ES2694765T3 - Polipéptidos con actividad de proteasa - Google Patents

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ES2694765T3 ES13758862.0T ES13758862T ES2694765T3 ES 2694765 T3 ES2694765 T3 ES 2694765T3 ES 13758862 T ES13758862 T ES 13758862T ES 2694765 T3 ES2694765 T3 ES 2694765T3
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Abstract

Polipéptido aislado dotado de actividad de proteasa, seleccionado del grupo constituido por: (a) un polipéptido que presenta al menos un 84% de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID N.º: 5; (b) un polipéptido codificado por un polinucleótido que presenta al menos un 84% de identidad de secuencia con la secuencia codificante del polipéptido maduro de SEQ ID N.º: 1; (c) una variante del polipéptido de SEQ ID N.º: 5 comprendiendo una sustitución, deleción, y/o inserción en una o más posiciones, en la que el número total de sustituciones, deleciones y/o inserciones de aminoácidos no es superior a 20; y (d) un fragmento de un polipéptido de (a), (b) o (c) dotado de actividad de proteasa, en el que el polipéptido tiene una actividad de proteasa mejorada entre pH 3 y 4, a 25°C en comparación con la proteasa con la secuencia mostrada en SEQ ID N.º: 8 de la cepa NRRL 18262.

Description

Polipéptidos con actividad de proteasa
Referencia a un listado de secuencias
[0001] Esta solicitud contiene un listado de secuencias en formato legible por ordenador, que se incorpora en la presente para referencia.
Antecedentes de la invención
Campo de la invención
[0002] La presente invención se refiere a polipéptidos aislados que tienen actividad de proteasa y secuencias de ácidos nucleicos aisladas que codifican las proteasas. La invención también se refiere a constructos de ácidos nucleicos, vectores y células huésped, incluyendo células vegetales y animales, que comprenden las secuencias de ácidos nucleicos, así como métodos para producir y utilizar las proteasas, en particular el uso de las proteasas en piensos para animales.
Antecedentes de la invención
[0003] Cabe señalar que, en el uso de proteasas en piensos para animales (in vivo) y/o el uso de tales proteasas para tratar proteínas vegetales (in vitro), las proteínas son factores nutricionales esenciales para animales y seres humanos. Los seres humanos y el ganado normalmente obtienen las proteínas necesarias de fuentes de proteína vegetales. Son fuentes de proteína vegetales importantes, por ejemplo, los cultivos de semillas oleaginosas, las legumbres y los cereales.
[0004] Cuando, por ejemplo, se incluye harina de soja en el pienso para animales monogástricos tales como cerdos y aves, una proporción significativa de la harina de soja no se digiere de manera eficaz (la digestibilidad ileal aparente de proteínas en lechones, cerdos en crecimiento y aves tales como pollos de engorde, gallinas ponedoras y gallos es solo de alrededor de un 80%).
[0005] El pedtubo digestivo de los animales consiste en una serie de segmentos, cada uno representando diferentes ambientes de pH. En animales monogástricos tales como cerdos y aves y muchos tipos de pescado, el estómago es marcadamente ácido con un pH potencialmente tan bajo como 1-2, mientras que el intestino tiene un pH más neutro de alrededor de 6-7,5. Aparte del estómago y el intestino, las aves también tienen un buche que precede al estómago. El pH en el buche está determinado principalmente por el pienso ingerido y por lo tanto típicamente se sitúa en el intervalo de pH 4-6. La digestión de proteínas por una proteasa puede ocurrir a lo largo de todo el tracto digestivo, siempre que la proteasa se active y sobreviva a las condiciones del tracto digestivo. Por lo tanto, las proteasas que son altamente estables en ácido y pueden sobrevivir así en el ambiente gástrico y al mismo tiempo son eficazmente activas en el amplio intervalo de pH fisiológico del tracto digestivo en el animal diana son especialmente deseables. Las novedosas proteasas S53 de la invención son útiles para estos fines.
[0006] Ya que el pienso para animales se formula frecuentemente en forma granulada, en el cual se aplica vapor en el proceso de granulación, es deseable también que las proteasas usadas en piensos para animales sean capaces de permanecer activas después de la exposición a dicho tratamiento de vapor.
[0007] Para producir una proteasa para el uso industrial, es importante que la proteasa se produzca en rendimientos altos que hacen que el producto esté disponible en cantidades suficientes para ser capaz de proporcionar la proteasa a un precio favorable.
Descripción de la técnica relacionada
[0008] Las proteasas S53 se conocen en la técnica. Un péptido S53 de Grifola frondosa con número de registro MER078639 (SEQ ID N.º: 9) tiene un 83,6% de identidad de secuencia con la SEQ ID N.º: 5. Martinez et al. aislaron una proteasa S53 de Postia placenta (Uniprot: B8PMI5, SEQ ID N.º: 10) con un 74,5% de identidad de secuencia con la SEQ ID N.º: 5 en "Genome, transcriptome, and secretome analysis of wood decay fungus Postia placenta supports unique mechanisms of lignocellulose conversion", 2009, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106:1954-1959.
[0009] VandenWymelenberg et al. han aislado una proteasa S53 (Uniprot: Q281W2, SEQ ID N.º: 11) en "Computational analysis of the Phanerochaete chrysosporium v2.0 genome database and mass spectrometry identification of peptides in ligninolytic cultures reveal complex mixtures of secreted proteins", 2006, Fungal Genet. Biol. 43:343-356 con un 74,1% de identidad de secuencia con la SEQ ID N.º: 5. Otro polipéptido S53 de Postia placenta (Uniprot:B8P431, SEQ ID N.º: 12) ha sido identificado por Martinez et al. en "Genome, transcriptome, and secretome analysis of wood decay fungus Postia placenta supports unique mechanisms of lignocellulose conversion", 2009, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106:1954-1959 con un 68,2% de identidad de secuencia con la SEQ ID N.º: 5. Otros péptidos, incluyendo proteasas S53, tienen menos de un 70% de identidad de secuencia con la SEQ ID N.º: 5.
[0010] Floudas et al. han publicado la secuencia de una proteasa S53 en "The Paleozoic origin of enzymatic lignin decomposition reconstructed from 31 fungal genomes", 2012, Science, 336:1715-1719 con un 80,6% de identidad con la SQE ID Nº: 5. Fernandez-Fueyo et al. han publicado las secuencias de tres serinproteasass en "Comparative genomics of Ceriporiopsis subvermispora and Phanerochaete chrysosporium provide insight into selective ligninolysis", 2012, Proc Natl Acad Sci USA. 109:5458-5463 (Uniprot:M2QQ01, SEQ ID N.º: 26, Uniprot:M2QWH2, SEQ ID N.º: 27; Uniprot:M2RD67, SEQ ID N.º: 28) con un 80,8%, 79,1% y 78,6% de identidad respectivamente con la SEQ ID N.º: 5.
[0011] WO 02/068623 describe una proteasa de Aspergillus niger con un 49,2% de identidad de secuencia con la SEQ ID N.º: 5 para el uso en aplicaciones en piensos y alimentación. WO 12/048334 describe endopeptidasas de tipo serina de Myceliophthora thermophila como un aditivo para piensos o para piensos con un 47,9% de identidad de secuencia con la SEQ ID N.º: 5.
[0012] WO 95/28850 divulga la combinación de una fitasa y una o más enzimas proteolíticas microbianas para mejorar la solubilidad de proteínas vegetales. WO 01/58275 divulga el uso de proteasas estables en ácido de la familia de la subtilisina en piensos para animales. WO 01/58276 divulga el uso de proteasas estables en ácido derivadas de Nocardiopsis sp. NRRL 18262 (la proteasa 10R), así como una proteasa derivada de Nocardiopsis alba DSM 14010 en piensos para animales. WO 04/072221, WO 04/111220, WO 04/111223, WO 05/035747 y WO 05/123911 revelan proteasas relacionadas con la proteasa 10R y su uso en piensos para animales. WO 04/072279 divulga el uso de otras proteasas en piensos para animales. WO 04/034776 divulga el uso de una subtilisina/queratinasa, PWD-1 de B. Licheniformis, en el pienso para aves. WO 04/077960 divulga un método para aumentar la digestibilidad de forraje o grano en rumiantes aplicando una proteasa bacteriana o fúngica.
[0013] Los productos comerciales que comprenden una proteasa y comercializados para el uso en piensos para animales incluyen RONOZYME® ProAct (DSM NP/Novozymes), Axtra® (Danisco), Avizyme® (Danisco), Porzyme® (Danisco), Allzyme™ (Alltech), Versazyme® (BioResources, Int.), Poultrygrow™ (Jefo) y Cibenza® DP100 (Novus).
Resumen de la invención
[0014] La presente invención relacionada con un polipéptido aislado que tiene actividad de proteasa, seleccionado del grupo constituido por:
(a)
un polipéptido que tiene al menos un 84% de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID N.º: 5;
(b)
un polipéptido codificado por un polinucleótido que tiene al menos un 84% de identidad de secuencia con la secuencia codificante del polipéptido maduro de SEQ ID N.º: 1;
(c)
una variante del polipéptido de SEQ ID N.º: 5 que comprende una sustitución, deleción y/o inserción en una o más posiciones, donde el número total de sustituciones, deleciones y/o inserciones de aminoácidos no es superior a 20; y
(d)
un fragmento de un polipéptido de (a), (b) o (c) con actividad de proteasa,
en el que el polipéptido tiene una actividad de proteasa mejorada a un pH de entre 3 y 4, a 25°C en comparación con la proteasa NRRL 18262. La invención se dirige además al polipéptido anteriormente definido que comprende o consiste en la SEQ ID N.º: 2, SEQ ID N.º: 4, SEQ ID N.º: 5 o SEQ ID N.º: 6 y a un polinucleótido aislado que codifica los polipéptidos de la invención.
[0015] La invención se refiere además a polinucleótidos aislados que codifican los polipéptidos de la presente invención, constructos de ácido nucleico, vectores de expresión recombinantes y a métodos para producir los polipéptidos.
[0016] La presente invención se refiere a una célula huésped de expresión recombinante que comprende el polinucleótido de la invención unido operativamente a una o más secuencias de control que dirigen la producción
del polipéptido donde el huésped se selecciona del grupo consistente en Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Bjerkandera, Ceriporiopsis, Chrysosporium, Coprinus, Coriolus, Cryptococcus, Filibasidium, Fusarium, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Phanerochaete, Phlebia, Piromyces, Pleurotus, Schizophyllum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trametes y Trichoderma o donde el huésped es una levadura, tal como Pichia o Saccharomyces, o un Bacillus tal como Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Geobacillus stearothermophilus, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis o Bacillus thuringiensis.
[0017] Además, la invención se dirige a un método para mejorar el valor nutricional de un pienso para animales, donde al menos un polipéptido de la invención se añade al pienso así como a un aditivo para piensos para animales que comprende al menos un polipéptido de la invención; y al menos una vitamina liposoluble, y/o al menos una vitamina hidrosoluble, y/o al menos un oligoelemento.
[0018] La presente invención también se refiere a composiciones, preferiblemente composiciones de piensos para animales, que comprenden los polipéptidos de la invención; uso de los polipéptidos de la invención en piensos para animales o como aditivos para piensos para animales; métodos para preparar una composición para el uso en piensos para animales, para mejorar el valor nutricional de un pienso para animales, y métodos de tratamiento de proteínas a utilizar en composiciones de piensos para animales.
Resumen del listado de secuencias
[0019]
SEQ ID N.º: 1 es la secuencia de ADNc de la proteasa S53 3 tal como se aísla de Meripilus giganteus. SEQ ID N.º: 2 es la secuencia de aminoácidos tal como se desprende de la SEQ ID N.º: 1. SEQ ID N.º: 3 es la secuencia de ADN de la secuencia de ADN de expresión recombinante de la SEQ ID N.º: 1 con etiqueta HQ. SEQ ID N.º: 4 es la secuencia de aminoácidos tal como se desprende de la SEQ ID N.º: 3. SEQ ID N.º: 5 es la secuencia de aminoácidos de la proteasa S53 3 madura de Meripilus giganteus. SEQ ID N.º: 6 es la secuencia de aminoácidos de la proteasa S53 madura obtenida de la SEQ ID N.º 3. SEQ ID N.º: 7 es la secuencia de ADN de la proteasa 10R (WO 05/035747, SEQ ID N.º: 1). SEQ ID N.º: 8 es la secuencia de aminoácidos de la proteasa 10R (WO 05/035747, SEQ ID N.º: 2). SEQ ID N.º: 9 es la secuencia de aminoácidos de un péptido S53 de Grifola frondosa (MER078639). SEQ ID N.º: 10 es la secuencia de aminoácidos de un péptido S53 de Postia placenta (Uniprot: B8PMI5). SEQ ID N.º: 11 es la secuencia de aminoácidos de un péptido S53 de Phanerochaete chrysosporium (Uniprot: Q281W2). SEQ ID N.º: 12 es la secuencia de aminoácidos de un péptido S53 de Postia placenta (Uniprot: B8P431). SEQ ID N.º: 13 es el cebador 597. SEQ ID N.º: 14 es el cebador 598. SEQ ID N.º: 15 es la secuencia de ADNc de la proteasa S53 1 aislada de Trametes cf. versicolor. SEQ ID N.º: 16 es la secuencia de aminoácidos tal como se deduce de la SEQ ID N.º: 15. SEQ ID N.º: 17 es la secuencia de ADN de la secuencia de ADN recombinante expresada a partir de la SEQ ID N.º: 15. SEQ ID N.º: 18 es la secuencia de aminoácidos tal como se desprende de la SEQ ID N.º: 17. SEQ ID N.º: 19 es la secuencia de aminoácidos de la proteasa S53 madura obtenida de la SEQ ID N.º 15 y la SEQ ID N.º: 17. SEQ ID N.º: 20 es la secuencia de ADNc de la proteasa S53 2 aislada de Trametes versicolor. SEQ ID N.º: 21 es la secuencia de aminoácidos tal como se deduce de la SEQ ID N.º: 20. SEQ ID N.º: 22 es la secuencia de ADN de la secuencia de ADN recombinante expresada a partir de la SEQ ID N.º: 20. SEQ ID N.º: 23 es la secuencia de aminoácidos tal como se desprende de la SEQ ID N.º: 22. SEQ ID N.º: 24 es la secuencia de aminoácidos de la proteasa S53 madura obtenida de la SEQ ID N.º 20 y la SEQ ID N.º: 22. SEQ ID N.º: 25 es la secuencia de aminoácidos de un péptido S53 de Dichomitus squalens (Uniprot: R7SPH9). SEQ ID N.º: 26 es la secuencia de aminoácidos de un péptido S53 de Ceriporiopsis subvermispora (Uniprot: M2QQ01). SEQ ID N.º: 27 es la secuencia de aminoácidos de un péptido S53 de Ceriporiopsis subvermispora (Uniprot: M2QWH2). SEQ ID N.º: 27 es la secuencia de aminoácidos de un péptido S53 de Ceriporiopsis subvermispora (Uniprot: M2QWH2).
SEQ ID N.º: 28 es la secuencia de aminoácidos de un péptido S53 de Ceriporiopsis subvermispora (Uniprot: M2RD67).
Matriz de identidad de secuencias:
SEQ ID:2
SEQ ID:5 SEQ ID:9 SEQ ID:18 SEQ ID:19 SEQ ID:23 SEQ ID:24 SEQ ID:25 SEQ ID:26 SEQ ID:27 SEQ ID:28
SEQ ID:2
100 100 79,8 86,7 86,6 86,0 85,5 76,2 75,0 73,1 72,8
SEQ ID:5
100 100 83,6 86,6 86,6 85,5 85,5 80,6 80,8 79,1 78,6
SEQ ID:9
79,8 83,6 100 79,6 84,1 78,6 82,7 72,7 78,0 75,8 76,4
SEQ ID:18
86,7 86,6 79,6 100 100 96,5 96,2 77,8 77,0 75,0 74,8
SEQ ID:19
86,6 86,6 84,1 100 100 96,2 96,2 81,4 82,5 79,4 79,7
SEQ ID:23
86,0 85,5 78,6 96,5 96,2 100 100 76,8 77,1 75,0 74,7
SEQ ID:24
85,5 85,5 82,7 96,2 96,2 100 100 80,0 82,2 79,1 79,5
SEQ ID:25
76,2 80,6 72,7 77,8 81,4 76,8 80,0 100 70,4 68,9 69,4
SEQ ID:26
75,0 80,8 78,0 77,0 82,5 77,1 82,2 70,4 100 93,0 94,2
SEQ ID:27
73,1 79,1 75,8 75,0 79,4 75,0 79,1 68,9 93,0 100 94,4
SEQ ID:28
72,8 78,6 76,4 74,8 79,7 74,7 79,5 69,4 94,2 94,4 100
Breve descripción de las figuras
5 [0020]
La figura 1 muestra el perfil de actividad en función del pH de la proteasa S53 3 de Meripilus giganteus (del ejemplo 2) en comparación con la proteasa 10R en el sustrato Suc-AAPF-pNA a 25°C. La figura 2 muestra el perfil de estabilidad en función del pH de la proteasa S53 3 de Meripilus giganteus (del ejemplo 2) en comparación con la proteasa 10R (actividad residual tras 2 horas a 37°C).
10 La figura 3 muestra el perfil de actividad en función de la temperatura de la proteasa S53 3 de Meripilus giganteus (del ejemplo 2) a pH 4,0 en comparación con la proteasa 10R en Protazyme AK a pH 6,5. La figura 4 muestra la especificidad por P1 de la proteasa S53 3 de Meripilus giganteus (del ejemplo 2) a pH 4 en comparación con la proteasa 10R a pH 9,0 en 10 sustratos Suc-AAPX-pNA a 25°C. La figura 5 muestra la actividad (OD340 x factor de dilución) en harina de maíz y soja de la proteasa S53 3 de
15 Meripilus giganteus (del ejemplo 2) en comparación con la proteasa 10R. La figura 6 muestra el nivel de aminas libres (OD340 x factor de dilución) en muestras blanco T0, muestras blanco y muestras incubadas con la proteasa S53 3 de Meripilus giganteus (del ejemplo 2) o la proteasa 10R. La figura 7 muestra el perfil de actividad en función del pH de la proteasa S53 1 aislada de Trametes cf. versicolor en comparación con la proteasa S53 3 de Meripilus giganteus (del ejemplo 2) en el sustrato Suc
20 AAPF-pNA a 25°C. La figura 8 muestra el perfil de estabilidad en función del pH de la proteasa S53 1 aislada de Trametes cf. versicolor en comparación con la Proteasa S53 3 de Meripilus giganteus (del ejemplo 2) (actividad residual tras 2 horas a 37°C).
La figura 9 muestra el perfil de actividad en función de la temperatura de la proteasa S53 1 aislada de Trametes cf. versicolor en comparación con la proteasa S53 3 de Meripilus giganteus (del ejemplo 2) en Protazyme AK a pH 4. La figura 10 muestra la especificidad por P1 de la proteasa S53 1 aislada de Trametes cf. versicolor en comparación con la proteasa S53 3 de Meripilus giganteus (del ejemplo 2) a pH 4 en 10 sustratos Suc-AAPXpNA, a 25°C.
Definiciones
[0021] Variante alélica: el término "variante alélica" se refiere a cualquiera de dos o más formas alternativas de un gen que ocupan el mismo locus cromosómico. La variación alélica surge naturalmente a través de mutaciones y puede resultar en polimorfismos dentro de poblaciones. Las mutaciones de gen pueden ser silenciosas (sin cambios en el polipéptido codificado) o pueden codificar polipéptidos que tienen secuencias de aminoácidos alteradas. Una variante alélica de un polipéptido es un polipéptido codificado por una variante alélica de un gen.
[0022] ADNc: el término "ADNc" se refiere a una molécula de ADN que se puede preparar por transcripción inversa a partir de una molécula de ARNm madura y empalmada, obtenida de una célula eucariota. El ADNc carece de secuencias de intrones que pueden estar presentes en el ADN genómico correspondiente. El transcrito de ARN primario inicial es un precursor del ARNm que se procesa a través de una serie de pasos, incluyendo el empalme, antes de aparecer como ARNm empalmado maduro.
[0023] Secuencia codificante: el término "secuencia codificante" se refiere a un polinucleótido, que especifica directamente la secuencia de aminoácidos de un polipéptido. Los límites de la secuencia codificante se determinan generalmente mediante un marco de lectura abierto, que empieza normalmente con el codón de inicio ATG o codones de inicio alternativos tales como GTG y TTG y termina con un codón de parada tal como, TAA, TAG y TGA. La secuencia codificante puede ser un polinucleótido de ADN, ADNc, sintético o recombinante.
[0024] Secuencias de control: el término "secuencias de control" se refiere a secuencias de ácido nucleico necesarias para la expresión de un polinucleótido que codifica un polipéptido maduro de la presente invención. Cada secuencia de control puede ser nativa (es decir, del mismo gen) o exógena (es decir, de un gen diferente) al polinucleótido que codifica el polipéptido o nativa o exógenas entre sí. Tales secuencias de control incluyen, pero de forma no limitativa, un líder, secuencia de poliadenilación, secuencia de propéptido, promotor, secuencia de péptido señal y terminador de la transcripción. Como mínimo, las secuencias de control incluyen un promotor y señales de terminación transcripcional y traduccional. Las secuencias de control pueden estar provistas de conectores con el propósito de introducir sitios de restricción específicos que faciliten el ligamiento de las secuencias de control con la región codificante del polinucleótido que codifica una variante.
[0025] Expresión: el término "expresión" incluye cualquier paso implicado en la producción del polipéptido incluyendo, pero de forma no limitativa, la transcripción, la modificación postranscripcional, la traducción, la modificación postraduccional y la secreción.
[0026] Vector de expresión: el término "vector de expresión" se refiere a una molécula de ADN lineal o circular que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido y está unido operativamente a nucleótidos adicionales que proveen a su expresión.
[0027] Fragmento: el término "fragmento" se refiere a un polipéptido con uno o más (por ejemplo, varios) aminoácidos eliminados del extremo amino y/o carboxilo terminal de un polipéptido maduro; donde el fragmento tiene actividad de proteasa. En un aspecto, un fragmento contiene al menos 330 residuos aminoacídicos (por ejemplo, aminoácidos 20 a 349 de la SEQ ID N.º: 2 o la SEQ ID N.º: 5); en otro aspecto, un fragmento contiene al menos 345 residuos aminoacídicos (por ejemplo, los aminoácidos 10 a 354 de la SEQ ID N.º: 2 o SEQ ID N.º: 5); en un aspecto adicional, un fragmento contiene al menos 355 residuos aminoacídicos (por ejemplo, los aminoácidos 5 a 359 de la SEQ ID N.º: 2 o la SEQ ID N.º: 5). En un aspecto, un fragmento contiene al menos 330 residuos aminoacídicos (por ejemplo, los aminoácidos 20 a 349 de la SEQ ID N.º: 16 o la SEQ ID N.º: 20); en otro aspecto, un fragmento contiene al menos 345 residuos aminoacídicos (por ejemplo, los aminoácidos 10 a 354 de la SEQ ID N.º: 16 o la SEQ ID N.º: 20); en un aspecto adicional, un fragmento contiene al menos 355 residuos aminoacídicos (por ejemplo, los aminoácidos 5 a 359 de la SEQ ID N.º: 16 o la SEQ ID N.º: 20). En un aspecto, un fragmento contiene al menos 330 residuos aminoacídicos (por ejemplo, los aminoácidos 20 a 349 de la SEQ ID N.º: 21 o la SEQ ID N.º: 24); en otro aspecto, un fragmento contiene al menos 345 residuos aminoacídicos (por ejemplo, los aminoácidos 10 a 354 de la SEQ ID N.º: 21 o la SEQ ID N.º: 24); en un aspecto adicional, un fragmento contiene al menos 355 residuos aminoacídicos (por ejemplo, los aminoácidos 5 a 359 de la SEQ ID N.º: 21 o la SEQ ID N.º: 24).
[0028] Célula huésped: el término "célula huésped" se refiere a cualquier tipo celular que es susceptible de transformación, transfección, transducción y similar con un constructo de ácido nucleico o vector de expresión que comprende un polinucleótido de la presente invención. El término "célula huésped" abarca cualquier progenie de una célula parental que no es idéntica a la célula parental debido a mutaciones que ocurren durante la replicación.
[0029] Polinucleótido aislado: el término "polinucleótido aislado" se refiere a un polinucleótido que está en una forma o ambiente que no ocurre en la naturaleza, tal como (1) cualquier polinucleótido que no ocurra de forma natural, (2) cualquier polinucleótido que esté al menos parcialmente apartado de uno o más o todos los constituyentes de origen natural con los que está asociado en la naturaleza; (3) cualquier polinucleótido que esté modificado por la mano del hombre con respecto a ese polinucleótido tal como se encuentra en la naturaleza o
(4) cualquier polinucleótido modificado mediante el aumento de la cantidad del polinucleótido con respecto a otros componentes con los que está asociado naturalmente (por ejemplo, producción recombinante en una célula huésped; copias múltiples de un gen codificante de la sustancia; y uso de un promotor más fuerte que el promotor naturalmente asociado al gen codificante de la sustancia). En un aspecto, el polinucleótido aislado es al menos un 1% puro, por ejemplo, al menos un 5% puro, más al menos un 10% puro, al menos un 20% puro, al menos un 40% puro, al menos un 60% puro, al menos un 80% puro, al menos un 90% puro y al menos un 95% puro, como se determina por electrofóresis de agarosa. Los polinucleótidos pueden ser de origen genómico, de ADNc, de ARN, semisintético, sintético o cualquier combinación de los mismos.
[0030] Polipéptido aislado: el término "polipéptido aislado" se refiere a un polipéptido que está en una forma o ambiente que no ocurre en la naturaleza, tal como (1) cualquier polipéptido que no ocurra de forma natural, (2) cualquier polipéptido que esté al menos parcialmente apartado de uno o más o todos los constituyentes de origen natural con los que está asociado en la naturaleza; (3) cualquier polipéptido que esté modificado por la mano del hombre con respecto a ese polipéptido tal como se encuentra en la naturaleza mezclado con otros componentes, tales como otros polipéptidos, metabolitos secundarios, sales y otros o (4) cualquier polipéptido modificado mediante el aumento de la cantidad del polipéptido con respecto a otros componentes con los que está asociado naturalmente. En un aspecto, el polipéptido es al menos un 1% puro, por ejemplo, al menos un 5% puro, al menos un 10% puro, al menos un 20% puro, al menos un 40% puro, al menos un 60% puro, al menos un 80% puro y al menos un 90% puro, tal como se determina por SDS-PAGE.
[0031] Polipéptido maduro: el término "polipéptido maduro" se refiere a un polipéptido en su forma final tras la traducción y cualquier modificación postraduccional, tal como procesado del extremo N-terminal, truncamiento del extremo C-terminal, glicosilación, fosforilación, etc. En un aspecto, el polipéptido maduro está constituido por los aminoácidos 1 a 366 en la numeración de la SEQ ID N.º: 2 basada en la secuenciación que usa la degradación de Edman y el análisis de peso molecular intacto del polipéptido maduro con etiqueta HQ C-terminal. Utilizando el programa de predicción SignalP (Nielsen et al., 1997, Protein Engineering 10: 1-6), se predice que los aminoácidos -198 a -182 en la numeración de la SEQ ID N.º: 2 constituyen el péptido señal.
[0032] En otro aspecto, el polipéptido maduro está constituido por los aminoácidos 1 a 366 en la numeración de la SEQ ID N.º: 17 basada en la secuenciación que usa la degradación de Edman y el análisis de peso molecular intacto del polipéptido maduro. Utilizando el programa de predicción SignalP (Nielsen et al., 1997, Protein Engineering 10: 1-6), se predice que los aminoácidos -199 a -183 en la numeración de la SEQ ID N.º: 17 constituyen el péptido señal.
[0033] En otro aspecto, el polipéptido maduro en la numeración de la SEQ ID N.º: 23 se predice que está constituido por los aminoácidos 1 a 366 y el péptido de señal se predice que está constituido por los aminoácidos -199 a -183 basado en el programa de predicción SignalP (Nielsen et al., 1997, Protein Engineering 10: 1-6). Se conoce en la técnica que una célula huésped puede producir una mezcla de dos o más polipéptidos maduros diferentes (es decir, con un aminoácido C-terminal y/o N-terminal diferente) expresado por el mismo polinucleótido.
[0034] Secuencia codificante del polipéptido maduro: el término "secuencia codificante del polipéptido maduro" se refiere a un polinucleótido que codifica un polipéptido maduro con actividad de proteasa. En un aspecto, la secuencia codificante del polipéptido maduro está constituido por los nucleótidos 605 a 1702 en la numeración de la SEQ ID N.º: 1 basada en la determinación del polipéptido maduro por degradación de Edman y análisis de peso molecular intacto del polipéptido maduro con etiqueta HQ C-terminal. Además se predice que los nucleótidos 11 a 61 en la numeración de la SEQ ID N.º: 1 codifican un péptido señal basado en el programa de predicción SignalP (Nielsen et al., 1997, Protein Engineering 10: 1-6).
[0035] En otro aspecto, la secuencia codificante del polipéptido maduro es la secuencia unida de los nucleótidos 707 a 853, los nucleótidos 912 a 1022, los nucleótidos 1077 a 1276, los nucleótidos 1332 a 1469, los nucleótidos 1531 a 1978 y los nucleótidos 2031 a 2084 de la SEQ ID N.º: 15 o la secuencia de ADNc de los mismos basada
en la determinación del polipéptido maduro por degradación de Edman y análisis de peso molecular intacto del polipéptido maduro. Se predice que los nucleótidos 1 a 51 en la numeración de la SEQ ID N.º: 15 codifican un péptido señal basado en el programa de predicción SignalP (Nielsen et al., 1997, Protein Engineering 10: 1-6). En otro aspecto, la secuencia codificante del polipéptido maduro está constituido por los nucleótidos 598 a 1695 de la SEQ ID N.º: 17 o la secuencia de ADNc de la misma basada en la determinación del polipéptido maduro por degradación de Edman y análisis de peso molecular intacto del polipéptido maduro. Se predice que los nucleótidos 1 a 51 en la numeración de la SEQ ID N.º: 22 codifican un péptido señal basado en el programa de predicción SignalP (Nielsen et al., 1997, Protein Engineering 10: 1-6).
[0036] En otro aspecto, se predice que la secuencia codificante del polipéptido maduro constituye la secuencia unida de los nucleótidos 706 a 852, los nucleótidos 914 a 1024, los nucleótidos 1080 a 1279, los nucleótidos 1333 a 1470, los nucleótidos 1532 a 1979 y los nucleótidos 2032 a 2085 de la SEQ ID N.º: 20 o la secuencia de ADNc de los mismos basada en el programa SignalP (Nielsen et al., 1997, supra) que predice que los nucleótidos 1 a 51 de la SEQ ID N.º: 20 codifican un péptido señal. En otro aspecto, se predice que la secuencia codificante del polipéptido maduro está constituida por los nucleótidos 598 a 1695 de la SEQ ID N.º: 22 o la secuencia de ADNc de la misma basada en el programa SignalP (Nielsen et al., 1997, supra) que predice que los nucleótidos 1 a 51 de la SEQ ID N.º: 22 codifican un péptido señal.
[0037] Constructo de ácido nucleico: el término "constructo de ácido nucleico" se refiere a una molécula de ácido nucleico, ya sea mono-o bicatenario, que se aísla de un gen de origen natural o se modifica para contener segmentos de ácidos nucleicos de manera que de otro modo no existiría en la naturaleza o que es sintético. El término constructo de ácido nucleico es sinónimo del término "casete de expresión" cuando el constructo de ácido nucleico contiene las secuencias de control requeridas para la expresión de una secuencia codificante de la presente invención.
[0038] Unido operativamente: el término "unido operativamente" se refiere a una configuración en la que una secuencia de control se coloca en una posición apropiada con relación a la secuencia codificante de un polinucleótido tal que la secuencia de control dirige la expresión de la secuencia codificante.
[0039] Actividad de proteasa: el término "actividad de proteasa" se refiere a actividad proteolítica (EC 3.4). Hay diferentes tipos de actividad de proteasa tales como proteasas de tipo tripsina que escinde el lado carboxiterminal de los residuos de Arg y Lys y proteasas de tipo quimotripsina escinden el lado carboxiterminal de residuos aminoacídicos hidrofóbicos. Las proteasas de la invención son endopeptidasas serinicas (EC 3.4.21) con un pH óptimo ácido (pH óptimo < pH 7).
[0040] La actividad de proteasa se puede medir utilizando cualquier ensayo, en el que se emplea un sustrato, que incluye enlaces peptídicos relevantes para la especificidad de la proteasa en cuestión. El ensayo de pH y ensayo de temperatura se adaptan igualmente a la proteasa en cuestión. Ejemplos de valores de pH de ensayo son pH 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12. Ejemplos de temperaturas de ensayo son 15, 20, 25, 30, 35, 37, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 80, 90 o 95°C. Ejemplos de sustratos de proteasa generales son caseína, albúmina de suero bovino y hemoglobina. En el método clásico de Anson y Mirsky, se utiliza hemoglobina desnaturalizada como sustrato y después de la incubación de ensayo con la proteasa en cuestión, la cantidad de hemoglobina soluble en ácido tricloroacético se determina como una medición de la actividad de proteasa (Anson, M.L. y Mirsky, A.E., 1932, J. Gen. Physiol. 16: 59 y Anson, M.L., 1938, J. Gen. Physiol. 22: 79).
[0041] Para el propósito de la presente invención, la actividad de proteasa se determinó utilizando ensayos que se describen en "Materiales y métodos", tales como el ensayo cinético Suc-AAPF-pNA, ensayo Protazyme AK, ensayo cinético Suc-AAPX-pNA y o-ftaldialdehído (OPA). En el ensayo Protazyme AK, el sustrato insoluble Protazyme AK (caseína entrecruzada con azurina) libera un color azul cuando se incuba con la proteasa y el color se determina como una medición de la actividad de proteasa. En el ensayo Suc-AAPF-pNA, el sustrato incoloro Suc-AAPF-pNA libera paranitroanilina amarilla cuando se incuba con la proteasa y el color amarillo se determina como una medición de la actividad de proteasa.
[0042] Los polipéptidos de la presente invención tienen al menos un 20%, por ejemplo, al menos un 40%, al menos un 50%, al menos un 60%, al menos un 70%, al menos un 80%, al menos un 90%, al menos un 95%, y al menos el 100% de la actividad de proteasa del polipéptido de SEQ ID N.º: 6, SEQ ID N.º: 19 y/o SEQ D N.º: 24.
[0043] Identidad de secuencia: la relación entre dos secuencias de aminoácidos o entre dos secuencias de nucleótidos se describe con el parámetro "identidad de secuencia".
