínas chaperonas, integrinas, proteínas del citoesqueleto y las tetraspaninas) y material genético. En consecuencia, los exosomas se consideran dispositivos de comunicación intercelulares para la transferencia de proteínas, lípidos y material genético entre las células, en el microambiente de células progenitoras y a una distancia considerable. Aunque la invención no está ligada a esta teoría, es posible que los exosomas sean responsables de la eficacia de las células madre neurales. Por lo tanto, se espera que los exosomas de las células madre neurales sean terapéuticamente eficaces.
Micropartículas diseñadas para tener las funciones deseadas
Las micropartículas retienen al menos algunas de las funciones de las células madre que las producen. Por lo tanto, es posible diseñar micropartículas manipulando la célula madre (que puede ser cualquier tipo de célula madre y no se limita a células madre neurales, aunque las micropartículas de células madre neurales de la invención se incluyen expresamente como una realización) para poseer una o más funciones deseadas, típicamente proteína o miARN. La manipulación será típicamente modificación genética, para introducir una o más secuencias de ácido nucleico codificantes no codificantes o reguladoras exógenas en la célula madre. Por ejemplo, si se desea un exosoma que contenga VEGF y/o bFGF, la célula madre productora de exosomas puede transformarse o transfectarse para expresar (niveles altos de) VEGF y/o bFGF, que luego se incorporarían a las micropartículas producidas por esa célula madre. De forma similar, las células iPS se pueden usar para producir micropartículas, y estas células se pueden diseñar para producir las proteínas y ácidos nucleicos (por ejemplo, miARN) que se requieren en las micropartículas producidas por las células iPS. Por lo tanto, la invención proporciona micropartículas ad hoc, de cualquier tipo de células madre, que contienen una función que no está presente de forma natural en la célula madre a partir de la cual se produce, es decir, las micropartículas (por ejemplo, exosomas) contienen una o más secuencias exógenas de proteína o ácido nucleico que no son de origen natural y están modificadas.
En una realización, las micropartículas aisladas o purificadas se cargan con uno o más ácidos nucleicos exógenos, lípidos, proteínas, fármacos o profármacos que están destinados a realizar una función deseada en una célula objetivo. Esto no requiere la manipulación de la célula madre y el material exógeno se puede añadir opcionalmente directamente a las micropartículas. Por ejemplo, los ácidos nucleicos exógenos se pueden introducir en las micropartículas por electroporación. Las micropartículas pueden usarse entonces como vehículos o portadores para el material exógeno. En una realización, las micropartículas que se han aislado a partir de las células que las producen se cargan con ARNpi exógeno, típicamente por electroporación, para producir micropartículas que se pueden desplegar para silenciar uno o más genes patológicos. De esta forma, las micropartículas pueden usarse como vehículos para administrar uno o más agentes, típicamente agentes terapéuticos o de diagnóstico, a una célula objetivo. Un ejemplo de esto es un exosoma de células madre neurales que comprende ARNpi exógeno capaz de silenciar uno o más genes patológicos.
Marcador de micropartículas
La invención proporciona una población de micropartículas de células madre neurales aisladas, en la que la población comprende esencialmente solo micropartículas de la invención, es decir, la población de micropartículas
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es pura. En muchos aspectos, la población de micropartículas comprende al menos aproximadamente 80% (en otros aspectos al menos 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99 %, 99,5%, 99,9% o 100%) de las micropartículas de la invención.
La micropartícula de células madre neurales aislada de la invención se caracteriza porque tiene un perfil de expresión distintivo para ciertos marcadores y se distingue de micropartículas de otros tipos de células. Cuando se describe un marcador en el presente documento, se puede usar su presencia o ausencia para distinguir la micropartícula. Por ejemplo, el término "puede comprender" o "puede expresar" también divulga la realización contraria en la que dicho marcador no está presente, por ejemplo, la frase "la micropartícula puede comprender una o más tetraspaninas, típicamente CD63, CD81, CD9, CD53, CD82 y/o CD37" también describe la realización contraria en la que la micropartícula puede no comprender una o más tetraspaninas, típicamente CD63, CD81, CD9, CD53, CD82 y/o CD37.
Se considera típicamente que la micropartícula de células madre neurales de la invención porta un marcador si al menos aproximadamente 70% de las micropartículas de la población, por ejemplo, el 70% de las partículas de membrana, vesículas de membrana, microvesículas, vesículas de tipo exosoma, exosomas, vesículas de tipo ectosoma, ectosomas o exovesículas muestran un nivel detectable del marcador. En otros aspectos, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 90% o al menos aproximadamente 95% o al menos aproximadamente 97% o al menos aproximadamente 98% o más de la población muestran un nivel detectable del marcador. En ciertos aspectos, al menos aproximadamente el 99% o el 100% de la población muestra un nivel detectable de los marcadores. La cuantificación del marcador puede detectarse mediante el uso de una RT-PCR cuantitativa (qRT-PCR) o mediante la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS). Debería apreciarse que esta lista se proporciona solo a modo de ejemplo, y no pretende ser limitante. Típicamente, se considera que una micropartícula de células madre neurales de la invención porta un marcador si al menos aproximadamente el 90% de las micropartículas de la población muestran un nivel detectable del marcador detectado por FACS.
Los marcadores descritos en este documento se consideran expresados por una célula de la población de la invención, si su nivel de expresión, medido por qRT-PCR tiene un valor de punto de cruce (Cp) inferior o igual a 35 (corte estándar en una matriz de qRT-PCR). El Cp representa el punto donde la curva de amplificación cruza el umbral de detección, y también puede reportarse como umbral de cruce (ct).
En una realización, la invención se refiere a micropartículas producidas por una población de células madre neurales caracterizada porque las células de la población expresan uno o más de los marcadores Nestin, Sox2, GFAP, tubulina pIII, DCX, GALC, TUBB3, GDNF e IDO. En otra realización, la micropartícula es un exosoma y la población de exosomas expresa uno o más de DCX (doblecortina-un marcador neuronal temprano), GFAP (proteína ácida fibrilar Glial-un marcador de astrocitos), GAlC, TUBB3, GDNF e IDO.
Las micropartículas de células madre neurales de la invención pueden expresar uno o más marcadores de proteínas a un nivel que es inferior o superior al nivel de expresión de ese marcador en una micropartícula de células madre mesenquimáticas de la misma especie. Los marcadores de proteínas que se expresan mediante las micropartículas de células CTX0E03 se identifican aquí y más adelante. En algunas realizaciones, las micropartículas pueden expresar un marcador de proteína a un nivel relativo a a tubulina u otra proteína o proteínas de control de ese tipo. En algunas realizaciones, las micropartículas de la invención pueden expresar esa proteína a un nivel de cambio de al menos +/-1,2 veces con respecto a la proteína de control, típicamente nivel de cambio de al menos +/-1,5 veces con respecto a la proteína de control, nivel de cambio de al menos +/- 2 veces con respecto a la proteína de control o un nivel de cambio de al menos +/- 3 veces con respecto a la proteína de control. En algunas realizaciones, las micropartículas pueden expresar un marcador de proteína a un nivel de entre 10'2 y 10'6 copias por célula con respecto a a tubulina u otra proteína de control. En algunas realizaciones, las micropartículas de la invención pueden expresar esa proteína a un nivel de entre 10'2 y 10'3 copias por célula con respecto a a tubulina u otra proteína de control.
Las micropartículas de células madre neurales de la invención pueden expresar uno o más miARN (incluyendo precursores de miARN) a un nivel que es menor o mayor que el nivel de expresión de ese miARN (incluyendo precursores de miARN) en una micropartícula de células madre mesenquimales de la misma especie. Los marcadores de miARN que se expresan mediante las micropartículas de células CTX0E03 se identifican a continuación. En algunas realizaciones, las micropartículas de la invención pueden expresar el miARN marcador a un nivel de cambio de al menos +/-1,5 veces, típicamente un nivel de cambio de al menos +/- 2 veces o un nivel de cambio de al menos +/- 3 veces (calculado de acuerdo con el método AAct, que es bien conocido) con respecto a U6B o 15a, o cualquier otro gen de referencia de miARN, también denominado gen de control interno.
Las micropartículas de células madre neurales de la invención pueden expresar uno o más ARNm a un nivel que es menor o mayor que el nivel de expresión de ese ARNm en una micropartícula de células madre mesenquimales de la misma especie. En algunas realizaciones, las micropartículas de la invención pueden expresar el ARNm del marcador a un nivel de cambio de al menos +/-1,5 veces, típicamente un nivel de cambio de al menos +/- 2 veces o un nivel de cambio de al menos +/- 3 veces (calculado de acuerdo con el método AAct) en relación con ATP5B o YWHAZ, o cualquier otro gen de referencia, también denominado gen de control interno.
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Los exosomas de la invención típicamente expresan integrinas específicas, tetraspaninas, antígenos MHC de Clase I y/o Clase II, antígenos CD y moléculas de adhesión celular en sus superficies, que pueden facilitar su captación por tipos celulares específicos. Los exosomas contienen una variedad de proteínas del citoesqueleto, GTPasas, clatrina, chaperonas y enzimas metabólicas (pero las proteínas mitocondriales, lisosomales y ER están excluidas, por lo que el perfil general no se parece al citoplasma). También contienen factores de empalme y traducción de ARNm. Finalmente, los exosomas generalmente contienen varias proteínas tales como HSP70, HSP90 y anexinas que se sabe que juegan un papel de señalización pero que no son secretadas por mecanismos clásicos (ER-Golgi).
La bicapa lipídica de un exosoma está típicamente enriquecida con colesterol, esfingomielina y ceramida. Los exosomas también expresan una o más proteínas marcadoras de tetraspanina. Las tetraspaninas incluyen CD81, CD63, CD9, CD53, cD82 y CD37. Los exosomas también pueden incluir factores de crecimiento, citoquinas y ARN, en particular miARN. Los exosomas típicamente expresan uno o más de los marcadores TSG101, Alix, CD109, thy-1 y CD133. Alix (número de acceso Uniprot Q8WUM4), TSG101 (número de acceso Uniprot Q99816) y las proteínas tetraspanina CD81 (número de acceso Uniprot P60033) y CD9 (número de acceso Uniprot P21926) son marcadores característicos de exosomas.
Alix es un marcador de ruta endosomal. Los exosomas son derivados de endosomas y, en consecuencia, una micropartícula positiva para este marcador se caracteriza como un exosoma. Los exosomas de la invención son típicamente positivos para Alix. Las microvesículas de la invención son típicamente negativas para Alix.
Proteoma de micropartículas
Las Tablas 18 y 20 enumeran todas las proteínas detectadas por espectrometría de masas en exosomas y microvesículas, respectivamente, aisladas de células CTX0E03 cultivadas durante dos semanas en un biorreactor de múltiples compartimientos CELLine de Integra. En una realización, los exosomas de la invención comprenden al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 99% o al menos 99,5% de las proteínas enumeradas en la Tabla 18. De forma similar, las microvesículas de la invención típicamente comprende al menos 70% al menos 80%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 99% o al menos 99,5% de las proteínas enumeradas en la Tabla 20. En una realización adicional, el proteoma de una microvesícula o el exosoma de la invención es al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 99% o al menos 99,5% idéntico al proteoma proporcionado en la Tabla 18 (exosoma) o Tabla 20 (microvesícula ). Cuando se determina el contenido de proteína de una micropartícula o exosoma, típicamente se usa espectrometría de masas, por ejemplo, el método LC/MS/MS descrito en el Ejemplo 13.
Las Tablas 19 y 21 muestran las 100 proteínas más abundantes detectadas por espectrometría de masas en exosomas y microvesículas, respectivamente, aisladas de células CTX0E03 cultivadas durante dos semanas en un biorreactor de múltiples compartimientos CELLine de Integra. Típicamente, un exosoma de la invención comprende las diez primeras proteínas enumeradas en la Tabla 19, más típicamente las primeras 20, las primeras 30, las primeras 40 o las primeras 50 proteínas enumeradas en la Tabla 19. De forma similar, una micropartícula de la invención típicamente comprende las primeras diez proteínas enumeradas en la Tabla 21, más típicamente las primeras 20, las primeras 30, las primeras 40 o las primeras 50 proteínas enumeradas en la Tabla 21. En una realización, un exosoma de la invención comprende las 100 proteínas enumeradas en la Tabla 19. En una realización, una microvesícula de la invención comprende las 100 proteínas enumeradas en la Tabla 21. Típicamente, las 100 proteínas más abundantes en un exosoma o microvesícula de la invención contienen al menos 70 de las proteínas identificadas en la Tabla 19 (exosoma) o en la Tabla 21 (micropartícula). Más típicamente, las 100 proteínas más abundantes en un exosoma o microvesícula de la invención contienen al menos 80, al menos 90, al menos 95, 96, 97, 98 o 99, o todas las 100 proteínas identificadas en la Tabla 19 (exosoma) o Tabla 21 (micropartícula).
Contenido de miARN en las micropartículas
El Ejemplo 12 (y la Figura 11 relacionada) muestra los resultados de la secuenciación profunda de miARN presente en células CTX0E03, microvesículas y exosomas producidos por estas células. Este ejemplo muestra que, sorprendentemente, el número de especies diferentes de miARN presentes en las micropartículas se reduce enormemente en comparación con el número de especies diferentes de miARN presentes en las células; las micropartículas contienen menos de 120 miARN diferentes mientras que las células contienen entre 450 y 700 especies de miARN. Las micropartículas contienen una mayoría de hsa-miR-1246.
Los datos en el Ejemplo 12 también muestran que las micropartículas se caracterizan por cuatro especies principales de miARN, a saber, hsa-miR-1246, hsa-miR-4492, hsa-miR-4488 y hsa-miR-4532. Estos cuatro miARN son los únicos miARN presentes en un Recuentos de lectura de más de 1.000 en las micropartículas; estos cuatro miARN están presentes en exceso masivo en comparación con los otros miARN en las micropartículas. Esto está en contraste con el perfil en las células, que contienen un número mucho mayor de miARN presentes a niveles altos (recuento de lectura mayor a 1.000) o muy altos (recuento de lectura mayor a 10.000). Aunque no están limitados por la teoría, los inventores proponen que hsa-miR-1246, hsa-miR-4492, hsa-miR-4488 y hsa-miR-4532 se trafican selectivamente (o bien se incorporan) en las micropartículas y se cree que juegan un papel en la función de las
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micropartículas.
Las micropartículas, por ejemplo, los exosomas de la invención contienen uno, dos, tres o los cuatro de hsa-miR- 1246, hsa-miR-4492, hsa-miR-4488 y hsa-miR-4532. Cada uno de estos marcadores de miARN está presente típicamente en un recuento de lectura (determinado opcionalmente usando la técnica de secuencia profunda descrita en el Ejemplo 12) de al menos 1.000 por micropartícula. Hsa-miR-1246 puede tener opcionalmente un recuento de lectura de al menos 2.000, 5.000, 10.000, 20.000 o 25.000 por micropartícula. Hsa-miR-4492 puede tener opcionalmente un recuento de lectura de al menos 2.000, 3.000, 4.000 o 5.000 por micropartícula. Hsa-miR- 4532 puede tener opcionalmente un Recuento de lectura de al menos 2.000 o 3.000 por micropartícula.
En una realización, cada uno de hsa-miR-1246, hsa-miR-4492, hsa-miR-4488 y/o hsa-miR-4532 está presente en la micropartícula, por ejemplo, exosoma, con un recuento de lectura mayor que el que está presente en la célula que produjo la micropartícula. En particular, miR-1246 típicamente tiene un recuento de lectura en la micropartícula de al menos dos veces el recuento en la celda, más típicamente al menos 4, 5, 6, 7 u 8 veces el recuento de lectura en la celda, y opcionalmente 10, 15 o 20 veces el recuento de lectura en la célula.
En una realización, las micropartículas de la invención contienen hsa-let-7a-5p, has-miR-92b-3p, hsa-miR-21-5p, hsa-miR-92a-3p, hsa-miR-10a- 5p, hsa-100-5p y/o hsa-99b-5p en un recuento de lectura menor que el que está presente en la célula que produjo la micropartícula. Típicamente, cada uno de estos miARN tiene un recuento de lectura de menos de 1.000 en las micropartículas de la invención, más típicamente menos de 100, por ejemplo, menos de 50. Opcionalmente, las micropartículas de la invención contienen hsa-let-7a-5p con un recuento de lectura de menos de 50 o menos de 25.
En una realización, las micropartículas de la invención contienen menos de 150 tipos de miARN (es decir, diferentes especies de miARN) cuando se analizan mediante secuenciación profunda, típicamente menos de 120 tipos de miARN.
En una realización, hsa-miR-1246 es el miARN más abundante en las micropartículas de la invención (opcionalmente determinado usando la técnica de secuencia profunda descrita en el Ejemplo 12). Típicamente, al menos el 40% del recuento total de miARN en micropartículas (por ejemplo, microvesículas y exosomas) de la invención es hsa-miR-1246. Típicamente, al menos el 50% del recuento total de miARN en exosomas de la invención es hsa-miR-1246.
Hsa-miR-4492 es típicamente el segundo miARN más abundante en las micropartículas de la invención. Típicamente, al menos el 3% del recuento total de miARN en micropartículas (por ejemplo, microvesículas y exosomas) de la invención es hsa-miR-4492. Más típicamente, al menos el 4% del recuento total de miARN en micropartículas (por ejemplo, microvesículas y exosomas) de la invención es hsa-miR-4492.
Típicamente, al menos el 2% del recuento total de miARN en micropartículas (por ejemplo, microvesículas y exosomas) de la invención es hsa-miR-4532.
Típicamente, al menos el 1% del recuento total de miARN en micropartículas (por ejemplo, microvesículas y exosomas) de la invención es hsa-miR-4488.
En una realización, las micropartículas de la invención contienen uno o ambos de hsa-miR-4508, hsa-miR-4516 a un nivel de al menos 0,1% del contenido total de miARN de las partículas.
Uno o más de hsa-miR-3676-5p, hsa-miR-4485, hsa-miR-4497, hsa-miR-21-5p, hsa-miR-3195, hsa-miR-3648, hsa- miR -663b, hsa-miR-3656, hsa-miR-3687, hsa-miR-4466, hsa-miR-4792, hsa-miR-99b-5p y hsa-miR-1973 pueden estar presentes en las micropartículas de la invención.
Típicamente, cada uno de hsa-let-7a-5p y hsa-100-5p está presente a menos del 1%, más típicamente menos del 0,1% o menos del 0,05% del recuento total de miARN en micropartículas de la invención.
En un exosoma típico de la invención, al menos el 50% del recuento total de miARN es hsa-miR-1246, y menos del 0,1% del recuento total de miARN es hsa-let-7a-5p.
En una realización, al menos el 90% del recuento total de miARN en micropartículas de la invención comprende hsa- miR-1246, hsa-miR-4492, hsa-miR-4488 y hsa-miR-4532. Típicamente, al menos el 95% o el 96% del recuento total de miARN en micropartículas de la invención comprende hsa-miR-1246, hsa-miR-4492, hsa-miR-4488 y hsa-miR- 4532. Menos del 10% del contenido total de miARN de estas micropartículas es un miARN que no es hsa-miR-1246, hsa-miR-4492, hsa-miR-4488 y hsa-miR-4532.
Se proporcionan combinaciones de las realizaciones de miARN discutidas anteriormente. Por ejemplo, una micropartícula de la invención contiene típicamente cada una de hsa-miR-1246, hsa-miR-4492, hsa-miR-4488 y hsa- miR-4532 con un recuento de lectura de al menos 1.000 y contiene cada uno de hsa-let -7a-5p, hsa-miR-92b-3p, hsa-miR-21-5p, hsa-miR-92a-3p, hsa-miR-10a-5p, hsa-100-5p y hsa-99b-5p con un recuento de lectura de al menos
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de 100. Típicamente, al menos el 90% o al menos el 95% del miARN total en estas micropartículas es hsa-miR- 1246, hsa-miR-4492, hsa-miR-4488 y hsa-miR-4532.
Una micropartícula (por ejemplo, microvesícula o exosoma) de la invención típicamente tiene hsa-miR-1246 como el miARN más abundante y hsa-miR-4492 es el segundo miARN más abundante. En esta realización, al menos 40% del recuento total de miARN en micropartículas (por ejemplo, microvesículas y exosomas) de la invención es hsa- miR-1246 y al menos 3% del recuento total de miARN en la micropartícula es hsa-miR- 4492. Al menos el 2% del recuento total de miARN en estas micropartículas es hsa-miR-4532 y al menos el 1% del recuento total de miARN en estas micropartículas es hsa-miR-4488. Cada uno de hsa-let-7a-5p y hsa-100-5p está presente con menos del 0.1% del recuento total de miARN en estas micropartículas.
El gráfico de los resultados de secuenciación profunda en los exosomas y microvesículas como el numero relativo de cuánto cambia comparado con las células confirma que hsa-miR-1246, hsa-miR-4492, hsa-miR-4488 y hsa-miR- 4532 están significativamente sobrerregulados en los exosomas y microvesículas comparados con las células. Esta comparación también muestra que el miARN hsa-miR-3195 es el miARN que está más sobrerregulado, tanto en exosomas como en microvesículas. Aunque las lecturas absolutas de hsa-miR-3195 están en el intervalo de -40 para exosomas y microvesículas, no se detecta hsa-miR-3195 en las células. Por consiguiente, hsa-miR-3195 se encuentra únicamente en los exosomas y microvesículas de la invención y, en una realización, un exosoma o microvesícula de la invención comprende hsa-miR-3195.
En una realización, las micropartículas de la invención comprenden uno o más de los siguientes precursores de miARN:
AC079949.1 (SEQ ID NO: 738)
GGCCGCGCCCCGTTTCCCAGGACAAAGGGCACTCCGCACCGGACCCTGGTCCCAGCG;
AP000318.1 (SEQ ID NO: 739)
CCCACTCCCTGGCGCCGCTTGTGGAGGGCCCAAGTCCTTCTGATTGAGGCCCAACCCGTGGAAG;
AL161626.1 (SEQ ID NO: 740)
CGCCGGGACCGGGGTCCGGGGCGGAGTGCCCTTCCTCCTGGGAAACGGGGTGCGGC;
AC004943.1 (SEQ ID NO: 741)
GCTTCACGTCCCCACCGGCGGCGGCGGCGGTGGCAGTGGCGGCGGCGGCGGCGGTGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCG GCTC; y
AL121897.1 (SEQ ID NO: 742)
GCCGCCCCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCCGCTTTCGGCTCGGGCCTCAGGTGAGTCGGAG
GGGCCGGGCGCC
En una realización, las micropartículas de la invención comprenden uno, dos o tres de los siguientes miARN maduros derivados de los precursores enumerados anteriormente (como se detalla en la parte D del Ejemplo 12):
ggcggagugcccuucuuccugg (derivado de AL161626.1-201) (SEQ ID NO: 743) ggagggcccaaguccuucugau (derivado de AP000318.1-201) (SEQ ID NO: 744) gaccaggguccggugcggagug (derivado de AC079949.1-201) (SEQ ID NO: 745).
Estos 5 precursores de miARN y 3 miARN maduros no se han aislado previamente y, por lo tanto, cada secuencia también se proporciona como una nueva secuencia en sí misma. En consecuencia, en un aspecto, la invención proporciona una composición que comprende uno o más de los precursores de miARN AC079949. 1, AP000318.1, AL161626.1, AC004943.1 y AL121897.1. En otra realización, la invención proporciona una composición que comprende uno o más de los miARN maduros ggcggagugcccuucuuccugg (derivado de AL161626.1-201), ggagggcccaaguccuucugau (derivado de AP000318.1-201) y gaccaggguccggugcggagug (derivado de AC079949.1- 201). Opcionalmente, la composición es una composición farmacéutica que comprende uno o más de los precursores de miARN y/o uno o más de los miARN maduros y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable. Como se observa en el Ejemplo 12, estos miARN y precursores parecen transportarse selectivamente a los exosomas y microvesículas y, por lo tanto, pueden ser al menos parcialmente responsables de la función de las micropartículas.
El Ejemplo 12 también muestra que las micropartículas de células madre neurales comprenden una variedad de especies de ARN no codificantes. En una realización, las micropartículas de la invención comprenden uno o más de aRn ribosómico, ARN nucleolar pequeño, ARN nuclear pequeño, ARN micro, ARN no codificante intergénico grande y ARN misceláneo (por ejemplo, RMRP, ARN de bóveda, SRP de metozoario y/o RNY).
El ejemplo 4 muestra miARN presentes en micropartículas producidas por las células CTX0E03 y que tienen una Cp por debajo de 35 según lo determinado por una matriz de qRT-PCR. Típicamente, en una realización, las micropartículas de la invención contienen 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60 o más, o todos, de los siguientes miARN (identificados de acuerdo con el nombre según Ambros et al. y accesible en 5
www.mirbase.org):
hsa-let
-7a
hsa-let
-7b
hsa-let
-7c
hsa-let
-7d
hsa-let
-7e
hsa-let
-7f
hsa-let
-7g
hsa-let
-7i
hsa-m
R-100
hsa-m
R-101
hsa-m
R-103a
hsa-m
R-106b
hsa-m
R-10a
hsa-m
R-10b
hsa-m
R-124
hsa-m
R-125a-5p
hsa-m
R-125b
hsa-m
R-126
hsa-m
R-127-5p
hsa-m
R-128
hsa-m
R-129-5p
hsa-m
R-130a
hsa-m
R-132
hsa-m
R-134
hsa-m
R-137
hsa-m
R-141
hsa-m
R-146b-5p
hsa-m
R-150
hsa-m
R-155
hsa-m
R-15a
hsa-m
R-15b
hsa-m
R-16
hsa-m
R-17
hsa-m
R-181a
hsa-m
R-182
hsa-m
R-183
hsa-m
R-185
hsa-m
R-18a
hsa-m
R-18b
hsa-m
R-192
hsa-m
R-194
hsa-m
R-195
hsa-m
R-196a
hsa-m
R-205
hsa-m
R-20a
hsa-m
R-20b
hsa-m
R-21
hsa-m
R-210
hsa-m
R-214
hsa-m
R-218
hsa-m
R-219-5p
hsa-m
R-22
hsa-m
R-222
hsa-m
R-23b
hsa-m
R-24
hsa-m
R-26a
hsa-m
R-301a
hsa-m
R-302a
hsa-m
R-302c
hsa-m
R-33a
hsa-m
R-345
hsa-m
R-375
hsa-m
R-378
hsa-m
R-424
hsa-m
R-7
hsa-m
R-9
hsa-m
R-92a
hsa-m
R-93
hsa-m
R-96
hsa-m
R-99a
En una realización, las micropartículas de CTX0E03 contienen 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30 o más de los siguientes miARN (que se seleccionan de la lista anterior):
hsa-let
-7g
hsa-m
R-101
hsa-m
R-10a
hsa-m
R-10b
hsa-m
R-126
hsa-m
R-128
hsa-m
R-129-5p
hsa-m
R-130a
hsa-m
R-134
hsa-m
R-137
hsa-m
R-155
hsa-m
R-15a
hsa-m
R-15b
hsa-m
R-16
hsa-m
R-17
hsa-m
R-182
hsa-m
R-183
hsa-m
R-185
hsa-m
R-18b
hsa-m
R-192
hsa-m
R-194
hsa-m
R-195
hsa-m
R-20a
hsa-m
R-20b
hsa-m
R-210
hsa-m
R-218
hsa-m
R-301a
hsa-m
R-302a
hsa-m
R-302c
hsa-m
R-345
hsa-m
R-375
hsa-m
R-378
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hsa-miR-7
hsa-miR-9
hsa-miR-93
hsa-miR-96
hsa-miR-99a
Proteínas detectadas por un dot-blot
El Ejemplo 5 muestra proteínas presentes en micropartículas producidas por las células CTX0E03, como se detecta mediante una transferencia de punto. Típicamente, las micropartículas de la invención contienen 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o todas las siguientes proteínas:
EDA-A2__________
Galectina-3
IGFBP-2
IGFBP- rp1/IGFBP-7
IL-1a____________
LECT2___________
MCP-1___________
SPARC__________
TIMP-1___________
Trombospondina-1
VEGF
Galectina-3 y Trombospondina-1 también se identifican como presentes en exosomas y microvesículas en el Ejemplo 13. TIMP-1 se identifica en el Ejemplo 13 como presente en exosomas.
El Ejemplo 5 también muestra que las micropartículas producidas por las células CTX0E03 también pueden expresar 1, 2, 3, 4 o 5 de las siguientes proteínas:
EGF-R/ErbB1
MDC_______
Endostatina
Folistatina
Csk
EGF-R y Csk también se identifican como presentes en exosomas y microvesículas en el Ejemplo 13.
Se sabe que galectina-3, SPARC, TIMP-1, trombospondina-1, VEGF, MDC y endostatina modulan la angiogénesis. Por consiguiente, las micropartículas que contienen una o más de estas proteínas son útiles en el tratamiento de enfermedades o trastornos que requieren la modulación de la angiogénesis.
Se sabe que IL-1a, LECT2, MCP-1 y Csk modulan la inflamación. Por lo tanto, las micropartículas que contienen una o más de estas proteínas son útiles en el tratamiento de enfermedades o trastornos que requieren la modulación de la inflamación.
Las micropartículas que contienen uno o más de (i) Galectina-3, SPARC, TIMP-1, Trombospondina-1, VEGF, MDC y Endostatina, y uno o más de (ii) IL-1a, LECT2, MCP-1 y Csk, pueden ser útil para tratar enfermedades o trastornos que requieren la modulación de la angiogénesis y de la inflamación.
Células madre neurales en cultivos en biorreactores de múltiples compartimientos
Como se muestra en el Ejemplo 10 y la Figura 9 a continuación, después del cultivo en biorreactores de múltiples compartimientos durante tres semanas, las células madre neurales expresan una cantidad de marcadores a niveles significativamente más altos que las células madre neurales cultivadas de acuerdo con el procedimiento estándar en un Matraz estándar T175 de un solo compartimiento. En una realización, las micropartículas de la invención se aíslan de NSC que se han cultivado, típicamente en un biorreactor de múltiples compartimientos, durante al menos dos semanas, típicamente al menos tres semanas, al menos cuatro semanas, al menos cinco semanas o al menos seis semanas. Opcionalmente, las NSC se han cultivado durante no más de diez semanas, por ejemplo, entre 2 y 10 semanas, entre 3 y 10 semanas, entre 4 y 10 semanas, entre 5 y 10 semanas o entre 6 y 10 semanas.
Las células madre neurales CTX0E03 cultivadas durante tres semanas en un biorreactor de múltiples
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compartimentos expresan DCX, GALC, GFAP, TUBB3, GDNF e IDO en un nivel más alto que las células madre neurales cultivadas en un matraz estándar de cultivo celular T175 de un solo compartimento. En consecuencia, las células madre neurales que se han cultivado en un biorreactor de múltiples compartimientos, típicamente durante una semana o más, diez días o más, dos semanas o más, o al menos tres semanas, cuatro semanas, cinco semanas o más, pueden expresar una o más de DCX, GALC, GFAP, TUBB3, GDNF e IDO. Las células cultivadas en un biorreactor de dos compartimentos muestran típicamente una expresión aumentada de uno o más de DCX, GALC, GFAP, TUBB3, GDNF e IDO en comparación con las células madre cultivadas bajo condiciones estándar. El nivel de expresión de estos marcadores en las células cultivadas en un biorreactor de múltiples compartimientos es típicamente significativamente mayor que en las células cultivadas en un matraz estándar de cultivo T175 de un solo compartimento. Típicamente, una célula madre cultivada en un biorreactor de múltiples compartimentos expresa uno o más de DCX1, GALC, GFAP, TUBB3, GDNF o IDO a un nivel de al menos 2 veces mayor que en las células CTX0E03 cultivadas en un matraz T-175 de acuerdo con el procedimiento estándar de cultivo. En una realización, las micropartículas, típicamente exosomas, se obtienen a partir de células madre neurales que muestran una mayor expresión de uno o más de DCX, GALC, GFAP, TUBB3, GDNF e IDO en comparación con las células madre cultivadas en condiciones estándar. Por ejemplo, se pueden obtener micropartículas a partir de medio acondicionado recién filtrado recogido de células madre neurales cultivadas en un biorreactor CeLLine de Integra.
Los marcadores sobrerregulados incluyen DCX (doblecortina-un marcador neuronal temprano), GFAP (proteína ácida fibrilar Glial-un marcador de astrocitos), GALC, TUBB3, GDNF e IDO. Las células CTX0E03 pueden diferenciarse en 3 tipos diferentes de células: neuronas, astrocitos y oligodendrocitos. Los altos niveles de DCX y GFAP después de tres semanas en un biorreactor de múltiples compartimentos indica que las células madre cultivadas se han diferenciado parcialmente y han entrado en el linaje neuronal (células DCX+) y/o astrocíticas (células GFAP+). Por consiguiente, en una realización, la invención proporciona una micropartícula producida por una población de células madre neurales que expresa (i) uno o más marcadores asociados con un linaje neuronal, típicamente DCX y/o (ii) uno o más marcadores asociados con un linaje astrocítico, típicamente GFAp. En otra realización, la invención proporciona micropartículas de células madre neurales, típicamente exosomas, que expresan (i) uno o más marcadores asociados con un linaje neuronal, típicamente DCX y/o (ii) uno o más marcadores asociados con un linaje astrocítico, típicamente GFAP. Estas células, o las micropartículas (típicamente exosomas) derivadas de estas células, expresan DCX y/o GFAP a un nivel más alto que las células madre correspondientes en cultivo estándar (T-175). Típicamente, estas células o micropartículas expresan DCX y/o GFAP a un nivel al menos 2 veces mayor que las células madre, más típicamente al menos 2,5 veces mayor que las células madre correspondientes en cultivo estándar, al menos 5 veces mayor que el tallo correspondiente células en cultivo estándar, al menos 7,5 veces mayor que las células madre correspondientes en cultivo estándar o al menos 10 veces mayor que las células madre correspondientes en cultivo estándar. Para la expresión de DCX, el nivel de cambio en las células o micropartículas comparado con las correspondientes células madre en cultivo estándar (T- 175) puede ser opcionalmente al menos 20 veces, al menos 50 veces, al menos 100 veces, al menos 500 veces o al menos 1000 veces mayor que las células madre estándar.
El término "biorreactor" debe tener su significado habitual en la técnica, es decir, un aparato utilizado para llevar a cabo un bioproceso. Los biorreactores descritos en este documento son adecuados para uso en cultivo de células madre. Los biorreactores simples para el cultivo celular son matraces de un solo compartimento, como el matraz T- 175 comúnmente utilizado (por ejemplo, el matraz de cultivo celular BD FalconMR de 175 cm2, 750 mL, poliestireno tratado para cultivo de tejidos, cuello recto, tapa de rosca para sello de tapón azul, código de producto BD 353028). Los biorreactores pueden tener múltiples compartimentos, como se conoce en la técnica. Estos biorreactores de múltiples compartimentos típicamente contienen al menos dos compartimentos separados por una o más membranas o barreras que separan el compartimiento que contiene las células de uno o más compartimentos que contienen gas y/o el medio de cultivo. Los biorreactores de múltiples compartimentos son bien conocidos en la técnica. Un ejemplo de un biorreactor de múltiples compartimientos es el biorreactor CeLLine de Integra, que contiene un compartimento de medio y un compartimento de células separados por medio de una membrana semipermeable de 10 kDa; esta membrana permite una difusión continua de nutrientes dentro del compartimiento de las células con una eliminación simultánea de cualquier producto de desecho inhibitorio. La accesibilidad individual de los compartimentos permite suministrar células con medio fresco sin interferir mecánicamente con el cultivo. Una membrana de silicona forma la base del compartimento de células y proporciona un suministro de oxígeno óptimo y el control de los niveles de dióxido de carbono al proporcionar una vía de difusión corta al compartimento de células. Se puede usar cualquier biorreactor de múltiples compartimientos de acuerdo con la invención.
El Ejemplo 11, la Tabla 3 y la Figura 10 muestran que el contenido de miARN de exosomas producidos por células madre neurales que se han cultivado en un biorreactor de múltiples compartimentos, durante tres semanas, es diferente del contenido de miARN de células madre cultivadas en matraces estándar T-175 y a partir de micropartículas producidas por las células madre neurales cultivadas en un matraz de cultivo T175 de un solo compartimento durante tres semanas. En una realización, la invención proporciona una micropartícula, típicamente un exosoma, en el que al menos dos, tres, cuatro, cinco, seis o siete miARN están sobrerregulados o subregulados en comparación con las células madre correspondientes cultivadas en matraces estándar T-175, de acuerdo a lo calculado por la regulación del número de veces (véase Ejemplo 11). La regulación del número de veces de cada miARN es opcionalmente al menos de dos veces hacia arriba o hacia abajo.
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Se puede ver a partir de la Figura 6C y del Ejemplo 8 que los exosomas aislados de las NSC muestran una eficacia particularmente sorprendente cuando las NSC se han cultivado durante varias semanas. Por consiguiente, en una realización, los exosomas de la invención se aíslan de las NSC que se han cultivado, típicamente en un biorreactor de múltiples compartimentos, durante al menos dos semanas, típicamente al menos tres semanas, al menos cuatro semanas, al menos cinco semanas o al menos seis semanas. Opcionalmente, las NSC se han cultivado durante no más de diez semanas, por ejemplo, entre 2 y 10 semanas, entre 3 y 10 semanas, entre 4 y 10 semanas, entre 5 y 10 semanas o entre 6 y 10 semanas.
En una realización, los exosomas de células madre neurales de la invención expresan uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis o siete de los siguientes miARN a un nivel superior al que se expresa en las células madre correspondientes cultivadas en matraces estándar T-175, como se calcula mediante la regulación del número de veces (donde un asterisco indica un miARN en el que se prefiere al menos un aumento de la regulación de dos veces):
hsa-miR-146b-5p*
hsa-let-7c*_____
hsa-miR-99a*
hsa-miR-132*
hsa-miR-378*
hsa-miR-181a*
hsa-let-7b*
En una realización, los exosomas de células madre neurales de la invención expresan uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez o más de los siguientes miARN en un nivel inferior al que se expresa en las correspondientes células madre cultivadas en matraces estándar T-175, según se calcula mediante la regulación del número de veces (donde un asterisco indica un miARN en el que se prefiere al menos una disminución de la regulación de dos veces):
hsa-miR-7*
hsa-miR-106b*
hsa-miR-101*
hsa-miR-302a*
hsa-miR-301a*
hsa-miR-183*
hsa-miR-219-5p*
hsa-miR-18a*
hsa-miR-15a*
hsa-miR-182*
hsa-miR-33a*
hsa-miR-96*
hsa-miR-18b*
En una realización adicional, los exosomas de NSC de la invención comprenden (i) un mayor nivel de al menos uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis o siete de los miARN indicados anteriormente como aumentados en exosomas en comparación con la correspondientes células en cultivo estándar y (ii) un menor nivel de al menos uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez o más de los miARN indicados anteriormente como disminuidos en exosomas en comparación con las correspondientes células en cultivo estándar. Por ejemplo, un exosoma de células madre neurales puede contener un aumento de cuánto se regula en tres o más de los miARN indicados anteriormente como aumentados en exosomas en comparación con las correspondientes células en cultivo estándar y una disminución en el número de cuánto se regula en tres o más de los miARN indicados anteriormente como disminuidos en los exosomas en comparación con las correspondientes células en cultivo estándar. En otra realización a modo de ejemplo, un exosoma de células madre neurales puede contener un aumento en cuánto se regula en cinco o más de los miARN indicados anteriormente como aumentados en exosomas en comparación con las correspondientes células en cultivo estándar y una disminución de cuánto se regula en cinco o más de los miARN indicados anteriormente como disminuidos en los exosomas en comparación con las células correspondientes en cultivo estándar.
El término "expresado" se usa para describir la presencia de un marcador dentro de una célula o micropartícula. Para que se considere que se expresa, un marcador debe estar presente en un nivel detectable. Por "nivel detectable" se entiende que el marcador puede detectarse usando una de las metodologías estándar de laboratorio tales como qRT-PCR o qPCR, transferencia, espectrometría de masas o análisis FACS. Se considera que un gen se expresa mediante una célula o micropartícula de la población de la invención si la expresión puede detectarse razonablemente a valores de punto de cruce (cp) por debajo o igual a 35. Los términos "expresar" y "expresión"
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tienen significados correspondientes. En un nivel de expresión por debajo de este valor de cp, se considera que un marcador no se expresa. La comparación entre el nivel de expresión de un marcador en una célula madre o micropartícula de la invención, y el nivel de expresión del mismo marcador en otra célula o micropartícula, tal como por ejemplo una célula madre mesenquimal, preferiblemente se puede realizar comparando los dos tipos de células/micropartículas que se han aislado de la misma especie. Preferiblemente, esta especie es un mamífero, y más preferiblemente esta especie es humana. Dicha comparación se puede llevar a cabo convenientemente usando un experimento de reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR).
Como se usa en el presente documento, el término "expresión significativa" o sus términos equivalentes "positivo" y "+" cuando se usan con respecto a un marcador se entenderá que significan que, en una población de células o micropartículas, más del 20%, preferiblemente más de, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% o incluso todas las células de las células/micropartículas expresan dicho marcador.
Como se usa en el presente documento, "negativo" o "-" como se usa con respecto a los marcadores se debe entender que significa que, en una población de células o micropartículas, menos del 20%, 10%, preferiblemente menos del 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% o ninguna de las células/micropartículas expresan dicho marcador.
La expresión de marcadores de superficie de micropartículas puede determinarse, por ejemplo, mediante citometría de flujo y/o FACS para un marcador de superficie celular específico usando métodos y aparatos convencionales (por ejemplo, un sistema de FACS Beckman Coulter Epics XL utilizado con anticuerpos comercialmente disponibles y protocolos estándar conocidos en la técnica) para determinar si la señal para un marcador de superficie de micropartículas específico es mayor que una señal de fondo. La señal de fondo se define como la intensidad de señal generada por un anticuerpo no específico del mismo isotipo que el anticuerpo específico utilizado para detectar cada marcador de superficie. Para que un marcador se considere positivo, la señal específica observada es típicamente mayor al 20%, preferiblemente más fuerte que el 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 500%, 1.000%, 5.000%, 10.000% o superior, mayor con respecto a la intensidad de la señal de fondo. Los métodos alternativos para analizar la expresión de marcadores de superficie de micropartículas de interés incluyen el análisis visual mediante microscopía electrónica usando anticuerpos contra marcadores de superficie celular de interés.
"Clasificación celular activada por fluorescencia (FACS)" es un método de purificación celular basado en el uso de anticuerpos marcados en forma fluorescente. Los anticuerpos se dirigen a un marcador en la superficie de la célula y, por lo tanto, se unen a las células de interés. Las células se separan en función del pico de emisión de fluorescencia de las células.
Los marcadores de micropartículas (que incluyen proteínas superficiales e intracelulares) también se pueden analizar mediante diversos métodos conocidos por los expertos en la técnica para analizar la expresión de proteínas, que incluyen, pero no se limitan a, electroforesis en gel seguida de transferencia Western con anticuerpos adecuados, inmunoprecipitación seguida por análisis electroforético, y/o microscopía electrónica como se describió anteriormente, con permeabilización de micropartículas para marcadores de intrapartículas. Por ejemplo, la expresión de una o más tetraspaninas se puede ensayar usando uno o más de los métodos anteriores o cualquier otro método conocido por un experto en la técnica. Los niveles de ARN también se pueden analizar para evaluar la expresión del marcador, por ejemplo qRT-PCR.
Función de la micropartícula
Como se indicó anteriormente, una micropartícula de células madre neurales conserva al menos una función biológica de la célula madre de la que se deriva. Las funciones biológicas que pueden conservarse incluyen la capacidad de promover la angiogénesis, la regeneración tisular, la reparación tisular y/o la neurogénesis, la capacidad de mejorar la función cognitiva en el cerebro de un paciente que ha sufrido un accidente cerebrovascular o la capacidad de acelerar la recuperación del flujo sanguíneo en la enfermedad arterial periférica.
Por ejemplo, se sabe que las células CTX0E03 inhiben la activación de células T en un ensayo de PBMC y, en una realización, las micropartículas de la invención conservan esta capacidad para inhibir la activación de células T en un ensayo de PBMC. Los ensayos de PBMC son bien conocidos por la persona experta y los kits para realizar el ensayo están disponibles en el mercado.
El Ejemplo 8, la Tabla 2 y la Figura 6 demuestran que los exosomas de células madre CTX0E03 retienen la capacidad de cerrar una herida en un modelo de "raspado" de cicatrización de heridas. Los resultados muestran que la actividad de migración de fibroblastos dérmicos humanos normales (NHDF) cultivados en medios condicionados con CTX0E03 es casi la misma que la actividad de migración observada en la adición de exosomas purificados. Por consiguiente, una función biológica que las micropartículas de la invención pueden retener es la capacidad de estimular la actividad de migración de fibroblastos dérmicos humanos normales (NHDF). Los ensayos de migración de NHDF son conocidos en la técnica. La estimulación de la migración de NHDF puede determinarse usando un ensayo de raspado in vitro (cierre de heridas), por ejemplo, el ensayo del Ejemplo 8 (A). El cierre de la herida se calcula como el área cubierta por las células NHDF en relación con el área inicial de la herida, según se determina a
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las 0 horas. La estimulación de la migración de NHDF en este ensayo típicamente se define como un aumento en el cierre de la herida, típicamente un cierre de la herida al menos 1,2 veces mayor, más típicamente al menos 1,5 veces mayor, que el cierre de la herida bajo condiciones basales (sin las micropartículas) después de 24 horas . Después de 48 horas, el cierre de la herida es típicamente al menos 1,2 veces mayor o 1,5 veces mayor, más típicamente al menos 2 veces mayor, que el cierre de la herida en condiciones basales (sin las micropartículas). La estimulación de la migración de NHDF también se puede definir como la causa de un cierre de la herida del 100%, de acuerdo a lo determinado por el ensayo de raspado, al menos 24 horas antes de que se observe un 100% de cierre de la herida en condiciones basales.
El ejemplo 8 también muestra que las microvesículas de la invención son capaces de estimular la angiogénesis de las HUVEC primarias y de estimular la excreción de neuritas de las células PC-12. Por consiguiente, una función biológica que las micropartículas de la invención pueden retener es la capacidad de estimular la angiogénesis de las HUVEC primarias y/o estimular la excreción de neuritas de las células PC-12. Los ensayos de angiogénesis y excreción de neuritas son conocidos en la técnica. La estimulación de la angiogénesis de las HUVEC primarias puede determinarse usando un ensayo de angiogénesis de 24 horas usando un microportaobjetos marca Ibidi y detección y análisis WimTube de la longitud del tubo y los puntos de bifurcación, por ejemplo, el ensayo del Ejemplo 8 (B). La estimulación de la angiogénesis en este ensayo típicamente se define como un aumento en comparación con la angiogénesis basal, por ejemplo, > 100% de angiogénesis basal, típicamente al menos 110%, al menos 120% o al menos 140% de angiogénesis basal (es decir, al menos 1,1 veces, al menos 1,2 veces o al menos 1,4 veces el nivel basal de angiogénesis). La estimulación de la excreción de neuritas puede determinarse detectando la excreción de células PC-12 a través de un inserto de 1 pm, por ejemplo, el ensayo del Ejemplo 8 (C). La estimulación de la excreción de neuritas en este ensayo se define típicamente como un aumento en la excreción de neuritas en comparación con condiciones basales (sin micropartículas), o un aumento en la excreción de neuritas cuando la micropartícula se combina con NGF en comparación con la adición de NGF solo, cuantificado por medio de un espectrofotómetro.
El análisis proteómico en el Ejemplo 13 indica que los exosomas de células madre neurales comprenden funciones biológicas asociadas con la producción, el empaquetamiento, la función y la degradación del material genético. Por consiguiente, en una realización, los exosomas de la invención conservan estas funciones, típicamente una o más de las funciones de la ARN polimerasa, la función de degradación del ARN, la función del ribosoma y la función del espliceosoma.
Inmunogenicidad
Las micropartículas de células madre neurales (alogénicas) de la invención típicamente no desencadenan una respuesta inmune in vitro o in vivo o desencadenan una respuesta inmune que es sustancialmente más débil que la que se esperaría que se desencadene tras la inyección de una población de células madre alogénicas en un paciente. En ciertos aspectos de la invención, se considera que las micropartículas de células madre neuronales no desencadenan una respuesta inmune si al menos aproximadamente el 70% de las micropartículas no desencadena una respuesta inmune. En algunas realizaciones, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 90% o al menos aproximadamente 95%, 99% o más de las micropartículas no desencadenan una respuesta inmune. Preferiblemente, las micropartículas de la invención no desencadenan una respuesta inmune mediada por anticuerpos o no desencadenan una respuesta inmune humoral. Más preferiblemente, las micropartículas de la invención no desencadenan ni una respuesta mediada por anticuerpo ni una respuesta inmune humoral in vitro. Aún más preferiblemente, las micropartículas de la invención no desencadenan una respuesta inmune de linfocitos mixtos. Un experto en la materia entenderá que la capacidad de las células de la invención para desencadenar una respuesta inmune puede probarse de diversas maneras.
Se ha demostrado previamente que las células CTX0E03 trasplantadas en un modelo de roedor de isquemia de miembros presentan una sobrerregulación más rápida y transitoria de los genes del huésped implicados en la angiogénesis, tales como CCL11, CCL2, CXCL1, CXCL5, IGF1, IL1 p, IL6, HGF, HIF1a, bFGF, VEGFA y VEGFC, en comparación con los controles tratados con vehículo. El tratamiento con hNSC transitoriamente eleva las respuestas inmunes innatas y angiogénicas del huésped y acelera la regeneración tisular.
Se ha demostrado previamente que la línea celular CTX0E03, utilizando un ensayo de PBMC humana, no es inmunogénica. Por consiguiente, también se espera que las micropartículas producidas por las células CTX0E03 sean no inmunogénicas. La falta de inmunogenicidad permite que las micropartículas eviten la eliminación por parte del sistema inmune del huésped/paciente y de ese modo ejerzan su efecto terapéutico sin una respuesta inflamatoria e inmune perjudicial.
Células madre neurales
Las células madre neurales que producen las micropartícula pueden ser una línea de células madre, es decir, un cultivo de células madre que se dividen establemente. Una línea de células madre puede cultivarse en grandes cantidades utilizando una fuente única definida. La inmortalización puede surgir de un evento espontáneo o puede lograrse introduciendo información genética exógena en la célula madre que codifica factores de inmortalización,
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dando como resultado un crecimiento celular ilimitado de la célula madre en condiciones de cultivo adecuadas. Tales factores genéticos exógenos pueden incluir el gen "myc", que codifica el factor de transcripción Myc. La información genética exógena se puede introducir en la célula madre a través de una variedad de medios adecuados, tales como transfección o transducción. Para la transducción, puede usarse un vehículo viral genéticamente modificado, tal como uno derivado de retrovirus, por ejemplo, lentivirus.
Se pueden obtener ventajas adicionales usando una línea de células madre inmortalizadas condicionalmente, en las que la expresión del factor de inmortalización se puede regular sin afectar adversamente la producción de micropartículas terapéuticamente efectivas. Esto puede lograrse introduciendo un factor de inmortalización que es inactivo a menos que se le suministre a la célula un agente activador. Tal factor de inmortalización puede ser un gen tal como c-mycER. El producto del gen c-MycER es una proteína de fusión que comprende una variante de c-Myc fusionada al dominio de unión al ligando de un receptor de estrógeno mutante. C-MycER solo impulsa la proliferación celular en presencia del esteroide sintético 4-hidroxitamoxifeno (4-OHT) (Littlewood et al., 1995). Este enfoque permite la expansión controlada de células madre neurales in vitro, evitando efectos in vivo no deseados en la proliferación de células huésped (por ejemplo, formación de tumores) debido a la presencia de c-Myc o el gen que la codifica en micropartículas derivadas de la línea de células madre neurales. Una célula madre neural adecuada inmortalizada condicionalmente con c-mycER se describe en la patente de los Estados Unidos No. 7.416.888. El uso de una línea de células madre neurales condicionalmente inmortalizadas proporciona, por lo tanto, una mejora sobre el aislamiento y la producción de micropartículas de células madre existentes.
