ES2695125T3

ES2695125T3 - Métodos y organismos para la producción de 1,4-butanodiol acoplada al crecimiento

Info

Publication number: ES2695125T3
Application number: ES13001197T
Authority: ES
Inventors: Anthony P Burgard; Dien Stephen J Van; Mark J Burk
Original assignee: Genomatica Inc
Current assignee: Genomatica Inc
Priority date: 2007-08-10
Filing date: 2008-08-06
Publication date: 2019-01-02
Anticipated expiration: 2028-08-06
Also published as: EP3447133B1; EP2185708A1; AU2008287072B2; EP2679685A1; ES2583179T3; US20110201071A1; EP2679676B1; US20200095616A1; AU2008287072A1; BRPI0815138A2; DK2679676T3; PL2679676T3; US20170240931A1; EP2679685B1; US8470582B2; HUE040654T2; US20090047719A1; CA2695706A1; CA2695706C; US20140030780A1

Abstract

Método para fabricar un producto posterior de 4-hidroxibutirato o 1,4-butanodiol, que comprende: (a) cultivar en fase de crecimiento exponencial en una cantidad suficiente de nutrientes y medios un microorganismo no natural que comprende perturbación de los genes adhE, ldhA, pflAB y mdh, en el que dicho microorganismo expresa al menos un ácido nucleico exógeno que codifica para una enzima en una ruta biosintética de 4-hidroxibutirato o 1,4-butanodiol en cantidades suficientes para producir 4- hidroxibutirato o 1,4-butanodiol, codificando dicho al menos un ácido nucleico exógeno para 4- hidroxibutanoato deshidrogenasa, semialdehído succínico deshidrogenasa independiente de CoA, succinil- CoA sintetasa, semialdehído succínico deshidrogenasa dependiente de CoA, 4-hidroxibutirato:CoA transferasa, glutamato:semialdehído succínico transaminasa, glutamato descarboxilasa, aldehído deshidrogenasa independiente de CoA, aldehído deshidrogenasa dependiente de CoA o alcohol deshidrogenasa, y en el que dicho microorganismo produce 4-hidroxibutirato o 1,4-butanodiol; (b) aislar opcionalmente 4-hidroxibutirato o 1,4-butanodiol; y (c) convertir químicamente 4-hidroxibutirato o 1,4-butanodiol en el producto posterior.

Description

DESCRIPCION

Metodos y organismos para la produccion de 1,4-butanodiol acoplada al crecimiento

Antecedentes de la invencion

La presente invencion se refiere generalmente a metodos para fabricar productos posteriores de 4-hidroxibutirato o 1.4- butanodiol.

1.4- Butanodiol (BDO) es un dialcohol de cuatro atomos de carbono que actualmente se fabrica exclusivamente a traves de varias rutas petroqmmicas. El BDO forma parte de una familia de disolventes e intermedios polimericos de gran volumen que incluye gamma-butirolactona (GBL), tetrahidrofurano (THF), pirrolidona, N-metilpirrolidona (NMP), y N-vinil-pirrolidona. La oportunidad global de mercado para esta familia excede los 4.000 millones de $.

Se producen globalmente al ano aproximadamente 2.500 millones de libras de BDO con un crecimiento anual del 4 5% con un precio reciente de venta que vana de 1,00 a 1,20 $/lb. La demanda de BDO se debe en gran parte a su uso como compuesto intermedio de las resinas plasticas de tereftalato de polibutileno (PBT), poliuretanos termoplasticos y eteres de copoliester. BDO sirve tambien como precursor principal de THF, que se emplea como compuesto intermedio para los copolfmeros de poli(tetrametilenglicol) PTMEG necesarios para la produccion de lycra y spandex. Se producen globalmente aproximadamente 700 millones de lb de THF por ano con una tasa anual de crecimiento de aproximadamente el 6%. Un porcentaje significativo del crecimiento (>30%) de BDO y THF se produce en Asia (China e India). GBL es actualmente un producto de un volumen mas pequeno (400 millones de lb/ano) que tiene numerosas aplicaciones como disolvente, como un aditivo para tintas, pinturas, y colorantes, asf como el precursor primario de derivados de pirrolidona tales como NMP.

Los procesos convencionales para la smtesis de BDO usan materias primas petroqmmicas como sus materiales de partida. Por ejemplo, se hace reaccionar acetileno con 2 moleculas de formaldehndo en la reaccion de smtesis de Reppe (Kroschwitz y Grant, Encyclopedia of Chem. Tech., John Wiley and Sons, Inc., Nueva York (1999)), seguido por hidrogenacion catalttica para formar 1,4-butanodiol. Se ha estimado que el 90% del acetileno producido en los Estados Unidos se consume en la produccion de butanodiol. Como alternativa, se puede formar por esterificacion e hidrogenacion catalttica de anhndrido maleico, que se deriva de butano. Posteriormente, el butanodiol se puede transformar adicionalmente; por ejemplo, mediante oxidacion de la Y-butirolactona, que se puede convertir adicionalmente en pirrolidona y N-metil-pirrolidona, o hidrogenolisis del tetrahidrofurano (figura 1). Estos compuestos tienen usos variados como compuestos intermedios, disolventes, y aditivos polimericos, y tienen un mercado combinado de casi 2000 millones de lb/ano.

Las soluciones convencionales basadas en materias primas de hidrocarburos utilizan metano para producir formaldetndo. Por tanto, un gran porcentaje de la produccion comercial de BDO se basa en metano como material de partida. La produccion de acetileno se basa tambien en materiales de partida basados en petroleo (vease la figura 1). Por tanto, los costes de produccion de BDO fluctuan con el precio del petroleo y el gas natural.

El documento JPS62285779 (A) se refiere a una cepa bacteriana que pertenece al genero Bacillus (cepa C-105 (FERM P-8788)) y a la produccion de 1,4-butanodiol usando la misma.

Es deseable desarrollar un metodo para la produccion de estos productos qmmicos por medios alternativos que sustituyan no solo materias primas basadas en petroleo por renovables, y usen tambien menos energfa y procesos de menor coste de inmovilizado. El Departamento de energfa de Estados Unidos ha propuesto los 1,4-diacidos, y particularmente el acido succmico, como compuestos intermedios clave producidos biologicamente para la fabricacion de la familia de productos del butanodiol (DOE Report, "Top Value-Added Chemicals from Biomass” , 2004). Sin embargo, el acido succmico es muy costoso de aislar y purificar y requiere elevadas temperaturas y presiones para la reduccion catalftica a butanodiol.

Por tanto, existe una necesidad de medios alternativos para producir eficazmente cantidades comerciales de 1,4-butanodiol y sus precursores qmmicos. La presente invencion satisface esta necesidad y proporciona tambien ventajas relacionadas.

Sumario de la invencion

La invencion se define mediante las reivindicaciones.

Breve descripcion de los dibujos

El archivo de patente o de solicitud contiene al menos un dibujo ejecutado a color. La Oficina proporcionara copias de esta patente o publicacion de solicitud de patente con dibujos a color, previa peticion y pago de la tasa necesaria.

La Figura 1 es un diagrama esquematico que muestra un punto de entrada del acido 4-hidroxibutanoico (4-HB) en la lmea de producto de la familia de productos qmmicos del 1,4-butanodiol (BDO), y la comparacion con las rutas de smtesis qmmica de las materias primas petroqmmicas. Las flechas negras solidas muestran las rutas de smtesis qmmica; las flechas azules punteadas muestran una ruta biosintetica de 4-HB y las posteriores etapas de conversion de la familia de productos qmmicos de BDO.

La Figura 2 es un diagrama esquematico que muestra las rutas bioqmmicas de produccion de 4-hidroxibutirato (4-HB) y Y-butirolactona (GBL). Los enzimas que catalizan las reacciones biosinteticas de 4-HB son: (1) semialdelmdo succmico deshidrogenasa independiente de CoA; (2) succinil-CoA sintetasa; (3) semialdelmdo succmico deshidrogenasa dependiente de CoA; (4) glutamato: semialdelmdo succmico transaminasa; (5) glutamato decarboxilasa; (6) 4-hidroxibutanoato deshidrogenasa. La conversion (7) corresponde a una reaccion no enzimatica espontanea, que convierte 4-HB en GBL.

La Figura 3 es un diagrama esquematico que muestra la smtesis qmmica de 1,4-butanodiol (BDO) y los productos posteriores Y-butirolactona (GBL), tetrahidrofurano (THF) y algunas pirrolidonas.

La Figura 4 es un diagrama de flujo de proceso esquematico de los bioprocesos de produccion de Y-butirolactona. El panel (a) ilustra la fermentacion con alimentacion discontinua con separacion discontinua y el panel (b) ilustra la fermentacion con alimentacion discontinua con separacion continua.

La Figura 5 muestra la envolvente de produccion teorica de una cepa disenada mediante OptKnock comparada con una cepa tfpica de produccion no acoplada al crecimiento. Senalar que las trayectorias evolutivas potenciales de la cepa OptKnock son fundamentalmente diferentes en que conduce a un fenotipo de alta produccion.

La Figura 6 muestra las rutas bioqmmicas que conducen hasta el 1,4-butanodiol. 1) semialdelmdo succmico deshidrogenasa independiente de CoA; 2) succinil-CoA sintetasa; 3) semialdelmdo succmico deshidrogenasa dependiente de CoA; 4) glutamato: semialdehfdo succmico transaminasa; 5) glutamato decarboxilasa; 6) 4-hidroxibutanoato deshidrogenasa; 7) 4-hidroxibutiril CoA:acetil-CoA transferasa; 8) aldehfdo deshidrogenasa; 9) alcohol deshidrogenasa.

La Figura 7 muestra los lfmites de solucion de la tasa de crecimiento anaerobio frente al rendimiento de BDO para una cepa de E. coli que tiene las rutas de produccion de BDO mostradas y las desactivaciones genicas previstas por OptKnock en la Figura 5 suponiendo a) la irreversibilidad de la PEP carboxiquinasa y b) la reversibilidad de la PEP carboxiquinasa. Se supuso una tasa de captacion de glucosa basa de 20 mmol/gDW/h junto con un requerimiento de mantenimiento de ATP no asociado al crecimiento de 7,6 mmol/gDW/h.

La Figura 8 muestra una representacion grafica del metabolismo central de E. coli.