[0044] Para los fines de la presente invención, el grado de identidad de secuencia entre dos secuencias de aminoácidos se determina utilizando el algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman y Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453) tal como se implementa en el programa Needle del paquete EMBOSS (EMBOSS: The
European Molecular Biology Open Software Suite,Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277), preferiblemente la versión 3.0.0 o posterior. Se utilizó la versión 6.1.0. Los parámetros opcionales usados son una penalización por apertura de espacio de 10, una penalización por extensión de espacio de 0,5 y la matriz de sustitución EBLOSUM62 (versión de BLOSUM62 de EMBOSS). El resultado de Needle etiquetado como "identidad más larga" (obtenido utilizando la opción -nobrief) se usa como el porcentaje de identidad y se calcula de la siguiente manera:
(Residuos idénticos x 100)/(Longitud del alineamiento – Número total de espacios en el alineamiento)
[0045] Para los fines de la presente invención, el grado de identidad de secuencia entre dos secuencias desoxirribonucleótidas se determina utilizando el algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman y Wunsch, 1970, supra) tal como se implementa en el programa Needle del paquete EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Riceet al.,2000,supra), preferiblemente la versión 3.0.0 o posterior. Se utilizó la versión 6.1.0. Los parámetros opcionales usados son una penalización por apertura de espacio de 10, una penalización por extensión de espacio de 0,5 y la matriz de sustitución EDNAFULL (versión de NCBI NUC4.4 de EMBOSS). El resultado de Needle etiquetado como "identidad más larga" (obtenido utilizando la opción -nobrief) se usa como el porcentaje de identidad y se calcula de la siguiente manera:
(Desoxirribonucleótidos idénticos x 100)/(Longitud del alineamiento – Número total de espacios en el alineamiento)
[0046] Condiciones de astringencia: las diferentes condiciones de astringencia se definen como sigue.
[0047] El término "condiciones de astringencia muy baja" se refiere, para sondas de al menos 100 nucleótidos de longitud, a prehibridación e hibridación a 42°C en SSPE 5X, SDS al 0,3%, 200 microgramos/ml de ADN de esperma de salmón cortado y desnaturalizado y formamida al 25%, siguiendo procedimientos estándares de transferencia de Southern durante 12 a 24 horas. El material portador se lava finalmente tres veces, cada vez durante 15 minutos, utilizando SSC 2X, SDS al 0,2% a 45°C.
[0048] El término "condiciones de astringencia baja" se refiere, para sondas de al menos 100 nucleótidos de longitud, a prehibridación e hibridación a 42°C en SSPE 5X, SDS al 0,3%, 200 microgramos/ml de ADN de esperma de salmón cortado y desnaturalizado y formamida al 25%, siguiendo procedimientos estándares de transferencia de Southern durante 12 a 24 horas. El material portador se lava finalmente tres veces, cada vez durante 15 minutos, utilizando SSC 2X, SDS al 0,2% a 50°C.
[0049] El término "condiciones de astringencia media" se refiere, para sondas de al menos 100 nucleótidos de longitud, a prehibridación e hibridación a 42°C en SSPE 5X, SDS al 0,3%, 200 microgramos/ml de ADN de esperma de salmón cortado y desnaturalizado y formamida al 35%, siguiendo procedimientos estándares de transferencia de Southern durante 12 a 24 horas. El material portador se lava finalmente tres veces, cada vez durante 15 minutos, utilizando SSC 2X, SDS al 0,2% a 55°C.
[0050] El término "condiciones de astringencia media-alta" se refiere, para sondas de al menos 100 nucleótidos de longitud, a prehibridación e hibridación a 42°C en SSPE 5X, SDS al 0,3%, 200 microgramos/ml de ADN de esperma de salmón cortado y desnaturalizado y formamida al 35%, siguiendo procedimientos estándares de transferencia de Southern durante 12 a 24 horas. El material portador se lava finalmente tres veces, cada vez durante 15 minutos, utilizando SSC 2X, SDS al 0,2% a 60°C.
[0051] El término "condiciones de astringencia alta" se refiere, para sondas de al menos 100 nucleótidos de longitud, a prehibridación e hibridación a 42°C en SSPE 5X, SDS al 0,3%, 200 microgramos/ml de ADN de esperma de salmón cortado y desnaturalizado y formamida al 50%, siguiendo procedimientos estándares de transferencia de Southern durante 12 a 24 horas. El material portador se lava finalmente tres veces, cada vez durante 15 minutos, utilizando SSC 2X, SDS al 0,2% a 65°C.
[0052] El término "condiciones de astringencia muy alta" se refiere, para sondas de al menos 100 nucleótidos de longitud, a prehibridación e hibridación a 42°C en SSPE 5X, SDS al 0,3%, 200 microgramos/ml de ADN de esperma de salmón cortado y desnaturalizado y formamida al 50%, siguiendo procedimientos estándares de transferencia de Southern durante 12 a 24 horas. El material portador se lava finalmente tres veces, cada vez durante 15 minutos, utilizando SSC 2X, SDS al 0,2% a 70°C.
[0053] Subsecuencia: el término "subsecuencia" se reifiere a un polinucleótido con uno o más (por ejemplo, varios) nucleótidos eliminados del extremo 5' y/o 3' de una secuencia codificante del polipéptido maduro; donde la subsecuencia codifica un fragmento que tiene actividad de proteasa. En un aspecto, una subsecuencia
contiene al menos 990 nucleótidos (por ejemplo, los nucleótidos 662 a 1651 de la SEQ ID N.º: 1), por ejemplo, y al menos 1035 nucleótidos (por ejemplo, los nucleótidos 632 a 1666 de la SEQ ID N.º: 1); por ejemplo, y al menos 1065 nucleótidos (por ejemplo, los nucleótidos 617 a 1681 de la SEQ ID N.º: 1).
[0054] Polinucleótido sustancialmente puro: el término "polinucleótido sustancialmente puro" se refiere a una preparación de polinucleótido libre de otros nucleótidos extraños o no deseados y en una forma adecuada para el uso en sistemas de producción de polipéptidos genéticamente modificados. Así, un polinucleótido sustancialmente puro contiene como máximo un 10%, como máximo un 8%, como máximo un 6%, como máximo un 5%, como máximo un 4%, como máximo un 3%, como máximo un 2%, como máximo un 1% y como máximo un 0,5% en peso de otro material polinucleotídico con el cual se asocia originalmente o por recombinación. Un polinucleótido sustancialmente puro puede incluir, no obstante, regiones 5'-y 3'-no traducidas de origen natural, tales como promotores y terminadores. Preferiblemente, el polinucleótido es al menos un 90% puro, por ejemplo, al menos un 92% puro, al menos un 94% puro, al menos un 95% puro, al menos un 96% puro, al menos un 97% puro, al menos un 98% puro, al menos un 99% puro y al menos un 99,5% puro o 100% puro en peso. Los polinucleótidos de la presente invención están preferiblemente en una forma sustancialmente pura.
[0055] Polipéptido sustancialmente puro: el término "polipéptido sustancialmente puro" se refiere a una preparación que contiene como máximo un 10%, como máximo un 8%, como máximo un 6%, como máximo un 5%, como máximo un 4%, como máximo un 3%, como máximo un 2%, como máximo un 1% y como máximo un 0,5% en peso de otro material polipeptídico con el cual se asocia originalmente o por recombinación. Preferiblemente, el polipéptido es al menos un 92% puro, por ejemplo, al menos un 94% puro, al menos un 95% puro, al menos un 96% puro, al menos un 97% puro, al menos un 98% puro, al menos un 99%, al menos un 99,5% puro, y 100% puro en peso del material polipeptídico total presente en la preparación. Los polipéptidos de la presente invención están preferiblemente en una forma sustancialmente pura. Esto se puede conseguir, por ejemplo, preparando el polipéptido por métodos recombinantes bien conocidos o por métodos tradicionales de purificación.
[0056] Variante: el término "variante" se refiere a un polipéptido con actividad de proteasa que incluye una modificación, es decir, una sustitución, inserción y/o deleción de uno o más (varios) residuos aminoacídicos en una o más (varias) posiciones. Una sustitución se refiere a una sustitución de un aminoácido que ocupa una posición por un aminoácido diferente; una deleción se refiere a la eliminación de un aminoácido que ocupa una posición; y una inserción se refiere a la adición de 1-3 aminoácidos adyacentes a un aminoácido que ocupa una posición. Las variantes de la presente invención tienen al menos un 20%, por ejemplo, al menos un 40%, al menos un 50%, al menos un 60%, al menos un 70%, al menos un 80%, al menos un 90%, al menos un 95% o al menos el 100% de la actividad de proteasa del polipéptido de SEQ ID N.º: 5, SEQ ID N.º: 6, o el polipéptido maduro de SEQ ID N.º: 2 o SEQ ID N.º: 4.
Descripción detallada de la invención
Polipéptidos con actividad de proteasa
[0057] Los polipéptidos con actividad de proteasa, o proteasas, también se designan a veces como peptidasas, proteinasas, péptido hidrolasas o enzimas proteolíticas. Las proteasas pueden ser del tipo exo que hidrolizan péptidos empezando por cualquier extremo de las mismas, o del tipo endo que actúan internamente en las cadenas polipeptídicas (endopeptidasas). Las endopeptidasas muestran actividad en sustratos peptídicos bloqueados en los extremos N-y C-terminales que son relevantes para la especificidad de la proteasa en cuestión.
[0058] El término "proteasa" se define en la presente como una enzima que hidroliza enlaces peptídicos. Esta definición de proteasa también se aplica a la parte relativa a la proteasa de los términos "proteasa parental" y "variante de proteasa", tal como se usan en la presente. El término "proteasa" incluye cualquier enzima perteneciente al grupo enzimático EC 3.4 (incluyendo cada una de las dieciocho subclases del mismo). El número EC se refiere a la nomeclatura enzimática de 1992 de NC-IUBBM, Academic Press, San Diego, California, incluyendo los suplementos 1-5 publicados en 1994, Eur. J. Biochem. 223: 1-5, 1995, Eur. J. Biochem.
232: 1-6, 1996, Eur. J. Biochem. 237: 1-5, 1997, Eur. J. Biochem. 250: 1-6; y 1999, Eur. J. Biochem. 264: 610650 respectivamente. La nomenclatura se suplementa y se actualiza regularmente; véase, por ejemplo, la red informática mundial (WWW) en http://www.chem.qmw.ac.uk/iubmb/enzyme/index.html.
[0059] Las proteasas de la invención y para el uso según la invención son seleccionadas del grupo constituido por:
(a)
proteasas del grupo enzimático EC 3.4.21.; y/o
(b)
proteasas del grupo enzimático EC 3.4.14.; y/o
(c) serinproteasas de la familia S53 de las peptidasas que comprende dos tipos diferentes de peptidasas: tripeptidil aminopeptidasas (tipo exo) y endopeptidasas; como se describe en 1993, Biochem. J. 290:205-218 y en la base de datos de proteasas MEROPS, publicación, 9.4 (31 de enero de 2011) (www.merops.ac.uk). La base de datos se describe en Rawlings, N.D., Barrett, A.J. y Bateman, A., 2010, "MEROPS: the peptidase database", Nucl. Acids Res. 38: D227-D233.
[0060] Para determinar si una proteasa dada es una serinproteasa y una proteasa de la familia S53, se hace referencia al manual anterior y los principios indicados en el mismo. Tal determinación puede llevarse a cabo para todos los tipos de proteasas, ya sean proteasas de origen natural o de tipo salvaje; o proteasas genéticamente modificadas o sintéticas.
[0061] La familia de peptidasas S53 contiene endopeptidasas y tripeptidil peptidasas activas en ácido. Los residuos de la tríada catalítica son Glu, Asp, Ser, y hay un residuo ácido adicional, Asp, en el agujero del oxoanión. El orden de los residuos es Glu, Asp, Asp, Ser. El residuo de Ser es el nucleófilo equivalente a la Ser en la tríada Asp, His, Ser de la subtilisina, y el Glu de la tríada es un sustituto de la base general, His, en la subtilisina.
[0062] La mutación de cualquiera de los aminoácidos de la tríada catalítica o el agujero de oxoanión dará lugar a un cambio o una pérdida de actividad enzimática. Los aminoácidos de la tríada catalítica y el agujero de oxoanión de la Proteasa S53 3 de Meripilus giganteus (SEQ ID N.º: 5) son probablemente las posiciones Glu-85, Asp-89, Asp-175 y Ser-283. Los aminoácidos de la tríada catalítica y el agujero de oxoanión de la proteasa S53 1 de Trametes versicolor (SEQ ID N.º: 19) son probablemente las posiciones Glu-85, Asp-89, Asp-175 y Ser-283. Los aminoácidos de la tríada catalítica y el agujero de oxoanión de la proteasa S53 2 de Trametes versicolor (SEQ ID N.º: 24) son probablemente las posiciones Glu-85, Asp-89, Asp-175 y Ser-283.
[0063] Las peptidasas de la familia S53 tienden ser más activas a pH ácido (a diferencia de las subtilisinas homólogas), y esto se puede atribuir a la importancia funcional de los residuos carboxílicos, sobre todo el Asp del agujero de oxoanión. Las secuencias de aminoácidos no son muy similares a aquellas de la familia S8 (es decir, las serín endopeptidasas subtilisinas y homólogas), y esto, considerado junto con los residuos de sitio activo bastante diferentes y el menor pH resultante para la actividad máxima, proporciona una diferencia sustancial a esa familia. El plegamiento de proteínas de la unidad peptidasa para miembros de esta familia se parece al de la subtilisina, que tiene el tipo de clan SB.
[0064] Una nueva proteasa S53 de Meripilus giganteus con actividad elevada a pH bajo (3-4) en la harina de maíz y soja se identificó y se clonó en relación a la presente invención. Para determinar si una proteasa dada es una serinproteasa y una proteasa de la familia S53, se hace referencia al manual anterior y los principios indicados en en el mismo. Tal determinación puede llevarse a cabo para todos los tipos de proteasas, ya sean proteasas de origen natural o de tipo salvaje; o proteasas genéticamente modificadas o sintéticas.
[0065] La presente invención proporciona polipéptidos que tienen actividad de proteasa y polinucleótidos que codifican los polipéptidos. Las proteasas de la invención son serinproteasas de la familia de peptidasas S53. Las proteasas de la invención muestran propiedades de pH, especialmente propiedades de estabilidad de pH, que las hacen de interés sustancial como candidatos para el uso en piensos para animales y otras aplicaciones.
[0066] Las proteasas de la invención son proteasas ácidas con una preferencia por residuos aminoacídicos hidrofóbicos tales como Leu, Tyr, Phe y Met en la posición P1. Las proteasas tienen actividad elevada en SucAla-Ala-Pro-Leu-pNA y Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA con un amplio intervalo de pH de 2-5 y retienen más del 95% de la actividad tras ser sometidas durante 2 horas a pH tan bajos como 3. La presente invención se refiere a un polipéptido aislado que tiene actividad de proteasa, seleccionado del grupo constituido por:
(a)
un polipéptido que tiene al menos un 84% de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID N.º: 5;
(b)
un polipéptido codificado por un polinucleótido que tiene al menos un 84% de identidad de secuencia con la secuencia codificante del polipéptido maduro de SEQ ID N.º: 1;
(c)
una variante del polipéptido de SEQ ID N.º: 5 que comprende una sustitución, deleción y/o inserción en una o más posiciones, donde el número total de sustituciones, deleciones y/o inserciones aminoacídicas no es superior a 20; y d) un fragmento de un polipéptido de (a), (b) o (c) con actividad de proteasa,
en el que el polipéptido tiene una actividad de proteasa mejorada a un pH de entre 3 y 4, a 25°C en comparación con la proteasa NRRL. 18262
[0067] Una forma de realización de la invención es un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido que tiene al menos un 85% de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID N.º: 5, SEQ ID N.º: 6, o el polipéptido maduro de SEQ ID N.º: 2 o SEQ ID N.º: 4.
[0068] Una forma de realización de la invención es un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido que tiene al menos un 86% de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID N.º: 5, SEQ ID N.º: 6, o el polipéptido maduro de SEQ ID N.º: 2 o SEQ ID N.º: 4.
[0069] Una forma de realización de la invención es un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido que tiene al menos un 87% de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID N.º: 5, SEQ ID N.º: 6, o el polipéptido maduro de SEQ ID N.º: 2 o SEQ ID N.º: 4.
[0070] Una forma de realización de la invención es un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido que tiene al menos un 88% de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID N.º: 5, SEQ ID N.º: 6, o el polipéptido maduro de SEQ ID N.º: 2 o SEQ ID N.º: 4.
[0071] Una forma de realización de la invención es un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido que tiene al menos un 89% de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID N.º: 5, SEQ ID N.º: 6, o el polipéptido maduro de SEQ ID N.º: 2 o SEQ ID N.º: 4.
[0072] Una forma de realización de la invención es un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido que tiene al menos un 90% de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID N.º: 5, SEQ ID N.º: 6, o el polipéptido maduro de SEQ ID N.º: 2 o SEQ ID N.º: 4.
[0073] Una forma de realización de la invención es un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido que tiene al menos un 91% de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID N.º: 5, SEQ ID N.º: 6, o el polipéptido maduro de SEQ ID N.º: 2 o SEQ ID N.º: 4.
[0074] Una forma de realización de la invención es un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido que tiene al menos un 92% de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID N.º: 5, SEQ ID N.º: 6, o el polipéptido maduro de SEQ ID N.º: 2 o SEQ ID N.º: 4.
[0075] Una forma de realización de la invención es un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido que tiene al menos un 93% de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID N.º: 5, SEQ ID N.º: 6, o el polipéptido maduro de SEQ ID N.º: 2 o SEQ ID N.º: 4.
[0076] Una forma de realización de la invención es un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido que tiene al menos un 94% de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID N.º: 5, SEQ ID N.º: 6, o el polipéptido maduro de SEQ ID N.º: 2 o SEQ ID N.º: 4.
[0077] Una forma de realización de la invención es un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido que tiene al menos un 95% de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID N.º: 5, SEQ ID N.º: 6, o el polipéptido maduro de SEQ ID N.º: 2 o SEQ ID N.º: 4.
[0078] Una forma de realización de la invención es un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido que tiene al menos un 96% de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID N.º: 5, SEQ ID N.º: 6, o el polipéptido maduro de SEQ ID N.º: 2 o SEQ ID N.º: 4.
[0079] Una forma de realización de la invención es un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido que tiene al menos un 97% de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID N.º: 5, SEQ ID N.º: 6, o el polipéptido maduro de SEQ ID N.º: 2 o SEQ ID N.º: 4.
[0080] Una forma de realización de la invención es un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido que tiene al menos un 98% de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID N.º: 5, SEQ ID N.º: 6, o el polipéptido maduro de SEQ ID N.º: 2 o SEQ ID N.º: 4.
[0081] Una forma de realización de la invención es un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido que tiene al menos un 99% de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID N.º: 5, SEQ ID N.º: 6, o el polipéptido maduro de SEQ ID N.º: 2 o SEQ ID N.º: 4.
[0082] Una forma de realización de la invención es un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido que tiene el 100% de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID N.º: 5, SEQ ID N.º: 6, o el polipéptido maduro de SEQ ID N.º: 2 o SEQ ID N.º: 4.
[0083] La presente invención se refiere a polipéptidos aislados que tienen una identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID N.º: 5, SEQ ID N.º: 6, o el polipéptido maduro de SEQ ID N.º: 2 o SEQ ID N.º: 4 de al menos un 84%, por ejemplo, al menos un 85%, al menos un 86%, al menos un 87%, al menos un 88%, al menos un 89%, al menos un 90%, al menos un 91%, al menos un 92%, al menos un 93%, al menos un 94%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, al menos un 99% o el 100%, que tiene actividad de proteasa. En un aspecto, los polipéptidos diferen en no más de treinta aminoácidos, por ejemplo, en veinticinco aminoácidos, en veinte aminoácidos, en quince aminoácidos, en doce aminoácidos, en diez aminoácidos, en nueve aminoácidos, en ocho aminoácidos, en siete aminoácidos, en seis aminoácidos, en cinco aminoácidos, en cuatro aminoácidos, en tres aminoácidos, en dos aminoácidos y en un aminoácido con el polipéptido de SEQ ID N.º: 5, SEQ ID N.º: 6, o el polipéptido maduro de SEQ ID N.º: 2 o SEQ ID N.º: 4.
[0084] Una forma de realización de la invención es un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido para el uso en piensos para animales que tiene al menos un 70% de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID N.º: 5, SEQ ID N.º: 6, o el polipéptido maduro de SEQ ID N.º: 2 o SEQ ID N.º: 4.
[0085] Una forma de realización de la invención es un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido para el uso en piensos para animales que tiene al menos un 75% de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID N.º: 5, SEQ ID N.º: 6, o el polipéptido maduro de SEQ ID N.º: 2 o SEQ ID N.º: 4.
[0086] Una forma de realización de la invención es un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido para el uso en piensos para animales que tiene al menos un 80% de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID N.º: 5, SEQ ID N.º: 6, o el polipéptido maduro de SEQ ID N.º: 2 o SEQ ID N.º: 4.
[0087] Una forma de realización de la invención es un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido para el uso en piensos para animales que tiene al menos un 85% de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID N.º: 5, SEQ ID N.º: 6, o el polipéptido maduro de SEQ ID N.º: 2 o SEQ ID N.º: 4.
[0088] Una forma de realización de la invención es un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido para el uso en piensos para animales que tiene al menos un 87% de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID N.º: 5, SEQ ID N.º: 6, o el polipéptido maduro de SEQ ID N.º: 2 o SEQ ID N.º: 4.
[0089] Una forma de realización de la invención es un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido para el uso en piensos para animales que tiene al menos un 90% de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID N.º: 5, SEQ ID N.º: 6, o el polipéptido maduro de SEQ ID N.º: 2 o SEQ ID N.º: 4.
[0090] Una forma de realización de la invención es un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido para el uso en piensos para animales que tiene al menos un 91% de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID N.º: 5, SEQ ID N.º: 6, o el polipéptido maduro de SEQ ID N.º: 2 o SEQ ID N.º: 4.
[0091] Una forma de realización de la invención es un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido para el uso en piensos para animales que tiene al menos un 92% de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID N.º: 5, SEQ ID N.º: 6, o el polipéptido maduro de SEQ ID N.º: 2 o SEQ ID N.º: 4.
[0092] Una forma de realización de la invención es un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido para el uso en piensos para animales que tiene al menos un 93% de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID N.º: 5, SEQ ID N.º: 6, o el polipéptido maduro de SEQ ID N.º: 2 o SEQ ID N.º: 4.
[0093] Una forma de realización de la invención es un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido para el uso en piensos para animales que tiene al menos un 94% de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID N.º: 5, SEQ ID N.º: 6, o el polipéptido maduro de SEQ ID N.º: 2 o SEQ ID N.º: 4.
[0094] Una forma de realización de la invención es un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido para el uso en piensos para animales que tiene al menos un 95% de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID N.º: 5, SEQ ID N.º: 6, o el polipéptido maduro de SEQ ID N.º: 2 o SEQ ID N.º: 4.
[0095] Una forma de realización de la invención es un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido para el uso en piensos para animales que tiene al menos un 96% de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID N.º: 5, SEQ ID N.º: 6, o el polipéptido maduro de SEQ ID N.º: 2 o SEQ ID N.º: 4.
[0096] Una forma de realización de la invención es un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido para el uso en piensos para animales que tiene al menos un 97% de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID N.º: 5, SEQ ID N.º: 6, o el polipéptido maduro de SEQ ID N.º: 2 o SEQ ID N.º: 4.
[0097] Una forma de realización de la invención es un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido para el uso en piensos para animales que tiene al menos un 98% de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID N.º: 5, SEQ ID N.º: 6, o el polipéptido maduro de SEQ ID N.º: 2 o SEQ ID N.º: 4.
[0098] Una forma de realización de la invención es un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido para el uso en piensos para animales que tiene al menos un 99% de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID N.º: 5, SEQ ID N.º: 6, o el polipéptido maduro de SEQ ID N.º: 2 o SEQ ID N.º: 4.
[0099] Una forma de realización de la invención es un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido para el uso en piensos para animales que tiene el 100% de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID N.º: 5, SEQ ID N.º: 6, o el polipéptido maduro de SEQ ID N.º: 2 o SEQ ID N.º: 4.
[0100] La presente invención se refiere al uso en piensos para animales de polipéptidos aislados que tienen una identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID N.º: 5, SEQ ID N.º: 6, o el polipéptido maduro de SEQ ID N.º: 2 o SEQ ID N.º: 4 de al menos un 60%, por ejemplo, al menos un 70%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 87%, al menos un 90%, al menos un 91%, al menos un 92%, al menos un 93%, al menos un 94%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, al menos un 99% o el 100%, que tiene actividad de proteasa. En un aspecto, los polipéptidos diferen en no más de veinte aminoácidos, por ejemplo, en quince aminoácidos, en diez aminoácidos, en ocho aminoácidos, en siete aminoácidos, en seis aminoácidos, en cinco aminoácidos, en cuatro aminoácidos, en tres aminoácidos, en dos aminoácidos y en un aminoácido con el polipéptido de SEQ ID N.º: 5, SEQ ID N.º: 6, o el polipéptido maduro de SEQ ID N.º: 2 o SEQ ID N.º: 4.
[0101] En una forma de realización particular, la presente invención también se refiere a un método para preparar un pienso para animales o aditivo para piensos, que comprende la preparación de una composición de pienso para animales o de aditivo para piensos que incluye un pienso para animales y un polipéptido aislado que tiene actividad de proteasa, seleccionado del grupo constituido por:
(a)
un polipéptido que tiene al menos un 84% de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID N.º: 5;
(b)
un polipéptido codificado por un polinucleótido que tiene al menos un 84% de identidad de secuencia con la secuencia codificante del polipéptido maduro de SEQ ID N.º: 1;
(c)
una variante del polipéptido de SEQ ID N.º: 5 que comprende una sustitución, deleción y/o inserción en una o más posiciones, donde el número total de sustituciones, deleciones y/o inserciones aminoacídicas no es superior a 20; y
(d)
un fragmento de un polipéptido de (a), (b) o (c) que tiene actividad de proteasa,
en el que el polipéptido tiene una actividad de proteasa mejorada a un pH de entre 3 y 4, a 25°C en comparación con la proteasa NRRL 18262. La presente invención también se refiere a una composición de pienso para animales o de aditivo para piensos que comprende un pienso para animales y un polipéptido aislado que tiene actividad de proteasa, seleccionado del grupo constituido por:
(a)
un polipéptido que tiene al menos un 84% de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID N.º: 5;
(b)
un polipéptido codificado por un polinucleótido que tiene al menos un 84% de identidad de secuencia con la secuencia codificante del polipéptido maduro de SEQ ID N.º: 1;
(c)
una variante del polipéptido de SEQ ID N.º: 5 que comprende una sustitución, deleción y/o inserción en una o más posiciones, donde el número total de sustituciones, deleciones y/o inserciones aminoacídicas no es superior a 20; y
(d)
un fragmento de un polipéptido de (a), (b) o (c) que tiene actividad de proteasa,
donde el polipéptido tiene una actividad de proteasa mejorada a un pH de entre 3 y 4, a 25°C en comparación con la proteasa NRRL 18262.
[0102] En un aspecto, los polipéptidos diferen en no más de veinte aminoácidos, por ejemplo, en quince aminoácidos, en diez aminoácidos, en ocho aminoácidos, en siete aminoácidos, en seis aminoácidos, en cinco
aminoácidos, en cuatro aminoácidos, en tres aminoácidos, en dos aminoácidos y en un aminoácido con el polipéptido de SEQ ID N.º: 5, SEQ ID N.º: 6, o el polipéptido maduro de SEQ ID N.º: 2 o SEQ ID N.º: 4.
[0103] Las composiciones de piensos para animales pueden, en formas de realización particulares, estar en forma de un granulado, un triturado o una composición líquida, como se describe más adelante en la presente.
[0104] Un polipéptido de la presente invención comprende o consiste preferiblemente en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.º: 5, SEQ ID N.º: 6, o el polipéptido maduro de SEQ ID N.º: 2 o SEQ ID N.º: 4, una variante alélica de la misma; o es un fragmento al que le faltan, por ejemplo, 30, 25, 20, 15, 10 o 5 aminoácidos del extremo N-y/o C-terminal y que tiene actividad de proteasa. En otro aspecto, el polipéptido comprende o consiste en el polipéptido de SEQ ID N.º: 5. En otro aspecto preferido, el polipéptido comprende o consiste en los aminoácidos 1 a 366 de la SEQ ID N.º: 2.
[0105] La presente invención también se refiere a polipéptidos aislados que tienen actividad de proteasa que están codificados por polinucleótidos que hibridan bajo condiciones de astringencia baja, condiciones de astringencia media, condiciones de astringencia media-alta, condiciones de astringencia alta o condiciones de astringencia muy alta con (i) la secuencia codificante del polipéptido maduro de SEQ ID N.º: 1, o (ii) la cadena complementaria en toda su longitud de (i) (J. Sambrook, E.F. Fritsch y T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d edition, Cold Spring Harbor, Nueva York).
[0106] El polinucleótido de SEQ ID N.º: 1, así como la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N.º: 5, SEQ ID N.º: 6, SEQ ID N.º: 19, SEQ ID N.º: 24, o el polipéptido maduro de SEQ ID N.º: 2, o SEQ ID N.º: 4, o un fragmento de los mismos, se pueden utilizar para diseñar sondas de ácido nucleico para identificar y clonar ADN que codifica polipéptidos que tienen actividad de proteasa de cepas de diferentes géneros o especies según métodos bien conocidos en la técnica. En particular, tales sondas se pueden usar para la hibridación con el ADN genómico o ADNc del género o especie de interés, siguiendo procedimientos de transferencia de Southern estándares, para identificar y aislar el gen correspondiente en el mismo. Tales sondas pueden ser considerablemente más cortas que la secuencia entera, pero debería ser de al menos 14, por ejemplo, al menos 25, al menos 35, o al menos 70 nucleótidos de longitud. Preferiblemente, la sonda de ácido nucleico es de al menos 100 nucleótidos de longitud, por ejemplo, al menos 200 nucleótidos, al menos 300 nucleótidos, al menos 400 nucleótidos, al menos 500 nucleótidos, al menos 600 nucleótidos, al menos 700 nucleótidos, al menos 800 nucleótidos, o al menos 900 nucleótidos de longitud. Se pueden usar tanto sondas de ADN como de ARN. Las sondas se marcan típicamente para la detección del gen correspondiente (por ejemplo, con 32P, 3H, 35S, biotina o avidina). La presente invención abarca tales sondas.
[0107] Se puede cribar una genoteca de ADN genómico o ADNc preparada a partir de tales otras cepas para seleccionar ADN que hibride con las sondas descritas anteriormente y que codifique un polipéptido con actividad de proteasa. El ADN genómico o de otro tipo de tales otras cepas se puede separar por electroforesis en gel de poliacrilamida o agarosa, u otras técnicas de separación. El ADN de las genotecas o el ADN separado se puede transferir e inmovilizar en nitrocelulosa u otro material portador adecuado. Para identificar un clon o ADN que sea homólogo a la SEQ ID N.º: 1, SEQ ID N.º: 15 o SEQ ID N.º: 20 o una subsecuencia de las mismas, el material portador se usa preferiblemente en una transferencia de Southern.
[0108] Para los fines de la presente invención, la hibridación indica que el polinucleótido hibrida con una sonda de ácido nucleico marcada que corresponde a la secuencia codificante del polipéptido maduro de SEQ ID N.º: 1, SEQ ID N.º: 15 o SEQ ID N.º: 20, su cadena complementaria en toda su longitud o una subsecuencia de la misma bajo condiciones de astringencia muy baja a muy alta. Las moléculas con las que la sonda de ácido nucleico hibrida bajo estas condiciones se pueden detectar utilizando, por ejemplo, película radiográfica o cualquiera de los otros medios de detección conocidos en la técnica.
[0109] En un aspecto, la sonda de ácido nucleico es la secuencia codificante del polipéptido maduro de SEQ ID N.º: 1, SEQ ID N.º: 15 o SEQ ID N.º: 20. En otro aspecto, la sonda de ácido nucleico es un fragmento de la misma. En otro aspecto, la sonda de ácido nucleico es un polinucleótido que codifica el polipéptido de SEQ ID N.º: 2, SEQ ID N.º: 16, SEQ ID N.º: 21 o un fragmento del mismo. En otro aspecto preferido, la sonda de ácido nucleico es la SEQ ID N.º: 1, SEQ ID N.º: 15 o SEQ ID N.º: 20.
[0110] Para sondas largas de al menos 100 nucleótidos de longitud, las condiciones de astringencia alta a muy alta se definen como prehibridación e hibridación a 42°C en SSPE 5X, SDS al 0,3%, 200 microgramos/ml de ADN de esperma de salmón cortado y desnaturalizado y, o formamida al 25% para astringencias muy bajas y bajas, o formamida al 35% para astringencias medias y medias-altas, o formamida al 50% para astringencias altas y muy altas, siguiendo procedimientos de transferencia de Southern estándares durante 12 a 24 horas óptimamente. El material portador se lava finalmente tres veces, cada vez durante 15 minutos, utilizando SSC 2X, SDS al 0,2% a 65°C (astringencia alta) y a 70°C (astringencia muy alta).
[0111] Para sondas cortas de aproximadamente 15 nucleótidos a aproximadamente 70 nucleótidos de longitud, las condiciones de astringencia se definen como prehibridación e hibridación a aproximadamente 5°C hasta aproximadamente 10°C por debajo de la Tm calculada utilizando el cálculo según Bolton y McCarthy (1962, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:1390) en 0,9 M de NaCl, 0,09 M de Tris-HCl pH 7,6, 6 mM EDTA, NP-40 al 0,5%, solución de Denhardt 1X, 1 mM de pirofosfato de sodio, 1 mM de fosfato monobásico de sodio, 0,1 mM de ATP y 0,2 mg de ARN de levadura por ml siguiendo procedimientos de transferencia de Southern estándares durante 12 a 24 horas óptimamente. El material portador se lava finalmente una vez en SCC 6X más SDS al 0,1% durante 15 minutos y dos veces, cada vez durante 15 minutos, utilizando SSC 6X a desde 5°C hasta 10°C por debajo de la Tm calculada.
[0112] La presente invención también se refiere a polipéptidos aislados con actividad de proteasa codificados por polinucleótidos que tienen una identidad de secuencia con la secuencia codificante del polipéptido maduro de SEQ ID N.º: 1 de al menos un 84%, por ejemplo, al menos un 85%, al menos un 86%, al menos un 87%, al menos un 88%, al menos un 89%, al menos un 90%, al menos un 91%, al menos un 92%, al menos un 93%, al menos un 94%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, al menos un 99% o el 100%.