Las líneas celulares inmortalizadas condicionalmente preferidas incluyen las líneas de células madre neurales CTX0E03, STR0C05 y HPC0A07, que se han depositado en la Colección Europea de Cultivos Animales (ECACC), Laboratorios de Investigación y Producción de Vacunas, Servicios de Laboratorios de Salud Pública, Porton Down, Salisbury, Wiltshire, SP4 0JG, con No. de acceso 04091601 (CTX0E03); No. de acceso 04110301 (STR0C05); y No. De acceso 04092302 (HPC0A07). La derivación y procedencia de estas células se describe en el documento EP1645626 B1. Las micropartículas producidas por estas células retienen las ventajas de estas células.
Las células de la línea celular CTX0E03 se pueden cultivar bajo las siguientes condiciones de cultivo:
• Albúmina de suero humana 0,03%
• Transferrina, humana 5 pg/mL
• Dihidrocloruro de putrescina 16,2 pg/mL
• Insulina humana recombinante 5 p/mL
• Progesterona 60 ng/mL
• L-Glutamina 2 mM
• Selenito de sodio (selenio) 40 ng/mL
Factor de crecimiento de fibroblastos básico Plus (10 ng/mL), factor de crecimiento epidérmico (20 ng/mL) y 4- hidroxitamoxifeno 100 nM para expansión celular. Las células se pueden diferenciar mediante la remoción del 4- hidroxitamoxifeno. Típicamente, las células se pueden cultivar con 5% de CO2/37°C o bajo condiciones hipóxicas de 5%, 4%, 3%, 2% o 1% de O2. Estas líneas celulares no requieren que el suero se cultive con éxito. Se requiere suero para el cultivo exitoso de muchas líneas celulares, pero contiene muchos contaminantes, incluidos sus propios exosomas. Otra ventaja de las líneas de células madre neurales CTX0E03, STR0C05 o HPC0A07, o cualquier otra línea celular que no requiera suero, es que se evita la contaminación por suero.
Las células de la línea celular CTX0E03 (y micropartículas derivadas de estas células) son células multipotentes derivadas originalmente de la corteza fetal humana de 12 semanas. El aislamiento, la fabricación y los protocolos para la línea celular CTX0E03 se describen en detalle por Sinden, et al., (Patente de los Estados Unidos No. 7.416.888 y el documento EP1645626 B1). Las células CTX0E03 no son "células madre embrionarias", es decir, no son células pluripotentes derivadas de la masa celular interna de un blastocisto; el aislamiento de las células originales no dio como resultado la destrucción de un embrión.
Las células CTX0E03 (y micropartículas derivadas de estas células) son angiogénicas y, por lo tanto, son útiles en el tratamiento de enfermedades que requieren angiogénesis, tales como la enfermedad arterial periférica. Las células (y micropartículas derivadas de estas células) también son neurogénicas y, por lo tanto, son útiles en el tratamiento de enfermedades que requieren neurogénesis, tal como el cerebro dañado por isquemia (accidente cerebrovascular). CTX0E03 es una línea celular clonal que contiene una copia única del transgén c-mycER que se administró por infección retroviral y está regulada condicionalmente por 4-OHt (4-hidroxitamoxifeno). El transgén C- mycER expresa una proteína de fusión que estimula la proliferación celular en presencia de 4-OHT y, por lo tanto, permite la expansión controlada cuando se cultiva en presencia de 4-OHT. Esta línea celular es clonal, se expande rápidamente en cultivo (duplicando el tiempo 50-60 horas) y tiene un cariotipo humano normal (46 XY). Es genéticamente estable y se puede cultivar en grandes cantidades.
Las células son seguras y no tumorigénicas. En ausencia de factores de crecimiento y 4-OHT, las células experimentan detención del crecimiento y se diferencian en neuronas y astrocitos. Una vez implantados en un
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cerebro dañado por isquemia, estas células migran solo a áreas de daño tisular.
El desarrollo de la línea celular CTX0E03 ha permitido el escalamiento de un producto consistente para uso clínico. La producción de células a partir de materiales apilados permite la generación de células en cantidades para aplicaciones comerciales (Hodges et al., 2007).
Pollock et al., 2006 describe que el trasplante de CTX0E03 en un modelo de accidente cerebrovascular en ratas (MCAo) causó mejorías estadísticamente significativas tanto en la función sensomotora como en la asimetría motora gruesa a las 6-12 semanas posteriores al injerto. Estos datos indican que CTX0E03 tiene las características biológicas y de fabricación apropiadas necesarias para el desarrollo como una línea celular terapéutica.
Stevanato et al., 2009 confirman que las células CTX0E03 subregularon la expresión del transgén c-mycERTAM tanto in vitro después del retiro de EGF, bFGF de 4-OHT como in vivo después del implante en cerebro de rata de MCAo. El silenciamiento del transgén c-mycERTAM in vivo proporciona una característica de seguridad adicional de las células CTX0E03 para una posible aplicación clínica.
Smithet et al., 2012 describen el ensayo de eficacia preclínica de CTX0E03 en un modelo de accidente cerebrovascular en rata (oclusión transitoria de la arteria cerebral media). Los resultados indican que los implantes de CTX0E03 recuperan de manera robusta la disfunción conductual durante un período de tiempo de 3 meses y que este efecto es específico de su sitio de implantación. La topología de la lesión es potencialmente un factor importante en la recuperación, con un accidente cerebrovascular limitado al cuerpo estriado que muestra un mejor resultado en comparación con un área más grande de daño.
Las líneas de células madre retinianas neurales (por ejemplo, como se describe en la patente de Estados Unidos No. 7.514.259) también pueden usarse de acuerdo con la invención.
El término "medio de cultivo" o "medio" se reconoce en la técnica, y se refiere en general a cualquier sustancia o preparación utilizada para el cultivo de células vivas. El término "medio", como se usa en referencia a un cultivo celular, incluye los componentes del entorno que rodea las células. Los medios pueden ser sólidos, líquidos, gaseosos o una mezcla de fases y materiales. Los medios incluyen medios de cultivo líquidos, así como medios líquidos que no sostienen el crecimiento celular. Los medios también incluyen medios gelatinosos tales como agar, agarosa, gelatina y matrices de colágeno. Los ejemplos de medios gaseosos incluyen la fase gaseosa a la que están expuestas las células que crecen en una placa de Petri u otro soporte sólido o semisólido. El término "medio" también se refiere al material que está destinado para su uso en un cultivo celular, incluso si todavía no se ha contactado con las células. En otras palabras, un líquido rico en nutrientes preparado para cultivo bacteriano es un medio. De manera similar, una mezcla en polvo que cuando se mezcla con agua u otro líquido se vuelve adecuada para el cultivo celular puede denominarse un "medio en polvo". "Medio definido" se refiere a los medios que están hechos de componentes químicamente definidos (generalmente purificados). Los "medios definidos" no contienen extractos biológicos mal caracterizados, como extracto de levadura y caldo de carne. El "medio enriquecido" incluye medios diseñados para respaldar el crecimiento de la mayoría o todas las formas viables de una especie en particular. Los medios ricos a menudo incluyen extractos biológicos complejos. Un "medio adecuado para el crecimiento de un cultivo de alta densidad" es cualquier medio que permita que un cultivo celular alcance una OD600 de 3 o mayor cuando otras condiciones (tales como la temperatura y la velocidad de transferencia de oxígeno) permitan dicho crecimiento. El término "medio basal" se refiere a un medio que promueve el crecimiento de muchos tipos de microorganismos que no requieren ningún complemento nutricional especial. La mayoría de los medios basales generalmente forman parte de cuatro grupos químicos básicos: aminoácidos, carbohidratos, sales inorgánicas y vitaminas. Un medio basal generalmente sirve como base para un medio más complejo, al que se agregan suplementos tales como suero, reguladores, factores de crecimiento, lípidos y similares. En un aspecto, el medio de cultivo puede ser un medio complejo con los factores de crecimiento necesarios para soportar el crecimiento y la expansión de las células de la invención mientras se mantiene su capacidad de autorrenovación. Ejemplos de medios basales incluyen, entre otros, medio basal de Eagle, medio esencial mínimo, medio de Eagle modificado por Dulbecco, medio 199, mezclas nutrientes F-10 de Ham y F-12 de Ham, 5A de McCoy, MEM/FI 2 de Dulbecco, RPMI 1640, y medio de Dulbecco modificado por Iscove (IMDM).
Composiciones farmacéuticas
La micropartícula de células madre neurales de la invención es útil en terapia y, por lo tanto, se puede formular como una composición farmacéutica. Una composición farmacéuticamente aceptable típicamente incluye al menos un portador, diluyente, vehículo y/o excipiente farmacéuticamente aceptable además de las micropartículas de la invención. Un ejemplo de un portador adecuado es la solución de Lactato de Ringer. En Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20a edición, ISBN: 0683306472 se brinda una discusión detallada de dichos componentes.
La frase "farmacéuticamente aceptable" se emplea en la presente memoria para referirse a aquellos compuestos, materiales, composiciones, y/o formas de dosificación que son, dentro del alcance del buen juicio médico, adecuados para el uso en contacto con los tejidos de los seres humanos y animales sin toxicidad excesiva, irritación, respuesta alérgica u otro problema o complicación, acorde con una relación beneficio/riesgo razonable.
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La composición, si se desea, también puede contener cantidades menores de agentes reguladores del pH. El portador puede comprender medios de almacenamiento tales como Hypothermosol®, disponible comercialmente a través de BioLife Solutions Inc., EE.UU. Los ejemplos de vehículos farmacéuticos adecuados se describen en "Remington's Pharmaceutical Sciences" por EW Martin. Dichas composiciones contendrán una cantidad profiláctica o terapéuticamente efectiva de una micropartícula profiláctica o terapéutica preferiblemente en forma purificada, junto con una cantidad adecuada de vehículo para proporcionar la forma de una administración adecuada al sujeto. La formulación debe adecuarse al modo de administración. En una realización preferida, las composiciones farmacéuticas son estériles y están en forma adecuada para la administración a un sujeto, preferiblemente un sujeto animal, más preferiblemente un sujeto mamífero, y lo más preferiblemente un sujeto humano.
La composición farmacéutica de la invención puede estar en una variedad de formas. Estas incluyen, por ejemplo, formas de dosificación semisólidas y líquidas, tales como preparaciones liofilizadas, soluciones o suspensiones líquidas, soluciones inyectables e infusibles. La composición farmacéutica es preferiblemente inyectable. Una ventaja particular de las micropartículas de la invención es su robustez mejorada en comparación con las células madre de las que se obtienen; las micropartículas pueden, por lo tanto, someterse a formulación, tal como liofilización, que no sería adecuada para células madre.
Se prefiere que los métodos, medicamentos y composiciones de la invención se usen para tratar o reparar tejido dañado, y/o para el tratamiento, la modulación, la profilaxis y/o la mejora de uno o más síntomas asociados con trastornos tisulares. Particularmente preferido es el uso de los métodos, medicamentos, composiciones y micropartículas de la invención en terapia regenerativa, típicamente el tratamiento de accidente cerebrovascular, enfermedad arterial periférica o enfermedades que causan ceguera de la retina.
Las composiciones farmacéuticas generalmente estarán en forma acuosa. Las composiciones pueden incluir un conservante y/o un antioxidante.
Para controlar la tonicidad, la composición farmacéutica puede comprender una sal fisiológica, tal como una sal de sodio. Se prefiere cloruro de sodio (NaCl), que puede estar presente entre 1 y 20 mg/mL. Otras sales que pueden estar presentes incluyen cloruro de potasio, dihidrogenofosfato de potasio, fosfato de disodio deshidratado, cloruro de magnesio y cloruro de calcio.
Las composiciones pueden incluir uno o más reguladores. Los reguladores típicos incluyen: un regulador de fosfato; un regulador Tris; un regulador de borato; un regulador de succinato; un regulador de histidina; o un regulador de citrato. Los reguladores generalmente se incluirán en una concentración en el intervalo de 5-20 mM. El pH de una composición generalmente estará entre 5 y 8, y más típicamente entre 6 y 8, por ejemplo, entre 6,5 y 7,5, o entre 7,0 y 7,8.
La composición es preferiblemente estéril. La composición está preferiblemente libre de gluten. La composición es preferiblemente no pirogénica.
En una realización típica, las micropartículas se suspenden en una composición que comprende ácido 6-hidroxi- 2,5,7,8-tetrametilcroman-2-carboxílico (Trolox®), Na+, K+, Ca2+, Mg2+, Cl-, H2P04", HePES, lactobionato, sacarosa, manitol, glucosa, dextrón-40, adenosina y glutatión. Típicamente, la composición no incluirá un disolvente aprótico dipolar, por ejemplo, DMSO. Las composiciones adecuadas están disponibles comercialmente, por ejemplo, HypoThermasol®-FRS. Tales composiciones son ventajosas ya que permiten que las micropartículas se almacenen a 4°C a 25°C durante períodos prolongados (horas a días) o se conservan a temperaturas criogénicas, es decir, temperaturas por debajo de -20°C. Las micropartículas pueden administrarse luego en esta composición después de la descongelación.
La composición farmacéutica puede administrarse por cualquier ruta apropiada, que será evidente para el experto en la materia dependiendo de la enfermedad o condición a tratar. Las vías de administración típicas incluyen intravenosa, intraarterial, intramuscular, subcutánea, intracraneal, intranasal o intraperitoneal. Para el tratamiento de un trastorno del cerebro, una opción es administrar las micropartículas intracerebralmente, típicamente al sitio de daño o enfermedad.
Las micropartículas se administrarán a una dosis terapéutica o profilácticamente efectiva, que será evidente para la persona experta. Debido a la baja o inexistente inmunogenicidad de las micropartículas, es posible administrar dosis repetidas sin inducir una respuesta inmune perjudicial.
Usos terapéuticos
Las micropartículas de la invención son útiles en el tratamiento o profilaxis de enfermedades. Por consiguiente, la invención incluye un método para tratar o prevenir una enfermedad o trastorno en un paciente que usa una micropartícula de la invención. El término "paciente" incluye sujetos humanos y otros mamíferos que reciben tratamiento profiláctico o terapéutico.
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Como se indicó anteriormente, las composiciones que comprenden miARN de la invención también son útiles en estas terapias, y las referencias a usos terapéuticos de micropartículas en la presente memoria se aplican, por lo tanto, por igual a las composiciones que comprenden miARN.
Las micropartículas terapéuticamente útiles de la invención tienen actividad regenerativa. Una micropartícula que tiene actividad regenerativa es una micropartícula que es capaz de activar o mejorar procesos regenerativos, o inhibir o reducir procesos degenerativos. Los procesos regenerativos conducen a la renovación, restauración, reparación y/o crecimiento de células y tejidos. Los procesos degenerativos conducen a la pérdida de la integridad y/o función de la célula o el tejido. Esto puede ser particularmente útil en el tratamiento de células o tejidos dañados o alterados, como los resultantes de accidente cerebrovascular, trastornos psiquiátricos, infarto de miocardio, esclerosis lateral amiotrófica y enfermedad arterial periférica.
Las micropartículas de la invención son útiles en la regeneración de tejidos. La "regeneración tisular" es el proceso de aumentar la cantidad de células en un tejido después de un trauma. El trauma puede ser cualquier cosa que hace que el número de células disminuya. Por ejemplo, un accidente, un trastorno autoinmune o un estado de enfermedad podrían constituir un trauma. La regeneración tisular aumenta el número de células dentro del tejido y permite restablecer las conexiones entre las células del tejido y recuperar la funcionalidad del tejido.
La terapia puede ser terapia regenerativa que requiere reemplazo, regeneración o reparación de tejido. La terapia puede ser para una enfermedad, trastorno o déficit neurológico. La terapia puede mejorar la recuperación funcional y/o cognitiva. La terapia puede ser de accidente cerebrovascular, enfermedad arterial periférica, neuropatía o cualquier otra enfermedad o trastorno que requiera regeneración tisular, revascularización o acción antiinflamatoria local, que incluye:
(i) Trastorno, enfermedad o déficit neurológico, tal como enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, accidente cerebrovascular o ALS;
(ii) Trastornos de almacenamiento lisosomal;
(iii) Trastornos cardiovasculares, tales como infarto de miocardio, insuficiencia cardíaca congestiva, enfermedad arterial periférica, úlceras diabéticas, cicatrización de heridas;
(iv) Enfermedades del pulmón, que incluyen fibrosis pulmonar idiopática, síndrome de dificultad respiratoria, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, hipertensión pulmonar idiopática, fibrosis quística y asma;
(v) Trastornos metabólicos o inflamatorios, tales como diabetes (I o II), artritis reumatoide, osteoartritis, lupus, enfermedad de Crohn, enfermedad inflamatoria intestinal o enfermedad de injerto contra huésped;
(vi) Trastornos psiquiátricos, tales como depresión, trastorno bipolar, esquizofrenia o un trastorno del síndrome autista como autismo, síndrome de Asperger o síndrome de Rett;
(vii) Enfermedades de la retina que causan ceguera, tales como la degeneración macular relacionada con la edad, enfermedad de Stargardt, retinopatía diabética, retinitis pigmentosa; y
(viii) Enfermedades desmielinizantes, como esclerosis múltiple, parálisis cerebral, mielinólisis central pontina, tabes dorsal, mielitis transversa, enfermedad de Devic, leucoencefalopatía multifocal progresiva, neuritis óptica, leucodistrofias, síndrome de Guillain-Barré, neuropatía periférica anti-MAG y enfermedad de Charcot-Marie-Tooth.
En una realización, la micropartícula y las composiciones que las contienen no se usan para la modulación inmune. En una realización, la terapia no está relacionada con la inmunomodulación.
La invención también proporciona un método para tratar o prevenir una enfermedad o afección que comprende administrar una cantidad eficaz de la micropartícula de la invención, tratando o previniendo así la enfermedad. Típicamente, la enfermedad o condición es como se identificó anteriormente.
Las micropartículas de la invención pueden usarse para tratar las mismas enfermedades que las células madre de las que se obtienen. Se sabe que las células madre neurales son útiles en el tratamiento de enfermedades que incluyen: accidente cerebrovascular, daño cerebral tal como déficit motor, sensorial y/o cognitivo, trastornos psiquiátricos, infarto de miocardio, esclerosis lateral amiotrófica, isquemia de las extremidades, enfermedad arterial periférica. Por consiguiente, las micropartículas de la invención también son útiles en el tratamiento del accidente cerebrovascular, daño cerebral tal como déficit motor, sensorial y/o cognitivo, trastornos psiquiátricos, infarto de miocardio, esclerosis lateral amiotrófica, isquemia de la extremidad, enfermedad arterial periférica.
La Figura 6 y el Ejemplo 8 demuestran que los exosomas obtenidos a partir de células madre neurales estimulan la curación de heridas. Por consiguiente, en una realización, los exosomas de la invención se usan para tratar una enfermedad o afección que requiere reemplazo, regeneración o reparación de tejido. Tales afecciones incluyen úlceras diabéticas y curación de heridas. La Figura 6C muestra que los exosomas aislados de las NSC cultivadas durante 6 semanas son más eficaces que los exosomas aislados de las NSC cultivadas durante 2 semanas. Por consiguiente, en una realización, los exosomas aislados de las NSC (típicamente células CTX0E03) que se han cultivado (típicamente en un biorreactor de múltiples compartimientos) durante al menos 2 semanas, más típicamente al menos 4 semanas o al menos 6 semanas, se usan para tratar una enfermedad o condición que requiere reemplazo, regeneración o reparación del tejido. Opcionalmente, las NSC se han cultivado durante no más
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de diez semanas, por ejemplo, entre 2 y 10 semanas, entre 3 y 10 semanas, entre 4 y 10 semanas, entre 5 y 10 semanas o entre 6 y 10 semanas.
La eficacia aumentada observada de los exosomas aislados de las NSC (células CTX0E03) que se han cultivado (en un biorreactor de múltiples compartimientos) durante 6 semanas se correlaciona con la reducción observada en el tamaño de los exosomas hasta alrededor de 70 nm de diámetro, lo que también ocurrió después cultivando las células durante 6 semanas. Por consiguiente, en una realización, los exosomas aislados de las NSC (típicamente células CTX0E03) que se han cultivado (típicamente en un biorreactor de múltiples compartimientos) durante al menos 6 semanas se usan para tratar una enfermedad o afección que requiere reemplazo, regeneración o reparación tisular. Como se indicó anteriormente, opcionalmente las NSC se han cultivado durante no más de diez semanas, por ejemplo, entre 6 y 10 semanas. En otra realización, los exosomas aislados de las NSC (típicamente células CTX0E03) que tienen un diámetro menor que 100 nm, típicamente menor que 80 nm, por ejemplo alrededor de 70 nm de diámetro, se usan para tratar una enfermedad o afección que requiere reemplazo, regeneración o reparación del tejido.
Como se muestra en la Figura 12 y se discute en el Ejemplo 8, las microvesículas obtenidas a partir de células madre neurales estimulan la angiogénesis. Por consiguiente, en una realización, las microvesículas de la invención se usan para tratar una enfermedad o afección que requiere angiogénesis, típicamente una enfermedad o trastorno que se trata mediante regeneración y/o revascularización de tejido. Las microvesículas de la invención pueden usarse en el tratamiento de trastornos cardiovasculares, tales como infarto de miocardio, insuficiencia cardíaca congestiva, enfermedad arterial periférica, úlceras diabéticas y curación de heridas. La estimulación de la angiogénesis también es terapéuticamente útil en el tratamiento de la isquemia, en particular la isquemia cardíaca y la isquemia de las extremidades. La Figura 12 muestra que las microvesículas recogidas a partir de las NSC cultivadas durante al menos 3 semanas son más eficaces que las microvesículas aisladas a partir de las NSC cultivadas durante 1 o 2 semanas. Por consiguiente, en una realización, se usan microvesículas aisladas de NSC (típicamente células CTX0E03) que se han cultivado (típicamente en un biorreactor de múltiples compartimientos) durante al menos 3 semanas, más típicamente al menos 4 semanas o al menos 6 semanas, para tratar una enfermedad o condición que requiere angiogénesis. Opcionalmente, las NSC se han cultivado durante no más de diez semanas, por ejemplo, entre 3 y 10 semanas, entre 4 y 10 semanas, entre 5 y 10 semanas o entre 6 y 10 semanas.
Como se muestra en la Figura 13 y se discute en el Ejemplo 8, las microvesículas obtenidas a partir de células madre neurales estimulan la excrecencia de neuritas. Por consiguiente, en una realización, las microvesículas de la invención se usan para tratar una enfermedad, trastorno o déficit neurológico, tales como enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, accidente cerebrovascular, neuropatía o ALS.
En aplicaciones profilácticas, las composiciones farmacéuticas o medicamentos se administran a un paciente susceptible, o bien en riesgo de una enfermedad particular en una cantidad suficiente para eliminar o reducir el riesgo o retrasar el comienzo de la enfermedad. En aplicaciones terapéuticas, las composiciones o medicamentos se administran a un paciente del que se sospecha, o que ya padece dicha enfermedad, en una cantidad suficiente para curar, o al menos detener parcialmente, los síntomas de la enfermedad y sus complicaciones. Una cantidad adecuada para lograr esto se define como una dosis terapéutica o farmacéuticamente efectiva. Tanto en los regímenes profiláctico como terapéutico, los agentes se administran típicamente en varias dosis hasta que se ha logrado una respuesta suficiente. Normalmente, la respuesta se controla y se administran dosis repetidas si la respuesta comienza a desvanecerse.
Las micropartículas de la invención se pueden combinar opcionalmente con una célula madre para proporcionar una terapia de combinación. La célula madre es opcionalmente la célula madre de la que se deriva la micropartícula, por ejemplo, si la micropartícula es un exosoma de una célula CTX0E03, entonces la célula madre para uso en terapia de combinación puede ser una célula CTX0E03. Una célula madre y una micropartícula se pueden administrar opcionalmente (i) juntas en una única composición farmacéutica, (ii) administrarse al mismo tiempo o simultáneamente pero de forma separada, o (iii) administrarse por separado y secuencialmente, por ejemplo, célula madre seguida de micropartícula, o micropartícula seguida de célula madre. Cuando la célula madre y la micropartícula se administran por separado y secuencialmente, la duración entre la administración de la célula y la micropartícula puede ser de una hora, un día, una semana, dos semanas o más.
En una realización, una terapia profiláctica induce tolerancia, típicamente inmunotolerancia, en un huésped que va a recibir las células madre de las que deriva la micropartícula. En una realización, la administración de una o más dosis de micropartículas de la invención a un paciente, antes de la administración de una terapia de células madre, se puede usar para reducir el riesgo de una respuesta inmune adversa, es decir, "rechazo", de la terapia de células madre. En otra realización, la tolerancia a las células madre puede aumentarse administrando células madre junto con micropartículas de la invención, como se discutió anteriormente.
Las dosis efectivas de las composiciones de la presente invención, para el tratamiento de las afecciones descritas anteriormente varían dependiendo de muchos factores diferentes, que incluyen medios de administración, sitio objetivo, estado fisiológico del paciente, si el paciente es humano o un animal, otros medicamentos administrados y
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si el tratamiento es profiláctico o terapéutico. Por lo general, el paciente es un humano.
Se ha demostrado que la línea celular CTX0E03 es eficaz en el tratamiento del accidente cerebrovascular, enfermedad arterial periférica, daño cerebral tal como el déficit motor, sensorial y/o cognitivo y trastornos psiquiátricos. Las células se están probando actualmente en un ensayo clínico para el tratamiento de pacientes con accidente cerebrovascular con discapacidad (Clinicaltrials.gov, identificador: NCT01151124). El documento WO-A- 2012/004611 describe el uso de las células CTX0E03 en el tratamiento de trastornos psiquiátricos que incluyen la depresión unipolar y bipolar, la esquizofrenia, el trastorno obsesivo compulsivo, el autismo y los trastornos del síndrome autista. En consecuencia, las micropartículas producidas por las células CTX0E03 también pueden tratar accidente cerebrovascular, enfermedad arterial periférica, enfermedades de la retina que causan ceguera (tales como retinitis pigmentosa), daño cerebral tal como un déficit motor, sensorial y/o cognitivo y trastornos psiquiátricos.
Como se usa en el presente documento, los términos "tratar", "tratamiento", "que tratar" y "terapia" cuando se usan directamente en referencia a un paciente o sujeto se interpretarán como la mejora de uno o más síntomas asociados con un trastorno, o la prevención o profilaxis de un trastorno o uno o más síntomas asociados con un trastorno. Los trastornos a tratar incluyen, pero no se limitan a, un trastorno degenerativo, un trastorno que implica destrucción tisular, un trastorno neoplásico, un trastorno inflamatorio, una enfermedad autoinmune o una enfermedad mediada inmunológicamente que incluye el rechazo de órganos y tejidos trasplantados. La mejoría o prevención de los síntomas resulta de la administración de las micropartículas de la invención, o de una composición farmacéutica que comprende estas micropartículas, a un sujeto que necesita dicho tratamiento.
Rastreo de células y micropartículas administradas in vivo
La presente invención proporciona un perfil de marcador distinto para micropartículas producidas por células madre neurales. Por lo tanto, es posible detectar la presencia de estas micropartículas in vivo, analizando una muestra obtenida de un paciente y determinando si el perfil del marcador en la muestra coincide con el de las micropartículas. Si el perfil de muestra coincide con el perfil de las micropartículas descritas aquí, entonces esto confirma la presencia de las micropartículas. Esto puede usarse para detectar no solo la presencia y/o biodistribución de las micropartículas en sí mismas, sino también la presencia de células madre que producen las micropartículas. Esto es particularmente útil cuando se detecta si una célula madre administrada in vivo se ha injertado en el tejido del huésped, y/o ha migrado, por ejemplo, en estudios ADME(T).
La detección de las micropartículas in vivo puede usarse para controlar el curso de un tratamiento en el que se administran micropartículas o células madre a un paciente. La determinación de la presencia, ausencia o cantidad de micropartículas o células que producen micropartículas de la invención en un paciente permite que el régimen de dosificación se altere en consecuencia, por ejemplo, para aumentar o disminuir la dosis según se requiera para proporcionar una cantidad efectiva de micropartículas o células madre in vivo.
Métodos de producción de micropartículas
Las micropartículas se aíslan de medios acondicionados de células madre. El "medio acondicionado" (CM) puede ser un medio de cultivo para células madre, que se ha usado para cultivar un cultivo en masa de células madre durante al menos aproximadamente 12 horas, al menos aproximadamente 24 horas, al menos aproximadamente 48 horas o menos 72 horas, típicamente hasta 168 horas (7 días), retiradas y esterilizadas por cualquier medio adecuado, preferiblemente por filtración, antes de su uso, si es necesario.
Alternativamente, las micropartículas se pueden recoger de un biorreactor de dos compartimentos que permite que el cultivo celular, y por lo tanto el medio acondicionado, se mantenga durante períodos de tiempo más largos, por ejemplo al menos 2 semanas, al menos 3 semanas, al menos 4 semanas, al menos 5 semanas, al menos 6 semanas o más. El sistema mantiene las células y las micropartículas secretadas dentro de un compartimento de células pequeñas (aproximadamente 15 mL) que se separa de un depósito más grande de medio por una membrana semipermeable de 10 kDa. Esto permite la eliminación eficiente de los productos de desecho metabólicos a la vez que se mantiene efectivamente una densidad celular extremadamente alta para maximizar la producción de micropartículas. El Ejemplo 9 y las Figuras 7 y 8 demuestran que el uso de un biorreactor de dos compartimentos da como resultado un rendimiento mucho mayor de micropartículas que el obtenido cuando se usa un matraz de cultivo celular estándar (matraz T175).
Las micropartículas pueden separarse de otros componentes del medio con base en el peso molecular, tamaño, forma, radio hidrodinámico, composición, carga, interacción sustrato-ligando, absorbancia o dispersión de ondas electromagnéticas, o actividad biológica. En una realización, el medio acondicionado se filtra utilizando un filtro de tamaño apropiado para separar la micropartícula deseada, por ejemplo un filtro MWCO de 100 K. Opcionalmente, el medio acondicionado con células madre se concentra antes del aislamiento de las micropartículas sometiendo el medio acondicionado con NSC concentrado a cromatografía de exclusión por tamaño. Las fracciones absorbentes de UV pueden seleccionarse entonces para el aislamiento de las micropartículas de interés.
Se pueden aislar diferentes micropartículas de los medios usando diferentes técnicas y parámetros de aislamiento. Por ejemplo, los exosomas tienen una densidad de vesículas de 1,13-1,19 g/mL y se pueden aislar mediante centrifugación diferencial y ultracentrifugación en gradiente de sacarosa a 100.000-200.000 g. Las microvesículas se
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pueden aislar por filtración (MWCO de 100 K) y centrifugación diferencial a 18,000-20,000 g. Las partículas de membrana tienen una densidad de 1,04 a 1,07 g/mL y las vesículas de tipo exosoma tienen una densidad de 1,1 g/mL.
Un método de producción típico comprende: cultivar células madre para producir medios acondicionados; eliminar los residuos celulares por centrifugación a 1.500 rpm; aislar microvesículas (< 1.000 kDa) mediante ultrafiltración a través de un filtro MWCO de 100 K o aislar exosomas (30-100 nm) mediante ultracentrifugación a 120.000 g; seguido por la cuantificación usando un ensayo de proteína BCA.
Células madre inmortalizadas condicionalmente como células productoras de micropartículas
En un aspecto de la invención, se usan células madre condicionadas inmortalizadas para producir micropartículas tales como microvesículas y/o exosomas. Estas células madre inmortalizadas condicionalmente son típicamente células madre neurales, pero pueden ser células madre de cualquier tipo, por ejemplo, una célula madre hematopoyética o una célula madre mesenquimal. Por lo tanto, se proporciona un método para producir micropartículas de células madre, que comprende las etapas de cultivar células madre condicionalmente inmortalizadas y recolectar las micropartículas que son producidas por las células. La inmortalización condicional de células madre se conoce en la técnica, como se describió anteriormente. Para evitar dudas, este método no se limita al uso de células madre neurales.
Cuando la célula madre utilizada para producir micropartículas es una célula madre neural, puede ser cualquiera de las células madre neurales descritas aquí, por ejemplo, la línea celular inmortalizada condicional CTX0E03 que es clonal, estandarizada, muestra una clara seguridad in vitro e in vivo y puede ser fabricada a escala, proporcionando así un recurso único para la producción estable de exosomas. Alternativamente, las células madre neurales pueden ser líneas celulares de células retinianas neurales, opcionalmente como se describe en la patente de estados Unidos No. 7.514.259.
Cuando la célula madre utilizada para producir micropartículas es una célula madre mesenquimal, puede ser opcionalmente una célula madre derivada de tejido adiposo inmortalizado condicionalmente ("ADSC") o una versión inmortalizada condicionalmente de las células madre mesenquimáticas descrita en el documento WO- A- 2009/105044; estas células son CD29+, CD44+, CD49a+/e+, CD105+, CD166+, CD34-, CD45-.
Métodos para inducir la secreción de micropartículas
Los inventores han descubierto que es posible aumentar la producción de micropartículas por las células madre. Este hallazgo, que no se limita a las células madre neurales y puede usarse para la producción de micropartículas de cualquier célula madre, permite obtener un rendimiento mejorado de micropartículas a partir de un cultivo de células madre.
Una primera técnica para aumentar la producción de micropartículas por las células madre es tratar las células madre con uno o más de TGF-p, IFN-y o TNF-a, típicamente entre 1 y 25 ng/mL, por ejemplo, 10 ng/mL, durante entre 12 y 96 horas antes de la eliminación de los medios acondicionados.
Como se explica en el Ejemplo 2 a continuación, se observó que la frecuencia de la aparición de cuerpos multivesiculares (MVB) se alteraba por la presencia de TGF-p, IFN-y o TNF-a (10 ng/mL). La frecuencia fue más alta en presencia de TGF-p, seguido por IFN-y, seguido por TNF-a. Por lo tanto, agregar uno o más de TGF-p, IFN-y o TNF-a al medio de cultivo de células madre estimulará la producción de micropartículas por parte de las células. Las micropartículas se pueden recolectar separando las micropartículas de otros componentes como se describió anteriormente.
Una segunda técnica para aumentar la producción de micropartículas por las células madre es cultivar las células en condiciones hipóxicas. Cultivar células en condiciones hipóxicas es bien conocido por el experto en la técnica, e implica cultivar las células en una atmósfera que tiene un nivel de O2 inferior al atmosférico, es decir, menos del 21% de O2. Esto se logra típicamente colocando las células en una incubadora que permite cambiar los niveles de oxígeno. El cultivo hipóxico generalmente implica cultivar en una atmósfera que contiene menos de 10% de O2, más típicamente 5% o menos de O2, por ejemplo 4% o menos, 3% o menos, 2% o menos, o 1% o menos de O2.
Los inventores también se han dado cuenta de que el cocultivo de células madre con un tipo de célula diferente puede alterar la producción de micropartículas por las células madre. El tipo de célula diferente puede ser una célula no madre, es decir, un tipo de célula diferenciada terminalmente. Típicamente, el tipo de célula diferente es uno con el que la célula madre interactuaría in vivo. En una realización, las células madre neurales se cocultivan con células epiteliales tales como células endoteliales, típicamente células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC). Se ha observado que, in vivo, las NSC y la vasculatura interactúan, y las NSC proliferantes se localizan muy cerca o adyacentes a los vasos sanguíneos. También se ha observado que la activación del receptor de tirosina quinasa y la secreción de la proteína señal están sobrerreguladas cuando las células NSC se cocultivan con células endoteliales, indicando nuevamente que la vasculatura modula la capacidad de proliferación de las NSC. Sin pretender estar
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ligado a ninguna teoría en particular, los inventores creen que, in vivo, existe una interacción fundamental entre las NSC y los microvasos (es decir, las células endoteliales) en el proceso de regeneración tisular, mediante la amplificación de la expresión de citoquinas. Las micropartículas, por ejemplo, exosomas, derivados de las NSC (por ejemplo, células CTX0E03) cocultivadas con células endoteliales (por ejemplo, HUVEC) están por lo tanto preparadas para uso terapéutico, porque se han producido en un entorno que imita el entorno in vivo en el que las células madre y las micropartículas están activas.
Por lo tanto, cultivar una célula madre con un tipo de célula diferente puede mejorar la cantidad de micropartículas producidas y/o refinar el contenido de las micropartículas, típicamente de modo que las micropartículas producidas por las células madre estén sesgadas hacia un estado activado de tejido reparar. Por consiguiente, las micropartículas producidas por células madre que se han cultivado conjuntamente con otras células, por ejemplo, las NSC cocultivadas con células endoteliales son ventajosas. Estas micropartículas se pueden obtener por aislamiento de los medios acondicionados de células madre cocultivadas, como se describe en este documento.
Sorprendentemente, los presentes inventores se han dado cuenta de que la cantidad de micropartículas producidas por células madre puede aumentarse enormemente simplemente cultivando células madre en un biorreactor de múltiples compartimientos. Este hallazgo no se limita a las células madre neurales y se aplica generalmente al cultivo de todas las células madre. Por consiguiente, un aspecto de la invención proporciona un método para producir micropartículas a partir de células madre que se han cultivado en un biorreactor de múltiples compartimientos. Las células de las que se recogen las micropartículas se cultivaron típicamente durante al menos una semana, típicamente al menos 8, 9, 10, 11, 12, 13 o 14 días, por ejemplo 15 días, 16 días, 17 días, 18 días, 19 días, 20 días, 21 días o más, por ejemplo, al menos tres semanas, cuatro semanas, cinco semanas, seis semanas o más. Se puede observar a partir de la Figura 8 que el aumento en la producción de micropartículas, semana tras semana, no es meramente aditivo, sino que es exponencial. El cultivo prolongado se ha observado típicamente en el biorreactor de dos compartimentos del sistema CELLine de Integra (comercializado por Integra Biosciences AG, Zizers, Suiza), pero los hallazgos no se limitan a este biorreactor específico de múltiples compartimientos; se puede usar cualquier biorreactor de múltiples compartimientos. Este método de cultivo se puede usar para producir micropartículas de cualquier tipo de células madre, que incluyen, pero no se limitan a, células madre neurales y células madre mesenquimales.
Método de selección de un agente que altera la producción de micropartículas
La invención proporciona un método de selección para un agente que altera la producción de una micropartícula por una célula madre. Este método comprende poner en contacto una célula madre con un agente candidato, típicamente en condiciones adecuadas para la producción de micropartículas, y observar si (i) aumenta o disminuye la velocidad de producción de micropartículas por la célula madre contactada, o (ii) las características (por ejemplo, tamaño, contenido de proteína, ARNm o miARN) de las micropartículas cambia, en comparación con una célula madre de control que no está en contacto con el agente.
Método para seleccionar la composición total de ARN del medio acondicionado
Después de la centrifugación (5 min a 1.500 rpm), se recogen las micropartículas del medio acondicionado a través de filtración (0,02-0,2 pm o MWCO de 100 K). El ARN total se obtiene usando extracción basada en trizol seguido de purificación usando el mini kit Qiagen RNaesy. El extracto en agua tiene una absorbancia de 260:280 nm, lo que sugiere que puede ser ARN. El ARN total se retrotranscribe ya sea con un protocolo adecuado para ARNm (Superscript lI RT, Invitrogen) o miARN (kit mScript RT, Qiagen). La validación de la presencia de ARNm y miARN se demuestra mediante qRT-PCR usando cebadores para ATP5B y YWHAZ para ARNm, y U6B y 15a para genes de mantenimiento de miARN, respectivamente. El ARN puede evaluarse mediante un ensayo genérico de análisis de expresión génica tal como una matriz (microarreglo o matriz basada en PCR) y secuenciación.
Kits
La divulgación proporciona un kit para uso en un método para producir la micropartícula de la invención. El kit comprende un medio de cultivo de células madre neurales, una célula madre neural y las instrucciones para producir la micropartícula de cualquiera de las reivindicaciones 1-16 o 23 usando el kit. Opcionalmente, el kit comprende uno o más componentes de las reivindicaciones 19 o 21. El kit también puede comprender una micropartícula de acuerdo con la invención, para uso como control. La micropartícula de control está opcionalmente liofilizada. El kit también puede contener opcionalmente un agente de detección adecuado para la detección de las micropartículas producidas, por ejemplo, un anticuerpo que se une específicamente a una proteína marcadora que puede usarse para identificar la micropartícula.
La invención se describe adicionalmente con referencia a los siguientes ejemplos no limitantes.
Ejemplos
Ejemplo 1: Preparación de células madre neurales y micropartículas de células madre neurales para visualización
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mediante microscopía electrónica.
Método
Inclusión de células CTX0E03 para microscopía electrónica
• Cultivos 5 x 70% de CTX0E03
• Tratar con +/- 4OHT, IFNy, TNFa y TGFp (todos a 10 ng durante 24 horas)
• Separar las células y fijar durante la noche en glutaraldehído al 2,5% en cacodilato 0,1 M pH 7,4
• Se centrifugaron las células a 300 g
• Osmio regulado al 2%, 1,5 horas
• Centrifugación, agua de lavado, durante la noche
• Acetato de uranio al 2%, 2 horas
• Centrifugación, agua de lavado, 30 minutos
• Gradiente de etanol al 20, 35, 50, 70, 80, 90, 100%, durante el fin de semana.
• 100% de óxido de propileno (PO), 1 hora
• Centrifugación, 50% de resina Agar LV en PO, 1 hora
• 75% de resina LV/PO 5 horas
• 100% de resina durante la noche a 60°C
• Enfriar a TA antes del corte (60-80 nm), imágenes de TEM a 200 Kv.
Resultados
La Figura 1A-E muestra las micrografías electrónicas de los cuerpos multivesiculares (MVB) que contienen exosomas de aproximadamente 30 nm - 50 nm de diámetro. La Figura 1F muestra microvesículas > 100 nm de diámetro.
Ejemplo 2: producción de micropartículas de células madre neurales a partir de una línea de células madre neurales. Método
Se trataron individualmente matraces subconfluentes que contenían el mismo cultivo de células CTX0E03 con 10 ng/mL de TGF-p, 10 ng/mL de IFNy o 10 ng/mL de TNFa junto con controles de medios de cultivo completos con o sin la adición de 4OHT. 72 horas después del tratamiento, las células se recogieron usando trypZean/EDTA, se lavaron y se fijaron durante la noche en glutaraldehído al 2,5% en cacodilato 0,1 M pH 7,4 listo para la evaluación mediante microscopía electrónica.
Resultados
Se observó que la frecuencia de la aparición de cuerpos multivesiculares (MVB) se alteraba por la presencia de TGF-p, IFN-y o TNF-a. La frecuencia fue más alta en presencia de TGF-p, seguido por IFN-y, seguido porTNF-a.
Conclusión
La producción de micropartículas a partir de células madre neurales se puede estimular mediante la adición de los factores TGF-p, IFN-y o TNF-a. Esto tiene el potencial para una producción más eficiente de micropartículas.
Ejemplo 3: Purificación, cuantificación y caracterización de micropartículas de células madre neurales.
Método
Se expone un protocolo para producir grandes cantidades de micropartículas en la Figura 2. Las principales etapas son la purificación, cuantificación, caracterización, pruebas de eficacia y fabricación.
(1) Purificación
Las micropartículas se pueden purificar a partir de medio acondicionado con células madre mediante ultracentrifugación, por ejemplo, a 100.000 x g durante 1-2 horas. Se pueden usar métodos alternativos o adicionales para la purificación, tales como métodos basados en anticuerpos, por ejemplo, inmunoprecipitación, purificación en perlas magnéticas, purificación a base de resina, usando anticuerpos específicos.
(2) Cuantificación
Las micropartículas purificadas se pueden cuantificar mediante la cuantificación de los niveles totales de ácido nucleico o proteína, por ejemplo, diversos métodos de cuantificación de proteína por PCR o colorimétricos, tales como el ensayo BCA. Se pueden usar alternativamente otras técnicas de cuantificación, que incluyen una cuadrícula
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de microscopía electrónica o un ensayo inmune que usa anticuerpos o fragmentos de anticuerpos que se unen específicamente a marcadores específicos de micropartículas (por ejemplo, ELISA, inmunotransferencia).
(3) Caracterización
Las micropartículas pueden caracterizarse funcionalmente o estructuralmente. El ARN/ARNm/miARN y el perfil de proteína se pueden utilizar usando procedimientos bien conocidos en la técnica (SDS-PAGE, espectrometría de masas, PCR). Las micropartículas secretadas de forma constitutiva se pueden analizar y comparar con micropartículas que se han inducido mediante la adición de un agente inductor tal como factor de crecimiento transformante beta (TGF-p), interferón gamma (INF-y) y/o factor de necrosis tumoral alfa ( TNF-a).
(4) Eficacia terapéutica
La eficacia de las micropartículas puede probarse mediante ensayos in vitro e in vivo. Para la evaluación in vitro, se pueden agregar micropartículas de células madre neurales a cultivos de monocitos, PBMC, células endoteliales y/o fibroblastos y se evalúa el efecto de las micropartículas sobre estas células. La administración de micropartículas de células madre neurales a modelos animales adecuados puede usarse para evaluar la eficacia in vivo. Se pueden realizar ensayos clínicos para evaluar la seguridad y el resultado de micropartículas de células madre neurales en sujetos humanos.
(5) Fabricación/escalamiento
Los biorreactores, tales como el T1000 desechable de Integra, pueden usarse para la fabricación a gran escala de micropartículas de células madre neurales. Las micropartículas purificadas se formulan a continuación como un producto terapéutico.
Ejemplo 4: caracterización de miARN en micropartículas de CTX0E03 Métodos
• 3 condiciones: células CTX0E03 en cultivo estándar; micropartículas obtenidas de células CTX0E03 en cultivo estándar; y exosomas purificados derivados de células CTX0E03 en el sistema CELLine de Integra (véanse los Ejemplos 7 a 11, a continuación)
• Investigación de la matriz de miARN utilizando el panel de qRT-PCR (Qiagen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Este ensayo proporciona alta precisión y alta sensibilidad, con normalización de datos sensibles al método/elección de genes de referencia. No proporciona una secuenciación genómica amplia.
Resultados:
A) Lista de miARN con un cp < 35 encontrados en (i) células CTX0E03 estándar, (ii) medio acondicionado filtrado (filtro 0,02-0,2 |jm) es decir, micropartículas y (iii) exosomas derivados del sistema CELLine de Integra (resultados preliminares de la matriz miniscript qRT-PCR de miARN (Qiagen)).
B) Media aritmética y geométrica de los genes de referencia (mantenimiento)
A
miARN maduro
Cultivo estándar de CTX0E03 Micropartículas de CM Exosoma de CM Integra
hsa-miR-21-5p
19,52 20,9 20,72
hsa-let-7a-5p
22,64 23,11 22,36
hsa-miR-125b-5p
21,64 23,25 21,74
hsa-miR-9-5p
22,58 23,64 22,94
hsa-miR-92a-3p
23,2 23,94 24,01
hsa-miR-24-3p
23,73 24,24 23,83
hsa-miR-20a-5p
23,45 24,43 25,06
hsa-miR-16-5p
23,14 24,72 24,32
hsa-miR-100-5p
23,28 24,74 23,04
hsa-let-7b-5p
24,67 24,75 23,7
hsa-let-7f-5p
23,93 25,09 23,86
hsa-miR-17-5p
24,56 25,24 26,13
hsa-miR-23b-3p
24,3 25,3 24,13
hsa-miR-106b-5p
24,4 25,41 26,16
hsa-miR-222-3p
23,25 25,49 23,17
hsa-let-7e-5p
24,57 25,58 24,16
hsa-miR-26a-5p
23,4 25,63 24,2
hsa-miR-181a-5p
25,16 25,7 24,32
hsa-miR-125a-5p
23,56 25,75 24,88
hsa-miR-103a-3p
24,65 25,8 25,77
hsa-let-7i-5p
24,37 25,98 24,23
hsa-miR-99a-5p
24,44 26,05 23,44
hsa-let-7c
25,76 26,12 24,07
hsa-let-7g
25,2 26,15 25,17
hsa-miR-195-5p
24,72 26,34 25,67
hsa-miR-93-5p
25,15 26,48 26,06
hsa-miR-22-3p
25,03 26,49 25,66
hsa-miR-20b-5p
26,03 26,86 27,42
hsa-miR-18a-5p
26,71 26,87 29,06
hsa-miR-15b-5p
25,1 26,92 26,43
hsa-let-7d-5p
26,84 26,96 26,52
hsa-miR-424-5p
25,56 27,72 26,66
hsa-miR-15a-5p
26,88 27,89 29,3
hsa-miR-130a-3p
27,23 28,26 28,49
hsa-miR-33a-5p
30,34 28,54 34,18
hsa-miR-128-
26,94 28,64 27,66
hsa-miR-218-5p
27,79 28,68 28,03
hsa-miR-301a-3p
29,53 28,69 31,57
hsa-miR-134
28,3 28,76 28,76
hsa-miR-101-3p
28,44 28,82 31,64
hsa-miR-7-5p
29,71 28,82 30,22
hsa-miR-18b-5p
28,83 28,85 35,47
hsa-miR-185-5p
28,34 28,99 28,13
hsa-miR-378-3p
29,76 29,25 28,97
hsa-miR-132-3p
28,65 29,32 27,72
hsa-miR-345-5p
28,49 29,52 29,66
hsa-miR-219-5p
30,58 29,52 32,7
hsa-miR-127-5p
30,05 29,95 31,11
hsa-miR-146b-5p
30,53 30,54 28,07
hsa-miR-10a-5p
27,1 30,69 28,32
hsa-miR-210
29,85 30,83 30,65
hsa-miR-129-5p
32,51 30,98 31,69
hsa-miR-137
31,46 31,13 30,95
hsa-miR-182-5p
28,34 31,64 31,27
hsa-miR-124-3p
33,38 31,71 33,07
hsa-miR-96-5p
29,77 32,27 34,67
hsa-miR-192-5p
31,42 32,42 32,52
hsa-miR-126-3p
31,73 32,44 32,05
hsa-miR-194-5p
31,11 32,49 31,72
hsa-miR-375
33,77 32,94 30,94
hsa-miR-205-5p
35 33,01 32,72
hsa-miR-183-5p
29,88 33,21 31,74
hsa-miR-10b-5p
29,6 33,22 30,79
hsa-miR-302a-3p
29,67 33,6 31,69
hsa-miR-214-3p
34,19 33,76 32,11
hsa-miR-141-3p
35 33,96 34,51
hsa-miR-302c-3p
31,6 34,29 33,93
hsa-miR-196a-5p
35 34,65 35,75
hsa-miR-150-5p
34,59 34,76 34,59
hsa-miR-155-p
32,04 35,75 32,76
B
Cultivo estándar de CTX0E03 Micropartículas de CM Exosoma de CM Integra
Promedio de la media aritmética
23,54 23,82 24,79
Promedio de la media geométrica
23,48 23,8 24,62
Ejemplo 5: Análisis de medio acondicionado de CTX0E03 usando una proteína de transferencia de punto Métodos
Medio acondicionado 24 horas y 72 horas (RMM y medio ITS)
Los medios recogidos se "concentraron" mediante diálisis y las proteínas biotiniladas (la concentración de proteína 10 total típica parece ser de 0,5 mg/mL). El medio se incuba luego con las matrices de proteínas humanas Raybiotech L507 (concentración de proteína total de 0,1 mg/mL). Después del lavado y la incubación de la matriz con estreptavidina conjugada con HRP, la presencia de proteínas se detecta por quimioluminiscencia. La matriz proporciona datos cualitativos (es decir, la proteína está presente, pero no hay indicación de su nivel de expresión en comparación con otras proteínas).