La Figura 9 muestra los lfmites de solucion de la tasa de crecimiento anaerobio frente al rendimiento de BDO para una cepa de E. coli que tiene las rutas de produccion de BDO mostradas y las desactivaciones genicas previstas por OptKnock en la Figura 5 suponiendo la reversibilidad de la PEP carboxiquinasa. Se supuso una tasa de captacion de glucosa basa de 20 mmol/gDW/h junto con un requerimiento de mantenimiento de ATP no asociado al crecimiento de 7,6 mmol/gDW/h.

Descripcion detallada de la invencion

Esta invencion se refiere al diseno y a la produccion de microorganismos que no se producen naturalmente que tienen capacidades de produccion biosinteticas para el acido 4-hidroxibutanoico (4-HB), Y-butirolactona y 1,4-butanodiol. La invencion utiliza modelos estequiometricos in silico del metabolismo de Escherichia coli que identifican disenos metabolicos para la produccion biosintetica de acido 4-hidroxibutanoico (4-HB) y 1,4-butanodiol (BDO). Los resultados descritos en el presente documento indican que se pueden disenar y conseguir mediante ingeniena genetica recombinante rutas metabolicas para conseguir la biosmtesis de 4-HB y de los productos posteriores tales como 1,4-butanodiol en Escherichia coli y otras celulas u organismos. La produccion biosintetica de 4-HB, por ejemplo, para los disenos in silico se puede confirmar mediante la construccion de cepas que tienen el genotipo metabolico disenado. Estas celulas u organismos disenados metabolicamente mediante ingeniena genetica se pueden someter a evolucion adaptativa para aumentar adicionalmente la biosmtesis de 4-HB, incluyendo en condiciones que se aproximan al crecimiento maximo teorico.

La invencion se refiere ademas a estrategias de diseno mediante ingeniena metabolica para obtener rendimientos elevados de 1,4-butanodiol (BDO) en Escherichia coli (veanse los Ejemplos V-VII). Como se divulga en el presente documento, se empleo un modelo estequiometrico a escala genomica del metabolismo de E. coli utilizando la infraestructura informatica de optimizacion de dos niveles OptKnock para identificar estrategias informaticas con multiples inactivaciones genicas. Las deleciones se introducen de tal manera que se reduce la redundancia en la red con el efecto en ultima instancia de acoplar el crecimiento a la produccion de BDO en la red. Las caractensticas de produccion de BDO acopladas al crecimiento de las cepas disenadas las convierten en geneticamente estables y adecuadas para bioprocesos continuos. Se identificaron estrategias de diseno de cepas suponiendo la adicion de capacidades de reaccion no naturales en E. coli que conducen a una ruta metabolica desde el succinato semialdetndo a BDO. De los cientos de estrategias identificadas por OptKnock, surgio un diseno que satisface multiples criterios. Este diseno, que utiliza la eliminacion de adhE, IdhA, mdh, aspA, y pflAB, 1) conduce a un elevado rendimiento de BDO previsto a crecimiento maximo, 2) requirio un numero de desactivaciones razonable, 3) no tuvo un efecto perjudicial sobre el rendimiento teorico maximo de BDO, 4) consiguio un acoplamiento fuerte entre la produccion de ^bD^oy el crecimiento celular, y 5) era solido con respecto a la supuesta irreversibilidad o reversibilidad de la PEP carboxiquinasa. Se divulgan tambien en el presente documento metodos para el ensayo experimental de disenos de cepas y su evolucion hacia el crecimiento maximo teorico.

En determinadas realizaciones, las caractensticas de la biosmtesis de 4-HB de las cepas disenadas las convierten en geneticamente estables y adecuadas para bioprocesos continuos. Se identificaron estrategias de diseno de cepas independientes con la incorporacion de capacidades de reaccion no naturales o heterologas diferente en E. coli que conducen a rutas metabolicas productoras de 4-HB y 1,4-butanodiol derivados de la semialdetndo succmico deshidrogenasa independiente de CoA, succinil-CoA sintetasa y semialdetndo succmico deshidrogenasa dependiente de CoA, o glutamato:semialdetndo succmico transaminasa. Se identificaron disenos metabolicos in silico que dieron como resultado la biosmtesis de 4-HB en especies de E. coli y levadura procedentes de cada una de estas rutas metabolicas. El compuesto intermedio de 1,4-butanodiol, Y-butirolactona, se puede generar en cultivo mediante ciclacion espontanea en condiciones de pH<7,5, particularmente en condiciones acidas, tales como por debajo de pH 5,5, por ejemplo, pH<7, pH<6,5, pH<6, y particularmente a pH<5,5 o inferior.

Las cepas identificadas mediante el componente de calculo de la plataforma pueden llevarse a la produccion real genomanipulando cualquiera de las alteraciones metabolicas previstas que conducen a la produccion biosintetica de 4-HB, 1,4-butanodiol u otros compuestos intermedios y/o productos posteriores. En otra realizacion mas, las cepas que presentan produccion biosintetica de estos compuestos pueden someterse adicionalmente a evolucion adaptativa para aumentar ademas la biosmtesis del producto. Los niveles de rendimiento de la biosmtesis del producto despues de la evolucion adaptativa tambien se pueden predecir mediante el componente de calculo del sistema.

Tal como se usa en el presente documento, se pretende que el termino "que no se produce naturalmente", cuando se usa en referencia a un organismo microbiano o microorganismo de la divulgacion signifique que el organismo microbiano tiene al menos una alteracion genetica que no se encuentra normalmente en una cepa que se produce naturalmente de las especies citadas, incluyendo las cepas silvestres de las especies citadas. Las alteraciones geneticas incluyen, por ejemplo, modificaciones que introducen acidos nucleicos expresables que codifican polipeptidos metabolicos, otras adiciones de acidos nucleicos, deleciones de acidos nucleicos y/u otras perturbaciones funcionales del material genetico microbiano. Dicha modificacion incluye, por ejemplo, regiones codificantes y fragmentos funcionales de las mismas, de polipeptidos heterologos, homologos o heterologos y homologos de las especies citadas. Las modificaciones adicionales incluyen, por ejemplo, regiones reguladoras no codificantes en las que las modificaciones alteran la expresion de un gen u operon. Los polipeptidos metabolicos ilustrativos incluyen enzimas comprendidas en la ruta biosintetica de 4-HB y enzimas comprendidas en la ruta biosintetica de la familia de compuestos de BDO.

Una modificacion metabolica se refiere a una reaccion bioqmmica que esta alterada a partir de su estado que se produce naturalmente. Por tanto, los microorganismos que no se producen naturalmente tienen modificaciones geneticas en acidos nucleicos que codifican polipeptidos metabolicos o, fragmentos funcionales de los mismos. Se describen modificaciones metabolicas ilustrativas adicionalmente a continuacion para E. coli y organismos microbianos de levaduras.

Tal como se usa en el presente documento, se pretende que el termino "aislado", cuando se usa en referencia a un organismo microbiano, signifique un organismo que esta sustancialmente exento de al menos un componente que posee el organismo microbiano natural citado. El termino incluye un organismo microbiano al que se eliminan alguno o todos los componentes que se encuentran en su entorno natural. El termino incluye tambien un organismo microbiano al que se eliminan alguno o todos los componentes que el organismo microbiano tiene en entornos que no se producen naturalmente. Por tanto, un organismo microbiano aislado esta parcial o completamente separado de otras sustancias que se encuentran en la naturaleza o a medida que crece, se almacena o subsiste en entornos que no se producen naturalmente. Los ejemplos espedficos de organismos microbianos aislados incluyen microbios parcialmente puros, microbios sustancialmente puros y microbios cultivados en un medio que no se produce naturalmente.

Tal como se usa en el presente documento, se pretende que los terminos "microbiano", "organismo microbiano" o "microorganismo" signifiquen cualquier organismo que exista como una celula microscopica que este incluido en los dominios de archaea, bacteria o eukarya. Por tanto, se pretende que el termino abarque celulas u organismos procariotas o eucariotas que tengan un tamano microscopico e incluye bacterias, archaeas y eubacterias de todas las especies, asf como microorganismos eucariotas tales como levaduras y hongos. El termino incluye tambien cultivos celulares de cualquier especie que se pueda cultivar para la produccion de un producto bioqmmico.

Tal como se usa en el presente documento, se pretende que el termino "acido 4-hidroxibutanoico" signifique un derivado 4-hidroxi de acido butmco que tiene la formula qmmica C4H8O3 y una masa molecular de 104,11 g/mol (126,09 g/mol para su sal de sodio). El compuesto qmmico acido 4-hidroxibutanoico se conoce tambien en la tecnica como 4-HB, 4-hidroxibutirato, acido gamma-hidroxibutmco o GHB. Se pretende que el termino tal como se usa en el presente documento incluya cualquiera de las diversas formas salinas de los compuestos e incluye, por ejemplo, 4-hidroxibutanoato y 4-hidroxibutirato. Los ejemplos espedficos de formas salinas de 4-HB incluyen sodio 4-HB y potasio 4-HB. Por tanto, los terminos acido 4-hidroxibutanoico, 4-HB, 4-hidroxibutirato, 4-hidroxibutanoato, acido gamma-hidroxibutmco y GBH asf como otros nombres reconocidos en la tecnica se usan como sinonimos en el presente documento.

Tal como se usa en el presente documento, se pretende que el termino "monomerico" cuando se usa en referencia a 4-HB signifique 4-HB en forma no polimerica o sin derivatizar. Los ejemplos espedficos de 4-HB polimerico incluyen acido poli-4-hidroxibutanoico y los copolfmeros de, por ejemplo, 4-Hb y 3-HB. Un ejemplo espedfico de una forma derivatizada de 4-HB es 4-HB-CoA. Se conocen tambien en la materia otras formas de 4-HB polimericas y otras formas derivatizadas de 4-HB.

Tal como se usa en el presente documento, se pretende que el termino ‘Vbutirolactona” signifique una lactona que tiene la formula qmmica C4H6O2 y una masa molecular de 86,089 g/mol. El compuesto qmmico Y-butirolactona se conoce tambien en la tecnica como GBL, butirolactona, 1,4-lactona, 4-butirolactona, acido 4-hidroxibutmco lactona, y acido gamma-hidroxibutmco lactona. Se pretende que el termino, tal como se usa en el presente documento, incluya cualquiera de las diversas formas salinas de los compuestos.