[0113] En otra forma de realización, la presente invención se refiere a variantes que comprenden una sustitución, deleción, y/o inserción en una o más (o varias) posiciones de la SEQ ID N.º: 5, SEQ ID N.º: 6, o el polipéptido maduro de SEQ ID N.º: 2 o SEQ ID N.º: 4, o una secuencia homóloga de las mismas. Los cambios aminoacídicos pueden ser de una naturaleza menor, es decir, sustituciones, inserciones o deleciones aminoacídicas conservadoras que no afectan significativamente al plegamiento y/o la actividad de la proteína; deleciones pequeñas, típicamente de uno a aproximadamente 30 aminoácidos; pequeñas extensiones del extremo amino o carboxilo terminal, tal como un residuo aminoterminal de metionina; un péptido conector pequeño de hasta 20-25 residuos; o una extensión pequeña que facilite la purificación cambiando la carga neta u otra función, tales como una etiqueta de polihistidina o etiqueta HQ, un epítopo antigénico o un dominio de unión.
[0114] Los ejemplos de sustituciones conservadoras se incluyen en el grupo de aminoácidos básicos (arginina, lisina e histidina), aminoácidos ácidos (ácido glutámico y ácido aspártico), aminoácidos polares (glutamina y asparagina), aminoácidos hidrofóbicos (leucina, isoleucina y valina), aminoácidos aromáticos (fenilalanina, triptófano y tirosina) y aminoácidos pequeños (glicina, alanina, serina, treonina y metionina). Las sustituciones aminoacídicas que generalmente no alteran la actividad específica se conocen en la técnica y son descritas, por ejemplo, por H. Neurath y R.L. Hill, 1979, In, The Proteins, Academic Press, Nueva York. Los intercambios que ocurren con más frecuencia que se espera que no alteren sustancialmente la actividad específica son Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu y Asp/Gly.
[0115] Alternativamente, los cambios aminoacídicos son de tal naturaleza que alteran las propiedades fisicoquímicas de los polipéptidos. Por ejemplo, los cambios aminoacídicos pueden mejorar la termoestabilidad del polipéptido, alterar la especificidad por el sustrato, cambiar el pH óptimo, y similares.
[0116] Los aminoácidos esenciales en un polipéptido parental se pueden identificar según procedimientos conocidos en la técnica, tales como mutagénesis dirigida al sitio o mutagénesis de barrido de alanina (Cunningham and Wells, 1989, Science 244: 1081-1085). En esta última técnica, se introducen mutaciones de una única alanina en cada residuo de la molécula y se determina la actividad de proteasa de las moléculas mutantes resultantes para identificar residuos aminoacídicos que son críticos para la actividad de la molécula. Véase también, Hilton et al., 1996, J. Biol. Chem. 271: 4699-4708. El sitio activo de la enzima u otra interacción biológica también puede determinarse mediante análisis físico de la estructura, como se determina por técnicas tales como la resonancia magnética nuclear, cristalografía, difracción de electrones o marcaje por fotoafinidad, junto con la mutación de aminoácidos del posible sitio de contacto. Véase, por ejemplo, de Vos et al., 1992, Science 255: 306-312; Smith et al., 1992, J. Mol. Biol. 224: 899-904; Wlodaver et al., 1992, FEBS Lett. 309: 59
64. La identidad de aminoácidos esenciales también puede inferirse a partir de análisis de identidad con polipéptidos que están relacionados con el polipéptido parental.
[0117] Las sustituciones, deleciones y/o inserciones aminoacídicas únicas o múltiples se pueden realizar y evaluar usando métodos conocidos de mutagénesis, recombinación y/o recombinación aleatoria, seguido de un procedimiento de cribado relevante, tal como los descritos por Reidhaar-Olson y Sauer, 1988, Science 241: 5357; Bowie y Sauer, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2152-2156; WO 95/17413; o WO 95/22625. Otros métodos que se pueden usar incluyen PCR propensa a errores, presentación en fagos (por ejemplo, Lowman et al., 1991, Biochemistry 30: 10832-10837; patente de EE.UU. nº 5,223,409; WO 92/06204), y mutagénesis dirigida a la región (Derbyshire et al., 1986, Gene 46: 145; Ner et al., 1988, DNA 7: 127).
[0118] Los métodos de mutagénesis/recombinación aleatoria pueden combinarse con métodos de cribado automatizados de alto rendimiento para detectar actividad de polipéptidos mutagenizados clonados expresados por células huésped (Ness et al., 1999, Nature Biotechnology 17: 893-896). Las moléculas de ADN mutagenizadas que codifican polipéptidos activos se pueden recuperar de las células huésped y secuenciar rápidamente usando métodos estándares en la técnica. Estos métodos permiten determinar con rapidez la importancia de residuos aminoacídicos individuales de un polipéptido.
[0119] La presente invención también se refiere a variantes de polipéptidos que tienen actividad de proteasa y que tienen al menos un 84%, por ejemplo, al menos un 85%, al menos un 86%, al menos un 87%, al menos un 88%, al menos un 89%, al menos un 90%, al menos un 91%, al menos un 92%, al menos un 93%, al menos un 94%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98% o al menos un 99% de identidad de secuencia con la SEQ ID N.º: 5, SEQ ID N.º: 6, o el polipéptido maduro de SEQ ID N.º: 2 o SEQ ID N.º: 4 que comprende al menos una sustitución, deleción y/o inserción de al menos uno o más (varios) aminoácidos de la SEQ ID N.º: 5, SEQ ID N.º: 6, o el polipéptido maduro de SEQ ID N.º: 2 o SEQ ID N.º: 4 o una secuencia homóloga de las mismas.
[0120] El polipéptido variante de la invención puede, en una forma de realización, tener al menos un 85% de identidad de secuencia con la SEQ ID N.º: 5.
[0121] El polipéptido variante de la invención puede, en una forma de realización, tener al menos un 86% de identidad de secuencia con la SEQ ID N.º: 5.
[0122] El polipéptido variante de la invención puede, en una forma de realización, tener al menos un 87% de identidad de secuencia con la SEQ ID N.º: 5.
[0123] El polipéptido variante de la invención puede, en una forma de realización, tener al menos un 88% de identidad de secuencia con la SEQ ID N.º: 5.
[0124] El polipéptido variante de la invención puede, en una forma de realización, tener al menos un 89% de identidad de secuencia con la SEQ ID N.º: 5.
[0125] El polipéptido variante de la invención puede, en una forma de realización, tener al menos un 90% de identidad de secuencia con la SEQ ID N.º: 5.
[0126] El polipéptido variante de la invención puede, en una forma de realización, tener al menos un 91 % de identidad de secuencia con la SEQ ID N.º: 5.
[0127] El polipéptido variante de la invención puede, en una forma de realización, tener al menos un 92% de identidad de secuencia con la SEQ ID N.º: 5.
[0128] El polipéptido variante de la invención puede, en una forma de realización, tener al menos un 93% de identidad de secuencia con la SEQ ID N.º: 5.
[0129] El polipéptido variante de la invención puede, en una forma de realización, tener al menos un 94% de identidad de secuencia con la SEQ ID N.º: 5.
[0130] El polipéptido variante de la invención puede, en una forma de realización, tener al menos un 95% de identidad de secuencia con la SEQ ID N.º: 5.
[0131] El polipéptido variante de la invención puede, en una forma de realización, tener al menos un 96% de identidad de secuencia con la SEQ ID N.º: 5.
[0132] El polipéptido variante de la invención puede, en una forma de realización, tener al menos un 97% de identidad de secuencia con la SEQ ID N.º: 5.
[0133] El polipéptido variante de la invención puede, en una forma de realización, tener al menos un 98% de identidad de secuencia con la SEQ ID N.º: 5.
[0134] El polipéptido variante de la invención puede, en una forma de realización, tener al menos un 99% de identidad de secuencia con la SEQ ID N.º: 5.
[0135] El número total de sustituciones, deleciones y/o inserciones aminoacídicas del polipéptido maduro de SEQ ID N.º: 5, SEQ ID N.º: 6, o el polipéptido maduro de SEQ ID N.º: 2 o SEQ ID N.º: 4 no es superior a 20, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20.
[0136] El polipéptido puede ser un polipéptido híbrido en el cual una porción de un polipéptido se fusiona en el extremo N-terminal o el C-terminal de una porción de otro polipéptido.
[0137] El polipéptido puede ser un polipéptido de fusión o polipéptido de fusión escindible en el cual otro polipéptido se fusiona en el extremo N-terminal o el C-terminal del polipéptido de la presente invención. Un polipéptido fusionado se produce por fusión de un polinucleótido que codifica otro polipéptido con un polinucleótido de la presente invención. Las técnicas para producir polipéptidos de fusión se conocen en la técnica e incluyen ligar las secuencias codificantes que codifican los polipéptidos de modo que estén en marco y que la expresión del polipéptido fusionado esté bajo control del/los mismo(s) promotor(es) y terminador. Las proteínas de fusión también se pueden construir utilizando tecnología de inteína en la cual las fusiones se crean postraduccionalmente (Cooper et al., 1993, EMBO J. 12: 2575-2583; Dawson et a/., 1994, Science 266: 776779).
[0138] Un polipéptido de fusión puede además comprender un sitio de escisión entre los dos polipéptidos. Cuando se secreta la proteína de fusión, el sitio se escinde y se liberan los dos polipéptidos. Los ejemplos de sitios de escisión incluyen, pero de forma no limitativa, los sitios descritos en Martin et al., 2003, J. Ind. Microbiol. Biotecnol. 3: 568-576; Svetina et al., 2000, J. Biotecnol. 76: 245-251; Rasmussen-Wilson et al., 1997, Appl. Environ. Microbiol. 63: 3488-3493; Ward et al., 1995, Biotechnology 13: 498-503; y Contreras et al., 1991, Biotechnology 9: 378-381; Eaton et al., 1986, Biochemistry 25: 505-512; Collins-Racie et al., 1995, Biotechnology
13: 982-987; Carter et al., 1989, Proteins: Structure, Function, and Genetics 6: 240-248; y Stevens, 2003, Drug Discovery World 4: 35-48.
[0139] El polipéptido puede expresarse por una secuencia de ADN recombinante que contiene la codificación para una etiqueta His o etiqueta HQ para proporcionar, después de cualesquiera modificaciones postraduccionales, el polipéptido maduro que contiene toda o parte de la etiqueta His o HQ. La etiqueta HQ, que tiene la secuencia -RHQHQHQ, puede escindirse completa o parcialmente del polipéptido durante las modificaciones postraduccionales, dando como resultado, por ejemplo, la unión de los aminoácidos adicionales RHQHQ al extremo C-terminal del polipéptido maduro.
[0140] Las moléculas de carbohidrato se unen con frecuencia a un polipéptido procedente de una fuente fúngica durante la modificación postraduccional. Para ayudar al análisis por espectrometría de masas, el polipéptido se puede incubar con una endoglicosidasa para deglicosilar cada posición unida a N. Para cada sitio unido a N deglicosilado, una N-acetil hexosamina permanece en la cadena principal de la proteína.
Formas de realización
[0141] En determinadas formas de realización de la invención, la proteasa de la invención muestra propiedades térmicas beneficiosas tales como termoestabilidad, estabilidad en vapor, etc. y/o propiedades de pH, tales como estabilidad en ácido, pH óptimo, etc.
[0142] Una forma de realización de la invención consiste en polipéptidos aislados que tienen actividad de proteasa mejorada entre pH 2 y 5, tal como entre pH 2 y 4, preferiblemente entre pH 3 y 5, o más preferiblemente entre pH 3 y 4, a 25°C en comparación con la proteasa 10R.
[0143] Una forma de realización adicional de la invención consiste en polipéptidos aislados que tienen actividad de proteasa mejorada a, por ejemplo, 60°C o menos, preferiblemente 50°C o menos, más preferiblemente 37°C
o menos; entre 25°C y 60°C, preferiblemente entre 25°C y 50°C; o a 25°C o a 37°C en comparación con la proteasa 10R.
[0144] Una forma de realización adicional de la invención es la actividad de proteasa mejorada en harina de soja y maíz entre pH 3,0 y 4,0 a 40°C en comparación con la proteasa 10R.
[0145] Otra forma de realización de la invención es la actividad proteolítica mejorada en la digesta de pollos de engorde expresada como aumento en la cantidad de aminas primarias en la digesta del buche y/o la molleja tras 3 o 1 hora de incubación cuando se compara con una muestra blanco no tratada con proteasa y cuando se compara con una muestra tratada con la proteasa 10R.
Propiedades de acidez/alcalinidad
[0146] En determinadas formas de realización de la invención, la proteasa de la invención muestra propiedades beneficiosas relativas al pH, tales como estabilidad en ácido, pH óptimo, etc. La estabilidad de la proteasa a un pH bajo es beneficiosa, ya que la proteasa puede tener actividad en el intestino después de pasar a través del estómago. En una forma de realización de la invención, la proteasa retiene >70% de la actividad, tal como >95% de la actividad tras 2 horas a pH 3 como se determina utilizando el método descrito en el ejemplo 3.
Temperatura-actividad
[0147] El perfil de temperatura-actividad de la proteasa se puede determinar como se describe en el ejemplo 3. La actividad a bajas temperaturas (30-40°C) puede ser ventajosa para la digestión de proteínas en un animal.
[0148] En una forma de realización, la invención comprende una proteasa que tiene un perfil de temperatura-actividad a pH 4,0 con actividad relativa de 0,20 o superior a 25°C o actividad relativa de 0,50 o superior a 37°C cuando se compara con la actividad de la proteasa a 50°C (cf. ejemplo 3).
Termoestabilidad
[0149] La termoestabilidad se puede determinar como se describe en el ejemplo 6, es decir, usando mediciones de DSC para determinar la temperatura de desnaturalización, Td, de la proteína proteasa purificada. La Td es indicativa de la termoestabilidad de la proteína: cuanto mayor sea la Td, mayor será la termoestabilidad. Por consiguiente, en una forma de realización preferida, la proteasa de la invención tiene una Td que es superior a la Td de una proteasa de referencia, donde la Td se determina en muestras de proteasa purificada (preferiblemente con una pureza de al menos un 90% o 95%, como se determina por SDS-PAGE).
[0150] En formas de realización preferidas, las propiedades térmicas tales como la estabilidad térmica, estabilidad a la temperatura, termoestabilidad, estabilidad en vapor y/o estabilidad de granulación como las proporcionan la actividad residual, temperatura de desnaturalización Td u otro parámetro de la proteasa de la invención, son superiores al valor correspondiente, como la actividad residual o Td, de la proteasa de SEQ ID N.º: 6, más preferiblemente al menos un 101% del mismo o al menos un 102%, 103%, 104%, 105%, 106%, 107%, 108%, 109%, o al menos un 110% del mismo. Aún más preferiblemente, el valor del parámetro, tal como la actividad residual o Td, de la proteasa de la invención es al menos un 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180% o al menos un 190% del valor para la proteasa de SEQ ID N.º: 6.
[0151] En formas de realización particulares adicionales, la proteasa termoestable de la invención tiene una temperatura de fusión, Tm (o una temperatura de desnaturalización, Td), determinada mediante el uso de calorimetría diferencial de barrido (DSC) como se describe en el ejemplo 10 (es decir, en 20 mM de acetato sódico, pH 4,0), de al menos 50°C. En formas de realización particulares adicionales, la Tm es al menos 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o al menos 100°C.
Estabilidad en vapor
[0152] La estabilidad en vapor se puede determinar como se describe en el ejemplo 7 mediante la determinación de la actividad residual de moléculas de proteasa después de tratar con vapor a 85°C o 90°C durante un tiempo corto.
Estabilidad de granulación
[0153] La estabilidad de granulación se puede determinar como se describe en el ejemplo 8 usando un granulado enzimático premezclado con pienso. Desde la mezcladora, el pienso se acondiciona con vapor a 95°C. Después de preparar el pienso, se prensa en gránulos y se determina la actividad residual.
Fuentes de polipéptidos con actividad de proteasa
[0154] Se puede obtener un polipéptido con actividad de proteasa de la presente invención a partir de hongos de cualquier género. Para los fines de la presente invención, el término "obtenido a partir de" tal como se utiliza en la presente en relación con una fuente dada significará que el polipéptido codificado por un polinucleótido es producido por la fuente o por una cepa en la cual se ha insertado el polinucleótido procedente de la fuente. En un aspecto, el polipéptido obtenido a partir de una fuente dada se secreta extracelularmente.
[0155] El polipéptido puede ser un polipéptido fúngico. Por ejemplo, el polipéptido puede ser un polipéptido con actividad de proteasa procedente de un filo tal como Basidiomycota. En un aspecto, el polipéptido es una proteasa procedente de un hongo de la clase Agaricomycetes, tal como del orden Polyporales, o de la familia Coriolaceae, o del género Meripilus o del género Trametes.
[0156] Se entenderá que para las especies anteriormente mencionadas, la invención abarca tanto los estados perfectos como los imperfectos y otros equivalentes taxonómicos, por ejemplo, anamorfos, independientemente del nombre de especie por el que se conocen. Los expertos en la técnica reconocerán fácilmente la identidad de equivalentes apropiados.
[0157] Las cepas de estos taxones son fácilmente accesibles al público en varias colecciones de cultivos, tales como la American Type Culture Collection (ATCC), Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS) y Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center (NRRL).
[0158] El polipéptido se puede identificar y obtener a partir de otras fuentes incluyendo microorganismos aislados de la naturaleza (por ejemplo, tierra, abonos, agua, etc.) o muestras de ADN obtenidas directamente a partir de materiales naturales (por ejemplo, tierra, abonos, agua, etc.) utilizando las sondas anteriormente mencionadas. Las técnicas para aislar microorganismos y ADN directamente a partir de hábitats naturales son bien conocidas en la técnica. Un polinucleótido que codifica un polipéptido puede obtenerse entonces cribando de forma similar una genoteca de ADN genómico o ADNc de otro microorganismo o muestra de ADN mezclado. Una vez ha sido detectado con la(s) sonda(s) un polinucleótido que codifica un polipéptido, el polinucleótido se puede aislar o clonar utilizando técnicas que conocen los expertos en la materia (veáse, por ejemplo, Sambrook et al., 1989, supra).
Polinucleótidos
[0159] La presente invención también se refiere a polinucleótidos aislados que codifican un polipéptido de la presente invención.
[0160] Las técnicas usadas para aislar o clonar un polinucleótido que codifica un polipéptido se conocen en la técnica e incluyen el aislamiento a partir de ADN genómico, la preparación de ADNc o una combinación de las mismas. La clonación de los polinucleótidos de tal ADN genómico puede efectuarse, por ejemplo, usando la bien conocida reacción en cadena de la polimerasa (PCR) o el cribado de anticuerpos de bibliotecas de expresión para detectar fragmentos de ADN clonados con características estructurales compartidas. Veáse, por ejemplo, Innis et al., 1990, PCR: A Guide to Methods and Application, Academic Press, Nueva York. Se pueden utilizar otros procedimientos de amplificación de ácidos nucleicos tales como la reacción en cadena de la ligasa (LCR), la transcripción activada por ligadura (LAT) y la amplificación basada en polinucleótidos (NASBA). Los polinucleótidos se pueden clonar a partir de una cepa de Bacillus sp. u otro organismo relacionado del orden Bacillales y así, por ejemplo, puede ser una variante alélica o de especie de la región codificante del polipéptido del polinucleótido.
[0161] La presente invención también se refiere a polinucleótidos aislados que comprenden o consisten en polinucleótidos que tienen un grado de identidad de secuencia con la secuencia codificante del polipéptido maduro de SEQ ID N.º: 1 de al menos un 84%, por ejemplo, al menos un 85%, al menos un 86%, al menos un 87%, al menos un 88%, al menos un 89%, al menos un 90%, al menos un 91%, al menos un 92%, al menos un 93%, al menos un 94%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, al menos un 99% o el 100%, que codifica un polipéptido que tiene actividad de proteasa.
[0162] La modificación de un polinucleótido que codifica un polipéptido de la presente invención puede ser necesaria para la síntesis de polipéptidos sustancialmente similares al polipéptido. El término "sustancialmente similar" al polipéptido se refiere a formas del polipéptido que no ocurren de manera natural. Estos polipéptidos pueden diferir de alguna manera que implique ingeniería a partir del polipéptido aislado de su fuente nativa, por ejemplo, variantes que difieren en la actividad específica, la termoestabilidad, el pH óptimo, o similares. La variante se puede construir basándose en el polinucleótido presentado como la secuencia codificante del polipéptido maduro de SEQ ID N.º: 1, por ejemplo, una subsecuencia de la misma, y/o por introducción de sustituciones nucleotídicas que no suponen un cambio en la secuencia de aminoácidos del polipéptido, pero que corresponden al uso de codones del organismo huésped destinado a la producción de la enzima, o por introducción de sustituciones nucleotídicas que pueden dar lugar a una secuencia de aminoácidos diferente. Para una descripción general de la sustitución nucleotídica, veáse, por ejemplo, Ford et al., 1991, Protein Expression and Purification 2: 95-107.
[0163] La presente invención también se refiere a polinucleótidos aislados que codifican polipéptidos de la presente invención, que hibridan bajo condiciones de astringencia muy baja, condiciones de astringencia baja, condiciones de astringencia media, condiciones de astringencia media-alta, condiciones de astringencia alta o condiciones de astringencia muy alta con (i) la secuencia codificante del polipéptido maduro de SEQ ID N.º: 1, (ii) la secuencia de ADN genómico que comprende la secuencia codificante del polipéptido maduro de SEQ ID N.º: 1, o (iii) la cadena complementaria en toda su longitud de (i) o (ii); o variantes alélicas y subsecuencias de las mismas (Sambrook et al., 1989, supra), tal y como se define en la presente.
[0164] En un aspecto, el polinucleótido comprende o consiste en la SEQ ID N.º: 1, la secuencia codificante del polipéptido maduro de SEQ ID N.º: 1 o una subsecuencia de la SEQ ID N.º: 1 que codifica un fragmento de SEQ ID N.º: 2 con actividad de proteasa, tal como el polinucleótido de los nucleótidos 605 a 1702 de la SEQ ID N.º: 1.
Constructos de ácido nucleico
[0165] La presente invención también se refiere a constructos de ácido nucleico que comprende un polinucleótido de la presente invención unido operativamente a una o más (varias) secuencias de control que dirigen la expresión de la secuencia codificante en una célula huésped adecuada bajo condiciones compatibles con las secuencias de control.
[0166] Un polinucleótido se puede manipular en una variedad de formas para proveer a la expresión del polipéptido. La manipulación del polinucleótido antes de su inserción en un vector puede ser deseable o necesaria en función del vector de expresión. Las técnicas para modificar polinucleótidos utilizando métodos de ADN recombinante se conocen bien en la técnica.
[0167] La secuencia de control puede ser una secuencia promotora, un polinucleótido que es reconocido por una célula huésped para la expresión de un polinucleótido que codifica un polipéptido de la presente invención. La secuencia promotora contiene secuencias de control transcripcional que median la expresión del polipéptido. El promotor puede ser cualquier polinucleótido que muestre actividad transcripcional en la célula huésped de elección incluyendo promotores mutantes, truncados e híbridos, y puede obtenerse a partir de genes que codifican polipéptidos extracelulares o intracelulares homólogos o heterólogos a la célula huésped.
[0168] Ejemplos de promotores adecuados para dirigir la transcripción de los constructos de ácido nucleico de la presente invención en una célula huésped bacteriana son los promotores obtenidos a partir del gen de la alfaamilasa de Bacillus amyloliquefaciens (amyQ), el gen de la alfa-amilasa de Bacillus licheniformis (amyL), el gen de la penicilinasa de Bacillus licheniformis (penP), el gen de la amilasa maltogénica de Bacillus stearothermophilus (amyM), el gen de la levansucrasa de Bacillus subtilis (sacB), los genes xylA y xylB de Bacillus subtilis, el gen cryIIIA de Bacillus thuringiensis (Agaisse y Lereclus, 1994, Molecular Microbiology 13: 97107), el operón lac de E. coli, el promotor trc de E. Coli (Egon et al., 1988, Gene 69: 301-315), el gen de la agarasa de Streptomyces coelicolor (dagA) y el gen de la beta-lactamasa procariótica (Villa-Kamaroff et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 3727-3731), así como el promotor tac (DeBoer et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 21-25). Otros promotores se describen en "Useful proteins from recombinant bacteria" en Gilbert et al., 1980, Scientific American 242: 74-94; y en Sambrook et al.. 1989, supra. Ejemplos de promotores en tándem se describen en WO 99/43835.
[0169] Ejemplos de promotores adecuados para dirigir la transcripción de los constructos de ácido nucleico de la presente invención en una célula huésped de hongo filamentoso son los promotores obtenidos de los genes de la acetamidasa de Aspergillus nidulans, alfa-amilasa neutra de Aspergillus niger, alfa-amilasa estable en medio ácido de Aspergillus niger, glucoamilasa de Aspergillus niger o Aspergillus awamori (glaA), TAKA amilasa de Aspergillus oryzae, proteasa alcalina de Aspergillus orizae, triosa fosfato isomerasa de Aspergillus oryzae, proteasa de tipo tripsina de Fusarium oxysporum (WO 96/00787), amiloglucosidasa de Fusarium venenatum (WO 00/56900), Fusarium venenatum Daria (WO 00/56900), Quinn de Fusarium venenatum (WO 00/56900), lipasa de de Rhizomucor miehei, proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei, beta-glucosidasa de Trichoderma reesei, celobiohidrolasa I de Trichoderma reesei, celobiohidrolasa II de Trichoderma reesei, endoglucanasa I de Trichoderma reesei, endoglucanasa II de Trichoderma reesei, endoglucanasa III de Trichoderma reesei, endoglucanasa IV de Trichoderma reesei, endoglucanasa V de Trichoderma reesei, xilanasa I de Trichoderma reesei, xilanasa II de Trichoderma reesei, beta-xilosidasa de Trichoderma reesei, así como el promotor NA2-tpi (un promotor modificado incluyendo un gen que codifica una alfa-amilasa neutra de Aspergilli en el que la secuencia líder no traducida se ha sustituido por una secuencia líder no traducida de un gen que codifica la triosa fosfato isomerasa en Aspergilli; ejemplos no limitativos incluyen promotores modificados incluyendo el gen que codifica la alfa-amilasa neutra en Aspergillus niger en el que la secuencia líder no traducida se ha sustituido por una secuencia líder no traducida del gen que codifica la triosa fosfato isomerasa en el Aspergillus nidulans o Aspergillus oryzae); y promotores mutantes, truncados e híbridos de los mismos.
[0170] En un huésped de levadura, se obtienen promotores útiles de los genes de la enolasa de Saccharomyces cerevisiae (ENO-1), galactocinasa de Saccharomyces cerevisiae (GAL1), alcohol dehidrogenasa/gliceraldehído3-fosfato deshidrogenasa de Saccharomyces cerevisiae (ADH1, ADH2/GAP), triosa fosfato isomerasa de Saccharomyces cerevisiae (TPI), metalotioneína de Saccharomyces cerevisiae (CUP1) y 3-fosfoglicerato cinasa de Saccharomyces cerevisiae. Otros promotores útiles para células huésped de levadura se describen en Romanos et al., 1992, Yeast 8: 423-488.
[0171] La secuencia de control también puede ser una secuencia terminadora de transcripción adecuada, que es reconocida por una célula huésped para terminar la transcripción. La secuencia terminadora está unida operativamente al extremo 3'-terminal del polinucleótido codificante del polipéptido. Cualquier terminador que sea funcional en la célula huésped de elección puede utilizarse en la presente invención.
[0172] Los terminadores preferidos para células huésped bacterianas se obtienen a partir de los genes de la proteasa alcalina de Bacillus clausii (aprH), la alfa-amilasa de Bacillus licheniformis (amyL) y ARN ribosómico de Escherichia coli (rrnB).
[0173] Los terminadores preferidos para células huésped fúngicas filamentosas se obtienen a partir de los genes de la antranilato sintasa de Aspergillus nidulans, glucoamilasa de Aspergillus niger, alfa-glucosidasa de Aspergillus niger, TAKA amilasa de Aspergillus oryzae y proteasa de tipo tripsina de Fusarium oxysporum.
[0174] Los terminadores preferidos para células huésped de levadura se obtienen a partir de los genes de la enolasa de Saccharomyces cerevisiae, el citocromo C (CYC1) de Saccharomyces cerevisiae y la gliceraldehído3-fosfato deshidrogenasa de Saccharomyces cerevisiae. Otros terminadores útiles para células huésped de levadura se describen en Romanos et al., 1992, supra.
[0175] La secuencia de control también puede ser una región estabilizadora de ARNm corriente abajo de un promotor y corriente arriba de la secuencia codificante de un gen que aumenta la expresión del gen.
[0176] Ejemplos de regiones estabilizadoras de ARNm adecuadas se obtienen a partir de un gen crylIIA de Bacillus thuringiensis (WO 94/25612) y un gen SP82 de Bacillus subtilis (Hue et al., 1995, Journal of Bacteriology
177: 3465-3471).
[0177] La secuencia de control también puede ser una secuencia líder, una región no traducida de un ARNm que es importante para la traducción por la célula huésped. La secuencia líder está unida operativamente al extremo 5'-terminal del polinucleótido que codifica el polipéptido. Puede utilizarse cualquier secuencia líder que sea funcional en la célula huésped.
[0178] Las secuencias líderes preferidas para células huésped fúngicas filamentosas se obtienen a partir de los genes de la TAKA amilasa de Aspergillus oryzae y y la triosa fosfato isomerasa de Aspergillus nidulans.
[0179] Las secuencias líderes adecuadas para células huésped de levadura se obtienen a partir de los genes de la enolasa de Saccharomyces cerevisiae (ENO-1), 3-fosfoglicerato cinasa de Saccharomyces cerevisiae, el factor alfa de Saccharomyces cerevisiae y la alcohol deshidrogenasa/gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasade Saccharomyces cerevisiae (ADH2/GAP).
[0180] La secuencia de control también puede ser una secuencia de poliadenilación, una secuencia unida operativamente al extremo 3'-terminal del polinucleótido y, cuando se transcribe, la célula huésped la reconoce como una señal para añadir residuos de poliadenosina al ARNm transcrito. Puede utilizarse cualquier secuencia de poliadenilación que sea funcional en la célula huésped de elección.
[0181] Las secuencias de poliadenilación preferidas para células huésped fúngicas filamentosas se obtienen a partir de los genes de la TAKA amilasa de Aspergillus oryzae, glucoamilasa de Aspergillus niger, antranilato sintasa de Aspergillus nidulans, proteasa de tipo tripsina de Fusarium oxysporum y alfa-glucosidasa de Aspergillus niger.
[0182] Las secuencias de poliadenilación útiles para células huésped de levadura se describen en Guo y Sherman, 1995, Mol. Cellular Biol. 15: 5983-5990.
[0183] La secuencia de control también puede ser una región codificante del péptido señal que codifica un péptido señal unido al extremo N-terminal de un polipéptido y dirige el polipéptido a la vía secretora de la célula. El extremo 5' de la secuencia codificante del polinucleótido puede contener intrínsecamente una secuencia
codificante del péptido señal naturalmente unida en el marco de lectura de traducción con el segmento de la secuencia codificante que codifica el polipéptido. Alternativamente, el extremo 5' de la secuencia codificante puede contener una secuencia codificante del péptido señal que es exógena a la secuencia codificante. La secuencia codificante del péptido señal exógena puede requerirse donde la secuencia codificante no contiene de manera natural una secuencia codificante del péptido señal. Alternativamente, la secuencia codificante del péptido señal exógena puede simplemente reemplazar la secuencia codificante del péptido señal natural para mejorar la secreción del polipéptido. Sin embargo, se puede utilizar cualquier secuencia codificante del péptido señal que dirija el polipéptido expresado a la vía secretora de una célula huésped de elección.
[0184] Secuencias codificantes del péptido señal eficaces para células huésped bacterianas son las secuencias codificantes del péptido señal obtenidas a partir de los genes de la amilasa maltogénica de Bacillus NCIB 11837, subtilisina de Bacillus licheniformis, beta-lactamasa de Bacillus licheniformis, alfa-amilasa de Bacillus stearothermophilus, proteasas neutras de Bacillus stearothermophilus (nprT, nprS, nprM), prsA de Bacillus subtilis y Bascillus lentus. Se describen péptidos señal adicionales en Simonen y Palva, 1993, Microbiological Reviews 57: 109-137.
[0185] Secuencias codificantes del péptido señal eficaces para células huésped fúngicas filamentosas son las secuencias codificantes del péptido señal obtenidas a partir de los genes de la amilasa neutra de Aspergillus niger, glucoamilasa de Aspergillus niger, TAKA amilasa de Aspergillus oryzae, celulasa de Humicola insolens, endoglucanasa V de Humicola insolens, lipasa de Humicola lanuginosa y proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei.
[0186] Se obtienen péptidos señal útiles para células huésped de levadura a partir de los genes del factor alfa de Saccharomyces cerevisiae y la invertasa de Saccharomyces cerevisiae. Se describen otras secuencias codificantes del péptido señal útiles en Romanos et al., 1992, supra.
[0187] La secuencia de control también puede ser una secuencia codificante del propéptido que codifica un propéptido situado en el extremo N-terminal de un polipéptido. El polipéptido resultante se conoce como una proenzima o propolipéptido (o un zimógeno en algunos casos). Generalmente, un propolipéptido es inactivo y se puede convertir en un polipéptido activo por escisión catalítica o autocatalítica del propéptido del propolipéptido. La secuencia codificante del propéptido se puede obtener a partir de los genes de la proteasa alcalina de Bacillus subtilis (aprE), la proteasa neutra de Bacillus subtilis (nprT), la lacasa de Myceliophthora thermophila (WO 95/33836), la proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei y el factor alfa de Saccharomyces cerevisiae.
[0188] Cuando tanto el péptido señal como las secuencias de propéptido están presentes en el extremo N-terminal de un polipéptido, la secuencia de propéptido está situada junto al extremo N-terminal de un polipéptido y la secuencia de péptido señal está situada junto al extremo N-terminal de la secuencia de propéptido.
[0189] También puede ser deseable añadir secuencias reguladoras que permitan la regulación de la expresión del polipéptido en relación con el crecimiento de la célula huésped. Ejemplos de sistemas reguladores son aquellos que causan que la expresión del gen se active o se desactive en respuesta a un estímulo químico o físico, incluyendo la presencia de un compuesto regulador. Los sistemas reguladores en sistemas procarióticos incluyen los sistemas operadores lac, tac y trp. En levaduras, puede utilizarse el sistema ADH2 o el sistema GAL1. En hongos filamentosos, pueden utilizarse el promotor de la glucoamilasa de Aspergillus niger, el promotor de la TAKA alfa-amilasa de Aspergillus oryzae y el promotor de la glucoamilasa de Aspergillus orizae. Otros ejemplos de secuencias reguladoras son aquellas que permiten la amplificación génica. En sistemas eucarióticos, estas secuencias reguladoras incluyen el gen de la dihidrofolato reductasa que se amplifica en presencia de metotrexato y los genes de metalotioneína que se amplifican con metales pesados. En estos casos, el polinucleótido que codifica el polipéptido estaría unido operativamente a la secuencia reguladora.