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Resultados
Nombre de la citoquina
Nombre completo de la citoquina Función
EDA-A2
ectodisplasina-A2 Puede estar involucrada en la formación adecuada de los apéndices de la piel
Galectina-3*
Galectina-3 Lectina específica de galactosa que se une a la IgE. Puede mediar con la integrina alfa-3, beta-1 la estimulación por CSPG4 de migración de células endoteliales.
IGFBP-2
Proteínas de unión al factor 2 de crecimiento tipo insulina Las proteínas de unión a IGF prolongan la semivida de los IGF y se ha demostrado que inhibe o estimula el crecimiento promoviendo los efectos de los IGF sobre el cultivo celular.
IGFBP- rp1/IGFBP- 7
Proteína de unión al factor de crecimiento tipo insulina relacionado con la proteína 1/ Proteína 7 de unión al factor de crecimiento tipo insulina Proteínas solubles que se unen a IGF con alta afinidad.
IL-1af
Interleuquina 1 alfa Mediador potente de inflamación e inmunidad
LECT2f
Quimiotaxina 2 derivada de células leucocitarias Tiene una actividad quimiotáctica neutrofílica. También un regulador positivo de proliferación de condrocitos.
MCP-1f
Proteína 1 quimioatrayente de monocitos Desempeña un papel en el reclutamiento de monocitos a sitios de lesión e infección.
SPARC*
Proteína secretada, proteína 1 de unión a calcio modular relacionada con la riqueza en cisteína ácida [Precursor] Proteína matricelular que modula la adhesión y proliferación celular y se cree que funciona en la remodelación de tejidos y la angiogénesis.
TIMP-1*
Inhibidor tisular de metaloproteinasas-2 Complejos con metaloproteinasas (como las colagenasas) y las inactiva de forma irreversible. También media la eritropoyesis in vitro; pero, a diferencia de la IL-3, es específica de la especie, estimulando el crecimiento y la diferenciación de progenitores eritroides humanos y murinos.
Trombospondina-1*
Trombospondina-1 Proteína secretada multimodular que se asocia con la matriz extracelular y posee una variedad de funciones biológicas, incluida una potente actividad angiogénica.
VEGF*
Factor de crecimiento vascular endotelial Factor de crecimiento activo en angiogénesis, vasculogénesis y crecimiento de células endoteliales.
Estas proteínas muestran expresión en algunos casos, aunque también pueden estar presentes en los medios.
EGF R/ErbB1
Receptor del factor de crecimiento epidérmico Receptor para EGF, pero también para otros miembros de la familia del EGF, tales como TGF-alfa, anfiregulina, betacelulina, factor de crecimiento similar al EGF de unión a heparina
MDC *
Un dominio 11 de desintegrina y Ligando probable para la integrina en el cerebro. Esta
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metaloproteinasa MDC de proteínas similares a metaloproteinasas, similares a desintegrinas y ricas en cisteína es una proteína similar a la metaloproteasa no catalítica.
Endostatina*
Endostatina Inhibidor de la angiogénesis; inhibe la migración de células endoteliales pero puede no efectuar la proliferación. Puede trabajar en equilibrio con VEGF para mantener el nivel de angiogénesis.
Folistatina
Folistatina
Regula la renovación de células madre frente a la diferenciación inhibiendo las proteínas prodiferenciación.
Cskf
Tirosina quinasa citoplasmática Se requiere actividad para la diferenciación inducida por interleuquina 6 (IL-6). Puede jugar un papel en el crecimiento y la diferenciación de las células hematopoyéticas. Puede estar involucrado en la transducción de señales en células endoteliales endocardiales y arteriales.
* = angiogénesis f = inflamación
Ejemplo 6: Análisis de medio acondicionado usando bandas de ELISA de angiogénesis humana (Signosis)
Método
Se utilizaron bandas de ELISA de angiogénesis humana (Signosis) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El medio RMM fresco y el medio RMM de CTX0E03 acondicionado 24 horas se analizaron para 8 citoquinas de angiogénesis; factor de necrosis tumoral a (TNFa), factor 1 de crecimiento similar a la insulina (IGF-1), VEGFA, interleuquina-6 (IL-6), bFGF, factor de crecimiento transformante p1 (TGFp1), EGF y leptina. Los pozos individuales de la banda, recubiertos con cada uno de los anticuerpos primarios dirigidos contra las citoquinas específicas de angiogénesis se cargaron con muestras de prueba. La absorbancia se midió mediante un espectrofotómetro a 450 nm. Las concentraciones de las citoquinas de la angiogénesis fueron directamente proporcionales a la intensidad del color de la muestra de prueba.
Los resultados se muestran en la Figura 3.
Ejemplo 7: CELLINE de Integra - Biorreactor desechable para la producción de micropartículas de células CTX0E03.
La producción y recolección eficiente de micropartículas a partir de una línea celular se basa en mantener condiciones de cultivo óptimas para la mayor densidad de células. Cualquier restricción en el oxígeno o nutrientes suministrados a las células o una acumulación de productos metabólicos residuales limitará la vida útil del cultivo y, por lo tanto, la producción de micropartículas.
El CELLine AD 1000 de dos compartimentos está diseñado para acomodar células adherentes unidas a una incrustación de matriz dentro de un compartimento de celda pequeña, separadas de un depósito de medio más grande por medio de una membrana semipermeable de 10 kDa. Esta membrana permite una difusión continua de nutrientes y la eliminación de productos de desecho, al tiempo que concentra cualquier micropartícula producida por la célula dentro del compartimiento de células más pequeñas. Debido a la gran capacidad de volumen (1 litro) del compartimiento de medios, el sistema tiene el potencial de mantener cultivos de alta densidad durante períodos de tiempo más largos sin la necesidad de un cambio de medios. La producción de exosomas de cultivos de células tumorales de mesotelioma se describe en Mitchellet al, 2008.
Método
Para obtener un rendimiento óptimo de la CELLine AD1000, coloque 25 mL de medio de cultivo completo (RMM con factores de crecimiento y 4OHT) en el compartimiento medio del matraz para prehumedecer la membrana semipermeable. Permita que el matraz repose durante 5 minutos a temperatura ambiente antes de recubrir la incrustación de la matriz con laminina de ratón añadiendo 15 mL de solución de laminina (20 pg/mL en DMEM/F12) al compartimento celular durante un mínimo de 1 hora a 37°C. Retire la solución de laminina y agregue 15 mL de DMEM/F12 caliente al compartimento celular para eliminar cualquier exceso de laminina. Evitando el secado de la incrustación de la matriz, introducir lentamente aproximadamente 15 x 106 células CTX0E03 en un total de 15 mL de medio de cultivo completo. Tenga cuidado de eliminar las burbujas de aire del compartimento de la celda. Añadir cuidadosamente otros 460 mL de medio de cultivo completo al compartimento de la celda antes de incubar el matraz durante la noche en 5% de CO2 a 37°C. Al día siguiente, retire el medio del compartimiento de la celda y reemplácelo con 15 mL de medio de cultivo precalentado.
Cada 7 días coseche las micropartículas/medio del compartimento celular. Centrifugue el medio a 1.500 rpm durante
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5 minutos para eliminar cualquier residuo celular y almacénelo a -80°C. Con cuidado, agregue otros 15 mL de medio de cultivo completo precalentado en el compartimiento de la celda y 485 mL de medio de cultivo completo en el compartimiento del medio e incube durante otros 7 días. Las micropartículas se aislaron mediante filtración por MWCO de 100 K. Repita según sea necesario.
La Figura 4A muestra la cantidad de proteína extraída de 15 mL de medio que contiene micropartículas purificadas usando el sistema Integra en comparación con las condiciones de cultivo normales (T175 durante 3 días). Miligramos de proteína medidos mediante el ensayo BCA. La Figura 5 muestra la cantidad correspondiente de ARN total aislado medido a 260/280 nm.
Las caracterizaciones de los marcadores indicaron que ambas poblaciones purificadas (microvesículas y exosomas) expresan CD63 y CD81 (determinados por FACS - Figura 4B). Solo los exosomas expresan el marcador endosomal Alix (determinado por transferencia Western, datos no mostrados).
Ejemplo 8: Ensayos de eficacia
(A) Comparación de la función de los medios acondicionados de CTX0E03 con la función de los exosomas purificados de las células CTX0E03 en un ensayo de curación de heridas.
Método - Ensayo de cierre/raspado de la herida
• Sembrar 0,25 x 106 NHDF (fibroblastos dérmicos humanos normales) por pozo de una placa de 12 pozos y dejar que se vuelva confluente (24 horas)
• Eliminar los factores de crecimiento durante 24 horas
• Retirar las células (raspado) e incubar con exosomas/medios acondicionados
• Imagen del área afectada durante 48 horas
• Estimar el área usando la imagen J
Resultados
Tabla 2- Ensayo de cierre/raspado de la herida que representa la actividad de migración de fibroblastos dérmicos humanos normales (NHDF) cultivados en medios acondicionados con CTX0E03 o tras la adición de exosomas ____________________________________ purificados._________________________________________
1
Cierre de la herida (%)
0 h
24 h 48 h
Medios acondicionados con CTX0E03
0% 100%
2 pg/mL de exosomas
0% 95,4% 100%
Control
0% 48,1% 49,7%
El cierre de la herida se calculó como el área cubierta por las células en relación con el área inicial de la herida, como se determina a 0 h. El cierre de la herida se expresa como el porcentaje del área inicial de la herida en el tiempo 0 h. Estos datos también se muestran, fotográficamente, en la Figura 6A.
La Figura 6B muestra que 10 |jg de los exosomas de CTX0E03 aumentan significativamente el cierre de la herida (según se determina en el ensayo de raspado/migración de HDNF) después de 72 horas, en comparación con las condiciones basales (sin exosomas).
Los experimentos adicionales confirmaron que los exosomas se purificaron (por ultracentrifugación, cuantificados por ensayo de proteína BCA, caracterizados como > 99% positivos para CD63 y CD81 y teniendo un mayor nivel de expresión de Alix en comparación con la fracción de micropartículas correspondiente) desde todos los puntos temporales (semanas 2-6) durante el cultivo continuo (utilizando los biorreactores CELLine de Integra en presencia de factores de crecimiento y 4OHT) mejoraron significativamente la migración de fibroblastos y la curación de heridas, con una respuesta máxima entre 5-10 jg/mL en comparación con las condiciones basales. La Figura 6C muestra el % de áreas curadas para condiciones basales, 2 pg/mL de exosomas, 6 pg/mL de exosomas, 20 pg/mL de exosomas y un control positivo de LSGS (suplemento de crecimiento sérico bajo). El panel superior de la Figura 6C muestra exosomas aislados de células CTX0E03 cultivadas durante 2 semanas en el sistema CELLine de Integra y el panel inferior de la Figura 6C muestra exosomas aislados de células CTX0E03 cultivadas durante 6 semanas en el sistema CELLine de Integra. Estos datos muestran que todas las dosis de todos los exosomas de NSC evaluados proporcionan una mejor curación en comparación con las condiciones basales, con un % de curación que se aproxima al control positivo (LSGS) después de 72 horas.
Los datos en la Figura 6C también muestran que los exosomas aislados de las NSC cultivadas durante 6 semanas causan una cicatrización más rápida (que los exosomas de 2 semanas), con el % de curación que se acerca al 100% después de solo 48 horas, para todas las dosis.
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La Figura 6D muestra los resultados de un ensayo de herida por inyección in vivo en un ratón, confirmando que las células CTX0E03 estimularon la curación de heridas a un grado estadísticamente significativo in vivo. Este es un simple bioensayo in vivo que se puede usar para confirmar la eficacia de las micropartículas in vivo.
Conclusión. Los exosomas liberados de la línea de células madre neuronales humanas CTX0E03 mejoran la migración de fibroblastos en un modelo in vitro de la cicatrización de heridas, lo que sugiere que los exosomas pueden contribuir a los mecanismos mediante los cuales las hNSC promueven la reparación. Los exosomas aislados de células cultivadas durante 6 semanas muestran una eficacia de cicatrización de heridas mejorada in vitro, en comparación con exosomas aislados de células cultivadas durante 2 semanas.
(B) Estimulación de la angiogénesis
Se llevó a cabo un ensayo de 24 horas para detectar la angiogénesis en HUVEC primarias usando un microportaobjetos Ibidi y detección y análisis automatizados de Wimtube (de longitud del tubo y puntos de bifurcación). Se añadieron microvesículas cosechadas de matraces Integra a 1, 2, 3, 4 y 6 semanas a HUVEC y angiogénesis en comparación con HUVEC basales (sin adición). Se utilizó LSGS (suplemento de crecimiento sérico bajo) como control positivo. Los resultados, representados en la Figura 12, muestran que las microvesículas de células madre neurales aumentan la angiogénesis. Además, estos datos muestran que un aumento mayor en la angiogénesis es proporcionado por microvesículas cosechadas después de al menos 3 semanas de cultivo (es decir, después de 3 semanas, 4 semanas y 6 semanas de cultivo en un biorreactor CELLine de Integra), que las microvesículas cultivadas durante 1 o 2 semanas. Las microvesículas cultivadas durante al menos 3 semanas estimularon la angiogénesis a un nivel estadísticamente significativo, y un nivel que se aproxima al del control positivo. Se demostró que el mayor aumento en la angiogénesis es proporcionado por microvesículas cosechadas después de 4 semanas; estas microvesículas estimularon la angiogénesis en la misma cantidad que el control positivo.
Estos datos indican que las microvesículas de hNSC estimulan la angiogénesis.
(C) Estimulación de la excrecencia de neurita
La excrecencia de neurita se determinó usando células PC-12 a través de un inserto de 1 pm. Después de 72 horas, los cuerpos celulares PC-12 se eliminaron y las neuritas se tiñeron en la parte inferior del inserto. La mancha fue luego extraída y cuantificada en un espectrofotómetro. Las microvesículas cosechadas de los matraces Integra a las 2 semanas se añadieron a las células a 0,03 pg, 0,3 pg y 3 pg, cada uno con 100 ng/mL de NGF (factor de crecimiento nervioso). La excrecencia de neurita se comparó con células basales (sin adición). Se usaron 100 ng/mL de NGF como control. Como se muestra en la Figura 13, la adición de 3 pg de microvesículas de hNSC causó un aumento notable en el crecimiento de neuritas, en comparación con la adición de NGF solamente.
Estos datos indican que las microvesículas de hNSC estimulan la excrecencia de neuritas.
Ejemplo 9: Producción de exosomas usando el sistema CELLine de Integra.
Las células CTX0E03 se cultivaron usando el sistema CELLine de Integra y los exosomas se purificaron como se describe en el Ejemplo 7. Se cuantificó la concentración de exosomas se purificó del medio usando el sistema CELLine en el punto de tiempo de 3 semanas, y como control un sistema T175 estándar como el rutinariamente usado en la técnica (usando un ensayo BCA para estimar el contenido de proteína). La Figura 7 muestra que la producción de exosomas usando el sistema CELLine de Integra se incrementa varias veces, en comparación con el uso de cultivo convencional (matraces T175).
Usando el sistema CELLine de Integra, las células CTX0E03 se cultivaron durante un período de 3 semanas y el medio se recolectó en la semana 1, 2 y 3 para la purificación y cuantificación de exosomas, como se describe en el Ejemplo 7. La Figura 8A muestra que la producción de micropartículas aumenta exponencialmente durante el período de cultivo de 3 semanas, lo que permite la producción eficiente y en gran escala de micropartículas. La concentración de exosomas recogidos de un único matraz CELLine de Integra se controló a continuación durante 1 - 6 semanas de cultivo continuo de CTX0E03, con los resultados que se muestran a continuación y se representan en la Figura 8B:
Punto de tiempo Integra
Cantidad total de exosomas (pg) Exosomas pg/mL
Semana 1
12 0,80
Semana 2
112 7,47
Semana 3
88 5,87
Semana 4
148 9,87
Semana 5
240 16,00
5
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Semana 6
440
29,33
Estos resultados muestran que la producción de exosomas se mejora sorprendentemente cuando las células madre se cultivan en un biorreactor de múltiples compartimientos durante semanas, típicamente al menos tres semanas.
Ejemplo 10: Caracterización del fenotipo de células obtenidas a partir del CELLine de Integra y el sistema de cultivo estándar (T175).
Las células CTX0E03 se cultivaron utilizando el biorreactor CELLine de Integra y el cultivo estándar, como se describe en el Ejemplo 7. La expresión de los marcadores de proteína DCX y GFAP se confirmó usando anticuerpos específicos del marcador y microscopía de fluorescencia.
La expresión de los marcadores DCX, GALC, GFAP, TUBB3, GDNF e IDO se detectó mediante qRT-PCR en muestras obtenidas de las células. La expresión del marcador se comparó entre micropartículas obtenidas del cultivo estándar (T175) y exosomas obtenidos a partir del sistema CELLine de Integra cultivado durante 3 semanas, evaluadas frente a una línea base del nivel de expresión en células CTX0E03 en cultivo estándar (T175).
Los inventores observaron una notable diferencia en la expresión del marcador de las células obtenidas a partir del sistema CELLine de Integra en comparación con las células de control obtenidas a partir del estándar. Los marcadores de células parcialmente diferenciadas se incrementaron varias veces en las células cultivadas en el sistema CELLine de Integra, en comparación con las células de control obtenidas a partir de cultivos estándar (Figura 9). Cambios particularmente notables son el aumento de la expresión de los marcadores DCX1 (doblecortina - un marcador para la entrada en el linaje neural), GFAP (proteína ácida fibrilar glial - un marcador para la entrada en el linaje astrocítico), GDNF (factor neurotrófico derivado de células gliales) e IDO (indolamina 2,3-dioxigenasa). Esto indica que las células madre neurales cultivadas en un biorreactor de dos compartimentos se diferencian parcialmente en células de linaje neural (DCX+) o astrocítico (GFAP+). La expresión de DCX y GFAP en las células cultivadas de Integra se confirmó mediante microscopía de fluorescencia, demostrando que las células CTX0E03 cultivadas usando el biorreactor CELLine de Integra tienen un fenotipo neuronal más diferenciado que las células CTX0E03 estándar.
Ejemplo 11: Caracterización de perfiles de expresión de miARN de exosomas obtenidos a partir de cultivos de CELLine de Integra y micropartículas obtenidas a partir de cultivos estándar (T175).
Se cultivaron células CTX0E03 durante tres semanas usando el cultivo CELLine de Integra y en el cultivo estándar en matraces T-175 de un solo compartimiento. Los exosomas se purificaron del cultivo Integra y las micropartículas se purificaron del cultivo estándar T-175 como se describe en el Ejemplo 7. Se determinaron los niveles de expresión relativa de varios miARN expresados en los exosomas y micropartículas obtenidos del cultivo estándar o del sistema CELLine de Integra con una matriz de miARN que utiliza el panel de qRT-PCR (Qiagen) según las instrucciones del fabricante, y se convierte en niveles de sobrerregulación y subregulación en comparación con un grupo de control de línea celular CTX0E03 estándar (véanse la Tabla 3 y la Figura 10). Estos datos muestran un perfil diferencial de expresión de miARN entre exosomas obtenidos del sistema de cultivo CELLine de Integra durante 3 semanas, micropartículas y células obtenidas a partir del cultivo estándar de un matraz.
Tabla 3: Cuánto se regulan los miARN en micropartículas obtenidas a partir de cultivo estándar o exosomas del ___________sistema CELLine de Integra, en relación con el control (células CTX0E03).___________
Cultivo estándar (micropartículas) Integra (exosomas)
miARN
Cuánto se regula con respecto al control (células CTX0E03)
hsa-miR-146b-5p
-1,0222 10,5805
hsa-let-7c
-1,6954 4,7678
hsa-miR-99a-5p
-3,5349 3,3714
hsa-miR-132-3p
-1,9163 3,088
hsa-miR-378-3p
1,2731 3,0175
hsa-miR-181a-5p
-1,7431 2,9147
hsa-let-7b-5p
-1,4658 2,7574
hsa-miR-100-5p
-3,208 1,977
hsa-let-7e-5p
-2,7101 1,9274
hsa-miR-23b-3p
-2,3322 1,8834
hsa-miR-185-5p
-1,9119 1,8532
hsa-let-7i-5p
-3,5677 1,8404
hsa-let-7a-5p
-1,851 1,7736
hsa-let-7d-5p
-1,5 1,7654
hsa-let-7g-5p
-2,2527 1,7092
hsa-miR-222-3p
-5,8092 1,6779
hsa-let-7f-5p
-2,8712 1,5948
hsa-miR-218-5p
-1,9611 1,5619
hsa-miR-24-3p
-1,6721 1,5511
hsa-miR-9-5p
-2,2475 1,4109
hsa-miR-126-3p
-2,1263 1,203
hsa-miR-134
-1,6567 1,1783
hsa-miR-128
-3,5842 1,0743
hsa-miR-155-5p
-8,8458 1,0425
hsa-miR-22-3p
-3,4782 -1,0023
hsa-miR-26a-5p
-5,3579 -1,0187
hsa-miR-210
-2,3107 -1,0449
hsa-miR-92a-3p
-1,9885 -1,0693
hsa-miR-93-5p
-3,056 -1,1701
hsa-miR-424-5p
-4,9189 -1,2086
hsa-miR-195-5p
-3,8951 -1,2541
hsa-miR-127-5p
-1,1316 -1,2953
hsa-miR-21-5p
-2,8845 -1,3044
hsa-miR-103a-3p
-2,6482 -1,3287
hsa-miR-16-5p
-3,5267 -1,3692
hsa-miR-125a-5p
-5,1159 -1,434
hsa-miR-10a-5p
-14,4701 -1,434
hsa-miR-10b-5p
-15,1194 -1,4373
hsa-miR-345-5p
-2,5521 -1,4406
hsa-miR-130a-3p
-2,6178 -1,5728
hsa-miR-15b-5p
-4,4025 -1,6058
hsa-miR-20b
-2,1312 -1,6096
hsa-miR-20a-5p
-2,3107 -1,8319
hsa-miR-17-5p
-1,9296 -1,8319
hsa-miR-7-5p
-1,5105 -2,042
hsa-miR-106b-5p
-2,4708 -2,1287
hsa-miR-101-3p
1,4794 -2,4453
hsa-miR-302a-3p
-18,0634 -2,4623
hsa-miR-301a-3p
1,4931 -2,5257
hsa-miR-183-5p
-13,9772 -2,5847
hsa-miR-219-5p
1,6994 -2,7321
hsa-miR-18a-5p
-1,4028 -3,2792
hsa-miR-15a-5p
-2,4766 -3,3714
hsa-miR-182-5p
-12,5099 -4,9588
hsa-miR-33a-5p
2,7927 -9,1472
hsa-miR-96-5p
-7,0047 -18,9396
hsa-miR-18b-5p
-1,3519 -49,18
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10
Los valores se calcularon a partir de datos sin procesar usando las siguientes ecuaciones:
ACT (muestra/control) = CT promedio CT (GOI) - CT promedio (HKG)
Cuánta expresión = (muestra/control) = 2'(ACT Promedi°)
Cuánto cambia = Cuánta expresión (muestra)
Cuánta expresión (control)
Sí (cuánto cambia) > 1 entonces (cuánto se regula) = (cuánto cambia)
Sí (cuánto cambia) < 1 entonces (cuánto se regula) = - (1 / cuánto cambia)
15 Donde:
CT = umbral del ciclo
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GOI = gen de interés (miARN investigado)
HKG = genes de mantenimiento (miARN de referencia utilizados para normalizar los datos)
Ejemplo 12: análisis de miARN total
Las células pueden transportar ARN en micropartículas determinadas para liberación en el espacio extracelular. Esto permite la transmisión de mensajes genéticamente codificados entre las células. Aquí nos referimos colectivamente al ARN extracelular como 'ARN lanzadera'. El objetivo fue analizar de forma exhaustiva las especies de ARN no codificante liberadas por las células madre neuronales (NSC) CTX0E03 mediante la secuenciación de próxima generación.
Los ARN no codificantes se dividen en dos categorías (pequeños y largos). Pequeños biotipos de ARN no codificantes incluyen ARN ribosómico (ARNr), nucleolar pequeño (ARNnup), ARN nuclear pequeño (ARNnp), microARN (miARN), otros ARN misceláneos (ARNc diversos, por ejemplo, RMRP, ARN bóveda, SrP de metazoos y RNY), y biotipos largos de ARN no codificantes incluyen ARN largos no codificantes (ARNlnc) y ARN intergénicos grandes no codificantes (ARNignc).
Aquí, se caracterizaron los ARN de lanzadera, que incluyen ARN pequeños y largos no codificantes, liberados de exosomas y microvesículas derivadas de NSC (MV) y se compararon con los contenidos de ARN de las NSC del productor.
A) Contenido total de ARN en células, exosomas y microvesículas identificados por el bioanalizador de ARN Agilent
El ARN en ambos exosomas y microvesículas consiste principalmente en especies de ARN pequeño como se muestra en la Fig. 14. La mayoría de los nucleótidos (nt) fue < 200 como se muestra contra la escalera molecular.
B) Composición de ARN
Se generaron bibliotecas de secuenciación de ARN pequeño para investigar la composición del ARN lanzadera y celular mediante secuenciación profunda (secuenciación de próxima generación). Los resultados se muestran en la Figura 15.
C) Secuenciación profunda de la expresión de miARN de las células CTX0E03, microvesículas y exosomas a partir de cultivos estándar (T175).
La secuenciación profunda se basa en la preparación de una biblioteca de ADNc seguido por secuenciación y proporciona información con respecto a la secuencia total leída de diferentes miARN en las microvesículas y exosomas. Estos datos de secuencia profunda complementan los datos de la matriz de qRT-PCR mostrados anteriormente y proporcionan un análisis exhaustivo del perfil de miARN de las células y micropartículas. A diferencia del análisis de la matriz qRT-PCR, la secuenciación profunda no se limita a la identificación de las secuencias presentes en la matriz de sonda y, por lo tanto, las secuencias que se van a identificar no necesitan conocerse de antemano. La secuenciación profunda también proporciona lectura directa y la capacidad de secuenciar secuencias muy cortas. Sin embargo, la secuenciación profunda no es adecuada para la detección de transcripciones con baja expresión.
Método
La presencia de una variedad de miARN en células parentales y sus exosomas (30-100 pm) y microvesículas (1001000 pm), purificadas por centrifugación diferencial, se identificó por secuenciación profunda, después de la construcción de 1 biblioteca de miARN etiquetada para cada muestra.
Además, se diseñaron cebadores específicos para miARN altamente transportados (por ejemplo, hsa-miR-1246) y se usaron en PCR de transcripción inversa en tiempo real (qRT-PCR) para rastrear exosomas/microvesículas después del implante in vivo.
Se realizó una secuenciación profunda por GATC Biotech (Alemania) y requirió la preparación de una biblioteca de miARN etiquetada para cada muestra seguida de secuenciación y barrido de miRBase:
• Construcción de bibliotecas de miARN etiquetado (22 a 30 nt)
°Se generaron bibliotecas de secuenciación por ligación del adaptador de ARN específico a los extremos 3' y 5' para cada muestra seguido de transcripción inversa, amplificación y purificación de bibliotecas de ARN pequeño (intervalo de tamaño de fracción contenida de ARN pequeño de 22-30 nt).
• Secuenciación en un HiSeq 2000 de Illumina (lectura única)
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° La secuenciación se realizó usando HiSeq 2000 de Illumina (lectura única). El análisis de una reserva puede incluir hasta una lectura única de 45.000.000, y cada longitud de lectura es de hasta 50 bases. Se hizo control de calidad de la secuenciación mediante el uso de archivos FastQ (secuencias y puntajes de calidad).
• La identificación de miARN conocidos se realizó de la siguiente manera:
° Los adaptadores de ARN se recortaron de las secuencias resultantes y se limpiaron los datos sin procesar. Los datos sin procesar se agruparon y para cada grupo se proporcionaron varias lecturas. Los miARN fueron identificados por barrido de miRBase (Ssearch).
Resultados
Muchos miARN de microvesículas y exosomas se enriquecieron con relación a las células, lo que indica que las células clasifican especialmente los miARN para la liberación extracelular. Además, los contenidos de miARN fueron similares tanto en exosomas como en microvesículas, lo que indica un aparato común de captación selectiva de miARN en microvesículas excretadas. Aunque sin estar limitados por la teoría, esto puede indicar que el contenido de miARN en microvesículas y exosomas secretados se puede usar como huella digital para identificar subtipos de hNSC.
Por lo tanto, el análisis de secuenciación profunda identificó un conjunto único de miARN tanto en exosomas de hNSC como en microvesículas no reportadas previamente. El contenido de miARN en las vesículas excretadas es similar, pero mostró una captación de miARN preferencial en comparación con hNSC. Estos hallazgos podrían apoyar los efectos biológicos mediados por miARN lanzadera no descritos previamente para hNSC.
Los resultados se detallan en las Tablas 4 a 9, a continuación. Los datos también se representan en la Figura 11, que muestra claramente los perfiles de miARN significativamente diferentes presentes en las microvesículas y los exosomas, en comparación con las células. En resumen, estos datos muestran un aumento masivo en la cantidad (recuentos de lectura) de hsa-miR-1246, hsa-miR-4492, hsa-miR-4488 y hsa-miR-4532 en microvesículas y exosomas en comparación con las células. También se observan grandes aumentos en hsa-miR-4508, hsa-miR- 4516, has-miR-3676-5p y hsa-miR-4485. Se observan disminuciones masivas en las cantidades (recuentos de lectura) de ciertos miARN, incluidos hsa-let-7a-5p, has-miR-92b-3p, has-miR-21-5p, hsa-miR-92a-3p, hsa-miR-10a- 5p, hsa-100-5p y hsa-99b-5p.
La presencia de cada uno de hsa-miR-1246, hsa-miR-4488, hsa-miR-4492, hsa-miR-4508, hsa-miR-4516 y hsa-miR- 4532 en los exosomas fue validada por qRT -PCR (datos no mostrados).
El gráfico de los resultados de la secuenciación profunda en los exosomas y microvesículas como cuánto cambia en forma relativa en comparación con las células confirma que hsa-miR-1246, hsa-miR-4492, hsa-miR-4488 y hsa-miR- 4532 están significativamente sobrerregulados en los exosomas y microvesículas en comparación con las células. Esta comparación también muestra que el miARN hsa-miR-3195 es el miARN que está más sobrerregulado, tanto en exosomas como en microvesículas. Aunque las lecturas absolutas de hsa-miR-3195 están en el intervalo de -40 para exosomas y microvesículas, no hay hsa-miR-3195 presente en las células.
Como se observó en el Ejemplo 11 anterior, los contenidos de miARN en exosomas, micropartículas y células parentales también se probaron y validaron usando el análisis de la matriz de PCR. Los siguientes miARN se encontraron presentes por qRT-PCR: hsa-let-7g-5p, hsa-miR-101-3p, hsa-miR-10a-5p, hsa-miR-10b-5p, hsa-miR- 125b-5p, hsa-miR-128, hsa-miR-130a-3p, hsa-miR-134, hsa-miR-137, hsa-miR-146b-5p, hsa-miR-15a-5p, hsa-miR- 15b-5p, hsa-miR-16-5p, hsa-miR-17-5p, hsa-miR-181a-5p, hsa-miR-182-5p, hsa-miR-185-5p, hsa-miR-18b-5p, hsa- miR-192-5p, hsa-miR-194-5p, hsa-miR-195-5p, hsa-miR-20a-5p, hsa-miR-20b-5p, hsa-miR-210, hsa-miR-21-5p, hsa-miR-218-5p, hsa-miR-219-5p, hsa-miR-222-3p, hsa-miR-22-3p, hsa-miR-23b-3p, hsa-miR-24-3p, hsa-miR-26a- 5p, hsa-miR-301a-3p, hsa-miR-302a-3p, hsa-miR-302c-3p, hsa-miR-345-5p, hsa-miR-378a-3p, hsa -miR-7-5p, hsa- miR-92a-3p, hsa-miR-93-5p, hsa-miR-9-5p, hsa-miR-96-5p, y hsa-miR-99a-5p.
Tabla 4: Células EH
Células: CTX0E03 07EH
miARN
Secuencia de miARN SEQ ID NO: Longitud de miARN Recuentos de lectura
hsa-let-7a-5p
UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU 1 22 75110
hsa-miR-10a-5p
UACCCUGUAGAUCCGAAUUUGUG 2 23 52927
hsa-miR-100-5p
AACCCGUAGAUCCGAACUUGUG 3 22 52451
hsa-miR-99b-5p
CACCCGUAGAACCGACCUUGCG 4 22 39457
hsa-miR-486-5p
UCCUGUACUGAGCUGCCCCGAG 5 22 20310
hsa-miR-27b-3p
UUCACAGUGGCUAAGUUCUGC 6 21 16900
hsa-miR-92a-3p
UAUUGCACUUGUCCCGGCCUGU 7 22 14359
hsa-miR-191-5p
CAACGGAAUCCCAAAAGCAGCUG 8 23 12591
hsa-miR-21-5p
UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA 9 22 11943
hsa-miR-98
UGAGGUAGUAAGUUGUAUUGUU 10 22 11760
hsa-let-7f-5p
UGAGGUAGUAGAUUGUAUAGUU 11 22 10349
hsa-miR-26a-5p
UUCAAGUAAUCCAGGAUAGGCU 12 22 9900
hsa-miR-92b-3p
UAUUGCACUCGUCCCGGCCUCC 13 22 9794
hsa-miR-127-3p
UCGGAUCCGUCUGAGCUUGGCU 14 22 7064
hsa-miR-181a-5p
AACAUUCAACGCUGUCGGUGAGU 15 23 6956
hsa-miR-182-5p
UUUGGCAAUGGUAGAACUCACACU 16 24 5531
hsa-let-7c
UGAGGUAGUAGGUUGUAUGGUU 17 22 5103
hsa-miR-379-5p
UGGUAGACUAUGGAACGUAGG 18 21 4746
hsa-miR-146b-5p
UGAGAACUGAAUUCCAUAGGCU 19 22 4552
hsa-miR-21-3p
CAACACCAGUCGAUGGGCUGU 20 21 4089
hsa-miR-1246
AAUGGAUUUUUGGAGCAGG 21 19 3973
hsa-let-7i-5p
UGAGGUAGUAGUUUGUGCUGUU 22 22 3015
hsa-miR-4532
CCCCGGGGAGCCCGGCG 23 17 2847
hsa-miR-183-5p
UAUGGCACUGGUAGAAUUCACU 24 22 2695
hsa-miR-151a-3p
CUAGACUGAAGCUCCUUGAGG 25 21 2681
hsa-miR-501-3p
AAUGCACCCGGGCAAGGAUUCU 26 22 2649
hsa-let-7e-5p
UGAGGUAGGAGGUUGUAUAGUU 27 22 2449
hsa-let-7b-5p
UGAGGUAGUAGGUUGUGUGGUU 28 22 2435
hsa-miR-16-5p
UAGCAGCACGUAAAUAUUGGCG 29 22 2173
hsa-miR-30a-5p
UGUAAACAUCCUCGACUGGAAG 30 22 2001
hsa-miR-30d-5p
UGUAAACAUCCCCGACUGGAAG 31 22 1977
hsa-miR-409-5p
AGGUUACCCGAGCAACUUUGCAU 32 23 1871
hsa-miR-22-3p
AAGCUGCCAGUUGAAGAACUGU 33 22 1826
hsa-miR-4492
GGGGCUGGGCGCGCGCC 34 17 1754
hsa-miR-125a-5p
UCCCUGAGACCCUUUAACCUGUGA 35 24 1451
hsa-miR-222-3p
AGCUACAUCUGGCUACUGGGU 36 21 1422
hsa-miR-151a-5p
UCGAGGAGCUCACAGUCUAGU 37 21 1386
hsa-miR-181b-5p