Tal como se usa en el presente documento, se pretende que el termino "1-4 butanodiol" signifique un derivado de alcohol del alcano butano, que transporta dos grupos hidroxilo que tienen la formula qmmica C4H10O2 y una masa molecular de 90,12 g/mol. El compuesto qmmico 1,4 butanodiol se conoce tambien en la tecnica como BDO y es un compuesto intermedio o precursor qmmico de una familia de compuestos denominada en el presente documento como familia BDO de compuestos, algunos de los cuales se ilustran en la figura 1.

Tal como se usa en el presente documento, se pretende que el termino "tetrahidrofurano" signifique un compuesto organico heterodclico que corresponde al analogo completamente hidrogenado del compuesto aromatico furano que tiene la formula qmmica C4H8O y una masa molecular de 72,11 g/mol. El compuesto qmmico tetrahidrofurano se conoce tambien en la tecnica como THF, tetrahidrofurano, 1,4-epoxibutano, oxido de butileno, oxido de ciclotetrametileno, oxaciclopentano, oxido de dietileno, oxolano, furanidina, hidrofurano, tetraoxido de metileno. Se pretende que el termino, tal como se usa en el presente documento, incluya cualquiera de las diversas formas salinas de los compuestos.

Tal como se usa en el presente documento, se pretende que el termino "CoA" o "coenzima A" signifique un cofactor organico o grupo prostetico (parte no proteica de un enzima) cuya presencia se requiere para la actividad de muchas enzimas (la apoenzima) para formar un sistema enzimatico activo. La coenzima A funciona en determinadas enzimas condensadoras, actua en la transferencia del acetilo u otros grupos acilo y en la smtesis y oxidacion de acidos grasos, la oxidacion del piruvato y en otras acetilaciones.

Tal como se usa en el presente documento, se pretende que el termino "sustancialmente anaerobio", cuando se usa en referencia a un cultivo o condicion de crecimiento, signifique que la cantidad de oxfgeno es menos de aproximadamente 10% de saturacion para el oxfgeno disuelto en un medio lfquido. Se pretende tambien que el termino incluya camaras precintadas de medio lfquido o solido mantenidas con una atmosfera de menos de aproximadamente un 1% de oxfgeno.

Los organismos microbianos no naturales tal como se divulgan pueden contener alteraciones geneticas estables, que se refieren a microorganismos que se pueden cultivar durante mas de cinco generaciones sin perder la alteracion. En general, las alteraciones geneticas estables incluyen modificaciones que persisten mas de 10 generaciones, las modificaciones particularmente estables persistiran mas de aproximadamente 25 generaciones, y mas especialmente, las modificaciones geneticas estables seran superiores a 50 generaciones, incluyendo de forma indefinida.

Los expertos en la materia entenderan que las alteraciones geneticas, incluyendo las modificaciones metabolicas ilustradas en el presente documento, se describen con referencia a genes de E. coli y levadura y sus correspondientes reacciones metabolicas. Sin embargo, dada la secuenciacion completa del genoma de una amplia variedad de organismos y el alto nivel de capacidad en el campo de la genomica, los expertos en la materia seran facilmente capaces de aplicar las ensenanzas y las directrices proporcionadas en el presente documento esencialmente a todos los diferentes organismos. Por ejemplo, las alteraciones metabolicas de E. coli ilustradas en el presente documento pueden aplicarse facilmente a otras especies incorporando los mismos acidos nucleicos codificantes o sus analogos de especies diferentes de las especies citadas. Dichas alteraciones geneticas incluyen, por ejemplo, alteraciones geneticas de especies homologas, por lo general, y en particular, ortologas, desplazamientos de genes paralogos o no ortologos.

Un ortologo es un gen o genes que estan relacionados por una descendencia vertical y son responsables de funciones sustancialmente iguales o identicas en diferentes organismos. Por ejemplo, la epoxido hidrolasa de raton y la epoxido hidrolasa de ser humano se pueden considerar ortologos para la funcion biologica de hidrolisis de los epoxidos. Los genes estan relacionados por una descendencia vertical cuando, por ejemplo, comparten una similitud de secuencias en cantidad suficiente para indicar que son homologos, o estan relacionados evolutivamente a partir de un ancestro comun. Los genes se pueden considerar tambien ortologos si comparten la estructura tridimensional pero no necesariamente la similitud de la secuencia, de una cantidad suficiente para indicar que han evolucionado a partir de un ancestro comun en la medida en la que la similitud de la secuencia primaria no sea identificable. Los genes que son ortologos pueden codificar protemas con una similitud de secuencias de aproximadamente 25% a 100% de identidad en la secuencia de aminoacidos. Puede considerarse que los genes que codifican protemas que comparten una similitud de aminoacidos menor del 25% proceden de descendencia vertical si su estructura tridimensional muestra tambien similitudes. Los miembros de la familia de enzimas de las serina proteasas, incluyendo el activador del plasminogeno tisular y la elastasa, se consideran procedentes de una descendencia vertical a partir de un ancestro comun.

Los ortologos incluyen genes o sus productos genicos codificados que mediante, por ejemplo, evolucion, han divergido en estructura o actividad global. Por ejemplo, donde una especie codifica un producto genico que presenta dos funciones y donde dichas funciones se han separado en distintos genes en una segunda especie, los tres genes y sus correspondientes productos se considera ortologos. Para la produccion acoplada al crecimiento de un producto bioqmmico, los expertos en la materia entenderan que el gen ortologo que hospeda la actividad metabolica que se va a perturbar es el que se va a seleccionar para la construccion del microorganismo no natural. Un ejemplo de ortologos que presentan actividades separables es cuando distintas actividades se han separado en distintos productos genicos entre dos o mas especies o en una unica especie. Un ejemplo espedfico es la separacion de la proteolisis de la elastasa y la proteolisis del plasminogeno, dos tipos de actividad serina proteasa, en moleculas distintas como activador del plasminogeno y la elastasa. Un segundo ejemplo es la separacion de la actividad de la 5'-3' exonucleasa de micoplasma y la actividad de la ADN polimerasa III. La ADN polimerasa de la primera especie se puede considerar un ortologo para cualquiera o ambas exonucleasa o polimerasa de la segunda especie y viceversa.

Por el contrario, los paralogos son homologos relacionados por, por ejemplo, duplicacion seguida de divergencia evolutiva y que tienen funciones similares o comunes, pero no funciones identicas. Los paralogos pueden originarse o derivarse de, por ejemplo, la misma especie o de una especie diferente. Por ejemplo, la epoxido hidrolasa microsomial (epoxido hidrolasa I) y la epoxido hidrolasa soluble (epoxido hidrolasa II) se pueden considerar paralogos por que representan dos enzimas distintas, que han evolucionado simultaneamente a partir de un ancestro comun, que catalizan diferentes reacciones y que tiene funciones distintas en la misma especie. Los paralogos son protemas de la misma especie con una similitud de secuencias significativa entre sf sugiriendo que son homologas, o relacionadas a traves de evolucion simultanea a partir de un ancestro comun. Los grupos de familias de protemas paralogas incluyen los homologos de HipA, genes de la luciferasa, peptidasas, y otros.

El desplazamiento de un gen no ortologo es un gen no ortologo de una especie que se puede sustituir por una funcion genica de una especie diferente a la que se hace referencia. La sustitucion incluye, por ejemplo, ser capaz de llevar a cabo sustancialmente la misma funcion o una funcion similar en la especie de origen en comparacion con la funcion a la que se hace referencia en la especie diferente. Aunque generalmente, el desplazamiento de un gen no ortologo se podra identificar como estructuralmente relacionado con un gen conocido que codifica la funcion a la que se hace referencia, los genes menos estructuralmente relacionados, pero funcionalmente similares, y sus correspondientes productos genomicos estaran comprendidos, sin embargo, en el significado del termino tal como se usa en el presente documento. La similitud funcional requiere, por ejemplo, al menos algo de similitud estructural en el sitio activo o la region de union de un gen no ortologo en comparacion con un gen que codifica la funcion que se desea sustituir. Por tanto, un gen no ortologo incluye, por ejemplo, un paralogo o un gen no relacionado.

Por tanto, en la identificacion y construccion de los organismos microbianos no naturales que tienen capacidad de biosmtesis de 4-HB, GBL y/o BDO, los expertos en la materia entenderan que, aplicando las ensenanzas y directrices proporcionadas en el presente documento para una especie concreta, la identificacion de las modificaciones metabolicas puede incluir la identificacion y la inclusion o la inactivacion de ortologos. En la medida en la que los desplazamientos de los genes paralogos y/o no ortologos estan presentes en el microorganismo citado que codifica un enzima que cataliza una reaccion metabolica similar o sustancialmente similar, los expertos en la materia tambien pueden utilizar estos genes relacionados evolutivamente.

Los desplazamientos de los genes ortologos, paralogos y no ortologos pueden determinarse mediante metodos bien conocidos por los expertos en la materia. Por ejemplo, el examen de las secuencias de acidos nucleicos o aminoacidos de dos polipeptidos revelara la identidad y las similitudes de secuencia entre las secuencias comparadas. Basandose en dichas similitudes, un experto en la materia puede determinar si la similitud es suficientemente alta para indicar que las protemas estan relacionadas evolutivamente a partir de un ancestro comun. Algoritmos bien conocidos por expertos en la materia, tales como Align, BLAST, Clustal W y otros comparan y determinan la similitud o identidad de la secuencia en bruto, y determinan tambien la presencia o significancia de huecos en la secuencia a los que se puede asignar a un peso o puntuacion. Dichos algoritmos tambien son bien conocidos en la tecnica y son analogamente aplicables para determinar la similitud o identidad de la secuencia de nucleotidos. Los parametros de similitud suficiente para determinar el parentesco se calculan besandose en metodos bien conocidos para calcular la similitud estadfstica, o la posibilidad de encontrar una correspondencia similar en un peptido aleatorio, y la significancia de la correspondencia determinada. Una comparacion informatica de dos o mas secuencias puede, si se desea, optimizarse tambien visualmente por los expertos en la materia. Puede esperarse que los productos o protemas genicas relacionadas tengan una similitud elevada, por ejemplo, 25% a l0o% de identidad de secuencias. Las protemas que no estan relacionadas pueden tener una identidad que es esencialmente la misma que la que se esperana que se produjera por azar, si se escaneara una base de datos de suficiente tamano (aproximadamente 5%). Las secuencias entre 5% y 24% pueden representar o no suficiente homologfa para concluir que las secuencias comparadas estan relacionadas. El analisis estadfstico adicional para determinar la significancia de dichas correspondencias dado el tamano del conjunto de datos se puede llevar a cabo para determinar la relevancia de estas secuencias.