Vectores de expresión
[0190] La presente invención también se refiere a vectores de expresión recombinantes que comprenden un polinucleótido de la presente invención, un promotor y señales de terminación transcripcional y traduccional. Las varias secuencias de nucleótidos y de control se pueden unir para producir un vector de expresión recombinante que puede incluir uno o más (varios) sitios de restricción convenientes para permitir la inserción o sustitución del polinucleótido codificante del polipéptido en tales sitios. Alternativamente, el polinucleótido se puede expresar mediante la inserción del polinucleótido o un constructo de ácido nucleico que comprende la secuencia en un vector apropiado para la expresión. En la creación del vector de expresión, la secuencia codificante se localiza en el vector de modo que la secuencia codificante esté unida operativamente a las secuencias de control apropiadas para la expresión.
[0191] El vector de expresión recombinante puede ser cualquier vector (por ejemplo, un plásmido o virus) que pueda someterse convenientemente a procedimientos de ADN recombinante y pueda provocar la expresión del polinucleótido. La elección del vector dependerá típicamente de la compatibilidad del vector con la célula huésped en la que el vector se va a introducir. El vector puede ser un plásmido lineal o circular cerrado .
[0192] El vector puede ser un vector de replicación autónoma, es decir, un vector que existe como una entidad extracromosómica, la replicación del cual es independiente de la replicación cromosómica, por ejemplo, un plásmido, un elemento extracromosómico, un minicromosoma o un cromosoma artificial. El vector puede contener cualquier medio para asegurar la autorreplicación. Alternativamente, el vector puede ser uno que, cuando se introduce en la célula huésped, se integra en el genoma y se replica junto con el/los cromosoma(s) en que se ha integrado. Además, se pueden utilizar un vector o plásmido único o dos o más vectores o plásmidos que juntos contienen el ADN total que se va a introducir en el genoma de la célula huésped, o un transposón.
[0193] El vector contiene preferiblemente uno o más (varios) marcadores seleccionables que permiten la selección fácil de células transformadas, transfectadas, transducidas o similares. Un marcador seleccionable es un gen el producto del cual proporciona resistencia vírica o a biocidas, resistencia a metales pesados, prototrofia a auxótrofos y similares.
[0194] Ejemplos de marcadores seleccionables bacterianos son los genes dal de Bacillus licheniformis o Bacillus subtilis, o marcadores que confieren resistencia antibiótica tal como resistencia a ampicilina, cloranfenicol, kanamicina, neomicina, espectinomicina o tetraciclina. Marcadores adecuados para células huésped de levadura incluyen, pero de forma no limitativa, ADE2, HIS3, LEU2, LYS2, MET3, TRP1 y URA3. Marcadores seleccionables para el uso en una célula huésped fúngica filamentosa incluyen, pero de forma no limitativa, amdS (acetamidasa), argB (ornitina-carbamoiltransferasa), bar (fosfinotricina acetiltransferasa), hph (higromicina fosfotransferasa), niaD (nitrato reductasa), pyrG (orotidina-5'-fosfato descarboxilasa), sC (sulfato adeniltransferasa) y trpC (antranilato sintasa), así como equivalentes de los mismos. Los genes amdS y pyrG de Aspergillus nidulans o Aspergillus oryzae y el gen bar de Streptomyces hygroscopicus se prefieren para uso en una célula de Aspergillus
[0195] El vector contiene preferiblemente un elemento(s) que permite(n) la integración del vector en el genoma de la célula huésped o la replicación autónoma del vector en la célula independientemente del genoma.
[0196] Para la integración en el genoma de la célula huésped, el vector puede depender de la secuencia codificante del polinucleótido del polipéptido o cualquier otro elemento del vector para la integración en el genoma por recombinación homóloga o no homóloga. Alternativamente, el vector puede contener polinucleótidos adicionales para dirigir la integración por recombinación homóloga en el genoma de la célula huésped en una ubicación(es) precisa(s) en el/los cromosoma(s). Para aumentar la probabilidad de integración en una ubicación precisa, los elementos integracionales deberían contener un número suficiente de ácidos nucleicos, tal como de 100 a 10.000 pares de bases, de 400 a 10.000 pares de bases y de 800 a 10.000 pares de bases, que tienen un alto grado de identidad de secuencia con la secuencia diana correspondiente para aumentar la probabilidad de recombinación homóloga. Los elementos integradores pueden ser cualquier secuencia que sea homóloga a la secuencia diana en el genoma de la célula huésped. Además, los elementos integradores pueden ser polinucleótidos codificantes o no codificantes. Por otro lado, el vector se puede integrar en el genoma de la célula huésped por recombinación no homóloga.
[0197] Para la replicación autónoma, el vector puede comprender además un origen de replicación que permite al vector replicarse autónomamente en la célula huésped en cuestión. El origen de replicación puede ser cualquier replicador de plásmido que media la replicación autónoma que funcione en una célula. El término "origen de replicación" o "replicador de plásmido" se refiere a un polinucleótido que permite que un plásmido o vector se replique in vivo.
[0198] Ejemplos de orígenes bacterianos de replicación son los orígenes de replicación de los plásmidos pBR322, pUC19, pACYC177 y pACYC184 que permiten la replicación en E. Coli, y pUB110, pE194, pTA1060 y pAMβ1 que permiten la replicación en Bacillus.
[0199] Ejemplos de orígenes de replicación para el uso en una célula huésped de levadura son los orígenes de replicación de 2 micras, ARS1, ARS4, la combinación de ARS1 y CEN3, y la combinación de ARS4 y CEN6.
[0200] Ejemplos de orígenes de replicación útiles en una célula fúngica filamentosa son AMA1 y ANS1 (Gems et al., 1991, Gene 98: 61-67; Cullen et al., 1987, Nucleic Acids Res. 15: 9163-9175; WO 00/24883). El aislamiento del gen AMA1 y la construcción de plásmidos o vectores que comprenden el gen pueden conseguirse según los métodos descritos en WO 00/24883.
[0201] Se puede insertar más de una copia de un polinucleótido de la presente invención en la célula huésped para aumentar producción de un polipéptido. Se puede obtener un aumento en el número de copias del polinucleótido integrando al menos una copia adicional de la secuencia en el genoma de la célula huésped o incluyendo un gen marcador seleccionable amplificable con el polinucleótido donde las células que contienen copias amplificadas del gen marcador seleccionable y, así, copias adicionales del polinucleótido, se pueden seleccionar por cultivo de las células en presencia del agente seleccionable apropiado.
[0202] Los procedimientos usados para unir los elementos anteriormente descritos para construir los vectores de expresión recombinantes de la presente invención son bien conocidos por un experto en la materia (véase, por ejemplo, Sambrook et al., 1989, supra).
Células huésped
[0203] La presente invención también se refiere a células huésped recombinantes, que comprenden un polinucleótido de la presente invención unido operativamente a una o más (varias) secuencias de control que dirigen la producción de un polipéptido de la presente invención. Un constructo o vector que comprende un polinucleótido se introduce en una célula huésped de modo que el constructo o vector se mantiene como un integrante cromosómico o como un vector extracromosómico autorreplicativo como se ha descrito anteriormente. El término "célula huésped" abarca cualquier progenie de una célula parental que no es idéntico a la célula parental debido a mutaciones que ocurren durante la replicación. La elección de una célula huésped dependerá en gran parte del gen codificante del polipéptido y su fuente.
[0204] La célula huésped puede ser cualquier célula útil en la producción recombinante de un polipéptido de la presente invención, por ejemplo, una procariota o una eucariota.
[0205] La célula huésped procariótica puede ser cualquier bacteria grampositiva o gramnegativa. Las bacterias grampositivas incluyen, pero de forma no limitativa, Bacillus, Clostridium, Enterococcus, Geobacillus, Lactobacillus, Lactococcus, Oceanobacillus, Staphylococcus, Streptococcus y Streptomyces. Las bacterias gramnegativas incluyen, pero de forma no limitativa, Campylobacter, E. Coli, Flavobacterium, Fusobacterium, Helicobacter, Ilyobacter, Neisseria, Pseudomonas, Salmonella y Ureaplasma.
[0206] La célula huésped bacteriana puede ser cualquier célula de Bacillus, incluyendo, pero de forma no limitativa, células de Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Geobacillus stearothermophilus, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis y Bacillus thuringiensis.
[0207] La célula huésped bacteriana también puede ser cualquier célula de Streptococcus, incluyendo, pero de forma no limitativa, células de Streptococcus equisimilis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus uberis y Streptococcus equi subesp. Zooepidemicus.
[0208] La célula huésped bacteriana también puede ser cualquier célula de Streptomyces, incluyendo, pero de forma no limitativa, células de Streptomyces achromogenes, Streptomyces avermitilis, Streptomyces coelicolor, Streptomyces griseus y Streptomyces lividans.
[0209] La introducción de ADN en una célula de Bacillus puede, por ejemplo, efectuarse por transformación de protoplastos (véase, por ejemplo, Chang y Cohen, 1979, Mol. Gen. Genet. 168: 111-115), usando células competentes (véase, por ejemplo, Young y Spizizen, 1961, J. Bacteriol. 81: 823-829, o Dubnau y Davidoff-Abelson, 1971, J. Mol. Biol. 56: 209-221), por electroporación (veáse, por ejemplo, Shigekawa y Dower, 1988, Biotechniques 6: 742-751), o por conjugación (veáse, por ejemplo, Koehler y Thorne, 1987, J. Bacteriol. 169: 5271-5278). La introducción de ADN en una célula de E. coli puede, por ejemplo, efectuarse por transformación de protoplastos (veáse, por ejemplo, Hanahan, 1983, J. Mol. Biol. 166: 557-580) o electroporación (veáse, por ejemplo, Dower et al., 1988, Nucleic Acids Res. 16: 6127-6145). La introducción de ADN en una célula de Streptomyces puede, por ejemplo, efectuarse por transformación de protoplastos y electroporación (veáse, por ejemplo, Gong et al., 2004, Folia Microbiol. (Praha) 49: 399-405), por conjugación (veáse, por ejemplo, Mazodier et al., 1989, J. Bacteriol. 171: 3583-3585), o por transducción (veáse, por ejemplo, Burke et al., 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 6289-6294). La introducción de ADN en una célula de Pseudomonas puede, por ejemplo, efectuarse por electroporación (veáse, por ejemplo, Choi et al., 2006, J. Microbiol. Methods 64: 391-397) o por conjugación (veáse, por ejemplo, Pinedo y Smets, 2005, Appl. Environ. Microbiol. 71: 51-57). La introducción de ADN en una célula de Streptococcus puede, por ejemplo, efectuarse por competencia natural (veáse, por ejemplo, Perry and Kuramitsu, 1981, Infect. Immun. 32: 1295-1297), por transformación de protoplastos (veáse, por ejemplo, Catt y Jollick, 1991, Microbios 68: 189-207), por electroporación (veáse, por ejemplo, Buckley et al., 1999, Appl. Environ. Microbiol. 65: 3800-3804) o por conjugación (veáse, por ejemplo, Clewell, 1981, Microbiol.
Rev. 45: 409-436). Sin embargo, puede usarse cualquier método conocido en la técnica para introducir ADN en una célula huésped.
[0210] La célula huésped también puede ser una célula eucariota, tal como de mamífero, de insecto, de planta o fúngica.
[0211] La célula huésped puede ser una célula fúngica. Los "hongos" tal como se utilizan en este caso incluye los filos Ascomycota, Basidiomycota, Chytridiomycota y Zygomycota (como se definen en Hawksworth et al., In, Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi, 8ª edición, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, Reino Unido) así como los hongos Oomycota (como se cita en Hawkswort et al., 1995, supra, página 171) y todos los mitospóricos (Hawkswort et al., 1995, supra).
[0212] La célula huésped fúngica puede ser una célula de levadura. La "levadura" como se utiliza en la presente incluye levadura ascoesporógena (Endomycetales), levadura basidioesporogéna y levadura perteneciente a los Fungi Imperfecti (Blastomycetes). Ya que la clasificación de levaduras puede cambiar en el futuro, para los fines de esta invención, la levadura debe definirse como se describe en Biology and Activities of Yeast (Skinner, F.A., Passmore, S.M. y Davenport, R.R., eds, Soc. App. Bacteriol. Symposium Series No. 9, 1980).
[0213] La célula huésped de levadura puede ser una célula de Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces o Yarrowia tal como una célula de Kluyveromyce lactis, Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis, Saccharomyces oviformis o Yarrowia lipolytica.
[0214] La célula huésped fúngica puede ser una célula fúngica filamentosa. Los "hongos filamentosos" incluyen todas las formas filamentosas de la subdivisión Eumycota y Oomycota (como se define en Hawkswort et al., 1995, supra). Los hongos filamentosos se caracterizan generalmente por una pared micelial compuesta por quitina, celulosa, glucano, quitosano, manano y otros polisacáridos complejos. El crecimiento vegetativo se produce por crecimiento hifal y el catabolismo de carbono es aeróbico estricto. En cambio, el crecimiento vegetativo de las levaduras tales como Saccharomyces cerevisiae se produce por gemación de un talo unicelular y el catabolismo de carbono puede ser fermentativo.
[0215] La célula huésped fúngica filamentosa puede ser una célula de Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Bjerkandera, Ceriporiopsis, Chrysosporium, Coprinus, Coriolus, Cryptococcus, Filibasidium, Fusarium, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Phanerochaete, Phlebia, Piromyces, Pleurotus, Schizophyllum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trametes
o Trichoderma.
[0216] Por ejemplo, la célula huésped fúngica filamentosa puede ser una célula de Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Bjerkandera adusta, Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis caregiea, Ceriporiopsis gilvescens, Ceriporiopsis pannocinta, Ceriporiopsis rivulosa, Ceriporiopsis subrufa, Ceriporiopsis subvermispora, Chrysosporium inops, Chrysosporium keratinophilum, Chrysosporium lucknowense, Chrysosporium merdarium, Chrysosporium pannicola, Chrysosporium queenslandicum, Chrysosporium tropicum, Chrysosporium zonatum, Coprinus cinereus, Coriolus hirsutus, Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, Fusarium venenatum, Humicola insolens, Humicola lanuginose, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium purpurogenum, Phanerochaete chrysosporium, Phlebia radiata, Pleurotus eryngii, Thielavia terrestris, Trametes villosa, Trametes versicolor, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei o Trichoderma viride. Una célula huésped preferida en concreto es una célula de Aspergillus oryzae.
[0217] Las células fúngicas se pueden transformar por un proceso que implica la formación de protoplastos, la transformación de los protoplastos y la regeneración de la pared celular de una manera conocida per se. Se describen procedimientos adecuados para la transformación de células huésped de Aspergillus y Trichoderma en EP 238023 y Yelton et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 1470-1474. Se describen métodos adecuados para transformar especies de Fusarium en Malardier et al., 1989, Gene 78: 147-156 y WO 96/00787. Se puede transformar levadura utilizando los procedimientos descritos en Becker y Guarente, In Abelson, J.N. y Simon, M.I., editores, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, volumen 194, págs. 182187, Academic Press, Inc., Nueva York; Ito et al., 1983, J. Bacteriol. 153: 163; y Hinnen et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 1920.
Métodos de producción
[0218] La presente invención también se refiere a métodos de producción de un polipéptido de la presente invención, que comprenden: (a) el cultivo de una célula, que en su forma de tipo salvaje produce el polipéptido, bajo condiciones que conducen a la producción del polipéptido; y (b) la recuperación del polipéptido. En un aspecto preferido, la célula es del género Bacillus. En un aspecto más preferido, la célula es Bacillus sp-19138.
[0219] La presente invención también se refiere a métodos de producción de un polipéptido de la presente invención, que comprenden: (a) el cultivo de una célula huésped recombinante de la presente invención bajo condiciones que conducen a la producción del polipéptido; y (b) la recuperación del polipéptido.
[0220] Las células huésped se cultivan en un medio nutritivo adecuado para la producción del polipéptido utilizando métodos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, la célula se puede cultivar mediante cultivo en matraces en agitación y mediante fermentación a pequeña o gran escala (incluyendo fermentación en continuo, por lotes, por lotes alimentados o en estado sólido) en fermentadores de laboratorio o industriales realizada en un medio adecuado y en condiciones que permitan que se exprese y/o se aísle el polipéptido. El cultivo tiene lugar en un medio nutritivo adecuado que comprende fuentes de nitrógeno y carbono y sales inorgánicas, usando procedimientos conocidos en la técnica. Los medios adecuados están disponibles de proveedores comerciales o se pueden preparar según composiciones publicadas (por ejemplo, en catálogos de la American Type Culture Collection). Si el polipéptido se segrega en el medio nutritivo, el polipéptido se puede recuperar directamente del medio. Si el polipéptido no se segrega, se puede recuperar de lisados celulares.
[0221] Se proporcionan más detalles en la sección de "constructos de ácido nucleico, vectores de expresión, células huésped recombinantes y métodos para la producción de proteasas" más adelante.
[0222] El polipéptido se puede detectar utilizando métodos conocidos en la técnica que son específicos para los polipéptidos. Estos métodos de detección pueden incluir el uso de anticuerpos específicos, la formación de un producto enzimático o la desaparición de un sustrato enzimático. Por ejemplo, se puede utilizar un ensayo enzimático para determinar la actividad del polipéptido.
[0223] El polipéptido se puede recuperar utilizando métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, el polipéptido se puede recuperar del medio nutritivo por procedimientos convencionales incluyendo, pero de forma no limitativa, centrifugación, filtración, extracción, secado por pulverización, evaporación o precipitación.
[0224] El polipéptido puede purificarse por una variedad de procedimientos conocidos en la técnica incluyendo, pero de forma no limitativa, cromatografía (por ejemplo, de intercambio iónico, de afinidad, hidrofóbica, cromatoenfoque y de exclusión por tamaño), procedimientos electroforéticos (por ejemplo, isoelectroenfoque preparativo), solubilidad diferencial (por ejemplo, precipitación de sulfato amónico), SDS-PAGE o extracción (véase, por ejemplo, Protein Purification, J.-C. Janson and Lars Ryden, editores, VCH Publishers, Nueva York, 1989) para obtener polipéptidos sustancialmente puros.
[0225] En un aspecto alternativo, el polipéptido no se recupera, sino que una célula huésped de la presente invención que expresa un polipéptido se usa como una fuente del polipéptido.
Plantas
[0226] La presente invención también se refiere a plantas, por ejemplo, una planta transgénica, parte de una planta o célula vegetal, que comprenden un polinucleótido aislado de la presente invención para expresar y producir el polipéptido en cantidades recuperables. El polipéptido se puede recuperar de la planta o parte de una planta. Alternativamente, la planta o parte de una planta que contiene el polipéptido se puede utilizar como tal para mejorar la calidad de un alimento o pienso, por ejemplo, mejorando el valor nutricional, la palatabilidad y las propiedades reológicas, o para destruir un factor antinutritivo.
[0227] La planta transgénica puede ser dicotiledónea (una dicotiledón) o monocotiledónea (una monocotiledón). Los ejemplos de plantas monocotiledóneas son hierbas, tales como poa de los prados (pasto azul, Poa), hierbas forrajeras tales como Festuca, Lolium, hierbas de zonas templadas, tales como Agrostis, y cereales, por ejemplo, trigo, avena, centeno, cebada, arroz, sorgo y maíz.
[0228] Ejemplos de plantas dicotiledóneas son el tabaco, las leguminosas, tales como los altramuces, la patata, la remolacha azucarera, el guisante, la judía y la soja, y plantas crucíferas (familia Brassicaceae), tales como la coliflor, la colza y el organismo modelo estrechamente relacionado Arabidopsis thaliana.
[0229] Ejemplos de partes de una planta son el tallo, el callo, las hojas, la raíz, los frutos, las semillas y los tubérculos así como los tejidos individuales que comprenden estas partes, por ejemplo, la epidermis, el mesófilo, el parénquima, los tejidos vasculares, los meristemos. Los compartimentos específicos de células vegetales, tales como cloroplastos, apoplastos, mitocondrias, vacuolas, peroxisomas y citoplasma también se consideran partes de una planta. Además, cualquier célula vegetal, cualquiera que sea el origen del tejido, se considera una parte de una planta. Asimismo, partes de una planta tales como tejidos específicos y células aisladas para facilitar la utilización de la invención también se consideran partes de una planta, por ejemplo, embriones, endospermas, la aleurona y cubiertas de semillas.
[0230] También se incluyen dentro del alcance de la presente invención la progenie de tales plantas, partes de plantas y células vegetales.
[0231] La planta o célula vegetal transgénica que expresa un polipéptido se puede construir conforme a métodos conocidos en la técnica. En resumen, la planta o célula vegetal se construye incorporando uno o más (varios) constructos de expresión que codifican un polipéptido en el genoma huésped de la planta o genoma de cloroplasto y propagando la planta o célula vegetal modificada resultante en una planta o célula vegetal transgénica.
[0232] El constructo de expresión es, convenientemente, un constructo de ácido nucleico que comprende un polinucleótido codificante de un polipéptido unido operativamente a secuencias reguladoras apropiadas requeridas para la expresión del polinucleótido en la planta o parte de una planta de elección. Además, el constructo de expresión puede comprender un marcador seleccionable útil para identificar células huésped en las que se ha integrado el constructo de expresión y las secuencias de ADN necesarias para la introducción del constructo en la planta en cuestión (esto último depende del método de introducción de ADN que se vaya a utilizar).
[0233] La elección de secuencias reguladoras, tales como secuencias promotoras y terminadoras y, opcionalmente, secuencias señal o de tránsito, se determina, por ejemplo, de acuerdo a cuándo, dónde y cómo se desea que se exprese el polipéptido. Por ejemplo, la expresión del gen codificante de un polipéptido puede ser constitutiva o inducible, o puede ser específica del desarrollo, fase o tejido, y el producto génico puede dirigirse a un tejido o parte de una planta específicos tales como las semillas u hojas. Se describen secuencias reguladoras, por ejemplo, en Tague et al., 1988, Plant Physiology 86: 506.
[0234] Para la expresión constitutiva, se pueden utilizar los promotores 35S-CaMV, de la ubiquitina 1 de maíz y de la actina 1 del arroz (Franck et al., 1980, Cell 21: 285-294; Christensen et al., 1992, Plant Mol. Biol. 18: 675689; Zhang et al., 1991, Plant Cell 3: 1155-1165). Los promotores específicos de órgano pueden ser, por ejemplo, un promotor de tejidos sumidero de almacenamiento tales como semillas, tubérculos de patata y frutos (Edwards y Coruzzi, 1990, Ann. Rev. Genet. 24: 275-303) o de tejidos sumidero metabólicos tales como los meristemos (Ito et al., 1994, Plant Mol. Biol. 24: 863-878), un promotor específico de semillas tales como el promotor de la glutelina, prolamina, globulina o albúmina del arroz (Wu et al., 1998, Plant Cell Physiol. 39: 885889), un promotor de Vicia faba de la legumina B4 y el gen de la proteína de semilla desconocida de Vicia faba (Conrad et al., 1998, J. Plant Physiol. 152: 708-711), un promotor de una proteína del cuerpo oleoso de semillas (Chen et al., 1998, Plant Cell Physiol. 39: 935-941), el promotor de la proteína de almacenamiento napA de Brassica napus o cualquier otro promotor específico de semillas conocido en la técnica, por ejemplo, como se describe en WO 91/14772. Además, el promotor puede ser un promotor específico de hoja tal como el promotor rbcs de arroz o tomate (Kyozuka et al., 1993, Plant Physiol. 102: 991-1000), el promotor del gen de la adenina metiltransferasa del virus chlorella (Mitra e Higgins, 1994, Plant Mol. Biol. 26: 85-93), el promotor del gen aldP del arroz (Kagaya et al., 1995, Mol. Gen. Genet. 248: 668-674) o un promotor inducible por heridas tal como el promotor pin2 de la patata (Xu et al., 1993, Plant Mol. Biol. 22: 573-588). Asimismo, el promotor puede ser inducible por tratamientos abióticos tales como la temperatura, sequía o alteraciones en la salinidad o inducido por sustancias aplicadas de forma exógena que activan el promotor, por ejemplo, etanol, estrógenos, hormonas vegetales tales como etileno, ácido abscísico y ácido giberélico, y metales pesados.
[0235] También se puede usar un elemento potenciador del promotor para conseguir una expresión mayor de un polipéptido en la planta. Por ejemplo, el elemento potenciador del promotor puede ser un intrón que se sitúa entre el promotor y el polinucleótido codificante de un polipéptido. Por ejemplo, Xu et al., 1993, supra, describen el uso del primer intrón del gen de la actina 1 del arroz para aumentar la expresión.
[0236] El gen marcador seleccionable y cualquiera de las otras partes del constructo de expresión se pueden elegir de aquellos disponibles en la técnica.
[0237] El constructo de ácido nucleico se incorpora en el genoma de la planta según técnicas convencionales conocidas en la técnica, incluyendo la transformación mediada por Agrobacterium, la transformación mediada
por virus, la microinyección, el bombardeo de partículas, la transformación biolística y la electroporación (Gasser et al., 1990, Science 244: 1293; Potrykus, 1990, Bio/Technology 8: 535; Shimamoto et al., 1989, Nature 338: 274).
[0238] Actualmente, la transferencia génica mediada por Agrobacterium tumefaciens es el método de elección para generar dicotiledóneas transgénicas (para una revisión, veáse Hooykas y Schilperoort, 1992, Plant Mol. Biol. 19: 15-38) y también pueden usarse para transfomar monocotiledóneas, aunque con frecuencia se usan otros métodos de transformación para estas plantas. Actualmente, el método de elección para generar monocotiledóneas transgénicas es el bombardeo de partículas (partículas microscópicas de oro o tungsteno recubiertas con el ADN transformante) de callos embriogénicos o embriones en desarrollo (Christou, 1992, Plant
J. 2: 275-281; Shimamoto, 1994, Curr. Opin. Biotechnol. 5: 158-162; Vasil et al., 1992, Bio/Technology 10: 667674). Un método alternativo para la transformación de monocotiledóneas se basa en la transformación de protoplastos como se describe en Omirulleh et al., 1993, Plant Mol. Biol. 21: 415-428. Métodos adicionales de transformación para el uso conforme a la presente descripción incluyen aquellos descritos en las patentes de EE.UU. N.ºs 6,395,966 y 7,151,204 (las cuales que se incorporan en la presente para referencia en su totalidad).
[0239] Después de la transformación, los transformantes que tienen incorporado el constructo de expresión se seleccionan y se regeneran en plantas enteras según métodos bien conocidos en la técnica. Frecuentemente el procedimiento de transformación se diseña para la eliminación selectiva de genes de selección bien durante regeneración o en las siguientes generaciones usando, por ejemplo, cotransformación con dos constructos de TADN separados o escisión específica de sitio del gen de selección por una recombinasa específica.
[0240] Además de la transformación directa de un genotipo vegetal particular con un constructo preparado según la presente invención, las plantas transgénicas se pueden preparar cruzando una planta que tiene el constructo con una segunda planta que carece del constructo. Por ejemplo, un constructo que codifica un polipéptido se puede introducir en una variedad vegetal particular mediante cruce, sin la necesidad de transformar directamente una planta de esa variedad dada. Por lo tanto, la presente invención no solo abarca una planta directamente regenerada a partir de células que se han transformado conforme a la presente invención, sino también la progenie de tales plantas. Como se utiliza en la presente, la progenie puede referirse a la descendencia de cualquier generación de una planta progenitora preparada conforme a la presente invención. Tal progenie puede incluir un constructo de ADN preparado conforme a la presente invención o una porción de un constructo de ADN preparado conforme a la presente invención. El cruce resulta en la introducción de un transgen en una línea vegetal por polinización cruzada de una línea de partida con una línea vegetal donante. Ejemplos no limitativos de tales pasos se articulan más a fondo en la patente de EE.UU. N.º: 7,151,204.
[0241] Las plantas se pueden generar a través de un proceso de conversión por retrocruzamiento. Por ejemplo, las plantas incluyen plantas referidas como un genotipo, línea, variedad endogámica o híbrido convertido por retrocruzamiento.
[0242] Se pueden utilizar marcadores genéticos para asistir en la introgresión de uno o más transgenes de la invención desde un fondo genético a otro. La selección asistida por marcadores ofrece ventajas en comparación con el cultivo convencional ya que se puede usar para evitar errores causados por variaciones fenotípicas. Además, los marcadores genéticos pueden proporcionar datos con respecto al grado relativo de germoplasma de élite en la progenie individual de un cruce particular. Por ejemplo, cuando una planta con una característica deseada que, por otra parte, tiene un fondo genético no deseable agronómicamente se cruza con un progenitor de élite, se pueden utilizar marcadores genéticos para seleccionar progenie que no solo posee la característica de interés, sino que también tienen una proporción relativamente grande del germoplasma deseado. De esta manera, se minimiza el número de generaciones requeridas para la introgresión de una o más características en un fondo genético particular.
[0243] La presente invención también se refiere a métodos de producción de un polipéptido de la presente invención que comprenden: (a) el cultivo de una planta o una célula vegetal transgénica que comprende un polinucleótido codificante del polipéptido bajo condiciones que conducen a la producción del polipéptido; y (b) la recuperación del polipéptido.
Composiciones
[0244] La presente invención también se refiere a composiciones que comprenden una proteasa de la presente invención. Preferiblemente, las composiciones están enriquecidas en tal proteasa. El término "enriquecido" indica que la actividad de proteasa de la composición se ha aumentado, por ejemplo, con un factor de enriquecimiento de al menos 1,1. En un aspecto, la composición comprende un polipéptido aislado que tiene actividad de proteasa, seleccionado del grupo constituido por:
(a)
un polipéptido con al menos un 84% de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID N.º: 5;
(b)
un polipéptido codificado por un polinucleótido con al menos un 84% de identidad de secuencia con la secuencia codificante del polipéptido maduro de SEQ ID N.º: 1;
(c)
una variante del polipéptido de SEQ ID N.º: 5 que comprende una sustitución, deleción y/o inserción en una o más posiciones, donde el número total de sustituciones, deleciones y/o inserciones aminoacídicas no es superior a 20; y
(d)
un fragmento de un polipéptido de (a), (b) o (c) que tiene actividad de proteasa,
en el que el polipéptido tiene actividad de proteasa mejorada a pH entre 3 y 4, a 25°C en comparación con la proteasa NRRL 18262..
[0245] Una forma de realización de la invención es una composición que comprende un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido con al menos un 70% de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID N.º: 5, SEQ ID N.º: 6, o el polipéptido maduro de SEQ ID N.º: 2 o SEQ ID N.º: 4.
[0246] Una forma de realización de la invención es una composición que comprende un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido con al menos un 75% de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID N.º: 5, SEQ ID N.º: 6, o el polipéptido maduro de SEQ ID N.º: 2 o SEQ ID N.º: 4.
[0247] Una forma de realización de la invención es una composición que comprende un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido con al menos un 80% de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID N.º: 5, SEQ ID N.º: 6, o el polipéptido maduro de SEQ ID N.º: 2 o SEQ ID N.º: 4.
[0248] Una forma de realización de la invención es una composición que comprende un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido con al menos un 85% de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID N.º: 5, SEQ ID N.º: 6, o el polipéptido maduro de SEQ ID N.º: 2 o SEQ ID N.º: 4.
[0249] Una forma de realización de la invención es una composición que comprende un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido con al menos un 87% de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID N.º: 5, SEQ ID N.º: 6, o el polipéptido maduro de SEQ ID N.º: 2 o SEQ ID N.º: 4.
[0250] Una forma de realización de la invención es una composición que comprende un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido con al menos un 90% de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID N.º: 5, SEQ ID N.º: 6, o el polipéptido maduro de SEQ ID N.º: 2 o SEQ ID N.º: 4.
[0251] Una forma de realización de la invención es una composición que comprende un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido con al menos un 91% de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID N.º: 5, SEQ ID N.º: 6, o el polipéptido maduro de SEQ ID N.º: 2 o SEQ ID N.º: 4.
[0252] Una forma de realización de la invención es una composición que comprende un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido con al menos un 92% de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID N.º: 5, SEQ ID N.º: 6, o el polipéptido maduro de SEQ ID N.º: 2 o SEQ ID N.º: 4.
[0253] Una forma de realización de la invención es una composición que comprende un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido con al menos un 93% de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID N.º: 5, SEQ ID N.º: 6, o el polipéptido maduro de SEQ ID N.º: 2 o SEQ ID N.º: 4.
[0254] Una forma de realización de la invención es una composición que comprende un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido con al menos un 94% de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID N.º: 5, SEQ ID N.º: 6, o el polipéptido maduro de SEQ ID N.º: 2 o SEQ ID N.º: 4.
[0255] Una forma de realización de la invención es una composición que comprende un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido con al menos un 95% de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID N.º: 5, SEQ ID N.º: 6, o el polipéptido maduro de SEQ ID N.º: 2 o SEQ ID N.º: 4.
[0256] Una forma de realización de la invención es una composición que comprende un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido con al menos un 96% de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID N.º: 5, SEQ ID N.º: 6, o el polipéptido maduro de SEQ ID N.º: 2 o SEQ ID N.º: 4.
[0257] Una forma de realización de la invención es una composición que comprende un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido con al menos un 97% de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID N.º: 5, SEQ ID N.º: 6, o el polipéptido maduro de SEQ ID N.º: 2 o SEQ ID N.º: 4.
[0258] Una forma de realización de la invención es una composición que comprende un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido con al menos un 98% de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID N.º: 5, SEQ ID N.º: 6, o el polipéptido maduro de SEQ ID N.º: 2 o SEQ ID N.º: 4.
[0259] Una forma de realización de la invención es una composición que comprende un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido con al menos un 99% de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID N.º: 5, SEQ ID N.º: 6, o el polipéptido maduro de SEQ ID N.º: 2 o SEQ ID N.º: 4.
[0260] Una forma de realización de la invención es una composición que comprende un polipéptido o un polipéptido codificado por un polinucleótido con el 100% de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID N.º: 5, SEQ ID N.º: 6, o el polipéptido maduro de SEQ ID N.º: 2 o SEQ ID N.º: 4.
[0261] En un aspecto, la composición comprende o consiste en la secuencia aminoacídica de SEQ ID N.º: 5, SEQ ID N.º: 6, o el polipéptido maduro de SEQ ID N.º: 2 o SEQ ID N.º: 4 o una variante alélica del mismo; o es un fragmento del mismo que tiene actividad de proteasa. En otro aspecto, la composición comprende o consiste en el polipéptido maduro de SEQ ID N.º: 2 o SEQ ID N.º: 4. En otro aspecto, la composición comprende o consiste en el polipéptido de SEQ ID N.º: 5 o SEQ ID N.º: 6. En otro aspecto, la composición comprende o consiste en los aminoácidos 1 a 366 de la SEQ ID N.º: 2, aminoácidos 1 a 366 de la SEQ ID N.º: 4, aminoácidos 1 a 366 de la SEQ ID N.º: 5 o aminoácidos 1 a 366 de la SEQ ID N.º: 6.
[0262] En una forma de realización, la variante que comprende una sustitución, deleción y/o inserción de uno o más (varios) aminoácidos de la SEQ ID N.º: 3 tiene al menos un 60%, por ejemplo, al menos un 70%, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 86%, al menos un 87%, al menos un 88%, al menos un 89%, al menos un 90%, al menos un 91%, al menos un 92%, al menos un 93%, al menos un 94%, al menos un 95%, al menos un 96%, al menos un 97%, al menos un 98%, al menos un 99%, pero menos del 100% de identidad de secuencia con la SEQ ID N.º: 5, SEQ ID N.º: 6, o el polipéptido maduro de SEQ ID N.º: 2 o SEQ ID N.º: 4.
