ES2693194T3 - Métodos mejorados para la purificación de vectores de AAV recombinantes - Google Patents
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Abstract
Un método para aislar una población de partículas de virus adenoasociado recombinante (rAAV) de impurezas de producción en una corriente de alimentación, que comprende las etapas de: (a) poner en contacto una corriente de alimentación que contiene las partículas de rAAV con un medio cromatográfico de interacción hidrófoba (HIC) en un tampón de salinidad alta, en donde el tampón de salinidad alta comprende entre 0,5 M y 2,0 M de citrato, en donde las partículas de rAAV y las impurezas de producción se unen al medio HIC; y (b) eluir las partículas de rAAV unidas al medio HIC con un tampón de salinidad media, en donde el tampón de salinidad media comprende menos de 0,5 M de citrato.
Description
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DESCRIPCION
Metodos mejorados para la purificacion de vectores de AAV recombinantes Campo de la invencion
La presente divulgacion, incluyendo la presente invencion, se refiere generalmente al campo de la purificacion de vectores de virus adenoasociados recombinantes (rAAV) que se pueden usar para la transferencia genica y especificamente para terapia o vacunacion genicas. Mas especificamente, se refiere a metodos para la purificacion de vectores de rAAV recombinantes que estan sustancialmente libres de componentes de produccion producidos durante el procedimiento tales como acidos nucleicos celulares, proteinas celulares, virus cooperadores y componentes del medio.
Antecedentes de la invencion
Los virus adenoasociados (AAV) tienen caracteristicas unicas que los hacen atractivos como vectores para terapia genica y vacunas geneticas. La infeccion por AAV de celulas cultivadas es no citopatica, y la infeccion natural de seres humanos y otros animales es oculta, asintomatica y no esta implicada en la etiologia de ninguna enfermedad humana. Por otra parte, los AAV infectan a una amplia gama de tipos de celulas incluyendo muchas celulas de mamifero, permitiendo la posibilidad de orientarse a muchos tejidos diferentes in vivo. Los AAV infectan celulas que se dividen lentamente y que no se dividen y pueden persistir esencialmente durante la vida de esas celulas como un episoma nuclear transcripcionalmente activo (elemento extracromosomico). Son muy raras las copias integradas de vector de rAAV en organos tales como el higado o el musculo. La transferencia genica a largo plazo eficaz se ha presentado en un numero de tipos de celulas incluyendo el ojo, el SNC y el musculo. Veanse, p. ej., X. Xiao y cols., J. Virol. 70(11 ):8098-8108 (1996); R.R. Ali y cols., Hum. Mol. Genet. 5(5):591 -94 (1996). Los estudios clinicos actuales se han enfocado en gran parte al uso de 2 vectores de rAAV, pero un numero de trabajos ha demostrado que otros serotipos de AAV, incluyendo rAAV-1, rAAV-4, rAAV-5 y rAAV-8, tienen una biodistribucion in vivo unica que los hace serotipos virales atractivos para probar en estudios clinicos.
El virus adenoasociado (AAV) es un parvovirus deficiente en replicacion, cuyo genoma de ADN de una sola hebra tiene aproximadamente 4,7 kb de longitud incluyendo repeticiones terminales invertidas (ITRs) de 145 nucleotidos. La secuencia nucleotidica del genoma del serotipo 2 de AAV (AAV2) se presenta en Srivastava y cols., J. Virol., 45: 555-564 (1983) segun se corregia por Ruffing y cols., J. Gen. Virol., 75: 3385-3392 (1994). Secuencias de accion cis que dirigen la replicacion (rep) de ADN viral, la encapsidacion/el empaquetado y la integracion en el cromosoma de la celula hospedadora estan contenidas dentro de las ITRs. Tres promotores de AAV, p5, p19 y p40 (nombrados por sus localizaciones cartograficas relativas), impulsan la expresion de los dos marcos de lectura abiertos internos de AAV que codifican genes rep y cap. Los dos promotores de rep (p5 y p19), acoplados con el empalme diferencial del unico intron de AAV en los nucleotidos 2107 y 2227, dan como resultado la produccion de cuatro proteinas rep (rep78, rep68, rep52 y rep40) a partir del gen rep. Las proteinas rep poseen multiples propiedades enzimaticas que finalmente son responsables de replicar el genoma viral. El gen cap se expresa a partir del promotor p40 y codifica las tres proteinas de la capside VP1, VP2 y VP3. Sitios de empalme y de comienzo de la traduccion no de consenso alternativos son responsables de la produccion de las tres proteinas de la capside relacionadas. Un unico sitio de poliadenilacion de consenso esta situado en la posicion cartografica 95 del genoma del AAV. El ciclo vital y la genetica de AAV se revisan en Muzyczka, Current Topics in Microbiology and Immunology, 158: 97-129 (1992).
Las particulas de AAV comprenden una capside proteinica que tiene tres proteinas de la capside, VP1, VP2 y VP3, que envuelven un genoma de ADN de una sola hebra lineal de ~4,6 kb. Las particulas individuales empaquetan solo una hebra de la molecula de ADN, pero esta puede ser la hebra mas o menos. Las particulas que contienen cualquier hebra son infecciosas, y la replicacion se produce mediante la conversion de la unica hebra infecciosa parental en una forma doble, y la amplificacion posterior, a partir de cuya progenie las hebras individuales se desplazan y se empaquetan en capsides. Copias de doble hebra o de una sola hebra de genomas de AAV (a veces denominadas "ADN proviral" o "provirus") pueden insertarse en plasmidos bacterianos o fagemidos, y transfectarse en celulas infectadas con adenovirus. Veanse Carter, HANDBOOK OF PARVOVIRUSES, Vol. I, pp. 169-228 (1989), y Berns, VIROLOGY, pp. 1743-1764, Raven Press, (1990) para una revision general de AAV.
La produccion de vectores de rAAV requiere generalmente cuatro elementos comunes: 1) una celulas hospedadora permisiva para la replicacion; 2) una funcion de virus cooperador que puede ser suministrada por virus cooperadores adecuados tales como adenovirus o herpesvirus, o alternativamente por construcciones plasmidicas que contienen las funciones cooperadoras adenovirales minimas; 3) una construccion rep-cap de transempaquetado; y 4) un medio de produccion adecuado.
Se pueden producir particulas de AAV recombinante a partir del empaquetado de lisados celulares. Vease, p. ej., Chirico y Trempe (1998) J. Virol. Methods 76:31-41. Sin embargo, el lisado celular contiene diversos componentes celulares tales como ADN de la celula hospedadora, proteinas de la celula hospedadora, componentes del medio y cualquier virus cooperador o ADN plasmidico de virus cooperador que se puedan separar del vector de rAAV antes de que sea adecuado para el uso in vivo. Avances recientes en la produccion de rAAV incluyen el uso de
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procedimientos de suspension de celulas no adherentes en biorreactores de tanque agitado y condiciones de produccion por las que los vectores de rAAV se liberan en el medio o el sobrenadante reduciendo la concentracion de componentes celulares del hospedador presentes en el material de produccion pero conteniendo todavia cantidades apreciables de impurezas producidas durante el procedimiento. Veanse la Patente de EE. UU. 6.566.118 y el documento PCT WO 99/11764. Por lo tanto, las particulas de rAAV pueden recogerse del medio y/o el lisado celular y purificarse adicionalmente.
Los metodos que incluyen centrifugacion con gradiente de densidad empleados para la purificacion de vectores de rAAV y en particular rAAV-2 no se pueden someter a una ampliacion a escala. Trabajos recientes para vectores de rAAV-2 han descrito metodos de purificacion que emplean cromatografia de intercambio ionico incluyendo cromatografia de intercambio ionico inversa (incluyendo cromatografia cationica y anionica). Veanse, por ejemplo, la Patente de EE. UU. N° 6.566.118 y el documento PCT WO 99/11764 que divulgan metodos para usar una combinacion de cromatografia de intercambio ionico inversa para purificar vectores de virus adenoasociados recombinantes a partir de un sobrenadante de cultivo y/o un lisado celular. Mejoras adicionales en preparaciones de estirpes de rAAV incluyen el uso de tratamiento del lisado celular con desoxicolato, la separacion con gradiente de iodixanol antes de la cromatografia de afinidad, que han dado como resultado rAAV2 de titulo alto (Clark y cols., Hum. Mol. Genet. 10(6):1031 -39 (1999); Zolotukhin y cols., Gene Therapy 6(6):973-985 (1999)). O'Riordan y cols. (O'Riordan y cols., J. Gene Med. 2:444-454 (2000); Patente de EE. UU. N° 7.015.026) tambien presentaron un procedimiento de preparacion cromatografica ampliable a escala para vectores de virus adenoasociados recombinantes y, segun se ejemplifica particularmente, vectores de rAAV-2, usando cromatografia de intercambio ionico, cromatografia en hidroxiapatito, cromatografia de afinidad en sulfato de celufina y cromatografia en quelato de cinc.
Datos recientes indican que serotipos de la capside de rAAV tales como rAAV-1, 4, 5 y 8 se unen debilmente a resinas anionicas bien como una estirpe de virus purificada o bien en presencia de impurezas de produccion producidas durante el procedimiento tales como ADN de la celula hospedadora, proteinas de la celula hospedadora, albumina serica, componentes del medio y componentes del virus cooperador. Por consiguiente, la purificacion de esos serotipos de capside implica tipicamente la cromatografia de intercambio anionico en combinacion con otros metodos de purificacion, tales como centrifugacion en gradiente de densidad de iodixinol. Veanse, p. ej., Zolotukhin y cols., Methods 28(2):158-167 (2002) y Kaludov y cols., Hum. Gene Therapy 13:1235-1243 (2002); y la Publicacion de Patente de EE. UU. N° 2004/0110266 A1. Sin embargo, esos metodos no son facilmente ampliables a escala hasta procedimientos a escala comercial.
Segun esto, en el desarrollo de vectores de AAV recombinantes tales como los usados en terapia genica y vacunas genicas, existe una necesidad de metodos para purificar vectores de rAAV a partir de componentes de produccion producidos durante el procedimiento incluyendo un virus cooperador, asi como proteinas de virus cooperador, proteinas celulares, ADN de celulas hospedadoras y componentes del medio presentes en la estirpe de produccion de rAAV. Tales metodos se deben emplear eficazmente a una escala que sea adecuada para la aplicacion practica de tecnicas de terapia genica. Por otra parte, existe una necesidad de desarrollar procedimientos de purificacion para vectores de rAAV que sean ampliables a escala para dar un titulo alto, estirpes comerciales muy purificadas utiles para la terapia genica y vacunas genicas de rAAV. Mas particularmente, existe una necesidad de desarrollar procedimientos de purificacion para vectores de rAAV que se unan debilmente a resinas cromatograficas y en particular resinas anionicas.
Aunque la divulgacion proporcionada en la presente se ha descrito con algun detalle a modo de ilustracion y ejemplo con propositos de claridad de comprension, sera facilmente evidente para los expertos normales en la tecnica a la luz de las ensenanzas de esta divulgacion que se pueden hacer en la misma ciertos cambios y modificaciones.
Sumario de la invencion
La divulgacion proporciona metodos para aislar una poblacion de particulas de virus adenoasociado recombinante (rAAV) de cualquier serotipo de capside de impurezas producidas durante el procedimiento al capturar las particulas de rAAV sobre un medio cromatografico de apatito en presencia de polietilenglicol (PEG). Los metodos de la divulgacion implican un procesamiento aguas arriba (tal como, por ejemplo, centrifugacion, tratamiento con Benzonase®, filtracion con intercambio anionico y/o filtracion con flujo tangencial) asi como un procesamiento aguas abajo (tal como, por ejemplo, inactivacion termica, filtracion, cromatografia de interaccion hidrofoba, cromatografia de exclusion por tamano y/o cromatografia de intercambio anionico). Los metodos aguas arriba y aguas abajo se pueden usar solos o en diversas combinaciones.
La divulgacion proporciona metodos para aislar una poblacion de particulas de virus adenoasociado recombinante (rAAV) a partir de impurezas producidas durante el procedimiento en una corriente de alimentacion, que comprenden las etapas de: (a) poner en contacto una corriente de alimentacion que contiene particulas de rAAV con un medio cromatografico de apatito en presencia de polietilenglicol (PEG), en donde las particulas de rAAV se unen al medio cromatografico de apatito; y (b) eluir las particulas de rAAV unidas al medio cromatografico de apatito con un tampon de elucion que contiene menos de 3% (p/v) de PEG. En ciertos casos, el medio cromatografico de apatito es hidroxiapatito ceramico (CHT) o fluoroapatito ceramico (CFT). En ciertos casos, las particulas de rAAV unidas al
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medio cromatografico de apatito se eluyen con un tampon de elucion que contiene menos de 3% (p/v) de PEG. En ciertos casos, las particulas de rAAV unidas al medio cromatografico de apatito se eluyen con un tampon de elucion en ausencia de PEG.
En algunos casos, la union especifica del medio cromatografico de apatito esta entre 106 y 1016 particulas resistentes a desoxirribonucleasa (DRPs) por mililitro. En algunos casos, la union especifica del medio cromatografico de apatito esta entre 108 y 1016 particulas resistentes a desoxirribonucleasa (DRPs) por mililitro. En algunos casos, la union especifica del medio cromatografico de apatito esta entre 1010 y 1016 particulas resistentes a desoxirribonucleasa (DRPs) por mililitro. En algunos casos, la union especifica del medio cromatografico de apatito esta entre 1012 y 1016 particulas resistentes a desoxirribonucleasa (DRPs) por mililitro. En algunos casos, la union especifica del medio cromatografico de apatito esta entre 1014 y 1016 particulas resistentes a desoxirribonucleasa (DRPs) por mililitro.
En algunos casos, el metodo comprende ademas una etapa de filtracion con intercambio anionico antes de la etapa cromatografica en apatito, en la que las particulas de rAAV estan en el flujo pasante de la filtracion con intercambio anionico. En algunos casos, el metodo comprende ademas concentrar las particulas de rAAV desde el flujo pasante de la filtracion con intercambio anionico mediante filtracion con flujo tangencial antes de la etapa cromatografica en apatito. En algunos casos, el metodo comprende ademas una etapa de unir las particulas de rAAV de la corriente de alimentacion eluida del medio cromatografico de apatito a un medio cromatografico anionico. En algunos casos, el metodo comprende ademas una etapa de inactivacion termica para inactivar el virus cooperador. En algunos casos, el metodo comprende ademas una etapa de unir las particulas de rAAV de la corriente de alimentacion a una cromatografia de interaccion hidrofoba despues de la cromatografia en apatito.
En algunos casos, la corriente de alimentacion que contiene las particulas de rAAV se pone en contacto con un medio cromatografico de apatito en presencia de polietilenglicol (PEG) y un tampon basico. En algunos casos, el tampon basico esta entre pH 7,2 y 10, entre pH 7,4 y 10, entre pH 7,6 y 10, entre pH 7,8 y 10, entre pH 8,0 y 10,0, entre pH 8,2 y 10,0, entre pH 8,4 y 10,0, entre pH 8,6 y 10,0, entre pH 8,8 y 10, entre pH 9,0 y 10,0, entre pH 9,2 y 10, entre pH 9,4 y 10,0, entre pH 9,6 y 10,0, o entre pH 9,8 y 10,0. En algunos casos, el tampon basico tiene un pH de aproximadamente cualquiera de 7,2, 7,6, 7,8, 8,0, 8,2, 8,4, 8,6, 8,8, 9,0, 9,2, 9,4, 9,6, 9,8 y 10,0. Se puede usar cualquier tampon basico conocido en la especialidad. En algunos casos, el tampon basico comprende borato. En algunos casos, el tampon basico es borato.
En algunos casos, la corriente de alimentacion que contiene las particulas de rAAV se pone en contacto con un medio cromatografico de apatito en presencia de polietilenglicol (PEG). Por ejemplo, se puede usar entre aproximadamente 3% (p/v) y aproximadamente 10% (p/v) de PEG. En algunos casos, la corriente de alimentacion que contiene las particulas de rAAV se pone en contacto con un medio cromatografico de apatito en presencia de aproximadamente 3% (p/v), aproximadamente 3,5% (p/v), aproximadamente 4% (p/v), aproximadamente 4,5% (p/v), aproximadamente 5% (p/v), aproximadamente 5,5% (p/v), aproximadamente 6% (p/v), aproximadamente 6,5% (p/v), aproximadamente 7% (p/v), aproximadamente 7,5% (p/v), aproximadamente 8% (p/v), aproximadamente 8,5% (p/v), aproximadamente 9% (p/v), aproximadamente 9,5% (p/v) o aproximadamente 10% (p/v) de PEG.
En algunos casos, el PEG tiene un peso molecular medio entre aproximadamente 5.000 (PEG5000) gramos por mol y aproximadamente 15.000 (PEG15000) gramos por mol, tal como, aproximadamente 5.000 gramos por mol (PEG5000), aproximadamente 6.000 (PEG6000) gramos por mol, aproximadamente 7.000 (PEG7000) gramos por mol, aproximadamente 8.000 (PEG8000) gramos por mol, aproximadamente 9.000 (PEG9000) gramos por mol, aproximadamente 10.000 (PEG10000) gramos por mol, aproximadamente 11.000 (PEG11000) gramos por mol, aproximadamente 12.000 (PEG12000) gramos por mol, aproximadamente 13.000 (PEG13000) gramos por mol, aproximadamente 14.000 (PEG14000) gramos por mol, y aproximadamente 15.000 (PEG15000) gramos por mol. En ciertos casos, el PEG tiene un peso molecular medio de aproximadamente 5.000 (PEG5000) gramos por mol. En
ciertos casos, el PEG tiene un peso molecular medio de aproximadamente 6.000 (PEG6000) gramos por mol. En
ciertos casos, el PEG tiene un peso molecular medio de aproximadamente 8.000 (PEG8000) gramos por mol. En
ciertos casos, el PEG tiene un peso molecular medio de aproximadamente 10.000 (PEG10000) gramos por mol. En
ciertos casos, el PEG tiene un peso molecular medio de aproximadamente 15.000 (PEG15000) gramos por mol.
En algunos casos, la corriente de alimentacion que contiene las particulas de rAAV se pone en contacto con un medio cromatografico de apatito en presencia de entre aproximadamente 3% (p/v) y aproximadamente 10% (p/v) de PEG6000. En algunos casos, la corriente de alimentacion que contiene las particulas de rAAV se pone en contacto con un medio cromatografico de apatito en presencia de aproximadamente 3% (p/v) de PEG6000. En algunos casos, la corriente de alimentacion que contiene las particulas de rAAV se pone en contacto con un medio cromatografico de apatito en presencia de aproximadamente 4% (p/v) de PEG6000. En algunos casos, la corriente de alimentacion que contiene las particulas de rAAV se pone en contacto con un medio cromatografico de apatito en presencia de aproximadamente 5% (p/v) de PEG6000. En algunos casos, la corriente de alimentacion que contiene las particulas de rAAV se pone en contacto con un medio cromatografico de apatito en presencia de aproximadamente 6% (p/v) de PEG6000. En algunos casos, la corriente de alimentacion que contiene las particulas de rAAV se pone en contacto con un medio cromatografico de apatito en presencia de aproximadamente 7% (p/v) de PEG6000. En algunos casos, la corriente de alimentacion que contiene las particulas de rAAV se pone en contacto
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con un medio cromatografico de apatito en presencia de aproximadamente 8% (p/v) de PEG6000. En algunos casos, la corriente de alimentacion que contiene las particulas de rAAV se pone en contacto con un medio cromatografico de apatito en presencia de aproximadamente 9% (p/v) de PEG6000. En algunos casos, la corriente de alimentacion que contiene las particulas de rAAV se pone en contacto con un medio cromatografico de apatito en presencia de aproximadamente 10% (p/v) de PEG6000.