Los parametros ilustrativos para determinar el parentesco de dos o mas secuencias usando el algoritmo BLAST, por ejemplo, pueden ser como se muestra a continuacion. En resumen, se pueden llevar a cabo las alineaciones de la secuencia de aminoacidos utilizando BLASTP version 2.0.8 (5 de enero de 1999) y los siguientes parametros: Matriz: 0: BLOSUM62; apertura de hueco: 11; extension de hueco: 1; x_desechar: 50; esperado: 10,0; tamano de palabra: 3; filtro: on. Se pueden llevar a cabo alineaciones de acidos nucleicos utilizando BLASTN version 2.0.6 (16 de septiembre de 1998) y los siguientes parametros: Correspondencia: 1; correspondencia incorrecta: -2; apertura de hueco: 5; extension de hueco: 2; x_desechar: 50; esperado: 10,0; tamano de palabra: 11; filtro: off Los expertos en la materia sabran que modificaciones se pueden hacer a los anteriores parametros para aumentar o disminuir el rigor de la comparacion, por ejemplo, y determinar el parentesco de dos o mas secuencias.

La divulgacion proporciona un biocatalizador microbiano que no se produce naturalmente que incluye un organismo microbiano que tiene una ruta biosintetica del acido 4-hidroxibutanoico (4-HB) que incluye al menos un acido nucleico exogeno que codifica la 4-hidroxibutanoato deshidrogenasa, semialdehfdo succmico deshidrogenasa independiente de CoA, succinil-CoA sintetasa, semialdehndo succmico deshidrogenasa dependiente de CoA, glutamato: semialdetndo succmico transaminasa o glutamato decarboxilasa, en el que el acido nucleico exogeno se expresa en cantidades suficientes para producir acido 4-hidroxibutanoico monomerico (4-HB). La succinil-CoA sintetasa se denomina tambien succinil-CoA sintasa o succinil CoA ligasa.

Los biocatalizadores microbianos que no se producen naturalmente de la divulgacion incluyen organismos microbianos que emplean combinaciones de reacciones metabolicas para producir biosinteticamente los compuestos de la divulgacion. Los compuestos ilustrativos producidos por los microorganismos no naturales incluyen, por ejemplo, acido 4-hidroxibutanoico, 1,4-butanodiol y Y-butirolactona. En la figura 1 se ilustran las relaciones de estos compuestos ilustrativos con respecto a la smtesis qrnmica o biosmtesis.

En una realizacion, se disena mediante ingeniena genetica un organismo microbiano no natural para producir 4-HB. Este compuesto es un punto de entrada util en la familia de compuestos de 1,4-butanodiol. Las reacciones bioqmmicas para la formacion de 4-HB a partir de succinato, a partir de succinato a traves de succinil-CoA o a partir de a-cetoglutarato se muestran en la figura 2.

La invencion se describe en el presente documento con referencia general a la reaccion metabolica, el reactivo o el producto de los mismos, o con referencia espedfica a uno o mas acidos nucleicos o genes que codifican un enzima asociada con, o que cataliza, la reaccion metabolica, el reactivo o el producto al que se hace referencia. Salvo que se indique de forma expresa lo contrario en el presente documento, los expertos en la materia entenderan que la referencia a una reaccion constituye tambien la referencia a los reactivos y productos de la reaccion. De manera similar, salvo que se indique de forma expresa lo contrario en el presente documento, la referencia a un reactivo o producto hace referencia tambien a la reaccion y que la referencia a cualquiera de esta reaccion metabolica constituye tambien una referencia al gen o genes que codifican los enzimas que catalizan la reaccion, el reactivo o el producto al que se hace referencia. Del mismo modo, dados los campos bien conocidos de la bioqmmica, enzimologfa y genomica metabolicas, la referencia hecha en el presente documento a un gen o un acido nucleico codificante constituye tambien una referencia a la correspondiente enzima codificada y a la reaccion que cataliza, asf como a los reactivos y productos de la reaccion.

La produccion de 4-HB por medios biosinteticos utilizando los organismos microbianos de la divulgacion es especialmente util debido ya que da como resultado 4-HB monomerico. Los organismos microbianos no naturales de la divulgacion y su biosmtesis de compuestos de la familia de 4-HB y BDO es tambien especialmente util ya que el producto 4-HB (1) se secreta; (2) esta desprovisto de cualesquiera derivatizaciones tales como Coenzima A; (3) evita los cambios termodinamicos durante la biosmtesis, y (4) permite la conversion qrnmica espontanea de 4-HB a Y-butirolactona (GBL) en un medio con pH acido. Esta caractenstica se ilustra posteriormente como etapa 7 en la figura 2 y es tambien especialmente util para una smtesis o biosmtesis qrnmica eficaz de compuestos de la familia BDO tales como 1,4-butanodiol y/o tetrahidrofurano (THF), por ejemplo.

Los organismos microbianos carecen generalmente de la capacidad de sintetizar 4-HB y, por tanto, cualquiera de los compuestos que se muestran en la figura 1 son conocidos por estar comprendidos en la familia de compuestos del 1.4- butanodiol o conocidos por los expertos en la materia por estar comprendidos en la familia de compuestos del 1.4- butanodiol. Ademas, los organismos que tienen todas las capacidades enzimaticas metabolicas necesarias no son conocidos por producir 4-HB a partir de los enzimas descritos y las rutas bioqmmicas ilustradas en el presente documento. Mas bien, con la posible excepcion de unos pocos microorganismos anaerobios descritos adicionalmente a continuacion, los microorganismos que tienen la capacidad enzimatica utilizan 4-HB como sustrato para producir, por ejemplo, succinato. Por el contrario, los organismos microbianos no naturales de la divulgacion generan 4-HB como producto. Tal como se ha descrito anteriormente, la biosmtesis de 4-HB en su forma monomerica no es solo particularmente util en la smtesis de la familia de compuestos de BDO, tambien permite la biosmtesis adicional de compuestos de la familia de BDO y evita en conjunto los procedimientos de smtesis qmmica.

Los organismos microbianos no naturales de la divulgacion que pueden producir 4-HB monomerico se producen asegurando que un organismo hospedador microbiano incluye capacidades funcionales para la smtesis bioqmmica completa de al menos una ruta biosintetica de 4-HB de la divulgacion. Asegurar al menos que una ruta biosintetica de 4-HB obligatoria confiere capacidad de biosmtesis de 4-HB sobre el organismo microbiano hospedador.

Se ilustran en el presente documento tres requisitos de las rutas biosinteticas de 4-HB que se muestran a fines ilustrativos en la figura 2. Un requisito de la ruta biosintetica de 4-HB incluye la biosmtesis de 4-HB a partir de succinato. Los enzimas que participan en esta ruta de 4-HB incluyen la semialdehndo succmico deshidrogenasa independiente de CoA y la 4-hidroxibutanoato deshidrogenasa. Otro requisito de la ruta biosintetica de 4-HB incluye la biosmtesis del succinato a traves de la succinil-CoA. Los enzimas que participan en esta ruta de 4-HB incluyen la succinil-CoA sintetasa, la semialdehndo succmico deshidrogenasa dependiente de CoA y la 4-hidroxibutanoato deshidrogenasa. Un tercer requisito de la ruta biosintetica de 4-HB incluye la biosmtesis de 4-HB a partir de acetoglutarato. Los enzimas que participan en esta ruta biosintetica de 4-HB incluyen glutamato:semialdehndo succmico transaminasa, glutamato decarboxilasa y 4-hidroxibutanoato deshidrogenasa. Cada una de estas rutas biosinteticas de 4-HB, sus sustratos, reactivos y productos se describen ademas adicionalmente en los Ejemplos.

Los organismos microbianos no naturales de la divulgacion se pueden producir introduciendo acidos nucleicos expresables que codifican una o mas de los enzimas que participan en una o mas rutas biosinteticas de 4-HB. Dependiendo del organismo microbiano hospedador seleccionado para la biosmtesis, se pueden expresar los acidos nucleicos para alguna o todas las rutas biosinteticas de 4-HB concretas. Por ejemplo, si un hospedador seleccionado es deficiente en ambas enzimas de la ruta del succinato a 4-HB (la ruta del succinato), y esta ruta se selecciona para la biosmtesis de 4-HB, entonces se introducen acidos nucleicos expresables de la semialdetndo succmico deshidrogenasa independiente de CoA y la 4-hidroxibutanoato deshidrogenasa en el hospedador para la posterior expresion exogena. Como alternativa, si el hospedador seleccionado es deficiente en 4-hidroxibutanoato deshidrogenasa, entonces se necesita un acido nucleico codificante de esta enzima para conseguir la biosmtesis de 4-HB.

De manera analoga, cuando se selecciona la biosmtesis de 4-HB para producirse a traves de la ruta del succinato a succinil-CoA (la ruta de la succinil-CoA), los acidos nucleicos que codifican las deficiencias del hospedador respecto a los enzimas succinil CoA sintetasa, semialdehndo succmico deshidrogenasa dependiente de CoA y/o 4-hidroxibutanoato deshidrogenasa deben expresarse exogenamente en el hospedador receptor. La seleccion de la biosmtesis de 4-HB a traves de la ruta del a-cetoglutarato al semialdehndo succmico (la ruta del a-cetoglutarato) utilizara la expresion exogena para cubrir las deficiencias del hospedador respecto a una o mas de los enzimas glutamato: semialdehndo succmico transaminasa, glutamato decarboxilasa y/o 4-hidroxibutanoato deshidrogenasa.