AACAUUCAUUGCUGUCGGUGGGU 38 23 1382
hsa-miR-221-5p
ACCUGGCAUACAAUGUAGAUUU 39 22 1363
hsa-miR-186-5p
CAAAGAAUUCUCCUUUUGGGCU 40 22 1225
hsa-miR-423-5p
UGAGGGGCAGAGAGCGAGACUUU 41 23 1080
hsa-miR-125b-5p
UCCCUGAGACCCUAACUUGUGA 42 22 1002
hsa-let-7g-5p
UGAGGUAGUAGUUUGUACAGUU 43 22 959
hsa-miR-500a-3p
AUGCACCUGGGCAAGGAUUCUG 44 22 923
hsa-miR-30e-5p
UGUAAACAUCCUUGACUGGAAG 45 22 911
hsa-miR-27a-3p
UUCACAGUGGCUAAGUUCCGC 46 21 867
hsa-miR-409-3p
GAAUGUUGCUCGGUGAACCCCU 47 22 865
hsa-miR-148b-3p
UCAGUGCAUCACAGAACUUUGU 48 22 856
hsa-miR-125b-1-3p
ACGGGUUAGGCUCUUGGGAGCU 49 22 851
hsa-miR-410
AAUAUAACACAGAUGGCCUGU 50 21 848
hsa-miR-381
UAUACAAGGGCAAGCUCUCUGU 51 22 842
hsa-miR-99a-5p
AACCCGUAGAUCCGAUCUUGUG 52 22 773
hsa-let-7d-5p
AGAGGUAGUAGGUUGCAUAGUU 53 22 765
hsa-miR-148a-3p
UCAGUGCACUACAGAACUUUGU 54 22 702
hsa-miR-23a-3p
AUCACAUUGCCAGGGAUUUCC 55 21 654
hsa-miR-28-3p
CACUAGAUUGUGAGCUCCUGGA 56 22 593
hsa-miR-423-3p
AGCUCGGUCUGAGGCCCCUCAGU 57 23 557
hsa-miR-9-5p
UCUUUGGUUAUCUAGCUGUAUGA 58 23 518
hsa-miR-23b-3p
AUCACAUUGCCAGGGAUUACC 59 21 508
hsa-miR-941
CACCCGGCUGUGUGCACAUGUGC 60 23 492
hsa-miR-4488
AGGGGGCGGGCUCCGGCG 61 18 485
hsa-miR-103a-3p
AGCAGCAUUGUACAGGGCUAUGA 62 23 459
hsa-miR-25-3p
CAUUGCACUUGUCUCGGUCUGA 63 22 436
hsa-miR-889
UUAAUAUCGGACAACCAUUGU 64 21 411
hsa-miR-378a-3p
ACUGGACUUGGAGUCAGAAGG 65 21 410
hsa-miR-30c-5p
UGUAAACAUCCUACACUCUCAGC 66 23 378
hsa-miR-4485
UAACGGCCGCGGUACCCUAA 67 20 358
hsa-miR-125b-2-3p
UCACAAGUCAGGCUCUUGGGAC 68 22 352
hsa-miR-671-3p
UCCGGUUCUCAGGGCUCCACC 69 21 350
hsa-miR-361-5p
UUAUCAGAAUCUCCAGGGGUAC 70 22 337
hsa-miR-30e-3p
CUUUCAGUCGGAUGUUUACAGC 71 22 294
hsa-miR-1271-5p
CUUGGCACCUAGCAAGCACUCA 72 22 288
hsa-miR-589-5p
UGAGAACCACGUCUGCUCUGAG 73 22 282
hsa-miR-374a-5p
UUAUAAUACAACCUGAUAAGUG 74 22 275
hsa-miR-769-5p
UGAGACCUCUGGGUUCUGAGCU 75 22 263
hsa-miR-345-5p
GCUGACUCCUAGUCCAGGGCUC 76 22 249
hsa-miR-30a-3p
CUUUCAGUCGGAUGUUUGCAGC 77 22 236
hsa-miR-15b-5p
UAGCAGCACAUCAUGGUUUACA 78 22 229
hsa-miR-221-3p
AGCUACAUUGUCUGCUGGGUUUC 79 23 225
hsa-miR-31-5p
AGGCAAGAUGCUGGCAUAGCU 80 21 213
hsa-miR-342-3p
UCUCACACAGAAAUCGCACCCGU 81 23 205
hsa-miR-136-3p
CAUCAUCGUCUCAAAUGAGUCU 82 22 203
hsa-miR-493-3p
UGAAGGUCUACUGUGUGCCAGG 83 22 192
hsa-miR-720
UCUCGCUGGGGCCUCCA 84 17 154
hsa-miR-7-5p
UGGAAGACUAGUGAUUUUGUUGU 85 23 154
hsa-miR-130b-3p
CAGUGCAAUGAUGAAAGGGCAU 86 22 150
hsa-miR-192-5p
CUGACCUAUGAAUUGACAGCC 87 21 138
hsa-miR-493-5p
UUGUACAUGGUAGGCUUUCAUU 88 22 115
hsa-miR-204-5p
UUCCCUUUGUCAUCCUAUGCCU 89 22 113
hsa-miR-26b-5p
UUCAAGUAAUUCAGGAUAGGU 90 21 107
hsa-miR-1307-5p
UCGACCGGACCUCGACCGGCU 91 21 105
hsa-let-7d-3p
CUAUACGACCUGCUGCCUUUCU 92 22 103
hsa-miR-340-5p
UUAUAAAGCAAUGAGACUGAUU 93 22 100
hsa-miR-134
UGUGACUGGUUGACCAGAGGGG 94 22 99
hsa-miR-432-5p
UCUUGGAGUAGGUCAUUGGGUGG 95 23 97
hsa-miR-30b-5p
UGUAAACAUCCUACACUCAGCU 96 22 96
hsa-miR-320a
AAAAGCUGGGUUGAGAGGGCGA 97 22 95
hsa-miR-100-3p
CAAGCUUGUAUCUAUAGGUAUG 98 22 94
hsa-miR-744-5p
UGCGGGGCUAGGGCUAACAGCA 99 22 89
hsa-miR-181a-3p
ACCAUCGACCGUUGAUUGUACC 100 22 86
hsa-miR-34a-5p
UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU 101 22 85
hsa-miR-181a-2-3p
ACCACUGACCGUUGACUGUACC 102 22 81
hsa-miR-190a
UGAUAUGUUUGAUAUAUUAGGU 103 22 79
hsa-miR-132-3p
UAACAGUCUACAGCCAUGGUCG 104 22 78
hsa-miR-181c-5p
AACAUUCAACCUGUCGGUGAGU 105 22 76
hsa-miR-29a-3p
UAGCACCAUCUGAAAUCGGUUA 106 22 75
hsa-miR-301a-3p
CAGUGCAAUAGUAUUGUCAAAGC 107 23 75
hsa-miR-411-5p
UAGUAGACCGUAUAGCGUACG 108 21 75
hsa-miR-128
UCACAGUGAACCGGUCUCUUU 109 21 74
hsa-miR-4516
GGGAGAAGGGUCGGGGC 110 17 74
hsa-miR-425-5p
AAUGACACGAUCACUCCCGUUGA 111 23 72
hsa-miR-130b-5p
ACUCUUUCCCUGUUGCACUAC 112 21 71
hsa-miR-130a-3p
CAGUGCAAUGUUAAAAGGGCAU 113 22 67
hsa-miR-30d-3p
CUUUCAGUCAGAUGUUUGCUGC 114 22 65
hsa-miR-654-5p
UGGUGGGCCGCAGAACAUGUGC 115 22 65
hsa-miR-93-5p
CAAAGUGCUGUUCGUGCAGGUAG 116 23 65
hsa-miR-487b
AAUCGUACAGGGUCAUCCACUU 117 22 63
hsa-miR-484
UCAGGCUCAGUCCCCUCCCGAU 118 22 62
hsa-miR-24-3p
UGGCUCAGUUCAGCAGGAACAG 119 22 61
hsa-miR-4677-3p
UCUGUGAGACCAAAGAACUACU 120 22 61
hsa-miR-149-5p
UCUGGCUCCGUGUCUUCACUCCC 121 23 56
hsa-miR-197-3p
UUCACCACCUUCUCCACCCAGC 122 22 56
hsa-miR-96-5p
UUUGGCACUAGCACAUUUUUGCU 123 23 56
hsa-miR-1307-3p
ACUCGGCGUGGCGUCGGUCGUG 124 22 55
hsa-miR-34c-5p
AGGCAGUGUAGUUAGCUGAUUGC 125 23 53
hsa-miR-370
GCCUGCUGGGGUGGAACCUGGU 126 22 52
hsa-miR-148b-5p
AAGUUCUGUUAUACACUCAGGC 127 22 51
hsa-miR-335-5p
UCAAGAGCAAUAACGAAAAAUGU 128 23 51
hsa-miR-4461
GAUUGAGACUAGUAGGGCUAGGC 129 23 50
hsa-miR-27a-5p
AGGGCUUAGCUGCUUGUGAGCA 130 22 49
hsa-miR-363-3p
AAUUGCACGGUAUCCAUCUGUA 131 22 47
hsa-miR-431-5p
UGUCUUGCAGGCCGUCAUGCA 132 21 47
hsa-miR-877-5p
GUAGAGGAGAUGGCGCAGGG 133 20 46
hsa-miR-550a-5p
AGUGCCUGAGGGAGUAAGAGCCC 134 23 45
hsa-miR-4508
GCGGGGCUGGGCGCGCG 135 17 44
hsa-miR-541-3p
UGGUGGGCACAGAAUCUGGACU 136 22 42
hsa-miR-135b-5p
UAUGGCUUUUCAUUCCUAUGUGA 137 23 40
hsa-miR-140-3p
UACCACAGGGUAGAACCACGG 138 21 39
hsa-miR-362-5p
AAUCCUUGGAACCUAGGUGUGAGU 139 24 37
hsa-miR-455-3p
GCAGUCCAUGGGCAUAUACAC 140 21 37
hsa-miR-758
UUUGUGACCUGGUCCACUAACC 141 22 37
hsa-miR-101-3p
UACAGUACUGUGAUAACUGAA 142 21 36
hsa-miR-374b-5p
AUAUAAUACAACCUGCUAAGUG 143 22 36
hsa-miR-148a-5p
AAAGUUCUGAGACACUCCGACU 144 22 35
hsa-miR-17-5p
CAAAGUGCUUACAGUGCAGGUAG 145 23 35
hsa-miR-20a-5p
UAAAGUGCUUAUAGUGCAGGUAG 146 23 35
hsa-miR-874
CUGCCCUGGCCCGAGGGACCGA 147 22 35
hsa-miR-193b-3p
AACUGGCCCUCAAAGUCCCGCU 148 22 34
hsa-miR-548ah-3p
CAAAAACUGCAGUUACUUUUGC 149 22 34
hsa-miR-539-3p
AUCAUACAAGGACAAUUUCUUU 150 22 33
hsa-miR-421
AUCAACAGACAUUAAUUGGGCGC 151 23 31
hsa-miR-28-5p
AAGGAGCUCACAGUCUAUUGAG 152 22 30
hsa-miR-485-3p
GUCAUACACGGCUCUCCUCUCU 153 22 29
hsa-miR-2467-5p
UGAGGCUCUGUUAGCCUUGGCUC 154 23 26
hsa-miR-4449
CGUCCCGGGGCUGCGCGAGGCA 155 22 26
hsa-miR-24-2-5p
UGCCUACUGAGCUGAAACACAG 156 22 25
hsa-miR-181d
AACAUUCAUUGUUGUCGGUGGGU 157 23 24
hsa-miR-323a-3p
CACAUUACACGGUCGACCUCU 158 21 24
hsa-miR-106b-3p
CCGCACUGUGGGUACUUGCUGC 159 22 23
hsa-miR-125a-3p
ACAGGUGAGGUUCUUGGGAGCC 160 22 23
hsa-miR-330-5p
UCUCUGGGCCUGUGUCUUAGGC 161 22 23
hsa-miR-1275
GUGGGGGAGAGGCUGUC 162 17 22
hsa-miR-19b-3p
UGUGCAAAUCCAUGCAAAACUGA 163 23 22
hsa-miR-301b
CAGUGCAAUGAUAUUGUCAAAGC 164 23 21
hsa-miR-485-5p
AGAGGCUGGCCGUGAUGAAUUC 165 22 21
hsa-miR-29b-3p
UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU 166 23 20
hsa-miR-3158-3p
AAGGGCUUCCUCUCUGCAGGAC 167 22 20
hsa-miR-431-3p
CAGGUCGUCUUGCAGGGCUUCU 168 22 20
hsa-miR-454-3p
UAGUGCAAUAUUGCUUAUAGGGU 169 23 20
hsa-miR-106b-5p
UAAAGUGCUGACAGUGCAGAU 170 21 19
hsa-miR-1973
ACCGUGCAAAGGUAGCAUA 171 19 19
hsa-miR-31-3p
UGCUAUGCCAACAUAUUGCCAU 172 22 19
hsa-miR-374a-3p
CUUAUCAGAUUGUAUUGUAAUU 173 22 19
hsa-miR-433
AUCAUGAUGGGCUCCUCGGUGU 174 22 19
hsa-miR-4417
GGUGGGCUUCCCGGAGGG 175 18 19
hsa-miR-143-3p
UGAGAUGAAGCACUGUAGCUC 176 21 18
hsa-miR-19a-3p
UGUGCAAAUCUAUGCAAAACUGA 177 23 18
hsa-miR-532-5p
CAUGCCUUGAGUGUAGGACCGU 178 22 18
hsa-miR-561-5p
AUCAAGGAUCUUAAACUUUGCC 179 22 18
hsa-miR-663b
GGUGGCCCGGCCGUGCCUGAGG 180 22 18
hsa-miR-1301
UUGCAGCUGCCUGGGAGUGACUUC 181 24 17
hsa-miR-299-3p
UAUGUGGGAUGGUAAACCGCUU 182 22 17
hsa-miR-9-3p
AUAAAGCUAGAUAACCGAAAGU 183 22 17
hsa-miR-17-3p
ACUGCAGUGAAGGCACUUGUAG 184 22 15
hsa-miR-376c
AACAUAGAGGAAAUUCCACGU 185 21 15
hsa-miR-424-5p
CAGCAGCAAUUCAUGUUUUGAA 186 22 15
hsa-miR-660-5p
UACCCAUUGCAUAUCGGAGUUG 187 22 15
hsa-miR-153
UUGCAUAGUCACAAAAGUGAUC 188 22 14
hsa-miR-3605-5p
UGAGGAUGGAUAGCAAGGAAGCC 189 23 14
hsa-miR-3687
CCCGGACAGGCGUUCGUGCGACGU 190 24 14
hsa-miR-4284
GGGCUCACAUCACCCCAU 191 18 14
hsa-miR-455-5p
UAUGUGCCUUUGGACUACAUCG 192 22 14
hsa-miR-543
AAACAUUCGCGGUGCACUUCUU 193 22 14
hsa-miR-1276
UAAAGAGCCCUGUGGAGACA 194 20 13
hsa-miR-330-3p
GCAAAGCACACGGCCUGCAGAGA 195 23 13
hsa-miR-369-3p
AAUAAUACAUGGUUGAUCUUU 196 21 13
hsa-miR-4786-5p
UGAGACCAGGACUGGAUGCACC 197 22 13
hsa-miR-548k
AAAAGUACUUGCGGAUUUUGCU 198 22 13
hsa-miR-1226-3p
UCACCAGCCCUGUGUUCCCUAG 199 22 12
hsa-miR-188-3p
CUCCCACAUGCAGGGUUUGCA 200 21 12
hsa-miR-27b-5p
AGAGCUUAGCUGAUUGGUGAAC 201 22 12
hsa-miR-377-5p
AGAGGUUGCCCUUGGUGAAUUC 202 22 12
hsa-miR-487a
AAUCAUACAGGGACAUCCAGUU 203 22 12
hsa-miR-92a-1-5p
AGGUUGGGAUCGGUUGCAAUGCU 204 23 12
hsa-miR-135b-3p
AUGUAGGGCUAAAAGCCAUGGG 205 22 11
hsa-miR-218-5p
UUGUGCUUGAUCUAACCAUGU 206 21 11
hsa-miR-3943
UAGCCCCCAGGCUUCACUUGGCG 207 23 11
hsa-miR-92b-5p
AGGGACGGGACGCGGUGCAGUG 208 22 11
hsa-miR-1185-1-3p
AUAUACAGGGGGAGACUCUUAU 209 22 10
hsa-miR-1273g-3p
ACCACUGCACUCCAGCCUGAG 210 21 10
hsa-miR-2355-5p
AUCCCCAGAUACAAUGGACAA 211 21 10
hsa-miR-23a-5p
GGGGUUCCUGGGGAUGGGAUUU 212 22 10
hsa-miR-30c-1-3p
CUGGGAGAGGGUUGUUUACUCC 213 22 10
hsa-miR-329
AACACACCUGGUUAACCUCUUU 214 22 10
hsa-miR-337-3p
CUCCUAUAUGAUGCCUUUCUUC 215 22 10
hsa-miR-3609
CAAAGUGAUGAGUAAUACUGGCUG 216 24 10
hsa-miR-378a-5p
CUCCUGACUCCAGGUCCUGUGU 217 22 10
hsa-miR-3929
GAGGCUGAUGUGAGUAGACCACU 218 23 10
hsa-miR-4745-5p
UGAGUGGGGCUCCCGGGACGGCG 219 23 10
hsa-miR-5096
GUUUCACCAUGUUGGUCAGGC 220 21 10
hsa-miR-656
AAUAUUAUACAGUCAACCUCU 221 21 10
hsa-let-7a-3p
CUAUACAAUCUACUGUCUUUC 222 21 9
hsa-miR-15a-5p
UAGCAGCACAUAAUGGUUUGUG 223 22 9
hsa-miR-185-5p
UGGAGAGAAAGGCAGUUCCUGA 224 22 9
hsa-miR-25-5p
AGGCGGAGACUUGGGCAAUUG 225 21 9
hsa-miR-3065-5p
UCAACAAAAUCACUGAUGCUGGA 226 23 9
hsa-miR-3176
ACUGGCCUGGGACUACCGG 227 19 9
hsa-miR-339-3p
UGAGCGCCUCGACGACAGAGCCG 228 23 9
hsa-miR-374b-3p
CUUAGCAGGUUGUAUUAUCAUU 229 22 9
hsa-miR-4435
AUGGCCAGAGCUCACACAGAGG 230 22 9
hsa-miR-4448
GGCUCCUUGGUCUAGGGGUA 231 20 9
hsa-miR-4497
CUCCGGGACGGCUGGGC 232 17 9
hsa-miR-4521
GCUAAGGAAGUCCUGUGCUCAG 233 22 9
hsa-miR-539-5p
GGAGAAAUUAUCCUUGGUGUGU 234 22 9
hsa-miR-548ah-5p
AAAAGUGAUUGCAGUGUUUG 235 20 9
hsa-miR-1910
CCAGUCCUGUGCCUGCCGCCU 236 21 8
hsa-miR-376a-3p
AUCAUAGAGGAAAAUCCACGU 237 21 8
hsa-miR-382-5p
GAAGUUGUUCGUGGUGGAUUCG 238 22 8
hsa-miR-3940-3p
CAGCCCGGAUCCCAGCCCACUU 239 22 8
hsa-miR-494
UGAAACAUACACGGGAAACCUC 240 22 8
hsa-miR-495
AAACAAACAUGGUGCACUUCUU 241 22 8
hsa-miR-545-3p
UCAGCAAACAUUUAUUGUGUGC 242 22 8
hsa-miR-99b-3p
CAAGCUCGUGUCUGUGGGUCCG 243 22 8
hsa-miR-1197
UAGGACACAUGGUCUACUUCU 244 21 7
hsa-miR-181b-3p
CUCACUGAACAAUGAAUGCAA 245 21 7
hsa-miR-212-5p
ACCUUGGCUCUAGACUGCUUACU 246 23 7
hsa-miR-3200-3p
CACCUUGCGCUACUCAGGUCUG 247 22 7
hsa-miR-340-3p
UCCGUCUCAGUUACUUUAUAGC 248 22 7
hsa-miR-3607-5p
GCAUGUGAUGAAGCAAAUCAGU 249 22 7
hsa-miR-361-3p
UCCCCCAGGUGUGAUUCUGAUUU 250 23 7
hsa-miR-3656
GGCGGGUGCGGGGGUGG 251 17 7
hsa-miR-532-3p
CCUCCCACACCCAAGGCUUGCA 252 22 7
hsa-miR-574-3p
CACGCUCAUGCACACACCCACA 253 22 7
hsa-miR-107
AGCAGCAUUGUACAGGGCUAUCA 254 23 6
hsa-miR-127-5p
CUGAAGCUCAGAGGGCUCUGAU 255 22 6
hsa-miR-18a-5p
UAAGGUGCAUCUAGUGCAGAUAG 256 23 6
hsa-miR-26a-2-3p
CCUAUUCUUGAUUACUUGUUUC 257 22 6
hsa-miR-296-5p
AGGGCCCCCCCUCAAUCCUGU 258 21 6
hsa-miR-3648
AGCCGCGGGGAUCGCCGAGGG 259 21 6
hsa-miR-382-3p
AAUCAUUCACGGACAACACUU 260 21 6
hsa-miR-3939
UACGCGCAGACCACAGGAUGUC 261 22 6
hsa-miR-432-3p
CUGGAUGGCUCCUCCAUGUCU 262 21 6
hsa-miR-4423-5p
AGUUGCCUUUUUGUUCCCAUGC 263 22 6
hsa-miR-4466
GGGUGCGGGCCGGCGGGG 264 18 6
hsa-miR-454-5p
ACCCUAUCAAUAUUGUCUCUGC 265 22 6
hsa-miR-4746-5p
CCGGUCCCAGGAGAACCUGCAGA 266 23 6
hsa-miR-496
UGAGUAUUACAUGGCCAAUCUC 267 22 6
hsa-miR-548o-3p
CCAAAACUGCAGUUACUUUUGC 268 22 6
hsa-miR-1248
ACCUUCUUGUAUAAGCACUGUGCUAAA 269 27 5
hsa-miR-1254
AGCCUGGAAGCUGGAGCCUGCAGU 270 24 5
hsa-miR-1296
UUAGGGCCCUGGCUCCAUCUCC 271 22 5
hsa-miR-136-5p
ACUCCAUUUGUUUUGAUGAUGGA 272 23 5
hsa-miR-199a-5p
CCCAGUGUUCAGACUACCUGUUC 273 23 5
hsa-miR-296-3p
GAGGGUUGGGUGGAGGCUCUCC 274 22 5
hsa-miR-3177-3p
UGCACGGCACUGGGGACACGU 275 21 5
hsa-miR-324-3p
ACUGCCCCAGGUGCUGCUGG 276 20 5
hsa-miR-337-5p
GAACGGCUUCAUACAGGAGUU 277 21 5
hsa-miR-342-5p
AGGGGUGCUAUCUGUGAUUGA 278 21 5
hsa-miR-365b-3p
UAAUGCCCCUAAAAAUCCUUAU 279 22 5
hsa-miR-3676-5p
AGGAGAUCCUGGGUU 280 15 5
hsa-miR-502-3p
AAUGCACCUGGGCAAGGAUUCA 281 22 5
hsa-miR-505-3p
CGUCAACACUUGCUGGUUUCCU 282 22 5
hsa-miR-550a-3p
UGUCUUACUCCCUCAGGCACAU 283 22 5
hsa-miR-5587-3p
GCCCCGGGCAGUGUGAUCAUC 284 21 5
hsa-miR-641
AAAGACAUAGGAUAGAGUCACCUC 285 24 5
hsa-miR-655
AUAAUACAUGGUUAACCUCUUU 286 22 5
hsa-miR-664-3p
UAUUCAUUUAUCCCCAGCCUACA 287 23 5
hsa-miR-671-5p
AGGAAGCCCUGGAGGGGCUGGAG 288 23 5
hsa-miR-760
CGGCUCUGGGUCUGUGGGGA 289 20 5
hsa-let-7e-3p
CUAUACGGCCUCCUAGCUUUCC 290 22 4
hsa-miR-1268a
CGGGCGUGGUGGUGGGGG 291 18 4
hsa-miR-1273f
GGAGAUGGAGGUUGCAGUG 292 19 4
hsa-miR-1286
UGCAGGACCAAGAUGAGCCCU 293 21 4
hsa-miR-1291
UGGCCCUGACUGAAGACCAGCAGU 294 24 4
hsa-miR-141-3p
UAACACUGUCUGGUAAAGAUGG 295 22 4
hsa-miR-1468
CUCCGUUUGCCUGUUUCGCUG 296 21 4
hsa-miR-328
CUGGCCCUCUCUGCCCUUCCGU 297 22 4
hsa-miR-424-3p
CAAAACGUGAGGCGCUGCUAU 298 21 4
hsa-miR-4454
GGAUCCGAGUCACGGCACCA 299 20 4
hsa-miR-4463
GAGACUGGGGUGGGGCC 300 17 4
hsa-miR-4671-3p
UUAGUGCAUAGUCUUUGGUCU 301 21 4
hsa-miR-4775
UUAAUUUUUUGUUUCGGUCACU 302 22 4
hsa-miR-500a-5p
UAAUCCUUGCUACCUGGGUGAGA 303 23 4
hsa-miR-548b-5p
AAAAGUAAUUGUGGUUUUGGCC 304 22 4
hsa-miR-573
CUGAAGUGAUGUGUAACUGAUCAG 305 24 4
hsa-miR-576-5p
AUUCUAAUUUCUCCACGUCUUU 306 22 4
hsa-miR-625-3p
GACUAUAGAACUUUCCCCCUCA 307 22 4
hsa-miR-652-3p
AAUGGCGCCACUAGGGUUGUG 308 21 4
hsa-miR-665
ACCAGGAGGCUGAGGCCCCU 309 20 4
hsa-miR-766-3p
ACUCCAGCCCCACAGCCUCAGC 310 22 4
hsa-miR-935
CCAGUUACCGCUUCCGCUACCGC 311 23 4
hsa-miR-937
AUCCGCGCUCUGACUCUCUGCC 312 22 4
hsa-miR-1180
UUUCCGGCUCGCGUGGGUGUGU 313 22 3
hsa-miR-1185-2-3p
AUAUACAGGGGGAGACUCUCAU 314 22 3
hsa-miR-132-5p
ACCGUGGCUUUCGAUUGUUACU 315 22 3
hsa-miR-16-2-3p
CCAAUAUUACUGUGCUGCUUUA 316 22 3
hsa-miR-20b-5p
CAAAGUGCUCAUAGUGCAGGUAG 317 23 3
hsa-miR-2116-3p
CCUCCCAUGCCAAGAACUCCC 318 21 3
hsa-miR-299-5p
UGGUUUACCGUCCCACAUACAU 319 22 3
hsa-miR-30b-3p
CUGGGAGGUGGAUGUUUACUUC 320 22 3
hsa-miR-30c-2-3p
CUGGGAGAAGGCUGUUUACUCU 321 22 3
hsa-miR-3187-3p
UUGGCCAUGGGGCUGCGCGG 322 20 3
hsa-miR-3615
UCUCUCGGCUCCUCGCGGCUC 323 21 3
hsa-miR-3620
UCACCCUGCAUCCCGCACCCAG 324 22 3
hsa-miR-3654
GACUGGACAAGCUGAGGAA 325 19 3
hsa-miR-3662
GAAAAUGAUGAGUAGUGACUGAUG 326 24 3
hsa-miR-3681-5p
UAGUGGAUGAUGCACUCUGUGC 327 22 3
hsa-miR-4286
ACCCCACUCCUGGUACC 328 17 3
hsa-miR-4640-3p
CACCCCCUGUUUCCUGGCCCAC 329 22 3
hsa-miR-4717-3p
ACACAUGGGUGGCUGUGGCCU 330 21 3
hsa-miR-542-3p
UGUGACAGAUUGAUAACUGAAA 331 22 3
hsa-miR-5584-5p
CAGGGAAAUGGGAAGAACUAGA 332 22 3
hsa-miR-570-3p
CGAAAACAGCAAUUACCUUUGC 333 22 3
hsa-miR-574-5p
UGAGUGUGUGUGUGUGAGUGUGU 334 23 3
hsa-miR-628-3p
UCUAGUAAGAGUGGCAGUCGA 335 21 3
hsa-miR-654-3p
UAUGUCUGCUGACCAUCACCUU 336 22 3
hsa-miR-769-3p
CUGGGAUCUCCGGGGUCUUGGUU 337 23 3
hsa-miR-943
CUGACUGUUGCCGUCCUCCAG 338 21 3
hsa-let-7b-3p
CUAUACAACCUACUGCCUUCCC 339 22 2
hsa-miR-1244
AAGUAGUUGGUUUGUAUGAGAUGGUU 340 26 2
hsa-miR-1255a
AGGAUGAGCAAAGAAAGUAGAUU 341 23 2
hsa-miR-1273e
UUGCUUGAACCCAGGAAGUGGA 342 22 2
hsa-miR-1289
UGGAGUCCAGGAAUCUGCAUUUU 343 23 2
hsa-miR-152
UCAGUGCAUGACAGAACUUGG 344 21 2
hsa-miR-194-5p
UGUAACAGCAACUCCAUGUGGA 345 22 2
hsa-miR-195-5p
UAGCAGCACAGAAAUAUUGGC 346 21 2
hsa-miR-200c-3p
UAAUACUGCCGGGUAAUGAUGGA 347 23 2
hsa-miR-212-3p
UAACAGUCUCCAGUCACGGCC 348 21 2
hsa-miR-222-5p
CUCAGUAGCCAGUGUAGAUCCU 349 22 2
hsa-miR-3065-3p
UCAGCACCAGGAUAUUGUUGGAG 350 23 2
hsa-miR-3115
AUAUGGGUUUACUAGUUGGU 351 20 2
hsa-miR-3126-5p
UGAGGGACAGAUGCCAGAAGCA 352 22 2
hsa-miR-3174
UAGUGAGUUAGAGAUGCAGAGCC 353 23 2
hsa-miR-324-5p
CGCAUCCCCUAGGGCAUUGGUGU 354 23 2
hsa-miR-33a-5p
GUGCAUUGUAGUUGCAUUGCA 355 21 2
hsa-miR-3677-3p
CUCGUGGGCUCUGGCCACGGCC 356 22 2
hsa-miR-369-5p
AGAUCGACCGUGUUAUAUUCGC 357 22 2
hsa-miR-425-3p
AUCGGGAAUGUCGUGUCCGCCC 358 22 2
hsa-miR-4426
GAAGAUGGACGUACUUU 359 17 2
hsa-miR-4467
UGGCGGCGGUAGUUAUGGGCUU 360 22 2
hsa-miR-4482-3p
UUUCUAUUUCUCAGUGGGGCUC 361 22 2
hsa-miR-4515
AGGACUGGACUCCCGGCAGCCC 362 22 2
hsa-miR-4792
CGGUGAGCGCUCGCUGGC 363 18 2
hsa-miR-659-5p
AGGACCUUCCCUGAACCAAGGA 364 22 2
hsa-miR-663a
AGGCGGGGCGCCGCGGGACCGC 365 22 2
hsa-miR-940
AAGGCAGGGCCCCCGCUCCCC 366 21 2
hsa-miR-99a-3p
CAAGCUCGCUUCUAUGGGUCUG 367 22 2
hsa-miR-1185-5p
AGAGGAUACCCUUUGUAUGUU 368 21 1
hsa-miR-1225-3p
UGAGCCCCUGUGCCGCCCCCAG 369 22 1
hsa-miR-1237
UCCUUCUGCUCCGUCCCCCAG 370 21 1
hsa-miR-1252
AGAAGGAAAUUGAAUUCAUUUA 371 22 1
hsa-miR-1257
AGUGAAUGAUGGGUUCUGACC 372 21 1
hsa-miR-1260b
AUCCCACCACUGCCACCAU 373 19 1
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hsa-miR-1290
UGGAUUUUUGGAUCAGGGA 375 19 1
hsa-miR-1306-3p
ACGUUGGCUCUGGUGGUG 376 18 1
hsa-miR-1321
CAGGGAGGUGAAUGUGAU 377 18 1
hsa-miR-1343
CUCCUGGGGCCCGCACUCUCGC 378 22 1
hsa-miR-138-5p
AGCUGGUGUUGUGAAUCAGGCCG 379 23 1
hsa-miR-140-5p
CAGUGGUUUUACCCUAUGGUAG 380 22 1
hsa-miR-146b-3p
UGCCCUGUGGACUCAGUUCUGG 381 22 1
hsa-miR-186-3p
GCCCAAAGGUGAAUUUUUUGGG 382 22 1
hsa-miR-1908
CGGCGGGGACGGCGAUUGGUC 383 21 1
hsa-miR-1915-3p
CCCCAGGGCGACGCGGCGGG 384 20 1
hsa-miR-1915-5p
ACCUUGCCUUGCUGCCCGGGCC 385 22 1
hsa-miR-193a-3p
AACUGGCCUACAAAGUCCCAGU 386 22 1
hsa-miR-19b-1-5p
AGUUUUGCAGGUUUGCAUCCAGC 387 23 1
hsa-miR-208b
AUAAGACGAACAAAAGGUUUGU 388 22 1
hsa-miR-2110
UUGGGGAAACGGCCGCUGAGUG 389 22 1
hsa-miR-219-1-3p
AGAGUUGAGUCUGGACGUCCCG 390 22 1
hsa-miR-26b-3p
CCUGUUCUCCAUUACUUGGCUC 391 22 1
hsa-miR-2964a-3p
AGAAUUGCGUUUGGACAAUCAGU 392 23 1
hsa-miR-29a-5p
ACUGAUUUCUUUUGGUGUUCAG 393 22 1
hsa-miR-3126-3p
CAUCUGGCAUCCGUCACACAGA 394 22 1
hsa-miR-3130-3p
GCUGCACCGGAGACUGGGUAA 395 21 1
hsa-miR-3130-5p
UACCCAGUCUCCGGUGCAGCC 396 21 1
hsa-miR-3140-5p
ACCUGAAUUACCAAAAGCUUU 397 21 1
hsa-miR-3155a
CCAGGCUCUGCAGUGGGAACU 398 21 1
hsa-miR-3157-3p
CUGCCCUAGUCUAGCUGAAGCU 399 22 1
hsa-miR-3180-3p
UGGGGCGGAGCUUCCGGAGGCC 400 22 1
hsa-miR-323b-5p
AGGUUGUCCGUGGUGAGUUCGCA 401 23 1
hsa-miR-339-5p
UCCCUGUCCUCCAGGAGCUCACG 402 23 1
hsa-miR-34a-3p
CAAUCAGCAAGUAUACUGCCCU 403 22 1
hsa-miR-34b-3p
CAAUCACUAACUCCACUGCCAU 404 22 1
hsa-miR-34c-3p
AAUCACUAACCACACGGCCAGG 405 22 1
hsa-miR-3658
UUUAAGAAAACACCAUGGAGAU 406 22 1
hsa-miR-365a-5p
AGGGACUUUUGGGGGCAGAUGUG 407 23 1
hsa-miR-3676-3p
CCGUGUUUCCCCCACGCUUU 408 20 1
hsa-miR-3691-5p
AGUGGAUGAUGGAGACUCGGUAC 409 23 1
hsa-miR-376a-5p
GUAGAUUCUCCUUCUAUGAGUA 410 22 1
hsa-miR-378g
ACUGGGCUUGGAGUCAGAAG 411 20 1
hsa-miR-3909
UGUCCUCUAGGGCCUGCAGUCU 412 22 1
hsa-miR-3928
GGAGGAACCUUGGAGCUUCGGC 413 22 1
hsa-miR-3942-3p
UUUCAGAUAACAGUAUUACAU 414 21 1
hsa-miR-3944-5p
UGUGCAGCAGGCCAACCGAGA 415 21 1
hsa-miR-3960
GGCGGCGGCGGAGGCGGGGG 416 20 1
hsa-miR-4326
UGUUCCUCUGUCUCCCAGAC 417 20 1
hsa-miR-4444
CUCGAGUUGGAAGAGGCG 418 18 1
hsa-miR-4450
UGGGGAUUUGGAGAAGUGGUGA 419 22 1
hsa-miR-4642
AUGGCAUCGUCCCCUGGUGGCU 420 22 1
hsa-miR-4668-5p
AGGGAAAAAAAAAAGGAUUUGUC 421 23 1
hsa-miR-4673
UCCAGGCAGGAGCCGGACUGGA 422 22 1
hsa-miR-4688
UAGGGGCAGCAGAGGACCUGGG 423 22 1
hsa-miR-4700-3p
CACAGGACUGACUCCUCACCCCAGUG 424 26 1
hsa-miR-4731-3p
CACACAAGUGGCCCCCAACACU 425 22 1
hsa-miR-4749-3p
CGCCCCUCCUGCCCCCACAG 426 20 1
hsa-miR-4769-5p
GGUGGGAUGGAGAGAAGGUAUGAG 427 24 1
hsa-miR-4800-5p
AGUGGACCGAGGAAGGAAGGA 428 21 1
hsa-miR-491-5p
AGUGGGGAACCCUUCCAUGAGG 429 22 1
hsa-miR-501-5p
AAUCCUUUGUCCCUGGGUGAGA 430 22 1
hsa-miR-5092
AAUCCACGCUGAGCUUGGCAUC 431 22 1
hsa-miR-541-5p
AAAGGAUUCUGCUGUCGGUCCCACU 432 25 1
hsa-miR-542-5p
UCGGGGAUCAUCAUGUCACGAGA 433 23 1
hsa-miR-551b-3p
GCGACCCAUACUUGGUUUCAG 434 21 1
hsa-miR-5690
UCAGCUACUACCUCUAUUAGG 435 21 1
hsa-miR-577
UAGAUAAAAUAUUGGUACCUG 436 21 1
hsa-miR-584-3p
UCAGUUCCAGGCCAACCAGGCU 437 22 1
hsa-miR-589-3p
UCAGAACAAAUGCCGGUUCCCAGA 438 24 1
hsa-miR-616-5p
ACUCAAAACCCUUCAGUGACUU 439 22 1
hsa-miR-628-5p
AUGCUGACAUAUUUACUAGAGG 440 22 1
hsa-miR-629-5p
UGGGUUUACGUUGGGAGAACU 441 21 1
hsa-miR-644b-3p
UUCAUUUGCCUCCCAGCCUACA 442 22 1
hsa-miR-664-5p
ACUGGCUAGGGAAAAUGAUUGGAU 443 24 1
hsa-miR-922
GCAGCAGAGAAUAGGACUACGUC 444 23 1
Tabla 5: Células EI
Células: CTX0E03 07EI
miARN
Secuencia de miARN SEQ ID NO: Longitud de miARN Recuentos de lectura
hsa-let-7a-5p
UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU 1 22 305060
hsa-miR-92b-3p
UAUUGCACUCGUCCCGGCCUCC 13 22 242715
hsa-miR-21-5p
UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA 9 22 154626
hsa-miR-92a-3p
UAUUGCACUUGUCCCGGCCUGU 7 22 137412
hsa-miR-127-3p
UCGGAUCCGUCUGAGCUUGGCU 14 22 110806
hsa-miR-100-5p
AACCCGUAGAUCCGAACUUGUG 3 22 109290
hsa-miR-27b-3p
UUCACAGUGGCUAAGUUCUGC 6 21 91902
hsa-miR-191-5p
CAACGGAAUCCCAAAAGCAGCUG 8 23 89150
hsa-miR-26a-5p
UUCAAGUAAUCCAGGAUAGGCU 12 22 88724
hsa-miR-99b-5p
CACCCGUAGAACCGACCUUGCG 4 22 87399
hsa-let-7f-5p
UGAGGUAGUAGAUUGUAUAGUU 11 22 78395
hsa-miR-181a-5p
AACAUUCAACGCUGUCGGUGAGU 15 23 47686
hsa-miR-486-5p
UCCUGUACUGAGCUGCCCCGAG 5 22 41639
hsa-miR-30a-5p
UGUAAACAUCCUCGACUGGAAG 30 22 35465
hsa-miR-98
UGAGGUAGUAAGUUGUAUUGUU 10 22 30440
hsa-miR-151a-3p
CUAGACUGAAGCUCCUUGAGG 25 21 29047
hsa-miR-21-3p
CAACACCAGUCGAUGGGCUGU 20 21 27733
hsa-miR-30d-5p
UGUAAACAUCCCCGACUGGAAG 31 22 27307
hsa-let-7c
UGAGGUAGUAGGUUGUAUGGUU 17 22 27224
hsa-miR-10a-5p
UACCCUGUAGAUCCGAAUUUGUG 2 23 26908
hsa-miR-22-3p
AAGCUGCCAGUUGAAGAACUGU 33 22 26456
hsa-miR-182-5p
UUUGGCAAUGGUAGAACUCACACU 16 24 25885
hsa-miR-222-3p
AGCUACAUCUGGCUACUGGGU 36 21 22187
hsa-miR-125a-5p
UCCCUGAGACCCUUUAACCUGUGA 35 24 20960
hsa-miR-16-5p
UAGCAGCACGUAAAUAUUGGCG 29 22 19856
hsa-let-7b-5p
UGAGGUAGUAGGUUGUGUGGUU 28 22 19774
hsa-miR-151a-5p
UCGAGGAGCUCACAGUCUAGU 37 21 19773
hsa-let-7e-5p
UGAGGUAGGAGGUUGUAUAGUU 27 22 19035
hsa-miR-125b-5p
UCCCUGAGACCCUAACUUGUGA 42 22 17965
hsa-let-7i-5p
UGAGGUAGUAGUUUGUGCUGUU 22 22 17802
hsa-let-7g-5p
UGAGGUAGUAGUUUGUACAGUU 43 22 15467
hsa-miR-409-3p
GAAUGUUGCUCGGUGAACCCCU 47 22 14133
hsa-miR-30e-5p
UGUAAACAUCCUUGACUGGAAG 45 22 13889
hsa-miR-181b-5p
AACAUUCAUUGCUGUCGGUGGGU 38 23 12606
hsa-miR-186-5p
CAAAGAAUUCUCCUUUUGGGCU 40 22 12441
hsa-miR-381
UAUACAAGGGCAAGCUCUCUGU 51 22 9851
hsa-miR-423-5p
UGAGGGGCAGAGAGCGAGACUUU 41 23 8893
hsa-miR-30c-5p
UGUAAACAUCCUACACUCUCAGC 66 23 8737
hsa-miR-410
AAUAUAACACAGAUGGCCUGU 50 21 8509
hsa-miR-146b-5p
UGAGAACUGAAUUCCAUAGGCU 19 22 8434
hsa-miR-654-3p
UAUGUCUGCUGACCAUCACCUU 336 22 8392
hsa-miR-9-5p
UCUUUGGUUAUCUAGCUGUAUGA 58 23 7957
hsa-miR-28-3p
CACUAGAUUGUGAGCUCCUGGA 56 22 7767
hsa-miR-148a-3p
UCAGUGCACUACAGAACUUUGU 54 22 6599
hsa-miR-379-5p
UGGUAGACUAUGGAACGUAGG 18 21 6135
hsa-let-7d-5p
AGAGGUAGUAGGUUGCAUAGUU 53 22 5972
hsa-miR-183-5p
UAUGGCACUGGUAGAAUUCACU 24 22 5477
hsa-miR-25-3p
CAUUGCACUUGUCUCGGUCUGA 63 22 5303
hsa-miR-423-3p
AGCUCGGUCUGAGGCCCCUCAGU 57 23 5225
hsa-miR-889
UUAAUAUCGGACAACCAUUGU 64 21 4597
hsa-miR-221-5p
ACCUGGCAUACAAUGUAGAUUU 39 22 4379
hsa-miR-125b-1-3p
ACGGGUUAGGCUCUUGGGAGCU 49 22 4192
hsa-miR-409-5p
AGGUUACCCGAGCAACUUUGCAU 32 23 3970
hsa-miR-4492
GGGGCUGGGCGCGCGCC 34 17 3864
hsa-miR-148b-3p
UCAGUGCAUCACAGAACUUUGU 48 22 3593
hsa-miR-103a-3p
AGCAGCAUUGUACAGGGCUAUGA 62 23 3518
hsa-miR-1271-5p
CUUGGCACCUAGCAAGCACUCA 72 22 3477
hsa-miR-136-3p
CAUCAUCGUCUCAAAUGAGUCU 82 22 3373
hsa-miR-769-5p
UGAGACCUCUGGGUUCUGAGCU 75 22 2957
hsa-miR-4532
CCCCGGGGAGCCCGGCG 23 17 2915
hsa-miR-378a-3p
ACUGGACUUGGAGUCAGAAGG 65 21 2895
hsa-miR-99a-5p
AACCCGUAGAUCCGAUCUUGUG 52 22 2767
hsa-miR-221-3p
AGCUACAUUGUCUGCUGGGUUUC 79 23 2764
hsa-miR-30e-3p
CUUUCAGUCGGAUGUUUACAGC 71 22 2441
hsa-miR-26b-5p
UUCAAGUAAUUCAGGAUAGGU 90 21 2432
hsa-miR-4488
AGGGGGCGGGCUCCGGCG 61 18 2391
hsa-miR-27a-3p
UUCACAGUGGCUAAGUUCCGC 46 21 2385
hsa-miR-23b-3p
AUCACAUUGCCAGGGAUUACC 59 21 2316
hsa-miR-500a-3p
AUGCACCUGGGCAAGGAUUCUG 44 22 2144
hsa-miR-941
CACCCGGCUGUGUGCACAUGUGC 60 23 2114
hsa-miR-23a-3p
AUCACAUUGCCAGGGAUUUCC 55 21 2086
hsa-miR-30a-3p
CUUUCAGUCGGAUGUUUGCAGC 77 22 2045
hsa-miR-30b-5p
UGUAAACAUCCUACACUCAGCU 96 22 1936
hsa-miR-501-3p
AAUGCACCCGGGCAAGGAUUCU 26 22 1895
hsa-miR-130b-3p
CAGUGCAAUGAUGAAAGGGCAU 86 22 1862
hsa-miR-1246
AAUGGAUUUUUGGAGCAGG 21 19 1783
hsa-miR-140-3p
UACCACAGGGUAGAACCACGG 138 21 1735
hsa-miR-31-5p
AGGCAAGAUGCUGGCAUAGCU 80 21 1705
hsa-miR-493-3p
UGAAGGUCUACUGUGUGCCAGG 83 22 1698
hsa-miR-181c-5p
AACAUUCAACCUGUCGGUGAGU 105 22 1554
hsa-miR-93-5p
CAAAGUGCUGUUCGUGCAGGUAG 116 23 1492
hsa-miR-181a-2-3p
ACCACUGACCGUUGACUGUACC 102 22 1491
hsa-miR-15b-5p
UAGCAGCACAUCAUGGUUUACA 78 22 1465
hsa-miR-7-5p
UGGAAGACUAGUGAUUUUGUUGU 85 23 1460
hsa-miR-192-5p
CUGACCUAUGAAUUGACAGCC 87 21 1453
hsa-miR-425-5p
AAUGACACGAUCACUCCCGUUGA 111 23 1432
hsa-miR-204-5p
UUCCCUUUGUCAUCCUAUGCCU 89 22 1378
hsa-miR-340-5p
UUAUAAAGCAAUGAGACUGAUU 93 22 1360
hsa-miR-190a
UGAUAUGUUUGAUAUAUUAGGU 103 22 1305
hsa-miR-34a-5p
UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU 101 22 1283
hsa-miR-20a-5p
UAAAGUGCUUAUAGUGCAGGUAG 146 23 1257
hsa-miR-29a-3p
UAGCACCAUCUGAAAUCGGUUA 106 22 1206
hsa-miR-361-5p
UUAUCAGAAUCUCCAGGGGUAC 70 22 1173
hsa-miR-671-3p
UCCGGUUCUCAGGGCUCCACC 69 21 1166
hsa-miR-411-5p
UAGUAGACCGUAUAGCGUACG 108 21 1130
hsa-miR-589-5p
UGAGAACCACGUCUGCUCUGAG 73 22 1067
hsa-miR-130a-3p
CAGUGCAAUGUUAAAAGGGCAU 113 22 1020
hsa-miR-320a
AAAAGCUGGGUUGAGAGGGCGA 97 22 994
hsa-miR-149-5p
UCUGGCUCCGUGUCUUCACUCCC 121 23 948
hsa-miR-335-5p
UCAAGAGCAAUAACGAAAAAUGU 128 23 945
hsa-miR-134
UGUGACUGGUUGACCAGAGGGG 94 22 941
hsa-miR-17-5p
CAAAGUGCUUACAGUGCAGGUAG 145 23 939
hsa-miR-493-5p
UUGUACAUGGUAGGCUUUCAUU 88 22 876
hsa-miR-34c-5p
AGGCAGUGUAGUUAGCUGAUUGC 125 23 846
hsa-miR-484
UCAGGCUCAGUCCCCUCCCGAU 118 22 835
hsa-miR-181a-3p
ACCAUCGACCGUUGAUUGUACC 100 22 803
hsa-miR-24-3p
UGGCUCAGUUCAGCAGGAACAG 119 22 740
hsa-miR-128
UCACAGUGAACCGGUCUCUUU 109 21 707
hsa-miR-342-3p
UCUCACACAGAAAUCGCACCCGU 81 23 698
hsa-miR-454-3p
UAGUGCAAUAUUGCUUAUAGGGU 169 23 690
hsa-miR-1307-5p
UCGACCGGACCUCGACCGGCU 91 21 616
hsa-miR-487b
AAUCGUACAGGGUCAUCCACUU 117 22 590
hsa-miR-130b-5p
ACUCUUUCCCUGUUGCACUAC 112 21 568
hsa-miR-197-3p
UUCACCACCUUCUCCACCCAGC 122 22 544
hsa-miR-432-5p
UCUUGGAGUAGGUCAUUGGGUGG 95 23 542
hsa-miR-374a-5p
UUAUAAUACAACCUGAUAAGUG 74 22 537
hsa-miR-345-5p
GCUGACUCCUAGUCCAGGGCUC 76 22 527
hsa-miR-744-5p
UGCGGGGCUAGGGCUAACAGCA 99 22 515
hsa-miR-376c
AACAUAGAGGAAAUUCCACGU 185 21 506
hsa-miR-181d
AACAUUCAUUGUUGUCGGUGGGU 157 23 497
hsa-miR-363-3p
AAUUGCACGGUAUCCAUCUGUA 131 22 493
hsa-miR-539-3p
AUCAUACAAGGACAAUUUCUUU 150 22 493
hsa-miR-758
UUUGUGACCUGGUCCACUAACC 141 22 477
hsa-miR-323a-3p
CACAUUACACGGUCGACCUCU 158 21 443
hsa-miR-107
AGCAGCAUUGUACAGGGCUAUCA 254 23 431
hsa-miR-720
UCUCGCUGGGGCCUCCA 84 17 427
hsa-miR-654-5p
UGGUGGGCCGCAGAACAUGUGC 115 22 409
hsa-miR-370
GCCUGCUGGGGUGGAACCUGGU 126 22 406
hsa-miR-421
AUCAACAGACAUUAAUUGGGCGC 151 23 399
hsa-miR-30d-3p
CUUUCAGUCAGAUGUUUGCUGC 114 22 358
hsa-miR-148b-5p
AAGUUCUGUUAUACACUCAGGC 127 22 354
hsa-miR-1301
UUGCAGCUGCCUGGGAGUGACUUC 181 24 346
hsa-miR-374b-5p
AUAUAAUACAACCUGCUAAGUG 143 22 339
hsa-miR-125b-2-3p
UCACAAGUCAGGCUCUUGGGAC 68 22 333
hsa-miR-28-5p
AAGGAGCUCACAGUCUAUUGAG 152 22 332
hsa-miR-495
AAACAAACAUGGUGCACUUCUU 241 22 321
hsa-miR-15a-5p
UAGCAGCACAUAAUGGUUUGUG 223 22 320
hsa-miR-100-3p
CAAGCUUGUAUCUAUAGGUAUG 98 22 314
hsa-miR-193b-3p
AACUGGCCCUCAAAGUCCCGCU 148 22 305
hsa-miR-330-5p
UCUCUGGGCCUGUGUCUUAGGC 161 22 303
hsa-miR-376a-3p
AUCAUAGAGGAAAAUCCACGU 237 21 298
hsa-miR-135b-5p
UAUGGCUUUUCAUUCCUAUGUGA 137 23 289
hsa-miR-301a-3p
CAGUGCAAUAGUAUUGUCAAAGC 107 23 280
hsa-miR-218-5p
UUGUGCUUGAUCUAACCAUGU 206 21 276
hsa-miR-143-3p
UGAGAUGAAGCACUGUAGCUC 176 21 256
hsa-miR-27b-5p
AGAGCUUAGCUGAUUGGUGAAC 201 22 255
hsa-miR-369-3p
AAUAAUACAUGGUUGAUCUUU 196 21 255
hsa-miR-877-5p
GUAGAGGAGAUGGCGCAGGG 133 20 249
hsa-miR-19b-3p
UGUGCAAAUCCAUGCAAAACUGA 163 23 246
hsa-miR-424-5p
CAGCAGCAAUUCAUGUUUUGAA 186 22 245
hsa-miR-660-5p
UACCCAUUGCAUAUCGGAGUUG 187 22 244
hsa-miR-532-5p
CAUGCCUUGAGUGUAGGACCGU 178 22 238
hsa-miR-299-3p
UAUGUGGGAUGGUAAACCGCUU 182 22 235
hsa-miR-431-3p
CAGGUCGUCUUGCAGGGCUUCU 168 22 231
hsa-miR-374a-3p
CUUAUCAGAUUGUAUUGUAAUU 173 22 220
hsa-miR-148a-5p
AAAGUUCUGAGACACUCCGACU 144 22 214
hsa-miR-4516
GGGAGAAGGGUCGGGGC 110 17 207
hsa-miR-92b-5p
AGGGACGGGACGCGGUGCAGUG 208 22 206
hsa-miR-16-2-3p
CCAAUAUUACUGUGCUGCUUUA 316 22 202
hsa-miR-101-3p
UACAGUACUGUGAUAACUGAA 142 21 201
hsa-let-7a-3p
CUAUACAAUCUACUGUCUUUC 222 21 199
hsa-miR-4485
UAACGGCCGCGGUACCCUAA 67 20 195
hsa-miR-455-3p
GCAGUCCAUGGGCAUAUACAC 140 21 192
hsa-miR-185-5p
UGGAGAGAAAGGCAGUUCCUGA 224 22 188
hsa-miR-1185-1-3p
AUAUACAGGGGGAGACUCUUAU 209 22 187
hsa-miR-1197
UAGGACACAUGGUCUACUUCU 244 21 185
hsa-miR-106b-3p
CCGCACUGUGGGUACUUGCUGC 159 22 178
hsa-miR-24-2-5p
UGCCUACUGAGCUGAAACACAG 156 22 178
hsa-miR-4677-3p
UCUGUGAGACCAAAGAACUACU 120 22 177
hsa-miR-380-3p
UAUGUAAUAUGGUCCACAUCUU 445 22 174
hsa-miR-548k
AAAAGUACUUGCGGAUUUUGCU 198 22 171
hsa-miR-1307-3p
ACUCGGCGUGGCGUCGGUCGUG 124 22 169
hsa-miR-485-3p
GUCAUACACGGCUCUCCUCUCU 153 22 168
hsa-miR-494
UGAAACAUACACGGGAAACCUC 240 22 165
hsa-miR-17-3p
ACUGCAGUGAAGGCACUUGUAG 184 22 163
hsa-miR-561-5p
AUCAAGGAUCUUAAACUUUGCC 179 22 160
hsa-miR-27a-5p
AGGGCUUAGCUGCUUGUGAGCA 130 22 158
hsa-miR-874
CUGCCCUGGCCCGAGGGACCGA 147 22 151
hsa-miR-9-3p
AUAAAGCUAGAUAACCGAAAGU 183 22 151
hsa-miR-96-5p
UUUGGCACUAGCACAUUUUUGCU 123 23 151
hsa-miR-656
AAUAUUAUACAGUCAACCUCU 221 21 147
hsa-miR-379-3p
UAUGUAACAUGGUCCACUAACU 446 22 145
hsa-miR-382-5p
GAAGUUGUUCGUGGUGGAUUCG 238 22 144
hsa-miR-541-3p
UGGUGGGCACAGAAUCUGGACU 136 22 141
hsa-miR-337-3p
CUCCUAUAUGAUGCCUUUCUUC 215 22 139
hsa-miR-15b-3p
CGAAUCAUUAUUUGCUGCUCUA 447 22 137
hsa-miR-20b-5p
CAAAGUGCUCAUAGUGCAGGUAG 317 23 136
hsa-miR-329
AACACACCUGGUUAACCUCUUU 214 22 136
hsa-miR-3676-5p
AGGAGAUCCUGGGUU 280 15 134
hsa-miR-543
AAACAUUCGCGGUGCACUUCUU 193 22 134
hsa-miR-365b-3p
UAAUGCCCCUAAAAAUCCUUAU 279 22 133
hsa-miR-125a-3p
ACAGGUGAGGUUCUUGGGAGCC 160 22 131
hsa-miR-3065-5p
UCAACAAAAUCACUGAUGCUGGA 226 23 130
hsa-miR-1296
UUAGGGCCCUGGCUCCAUCUCC 271 22 126
hsa-miR-935
CCAGUUACCGCUUCCGCUACCGC 311 23 118
hsa-miR-132-3p
UAACAGUCUACAGCCAUGGUCG 104 22 116
hsa-miR-4284
GGGCUCACAUCACCCCAU 191 18 116
hsa-miR-487a
AAUCAUACAGGGACAUCCAGUU 203 22 113
hsa-miR-574-5p
UGAGUGUGUGUGUGUGAGUGUGU 334 23 113
hsa-miR-301b
CAGUGCAAUGAUAUUGUCAAAGC 164 23 111
hsa-miR-548o-3p
CCAAAACUGCAGUUACUUUUGC 268 22 105
hsa-miR-18a-5p
UAAGGUGCAUCUAGUGCAGAUAG 256 23 104
hsa-miR-485-5p
AGAGGCUGGCCGUGAUGAAUUC 165 22 104
hsa-miR-548ah-5p
AAAAGUGAUUGCAGUGUUUG 235 20 103
hsa-miR-361-3p
UCCCCCAGGUGUGAUUCUGAUUU 250 23 101
hsa-miR-433
AUCAUGAUGGGCUCCUCGGUGU 174 22 101
hsa-miR-337-5p
GAACGGCUUCAUACAGGAGUU 277 21 100
hsa-miR-1276
UAAAGAGCCCUGUGGAGACA 194 20 99
hsa-miR-30c-1-3p
CUGGGAGAGGGUUGUUUACUCC 213 22 99
hsa-miR-31-3p
UGCUAUGCCAACAUAUUGCCAU 172 22 96
hsa-miR-424-3p
CAAAACGUGAGGCGCUGCUAU 298 21 96
hsa-miR-550a-5p
AGUGCCUGAGGGAGUAAGAGCCC 134 23 95
hsa-miR-4454
GGAUCCGAGUCACGGCACCA 299 20 94
hsa-miR-541-5p
AAAGGAUUCUGCUGUCGGUCCCACU 432 25 92
hsa-miR-106b-5p
UAAAGUGCUGACAGUGCAGAU 170 21 89
hsa-miR-153
UUGCAUAGUCACAAAAGUGAUC 188 22 88
hsa-miR-135b-3p
AUGUAGGGCUAAAAGCCAUGGG 205 22 87
hsa-miR-574-3p
CACGCUCAUGCACACACCCACA 253 22 87
hsa-miR-1226-3p
UCACCAGCCCUGUGUUCCCUAG 199 22 85
hsa-miR-576-5p
AUUCUAAUUUCUCCACGUCUUU 306 22 84
hsa-miR-127-5p
CUGAAGCUCAGAGGGCUCUGAU 255 22 83
hsa-miR-155-5p
UUAAUGCUAAUCGUGAUAGGGGU 448 23 83
hsa-miR-3176
ACUGGCCUGGGACUACCGG 227 19 83
hsa-miR-382-3p
AAUCAUUCACGGACAACACUU 260 21 83
hsa-miR-1275
GUGGGGGAGAGGCUGUC 162 17 82
hsa-miR-671-5p
AGGAAGCCCUGGAGGGGCUGGAG 288 23 82
hsa-miR-23a-5p
GGGGUUCCUGGGGAUGGGAUUU 212 22 81
hsa-miR-25-5p
AGGCGGAGACUUGGGCAAUUG 225 21 80
hsa-miR-641
AAAGACAUAGGAUAGAGUCACCUC 285 24 80
hsa-miR-19a-3p
UGUGCAAAUCUAUGCAAAACUGA 177 23 79
hsa-miR-377-3p
AUCACACAAAGGCAACUUUUGU 449 22 78
hsa-miR-454-5p
ACCCUAUCAAUAUUGUCUCUGC 265 22 78
hsa-miR-496
UGAGUAUUACAUGGCCAAUCUC 267 22 78
hsa-miR-29b-3p
UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU 166 23 77
hsa-miR-26a-2-3p
CCUAUUCUUGAUUACUUGUUUC 257 22 76
hsa-miR-1260b
AUCCCACCACUGCCACCAU 373 19 74
hsa-miR-2467-5p
UGAGGCUCUGUUAGCCUUGGCUC 154 23 74
hsa-miR-377-5p
AGAGGUUGCCCUUGGUGAAUUC 202 22 74
hsa-miR-330-3p
GCAAAGCACACGGCCUGCAGAGA 195 23 73
hsa-miR-1180
UUUCCGGCUCGCGUGGGUGUGU 313 22 71
hsa-miR-99b-3p
CAAGCUCGUGUCUGUGGGUCCG 243 22 71
hsa-miR-299-5p
UGGUUUACCGUCCCACAUACAU 319 22 69
hsa-miR-374b-3p
CUUAGCAGGUUGUAUUAUCAUU 229 22 69
hsa-miR-4746-5p
CCGGUCCCAGGAGAACCUGCAGA 266 23 69
hsa-miR-331-3p
GCCCCUGGGCCUAUCCUAGAA 450 21 68
hsa-miR-340-3p
UCCGUCUCAGUUACUUUAUAGC 248 22 68
hsa-miR-92a-1-5p
AGGUUGGGAUCGGUUGCAAUGCU 204 23 68
hsa-miR-542-3p
UGUGACAGAUUGAUAACUGAAA 331 22 66
hsa-miR-431-5p
UGUCUUGCAGGCCGUCAUGCA 132 21 65
hsa-miR-1254
AGCCUGGAAGCUGGAGCCUGCAGU 270 24 61
hsa-miR-3158-3p
AAGGGCUUCCUCUCUGCAGGAC 167 22 61
hsa-miR-362-5p
AAUCCUUGGAACCUAGGUGUGAGU 139 24 61
hsa-miR-30c-2-3p
CUGGGAGAAGGCUGUUUACUCU 321 22 59
hsa-miR-4461
GAUUGAGACUAGUAGGGCUAGGC 129 23 59
hsa-miR-3200-3p
CACCUUGCGCUACUCAGGUCUG 247 22 57
hsa-miR-215
AUGACCUAUGAAUUGACAGAC 451 21 56
hsa-miR-1185-5p
AGAGGAUACCCUUUGUAUGUU 368 21 55
hsa-miR-328
CUGGCCCUCUCUGCCCUUCCGU 297 22 55
hsa-miR-655
AUAAUACAUGGUUAACCUCUUU 286 22 55
hsa-miR-181b-3p
CUCACUGAACAAUGAAUGCAA 245 21 54
hsa-miR-376b
AUCAUAGAGGAAAAUCCAUGUU 452 22 54
hsa-miR-486-3p
CGGGGCAGCUCAGUACAGGAU 453 21 54
hsa-miR-760
CGGCUCUGGGUCUGUGGGGA 289 20 54
hsa-miR-3909
UGUCCUCUAGGGCCUGCAGUCU 412 22 53
hsa-miR-4508
GCGGGGCUGGGCGCGCG 135 17 53
hsa-miR-4521
GCUAAGGAAGUCCUGUGCUCAG 233 22 53
hsa-let-7e-3p
CUAUACGGCCUCCUAGCUUUCC 290 22 52
hsa-miR-455-5p
UAUGUGCCUUUGGACUACAUCG 192 22 52
hsa-miR-93-3p
ACUGCUGAGCUAGCACUUCCCG 454 22 51
hsa-miR-151b
UCGAGGAGCUCACAGUCU 455 18 49
hsa-miR-887
GUGAACGGGCGCCAUCCCGAGG 456 22 49
hsa-miR-152
UCAGUGCAUGACAGAACUUGG 344 21 48
hsa-miR-324-3p
ACUGCCCCAGGUGCUGCUGG 276 20 48
hsa-miR-1266
CCUCAGGGCUGUAGAACAGGGCU 457 23 47
hsa-miR-302b-3p
UAAGUGCUUCCAUGUUUUAGUAG 458 23 47
hsa-miR-548e
AAAAACUGAGACUACUUUUGCA 459 22 47