En algunos casos, la corriente de alimentacion que contiene las particulas de rAAV se pone en contacto con un medio cromatografico de apatito en presencia de entre aproximadamente 3% (p/v) y aproximadamente 10% (p/v) de PEG8000. En algunos casos, la corriente de alimentacion que contiene las particulas de rAAV se pone en contacto con un medio cromatografico de apatito en presencia de aproximadamente 3% (p/v) de PEG8000. En algunos casos, la corriente de alimentacion que contiene las particulas de rAAV se pone en contacto con un medio cromatografico de apatito en presencia de aproximadamente 4% (p/v) de PEG8000. En algunos casos, la corriente de alimentacion que contiene las particulas de rAAV se pone en contacto con un medio cromatografico de apatito en presencia de aproximadamente 5% (p/v) de PEG8000. En algunos casos, la corriente de alimentacion que contiene las particulas de rAAV se pone en contacto con un medio cromatografico de apatito en presencia de aproximadamente 6% (p/v) de PEG8000. En algunos casos, la corriente de alimentacion que contiene las particulas de rAAV se pone en contacto con un medio cromatografico de apatito en presencia de aproximadamente 7% (p/v) de PEG8000. En algunos casos, la corriente de alimentacion que contiene las particulas de rAAV se pone en contacto con un medio cromatografico de apatito en presencia de aproximadamente 8% (p/v) de PEG8000. En algunos casos, la corriente de alimentacion que contiene las particulas de rAAV se pone en contacto con un medio cromatografico de apatito en presencia de aproximadamente 9% (p/v) de PEG8000. En algunos casos, la corriente de alimentacion que contiene las particulas de rAAV se pone en contacto con un medio cromatografico de apatito en presencia de aproximadamente 10% (p/v) de PEG8000.
En algunos casos, la corriente de alimentacion que contiene las particulas de rAAV se pone en contacto con un medio cromatografico de apatito en presencia de entre aproximadamente 3% (p/v) y aproximadamente 10% (p/v) de PEG10000. En algunos casos, la corriente de alimentacion que contiene las particulas de rAAV se pone en contacto con un medio cromatografico de apatito en presencia de aproximadamente 3% (p/v) de PEG10000. En algunos casos, la corriente de alimentacion que contiene las particulas de rAAV se pone en contacto con un medio cromatografico de apatito en presencia de aproximadamente 4% (p/v) de PEG10000. En algunos casos, la corriente de alimentacion que contiene las particulas de rAAV se pone en contacto con un medio cromatografico de apatito en presencia de aproximadamente 5% (p/v) de PEG10000. En algunos casos, la corriente de alimentacion que contiene las particulas de rAAV se pone en contacto con un medio cromatografico de apatito en presencia de aproximadamente 6% (p/v) de PEG10000. En algunos casos, la corriente de alimentacion que contiene las particulas de rAAV se pone en contacto con un medio cromatografico de apatito en presencia de aproximadamente 7% (p/v) de PEG10000. En algunos casos, la corriente de alimentacion que contiene las particulas de rAAV se pone en contacto con un medio cromatografico de apatito en presencia de aproximadamente 8% (p/v) de PEG10000. En algunos casos, la corriente de alimentacion que contiene las particulas de rAAV se pone en contacto con un medio cromatografico de apatito en presencia de aproximadamente 9% (p/v) de PEG10000. En algunos casos, la corriente de alimentacion que contiene las particulas de rAAV se pone en contacto con un medio cromatografico de apatito en presencia de aproximadamente 10% (p/v) de PEG10000.
En algunos casos, la corriente de alimentacion que contiene las particulas de rAAV se pone en contacto con un medio cromatografico de apatito en presencia de entre aproximadamente 3% (p/v) y aproximadamente 10% (p/v) de PEG15000. En algunos casos, la corriente de alimentacion que contiene las particulas de rAAV se pone en contacto con un medio cromatografico de apatito en presencia de aproximadamente 3% (p/v) de PEG15000. En algunos casos, la corriente de alimentacion que contiene las particulas de rAAV se pone en contacto con un medio cromatografico de apatito en presencia de aproximadamente 4% (p/v) de PEG15000. En algunos casos, la corriente de alimentacion que contiene las particulas de rAAV se pone en contacto con un medio cromatografico de apatito en presencia de aproximadamente 5% (p/v) de PEG15000. En algunos casos, la corriente de alimentacion que contiene las particulas de rAAV se pone en contacto con un medio cromatografico de apatito en presencia de aproximadamente 6% (p/v) de PEG15000. En algunos casos, la corriente de alimentacion que contiene las particulas de rAAV se pone en contacto con un medio cromatografico de apatito en presencia de aproximadamente 7% (p/v) de PEG15000. En algunos casos, la corriente de alimentacion que contiene las particulas de rAAV se pone en contacto con un medio cromatografico de apatito en presencia de aproximadamente 8% (p/v) de PEG15000. En algunos casos, la corriente de alimentacion que contiene las particulas de rAAV se pone en contacto con un medio cromatografico de apatito en presencia de aproximadamente 9% (p/v) de PEG15000. En algunos casos, la corriente de alimentacion que contiene las particulas de rAAV se pone en contacto con un medio cromatografico de apatito en presencia de aproximadamente 10% (p/v) de PEG15000.
En algunos casos, la corriente de alimentacion que contiene las particulas de rAAV se pone en contacto con un medio cromatografico de apatito en un tampon que comprende aproximadamente 20 mM de borato pH 9,0, y aproximadamente 5% de PEG (tal como PEG6000). En algunos casos, la corriente de alimentacion se mezcla en linea con un volumen igual de un tampon que comprende aproximadamente 40 mM de borato a pH 9,0 y aproximadamente 10% de PEG para dar una concentracion final de aproximadamente 20 mM de borato a pH 9,0 y aproximadamente 5% de PEG.
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En algunos casos, el medio cromatografico de apatito con las particulas de rAAV unidas al medio se lava para retirar las impurezas producidas durante el procedimiento antes de eluir las particulas de rAAV. En algunos casos, el medio cromatografico de apatito se lava una o mas veces con un tampon de lavado que contiene concentraciones decrecientes de PEG para retirar las impurezas producidas durante el procedimiento. En algunos casos, el medio cromatografico de apatito se lava una o mas veces con un tampon de lavado que contiene entre aproximadamente 3% (p/v) y aproximadamente 10% (p/v) de PEG. En algunos casos, el tampon de lavado contiene aproximadamente cualquiera de 10% (p/v), 9,5% (p/v), 9% (p/v), 8,5% (p/v), 8% (p/v), 7,5% (p/v), 7% (p/v), 6,5% (p/v), 6% (p/v), 5,5% (p/v), 5% (p/v), 4,5% (p/v), 4% (p/v), 3,5% (p/v) y 3% (p/v) de PEG. En algunos casos, el medio cromatografico de apatito se lava una o mas veces con un tampon de lavado que contiene 7,5% (p/v) de PEG6000. En algunos casos, el medio cromatografico de apatito se lava una o mas veces con un tampon de lavado que contiene 7,5% (p/v) de PEG8000. En algunos casos, el medio cromatografico de apatito se lava una o mas veces con un tampon de lavado que contiene 7,5% (p/v) de PEG10000. En algunos casos, el medio cromatografico de apatito se lava una o mas veces con un tampon de lavado que contiene 7,5% (p/v) de PEG15000. En algunos casos, el medio cromatografico de apatito se lava una o mas veces con un tampon de lavado que contiene aproximadamente 5% (p/v) de PEG6000. En algunos casos, el medio cromatografico de apatito se lava una o mas veces con un tampon de lavado que contiene aproximadamente 5% (p/v) de PEG8000. En algunos casos, el medio cromatografico de apatito se lava una o mas veces con un tampon de lavado que contiene aproximadamente 5% (p/v) de PEG10000. En algunos casos, el medio cromatografico de apatito se lava una o mas veces con un tampon de lavado que contiene aproximadamente 5% (p/v) de PEG15000. En algunos casos, el medio cromatografico de apatito se lava una o mas veces con un tampon de lavado que contiene menos de aproximadamente 3% (p/v) de PEG6000. En algunos casos, el medio cromatografico de apatito se lava una o mas veces con un tampon de lavado que contiene menos de aproximadamente 3% (p/v) de PEG8000. En algunos casos, el medio cromatografico de apatito se lava una o mas veces con un tampon de lavado que contiene menos de aproximadamente 3% (p/v) de PEG10000. En algunos casos, el medio cromatografico de apatito se lava una o mas veces con un tampon de lavado que contiene menos de aproximadamente 3% (p/v) de PEG15000. En algunos casos, el medio cromatografico de apatito se lava una o mas veces con un tampon de lavado que no contiene PEG.
En algunos casos, el tampon de lavado contiene tampones conocidos en la especialidad. En algunos casos, el tampon de lavado comprende un tampon seleccionado del grupo que consiste en borato, acido N-2- hidoxietilpiperacino-N'-2-etanosulfonico (HEPES) y Tris-HCl. En algunos casos, el tampon de lavado comprende o es borato. En algunos casos, el tampon de lavado comprende o es HEPES. En algunos casos, el tampon de lavado comprende o es Tris-HCl. En algunos casos, el tampon de lavado esta a pH basico. En algunos casos, el tampon de lavado tiene un pH entre pH 7,0 y pH 10,0, entre pH 7,2 y pH 10,0, entre pH 7,4 y pH 10,0, entre pH 7,6 y pH 10,0, entre pH 7,8 y pH 10,0, pH 8,0 y pH 10,0, pH 8,2 y pH 10,0, entre pH 8,4 y pH 10,0, entre pH 8,6 y pH 10,0, entre pH 8,8 y pH 10,0, entre pH 9,0 y pH 10,0, entre pH 9,2 y pH 10,0, entre pH 9,4 y pH 10,0, entre pH 9,6 y pH 10,0 o entre pH 9,8 y pH 10,0. En algunos casos, el tampon de lavado tiene un pH de 7,0, 7,2, 7,4, 7,6, 7,8, 8,0, 8,2, 8,4, 8,6, 8,8,
9.0, 9,2, 9,4, 9,6, 9,8 o 10,0. En algunos casos, el tampon de lavado comprende o es borato a un pH entre 8,0 y
10.0. En algunos casos, el tampon de lavado comprende o es borato a pH 8,0. En algunos casos, el tampon de lavado comprende o es borato a pH 9,0. En algunos casos, el tampon de lavado comprende o es borato a pH 10,0. En algunos casos, el tampon de lavado comprende o es HEPES a un pH entre 7,0 y 10,0. En algunos casos, el tampon de lavado comprende o es HEPES a pH 7,0. En algunos casos, el tampon de lavado comprende o es HEPES a pH 8,0. En algunos casos, el tampon de lavado comprende o es HEPES a pH 9,0. En algunos casos, el tampon de lavado comprende o es HEPES a pH 10,0. En algunos casos, el tampon de lavado comprende o es Tris- HCl a un pH entre 7,0 y 10,0. En algunos casos, el tampon de lavado comprende o es Tris-HCl a pH 7,0. En algunos casos, el tampon de lavado comprende o es Tris-HCl a pH 8,0. En algunos casos, el tampon de lavado comprende o es Tris-HCl a pH 9,0. En algunos casos, el tampon de lavado comprende o es Tris-HCl a pH 10,0. En algunos casos, el tampon de lavado comprende ademas entre 100 y 500 mM de fosfato. En algunos casos, el tampon de lavado comprende ademas entre 50 y 250 mM de NaCl.
En algunos casos, la etapa de lavado comprende un primer lavado con un tampon de lavado que comprende aproximadamente 30 mM de borato a pH aproximadamente 9,0 y aproximadamente 7,5% de PEG; un segundo lavado con un tampon de lavado que comprende aproximadamente 150 mM de fosfato potasico, aproximadamente 20 mM de borato a pH aproximadamente 9,0 y aproximadamente 5% de PEG; un tercer lavado con un tampon de lavado que comprende aproximadamente 20 mM de borato a pH aproximadamente 9,0 y aproximadamente 5% de PEG; y un cuarto lavado con un tampon de lavado que comprende aproximadamente 20 mM de HEPES a pH aproximadamente 7,0 y 150 mM de NaCl.
En algunos casos, las particulas de rAAV unidas al medio cromatografico de apatito se eluyen con un tampon de elucion que contiene bajas concentraciones de PEG o en ausencia de PEG. En algunos casos, el tampon de elucion contiene menos de aproximadamente 3% (p/v) de PEG, menos de aproximadamente 2% (p/v) de PEG o menos de aproximadamente 1% (p/v) de PEG. En algunos casos, el tampon de elucion contiene aproximadamente 2,5% (p/v), aproximadamente 2% (p/v), aproximadamente 1,5% (p/v), aproximadamente 1% (p/v) o aproximadamente 0,5% (p/v) de PEG o no contiene PEG. En algunos casos, el tampon de elucion contiene menos de aproximadamente 3% (p/v) de PEG6000. En algunos casos, el tampon de elucion contiene menos de aproximadamente 3% (p/v) de PEG8000. En algunos casos, el tampon de elucion contiene menos de aproximadamente 3% (p/v) de PEG10000. En algunos
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casos, el tampon de elucion contiene menos de aproximadamente 3% (p/v) de PEG15000. En algunos casos, las particulas de rAAV unidas al medio cromatografico de apatito se eluyen con un tampon de elucion en ausencia de PEG. En algunos casos, el tampon de elucion comprende un tampon seleccionado del grupo que consiste en borato, acido N-2-hidoxietilpiperacino-N’-2-etanosulfonico (HEPES) y Tris-HCl. En algunos casos, el tampon de elucion comprende o es borato. En algunos casos, el tampon de elucion comprende o es HEPES. En algunos casos, el tampon de elucion comprende o es Tris-HCl. En algunos casos, el tampon de elucion esta a pH neutro. En algunos casos, el tampon de elucion comprende o es HEPES a pH neutro. En algunos casos, el tampon de elucion comprende o es Tris-HCl a pH neutro. En algunos casos, el tampon de elucion comprende ademas menos de 100 mM de fosfato. En algunos casos, el tampon de elucion comprende ademas menos de 50 mM de fosfato. En algunos casos, el tampon de elucion comprende ademas entre 50 y 250 mM de NaCl. En algunos casos, las particulas de rAAV unidas al medio cromatografico de apatito se eluyen con un tampon de elucion que comprende aproximadamente 50 mM de fosfato potasico, aproximadamente 20 mM de HEPES a pH aproximadamente 7,0, y aproximadamente 150 mM de NaCl.
En algunos casos, el metodo para aislar las particulas de rAAV de impurezas producidas durante el procedimiento en una corriente de alimentacion comprende las etapas de: (a) poner en contacto una corriente de alimentacion que contiene las particulas de rAAV con un medio cromatografico de apatito en presencia de aproximadamente 5% (p/v) de PEG en un tampon basico a pH aproximadamente 9,0, en donde las particulas de rAAV se unen al medio cromatografico de apatito; (b) lavar el medio cromatografico de apatito con un primer tampon de lavado que comprende aproximadamente 30 mM de borato a pH aproximadamente 9,0 y aproximadamente 7,5% de PEG; (c) lavar el medio cromatografico de apatito con un segundo tampon de lavado que comprende aproximadamente 150 de fosfato potasico, aproximadamente 20 mM de borato a pH aproximadamente 9,0, y aproximadamente 5% de PEG; (d) lavar el medio cromatografico de apatito con un tercer tampon de lavado que comprende aproximadamente 20 mM de borato a pH aproximadamente 9,0 y aproximadamente 5% de PEG; (e) lavar el medio cromatografico de apatito con un cuarto tampon de lavado que comprende aproximadamente 20 mM de HEPES a pH aproximadamente 7,0 y 150 mM de NaCl; y (f) eluir las particulas de rAAV unidas al medio cromatografico de apatito con un tampon de elucion que comprende aproximadamente 50 mM de fosfato potasico, aproximadamente 20 mM de HEPES a pH aproximadamente 7,0 y aproximadamente 150 mM de NaCl.
Tambien se proporcionan en la presente metodos para aislar una poblacion de particulas de virus adenoasociado recombinante (rAAV) de impurezas producidas durante el procedimiento en una corriente de alimentacion, que comprende las etapas de: (a) poner en contacto una corriente de alimentacion que contiene las particulas de rAAV con un medio de cromatografia de interaccion hidrofoba (HIC) en un tampon de salinidad alta, en donde las particulas de rAAV y las impurezas producidas durante el procedimiento se unen al medio de HIC; y (b) eluir las particulas de rAAV unidas al medio de HIC con un tampon de salinidad media. Basandose en la divulgacion que esta contenida en la presente, la invencion proporciona un metodo para aislar una poblacion de particulas de virus adenoasociado recombinante (rAAV) de impurezas de produccion en una corriente de alimentacion, que comprende las etapas de: (a) poner en contacto una corriente de alimentacion que contiene las particulas de rAAV con un medio cromatografico de interaccion hidrofoba (HIC) en un tampon de salinidad alta, en donde el tampon de salinidad alta comprende entre 0,5 M y 2,0 M de citrato, en donde las particulas de rAAV y las impurezas de produccion se unen al medio HIC; y (b) eluir las particulas de rAAV unidas al medio HIC con un tampon de salinidad media, en donde el tampon de salinidad media comprende menos de 0,5 M de citrato. Aspectos y realizaciones adicionales de la invencion se indican en las reivindicaciones adjuntas. En algunas realizaciones, el medio de HIC se selecciona del grupo que consiste en resina Tosoh Butyl 650M, Tosoh SuperButyl 650C, Tosoh Phenyl 650C, EMD Fractogel Phenyl y Tosoh Has(butyl). En algunos casos, y en la presente invencion el tampon de salinidad alta comprende o es entre 0,5 M y 2,0 M de citrato (p. ej., citrato sodico). En algunas realizaciones, el tampon de salinidad alta comprende aproximadamente cualquiera de 0,5 M, 0,75 M, 1,0 M, 1,25 M, 1,5 M, 1,75 M, y 2,0 M de citrato. En algunas realizaciones, el tampon de salinidad media comprende o es menos de 0,5 M de citrato (p. ej., citrato sodico). En algunas realizaciones, el tampon de salinidad media comprende entre 0,5 M y aproximadamente 0,3 M de citrato. En algunas realizaciones, el tampon de salinidad media comprende aproximadamente cualquiera de 0,45 M, 0,4 M, 0,35 M, 0,3 M y 0,25 M de citrato. En algunas realizaciones, el tampon de salinidad alta comprende ademas entre 1 y 100 mM de fosfato. En algunas realizaciones, el tampon de salinidad media comprende ademas entre 1 y 100 mM de fosfato. En algunas realizaciones, el tampon de salinidad media eluye las particulas de rAAV sin eluir particulas de rAAV con capsides vacias, capsides parcialmente desnaturalizadas, capsides menos infecciosas y/o capsides parcialmente llenas.