Dependiendo de los constituyentes de la ruta biosintetica de 4-HB de un organismo microbiano hospedador seleccionado, los biocatalizadores de 4-HB microbianos no naturales de la invencion incluiran al menos un acido nucleico que codifica una ruta de 4-HB expresada exogenamente y hasta los acidos nucleicos que codifican las seis rutas de 4-HB. Por ejemplo, se puede establecer la biosmtesis de 4-HB a partir de las tres rutas en un hospedador deficiente en 4-hidroxibutanoato deshidrogenasa mediante la expresion exogena de un acido nucleico que codifica una 4-hidroxibutanoato deshidrogenasa. Por el contrario, se puede establecer la biosmtesis de 4-HB a partir de las tres rutas en un hospedador deficiente en las seis enzimas mediante la expresion exogena de las seis semialdehndo succmico deshidrogenasas independientes de CoA, succinil-CoA sintetasa, semialdehndo succmico deshidrogenasa dependiente de CoA, glutamato: semialdehndo succmico transaminasa, glutamato decarboxilasa y 4-hidroxibutanoato deshidrogenasa.

Con las ensenanzas y directrices que se proporcionan en el presente documento, los expertos en la materia entenderan que el numero de acidos nucleicos codificantes que se introducen en una forma expresable seran equivalentes a las deficiencias de la ruta de 4-HB del organismo microbiano hospedador seleccionado. Por tanto, un organismo microbiano no natural de la divulgacion puede tener uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis acidos nucleicos codificantes que codifican las anteriores enzimas que constituyen las rutas biosinteticas de 4-HB. En algunas realizaciones, los organismos microbianos no naturales pueden incluir tambien otras modificaciones geneticas que facilitan u optimizan la biosmtesis de 4-HB o que transmiten otras funciones utiles para el organismo microbiano hospedador. Una de dichas funcionalidades adicionales puede incluir, por ejemplo, el aumento de la smtesis de uno o mas de los precursores de la ruta de 4-HB tal como succinato, succinil-CoA y/o a-cetoglutarato.

En algunas realizaciones, un organismo microbiano no natural de la divulgacion se genera a partir de un hospedador que contiene la capacidad enzimatica de sintetizar 4-HB. En esta realizacion espedfica puede ser util aumentar la smtesis o la acumulacion de un producto de la ruta de 4-HB hasta, por ejemplo, impulsar las reacciones de la ruta de 4-HB hacia la produccion de 4-HB. La smtesis aumentada o acumulacion se puede llevar a cabo mediante, por ejemplo, la sobreexpresion de acidos nucleicos que codifican una o mas de los enzimas de la ruta de 4-HB anteriormente descrita. Se puede producir la sobreexpresion del enzima o enzimas de la ruta de 4-HB, por ejemplo, mediante la expresion exogena del gen o genes endogenos, o mediante la expresion exogena del gen o genes heterologos. Por tanto, los organismos que se producen naturalmente pueden generarse facilmente para convertirse en organismos microbianos no naturales productores de 4-HB de la invencion mediante la sobreexpresion de uno, dos, tres, cuatro, cinco o los seis acidos nucleicos que codifican los enzimas de la ruta biosintetica de 4-HB. Ademas, se puede generar un organismo no natural mediante mutagenesis de un gen endogeno que da como resultado un aumento en la actividad de un enzima en la ruta biosintetica de 4-HB.

En realizaciones especialmente utiles, se emplea la expresion exogena. La expresion exogena confiere la capacidad de personalizar la expresion y/ los elementos reguladores del hospedador y la aplicacion para conseguir un nivel de expresion deseado que controla el usuario. Sin embargo, se puede utilizar tambien la expresion endogena en otras realizaciones tales como mediante la eliminacion de un efector regulador negativo o la induccion del promotor del gen cuando se une a un promotor inducible u otro elemento regulador. Por tanto, un gen endogeno que tiene un promotor inducible que se produce naturalmente puede regularse por exceso proporcionado el agente inductor adecuado, o la region reguladora de un gen endogeno se puede genomanipular para incorporar un elemento regulador inducible, permitiendo por tanto la regulacion de la expresion aumentada de un gen endogeno en el tiempo deseado. De manera similar, se puede incluir un promotor inducible como un elemento regulador de un gen exogeno introducido en un organismo microbiano no natural (vease el Ejemplo II).

Se pretende que "exogeno", tal como se usa en el presente documento, signifique que la molecula a la que se hace referencia o la actividad a la que se hace referencia se introduce en el organismo microbiano hospedador. Por tanto, el termino tal como se usa en referencia a la expresion de un acido nucleico codificante se refiere a la introduccion del acido nucleico codificante en una forma expresable en el organismo microbiano. Cuando se usa en referencia a una actividad biosintetica, el termino se refiere a una actividad que se introduce en el organismo hospedador de referencia. La fuente puede ser, por ejemplo, acidos nucleicos homologos o heterologos codificantes que expresan la actividad a la que se hace referencia tras su introduccion en el organismo microbiano hospedador. Por tanto, el termino "endogeno" se refiere a una molecula o actividad a la que se hace referencia que esta presente en el hospedador. De manera similar, el termino, cuando se usa en referencia a la expresion de un acido nucleico codificante, se refiere a la expresion de un acido nucleico codificante contenido en el organismo microbiano El termino "heterologo" se refiere a una molecula o actividad derivada de una fuente diferente de la de la especie a la que se hace referencia mientras que "homologo" se refiere a una molecula o actividad derivada del organismo microbiano hospedador. De acuerdo con ello, la expresion exogena de un acido nucleico codificante puede utilizar un acido nucleico homologo o heterologo codificante.

Las fuentes de acidos nucleicos codificantes de un enzima de la ruta de 4-HB pueden incluir, por ejemplo, cualquier especie donde el producto genico codificado es capaz de catalizar la reaccion a la que se hace referencia. Dichas especies incluyen organismos procariotas y eucariotas que incluyen, aunque no de forma limitativa, bacterias, incluyendo archaeas y eubacterias, y eucariotas, incluyendo levaduras, plantas, insectos, animales, y mairnferos, incluyendo seres humanos. Por ejemplo, los organismos microbianos que tienen produccion biosintetica de 4-HB se ilustran en el presente documento con referencia a E. coli y levaduras hospedadoras. Sin embargo, con la secuencia genomica completa disponible ahora para mas de 550 especies (con mas de la mitad de estas disponibles en bases de datos publicas tales como la NCBI), que incluyen 395 genomas de microorganismos y una variedad de genomas de levaduras, hongos, plantas, y marnfferos, la identificacion de los genes que codifican la actividad biosintetica de 4-HB necesaria para uno o mas genes en especies relacionadas o distantes, incluyendo por ejemplo, desplazamientos de genes homologos, ortologos, paralogos y no ortologos de genes conocidos, y el intercambio de alteraciones geneticas entre organismos es rutinario y bien conocido en la tecnica. De acuerdo con ello, las alteraciones metabolicas que permiten la biosmtesis de 4-HB y otros compuestos descritos en el presente documento con referencia a un organismo concreto tal como E. coli o levadura pueden aplicarse facilmente a otros microorganismos, incluyendo organismos procariotas y eucariotas analogos. Con las ensenanzas y directrices que se proporcionan en el presente documento, los expertos en la materia sabran que una alteracion metabolica ilustrada en un organismo se puede aplicar igualmente a otros organismos.

En algunos casos, tales como cuando existe una ruta biosintetica de 4-HB alternativa en una especie no relacionada, se puede conferir la biosmtesis de 4-HB a la especie hospedadora mediante, por ejemplo, la expresion exogena de un paralogo o paralogos de la especie no relacionada que cataliza una reaccion metabolica similar pero no identica para sustituir a la reaccion a la que se hace referencia. Como existen determinadas diferencias entre redes metabolicas entre diferentes organismos, los expertos en la materia entenderan que puede diferir la utilizacion de genes reales entre diferentes organismos. Sin embargo, con las ensenanzas y directrices que se proporcionan en el presente documento, los expertos en la materia entenderan tambien que las ensenanzas y metodos de la invencion se pueden aplicar a todos los organismos microbianos que utilizan alteraciones metabolicas analogas a las ilustradas en el presente documento para construir un organismo microbiano en una especie de interes que sintetizara el 4-HB monomerico.

Se pueden seleccionar organismos microbianos hospedadores a partir de, y los organismos microbianos no naturales generarse en, por ejemplo, bacterias, levaduras, hongos o cualquiera de una variedad de diferentes microorganismos aplicable a los procesos de fermentacion. Las bacterias ilustrativas incluyen especies seleccionadas entre E. coli, Klebsiella oxytoca, Anaerobiospirillum succiniciproducens, Actinobacillus succinogenes, Mannheimia succiniciproducens, Rhizobium etli, Bacillus subtilis, Corynebacterium glutamicum, Gluconobacter oxydans, Zymomonas mobilis, Lactococcus lactis, Lactobacillus plantarum, Streptomyces coelicolor, Clostridium acetobutylicum, Pseudomonas fluorescens, y Pseudomonas putida. Las levaduras u hongos ilustrativos incluyen especies seleccionadas entre Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces marxianus, Aspergillus terreus, Aspergillus niger y Pichia pastoris.

Se pueden llevar a cabo metodos para construir y ensayar los niveles de expresion de un hospedador productor de 4-HB que no se produce naturalmente, por ejemplo, por metodos recombinantes y de deteccion bien conocidos en la materia. Se pueden encontrar descritos dichos metodos en, por ejemplo, Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Tercera Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York (2001); Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Md. (1999). 4-HB y GBL se pueden separar mediante, por ejemplo, HPLC usando una columna Spherisorb 5 ODS 1 y una fase movil de tampon fosfato 10 mM al 70% (pH=7) y metanol al 30%, y detectarse con un detector UV a 215 nm (Hennessy et al. J. Forensic Sci.

46(6):1-9 (2004)). BDO se detecta mediante cromatograffa gaseosa o mediante HPLC y un detector de mdice de refraccion utilizando una columna Aminex HPX-87H y una fase movil de acido sulfurico 0,5 mM (Gonzalez-Pajuelo et al., Met. Eng. 7:329-336 (2005)).