hsa-miR-502-3p
AAUGCACCUGGGCAAGGAUUCA 281 22 46
hsa-miR-302d-3p
UAAGUGCUUCCAUGUUUGAGUGU 460 23 45
hsa-miR-3943
UAGCCCCCAGGCUUCACUUGGCG 207 23 45
hsa-miR-1286
UGCAGGACCAAGAUGAGCCCU 293 21 44
hsa-miR-3605-5p
UGAGGAUGGAUAGCAAGGAAGCC 189 23 44
hsa-miR-505-3p
CGUCAACACUUGCUGGUUUCCU 282 22 44
hsa-miR-3615
UCUCUCGGCUCCUCGCGGCUC 323 21 43
hsa-miR-4435
AUGGCCAGAGCUCACACAGAGG 230 22 43
hsa-miR-598
UACGUCAUCGUUGUCAUCGUCA 461 22 43
hsa-miR-126-5p
CAUUAUUACUUUUGGUACGCG 462 21 42
hsa-miR-4671-3p
UUAGUGCAUAGUCUUUGGUCU 301 21 41
hsa-miR-652-3p
AAUGGCGCCACUAGGGUUGUG 442 21 41
hsa-miR-3687
CCCGGACAGGCGUUCGUGCGACGU 190 24 40
hsa-miR-4286
ACCCCACUCCUGGUACC 328 17 40
hsa-miR-590-3p
UAAUUUUAUGUAUAAGCUAGU 463 21 40
hsa-miR-1285-3p
UCUGGGCAACAAAGUGAGACCU 464 22 39
hsa-miR-2355-5p
AUCCCCAGAUACAAUGGACAA 593 21 38
hsa-miR-550a-3p
UGUCUUACUCCCUCAGGCACAU 283 22 38
hsa-let-7d-3p
CUAUACGACCUGCUGCCUUUCU 92 22 37
hsa-miR-136-5p
ACUCCAUUUGUUUUGAUGAUGGA 272 23 37
hsa-miR-1468
CUCCGUUUGCCUGUUUCGCUG 296 21 37
hsa-miR-3609
CAAAGUGAUGAGUAAUACUGGCUG 216 24 37
hsa-miR-548b-5p
AAAAGUAAUUGUGGUUUUGGCC 304 22 37
hsa-miR-664-3p
UAUUCAUUUAUCCCCAGCCUACA 287 23 37
hsa-miR-99a-3p
CAAGCUCGCUUCUAUGGGUCUG 367 22 37
hsa-miR-532-3p
CCUCCCACACCCAAGGCUUGCA 252 22 36
hsa-miR-10b-5p
UACCCUGUAGAACCGAAUUUGUG 465 23 33
hsa-miR-369-5p
AGAUCGACCGUGUUAUAUUCGC 357 22 33
hsa-miR-3161
CUGAUAAGAACAGAGGCCCAGAU 466 23 32
hsa-miR-3940-3p
CAGCCCGGAUCCCAGCCCACUU 239 22 32
hsa-miR-663b
GGUGGCCCGGCCGUGCCUGAGG 180 22 32
hsa-miR-219-2-3p
AGAAUUGUGGCUGGACAUCUGU 467 22 31
hsa-miR-2277-5p
AGCGCGGGCUGAGCGCUGCCAGUC 735 24 31
hsa-miR-4448
GGCUCCUUGGUCUAGGGGUA 231 20 31
hsa-miR-339-5p
UCCCUGUCCUCCAGGAGCUCACG 402 23 30
hsa-miR-3613-5p
UGUUGUACUUUUUUUUUUGUUC 469 22 30
hsa-miR-4775
UUAAUUUUUUGUUUCGGUCACU 302 22 30
hsa-miR-212-5p
ACCUUGGCUCUAGACUGCUUACU 246 23 29
hsa-miR-324-5p
CGCAUCCCCUAGGGCAUUGGUGU 354 23 27
hsa-miR-4326
UGUUCCUCUGUCUCCCAGAC 417 20 27
hsa-miR-582-3p
UAACUGGUUGAACAACUGAACC 470 22 27
hsa-miR-34a-3p
CAAUCAGCAAGUAUACUGCCCU 403 22 26
hsa-miR-106a-5p
AAAAGUGCUUACAGUGCAGGUAG 471 23 25
hsa-miR-4745-5p
UGAGUGGGGCUCCCGGGACGGCG 219 23 25
hsa-miR-769-3p
CUGGGAUCUCCGGGGUCUUGGUU 337 23 25
hsa-miR-1268a
CGGGCGUGGUGGUGGGGG 291 18 24
hsa-miR-154-3p
AAUCAUACACGGUUGACCUAUU 472 22 24
hsa-miR-188-3p
CUCCCACAUGCAGGGUUUGCA 200 21 24
hsa-miR-29c-3p
UAGCACCAUUUGAAAUCGGUUA 473 22 24
hsa-miR-539-5p
GGAGAAAUUAUCCUUGGUGUGU 234 22 24
hsa-miR-766-3p
ACUCCAGCCCCACAGCCUCAGC 310 22 24
hsa-miR-30b-3p
CUGGGAGGUGGAUGUUUACUUC 320 22 23
hsa-miR-3177-3p
UGCACGGCACUGGGGACACGU 275 21 23
hsa-miR-191-3p
GCUGCGCUUGGAUUUCGUCCCC 474 22 22
hsa-miR-296-3p
GAGGGUUGGGUGGAGGCUCUCC 274 22 22
hsa-miR-296-5p
AGGGCCCCCCCUCAAUCCUGU 258 21 22
hsa-miR-339-3p
UGAGCGCCUCGACGACAGAGCCG 228 23 22
hsa-miR-501-5p
AAUCCUUUGUCCCUGGGUGAGA 430 22 22
hsa-miR-200b-3p
UAAUACUGCCUGGUAAUGAUGA 475 22 21
hsa-miR-212-3p
UAACAGUCUCCAGUCACGGCC 348 21 21
hsa-miR-26b-3p
CCUGUUCUCCAUUACUUGGCUC 391 22 21
hsa-miR-665
ACCAGGAGGCUGAGGCCCCU 309 20 21
hsa-miR-668
UGUCACUCGGCUCGGCCCACUAC 476 23 21
hsa-miR-146a-5p
UGAGAACUGAAUUCCAUGGGUU 477 22 20
hsa-miR-1973
ACCGUGCAAAGGUAGCAUA 171 19 20
hsa-miR-210
CUGUGCGUGUGACAGCGGCUGA 478 22 20
hsa-miR-3607-5p
GCAUGUGAUGAAGCAAAUCAGU 249 22 20
hsa-miR-425-3p
AUCGGGAAUGUCGUGUCCGCCC 358 22 14
hsa-miR-548ah-3p
CAAAAACUGCAGUUACUUUUGC 149 22 14
hsa-miR-5699
UCCUGUCUUUCCUUGUUGGAGC 488 22 14
hsa-miR-582-5p
UUACAGUUGUUCAACCAGUUACU 489 23 14
hsa-miR-1185-2-3p
AUAUACAGGGGGAGACUCUCAU 314 22 13
hsa-miR-1249
ACGCCCUUCCCCCCCUUCUUCA 490 22 13
hsa-miR-1255a
AGGAUGAGCAAAGAAAGUAGAUU 341 23 13
hsa-miR-1910
CCAGUCCUGUGCCUGCCGCCU 236 21 13
hsa-miR-301a-5p
GCUCUGACUUUAUUGCACUACU 491 22 13
hsa-miR-5001-3p
UUCUGCCUCUGUCCAGGUCCUU 492 22 13
hsa-miR-5094
AAUCAGUGAAUGCCUUGAACCU 493 22 13
hsa-miR-628-5p
AUGCUGACAUAUUUACUAGAGG 440 22 13
hsa-miR-629-5p
UGGGUUUACGUUGGGAGAACU 441 21 13
hsa-miR-937
AUCCGCGCUCUGACUCUCUGCC 312 22 13
hsa-miR-940
AAGGCAGGGCCCCCGCUCCCC 366 21 13
hsa-miR-1248
ACCUUCUUGUAUAAGCACUGUGCUAAA 269 27 12
hsa-miR-194-5p
UGUAACAGCAACUCCAUGUGGA 345 22 12
hsa-miR-199b-3p
ACAGUAGUCUGCACAUUGGUUA 494 22 12
hsa-miR-22-5p
AGUUCUUCAGUGGCAAGCUUUA 495 22 12
hsa-miR-3605-3p
CCUCCGUGUUACCUGUCCUCUAG 496 23 12
hsa-miR-3654
GACUGGACAAGCUGAGGAA 325 19 12
hsa-miR-504
AGACCCUGGUCUGCACUCUAUC 497 22 12
hsa-miR-1291
UGGCCCUGACUGAAGACCAGCAGU 294 24 11
hsa-miR-1299
UUCUGGAAUUCUGUGUGAGGGA 498 22 11
hsa-miR-188-5p
CAUCCCUUGCAUGGUGGAGGG 499 21 11
hsa-miR-222-5p
CUCAGUAGCCAGUGUAGAUCCU 349 22 11
hsa-miR-331-5p
CUAGGUAUGGUCCCAGGGAUCC 500 22 11
hsa-miR-3939
UACGCGCAGACCACAGGAUGUC 261 22 11
hsa-miR-154-5p
UAGGUUAUCCGUGUUGCCUUCG 501 22 10
hsa-miR-18a-3p
ACUGCCCUAAGUGCUCCUUCUGG 502 23 10
hsa-miR-1908
CGGCGGGGACGGCGAUUGGUC 383 21 10
hsa-miR-200c-3p
UAAUACUGCCGGGUAAUGAUGGA 347 23 10
hsa-miR-2116-3p
CCUCCCAUGCCAAGAACUCCC 318 21 10
hsa-miR-302a-3p
UAAGUGCUUCCAUGUUUUGGUGA 503 23 10
hsa-miR-3174
UAGUGAGUUAGAGAUGCAGAGCC 353 23 10
hsa-miR-378a-5p
CUCCUGACUCCAGGUCCUGUGU 217 22 20
hsa-miR-4449
CGUCCCGGGGCUGCGCGAGGCA 155 22 20
hsa-miR-138-5p
AGCUGGUGUUGUGAAUCAGGCCG 379 23 19
hsa-miR-146b-3p
UGCCCUGUGGACUCAGUUCUGG 381 22 18
hsa-miR-3065-3p
UCAGCACCAGGAUAUUGUUGGAG 350 23 18
hsa-miR-4417
GGUGGGCUUCCCGGAGGG 175 18 18
hsa-miR-497-5p
CAGCAGCACACUGUGGUUUGU 479 21 18
hsa-miR-500a-5p
UAAUCCUUGCUACCUGGGUGAGA 303 23 18
hsa-miR-625-3p
GACUAUAGAACUUUCCCCCUCA 307 22 18
hsa-miR-628-3p
UCUAGUAAGAGUGGCAGUCGA 335 21 18
hsa-miR-1343
CUCCUGGGGCCCGCACUCUCGC 378 22 17
hsa-miR-3648
AGCCGCGGGGAUCGCCGAGGG 259 21 17
hsa-miR-432-3p
CUGGAUGGCUCCUCCAUGUCU 262 21 17
hsa-miR-4482-3p
UUUCUAUUUCUCAGUGGGGCUC 361 22 17
hsa-miR-542-5p
UCGGGGAUCAUCAUGUCACGAGA 433 23 17
hsa-miR-551b-3p
GCGACCCAUACUUGGUUUCAG 434 21 17
hsa-miR-7-1-3p
CAACAAAUCACAGUCUGCCAUA 480 22 17
hsa-miR-219-1-3p
AGAGUUGAGUCUGGACGUCCCG 390 22 16
hsa-miR-3656
GGCGGGUGCGGGGGUGG 251 17 16
hsa-miR-3661
UGACCUGGGACUCGGACAGCUG 481 22 16
hsa-miR-411-3p
UAUGUAACACGGUCCACUAACC 482 22 16
hsa-miR-5096
GUUUCACCAUGUUGGUCAGGC 220 21 16
hsa-miR-577
UAGAUAAAAUAUUGGUACCUG 436 21 16
hsa-let-7i-3p
CUGCGCAAGCUACUGCCUUGCU 483 22 15
hsa-miR-132-5p
ACCGUGGCUUUCGAUUGUUACU 315 22 15
hsa-miR-140-5p
CAGUGGUUUUACCCUAUGGUAG 380 22 15
hsa-miR-195-5p
UAGCAGCACAGAAAUAUUGGC 346 21 15
hsa-miR-3187-3p
UUGGCCAUGGGGCUGCGCGG 322 20 15
hsa-miR-342-5p
AGGGGUGCUAUCUGUGAUUGA 278 21 15
hsa-miR-34b-3p
CAAUCACUAACUCCACUGCCAU 404 22 15
hsa-miR-4661-5p
AACUAGCUCUGUGGAUCCUGAC 484 22 15
hsa-miR-584-5p
UUAUGGUUUGCCUGGGACUGAG 485 22 15
hsa-miR-744-3p
CUGUUGCCACUAACCUCAACCU 486 22 15
hsa-miR-770-5p
UCCAGUACCACGUGUCAGGGCCA 487 23 15
hsa-miR-3677-3p
CUCGUGGGCUCUGGCCACGGCC 356 22 14
hsa-miR-425-3p
AUCGGGAAUGUCGUGUCCGCCC 358 22 14
hsa-miR-548ah-3p
CAAAAACUGCAGUUACUUUUGC 149 22 14
hsa-miR-5699
UCCUGUCUUUCCUUGUUGGAGC 488 22 14
hsa-miR-582-5p
UUACAGUUGUUCAACCAGUUACU 489 23 14
hsa-miR-1185-2-3p
AUAUACAGGGGGAGACUCUCAU 314 22 13
hsa-miR-1249
ACGCCCUUCCCCCCCUUCUUCA 490 22 13
hsa-miR-1255a
AGGAUGAGCAAAGAAAGUAGAUU 341 23 13
hsa-miR-1910
CCAGUCCUGUGCCUGCCGCCU 236 21 13
hsa-miR-301a-5p
GCUCUGACUUUAUUGCACUACU 491 22 13
hsa-miR-5001-3p
UUCUGCCUCUGUCCAGGUCCUU 492 22 13
hsa-miR-5094
AAUCAGUGAAUGCCUUGAACCU 493 22 13
hsa-miR-628-5p
AUGCUGACAUAUUUACUAGAGG 440 22 13
hsa-miR-629-5p
UGGGUUUACGUUGGGAGAACU 441 21 13
hsa-miR-937
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hsa-miR-940
AAGGCAGGGCCCCCGCUCCCC 366 21 13
hsa-miR-1248
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hsa-miR-194-5p
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hsa-miR-199b-3p
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hsa-miR-3605-3p
CCUCCGUGUUACCUGUCCUCUAG 496 23 12
hsa-miR-3654
GACUGGACAAGCUGAGGAA 325 19 12
hsa-miR-504
AGACCCUGGUCUGCACUCUAUC 497 22 12
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CAUCCCUUGCAUGGUGGAGGG 499 21 11
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ACUGCCCUAAGUGCUCCUUCUGG 502 23 10
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hsa-miR-141-3p
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hsa-miR-3115
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hsa-miR-1273g-3p
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hsa-miR-1538
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hsa-miR-3173-5p
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hsa-miR-3175
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hsa-miR-3928
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hsa-miR-499a-5p
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hsa-miR-545-3p
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hsa-miR-548u
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hsa-miR-659-5p
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hsa-miR-1257
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hsa-miR-195-3p
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hsa-miR-302c-5p
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AUCGGGCCCUCGGCGCCGG 644 19 1
hsa-miR-3187-5p
CCUGGGCAGCGUGUGGCUGAAGG 645 23 1
hsa-miR-3190-5p
UCUGGCCAGCUACGUCCCCA 646 20 1
hsa-miR-3198
GUGGAGUCCUGGGGAAUGGAGA 647 22 1
hsa-miR-320b
AAAAGCUGGGUUGAGAGGGCAA 648 22 1
hsa-miR-323b-5p
AGGUUGUCCGUGGUGAGUUCGCA 401 23 1
hsa-miR-3591-5p
UUUAGUGUGAUAAUGGCGUUUGA 649 23 1
hsa-miR-3619-5p
UCAGCAGGCAGGCUGGUGCAGC 650 22 1
hsa-miR-3659
UGAGUGUUGUCUACGAGGGCA 651 21 1
hsa-miR-3674
AUUGUAGAACCUAAGAUUGGCC 652 22 1
hsa-miR-3679-3p
CUUCCCCCCAGUAAUCUUCAUC 653 22 1
hsa-miR-375
UUUGUUCGUUCGGCUCGCGUGA 654 22 1
hsa-miR-378b
ACUGGACUUGGAGGCAGAA 655 19 1
hsa-miR-3908
GAGCAAUGUAGGUAGACUGUUU 656 22 1
hsa-miR-3911
UGUGUGGAUCCUGGAGGAGGCA 657 22 1
hsa-miR-3913-5p
UUUGGGACUGAUCUUGAUGUCU 658 22 1
hsa-miR-3917
GCUCGGACUGAGCAGGUGGG 659 20 1
hsa-miR-3944-3p
UUCGGGCUGGCCUGCUGCUCCGG 660 23 1
hsa-miR-429
UAAUACUGUCUGGUAAAACCGU 661 22 1
hsa-miR-4421
ACCUGUCUGUGGAAAGGAGCUA 718 22 1
hsa-miR-4443
UUGGAGGCGUGGGUUUU 663 17 1
hsa-miR-4459
CCAGGAGGCGGAGGAGGUGGAG 664 22 1
hsa-miR-4473
CUAGUGCUCUCCGUUACAAGUA 665 22 1
hsa-miR-4479
CGCGCGGCCGUGCUCGGAGCAG 666 22 1
hsa-miR-4497
CUCCGGGACGGCUGGGC 232 17 1
hsa-miR-4504
UGUGACAAUAGAGAUGAACAUG 667 22 1
hsa-miR-4520b-3p
UUUGGACAGAAAACACGCAGGU 668 22 1
hsa-miR-452-5p
AACUGUUUGCAGAGGAAACUGA 669 22 1
hsa-miR-4636
AACUCGUGUUCAAAGCCUUUAG 670 22 1
hsa-miR-4659b-3p
UUUCUUCUUAGACAUGGCAGCU 671 22 1
hsa-miR-4664-3p
CUUCCGGUCUGUGAGCCCCGUC 672 22 1
hsa-miR-4665-5p
CUGGGGGACGCGUGAGCGCGAGC 673 23 1
hsa-miR-4666a-5p
AUACAUGUCAGAUUGUAUGCC 674 21 1
hsa-miR-4673
UCCAGGCAGGAGCCGGACUGGA 422 22 1
hsa-miR-4681
AACGGGAAUGCAGGCUGUAUCU 675 22 1
hsa-miR-4682
UCUGAGUUCCUGGAGCCUGGUCU 676 23 1
hsa-miR-4690-5p
GAGCAGGCGAGGCUGGGCUGAA 677 22 1
hsa-miR-4699-5p
AGAAGAUUGCAGAGUAAGUUCC 678 22 1
hsa-miR-4700-3p
CACAGGACUGACUCCUCACCCCAGUG 424 26 1
hsa-miR-4706
AGCGGGGAGGAAGUGGGCGCUGCUU 679 25 1
hsa-miR-4721
UGAGGGCUCCAGGUGACGGUGG 680 22 1
hsa-miR-4728-3p
CAUGCUGACCUCCCUCCUGCCCCAG 681 25 1
hsa-miR-4742-5p
UCAGGCAAAGGGAUAUUUACAGA 682 23 1
hsa-miR-4747-3p
AAGGCCCGGGCUUUCCUCCCAG 683 22 1
hsa-miR-4749-5p
UGCGGGGACAGGCCAGGGCAUC 684 22 1
hsa-miR-4755-3p
AGCCAGGCUCUGAAGGGAAAGU 685 22 1
hsa-miR-4763-5p
CGCCUGCCCAGCCCUCCUGCU 686 21 1
hsa-miR-4766-3p
AUAGCAAUUGCUCUUUUGGAA 687 21 1
hsa-miR-4781-3p
AAUGUUGGAAUCCUCGCUAGAG 688 22 1
hsa-miR-4793-3p
UCUGCACUGUGAGUUGGCUGGCU 689 23 1
hsa-miR-488-3p
UUGAAAGGCUAUUUCUUGGUC 690 21 1
hsa-miR-4999-5p
UGCUGUAUUGUCAGGUAGUGA 691 21 1
hsa-miR-5001-5p
AGGGCUGGACUCAGCGGCGGAGCU 692 24 1
hsa-miR-5002-5p
AAUUUGGUUUCUGAGGCACUUAGU 693 24 1
hsa-miR-5004-5p
UGAGGACAGGGCAAAUUCACGA 694 22 1
hsa-miR-5006-3p
UUUCCCUUUCCAUCCUGGCAG 695 21 1
hsa-miR-5088
CAGGGCUCAGGGAUUGGAUGGAG 696 23 1
hsa-miR-544a
AUUCUGCAUUUUUAGCAAGUUC 697 22 1
hsa-miR-548al
AACGGCAAUGACUUUUGUACCA 698 22 1
hsa-miR-548aq-5p
GAAAGUAAUUGCUGUUUUUGCC 699 22 1
hsa-miR-548at-5p
AAAAGUUAUUGCGGUUUUGGCU 700 22 1
hsa-miR-548au-5p
AAAAGUAAUUGCGGUUUUUGC 701 21 1
hsa-miR-548b-3p
CAAGAACCUCAGUUGCUUUUGU 702 22 1
hsa-miR-556-3p
AUAUUACCAUUAGCUCAUCUUU 703 22 1
hsa-miR-5582-3p
UAAAACUUUAAGUGUGCCUAGG 704 22 1
hsa-miR-5586-3p
CAGAGUGACAAGCUGGUUAAAG 705 22 1
hsa-miR-5588-5p
ACUGGCAUUAGUGGGACUUUU 706 21 1
hsa-miR-5683
UACAGAUGCAGAUUCUCUGACUUC 707 24 1
hsa-miR-5696
CUCAUUUAAGUAGUCUGAUGCC 708 22 1
hsa-miR-5701
UUAUUGUCACGUUCUGAUU 709 19 1
hsa-miR-5706
UUCUGGAUAACAUGCUGAAGCU 710 22 1
hsa-miR-592
UUGUGUCAAUAUGCGAUGAUGU 711 22 1
hsa-miR-603
CACACACUGCAAUUACUUUUGC 712 22 1
hsa-miR-624-3p
CACAAGGUAUUGGUAUUACCU 713 21 1
hsa-miR-885-5p
UCCAUUACACUACCCUGCCUCU 714 22 1
hsa-miR-933
UGUGCGCAGGGAGACCUCUCCC 715 22 1
Tabla 6: Microvesículas EI
Microvesículas CTX0E03 07EI
miARN
Secuencia de miARN SEQ ID NO: Longitud de miARN Recuentos de lectura
hsa-miR-1246
AAUGGAUUUUUGGAGCAGG 21 19 32723
hsa-miR-4492
GGGGCUGGGCGCGCGCC 34 17 16225
hsa-miR-4488
AGGGGGCGGGCUCCGGCG 61 18 12878
hsa-miR-4532
CCCCGGGGAGCCCGGCG 23 17 6746
hsa-miR-4508
GCGGGGCUGGGCGCGCG 135 17 531
hsa-miR-4516
GGGAGAAGGGUCGGGGC 110 17 500
hsa-miR-3676-5p
AGGAGAUCCUGGGUU 280 15 357
hsa-miR-4485
UAACGGCCGCGGUACCCUAA 67 20 44
hsa-miR-4497
CUCCGGGACGGCUGGGC 232 17 43
hsa-miR-21-5p
UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA 9 22 33
hsa-miR-3195
CGCGCCGGGCCCGGGUU 716 17 28
hsa-miR-3648
AGCCGCGGGGAUCGCCGAGGG 259 21 26
hsa-miR-663b
GGUGGCCCGGCCGUGCCUGAGG 180 22 24
hsa-miR-3656
GGCGGGUGCGGGGGUGG 251 17 19
hsa-miR-3687
CCCGGACAGGCGUUCGUGCGACGU 190 24 19
hsa-miR-4466
GGGUGCGGGCCGGCGGGG 264 18 19
hsa-miR-4792
CGGUGAGCGCUCGCUGGC 363 18 19
hsa-miR-99b-5p
CACCCGUAGAACCGACCUUGCG 4 22 18
hsa-let-7a-5p
UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU 1 22 15
hsa-miR-1290
UGGAUUUUUGGAUCAGGGA 375 19 7
hsa-miR-1291
UGGCCCUGACUGAAGACCAGCAGU 294 24 7
hsa-miR-182-5p
UUUGGCAAUGGUAGAACUCACACU 16 24 7
hsa-miR-5096
GUUUCACCAUGUUGGUCAGGC 220 21 7
hsa-miR-1273f
GGAGAUGGAGGUUGCAGUG 292 19 5
hsa-miR-26a-5p
UUCAAGUAAUCCAGGAUAGGCU 12 22 5
hsa-miR-4284
GGGCUCACAUCACCCCAU 191 18 5
hsa-miR-92b-3p
UAUUGCACUCGUCCCGGCCUCC 13 22 5
hsa-let-7b-5p
UGAGGUAGUAGGUUGUGUGGUU 28 22 4
hsa-let-7c
UGAGGUAGUAGGUUGUAUGGUU 17 22 4
hsa-let-7f-5p
UGAGGUAGUAGAUUGUAUAGUU 11 22 4
hsa-miR-100-5p
AACCCGUAGAUCCGAACUUGUG 3 22 4
hsa-miR-1248
ACCUUCUUGUAUAAGCACUGUGCUAAA 269 27 4
hsa-miR-1973
ACCGUGCAAAGGUAGCAUA 171 19 4
hsa-miR-21-3p
CAACACCAGUCGAUGGGCUGU 20 21 4
hsa-miR-3654
GACUGGACAAGCUGAGGAA 325 19 4
hsa-miR-92a-3p
UAUUGCACUUGUCCCGGCCUGU 7 22 4
hsa-miR-1273g-3p
ACCACUGCACUCCAGCCUGAG 210 21 3
hsa-miR-23b-3p
AUCACAUUGCCAGGGAUUACC 59 21 3
hsa-miR-3609
CAAAGUGAUGAGUAAUACUGGCUG 216 24 3
hsa-miR-3615
UCUCUCGGCUCCUCGCGGCUC 323 21 3
hsa-miR-3653
CUAAGAAGUUGACUGAAG 544 18 3
hsa-miR-3960
GGCGGCGGCGGAGGCGGGGG 416 20 3
hsa-miR-4448
GGCUCCUUGGUCUAGGGGUA 231 20 3
hsa-let-7d-5p
AGAGGUAGUAGGUUGCAUAGUU 92 22 2
hsa-miR-16-5p
UAGCAGCACGUAAAUAUUGGCG 29 22 2
hsa-miR-181a-5p
AACAUUCAACGCUGUCGGUGAGU 15 23 2
hsa-miR-181b-5p
AACAUUCAUUGCUGUCGGUGGGU 38 23 2
hsa-miR-222-3p
AGCUACAUCUGGCUACUGGGU 36 21 2
hsa-miR-24-3p
UGGCUCAGUUCAGCAGGAACAG 119 22 2
hsa-miR-3196
CGGGGCGGCAGGGGCCUC 717 18 2
hsa-miR-4419b
GAGGCUGAAGGAAGAUGG 718 18 2
hsa-miR-4461
GAUUGAGACUAGUAGGGCUAGGC 129 23 2
hsa-miR-4486
GCUGGGCGAGGCUGGCA 719 17 2
hsa-miR-663a
AGGCGGGGCGCCGCGGGACCGC 365 22 2
hsa-miR-9-5p
UCUUUGGUUAUCUAGCUGUAUGA 58 23 2
hsa-let-7i-3p
CUGCGCAAGCUACUGCCUUGCU 483 22 1
hsa-let-7i-5p
UGAGGUAGUAGUUUGUGCUGUU 22 22 1
hsa-miR-1225-5p
GUGGGUACGGCCCAGUGGGGGG 720 22 1
hsa-miR-1244
AAGUAGUUGGUUUGUAUGAGAUGGUU 340 26 1
hsa-miR-125b-5p
UCCCUGAGACCCUAACUUGUGA 42 22 1
hsa-miR-1275
GUGGGGGAGAGGCUGUC 162 17 1
hsa-miR-1280
UCCCACCGCUGCCACCC 584 17 1
hsa-miR-134
UGUGACUGGUUGACCAGAGGGG 94 22 1
hsa-miR-149-5p
UCUGGCUCCGUGUCUUCACUCCC 121 23 1
hsa-miR-191-5p
CAACGGAAUCCCAAAAGCAGCUG 8 23 1
hsa-miR-221-3p
AGCUACAUUGUCUGCUGGGUUUC 79 23 1
hsa-miR-22-3p
AAGCUGCCAGUUGAAGAACUGU 33 22 1
hsa-miR-26b-5p
UUCAAGUAAUUCAGGAUAGGU 90 21 1
hsa-miR-30c-5p
UGUAAACAUCCUACACUCUCAGC 66 23 1
hsa-miR-30d-5p
UGUAAACAUCCCCGACUGGAAG 31 22 1
hsa-miR-3182
GCUUCUGUAGUGUAGUC 721 17 1
hsa-miR-320a
AAAAGCUGGGUUGAGAGGGCGA 97 22 1
hsa-miR-34a-5p
UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU 101 22 1
hsa-miR-3607-3p
ACUGUAAACGCUUUCUGAUG 543 20 1
hsa-miR-361-5p
UUAUCAGAAUCUCCAGGGGUAC 70 22 1
hsa-miR-3652
CGGCUGGAGGUGUGAGGA 722 18 1
hsa-miR-409-3p
GAAUGUUGCUCGGUGAACCCCU 47 22 1
hsa-miR-423-3p
AGCUCGGUCUGAGGCCCCUCAGU 57 23 1
hsa-miR-423-5p
UGAGGGGCAGAGAGCGAGACUUU 41 23 1
hsa-miR-432-5p
UCUUGGAGUAGGUCAUUGGGUGG 95 23 1
hsa-miR-4417
GGUGGGCUUCCCGGAGGG 175 18 1
hsa-miR-4426
GAAGAUGGACGUACUUU 359 17 1
hsa-miR-4449
CGUCCCGGGGCUGCGCGAGGCA 155 22 1
hsa-miR-4800-3p
CAUCCGUCCGUCUGUCCAC 549 19 1
hsa-miR-484
UCAGGCUCAGUCCCCUCCCGAU 118 22 1
hsa-miR-486-5p
UCCUGUACUGAGCUGCCCCGAG 5 22 1
hsa-miR-493-3p
UGAAGGUCUACUGUGUGCCAGG 83 22 1
hsa-miR-5095
UUACAGGCGUGAACCACCGCG 723 21 1
hsa-miR-556-3p
AUAUUACCAUUAGCUCAUCUUU 703 22 1
hsa-miR-644b-5p
UGGGCUAAGGGAGAUGAUUGGGUA 724 24 1
hsa-miR-664-5p
ACUGGCUAGGGAAAAUGAUUGGAU 443 24 1
hsa-miR-760
CGGCUCUGGGUCUGUGGGGA 289 20 1
hsa-miR-941
CACCCGGCUGUGUGCACAUGUGC 60 23 1
hsa-miR-98
UGAGGUAGUAAGUUGUAUUGUU 10 22 1
hsa-miR-99a-5p
AACCCGUAGAUCCGAUCUUGUG 52 22 1
Tabla 7: Exosomas EI
Exosomas CTX0E03 07EI
miARN
Secuencia de miARN SEQ ID NO: Longitud de miARN Recuentos de lectura
hsa-miR-1246
AAUGGAUUUUUGGAGCAGG 21 19 83958
hsa-miR-4492
GGGGCUGGGCGCGCGCC 34 17 22482
hsa-miR-4488
AGGGGGCGGGCUCCGGCG 61 18 20618
hsa-miR-4532
CCCCGGGGAGCCCGGCG 23 17 6419
hsa-miR-4516
GGGAGAAGGGUCGGGGC 110 17 904
hsa-miR-4508
GCGGGGCUGGGCGCGCG 135 17 723
hsa-miR-3676-5p
AGGAGAUCCUGGGUU 280 15 174
hsa-miR-4485
UAACGGCCGCGGUACCCUAA 67 20 43
hsa-miR-21-5p
UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA 9 22 41
hsa-miR-4497
CUCCGGGACGGCUGGGC 232 17 28
hsa-miR-663b
GGUGGCCCGGCCGUGCCUGAGG 180 22 26
hsa-miR-4792
CGGUGAGCGCUCGCUGGC 363 18 24
hsa-miR-4454
GGAUCCGAGUCACGGCACCA 299 20 22
hsa-miR-1291
UGGCCCUGACUGAAGACCAGCAGU 294 24 17
hsa-miR-26a-5p
UUCAAGUAAUCCAGGAUAGGCU 12 22 17
hsa-miR-3195
CGCGCCGGGCCCGGGUU 716 17 17
hsa-let-7a-5p
UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU 1 22 15
hsa-miR-182-5p
UUUGGCAAUGGUAGAACUCACACU 16 24 15
hsa-miR-99b-5p
CACCCGUAGAACCGACCUUGCG 4 22 15
hsa-miR-5096
GUUUCACCAUGUUGGUCAGGC 220 21 14
hsa-miR-3648
AGCCGCGGGGAUCGCCGAGGG 259 21 13
hsa-miR-3654
GACUGGACAAGCUGAGGAA 325 19 13
hsa-miR-4466
GGGUGCGGGCCGGCGGGG 264 18 12
hsa-miR-3687
CCCGGACAGGCGUUCGUGCGACGU 190 24 11
hsa-miR-4284
GGGCUCACAUCACCCCAU 191 18 11
hsa-miR-3656
GGCGGGUGCGGGGGUGG 251 17 10
hsa-miR-3609
CAAAGUGAUGAGUAAUACUGGCUG 216 24 8
hsa-miR-644b-5p
UGGGCUAAGGGAGAUGAUUGGGUA 724 24 8
hsa-miR-664-5p
ACUGGCUAGGGAAAAUGAUUGGAU 443 24 8
hsa-miR-92a-3p
UAUUGCACUUGUCCCGGCCUGU 7 22 7
hsa-miR-92b-3p
UAUUGCACUCGUCCCGGCCUCC 13 22 7
hsa-let-7b-5p
UGAGGUAGUAGGUUGUGUGGUU 28 22 6
hsa-let-7f-5p
UGAGGUAGUAGAUUGUAUAGUU 11 22 6
hsa-miR-127-3p
UCGGAUCCGUCUGAGCUUGGCU 14 22 6
hsa-miR-1290
UGGAUUUUUGGAUCAGGGA 375 19 6
hsa-miR-4449
CGUCCCGGGGCUGCGCGAGGCA 155 22 6
hsa-miR-4461
GAUUGAGACUAGUAGGGCUAGGC 129 23 6
hsa-miR-100-5p
AACCCGUAGAUCCGAACUUGUG 3 22 5
hsa-miR-1248
ACCUUCUUGUAUAAGCACUGUGCUAAA 269 27 5
hsa-miR-1973
ACCGUGCAAAGGUAGCAUA 171 19 5
hsa-miR-3653
CUAAGAAGUUGACUGAAG 544 18 5
hsa-miR-4417
GGUGGGCUUCCCGGAGGG 175 18 5
hsa-miR-125b-5p
UCCCUGAGACCCUAACUUGUGA 42 22 4
hsa-miR-151a-3p
CUAGACUGAAGCUCCUUGAGG 25 21 4
hsa-miR-16-5p
UAGCAGCACGUAAAUAUUGGCG 29 22 4
hsa-miR-21-3p
CAACACCAGUCGAUGGGCUGU 20 21 4
hsa-miR-23a-3p
AUCACAUUGCCAGGGAUUUCC 55 21 4
hsa-miR-4419b
GAGGCUGAAGGAAGAUGG 718 18 4
hsa-miR-1273f
GGAGAUGGAGGUUGCAGUG 292 19 3
hsa-miR-1273g-3p
ACCACUGCACUCCAGCCUGAG 210 21 3
hsa-miR-181b-5p
AACAUUCAUUGCUGUCGGUGGGU 38 23 3
hsa-miR-221-3p
AGCUACAUUGUCUGCUGGGUUUC 79 23 3
hsa-miR-3615
UCUCUCGGCUCCUCGCGGCUC 323 21 3
hsa-miR-9-5p
UCUUUGGUUAUCUAGCUGUAUGA 58 23 3
hsa-let-7c
UGAGGUAGUAGGUUGUAUGGUU 17 22 2
hsa-let-7e-5p
UGAGGUAGGAGGUUGUAUAGUU 27 22 2
hsa-let-7i-5p
UGAGGUAGUAGUUUGUGCUGUU 22 22 2
hsa-miR-103a-3p
AGCAGCAUUGUACAGGGCUAUGA 62 23 2
hsa-miR-106b-5p
UAAAGUGCUGACAGUGCAGAU 170 21 2
hsa-miR-1273e
UUGCUUGAACCCAGGAAGUGGA 342 22 2
hsa-miR-221-5p
ACCUGGCAUACAAUGUAGAUUU 39 22 2
hsa-miR-222-3p
AGCUACAUCUGGCUACUGGGU 36 21 2
hsa-miR-30d-5p
UGUAAACAUCCCCGACUGGAAG 31 22 2
hsa-miR-3960
GGCGGCGGCGGAGGCGGGGG 416 20 2
hsa-let-7d-3p
CUAUACGACCUGCUGCCUUUCU 92 22 1
hsa-let-7d-5p
AGAGGUAGUAGGUUGCAUAGUU 53 22 1
hsa-let-7g-5p
UGAGGUAGUAGUUUGUACAGUU 43 22 1
hsa-let-7i-3p
CUGCGCAAGCUACUGCCUUGCU 483 22 1
hsa-miR-10a-5p
UACCCUGUAGAUCCGAAUUUGUG 2 23 1
hsa-miR-1181
CCGUCGCCGCCACCCGAGCCG 725 21 1
hsa-miR-1225-3p
UGAGCCCCUGUGCCGCCCCCAG 369 22 1
hsa-miR-1244
AAGUAGUUGGUUUGUAUGAGAUGGUU 340 26 1
hsa-miR-125a-5p
UCCCUGAGACCCUUUAACCUGUGA 35 24 1
hsa-miR-1296
UUAGGGCCCUGGCUCCAUCUCC 271 22 1
hsa-miR-1307-5p
UCGACCGGACCUCGACCGGCU 91 21 1
hsa-miR-146b-5p
UGAGAACUGAAUUCCAUAGGCU 19 22 1
hsa-miR-149-5p
UCUGGCUCCGUGUCUUCACUCCC 121 23 1
hsa-miR-151a-5p
UCGAGGAGCUCACAGUCUAGU 37 21 1
hsa-miR-15b-5p
UAGCAGCACAUCAUGGUUUACA 78 22 1
hsa-miR-181a-2-3p
ACCACUGACCGUUGACUGUACC 102 22 1
hsa-miR-181a-5p
AACAUUCAACGCUGUCGGUGAGU 15 23 1
hsa-miR-191-5p
CAACGGAAUCCCAAAAGCAGCUG 8 23 1
hsa-miR-198
GGUCCAGAGGGGAGAUAGGUUC 726 22 1
hsa-miR-204-5p
UUCCCUUUGUCAUCCUAUGCCU 89 22 1
hsa-miR-20a-5p
UAAAGUGCUUAUAGUGCAGGUAG 146 23 1
hsa-miR-219-5p
UGAUUGUCCAAACGCAAUUCU 527 21 1
hsa-miR-22-3p
AAGCUGCCAGUUGAAGAACUGU 33 22 1
hsa-miR-23b-3p
AUCACAUUGCCAGGGAUUACC 59 21 1
hsa-miR-26b-3p
CCUGUUCUCCAUUACUUGGCUC 391 22 1
hsa-miR-299-5p
UGGUUUACCGUCCCACAUACAU 319 22 1
hsa-miR-29a-3p
UAGCACCAUCUGAAAUCGGUUA 106 22 1
hsa-miR-30e-3p
CUUUCAGUCGGAUGUUUACAGC 71 22 1
hsa-miR-31-3p
UGCUAUGCCAACAUAUUGCCAU 172 22 1
hsa-miR-3198
GUGGAGUCCUGGGGAAUGGAGA 647 22 1
hsa-miR-323a-3p
CACAUUACACGGUCGACCUCU 158 21 1
hsa-miR-342-3p
UCUCACACAGAAAUCGCACCCGU 81 23 1
hsa-miR-3607-3p
ACUGUAAACGCUUUCUGAUG 543 20 1
hsa-miR-3651
CAUAGCCCGGUCGCUGGUACAUGA 727 24 1
hsa-miR-378a-3p
ACUGGACUUGGAGUCAGAAGG 65 21 1
hsa-miR-379-5p
UGGUAGACUAUGGAACGUAGG 18 21 1
hsa-miR-423-3p
AGCUCGGUCUGAGGCCCCUCAGU 57 23 1
hsa-miR-423-5p
UGAGGGGCAGAGAGCGAGACUUU 41 23 1
hsa-miR-425-5p
AAUGACACGAUCACUCCCGUUGA 111 23 1
hsa-miR-4258
CCCCGCCACCGCCUUGG 728 17 1
hsa-miR-4426
GAAGAUGGACGUACUUU 359 17 1
hsa-miR-4443
UUGGAGGCGUGGGUUUU 663 17 1
hsa-miR-4448
GGCUCCUUGGUCUAGGGGUA 231 20 1
hsa-miR-4697-3p
UGUCAGUGACUCCUGCCCCUUGGU 729 24 1
hsa-miR-4700-3p
CACAGGACUGACUCCUCACCCCAGUG 424 26 1
hsa-miR-4700-5p
UCUGGGGAUGAGGACAGUGUGU 730 22 1
hsa-miR-4797-3p
UCUCAGUAAGUGGCACUCUGU 731 21 1
hsa-miR-484
UCAGGCUCAGUCCCCUCCCGAU 118 22 1
hsa-miR-486-5p
UCCUGUACUGAGCUGCCCCGAG 5 22 1
hsa-miR-494
UGAAACAUACACGGGAAACCUC 240 22 1
hsa-miR-500a-5p
UAAUCCUUGCUACCUGGGUGAGA 303 23 1
hsa-miR-644b-3p
UUCAUUUGCCUCCCAGCCUACA 442 22 1
hsa-miR-663a
AGGCGGGGCGCCGCGGGACCGC 365 22 1
Tabla 8: Microvesículas EH
Microvesículas CTX0E03 07EH
miARN
Secuencia de miARN SEQ ID NO: Longitud de miARN Recuentos de lectura
hsa-miR-1246
AAUGGAUUUUUGGAGCAGG 21 19 78791
hsa-miR-4492
GGGGCUGGGCGCGCGCC 34 17 6012
hsa-miR-4532
CCCCGGGGAGCCCGGCG 23 17 3410
hsa-miR-4488
AGGGGGCGGGCUCCGGCG 61 18 1737
hsa-miR-4485
UAACGGCCGCGGUACCCUAA 67 20 319
hsa-miR-4508
GCGGGGCUGGGCGCGCG 135 17 221
hsa-miR-4516
GGGAGAAGGGUCGGGGC 110 17 114
hsa-miR-4466
GGGUGCGGGCCGGCGGGG 264 18 61
hsa-miR-4497
CUCCGGGACGGCUGGGC 232 17 51
hsa-miR-3195
CGCGCCGGGCCCGGGUU 716 17 41
hsa-miR-1973
ACCGUGCAAAGGUAGCAUA 171 19 30
hsa-miR-21-5p
UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA 9 22 22
hsa-miR-4284
GGGCUCACAUCACCCCAU 191 18 20
hsa-miR-4792
CGGUGAGCGCUCGCUGGC 363 18 12
hsa-miR-92a-3p
UAUUGCACUUGUCCCGGCCUGU 7 22 12
hsa-miR-1291
UGGCCCUGACUGAAGACCAGCAGU 294 24 11
hsa-miR-3676-5p
AGGAGAUCCUGGGUU 280 15 10
hsa-miR-100-5p
AACCCGUAGAUCCGAACUUGUG 3 22 8
hsa-miR-3656
GGCGGGUGCGGGGGUGG 251 17 8
hsa-miR-663b
GGUGGCCCGGCCGUGCCUGAGG 180 22 8
hsa-let-7a-5p
UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU 1 22 7
hsa-miR-1290
UGGAUUUUUGGAUCAGGGA 375 19 7
hsa-miR-3687
CCCGGACAGGCGUUCGUGCGACGU 190 24 7
hsa-miR-4461
GAUUGAGACUAGUAGGGCUAGGC 52 23 6
hsa-miR-664-5p
ACUGGCUAGGGAAAAUGAUUGGAU 91 24 6
hsa-miR-92b-3p
UAUUGCACUCGUCCCGGCCUCC 13 22 6
hsa-miR-125b-5p
UCCCUGAGACCCUAACUUGUGA 42 22 5
hsa-miR-3653
CUAAGAAGUUGACUGAAG 544 18 5
hsa-let-7f-5p
UGAGGUAGUAGAUUGUAUAGUU 11 22 4
hsa-miR-16-5p
UAGCAGCACGUAAAUAUUGGCG 29 22 4
hsa-miR-181a-5p
AACAUUCAACGCUGUCGGUGAGU 15 23 4
hsa-miR-3609
CAAAGUGAUGAGUAAUACUGGCUG 216 24 4
hsa-miR-9-5p
UCUUUGGUUAUCUAGCUGUAUGA 58 23 4
hsa-let-7c
UGAGGUAGUAGGUUGUAUGGUU 17 22 3
hsa-miR-1244
AAGUAGUUGGUUUGUAUGAGAUGGUU 59 26 3
hsa-miR-127-3p
UCGGAUCCGUCUGAGCUUGGCU 14 22 3
hsa-miR-181b-5p
AACAUUCAUUGCUGUCGGUGGGU 38 23 3
hsa-miR-21-3p
CAACACCAGUCGAUGGGCUGU 20 21 3
hsa-miR-26a-5p
UUCAAGUAAUCCAGGAUAGGCU 12 22 3
hsa-miR-30c-5p
UGUAAACAUCCUACACUCUCAGC 66 23 3
hsa-miR-3960
GGCGGCGGCGGAGGCGGGGG 416 20 3
hsa-miR-485-3p
GUCAUACACGGCUCUCCUCUCU 153 22 3
hsa-let-7b-5p
UGAGGUAGUAGGUUGUGUGGUU 28 22 2
hsa-let-7g-5p
UGAGGUAGUAGUUUGUACAGUU 43 22 2
hsa-miR-1273f
GGAGAUGGAGGUUGCAGUG 292 19 2
hsa-miR-151a-3p
CUAGACUGAAGCUCCUUGAGG 25 21 2
hsa-miR-182-5p
UUUGGCAAUGGUAGAACUCACACU 16 24 2
hsa-miR-191-5p
CAACGGAAUCCCAAAAGCAGCUG 8 23 2
hsa-miR-197-3p
UUCACCACCUUCUCCACCCAGC 122 22 2
hsa-miR-423-5p
UGAGGGGCAGAGAGCGAGACUUU 41 23 2
hsa-miR-4468
AGAGCAGAAGGAUGAGAU 732 18 2
hsa-miR-644b-5p
UGGGCUAAGGGAGAUGAUUGGGUA 724 24 2
hsa-miR-93-5p
CAAAGUGCUGUUCGUGCAGGUAG 116 23 2
hsa-let-7d-5p
AGAGGUAGUAGGUUGCAUAGUU 92 22 1
hsa-miR-1225-3p
UGAGCCCCUGUGCCGCCCCCAG 369 22 1
hsa-miR-1254
AGCCUGGAAGCUGGAGCCUGCAGU 270 24 1
hsa-miR-1273g-3p
ACCACUGCACUCCAGCCUGAG 210 21 1
hsa-miR-1275
GUGGGGGAGAGGCUGUC 162 17 1
hsa-miR-1296
UUAGGGCCCUGGCUCCAUCUCC 271 22 1
hsa-miR-1307-5p
UCGACCGGACCUCGACCGGCU 91 21 1
hsa-miR-134
UGUGACUGGUUGACCAGAGGGG 94 22 1
hsa-miR-15b-5p
UAGCAGCACAUCAUGGUUUACA 78 22 1
hsa-miR-17-5p
CAAAGUGCUUACAGUGCAGGUAG 145 23 1
hsa-miR-1972
UCAGGCCAGGCACAGUGGCUCA 733 22 1
hsa-miR-22-3p
AAGCUGCCAGUUGAAGAACUGU 33 22 1
hsa-miR-25-3p
CAUUGCACUUGUCUCGGUCUGA 63 22 1
hsa-miR-27b-3p
UUCACAGUGGCUAAGUUCUGC 6 21 1
hsa-miR-3065-5p
UCAACAAAAUCACUGAUGCUGGA 226 23 1
hsa-miR-30d-5p
UGUAAACAUCCCCGACUGGAAG 31 22 1
hsa-miR-320a
AAAAGCUGGGUUGAGAGGGCGA 97 22 1
hsa-miR-342-3p
UCUCACACAGAAAUCGCACCCGU 81 23 1
hsa-miR-3648
AGCCGCGGGGAUCGCCGAGGG 259 21 1
hsa-miR-3652
CGGCUGGAGGUGUGAGGA 722 18 1
hsa-miR-376c
AACAUAGAGGAAAUUCCACGU 185 21 1
hsa-miR-378a-3p
ACUGGACUUGGAGUCAGAAGG 65 21 1
hsa-miR-409-3p
GAAUGUUGCUCGGUGAACCCCU 47 22 1
hsa-miR-433
AUCAUGAUGGGCUCCUCGGUGU 174 22 1
hsa-miR-4417
GGUGGGCUUCCCGGAGGG 175 18 1
hsa-miR-4448
GGCUCCUUGGUCUAGGGGUA 231 20 1
hsa-miR-4454
GGAUCCGAGUCACGGCACCA 299 20 1
hsa-miR-454-3p
UAGUGCAAUAUUGCUUAUAGGGU 169 23 1
hsa-miR-4800-3p
CAUCCGUCCGUCUGUCCAC 549 19 1
hsa-miR-493-3p
UGAAGGUCUACUGUGUGCCAGG 83 22 1
hsa-miR-5095
UUACAGGCGUGAACCACCGCG 723 21 1
hsa-miR-574-3p
CACGCUCAUGCACACACCCACA 253 22 1
hsa-miR-665
ACCAGGAGGCUGAGGCCCCU 309 20 1
hsa-miR-720
UCUCGCUGGGGCCUCCA 84 17 1
hsa-miR-99a-5p
AACCCGUAGAUCCGAUCUUGUG 52 22 1
hsa-miR-99b-5p
CACCCGUAGAACCGACCUUGCG 4 22 1
Tabla 9: Exosomas EH
Exosomas CTX0E03 07EH
miARN
Secuencia de miARN SEQ ID NO: Longitud de miARN Recuentos de lectura
hsa-miR-1246
AAUGGAUUUUUGGAGCAGG 21 19 111092
hsa-miR-4492
GGGGCUGGGCGCGCGCC 34 17 5188
hsa-miR-4532
CCCCGGGGAGCCCGGCG 23 17 3368
hsa-miR-4488
AGGGGGCGGGCUCCGGCG 61 18 1389
hsa-miR-4485
UAACGGCCGCGGUACCCUAA 67 20 386
hsa-miR-4508
GCGGGGCUGGGCGCGCG 135 17 188
hsa-miR-4516
GGGAGAAGGGUCGGGGC 110 17 135
hsa-miR-4497
CUCCGGGACGGCUGGGC 232 17 73
hsa-miR-1973
ACCGUGCAAAGGUAGCAUA 171 19 50
hsa-miR-3195
CGCGCCGGGCCCGGGUU 716 17 48
hsa-miR-4466
GGGUGCGGGCCGGCGGGG 264 18 43
hsa-let-7a-5p
UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU 1 22 20
hsa-miR-99b-5p
CACCCGUAGAACCGACCUUGCG 4 22 19
hsa-miR-21-5p
UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA 9 22 18
hsa-miR-92a-3p
UAUUGCACUUGUCCCGGCCUGU 7 22 18
hsa-miR-3676-5p
AGGAGAUCCUGGGUU 280 15 17
hsa-miR-4792
CGGUGAGCGCUCGCUGGC 363 18 15
hsa-miR-664-5p
ACUGGCUAGGGAAAAUGAUUGGAU 443 24 13
hsa-miR-100-5p
AACCCGUAGAUCCGAACUUGUG 3 22 11
hsa-miR-1291
UGGCCCUGACUGAAGACCAGCAGU 294 24 10
hsa-miR-16-5p
UAGCAGCACGUAAAUAUUGGCG 29 22 10
hsa-miR-4284
GGGCUCACAUCACCCCAU 191 18 10
hsa-miR-663b
GGUGGCCCGGCCGUGCCUGAGG 180 22 9
hsa-miR-25-3p
CAUUGCACUUGUCUCGGUCUGA 63 22 8
hsa-miR-3656
GGCGGGUGCGGGGGUGG 251 17 8
hsa-miR-181a-5p
AACAUUCAACGCUGUCGGUGAGU 15 23 7
hsa-miR-26a-5p
UUCAAGUAAUCCAGGAUAGGCU 12 22 6
hsa-miR-3654
GACUGGACAAGCUGAGGAA 325 19 6
hsa-miR-644b-5p
UGGGCUAAGGGAGAUGAUUGGGUA 724 24 6
hsa-let-7b-5p
UGAGGUAGUAGGUUGUGUGGUU 28 22 5
hsa-let-7f-5p
UGAGGUAGUAGAUUGUAUAGUU 11 22 5
hsa-miR-1290
UGGAUUUUUGGAUCAGGGA 375 19 5
hsa-miR-4426
GAAGAUGGACGUACUUU 359 17 5
hsa-miR-5096
GUUUCACCAUGUUGGUCAGGC 220 21 5
hsa-miR-125b-5p
UCCCUGAGACCCUAACUUGUGA 42 22 4
hsa-miR-1273f
GGAGAUGGAGGUUGCAGUG 292 19 4
hsa-miR-191-5p
CAACGGAAUCCCAAAAGCAGCUG 8 23 4
hsa-miR-22-3p
AAGCUGCCAGUUGAAGAACUGU 33 22 4
hsa-miR-3609
CAAAGUGAUGAGUAAUACUGGCUG 216 24 4
hsa-miR-3687
CCCGGACAGGCGUUCGUGCGACGU 190 24 4
hsa-miR-93-5p
CAAAGUGCUGUUCGUGCAGGUAG 116 23 4
hsa-miR-1248
ACCUUCUUGUAUAAGCACUGUGCUAAA 269 27 3
hsa-miR-1273g-3p
ACCACUGCACUCCAGCCUGAG 210 21 3
hsa-miR-151a-3p
CUAGACUGAAGCUCCUUGAGG 25 21 3
hsa-miR-182-5p
UUUGGCAAUGGUAGAACUCACACU 16 24 3
hsa-miR-221-3p
AGCUACAUUGUCUGCUGGGUUUC 79 23 3
hsa-miR-222-3p
AGCUACAUCUGGCUACUGGGU 36 21 3
hsa-miR-29a-3p
UAGCACCAUCUGAAAUCGGUUA 106 22 3
hsa-miR-4461
GAUUGAGACUAGUAGGGCUAGGC 129 23 3
hsa-miR-486-5p
UCCUGUACUGAGCUGCCCCGAG 5 22 3
hsa-miR-92b-3p
UAUUGCACUCGUCCCGGCCUCC 13 22 3
hsa-miR-9-5p
UCUUUGGUUAUCUAGCUGUAUGA 58 23 3
hsa-miR-98
UGAGGUAGUAAGUUGUAUUGUU 10 22 3
hsa-let-7d-5p
AGAGGUAGUAGGUUGCAUAGUU 53 22 2
hsa-miR-134
UGUGACUGGUUGACCAGAGGGG 94 22 2
hsa-miR-151a-5p
UCGAGGAGCUCACAGUCUAGU 37 21 2
hsa-miR-15b-5p
UAGCAGCACAUCAUGGUUUACA 78 22 2
hsa-miR-30a-5p
UGUAAACAUCCUCGACUGGAAG 30 22 2
hsa-miR-3124-3p
ACUUUCCUCACUCCCGUGAAGU 734 22 2
hsa-miR-3653
CUAAGAAGUUGACUGAAG 544 18 2
hsa-let-7c
UGAGGUAGUAGGUUGUAUGGUU 17 22 1
hsa-let-7d-3p
CUAUACGACCUGCUGCCUUUCU 92 22 1
hsa-let-7g-5p
UGAGGUAGUAGUUUGUACAGUU 43 22 1
hsa-let-7i-5p
UGAGGUAGUAGUUUGUGCUGUU 22 22 1
hsa-miR-103a-3p
AGCAGCAUUGUACAGGGCUAUGA 62 23 1
hsa-miR-106b-5p
UAAAGUGCUGACAGUGCAGAU 170 21 1
hsa-miR-1244
AAGUAGUUGGUUUGUAUGAGAUGGUU 340 26 1
hsa-miR-128
UCACAGUGAACCGGUCUCUUU 109 21 1
hsa-miR-1285-3p
UCUGGGCAACAAAGUGAGACCU 464 22 1
hsa-miR-1307-3p
ACUCGGCGUGGCGUCGGUCGUG 124 22 1
hsa-miR-140-3p
UACCACAGGGUAGAACCACGG 138 21 1
hsa-miR-148b-3p
UCAGUGCAUCACAGAACUUUGU 48 22 1
hsa-miR-181b-5p
AACAUUCAUUGCUGUCGGUGGGU 38 23 1
hsa-miR-193a-3p
AACUGGCCUACAAAGUCCCAGU 386 22 1
hsa-miR-1972
UCAGGCCAGGCACAGUGGCUCA 733 22 1
hsa-miR-21-3p
CAACACCAGUCGAUGGGCUGU 20 21 1
hsa-miR-2277-3p
UGACAGCGCCCUGCCUGGCUC 735 21 1
hsa-miR-23a-3p
AUCACAUUGCCAGGGAUUUCC 55 21 1
hsa-miR-23b-3p
AUCACAUUGCCAGGGAUUACC 59 21 1
hsa-miR-24-3p
UGGCUCAGUUCAGCAGGAACAG 119 22 1
hsa-miR-27a-3p
UUCACAGUGGCUAAGUUCCGC 46 21 1
hsa-miR-27b-3p
UUCACAGUGGCUAAGUUCUGC 6 21 1
hsa-miR-299-3p
UAUGUGGGAUGGUAAACCGCUU 182 22 1
hsa-miR-30b-5p
UGUAAACAUCCUACACUCAGCU 96 22 1
hsa-miR-30c-5p
UGUAAACAUCCUACACUCUCAGC 66 23 1
hsa-miR-31-3p
UGCUAUGCCAACAUAUUGCCAU 172 22 1
hsa-miR-3196
CGGGGCGGCAGGGGCCUC 717 18 1
hsa-miR-3198
GUGGAGUCCUGGGGAAUGGAGA 647 22 1
hsa-miR-320a
AAAAGCUGGGUUGAGAGGGCGA 97 22 1
hsa-miR-329
AACACACCUGGUUAACCUCUUU 214 22 1
hsa-miR-339-5p
UCCCUGUCCUCCAGGAGCUCACG 402 23 1
hsa-miR-34a-5p
UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU 101 22 1
hsa-miR-3607-5p
GCAUGUGAUGAAGCAAAUCAGU 249 22 1
hsa-miR-3648
AGCCGCGGGGAUCGCCGAGGG 259 21 1
hsa-miR-376c
AACAUAGAGGAAAUUCCACGU 185 21 1
hsa-miR-3960
GGCGGCGGCGGAGGCGGGGG 416 20 1
hsa-miR-411-3p
UAUGUAACACGGUCCACUAACC 482 22 1
hsa-miR-423-3p
AGCUCGGUCUGAGGCCCCUCAGU 57 23 1
hsa-miR-423-5p
UGAGGGGCAGAGAGCGAGACUUU 41 23 1
hsa-miR-4417
GGUGGGCUUCCCGGAGGG 175 18 1
hsa-miR-4444
CUCGAGUUGGAAGAGGCG 418 18 1
hsa-miR-4499
AAGACUGAGAGGAGGGA 736 17 1
hsa-miR-4521
GCUAAGGAAGUCCUGUGCUCAG 233 22 1
hsa-miR-4680-5p
AGAACUCUUGCAGUCUUAGAUGU 737 23 1
hsa-miR-4709-5p
ACAACAGUGACUUGCUCUCCAA 575 22 1
hsa-miR-501-3p
AAUGCACCCGGGCAAGGAUUCU 26 22 1
hsa-miR-644b-3p
UUCAUUUGCCUCCCAGCCUACA 442 22 1
hsa-miR-654-3p
UAUGUCUGCUGACCAUCACCUU 336 22 1
hsa-miR-9-3p
AUAAAGCUAGAUAACCGAAAGU 183 22 1
hsa-miR-940
AAGGCAGGGCCCCCGCUCCCC 366 21 1
hsa-miR-99a-5p
AACCCGUAGAUCCGAUCUUGUG 52 22 1
D) Identificación de los principales ARN codificantes y no codificantes mediante el análisis GENCODE realizado en exosomas, MV y células productoras
5 Tabla 10: Número total de lecturas de secuencia identificadas mediante el uso de GENCODE en cada muestra
analizada
CTX0E0307EH
CTX0E0307EH
CTX0E0307EH
CTX0E0307EI CTX0E0307EIE CTX0E0307EI
Célula
EXO MV Célula XO MV
18741941
12678688 10876797 22116110 16311289 835970
Usando el análisis de la base de datos GENCODE de los resultados de la secuencia, se identificaron siete secuencias putativas nuevas de miARN en exosomas (EXO), microvesículas (MV) y células productoras, como se
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muestra en la Tabla 11. (las lecturas de nb CTX0E03 07EI de MV están tergiversadas debido a la menor cantidad de material de partida - véase la Tabla 10). Estos datos se muestran gráficamente en la Figura 16, que muestra que estas secuencias se transportan preferentemente en exosomas y microvesículas en comparación con las células.