En cualquiera de los casos o realizaciones descritos en la presente, las particulas de rAAV tienen un serotipo de la capside de AAV seleccionado del grupo que consiste en AAV-1, AAV-2, AaV-3, AAV-4, AAV-5, AAV-6, AAV-7, AAV- 8, AAV-9, AAV-10, AAV-11, AAV-12, AAV-13, AAV-14, AAV-15 y AAV-16. En algunos casos o realizaciones, las particulas de rAAV tienen un serotipo de la capside de AAV seleccionado del grupo que consiste en AAV-1, AAV-4, AAV-5, y AAV-8. En algunos casos o realizaciones, las particulas de rAAV tienen un serotipo de la capside de AAV de AAV-1. En algunos casos o realizaciones, las particulas de rAAV tienen un serotipo de la capside de AAV de AAV-4. En algunos casos o realizaciones, las particulas de rAAV tienen un serotipo de la capside de AAV de AAV-5. En algunos casos o realizaciones, las particulas de rAAV tienen un serotipo de la capside de AAV de AAV-8. En algunos casos o realizaciones, las particulas de rAAV comprenden una proteina de la capside de AAV procedente de un serotipo de AAV seleccionado del grupo que consiste en AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, aAv-6, AAV-
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7, AAV-8, AAV-9, AAV-10, AAV-11, AAV-12, AAV-13, AAV-14, AAV-15 y AAV-16. En algunos casos o realizaciones, las partfculas de rAAV tienen un serotipo de la capside de AAV que es un aglutinante anionico debil. En algunos casos o realizaciones, el serotipo de la capside de AAV que es una union anionica debil se selecciona del grupo que consiste en AAV-1, AAV-4, AAV-5 y AAV-8. En algunos casos o realizaciones, la composicion que contiene partfculas de rAAV comprende ademas contaminantes de cultivos de produccion. En algunos casos o realizaciones, los contaminantes de cultivos de produccion comprenden partfculas de rAAV danadas, contaminantes de celulas hospedadoras, contaminantes virus cooperadores y/o contaminantes de cultivos celulares. En algunos casos o realizaciones, los contaminantes de celulas hospedadoras comprenden ADN de celulas hospedadoras, plasmidos, o una protefna de celula hospedadora. En algunos casos o realizaciones, los contaminantes del virus cooperador comprenden partfculas del adenovirus, ADN del adenovirus o protefnas del adenovirus. En algunos casos o realizaciones, los contaminantes del cultivo celular comprenden componentes del medio, albumina serica u otras protefnas sericas. En algunos casos o realizaciones, los contaminantes del cultivo celular comprenden componentes del medio. En algunos casos o realizaciones, los contaminantes del cultivo celular no comprenden albumina serica u otras protefnas sericas.
Se ha de entender que una, alguna o todas las propiedades de las diversas realizaciones descritas en la presente se pueden combinar para formar otras realizaciones de la presente invencion.
Breve descripcion de las figuras
La Figura 1 presenta los resultados de la digestion con Benzonase® del sobrenadante depurado de la cosecha del cultivo de produccion de rAAV. Los resultados demuestran que no estaba presente ADN de alto peso molecular despues de la digestion con Benzonase®.
La Figura 2 presenta un rastreo espectrofotometrico tfpico para una resina tfpica cribada con respecto a la afinidad de union a rAAV segun se describe en el Ejemplo 4. Se indicaban la absorbancia (AU) y la conductividad (mS/cm).
La Figura 3 presenta un analisis de capacidad de saturacion con y sin PEG. Se usaron dos cultivos de produccion de rAAV modelicos para juzgar la capacidad de la resina de apatito (CFT tipo I). Panel superior: Saturacion durante la carga de corrientes de alimentacion que contienen suero o libres de suero en presencia o ausencia de aproximadamente 5% (p/v) de PEG6000 en la carga. Los volumenes de carga se refieren a la corriente de alimentacion de partida, antes de la dilucion en lfnea 1:1, y se normalizaron por ml de volumen de resina. Panel inferior: Volumenes de carga (ml) en los que se observaba 1% de saturacion, y recuperacion en la fraccion eluida. Las cosechas de TFF utilizadas en el experimento estaban en una concentracion de aproximadamente 1016 DRP/ml para los vectores de rAAV. En presencia de aproximadamente 5% (p/v) de PEG6000, 150 ml de la cosecha de TFF se cargaron a los 1,2 ml de resina de CFT sin saturacion, lo que se definio como la presencia de >1% de rAAV en el flujo pasante de columna, correspondiente a una carga de 1,8x1014 de DRP de rAAV totales.
La Figura 4 presenta un cromatograma de CHT I tfpico. Se muestran en lfnea medidas de la absorbancia UV A280 (AU, unidad de absorbancia) y la conductividad (mS/cm) mediante el Amersham 3 mm Skid. Las llaves indican los principales segmentos del programa descrito en el Ejemplo 7. "NaOH" indica la etapa de descontaminacion de la columna.
La Figura 5 muestra la pureza relativa de vectores de rAAV eluidos desde resinas de apatito. El Panel A muestra la distribucion del vector entre el flujo pasante/el recorrido (FT), el lavado con alto contenido de fosfato/5% (p/v) de PEG6000 (PO4), los lavados para retirar fosfato y PEG6000 (WII/WIII) y la elucion. Ninguna de las diferencias entre los casos son significativas dentro de la precision de la analftica, y es tfpica la falta de balance de masas. El Panel B muestra los carriles pertinentes procedentes de una SDS PAGE con tincion con Sypro orange con fracciones de elucion desde la columna de apatito. Cada muestra se cargo en 2x10^ DRP/carril; la diferencia de migracion aparente entre los carriles es un artefacto salino debido a que tiene que concentrar la elucion de CFT mediante la evaporacion hasta un volumen que cupiera en el gel. Las unicas bandas predominantes parecen ser protefnas de la capside de AAV. El Panel C muestra los carriles pertinentes de una trasferencia Western de Ad5 con carriles reordenados por claridad, demostrando una depuracion comparable de protefnas Ad5.
La Figura 6 muestra el examen de la purificacion a traves del procedimiento mediante SDS-PAGE. Muestras producidas durante el procedimiento a partir de una cosecha de cultivo de produccion representativa se probaron en un gel de poliacrilamida al 10% desnaturalizador/reductor y se tino con Sypro orange. Todas las muestras despues de la cosecha se cargaron en 1x1010 DRP/carril. Las dos muestras aguas arriba antes de la etapa de concentracion de TFF (etapa de depuracion inicial y flujo pasante de AEX) solo se podfan cargar en 1x109 DRP/carril debido a restricciones de volumen en el gel. Se cargo B-galactosidasa (B-Gal) en 50 ng/carril para examinar la sensibilidad y la consistencia de la tincion a traves del gel. Se indican las tres protefnas de la capside de AAV1 (VP1,2, y 3).
La Figura 7 muestra la recuperacion por etapas para la purificacion de rAAV segun se describe en los Ejemplos 112. La DRP total presente en el sobrenadante antes de la cosecha se definio como 100%. La recuperacion en cada etapa es la DRP total recuperada con relacion a DRP total procesada a lo largo de esa etapa. La recuperacion global para todo el procedimiento era aproximadamente 28%. D4 sup: cultivo de produccion; AEX FT: flujo pasante del
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intercambio anionico (Mustang® Q); captura: cromatografia en apatito; calor: inactivacion termica o destruccion termica; HIC: cromatografia de interaccion hidrofoba; SEC: cromatografia de exclusion por tamano; AEX: intercambio anionico.
Descripcion detallada
Un objetivo de esta divulgacion, incluyendo la presente invencion, es proporcionar metodos para aislar una poblacion de particulas de virus adenoasociado recombinante (rAAV) para cualquier serotipo de la capside de AAV de contaminantes del cultivo de produccion tales como particulas de rAAV danadas, virus cooperadores, proteinas de virus cooperadores, plasmidos, proteinas y ADN celulares, componentes del medio, proteinas sericas, y similares. Por otra parte, los metodos de la presente divulgacion, incluyendo la presente invencion, proporcionan procedimientos ortogonales comercialmente ampliables a escala de acuerdo con los requisitos reguladores para el aislamiento de una poblacion de particulas de rAAV de cosechas o corrientes de alimentacion de cultivos de produccion de rAAV de titulo alto. Las poblaciones de particulas de rAAV aisladas mediante los metodos de la presente divulgacion, incluyendo la presente invencion, estan sustancialmente libres de contaminantes, incluyendo contaminantes del cultivo de produccion y/o contaminantes producidos durante el procedimiento, tales como particulas de rAAV danadas, virus cooperadores, proteinas de virus cooperadores, plasmidos, proteinas y ADN celulares, componentes del medio, proteinas sericas y glucanos. Los metodos de la presente divulgacion, incluyendo la presente invencion, son particularmente adecuados para serotipos de vectores de rAAV que son aglutinantes anionicos debiles tales como, por ejemplo, rAAV-1, rAAV-4, rAAV-5 y rAAV-8. La divulgacion, incluyendo la presente invencion, contempla ademas un metodo para aislar una poblacion de titulo alto de particulas de rAAV sustancialmente libres de contaminantes, incluyendo contaminantes del cultivo de produccion y/o contaminantes producidos durante el procedimiento, adecuado para el uso en aplicaciones de terapia genica sin la necesidad de realizar una centrifugacion con gradiente de densidad.
Definiciones
El termino "aislado" o "purificado", segun se usa en la presente, se refiere a una preparacion de particulas de rAAV desprovista de al menos algunos de los otros componentes que tambien pueden estar presentes cuando las particulas de rAAV son las presentes en la naturaleza o se preparan inicialmente a partir de las mismas. Asi, por ejemplo, se pueden preparar particulas de rAAV aisladas usando una tecnica de purificacion para enriquecerla desde una mezcla fuente, tal como un lisado de cultivo o un sobrenadante del cultivo de produccion. El enriquecimiento se puede medir de una variedad de modos, tales como, por ejemplo, por la proporcion de particulas resistentes a desoxirribonucleasa (DRPs) presentes en una solucion, o por la infectividad, o se puede medir con relacion a una segunda sustancia potencialmente interferente presente en la mezcla fuente, tal como contaminantes, incluyendo contaminantes del cultivo de produccion o contaminantes producidos durante el procedimiento, incluyendo virus cooperadores, componentes del medio, y similares, segun se define posteriormente.
Se dice que una preparacion de rAAV esta "sustancialmente libre" de virus cooperador si la relacion de particulas de AAV infecciosas a particulas de virus cooperador infecciosas es al menos aproximadamente 102:1; preferiblemente al menos aproximadamente 104:1, mas preferiblemente al menos aproximadamente 106:1; aun mas preferiblemente al menos aproximadamente 108:1. Preferiblemente, las preparaciones tambien estan libres de cantidades equivalentes de proteinas del virus cooperador (es decir, proteinas que estarian presentes como resultado de tal nivel de virus cooperador si las impurezas de las particulas de virus cooperador apuntadas anteriormente estuvieran presentes en forma alterada). La contaminacion viral y/o de proteinas celulares se puede observar generalmente como la presencia de bandas de tincion con Coomassie sobre geles de SDS (p. ej., la aparicion de bandas distintas a las correspondientes a las proteinas de la capside de AAV VP1, VP2 y VP3).
El termino "aglutinante anionico debil" o "aglutinante anionico de baja afinidad", segun se usa en la presente intercambiablemente, se refiere a una particula de rAAV que tiene un serotipo de la capside que, en presencia de contaminantes (incluyendo contaminantes del cultivo de produccion o contaminantes producidos durante el procedimiento), no se une con suficiente afinidad para permitir el aislamiento de las particulas de rAAV de otros contaminantes del cultivo de produccion de rAVV. Tales serotipos de la capside son conocidos en la especialidad e incluyen, sin limitacion, AAV-1, AAV-5, AAV-8 y AAV-4. Segun se describe en la especialidad, tales aglutinantes anionicos debiles se purifican generalmente mediante metodos que incluyen al menos una etapa de centrifugacion por densidad que incluye centrifugacion con gradiente de iodixinol (vendido bajo el nombre comercial Optiprep®) o cloruro de cesio.
Segun se usa en la presente, el termino "virus cooperador" o "virus cooperador contaminante" se refiere a un virus usado cuando se producen copias de un vector viral dependiente del virus cooperador, tal como un virus adenoasociado, que no tiene la capacidad de replicarse por si mismo. El virus cooperador se usa para coinfectar celulas junto con el vector viral y proporciona las proteinas necesarias para la replicacion del genoma del vector viral. El termino abarca particulas virales intactas, capsides vacias, ADN viral y similares. Virus cooperadores comunmente usados para producir particulas de rAAV incluyen adenovirus, virus de herpes simple, citomegalovirus, virus de Epstein-Barr y virus vacunal.
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El termino "cultivo de produccion", segun se usa en la presente, se refiere a un recipiente que contiene los componentes necesarios para la produccion de particulas de vectores de rAAV. Los cultivos de produccion incluyen, sin limitacion, los siguientes componentes: 1) una celula hospedadora adecuada; 2) funcion de virus cooperador; 3) genes y productos genicos de rep y cap de AAV; 4) el transgen terapeutico flanqueado por secuencias de ITR de AAV; y 5) un medio adecuado, componentes del medio y complementos del medio, incluyendo sin limitacion, suero, proteinas derivadas del suero, vitaminas, aminoacidos esenciales y no esenciales y glucosa, que se sabe que apoyan la produccion de rAAV.
Segun se usa en la presente, los terminos "contaminantes", "contaminantes del cultivo de produccion", "contaminantes producidos durante el procedimiento", "impurezas producidas durante el procedimiento", "impurezas" o "contaminantes", que se usan intercambiablemente en la presente, se refieren, sin limitacion, a formulaciones de medio que se sabe en la especialidad que apoyan la produccion de vectores de rAAV; complementos del medio tales como sales, suero de ternero, complementos de aminoacidos, complementos vitaminicos, factores de crecimiento, albumina serica y otras proteinas de bajo peso molecular presentes en formulaciones de medio conocidas en la especialidad; celulas hospedadoras permisivas, proteinas de celulas hospedadoras o ADN de celulas hospedadoras; virus cooperadores, proteinas de virus cooperadores o ADN de virus cooperadores tales como proteinas de adenovirus o herpesvirus silvestres; y otros materiales de cultivos de produccion no relacionados o relacionados con vectores de rAAV introducidos durante el procedimiento de purificacion tales como glucanos o tampones cromatograficos utilizados en la purificacion de vectores de rAAV de corrientes de alimentacion.
El termino "cosecha del cultivo de produccion", segun se usa en la presente, se define como una solucion que comprende particulas de vectores de rAAV producidas a partir de cultivos de produccion de vectores de rAAV por medios conocidos en la especialidad, incluyendo sin limitacion procedimientos de transfeccion, produccion de lineas celulares estables, sistemas de produccion de hibridos de Ad o sistemas de produccion de baculovirus. Por otra parte, el termino "cosecha del cultivo de produccion", segun se usa en la presente, se refiere al material aislado del recipiente de cultivo de produccion e incluye tanto materiales aislados mediante lisis de celulas productoras de rAAV por medios conocidos en la especialidad como materiales aislados de cultivos de produccion de rAAV mantenidos bajo condiciones de cultivo conocidas en la especialidad para dar particulas de rAAV liberadas en el medio a partir de celulas intactas. Una cosecha del cultivo de produccion puede contener alguno o la totalidad de los siguientes, sin limitacion: particulas de vectores de rAAV, componentes de cultivos de produccion, tales como componentes del medio, proteinas de celulas hospedadoras, ADN de celulas hospedadoras, celulas hospedadoras, virus cooperadores, proteinas de virus cooperadores, ADN de virus cooperadores, ADN plasmidico, ADN viral portador, suero, proteinas derivadas del suero y complementos del medio.
El termino "corriente de alimentacion", segun se usa en la presente, se refiere a una fuente de particulas de vector de rAAV que se carga sobre, se hace pasar a traves o se aplica a una matriz cromatografica. Corrientes de alimentacion de la presente divulgacion, incluyendo la presente invencion, incluyen cosechas del cultivo de produccion y materiales aislados de etapas cromatograficas previas de la divulgacion, incluyendo la presente invencion, ya estuviera el material presente como flujo pasante procedente de la etapa, se uniera y eluyera en la etapa previa, estuviera presente en el volumen de huecos de la etapa previa o estuviera presente en cualquier fraccion obtenida durante la purificacion de particulas de rAAV. Estas corrientes de alimentacion pueden incluir uno o mas "contaminantes", "contaminantes del cultivo de produccion”, "contaminantes producidos durante el procedimiento”, "impurezas producidas durante el procedimiento” o "impurezas” o "contaminantes”, segun se definen en la presente.
Los terminos "captura”, "unido”, "se une” o "union", segun se usan en la presente intercambiablemente, se refieren a la union, la adherencia o el pegado de un componente de una corriente de alimentacion a un medio cromatografico. Los componentes se pueden unir a un medio cromatografico mediante cualquier fuerza o quimica conocida en la especialidad, incluyendo sin limitacion hidrofoba, ionica (incluyendo anionica y cationica), afinidad, quelacion a metales y quelacion. Los componentes se pueden unir a un medio cromatografico mediante mas de un tipo de quimica tal como en medios cromatograficos de apatito.
Los terminos "resina de apatito”, "medio cromatografico de apatito”, "matriz de apatito" o "medio de apatito”, segun se usan en la presente intercambiablemente, se refieren a un medio cromatografico comprendido por un mineral de fosfato calcico, e incluye sin limitacion medios cromatograficos de hidroxiapatito ceramico (CHT) y fluoroapatito ceramico (CFT).
Los terminos "modo mixto" o "multimodal" se refieren a medios cromatograficos que tienen la capacidad para mas de una quimica de union. Medios cromatograficos en modo mixto incluyen sin limitacion medios cromatograficos de apatito, que son capaces de exhibir union por afinidad a metales a traves de los restos calcio, union por enlaces de hidrogeno a traves de los grupos hidroxilo presentes sobre la cadena principal, repulsion de cargas positivas y atraccion de cargas negativas a traves de los restos calcio y repulsion de cargas negativas y atraccion de cargas positivas a traves de los restos fosfato presentes sobre el medio.
Una referencia general a "la composicion" o "composiciones" incluye y es aplicable a composiciones de la divulgacion, incluyendo la presente invencion.
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Segun se usa en la presente, la forma singular de los articulos "un”, "uno(a)”, y "el(la)" incluye referencias plurales a menos que se indique otra cosa. Por ejemplo, la expresion "una particula de virus" incluye una o mas particulas de virus.
La referencia a "aproximadamente" un valor o parametro en la presente incluye (y describe) realizaciones que se dirigen a ese valor o parametro de por si. Por ejemplo, una descripcion que se refiere a "aproximadamente X" incluye la descripcion de "X."
Se entiende que los aspectos y las realizaciones de la invencion en la presente incluyen que consisten y/o que consisten esencialmente en aspectos y realizaciones.
Produccion de vectores de rAAV
Se conocen en la tecnica numerosos metodos para la produccion de vectores de rAAV, incluyendo sistemas de transfeccion, de produccion de lineas celulares estables y de produccion de virus hibridos infecciosos que incluyen hibridos de adenovirus-AAV, hibridos de herpesvirus-AAV e hibridos de baculovirus-AAV. Los cultivos de produccion de rAAV para la produccion de particulas de virus rAAV requieren todos; 1) celulas hospedadoras adecuadas, incluyendo, por ejemplo, lineas celulares derivadas de ser humano tales como celulas HeLa, A549 o 293, o lineas celulares derivadas de insecto tales como SF-9, en el caso de sistemas de produccion de baculovirus; 2) funcion de virus cooperador adecuada, proporcionada por adenovirus silvestres o mutantes (tales como adenovirus sensibles a la temperatura), herpesvirus, baculovirus, o una construccion plasmidica que proporciona funciones cooperadoras; 3) genes y productos genicos rep y cap de AAV; 4) un transgen (tal como un transgen terapeutico) flanqueado por secuencias de ITR de AAV; y 5) medios y componentes de medios adecuados para soportar la produccion de rAAV. Medios adecuados conocidos en la especialidad se pueden usar para la produccion de vectores de rAAV. Estos medios incluyen, sin limitacion, medios producidos por Hyclone Laboratories y JRH incluyendo medio de Eagle modificado (MEM), medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM), formulaciones habituales tales como las descritas en la Patente de EE. UU. N° 6.566.118, y medio Sf-900 II SFM segun se describe en la Patente de EE. UU. N° 6.723.551, particularmente con respecto a formulaciones de medios habituales para el uso en la produccion de vectores de AAV recombinantes.