Los organismos microbianos no naturales de la divulgacion se construyen utilizando metodos bien conocidos en la tecnica como se ilustra anteriormente para expresar de forma exogena al menos un acido nucleico que codifica un enzima de una ruta de 4-HB en cantidades suficientes para producir 4-HB monomerico. Los niveles ilustrativos de expresion de enzimas 4-HB en cada ruta se describen adicionalmente a continuacion en los Ejemplos. Siguiendo las ensenanzas y directrices proporcionadas en el presente documento, los organismos microbianos no naturales de la divulgacion pueden conseguir la biosmtesis del 4-HB monomerico dando como resultado concentraciones intracelulares entre aproximadamente 0,1-25 mM o mas. En general, la concentracion intracelular de 4-HB monomerico esta entre aproximadamente 3-20 mM, particularmente entre aproximadamente 5-15 mM y mas particularmente entre aproximadamente 8-12 mM, incluyendo aproximadamente 10 mM o mas. Las concentraciones intracelulares entre y por encima de cada uno de estos intervalos ilustrativos puede conseguirse tambien a partir de los organismos microbianos que no se producen naturalmente de la divulgacion.

Como se describe adicionalmente a continuacion, una condicion de crecimiento ilustrativa para conseguir la biosmtesis de 4-HB incluye condiciones de cultivo o fermentacion anaerobias. En determinadas realizaciones, los organismos microbianos que no se producen naturalmente de la divulgacion se pueden mantener, cultivar o fermentar en condiciones de cultivo anaerobias o sustancialmente anaerobias. En resumen, las condiciones anaerobias se refieren a un entorno desprovisto de oxfgeno. Las condiciones sustancialmente anaerobias incluyen, por ejemplo, un cultivo, una fermentacion discontinua o continua de tal manera que la concentracion de oxfgeno disuelto en el medio permanezca entre 0 y 10% de saturacion. Las condiciones sustancialmente anaerobias incluyen tambien celulas en crecimiento o en reposo en un medio lfquido o en agar solido en el interior de una camara precintada mantenida con una atmosfera de menos de un 1% de oxfgeno. El porcentaje de oxfgeno puede mantenerse mediante, por ejemplo, burbujeo en el cultivo una mezcla de N2/CO2 u otro gas o gases no de oxfgeno adecuados.

La divulgacion tambien proporciona un biocatalizador microbiano que no se produce naturalmente que incluye un organismo microbiano que tiene rutas biosintetica del acido 4-hidroxibutanoico (4-HB) y 1,4-butanodiol (BDO) que incluye al menos un acido nucleico exogeno que codifica la 4-hidroxibutanoato deshidrogenasa, semialdehndo succmico deshidrogenasa independiente de CoA, succinil-CoA sintetasa, semialdetndo succmico deshidrogenasa dependiente de CoA, 4-hidroxibutirato:CoA transferasa, glutamato: semialdehndo succmico transaminasa, glutamato descarboxilasa, aldehndo deshidrogenasa independiente de CoA, aldehndo deshidrogenasa dependiente de CoA o alcohol deshidrogenasa, en el que el acido nucleico exogeno se expresa en cantidad suficiente para producir 1,4-butanodiol (BDO).

Se pueden generar tambien organismos microbianos que no se produce naturalmente que biosintetizan BDO. Siguiendo las ensenanzas y directrices proporcionadas anteriormente para la construccion de organismos microbianos que sintetizan 4-HB, se pueden incorporar rutas de BDO adicionales en los organismos microbianos productores de 4-HB para generar organismos que sintetizan tambien BDO y otros compuestos de la familia BDO. En la figura 3 se ilustra la smtesis qrnmica de BDO y sus productos posteriores. Los organismos microbianos no naturales de la divulgacion capaces de la biosmtesis de BDO evitan esta smtesis qrnmica utilizando 4-HB como punto de entrada como se ilustra en la figura 2. Como se describe adicionalmente a continuacion, se pueden usar productores de 4-HB para convertir qmmicamente 4-HB en GBL y a continuacion, en BDO o THF, por ejemplo. Como alternativa, se pueden modificar adicionalmente los productores de 4-HB para incluir capacidades biosinteticas para la conversion de 4-HB y/o GBL en BDO.

Las rutas de BDO adicionales a introducir en productores de 4-HB incluyen, por ejemplo, la expresion exogena en un fondo de hospedador deficiente o la sobreexpresion de una aldehndo deshidrogenasa independiente de CoA, aldehndo deshidrogenasa dependiente de CoA o alcohol deshidrogenasa. En ausencia de la acil-CoA sintetasa endogena capaz de modificar 4-HB, los organismos microbianos productores de BDO que no se producen naturalmente pueden incluir ademas una acil-CoA sintetasa exogena selectiva para 4-HB. En la Tabla 1 a continuacion se relacionan alcohol y aldehfdo deshidrogenasas ilustrativos que se pueden usar para estas conversiones in vivo de 4-HB a BDO.

Tabla 1. Alcohol y aldehido deshidrogenasas para la conversion de 4-HB en BDO.

ALCOHOL DESHIDROGENASAS

ec: 1.1.1.1 alcohol deshidrogenasa

ec: 1.1.1.2 alcohol deshidrogenasa (NADP+)

ec: 1.1.1.4 (R,R)-butanodiol deshidrogenasa

ec: 1.1.1.5 acetoma deshidrogenasa

ec: 1.1.1.6 glicerol deshidrogenasa

ec: 1.1.1.7 propanodiol-fosfato deshidrogenasa

ec: 1.1.1.8 glicerol-3-fosfato deshidrogenasa (NAD+)

ec: 1.1.1.11 D-arabinitol 4-deshidrogenasa

ec: 1.1.1.12 L-arabinitol 4-deshidrogenasa

ec: 1.1.1.13 L-arabinitol 2-deshidrogenasa

ec: 1.1.1.14 L-iditol 2-deshidrogenasa

ec: 1.1.1.15 D-iditol 2-deshidrogenasa

ec: 1.1.1.16 galactitol 2-deshidrogenasa

ec: 1.1.1.17 manitol-1-fosfato 5-deshidrogenasa

ec: 1.1.1.18 inositol 2-deshidrogenasa

ec: 1.1.1.21 aldehfdo reductasa

ec: 1.1.1.23 histidinol deshidrogenasa

ec: 1.1.1.26 glioxilato reductasa

ec: 1.1.1.27 L-lactato deshidrogenasa

ec: 1.1.1.28 D-lactato deshidrogenasa

ec: 1.1.1.29 glicerato deshidrogenasa

ec: 1.1.1.30 3-hidroxibutirato deshidrogenasa

ec: 1.1.1.31 3-hidroxibutirato deshidrogenasa

ec: 1.1.1.35 3-hidroxiacil-CoA deshidrogenasa

ec: 1.1.1.36 acetoacetil-CoA reductasa

ec: 1.1.1.37 malato deshidrogenasa

ec: 1.1.1.38 malato deshidrogenasa (oxaloacetato-descarboxilante)

ec: 1.1.1.39 malato deshidrogenasa (descarboxilante)

ec: 1.1.1.40 malato deshidrogenasa (oxaloacetato-descarboxilante) (NADP+)

ec: 1.1.1.41 isocitrato deshidrogenasa (NAD+)

ec: 1.1.1.42 isocitrato deshidrogenasa (NADP+)

ec: 1.1.1.54 alil-alcohol deshidrogenasa

ec: 1.1.1.55 lactaldehfdo reductasa (NADPH)

ec: 1.1.1.56 ribitol 2-deshidrogenasa

ec: 1.1.1.59 3-hidroxipropionato deshidrogenasa

ec: 1.1.1.60 2-hidroxi-3-oxopropionato reductasa

ec: 1.1.1.61 4-hidroxibutirato deshidrogenasa

ec: 1.1.1.66 omega-hidroxidecanoato deshidrogenasa

ec: 1.1.1.67 manitol 2-deshidrogenasa

ec: 1.1.1.71 alcohol deshidrogenasa [NAD(P)+]

ec: 1.1.1.72 glicerol deshidrogenasa (NADP+)

ec: 1.1.1.73 octanol deshidrogenasa

ec: 1.1.1.75 (R)-aminopropanol deshidrogenasa

ec: 1.1.1.76 (S,S)-butanodiol deshidrogenasa

ec: 1.1.1.77 lactaldehfdo reductasa

ec: 1.1.1.78 metilglioxal reductasa (dependiente de NADH)

ec: 1.1.1.79 glioxilato reductasa (NADP+)

ec: 1.1.1.80 isopropanol deshidrogenasa (NADP+)

ec: 1.1.1.81 hidroxipiruvato reductasa

ec: 1.1.1.82 malato deshidrogenasa (NADP+)

ec: 1.1.1.83 D-malato deshidrogenasa (descarboxilante)

ec: 1.1.1.84 dimetilmalato deshidrogenasa

ec: 1.1.1.85 3-isopropilmalato deshidrogenasa

ec: 1.1.1.86 cetol-acido reductoisomerasa

ec: 1.1.1.87 homoisocitrato deshidrogenasa

ec: 1.1.1.88 hidroximetilglutaril-CoA reductasa

ec: 1.1.1.90 aril-alcohol deshidrogenasa

ec: 1.1.1.91 aril-alcohol deshidrogenasa (NADP+)

ec: 1.1.1.92 oxaloglicolato reductasa (descarboxilante)

ec: 1.1.1.94 glicerol-3-fosfato deshidrogenasa [NAD(P)+]

ec: 1.1.1.95 fosfoglicerato deshidrogenasa

ec: 1.1.1.97 3-hidroxibencil-alcohol deshidrogenasa

ec: 1.1.1.101 acilglicerona-fosfato reductasa

ec: 1.1.1.103 L-treonina 3-deshidrogenasa

ec: 1.1.1.104 4-oxoprolina reductasa

ec: 1.1.1.105 retinol deshidrogenasa

ec: 1.1.1.110 indololactato deshidrogenasa

ec: 1.1.1.112 indanol deshidrogenasa

ec: 1.1.1.113 L-xilosa 1-deshidrogenasa

ec: 1.1.1.129 L-treonato 3-deshidrogenasa

ec: 1.1.1.137 ribitol-5-fosfato 2-deshidrogenasa

ec: 1.1.1.138 manitol 2-deshidrogenasa (NADP+)

ec: 1.1.1.140 sorbitol-6-fosfato 2- deshidrogenasa

ec: 1.1.1.142 D-pinitol deshidrogenasa

ec: 1.1.1.143 secuoyitol deshidrogenasa

ec: 1.1.1.144 perilil-alcohol deshidrogenasa

ec: 1.1.1.156 glicerol 2-deshidrogenasa (NADP+)