Símbolo del gen
ID del transcrito Longitud Tipo de ARN Células CTX0E 0307EH EXO CTX0E030 7EH MV CTX0E0307 EHE Células CTXOE030 7EI EXO CTX0E03 07EI MV CTXOE03 07EI
AC079949.1
AC079949. 1-201 57 Nuevo miARN 2629 27006 14873 2425 11433 848
AP000318.1
AP000318. 1-201 64 Nuevo miARN 1353 9379 11002 7469 2963 419
AL161626.1
AL161626. 1-201 57 Nuevo miARN 471 4450 3712 291 1263 129
AC004943.1
AC004943. 1-201 81 Nuevo miARN 24 81 43 23 94 5
AL121897.1
AL121897. 1-201 89 Nuevo miARN 6 22 14 2 30 3
Tabla 11: Identificación de secuencias putativas nuevas de miARN usando GENCODE en exosomas (EXO), microvesículas (MV) y células productoras. Las lecturas de MV CTX0E03 07EI están tergiversadas debido a la baja cantidad de materia de partida (tabla 1). Las ID de los transcritos fueron tomadas a partir de la base de datos Ensembl (
www.ensembl.org).
Validación y de nuevos miARN
AC079949.1-201 (SEQ ID NO: 738)
Gen: AC079949.1 ENSG00000239776
> 12 adn:cromosoma cromosoma:GRCh37:12:127650616:127650672:1 GGCCGCGCCCCGTTTCCCAGGACAAAGGGCACTCCGCACCGGACCCTGGTCCCAGCG
Para el miARN maduro putativo AC079949.1-201, se identificó el gaccaggguccggugcggagug (SEQ ID NO: 745) como el posible miARN madurado en el tallo 5' usando
http://mirna.imbb.forth.gr/MatureBayes.htmL, una herramienta para encontrar miARN maduro dentro de una secuencia precursora de miARN utilizando un clasificador Naive Bays. Su validación de presencia se realizó usando la secuencia de cebador AGGGTCCGGTGCGGAGT (SEC ID NO: 746). Esta secuencia se introdujo en mirbase (
http://www.mirbase.org/) y se encontró el siguiente miARN con una secuencia similar: Bos taurus miR-2887-1 (No. de acceso MIMAT0013845). bta-miR-2887: 9-20 (SEQ ID NO: 747)
AC 07 9 94 9 (5) 2 ggguccggugcg 13
I I I I I I I I I I I I
bta-miR-2887 9 ggguccggugcg 20
La presencia de este nuevo miARN se probó mediante qRT-PCR en miARN retrotranscrito de exosomas purificados.
Se realizó el mismo análisis usando el tallo 3' de AC079949, secuencia TGCGGAGTGCCCTTTGTCCT (SEQ ID NO: 748), pero en este caso no se identificó ningún miARN similar en mirbase.
AP000318.1-201 (SEQ ID NO: 739)
Gen: AP000318.1 ENSG00000266007
> 21 adn: cromosoma cromosoma: GRCh37:21:35677430:35677493:1
CCCACTCCCTGGCGCCGCTTGTGGAGGGCCCAAGTCCTTCTGATTGAGGCCCAACCCGTGGAAG
Para el miARN maduro putativo AP000318.1-201, se identificó ggagggcccaaguccuucugau (SEQ ID NO: 744) como el posible miARN maduro del tallo 5'. Su validación de presencia se realizó utilizando la secuencia del cebador GGAGGGCCCAAGTCCTTCTGAT (SEC ID NO: 749). Se identificó el tallo-bucle del miR-55 de Caenorhabditis remanei como un miARN similar. La validación del cebador se llevó a cabo nuevamente mediante qRT-PCR. crm-miR-55-5p: 4-17 (SEQ ID NO: 750)
AP000318.1 20 cccaaguccuucug 7
I I I I I I I lililí
crm-miR-55-5p 4 cccaagugcuucug 17
AL161626.1-201 (SEQ ID NO: 740)
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Gen: AL161626.1 ENSG00000241781
> 9 adn:cromosoma cromosoma:GRCh37:9:79186731:79186787:1
CGCCGGGACCGGGGTCCGGGGCGGAGTGCCCTTCCTCCTGGGAAACGGGGTGCGGC
Para el miARN maduro putativo AL161626.1-201, se identificó ggcggagugcccuucuuccugg (SEQ ID NO: 743) como el posible miARN madurado del tallo 5'. Su validación de presencia se realizó usando la secuencia del cebador CGGAGTGCCCTTCTTCCT (SEQ ID NO: 751). Se identificaron el tallo-bucle del miR164c de Zea mays y el tallo- bucle del miR164f de Achypodium distachyon como miARN similar. La validación del cebador se llevó a cabo nuevamente mediante qRT-PCR. zma-miR164c-3p: 4-15 (SEQ ID NO: 752)
AL16162 6.1 zma-miR164c-3p
5 gugcccuucuuc 16
I I I I I I I I I I I I
4 gugcccuucuuc 15
AC004943.1 (SEQIDNO: 741)
Gen: AC004943.1 ENSG00000265573
> 16 adn:cromosoma cromosoma:GRCh37:16:72821592:72821672:-1
GCTTCACGTCCCCACCGGCGGCGGCGGCGGTGGCAGTGGCGGCGGCGGCGGCGGTGGCGG
CGGCGGCGGCGGCGGCGGCTC
AL121897.1 (SEQIDNO: 742)
Gen: AL121897.1 ENSG00000264308
> 20 adn:cromosoma cromosoma:GRCh37:20:30865503:30865591:1
GCCGCCCCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCCGCTTTCGGCTCGGG
CCTCAGGTGAGTCGGAGGGGCCGGGCGCC
ARN misceláneo (ARN_ misc), incluido putativo nuevo
ARN_misc es la abreviatura de ARN misceláneo, un término general para una serie de ARN pequeño misceláneo. La característica del transcrito miscelánea no está definida por otras claves de ARN.
Lista de ARN_misc conocidos y nuevos de clasificación superior identificados usando el conjunto de datos de secuencia GENCODE:
Símbolo del gen
ID del transcrito Longitud Tipo de ARN Células CTX0E03 07EH EXO CTX0E0307 EH MV CTXOE0307E HE Células CTX0E03 07EI EXO CTX0E0 307EI MV CTX0E 0307EI
RPPH1
RPPH1-201 333 ARN misc 76 2229 1785 0 1077 197
RMRP
RMRP-201 264 ARN misc 139 1803 1443 191 659 87
RPPH1
RPPH1-001 638 ARN misc 182 931 1372 795 2017 157
VTARN1-1
VTARN1-1-201 99 ARN misc 43 720 52 247 210 9
Y ARN
Y ARN.321-201 93 ARN misc nuevo 159 196 661 960 903 217
Y ARN
Y ARN.725-201 95 ARN misc nuevo 1092 18 74 1005 39 11
Y ARN
Y ARN.125-201 96 ARN misc nuevo 1079 15 58 906 27 12
Y ARN
Y ARN.118-201 99 ARN misc nuevo 134 12 9 156 45 7
Y ARN
Y ARN.394-201 109 ARN misc nuevo 9 9 7 33 13 1
Y ARN
Y ARN.687-201 111 ARN misc nuevo 36 6 15 103 41 10
Y ARN
Y ARN. 144-201 102 ARN misc nuevo 129 5 21 187 84 5
Y ARN
Y ARN.337-201 105 ARN misc nuevo 7 4 0 15 4 0
Y ARN
Y ARN .413-201 97 ARN misc nuevo 136 4 8 125 46 3
Y ARN
Y ARN.30-201 103 ARN misc nuevo 74 3 3 62 21 2
Tabla 12: Identificación de secuencias de ARN misc, incluyendo ARN misc putativo nuevo, usando GENCODE en exosomas (EXO), microvesículas (MV) y células productoras. (las lecturas de MV CTX0E03 07EI están mal representadas debido a la baja cantidad de material de partida - Tabla 10). Las ID de los transcritos se tomaron de la base de datos Ensembl (
www.ensembl.org).
Entre los ARN_misc las siguientes secuencias se encontraron preferentemente sub y sobretransportadas en exosomas y MV: RPHI, RMRP y VTARN1-1 sobretransportados y Y_ARN.725-201, y Y_ARN.125-201 subtransportados, respectivamente. RPHI es un componente h1 de ARN ribonucleasa P. El gen RMRP codifica el componente de ARN del ARN mitocondrial que procesa la endorribonucleasa, que escinde el ARN mitocondrial en un sitio de cebado de la replicación del ADN mitocondrial. Este ARN también interactúa con la subunidad catalítica de la transcriptasa inversa de telomerasa para formar un complejo de ribonucleoproteína distinto que tiene actividad
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de ARN polimerasa dependiente del ARN y produce ARN de cadena doble que pueden procesarse en ARN pequeño de interferencia. VTARN1-1 es el componente 1 del ARN bóveda. Las bóvedas son ribonucleoproteínas citoplásmicas grandes y están compuestas por una proteína principal de la bóveda, MVP, 2 proteínas menores de la bóveda, TEP1 y PARP4, y un componente de ArN no traducido, VTARN1-1. Y_ARN.725-201, y Y_ARN.125-201 son nuevos ARN_misc y su función no está definida.
ARN misceláneo de Metazoarios
El ARN de la partícula de reconocimiento de señal, también conocido como ARN 7SL, 6S, ffs o 4.5S, es el componente de ARN del complejo de ribonucleoproteína de la partícula de reconocimiento de señal (SRP). SRP es una ribonucleoproteína universalmente conservada que dirige el tráfico de proteínas dentro de la célula y permite que sean secretadas. El ARN de SRP, junto con una o más proteínas de SRP, contribuye a la unión y liberación del péptido señal. Los componentes del aRn y la proteína de este complejo están altamente conservados, pero varían entre los diferentes reinos de la vida.
Lista de los principales ARN_miscs de Metazoarios identificados usando el conjunto de datos de secuencia GENCODE:
Símbolo del gen
ID del transcrito Longitud Tipo de ARN Células CTX0E0307EH EXO CTX0E0307 EH MV CTX0E0307E HE Células CTX0E03 07EI EXO CTX0E0 307EI MV CTX0E 0307EI
SRP de Metazoarios
SRP.791-201 de Metazoarios 288 Reconocimiento de señal Metozoario 679 2324 2058 771 2698 465
SRP de Metazoarios
SRP.561-201 de Metazoarios 294 Reconocimiento de señal Metozoario 634 2006 1683 744 2147 432
SRP de Metazoarios
SRP.864-201 de Metazoarios 297 Reconocimiento de señal Metozoario 252 1884 1544 78 170 148
SRP de Metazoarios
SRP.824-201 de Metazoarios 297 Reconocimiento de señal Metozoario 438 881 958 505 1860 342
SRP de Metazoarios
SRP.72-201 de Metazoarios 278 Reconocimiento de señal Metozoario 441 630 631 494 2184 349
SRP de Metazoarios
SRP.151-201 de Metazoarios 307 Reconocimiento de señal Metozoario 377 464 470 432 1431 265
SRP de Metazoarios
SRP.208-201 de Metazoarios 277 Reconocimiento de señal Metozoario 382 410 431 422 1104 242
SRP de Metazoarios
SRP.501-201 de Metazoarios 280 Reconocimiento de señal Metozoario 265 272 266 236 434 44
SRP de Metazoarios
SRP.682-201 de Metazoarios 298 Reconocimiento de señal Metozoario 12 52 21 10 13 2
Tabla 13: Identificación de secuencias de ARN (ARN misc), usando GENCODE en exosomas (EXO), microvesículas (MV) y células productoras. Las ID de los transcritos se tomaron de la base de datos Ensembl (
www.ensembl.org).
RRNA (ARN ribosomal)
El ARN ribosomal (ARNr) forma parte del orgánulo que sintetiza proteínas conocido como ribosoma y que se exporta al citoplasma para ayudar a traducir la información en ARN mensajero (ARNm) en proteína. Los componentes de ARNr de ribosoma eucariótico (80S) son: unidad grande (ARNr 5S, 5.8S y 28S) unidad pequeña (ARNr 18S). Tanto el ARNr 28S como el 5.8S se sobretransportan selectivamente en exosomas y Mv.
Lista de los principales ARNr identificados usando el conjunto de datos de secuencia GENCODE:
Símbolo del gen
ID del transcrito Longitud Tipo de ARN Células CTX0E030 7EH EXO CTX0E0307 EH MV CTX0E0307E HE Células CTXOE03 07EI EXO CTXOEO 307 El MV CTXOEO 307EI
ARN5- 8SP6
ARN5-8SP6-201 152 ARNr 205.008 1.148.190 706.558 213.18 7 135.909 14.732
ARN26S 5
ARN26S5-001 432 ARNr 86.111 458.585 516.754 62.829 390.237 47.483
ARN18S 5
ARN18S5-001 599 ARNr 74.634 52.055 61.639 116.87 4 138.484 14.616
ARN5- 8SP2
ARN5-8SP2-201 152 ARNr 6.488 1.719 1.540 9.231 3.112 149
ARN5- 8SP5
ARN5-8SP5-201 152 ARNr 2.794 7.393 3.924 7.314 3.579 232
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Tabla 14: Identificación de secuencias de ARNr, usando GENCODE en exosomas (EXO), microvesículas (MV) y células productoras. Las ID de los transcritos se tomaron de la base de datos Ensembl (
www.ensembl.org).
ARN nucleolar pequeño: ARNnup
Los ARN nucleolares pequeños (ARNnup) son una clase de moléculas de ARN pequeño que guían principalmente modificaciones químicas de otros ARN, principalmente ARN ribosómicos, ARN de transferencia y ARN nucleares pequeños. Hay dos clases principales de ARNnup, los ARNnup de la caja C/D que están asociados con la metilación, y los ARNnup de la caja H/ACA que están asociados con la pseudouridilación.
Lista de los principales ARNnup identificados usando el conjunto de datos de secuencia GENCODE:
Símbolo del gen
ID del transcrito Longitud Tipo de ARN Células CTX0E030 7EH EXO CTX0E0307 EH MV CTX0E0307E HE Células CTX0E03 07EI EXO CTX0E0 307EI MV CTX0E0 307EI
SNORD 3A
SNORD3A-201 216 ARNnup 1.433 2.085 1.621 906 1.732 120
SNORD 3C
SNORD3C-201 216 ARNnup 1.169 1.702 1.220 639 1.176 86
SNORD 29
SNORD29-201 65 ARNnup 28.130 1.633 1.070 36.677 1.752 45
SNORD8 3B
SNORD83B-201 93 ARNnup 1.835 675 487 638 575 29
SNORD 30
SNORD30-201 70 ARNnup 29.743 254 244 29.071 283 24
Tabla 15: Identificación de secuencias de ARNnup, usando GENCODE en exosomas (EXO), microvesículas (MV) y células productoras. Las ID de los transcritos se tomaron de la base de datos Ensembl (
www.ensembl.org).
ARN nuclear pequeño (ARNnp)
El ácido ribonucleico nuclear pequeño (ARNnp), también conocido comúnmente como U-ARN, es una clase de moléculas de ARN pequeño que componen el espliceosoma principal que se denominan U1, U2, U4, U5 y U6, y participan en varias interacciones ARN-ARN y ARN-proteína. Su función principal es en el procesamiento de pre- ARNm (ARNhn) en el núcleo. También se ha demostrado que ayudan en la regulación de los factores de transcripción (ARN 7SK) o la ARN polimerasa II (ARN B2) y el mantenimiento de los telómeros.
Lista de los principales ARNnp identificados usando el conjunto de datos de secuencia GENCODE:
Símbolo del gen
ID del transcrito Longitud Tipo de ARN Células CTX0E030 7EH EXO CTX0E0307 EH MV CTX0EO3O7E HE Células CTX0E03 07EI EXO CTXOEO 307El MV CTXOEO 307EI
U2
U2.38-201 191 ARNnp 1.354 71.596 49.223 751 35.290 1.919
U2
U2.6-201 192 ARNnp 834 15.561 13.594 303 8.146 272
U1
111.81-201 164 ARNnp 584 10.901 7.307 91 3.197 121
U1
U 1.190201 167 ARNnp 533 9.927 6.689 48 2.187 84
U2
U2.7-201 191 ARNnp 201 9.267 3.109 288 6.736 262
Tabla 16A: Identificación de secuencias de ARNnp, usando GENCODE en exosomas (EXO), microvesículas (MV) y células productoras. Las ID de los transcritos se tomaron de la base de datos Ensembl (
www.ensembl.org).
ARNncig y nuevo ARNncig
Los ARN no codificantes intergénicos grandes (ARNncig) están emergiendo como reguladores clave de diversos procesos celulares. La determinación de la función de los ARNncig individuales sigue siendo un desafío. Los ARN no codificantes largos (ARNnc largos, ARNncl) son transcritos de codificación no proteica de más de 200 nucleótidos.
Lista de los principales ARNncig previamente conocidos y nuevos identificados usando el conjunto de datos de secuencia GENCODE:
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Símbolo del gen
ID del transcrito Longitud Tipo de ARN Células CTX0E030 7EH EXO CTX0E0307 EH MV CTX0E0307E HE Células CTX0E03 07EI EXO CTX0E0 307 El MV CTX0E 0307EI
RP11- 108M9.3
RP11- 108M9.3- 001 1.761 ARNncig nuevo 244 159 240 539 324 45
RP11- 329L6.1
RP11- 329L6.1- 001 507 ARNncig nuevo 19 70 41 29 84 2
RP11- 160E2.6
RP11- 160E2.6- 001 637 ARNncig nuevo 228 67 115 489 74
AC004528 .3
AC004528. 3-001 107 ARNncig nuevo 16 58 46 14 55 4
MALAT1
MALAT1- 201 4.585 ARNncig 150 308 234 26 182 12
GAS5
GAS5-007 2.743 ARNncig 12.024 215 120 46.501 875 13
Tabla 16B: Identificación de secuencias de ARNncig y ARNncig putativo nuevo, usando GENCODE en exosomas (EXO), microvesículas (MV) y células productoras. Las ID de los transcritos se tomaron de la base de datos Ensembl (
www.ensembl.org).
El ARNncig de GAS5 se expresa mucho en el productor de células en comparación con, en exosomas y microvesículas (menos transportados tanto en exosomas como en MV).
ARNm
También se identificaron los ARNm de secuenciación codificante.
Símbolo del gen
ID del transcrito Longitud Tipo de ARN Células CTX0E030 7EH EXO CTX0E0307 EH MV CTXOE0307E HE Células CTX0E03 07EI EXO CTX0E0 307EI MV CTX0E0 307EI
EEF2
EEF2-201 9.407 ARN m 710 578 449 1.155 471 33
MTRNR2L 8
MTRNR2L8- 201 1.290 ARN m 1.383 548 642 1.323 258 15
NES
NES-001 8.635 ARN m 668 406 234 1.448 267 20
VIM
VIM-001 8.316 ARN m 563 911 501 1.500 618 36
Tabla 17: Identificación de secuencias de ARNm usando GENCODE en exosomas (EXO), microvesículas (MV) y células productoras. Las ID de los transcritos se tomaron de la base de datos Ensembl (
www.ensembl.org).
Ejemplo 12: Conclusión
El alcance principal del análisis de secuencia profunda fue identificar sus componentes de miARN en vesículas derivadas de células madre neurales (exosomas y microvesículas). Este análisis identificó un nuevo conjunto de miARN conocidos y novedosos que se transportan preferentemente tanto en exosomas como en MV. Entre los miARN identificados ya incluidos en la base de datos mirbase se encuentran hsa-miR-1246, hsa-miR-4488, hsa-miR- 4492, hsa-miR-4508, hsa-miR-4516, hsa-miR-4532, y entre los miARN nuevos estaban AC079949.1, AP000318.1, AL161626.1, AC004943.1, AL121897.1. Los principales miARN transportados, incluidos los nuevos, fueron validados por qRT-PCR en exosomas.
La distribución de tamaño del ARN lanzadera, como se muestra en la presente memoria, está principalmente en el intervalo de 20 a 200 nt y otras especies de ARN son liberadas por las células en el espacio extracelular. Mediante la secuenciación profunda y el análisis del conjunto de secuencias GENCODE, se encontró una mayor complejidad y diversidad de transcritos de ARN no codificantes. Se extendió este análisis con una evaluación detallada y esto condujo al descubrimiento de una transferencia preferencial mayor (definida como log2 de cuánto cambia > 2) y menor (definida como log2 de cuánto cambia < - 2) de otros ARN no codificantes tanto en exosomas como en microvesículas. Los ARN no codificantes diferencialmente transportados se encontraron en casi todos los subtipos de ARN no codificante, ARN ribosomal (ARNr), nucleolar pequeño (ARNnup), ARN nuclear pequeño (ARNnp), microARN (miARN), otros ARN misceláneos (ARNc_misc, por ejemplo rMrP, ARN de la bóveda, SRP de metazoarios y RNY), y ARN no codificantes intergénicos grandes (ARNncig).
La distribución desigual de las especies de ARN detectadas sobre el ARN celular y lanzadera, combinada con una evidencia creciente de su papel en la regulación génica, sugiere fuertemente que las células liberan específicamente estos ARN para modificar la función de las células objetivo.
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Ejemplo 13: Análisis proteómico Métodos
Se prepararon exosomas y fracciones de microvesículas a partir de un cultivo Integra de células CTX0E03 (semana 2), usando ultracentrifugación diferencial. Los exosomas y microvesículas se rompieron en regulador RIPA modificado (Tris HCl 50 mM, pH 8,0, NaCl 150 mM, SDS al 1%, Triton X100 al 0,1%, DTT 10 mM, 1x inhibidor de proteasa completo (Roche) y 1x inhibidor de fosfatasa PhosStop (Roche)) y se sometieron a corte manual utilizando una jeringa de tuberculina de 1 mL y una aguja de calibre 25. Se cuantificaron nuevamente las muestras después del rompimiento mediante el fluorómetro Qubit (Invitrogen). Se cargaron 20 |jg de cada muestra en un gel SDS- PAGE al 4-12% (Novex, Invitrogen). El gel se cortó en cuarenta segmentos por línea y las secciones de gel se procesaron utilizando un robot (ProGest, DigiLab) con el siguiente protocolo:
a) lavar con bicarbonato de amonio 25 mM seguido de acetonitrilo;
b) reducir con ditiotreitol 10 mM a 60°C seguido de alquilación con yodoacetamida 50 mM a temperatura ambiente;
c) digerir con tripsina (Promega) a 37°C durante 4 h;
d) inactivación con ácido fórmico;
e) el sobrenadante se analizó por espectrometría de masas directamente sin procesamiento adicional.
Espectrometría de masas
Cada digestión en gel se analizó mediante nano LC/MS/MS con un sistema de HPLC NanoAcquity de Waters interconectado a un ThermoFisher Q Exactive. Los péptidos se cargaron en una columna de captura y se eluyeron en una columna analítica de 75 pm a razón de 350 nL/min; ambas columnas fueron empacadas con resina Jupiter Proteo (Phenomenex). El espectrómetro de masas fue operado en modo dependiente de los datos, con MS y MS/MS realizados en el Orbitrap a 70.000 FWHM y 17.500 FwHM de resolución, respectivamente.
Exosomas
Se identificaron 2.572 proteínas por espectrometría de masas en exosomas purificados por ultracentrifugación. Los exosomas se aislaron de las etapas iniciales de un cultivo Integra (semana 2). Los nombres de los genes y los números de acceso correspondientes del SWISSPROT (entre paréntesis) de todas las 2.572 proteínas se enumeran en la Tabla 18 (en orden alfabético por el nombre del gen) y las 100 proteínas más abundantes se enumeran en la Tabla 19, en orden de abundancia decreciente. Los marcadores característicos de exosomas CD9, CD81 y Alix (también conocidos como PDCD6IP) están presentes en las 100 proteínas más abundantes.
Tabla 18: Nombres de los genes y números de acceso del SWISSPROT de todas las 2.572 proteínas identificadas
en los exosomas CTX0E03 (enumeradas en orden alfabético del nombre del gen).____________________________
A1BG (P04217), A2M (P01023), AACS (Q86V21), AAMP (Q13685), AARS (P49588), AARSD1 (Q9BTE6), AASDHPPT (Q9NRN7), ABCA3 (Q99758), ABCE1 (P61221), ABCF1 (Q8NE71), ABCF3 (Q9NUQ8), ABHD10 (Q9NUJ1), ABHD14B (Q96IU4), ABI1 (Q8IZP0), ABR (Q12979), ACAA2 (P42765), ACACA (Q13085), ACADVL (P49748), ACAP2 (Q15057), ACAT1 (P24752), ACAT2 (Q9BWD1), ACBD7 (Q8N6N7), ACLY (P53396), ACO1 (P21399), ACO2 (Q99798), ACOT1 (Q86TX2), ACOT13 (Q9NPJ3), ACOT7 (000154), ACP1 (P24666), ACSL1 (P33121), ACSL3 (O95573), ACSL4 (O60488), ACSS2 (Q9NR19), ACTC1 (P68032), ACTG1 (P63261), ACTL6A (096019), ACTN1 (P12814), ACTN4 (O43707), ACTR10 (Q9NZ32), ACTR1A (P61163), ACTR1B (P42025), ACTR2 (P61160), ACTR3 (P61158), ADAM10 (014672), ADAM12 (043184), ADAMTS15 (Q8TE58), ADAMTS16 (Q8TE57), ADAR (P55265), ADAT2 (Q7Z6V5), ADH5 (P11766), ADI1 (Q9BV57), ADK (P55263), ADRBK1 (P25098), ADRM1 (Q16186), ADSL (P30566), ADSS (P30520), AEBP1 (Q8IUX7), AFM (P43652), AGL (P35573), AGRN (000468),
AGT (P01019), AHCY (P23526), AHCYL1 (043865), AHNAK (Q09666), AHSA1 (095433), AHSG (P02765), AIDA (Q96BJ3), AIFM1 (095831), AIMP1 (Q12904), AIMP2 (Q13155), AIP (000170), AK1 (P00568), AK3 (Q9UIJ7), AK4 (P27144), AKAP12 (Q02952), AKAP9 (Q99996), AKR1A1 (P14550), AKR1B1 (P15121), AKR1C1 (Q04828),
AKR7A2 (043488), AKR7A3 (095154), AKT1 (P31749), ALCAM (Q13740), ALDH16A1 (Q8IZ83), ALDH3A1 (P30838), ALDH7A1 (P49419), ALDH9A1 (P49189), ALD0A (P04075), ALD0C (P09972), ALKBH2 (Q6NS38), ALKBH4 (Q9NXW9), AMBP (P02760), AMDHD2 (Q9Y303), AMPD2 (Q01433), AMZ2 (Q86W34), ANAPC1 (Q9H1A4), ANAPC4 (Q9UJX5), ANAPC5 (Q9UJX4), ANAPC7 (Q9UJX3), ANKFY1 (Q9P2R3), ANKRD28 (015084), ANP32A (P39687), ANP32B (Q92688), ANP32E (Q9BTT0), ANXA1 (P04083), ANXA2 (P07355), ANXA4 (P09525), ANXA5 (P08758), ANXA6 (P08133), ANXA7 (P20073), AP1B1 (Q10567), AP1G1 (043747), AP1M1 (Q9BXS5), AP1S1 (P61966), AP1S2 (P56377), AP2A1 (095782), AP2A2 (094973), AP2B1 (P63010), AP2M1 (Q96CW1),
AP2S1 (P53680), AP3B1 (000203), AP3D1 (014617), AP3M1 (Q9Y2T2), AP3S1 (Q92572), AP3S2 (P59780),
AP4S1 (Q9Y587), APEH (P13798), APEX1 (P27695), API5 (Q9BZZ5), APIP (Q96GX9), AP0A1 (P02647),
AP0A1BP (Q8NCW5), AP0A2 (P02652), AP0BEC3C (Q9NRW3), AP0C2 (P02655), AP0D (P05090), AP0H (P02749), AP0M (095445), APPL1 (Q9UKG1), APRT (P07741), AQR (060306), ARCN1 (P48444), ARF1 (P84077), ARF4 (P18085), ARF5 (P84085), ARF6 (P62330), ARFIP1 (P53367), ARFIP2 (P53365), ARHGAP1 (Q07960), ARHGAP12 (Q8IWW6), ARHGDIA (P52565), ARHGEF1 (Q92888), ARHGEF10 (015013), ARHGEF7 (Q14155), ARIH1 (Q9Y4X5), ARIH2 (095376), ARL1 (P40616), ARL2 (P36404), ARL3 (P36405), ARL6IP1 (Q15041), ARL8B (Q9NVJ2), ARMC10 (Q8N2F6), ARMC6 (Q6NXE6), ARMc8 (Q8IUR7), ARMC9 (Q7Z3E5), ARMCX3 (Q9UH62),
ARPC1A (Q92747), ARPC1B (015143), ARPC2 (015144), ARPC3 (015145), ARPC4 (P59998), ARPC5 (015511), ARPC5L (Q9BPX5), ARRDC1 (Q8N5I2), ASB6 (Q9NWX5), ASCC1 (Q8N9N2), ASCC2 (Q9H1I8), ASCC3 (Q8N3CO), ASF1A (Q9Y294), ASH2L (Q9UBL3), ASMTL (095671), ASNA1 (043681), ASNS (P08243), ASS1 (P00966), ATG16L1 (Q676U5), ATG3 (Q9NT62), ATG4B (Q9Y4P1), ATG7 (O95352), ATIC (P31939), ATL3 (Q6DD88), ATM (Q13315), ATOX1 (000244), ATP1A1 (P05023), ATP1B1 (P05026), ATP1B3 (P54709), ATP2B1 (P20020), ATP2B4 (P23634), ATP5B (P06576), ATP5E (P56381), ATP5I (P56385), ATP6AP2 (075787), ATP6V0D1 (P61421), ATP6V1A (P38606), ATP6V1B2 (P21281), ATP6V1C1 (P21283), ATP6V1D (Q9Y5K8), ATP6V1E1 (P36543), ATP6V1G1 (075348), ATP6V1H (Q9UI12), ATR (Q13535), ATRN (075882), ATXN10 (Q9UBB4), B2M (P61769), B3GAT3 (O94766), B3GNT1 (O43505), B4GALT7 (Q9UBV7), BAG2 (095816), BAIAP2 (Q9UQB8),
BANF1 (075531), BAT1 (Q13838), BAT3 (P46379), BBOX1 (O75936), BCAS2 (O75934), BCAT1 (P54687), BCCIP (Q9P287), BCL2L13 (Q9BXK5), BCLAF1 (Q9NYF8), BDH2 (Q9BUT1), BICD2 (Q8TD16), BLOC1S1 (P78537), BLVRA (P53004), BLVRB (P30043), BMP1 (P13497), BOLA2 (Q9H3K6), BPGM (P07738), BPHL (Q86WA6), BPNT1 (095861), BRCC3 (P46736), BRE (Q9NXR7), BROX (Q5VW32), BRP16L (POCB43), BSG (P35613), BST1 (Q10588), BTAF1 (014981), BUB3 (O43684), BUD31 (P41223), BYSL (Q13895), BZW1 (Q7L1Q6), BZW2 (Q9Y6E2), C10orf119 (Q9BTE3), C10orf58 (Q9BRX8), C10orf76 (Q5T2E6), C11orf54 (Q9H0W9), C11orf68 (Q9H3H3), C12orf10 (Q9HB07), C14orf149 (Q96EM0), C14orf166 (Q9Y224), C15orf58 (Q6ZNW5), C16orf13 (Q96S19), C16orf80 (Q9Y6A4), C1D (Q13901), C1orf123 (Q9NWV4), C1orf50 (Q9BV19), C1orf57 (Q9BSD7), C1RL (Q9NZP8), C20orf11 (Q9NWU2), C20orf27 (Q9GZN8), C20orf4 (Q9Y312), C21orf59 (P57076), C22orf25 (Q6ICL3), C22orf28 (Q9Y3I0), C2orf29 (Q9UKZ1), C2orf79 (Q6GMV3), C3orf10 (Q8WUW1), C3orf26 (Q9BQ75), C3orf75 (Q0PNE2), C4orf27 (Q9NWY4), C4orf41 (Q7Z392), C5orf32 (Q9H1C7), C6orf130 (Q9Y530), C6orf211 (Q9H993), C7orf25 (Q9BPX7), C7orf28B (P86790), C7orf41 (Q8N3F0), C7orf59 (Q0VGL1), C9orf142 (Q9BUH6), C9orf23 (Q8N5L8), C9orf41 (Q8N4J0), C9orf64 (Q5T6V5), CA11 (O75493), CAB39 (Q9Y376), CACNA2D1 (P54289), CACYBP (Q9HB71), CAD (P27708), CADM1 (Q9BY67), CADM4 (Q8NFZ8), CALB1 (P05937), CALD1 (Q05682), CALM1 (P62158), CAMK2D (Q13557), CAND1 (Q86VP6), CAP1 (Q01518), CAPN1 (P07384), CAPN2 (P17655), CAPN5 (015484), CAPNS1 (P04632), CAPS (Q13938), CAPZA1 (P52907), CAPZA2 (P47755), CAPZB (P47756), CARHSP1 (Q9Y2V2), CARKD (Q8IW45), CARM1 (Q86X55), CARS (P49589), CASK (014936), CASP3 (P42574), CASP6 (P55212), CAT (P04040), CBFB (Q13951), CBR1 (P16152), CBR3 (O75828), CBS (P35520), CBWD2 (Q8IUF1), CBX1 (P83916), CBX3 (Q13185), CBX5 (P45973), CC2D1A (Q6P1N0), CC2D1B (Q5T0F9), CCAR1 (Q8IX12), CCBL1 (Q16773), CCBL2 (Q6YP21), CCDC22 (O60826), CCDC25 (Q86WR0), CCDC53 (Q9Y3C0), CCDC56 (Q9Y2R0), CCDC93 (Q567U6), CCNC (P24863), CCND2 (P30279), CCNH (P51946), CCT2 (P78371), CCT3 (P49368), CCT4 (P50991), CCT5 (P48643), CCT6A (P40227), CCT7 (Q99832), CCT8 (P50990), CD109 (Q6YHK3), CD151 (P48509), CD276 (Q5ZPR3), CD44 (P16070), CD47 (Q08722), CD59 (P13987), CD63 (P08962), CD81 (P60033), CD9 (P21926), CD99 (P14209), CDC16 (Q13042), CDC23 (Q9UJX2), CDC27 (P30260), CDC34 (P49427), CDC37 (Q16543), CDC40 (O60508), CDC42 (P60953), CDC5L (Q99459), CDCP1 (Q9H5V8), CDH2 (P19022), CDK1 (P06493), CDK2 (P24941), CDK2AP2 (O75956), CDK4 (P11802), CDK5 (Q00535), CDK5RAP3 (Q96JB5), CDK7 (P50613), CDKN2A (P42771), CDKN2AIP (Q9NXV6), CELSR1 (Q9NYQ6), CELSR2 (Q9HCU4), CEP57 (Q86XR8), CFL1 (P23528), CFL2 (Q9Y281), CHAC2 (Q8WUX2), CHAF1B (Q13112), CHD4 (Q14839), CHEK2 (096017), CHERP (Q8IWX8), CHID1 (Q9BWS9), CHML (P26374), CHMP1B (Q7LBR1), CHMP2A (O43633), CHMP4A (Q9BY43), CHMP4B (Q9H444), CHMP6 (Q96FZ7), CHORDC1 (Q9UHD1), CHP (Q99653), CHRAC1 (Q9NRG0), CHST14 (Q8NCH0), CHST3 (Q7LGC8), CHURC1 (Q8WUH1), CIAO1 (076071), CIAPIN1 (Q6FI81), CIRH1A (Q969X6), CKAP5 (Q14008), CKB (P12277), CLASP1 (Q7Z460), CLDN3 (015551), CLEC18B (Q6UXF7), CLIC1 (O00299), CLIC4 (Q9Y696), CLLD6 (Q5W111), CLNS1A (P54105), CLP1 (Q92989), CLPB (Q9H078), CLTA (P09496), CLTC (Q00610), CLU (P10909), CMAS (Q8NFW8), CMBL (Q96DG6), CMPK1 (P30085), CNBP (P62633), CNDP2 (Q96KP4), CNN2 (Q99439), CNN3 (Q15417), CNOT1 (A5YKK6), CNOT10 (Q9H9A5), CNOT6L (Q96LI5), CNOT7 (Q9UIV1), CNP (P09543), COASY (Q13057), COBRA1 (Q8WX92), COG1 (Q8WTW3), COG2 (Q14746), COG3 (Q96JB2), COG4 (Q9H9E3), COG5 (Q9UP83), COG6 (Q9Y2V7), COG7 (P83436), COG8 (Q96MW5), COL11A1 (P12107), COL14A1 (Q05707), COL6A1 (P12109), COMMD1 (Q8N668), COMMD10 (Q9Y6G5),
COMMD2 (Q86X83), COMMD3 (Q9UBI1), COMMD4 (Q9H0A8), COMMD5 (Q9GZQ3), COMMD6 (Q7Z4G1), COMMD7 (Q86VX2), COMMD8 (Q9NX08), COMMD9 (Q9P000), COMT (P21964), COPA (P53621), COPB1 (P53618), COPB2 (P35606), COPE (014579), COPG (Q9Y678), COPG2 (Q9UBF2), COPS2 (P61201), COPS3 (Q9UNS2), COPS4 (Q9BT78), COPS5 (Q92905), COPS6 (Q7L5N1), COPS7A (Q9UBW8), COPS7B (Q9H9Q2), COPS8 (Q99627), COPZ1 (P61923), CORO1A (P31146), CORO1B (Q9BR76), CORO1C (Q9ULV4), CORO2B (Q9UQ03), CORO7 (P57737), COTL1 (Q14019), COX5A (P20674), COX5B (P10606), COX6C (P09669), COX7A2 (P14406), CP (P00450), CPD (O75976), CPN2 (P22792), CPNE1 (Q99829), CPNE3 (075131), CPNE7 (Q9UBL6), CPSF1 (Q10570), CPSF2 (Q9P2I0), CPSF3 (Q9UKF6), CPSF7 (Q8N684), CPXM1 (Q96SM3), CRIP2 (P52943), CRK (P46108), CRLF3 (Q8IUI8), CRTAP (075718), CRYAB (P02511), CRYM (Q14894), CRYZ (Q08257), CRYZL1 (O95825), CS (O75390), CSDE1 (O75534), CSE1L (P55060), CSK (P41240), CSNK1A1 (P48729), CSNK2A1 (P68400), CSNK2B (P67870), CSRP1 (P21291), CSRP2 (Q16527), CSTB (P04080), CSTF1 (Q05048), CSTF2T (Q9H0L4), CSTF3 (Q12996), CTBP1 (Q13363), CTBP2 (P56545), CTNNA1 (P35221), CTNNB1 (P35222),
CTNNBL1 (Q8WYA6), CTNND1 (060716), CTPS (P17812), CTPS2 (Q9NRF8), CTR9 (Q6PD62), CTSC (P53634), CTSD (P07339), CTSF (Q9UBX1), CTSL2 (060911), CTU1 (Q7Z7A3), CTU2 (Q2VPK5), CUL1 (Q13616), CUL2 (Q13617), CUL3 (Q13618), CUL4A (Q13619), CUL4B (Q13620), CUL5 (Q93034), CWF19L1 (Q69YN2), CXADR (P78310), CXorf26 (Q9BVG4), CYB5A (P00167), CYCS (P99999), CYFIP1 (Q7L576), CYFIP2 (Q96F07), CYR61 (O00622), DAG1 (Q14118), DAK (Q3LXA3), DARS (P14868), DAZAP1 (Q96EP5), DBI (P07108), DBN1 (Q16643), DBNL (Q9UJU6), DBR1 (Q9UK59), DCAF7 (P61962), DCAF8 (Q5TAQ9), DCD (P81605), DCK (P27707), DCLK1 (015075), DCPS (Q96C86), DCTD (P32321), DCTN1 (Q14203), DCTN2 (Q13561), DCTN3 (O75935), DCTN4
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(P60174), TPM3 (P06753), TPM3L (A6NL28), TPM4 (P67936), TPMT (P51580), TPP1 (014773), TPP2 (P29144), TPR (P12270), TPRG1L (Q5T0D9), TPRKB (Q9Y3C4), TPT1 (P13693), TRAF2 (Q12933), TRAP1 (Q12931), TRAPPC1 (Q9Y5R8), TRAPPC2L (Q9UL33), TRAPPC3 (043617), TRAPPC4 (Q9Y296), TRAPPC5 (Q8IUR0), TRAPPC6A (O75865), TRAPPC6B (Q86SZ2), TRIM22 (Q8IYM9), TRIM25 (Q14258), TRIM28 (Q13263), TRIP12 (Q14669), TRIP13 (Q15645), TRIP6 (Q15654), TRMT1 (Q9NXH9), TRMT112 (Q9UI30), TRMT5 (Q32P41), TRMT6 (Q9UJA5), TRMT61A (Q96FX7), TRNT1 (Q96Q11), TROVE2 (P10155), TRRAP (Q9Y4A5), TSG101 (Q99816),
TSKU (Q8WUA8), TSPAN14 (Q8NG11), TSPAN4 (014817), TSPAN5 (P62079), TSPAN6 (O43657), TSPAN9 (O75954), TSSC1 (Q53HC9), TSTA3 (Q13630), TTC1 (Q99614), TTC37 (Q6PGP7), TTC38 (Q5R3I4), TTC5 (Q8N0Z6), TTC9C (Q8N5M4), TTL (Q8NG68), TTLL12 (Q14166), TTN (Q8WZ42), TTR (P02766), TTYH1 (Q9H313), TTYH2 (Q9BSA4), TTYH3 (Q9C0H2), TUBA1B (P68363), TUBA1C (Q9BQE3), TUBB (P07437), TUBB2A (Q13885), TUBB2B (Q9BVA1), TUBB2C (P68371), TUBB3 (Q13509), TUBB4 (P04350), TUBB6 (Q9BUF5), TUBG1 (P23258), TUBGCP2 (Q9BSJ2), TUBGCP3 (Q96CW5), TWF1 (Q12792), TWF2 (Q6IBS0), TXN (P10599), TXNDC17 (Q9BRA2), TXNDC9 (014530), TXNL1 (O43396), TXNL4B (Q9NX01), TXNRD1 (Q16881), TYMS (P04818), U2AF1 (Q01081), U2AF2 (P26368), UAP1 (Q16222), UBA1 (P22314), UBA2 (Q9UBT2), UBA3 (Q8TBC4), UBA5 (Q9GZZ9), UBA6 (A0AVT1), UBE2D1 (P51668), UBE2D3 (P61077), UBE2E1 (P51965), UBE2G2 (P60604), UBE2I (P63279), UBE2J2 (Q8N2K1), UBE2K (P61086), UBE2L3 (P68036), UBE2M (P61081), UBE2N (P61088), UBE2O (Q9C0C9), UBE2V1 (Q13404), UBE2V2 (Q15819), UBE2Z (Q9H832), UBE3A (Q05086), UBE4A (Q14139), UBE4B (095155), UBL3 (095164), UBL4A (P11441), UBL5 (Q9BZL1), UBR1 (Q8IWV7), UBR4 (Q5T4S7), UBTD1 (Q9HAC8), UBXN1 (Q04323), UCHL1 (P09936), UCHL3 (P15374), UCHL5 (Q9Y5K5), UCK2 (Q9BZX2), UFC1 (Q9Y3C8), UFD1L (Q92890), UFSP2 (Q9NUQ7), UGDH (060701), UGP2 (Q16851), UMPS (P11172), UNC119B (A6NIH7), UNC45A (Q9H3U1), UPF1 (Q92900), UPP1 (Q16831), UROD (P06132), UROS (P10746), USO1 (O60763), USP10 (Q14694), USP11 (P51784), USP14 (P54578), USP15 (Q9Y4E8), USP24 (Q9UPU5), USP39 (Q53GS9), USP5 (P45974),
USP7 (Q93009), USP9X (Q93008), UTP15 (Q8TED0), UXS1 (Q8NBZ7), UXT (Q9UBK9), VAC14 (Q08AM6), VAMP3 (Q15836), VAMP5 (095183), VAPA (Q9P0L0), VAPB (O95292), VARS (P26640), VASN (Q6EMK4), VASP (P50552), VAT1 (Q99536), VAV2 (P52735), VBP1 (P61758), VCAN (P13611), VCL (P18206), VCP (P55072), VIM (P08670), VPRBP (Q9Y4B6), VPS11 (Q9H270), VPS13C (Q709C8), VPS16 (Q9H269), VPS18 (Q9P253), VPS24 (Q9Y3E7), VPS25 (Q9BRG1), VPS26A (O75436), VPS26B (Q4G0F5), VPS28 (Q9UK41), VPS29 (Q9UBQ0), VPS33A (Q96AX1), VPS33B (Q9H267), VPS35 (Q96QK1), VPS36 (Q86VN1), VPS37B (Q9H9H4), VPS39 (Q96JC1), VPS45 (Q9NRW7), VPS4A (Q9UN37), VPS4B (075351), VPS53 (Q5VIR6), VRK1 (Q99986), VTA1 (Q9NP79), VWA1 (Q6PCB0), VWA5A (O00534), WARS (P23381), WASF1 (Q92558), WASL (000401), WDFY1 (Q8IWB7), WDR1 (O75083), WDR11 (Q9BZH6), WDR12 (Q9GZL7), WDR18 (Q9BV38), WDR26 (Q9H7D7), WDR33 (Q9C0J8), WDR4 (P57081), WDR43 (Q15061), WDR45L (Q5MNZ6), WDR48 (Q8TAF3), WDR5 (P61964), WDR54 (Q9H977), WDR55 (Q9H6Y2), WDR59 (Q6PJI9), WDR6 (Q9NNW5), WDR61 (Q9GZS3), WDR73 (Q6P4I2), WDR77 (Q9BQA1), WDR82 (Q6UXN9), WDR91 (A4D1P6), WDR92 (Q96MX6), WNK1 (Q9H4A3), XPNPEP1 (Q9NQW7), XPO1 (014980), XPO4 (Q9C0E2), XPO5 (Q9HAV4), XPO6 (Q96QU8), XPO7 (Q9UIA9), XPOT (O43592), XRCC1 (P18887), XRCC5 (P13010), XRCC6 (P12956), XRN2 (Q9H0D6), YARS (P54577), YBX1 (P67809), YEATS4 (095619), YES1 (P07947), YIPF4 (Q9BSR8), YKT6 (015498), YPEL5 (P62699), YRDC (Q86U90), YTHDF2 (Q9Y5A9), YWHAB (P31946), YWHAE (P62258), YWHAG (P61981), YWHAH (Q04917), YWHAQ (P27348), YWHAZ (P63104), ZC3HAV1L (Q96H79), ZCCHC3 (Q9NUD5), ZER1 (Q7Z7L7), ZFPL1 (095159), ZFR (Q96KR1), ZMAT2 (Q96NC0), ZNF259 (075312), ZW10 (O43264), ZWILCH (Q9H900), ZYG11B (Q9C0D3), ZYX (Q15942), ZZEF1 (043149).