Medios de cultivo de produccion de rAAV adecuados de la presente divulgacion, incluyendo la presente invencion, se pueden complementar con suero o proteinas recombinantes derivadas de suero en un nivel de 0,5%-20% (v/v o p/v). Alternativamente, como se sabe en la especialidad, se pueden producir vectores de rAAV en condiciones libres de suero que tambien se pueden denominar medios sin productos derivados de animales. Un experto normal en la especialidad puede apreciar que medios comerciales o habituales disenados para soportar la produccion de vectores de rAAV tambien se pueden complementar con uno o mas componentes de cultivo celular conocidos en la especialidad, incluyendo sin limitacion glucosa, vitaminas, aminoacidos y/o factores de crecimiento, a fin de incrementar el titulo de rAAV en cultivos de produccion.
Los cultivos de produccion de rAAV se pueden desarrollar bajo una variedad de condiciones (a lo largo de un amplio intervalo de temperatura, durante espacios de tiempo variables, y similares) adecuadas para la celula hospedadora particular que se utilice. Como se sabe en la especialidad, los cultivos de produccion de rAAV incluyen cultivos dependientes de la adhesion que se pueden cultivar en recipientes dependientes de la adhesion adecuados tales como, por ejemplo, botellas giratorias, filtros de fibra hueca, microportadores y biorreactores de lecho relleno o de lecho fluidizado. Los cultivos de produccion de vectores de rAAV tambien pueden incluir celulas hospedadoras adaptadas a suspensiones tales como celulas HeLa, 293 y SF-9 que se pueden cultivar de una variedad de modos incluyendo, por ejemplo, matraces rotatorios, biorreactores de tanque agitado y sistemas desechables tales como el sistema de bolsa de Wave.
Las particulas de vector de rAAV de la divulgacion, incluyendo la presente invencion, se pueden cosechar de cultivos de produccion de rAAV mediante la lisis de las celulas hospedadoras del cultivo de produccion o mediante la cosecha de los medios agotados a partir del cultivo de produccion, con tal de que las celulas se cultiven bajo condiciones que se sabe en la especialidad que provocan la liberacion de particulas de rAAV en el medio a partir de celulas intactas, segun se describe mas a fondo en la Patente de EE. UU. N° 6.566.118). Metodos adecuados para someter a lisis a las celulas tambien se conocen en la especialidad e incluyen, por ejemplo, multiples ciclos de congelacion/descongelacion, ultrasonidos, microfluidizacion y tratamiento con productos quimicos, tales como detergentes y/o proteasas.
Purificacion de vectores de rAAV
En la cosecha, los cultivos de produccion de rAAV de la presente divulgacion, incluyendo la presente invencion, pueden contener uno o mas de los siguientes: (1) proteinas de celulas hospedadoras; (2) ADN de celulas hospedadoras; (3) ADN plasmidico; (4) virus cooperadores; (5) proteinas de virus cooperadores; (6) ADN de virus cooperadores; y (7) componentes del medio incluyendo, por ejemplo, proteinas sericas, aminoacidos, transferrinas y otras proteinas de bajo peso molecular. Ademas, los cultivos de produccion de rAAV incluyen ademas particulas de
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rAAV que tienen un serotipo de la capside de AAV seleccionado del grupo que consiste en AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAV-6, AAV-7, AAV-8, AAV-9, AAV-10, AAV-11, AAV-12, AAV-13, AAV-14, AAV-15 y AAV-16. En algunos casos o realizaciones, las particulas de rAAV tienen un serotipo de la capside de AAV seleccionado del grupo que consiste en AAV-1, AaV-4, AAV-5 y AAV-8.
En algunos casos, incluyendo algunas realizaciones, la cosecha del cultivo de produccion de rAAV se depura para retirar residuos de celulas hospedadoras. En algunos casos, incluyendo algunas realizaciones, la cosecha del cultivo de produccion se depura mediante filtracion a traves de una serie de filtros de profundidad incluyendo, por ejemplo, una clase D0HC Millipore Millistak+ HC Pod Filter, una clase A1HC Millipore Millistak+ HC Pod Filter y un filtro Filter Opticap XL10 Millipore Express SHC Hydrophilic Membrane de 0,2 pm. La depuracion tambien se puede alcanzar mediante una variedad de otras tecnicas estandar conocidas en la especialidad, tales como centrifugacion o filtracion a traves de cualquier filtro de acetato de celulosa de un tamano de poro de 0,2 pm o mas conocido en la especialidad.
En algunos casos, incluyendo algunas realizaciones, la cosecha del cultivo de produccion de rAAV se trata adicionalmente con Benzonase® para digerir cualquier ADN de alto peso molecular presente en el cultivo de produccion. En algunos casos, incluyendo algunas realizaciones, la digestion con Benzonase® se realiza bajo condiciones estandar conocidas en la especialidad incluyendo, por ejemplo, una concentracion final de 1-2,5 unidades/ml de Benzonase® a una temperatura que varia de ambiente a 37°C durante un periodo de 30 minutos a varias horas.
Las particulas de rAAV se pueden aislar o purificar usando una o mas de las siguientes etapas: filtracion con intercambio ionico de flujo pasante, filtracion con flujo tangencial (TFF) para concentrar las particulas de rAAV, captura de rAAV mediante cromatografia en apatito, inactivacion termica de un virus cooperador, captura de rAAV mediante cromatografia de interaccion hidrofoba, intercambio de tampones mediante cromatografia de exclusion por tamano (SEC), nanofiltracion y captura de rAAV mediante cromatografia de intercambio anionico. Estas etapas se pueden usar solas, en diversas combinaciones o en diferentes ordenes. En algunos casos, el metodo comprende todas las etapas en el orden descrito posteriormente.
Filtracion con intercambio anionico
Opcionalmente, en algunos casos, incluyendo algunas realizaciones, la cosecha del cultivo de produccion depurada y tratada con Benzonase® se somete a filtracion con intercambio anionico bajo condiciones en las que el vector de rAAV esta presente en el flujo pasante y se retiene virus cooperador contaminante sobre el filtro cargado. A la intensidad ionica de la cosecha del cultivo de produccion de rAAV, las particulas de rAAV se pueden distinguir del virus cooperador, por ejemplo, adenovirus, mediante el paso a traves de un filtro anionico tal como un filtro Mustang® Q (Pall Corp., East Hills, NY). Un experto en la especialidad puede determinar el tamano y el numero de filtros necesarios para alcanzar la reduccion logaritmica optima de adenovirus (LRV) y proteinas adenovirales presentes en el cultivo de produccion depurado, tratado con Benzonase® y filtrado anionicamente. En algunos casos, incluyendo algunas realizaciones, la LRV es al menos un logaritmo y mayor de diez logaritmos. En un caso o realizacion preferidos, la LRV es al menos dos y mayor de ocho logaritmos. En un caso o una realizacion mas preferidos, la LRV es al menos seis logaritmos.
Concentracion por filtracion con flujo tangencial (TFF)
En algunos casos, incluyendo algunas realizaciones, el flujo pasante procedente de la filtracion anionica de la corriente de alimentacion depurada tratada con Benzonase® se concentra a traves de filtracion con flujo tangencial ("TFF") antes de aplicarse a un medio cromatografico de apatito. La concentracion a gran escala de virus usando ultrafiltracion TFF ha sido descrita por R. Paul y cols., HUMAN GENE THERAPY, 4:609-615 (1993). La concentracion por TFF de la corriente de alimentacion permite que un volumen tecnicamente manejable de corriente de alimentacion se someta a las etapas cromatograficas de la presente divulgacion, incluyendo la presente invencion, y permite un dimensionamiento mas razonable de las columnas sin la necesidad de tiempos de recirculacion prolongados. En algunos casos, incluyendo algunas realizaciones, la corriente de alimentacion de rAAV se concentra entre al menos dos veces y al menos diez veces. En algunos casos o realizaciones, la corriente de alimentacion se concentra entre al menos diez veces y al menos veinte veces. En algunos casos o realizaciones, la corriente de alimentacion se concentra entre al menos veinte veces y al menos cincuenta veces. Un experto normal en la especialidad tambien entendera que la TFF tambien se puede usar en cualquier etapa del procedimiento de purificacion en la que sea deseable intercambiar tampones antes de realizar la siguiente etapa en el procedimiento de purificacion.
Captura de rAAV mediante cromatografia en apatito en presencia de polietilenglicol (PEG)
Los procedimientos aprobados por la FDA para la purificacion de proteinas y otros productos biologicos adecuados para el uso en estudios clinicos humanos y productos farmaceuticos se basan en procedimientos ortogonales a escala comercial. Se considera que un esquema de purificacion de varias etapas incluye un procedimiento ortogonal si emplea mecanismos de separacion que son distintos entre si, representando cada etapa un eje en el espacio
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cartesiano. Por ejemplo, un procedimiento en dos etapas que use intercambio anionico y cromatografia de interaccion hidrofoba (HIC) se consideraria ortogonal. Los procedimientos para retirar contaminantes, tales como contaminantes del cultivo de produccion o contaminantes producidos durante el procedimiento, de una cosecha del cultivo de produccion o una corriente de alimentacion descrita en la presente son procedimientos ortogonales que incluyen etapas tanto de captura como de flujo pasante sobre una variedad de medios cromatograficos para el producto final (es decir, un vector de rAAV). Se ha demostrado en la tecnica que los vectores de rAAV (especificamente rAAV-2) se unen a resinas anionicas. Se ha demostrado que vectores de rAAV tales como rAAV-1, -5 y -8 se unen mucho menos fuertemente que rAAV-2 a medios de intercambio anionico en presencia de componentes de produccion tales como albumina serica, componentes del virus cooperador, componentes del medio de produccion y ADN de celulas hospedadoras, dando como resultado un esquema de purificacion menos eficaz y de calidad inferior.
Estrategias de purificacion previas descritas en la especialidad para aglutinantes anionicos de afinidad inferior tales como AAV-1 incluian una etapa de gradiente de iodixinol que reduce la concentracion relativa de los contaminantes, tales como contaminantes del cultivo de produccion e impurezas producidas durante el procedimiento, a fin de alcanzar una union mas fuerte del vector de rAAV a intercambiadores anionicos. Los gradientes por etapas de iodixinol no son facilmente ampliables a escala hasta los procedimientos a escala comercial descritos en la presente.
Los inventores de la presente solicitud han descubierto que las particulas de vectores de rAAV se pueden aislar de contaminantes, tales como contaminantes del cultivo de produccion o contaminantes producidos durante el procedimiento, mediante captura y elucion desde resinas de apatito. Asi, ademas de capturar producto de una corriente de alimentacion en bruto, la columna de apatito depura una variedad de impurezas relacionadas con el procedimiento, incluyendo proteinas de celulas hospedadoras y adenovirus, glucanos y proteinas sericas, asi como proporciona factores de depuracion para el virus cooperador (tal como el virus cooperador Ad5).
Las resinas de apatito son medios cromatograficos que comprenden minerales de fosfato calcico, incluyendo sin limitacion hidroxiapatito ceramico (CHT) y fluoroapatito ceramico (CFT). Los medios cromatograficos de apatito tambien se denominan medios de modo mixto o multimodales debido a que el apatito tiene grupos funcionales que proporcionan mas de una quimica de union. Sin querer limitarse por una teoria, los medios de apatito proporcionan la oportunidad de union por afinidad a calcio metalico, union por enlaces de hidrogeno, repulsion de cargas positivas, atraccion de cargas positivas, repulsion de cargas negativas y atraccion de cargas negativas a traves de un hospedador de diferentes grupos quimicos, incluyendo residuos hidroxilo presentes sobre la cadena principal, restos calcio cargados positivamente y restos fosfato cargados negativamente presentes sobre la resina. Cada quimica de union se aplica a la union en modo mixto igual que se hace para la cromatografia en modo simple. Sin embargo, a diferencia de la cromatografia en modo simple, las diversas quimicas de union y elucion no son independientes y pueden funcionar de maneras opuestas. Por ejemplo, incrementar la intensidad ionica puede impulsar la union hidrofoba. (T. Kawasaki, M. Niikura e Y. Kobayashi, J. Chrom. 515:125-148 (1990) y P.S. Gagnon, P. Ng, J. Zhen, C. Aberin, y J. He, BioProcess Int’l 4:50-60 (2006)). Especificamente, el CHT y el CFT son formas macroporosas esfericas de hidroxiapatito (Ca5(PO4)3OH)2) sinterizado a altas temperaturas para convertir el mineral desde una forma cristalina hasta una ceramica. Esto da un medio cromatografico con una estructura macroporosa que proporciona una gran superficie especifica, una resistencia limitada a la transferencia de masa, una gran resistencia mecanica y una resistencia basica. Sinterizar a diferentes temperaturas y tiempos da como resultado diferentes estructuras fisicas - tipos I y II - que son quimicamente identicas pero ofrecen diferentes capacidades para diferentes clases de moleculas. El CFT difiere del CHT en que es un material compuesto de fluoroapatito e hidroxiapatito preparado al reemplazar quimicamente los grupos hidroxilo por grupos fluor para incrementar la estabilidad a condiciones acidas. Estan disponibles comercialmente resinas de CFT y CHT (p. ej., de Bio-Rad Laboratories, Inc.).
Los inventores de la presente divulgacion, incluyendo la presente invencion, han descubierto sorprendentemente que la presencia de polietilenglicol (PEG) en el tampon de carga incrementa drasticamente la capacidad y la reproducibilidad (al reducir la saturacion variable de particulas de rAAV en el flujo pasante) de la union de particulas de vectores de rAAV a resinas de apatito. Sin querer limitarse por una teoria, un atributo de los vectores de rAAV que los distingue de la mayoria de las impurezas relacionadas con el procedimiento es el gran tamano fisico de las particulas. Esta diferencia de tamano se exploto en las etapas de captura y lavado al incluir polietilenglicol (PEG) en los tampones de captura y lavado cromatograficos para incrementar preferentemente los coeficientes de reparto de moleculas mayores al estado unido basandose en la comparticion energeticamente favorable de envueltas de hidratacion. Aunque se ha descrito en la especialidad el uso de PEG en la purificacion de vectores virales y de bacteriofago, a diferencia de la presente divulgacion, se usaba principalmente como un agente precipitante para agregar fisicamente y retirar particulas virales de la solucion. Puesto que se sabe en la tecnica que el PEG facilita la agregacion y la precipitacion de particulas virales y se ha descrito en la especialidad que rAAV forma agregados a una intensidad ionica por debajo de 200 mM (Wright y cols., Molecular Therapy 12:171-178 (2005)), el efecto del PEG sobre la union de vectores de rAAV a resinas de apatito era impredecible. Se sabia en la especialidad que el PEG facilitaba la union de moleculas de inmunoglobulina a resinas de intercambio ionico segun se describe, por ejemplo, en Gagnon, J. Chromtogr. 743A:51-55 (1996), y para resinas de modo mixto hidrofobas cargadas, segun se describe, por ejemplo, en Gagnon y cols., 22nd International IBC Conference on Antibody Production and Development, 4-6 de marzo de 2009.
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Los inventores de la presente solicitud han determinado basandose en la experimentacion con PEG6000 a lo largo de un intervalo de concentracion entre 3-10% (p/v) en la corriente de alimentacion que una concentracion relativa de aproximadamente 5% (p/v) de PEG6000 era optima. Un experto normal en la tecnica apreciara que se pueden utilizar otras especies y pesos moleculares de PEG incluyendo sin limitacion PEG8000, PEG10000 y PEG15000, y que la concentracion relativa de PEG a la concentracion final en la solucion de vector de rAAV se puede determinar empiricamente de modo que a las concentraciones apropiadas de PEG, las particulas de vector de rAAV en la solucion sean impulsadas a unirse a la resina de apatito pero no formen agregados o precipiten fisicamente.
En algunos casos, las particulas de vector de rAAV se aislan de contaminantes del cultivo de produccion mediante captura sobre una resina de apatito en presencia de PEG y elucion de la particula de rAAV unida desde la resina de apatito en un tampon de fosfato. En casos preferidos, las particulas de vector de rAAV se aislan de contaminantes del cultivo de produccion mediante captura sobre una resina de apatito en presencia de PEG y elucion de la particula de rAAV unida desde la resina de apatito en un tampon en ausencia de PEG. En algunos casos, particulas de rAAV que comprenden capsides que son aglutinantes anionicos debiles se aislan de contaminantes del cultivo de produccion mediante captura sobre una resina de apatito en presencia de PEG y la particula de rAAV unida se eluye desde la resina de apatito en un tampon en ausencia de PEG. En casos mas preferidos, particulas de rAAV que comprenden capsides de serotipo 1 (serotipo rAAV-1) se aislan de contaminantes del cultivo de produccion mediante captura sobre una resina de apatito en presencia de PEG y la capside de serotipo rAAV-1 que contiene particulas unidas a la resina se eluye en tampon en ausencia de PEG. En algunos casos, las particulas de vectores de rAAV se aislan de contaminantes del cultivo de produccion segun un metodo que comprende cargar una corriente de alimentacion en un tampon de carga en ausencia de fosfato pero en presencia de PEG y eluir el rAAV unido desde la resina de apatito en un tampon de elucion que comprende fosfato y que carece de PEG.
Aunque la cromatografia en apatito en presencia de PEG representa una estrategia de captura o union eficaz para la purificacion de vectores de rAAV, muchas impurezas producidas durante el procedimiento tambien eran retenidas por la resina de apatito a pH 7,0. Sin querer limitarse por una teoria, seria mas probable que las proteinas presentes en la corriente de alimentacion a pH basico (pH mayor de 7,0) tuvieran una carga neta negativa y fueran repelidas por los sitios de union de fosfato negativos presentes sobre la resina de apatito, reduciendo de ese modo la capacidad de union por intercambio cationico global de la resina cromatografica. Sin embargo, dada la naturaleza de modo mixto de las resinas de apatito, todavia se produce la union a traves de atraccion a cargas positivas y afinidad a metales.
Los tampones de borato se usan habitualmente en la tecnica como sistemas tamponadores basicos debido a sus propiedades de fabricacion deseables incluyendo sin limitacion facilidad de preparacion, solubilidad optima, excelente capacidad tamponadora y bajo coste. Por lo tanto, tampones de borato como el sistema tamponador basico modelico se evaluaron con respecto a la captura de rAAV sobre resinas de apatito. Un experto normal en la especialidad puede apreciar que se podrian evaluar otros tampones basicos para determinar si reducian el nivel de union de impurezas producidas durante el procedimiento a resinas de apatito en presencia de PEG. Otros tampones basicos se pueden probar y usar con respecto a la captura de rAAV. En algunos casos, el tampon de carga de apatito en ausencia de PEG comprende un tampon de borato. En casos preferidos, el tampon de borato se formula a un pH entre aproximadamente 8,0 y aproximadamente pH 9,9. En un caso os preferidos, el tampon de borato se formula a un pH de aproximadamente 9,0. En algunos casos, el tampon de borato esta en una concentracion entre aproximadamente 5 mM y aproximadamente 500 mM. En casos mas preferidos, el tampon de borato se formula en aproximadamente 20 mM de borato, pH 9,0. En algunos casos, el tampon de borato 20 mM a pH 9,0 reduce especificamente la captura de impurezas de molecula pequena producidas durante el procedimiento sobre la resina de apatito.