ec: 1.1.1.157 3-hidroxibutiril-CoA deshidrogenasa

ec: 1.1.1.163 ciclopentanol deshidrogenasa

ec: 1.1.1.164 hexadecanol deshidrogenasa

ec: 1.1.1.165 2-alquin-1-ol deshidrogenasa

ec: 1.1.1.166 hidroxiciclohexanocarboxilato deshidrogenasa

ec: 1.1.1.167 hidroximalonato deshidrogenasa

ec: 1.1.1.174 ciclohexano-1,2-diol deshidrogenasa

ec: 1.1.1.177 glicerol-3-fosfato-1-deshidrogenasa (NADP+)

ec: 1.1.1.178 3-hidroxi-2-metilbutiril-CoA deshidrogenasa

ec: 1.1.1.185 L-glicol deshidrogenasa

ec: 1.1.1.190 indol-3-acetaldehfdo reductasa (NADH)

ec: 1.1.1.191 indol-3-acetaldehfdo reductasa (NADPH)

ec: 1.1.1.192 alcohol deshidrogenasa de cadena larga

ec: 1.1.1.194 coniferil-alcohol deshidrogenasa

ec: 1.1.1.195 cinnamil-alcohol deshidrogenasa

ec: 1.1.1.198 (+)-borneol deshidrogenasa

ec: 1.1.1.202 1,3-propanodiol deshidrogenasa

ec: 1.1.1.207 (-)-mentol deshidrogenasa

ec: 1.1.1.208 (+)-neomentol deshidrogenasa

ec: 1.1.1.216 farnesol deshidrogenasa

ec: 1.1.1.217 bencil-2-metil-hidroxibutirato deshidrogenasa

ec: 1.1.1.222 (R)-4-hidroxifenillactato deshidrogenasa

ec: 1.1.1.223 isopiperitenol deshidrogenasa

ec: 1.1.1.226 4-hidroxiciclohexanocarboxilato deshidrogenasa

ec: 1.1.1.229 dietil 2-metil-3-oxosuccinato reductasa

ec: 1.1.1.237 hidroxifenilpiruvato reductasa

ec: 1.1.1.244 metanol deshidrogenasa

ec: 1.1.1.245 ciclohexanol deshidrogenasa

ec: 1.1.1.250 D-arabinitol 2-deshidrogenasa

ec: 1.1.1.251 galactitol 1-fosfato 5- deshidrogenasa

ec: 1.1.1.255 manitol deshidrogenasa

ec: 1.1.1.256 fluoren-9-ol deshidrogenasa

ec: 1.1.1.257 4-(hidroximetil)bencenosulfonato deshidrogenasa ec: 1.1.1.258 6-hidroxihexanoato deshidrogenasa

ec: 1.1.1.259 3-hidroxipimeloil-CoA deshidrogenasa

ec: 1.1.1.261 glicerol-1-fosfato deshidrogenasa [NAD(P)+]

ec: 1.1.1.265 3-metilbutanal reductasa

ec: 1.1.1.283 metilglioxal reductasa (dependiente de NADPH) ec: 1.1.1.286 isocitrato-homoisocitrato deshidrogenasa

ec: 1.1.1.287 D-arabinitol deshidrogenasa (NADP+) butanol deshidrogenasa

ALDEHDO DESHIDROGENASAS

ec: 1.2.1.2 formiato deshidrogenasa

ec: 1.2.1.3 aldehndo deshidrogenasa (NAD+)

ec: 1.2.1.4 aldehndo deshidrogenasa (NADP+)

ec: 1.2.1.5 aldehndo deshidrogenasa [NAD(P)+]

ec: 1.2.1.7 benzaldehndo deshidrogenasa (NADP+)

ec: 1.2.1.8 betarna-aldehndo deshidrogenasa

ec: 1.2.1.9 gliceraldehndo-3-fosfato deshidrogenasa (NADP+)

ec: 1.2.1.10 acetaldehndo deshidrogenasa (acetilante)

ec: 1.2.1.11 semialdehndo de aspartato deshidrogenasa

ec: 1.2.1.12 gliceraldehndo-3-fosfato deshidrogenasa (fosforilante)

ec: 1.2.1.13 gliceraldehndo-3-fosfato deshidrogenasa (NADP+) (fosforilante)

ec: 1.2.1.15 semialdehndo de malonato deshidrogenasa

ec: 1.2.1.16 semialdehndo de succinato deshidrogenasa [NAD(P)+]

ec: 1.2.1.17 glioxilato deshidrogenasa (acilante)

ec: 1.2.1.18 semialdehndo de malonato-deshidrogenasa (acetilante)

ec: 1.2.1.19 aminobutiraldehndo deshidrogenasa

ec: 1.2.1.20 semialdehndo de glutarato-deshidrogenasa

ec: 1.2.1.21 glicolaldehfdo deshidrogenasa

ec: 1.2.1.22 lactaldehfdo deshidrogenasa

ec: 1.2.1.23 2-oxoaldehfdo deshidrogenasa (NAD+)

ec: 1.2.1.24 semialdehndo de succinato-deshidrogenasa

ec: 1.2.1.25 2-oxoisovalerato deshidrogenasa (acilante)

ec: 1.2.1.26 2,5-dioxovalerato deshidrogenasa

ec: 1.2.1.27 semialdehndo de metilmalonato deshidrogenasa (acilante)

ec: 1.2.1.28 benzaldehfdo deshidrogenasa (NAD+)

ec: 1.2.1.29 aril-aldehndo deshidrogenasa

ec: 1.2.1.30 aril-aldehndo deshidrogenasa (NADP+)

ec: 1.2.1.31 semialdehndo de L-aminoadipato deshidrogenasa

ec: 1.2.1.32 semialdehndo de aminomuconato deshidrogenasa

ec: 1.2.1.36 retinal deshidrogenasa

ec: 1.2.1.39 fenilacetaldehndo deshidrogenasa

ec: 1.2.1.41 glutamato-5-semialdel'ndo deshidrogenasa

ec: 1.2.1.42 hexadecanal deshidrogenasa (acilante)

ec: 1.2.1.43 formiato deshidrogenasa (NADP+)

ec: 1.2.1.45 4-carboxi-2-hidroximuconato-6- semialdehndo deshidrogenasa

ec: 1.2.1.46 formaldehndo deshidrogenasa

ec: 1.2.1.47 4-trimetilamoniobutiraldel'ndo deshidrogenasa

ec: 1.2.1.48 aldehfdo deshidrogenasa de cadena larga

ec: 1.2.1.49 2-oxoaldehfdo deshidrogenasa (NADP+)

ec: 1.2.1.51 piruvato deshidrogenasa (NADP+)

ec: 1.2.1.52 oxoglutarato deshidrogenasa (NADP+)

ec: 1.2.1.53 4-hidroxifenilacetaldel'ndo deshidrogenasa

ec: 1.2.1.57 butanal deshidrogenasa

ec: 1.2.1.58 fenilglioxilato deshidrogenasa (acilante)

ec: 1.2.1.59 gliceraldehndo-3-fosfato deshidrogenasa (NAD(P)+) (fosforilante)

ec: 1.2.1.62 4-formilbencenosulfonato deshidrogenasa

ec: 1.2.1.63 6-oxohexanoato deshidrogenasa

ec: 1.2.1.64 4-hidroxibenzaldehndo deshidrogenasa

ec: 1.2.1.65 salicilaldehndo deshidrogenasa

ec: 1.2.1.66 formaldehndo deshidrogenasa dependiente de micotiol

ec: 1.2.1.67 vanillin deshidrogenasa

ec: 1.2.1.68 coniferil-aldel'ndo deshidrogenasa

ec: 1.2.1.69 fluoroacetaldehndo deshidrogenasa

ec: 1.2.1.71 semialdehndo de succinilglutamato deshidrogenasa

Por tanto, ademas de cualquiera de las diversas modificaciones ilustradas previamente para establecer la biosmtesis de 4-HB en un hospedador seleccionado, los organismos microbianos productores de BDO pueden incluir cualquiera de las combinaciones y permutaciones anteriores de las modificaciones metabolicas de la ruta de 4-HB asf como cualquier combinacion de expresion para la aldehfdo deshidrogenasa independiente de CoA, la aldehfdo deshidrogenasa dependiente de CoA o una alcohol deshidrogenasa para generar rutas biosinteticas para BDO. Por tanto, los productores de BDO de la divulgacion pueden tener la expresion exogena de, por ejemplo, uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o las 10 enzimas de cualquiera de las seis rutas de 4-HB y/o cualquiera de los enzimas de las 4 rutas de BDO.

El diseno y la construccion de los organismos microbianos geneticamente modificados se lleva a cabo usando metodos bien conocidos en la tecnica para conseguir suficientes cantidades de expresion para producir BDO. En particular, los organismos bacterianos no naturales de la divulgacion pueden conseguir la biosmtesis de BDO dando como resultado concentraciones intracelulares entre aproximadamente 0,1-25 mM o mas. En general, la concentracion intracelular de BDO esta entre aproximadamente 3-20 mM, particularmente entre aproximadamente 5 15 mM y mas particularmente entre aproximadamente 8-12 mM, incluyendo aproximadamente 10 mM o mas. Las concentraciones intracelulares entre y por encima de cada uno de estos intervalos ilustrativos pueden conseguirse tambien a partir de los organismos microbianos no naturales de la divulgacion. Como con los productores de 4-HB, los productores de BDO tambien se pueden mantener, cultivar o fermentar en condiciones anaerobias.

La divulgacion proporciona ademas un metodo para la produccion de 4-HB. El metodo incluye cultivar un organismo microbiano que no se produce naturalmente que tiene una ruta biosintetica del acido 4-hidroxibutanoico (4-HB) que comprende al menos un acido nucleico exogeno que codifica la 4-hidroxibutanoato deshidrogenasa, semialdehndo succmico deshidrogenasa independiente de CoA, succinil-CoA sintetasa, semialdehndo succmico deshidrogenasa dependiente de CoA, glutamato: semialdehndo succmico transaminasa o glutamato decarboxilasa en condiciones sustancialmente anaerobias durante un periodo de tiempo suficiente para producir acido 4-hidroxibutanoico monomerico (4-HB). El metodo puede incluir adicionalmente la conversion qrnmica de 4-HB a GBL y de BDO o THF, por ejemplo.