Tabla 19: Las 100 proteínas más abundantes (nombre y número de acceso del SwissProt) observadas en los
exosomas CTX0E03
Proteínas identificadas
Número de Acceso
Actina, citoplasmática 2
P63261
Gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa
P04406
Histona H4
P62805
Isozimas piruvato quinasa M1/M2
P14618
Alfa-enolasa
P06733
Proteína HSP 90-beta de choque térmico
P08238
Proteína ribosomal S27a de ubiquitina-40S
P62979
Proteína afín de 71 kDa de choque térmico
P11142
Haptoglobina
P00738
Proteína HSP 90-alfa de choque térmico
P07900
Fosfoglicerato quinasa 1
P00558
Actina, alfa 1 de músculo cardíaco
P68032
Proteína S3 40S ribosomal
P23396
Factor 1 -alfa 1 de alargamiento
P68104
Proteína nuclear Ran de union a GTP
P62826
Histona H2B tipo 1-M
Q99879
Peptidil-prolil cis-trans isomerasa A
P62937
Profilina-1
P07737
Factor 2 de alargamiento
P13639
Ácido graso sintasa
P49327
Cadena de tubulina beta-2C
P68371
Cadena de tubulina alfa-1B
P68363
Cadena de tubulina beta
P07437
Proteína S11 ribosomal 40S
P62280
Factor eucariota de iniciación 4A-I
P60842
Subunidad theta de la proteína 1 del complejo T
P50990
Proteína theta 14-3-3
P27348
Proteína S 18 ribosomal 40S
P62269
Cadena tubulina beta-3
Q13509
Subunidad beta de la proteina 1 del complejo T
P78371
Proteína S16 ribosomal 40S
P62249
Proteína 1A/1 B de 70 kDa de choque térmico
P08107
Histona H3.2
Q71DI3
Transcetolasa
P29401
Proteína Sa ribosomal 40S
P08865
Clusterina
P10909
Proteína de unión a ácido graso, cerebro
O15540
Hemopexina
P02790
Subunidad gamma de la proteína 1 del complejo T
P49368
Cadena de tubulina beta-2B
Q9BVA1
Adenosilhomocisteinasa
P23526
Subunidad beta de la proteína 1 del complejo T
Q99832
Proteína S15a ribosomal 40S
P62244
Subunidad delta de la proteína 1 del complejo T
P50991
Vimentina
P08670
Subunidad beta-2-tipo 1 de la proteina de unión al nucleótido guanina
P63244
Proteína 3 relacionada con dihidropirimidinasa
Q14195
Factor 1-gamma de alargamiento
P26641
Fascina
Q16658
Creatina quinasa tipo B
P12277
Proteína 5 que complementa la reparación cruzada causada por rayos X
P13010
Proteína S2 ribosomal 40S
P15880
Histona H2A tipo 2-A
Q6FI13
Proteína S4 ribosomal 40S, isoforma X
P62701
Proteína zeta/delta 14-3-3
P63104
Ribonucleoproteína A1 nuclear homogénea
P09651
Antígeno CD81
P60033
Queratina, tipo I citoesquelética 14
P02533
ATP-citrato sintasa
P53396
Proteína S9 ribosomal 40S
P46781
Transgelina-2
P37802
Fructosa-bisfosfato aldolasa A
P04075
Enzima 1 que activa el modificador tipo ubiquitina
P22314
Peroxirredoxina-1
Q06830
Proteína S5 ribosomal 40S
P46782
Subunidad épsilon de la proteína 1 del complejo T
P48643
Proteína L30 ribosomal 60S
P62888
Subunidad alfa de la proteína 1 del complejo T
P17987
Proteína L12 ribosomal 60S
P30050
Cofilina-1
P23528
Ribonucleoproteínas A2/B1 nucleares heterogeneas
P22626
Factor 5A-1 de inicio de la traducción en eucariotas
P63241
Fosfoglicerato mutasa 1
P18669
Cadena pesada 1 de clatrina
Q00610
Proteína 2 relacionada con dihidropirimidinasa
Q16555
Proteína L35a ribosomal 60S
P18077
Subunidad zeta de la proteína 1 del complejo T
P40227
Carbonil reductasa [NADPH] 1
P16152
Proteína S3a ribosomal 40S
P61247
Cadena pesada de ferritina
P02794
Anexina A2
P07355
Polipéptido ligero 6 de miosina
P60660
Proteína principal de la bóbeda
Q14764
Ribonucleoproteína D0 nuclear heterogénea
Q14103
Proteína P0 ribosomal ácida 60S
P05388
Proteína 6 que complementa la reparación cruzada causada por rayos X
P12956
Proteína S20 ribosomal 40S
P60866
Proteína arginina N-metiltransferasa 1
Q99873
Proteína S10 ribosomal 40S
P46783
Transaldolasa
P37837
Histona H2B tipo 1
P23527
Triosafosfato isomerasa
P60174
Proteína S100-A6
P06703
Proteína S17 ribosomal 40S
P08708
Antígeno CD9
P21926
Filamina-A
P21333
Peptidil-prolil cis-trans isomerasa FKBP4
Q02790
Proteína de interacción 6 de muerte celular programada
Q8WUM4
Glutatión S-transferasa P
P09211
Proteína épsilon 14-3-3
P62258
Microvesículas
Las proteínas 2940 se identificaron mediante espectrometría de masas en microvesículas aisladas de las etapas 5 iniciales de un cultivo de Integra (semana 2) y se purificaron mediante centrifugación a 10.000 x g. Los nombres de los genes y los números de acceso correspondientes de SWISSPROT (entre paréntesis) de todas las 2.940 proteínas se enumeran en la Tabla 20 (en orden alfabético del nombre del gen) y las 100 proteínas más abundantes se enumeran en la Tabla 21, en orden de abundancia decreciente.
10 Tabla 20: Nombres de genes y números de acceso del SWISSPROT de todas las 2.940 proteínas identificadas en
________________microvesículas CTX0E03 (enumeradas en orden alfabético del nombre del gen)._______________
A1BG (P04217), AACS (Q86V21), AAMP (Q13685), AARS (P49588), AARSD1 (Q9BTE6), AASDHPPT (Q9NRN7), ABCA3 (Q99758), ABCC1 (P33527), ABCC4 (015439), ABCE1 (P61221), ABCF1 (Q8NE71), ABCF2 (Q9UG63), ABCF3 (Q9NUQ8), ABHD14B (Q96IU4), ABI1 (Q8IZP0), ABR (Q12979), ACAA1 (P09110), ACAA2 (P42765), ACACA (Q13085), ACADM (P11310), ACADVL (P49748), ACAT1 (P24752), ACAT2 (Q9BWD1), ACBD6 (Q9BR61), ACBD7 (Q8N6N7), ACLY (P53396), ACO1 (P21399), ACO2 (Q99798), ACOT1 (Q86TX2), ACOT13 (Q9NPJ3), ACOT7 (000154), ACOX1 (Q15067), ACOX3 (015254), ACP1 (P24666), ACSL1 (P33121), ACSL3 (O95573), ACSL4 (O60488), ACSS2 (Q9NR19), ACTC1 (P68032), ACTG1 (P63261), ACTL6A (096019), ACTN1 (P12814), ACTN4 (O43707), ACTR10 (Q9NZ32), ACTR1A (P61163), ACTR1B (P42025), ACTR2 (P61160), ACTR3 (P61158), ACY1 (Q03154), ADAM10 (014672), ADAM9 (Q13443), ADAMTS15 (Q8TE58), ADAMTS16 (Q8TE57), ADAR (P55265), ADD1 (P35611), ADD3 (Q9UEY8), ADH5 (P11766), ADK (P55263), ADO (Q96SZ5), ADPRH (P54922), ADRBK1 (P25098), ADRM1 (Q16186), ADSL (P30566), ADSS (P30520), AEBP1 (Q8IUX7), AFM (P43652), AGL (P35573), AGPS (000116), AGRN (O00468), AHCY (P23526), AHCYL1 (O43865), AHNAK (Q09666), AHNAK2 (Q8IVF2), AHSA1 (O95433), AHSG (P02765), AIDA (Q96BJ3), AIFM1 (095831), AIMP1 (Q12904), AIMP2 (Q13155), AIP (000170), AK1 (P00568), AK2 (P54819), AK3 (Q9UIJ7), AK4 (P27144), AKAP12 (Q02952), AKAP9 (Q99996), AKR1A1 (P14550), AKR1B1 (P15121), AKR1C1 (Q04828), AKR7A2 (O43488), AKR7A3 (095154), AKT1 (P31749), ALCAM (Q13740), ALDH16A1 (Q8IZ83), ALDH18A1 (P54886), ALDH2 (P05091), ALDH3A1 (P30838), ALDH7A1 (P49419), ALDH9A1 (P49189), ALDOA (P04075), ALDOC (P09972), ALKBH2 (Q6NS38), ALOX12B (O75342), AMDHD2 (Q9Y303), AMPD2 (Q01433), ANAPC1 (Q9H1A4), ANAPC4 (Q9UJX5), ANAPC5 (Q9UJX4), ANAPC7 (Q9UJX3), ANKFY1 (Q9P2R3), ANKRD17 (075179), ANKRD28 (015084), ANKRD52 (Q8NB46), ANP32A (P39687), ANP32B (Q92688), ANP32E (Q9BTT0), ANXA1 (P04083), ANXA11 (P50995), ANXA2 (P07355), ANXA3 (P12429), ANXA4 (P09525), ANXA5 (P08758), ANXA6 (P08133), ANXA7 (P20073), AP1B1 (Q10567), AP1G1 (O43747),
AP1M1 (Q9BXS5), AP1S2 (P56377), AP2A1 (O95782), AP2A2 (O94973), AP2B1 (P63010), AP2M1 (Q96CW1),
AP2S1 (P53680), AP3B1 (000203), AP3D1 (014617), AP3M1 (Q9Y2T2), AP3S1 (Q92572), AP4S1 (Q9Y587), APEH (P13798), APEX1 (P27695), API5 (Q9BZZ5), APIP (Q96GX9), APMAP (Q9HDC9), AP0A2 (P02652), AP0BEC3C (Q9NRW3), APOH (P02749), AP0L2 (Q9BQE5), APPL1 (Q9UKG1), APRT (P07741), AQR (060306), ARAF (P10398), ARCN1 (P48444), ARF1 (P84077), ARF4 (P18085), ARF6 (P62330), ARFGAP2 (Q8N6H7), ARFIP1 (P53367), ARFIP2 (P53365), ARG1 (P05089), ARHGAP1 (Q07960), ARHGAP5 (Q13017), ARHGDIA (P52565), ARHGEF1 (Q92888), ARHGEF10 (015013), ARHGEF6 (Q15052), ARHGEF7 (Q14155), ARIH1 (Q9Y4X5), ARIH2 (095376), ARL1 (P40616), ARL2 (P36404), ARL3 (P36405), ARL6IP1 (Q15041), ARL8A (Q96BM9), ARL8B (Q9NVJ2), ARMC10 (Q8N2F6), ARMC6 (Q6NXE6), ARMC8 (Q8IUR7), ARMC9 (Q7Z3E5), ARPC1A (Q92747), ARPC1B (015143), ARPC2 (015144), ARPC3 (015145), ARPC4 (P59998), ARPC5 (015511), ARPC5L (Q9BPX5), ASAH1 (Q13510), ASCC1 (Q8N9N2), ASCC3 (Q8N3C0), ASMTL (095671), ASNA1 (043681), ASNS (P08243), ASPSCR1 (Q9BZE9), ASS1 (P00966), ATAD3A (Q9NVI7), ATE1 (095260), ATG101 (Q9BSB4), ATG16L1 (Q676U5), ATG3 (Q9NT62), ATG4B (Q9Y4P1), ATG7 (095352), ATIC (P31939), ATL3 (Q6DD88), ATM (Q13315), AT0X1 (000244), ATP1A1 (P05023), ATP1B1 (P05026), ATP1B3 (P54709), ATP2A2 (P16615), ATP2B1 (P20020), ATP2B4 (P23634), ATP5A1 (P25705), ATP5B (P06576), ATP5C1 (P36542), ATP5E (P56381), ATP5F1 (P24539), ATP5H (075947), ATP5I (P56385), ATP5L (075964), ATP50 (P48047), ATP6AP1 (Q15904), ATP6AP2 (075787), ATP6V0A1 (Q93050), ATP6V0D1 (P61421), ATP6V1A (P38606), ATP6V1B2 (P21281), ATP6V1C1 (P21283), ATP6V1D (Q9Y5K8), ATP6V1E1 (P36543), ATP6V1G1 (075348), ATP6V1H (Q9UI12), ATR (Q13535), ATRN (075882), ATXN10 (Q9UBB4), B2M (P61769), B3GAT3 (094766), B3GNT1 (043505), BAG2 (095816), BAG5 (Q9UL15), BAIAP2 (Q9UQB8), BANF1 (075531), BAT1 (Q13838), BAT3 (P46379), BCAM (P50895), BCAS2 (075934), BCAT1 (P54687), BCCIP (Q9P287), BCL2L12 (Q9HB09), BDH2 (Q9BUT1), BICD2 (Q8TD16), BLMH (Q13867), BLVRA (P53004), BLVRB (P30043), BMP1 (P13497), B0LA2 (Q9H3K6), B0P1 (Q14137), BPGM (P07738), BPNT1 (095861), BRCC3 (P46736), BRE (Q9NXR7), BRIX1 (Q8TDN6), BR0X (Q5VW32), BRP16L (P0CB43), BSG (P35613), BST1 (Q10588), BTAF1 (014981), BUB3 (043684), BUD31 (P41223), BYSL (Q13895), BZW1 (Q7L1Q6), BZW2 (Q9Y6E2), C10orf119 (Q9BTE3), C10orf58 (Q9BRX8), C10orf76 (Q5T2E6), C11orf54 (Q9HOW9), C11orf68 (Q9H3H3), C12orf10 (Q9HB07), C12orf57 (Q99622), C14orf149 (Q96EM0), C14orf166 (Q9Y224), C14orf21 (Q86U38), C15orf58 (Q6ZNW5), C16orf13 (Q96S19), C16orf61 (Q9NRP2), C16orf80 (Q9Y6A4), C18orf21 (Q32NC0), C18orf8 (Q96DM3), C1orf123 (Q9NWV4), C1orf128 (Q9GZP4), C1orf57 (Q9BSD7), C20orf11 (Q9NWU2), C20orf4 (Q9Y312), C21orf33 (P30042), C21orf59 (P57076), C22orf28 (Q9Y3I0), C3orf10 (Q8WUW1), C3orf26 (Q9BQ75), C3orf75 (Q0PNE2), C4orf27 (Q9NWY4), C4orf41 (Q7Z392), C4orf43 (Q96EY4), C5orf33 (Q4G0N4), C6orf211 (Q9H993), C7orf28B (P86790), C7orf50 (Q9BRJ6), C7orf59 (Q0VGL1), C8orf33 (Q9H7E9), C9orf142 (Q9BUH6), C9orf23 (Q8N5L8), C9orf41 (Q8N4J0), C9orf64 (Q5T6V5), CA11 (075493), CA12 (043570), CA2 (P00918), CAB39 (Q9Y376), CACNA2D1 (P54289), CACYBP (Q9HB71), CAD (P27708), CADM1 (Q9BY67), CADM4 (Q8NFZ8), CALB1 (P05937), CALD1 (Q05682), CALM1 (P62158), CALR (P27797), CALU (043852), CAMK1 (Q14012), CAMK2D (Q13557), CAMKV (Q8NCB2), CAND1 (Q86VP6), CANX (P27824), CAP1 (Q01518), CAPN1 (P07384), CAPN2 (P17655), CAPN5 (015484), CAPN7 (Q9Y6W3), CAPNS1 (P04632), CAPRIN1 (Q14444), CAPS (Q13938), CAPZA1 (P52907), CAPZA2 (P47755), CAPZB (P47756), CARHSP1 (Q9Y2V2),
CARKD (Q8IW45), CARM1 (Q86X55), CARS (P49589), CASK (014936), CASP14 (P31944), CASP3 (P42574), CASP7 (P55210), CAT (P04040), CBFB (Q13951), CBR1 (P16152), CBR3 (075828), CBS (P35520), CBX1 (P83916), CBX3 (Q13185), CBX5 (P45973), CC2D1A (Q6P1N0), CCAR1 (Q8IX12), CCBL2 (Q6YP21), CCDC102B (Q68D86), CCDC22 (060826), CCDC25 (Q86WR0), CCDC93 (Q567U6), CCND2 (P30279), CCNY (Q8ND76),
CCT2 (P78371), CCT3 (P49368), CCT4 (P50991), CCT5 (P48643), CCT6A (P40227), CCT7 (Q99832), CCT8 (P50990), CD109 (Q6YHK3), CD151 (P48509), CD276 (Q5ZPR3), CD44 (P16070), CD46 (P15529), CD47 (Q08722), CD58 (P19256), CD59 (P13987), CD63 (P08962), CD81 (P60033), CD9 (P21926), CD97 (P48960), CD99 (P14209), CDC123 (075794), CDC16 (Q13042), CDC23 (Q9UJX2), CDC34 (P49427), CDC37 (Q16543), CDC40 (060508), CDC42 (P60953), CDC42BPB (Q9Y5S2), CDC5L (Q99459), CDCP1 (Q9H5V8), CDH2 (P19022), CDK1 (P06493), CDK2 (P24941), CDK4 (P11802), CDK5 (Q00535), CDK5RAP3 (Q96JB5), CDK7 (P50613), CDKN2A (P42771), CDKN2AIP (Q9NXV6), CECR5 (Q9BXW7), CELF1 (Q92879), CELSR1 (Q9NYQ6), CELSR2 (Q9HCU4), CFL1 (P23528), CFL2 (Q9Y281), CHCHD3 (Q9NX63), CHD4 (Q14839), CHEK2 (096017), CHERP (Q8IWX8),
CHID1 (Q9BWS9), CHMP1A (Q9HD42), CHMP1B (Q7LBR1), CHMP2A (043633), CHMP4A (Q9BY43), CHMP4B (Q9H444), CHMP5 (Q9NZZ3), CHMP6 (Q96FZ7), CHN1 (P15882), CHORDC1 (Q9UHD1), CHP (Q99653), CHRAC1 (Q9NRG0), CHST3 (Q7LGC8), CIAO1 (076071), CIAPIN1 (Q6FI81), CIRBP (Q14011), CIRH1A (Q969X6), CISD2 (Q8N5K1), CKAP4 (Q07065), CKAP5 (Q14008), CKB (P12277), CLASP1 (Q7Z460), CLIC1 (000299), CLIC4 (Q9Y696), CLLD6 (Q5W111), CLNS1A (P54105), CLPB (Q9H078), CLTA (P09496), CLTC (Q00610), CLTCL1 (P53675), CLU (P10909), CMBL (Q96DG6), CMC1 (Q7Z7KO), CMPK1 (P30085), CMTM6 (Q9NX76), CNBP (P62633), CNDP2 (Q96KP4), CNN2 (Q99439), CNN3 (Q15417), CNNM3 (Q8NE01), CNOT1 (A5YKK6), CNOT10 (Q9H9A5), CNOT6L (Q96LI5), CNP (P09543), COASY (Q13057), COBRA1 (Q8WX92), COG1 (Q8WTW3), COG3 (Q96JB2), COG4 (Q9H9E3), COG5 (Q9UP83), COG6 (Q9Y2V7), COL11A1 (P12107), COL14A1 (Q05707), COL18A1 (P39060), COL6A1 (P12109), COMMD10 (Q9Y6G5), COMMD2 (Q86X83), COMMD3 (Q9UBI1),
COMMD5 (Q9GZQ3), COMMD8 (Q9NX08), COMMD9 (Q9P000), COMT (P21964), COPA (P53621), COPB1 (P53618), COPB2 (P35606), COPE (014579), COPG (Q9Y678), COPG2 (Q9UBF2), COPS2 (P61201), COPS3 (Q9UNS2), COPS4 (Q9BT78), COPS5 (Q92905), COPS6 (Q7L5N1), COPS7A (Q9UBW8), COPS7B (Q9H9Q2), COPS8 (Q99627), CORO1B (Q9BR76), CORO1C (Q9ULV4), CORO2B (Q9UQ03), CORO7 (P57737), COTL1 (Q14019), COX4NB (043402), COX5A (P20674), COX5B (P10606), COX6C (P09669), CP (P00450), CPD (075976), CPNE1 (Q99829), CPNE2 (Q96FN4), CPNE3 (075131), CPNE4 (Q96A23), CPNE7 (Q9UBL6), CPOX (P36551), CPSF1 (Q10570), CPSF2 (Q9P2I0), CPSF3 (Q9UKF6), CPSF3L (Q5TA45), CPSF6 (Q16630), CPSF7 (Q8N684), CPXM1 (Q96SM3), CRABP2 (P29373), CRIP2 (P52943), CRK (P46108), CRLF3 (Q8IUI8), CRNKL1
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SLC3A2 (P08195), SLC44A2 (Q8IWA5), SLC4A2 (P04920), SLC4A7 (Q9Y6M7), SLC5A3 (P53794), SLC5A6 (Q9Y289), SLC6A8 (P48029), SLC7A1 (P30825), SLC7A5 (Q01650), SLC9A3R1 (O14745), SLC9A3R2 (Q15599), SLIRP (Q9GZT3), SLK (Q9H2G2), SMAD1 (Q15797), SMAD2 (Q15796), SMARCA4 (P51532), SMARCA5 (O60264), SMARCB1 (Q12824), SMARCC1 (Q92922), SMARCC2 (Q8TAQ2), SMARCD2 (Q92925), SMC1A (Q14683), SMC2 (O95347), SMC3 (Q9UQE7), SMC4 (Q9NTJ3), SMC5 (Q8IY18), SMCHD1 (A6NHR9), SMEK1 (Q6IN85), SMG1 (Q96Q15), SMN1 (Q16637), SMS (P52788), SMU1 (Q2TAY7), SMYD3 (Q9H7B4), SMYD5 (Q6GMV2), SNAP23 (O00161), SND1 (Q7KZF4), SNF8 (Q96H20), SNRNP200 (O75643), SNRNP40 (Q96DI7), SNRNP70 (P08621), SNRPA1 (P09661), SNRPB (P14678), SNRPB2 (P08579), SNRPD1 (P62314), SNRPD2 (P62316), SNRPD3 (P62318), SNRPE (P62304), SNRPF (P62306), SNRPG (P62308), SNTB1 (Q13884), SNTB2 (Q13425), SNX1 (Q13596), SNX12 (Q9UMY4), SNX17 (Q15036), SNX18 (Q96RF0), SNX2 (O60749), SNX27 (Q96L92), SNX3 (O60493), SNX5 (Q9Y5X3), SNX6 (Q9UNH7), SNX9 (Q9Y5X1), SOD1 (P00441), SOD2 (P04179), SORD (Q00796), SORT1 (Q99523), SPATS2L (Q9NUQ6), SPC24 (Q8NBT2), SPCS2 (Q15005), SPCS3 (P61009), SPG21 (Q9NZD8), SPIN1 (Q9Y657), SPR (P35270), SPRR1B (P22528), SPRR2E (P22531), SPTAN1 (Q13813), SPTBN1 (Q01082), SPTBN2 (O15020), SR140 (015042), SRBD1 (Q8N5C6), SRCRL (A1L4H1), SRGAP2 (O75044), SRI (P30626), SRM_______
(P19623), SRP14 (P37108), SRP19 (P09132), SRP54 (P61011), SRP68 (Q9UHB9), SRP72 (O76094), SRP9 (P49458), SRPK1 (Q96SB4), SRPR (P08240), SRPRB (Q9Y5M8), SRPX (P78539), SRPX2 (O60687), SRR (Q9GZT4), SRRM1 (Q8IYB3), SRRM2 (Q9UQ35), SRRT (Q9BXP5), SRSF1 (Q07955), SRSF10 (O75494), SRSF11 (Q05519), SRSF2 (Q01130), SRSF3 (P84103), SRSF5 (Q13243), SRSF6 (Q13247), SRSF7 (Q16629), SRSF9 (Q13242), SRXN1 (Q9BYN0), SSB (P05455), SSBP1 (Q04837), SSR1 (P43307), SSR3 (Q9UNL2), SSRP1 (Q08945), SSSCA1 (O60232), SSU72 (Q9NP77), ST13 (P50502), STAG1 (Q8WVM7), STAM (Q92783), STAMBP (O95630), STAT1 (P42224), STAT2 (P52630), STAT3 (P40763), STAU1 (O95793), STIP1 (P31948), STK10 (O94804), STK24 (Q9Y6E0), STK25 (000506), STK38 (Q15208), STK38L (Q9Y2H1), STOM (P27105), STOML2 (Q9UJZ1), ST0N2 (Q8WXE9), STRAP (Q9Y3F4), STT3A (P46977), STUB1 (Q9UNE7), STX12 (Q86Y82), STX4 (Q12846), STX5 (Q13190), STXBP1 (P61764), STXBP3 (000186), STYX (Q8WUJ0), SUBI (P53999), SUCLA2 (Q9P2R7), SUCLG2 (Q96I99), SUGT1 (Q9Y2Z0), SULF2 (Q8IWU5), SUMOI (P63165), SUPT16H (Q9Y5B9), SUPT4H1 (P63272), SUPT5H (000267), SUPT6H (Q7KZ85), SUSD5 (060279), SVEP1 (Q4LDE5), SVIL (095425), SWAP70 (Q9UH65), SYMPK (Q92797), SYNCRIP (060506), SYNGR2 (043760), SYNJ2BP (P57105), SYNM (015061), SYPL1 (Q16563), TAB1 (Q15750), TAF9 (Q9Y3D8), TAGLN (Q01995), TAGLN2 (P37802), TALD01 (P37837), TA0K1 (Q7L7X3), TARDBP (Q13148), TARS (P26639), TATDN1 (Q6P1N9), TAX1BP3 (014907), TBC1D13 (Q9NVG8), TBC1D15 (Q8TC07), TBC1D23 (Q9NUY8), TBC1D24 (Q9ULP9), TBC1D4 (060343), TBC1D9B (Q66K14), TBCA (075347), TBCB (Q99426), TBCC (Q15814), TBCD (Q9BTW9), TBCE (Q15813), TBK1 (Q9UHD2), TBL1XR1 (Q9BZK7), TBL2 (Q9Y4P3), TBL3 (Q12788), TBPL1 (P62380), TCEA1 (P23193), TCEB1 (Q15369), TCEB2 (Q15370), TCERG1 (014776), TCF25 (Q9BQ70), TCP1 (P17987), TEL02 (Q9Y4R8), TEX10 (Q9NXF1), TEX15 (Q9BXT5), TF (P02787), TFCP2 (Q12800), TFG (Q92734), TFRC (P02786), TGFB1 (P01137), TGFB2 (P61812), TGFBI (Q15582), TGFBRAP1 (Q8WUH2), TGM1 (P22735), TGM3 (Q08188), TH1L (Q8IXH7), THBS1 (P07996), THBS3 (P49746), THG1L (Q9NWX6), THOC2 (Q8NI27), THOC3 (Q96J01), THOC5 (Q13769), THOC6 (Q86W42), THOC7 (Q6I9Y2), THOP1 (P52888), THTPA (Q9BU02), THUMPD1 (Q9NXG2), THUMPD3 (Q9BV44), THY1 (P04216), THYN1 (Q9P016), TIA1 (P31483), TIAL1 (Q01085), TIGAR (Q9NQ88), TIMM13 (Q9Y5L4), TIMM44 (043615), TIMM50 (Q3ZCQ8), TIMM8A (060220), TIMM8B (Q9Y5J9), TIMM9 (Q9Y5J7), TIMP2 (P16035), TIPRL (075663), TJP1 (Q07157), TKT (P29401), TLN1 (Q9Y490), TLN2 (Q9Y4G6), TM9SF3 (Q9HD45), TMED10 (P49755), TMED2 (Q15363), TMED5 (Q9Y3A6), TMED7 (Q9Y3B3), TMED9 (Q9BVK6), TMEFF2 (Q9UIK5), TMEM132A (Q24JP5), TMEM2 (Q9UHN6), TMEM30A (Q9NV96), TMEM33 (P57088), TMOD3 (Q9NYL9), TMPO (P42166), TMX1 (Q9H3N1), TNC (P24821), TNKS1BP1 (Q9C0C2), TNPO1 (Q92973), TNPO2 (014787), TNPO3 (Q9Y5L0), TOM1L2 (Q6ZVM7), TOMM20 (Q15388), TOMM34 (Q15785), TOMM5 (Q8N4H5), TOMM70A (094826), TOP1 (P11387), TOP2A (P11388), TOP2B (Q02880), TP53I3 (Q53FA7), TP53RK (Q96S44), TPBG (Q13641), TPD52 (P55327), TPI1 (P60174), TPM1 (P09493), TPM2 (P07951), TPM3 (P06753), TPM3L (A6NL28), TPM4 (P67936), TPP2 (P29144), TPT1 (P13693), TRA2A (Q13595), TRA2B (P62995), TRAF2 (Q12933), TRAP1 (Q12931), TRAPPC1 (Q9Y5R8), TRAPPC2L (Q9UL33), TRAPPC3 (043617), TRAPPC4 (Q9Y296), TRAPPC5 (Q8IUR0), TRIM16 (095361), TRIM22 (Q8IYM9), TRIM25 (Q14258), TRIM26 (Q12899), TRIM28 (Q13263), TRIM47 (Q96LD4), TRIM5 (Q9C035), TRIO (075962), TRIP13 (Q15645), TRIP6 (Q15654), TRMT1 (Q9NXH9), TRMT112 (Q9UI30), TRMT5 (Q32P41), TRMT6 (Q9UJA5), TRMT61A (Q96FX7), TRNT1 (Q96Q11), TROVE2 (P10155), TRRAP (Q9Y4A5), TSG101 (Q99816), TSKU (Q8WUA8), TSN (Q15631), TSPAN14 (Q8NG11), TSPAN6 (043657), TSR1 (Q2NL82), TSSC1 (Q53HC9), TSTA3 (Q13630), TTC1 (Q99614), TTC15 (Q8WVT3), TTC27 (Q6P3X3),
TTC37 (Q6PGP7), TTC38 (Q5R3I4), TTC7B (Q86TV6), TTC9C (Q8N5M4), TTL (Q8NG68), TTLL12 (Q14166), TTN (Q8WZ42), TTYH1 (Q9H313), TTYH3 (Q9C0H2), TUBA1B (P68363), TUBA4A (P68366), TUBB (P07437), TUBB2B (Q9BVA1), TUBB2C (P68371), TUBB3 (Q13509), TUBB6 (Q9BUF5), TUBG1 (P23258), TUBGCP2 (Q9BSJ2), TUBGCP3 (Q96CW5), TUFM (P49411), TWF1 (Q12792), TWF2 (Q6IBS0), TXN (P10599), TXNDC17 (Q9BRA2), TXNDC5 (Q8NBS9), TXNDC9 (014530), TXNL1 (043396), TXNRD1 (Q16881), TYK2 (P29597), TYMS (P04818), U2AF1 (Q01081), U2AF2 (P26368), UAP1 (Q16222), UBA1 (P22314), UBA2 (Q9UBT2), UBA3 (Q8TBC4), UBA52 (P62987), UBA6 (A0AVT1), UBE2D1 (P51668), UBE2D3 (P61077), UBE2E1 (P51965), UBE2G2 (P60604), UBE2I (P63279), UBE2J2 (Q8N2K1), UBE2K (P61086), UBE2L3 (P68036), UBE2M (P61081), UBE2N (P61088), UBE2O (Q9C0C9), UBE2S (Q16763), UBE2V1 (Q13404), UBE2V2 (Q15819), UBE3A (Q05086), UBE3C (Q15386), UBE4A (Q14139), UBE4B (095155), UBFD1 (014562), UBL3 (095164), UBL4A (P11441), UBL5 (Q9BZL1), UBLCP1 (Q8WVY7), UBP1 (Q9NZI7), UBQLN2 (Q9UHD9), UBR1 (Q8IWV7), UBR4 (Q5T4S7), UBTD1 (Q9HAC8), UBXN1 (Q04323), UBXN6 (Q9BZV1), UCHL1 (P09936), UCHL3 (P15374), UCHL5 (Q9Y5K5), UCK2 (Q9BZX2), UFC1 (Q9Y3C8), UFD1L (Q92890), UGDH (060701), UGGT1 (Q9NYU2), UGP2 (Q16851), ULK3 (Q6PHR2), UMPS (P11172), UNC119B (A6NIH7), UNC45A (Q9H3U1), UPF1 (Q92900), UPP1 (Q16831), UQCRC1 (P31930),
UQCRC2 (P22695), UQCRFS1 (P47985), URB1 (060287), URB2 (Q14146), UROD (P06132), UROS (P10746), USO1 (060763), USP10 (Q14694), USP11 (P51784), USP13 (Q92995), USP14 (P54578), USP15 (Q9Y4E8),
USP24 (Q9UPU5), USP39 (Q53GS9), USP5 (P45974), USP7 (Q93009), USP9X (Q93008), UTP15 (Q8TED0), UTP18 (Q9Y5J1), UTP20 (075691), UTP6 (Q9NYH9), UTRN (P46939), UXS1 (Q8NBZ7), UXT (Q9UBK9), VAC14 (Q08AM6), VAMP3 (Q15836), VAMP5 (095183), VAPA (Q9P0L0), VAPB (095292), VARS (P26640), VASP (P50552), VAT1 (Q99536), VAV2 (P52735), VBP1 (P61758), VCAN (P13611), VCL (P18206), VCP (P55072),
VDAC1 (P21796), VDAC2 (P45880), VDAC3 (Q9Y277), VIM (P08670), VPRBP (Q9Y4B6), VPS11 (Q9H270), VPS13A (Q96RL7), VPS13C (Q709C8), VPS16 (Q9H269), VPS18 (Q9P253), VPS24 (Q9Y3E7), VPS25 (Q9BRG1), VPS26A (075436), VPS26B (Q4G0F5), VPS28 (Q9UK41), VPS29 (Q9UBQ0), VPS33A (Q96AX1), VPS33B (Q9H267), VPS35 (Q96QK1), VPS36 (Q86VN1), VPS37B (Q9H9H4), VPS39 (Q96JC1), VPS41 (P49754), VPS45 (Q9NRW7), VPS4A (Q9UN37), VPS4B (075351), VPS53 (Q5VIR6), VPS8 (Q8N3P4), VRK1 (Q99986), VTA1 (Q9NP79), VWA1 (Q6PCB0), VWA5A (000534), WARS (P23381), WASF2 (Q9Y6W5), WASL (000401), WBSCR22 (043709), WDFY1 (Q8IWB7), WDR1 (075083), WDR11 (Q9BZH6), WDR12 (Q9GZL7), WDR18 (Q9BV38), WDR26
(Q9H7D7), WDR3 (Q9UNX4), WDR36 (Q8NI36), WDR4 (P57081), WDR43 (Q15061), WDR45L (Q5MNZ6), WDR48 (Q8TAF3), WDR5 (P61964), WDR54 (Q9H977), WDR6 (Q9NNW5), WDR61 (Q9GZS3), WDR73 (Q6P4I2), WDR74 (Q6RFH5), WDR75 (Q8IWA0), WDR77 (Q9BQA1), WDR82 (Q6UXN9), WDR92 (Q96MX6), WHSC2 (Q9H3P2), WRNIP1 (Q96S55), XP32 (Q5T750), XPC (Q01831), XPNPEP1 (Q9NQW7), XPO1 (O14980), XPO4 (Q9C0E2), XPO5 (Q9HAV4), XPO6 (Q96QU8), XPO7 (Q9UIA9), XPOT (O43592), XRCC1 (P18887), XRCC5 (P13010), XRCC6 (P12956), XRN2 (Q9H0D6), YARS (P54577), YBX1 (P67809), YES1 (P07947), YKT6 (O15498), YRDC (Q86U90), YTHDC1 (Q96MU7), YTHDF2 (Q9Y5A9), YWHAB (P31946), YWHAE (P62258), YWHAG (P61981), YWHAH (Q04917), YWHAQ (P27348), YWHAZ (P63104), ZC3H15 (Q8WU90), ZC3HAV1 (Q7Z2W4), ZC3HAV1L (Q96H79), ZCCHC3 (Q9NUD5), ZFAND1 (Q8TCF1), ZFR (Q96KR1), ZMAT2 (Q96NC0), ZNF259 (O75312), ZNF326 (Q5BKZ1), ZNF330 (Q9Y3S2), ZNF622 (Q969S3), ZNF765 (Q7L2R6), ZNFX1 (Q9P2E3), ZW10 (O43264), ZWILCH (Q9H900), ZYG11B (Q9C0D3), ZYX (Q15942).________________________________________________________
Tabla 21: Las 100 proteínas más abundantes (nombre y número de acceso del SwissProt) en microvesículas
CTX0E03
Proteínas identificadas
Número de acceso
Actina, citoplasmática 2
P63261
Histona H4
P62805
Histona H2B
Q99879
Histona H3.2
Q71DI3
Histona H2B tipo 1
P23527
Gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa
P04406
Histona H2A tipo 2-A
Q6FI13
Proteína S27a ribosomal de ubiquitina-40S
P62979
Anexina A2
P07355
Alfa-enolasa
P06733
Isozimas piruvato quinasa M1/M2
P14618
Proteína L6 ribosomal 60S
Q02878
Histona H2B tipo 2-E
Q16778
Proteína afín de 71 kDa de choque térmico
P11142
Actina 1, alpha de músculo cardíaco
P68032
Proteína HSP 90-beta de choque térmico
P08238
Histona H2B tipo 1-J
P06899
Factor 1 -alfa 1 de alargamiento
P68104
Cadena de tubulina beta-2C
P68371
Proteína L18 ribosomal 60S
Q07020
Cadena de tubulina beta
P07437
Proteína S2 ribosomal 40S
P15880
Proteína S11 ribosomal 40S
P62280
Histona H2B tipo 3-B
Q8N257
Cadena de tubulina alfa-1B
P68363
Proteína S3 ribosomal 40S
P23396
Proteína S3a ribosomal 40S
P61247
Histona H2A tipo 1-D
P20671
Factor 2 de alargamiento
P13639
Proteína HSP 90-alfa de choque térmico
P07900
Proteína nuclear Ran de unión a GTP
P62826
Proteína L4 ribosomal 60S
P36578
Proteína S9 ribosomal 40S
P46781
Profilina-1
P07737
Proteína L13a ribosomal 60S
P40429
Fosfoglicerata quinasa 1
P00558
Ácido graso sintasa
P49327
Anexina A1
P04083
Histona H2A.Z
P0C0S5
Vimentina
P08670
Proteína S6 ribosomal 40S
P62753
Moesina
P26038
Peptidil-prolil cis-trans isomerasa70 A
P62937
Proteína L26 ribosomal 60S
P61254
Proteína L3 ribosomal 60S
P39023
Proteína S8 ribosomal 40S
P62241
Proteína L28 ribosomal 60S
P46779
Ezrina
P15311
Proteína S4 ribosomal 40S, isoforma X
P62701
Proteína L7a ribosomal 60S
P62424
Proteína L13 ribosomal 60S
P26373
Proteína L7 ribosomal 60S
P18124
Proteína S23 ribosomal 40S
P62266
Proteína L5 ribosomal 60S
P46777
Factor 4A-I de iniciación eucariota
P60842
Proteína S24 ribosomal 40S
P62847
Cadena de tubulina beta-2B
Q9BVA1
Proteína L8 ribosomal 60S
P62917
Proteína L15 ribosomal 60S
P61313
Proteína L10 ribosomal 60S
P27635
Peroxirredoxina-1
Q06830
Queratina, tipo I citoesquelética 14
P02533
Proteína theta 14-3-3
P27348
Proteína S18 ribosomal 40S
P62269
Transcetolasa
P29401
Proteína L24 ribosomal 60S
P83731
Histona H1.5
P16401
Cofilina-1
P23528
Proteína 3 relacionada con dihidropirimidinasa
Q14195
Proteína L21 ribosomal 60S
P46778
Proteína L36 ribosomal 60S
Q9Y3U8
Subunidad alfa 1 de ATPasa que transporta sodio/potasio
P05023
Proteína S16 ribosomal 40S
P62249
Subunidad gamma de la proteína 1 del complejo T
P49368
Ribonucleoproteína nuclear A1 heterogénea
P09651
Proteína L14 ribosomal 60S
P50914
Proteína 1A/1B de 70 kDa de choque térmico
P08107
Subunidad theta de la proteína 1 del complejo T
P50990
Proteína L30 ribosomal 60S
P62888
Proteína S100-A6
P06703
Proteína SA ribosomal 40S
P08865
Antígeno CD44
P16070
Proteína L35a ribosomal 60S
P18077
Cadena de tubulina beta-3
Q13509
Subunidad delta de la proteína 1 del complejo T
P50991
Cadena pesada del antígeno de la superficie celular 4F2
P08195
Subunidad beta de la proteína 1 del complejo T
P78371
Miosina-9
P35579
Adenosilhomocisteinasa
P23526
Filamina-A
P21333
Proteína de unión de ácido graso, cerebro
O15540
Sustrato quinasa C rico en alanina miristoilada
P29966
Subunidad eta de la proteína 1 del complejo T
Q99832
Fascina
Q16658
Fructosa-bisfosfato aldolasa A
P04075
Proteína L27 ribosomal 60S
P61353
Proteína L17 ribosomal 60S
P18621
5
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30
35
40
45
50
55
60
Ribonucleoproteínas A2/B1 nucleares heterogéneas
P22626
Proteína L10a ribosomal 60S
P62906
Proteína L35 ribosomal 60S
P42766
Discusión de datos proteómicos
CD63 (también conocida como MLA1 y TSPAN30), TSG101 (también conocida como subunidad TSG101 del complejo ESCRT-I), CD109 (también conocida como proteína de unión TGF-beta-1 de 150 kDa) y thy-1 (también conocida como CD90) tanto en exosomas como microvesículas.
También se detectaron otras tetraspaninas: Tetraspanina-4, 5, 6, 9 y 14 se detectaron en la fracción del exosoma; las tetraspaninas-6 y 14 se detectaron en las microvesículas.
CD133 (también conocida como AC133, Prominina-1, PROM1, PROML1 y MSTP061) se detectó en los exosomas pero no en las microvesículas.
CD53 (también conocida como MOX44 y TSPAN25), CD82 (también conocida como KAI1, SAR2, ST6 y TSPAN27), CD37 (también conocida como TSPAN26) y ligando CD40 (también conocido como CD40LG, CD40L y TNFSF5) no fueron detectados en los exosomas o las microvesículas.
Se detectaron Nestin, GFAP y cadena de tubulina beta-3 (también conocida como TUBB3) tanto en la fracción de exosoma como en la de microvesícula, siendo la cadena de tubulina beta-3 particularmente prominente dentro de las 100 proteínas principales en ambas fracciones. No se detectaron Sox2, DCX, GALC, GDNF e IDO.
No se detectaron las selectinas y TNFRI (también conocidas como receptor 1 de TNF, TNFRSF1A, TNFAR y TNFR1).
Se detectaron integrina alfa-2, 3, 4, 5, 6, 7, Ve integrina beta-1, 4 y 8 en ambas fracciones de exosoma y microvesícula. Integrina beta-3 y 5 se detectaron solo en las microvesículas.
Se detectaron antígenos del MHC de Clase I (por ejemplo, HLA_A1, HLA-A2 y HLA-B27) tanto en los exosomas como en las microvesículas.
Se detectaron moléculas de adhesión celular (por ejemplo, CADM1, CADM4, ICAM1, JAM3, L1CAM, NCAM) tanto en los exosomas como en las microvesículas.
Se detectaron proteínas citoesqueléticas (egactina, vimentina, queratinas, cateninas, distroflucano, polipéptido del neurofilamento, proteína asociada a microtúbulos, tubulina, desmoplaquina, plectina, placofilina, septina, espectrina, talina, vinculina y zixina) tanto en el exosoma como en las fracciones de microvesículas.
Se detectaron GTPasas, clatrina, chaperonas, proteínas de choque térmico (por ejemplo, Hsp90, Hsp70), factores de empalme, factores de traducción, anexinas y factores de crecimiento (por ejemplo, TGF-beta) tanto en los exosomas como en las microvesículas.
Se detectaron Galectina-3, TIMP-1, trombospondina-1, receptor de EGF y CSK tanto en los exosomas como en las microvesículas.
La Figura 18 compara los datos proteómicos de los exosomas y las microvesículas. La Figura 18A ilustra el número de proteínas únicas dentro de cada población de micropartículas, aisladas de la semana 2 del sistema de cultivo Integra. La Figura 18B compara los procesos biológicos asociados con las proteínas identificadas dentro de cada población de micropartículas, aislada de la semana 2 del sistema Integra. Las proteínas identificadas dentro de exosomas y microvesículas se asocian con procesos biológicos muy similares.
Las proteínas asociadas con el metabolismo de biotina solo se encontraron en exosomas y las proteínas implicadas en la biosíntesis de triptófano y el metabolismo de taurina/ácido alfa-linolénico solo se identificaron en microvesículas.
La Figura 18C compara el proteoma CTX0E03 con el proteoma del exosoma de células madre mesenquimales descrito en Lai et al. 2012, en el que se identificaron un total de 857 proteínas en exosomas liberados de células madre mesenquimales.
La Figura 18D compara los procesos biológicos asociados con las proteínas identificadas dentro de los exosomas derivados de MSC (Lim 2012) con los exosomas derivados de células madre neurales de la invención. Los tres procesos biológicos que se encuentran asociados con los exosomas derivados de MSC solo son (en orden decreciente de importancia): Asma; biosíntesis de fenilalanina, tirosina y triptófano; e inmunodeficiencia primaria. Los
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10
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45
50
treinta procesos biológicos que se encontraron asociados solo con los exosomas de células madre neurales se muestran en la Figura 19; la función biológica identificada más importante se relaciona con la ARN polimerasa.
Una comparación adicional de los 197 procesos biológicos compartidos por exosomas derivados de MSC y exosomas derivados de NSC muestra que los exosomas de NSC contienen notablemente más procesos implicados en la degradación de ARN, el ribosoma y los espliceosomas, en comparación con los exosomas de MSC.
La comparación anterior indica una serie de diferencias significativas entre los exosomas derivados de NSC y los exosomas derivados de MSC (como se caracteriza por Lim et al. 2012). Las 4 diferencias biológicas más significativas identificadas como presentes en los exosomas de NSC en comparación con las que están muy bajas/ausentes en las identificadas por el grupo de Lim, todas involucran proteínas asociadas con la producción, empaquetamiento, función y degradación del material genético, es decir, ARN polimerasa, degradación del ARN, Ribosomas y espliceosomas.
Ejemplo 14: Distribución por tamaño de las micropartículas
Se realizó un análisis de NanoSight para determinar el tamaño de partícula y la concentración de microvesículas ("mv1" a "mv6") y exosomas ("exo1" a "exo6") aisladas de las células CTX0E03 cultivadas en el sistema CELLine de Integra durante 1, 2, 3, 4, 5 y 6 semanas. Todos los resultados se basan en 5 mediciones repetidas.
La distribución del tamaño de partícula se midió usando análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA). NTA detecta el movimiento de partículas en solución y lo relaciona con el tamaño de partícula. Se calculó el tamaño de partícula modo y mediano para todas las muestras. Las muestras de exosomas se analizaron usando los ajustes de cámara más sensibles para capturar las vesículas más pequeñas. Las muestras de microvesículas se analizaron utilizando ajustes de cámara menos sensibles para evitar la sobreexposición de las vesículas más grandes. Como resultado, algunas vesículas más pequeñas no se detectaron en las muestras. Aunque las vesículas más pequeñas estuvieron presentes en las muestras de MV, éstas representan un porcentaje pequeño de la muestra en términos de masa.
Se marcó una proporción de Exo1 con un colorante específico de membrana fluorescente (CellMaskMR) y una combinación de análisis de NTA con la marcación con CellMaskMR confirmó que los eventos detectados por NTA corresponden a vesículas de membrana (datos no mostrados).
Los resultados se muestran en la Tabla 22 a continuación, y en la Figura 17.
Los exosomas muestran un descenso en el tamaño en la semana seis, desde un modo de aproximadamente 110 nm hasta aproximadamente 70 nm, o desde una media de aproximadamente 130 nm a aproximadamente 75 nm. El intervalo total de tamaño, desde 70 nm hasta 150 nm, es consistente con el tamaño de los exosomas de otros tipos de células, descritos en la técnica. La reducción observada en el tamaño de los exosomas a alrededor de 70 nm de diámetro después de cultivar las células durante 6 semanas se correlaciona con la eficacia aumentada de los exosomas aislados de células CTX0E03 que se han cultivado en un biorreactor de múltiples compartimientos durante 6 semanas, como se reporta en el Ejemplo 8 y la Figura 6.