En algunos casos, la corriente de alimentacion se carga sobre la resina de apatito en un tampon que contiene fosfato en presencia de PEG mediante mezcladura en linea de la corriente de alimentacion con un tampon de fosfato que comprende PEG en dos veces la concentracion final de PEG. En algunos casos, el pH del tampon de fosfato esta entre pH 6,5 y pH 7,0. En algunos casos, el PEG es PEG6000. En algunos casos, la concentracion de PEG6000 en el tampon de carga esta entre aproximadamente 3% (p/v) y aproximadamente 10% (p/v). En casos mas preferidos, la concentracion de PEG6000 en el tampon de carga es aproximadamente 5% (p/v). En algunos casos, la concentracion de fosfato en el tampon de carga para la resina de apatito esta entre 5 mM y 500 mM
En algunos casos, la capacidad de union de la resina de apatito en presencia de PEG se potencia con relacion a la capacidad de union de la resina de apatito en ausencia de PEG. En algunos casos, la capacidad de union de la resina de apatito para particulas de vector de rAAV en una corriente de alimentacion en presencia de PEG se potencia desde aproximadamente medio logaritmo hasta aproximadamente diez logaritmos con relacion a la capacidad de union de la resina de apatito en ausencia de PEG. En casos preferidos, la capacidad de union de la resina de apatito para particulas de rAAV presentes en una corriente de alimentacion en presencia de PEG se potencia ocho logaritmos. En algunos casos, la capacidad de union de la resina de apatito para particulas de vector de rAAV en una corriente de alimentacion en presencia de PEG es de al menos aproximadamente 106 particulas de rAAV por ml de resina a aproximadamente 1016 particulas por ml de resina (tal como aproximadamente cualquiera de 106, 107, 108, 109, 1010, 1011, 1012, 1013, 1014, 1015, 1016 particulas por ml de resina). En algunos casos, la
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capacidad de union de la resina de apatito en presencia de PEG es aproximadamente 1014 particulas por ml de resina.
Aunque esta sorprendente capacidad de union de aproximadamente 1012-1014 DRP de rAAV-1 por ml de resina de apatito en presencia de PEG permite la ampliacion a escala rentable altamente eficaz de la purificacion de rAAV-1 comercial, un experto normal en la especialidad apreciara que la capacidad de union representa el numero maximo de rAAV-1 que se unira por ml de resina y no pretende limitar operativamente el alcance de la divulgacion. En efecto, los inventores aprecian que los cultivos cosechados de vectores de rAAV-1 que contienen menos de 1014-1016 DRP de rAAV-1/ml se pueden purificar mediante la presente divulgacion, incluyendo la presente invencion.
En algunos casos, las particulas de rAAV unidas al medio de apatito se lavan antes de eluir las particulas de rAAV desde la resina. En algunos casos, el medio cromatografico de apatito se lava una o mas veces con un tampon de lavado que contiene concentraciones decrecientes de PEG para retirar las impurezas producidas durante el procedimiento. En algunos casos, el medio cromatografico de apatito se lava una o mas veces con un tampon de lavado que contiene entre aproximadamente 3% (p/v) y aproximadamente 10% (p/v) de PEG. En algunos casos, el tampon de lavado contiene aproximadamente cualquiera de 10% (p/v), 9,5% (p/v), 9% (p/v), 8,5% (p/v), 8% (p/v), 7,5% (p/v), 7% (p/v), 6,5% (p/v), 6% (p/v), 5,5% (p/v), 5% (p/v), 4,5% (p/v), 4% (p/v), 3,5% (p/v) y 3% (p/v) de PEG. En algunos casos, el medio de apatito se lava con un tampon de lavado que contiene PEG a una concentracion mayor que la concentracion de PEG usada para permitir la union de las particulas de rAAV al medio de apatito. En algunos casos, el medio de apatito se lava adicionalmente con una concentracion decreciente de PEG. En algunos casos, el tampon de lavado contiene tampones conocidos en la especialidad. En algunos casos, el tampon de lavado comprende un tampon seleccionado del grupo que consiste en borato, acido N-2-hidoxietilpiperacino-N’-2- etanosulfonico (HEPES) y Tris-HCl. En algunos casos, el tampon de lavado esta a un pH basico. En algunos casos, el tampon de lavado tiene un pH entre pH 7,0 y pH 10,0, entre pH 7,2 y pH 10,0, entre pH 7,4 y pH 10,0, entre pH 7,6 y pH 10,0, entre pH 7,8 y pH 10,0, pH 8,0 y pH 10,0, pH 8,2 y pH 10,0, entre pH 8,4 y pH 10,0, entre pH 8,6 y pH 10,0, entre pH 8,8 y pH 10,0, entre pH 9,0 y pH 10,0, entre pH 9,2 y pH 10,0, entre pH 9,4 y pH 10,0, entre pH 9,6 y pH 10,0, o entre pH 9,8 y pH 10,0. En algunos casos, el tampon de lavado tiene un pH en 7,0, 7,2, 7,4, 7,6, 7,8, 8,0, 8,2, 8,4, 8,6, 8,8, 9,0, 9,2, 9,4, 9,6, 9,8 o 10,0. En algunos casos, el tampon de lavado comprende ademas entre 100 y 500 mM de fosfato. En algunos casos, el tampon de lavado comprende ademas entre 50 y 250 mM de NaCl.
En algunos casos, los vectores de rAAV aislados de una corriente de alimentacion mediante captura sobre una resina de apatito en presencia de PEG se eluyen en un tampon en concentraciones bajas de PEG. En algunos casos, las bajas concentraciones de PEG estan entre aproximadamente 2,9% (p/v) y aproximadamente 0,1% (p/v) de PEG. En algunos casos, los vectores de rAAV aislados de una corriente de alimentacion mediante captura sobre una resina de apatito en presencia de PEG se eluyen en un tampon en ausencia de PEG. En casos preferidos, los vectores de rAAV aislados de una corriente de alimentacion mediante captura sobre una resina de apatito en presencia de PEG se eluyen en un tampon que contiene fosfato en ausencia de PEG.
En algunos casos, los vectores de rAAV aislados de una corriente de alimentacion mediante captura sobre una resina de apatito en presencia de PEG se eluyen en un tampon que contiene fosfato. En algunos casos, los vectores de rAAV aislados de una corriente de alimentacion mediante captura sobre una resina de apatito en presencia de PEG se eluyen en un tampon que contiene fosfato en una concentracion entre aproximadamente 0,1 mM y aproximadamente 500 mM (tal como entre aproximadamente 1 mM y aproximadamente 250 mM, entre aproximadamente 10 mM y aproximadamente 100 mM). En casos preferidos, los vectores de rAAV aislados de una corriente de alimentacion mediante captura sobre una resina de apatito en presencia de PEG se eluyen en un tampon de fosfato 50 mM.
Los inventores de la presente solicitud han descubierto que los vectores de rAAV presentes en una corriente de alimentacion se pueden aislar mediante captura sobre una resina de apatito en presencia de PEG. Sin embargo, si virus cooperadores usados en el cultivo de produccion (tales como adenovirus) estan presentes en la corriente de alimentacion aplicada a la resina de apatito, son capturados por la resina de apatito en presencia de PEG. Las particulas de vector de rAAV capturadas por la resina de apatito en presencia de PEG se pueden aislar facilmente del adenovirus por su perfil de elucion en tampones de fosfato. Las particulas de vector de rAAV unidas a la resina de apatito en presencia de PEG se eluyen, en ausencia de PEG, en tampones que contienen tan poco como 0 mM de fosfato; mientras que las particulas adenovirales de virus cooperador son retenidas sobre las resinas de apatito bajo las concentraciones de fosfato usadas para eluir las particulas de vector de rAAV. Experimentalmente, se encontro que los vectores de rAAV se eluyen en un solo pico agudo en tan poco como 50 mM de fosfato en ausencia de PEG, mientras que un virus cooperador tal como adenovirus si esta presente se retiene sobre la resina. En estudios de agregacion en los que a las corrientes de alimentacion de rAAV se agregaban 89 particulas resistentes a desoxirribonucleasa (DRPs) de adenovirus infeccioso y se sometian a cromatografia sobre resinas de apatito en presencia de PEG, los vectores de rAAV se capturaban sobre la resina de apatito y se eluian en tampon de fosfato 50 mM en ausencia de PEG, mientras que aproximadamente 4 logaritmos de proteinas adenovirales se retenian sobre la resina de apatito. Segun esto, en algunos casos, los vectores de rAAV presentes en una corriente de alimentacion se aislan del virus cooperador contaminante mediante captura sobre una resina de apatito en presencia de PEG y elucion en tampones de fosfato en ausencia de PEG. En algunos casos, los tampones de fosfato se formulan en concentraciones que retienen el virus cooperador contaminante unido a la resina de apatito.
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En algunos casos, de dos a ocho logaritmos de adenovirus son retenidos por ml de resina de apatito. En algunos casos, los vectores de rAAV presentes en una corriente de alimentacion se aislan mediante elucion desde una resina de apatito en tampon de fosfato 0-500 mM (tal como 0-400 mM, 0-300 mM, 0-200 mM, 0-100 mM, 0-50 mM) bajo condiciones que retienen el virus cooperador unido a la resina de apatito.
Sistemas de produccion conocidos en la tecnica para producir vectores de rAAV pueden incluir medios de produccion que contienen suero en el intervalo de 0,5%-20% (v/v), o pueden estar desprovistos por completo de suero. Por otra parte, esquemas de purificacion descritos en la especialidad pueden incluir una o mas etapas de concentracion que pueden dar como resultado un incremento de proteinas sericas y otros componentes sericos en la corriente de alimentacion aplicada a la resina de apatito. Por ejemplo, el sobrenadante del cultivo de produccion que se describe en la presente que estaba formulado con 1% (v/v) de suero se concentro aproximadamente veinte veces en la etapa de TFF, de modo que la corriente de alimentacion cargada sobre la resina de apatito contuviera tanto como 20% de contaminantes de proteina serica en comparacion con un concentrado de la corriente de alimentacion procedente de un cultivo de produccion formulado sin suero. Los inventores de la presente solicitud probaron los metodos de captura en apatito proporcionados en la presente con concentrados de corrientes de alimentacion procedentes de cultivos de produccion formulados en presencia o ausencia de suero. Se encontro que la presencia de proteinas sericas en la corriente de alimentacion no tenia efecto sobre el comportamiento de la etapa cromatografica en apatito.
Inactivacion termica de virus cooperador (destruccion termica)
Si se usan adenovirus infecciosos como una fuente de virus cooperador en los cultivos de produccion para la produccion de rAAV, se puede incorporar una etapa de inactivacion termica (destruccion termica) opcional para inactivar cualesquiera particulas adenovirales residuales que puedan estar presentes en la corriente de alimentacion. La etapa de destruccion termica se beneficia de una de las principales diferencias entre AAV y adenovirus: las particulas de adenovirus se inactivan a temperaturas de aproximadamente 54-56°C, mientras que las particulas virales de AAV y rAAV son estables y no se ven afectadas por esas temperaturas. En la presente divulgacion, incluyendo la presente invencion, los inventores han ajustado la etapa de inactivacion termica para ajustarse a una optimizacion del procedimiento a mayor escala tal como los cultivos de produccion a una escala de 250 l realizados en la presente. En particular, el eluido del apatito se inactivo termicamente en una bolsa de bioprocesamiento de un solo uso esteril de 5 l sobre una plataforma giratoria de temperatura controlada ajustada a 53°C con una velocidad de giro de 40 RPM, con un angulo de 12° para la mezcladura (recipiente calentador de Wave de 20 l). El eluido del apatito se incubo sobre la plataforma hasta que alcanzaba 52°C, y a continuacion se mantuvo a esa temperatura durante 10 minutos adicionales. Se anadio MgCl2 al eluido del apatito en una concentracion final de 2 mM para estabilizar el vector de rAAV durante el calentamiento. Un experto normal en la especialidad puede apreciar que la escala, el punto de ajuste final para el calentamiento y el tiempo de calentamiento se pueden probar empiricamente para encontrar condiciones optimas para inactivar particulas adenovirales mientras se mantiene la infectividad y la integridad de las particulas de rAAV. La etapa de inactivacion termica se puede omitir para la purificacion de particulas de rAAV de cultivos de produccion que utilizan construcciones plasmidicas para proporcionar una funcion cooperadora.
Cromatografia de interaccion hidrofoba
La cromatografia de interaccion hidrofoba (HIC) es una tecnica para separar biomoleculas basandose en diferencias en su hidrofobia superficial. Asi, la HIC se considera un metodo ortogonal a las otras etapas de purificacion en el procedimiento de AAV. Los medios cromatograficos de HIC contienen ligandos hidrofobos tales como hidrocarburos de cadena lineal (p. ej., propilo (C3), butilo (C4), hexilo (C6) u octilo (C8)) o compuestos aromaticos (p. ej., fenilo). En agua pura, el efecto hidrofobo es demasiado debil para la interaccion funcional entre el ligando y proteinas, o entre las propias proteinas. Sin embargo, las sales liotropicas potencian las interacciones hidrofobas, y la adicion de sal impulsa la captura de proteinas en medios de HIC. Por esta razon, las resinas de HIC se cargan habitualmente bajo altas concentraciones de sal y se eluyen a concentraciones de sal inferiores. Como apreciara un experto normal en la especialidad, el sulfato amonico [(NH4)2SO4] es la sal mas comunmente usada para controlar la captura de proteinas a traves de cromatografia HIC, debido a la alta clasificacion liotropica de los iones tanto amonio como sulfato en la serie de Hofmeister, y la alta solubilidad de la sal. En la presente divulgacion, particulas de rAAV presentes en una corriente de alimentacion se cargaron sobre una resina de HIC mediante la mezcladura en linea de una relacion 75:25 (volumen:volumen) de tampon de sulfato amonico 2 M + BisTris 50 mM (pH 7,0):corriente de alimentacion, respectivamente. La mezcladura en linea de la corriente de alimentacion con el tampon de carga evita el riesgo de cualquier precipitacion de vectores de rAAV por la alta concentracion de sulfato amonico presente en el tampon. Como apreciara un experto normal en la especialidad, la concentracion de sal (sulfato amonico) se puede manipular para alcanzar la concentracion optima para la union a rAAV. Segun esto, en algunos casos, la concentracion de sulfato amonico esta entre 1 M y 3 M. En algunos casos preferidos, la concentracion de sulfato amonico en el tampon de carga es 2 mM. Como puede apreciar un experto normal en la especialidad, la mezcladura en linea del sulfato amonico y la corriente de alimentacion se realiza por comodidad y fluidez de la operacion de la unidad, pero se podria mezclar facilmente la corriente de alimentacion con la concentracion apropiada de tampon de carga por cualquier medio conocido en la especialidad y a continuacion cargar la corriente de alimentacion + la solucion de tampon de carga sobre el medio cromatografico de HIC.
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Los codisolventes tambien pueden afectar a la interaccion hidrofoba. Por ejemplo, el etilen- o el propilenglicol puede reducir la interaccion entre la protema y el ligando inmovilizado y asf ser util para mejorar los perfiles de elucion. Segun esto, la columna de HIC se lavo con una mezcla 75:25 (v:v) de tampon de sulfato amonico 2 M + BisTris 50 mM (pH 7,0):tampon de BisTris 50 mM (pH 7,0) + 10% de propilenglicol (v:v) (EMD BioSciences), y el rAAV se eluyo en un tampon con bajo contenido de sal mas propilenglicol (tampon de sulfato amonico 800 mM + BisTris 50 mM (pH 7,0) + 4% de propilenglicol. Bajo esas condiciones de elucion, cualesquiera virus cooperadores y protefnas residuales presentes en la corriente de alimentacion cargada sobre la columna permanecerfan unidos a la columna. El propilenglicol en este ejemplo se anadio a los tampones para agudizar el perfil de elucion, en comparacion con el perfil de elucion amplio del tampon sin propilenglicol, pero es opcional en el procedimiento.
Ejemplos de resinas hidrofobas adecuadas incluyen sin limitacion Tosoh Butyl 650M, Tosoh SuperButyl 650C, Tosoh Phenyl 650C y EMD Fractogel Phenyl (Tosoh Bioscience LLC, PA)
Un residuo procedente de procedimientos de produccion de rAAV requiere una descontaminacion rigurosa antes de la eliminacion al menos por dos razones: (1) el producto comprende un vector viral; y (2) los cultivos de produccion comunmente usan adenovirus tipo 5 (Ad5) vivo como un virus cooperador para la produccion de rAAV. Un residuo lfquido procedente de operaciones cromatograficas tfpicamente se descontamina en primer lugar con lejfa en el punto de uso y a continuacion se somete a una descontaminacion adicional manteniendo a pH alto antes de la neutralizacion y la eliminacion.
El sulfato amonico presente en los tampones de HIC reacciona tanto como ^a como con hidroxido sodico para liberar cloro y amonfaco gaseosos nocivos, respectivamente. Por lo tanto, una primera consideracion para la optimizacion de un procedimiento de la etapa de cromatograffa HIC era el desarrollo de un sistema tamponador adecuado que se pudiera descontaminar de forma segura mediante metodos conocidos en la especialidad.
Como apreciara un experto normal en la especialidad, los tampones con altas concentraciones de sal usados en la cromatograffa de interaccion hidrofoba se deben cribar con respecto a cuestiones de viscosidad que pueden dar como resultado altas contrapresiones que bien pueden limitar los caudales o bien provocar problemas de mezcladura, incrementando de ese modo el riesgo de precipitacion del producto mediante cristalizacion de sales en los tampones que se producen a temperaturas usadas para el almacenamiento o el funcionamiento. Basandose en los datos de la Tabla 6 posterior y considerando los factores descritos anteriormente, los inventores seleccionaron el citrato sodico 1 M (pH 7,0) como el tampon optimo para la union de vectores de rAAV al medio cromatografico de HIC, aunque se pueden usar tampones de citrato en la cromatograffa de interaccion hidrofoba a concentraciones de 0,5 M a 2,0 M.
Intercambio de tampones mediante cromatograffa de exclusion por tamano (SEC)
Se conocen en la especialidad numerosos metodos para realizar el intercambio de tampones descrito en la presente, incluyendo TFF y dialisis. El uso de cromatograffa de exclusion por tamano tiene la ventaja adicional de proporcionar una depuracion protefnica adicional de protefnas con tamanos que atraviesan los poros de las resinas y ser relativamente rapido en cuanto al tiempo necesario para intercambiar los tampones. El intercambio de tampones se realizo en esta etapa para asegurar que el eluido de HIC de la etapa previa se intercambiaba por un tampon apropiado para rAAV que se une a la etapa de cromatograffa de intercambio anionico final en el procedimiento.
Agente adventicio (depuracion viral)
Opcionalmente, una etapa adicional para depurar oligocontaminantes, tales como virus adventicios que pueden estar presentes en la corriente de alimentacion, se puede incorporar en el procedimiento, dando de ese modo un procedimiento ortogonal comercialmente razonable. Asf, en algunos casos o realizaciones, el procedimiento incluye ademas un filtro de depuracion viral. Ejemplos de estos filtros se conocen en la especialidad e incluyen Millipore Viresolve NFR (50 nm), Pall Ultipore VF (50 nm) y Asahi 70 nm.