[0263] En una forma de realización preferida, la composición es una composición de pienso para animales que comprende además una o más amilasas, fitasas, xilanasas, galactanasas, alfa-galactosidasas, proteasas, fosfolipasas, beta-glucanasas o cualquier mezcla de las mismas.
[0264] En otra forma de realización preferida, la composición es un aditivo para piensos para animales que comprende, además, al menos una vitamina liposoluble, y/o al menos una vitamina hidrosoluble, y/o al menos un oligoelemento. El aditivo para piensos para animals puede comprender además una o más amilasas, fitasas, xilanasas, galactanasas, alfa-galactosidasas, proteasas, fosfolipasas, beta-glucanasas, o cualquier mezcla de las mismas.
[0265] La composición puede comprender una proteasa de la presente invención como el componente enzimático principal, por ejemplo, una composición monocomponente. Alternativamente, la composición puede comprender actividades enzimáticas múltiples, tales como una aminopeptidasa, amilasa, carbohidrasa, carboxipeptidasa, catalasa, celulasa, quitinasa, cutinasa, ciclodextrina glicosiltransferasa, desoxirribonucleasa, esterasa, alfa-galactosidasa, beta-galactosidasa, glucoamilasa, alfa-glucosidasa, beta-glucosidasa, haloperoxidasa, invertasa, lacasa, lipasa, manosidasa, oxidasa, enzima pectinolítica, peptidoglutaminasa, peroxidasa, fitasa, polifenoloxidasa, enzima proteolítica, ribonucleasa, transglutaminasa o xilanasa. La(s) enzima(s) adicional(es) puede(n) estar producida(s), por ejemplo, por microorganismos tales como bacterias u hongos o por plantas o por animales. Las composiciones se pueden preparar conforme a métodos conocidos en la técnica y pueden estar en forma de un líquido o una composición seca. Por ejemplo, la composición puede estar en forma de un granulado o un microgranulado. La proteasa se puede estabilizar conforme a métodos conocidos en la técnica.
Usos
[0266] La presente invención se dirige también a métodos para utilizar los polipéptidos con actividad de proteasa,
o composiciones de los mismos, por ejemplo, en piensos para animales.
Uso en piensos para animales
[0267] La presente invención se dirige también a métodos para utilizar las proteasas con actividad de proteasa en piensos para animales, así como en composiciones de pienso y aditivos para piensos que comprenden las proteasas de la invención.
[0268] El término animal incluye todos los animales. Ejemplos de animales son no rumiantes y rumiantes. Los animales rumiantes incluyen, por ejemplo, animales tales como ovejas, cabras y ganado, por ejemplo, ganado bovino, vacas y terneros jóvenes. En una forma de realización particular, el animal es un animal no rumiante. Los animales no rumiantes incluyen animales monogástricos, por ejemplo, cerdos o puercos (incluyendo, pero de forma no limitativa, lechones, cerdos en crecimiento y cerdas); aves tales como pavos, patos y pollo (incluyendo, pero de forma no limitativa, pollos de engorde, ponedoras); caballos (incluyendo, pero de forma no limitativa, de sangre caliente, de sangre fría y de sangre tibia), terneros jóvenes; y pescados (incluyendo, pero de forma no limitativa, salmón, trucha, tilapia, siluro y carpas; y crustáceos (incluyendo, pero de forma no limitativa, langostinos y gambas).
[0269] El término pienso o composición de pienso se refiere a cualquier compuesto, preparación, mezcla o composición adecuada para, o destinada para la ingesta por un animal.
[0270] En el uso según la invención, se puede suministrar la proteasa al animal antes, después o simultáneamente con la dieta. Se prefiere lo último.
[0271] En una forma de realización particular, la proteasa, en la forma en que se añade al pienso, o cuando se incluye en un aditivo de pienso, está bien definida. Bien definida significa que la preparación de proteasa es al menos un 50% pura como se determina por cromatografía de exclusión de tamaño (véase el ejemplo 12 de WO 01/58275). En otras formas de realización particulares, la preparación de proteasa es al menos un 60, 70, 80, 85, 88, 90, 92, 94 o al menos un 95% pura como se determina por este método.
[0272] Una preparación de proteasa bien definida es ventajosa. Por ejemplo, es mucho más fácil dosificar correctamente en el pienso una proteasa que está esencialmente libre de interferir o contaminar otras proteasas. El término dosificar correctamente se refiere en particular al objetivo obtener resultados consistentes y constantes, y la capacidad de optimizar la dosificación en función del efecto deseado.
[0273] Para el uso en piensos para animales, sin embargo, la proteasa no necesita ser tan pura; puede, por ejemplo, incluir otras enzimas, en cuyo caso podría denominarse una preparación de proteasa.
[0274] La preparación de proteasa puede ser (a) añadida directamente al pienso (o usada directamente en un proceso de tratamiento de proteínas), o (b) se puede usar en la producción de una o más composiciones intermedias tales como aditivos para piensos o premezclas que se añaden posteriormente al pienso (o se usan en un proceso de tratamiento). El grado de pureza anteriormente descrito se refiere a la pureza de la preparación de proteasa original, independientemente de que se utilice según las opciones anteriores (a) o (b).
[0275] Las preparaciones de proteasa con purezas de este orden de magnitud son obtenibles en particular usando métodos recombinantes de producción, mientras que no se obtienen tan fácilmente y además están sujetas a una variación entre lotes mucho más alta cuando la proteasa se produce por métodos tradicionales de fermentación.
[0276] Tal preparación de proteasa puede, por supuesto, mezclarse con otras enzimas.
[0277] La proteína puede ser una proteína animal, tal como harina de carne y huesos, harina de plumas y/o harina de pescado; o puede ser una proteína vegetal.
[0278] El término proteínas vegetales como se utiliza en la presente se refiere a cualquier compuesto, composición, preparación o mezcla que incluye al menos una proteína derivada de u originada en un vegetal, incluyendo proteínas modificadas y derivados de proteínas. En formas de realización particulares, el contenido proteico de las proteínas vegetales es de al menos un 10, 20, 30, 40, 50 o 60% (p/p).
[0279] Las proteínas vegetales se pueden derivar de fuentes de proteína vegetal, tales como leguminosas y cereales, por ejemplo, materiales de plantas de las familias Fabaceae (Leguminosae), Cruciferaceae, Chenopodiaceae y Poaceae, tales como harina de soja, harina de altramuz y harina de colza.
[0280] En una forma de realización particular, la fuente de proteína vegetal es material de una o más plantas de la familia Fabaceae, por ejemplo, soja, altramuz, guisante o judía.
[0281] En otra forma de realización particular, la fuente de proteína vegetal es material de una o más plantas de la familia Chenopodiaceae, por ejemplo, remolacha, remolacha azucarera, espinaca o quinoa.
[0282] Otros ejemplos de fuentes de proteína vegetal son la colza, semilla de girasol, semilla de algodón y col.
[0283] La soja es una fuente preferida de proteína vegetal.
[0284] Otros ejemplos de fuentes de proteína vegetal son cereales tales como la cebada, el trigo, el centeno, la avena, el maíz, el arroz, el triticale y el sorgo.
[0285] En una forma de realización particular de un proceso de tratamiento, la(s) proteasa(s) en cuestión afecta (o actúa sobre, o ejerce su influencia hidrolítica o de degradación sobre) las proteínas, tales como proteínas vegetales o fuentes de proteína. Para conseguir esto, la proteína o fuente de proteína se suspende típicamente en un solvente, por ejemplo, un solvente acuoso tal como agua, y los valores de pH y de temperatura se ajustan teniendo la debida consideración hacia las características de la enzima en cuestión. Por ejemplo, el tratamiento puede ocurrir a un valor de pH en el que la actividad de la proteasa real es de al menos un 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% o al menos un 90%. Asimismo, por ejemplo, el tratamiento puede ocurrir a una temperatura a la que la actividad de la proteasa real es de al menos un 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% o al menos un 90%. Las indicaciones anteriores de porcentaje de actividad son relativas a las actividades máximas. La reacción enzimática continúa hasta que se consigue el resultado deseado, después de lo cual se puede detener o no inactivando la enzima, por ejemplo, con un paso de tratamiento térmico.
[0286] En otra forma de realización particular de un proceso de tratamiento de la invención, la acción de la proteasa se sostiene, lo que significa, por ejemplo, que la proteasa se añade a las proteínas, pero su influencia hidrolítica no se acciona, por así decirlo, hasta más tarde cuando se desea, una vez se han establecido las condiciones de hidrolización adecuadas, o una vez se han inactivado cualesquiera inhibidores enzimáticos, o cualquier otro medio que se haya aplicado para posponer la acción de la enzima.
[0287] En una forma de realización, el tratamiento es un pretratamiento de piensos para animales o proteínas para el uso en piensos para animales, es decir, las proteínas se hidrolizan antes de la ingesta.
[0288] El término mejora del valor nutricional de un pienso para animales, se refiere a la mejora de la disponibilidad de nutrientes en el pienso. En esta invención, la mejora de los valores nutricionales se refiere en particular a mejorar la disponibilidad de la fracción proteica del pienso, llevando así a la extracción aumentada de proteínas, mayores rendimientos de proteína y/o utilización mejorada de proteínas. Cuando se aumenta el valor nutricional del pienso, aumenta la digestibilidad de proteínas y/o aminoácidos y puede mejorar el índice de crecimiento y/o aumento de peso y/o conversión de pienso (es decir, el peso de pienso ingerido en relación al aumento de peso) del animal.
[0289] La proteasa se puede añadir al pienso en cualquier forma, ya sea como una proteasa relativamente pura
o mezclada con otros componentes destinados a la adición en piensos para animales, es decir, en forma de aditivos para piensos para animales, tales como las denominadas premezclas para piensos para animales.
[0290] En otro aspecto, la presente invención se refiere a composiciones para el uso en piensos para animales, tales como piensos para animales, y aditivos para piensos para animales, por ejemplo, premezclas.
[0291] Aparte de la proteasa de la invención, los aditivos para piensos para animales de la invención contienen al menos una vitamina liposoluble, y/o al menos una vitamina hidrosoluble, y/o al menos un oligoelemento, y/o al menos un macromineral.
[0292] Otros ingredientes opcionales de aditivos para piensos son los agentes colorantes, por ejemplo, carotenoides tales como el beta-caroteno, la astaxantina y la luteína; estabilizadores; aditivos de mejora de crecimiento y compuestos aromáticos/saborizantes, por ejemplo, creosol, anetol, deca-, undeca-y/o dodecalactonas, iononas, irona, gingerol, piperidina, ftalida de propilideno, ftalida de butilideno, capsaicina y/o tanino; péptidos antimicrobianos; ácidos grasos poliinsaturados (AGPI); especies generadoras de oxígeno reactivo; también, se puede utilizar un soporte que puede contener, por ejemplo, 40-50% en peso de fibras de madera, 8-10% en peso de estearina, 4-5% en peso de polvo de cúrcuma, 4-58% en peso de polvo de romero, 22-28% en peso de caliza, 1-3% en peso de una goma, tal como goma arábiga, 5-50% en peso de azúcar y/o almidón y 5-15% en peso de agua.
[0293] Un pienso o un aditivo para piensos de la invención también puede comprender al menos otra enzima seleccionada de entre fitasa (EC 3.1.3.8 o 3.1.3.26); xilanasa (EC 3.2.1.8); galactanasa (EC 3.2.1.89); alfa
galactosidasa (EC 3.2.1.22); proteasa adicional (EC 3.4); fosfolipasa A1 (EC 3.1.1.32); fosfolipasa A2 (EC 3.1.1.4); lisofosfolipasa (EC 3.1.1.5); fosfolipasa C (3.1.4.3); fosfolipasa D (EC 3.1.4.4); amilasa tal como, por ejemplo, alfa-amilasa (EC 3.2.1.1) lisozima (EC 3.2.1.17); y/o beta-glucanasa (EC 3.2.1.4 o EC 3.2.1.6).
[0294] En una forma de realización particular, el pienso o un aditivo para piensos de la invención también comprende una fitasa (EC 3.1.3.8 o 3.1.3.26).
[0295] En una forma de realización particular, el pienso o un aditivo para piensos de la invención también comprende una xilanasa (EC 3.2.1.8).
[0296] Un pienso o un aditivo para piensos de la invención también puede comprender al menos un probiótico o producto microbiano para alimentación directa (DFM) opcionalmente junto con una o más enzimas diferentes seleccionadas de entre fitasa (EC 3.1.3.8 o 3.1.3.26); xilanasa (EC 3.2.1.8); galactanasa (EC 3.2.1.89); alfagalactosidasa (EC 3.2.1.22); proteasa adicional (EC 3.4), fosfolipasa A1 (EC 3.1.1.32); fosfolipasa A2 (EC 3.1.1.4); lisofosfolipasa (EC 3.1.1.5); fosfolipasa C (3.1.4.3); fosfolipasa D (EC 3.1.4.4); amilasa tal como, por ejemplo, alfa-amilasa (EC 3.2.1.1); y/o beta-glucanasa (EC 3.2.1.4 o EC 3.2.1.6).
[0297] El producto microbiano para alimentación directa puede ser una bacteria de uno o más de los siguientes géneros: Lactobacillus, Lactococcus, Streptococcus, Bacillus, Pediococcus, Enterococcus, Leuconostoc, Carnobacterium, Propionibacterium, Bifidobacterium, Clostridium y Megasphaera o cualquier combinación de los mismos, preferiblemente de Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, Enterococcus faecium, Enterococcus spp, y Pediococcus spp, Lactobacillus spp, Bifidobacterium spp, Lactobacillus acidophilus, Pediococsus acidilactici, Lactococcus lactis, Bifidobacterium bifidum, Propionibacterium thoenii, Lactobacillus farciminus, lactobacillus rhamnosus, Clostridium butyricum, Bifidobacterium animalis ssp. animalis, Lactobacillus reuteri, Bacillus cereus, Lactobacillus salivarius ssp. salivarius, Megasphaera elsdenii, Propionibacteria sp y más preferiblemente de las cepas de Bacillus subtilis 3A-P4 (PTA-6506); 15A-P4 (PTA6507); 22C-P1 (PTA-6508); 2084 (NRRL B-500130); LSSA01 (NRRL-B-50104); BS27 (NRRL B-501 05); BS 18 (NRRL B-50633); y BS 278 (NRRL B-50634).
[0298] En una forma de realización particular estas otras enzimas están bien definidas (como se ha definido anteriormente para preparaciones de proteasa).
[0299] Ejemplos de péptidos antimicrobianos (PAM) son CAP18, leucocina A, tritrpticina, protegrina-1, tanatina, defensina, lactoferrina, lactoferricina y ovispirina tal como novispirina (Robert Lehrer, 2000), plectasinas y estatinas, incluyendo los compuestos y polipéptidos descritos en WO 03/044049 y WO 03/048148, así como variantes o fragmentos de los anteriores que retienen actividad antimicrobiana.
[0300] Ejemplos de polipéptidos antifúngicos (PAF) son los péptidos de Aspergillus giganteus y Aspergillus niger, así como variantes y fragmentos de los mismos que retienen actividad antifúngica, como se describe en WO 94/01459 y WO 02/090384.
[0301] Ejemplos de ácidos grasos poliinsaturados son ácidos grasos C18, C20 y C22 poliinsaturados, tales como el ácido araquidónico, ácido docosahexaenoico, ácido eicosapentanoico y ácido gammalinolénico.
[0302] Ejemplos de especies generadoras de oxígeno reactivo son productos químicos tales como perborato, persulfato o percarbonato; y enzimas tales como una oxidasa, una oxigenasa o una sintetasa.
[0303] Por lo general, vitaminas lipo-e hidrosolubles, así como oligoelementos forman parte de lo que se denomina una premezcla destinada a la adición al pienso, mientras que los macrominerales se añaden normalmente por separado al pienso. Cualquiera de estos tipos de composición, cuando se enriquecen con una proteasa de la invención, es un aditivo para piensos para animales de la invención.
[0304] En una forma de realización particular, el aditivo para piensos para animales de la invención está destinado a ser incluido (o prescrito como que debe incluirse) en dietas o piensos para animales en cantidades de 0,01 a 10,0%; más particularmente de 0,05 a 5,0%; o de 0,2 a 1,0% (% se refiere a g de aditivo por 100 g de pienso). Esto es así en particular para las premezclas.
[0305] Las siguientes son listas no exclusivas de ejemplos de estos componentes: Ejemplos de vitaminas liposolubles son la vitamina A, la vitamina D3, la vitamina E y la vitamina K, por ejemplo, la vitamina K3.
[0306] Ejemplos de vitaminas hidrosolubles son la vitamina B12, la biotina y la colina, la vitamina B1, la vitamina B2, la vitamina B6, la niacina, el ácido fólico y el pantotenato, por ejemplo, el Ca-D-pantotenato.
[0307] Ejemplos de oligoelementos son manganeso, zinc, hierro, cobre, yodo, selenio y cobalto.
[0308] Ejemplos de macrominerales son calcio, fósforo y sodio.
[0309] Los requisitos nutricionales de estos componentes (ejemplificados con aves y lechones/cerdos) se enumeran en la tabla A de WO 01/58275. El requisito nutricional se refiere a que estos componentes deberían ser proporcionados en la dieta en las concentraciones indicadas.
[0310] En la alternativa, el aditivo para piensos para animales de la invención comprende al menos uno de los componentes individuales especificados en la tabla A de WO 01/58275. Al menos uno se refiere cualquiera de uno o más de, uno, o dos, o tres, o cuatro y así sucesivamente hasta los trece, o hasta los quince componentes individuales. Más específicamente, este al menos un componente individual se incluye en el aditivo de la invención en una cantidad tal que proporcione una concentración en el pienso dentro del intervalo indicado en la columna cuatro, o la columna cinco, o la columna seis de la tabla A.
[0311] En una forma de realización adicional más, el aditivo para piensos para animales de la invención comprende al menos una de las vitaminas siguientes, preferiblemente para proporcionar una concentración en pienso dentro de los intervalos especificados en la tabla 1 siguiente (para dietas para lechones y dietas para pollos de engorde, respectivamente).
Tabla 1: Recomendaciones típicas de vitaminas
Vitamina
Dieta de lechón Dieta de pollo de engorde
Vitamina A
10.000-15.000 IU/kg de pienso 8-12.500 IU/kg de pienso
Vitamina D3
1800-2000 IU/kg de pienso 3000-5000 IU/kg de pienso
Vitamina E
60-100 mg/kg de pienso 150-240 mg/kg de pienso
Vitamina K3
2-4 mg/kg de pienso 2-4 mg/kg de pienso
Vitamina B1
2-4 mg/kg de pienso 2-3 mg/kg de pienso
Vitamina B2
6-10 mg/kg de pienso 7-9 mg/kg de pienso
Vitamina B6
4-8 mg/kg de pienso 3-6 mg/kg de pienso
Vitamina B12
0,03-0,05 mg/kg de pienso 0,015-0,04 mg/kg de pienso
Niacina (Vitamina B3)
30-50 mg/kg de pienso 50-80 mg/kg de pienso
Ácido pantoténico
20-40 mg/kg de pienso 10-18 mg/kg de pienso
Ácido fólico
1-2 mg/kg de pienso 1-2 mg/kg de pienso
Biotina
0,15-0,4 mg/kg de pienso 0,15-0,3 mg/kg de pienso
Cloruro de colina
200-400 mg/kg de pienso 300-600 mg/kg de pienso
[0312] La presente invención también se refiere a composiciones de piensos para animales. Las composiciones de piensos o dietas para animales tienen un contenido relativamente alto de proteína. Las dietas para aves y para cerdos se pueden caracterizar como se indica en la tabla B de WO 01/58275, columnas 2-3. Las dietas para pescado se pueden caracterizar como se indica en la columna 4 de esta tabla B. Además, tales dietas para pescado tienen normalmente un contenido de grasa bruta de 200-310 g/kg.
[0313] WO 01/58275 corresponde a US 09/779334 que se incorpora en la presente para referencia.
[0314] Una composición de pienso para animales según la invención tiene un contenido de proteína bruta de 50800 g/kg y comprende además al menos una proteasa como se reivindica en la presente.
[0315] Además, o en la alternativa (al contenido de proteína bruta indicado arriba), la composición de pienso para animales de la invención tiene un contenido de energía metabolizable de 10-30 MJ/kg; y/o un contenido de calcio de 0,1-200 g/kg; y/o un contenido de fósforo disponible de 0,1-200 g/kg; y/o un contenido de metionina de 0,1100 g/kg; y/o un contenido de metionina más cisteína de 0,1-150 g/kg; y/o un contenido de lisina de 0,5-50 g/kg.
[0316] En formas de realización particulares, el contenido de energía metabolizable, proteína bruta, calcio, fósforo, metionina, metionina más cisteína, y/o lisina está dentro de cualquiera de los intervalos 2, 3, 4 o 5 de la tabla B de WO 01/58275 (R. 2-5).
[0317] La proteína bruta se calcula como nitrógeno (N) multiplicado por un factor 6,25, es decir, proteína bruta (g/kg) = N (g/kg) x 6,25. El contenido de nitrógeno se determina por el método de Kjeldahl (A.O.A.C., 1984, Official Methods of Analysis 14ª ed., Association of Official Analytical Chemists, Washington DC).
[0318] La energía metabolizable se puede calcular basándose en la publicación del NRC Nutrient requirements in swine, ninth revised edition 1988, subcommittee on swine nutrition, committee on animal nutrition, board of agriculture, national research council. National Academy Press, Washington, D.C., págs. 2-6, y la European Table of Energy Values for Poultry Feed-stuffs, Spelderholt centre for poultry research and extension, 7361 DA Beekbergen, Países Bajos. Grafisch bedrijf Ponsen & looijen bv, Wageningen. ISBN 90-71463-12-5.
[0319] El contenido dietético de calcio, fósforo disponible y aminoácidos en dietas para animales completas se calcula basándose en tablas de alimentación tales como Veevoedertabel 1997, gegevens over chemische samenstelling, verteerbaarheid en voederwaarde van voedermiddelen, Central Veevoederbureau, Runderweg 6, 8219 pk Lelystad. ISBN 90-72839-13-7.
[0320] En una forma de realización particular, la composición de pienso para animales de la invención contiene al menos una proteína vegetal tal como se ha definido anteriormente.
[0321] La composición de pienso para animales de la invención también puede contener proteína animal, tal como harina de carne y huesos, harina de plumas y/o harina de pescado, típicamente en una cantidad de 0-25%. La composición de pienso para animales de la invención también puede comprender granos secos de destilería con solubles (DDGS), típicamente en cantidades de 0-30%.
[0322] En otras formas de realización particulares adicionales, la composición de pienso para animales de la invención contiene 0-80% de maíz; y/o 0-80% de sorgo; y/o 0-70% de trigo; y/o 0-70% de cebada; y/o 0-30% de avena; y/o 0-40% de harina de soja; y/o 0-25% de harina de pescado; y/o 0-25% de harina de carne y huesos; y/o 0-20% de suero de leche.
[0323] Las dietas para animales pueden, por ejemplo, fabricarse como pienso triturado (no granulado) o pienso granulado. Típicamente, se mezclan los piensos molidos y cantidades suficientes de vitaminas esenciales y se añaden minerales según las especificaciones para la especie en cuestión. Las enzimas se pueden añadir como formulaciones enzimáticas sólidas o líquidas. Por ejemplo, para el pienso triturado se puede añadir una formulación enzimática sólida o líquida antes o durante el paso de mezcla de ingredientes. Para pienso granulado la preparación (líquida o sólida) de proteasa/enzima también se puede añadir antes o durante el paso de alimentación de ingredientes. Típicamente una preparación líquida de proteasa/enzima se añade después del paso de granulación. La enzima también se puede incorporar en un aditivo para piensos o premezcla.
[0324] La concentración enzimática final en la dieta está dentro del intervalo de 0,01-200 mg de proteína enzimática por kg de dieta, por ejemplo, en el intervalo de 0,5-25 mg de proteína enzimática por kg de dieta animal.
[0325] La proteasa debe aplicarse, por supuesto, en una cantidad efectiva, es decir, en una cantidad adecuada para mejorar la hidrólisis, la digestibilidad y/o mejorar el valor nutricional del pienso. Actualmente, se contempla que la enzima se administre en una o más de las siguientes cantidades (intervalos de dosificación): 0,01-200; 0,01-100; 0,5-100; 1-50; 5-100; 10-100; 0,05-50; o 0,10-10 -todos estos intervalos están en mg de proteína proteasa por kg de pienso (ppm).
[0326] Para la determinación de mg de proteína proteasa por kg de pienso, la proteasa se purifica a partir de la composición de pienso, y la actividad específica de la proteasa purificada se determina usando un ensayo relevante (veáse en actividad de proteasa, sustratos y ensayos). La actividad de proteasa de la composición de pienso como tal también se determina usando el mismo ensayo, y basándose en estas dos determinaciones, se calcula la dosificación en mg de proteína proteasa por kg de pienso.
[0327] Los mismos principios se aplican para la determinación de mg de proteína proteasa en aditivos para piensos. Por supuesto, si una muestra de la proteasa usada está disponible para la preparación del aditivo para piensos o el pienso, la actividad específica se determina a partir de esta muestra (no es necesario purificar la proteasa de la composición de pienso o el aditivo).
Constructos de ácido nucleico, vectores de expresión, células huésped recombinantes y métodos para laproducción de proteasas
[0328] La presente invención también se refiere a constructos de ácido nucleico, vectores de expresión y células huésped recombinantes que comprenden tales polinucleótidos codificantes de las proteasas de la invención.
[0329] La presente invención también se refiere a métodos de producción de una proteasa, que comprenden: (a) el cultivo de una célula huésped recombinante que comprende tal polinucleótido; y (b) la recuperación de la proteína.
[0330] La proteína puede ser nativa o heteróloga a una célula huésped. No se pretende en la presente que el término "proteína" haga referencia a una longitud específica del producto codificado y, por lo tanto, abarca péptidos, oligopéptidos y proteínas. El término "proteína" también abarca dos o más polipéptidos combinados para formar el producto codificado. Las proteínas también incluyen polipéptidos híbridos y polipéptidos fusionados.
[0331] Preferiblemente, la proteína es una proteasa. Por ejemplo, la proteína puede ser una hidrolasa, tal como una enzima proteolítica o proteasa.
[0332] El gen se puede obtener de cualquier fuente procariótica, eucariota o de otro tipo.
[0333] La presente invención se describe más detalladamente con los ejemplos siguientes que no deberían interpretarse como limitativos del alcance de la invención.
EJEMPLOS
Materiales y métodos
Medios
[0334] El medio DAP4C-1 estaba compuesto por 0,5 g de extracto de levadura, 10 g de maltosa, 20 g de dextrosa, 11 g de sulfato de magnesio heptahidratado, 1 g de fosfato dipotásico, 2 g ácido cítrico monohidratado, 5,2 g de fosfato de potasio tribásico monohidratado, 1 ml de Dowfax 63N10 (sustancia antiespumante), 2,5 g de carbonato cálcico, suplementado con 1 ml de disolución de metales KU6, y agua desionizada hasta 1000 ml.
[0335] La disolución de metales KU6 estaba compuesta por 6,8 g de ZnCl2, 2,5 g de CuSO4.5H2O, 0,13 g NiCl2,13,9 g de FeSO4.7H2O, 8,45 g de MnSO4.H2O, 3 g de C6H8O7.H2O,y agua desionizada hasta 1000 ml.
[0336] Las placas LB estaban compuestas por 10 g de Bacto-triptona, 5 g de extracto de levadura, 10 g de cloruro sódico, 15 g de Bacto-agar y agua desionizada hasta 1000 ml.
[0337] El medio LB estaba compuesto por 10 g de Bacto-triptona, 5 g de extracto de levadura y 10 g de cloruro sódico, y agua desionizada hasta 1000 ml.
[0338] Las placas COVE-Sacarosa-T estaban compuestas por 342 g de sacarosa, 20 g de polvo de agar, 20 ml de solución salina COVE y agua desionizada hasta 1000 ml. El medio fue esterilizado por autoclave a 15 psi durante 15 minutos (Bacteriological Analytical Manual, 8ª edición, Revisión A, 1998). El medio se enfrió a 60°C y se añadió 10 mM de acetamida, Tritón X-100 (50 µl/500 ml).
[0339] Los tubos COVE-N-Agar estaban compuestos por 218 g de sorbitol, 10 g de dextrosa, 2,02 g de KNO3, 25 g de agar, 50 ml de solución salina Cove y agua desionizada hasta 1000 ml.
[0340] La solución salina COVE estaba compuesta por 26 g de MgSO4·7H2O, 26 g de KCl, 26 g de KH2PO4, 50 ml de solución de metales traza COVE y agua desionizada hasta 1000 ml.
[0341] La solución de metales traza COVE estaba compuesto por 0,04 g de Na2B4O7·10H2O, 0,4 g de CuSO4·5H2O, 1,2 g de FeSO4·7H2O, 0,7 g de MnSO4·H2O, 0,8 g de Na2MoO4·2H2O, 10 g de ZnSO4·7H2O y agua desionizada hasta 1000 ml.
Ensayos de proteasa
Ensayo cinético Suc-AAPF-pNA:
[0342]
Sustrato pNA: Suc-AAPF-pNA (Bachem L-1400).
Temperatura: Temperatura ambiente (25°C)
Tampones de ensayo: 100 mM de ácido succínico, 100 mM de HEPES, 100 mM de CHES, 100 mM de
CABS, 1 mM de CaCl2,150 mM de KCl, 0,01% de Tritón X-100 ajustado a valores de
pH 2,0, 3,0, 4,0, 5,0, 6,0, 7,0, 8,0, 9,0, 10,0 y 11,0 con HCl o NaOH.
[0343] Se mezclaron 20 µl de muestra de proteasa (diluida en 0,01% de Tritón X-100) con 100 µl de tampón de ensayo. El ensayo se comenzó añadiendo 100 µl de sustrato pNA (50 mg disueltos en 1,0 ml de DMSO y diluido adicionalmente 45x con 0,01% de Tritón X-100). El aumento en OD405 se monitoreó como una medida de la actividad de proteasa.
Ensayo de punto final Suc-AAPF-pNA:
[0344]
Sustrato pNA: Suc-AAPF-pNA (Bachem L-1400).
Temperatura: controlada (temperatura de ensayo).
Tampón de ensayo: 100 mM de ácido succínico, 100 mM de HEPES, 100 mM de CHES, 100 mM de CABS, 1 mM de CaCl2,150 mM de KCl, 0,01% de Tritón X-100, pH 4,0
[0345] 200 µl de sustrato pNA (50 mg disueltos en 1,0 ml de DMSO y diluido adicionalmente 45x con el tampón de ensayo) se pipetearon en un tubo Eppendorf y colocados en hielo. Se añadieron 20 µl de muestra de proteasa (diluida en 0,01% de Tritón X-100). El ensayo se inició transfiriendo el tubo Eppendorf a un termomezclador Eppendorf, que se ajustó a la temperatura de ensayo. El tubo se incubó durante 15 minutos en el termomezclador Eppendorf a su velocidad de agitación máxima (1400 rpm). La incubación se detuvo transfiriendo el tubo de nuevo al baño de hielo y añadiendo 600 µl de 500 mM de H3BO3/NaOH, pH 9,7. El tubo se mezcló y se transfirieron 200 µl de mezcla a una placa de microtitulación, que se leyó a OD405. Se incluyó un tampón ciego en el ensayo (en vez de enzima). OD405 (muestra) -OD405 (ciego) fue una medida de actividad de proteasa.
Ensayo Protazyme AK:
[0346]
Sustrato: comprimido Protazyme AK (caseína reticulada y teñida; de Megazyme)
Temperatura: controlada (temperatura de ensayo).
Tampón de ensayo: 100 mM de ácido succínico, 100 mM de HEPES, 100 mM de CHES, 100 mM de CABS, 1 mM de CaCl2, 150 mM de KCl, 0,01% de Tritón X-100, pH 6,5.
[0347] Un comprimido Protazyme AK se suspendió en 2,0 ml de 0,01% de Tritón X-100 por agitación suave. 500 µl de esta suspensión y 500 µl de tampón de ensayo se dispensaron en un tubo Eppendorf y se colocaron en hielo. Se añadieron 20 µl de muestra de proteasa (diluida en 0,01% de Tritón X-100). El ensayo se inició transfiriendo el tubo Eppendorf para un termomezclador Eppendorf, que se ajustó a la temperatura de ensayo. El tubo se incubó durante 15 minutos en el termomezclador Eppendorf a su velocidad de agitación máxima (1400 rpm). La incubación se detuvo transfiriendo el tubo de nuevo al baño de hielo. Luego el tubo se centrifugó en una centrífuga helada durante unos pocos minutos y se transfirieron 200 µl de sobrenadante a una placa de microtitulación, que se leyó a OD650. Se incluyó un tampón ciego en el ensayo (en vez de enzima). OD650 (muestra) -OD650 (ciego) fue una medida de actividad de proteasa.
Ensayo cinético Suc-AAPX-pNA:
[0348]
Sustratos pNA
: Suc-AAPA-pNA (Bachem L-1775)
Suc-AAPR-pNA (Bachem L-1720)
Suc-AAPD-pNA (Bachem L-1835)
Suc-AAPI-pNA (Bachem L-1790)
Suc-AAPM-pNA (Bachem L-1395)
Suc-AAPV-pNA (Bachem L-1770)
Suc-AAPL-pNA (Bachem L-1390)
Suc-AAPE-pNA (Bachem L-1710)
Suc-AAPK-pNA (Bachem L-1725)
Suc-AAPF-pNA (Bachem L-1400)
Temperatura
: temperatura ambiente (25°C)
Tampón de ensayo
: 100 mM de ácido succínico, 100 mM de HEPES, 100 mM de CHES, 100 mM de CABS, 1 mM de CaCl2, 150 mM de KCl, 0,01% de Tritón X-100, pH 4,0 o pH 9,0.
[0349] Se mezclaron 20 µl de proteasa (diluida en 0,01% de Tritón X-100) con 100 µl de tampón de ensayo. El ensayo se comenzó añadiendo 100 µl de sustrato pNA (50 mg disueltos en 1,0 ml DMSO y diluido adicionalmente 45x con 0,01% de Tritón X-100). El aumento en OD405 se monitoreó como una medida de la actividad de proteasa.
Ensayo o-ftaldialdehído (OPA):
[0350] Este ensayo detecta aminas primarias y, por lo tanto, la escisión de enlaces peptídicos por una proteasa se puede medir como la diferencia en la absorbancia entre una muestra tratada con proteasa y una muestra de control. El ensayo se lleva a cabo esencialmente según Nielsen et al. (Nielsen, PM, Petersen, D, Dampmann, C. Improved method for determining food protein degree of hydrolysis. J Food Sci, 2001, 66: 642-646).