También se observa que la concentración de microvesículas y exosomas disminuye durante el período de seis semanas de la Figura 17, lo que refleja ampliamente la eficacia mejorada observada a lo largo del tiempo.
Las microvesículas son, como se esperaba, más grandes, con un diámetro de modo de aproximadamente 150 nm a 200 nm, o un diámetro medio de aproximadamente 180 nm a 350 nm.
Tabla 22: Distribución de tamaño de microvesículas^ y exosomas de CTX0E03.
Muestra
Recuento Dilución Concentración x1012/mL Modo (nm) Mediana (nm)
Exo1 (1)
5,204 10000 32,26 107 151
Exo1 (2)
1,734 10000 10,75 135 164
Exo1 (3)
6,55 10000 40,61 108 128
Exo2
14,33 10000 88,85 118 153
Exo3 (1)*
2,52 10000 15,62 89 115
Exo3 (2)
10,06 10000 62,37 115 146
Exo3 (3)
8,98 10000 55,68 128 147
Exo4 (1)
3,04 10000 18,85 111 136
Exo4 (2)
2,89 10000 17,92 110 120
Exo4 (3)
2,77 10000 17,17 116 134
Exo5 (1)
2,34 100 0,15 99 117
Exo5 (2)
2,02 100 0,13 102 124
5
10
15
20
25
30
35
40
Exo 5 (3)
2,08 100 0,13 116 127
Exo6 (1)
1,45 100 0,09 68 74
Exo6 (2)
1,19 100 0,07 69 75
MV1 (1)
9,314 200 1,15 183 212
MV1 (2)
10,76 200 1,33 161 214
MV1 (3)
10,738 200 1,33 173 198
MV2
5,89 1000 3,65 177 194
MV3 (1)*
5,68 2000 7,04 150 186
MV3 (2)
11,5 2000 14,26 221 351
MV3 (3)
9,57 2000 11,87 214 270
MV4 (1)
4,894 400 1,21 209 240
MV4 (2)
2,934 1000 1,82 195 212
MV4 (3)
2,55 1000 1,58 184 221
MV5 (1)
1,086 200 0,13 164 237
MV5 (2)
1,458 200 0,18 205 205
MV 5 (3)
1,3 200 0,16 219 210
MV6 (1)
0,346 200 0,04 171 186
MV6 (2)
0,37 200 0,05 168 212
Media
0,14 10 0,00 100 149
* Agregados grandes
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Listado de secuencias
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15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
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<120> Micropartículas de Células Madre
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<160> 752
<170> SeqWin2010, versión 1.0
<210> 1 <211> 22 <212>ARN <213> Homo sapiens
<400> 1
ugagguagua gguuguauag uu 22
<210> 2 <211> 23 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 2
uacccuguag auccgaauuu gug 23
<210> 3 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 3
aacccguaga uccgaacuug ug 22
<210> 4 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 4
cacccguaga accgaccuug cg 22
<210> 5 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 5
uccuguacug agcugccccg ag 22
<210> 6 <211> 21 <212> ARN <213> Homo sapiens
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<400>6
uucacagugg cuaaguucug c
<210>7 <211> 22 <212>ARN <213> Homo sapiens
<400> 7
uauugcacuu gucccggccu gu
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<400> 8
caacggaauc ccaaaagcag cug
<210>9 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 9
uagcuuauca gacugauguu ga
<210> 10 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 10
ugagguagua aguuguauug uu
<210> 11 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens <400> 11
ugagguagua gauuguauag uu
<210> 12 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 12
uucaaguaau ccaggauagg cu
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<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 13
uauugcacuc gucccggccu cc
<210> 14 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 14
ucggauccgu cugagcuugg cu <210> 15
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<211> 23
<212>ARN
<213> Homo sapiens
<400> 15
aacauucaac gcugucggug agu
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<400> 16
uuuggcaaug guagaacuca cacu
<210> 17 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 17
ugagguagua gguuguaugg uu
<210> 18 <211> 21 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 18
ugguagacua uggaacguag g
<210> 19 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 19
ugagaacuga auuccauagg cu <210> 20 <211> 21 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 20
caacaccagu cgaugggcug u
<210> 21 <211> 19 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 21
aauggauuuu uggagcagg
<210> 22 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens
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ugagguagua guuugugcug uu
<210> 23 <211> 17 <212> ARN <213> Homo sapiens
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ccccggggag cccggcg
<210> 24 <211> 22 <212>ARN <213> Homo sapiens
<400> 24
uauggcacug guagaauuca cu
<210> 25 <211> 21 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 25
cuagacugaa gcuccuugag g
<210> 26 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 26
aaugcacccg ggcaaggauu cu
<210> 27 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens
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ugagguagga gguuguauag uu
<210> 28 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 28
ugagguagua gguugugugg uu
<210> 29 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 29
uagcagcacg uaaauauugg cg
<210> 30 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 30
uguaaacauc cucgacugga ag
<210> 31 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 31
uguaaacauc cccgacugga ag
21
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22
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22
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<210> 32 <211> 23 <212>ARN <213> Homo sapiens
<400> 32
agguuacccg agcaacuuug cau
<210> 33 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 33
aagcugccag uugaagaacu gu
<210> 34 <211> 17 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 34
ggggcugggc gcgcgcc 17
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ucccugagac ccuuuaaccu guga
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agcuacaucu ggcuacuggg u
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<400> 37
ucgaggagcu cacagucuag u
<210> 38 <211> 23 <212> ARN <213> Homo sapiens
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aacauucauu gcugucggug ggu
<210> 39 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 39
accuggcaua caauguagau uu
<210> 40 <211 > 22 <212> ARN
22
24
21
21
23
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<213> Homo sapiens <400> 40
caaagaauuc uccuuuuggg cu
<210> 41 <211> 23 <212>ARN <213> Homo sapiens
<400> 41
ugaggggcag agagcgagac uuu
<210> 42 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 42
ucccugagac ccuaacuugu ga
<210> 43 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 43
ugagguagua guuuguacag uu
<210> 44 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 44
augcaccugg gcaaggauuc ug
<210> 45 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 45
uguaaacauc cuugacugga ag
<210> 46 <211> 21 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 46
uucacagugg cuaaguuccg c
<210> 47 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 47
gaauguugcu cggugaaccc cu
<210> 48 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens
23
22
22
22
22
21
22
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<400> 48
ucagugcauc acagaacuuu gu
<210> 49 <211> 22 <212>ARN <213> Homo sapiens
<400> 49
acggguuagg cucuugggag cu
<210> 50 <211> 21 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 50
aauauaacac agauggccug u
<210> 51 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 51
uauacaaggg caagcucucu gu
<210> 52 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 52
aacccguaga uccgaucuug ug
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<400> 53
agagguagua gguugcauag uu
<210> 54 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 54
ucagugcacu acagaacuuu gu
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<400> 55
aucacauugc cagggauuuc c
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<400> 56
cacuagauug ugagcuccug ga
22
21
22
22
22
22
21
5
10
15
20
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30
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40
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60
65
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<400> 57
agcucggucu gaggccccuc agu
<210> 58 <211> 23 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 58
ucuuugguua ucuagcugua uga
<210> 59 <211> 21 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 59
aucacauugc cagggauuac c
<210> 60 <211> 23 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 60
cacccggcug ugugcacaug ugc
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<400> 61
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<210> 62 <211> 23 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 62
agcagcauug uacagggcua uga
<210> 63 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 63
cauugcacuu gucucggucu ga
<210> 64 <211> 21 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 64
uuaauaucgg acaaccauug u <210> 65
23
21
23
23
22
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<400> 65
acuggacuug gagucagaag g
<210> 66 <211> 23 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 66
uguaaacauc cuacacucuc agc
<210> 67
<211> 20
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 67
uaacggccgc gguacccuaa
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<400> 68
ucacaaguca ggcucuuggg ac
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<400> 69
uccgguucuc agggcuccac c
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<400> 70
uuaucagaau cuccaggggu ac
<210> 71 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 71
cuuucagucg gauguuuaca gc
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<400> 72
cuuggcaccu agcaagcacu ca
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23
20
22
21
22
22
22
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<400> 73
ugagaaccac gucugcucug ag
<210> 74 <211> 22 <212>ARN <213> Homo sapiens
<400> 74
uuauaauaca accugauaag ug
<210> 75 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 75
ugagaccucu ggguucugag cu
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<400> 76
gcugacuccu aguccagggc uc
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<400> 77
cuuucagucg gauguuugca gc
<210> 78 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 78
uagcagcaca ucaugguuua ca
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<400> 79
agcuacauug ucugcugggu uuc
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<400> 80
aggcaagaug cuggcauagc u
<210> 81 <211> 23 <212> ARN <213> Homo sapiens
22
22
22
22
22
23
21
106
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
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<400> 82
caucaucguc ucaaaugagu cu
<210> 83 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens <400> 83
ugaaggucua cugugugcca gg
<210> 84 <211> 17 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 84
ucucgcuggg gccucca 17
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<400> 85
uggaagacua gugauuuugu ugu
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<400> 86
cagugcaaug augaaagggc au
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<400> 87
cugaccuaug aauugacagc c
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<400> 88
uuguacaugg uaggcuuuca uu
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<400> 89
uucccuuugu cauccuaugc cu <210> 90
22
22
23
22
21
22
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<400> 90
uucaaguaau ucaggauagg u
<210> 91 <211> 21 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 91
ucgaccggac cucgaccggc u
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<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 92
cuauacgacc ugcugccuuu cu
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<400> 93
uuauaaagca augagacuga uu
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<400> 94
ugugacuggu ugaccagagg gg
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ucuuggagua ggucauuggg ugg
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uguaaacauc cuacacucag cu
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<400> 97
aaaagcuggg uugagagggc ga
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21
22
22
22
23
22
22
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<400> 98
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ugcggggcua gggcuaacag ca
<210> 100 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens
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accaucgacc guugauugua cc
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uggcaguguc uuagcugguu gu
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<400> 102
accacugacc guugacugua cc
<210> 103 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 103
ugauauguuu gauauauuag gu
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<400> 104
uaacagucua cagccauggu cg
<210> 105 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 105
aacauucaac cugucgguga gu
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22
22
22
22
22
22
22
5
10
15
20
25
30
35
40
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50
55
60
65
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<400> 107
cagugcaaua guauugucaa agc
<210> 108 <211> 21 <212> ARN <213> Homo sapiens <400> 108
uaguagaccg uauagcguac g
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<400> 109
ucacagugaa ccggucucuu u
<210> 110 <211> 17 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 110
gggagaaggg ucggggc 17
<210> 111 <211> 23 <212> ARN <213> Homo sapiens
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aaugacacga ucacucccgu uga
<210> 112 <211> 21 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 112
acucuuuccc uguugcacua c
<210> 113 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 113
cagugcaaug uuaaaagggc au
<210> 114 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 114
cuuucaguca gauguuugcu gc <210> 115
23
21
21
23
21
22
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<400> 115
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<400> 116
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<210> 117
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 117
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<400> 118
ucaggcucag uccccucccg au 22
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<400> 119
uggcucaguu cagcaggaac ag 22
<210> 120 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 120
ucugugagac caaagaacua cu 22
<210> 121 <211> 23 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 121
ucuggcuccg ugucuucacu ccc 23
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uucaccaccu ucuccaccca gc 22
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5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<400> 123
uuuggcacua gcacauuuuu gcu
<210> 124 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 124
acucggcgug gcgucggucg ug
<210> 125 <211> 23 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 125
aggcagugua guuagcugau ugc
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gccugcuggg guggaaccug gu
<210> 127 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 127
aaguucuguu auacacucag gc
<210> 128 <211> 23 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 128
ucaagagcaa uaacgaaaaa ugu
<210> 129 <211> 23 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 129
gauugagacu aguagggcua ggc
<210> 130 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 130
agggcuuagc ugcuugugag ca
<210> 131 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens
22
23
22
22
23
23
22
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
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ugucuugcag gccgucaugc a
<210> 133 <211> 20 <212> ARN <213> Homo sapiens <400> 133
guagaggaga uggcgcaggg
<210> 134 <211> 23 <212> ARN <213> Homo sapiens
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agugccugag ggaguaagag ccc
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gcggggcugg gcgcgcg 17
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uggugggcac agaaucugga cu
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<400> 137
uauggcuuuu cauuccuaug uga
<210> 138 <211> 21 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 138
uaccacaggg uagaaccacg g
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<400> 139
aauccuugga accuaggugu gagu <210> 140
21
20
23
22
23
21
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<400> 140
gcaguccaug ggcauauaca c 21
<210> 141 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 141
uuugugaccu gguccacuaa cc 22
<210> 142
<211> 21
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 142
uacaguacug ugauaacuga a 21
<210> 143 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 143
auauaauaca accugcuaag ug 22
<210> 144 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 144
aaaguucuga gacacuccga cu 22
<210> 145 <211> 23 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 145
caaagugcuu acagugcagg uag 23
<210> 146 <211> 23 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 146
uaaagugcuu auagugcagg uag 23
<210> 147 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 147
cugcccuggc ccgagggacc ga 22
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5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<400> 148
aacuggcccu caaagucccg cu
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<400> 149
caaaaacugc aguuacuuuu gc
<210> 150 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 150
aucauacaag gacaauuucu uu
<210> 151 <211> 23 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 151
aucaacagac auuaauuggg cgc
<210> 152 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 152
aaggagcuca cagucuauug ag
<210> 153 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 153
gucauacacg gcucuccucu cu
<210> 154 <211> 23 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 154
ugaggcucug uuagccuugg cuc
<210> 155 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 155
cgucccgggg cugcgcgagg ca
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22
22
23
22
22
23
22
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
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65
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<400> 157
aacauucauu guugucggug ggu
<210> 158 <211> 21 <212> ARN <213> Homo sapiens <400> 158
cacauuacac ggucgaccuc u
<210> 159 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 159
ccgcacugug gguacuugcu gc
<210> 160 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 160
acaggugagg uucuugggag cc
<210> 161 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 161
ucucugggcc ugugucuuag gc
<210> 162 <211> 17 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 162
gugggggagaggcuguc 17
<210> 163 <211> 23 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 163
ugugcaaauc caugcaaaac uga
<210> 164 <211> 23 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 164
cagugcaaug auauugucaa agc <210> 165
23
21
22
22
22
23
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<400> 165
agaggcuggc cgugaugaau uc 22
<210> 166 <211> 23 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 166
uagcaccauu ugaaaucagu guu 23
<210> 167
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 167
aagggcuucc ucucugcagg ac 22
<210> 168 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 168
caggucgucu ugcagggcuu cu 22
<210> 169 <211> 23 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 169
uagugcaaua uugcuuauag ggu 23
<210> 170 <211> 21 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 170
uaaagugcug acagugcaga u 21
<210> 171 <211> 19 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 171
accgugcaaa gguagcaua 19
<210> 172 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 172
ugcuaugcca acauauugcc au 22
<210> 173 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<400> 173
cuuaucagau uguauuguaa uu
<210> 174 <211> 22 <212>ARN <213> Homo sapiens
<400> 174
aucaugaugg gcuccucggu gu
<210> 175 <211> 18 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 175
ggugggcuucccggaggg 18
<210> 176 <211> 21 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 176
ugagaugaag cacuguagcu c
<210> 177 <211> 23 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 177
ugugcaaauc uaugcaaaac uga
<210> 178 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 178
caugccuuga guguaggacc gu
<210> 179 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 179
aucaaggauc uuaaacuuug cc
<210> 180 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 180
gguggcccgg ccgugccuga gg
<210> 181 <211> 24 <212> ARN <213> Homo sapiens
22
21
23
22
22
22
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
uugcagcugc cugggaguga cuuc
24
<210> 182 <211> 22 <212>ARN <213> Homo sapiens
<400> 182
uaugugggau gguaaaccgc uu
<210> 183 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens <400> 183
auaaagcuag auaaccgaaa gu
<210> 184 <211 > 22 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 184
acugcaguga aggcacuugu ag
<210> 185 <211> 21 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 185
aacauagagg aaauuccacg u
<210> 186 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 186
cagcagcaau ucauguuuug aa
<210> 187 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 187
uacccauugc auaucggagu ug
<210> 188 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 188
uugcauaguc acaaaaguga uc
<210> 189 <211> 23 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 189
ugaggaugga uagcaaggaa gcc <210> 190
22
22
22
21
22
22
22
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<400> 190
cccggacagg cguucgugcg acgu
<210> 191 <211> 18 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 191
gggcucacau caccccau 18
<210> 192
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 192
uaugugccuu uggacuacau cg
<210> 193 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 193
aaacauucgc ggugcacuuc uu
<210> 194 <211> 20 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 194
uaaagagccc uguggagaca
<210> 195 <211> 23 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 195
gcaaagcaca cggccugcag aga
<210> 196 <211> 21 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 196
aauaauacau gguugaucuu u
<210> 197 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 197
ugagaccagg acuggaugca cc
<210> 198 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens
22
22
20
23
21
22
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<400> 198
aaaaguacuu gcggauuuug cu
<210> 199 <211> 22 <212>ARN <213> Homo sapiens
<400> 199
ucaccagccc uguguucccu ag
<210> 200 <211> 21 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 200
cucccacaug caggguuugc a
<210> 201 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 201
agagcuuagc ugauugguga ac
<210> 202 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 202
agagguugcc cuuggugaau uc
<210> 203 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 203
aaucauacag ggacauccag uu
<210> 204 <211 > 23 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 204
agguugggau cgguugcaau gcu
<210> 205 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 205
auguagggcu aaaagccaug gg
<210> 206 <211> 21 <212> ARN <213> Homo sapiens
22
21
22
22
22
23
22
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<210> 207 <211> 23 <212>ARN <213> Homo sapiens
<400> 207
uagcccccag gcuucacuug gcg
<210> 208 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens <400> 208
agggacggga cgcggugcag ug
<210> 209 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 209
auauacaggg ggagacucuu au
<210> 210 <211> 21 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 210
accacugcac uccagccuga g
<210> 211 <211> 21 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 211
auccccagau acaauggaca a
<210> 212 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 212
gggguuccug gggaugggau uu
<210> 213 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 213
cugggagagg guuguuuacu cc
<210> 214 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 214
aacacaccug guuaaccucu uu <210> 215
23
22
22
21
21
22
22
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<400> 215
cuccuauaug augccuuucu uc
<210> 216 <211> 24 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 216
caaagugaug aguaauacug gcug
<210> 217
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 217
cuccugacuc cagguccugu gu
<210> 218 <211> 23 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 218
gaggcugaug ugaguagacc acu
<210> 219 <211> 23 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 219
ugaguggggc ucccgggacg gcg
<210> 220 <211> 21 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 220
guuucaccau guuggucagg c
<210> 221 <211> 21 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 221
aauauuauac agucaaccuc u
<210> 222 <211> 21 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 222
cuauacaauc uacugucuuu c
<210> 223 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens
22
23
23
21
21
21
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<400> 223
uagcagcaca uaaugguuug ug
<210> 224 <211> 22 <212>ARN <213> Homo sapiens
<400> 224
uggagagaaa ggcaguuccu ga
<210> 225 <211> 21 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 225
aggcggagac uugggcaauu g
<210> 226 <211> 23 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 226
ucaacaaaau cacugaugcu gga
<210> 227 <211> 19 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 227
acuggccugg gacuaccgg 19
<210> 228 <211> 23 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 228
ugagcgccuc gacgacagag ccg
<210> 229 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 229
cuuagcaggu uguauuauca uu
<210> 230 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 230
auggccagag cucacacaga gg
<210> 231 <211> 20 <212> ARN <213> Homo sapiens
22
21
23
23
22
22
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<210> 232 <211> 17 <212>ARN <213> Homo sapiens
<400> 232
cuccgggacg gcugggc 17
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gcuaaggaag uccugugcuc ag
<210> 234 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 234
ggagaaauua uccuuggugu gu
<210> 235
<211> 20
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 235
aaaagugauu gcaguguuug
<210> 236 <211> 21 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 236
ccaguccugu gccugccgcc u
<210> 237 <211> 21 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 237
aucauagagg aaaauccacg u
<210> 238 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 238
gaaguuguuc gugguggauu cg
<210> 239 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 239
cagcccggau cccagcccac uu
<210> 240 <211> 22
22
22
20
21
21
22
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<400> 240
ugaaacauac acgggaaacc uc
<210> 241 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 241
aaacaaacau ggugcacuuc uu
<210> 242 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 242
ucagcaaaca uuuauugugu gc
<210> 243 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 243
caagcucgug ucuguggguc cg
<210> 244 <211> 21 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 244
uaggacacau ggucuacuuc u
<210> 245 <211> 21 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 245
cucacugaac aaugaaugca a
<210> 246 <211> 23 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 246
accuuggcuc uagacugcuu acu
<210> 247 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 247
caccuugcgc uacucagguc ug
<210> 248 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens
22
22
22
21
21
23
22
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<400> 248
uccgucucag uuacuuuaua gc
<210> 249 <211> 22 <212>ARN <213> Homo sapiens
<400> 249
gcaugugaug aagcaaauca gu
<210> 250 <211> 23 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 250
ucccccaggu gugauucuga uuu
<210> 251 <211> 17 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 251
ggcgggugcgggggugg 17
<210> 252 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 252
ccucccacac ccaaggcuug ca
<210> 253 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 253
cacgcucaug cacacaccca ca
<210> 254 <211> 23 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 254
agcagcauug uacagggcua uca
<210> 255 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 255
cugaagcuca gagggcucug au
<210> 256 <211> 23 <212> ARN <213> Homo sapiens
22
23
22
22
23
22
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
uaaggugcau cuagugcaga uag
23
<210> 257 <211> 22 <212>ARN <213> Homo sapiens
<400> 257
ccuauucuug auuacuuguu uc
<210> 258 <211> 21 <212> ARN <213> Homo sapiens <400> 258
agggcccccc cucaauccug u
<210> 259 <211> 21 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 259
agccgcgggg aucgccgagg g
<210> 260 <211> 21 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 260
aaucauucac ggacaacacu u
<210> 261 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 261
uacgcgcaga ccacaggaug uc
<210> 262 <211> 21 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 262
cuggauggcu ccuccauguc u
<210> 263 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 263
aguugccuuu uuguucccau gc
<210> 264 <211> 18 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 264
gggugcgggccggcgggg 18 <210> 265
22
21
21
21
22
21
22
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<400> 265
acccuaucaa uauugucucu gc 22
<210> 266 <211> 23 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 266
ccggucccag gagaaccugc aga 23
<210> 267
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 267
ugaguauuac auggccaauc uc 22
<210> 268 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 268
ccaaaacugc aguuacuuuu gc 22
<210> 269 <211> 27 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 269
accuucuugu auaagcacug ugcuaaa
<210> 270 <211> 24 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 270
agccuggaag cuggagccug cagu 24
<210> 271 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 271
uuagggcccu ggcuccaucu cc 22
<210> 272 <211> 23 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 272
acuccauuug uuuugaugau gga 23
<210> 273 <211> 23 <212> ARN <213> Homo sapiens
27
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<400> 273
cccaguguuc agacuaccug uuc
<210> 274 <211> 22 <212>ARN <213> Homo sapiens
<400> 274
gaggguuggg uggaggcucu cc
<210> 275 <211> 21 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 275
ugcacggcac uggggacacg u
<210> 276 <211> 20 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 276
acugccccag gugcugcugg
<210> 277 <211> 21 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 277
gaacggcuuc auacaggagu u
<210> 278 <211> 21 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 278
aggggugcua ucugugauug a
<210> 279 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 279
uaaugccccu aaaaauccuu au
<210> 280 <211> 15 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 280
aggagauccu ggguu 15
<210> 281 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens
22
21
20
21
21
22
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<210> 282 <211> 22 <212>ARN <213> Homo sapiens
<400> 282
cgucaacacu ugcugguuuc cu
<210> 283 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens <400> 283
ugucuuacuc ccucaggcac au
<210> 284 <211> 21 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 284
gccccgggca gugugaucau c
<210> 285 <211> 24 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 285
aaagacauag gauagaguca ccuc
<210> 286 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 286
auaauacaug guuaaccucu uu
<210> 287 <211> 23 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 287
uauucauuua uccccagccu aca
<210> 288 <211> 23 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 288
aggaagcccu ggaggggcug gag
<210> 289 <211> 20 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 289
cggcucuggg ucugugggga <210> 290
22
22
21
24
22
23
23
5
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50
55
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cuccguuugc cuguuucgcu g 21
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5
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uuagugcaua gucuuugguc u
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uuaauuuuuu guuucgguca cu
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uaauccuugc uaccugggug aga
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aaaaguaauu gugguuuugg cc
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cugaagugau guguaacuga ucag
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accaggaggc ugaggccccu
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22
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accguggcuu ucgauuguua cu
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ccaauauuac ugugcugcuu ua
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ugguuuaccg ucccacauac au
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cugggaggug gauguuuacu uc
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cugggagaag gcuguuuacu cu
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uuggccaugg ggcugcgcgg
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23
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22
22
22
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ucucucggcu ccucgcggcu c
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gaaaaugaug aguagugacu gaug
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22
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cgaaaacagc aauuaccuuu gc
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22
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21
22
23
21
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22
23
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uggcggcggu aguuaugggc uu
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22
22
22
22
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22
21
22
21
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22
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23
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acugggcuug gagucagaag
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20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<400> 415
ugugcagcag gccaaccgag a 21
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<400> 416
ggcggcggcg gaggcggggg 20
<210> 417
<211> 20
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 417
uguuccucug ucucccagac 20
<210> 418 <211> 18 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 418
cucgaguugg aagaggcg 18
<210> 419 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 419
uggggauuug gagaaguggu ga 22
<210> 420 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 420
auggcaucgu ccccuggugg cu 22
<210> 421 <211> 23 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 421
agggaaaaaa aaaaggauuu guc 23
<210> 422 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 422
uccaggcagg agccggacug ga 22
<210> 423 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<400> 423
uaggggcagc agaggaccug gg
<210> 424 <211> 26 <212>ARN <213> Homo sapiens
<400> 424
cacaggacug acuccucacc ccagug
<210> 425 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 425
cacacaagug gcccccaaca cu 22
<210> 426 <211> 20 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 426
cgccccuccu gcccccacag 20
<210> 427 <211> 24 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 427
ggugggaugg agagaaggua ugag
<210> 428 <211> 21 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 428
aguggaccga ggaaggaagg a 21
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<400> 429
aguggggaac ccuuccauga gg 22
<210> 430 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 430
aauccuuugu cccuggguga ga 22
<210> 431 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens
24
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
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<400> 432
aaaggauucu gcugucgguc ccacu
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ucggggauca ucaugucacg aga
<210> 434 <211> 21 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 434
gcgacccaua cuugguuuca g
<210> 435 <211> 21 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 435
ucagcuacua ccucuauuag g
<210> 436 <211> 21 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 436
uagauaaaau auugguaccu g
<210> 437 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 437
ucaguuccag gccaaccagg cu
<210> 438 <211> 24 <212> ARN <213> Homo sapiens
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ucagaacaaa ugccgguucc caga
<210> 439 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 439
acucaaaacc cuucagugac uu <210> 440
23
21
21
21
22
24
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<400> 440
augcugacau auuuacuaga gg
<210> 441 <211> 21 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 441
uggguuuacg uugggagaac u
<210> 442
<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 442
uucauuugcc ucccagccua ca
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<400> 443
acuggcuagg gaaaaugauu ggau
<210> 444 <211> 23 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 444
gcagcagaga auaggacuac guc
<210> 445 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 445
uauguaauau gguccacauc uu
<210> 446 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 446
uauguaacau gguccacuaa cu
<210> 447 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 447
cgaaucauua uuugcugcuc ua
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21
22
24
23
22
22
22
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<400> 448
uuaaugcuaa ucgugauagg ggu
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<400> 449
aucacacaaa ggcaacuuuu gu
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<400> 450
gccccugggc cuauccuaga a
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<400> 451
augaccuaug aauugacaga c
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<400> 452
aucauagagg aaaauccaug uu
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<400> 453
cggggcagcu caguacagga u
<210> 454 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 454
acugcugagc uagcacuucc cg
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<400> 455
ucgaggagcu cacagucu 18
<210> 456 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens
22
21
21
22
21
22
5
10
15
20
25
30
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65
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<400> 457
ccucagggcu guagaacagg gcu
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uaagugcuuc cauguuuuag uag
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<400> 459
aaaaacugag acuacuuuug ca
<210> 460 <211> 23 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 460
uaagugcuuc cauguuugag ugu
<210> 461 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 461
uacgucaucg uugucaucgu ca
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<400> 462
cauuauuacu uuugguacgc g
<210> 463 <211> 21 <212> ARN <213> Homo sapiens
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uaauuuuaug uauaagcuag u
<210> 464 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 464
ucugggcaac aaagugagac cu <210> 465
23
23
22
23
22
21
21
5
10
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20
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30
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55
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65
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uacccuguag aaccgaauuu gug
<210> 466 <211> 23 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 466
cugauaagaa cagaggccca gau
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<211> 22
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 467
agaauugugg cuggacaucu gu
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<400> 468
agcgcgggcu gagcgcugcc aguc
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<400> 469
uguuguacuu uuuuuuuugu uc
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<400> 470
uaacugguug aacaacugaa cc
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<400> 471
aaaagugcuu acagugcagg uag
<210> 472 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 472
aaucauacac gguugaccua uu
<210> 473 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens
23
22
24
22
22
23
22
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<400> 473
uagcaccauu ugaaaucggu ua
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<400> 474
gcugcgcuug gauuucgucc cc
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<400> 475
uaauacugcc ugguaaugau ga
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<400> 476
ugucacucgg cucggcccac uac
<210> 477 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 477
ugagaacuga auuccauggg uu
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<400> 478
cugugcgugu gacagcggcu ga
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<400> 479
cagcagcaca cugugguuug u
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<400> 480
caacaaauca cagucugcca ua
<210> 481 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens
22
22
23
22
22
21
22
5
10
15
20
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30
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50
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65
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uauguaacac gguccacuaa cc
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cugcgcaagc uacugccuug cu
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<400> 484
aacuagcucu guggauccug ac
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<400> 485
uuaugguuug ccugggacug ag
<210> 486 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 486
cuguugccac uaaccucaac cu
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<400> 487
uccaguacca cgugucaggg cca
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<400> 488
uccugucuuu ccuuguugga gc
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<400> 489
uuacaguugu ucaaccaguu acu <210> 490 <211> 22
22
22
22
22
22
23
22
23
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<400> 490
acgcccuucc cccccuucuu ca
<210> 491 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 491
gcucugacuu uauugcacua cu
<210> 492 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 492
uucugccucu guccaggucc uu
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aaucagugaa ugccuugaac cu
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<400> 494
acaguagucu gcacauuggu ua
<210> 495 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 495
aguucuucag uggcaagcuu ua
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<400> 496
ccuccguguu accuguccuc uag
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<400> 497
agacccuggu cugcacucua uc
<210> 498 <211> 22 <212> ARN <213> Homo sapiens
22
22
22
22
22
23
22
5
10
15
20
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30
35
40
45
50
55
60
65
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uucuggaauu cugugugagg ga
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<400> 499
caucccuugc augguggagg g
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cuagguaugg ucccagggau cc
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uagguuaucc guguugccuu cg
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acugcccuaa gugcuccuuc ugg
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<400> 503
uaagugcuuc cauguuuugg uga
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ccucugggcc cuuccuccag
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22
22
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23
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21
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aaauaugaug aaacucacag cugag
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<400> 509
cucucaccac ugcccuccca cag
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uggguuccug gcaugcugau uu
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acuuaaacgu ggauguacuu gcu
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aauucccuug uagauaaccc gg
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cuguacagcc uccuagcuuu cc
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23
22
23
22
22
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60
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gugcauugcu guugcauugc
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uuuccuaccc uaccugaaga cu
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acagggccgc agauggagac u
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22
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10
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35
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uuugaggcua cagugagaug ug
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cggcccgggc ugcugcuguu ccu
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ugggucuuug cgggcgagau ga
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ugauugucca aacgcaauuc u
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uaggauuaca agugucggcc ac
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ugcccugccu guuuucuccu uu
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cggggagaga acgcagugac gu
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22
22
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22
22
22
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caaagacugc aauuacuuuu gcg
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ugggaacggg uuccggcaga cgcug
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ccaauauugg cugugcugcu cc
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uuuaacaugg ggguaccugc ug <210> 540
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24
21
23
25
22
22
5
10
15
20
25
30
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55
60
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<213> Homo sapiens
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uuuuucauua uugcuccuga cc
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acuguaaacg cuuucugaug
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cuaagaaguu gacugaag
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ugagcaccac acaggccggg cgc
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22
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gggagccagg aaguauugau gu
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caaaacuggc aauuacuuuu gc
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uccucuucuc ccuccuccca g
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acugcauuau gagcacuuaa ag
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22
22
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22
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auccuugcua ucugggugcu a
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22
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22
22
22
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22
22
22
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21
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23
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22
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ccaggaggcg gaggaggugg ag
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30
35
40
45
50
55
60
65
<400> 665
cuagugcucu ccguuacaag ua
<210> 666 <211> 22 <212>ARN <213> Homo sapiens
<400> 666
cgcgcggccg ugcucggagc ag
<210> 667 <211 > 22 <212>ARN <213> Homo sapiens
<400> 667
ugugacaaua gagaugaaca ug
<210> 668 <211> 22 <212>ARN <213> Homo sapiens
<400> 668
uuuggacaga aaacacgcag gu
<210> 669 <211> 22 <212>ARN <213> Homo sapiens
<400> 669
aacuguuugc agaggaaacu ga
<210> 670 <211> 22 <212>ARN <213> Homo sapiens
<400> 670
aacucguguu caaagccuuu ag
<210> 671 <211> 22 <212>ARN <213> Homo sapiens
<400> 671
uuucuucuua gacauggcag cu
<210> 672 <211> 22 <212>ARN <213> Homo sapiens
<400> 672
cuuccggucu gugagccccg uc
<210> 673 <211> 23 <212>ARN <213> Homo sapiens
22
22
22
22
22
22
22
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<400> 673
cugggggacg cgugagcgcg agc
<210> 674 <211> 21 <212>ARN <213> Homo sapiens
<400> 674
auacauguca gauuguaugc c 21
<210> 675 <211> 22 <212>ARN <213> Homo sapiens
<400> 675
aacgggaaug caggcuguau cu 22
<210> 676 <211> 23 <212>ARN <213> Homo sapiens
<400> 676
ucugaguucc uggagccugg ucu 23
<210> 677 <211> 22 <212>ARN <213> Homo sapiens
<400> 677
gagcaggcga ggcugggcug aa 22
<210> 678 <211> 22 <212>ARN <213> Homo sapiens
<400> 678
agaagauugc agaguaaguu cc 22
<210> 679 <211> 25 <212>ARN <213> Homo sapiens
<400> 679
agcggggagg aagugggcgc ugcuu
<210> 680 <211> 22 <212>ARN <213> Homo sapiens
<400> 680
ugagggcuccaggugacggu gg 22
<210> 681 <211> 25 <212>ARN <213> Homo sapiens
25
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
caugcugacc ucccuccugc cccag
25
<210> 682 <211> 23 <212>ARN <213> Homo sapiens
<400> 682
ucaggcaaag ggauauuuac aga
<210> 683 <211> 22 <212>ARN <213> Homo sapiens
<400> 683
aaggcccggg cuuuccuccc ag
<210> 684 <211> 22 <212>ARN <213> Homo sapiens
<400> 684
ugcggggaca ggccagggca uc
<210> 685 <211> 22 <212>ARN <213> Homo sapiens
<400> 685
agccaggcuc ugaagggaaa gu
<210> 686 <211> 21 <212>ARN <213> Homo sapiens
<400> 686
cgccugccca gcccuccugc u
<210> 687 <211> 21 <212>ARN <213> Homo sapiens
<400> 687
auagcaauug cucuuuugga a
<210> 688 <211> 22 <212>ARN <213> Homo sapiens
<400> 688
aauguuggaa uccucgcuag ag
<210> 689 <211> 23 <212>ARN <213> Homo sapiens
<400> 689
ucugcacugu gaguuggcug gcu
23
22
22
22
21
21
22
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<210> 690 <211> 21 <212>ARN <213> Homo sapiens
<400> 690
uugaaaggcu auuucuuggu c
<210> 691 <211> 21 <212>ARN <213> Homo sapiens <400> 691
ugcuguauug ucagguagug a
<210> 692 <211> 24 <212>ARN <213> Homo sapiens
<400> 692
agggcuggac ucagcggcgg agcu
<210> 693 <211> 24 <212>ARN <213> Homo sapiens
<400> 693
aauuugguuu cugaggcacu uagu
<210> 694 <211> 22 <212>ARN <213> Homo sapiens
<400> 694
ugaggacagg gcaaauucac ga
<210> 695 <211> 21 <212>ARN <213> Homo sapiens
<400> 695
uuucccuuuc cauccuggca g
<210> 696 <211> 23 <212>ARN <213> Homo sapiens
<400> 696
cagggcucag ggauuggaug gag
<210> 697 <211> 22 <212>ARN <213> Homo sapiens
<400> 697
auucugcauu uuuagcaagu uc
<210> 698 <211> 22 <212>ARN
21
24
24
22
21
23
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<213> Homo sapiens <400> 698
aacggcaaug acuuuuguac ca
<210> 699 <211> 22 <212>ARN <213> Homo sapiens
<400> 699
gaaaguaauu gcuguuuuug cc
<210> 700
<211> 22
<212>ARN
<213> Homo sapiens
<400> 700
aaaaguuauu gcgguuuugg cu
<210> 701 <211> 21 <212>ARN <213> Homo sapiens
<400> 701
aaaaguaauu gcgguuuuug c
<210> 702 <211> 22 <212>ARN <213> Homo sapiens
<400> 702
caagaaccuc aguugcuuuu gu
<210> 703 <211> 22 <212>ARN <213> Homo sapiens
<400> 703
auauuaccau uagcucaucu uu
<210> 704 <211> 22 <212>ARN <213> Homo sapiens
<400> 704
uaaaacuuua agugugccua gg
<210> 705 <211> 22 <212>ARN <213> Homo sapiens
<400> 705
cagagugaca agcugguuaa ag
<210> 706 <211> 21 <212>ARN <213> Homo sapiens
22
22
21
22
22
22
22
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
acuggcauua gugggacuuu u
<210> 707 <211> 24 <212>ARN <213> Homo sapiens
<400> 707
uacagaugca gauucucuga cuuc
<210> 708 <211> 22 <212>ARN <213> Homo sapiens
<400> 708
cucauuuaag uagucugaug cc
<210> 709 <211> 19 <212>ARN <213> Homo sapiens
<400> 709
uuauugucacguucugauu 19
<210> 710 <211> 22 <212>ARN <213> Homo sapiens
<400> 710
uucuggauaa caugcugaag cu
<210> 711 <211> 22 <212>ARN <213> Homo sapiens
<400> 711
uugugucaau augcgaugau gu
<210> 712 <211> 22 <212>ARN <213> Homo sapiens
<400> 712
cacacacugc aauuacuuuu gc
<210> 713 <211> 21 <212>ARN <213> Homo sapiens
<400> 713
cacaagguau ugguauuacc u
<210> 714 <211> 22 <212>ARN <213> Homo sapiens
<400> 714
uccauuacac uacccugccu cu
21
22
22
22
22
21
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<210> 715 <211> 22 <212>ARN <213> Homo sapiens
<400> 715
ugugcgcagg gagaccucuc cc
<210> 716 <211> 17 <212>ARN <213> Homo sapiens <400> 716
cgcgccgggcccggguu 17
<210> 717 <211> 18 <212>ARN <213> Homo sapiens
<400> 717
cggggcggcaggggccuc 18
<210> 718 <211> 18 <212>ARN <213> Homo sapiens
<400> 718
gaggcugaaggaagaugg 18
<210> 719 <211> 17 <212>ARN <213> Homo sapiens
<400> 719
gcugggcgag gcuggca 17
<210> 720 <211> 22 <212>ARN <213> Homo sapiens
<400> 720
guggguacgg cccagugggg gg
<210> 721 <211> 17 <212>ARN <213> Homo sapiens
<400> 721
gcuucuguag uguaguc 17
<210> 722 <211> 18 <212>ARN <213> Homo sapiens
<400> 722
cggcuggagg ugugagga 18
<210> 723 <211> 21 <212>ARN
22
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<400> 723
uuacaggcgu gaaccaccgc g
<210> 724 <211> 24 <212>ARN <213> Homo sapiens
<400> 724
ugggcuaagg gagaugauug ggua
<210> 725
<211> 21
<212>ARN
<213> Homo sapiens
<400> 725
ccgucgccgc cacccgagcc g
<210> 726 <211> 22 <212>ARN <213> Homo sapiens
<400> 726
gguccagagg ggagauaggu uc
<210> 727 <211> 24 <212> ARN <213> Homo sapiens
<400> 727
cauagcccgg ucgcugguac auga
<210> 728 <211> 17 <212>ARN <213> Homo sapiens
<400> 728
ccccgccacc gccuugg 17
<210> 729 <211> 24 <212>ARN <213> Homo sapiens
<400> 729
ugucagugac uccugccccu uggu
<210> 730 <211> 22 <212>ARN <213> Homo sapiens
<400> 730
ucuggggaug aggacagugu gu
<210> 731 <211> 21 <212>ARN <213> Homo sapiens
21
22
24
24
22
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<210> 732 <211> 18 <212>ARN <213> Homo sapiens
<400> 732
agagcagaag gaugagau 18
<210> 733 <211> 22 <212>ARN <213> Homo sapiens
<400> 733
ucaggccagg cacaguggcu ca 22
<210> 734 <211> 22 <212>ARN <213> Homo sapiens
<400> 734
acuuuccuca cucccgugaa gu 22
<210> 735 <211> 21 <212>ARN <213> Homo sapiens
<400> 735
ugacagcgcc cugccuggcu c 21
<210> 736 <211> 17 <212>ARN <213> Homo sapiens
<400> 736
aagacugagaggaggga 17
<210> 737 <211> 23 <212>ARN <213> Homo sapiens
<400> 737
agaacucuug cagucuuaga ugu 23
<210> 738 <211> 57 <212>ADN <213> Homo sapiens
<220>
<223> secuencia genómica del precursor de miARN <400> 738
ggccgcgccc cgtttcccag gacaaagggc actccgcacc ggaccctggt cccagcg
<210> 739 <211> 64 <212>ADN <213> Homo sapiens
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
<220>
<223> secuencia genómica del precursor de miARN
<400> 739
cccactccct ggcgccgctt gtggagggcc caagtccttc tgattgaggc ccaacccgtg 60 gaag 64
<210> 740 <211> 56 <212>ADN <213> Homo sapiens <220>
<223> secuencia genómica del precursor de miARN <400> 740
cgccgggacc ggggtccggg gcggagtgcc cttcctcctg ggaaacgggg tgcggc 56
<210> 741 <211> 81 <212>ADN <213> Homo sapiens
<220>
<223> secuencia genómica del precursor de miARN <400> 741
gcttcacgtc cccaccggcg gcggcggcgg tggcagtggc ggcggcggcg gcggtggcgg 60
cggcggcggc ggcggcggct c 81
<210> 742 <211> 89 <212>ADN <213> Homo sapiens
<220>
<223> secuencia genómica del precursor de miARN <400> 742
gccgcccccg ccgccgccgc cgccgccgcc gccgccgccg ccgcccgctt tcggctcggg 60
cctcaggtga gtcggagggg ccgggcgcc 89
<210> 743 <211> 22 <212>ARN <213> Homo sapiens
<400> 743
ggcggagugc ccuucuuccu gg 22
<210> 744 <211> 22 <212>ARN <213> Homo sapiens
<400> 744
ggagggccca aguccuucug au 22
<210> 745 <211> 22 <212>ARN <213> Homo sapiens
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<400> 745
gaccaggguc cggugcggag ug 22
<210> 746 <211> 17 <212>ADN <213> Homo sapiens
<220>
<223> secuencia genómica del cebador <400> 746
agggtccggt gcggagt 17
<210> 747 <211> 12 <212>ARN <213> Bos taurus
<400> 747
ggguccggug cg 12
<210> 748 <211> 20 <212>ADN <213> Homo sapiens
<220>
<223> secuencia genómica del cebador <400> 748
tgcggagtgc cctttgtcct 20
<210> 749 <211> 22 <212>ADN <213> Homo sapiens
<220>
<223> secuencia genómica del cebador <400> 749
ggagggccca agtccttctg at 22
<210> 750 <211> 14 <212>ARN
<213> Caenorhabditis remanei <400> 750
cccaagugcu ucug 14
<210> 751 <211> 18 <212>ADN <213> Homo sapiens
<220>
<223> secuencia genómica del cebador <400> 751
cggagtgccc ttcttcct 18
<210> 752 <211> 12 <212>ARN
<400> 752 gugcccuucu uc 5

Claims (14)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    55
    60
    Reivindicaciones
    1. Una micropartícula de células madre neurales, que comprende uno, dos, tres o cuatro de hsa-miR-1246, hsa-miR- 4492, hsa-miR-4488 y hsa-miR-4532.
  2. 2. La micropartícula de células madre neurales de la reivindicación 1, en la que la micropartícula es un exosoma, microvesícula, partícula de membrana, vesícula de membrana, vesícula de tipo exosoma, vesícula de tipo ectosoma, ectosoma o exovesícula.
  3. 3. La micropartícula de células madre neurales de la reivindicación 1 o 2, en la que la micropartícula se deriva de una línea de células madre neurales, que opcionalmente se inmortaliza condicionalmente y/o crece en medio sin suero, y opcionalmente en la que la línea de células madre neurales es CTX0E03 que tiene el número de acceso de ECACC 04091601, STR0C05 que tiene el número de acceso de ECACC 04110301 o HPC0A07 que tiene el número de acceso de ECACC 04092302.
  4. 4. La micropartícula de células madre neurales de cualquier reivindicación precedente, en la que la micropartícula tiene:
    (a) un tamaño de entre 30 nm y 1.000 nm, o entre 30 y 200 nm, o entre 30 y 100 nm, como se determina por microscopía electrónica; o
    (b) una densidad en sacarosa de 1,1-1,2 g/mL.
  5. 5. La micropartícula de células madre neurales de cualquier reivindicación precedente, que comprende ARNm.
  6. 6. La micropartícula de células madre neurales de cualquier reivindicación precedente, que comprende uno o más de:
    (a) un lípido seleccionado de ceramida, colesterol, esfingomielina, fosfatidilserina, fosfatidilinositol y/o fosfatidilcolina;
    (b) miARN seleccionado de hsa-let-7g, hsa-miR-101, hsa-miR-10a, hsa-miR-10b, hsa-miR-126, hsa-miR-128, hsa- miR-129-5p, hsa-miR-130a, hsa-miR-134, hsa-miR-137, hsa-miR-155, hsa-miR-15a, hsa-miR-15b, hsa-miR-16, hsa- miR-17, hsa- miR-182, hsa-miR-183, hsa-miR-185, hsa-miR-18b, hsa-miR-192, hsa-miR-194, hsa-miR-195, hsa- miR-20a, hsa-miR- 20b, hsa-miR-210, hsa-miR-218, hsa-miR-301a, hsa-miR-302a, hsa-miR-302c, hsa-miR-345, hsa-miR-375, hsa-miR-378, hsa-miR-7, hsa-miR-9, hsa-miR-93, hsa-miR-96 y hsa-miR-99a;
    (c) una tetraspanina, opcionalmente seleccionada de CD63, CD81, CD9, Cd53, CD82 y/o CD37;
    (d) TSG101, Alix, CD109 y/o thy-1; y/o
    (e) CD133.
  7. 7. La micropartícula de células madre neurales de cualquier reivindicación anterior, para uso en terapia.
  8. 8. La micropartícula de células madre neurales para su uso de acuerdo con la reivindicación 7, en la que la terapia:
    (a) es terapia regenerativa;
    (b) es para a:
    (i) Trastorno, enfermedad o déficit neurológico, tal como enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, accidente cerebrovascular o ALS;
    (ii) Trastornos de almacenamiento lisosomal;
    (iii) Trastornos cardiovasculares, tales como infarto de miocardio, insuficiencia cardíaca congestiva, enfermedad arterial periférica, úlceras diabéticas, cicatrización de heridas;
    (iv) Enfermedades del pulmón, que incluyen fibrosis pulmonar idiopática, síndrome de dificultad respiratoria, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, hipertensión pulmonar idiopática, fibrosis quística y asma;
    (v) Trastornos metabólicos o inflamatorios, como diabetes (I o II), artritis reumatoide, osteoartritis, lupus, enfermedad de Crohn, enfermedad inflamatoria intestinal o enfermedad de injerto contra huésped;
    (vi) Trastornos psiquiátricos, tales como depresión, trastorno bipolar, esquizofrenia o un trastorno del síndrome autista tal como autismo, síndrome de Asperger o síndrome de Rett;
    (vii) Enfermedades de la retina que causan ceguera, tales como la degeneración macular relacionada con la edad, enfermedad de Stargardt, retinopatía diabética, retinitis pigmentosa; y
    (viii) Enfermedades desmielinizantes, como esclerosis múltiple, parálisis cerebral, mielinólisis central pontina, tabes dorsal, mielitis transversa, enfermedad de Devic, leucoencefalopatía multifocal progresiva, neuritis óptica, leucodistrofias, síndrome de Guillain-Barre, neuropatía periférica anti-MAG y enfermedad de Charcot-Marie-Tooth; y/o
    (c) mejora la recuperación funcional y/o cognitiva.
    5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
  9. 9. La micropartícula de células madre neurales para uso de acuerdo con la reivindicación 7 o la reivindicación 8, en la que la terapia es para accidente cerebrovascular, enfermedad arterial periférica o enfermedades de la retina que causan ceguera.
  10. 10. La micropartícula de células madre neurales para uso de acuerdo con la reivindicación 7 o la reivindicación 8, en la que:
    (i) la micropartícula es un exosoma y la terapia es de una enfermedad o afección que requiere reemplazo, regeneración o reparación del tejido; o
    (ii) la micropartícula es una microvesícula y la terapia es de una enfermedad que requiere angiogénesis o una enfermedad, trastorno o déficit neurológico.
  11. 11. Un método para producir una micropartícula de células madre neurales como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-6, que comprende aislar la micropartícula de un medio acondicionado de células madre neurales.
  12. 12. Un método para producir una micropartícula de célula madre, que comprende aislar una micropartícula de un medio acondicionado de células madre en el que:
    (i) el medio acondicionado de células madre comprende uno o más componentes que inducen la liberación de micropartículas por las células madre en el medio, en el que uno o más componentes se seleccionan entre: factor de crecimiento transformante beta (TGF-p), interferón gamma (INF-y) y factor de necrosis tumoral alfa (TNF-a);
    (ii) las células madre se cultivaron en condiciones hipóxicas;
    (iii) las células madre se cocultivaron con un tipo de célula diferente, opcionalmente en el que el tipo de célula diferente es una célula endotelial; y/o
    (iv) las células madre se cultivaron en un biorreactor de múltiples compartimientos;
    opcionalmente en el que la célula madre es una célula madre neural, opcionalmente como se define en la reivindicación 3.
  13. 13. Una composición que comprende una micropartícula de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-6 y un excipiente, vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.
  14. 14. Un método de selección para un agente que altera la tasa de producción de una micropartícula por una célula madre, que comprende poner en contacto una célula madre con un agente candidato y observar si la tasa de producción de micropartículas por la célula madre contactada aumenta o disminuye en comparación con un control.
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