Cromatograffa de intercambio anionico
Una etapa de captura con intercambio anionico para el vector de rAAV sometido a cromatograffa en apatito se realizo como una etapa de concentracion y refinado final. Medios para cromatograffa de intercambio anionico adecuados son conocidos en la especialidad e incluyen, sin limitacion, Unosphere Q (Biorad, Hercules, California) y amino- e iminorresinas cargadas en N tales como, p. ej., POROS 50 PI, o cualquier DEAE, TMAE, amina terciaria o cuaternaria o resinas basadas en PEI conocidas en la especialidad (Patente de EE. UU. N° 6.989.264; N. Brument y cols., Mol. Therapy 6(5):678-686 (2002); G. Gao y cols., Hum. Gene Therapy 11:2079-2091 (2000)). Un experto normal en la especialidad puede apreciar que se pueden identificar tampones de lavado de intensidad ionica adecuada de modo que el rAAV permanezca unido a la resina mientras se separan otras impurezas producidas durante el procedimiento incluyendo sin limitacion glucanos que se pueden introducir mediante percolacion desde diversos filtros utilizados en las etapas de purificacion. En algunos casos, el tampon de lavado es NaCl 60 mM y el vector de rAAV se eluye desde la columna con NaCl 130 mM, de modo que cualesquiera oligoimpurezas producidas durante el procedimiento residuales presentes, tales como albumina serica o virus cooperadores, se retengan en la columna.
Ejemplos
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Ejemplo 1 :Cosecha de rAAV-1 de la depuracion del medio de cultivo y la digestion con Benzonase®
Medio de produccion de rAAV-1 gastado (sobrenadante) procedente de un cultivo de produccion viral de rAAV-1 de 250 l producido mediante cualquier metodo conocido en la especialidad que contiene el vector de rAAV-1 se depuro para retirar cualesquiera celulas contenidas en el sobrenadante. El sobrenadante se hizo pasar a traves de una serie de filtros conectados en serie, que incluyen: (1) a Millipore Millistak+® HC Pod Filter, Grade D0HC (Millipore Corp., Bedford, MA) (4 veces); (2) un Millipore Millistak+® HC Pod Filter, Grade A1HC; y (3) un Opticap® XU0 Millipore Express SHC Hydrophilic Membrane 0,2 pm Filter a una velocidad de 5 litros por minuto (LPM) que se reducia escalonadamente hasta 4 LPM.
Todos los filtros se prelavaron en agua de osmosis inversa/desionizada ("RO/DI") segun las especificaciones del fabricante. El flujo pasante se recogio en una bolsa de bioprocesamiento para la digestion con Benzonase®. Una concentracion final de 2 unidades/ml de Benzonase® (numero de catalogo de EM Industries 1.01695.0002) se disolvio en el medio de produccion de rAAV-1 y se anadio al sobrenadante viral depurado para alcanzar una concentracion final de 2,5 unidades/ml. El sobrenadante mas Benzonase® se incubo a temperatura ambiente con recirculacion constante a 4 LPM para permitir la digestion del ADN. Datos de la digestion con Benzonase® se muestran en la Figura 1, que demuestra que no estaba presente ADN de alto peso molecular despues de la digestion con Benzonase®.
Ejemplo 2: Retirada de contaminantes de produccion a traves de intercambio anionico
El sobrenadas depurado y digerido con Benzonase® de rAAV-1 del Ejemplo 1 se hizo pasar sobre una serie de filtros Pall Mustang® Q ("MQ") de 5,1 cm por 55,9 cm (dos pulgadas por veintidos pulgadas) conectados en serie (Pall Corp., numero de catalogo NP6MSTGQP1). Antes de la carga del sobrenadante viral de rAAV-1, los filtros se esterilizaron con 15 l de NaOH 0,5 M a 0,5 LPM con un tiempo de espera de 15 minutos, se cargaron al enjuagar con 15 l de TMEG + NaCl 2M (tMeG: Tris-HCl 0,05 M, pH 7,5, 2-mercaptoetanol 1 mM, Na2EDTA 1 mM, 10% (v/v) de glicerol) a una velocidad de 6 LPM, y se equilibraron con 15 l de medio de produccion de vectores a 6 LPM. A continuacion, el sobrenadante se bombeo a un caudal de aproximadamente 6 LPM a traves de una serie de filtros y se recogio en una bolsa de bioprocesamiento. A la intensidad ionica del medio de produccion, se demostro que el filtro MQ de intercambio anionico depuraba virus cooperador y ADN residual, entre otras impurezas, del sobrenadante de rAAV-1 mediante la union de los contaminantes a la membrana cargada. Sin embargo, a la intensidad ionica del cultivo de produccion, el vector de rAAV-1 presente en el sobrenadante fluia a traves de la membrana de intercambio anionico. Durante la optimizacion del procedimiento, se determino experimentalmente que usar un solo filtro MQ daba como resultado una saturacion de contaminantes en el procedimiento, incluyendo el virus cooperador Ad5. Por consiguiente, un segundo filtro se anadio en serie o en tandem en el procedimiento.
Ejemplo 3: Concentracion de sobrenadante de vector rAAV-1
El sobrenadante de produccion completo del vector de rAAV-1 procesado en los Ejemplos 1 y 2 se concentro aproximadamente 20 veces a traves de filtracion con flujo tangencial ("TFF") desde un volumen inicial de aproximadamente 250 l hasta un volumen de aproximadamente 12,5 l. Cartuchos filtrantes de polietersulfona de flujo tangencial con un corte de peso molecular de 100 kD, tamiz C y una superficie especifica total de 5 m2 (Millipore Pellicon® 2 Biomax, N° Catalogo P2B100C05) se barrieron con 50 l de agua RO/DI, se esterilizaron con 15 l de NaOH 0,5 M con un tiempo de espera de 15 minutos, se barrieron de nuevo con 100 l de WIFI (agua purificada WFI HyPure™; HyClone, Logan, UT), se barrieron con 15 l de TMEG + NaCl 2 M y finalmente se equilibraron con 15 l de medio de produccion de rAAV-1. El sobrenadante se hizo pasar a traves del cartucho de TFF a un caudal de aproximadamente 3 LPM con una velocidad de recirculacion de 16 LPM. El material de TFF retenido sobre el filtro ("retenido") se concentro hasta aproximadamente 10,5 l y se transfirio a un deposito. El filtro se barrio con aproximadamente 2 l de medio de produccion. El lavado y el concentrado se reunieron a continuacion para dar un volumen final de aproximadamente 12,5 l.
La concentracion de rAAV-1 hasta un volumen de 12,5 l mediante TFF tambien concentraba los restantes contaminantes de produccion de rAAV-1 en la solucion en aproximadamente 20 veces. Asi, se introdujo una etapa de fabricacion de espera despues de la etapa de TFF, durante la cual el concentrado de TFF se filtraba a traves de una membrana filtrante de 0,22 pM Opticap de 10,2 cm (4 pulgadas) (Millipore Opticap® N° Catalogo KVSC04HB3). Esta etapa de filtracion suplementaria permite que el concentrado de TFF que contiene rAAV-1 avance hasta la siguiente etapa del procedimiento sin requerir diafiltracion e intercambio de tampones. El material despues de la TFF se puede almacenar a 2-8°C durante cualquier periodo de tiempo, incluyendo desde tan poco como 24 horas hasta tanto como 3 meses o mas, antes del procesamiento adicional sin perdida en la estabilidad segun se mide por el rendimiento de vector o la infectividad valorados mediante ensayos conocidos en la especialidad. Alternativamente, la TFF realizada como se describe en la presente se podia usar en cualquier etapa del procedimiento de purificacion para concentrar o someter a intercambio de tampones el vector de rAAV-1.
Ejemplo 4: Cribado de resinas con respecto al vector de rAAV-1 frente a la union a impurezas del procedimiento Procedimientos comerciales aprobados por la FDA para la purificacion de proteinas y otros productos biologicos se basan en procedimientos ortogonales de incorporacion a escala comercial. Los procedimientos ortogonales son procedimientos que tienen mas de una etapa o procedimiento para la retirada de impurezas producidas durante el procedimiento, incluyendo etapas tanto de captura como de flujo pasante para el producto final tal como, por
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ejemplo, un vector de rAAV-1. Se ha demostrado en la especialidad que los vectores de rAAV (especificamente rAAV-2) se unen a resinas anionicas. Se ha demostrado que vectores de rAAV tales como rAAV-1, -5 y -8 se unen mucho menos fuertemente que rAAV-2 a intercambiadores anionicos en presencia de componentes de produccion tales como albumina serica, componentes de virus cooperadores, componentes del medio de produccion y ADN de celulas hospedadoras, dando como resultado un esquema de purificacion menos eficaz y de menor calidad.
Estrategias de purificacion previas descritas en la especialidad para aglutinantes anionicos de afinidad inferior tales como AAV-1 incluyen un gradiente por etapas de iodixinol que reduce la concentracion relativa de los componentes de produccion a fin de alcanzar una union mas fuerte del vector de rAAV a intercambiadores anionicos. Los gradientes por etapas de iodixinol no son facilmente ampliables a escala hasta procedimientos a escala comercial tales como los descritos en la presente. Por lo tanto, a fin de optimizar la purificacion del vector de rAAV con respecto a aglutinantes anionicos de baja afinidad tales como rAAV-1 sin la necesidad de realizar ultracentrifugacion y gradientes por etapas, se cribo un numero de resinas con respecto a su capacidad para unirse a vectores de rAAV o excluir los vectores de rAAV en el flujo pasante en comparacion con la capacidad para unirse a o dejar fluir a su traves impurezas del procedimiento observadas comunmente incluyendo ADN de celulas hospedadoras, virus cooperadores, albumina serica, proteinas sericas (si se incluye suero en el medio de produccion), y otras proteinas de bajo peso molecular encontradas en los cultivos de produccion a fin de desarrollar un procedimiento de purificacion de rAAV comercialmente ampliable a escala, ortogonal y eficaz.
El cribado de resinas se realizo usando una columna de 1 ml (altura del lecho 5 cm) con caudales lineales recomendados por el vendedor para cada resina a capacidades sobrecargadas intensamente con relacion a las recomendaciones del fabricante. Se recogieron rastreos espectrofotometricos de absorbancia ultravioleta a 280 nanometros (A280) con respecto a la union a y la elucion de cada resina. Los picos se analizaron mediante el ensayo apropiado tanto para el vector de rAAV-1 como para impurezas del procedimiento representativas. Los datos presentados en la Figura 2 representan un rastreo espectrofotometrico tipico para una resina tipica de la lista. La Tabla 2 lista algunas de las resinas rastreadas asi como las afinidades de union relativas de la resina para el vector de rAAV-1 y diversas impurezas del procedimiento.
Tabla 2: Cribado de resinas con respecto a la union de rAAV-1 en comparacion con la union de contaminantes del procedimiento
- Resina
- Tipo de Resina rAAV-1 Virus cooperador ADN de Celulas Hospedadoras Albumina Serica Proteinas sericas
- UnoS pH 5,5
- Intercambio Cationico + 0 - + +
- UnoS pH 7,0
- Intercambio Cationico - - - - -
- UnoQ pH 8,5
- Intercambio Anionico + ++ ++++ ++ ++
- UnoQ pH 7,0
- Intercambio Anionico + +++ ++++ ++ ++
- Fractogel EMD SO3
- Intercambio Cationico + ++ - 0 0
- CHT
- Apatito + 0 ++ + +
- CFT
- Apatito + 0 ++ + +
- HIC Phenyl
- Intercambio Hidrofobo - - 0 0
- HIC Butyl
- Intercambio Hidrofobo + ++ - 0 0
- HIC Hexyl
- Intercambio Hidrofobo + ++ - 0 0
- HIC PPG
- Intercambio Hidrofobo - - 0 0
- Source S
- Intercambio Ionico + 0 0 ++ 0
- Source Q
- Intercambio Ionico + 0 0 ++ 0
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- Resina
- Tipo de Resina rAAV-1 Virus cooperador ADN de Celulas Hospedadoras Albumina Serica Proteinas sericas
- TMAE
- Intercambio Ionico + 0 0 ++ 0
- IMAC FeCl3
- 0 0 - + +
- Superdex 200
- Filtracion en Gel hueco hueco recorrido recorrido recorrido
- HW55
- Filtracion en Gel hueco hueco recorrido recorrido recorrido
- HW65
- Filtracion en Gel hueco hueco recorrido recorrido recorrido
- HW75
- Filtracion en Gel hueco hueco recorrido recorrido recorrido
Clave: (-) = presente en el flujo pasante (sin union); + = debilmente unido (eluido muy pronto en el gradiente); ++ a ++++ = union mas fuerte (eluida mas adelante en el gradiente).
Ejemplo 5: Desarrollo de cromatografia en apatito en presencia de polietilenglicol ("PEG") para la captura de rAAV-1 Basandose en los resultados del cribado de resinas realizado en el Ejemplo 4, una resina de apatito o una resina de apatito ceramico se eligio como una de las resinas de captura para rAAV-1. Se realizaron experimentos iniciales usando resinas de CFT II, pero para la ultima purificacion la resina se cambio por CHT I, segun se analiza con detalle posteriormente. Los datos indicaban que ambas resinas cromatograficas se comportaban equivalentemente. Los experimentos se realizaron para incrementar adicionalmente la capacidad de union a rAAV-1 de la resina de apatito y mejorar la capacidad de la resina para discriminar entre particulas de rAAV-1 y otras impurezas producidas durante el procedimiento. Se desarrollaron ademas dos mejoras clave para la funcion de las resinas de apatito segun se describe en la presente: 1) la adicion de PEG; y 2) el desarrollo de las condiciones del tampon de carga.
Basandose en la saturacion variable de la columna de apatito debido a cuestiones de capacidad en los tamanos de columna comercialmente razonables, se mezclo PEG con el concentrado de TFF (vease el Ejemplo 3 anterior) antes de la carga sobre la resina de apatito a fin de incrementar la union del vector de rAAV-1 con relacion a otras impurezas producidas durante el procedimiento tales como albumina serica, virus cooperador y otras impurezas proteinicas que desplazan al vector de rAAV-1 con respecto a la union a la columna en el Ejemplo 4.
La cromatografia en apatito en presencia de PEG representa una estrategia de captura o union eficaz para la purificacion de vectores de rAAV-1, aunque muchas impurezas producidas durante el procedimiento tambien eran retenidas por la resina de apatito a pH 7,0.
Se realizaron experimentos para determinar si modificar las condiciones de tamponacion podia mejorar la resolucion de rAAV-1 de otras impurezas producidas durante el procedimiento. Se realizaron experimentos a pequena escala usando un AKTAexplorer FPLC System (GE Healthcare, Piscataway, NJ) equipado con 5 columnas Tricorn de 1,2 ml (GE Healthcare) rellenas a una altura del lecho de 6 cm con resina de cFt, con circulacion a un caudal de 150 cm/h. Esas columnas se evaluaron con respecto a la captura del vector de rAAV-1 frente a la union de albumina serica bovina ("BSA"), una impureza producida durante el procedimiento, de molecula pequena, modelica, en diversos sistemas tamponadores en presencia o ausencia de 5% de PEG6000.
Se inyecto rAAV-1 o BSA en pequenos volumenes (<5% del volumen total) en la columna de CFT en el sistema tamponador que se va a ensayar, bien en presencia o bien en ausencia de 5% (p/v) de PEG6000. Se usaron pequenos volumenes a fin de obviar la necesidad de intercambio de tampones entre las muestras. Los productos se eluyeron junto con un gradiente de PO4 500 mM. Se uso acido 2-(N-morfolino)etanosulfonico ("MES") 50 mM para tamponar el sistema a pH=6,50, y se uso borato 20 mM para tamponar el sistema a pH 9,0.
Los datos presentados en la Tabla 3 demuestran que la union de vector de rAAV-1 a la resina de apatito era esencialmente la misma a pH 6,5 o pH 9,0 en presencia de 5% (p/v) de PEG6000, mientras que la union de BSA, la impureza producida durante el procedimiento, de molecula pequena, modelica, se reducia drasticamente a pH 9,0 en presencia o ausencia de 5% (p/v) de PEG6000, segun se indica por los rastreos espectrofotometricos (datos no mostrados). Un analisis adicional de la capacidad reducida de BSA para unirse a la columna de apatito en condiciones de carga de tampon basico (es decir, pH=9,0) mediante un ensayo de inmunoabsorcion con enzimas ligadas ("ELISA") demostraba que la mayoria de la BSA (~78%) estaba presente en el flujo pasante a condiciones tamponadoras de pH 9,0, mientras que se podian alcanzar niveles adicionales de depuracion o reduccion en la union a BSA durante etapas de lavado posteriores (~19%), dejando solo ~0,1% de la BSA cargada en la columna realmente unida a la resina de apatito y coeluyendo con el vector de rAAV-1. Las particulas de rAAV-1 eran estables a pH=9,0, segun se indicaba por la falta de perdida de infectividad o la disminucion en el numero de particulas resistentes a desoxirribonucleasa ("DRP") eluidas.
Tabla 3: Fuerza relativa de la union de rAAV-1 y BSA a resina de apatito a pH=6,5 o pH=9,0, con o sin 5% (p/v) de PEG6000
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- Condiciones de union
- BSA rAAV-1
- pH=6,50
- ++ +
- pH=6,50 + 5% (p/v) de PEG6000
- ++ ++++
- pH=9,0
- + +
- pH=9,00 + 5% (p/v) de PEG 6000
- + ++++
Clave: + = union debil; ++ = union media; ++++ = union fuerte.
Ejemplo 6: Efecto del suero en el cultivo de cosecha de rAAV-1 sobre la captura de rAAV-1 a traves de cromatografia en apatito en presencia de PEG
Los cultivos de produccion de rAAV-1 o las corrientes de alimentacion que contienen rAAV-1 que se van a purificar mediante los metodos descritos en la presente pueden contener suero y proteinas sericas si los cultivos de produccion se sembraban en medio que contiene suero. Aunque se ha descrito la produccion de vectores rAAV-1 que usa concentraciones muy bajas de suero (es decir, 1% o menos) (vease, p. ej., la Pat. EE. UU. N° 6.995.006), la concentracion del cultivo de produccion o la corriente de alimentacion segun se describe en el Ejemplo 3 puede producir una corriente de alimentacion que contiene efectivamente 20% de suero y proteinas sericas como resultado de la concentracion de 20 veces de la cosecha del cultivo de produccion. A fin de evaluar el efecto de componentes sericos sobre el comportamiento de la cromatografia en apatito, se efectuaron experimentos sobre cultivos de produccion producidos en presencia o ausencia de suero, en presencia o ausencia de PEG6000.
Se usaron dos cultivos de produccion de rAVV-1 modelicos para valorar la capacidad de la resina de apatito (CFT tipo I) mediante analisis de saturacion tradicional en un total de cuatro experimentos de carga en columna. En un experimento, los cultivos de produccion contenian suero; y, en el segundo experimento, el cultivo de produccion no contenia suero. Ambas corrientes de alimentacion se probaron en presencia de 5% (p/v) de PEG6000 o en ausencia de PEG. Las corrientes de alimentacion eran representativas del procedimiento de cosecha, y eran sobrenadantes de cultivo depurados que se habian hecho pasar sobre un filtro de intercambio anionico y se habian concentrado 20 veces mediante filtracion con flujo tangencial segun se describe en la presente. Columnas de CFT tipo I se cargaron mediante la mezcladura en linea 1:1 de la corriente de alimentacion con un tampon de borato a pH=9,0. El tampon contenia bien 0% o bien 10% (p/v) de PEG6000 (para alcanzar una concentracion final de 5% (p/v) de PEG6000). A medida que se cargaban las columnas, el flujo pasante se recogio en una serie de fracciones que se analizaron con respecto al producto mediante DRP-PCR. La capacidad funcional se definio como el punto en el que la concentracion de producto en el flujo de salida de la columna alcanzaba justo 1% de la concentracion que entraba en la columna, despues de tener en cuenta la dilucion en linea. Para cargas de columna que contenian PEG, el resto del procedimiento cromatografico se realizo a continuacion para valorar la recuperacion de vector en las fracciones eluidas.