[0351] 500 µl de muestra se filtra a través de un filtro de centrífuga Microcon de 100 kDa (60 min, 11.000 rpm, 5°C). Las muestras se diluyen apropiadamente (por ejemplo, 10, 50 o 100 veces) en agua desionizada y 25 µl de cada muestra se carga en una placa de microtitulación de 96 pocillos (5 réplicas). Se dispensan 200 µl de reactivo OPA (100 mM de tetraborato de disodio decahidratado, 3,5 mM de dodecilsulfato sódico (SDS), 5,7 mM de ditiotreitol (DDT), 6 mM de o-ftaldialdehído) en todos los pocillos, la placa se agita (10 seg, 750 rpm) y absorbancia medida a 340 nm.
Cepa
[0352] La cepa Meripilus giganteus se aisló a partir de un cuerpo fructífero recogido en Dinamarca en 1993 por Novozymes.
[0353] Una cepa interna de Trametes cf. versicolor identificada por secuenciación ITS (espaciador transcrito interno) se usó como la fuente del gen de la proteasa de SEQ ID N.º: 15.
[0354] Una segunda cepa de Trametes vesicolor secuenciada por Genome Canada (www.fungalgenomics.ca) se usó para identificar el gen de la proteasa de SEQ ID N.º: 20.
[0355] La cepa de Escherichia coli Top-10 comprada a Invitrogen (Life Technologies, Carlsbad, CA, EE.UU.) se usó para propagar los vectores de expresión.
[0356] La cepa de Aspergillus oryzae MT3568 se usó para la expresión heteróloga del gen codificante de los polipéptidos que tienen homología con los polipéptidos con actividad de proteasa. A. oryzae MT3568 es un derivado génico alterado de amdS (acetamidasa) de Aspergillus oryzae JaL355 (WO 2002/40694) en el que se restauró la auxotrofia pyrG mediante la interrupción del gen de la acetamidasa de A. oryzae (amdS) con el gen pyrG.
Ejemplo 1: expresión recombinante de la proteasa S53 3 de Meripilus giganteus (SEQ ID N.º: 3)
[0357] Para obtener material para probar y caracterizar la proteasa S53 3 de Meripilus giganteus, la secuencia de ADN de SEQ ID N.º: 1 se clonó en un vector de expresión de Aspergillus y se expresó en Aspergillus oryzae.
[0358] El gen de la proteasa S53 3 de Meripilus giganteus se subclonó en el vector de expresión de Aspergillus pMStr100 (WO 10/009400) mediante la amplificación de la región codificante sin el codón de parada del ADN en la SEQ ID N.º: 1 desde el clon de plásmido de ADNc, pA2PR22, con técnicas de PCR estándares utilizando los cebadores siguientes:
597 TAGGGATCCTCACGATGGTCGCCACCAGCT (SEQ ID N.º: 13)
598 CAGGCCGACCGCGGTGAG (SEQ ID N.º: 14)
[0359] El producto de PCR se restringió con BamHI y se ligó a los sitios BamHI y Nrul de pMStr100, dando como resultado una fusión en marco con la secuencia de etiqueta C-terminal RHQHQHQH(parada) en el vector de expresión. El gen de la proteasa S53 3 en el constructo de expresión de Aspergillus resultante, pMStr121, se secuenció, y se confirmó que la porción codificante de la proteasa de la secuencia concuerda con la secuencia codificante original de SEQ ID N.º: 1. La fusión en marco a la secuencia codificante de la etiqueta se confirmó también, dando como resultado la secuencia en SEQ ID N.º: 3, que codifica la secuencia peptídica en SEQ ID N.º: 4.
[0360] La cepa de Aspergillus oryzae BECh2 (WO 00/39322) se transformó con pMStr121 utilizando técnicas estándares como se describe en Christensen et al., 1988, Biotechnology 6,1419-1422 y WO 04/032648. Para identificar los transformantes que producen la proteasa recombinante, se cultivaron los transformantes y BECh2 en 10 ml de medio YP + 2% de glucosa a 30°C y 200 RPM. Las muestras se tomaron después de 3 días de crecimiento y se resolvieron con SDS-PAGE para identificar la producción de proteasa recombinante. Se observó una banda nueva entre 35 y 50 kDa en los cultivos de transformantes que no se observó en cultivos de BECh2 no transformados. Varios transformantes que parecía que expresaban la proteasa recombinante en cantidades altas se cultivaron adicionalmente en 100 ml de medio YP + 2% de glucosa en 500 ml en matraces de agitación a 30°C y 200 RPM. Las muestras se tomaron después de 2, 3 y 4 días de crecimiento y niveles de expresión comparados resolviendo las muestras con SDS-PAGE. Un único transformante que expresó la proteasa recombinante a niveles relativamente altos se seleccionó y se designó EXP01737. EXP01737 se aisló dos veces por dilución de conidias en medio selectivo que contenía 0,01% de TRITON® X-100 para limitar el tamaño de colonia y se fermentó en medio YP + 2% de glucosa en matraces de agitación como se ha descrito anteriormente para proporcionar material para la purificación. Los cultivos de los matraces de agitación se cosecharon después de 4 días de crecimiento y los micelios fúngicos se eliminaron por filtración del caldo de fermentación a través de Miracloth (Calbiochem) y purificados luego como se describe en el ejemplo 2.
Medio YP + 2% de glucosa
[0361]
10 g de extracto de levadura
20 g de peptona
Agua hasta 1L
Autoclavar a 121°C, 20 minutos
Añadir 100 ml de solución estéril de glucosa al 20%
Ejemplo 2: purificación de la proteasa S53 3 de Meripilus giganteus con etiqueta HQ C-terminal
[0362] El caldo de cultivo se centrifugó (20000 x g, 20 min) y el sobrenadante se decantó cuidadosamente del precipitado. El sobrenadante se filtró a través de una unidad de filtración Nalgene de 0,2 µm para eliminar el resto de células huésped de Aspergillus. El filtrado de 0,2 µm se transfirió a 10 mM de ácido succínico/NaOH, pH 3,5 en una columna Sefadex G25 (de GE Healthcare). La enzima transferida a Sefadex G25 se aplicó a una columna Q-sefarosa FF (de GE Healthcare) equilibrada en 10 mM de ácido succínico/NaOH, pH 3,5. El producto filtrado y lavado con 10 mM de ácido succínico/NaOH, pH 3,5 se recogió y contenía la proteasa S53 (actividad confirmada utilizando el ensayo cinético Suc-AAPF-pNA a pH 4). El pH de la fracción filtrada y lavada se ajustó a pH 3,25 con 1M de HCI mientras se mezclaba la fracción concienzudamente. La solución ajustada al pH se aplicó a una columna SP-sefarosa FF (de GE Healthcare) equilibrada en 10 mM de ácido succínico/NaOH, pH 3,25. Después de lavar la columna extensivamente con el tampón de equilibrado, la proteasa se eluyó con un gradiente lineal de NaCl (0 --> 0,5 M) en el mismo tampón en diez volúmenes de columna. Las fracciones de la columna se analizaron para determinar la actividad de proteasa (utilizando el ensayo cinético Suc-AAPF-pNA a pH 4) y se agruparon las fracciones pico. El sulfato de amonio sólido se añadió al conjunto a una concentración final de (NH4)2SO4 de 2,0 M. La solución enzimática se aplicó a una columna fenil-Toyopearl (de TosoHaas) equilibrada en 10 mM de ácido succínico/NaOH, 2,0 M de (NH4)2SO4, pH 3,25. Después de lavar la columna
extensivamente con el tampón de equilibrado, la proteasa S53 se eluyó con un gradiente lineal entre el tampón de equilibrado y 10 mM de ácido succínico/NaOH, pH 3,25 en diez volúmenes de columna. Las fracciones de la columna se analizaron para determinar la actividad de proteasa (utilizando el ensayo cinético Suc-AAPF-pNA a pH 4). Las fracciones con actividad alta se agruparon y transfirieron a 10 mM de ácido succínico/NaOH, pH 3,5 en una columna Sefadex G25 (de GE Healthcare). La proteasa transferida a Sefadex G25 se aplicó a una columna SP-sefarosa HP (de GE Healthcare) equilibrada en 10 mM de ácido succínico/NaOH, pH 3,5. Después de lavar la columna extensivamente con el tampón de equilibrado, la proteasa se eluyó con un gradiente lineal de NaCl (0 --> 0,5 M) en el mismo tampón en cinco volúmenes de columna. Las fracciones que constituyen el pico principal de la columna se agruparon como producto purificado. El producto purificado se analizó por SDS-PAGE y se observó una banda principal en el gel y tres bandas menores. La secuenciación de EDMAN N-terminal de las bandas mostró que todas las bandas estaban relacionadas con la proteasa S53 y, por lo tanto, esperamos que las bandas menores representen el corte de alguna de las moléculas de proteasa S53. El producto purificado se usó para la caracterización adicional.
Ejemplo 3: caracterización de la proteasa S53 3 de Meripilus giganteus con etiqueta HQ C-terminal
[0363] El ensayo cinético Suc-AAPF-pNA se usó para obtener el perfil de actividad en función del pH y el perfil de estabilidad en función del pH (actividad residual tras 2 horas a los valores de pH indicados). Para el perfil de estabilidad en función del pH la proteasa se diluyó 10x en los diferentes tampones de ensayo para alcanzar los valores de pH de estos tampones y luego se incubó durante 2 horas a 37°C. Tras la incubación, el pH de las incubaciones de proteasa se transfirió al mismo valor de pH, antes del ensayo para determinar la actividad residual, por dilución en el tampón de ensayo de pH 4,0. El ensayo de punto final Suc-AAPF-pNA se usó para la obtención del perfil de actividad en función de la temperatura a pH 4,0. El ensayo cinético Suc-AAPX-pNA y diez sustratos Suc-AAPX-pNA diferentes se usaron para la obtención de la especificidad por P1 de la enzima a pH 4,0.
[0364] Los resultados se muestran en las tablas 2-5 a continuación. Los datos para la proteasa 10R se incluyen en las tablas. Para la tabla 2, las actividades son relativas al pH óptimo para las enzimas. Para la tabla 3, las actividades son actividades residuales con respecto a muestras, que se mantuvieron en condiciones estables (5°C, pH 4,0 para la proteasa S53 3 de Meripilus giganteus (del ejemplo 2); 5°C, pH 9,0 para la proteasa 10R). Para la tabla 4, las actividades son relativas a la temperatura óptima para la enzima (pH 4,0 para la proteasa S53 3 de Meripilus giganteus (del ejemplo 2); pH 6,5 para la proteasa 10R). Para la tabla 5, las actividades son relativas al mejor sustrato para las enzimas (Suc-AAPL-pNA para la proteasa S53 3 de Meripilus giganteus (del ejemplo 2)). El ensayo Protazyme AK se usó para la obtención del perfil de temperatura-actividad a pH de 6,5 para la proteasa 10R.
[0365] La actividad en función del pH en el sustrato Suc-AAPF-pNA, el perfil de estabilidad en función del pH (actividad residual tras 2 horas a 37°C), el perfil de actividad en función de la temperatura en Suc-AAPF-pNA a pH 4,0 y la especificidad por P1 en 10 sustratos Suc-AAPF-pNA a pH 4,0 para la proteasa S53 3 de Meripilus giganteus (del ejemplo 2) comparada con los datos para la proteasa 10R también se muestan en las figuras 1-4. Para la proteasa 10R, el perfil de actividad en función de la temperatura está en Protazyme AK a pH 6,5 y la especificidad por P1 está a pH 9,0.
Tabla 2: perfil de actividad en función del pH a 25°C como se determina utilizando el ensayo cinético Suc-AAPF
pNA
pH
Proteasa S53 3 de Meripilus giganteus (del ejemplo 2) Proteasa 10R
2
0,38 -
3
0,95 0,00
4
1,00 0,02
5
0,27 0,07
6
0,02 0,21
7
0,00 0,44
8
0,00 0,67
9
0,00 0,88
10
0,00 1,00
11
0,00 0,93
Tabla 3: perfil de estabilidad en función del pH (actividad residual tras 2 horas a 37°C) como se determina utilizando el ensayo cinético Suc-AAPF-pNA
pH
Proteasa S53 3 de Meripilus giganteus (del ejemplo 2) Proteasa 10R
2
0,01 0,78
3
0,99 1,03
4
0,96 0,99
5
0,94 1,00
6
0,87 1,03
7
0,69 1,01
8
0,01 0,98
9
0,01 0,99
10
0,01 0,99
11
0,01 0,86
Tras 2 horas a 5 °C
1,00 (a pH 4) 1,00 (a pH 9)
Tabla 4: perfil de actividad de temperatura a pH 4,0 o pH 6,5 como se determina utilizando el ensayo de punto final Suc-AAPF-pNA
Temp (°C)
Proteasa S53 3 de Meripilus giganteus (del ejemplo 2, pH 4) Proteasa 10R (pH 6,5)
15
0,07 0,01
25
0,23 0,02
37
0,58 0,06
50
1,00 0,13
60
0,44 0,35
70
0,08 0,96
80
- 1,00
90
- 0,18
Tabla 5: especificidad por P1 en 10 sustratos Suc-AAPX-pNA a pH 4,0 o pH 9,0 a 37°C como se determina utilizando el ensayo cinético Suc-AAPX-pNA 5
Suc-AAPX-pNA
Proteasa S53 3 de Meripilus giganteus (del ejemplo 2, pH 4) Proteasa 10R (pH 9)
Suc-AAPA-pNA
0,01 0,13
Suc-AAPR-pNA
0,00 0,09
Suc-AAPD-pNA
0,06 0,00
Suc-AAPI-pNA
0,00 0,00
Suc-AAPM-pNA
0,53 0,78
Suc-AAPV-pNA
0,00 0,01
Suc-AAPL-pNA
1,00 0,18
Suc-AAPE-pNA
0,05 0,00
Suc-AAPK-pNA
0,00 0,08
Suc-AAPF-pNA
0,99 1,00
Otras características para la Proteasa S53 3 de Meripilus giganteus (del ejemplo 2)
[0366] La determinación de la secuencia N-terminal fue: AIPASCASTI.
[0367] El peso molecular relativo como se determina por SDS-PAGE fue aprox. Mr = 43 kDa.
Confirmación de etiqueta HQ C-terminal unida a la secuencia madura
[0368] Esta muestra fue tampón intercambiado con 50 mM de tampón de acetato sódico pH 5,5 que utiliza una unidad de ultrafiltración Vivaspin equipada con un filtro de corte de 10 kDa. Después del intercambio de tampón, se añadieron 2 µL de endoglicosidasa H y se incubó la muestra luego a 5°C durante toda la noche. Nota: para cada sitio unido a N deglicosilado permanece un residuo N-acetil hexosamina en la cadena principal de la proteína que aumenta el peso molecular con 203,19 Da por sitio. La muestra se analizó luego por espectrometría de masas.
[0369] El peso molecular determinado por análisis de peso molecular intacto del pico principal fue: 38088,6 Da, que corresponde a 1,8 Da de la secuencia madura más -RHQHQ más una acetilhexosamina única y un residuo de cisteína no reticulado.
[0370] El peso molecular determinado por análisis de peso molecular intacto del pico secundario fue: 37961 Da, que se corresponde con 2,3 Da de la secuencia madura más -RHQH más una acetil hexosamina única y un residuo de cisteína no reticulado.
[0371] La secuencia madura (a partir de datos de secuenciación de EDMAN N-terminal y análisis de peso molecular intacto):
[0372] El peso molecular calculado de esta secuencia madura es 37882,6 Da.
Ejemplo 4: ensayo de actividad de harina de maíz y soja
[0373] Un ensayo de punto final que usa harina de maíz y soja como sustrato se usó para la obtención del perfil de actividad de las proteasas a pH 3-7.
Sustrato: harina de soja -harina de maíz mezclado en una proporción de 30:70. Tampones de ensayo: se preparon 9 tampones conteniendo 100 mM de ácido succínico, 100 mM de HEPES, 100 mM de CHES, 100 mM de CAPS, 1 mM de CaCl2, 150 mM de KCI, 0,01% de Tritón X-100 y ajustados usando HCI o NaOH a un valor de pH tal que después de que se haya mezclado el sustrato de harina de soja-maíz (1 g) con tampón de ensayo (10 mL) para dar una suspensión, el pH final de la suspensión fue uno de los siguientes pH: 3,0, 4,0, 5,0, 6,0, 7,0, 8,0, 9,0, 10,0 y 11,0.
[0374] La suspensión de sustrato (2 ml) se mezcló durante 30 min antes de la adición de proteasa e incubada durante 3 horas a 40°C (500 rpm). La proteasa (200 mg de proteína enzimática/kg de sustancia seca) se disolvió en 100 µl de 100 mM de tampón de acetato sódico (9,565 g/L de NaOAc, 1,75 g/L de ácido acético, 5 mM de CaCl2, 0,01% de BSA, 0,01% de Tween20, pH 6,0) y añadida. Las muestras se centrifugaron (10 min, 4000 rpm, 0°C) y los sobrenadantes se recogieron para análisis utilizando el ensayo o-ftaldialdehído (OPA).
[0375] Los resultados se muestran en la tabla 6 a continuación. La actividad proteolítica de la proteasa S53 3 de Meripilus giganteus (del ejemplo 2) en la harina de maíz y soja está en su máximo a pH de 3 y se reduce con pH creciente. A pH 5, la proteasa S53 3 de Meripilus giganteus (del ejemplo 2) es tan activa en la harina de maíz y
soja como la proteasa 10R, mientras que a pH 3 y pH 4 la proteasa S53 3 de Meripilus giganteus (del ejemplo 2) es mucho más activa que la proteasa 10R. Estos resultados indican que la proteasa S53 3 de Meripilus giganteus (del ejemplo 2) podría ser eficaz para obtener hidrólisis de proteína en el tubo digestivo superior de animales monogastricos tales como, por ejemplo, cerdos y aves, conduciendo a la utilización mejorada de proteínas de pienso en estas especies.
Tabla 6: actividad de proteasa (OD340 x factor de dilución) en harina de maíz y soja a pH de 3,0, 4,0, 5,0, 6,0 y
7,0
pH
Proteasa S53 3 de Meripilus giganteus (del ejemplo 2) Proteasa 10R
Media
Desviación estándar Media Desviación estándar
3,0
3,02 0,08 0,22 0,06
4,0
1,31 0,06 0,30 0,10
5,0
0,64 0,03 0,71 0,01
6,0
0,19 0,04 1,81 0,14
7,0
0,02 0,04 2,92 0,11
La figura 5 muestra la actividad (OD340 x factor de dilución) en la harina de maíz y soja de la proteasa S53 3 de Meripilus giganteus (del ejemplo 2) en comparación con la proteasa 10R.
Ejemplo 5: actividad proteolítica en digestas de buche, molleja e íleon de pollos de engorde
[0376] Se recogió el material de las digestas de buche, molleja e íleon de pollos de engorde de 21 días alimentados con una dieta de maíz-soja; se liofilizó y molido utilizando un molinillo de café pequeño. Las muestras molidas se suspendieron (47% p/v) en los siguientes tampones y se dejaron hidratar a 4°C durante toda la noche (sin agitación):
Tampón de buche:
100 mM HEPES, 1 mM CaCl2·2 H2O, 150 mM KCI, 0,01% Tritón X-100, ajustado a pH 5 usando HCI
Tampón de molleja:
100 mM ácido succínico, 1 mM CaCl2·2 H2O, 150 mM KCI, 0,01% Tritón X-100, ajustado a pH 1,67 usando HCI
Tampón de íleon:
100 mM HEPES, 1 mM CaCl2·2 H2O, 150 mM KCI, 0,01% Tritón X-100, ajustado a pH 7,2 usando HCI
[0377] El pH resultante fue: pH 5 en las muestras de buche; pH 3 en las muestras de molleja; y pH 7 en las muestras de íleon. Las suspensiones se calentaron a 40°C y se dispensó 1 ml en tubos mantenidos a 40°C. Tres tubos representando el blanco (T0) se centrifugaron inmediatamente (3000 x g, 0°C, 10 min) y los sobrenadantes se congelaron. O la enzima (200 mg de proteína enzimática/kg de sustrato) en 50 µL de 100 mM tampón de acetato sódico (9,565 g/l NaOAc, 1,75 g/l ácido acético, 5 mM CaCl2, 0,01% BSA, 0,01% Tween20, pH 6,0) o solo tampón de acetato sódico (50 µL) para las muestras blanco se añadió a los tubos y muestras de buche e íleon se incubaron durante 3 horas (T3) mientras que las muestras de molleja se incubaron durante 1 hora (T1) a 40°C en agitación (500 rpm). Las muestras se centrifugaron (3000 x g, 0°C, 10 min) y los sobrenadantes se recuperaron y se congelaron. La actividad proteolítica se determinó mediante análisis de aminas primarias utilizando el ensayo o-ftaldialdehído (OPA).
[0378] Los resultados se muestran en la tabla 7. Para cada uno de los tipos de digesta (buche, molleja e íleon) hubo una diferencia significativa entre el nivel de aminas primarias en la muestra blanco T0 y las muestras blanco se incubaron durante 1 o 3 horas. Esta diferencia se puede asignar a la actividad de proteasas presente en el sustrato y originada de las materias primas de la dieta o el animal. Durante la incubación de las digestas de buche y de molleja, la proteasa S53 3 de Meripilus giganteus (del ejemplo 2) aumentó adicionalmente el nivel de aminas primarias en comparación con la muestra blanco, que demuestra que la proteasa tenía una actividad proteolítica en este sustrato bajo las condiciones dadas. La proteasa S53 3 de Meripilus giganteus (del ejemplo 2) funcionó significativamente mejor durante la incubación de buche y molleja que la proteasa 10R, indicación de que la proteasa S53 3 de Meripilus giganteus (del ejemplo 2) podría ser más eficaz para la hidrólisis de proteínas de pienso en el tubo digestivo superior de aves, conduciendo a una digestibilidad de proteína mejorada. Como se esperaba, la proteasa S53 3 de Meripilus giganteus (del ejemplo 2) no aumentó significativamente el nivel de aminas libres durante la incubación de íleon a pH 7.
Tabla 7: actividad proteolítica de la proteasa S53 3 de Meripilus giganteus (del ejemplo 2) en comparación con la proteasa 10R cuando se incuba con digesta de pollos de engorde y expresada como nivel de aminas primarias medido por el ensayo OPA (OD340 x factor de dilución)
Tratamiento
Buche (3 horas) Molleja (1 hora) Íleon (3 horas)
Blanco (T0)
2,21 ± 0,02d 2,95 ± 0,02c 9,37 ± 0,08c
Blanco
3,54 ± 0,02c 3,94 ± 0,08b 14,40 ± 0,66ab
Proteasa S53 3 de Meripilus giganteus (del ejemplo 2)
4,13 ± 0,03a 4,37 ± 0,05a 14,20 ± 0,19ab
Proteasa 10R
3,85 ± 0,07b 3,87 ± 0,21b 14,74 ± 0,15a
a,b,cLos valores dentro de una columna que no están conectadas por las mismas letras en superíndice son diferentes estadísticamente como se determina por el test de Tukey Kramer (α = 0,05) proporcionadas por el procedimiento ANOVA (SAS Institute Inc.).
[0379] La figura 6 muestra el nivel de aminas libres (OD340 x factor de dilución) en muestras blanco T0, muestras blanco y muestras incubadas con la proteasa S53 3 de Meripilus giganteus (del ejemplo 2) o la proteasa 10R. El sustrato para la incubación fue material de digestas del buche, molleja o íleon de pollos de engorde.
Ejemplo 6: termoestabilidad
[0380] Una alícuota de la muestra de proteína de proteasa (purificada como se describe en el ejemplo 2 o 12) o bien se desala o se cambia de tampón en 20 mM de acetato de Na, pH 4,0 utilizando una columna PD-10 preempaquetada o bien se dializa contra 2 x 500 ml 20 mM de acetato de Na, pH 4,0 a 4°C en un paso de 2-3h seguido de un paso durante toda la noche. La muestra se filtra a 0,45 µm y se diluye con tampón hasta aprox. 2 unidades A280. El tampón de diálisis se usa como referencia en la calorimetría diferencial de barrido (DSC). Las muestras se desgasifican usando aspiración al vacío y agitación durante aprox. 10 minutos.
[0381] Se realiza un barrido DSC en un calorímetro VP-DSC de MicroCal a una velocidad de barrido constante de 1,5 °C/min de 20-90 °C. El manejo de datos se realiza utilizando el software Origin de MicroCal (versión 4.10), y la temperatura de desnaturalización, Td (también llamada temperatura de fusión, Tm) se define como la temperatura en el ápice del pico en el termograma.
Ejemplo 7: estabilidad de vapor
[0382] La actividad residual de la proteasa después de tratar con vapor se puede evaluar utilizando el ensayo siguiente.
[0383] En estos experimentos se usa una configuración modificada con la cual se proporciona el vapor a partir de un generador de vapor y llevado a la caja. Las muestras colocadas en una placa se insertan en la caja a través de un cajón cuando la temperatura ha alcanzado aprox. 93-94°C. Tras la inserción de las muestras la temperatura cae a 4 °C. La incubación se realiza durante 30 segundos mientras la temperatura permanece aproximadamente constante a 90°C. Luego la placa se retira rápidamente desde la caja, las muestras se colocan en hielo, se resuspenden y se evalúan respecto a la actividad de proteasa usando, por ejemplo, el ensayo SucAAPF-pNA u o-ftaldialdehído (OPA). Cada muestra de enzima se compara con una muestra similar que no ha sido tratada con vapor para calcular la actividad residual.
Ejemplo 8: pruebas de estabilidad de granulación
[0384] La granulación enzimática se realiza de una manera como se describe en la patente de EE.UU n.º 4,106,991, ejemplo 1. El granulado obtenido se seca en un lecho fluido hasta un contenido de agua inferior a un 1% y se tamiza para obtener un producto con el intervalo de partícula de 250 µm a 850 µm. Finalmente, el producto se recubre con aceite de palma y carbonato cálcico de la manera como se describe en la patente de EE.UU. Nº. 4,106,991, ejemplo 22.
[0385] Aproximadamente 50 g de granulado enzimático se premezcla con 10 kg de pienso durante 10 minutos en un mezclador horizontal pequeño. Esta premezcla se mezcla con 90 kg de pienso durante 10 minutos en un mezclador horizontal mayor. Desde el mezclador, el pienso se lleva al acondicionador (un mezclador de cascada
con inyección de vapor) a una velocidad de aproximadamente 300 kg/hora. El acondicionador calienta el pienso a 95°C (medido en la salida) por vapor de inyección. El periodo de permanencia en el acondicionador es de 30 segundos. Desde el acondicionador, el pienso se lleva a una prensa Simon Heesen equipada con un troquel horizontal de 3,0x35 mm y se prensa en gránulos con una longitud de alrededor de 15 mm. Después de la prensa, los gránulos se colocan en un refrigerador de aire y se enfrian durante 15 minutos.
[0386] La actividad de proteasa se mide utilizando el ensayo Suc-AAPF-pNA antes de la granulación y en los gránulos de pienso después de la granulación. La estabilidad de granulación se determina por comparación de la actividad de proteasa en el pienso granulado respecto a la actividad en el pienso no granulado.
Ejemplo 9: clonación de dos genes de proteasa de Trametes cf. versicolor y Trametes versicolor
[0387] Basándose en las secuencias de gen identificadas, la SEQ ID N.º: 15 de una cepa de Trametes cf. versicolor (veáse la sección de cepa) y la SEQ ID N.º: 20 de una cepa de Trametes versicolor (veáse la sección de cepa) se diseñaron dos secuencias de ADN codificantes (CDS) sintéticas con optimización de codón para la expresión en Aspergillus oryzae (SEQ ID N.º: 17 y SEQ ID N.º: 22, respectivamente). Esas dos secuencias CDS se sintetizaron por GeneArt® (Life Technologies, Carlsbad, CA, EE.UU.) en un vector pMA-T en una escala de 5 µg con dos sitios flanqueantes BamHI en 5' y HindIII en 3' compatibles con el vector de expresión pDAu109 (WO 2005042735). 1 µg de esos plásmidos se digirieron posteriormente con las enzimas de restricción BamHI y HindIII de NEB (New England Biolabs, Frankfurt am Main, Alemania) siguiendo las recomendaciones del fabricante, y los fragmentos resultantes se separan por electroforesis en gel de agarosa al 1% usando tampón TAE. El fragmento de 1,7 kb correspondiente a los genes de proteasa sintéticos se escindieron del gel y se purificaron utilizando un kit de GFX® PCR DNA y Gel Band Purification (GE Healthcare, Hillerød, Dinamarca) siguiendo las instrucciones del fabricante. 100 ng de aquellos insertos se clonaron en el vector de expresión pDAu109 (WO 2005042735) previamente digeridos con BamHI e HindIII por ligamiento con una ligasa T4 de NEB (New England Biolabs, Frankfurt am Main, Alemania) siguiendo las instrucciones del fabricante.
[0388] Un volumen de 2,5 µl de la mezcla de ligamiento diluida se usó para transformar células de E. coli TOP10 competentes químicamente (Life Technologies, Carlsbad, CA, EE.UU.). Se seleccionaron tres colonias de placas de agar LB conteniendo 100 µg de ampicilina por ml para cada constructo y se cultivaron durante toda la noche en 3 ml de medio LB suplementado con 100 µg de ampicilina por ml. El plásmido de ADN se purificó utilizando un kit Qiagen Spin Miniprep (Cat. 27106) (QIAGEN GmbH, Hilden, Alemania) según las instrucciones del fabricante. Las secuencias sintéticas de proteasa de Trametes cf. versicolor y Trametes versicolor se verificaron por secuenciación de Sanger antes de la expresión heteróloga. Los plásmidos designados como MDQM0673-1 y MDQM0584-1 (reteniendo las CDS SEQ ID N.º: 17 y SEQ ID N.º: 22, respectivamente) se seleccionaron para la transformación de protoplastos y la expresión heteróloga de sus proteasas codificadas en una célula huésped de Aspergillus oryzae MT3568 (descritas en el capítulo de cepa).
Ejemplo 10: transformación de Aspergillus oryzae con el gen que codifica las proteasas de Trametes cf. versicolor y Trametes versicolor y selección de los mejores transformantes
[0389] Los protoplastos de Aspergillus oryzae MT3568 (veáse capítulo de cepas) se preparon según WO 95/002043. Cien µl de protoplastos se mezclaron con 2,5-10 µg de cualquiera de los vectores de expresión de Aspergillus MDQM0673-1 y MDQM0584-1 (ejemplo 9), 250 µl de 60% de PEG 4000 (Applichem, Darmstadt, Alemania) (polietilenoglicol, peso molecular 4.000), 10 mM de CaCl2 y 10 mM de Tris-HCl pH 7,5 y se mezclaron suavemente. La mezcla se incubó a 37°C durante 30 minutos y los protoplastos se extendieron sobre placas COVE para la selección. Tras la incubación durante 4-7 días a 37°C, las esporas de ocho transformantes se inocularon en 0,5 ml de medio DAP4C-1 suplementado con ácido láctico y con fosfato de diamonio en placas de 96 pocillos profundos. Tras 4 días de cultivo a 30°C, los caldos de cultivo se analizaron por SDS-PAGE usando gel Novex® de tris-glicina al 4-20% (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, EE.UU) para identificar los transformantes que producien la mayor cantidad de proteasa recombinante de Trametes versicolor.
[0390] Basándose en la intensidad de banda del gel SDS-PAGE, las esporas del mejor transformante se extendieron en placas COVE-Sacarosa-T conteniendo 0,01% TRITON® X-100 para aislar colonias individuales. La extensión se repitió dos veces en total en placas COVE-Sacarosa-T, y luego una colonia individual se extendió en un tubo COVE-N-Agar hasta la esporulación.
Ejemplo 11: fermentación de Aspergillus oryzae transformado con el gen codificante de las proteasas de Trametes cf. versicolor y Tramete versicolor
[0391] 150 ml de medio DAP4C-1 suplementado con 5 ml de ácido láctico al 20% y 3,5 ml de fosfato de diamonio al 50% y las esporas de los mejores transformantes se cultivaron en matraces de agitación durante 4 días a una
temperatura de 30°C en agitación a 100 rpm. Los caldos de cultivo se cosecharon por filtración utilizando un dispositivo de filtro de 0,2 µm y se usaron para caracterización adicional.
Ejemplo 12: purificación de la proteasa S53 1 de Trametes cf versicolor
[0392] El caldo de cultivo se centrifugó (20000 x g, 20 min) y el sobrenadante se decantó cuidadosamente desde el precipitado. El sobrenadante se filtró a través de una unidad de filtración Nalgene de 0,2 µm para eliminar el resto de las células huésped de Aspergillus. El filtrado de 0,2 µm se transfirió a 10 mM de ácido succínico/NaOH, pH 3,5 en una columna Sefadex G25 (de GE Healthcare). La enzima transferida a Sefadex G25 se aplicó a una columna SP-sefarosa FF (de GE Healthcare) equilibrada en 10 mM de ácido succínico/NaOH, pH 3,5. Después de lavar la columna extensivamente con el tampón de equilibrado, la proteasa se eluyó con un gradiente lineal de NaCl (0 --> 1,0 M) en el mismo tampón en diez volúmenes de columna. Las fracciones de la columna se analizaron para determinar la actividad de proteasa (utilizando el ensayo cinético Suc-AAPF-pNA a pH 4) y se analizaron fracciones pico por SDS-PAGE. Las fracciones con solo una banda en el gel SDS-PAGE teñido con coomassie se agruparon como el producto purificado. El producto purificado se usó para caracterización adicional.
Ejemplo 13: caracterización de la proteasa S53 1 de Trametes cf versicolor (SEQ ID N.º: 19)
[0393] El ensayo cinético Suc-AAPF-pNA se usó para obtener el perfil de actividad en función del pH. El ensayo de punto final Suc-AAPF-pNA se usó para obtener el perfil de estabilidad en función del pH (actividad residual tras 2 horas a los valores de pH indicados) y el perfil de temperatura-actividad a pH de 4,0. Para el perfil de estabilidad en función del pH, la proteasa se diluyó 7x en los diferentes tampones de ensayo para alcanzar los valores de pH de estos tampones y luego se incubó durante 2 horas a 37°C. Tras la incubación, el pH de las incubaciones de proteasa se transfirió al mismo valor de pH, antes del ensayo para determinar la actividad residual, por dilución en el tampón de ensayo de pH 4,0. Se usaron el ensayo cinético Suc-AAPX-pNA y diez sustratos Suc-AAPX-pNA diferentes para la obtención de la especificidad por P1 de la enzima a pH 4,0.
[0394] Los resultados se muestran en las tablas 8-11 siguientes. Los datos para la proteasa S53 3 de Meripilus giganteus (del ejemplo 2) y la proteasa 10R se incluyen en las tablas. Para la tabla 8, las actividades son relativas al pH óptimo para las enzimas. Para la tabla 9, las actividades son actividades residuales con respecto a muestras, que se mantuvieron en condiciones estables (5°C, pH 4,0). Para la tabla 10, las actividades son relativas a la temperatura óptima a pH 4,0 para la enzima. Para la tabla 11, las actividades son relativas al mejor sustrato para las enzimas (Suc-AAPL-pNA para la proteasa S53 1 de Trametes cf versicolor).