Los datos presentados en la Figura 3 demuestran que la adicion de PEG6000 incrementa la capacidad de la resina de apatito con respecto a la union al vector de rAAV-1 independientemente de si estaba presente suero en el cultivo de produccion. Sin querer limitarse por una teoria, el sobrenadante posterior a TFF en presencia de PEG se une preferentemente rAAV-1 a la resina de apatito sobre otras impurezas producidas durante el procedimiento a traves de una interaccion anionica con los restos fosfato que puede ser desplazada por la presencia de fosfato en el tampon de elucion. Ademas, la union de rAAV-1 a la resina de apatito se discrimina adicionalmente de impurezas producidas durante el procedimiento a traves de la interaccion con metales que puede ser desplazada por la presencia de sal. La union de rAAV-1 a los restos fosfato no es impulsada principalmente por la hidrofobia, ya que los tampones de captura y elucion estan formulados para ser principalmente de naturaleza ionica (es decir, el tampon de elucion contiene fosfato 50 mM, en comparacion con tampones de elucion que contienen fosfato 150 mM o superior usados comunmente para eluir composiciones unidas por interacciones principalmente hidrofobas). Bajo estas condiciones de elucion de alto contenido de sal y bajo contenido de fosfato, el virus cooperador, el ADN de celulas hospedadoras y otras proteinas de bajo peso molecular residuales contenidos en el sobrenadante de los cultivos de produccion, si estuvieran presentes, serian retenidos sobre la resina. Sorprendentemente, los datos demuestran que en presencia de PEG6000, los vectores de rAAV-1 producidos en medios bien libres de suero o bien que contienen suero demuestran una capacidad de union para las resinas de apatito de al menos 1,2x1012 DRP/ml (una carga de 1 ml) a mas de 1,5x1014 DRP/ml de resina (150 ml). En ausencia de 5% (p/v) de PEG6000, la capacidad de union de la resina de apatito para la cosecha por TFF era menos de 2,4x1012 DRP/ml para vectores producidos medios que contienen suero y 7,2x1012 DRP/ml para vectores producidos en medios libres de suero, ya que no se recuperaba vector de rAAV-1 en el eluido de CFT.
Ejemplo 7: Purificacion de rAAV-1 a traves de cromatografia en apatito
La columna de CHT tipo I se relleno con NaCl 2 M y se esterilizo con NaOH 1 M. Antes de la carga, la columna se equilibro con 6 volumenes de columna ("VC") de borato 20 mM (pH = 9) + 5% (p/v) de PEG6000. El concentrado de la corriente de alimentacion de TFF se cargo a traves de un BioProcess Skid de 3 mm (GE Healthcare) sobre una columna de CHT de 923 ml (14 cm de diametro x 6 cm de altura del lecho) preparada como se describe previamente a un caudal de 96 cm/h. El concentrado de la corriente de alimentacion de TFF se mezclo en linea con un volumen
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igual de un tampon de borato 40 mM (pH = 9) + 10% (p/v) de PEG6000 para dar una concentracion final de 20 mM de borato (pH = 9) + 5% (p/v) de PEG6000.
Se realizo una serie de 4 lavados secuenciales para retirar impurezas producidas durante el procedimiento mientras se retenia el vector de rAAV-1 sobre la columna. El lavado 1 ("el recorrido") se realizo mediante la mezcladura en linea de 5 VC de un borato 20 mM (pH = 9,0) + 5% (p/v) de PEG6000:borato 40 mM (pH = 9,0) + 10% (p/v) de PEG6000 50:50 (volumen:volumen) para seguir todos los conductos de carga con PEG6000. Ademas, se encontro que esta etapa incrementaba preferentemente la afinidad de union de los vectores de rAAV-1. El lavado 2 se realizo con 15 VC de fosfato potasico 150 mM + borato 20 mM (pH = 9) + 5% (p/v) de PEG6000 para retirar la mayoria de la albumina serica y otras impurezas producidas durante el procedimiento proteinicas de bajo peso molecular mientras se retenia rAAV-1 en la columna. El lavado 3 ("WII" en la Figura 5) se realizo con 15 VC de borato 20 mM (pH = 9) + 5% (p/v) de PEG6000 para retirar cualquier fosfato residual de modo que el rAAV-1 permaneciera unido a la columna una vez que se retiraba el PEG6000. El lavado 4 ("WIII" en la Figura 5) se realizo con 5 VC de tampon de HEPES 20 mM (pH = 7,0) + NaCl 150 mM para retirar el PEG6000 y para ajustar la concentracion de sal, permitiendo de ese modo la discriminacion entre rAAV-1 y cualquier virus cooperador residual u otras impurezas producidas durante el procedimiento, tales como contaminantes proteinicos, que pueden permanecer unidos a la columna.
El vector de rAAV-1 se eluyo de la columna mediante 6 VC de un tampon de fosfato potasico 50 mM + HEPES 20 mM (pH = 7,0) + NaCl 150 mM. La Figura 4 muestra un rastreo espectrofotometrico tipico de absorbancia UV a 280 nm (A280) y conductividad para el procedimiento cromatografico en CHT I. La Figura 5 muestra la pureza relativa de vectores de rAAV eluidos de la resina de apatito.
Depuracion de glucanos mediante cromatografia en apatito
Los glucanos son carbohidratos similares a celulosa que se filtran en el procedimiento desde el filtro de profundidad a base de celulosa usado para recolectar particulas de rAAV-1 desde cultivos de produccion. Los glucanos en concentraciones por encima de ~1 ng/ml pueden interferir con pruebas de lisados de amebocitos de Limulus estandar ("LAL") con respecto a la contaminacion con endotoxinas bacterianas. Segun se demuestra en la Tabla 4 posteriormente, la columna de apatito CHT tipo I se depuraba ~2,5 logaritmos de glucanos procedentes del cultivo de produccion. Bajo las condiciones tamponadoras descritas en la presente, la gran mayoria de los glucanos estaba presente en el flujo pasante y no se unfa a la columna.
Tabla 4: Depuracion de glucanos en el procedimiento
- Etapa de procesamiento
- Concentracion de glucanos (ng/ml) Cantidad total por lote (ng) (escala de 250 l)
- Depuracion
- 10,4 2.600.000
- TFF
- 136 1.541.016
- Elucion de CHT
- 1,9 4.769
- Despues de HIC y SEC
- 0,2 662
- Eluido Final del Intercambio Anionico
- 0,1 71
Las muestras se ensayaron con respecto al glucano usando un ensayo cromogenico cinetico basado en LAL especifico para glucanos (Glucatell®, Cape Cod, MA).
Depuracion de virus cooperador Ad5 mediante cromatografia en apatito
Para confirmar que la cromatografia en CHT depuraba Ad5 de la corriente de alimentacion, se realizo un estudio de agregacion preliminar usando una corriente de alimentacion procedente del procedimiento aguas arriba final. Los niveles de agregacion de Ad5 se establecieron basandose en datos obtenidos del estudio de depuracion viral en fase I con resinas de CFT II, y se usaron tres relaciones de carga diferentes de la corriente de alimentacion: 6,6 ml; 13,5 ml y 33 ml de corriente de alimentacion posterior a TFF por ml de resina de CHT.
Los datos presentados en la Tabla 5, depuracion de Ad5 mediante CHT, eran comparables con la depuracion de 4 LRV, demostraban aproximadamente 4 logaritmos de depuracion viral de Ad5 y parecian ser independientes del volumen de corriente de alimentacion cargada, dentro del intervalo de 5 veces valorado. La baja recuperacion de Ad5 esta de acuerdo con datos previos que indican que bajo las condiciones tamponadoras utilizadas, el Ad5 se une mas fuertemente que rAAV-1 a la resina de apatito.
Tabla 5: Unidades infecciosas totales de Ad5 en fracciones de la columna de CHT
- Fraccion de relacion de carga
- 6,6 ml 13,5 ml 33 ml
- Carga
- 9,0x108 1,3x109 9,0x108
- Flujo pasante + recorrido
- <2,5x105 <3,6x105 <6,9x105
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- Lavado con PO4
- 2,9x106 2,7x106 <2,6x10°
- Lavados II y III
- 3,6x106 2,2x106 2,8x106
- Elucion
- <6,9x104 <6,9x104 <3,5x10°
- Valor de reduccion logaritmico (LRV)
- >4,1 >4,3 >3,4
Un total de 8x109 particulas infecciosas de Ad5 (es decir, particulas totales con una P:I de ~10) se agrego a diferentes volumenes de corriente de alimentacion posterior a TFF para circular por la columna de CHT de 1,2 ml. La circulacion en las columnas era de 100 cm/h y se recogieron fracciones para ensayar el vector mediante DRP y Ad5 mediante un ensayo de valoracion de la infeccion. Se uso una version controlada por agregacion del ensayo de infectividad de Ad5 puesto que se sabe que altas concentraciones de las muestras tanto de carga como de elucion de CHT interfieren en el ensayo basado en celulas. La depuracion de Ad5 se determino como el valor de reduccion logaritmico ("LRV"), calculado como el logaritmo de la cantidad total de Ad5 cargada dividida por la cantidad total de Ad5 recuperada en la fraccion de elucion (valor de reduccion logaritmico).
Ejemplo 8: Inactivacion termica de virus cooperador residual
Se realizo una etapa de inactivacion a fin de inactivar y retirar cualquier virus cooperador residual presente en el eluido de CHT I. Para experimentos a menor escala, el eluido de CHT I se dividio entre dos botellas de PETG de 1 l (Nalgene®) y se anadio MgCl2 hasta una concentracion final de 2 mM a fin de incrementar la estabilidad del receptor de rAAV-1. Las botellas se incubaron en un bano de agua a 53,5°C con mezcladura hasta que la temperatura en la botella alcanzaba aproximadamente 52°C. A continuacion, las botellas se enfriaron mediante transferencia a un bano de agua a temperatura ambiente y se mezclaron hasta que la temperatura de la botella fuera no mayor de 5°C por encima de la temperatura ambiente. La mezcla destruida termicamente se filtro a traves de una membrana filtrante de 0,22 pM Opticap® de 10,2 cm (4 pulgadas) (Millipore Opticap® numero de catalogo KVSC04HB3). Alternativamente, para experimentos a mayor escala, el eluido de CHT I se inactivo termicamente en una bolsa de bioprocesamiento esteril de un solo uso (bolsa Custom Hyclone 5 l, pelicula CX5-14) sobre una plataforma giratoria de temperatura controlada con un punto de ajuste de temperatura de 53°C a una velocidad de giro de 40 RPM y un angulo de mezcladura de 12° (recipiente calentador de Wave de 20 l). El eluido de CHT I se incubo sobre la plataforma hasta que la temperatura alcanzaba 52°C y a continuacion se mantuvo durante 10 minutos adicionales. Para estabilizar el rAAV-1 durante el calentamiento, se anadio MgCl2 hasta una concentracion final de 2 mM. Despues de la prueba, el producto se filtro a traves de un filtro de 0,2 pm y se mantuvo durante la noche a temperatura ambiente para minimizar posibles efectos de la temperatura sobre la columna de interaccion hidrofoba posterior.
Ejemplo 9: Captura de rAAV-1 a traves de cromatografia de interaccion hidrofoba ("HIC")
La HIC es una tecnica para separar biomoleculas basada en diferencias en su hidrofobia superficial. Como tal, la HIC se considera un metodo ortogonal a las otras etapas de purificacion en el procedimiento de rAAV-1. Los medios de HIC contienen ligandos hidrofobos tales como hidrocarburos de cadena lineal (p. ej., propilo (C3), butilo (C4), hexilo (C6) u octilo (C8)) o hidrocarburos aromaticos (p. ej., fenilo). En agua pura, el efecto hidrofobo es demasiado debil para la interaccion funcional entre el ligando y proteinas, o entre las propias proteinas. Sin embargo, las sales liotropicas potencian las interacciones hidrofobas, y anadir estas sales impulsa la adsorcion de proteinas a medios de HIC. Por esta razon, las resinas de HIC se cargan habitualmente bajo altas concentraciones de sal y se eluyen a concentraciones de sal inferiores.
Cromatografia HIC con tampones de sulfato amonico
Resumiendo, una columna butilica de HIC de 170 ml (6 cm de diametro x 6 cm de altura del lecho) (Toyopearl® Butyl 650M; Tosoh Biosciences, Montgomeryville, PA; Numero de catalogo 14702) se esterilizo con varios volumenes de columna de NaOH 0,5 M y se equilibro con una mezcla 75:25 (volumen:volumen) de sulfato amonico 2 M + Bis Tris 50 mM (pH = 7,0):Bis Tris 50 mM (pH = 7,0). El eluido de apatito de vectores de rAAV-1 destruidos termicamente se cargo a una velocidad de 3,3 l/h con mezcladura en linea en una relacion 75:25 (volumen:volumen) de sulfato amonico 2 M + Bis Tris 50 mM (pH = 7,0):eluido del apatito de rAAV-1. La mezcladura en linea evita el riesgo de cualquier precipitacion del vector de rAAV-1 por el sulfato amonico presente en el tampon. La columna se lavo con uno o mas volumenes de columna de una mezcla 75:25 (volumen:volumen) de un tampon de sulfato amonico 2 M +
Bis Tris 50 mM pH = 7,0:tampon de Bis Tris 50 mM pH = 7,0 + 10% de propilenglicol (volumen:volumen) (EMD
Biosciences). En este ejemplo, el propilenglicol se anadio a los tampones para agudizar el perfil de elucion, en comparacion con el perfil de elucion amplio del tampon sin propilenglicol, aunque es opcional en el procedimiento. El vector de rAAV-1 se eluyo de la columna con tampon de sulfato amonico 800 mM + Bis Tris 50 mM (pH = 7,0) + 4% de propilenglicol. A las condiciones de elucion utilizadas, cualesquiera virus cooperador y proteinas residuales presentes en la carga permanecerian unidos a la columna.
El residuo procedente de procedimientos de produccion de rAAV-1 requiere una descontaminacion rigurosa antes de la eliminacion, debido a que tanto el producto que es un vector viral como el uso de adenovirus tipo 5 (Ad5) vivo como un virus cooperador para la produccion. El residuo liquido procedente de operaciones cromatograficas
tipicamente se descontamina en primer lugar con lejia en el punto de uso y a continuacion se descontamina
adicionalmente al mantener a pH alto antes de la neutralizacion y la eliminacion. El sulfato amonico presente en los tampones de HIC reacciona tanto con lejia como con hidroxido sodico para liberar cloro y amoniaco gaseosos
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nocivos, respectivamente. Por lo tanto, una consideracion primaria para la optimizacion del procedimiento de la etapa cromatografica de HIC era el desarrollo de un sistema tamponador adecuado que se podria descontaminar con seguridad mediante metodos conocidos en la especialidad.
Cribado con respecto a tampones adecuados para la union de rAAV-1 a la columna de HIC
Vector de rAAV-1 se cargo en columnas en una variedad de diferentes condiciones tamponadoras y la eficacia de union relativa se determino al medir la cantidad de vector de rAAV-1 presente en la fraccion de flujo pasante (Tabla 6). Los tampones evaluados incluian tanto sales liotropicas a alta concentracion utilizadas tradicionalmente con procedimientos cromatograficos de HIC como varios tampones de pH bajo en los que se produciria potencialmente una interaccion en modo mixto (HIC/intercambio cationico). Las resinas tanto Tosoh Butyl 650M como EMD Phenyl se unian al vector en varios de los tampones alternativos.
Los tampones con altas concentraciones salinas usados en la cromatografia de interaccion hidrofoba se deben cribar adicionalmente con respecto a cuestiones de viscosidad que pueden dar como resultado altas contrapresiones que bien pueden limitar los caudales o bien provocar problemas de mezcladura y el riesgo de precipitacion del producto debido a la cristalizacion durante el almacenamiento o las temperaturas de trabajo de los tampones. Basandose en los datos de la Tabla 6 posterior, y despues de considerar los factores descritos anteriormente, se eligio citrato sodico 1 M, pH = 7,0 como el tampon optimo para la union de vectores de rAAV-1 al medio cromatografico de HIC.
Tabla 6: Cribado con respecto a la union de AAV1 en tampones alternativos
- Sistema Tamponador Probado
- Butyl 650M (% en flujo pasante) EMD-Phenyl (% en flujo pasante)
- Sulfato Sodico 1,1 M (pH = 7)
- 0% 0%
- Citrato Sodico 1 M (pH = 7)
- 0% 0%
- Fosfato Potasico 1,3 M (pH = 7)
- 3% 3%
- NaCl 2,9 M, Citrato Sodico 50 mM (pH = 4)
- 0% 28%
- Glicina 1 M, Citrato Sodico 50 mM (pH = 4)
- 4% 1%
- Fosfato Potasico 50 mM (pH = 4,5)
- 3% NT
- Citrato Sodico 50 mM (pH 4)
- 4% NT
- NaCl 2,9 M, Fosfato Potasico 50 mM (pH 4,5)
- 17% NT
Los experimentos se realizaron a temperatura ambiente en columnas Tricorn 5/50 (6 cm de altura del lecho, volumen de la columna 1,2 ml) usando vector de rAAV-1 purificado. Las columnas se equilibraron con los tampones listados y se cargaron a la columna -2x10^ DRP o rAAV-1. El rAAV-1 se eluyo a lo largo de un gradiente lineal de 20 VC desde Bis Tris 145 mM (pH = 7,0), 10% (v/v) de propilenglicol. El flujo pasante se recogio y se ensayo mediante analisis de DRP con respecto a la fraccion de rAAV-1 aplicada a la columna que fluia a su traves o no se unfa.
Se realizo una caracterizacion adicional sobre la depuracion de impurezas producidas durante el procedimiento en la columna de HIC en los diversos tampones demostrando buena union de rAAV-1 en el experimento previo. Los datos de la Tabla 7 posterior para la union de contaminantes modelicos demuestran que tanto el adenovirus como el ADN si estan presentes en la corriente de alimentacion se discriminan eficazmente mediante la etapa cromatografica de HIC.
Tabla 7: Union relativa de rAAV-1 frente a impurezas producidas durante el procedimiento modelicas en diferentes tampones de HIC
- Sistema Tamponador
- rAAV-1 Ad5 DNA
- tampon de sulfato sodico 0,1 M + bis tris, pH = 7,0
- + ++ -
- tampon de sulfato sodico 0,8 M, bis tris, pH = 7,0
- + ++ 0
- citrato sodico 1 M, pH = 7,0
- + ++ 0
- NaCl 2,9 M (citrato sodico 50 mM hasta tampon a pH = 4,0)
- - - 0
Clave: "0" = sin material de union presente en el flujo pasante; "-" = aglutinante muy debil; "+" = aglutinante fuerte; "++" = aglutinantes mas fuerte.
Los experimentos se realizaron a temperatura ambiente en columnas Tricorn 5/50 (altura del lecho 6 cm, volumen de la columna 1,2 ml). Las columna se equilibraron con los tampones listados y las muestras indicadas se cargaron a la
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columna. Cada muestra se eluyo a lo largo de un gradiente lineal de 20 VC. Las muestras se recogieron y se ensayaron con respecto al material de carga pertinente.
Cromatografia HIC con tampones de citrato sodico
El eluido de apatito de vector rAAV-1 destruido termicamente se cargo posteriormente a una columna butilica de HIC a fin de reducir adicionalmente cualesquiera impurezas del procedimiento residuales y como una etapa de concentracion y desalado. Una columna butilica de HIC de 373 ml (6 cm de diametro x 8,9 cm de altura del lecho) (Tosoh Biosciences Toyopearl® Butyl 650M numero de catalogo 14702) se esterilizo con varios volumenes de columna de NaOH 0,5 M y se equilibro con 5 VC de una mezcla 75:25 (volumen:volumen) de citrato 1 M + fosfato sodico 20 mM:fosfato sodico 20 mM. El eluido de CHT I de vector de rAAV-1 destruido termicamente se cargo a una velocidad de 106 cm/h con mezcladura en linea en una relacion de 75:25 (volumen:volumen) de citrato 1 M + fosfato sodico 20 mM:eluido de CHT I. La mezcladura en linea evita el riesgo de cualquier precipitacion del vector de rAAV- 1. La columna se lavo con 5 VC de una mezcla 75:25 (volumen:volumen) de tampon de citrato 1 M + fosfato sodico 20 mM:fosfato sodico 20 mM. El vector de rAAV-1 se eluyo de la columna con 6 VC de citrato 0,35 M + fosfato sodico 20 mM. A continuacion, la columna se lavo con 3,5 VC de tampon de fosfato sodico 20 mM. Este lavado bajo en sal (sodio 20 mM) eluye una fraccion de particulas de vector de rAAV-1 que son hidrofobamente distintas en su perfil de elucion de las particulas de vector de rAAV-1 que se eluyen en el tampon de elucion de salinidad superior. De hecho, si la fraccion eluida en bajo contenido de sal se aisla y se aplica de nuevo a la columna de HIC bajo las condiciones descritas, esa poblacion de vector todavia se eluia solamente en la fraccion de baja salinidad, indicando que la fraccion no era el resultado de una saturacion en la capacidad de la columna. El analisis de infectividad sugiere que esta fraccion de rAAV-1 probablemente representa una poblacion que comprende capsides vacias, capsides parcialmente desnaturalizadas, material de la capside menos infeccioso y capsides parcialmente llenas. Por lo tanto, esta observacion puede conducir a mejoras en la separacion de particulas de rAAV-1 que son menos infecciosas y por lo tanto menos deseables como material obtenido como producto. A las condiciones de elucion utilizadas, cualesquiera virus cooperadores y proteinas residuales presentes en la carga permanecerian unidos a la columna y asi estarian presentes en la separacion con bajo contenido de sal.
Ejemplo 10: Intercambio de tampon mediante cromatografia de exclusion por tamano ("SEC")
El intercambio de tampones mediante cromatografia de exclusion por tamano proporciona depuracion proteinica adicional de proteinas de un tamano que atraviesa los poros de las resinas, y es relativamente rapido en cuanto al tiempo necesario para intercambiar los tampones. El intercambio de tampones realizado en esta etapa era para asegurar que el eluido de HIC de la etapa previa se intercambiara por un tampon apropiado para la union de rAAV-1 a la etapa de cromatografia de intercambio anionico final del procedimiento. Una resina de calidad preparativa Amersham Superdex® 200 de 3,2 l (14 cm de diametro x 21 cm de altura del lecho) (Amersham/GE Healthcare, Piscataway, NJ; Numero de catalogo 17-1043-04) se relleno y se preparo al esterilizar con NaCl 2 M + NaOH 1 M y se equilibro con 2,8 VC de NaCl 20 mM + Tris 20 mM (pH = 8,0). La elucion de HIC se subdividio al procedimiento a lo largo de la SEC en tres ciclos secuenciales de aproximadamente 400 ml cada uno, cargando no mas de 12,5% del volumen de la columna de SEC para cada ciclo. Los picos de producto (contenidos en el volumen de huecos) de los tres ciclos de SEC se recogieron en una sola bolsa de bioprocesamiento. El eluido de HIC se cargo a la columna a un caudal de 49 cm/h. La columna se recorrio y se barrio con 1,4 VC de NaCl 20 mM + Tris 20 mM (pH = 8,0) y el vector de rAAV-1 presente en el eluido de HIC estaba presente en el volumen de huecos de la columna. Despues de la recogida del volumen de huecos segun se describe, las fracciones segunda y tercera se cargaron y se recogieron en la misma columna como se describe previamente para la primera fraccion.
Ejemplo 11: Agente adventicio (depuracion viral)
Como un procedimiento opcional para depurar virus adventicios que pueden estar presentes como oligocontaminantes y asi dar un procedimiento ortogonal comercialmente razonable, se introdujo en el procedimiento un filtro de depuracion viral. Ejemplos de estos filtros son conocidos en la especialidad e incluyen Millipore Viresolve® NFR (50 nm), Pall Ultipore® VF (50 nm) y Asahi 70 nm. Un filtro de depuracion viral Millipore Viresolve® NFR (filtro Millipore 4" Virosolve NFR Numero de catalogo KZRV 04T C3) se preparo segun las instrucciones del fabricante, se barrio con NaCl 20 mM + Tris 20 mM (pH = 8,0) y la elucion de SEC se filtro a traves de la membrana. El filtro se barrio con varios volumenes de NaCl 20 mM + Tris-HCl 20 mM (pH 8,0) y se reunio con el eluido de SEC filtrado.
Ejemplo 12: Cromatografia de intercambio anionico
Se realizo una segunda etapa de captura por intercambio anionico para el vector de rAAV-1 como una etapa de concentracion final y refinado sobre una resina Unosphere® Q (Biorad, Hercules, CA). Una columna de 373 ml (8,9 cm de diametro x 6 cm de altura del lecho) se esterilizo con varios volumenes de columna de NaOH 0,5 M y se equilibro con 7 VC de tampon de NaCl 20 mM + Tris 20 mM (pH = 8,0). La fraccion de volumen de huecos de SEC u opcionalmente el eluido filtrado viralmente se cargo a una velocidad de 309 cm/h. La columna se lavo con 10 VC de NaCl 60 mM. La intensidad ionica de la solucion de lavado se eligio para retener rAAV-1 unido a la resina mientras se separaban cualesquiera otras impurezas producidas durante el procedimiento, tales como glucanos que se pueden introducir mediante percolacion desde diversos filtros utilizados en las etapas de purificacion. El vector de rAAV-1 se eluyo de la columna con 6 VC de un NaCl 130 mM. La intensidad ionica de la elucion salina de NaCl 130 mM separara el rAAV-1 de la columna mientras cualesquiera oligoimpurezas producidas durante el procedimiento residuales, tales como albumina serica o virus cooperador, permaneceran unidas.
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La Figura 6 compara el grado de purificacion a traves de diversas etapas de procedimiento mediante SDS-PAGE. Muestras obtenidas durante el procedimiento procedentes de una cosecha del cultivo de produccion representativas se hicieron circular en un gel de poliarilamida al 10% desnaturalizador/reductor y se tineron con Sypro Orange. Todas las muestras posteriores a la cosecha se cargaron a 1x1010 DRP / carril. Las dos muestras aguas arriba antes de la etapa de concentracion por TFF (flujo pasante de la etapa de depuracion inicial y el intercambio anionico ("AEX")) solo se podian cargar a 1x109 DRP/carril debido a restricciones de volumen sobre el gel. Se cargo B- galactosidasa (B-Gal) en 50 ng/carril para valorar la sensibilidad y la consistencia de la tincion a traves del gel. Se indican las tres proteinas de la capside de AAV1 (VP1,2, y 3).
Ejemplo 13: Porcentaje de recuperacion de rAAV durante la purificacion
Los datos presentados en la Figura 7 muestran el porcentaje de recuperacion de particulas infecciosas de rAAV despues de cada etapa de procedimiento del esquema de purificacion a partir de un cultivo de produccion representativo de un vector de rAAV-1. El porcentaje de recuperacion se calculo basandose en las DRPs totales del vector de rAAV-1 recuperado de cada etapa de procedimiento dividido por el numero total de DRPs cargadas o sometidas a esa etapa de purificacion. Los datos demuestran que en cada etapa en el procedimiento de purificacion, se alcanzaban recuperaciones de aproximadamente 60% o mas. En numerosos experimentos, el intervalo de recuperacion de cada etapa de procedimiento era al menos de 60% a 90%. De forma particularmente notable, el intervalo de recuperacion en la etapa de captura (es decir, la etapa cromatografica en apatito) en experimentos individuales variaba de 57% a mas de 90%. Por otra parte, el intervalo de recuperacion en la etapa de HIC variaba de 60% a 80%.
Aunque la divulgacion precedente, incluyendo la presente invencion, se ha descrito con algun detalle a modo de ilustracion y ejemplo con propositos de claridad de compresion, es evidente para los expertos en la especialidad que se pueden poner en practica ciertos pequenos cambios y modificaciones. Por lo tanto, no se debe considerar que la descripcion y los ejemplos limiten el alcance de la invencion.
Casos preferidos de la presente divulgacion se divulgan posteriormente y se indican como caso E1 a E42.
E1. Un metodo para aislar una poblacion de particulas de virus adenoasociado recombinante (rAAV) de impurezas producidas durante el procedimiento en una corriente de alimentacion, que comprende las etapas de:
(a) poner en contacto una corriente de alimentacion que contiene las particulas de rAAV con un medio cromatografico de apatito en presencia de polietilenglicol (PEG), en donde las particulas de rAAV se unen al medio cromatografico de apatito; y
(b) eluir las particulas de rAAV unidas al medio cromatografico de apatito con un tampon de elucion que contiene menos de 3% (p/v) de PEG.
E2. El metodo segun el caso 1, en el que el medio cromatografico de apatito es hidroxiapatito ceramico (CHT).
E3. El metodo segun el caso 1, en el que el medio cromatografico de apatito es fluoroapatito ceramico (CFT).
E4. El metodo segun el caso 1, en el que la union especifica del medio cromatografico de apatito a las particulas de rAAV esta entre 1014 y 1016 particulas resistentes a desoxirribonucleasa por mililitro (DRP/ml).
E5. El metodo segun el caso 1, que comprende ademas una etapa de unir las particulas de rAAV de la corriente de alimentacion eluida del medio cromatografico de apatito a un medio cromatografico anionico.
E6. El metodo segun el caso 1, en el que la corriente de alimentacion que contiene las particulas de rAAV de la etapa (a) se pone en contacto con un medio cromatografico de apatito en presencia de polietilenglicol (PEG) y un tampon basico.
E7. El metodo segun el caso 6, en el que el tampon basico esta entre pH 7,6 y 10.
E8. El metodo segun el caso 6, en el que el tampon basico esta entre pH 8,0 y 10,0.
E9. El metodo segun el caso 6, en el que el tampon basico esta entre pH 9,0 y 10,0.
E10. El metodo segun el caso 6, en el que el tampon basico comprende borato.
E11. El metodo segun el caso 1, en el que el PEG tiene un peso molecular medio entre aproximadamente 5.000 (PEG5000) gramos por mol y aproximadamente 15.000 (PEG15000) gramos por mol.
E12. El metodo segun el caso 11, en el que el PEG tiene un peso molecular medio de aproximadamente 6.000 (PEG6000) gramos por mol.
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E13. El metodo segun el caso 1, en el que la corriente de alimentacion que contiene las particulas de rAAV en la etapa (a) se pone en contacto con el medio cromatografico de apatito en presencia de entre aproximadamente 3% (p/v) y aproximadamente 10% (p/v) de PEG.
E14. El metodo del caso 13, en el que la corriente de alimentacion se pone en contacto con el medio cromatografico de apatito en presencia de aproximadamente 5% (p/v) de PEG6000.
E15. El metodo del caso 13, en el que la corriente de alimentacion se pone en contacto con el medio cromatografico de apatito en presencia de aproximadamente 10% (p/v) de PEG6000.
E16. El metodo segun el caso 1, que comprende ademas una etapa de lavado del medio cromatografico de apatito con un tampon de lavado despues de que la corriente de alimentacion se ponga en contacto con el medio cromatografico de apatito pero antes de eluir las particulas de rAAV del medio cromatografico de apatito.
E17. El metodo segun el caso 16, en el que el medio cromatografico de apatito se lava una o mas veces con un tampon de lavado que contiene aproximadamente 7,5% (p/v) de PEG y/o un tampon de lavado que contiene aproximadamente 5% (p/v) de PEG.
E18. El metodo segun el caso 17, en el que el medio cromatografico de apatito se lava ademas con un tampon de lavado que contiene menos de aproximadamente 3% (p/v) de PEG y/o un tampon de lavado que no contiene PEG.
E19. El metodo segun el caso 16, en el que el tampon de lavado comprende un tampon seleccionado del grupo que consiste en borato, acido N-2-hidoxietilpiperacino-N’-2-etanosulfonico (HEPES) y Tris-HCl.
E20. El metodo segun el caso 16, en el que el tampon de lavado tiene un pH basico.
E21. El metodo segun el caso 20, en el que el tampon de lavado comprende borato a un pH entre aproximadamente 8,0 y aproximadamente 10,0.
E22. El metodo segun el caso 21, en el que el tampon de lavado comprende borato a un pH de aproximadamente
8,0.
E23. El metodo segun el caso 21, en el que el tampon de lavado comprende borato a un pH de aproximadamente
9.0.
E24. El metodo segun el caso 21, en el que el tampon de lavado comprende borato a un pH de aproximadamente
10.0.
E25. El metodo segun el caso 20, en el que el tampon de lavado comprende ademas entre 100 y 500 mM de un fosfato.
E26. El metodo segun el caso 20, en el que el tampon de lavado comprende ademas entre 50 y 250 mM de NaCl.
E27. El metodo segun el caso 1, en el que las particulas de rAAV unidas al medio cromatografico de apatito se eluyen con un tampon de elucion que contiene bajas concentraciones de PEG o en ausencia de PEG.
E28. El metodo segun el caso 27, en el que el tampon de elucion comprende un tampon seleccionado del grupo que consiste en borato, acido N-2-hidoxietilpiperacino-N’-2-etanosulfonico (HEPES) y Tris-HCl a pH neutro.
E29. El metodo segun el caso 27, en el que el tampon de elucion contiene menos de aproximadamente 3% (p/v) de PEG6000.
E30. El metodo segun el caso 29, en el que el tampon de elucion comprende ademas menos de 100 mM de fosfato.
E31. El metodo segun el caso 30, en el que el tampon de elucion comprende ademas 50 mM de fosfato.
E32. El metodo segun el caso 31, en el que el tampon de elucion comprende ademas entre 50 y 250 mM de NaCl.
E33. Un metodo para aislar una poblacion de particulas de virus adenoasociado recombinante (rAAV) de impurezas
de produccion en una corriente de alimentacion, que comprende las etapas de:
(a) poner en contacto una corriente de alimentacion que contiene las particulas de rAAV con un medio cromatografico de interaccion hidrofoba (HIC) en un tampon de salinidad alta, en donde las particulas de rAAV y las impurezas de produccion se unen al medio HIC; y
(b) eluir las particulas de rAAV unidas al medio HIC con un tampon de salinidad media.
E34. El metodo segun el caso 33, en el que el medio HIC se selecciona del grupo que consiste en resina Tosoh Butyl 650M, Tosoh SuperButyl 650C, Tosoh Phenyl 650C, EMD Fractogel Phenyl y Tosoh Has(butyl).
E35. El metodo segun el caso 33, en el que el tampon de salinidad alta comprende entre aproximadamente 0,5 M y 5 aproximadamente 2,0 M de citrato.
E36. El metodo segun el caso 35, en el que el tampon de salinidad alta comprende ademas entre aproximadamente 1 y aproximadamente 100 mM de fosfato.
10 E37. El metodo segun el caso 33, en el que el tampon de salinidad media comprende menos de 0,5 M de citrato.
E38. El metodo segun el caso 37, en el que el tampon de salinidad media comprende ademas entre aproximadamente 1 y aproximadamente 100 mM de fosfato.
15 E39. El metodo segun el caso 37, en el que el tampon de salinidad media comprende de 0,2 M a 0,5 M de citrato.
E40. El metodo segun el caso 39, en el que una poblacion de particulas de rAAV con capsides vacias, capsides parcialmente desnaturalizadas, material de capside menos infeccioso y/o capsides parcialmente llenas se une al medio HIC despues de la elucion con el tampon de salinidad media.
20
E41. El metodo segun el caso 1 o el caso 33, en el que las particulas de rAAV comprenden una proteina de la capside de AAV de un serotipo de la capside de AAV seleccionado del grupo que consiste en AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAV-6, AAV-7, AAV-8, AAV-9, AAV-10, AAV-11, AAV-12, AAV-13, AAV-14, AAV-15 y AAV-16.
25 E42. El metodo segun el caso 41, en el que las particulas de rAAV comprenden una proteina de la capside de AAV
de un serotipo de la capside de AAV seleccionado del grupo que consiste en AAV-1, AAV-4, AAV-5 y AAV-8.
Claims (10)
- 510152025303540REIVINDICACIONES1. Un metodo para aislar una poblacion de particulas de virus adenoasociado recombinante (rAAV) de impurezas de produccion en una corriente de alimentacion, que comprende las etapas de:(a) poner en contacto una corriente de alimentacion que contiene las particulas de rAAV con un medio cromatografico de interaccion hidrofoba (HIC) en un tampon de salinidad alta, en donde el tampon de salinidad alta comprende entre 0,5 M y 2,0 M de citrato, en donde las particulas de rAAV y las impurezas de produccion se unen al medio HIC; y(b) eluir las particulas de rAAV unidas al medio HIC con un tampon de salinidad media, en donde el tampon de salinidad media comprende menos de 0,5 M de citrato.
- 2. El metodo segun la reivindicacion 1, en el que el tampon de salinidad alta comprende entre 0,5 M y 2,0 M de citrato sodico.
- 3. El metodo segun la reivindicacion 1 o 2, en el que el tampon de salinidad alta comprende aproximadamente cualquiera de 0,5 M, 0,75 M, 1,0 M, 1,25 M, 1,5 M, 1,75 M y 2,0 M de citrato.
- 4. El metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el tampon de salinidad alta comprende 1 M de citrato sodico (pH 7,0).
- 5. El metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el medio HIC se selecciona del grupo que consiste en resina Tosoh Butyl 650M, Tosoh SuperButyl 650C, Tosoh Phenyl 650C, EMD Fractogel Phenyl, y Tosoh Has(butyl).
- 6. El metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el tampon de salinidad alta comprende ademas entre aproximadamente 1 y aproximadamente 100 mM de fosfato.
- 7. El metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el tampon de salinidad media comprende aproximadamente cualquiera de 0,45 M, 0,4 M, 0,35 M, 0,3 M y 0,25 M de citrato.
- 8. El metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el tampon de salinidad media comprende ademas entre aproximadamente 1 y aproximadamente 100 mM de fosfato.
- 9. El metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que una poblacion de particulas de rAAV con capsides vacias, capsides parcialmente desnaturalizadas, material de capside menos infeccioso y/o capsides parcialmente llenas se une al medio HIC despues de la elucion con el tampon de salinidad media.
- 10. El metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que las particulas de rAAV comprenden una proteina de capside de AAV procedente de un serotipo de capside de AAV seleccionado del grupo que consiste en AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAV-6, AAV-7, AAV-8, AAV-9, AAV-10, AAV-11, AAV-12, AAV-13, AAV-14, AAV-15 y AAV-16, y preferiblemente seleccionado del grupo que consiste en aAv-1 , AAV-4, AAV-5 y AAV-8.Figura 1
imagen1 - Carril
- Muestra
- 1
- Tampon solo
- 2
- Escalera en TE
- 3
- -
- 4
- Escalera en la corriente de alimentacio despues de la depuracion (PCLF)
- 5
- Controles
- 6
- ADN A en PCLF (sin Benz.)
- 7
- control de parada (A+PCLF+EDTA+Benz.)
- 8
- control positivo (ADN A en tampon + Benz.)
- 9
- PCLF del lote de produccion
- 10
- muestra de Benzonase del lote de produccion
- 11
- muestra de AEXFT del lote de produccion Diaestiones con aareaacion
- 12
- 5 min. a 15°C
- 13
- 20 min. a 15°C
- 14
- 62 min. a 15°C
- 15
- 5 min. a 37°C
- 16
- 20 min. a 37°C
- 17
- 62 min. a 37°C
- 18
- -
- 19
- Escalera en PCFL
- 20
- Escalera en TE
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