Tabla 8: perfil de actividad-pH a 25°C como se determina utilizando el ensayo cinético Suc-AAPF-pNA
pH
Proteasa S53 1 de Trametes cf versicolor (del ejemplo 12) Proteasa S53 3 de Meripilus giganteus (del ejemplo 2) Proteasa 10R
2
0,00 0,38 -
3
0,75 0,95 0,00
4
1,00 1,00 0,02
5
0,32 0,27 0,07
6
0,02 0,02 0,21
7
0,00 0,00 0,44
8
0,00 0,00 0,67
9
0,00 0,00 0,88
10
0,00 0,00 1,00
11
0,00 0,00 0,93
cinético Suc-AAPF-pNA
pH
Proteasa S53 1 de Trametes cf versicolor (del ejemplo 12) Proteasa S53 3 de Meripilus giganteus (del ejemplo 2) Proteasa 10R
2
0,01 0,01 0,78
3
0,31 0,99 1,03
4
0,94 0,96 0,99
5
0,92 0,94 1,00
6
0,10 0,87 1,03
7
0,03 0,69 1,01
8
0,01 0,01 0,98
9
0,01 0,01 0,99
10
0,01 0,01 0,99
11
0,00 0,01 0,86
Tras 2 horas a 5 °C
1,00 (a pH 4) 1,00 (a pH 4) 1,00 (a pH 9)

Tabla 10: perfil de temperatura actividad pH 4,0 o pH 6,5 como se determina utilizando el ensayo de punto final Suc-AAPF-pNA
Temp (°C)
Proteasa S53 1 de Trametes cf versicolor (del ejemplo 12, pH 4) Proteasa S53 3 de Meripilus giganteus (del ejemplo 2, pH 4) Protease 10R (pH 6,5)
15
0,16 0,07 0,01
25
0,36 0,23 0,02
37
1,00 0,58 0,06
50
0,79 1,00 0,13
60
0,16 0,44 0,35
70
0,08 0,08 0,96
80
- - 1,00
90
- - 0,18

Tabla 11: especificidad por P1 en 10 sustratos Suc-AAPX-pNA a pH 4,0 o pH 9,0 a 37°C como se determina utilizando el ensayo cinético Suc-AAPX-pNA
Suc-AAPXpNA
Proteasa S53 1 de Trametes cf versicolor (del ejemplo 12, pH 4) Proteasa S53 3 de Meripilus giganteus (del ejemplo 2, pH 4) Proteasa 10R (pH 9)
Suc-AAPA-pNA
0,01 0,01 0,13
Suc-AAPR-pNA
0,00 0,00 0,09
Suc-AAPD-pNA
0,04 0,06 0,00
Suc-AAPI-pNA
0,00 0,00 0,00
Suc-AAPM-pNA
0,46 0,53 0,78
Suc-AAPV-pNA
0,00 0,00 0,01
Suc-AAPL-pNA
1,00 1,00 0,18
Suc-AAPE-pNA
0,03 0,05 0,00
Suc-AAPK-pNA
0,00 0,00 0,08
Suc-AAPF-pNA
0,81 0,99 1,00
[0395] La actividad en función del pH en el sustrato Suc-AAPF-pNA, el perfil de estabilidad en función del pH (actividad residual tras 2 horas a 37°C), el perfil de actividad en función de la temperatura en Suc-AAPF-pNA a pH 4,0 y la especificidad por P1 en 10 sustratos Suc-AAPF-pNA a pH 4,0 para la proteasa S53 1 de Trametes cf versicolor comparados con los datos para la proteasa S53 3 de Meripilus giganteus se muestran también en las
5 figuras 1-4 siguientes.
Otras características para la proteasa S53 1 de Trametes cf versicolor
[0396] La determinación de la secuencia N-terminal fue: AIPASCASTI.
[0397] El peso molecular relativo como se determina por SDS-PAGE fue aprox. Mr = 42 kDa.
Confirmación de la secuencia madura para la proteasa S53 1 de Trametes cf versicolor
10 [0398] La muestra purificada se intercambió de tampón con 50 mM de tampón de acetato sódico a pH 5,5 utilizando una unidad de ultrafiltración Vivaspin equipada con un filtro de corte de 10 kDa. Después del intercambio de tampón, se añadió endoglicosidasa H y la muestra se incubó a 30°C durante 3 horas. Nota: para cada sitio N-enlazado deglicosilado un residuo de N-acetil hexosamina permanece en el esqueleto de proteína que aumenta el peso molecular con 203,19 Da por sitio. La muestra se analizó luego por espectrometría de
15 masas.
[0399] El peso molecular determinado por análisis de peso molecular intacto del pico principal fue: 37467,6 Da, que se corresponde con 0,41 Da de la secuencia madura más una acetil hexosamina única y un residuo de cisteína no reticulada. La secuencia madura (a partir de datos de secuenciación de EDMAN N-terminal y datos de Intact MS):
El peso molecular calculado de esta secuencia madura es 37263,0 Da. LISTADO DE SECUENCIAS [0400]
<110> Novozymes A/S
<120> USO DE POLIPÉPTIDOS CON ACTIVIDAD DE PROTEASA EN PIENSOS PARA ANIMALES
<130> 12355-WO-PCT 30 <150> EP 12183079.8
<151> 2012-09-05
<160> 25
<170> versión de PatentIn 3.5
<210> 1
<211> 1847 5 <212> ADN
<213> Meripilus giganteus
<220>
<221> CDS
<222> (11)..(1702)
<220>
<221> sig_peptide15 <222> (11)..(61)
<220>
<221> mat_peptide
<222> (605)..(1702)
<400> 1
ctcgaacacg atg gtc gcc acc agc ttg ctc gtt gcc tcc cta ttc acg 49 Met Val Ala Thr Ser Leu Leu Val Ala Ser Leu Phe Thr 25 -195 -190
ctc gcc ctc ggc acg ccg acg ggt cgc aac ctc aag ctg cac gag 94 Leu Ala Leu Gly Thr Pro Thr Gly Arg Asn Leu Lys Leu His Glu-185 -180 -175
gcg cgc gaa gac ctt cct gcc ggt ttc tcg ctg cgc ggc gcc gcc 139 Ala Arg Glu Asp Leu Pro Ala Gly Phe Ser Leu Arg Gly Ala Ala-170 -165 -160
35 tcg ccc gac acg acg ctg aag ctc cgc atc gcg ctc gtg cag aac 184 Ser Pro Asp Thr Thr Leu Lys Leu Arg Ile Ala Leu Val Gln Asn -155 -150 -145
aac ttc gcc gag ctc gaa gac aag ctc tac gac gtc agc aca ccg 229 Asn Phe Ala Glu Leu Glu Asp Lys Leu Tyr Asp Val Ser Thr Pro -140 -135 -130
tcc agc gcc aac tac ggc aac cac ctc tcg aag gaa gag gtt gag 274 Ser Ser Ala Asn Tyr Gly Asn His Leu Ser Lys Glu Glu Val Glu 45 -125 -120 -115
cag tac att gct ccg gct ccc gag agc gtg aaa gcc gtg aat gcc 319 Gln Tyr Ile Ala Pro Ala Pro Glu Ser Val Lys Ala Val Asn Ala -110 -105 -100
tgg ctc acc gag aac gga ctc gac gcg cac acc att tcg ccc gcc ggc 367 Trp Leu Thr Glu Asn Gly Leu Asp Ala His Thr Ile Ser Pro Ala Gly-95 -90 -85 -80
55 gac tgg ctc gca ttc gag gtc ccc gtc agc aag gcg aat gag ctc ttc 415 Asp Trp Leu Ala Phe Glu Val Pro Val Ser Lys Ala Asn Glu Leu Phe-75 -70 -65
gac gcc gac ttc tcc gtg ttt acc cac gat gag tcc ggc ctc gag gct 463 Asp Ala Asp Phe Ser Val Phe Thr His Asp Glu Ser Gly Leu Glu Ala-60 -55 -50
atc cgg acg ctg gcc tac tcc atc cct gct gag ctt cag gga cac ctc 511 Ile Arg Thr Leu Ala Tyr Ser Ile Pro Ala Glu Leu Gln Gly His Leu65 -45 -40 -35
gac ctt gtt cac ccc acc gtc acg ttc ccg aac ccc aat gcg cac ctg 559 Asp Leu Val His Pro Thr Val Thr Phe Pro Asn Pro Asn Ala His Leu-30 -25 -20
5
ccc gtc gtg cgc tcc acc cag ccc atc cgg aac ctg acc gga cgt gctPro Val Val Arg Ser Thr Gln Pro Ile Arg Asn Leu Thr Gly Arg Ala -15 -10 -5 -1 1 ata ccg gcc tct tgc gcg agc acc atc acc cct gcg tgc ttg cag gccIle Pro Ala Ser Cys Ala Ser Thr Ile Thr Pro Ala Cys Leu Gln Ala 5 10 15 607 655
atc tac ggt atc ccc acc acc aag gct act cag tcc tcg aac aag ctcIle Tyr Gly Ile Pro Thr Thr Lys Ala Thr Gln Ser Ser Asn Lys Leu20 25 30
703
15
gct gtc agc ggc ttc atc gac cag ttt gcg aac aag gct gac ctg aagAla Val Ser Gly Phe Ile Asp Gln Phe Ala Asn Lys Ala Asp Leu Lys35 40 45 751
tca ttc ctg gcc cag ttc cgc aaa gac atc tca tcc tcc acg act ttcSer Phe Leu Ala Gln Phe Arg Lys Asp Ile Ser Ser Ser Thr Thr Phe50 55 60 65
799
25
tcg ctt cag act ctc gat ggt gga gag aac gac cag agc cct agc gagSer Leu Gln Thr Leu Asp Gly Gly Glu Asn Asp Gln Ser Pro Ser Glu70 75 80 gcg ggt atc gag gct aac ttg gat atc cag tac acc gtc ggc ctc gcc Ala Gly Ile Glu Ala Asn Leu Asp Ile Gln Tyr Thr Val Gly Leu Ala85 90 95 847 895
acg ggc gtc cct acc acg ttc atc tcc gtc ggc gac gac ttc cag gat Thr Gly Val Pro Thr Thr Phe Ile Ser Val Gly Asp Asp Phe Gln Asp100 105 110
943
35
ggc aac ttg gag ggc ttc ctg gac atc atc aac ttc ttg ctc ggc gagGly Asn Leu Glu Gly Phe Leu Asp Ile Ile Asn Phe Leu Leu Gly Glu 115 120 125 991
agc aac ccg ccg cag gtc ctc acc acc agt tac ggc cag aac gag aacSer Asn Pro Pro Gln Val Leu Thr Thr Ser Tyr Gly Gln Asn Glu Asn 130 135 140 145
1039
45
acg atc tcg gcc aag ctt gct aac caa ctt tgc aat gcg tac gct cagThr Ile Ser Ala Lys Leu Ala Asn Gln Leu Cys Asn Ala Tyr Ala Gln150 155 160 ctc ggc gcg cgc ggc acc tct atc ctc ttc gcg tcg ggt gat ggc ggtLeu Gly Ala Arg Gly Thr Ser Ile Leu Phe Ala Ser Gly Asp Gly Gly165 170 175 1087 1135
gtg tcc ggc tcg cag tcc gcg cac tgc agc aat ttt gtc ccg aca ttcVal Ser Gly Ser Gln Ser Ala His Cys Ser Asn Phe Val Pro Thr Phe180 185 190
1183
55
ccc tcc ggc tgc ccc ttc atg act tcc gtc ggc gcg acg cag ggc gtcPro Ser Gly Cys Pro Phe Met Thr Ser Val Gly Ala Thr Gln Gly Val195 200 205 1231
agc ccc gag act gcc gcc gcc ttc tca tcc ggc ggc ttc tcg aac gtg Ser Pro Glu Thr Ala Ala Ala Phe Ser Ser Gly Gly Phe Ser Asn Val210 215 220 225
1279
65
ttc ggc atc ccg tcg tac cag gct tcc gcg gtc agc ggc tac ctg tcc Phe Gly Ile Pro Ser Tyr Gln Ala Ser Ala Val Ser Gly Tyr Leu Ser230 235 240 gcg ctc gga agc acg aac tcg ggc aag ttc aac cgc agc gga cgc ggaAla Leu Gly Ser Thr Asn Ser Gly Lys Phe Asn Arg Ser Gly Arg Gly245 250 255 1327 1375
ttc ccc gac gtc tcc acg caa ggc gtg gac ttc cag atc gtc agc ggcPhe Pro Asp Val Ser Thr Gln Gly Val Asp Phe Gln Ile Val Ser Gly 260 265 270
1423
5
ggc cag acg atc ggc gtc gac ggc acg agc tgc gcc agc ccg acg ttcGly Gln Thr Ile Gly Val Asp Gly Thr Ser Cys Ala Ser Pro Thr Phe 275 280 285 1471
gcg agc gtc atc tcg ctg gta aac gac cgc ctc atc gcg gcc ggc aagAla Ser Val Ile Ser Leu Val Asn Asp Arg Leu Ile Ala Ala Gly Lys290 295 300 305
1519
15
agc ccg ctc ggc ttc ctg aac ccc ttc ctg tac tcg tcg gcg ggc aagSer Pro Leu Gly Phe Leu Asn Pro Phe Leu Tyr Ser Ser Ala Gly Lys310 315 320 1567
gcc gcg ctc aac gac gtc acg agt ggc tcg aac cct ggc tgc agc acgAla Ala Leu Asn Asp Val Thr Ser Gly Ser Asn Pro Gly Cys Ser Thr325 330 335
1615
aac ggc ttc ccc gct aag gcc ggc tgg gac ccg gtc act ggt ctt ggcAsn Gly Phe Pro Ala Lys Ala Gly Trp Asp Pro Val Thr Gly Leu Gly340 345 350
1663
25
acg ccc aac ttt gcc aag ctc ctc acc gcg gtc ggc ctg tgaatgtgga Thr Pro Asn Phe Ala Lys Leu Leu Thr Ala Val Gly Leu355 360 365 1712
35
cgaaatacaa gaacgtggaa cgatgtgcac agtcagaagg aatgatcgcg cagtggcggt gtactattgt agatgtacgg gcaaagatgt acaccttttt agcagtcaaa atgtaaacgt gtttgcgtct ggctt <210> 2 <211> 564 <212> PRT <213> Meripilus giganteus <400> 2 1772 1832 1847
45
Met Val Ala Thr Ser Leu Leu Val Ala Ser Leu Phe Thr Leu Ala -195 -190 -185
Leu Gly Thr Pro Thr Gly Arg Asn Leu Lys Leu His Glu Ala Arg-180 -175 -170
Glu Asp Leu Pro Ala Gly Phe Ser Leu Arg Gly Ala Ala Ser Pro -165 -160 -155
55
Asp Thr Thr Leu Lys Leu Arg Ile Ala Leu Val Gln Asn Asn Phe -150 -145 -140
Ala Glu Leu Glu Asp Lys Leu Tyr Asp Val Ser Thr Pro Ser Ser -135 -130 -125
65
Ala Asn Tyr Gly Asn His Leu Ser Lys Glu Glu Val Glu Gln Tyr-120 -115 -110
Ile Ala Pro Ala Pro Glu Ser Val Lys Ala Val Asn Ala Trp Leu Thr-105 -100 -95
Glu Asn Gly Leu Asp Ala His Thr Ile Ser Pro Ala Gly Asp Trp Leu-90 -85 -80
Ala Phe Glu Val Pro Val Ser Lys Ala Asn Glu Leu Phe Asp Ala Asp-75 -70 -65
Phe Ser Val Phe Thr His Asp Glu Ser Gly Leu Glu Ala Ile Arg Thr-60 -55 -50 -45
Leu Ala Tyr Ser Ile Pro Ala Glu Leu Gln Gly His Leu Asp Leu Val15 -40 -35 -30
His Pro Thr Val Thr Phe Pro Asn Pro Asn Ala His Leu Pro Val Val -25 -20 -15
Arg Ser Thr Gln Pro Ile Arg Asn Leu Thr Gly Arg Ala Ile Pro Ala-10 -5 -1 1
25 Ser Cys Ala Ser Thr Ile Thr Pro Ala Cys Leu Gln Ala Ile Tyr Gly5 10 15 20
Ile Pro Thr Thr Lys Ala Thr Gln Ser Ser Asn Lys Leu Ala Val Ser25 30 35
Gly Phe Ile Asp Gln Phe Ala Asn Lys Ala Asp Leu Lys Ser Phe Leu35 40 45 50
Ala Gln Phe Arg Lys Asp Ile Ser Ser Ser Thr Thr Phe Ser Leu Gln55 60 65
Thr Leu Asp Gly Gly Glu Asn Asp Gln Ser Pro Ser Glu Ala Gly Ile70 75 80
45 Glu Ala Asn Leu Asp Ile Gln Tyr Thr Val Gly Leu Ala Thr Gly Val85 90 95 100
Pro Thr Thr Phe Ile Ser Val Gly Asp Asp Phe Gln Asp Gly Asn Leu105 110 115
Glu Gly Phe Leu Asp Ile Ile Asn Phe Leu Leu Gly Glu Ser Asn Pro55 120 125 130
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65 Arg Gly Thr Ser Ile Leu Phe Ala Ser Gly Asp Gly Gly Val Ser Gly 165 170 175 180
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Thr Ala Ala Ala Phe Ser Ser Gly Gly Phe Ser Asn Val Phe Gly Ile215 220 225
Pro Ser Tyr Gln Ala Ser Ala Val Ser Gly Tyr Leu Ser Ala Leu Gly 230 235 240
Ser Thr Asn Ser Gly Lys Phe Asn Arg Ser Gly Arg Gly Phe Pro Asp245 250 255 260
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Ile Ser Leu Val Asn Asp Arg Leu Ile Ala Ala Gly Lys Ser Pro Leu 295 300 305
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Asn Asp Val Thr Ser Gly Ser Asn Pro Gly Cys Ser Thr Asn Gly Phe 325 330 335 340
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<220>
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<220>
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<220>
<221> misc_recomb
<222> (1693)..(1716)
5
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gaa gac ctt cct gcc ggt ttc tcg ctg cgc ggc gcc gcc tcgGlu Asp Leu Pro Ala Gly Phe Ser Leu Arg Gly Ala Ala Ser-165 -160 -155
ccc Pro 135
15
gac acg acg ctg aag ctc cgc atc gcg Asp Thr Thr Leu Lys Leu Arg Ile Ala-150 -145 ctc gtg cag aac aacLeu Val Gln Asn Asn -140 ttc Phe 180
gcc gag ctc gaaAla Glu Leu Glu -135
gac aag ctc tac gacAsp Lys Leu Tyr Asp-130 gtc agc aca ccg tccVal Ser Thr Pro Ser -125 agcSer 225
25
gcc aac tac ggc aac cac ctc tcg aag gaa gag gtt gag cag tac Ala Asn Tyr Gly Asn His Leu Ser Lys Glu Glu Val Glu Gln Tyr-120 -115 -110 att gct ccg gct ccc gag agc gtg aaa gcc gtg aat gcc tgg ctc accIle Ala Pro Ala Pro Glu Ser Val Lys Ala Val Asn Ala Trp Leu Thr -105 -100 -95 270 318
gag aac gga ctc gac gcg cac acc att tcg ccc gcc ggc gac tgg ctcGlu Asn Gly Leu Asp Ala His Thr Ile Ser Pro Ala Gly Asp Trp Leu-90 -85 -80
366
35
gca ttc gag gtc ccc gtc agc aag gcg aat gag ctc ttc gac gcc gacAla Phe Glu Val Pro Val Ser Lys Ala Asn Glu Leu Phe Asp Ala Asp-75 -70 -65 414
ttc tcc gtg ttt acc cac gat gag tcc ggc ctc gag gct atc cgg acgPhe Ser Val Phe Thr His Asp Glu Ser Gly Leu Glu Ala Ile Arg Thr-60 -55 -50 -45
462
45
ctg gcc tac tcc atc cct gct gag ctt cag gga cac ctc gac ctt gttLeu Ala Tyr Ser Ile Pro Ala Glu Leu Gln Gly His Leu Asp Leu Val-40 -35 -30 cac ccc acc gtc acg ttc ccg aac ccc aat gcg cac ctg ccc gtc gtg His Pro Thr Val Thr Phe Pro Asn Pro Asn Ala His Leu Pro Val Val -25 -20 -15 510 558
cgc tcc acc cag ccc atc cgg aac ctg acc gga cgt gct ata ccg gcc Arg Ser Thr Gln Pro Ile Arg Asn Leu Thr Gly Arg Ala Ile Pro Ala-10 -5 -1 1
606
55
tct tgc gcg agc acc atc acc cct gcg tgc ttg cag gcc atc tac ggtSer Cys Ala Ser Thr Ile Thr Pro Ala Cys Leu Gln Ala Ile Tyr Gly5 10 15 20 654
atc ccc acc acc aag gct act cag tcc tcg aac aag ctc gct gtc agcIle Pro Thr Thr Lys Ala Thr Gln Ser Ser Asn Lys Leu Ala Val Ser 25 30 35
702
65
ggc ttc atc gac cag ttt gcg aac aag gct gac ctg aag tca ttc ctgGly Phe Ile Asp Gln Phe Ala Asn Lys Ala Asp Leu Lys Ser Phe Leu 40 45 50 gcc cag ttc cgc aaa gac atc tca tcc tcc acg act ttc tcg ctt cagAla Gln Phe Arg Lys Asp Ile Ser Ser Ser Thr Thr Phe Ser Leu Gln55 60 65 750 798
act ctc gat ggt gga gag aac gac cag agc cct agc gag gcg ggt atc 846 Thr Leu Asp Gly Gly Glu Asn Asp Gln Ser Pro Ser Glu Ala Gly Ile70 75 80
5 gag gct aac ttg gat atc cag tac acc gtc ggc ctc gcc acg ggc gtc 894 Glu Ala Asn Leu Asp Ile Gln Tyr Thr Val Gly Leu Ala Thr Gly Val85 90 95 100
cct acc acg ttc atc tcc gtc ggc gac gac ttc cag gat ggc aac ttg 942 Pro Thr Thr Phe Ile Ser Val Gly Asp Asp Phe Gln Asp Gly Asn Leu105 110 115
gag ggc ttc ctg gac atc atc aac ttc ttg ctc ggc gag agc aac ccg 990 Glu Gly Phe Leu Asp Ile Ile Asn Phe Leu Leu Gly Glu Ser Asn Pro15 120 125 130
ccg cag gtc ctc acc acc agt tac ggc cag aac gag aac acg atc tcg 1038 Pro Gln Val Leu Thr Thr Ser Tyr Gly Gln Asn Glu Asn Thr Ile Ser135 140 145
gcc aag ctt gct aac caa ctt tgc aat gcg tac gct cag ctc ggc gcg 1086 Ala Lys Leu Ala Asn Gln Leu Cys Asn Ala Tyr Ala Gln Leu Gly Ala 150 155 160
25 cgc ggc acc tct atc ctc ttc gcg tcg ggt gat ggc ggt gtg tcc ggc 1134 Arg Gly Thr Ser Ile Leu Phe Ala Ser Gly Asp Gly Gly Val Ser Gly 165 170 175 180
tcg cag tcc gcg cac tgc agc aat ttt gtc ccg aca ttc ccc tcc ggc 1182 Ser Gln Ser Ala His Cys Ser Asn Phe Val Pro Thr Phe Pro Ser Gly185 190 195
tgc ccc ttc atg act tcc gtc ggc gcg acg cag ggc gtc agc ccc gag 1230 Cys Pro Phe Met Thr Ser Val Gly Ala Thr Gln Gly Val Ser Pro Glu35 200 205 210
act gcc gcc gcc ttc tca tcc ggc ggc ttc tcg aac gtg ttc ggc atc 1278 Thr Ala Ala Ala Phe Ser Ser Gly Gly Phe Ser Asn Val Phe Gly Ile215 220 225
ccg tcg tac cag gct tcc gcg gtc agc ggc tac ctg tcc gcg ctc gga 1326 Pro Ser Tyr Gln Ala Ser Ala Val Ser Gly Tyr Leu Ser Ala Leu Gly230 235 240
45 agc acg aac tcg ggc aag ttc aac cgc agc gga cgc gga ttc ccc gac 1374 Ser Thr Asn Ser Gly Lys Phe Asn Arg Ser Gly Arg Gly Phe Pro Asp245 250 255 260
gtc tcc acg caa ggc gtg gac ttc cag atc gtc agc ggc ggc cag acg 1422 Val Ser Thr Gln Gly Val Asp Phe Gln Ile Val Ser Gly Gly Gln Thr265 270 275
atc ggc gtc gac ggc acg agc tgc gcc agc ccg acg ttc gcg agc gtc 1470 Ile Gly Val Asp Gly Thr Ser Cys Ala Ser Pro Thr Phe Ala Ser Val55 280 285 290
atc tcg ctg gta aac gac cgc ctc atc gcg gcc ggc aag agc ccg ctc 1518 Ile Ser Leu Val Asn Asp Arg Leu Ile Ala Ala Gly Lys Ser Pro Leu 295 300 305
ggc ttc ctg aac ccc ttc ctg tac tcg tcg gcg ggc aag gcc gcg ctc 1566 Gly Phe Leu Asn Pro Phe Leu Tyr Ser Ser Ala Gly Lys Ala Ala Leu 310 315 320
65 aac gac gtc acg agt ggc tcg aac cct ggc tgc agc acg aac ggc ttc 1614 Asn Asp Val Thr Ser Gly Ser Asn Pro Gly Cys Ser Thr Asn Gly Phe325 330 335 340
ccc gct aag gcc ggc tgg gac ccg gtc act ggt ctt ggc acg ccc aac 1662
Pro Ala Lys Ala Gly Trp Asp Pro Val Thr Gly Leu Gly Thr Pro Asn 345 350 355
ttt gcc aag ctc ctc acc gcg gtc ggc ctg cga cat cag cac cag cat 1710 5 Phe Ala Lys Leu Leu Thr Ala Val Gly Leu Arg His Gln His Gln His 360 365 370
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<210> 4
<211> 572 15 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Constructo sintético
<400> 4
Met Val Ala Thr Ser Leu Leu Val Ala Ser Leu Phe Thr Leu Ala -195 -190 -185
Leu Gly Thr Pro Thr Gly Arg Asn Leu Lys Leu His Glu Ala Arg -180 -175 -170
Glu Asp Leu Pro Ala Gly Phe Ser Leu Arg Gly Ala Ala Ser Pro
-165 -160
35 Asp Thr Thr Leu Lys Leu Arg Ile Ala-150 -145
Ala Glu Leu Glu Asp Lys Leu Tyr Asp-135 -130
Ala Asn Tyr Gly Asn His Leu Ser Lys -120 -115
-
155
Leu Val Gln Asn Asn Phe -140
Val Ser Thr Pro Ser Ser -125
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Ile Ala Pro Ala Pro Glu Ser Val Lys Ala Val Asn Ala Trp Leu Thr-105 -100 -95
Glu Asn Gly Leu Asp Ala His Thr Ile Ser Pro Ala Gly Asp Trp Leu -90 -85 -80
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Phe Ser Val Phe Thr His Asp Glu Ser Gly Leu Glu Ala Ile Arg Thr -60 -55 -50 -45
Leu Ala Tyr Ser Ile Pro Ala Glu Leu Gln Gly His Leu Asp Leu Val-40 -35 -30
His Pro Thr Val Thr Phe Pro Asn Pro Asn Ala His Leu Pro Val Val -25 -20 -15
Arg Ser Thr Gln Pro Ile Arg Asn Leu Thr Gly Arg Ala Ile Pro Ala-10 -5 -1 1
Ser Cys Ala Ser Thr Ile Thr Pro Ala Cys Leu Gln Ala Ile Tyr Gly 5 10 15 20
Ile Pro Thr Thr Lys Ala Thr Gln Ser Ser Asn Lys Leu Ala Val Ser25 30 35
Gly Phe Ile Asp Gln Phe Ala Asn Lys Ala Asp Leu Lys Ser Phe Leu15 40 45 50
Ala Gln Phe Arg Lys Asp Ile Ser Ser Ser Thr Thr Phe Ser Leu Gln55 60 65
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Ser Gln Ser Ala His Cys Ser Asn Phe Val Pro Thr Phe Pro Ser Gly185 190 195
Cys Pro Phe Met Thr Ser Val Gly Ala Thr Gln Gly Val Ser Pro Glu55 200 205 210
Thr Ala Ala Ala Phe Ser Ser Gly Gly Phe Ser Asn Val Phe Gly Ile215 220 225
Pro Ser Tyr Gln Ala Ser Ala Val Ser Gly Tyr Leu Ser Ala Leu Gly230 235 240
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5 Ile Gly Val Asp Gly Thr Ser Cys Ala Ser Pro Thr Phe Ala Ser Val 280 285 290
Ile Ser Leu Val Asn Asp Arg Leu Ile Ala Ala Gly Lys Ser Pro Leu295 300 305
Gly Phe Leu Asn Pro Phe Leu Tyr Ser Ser Ala Gly Lys Ala Ala Leu 310 315 320
Asn Asp Val Thr Ser Gly Ser Asn Pro Gly Cys Ser Thr Asn Gly Phe325 330 335 340
Pro Ala Lys Ala Gly Trp Asp Pro Val Thr Gly Leu Gly Thr Pro Asn 345 350 355
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Gln His
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Leu Ala Val Ser Gly Phe Ile Asp Gln Phe Ala Asn Lys Ala Asp Leu35 40 45
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Val Ser Pro Glu Thr Ala Ala Ala Phe Ser Ser Gly Gly Phe Ser Asn 210 215 220
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Gly Gly Gln Thr Ile Gly Val Asp Gly Thr Ser Cys Ala Ser Pro Thr 275 280 285
Phe Ala Ser Val Ile Ser Leu Val Asn Asp Arg Leu Ile Ala Ala Gly290 295 300
Lys Ser Pro Leu Gly Phe Leu Asn Pro Phe Leu Tyr Ser Ser Ala Gly305 310 315 320
Lys Ala Ala Leu Asn Asp Val Thr Ser Gly Ser Asn Pro Gly Cys Ser325 330 335
55 Thr Asn Gly Phe Pro Ala Lys Ala Gly Trp Asp Pro Val Thr Gly Leu340 345 350
Gly Thr Pro Asn Phe Ala Lys Leu Leu Thr Ala Val Gly Leu355 360 365
<210> 6
<211> 371 65 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> polipéptido maduro con etiqueta HQ parcial
<400> 6
Ala Ile Pro Ala Ser Cys Ala Ser Thr Ile Thr Pro Ala Cys Leu Gln5 1 5 10 15
Ala Ile Tyr Gly Ile Pro Thr Thr Lys Ala Thr Gln Ser Ser Asn Lys20 25 30
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395
gcc ctc gcg gccAla Leu Ala Ala
acc gga gcg ctc cccThr Gly Ala Leu Pro cag tca ccc acc ccgGln Ser Pro Thr Pro gagGlu 440
-165 -160 -155
gcc gac gcg gtc tcc atg cag gag gcg ctc cag cgc gac ctc gac 485 Ala Asp Ala Val Ser Met Gln Glu Ala Leu Gln Arg Asp Leu Asp
-150 -145 -140
ctg acc tcc gcc gag gcc gag gag ctg ctg gcc gcc cag gac acc 530 Leu Thr Ser Ala Glu Ala Glu Glu Leu Leu Ala Ala Gln Asp Thr
-135 -130 -125
gcc ttc gag gtc gac gag gcc gcg gcc gag gcc gcc ggg gac gcc 575 Ala Phe Glu Val Asp Glu Ala Ala Ala Glu Ala Ala Gly Asp Ala
-120 -115 -110
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-105 -100 -95
gtc acc gat gcc gcc gcg gtc gag gcc gtg gag gcc acc ggc gcc ggg 671 Val Thr Asp Ala Ala Ala Val Glu Ala Val Glu Ala Thr Gly Ala Gly
-90 -85 -80
acc gag ctg gtc tcc tac ggc atc gac ggt ctc gac gag atc gtc cag 719 Thr Glu Leu Val Ser Tyr Gly Ile Asp Gly Leu Asp Glu Ile Val Gln
-75 -70 -65
gag ctc aac gcc gcc gac gcc gtt ccc ggt gtg gtc ggc tgg tac ccg 767 Glu Leu Asn Ala Ala Asp Ala Val Pro Gly Val Val Gly Trp Tyr Pro -60 -55 -50 -45
gac gtg gcg ggt gac acc gtc gtc ctg gag gtc ctg gag ggt tcc gga 815 Asp Val Ala Gly Asp Thr Val Val Leu Glu Val Leu Glu Gly Ser Gly
-40 -35 -30
gcc gac gtc agc ggc ctg ctc gcg gac gcc ggc gtg gac gcc tcg gcc 863 Ala Asp Val Ser Gly Leu Leu Ala Asp Ala Gly Val Asp Ala Ser Ala
-25 -20 -15
gtc gag gtg acc acg agc gac cag ccc gag ctc tac gcc gac atc atc 911 Val Glu Val Thr Thr Ser Asp Gln Pro Glu Leu Tyr Ala Asp Ile Ile
-10 -5 -1 1
ggt ggt ctg gcc tac acc atg ggc ggc cgc tgt tcg gtc ggc ttc gcg 959 Gly Gly Leu Ala Tyr Thr Met Gly Gly Arg Cys Ser Val Gly Phe Ala5 10 15 20
gcc acc aac gcc gcc ggt cag ccc ggg ttc gtc acc gcc ggt cac tgc 1007 Ala Thr Asn Ala Ala Gly Gln Pro Gly Phe Val Thr Ala Gly His Cys
25 30 35
ggc cgc gtg ggc acc cag gtg acc atc ggc aac ggc agg ggc gtc ttc 1055 Gly Arg Val Gly Thr Gln Val Thr Ile Gly Asn Gly Arg Gly Val Phe
40 45 50
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55 60 65
tcc aac ttc acg ctg acc aac ctg gtc agc cgc tac aac acc ggc ggg 1151 Ser Asn Phe Thr Leu Thr Asn Leu Val Ser Arg Tyr Asn Thr Gly Gly
70 75 80
tac gcc acg gtc gcc ggt cac aac cag gcc ccc atc ggc tcc tcc gtc 1199 Tyr Ala Thr Val Ala Gly His Asn Gln Ala Pro Ile Gly Ser Ser Val 85 90 95 100
tgc cgc tcc ggc tcc acc acc ggt tgg cac tgc ggc acc atc cag gcc 1247 Cys Arg Ser Gly Ser Thr Thr Gly Trp His Cys Gly Thr Ile Gln Ala
105 110 115
cgc ggc cag tcg gtg agc tac ccc gag ggc acc gtc acc aac atg accArg Gly Gln Ser Val Ser Tyr Pro Glu Gly Thr Val Thr Asn Met Thr120 125 130 cgg acc acc gtg tgc gcc gag ccc ggc gac tcc ggc ggc tcc tac atcArg Thr Thr Val Cys Ala Glu Pro Gly Asp Ser Gly Gly Ser Tyr Ile135 140 145 tcc ggc acc cag gcc cag ggc gtg acc tcc ggc ggc tcc ggc aac tgcSer Gly Thr Gln Ala Gln Gly Val Thr Ser Gly Gly Ser Gly Asn Cys150 155 160 cgc acc ggc ggg acc acc ttc tac cag gag gtc acc ccc atg gtg aacArg Thr Gly Gly Thr Thr Phe Tyr Gln Glu Val Thr Pro Met Val Asn165 170 175 180 tcc tgg ggc gtc cgt ctc cgg acc tgatccccgc ggttccaggc ggaccgacgg Ser Trp Gly Val Arg Leu Arg Thr185 tcgtgacctg agtaccaggc gtccccgccg cttccagcgg cgtccgcacc ggggtgggac cgggcgtggc cacggcccca cccgtgaccg gaccgcccgg cta
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<212> ADN
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<223>
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18
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ttc ccc gac atc gcg acc cag ggc gtc gac ttt gag atc gtc gtc agcPhe Pro Asp Ile Ala Thr Gln Gly Val Asp Phe Glu Ile Val Val Ser 260 265 270
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agc ccc ctt ggc ttc ctc aac ccc ttc ttg tac tcg gcg gcg ggc actSer Pro Leu Gly Phe Leu Asn Pro Phe Leu Tyr Ser Ala Ala Gly Thr310 315 320
1897
gct gcg ctc act gac atc acg tcg ggc tcg aac ccg ggc tgc aac acc 1945 Ala Ala Leu Thr Asp Ile Thr Ser Gly Ser Asn Pro Gly Cys Asn Thr
325 330 335
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-165 -160
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Secuencia artificial
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Constructo sintético
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18
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cacagtaccc gcttatcgca g c atg acc tcc gtc ggc gcg acg cag ggc atc Met Thr Ser Val Gly Ala Thr Gln Gly Ile200 205
1562
aac ccg gag acc gcc gcc gac ttc tcc tcc ggc ggc ttc tca aac gtcAsn Pro Glu Thr Ala Ala Asp Phe Ser Ser Gly Gly Phe Ser Asn Val 210 215 220 225
1610
ttc gcc cgc ccc tcg tac cag tct acc gcc gtc agc agc tac ctg accPhe Ala Arg Pro Ser Tyr Gln Ser Thr Ala Val Ser Ser Tyr Leu Thr 230 235 240
1658
gcg ctc ggc agc acc aac tcg ggc aag ttc aac acc tcc ggc cgc gcgAla Leu Gly Ser Thr Asn Ser Gly Lys Phe Asn Thr Ser Gly Arg Ala 245 250 255
1706
ttc ccc gac atc gcc acc cag ggt gtc gac ttc gag atc gtc gtt ggcPhe Pro Asp Ile Ala Thr Gln Gly Val Asp Phe Glu Ile Val Val Gly260 265 270
1754
ggc cgc act gag ggc gtc gac ggc act agc tgc gcc agc ccg acg cttGly Arg Thr Glu Gly Val Asp Gly Thr Ser Cys Ala Ser Pro Thr Leu275 280 285
1802
gcc gcg atc atc tcg ctc ctg aac gac cgc ctc atc gcg gcc ggc aagAla Ala Ile Ile Ser Leu Leu Asn Asp Arg Leu Ile Ala Ala Gly Lys290 295 300 305
1850
agc ccc ctt ggc ttc ctc aac ccc ttc ctg tac tcg gcg gcg ggc gccSer Pro Leu Gly Phe Leu Asn Pro Phe Leu Tyr Ser Ala Ala Gly Ala310 315 320
1898
gcg gca ctc acc gac atc acg tct ggc tcg aac ccc ggt tgc ggc acc Ala Ala Leu Thr Asp Ile Thr Ser Gly Ser Asn Pro Gly Cys Gly Thr325 330 335
1946
aac ggc ttc ccc gcg aag gct ggc tgg gac ccg gtacgtttct gtctccgtag Asn Gly Phe Pro Ala Lys Ala Gly Trp Asp Pro340 345
1999
cgcgcccgaa acataaactg acggctttgc ag gtc acc ggt ctt ggc acg cccVal Thr Gly Leu Gly Thr Pro350 355
2052
aac ttc gcc aag ctg ctc act gct gtt ggc ctg taaAsn Phe Ala Lys Leu Leu Thr Ala Val Gly Leu360 365
2088
<210>
21
<211>
565
<212>
PRT
<213>
Trametes versicolor
<400>
21
Met Val Ala Thr Ser
Leu Leu Val Ala Ser Leu Phe Thr Leu Val
-195
-190 -185
Leu Gly Thr Pro Thr Ala Arg Asn Leu Lys Leu His Glu Ser Arg-180 -175 -170
Glu Glu Ile Pro Ala Gly Phe Ser Leu Ser Gly Ala Ala Ser Pro-165 -160 -155
Asp Thr Thr Leu Lys Leu Arg Leu Ala Leu Val Gln Ser Asn Phe -150 -145 -140
Ala Glu Leu Glu Asp Lys Leu Tyr Asp Val Ser Thr Pro Ser Ser -135 -130 -125
Ala Asn Tyr Gly Gln His Leu Ser Lys Glu Glu Val Glu Gln Leu -120 -115 -110
Val Ala Pro Ser Ala Ala Ser Val Ala Ala Val Asn Ala Trp Leu Thr-105 -100 -95
Glu Asn Gly Leu Thr Ala Gln Thr Ile Ser Pro Ala Gly Asp Trp Leu-90 -85 -80
Ala Phe Glu Val Pro Val Ser Gln Ala Asn Glu Leu Phe Asp Ala Asp -75 -70 -65
Phe Ser Val Phe Thr His Asp Glu Ser Gly Leu Gln Ala Val Arg Thr-60 -55 -50
Leu Ala Tyr Ser Ile Pro Ala Glu Leu Gln Gly His Leu Asp Leu Val -45 -40 -35 -30
His Pro Thr Ile Thr Phe Pro Asn Pro Asn Ser His Leu Pro Val Val -25 -20 -15
Arg Ser Pro Val Lys Pro Ile Gln Asn Leu Thr Ser Arg Ala Val Pro -10 -5 -1 1
Ala Ser Cys Ala Ser Thr Ile Thr Pro Ala Cys Leu Gln Ala Leu Tyr5 10 15
Gly Ile Pro Thr Thr Lys Ala Thr Gln Ser Ser Asn Lys Leu Ala Val 20 25 30 35
Ser Gly Phe Ile Asp Gln Phe Ala Asn Ser Ala Asp Leu Lys Thr Phe40 45 50
Leu Gly Lys Phe Arg Thr Asp Ile Ser Ser Ser Thr Thr Phe Thr Leu 55 60 65
Gln Thr Leu Asp Gly Gly Ser Asn Ser Gln Ser Ser Ser Gln Ala Gly70 75 80
Val Glu Ala Asn Leu Asp Val Gln Tyr Ala Ile Gly Ile Ala Thr Gly 85 90 95
Val Pro Thr Thr Phe Ile Ser Val Gly Asp Asp Phe Gln Asp Gly Asp 100 105 110 115
Leu Glu Gly Phe Leu Asp Ile Ile Asn Phe Leu Leu Asn Glu Ser Ala 120 125 130
Pro Pro Gln Val Leu Thr Thr Ser Tyr Gly Gln Asn Glu Asn Thr Ile135 140 145
Ser Ala Lys Leu Ala Asn Gln Leu Cys Asn Ala Tyr Ala Gln Leu Gly150 155 160
Ala Arg Gly Thr Ser Ile Leu Phe Ala Ser Gly Asp Gly Gly Val Ala165 170 175
Gly Ser Gln Thr Ser Ser Cys Thr Lys Phe Leu Pro Thr Phe Pro Ser180 185 190 195
Gly Cys Pro Phe Met Thr Ser Val Gly Ala Thr Gln Gly Ile Asn Pro200 205 210
Glu Thr Ala Ala Asp Phe Ser Ser Gly Gly Phe Ser Asn Val Phe Ala215 220 225
Arg Pro Ser Tyr Gln Ser Thr Ala Val Ser Ser Tyr Leu Thr Ala Leu230 235 240
Gly Ser Thr Asn Ser Gly Lys Phe Asn Thr Ser Gly Arg Ala Phe Pro245 250 255
Asp Ile Ala Thr Gln Gly Val Asp Phe Glu Ile Val Val Gly Gly Arg260 265 270 275
Thr Glu Gly Val Asp Gly Thr Ser Cys Ala Ser Pro Thr Leu Ala Ala280 285 290
Ile Ile Ser Leu Leu Asn Asp Arg Leu Ile Ala Ala Gly Lys Ser Pro295 300 305
Leu Gly Phe Leu Asn Pro Phe Leu Tyr Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala310 315 320
Leu Thr Asp Ile Thr Ser Gly Ser Asn Pro Gly Cys Gly Thr Asn Gly325 330 335
Phe Pro Ala Lys Ala Gly Trp Asp Pro Val Thr Gly Leu Gly Thr Pro340 345 350 355
Asn Phe Ala Lys Leu Leu Thr Ala Val Gly Leu360 365
<210> 22
<211> 1698
<212> <213>
ADN Secuencia artificial
<220> <223>
Constructo sintético
<220> <221> <222> <220> <221> <222> <220> <221> <222> <400>
CDS (1)..(1695) sig_peptide(1)..(51) mat_peptide(598)..(1695) 22
atg gtc gca aca tcg ttg ttg gtg gca tcg ttg ttc aca ttg gtcMet Val Ala Thr Ser Leu Leu Val Ala Ser Leu Phe Thr Leu Val -195 -190 -185
45
ttg gga aca ccg aca gca cgc aac ttg aaa ttg cat gaa tcc cgaLeu Gly Thr Pro Thr Ala Arg Asn Leu Lys Leu His Glu Ser Arg-180 -175 -170
90
gag gaa att cct gca gga ttc tcg ttg tcg gga gca gca tcg cctGlu Glu Ile Pro Ala Gly Phe Ser Leu Ser Gly Ala Ala Ser Pro-165 -160 -155
135
gat aca aca ttg aaa ttg cgg ttg gca ttg gtc cag tcg aac ttcAsp Thr Thr Leu Lys Leu Arg Leu Ala Leu Val Gln Ser Asn Phe -150 -145 -140
180
gca gag ttg gag gac aaa ttg tat gat gtc tcg aca cct tcg tcgAla Glu Leu Glu Asp Lys Leu Tyr Asp Val Ser Thr Pro Ser Ser -135 -130 -125
225
gca aac tat gga cag cac ttg tcc aaa gag gag gtc gag cag ttgAla Asn Tyr Gly Gln His Leu Ser Lys Glu Glu Val Glu Gln Leu -120 -115 -110
270
gtc gca ccc tcg gca gca tcg gtg gca gca gtc aac gca tgg ttg acaVal Ala Pro Ser Ala Ala Ser Val Ala Ala Val Asn Ala Trp Leu Thr-105 -100 -95
318
gaa aac gga ttg aca gca cag aca att tcg cct gca gga gat tgg ttgGlu Asn Gly Leu Thr Ala Gln Thr Ile Ser Pro Ala Gly Asp Trp Leu-90 -85 -80
366
gca ttc gag gtg cct gtc tcg cag gca aac gag ttg ttc gat gca gatAla Phe Glu Val Pro Val Ser Gln Ala Asn Glu Leu Phe Asp Ala Asp-75 -70 -65
414
ttc tcg gtg ttc aca cat gat gag tcg gga ttg cag gca gtc cga aca Phe Ser Val Phe Thr His Asp Glu Ser Gly Leu Gln Ala Val Arg Thr-60 -55 -50
462
ttg gca tat tcg att ccc gca gaa ttg cag gga cac ttg gat ttg gtg Leu Ala Tyr Ser Ile Pro Ala Glu Leu Gln Gly His Leu Asp Leu Val-45 -40 -35 -30
510
cat ccc aca att aca ttc ccc aac ccc aac tcg cat ttg ccc gtc gtgHis Pro Thr Ile Thr Phe Pro Asn Pro Asn Ser His Leu Pro Val Val -25 -20 -15
558
cgg tcg cct gtc aaa cct att cag aac ttg aca tcc cga gca gtg cctArg Ser Pro Val Lys Pro Ile Gln Asn Leu Thr Ser Arg Ala Val Pro -10 -5 -1 1
606
gca tcc tgt gca tcg aca att aca ccg gca tgt ttg cag gca ttg tatAla Ser Cys Ala Ser Thr Ile Thr Pro Ala Cys Leu Gln Ala Leu Tyr 5 10 15
654
gga att cct aca aca aaa gca aca cag tcg tcc aac aaa ttg gca gtcGly Ile Pro Thr Thr Lys Ala Thr Gln Ser Ser Asn Lys Leu Ala Val20 25 30 35
702
tcg gga ttc att gat cag ttc gca aac tcc gca gat ttg aaa aca ttcSer Gly Phe Ile Asp Gln Phe Ala Asn Ser Ala Asp Leu Lys Thr Phe40 45 50
750
ttg ggc aaa ttc cgc aca gac att tcg tcg tcg aca aca ttc aca ttgLeu Gly Lys Phe Arg Thr Asp Ile Ser Ser Ser Thr Thr Phe Thr Leu55 60 65
798
cag aca ttg gat gga ggc tcc aac tcg cag tcg tcg tcg cag gca ggaGln Thr Leu Asp Gly Gly Ser Asn Ser Gln Ser Ser Ser Gln Ala Gly70 75 80
846
gtg gaa gca aac ttg gat gtc cag tat gca atc gga att gca aca gga Val Glu Ala Asn Leu Asp Val Gln Tyr Ala Ile Gly Ile Ala Thr Gly85 90 95
894
gtc cct aca aca ttc att tcg gtc gga gat gat ttc cag gat gga gat Val Pro Thr Thr Phe Ile Ser Val Gly Asp Asp Phe Gln Asp Gly Asp100 105 110 115
942
ttg gaa gga ttc ttg gac atc att aac ttc ttg ttg aac gaa tcg gcaLeu Glu Gly Phe Leu Asp Ile Ile Asn Phe Leu Leu Asn Glu Ser Ala 120 125 130
990
ccc cct cag gtc ttg aca aca tcc tat gga cag aac gaa aac aca attPro Pro Gln Val Leu Thr Thr Ser Tyr Gly Gln Asn Glu Asn Thr Ile 135 140 145
1038
tcc gcc aaa ttg gca aac cag ttg tgt aac gca tat gca cag ttg ggaSer Ala Lys Leu Ala Asn Gln Leu Cys Asn Ala Tyr Ala Gln Leu Gly150 155 160
1086
gca cgg gga aca tcg atc ttg ttc gca tcc ggc gat gga gga gtc gcaAla Arg Gly Thr Ser Ile Leu Phe Ala Ser Gly Asp Gly Gly Val Ala165 170 175
1134
gga tcg cag aca tcg tcg tgt aca aag ttc ttg ccc aca ttc ccc tccGly Ser Gln Thr Ser Ser Cys Thr Lys Phe Leu Pro Thr Phe Pro Ser180 185 190 195
1182
gga tgt ccc ttc atg aca tcc gtc ggc gca aca cag ggc att aac cctGly Cys Pro Phe Met Thr Ser Val Gly Ala Thr Gln Gly Ile Asn Pro200 205 210
1230
gaa aca gcc gcc gat ttc tcg tcg ggc gga ttc tcg aac gtg ttc gca Glu Thr Ala Ala Asp Phe Ser Ser Gly Gly Phe Ser Asn Val Phe Ala215 220 225
1278
agg ccg tcg tat cag tcg aca gca gtc tcg tcg tat ttg aca gca ttg Arg Pro Ser Tyr Gln Ser Thr Ala Val Ser Ser Tyr Leu Thr Ala Leu230 235 240
1326
gga tcg aca aac tcg ggc aaa ttc aac aca tcc gga cga gca ttc ccgGly Ser Thr Asn Ser Gly Lys Phe Asn Thr Ser Gly Arg Ala Phe Pro245 250 255
1374
gat att gca aca cag gga gtc gat ttc gag att gtc gtc gga gga agg
1422
Asp Ile Ala Thr Gln Gly Val Asp Phe Glu Ile Val Val Gly Gly Arg 260 265 270 275 aca gaa gga gtg gat gga aca tcc tgt gca tcc ccg aca ttg gca gccThr Glu Gly Val Asp Gly Thr Ser Cys Ala Ser Pro Thr Leu Ala Ala 280 285 290 atc att tcc ttg ttg aac gat cga ttg att gca gca gga aaa tcc cccIle Ile Ser Leu Leu Asn Asp Arg Leu Ile Ala Ala Gly Lys Ser Pro295 300 305 ttg gga ttc ttg aac cct ttc ttg tat tcc gcc gca ggc gcc gcc gcaLeu Gly Phe Leu Asn Pro Phe Leu Tyr Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala310 315 320 ttg aca gac att aca tcg ggc tcc aac cct gga tgt gga aca aac ggaLeu Thr Asp Ile Thr Ser Gly Ser Asn Pro Gly Cys Gly Thr Asn Gly325 330 335 ttc cct gca aaa gca gga tgg gac cct gtc aca gga ttg gga aca cccPhe Pro Ala Lys Ala Gly Trp Asp Pro Val Thr Gly Leu Gly Thr Pro340 345 350 355 aac ttc gcc aaa ttg ttg aca gca gtg gga ttg taa Asn Phe Ala Lys Leu Leu Thr Ala Val Gly Leu360 365
1470 1518 1566 1614 1662 1698
<210> 23 <211> 565 <212> PRT <213> Secuencia artificial <220> <223> Constructo sintético <400> 23 Met Val Ala Thr Ser Leu Leu Val Ala Ser Leu Phe Thr Leu Val -195 -190 -185
Leu Gly Thr Pro Thr Ala Arg Asn Leu Lys Leu His Glu Ser Arg-180 -175 -170
Glu Glu Ile Pro Ala Gly Phe Ser Leu Ser Gly Ala Ala Ser Pro-165 -160 -155
Asp Thr Thr Leu Lys Leu Arg Leu Ala Leu Val Gln Ser Asn Phe -150 -145 -140
Ala Glu Leu Glu Asp Lys Leu Tyr Asp Val Ser Thr Pro Ser Ser -135 -130 -125
Ala Asn Tyr Gly Gln His Leu Ser Lys Glu Glu Val Glu Gln Leu -120 -115 -110
Val Ala Pro Ser Ala Ala Ser Val Ala Ala Val Asn Ala Trp Leu Thr-105 -100 -95
Glu Asn Gly Leu Thr Ala Gln Thr Ile Ser Pro Ala Gly Asp Trp Leu -90 -85 -80
Ala Phe Glu Val Pro Val Ser Gln Ala Asn Glu Leu Phe Asp Ala Asp-75 -70 -65
Phe Ser Val Phe Thr His Asp Glu Ser Gly Leu Gln Ala Val Arg Thr -60 -55 -50
Leu Ala Tyr Ser Ile Pro Ala Glu Leu Gln Gly His Leu Asp Leu Val-45 -40 -35 -30
His Pro Thr Ile Thr Phe Pro Asn Pro Asn Ser His Leu Pro Val Val -25 -20 -15
Arg Ser Pro Val Lys Pro Ile Gln Asn Leu Thr Ser Arg Ala Val Pro-10 -5 -1 1
Ala Ser Cys Ala Ser Thr Ile Thr Pro Ala Cys Leu Gln Ala Leu Tyr 5 10 15
Gly Ile Pro Thr Thr Lys Ala Thr Gln Ser Ser Asn Lys Leu Ala Val20 25 30 35
Ser Gly Phe Ile Asp Gln Phe Ala Asn Ser Ala Asp Leu Lys Thr Phe 40 45 50
Leu Gly Lys Phe Arg Thr Asp Ile Ser Ser Ser Thr Thr Phe Thr Leu55 60 65
Gln Thr Leu Asp Gly Gly Ser Asn Ser Gln Ser Ser Ser Gln Ala Gly 70 75 80
Val Glu Ala Asn Leu Asp Val Gln Tyr Ala Ile Gly Ile Ala Thr Gly85 90 95
Val Pro Thr Thr Phe Ile Ser Val Gly Asp Asp Phe Gln Asp Gly Asp 100 105 110 115
Leu Glu Gly Phe Leu Asp Ile Ile Asn Phe Leu Leu Asn Glu Ser Ala120 125 130
Pro Pro Gln Val Leu Thr Thr Ser Tyr Gly Gln Asn Glu Asn Thr Ile 135 140 145
Ser Ala Lys Leu Ala Asn Gln Leu Cys Asn Ala Tyr Ala Gln Leu Gly150 155 160
Ala Arg Gly Thr Ser Ile Leu Phe Ala Ser Gly Asp Gly Gly Val Ala165 170 175
Gly Ser Gln Thr Ser Ser Cys Thr Lys Phe Leu Pro Thr Phe Pro Ser180 185 190 195
Gly Cys Pro Phe Met Thr Ser Val Gly Ala Thr Gln Gly Ile Asn Pro200 205 210
Glu Thr Ala Ala Asp Phe Ser Ser Gly Gly Phe Ser Asn Val Phe Ala215 220 225
Arg Pro Ser Tyr Gln Ser Thr Ala Val Ser Ser Tyr Leu Thr Ala Leu230 235 240
Gly Ser Thr Asn Ser Gly Lys Phe Asn Thr Ser Gly Arg Ala Phe Pro245 250 255
Asp Ile Ala Thr Gln Gly Val Asp Phe Glu Ile Val Val Gly Gly Arg260 265 270 275
Thr Glu Gly Val Asp Gly Thr Ser Cys Ala Ser Pro Thr Leu Ala Ala280 285 290
Ile Ile Ser Leu Leu Asn Asp Arg Leu Ile Ala Ala Gly Lys Ser Pro295 300 305
Leu Gly Phe Leu Asn Pro Phe Leu Tyr Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala310 315 320
Leu Thr Asp Ile Thr Ser Gly Ser Asn Pro Gly Cys Gly Thr Asn Gly325 330 335
Phe Pro Ala Lys Ala Gly Trp Asp Pro Val Thr Gly Leu Gly Thr Pro340 345 350 355
Asn Phe Ala Lys Leu Leu Thr Ala Val Gly Leu360 365
<210> 24
<211> 366
<212> PRT
<213> Trametes versicolor
<220>
<221> mat_polypepitde
<222> (1)..(366)
<400> 24
Ala Val Pro Ala Ser Cys Ala Ser Thr Ile Thr Pro Ala Cys Leu Gln1 5 10 15
Ala Leu Tyr Gly Ile Pro Thr Thr Lys Ala Thr Gln Ser Ser Asn Lys20 25 30
Leu Ala Val Ser Gly Phe Ile Asp Gln Phe Ala Asn Ser Ala Asp Leu35 40 45
Lys Thr Phe Leu Gly Lys Phe Arg Thr Asp Ile Ser Ser Ser Thr Thr 50 55 60
Phe Thr Leu Gln Thr Leu Asp Gly Gly Ser Asn Ser Gln Ser Ser Ser65 70 75 80
Gln Ala Gly Val Glu Ala Asn Leu Asp Val Gln Tyr Ala Ile Gly Ile85 90 95
Ala Thr Gly Val Pro Thr Thr Phe Ile Ser Val Gly Asp Asp Phe Gln100 105 110
Asp Gly Asp Leu Glu Gly Phe Leu Asp Ile Ile Asn Phe Leu Leu Asn115 120 125
Glu Ser Ala Pro Pro Gln Val Leu Thr Thr Ser Tyr Gly Gln Asn Glu130 135 140
Asn Thr Ile Ser Ala Lys Leu Ala Asn Gln Leu Cys Asn Ala Tyr Ala145 150 155 160
Gln Leu Gly Ala Arg Gly Thr Ser Ile Leu Phe Ala Ser Gly Asp Gly165 170 175
Gly Val Ala Gly Ser Gln Thr Ser Ser Cys Thr Lys Phe Leu Pro Thr180 185 190
Phe Pro Ser Gly Cys Pro Phe Met Thr Ser Val Gly Ala Thr Gln Gly195 200 205
Ile Asn Pro Glu Thr Ala Ala Asp Phe Ser Ser Gly Gly Phe Ser Asn210 215 220
Val Phe Ala Arg Pro Ser Tyr Gln Ser Thr Ala Val Ser Ser Tyr Leu225 230 235 240
Thr Ala Leu Gly Ser Thr Asn Ser Gly Lys Phe Asn Thr Ser Gly Arg 245 250 255
Ala Phe Pro Asp Ile Ala Thr Gln Gly Val Asp Phe Glu Ile Val Val260 265 270
Gly Gly Arg Thr Glu Gly Val Asp Gly Thr Ser Cys Ala Ser Pro Thr 275 280 285
Leu Ala Ala Ile Ile Ser Leu Leu Asn Asp Arg Leu Ile Ala Ala Gly290 295 300
Lys Ser Pro Leu Gly Phe Leu Asn Pro Phe Leu Tyr Ser Ala Ala Gly 305 310 315 320
Ala Ala Ala Leu Thr Asp Ile Thr Ser Gly Ser Asn Pro Gly Cys Gly325 330 335
Thr Asn Gly Phe Pro Ala Lys Ala Gly Trp Asp Pro Val Thr Gly Leu 340 345 350
Gly Thr Pro Asn Phe Ala Lys Leu Leu Thr Ala Val Gly Leu355 360 365
<210> 25
<211> 567
<212> PRT
<213> Dichomitus squalens
<400> 25
Met Val Ala Ser Gly Leu Phe Leu Ala Ser Leu Ile Ala Leu Ala Leu1 5 10 15
Gly Lys Pro Thr Ala Arg Asn Leu Lys Leu His Glu Ser Arg Pro Ser20 25 30
Ala Pro Asn Gly Phe Ser Leu Val Gly Ser Ala Asp Ser Asn Arg Thr35 40 45
Leu Lys Leu Arg Leu Ala Leu Ala Glu Ser Asn Phe Ser Glu Leu Glu50 55 60
Arg Lys Leu Tyr Asp Val Ser Thr Pro Lys Ser Ala Asn Tyr Gly Lys65 70 75 80
His Leu Ser Lys Ala Glu Val Gln Gln Leu Val Ala Pro Gly Gln Asp85 90 95
Ser Ile Asp Ala Val Asn Ser Trp Leu Lys Glu Asn Asp Ile Thr Ala100 105 110
Lys Thr Ile Ser Ser Thr Gly Glu Trp Ile Ser Phe Glu Val Pro Val115 120 125
Ser Lys Ala Asn Asp Leu Phe Asp Ala Asp Phe Ser Val Phe Lys His130 135 140
Asp Asp Thr Gly Val Glu Ala Ile Arg Thr Leu Ser Tyr Ser Ile Pro145 150 155 160
Ala Glu Leu Gln Gly His Leu Asp Leu Val His Pro Thr Val Thr Phe165 170 175
Pro Asn Pro Tyr Ser His Leu Pro Val Phe Gln Ser Pro Val Lys Lys 180 185 190
Thr Ala Glu Ile Gln Asn Phe Thr Ala Gly Ala Ile Pro Ser Ser Cys195 200 205
Ser Ser Thr Ile Thr Pro Ala Cys Leu Gln Ala Ile Tyr Asn Ile Pro 210 215 220
Thr Thr Ala Ala Thr Glu Ser Ser Asn Gln Leu Gly Val Thr Gly Phe225 230 235 240
Ile Asp Gln Tyr Ala Asn Lys Lys Asp Leu Lys Thr Phe Leu Lys Lys 245 250 255
Tyr Arg Thr Asp Ile Ser Ser Ser Thr Thr Phe Thr Leu Gln Thr Leu260 265 270
Asp Gly Gly Ser Asn Ser Gln Thr Gly Ser Lys Ala Gly Val Glu Ala 275 280 285
Asn Leu Asp Ile Gln Tyr Thr Val Gly Val Ala Thr Gly Val Pro Thr290 295 300
Thr Phe Ile Ser Val Gly Asp Asp Phe Gln Asp Gly Asp Leu Glu Gly 305 310 315 320
Phe Leu Asp Val Ile Asn Ala Leu Leu Asp Glu Asp Ala Pro Pro Ser325 330 335
Val Leu Thr Thr Ser Tyr Gly Gln Asp Glu Ser Thr Ile Ser Arg Ala 340 345 350
Leu Ala Val Lys Leu Cys Asn Ala Tyr Ala Gln Leu Gly Ala Arg Gly355 360 365
Val Ser Ile Leu Phe Ala Ser Gly Asp Gly Gly Val Ser Gly Ser Gln 370 375 380
Ser Ala Ser Cys Ser Lys Phe Val Pro Thr Phe Pro Ser Gly Cys Pro385 390 395 400
Tyr Met Thr Ser Val Gly Ala Thr Gln Gly Val Asn Pro Glu Thr Ala405 410 415
Ala Asp Phe Ser Ser Gly Gly Phe Ser Asn Tyr Trp Gly Val Pro Asp420 425 430
Tyr Gln Ser Asp Ala Val Ser Thr Tyr Leu Ser Ala Leu Gly Lys Thr435 440 445
Asn Ser Gly Lys Tyr Asn Ala Ser Gly Arg Gly Phe Pro Asp Val Ser450 455 460
Thr Gln Gly Val Ser Phe Glu Val Val Val Asp Gly Ser Val Glu Ala465 470 475 480
Val Asp Gly Thr Ser Cys Ala Ser Pro Thr Phe Ala Ser Ile Ile Ser
485
490 495
5
Leu Val Asn Asp Lys Leu Val Ala Ala Gly Lys Ser Pro Leu Gly Phe500 505 510
10 15
Leu Asn Pro Phe Leu Tyr Ser Asp Gly Val Ala Ala Leu Asn Asp Ile515 520 525 Thr Ser Gly Ser Asn Pro Gly Cys Asn Thr Asn Gly Phe Pro Ala Lys530 535 540 Lys Gly Trp Asp Pro Val Thr Gly Leu Gly Thr Pro Asp Phe Lys Lys545 550 555 560
20
Leu Leu Thr Ala Val Gly Leu565

Claims (19)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Polipéptido aislado dotado de actividad de proteasa, seleccionado del grupo constituido por:
    (a) un polipéptido que presenta al menos un 84% de identidad de secuencia con el polipéptido de SEQ ID N.º: 5;
    5 (b) un polipéptido codificado por un polinucleótido que presenta al menos un 84% de identidad de secuencia con la secuencia codificante del polipéptido maduro de SEQ ID N.º: 1;
    (c) una variante del polipéptido de SEQ ID N.º: 5 comprendiendo una sustitución, deleción, y/o inserción en una o más posiciones, en la que el número total de sustituciones, deleciones y/o inserciones de aminoácidos no es superior a 20; y
    10 (d) un fragmento de un polipéptido de (a), (b) o (c) dotado de actividad de proteasa,
    en el que el polipéptido tiene una actividad de proteasa mejorada entre pH 3 y 4, a 25°C en comparación con la proteasa con la secuencia mostrada en SEQ ID N.º: 8 de la cepa NRRL 18262.
  2. 2. Polipéptido según la reivindicación 1 que comprende o consiste en SEQ ID N.º: 2, SEQ ID N.º: 4, SEQ ID N.º: 5 o SEQ ID N.º: 6.
    15 3. Composición que comprende el polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2.
  3. 4.
    Composición según la reivindicación 3 que está en forma de un granulado o un microgranulado.
  4. 5.
    Polinucleótido aislado que codifica el polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2.
  5. 6.
    Constructo de ácido nucleico o vector de expresión que comprende el polinucleótido según la reivindicación 5
    unido operativamente a una o más secuencias de control que dirigen la producción del polipéptido en una célula 20 huésped de expresión.
  6. 7. Célula huésped de expresión recombinante comprendiendo el polinucleótido según la reivindicación 5 unido operativamente a una o más secuencias de control que dirigen la producción del polipéptido, donde el huésped es seleccionado del grupo constituido por Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Bjerkandera, Ceriporiopsis, Chrysosporium, Coprinus, Coriolus, Cryptococcus, Filibasidium, Fusarium, Humicola, Magnaporthe, Mucor, 25 Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Phanerochaete, Phlebia, Piromyces, Pleurotus, Schizophyllum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trametes, y Trichoderma o en la que el huésped es una levadura, tal como Pichia o Saccharomyces, o un Bacillus tal como Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Geobacillus stearothermophilus, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus
    30 megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis o Bacillus thuringiensis.
  7. 8.
    Célula huésped según la reivindicación 7, donde el huésped es un Aspergillus, tal como Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger o Aspergillus oryzae.
  8. 9.
    Método para producir el polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, que comprende:
    (a) el cultivo de una célula, que en su forma tipo salvaje produce el polipéptido, bajo condiciones que 35 conducen a la producción del polipéptido; y
    (b) la recuperación del polipéptido.
  9. 10. Método para producir el polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, que comprende:
    (a) el cultivo de una célula huésped según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 8 bajo condiciones que
    conducen a la producción del polipéptido; y 40 (b) la recuperación del polipéptido.
  10. 11.
    Composición de pienso para animales que comprende el polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2.
  11. 12.
    Composición de pienso para animales según la reivindicación 11, que comprende además una o más amilasas, fitasas, xilanasas, galactanasas, alfa-galactosidasas, proteasas, fosfolipasas, beta-glucanasas, o cualquier mezcla de las mismas.
  12. 13.
    Composición de pienso para animales según la reivindicación 12, que comprende además al menos un probiótico o producto microbiano para alimentación directa (DFM).
  13. 14.
    Uso de al menos un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2
    en piensos para animales; en aditivos de piensos para animales; en la preparación de una composición para usar en piensos para animales; para mejorar el valor nutricional de un pienso para animales; para aumentar la proteína digerible y/o soluble en piensos para animales; para aumentar el grado de hidrólisis de proteínas en dietas animales; y/o para el tratamiento de proteínas.
  14. 15.
    Método para mejorar el valor nutricional de un pienso para animales, en el que al menos un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2 se añade al pienso.
  15. 16.
    Aditivo para piensos para animales que comprende
    al menos un polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2; y al menos una vitamina liposoluble, y/o al menos una vitamina hidrosoluble, y/o al menos un oligoelemento.
  16. 17.
    Aditivo para piensos para animales según la reivindicación 16, que comprende además una o más amilasas; fitasas; xilanasas; galactanasas; alfa-galactosidasas; proteasas, fosfolipasas, beta-glucanasas, o cualquier mezcla de las mismas.
  17. 18.
    Pienso para animales que tiene un contenido de proteína bruta de 50 a 800 g/kg y que comprende al menos un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2.
  18. 19.
    Método para el tratamiento de proteínas, que comprende el paso de la adición de al menos un polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2 a al menos una proteína o fuente de proteínas.
  19. 20.
    Método según la reivindicación 19, en el que se incluye soja o harina de soja entre la al menos una fuente de proteínas.
    Figura 1
    Figura 2
    Figura 3
    Figura 4
    Figura 5
    Figura 6
    Figura 7
    Figura 8
    Figura 9
    Figura 10
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