Se entiende que, en los metodos de la divulgacion, cualquiera del uno o mas acidos nucleicos exogenos se puede combinar en un organismo microbiano no naturales de la divulgacion siempre que se produzca el producto deseado, por ejemplo, 4-HB, BDO, THF o GBL. Por ejemplo, un organismo microbiano no natural que tiene una ruta biosintetica de 4-HB puede comprender al menos dos acidos nucleicos exogenos que codifican los enzimas deseadas, de tal manera que la combinacion de 4-hidroxibutanoato deshidrogenasa y la semialdehndo succmico deshidrogenasa independiente de CoA; 4-hidroxibutanoato deshidrogenasa y la semialdehndo succmico deshidrogenasa dependiente de CoA; la semialdehndo succmico deshidrogenasa dependiente de CoA y la succinil-CoA sintetasa; succinil-CoA sintetasa y glutamato decarboxilasa, y similares. Por tanto, se entiende que cualquier combinacion de dos o mas enzimas de una ruta biosintetica puede estar incluida en un organismo microbiano no natural de la divulgacion. De manera similar, se entiende que cualquier combinacion de tres o mas enzimas de una ruta biosintetica puede estar incluida en un organismo microbiano no natural de la divulgacion, por ejemplo, 4-hidroxibutanoato deshidrogenasa, semialdehndo succmico deshidrogenasa independiente de CoA y succinil-CoA sintetasa; 4-hidroxibutanoato deshidrogenasa, semialdehndo succmico deshidrogenasa dependiente de CoA y glutamato: semialdehndo succmico transaminasa, y asf sucesivamente, segun se desee, siempre que la combinacion de enzimas de la ruta biosintetica deseada de como resultado la produccion del correspondiente producto deseado. Cualquiera de los organismos microbianos que no se producen naturalmente descritos anteriormente puede cultivarse para producir los productos biosinteticos de la divulgacion. Por ejemplo, los productores de 4-HB pueden cultivarse para la produccion biosintetica de 4-HB. El 4-HB puede estar aislado o tratarse como se describe a continuacion para generar GBL, THF y/o BDO. De manera similar, los productores de BDO pueden cultivarse para la produccion biosintetica de BDO. El BDO se puede aislar o someterse a tratamientos adicionales para la smtesis qrnmica de la familia de compuestos de BDO tales como los compuestos posteriores ilustrados en la figura 3.

En algunas realizaciones, las condiciones de cultivo incluyen crecimiento anaerobio o sustancialmente anaerobio o condiciones de mantenimiento. Se han descrito las condiciones anaerobias ilustrativas anteriormente y son bien conocidas en la tecnica. Se describen a continuacion en los Ejemplos las condiciones anaerobias ilustrativas para los procesos de fermentacion. Puede emplearse cualquiera de estas condiciones con los organismos que no se producen naturalmente, asf como otras condiciones anaerobias bien conocidas en la tecnica. En dichas condiciones anaerobias, los productores de 4-HB y BDO pueden sintetizar 4-HB y BDO monomerico, respectivamente, a concentraciones intracelulares de 5-10 mM o mas, asf como las otras concentraciones ilustradas anteriormente. Pueden generarse tambien numerosos compuestos posteriores para organismos bacterianos no naturales productores de 4-HB y BDO de la divulgacion Con respecto a los organismos microbianos productores de 4-HB de la divulgacion, 4-HB y GBL monomericos se encuentran en equilibrio en el medio de cultivo. La conversion de 4-HB a GBL puede llevarse a cabo eficazmente, por ejemplo, cultivando los organismos microbianos en medio a pH acido. A pH menor o igual a 7,5, en particular a o por debajo de pH 5,5, 4-HB se convierte espontaneamente en GBL, como se ilustra en la figura 1.

El GBL resultante se puede separar de 4-HB y otros componentes del cultivo usando una variedad de metodos bien conocidos en la tecnica. Dichos metodos de separacion incluyen, por ejemplo, los procedimientos de extraccion ilustrados en los Ejemplos, asf como los metodos que incluyen la extraccion lfquido-lfquido continua, pervaporacion, filtracion con membrana, separacion con membrana, osmosis inversa, electrodialisis, destilacion, cristalizacion, centrifugacion, filtracion extractiva, cromatograffa de intercambio ionico, cromatograffa de exclusion por tamano, cromatograffa de adsorcion, y ultrafiltracion. Todos los metodos anteriores son bien conocidos en la materia. El GBL separado se puede purificar mediante, por ejemplo, destilacion.

Otro compuesto posterior que se puede producir a partir de organismos microbianos no naturales productores de 4-HB de la divulgacion incluye, por ejemplo, BDO. Este compuesto se puede sintetizar mediante, por ejemplo, hidrogenacion qrnmica de GBL. Las reacciones de hidrogenacion qrnmica son bien conocidas en la tecnica. Un procedimiento ilustrativo incluye la reduccion qmmica de 4-HB y/o GBL o una mezcla de estos dos componentes que se derivan del cultivo usando un catalizador de hidrogenacion heterogeneo u homogeneo junto con hidrogeno, o un agente reductor de tipo hidruro usado estequiometrica o catalfticamente, para producir 1,4-butanodiol.

Son igualmente aplicables otros procedimientos bien conocidos en la tecnica para la anterior reaccion qmmica e incluye, por ejemplo, el documento WO N° 82/03854 (Bradley, et al.), que describe la hidrogenolisis de la gammabutirolactona en fase vapor sobre catalizador de oxido de cobre y oxido de cinc. La patente britanica n° 1.230.276, que describe la hidrogenacion de la gamma-butirolactona usando un catalizador de oxido de cobre-oxido de cromo. La hidrogenacion se lleva a cabo en fase lfquida. Se ilustran tambien reacciones discontinuas que tienen presiones totales de reactor elevadas. Las presiones parciales de reactivos y productos en los reactores estan tambien por encima de los respectivos puntos de rodo. La patente britanica n° 1.314.126, que describe la hidrogenacion de la gamma-butirolactona en fase lfquida sobre un catalizador de oxido de mquel-cobalto-torio. Se ilustran reacciones discontinuas teniendo presiones totales elevadas y presiones parciales de componentes tambien por encima de los respectivos puntos de rodo de los componentes. La patente britanica n° 1.344.557, que describe la hidrogenacion de la gamma-butirolactona en fase lfquida sobre un catalizador de oxido de cobre-oxido de cromo. Una fase vapor o una fase mixta que contiene vapor se indica como adecuada en algunos casos. Se ilustra un reactor tubular de flujo continuo utilizando presiones totales del reactor elevadas. La patente britanica n° 1.512.751, que describe la hidrogenacion de la gamma-butirolactona a 1,4-butanodiol en fase lfquida sobre un catalizador de oxido de cobreoxido de cromo. Se ilustran reacciones discontinuas que tienen presiones totales de reactor elevadas y, cuando sea determinable, las presiones parciales de reactivos y productos estaran tambien por encima de los respectivos puntos de rodo. La patente de Estados Unidos n° 4.301.077, que describe la hidrogenacion a 1,4-butanodiol de la gammabutirolactona sobre un catalizador de Ru--NI--Co--Zn. La reaccion se puede llevar a cabo en fase lfquida o fase gaseosa o en una fase lfquido-gas mixta. Se ilustran reacciones en fase lfquida de flujo continuo a presiones totales del reactor elevadas y productividades de reactor relativamente bajas. La patente de Estados Unidos n° 4.048.196, que describe la produccion de 1,4-butanodiol mediante la hidrogenacion en fase lfquida de gamma-butirolactona sobre un catalizador de oxido de cobre-oxido de cinc. Se ilustra ademas un reactor tubular de flujo continuo que funciona a presiones totales de reactor elevadas y a presiones parciales de reactivos y productos elevadas. Y la patente de Estados Unidos n° 4.652.685, que describe la hidrogenacion de lactonas a glicoles.

Un compuesto posterior adicional que se puede producir a partir de organismos microbianos no naturales productores de 4-HB de la divulgacion incluye, por ejemplo, THF. Este compuesto se puede sintetizar mediante, por ejemplo, hidrogenacion qmmica de GBL. Un procedimiento ilustrativo bien conocido en la tecnica aplicable para la conversion de GBL a THF incluye, por ejemplo, la reduccion qmmica de 4-HB y/o GBL o una mezcla de estos dos componentes que se derivan del cultivo usando un catalizador de hidrogenacion heterogeneo u homogeneo junto con hidrogeno, o un agente reductor de tipo hidruro usado estequiometrica o catalfticamente, para producir tetrahidrofurano. Son igualmente aplicables otros procedimientos bien conocidos en la tecnica para la anterior reaccion qmmica e incluyen, por ejemplo, la patente de Estados Unidos n° 6.686.310, que describe una ruta sol-gel de area superficial elevada preparada para catalizadores de hidrogenacion. Se describen tambien procesos para la reduccion de gamma butirolactona a tetrahidrofurano y 1,4-butanodiol.

Las condiciones de cultivo pueden incluir, por ejemplo, procedimientos de cultivo ftquido, asf como fermentacion y otros procedimientos de cultivo a gran escala. Como se describe adicionalmente a continuacion en los Ejemplos, se pueden obtener rendimientos particularmente utiles de los productos biosinteticos de la divulgacion en condiciones de cultivo anaerobias o sustancialmente anaerobias.

La divulgacion proporciona ademas un metodo de fabricacion de 4-HB. El metodo incluye fermentar un organismo microbiano que no se produce naturalmente que tiene una ruta biosintetica del acido 4-hidroxibutanoico (4-HB) que comprende al menos un acido nucleico exogeno que codifica la 4-hidroxibutanoato deshidrogenasa, semialdehfdo sucdnico deshidrogenasa independiente de CoA, succinil-CoA sintetasa, semialdeddo sucdnico deshidrogenasa dependiente de CoA, glutamato: semialdeddo succmico transaminasa o glutamato decarboxilasa en condiciones sustancialmente anaerobias durante un periodo de tiempo suficiente para producir acido 4-hidroxibutanoico monomerico (4-HB), comprendiendo el proceso una fermentacion de alimentacion discontinua y una separacion discontinua; fermentacion de alimentacion discontinua y separacion continua, o fermentacion continua y separacion continua.

El cultivo y las hidrogenaciones qmmicas descritas anteriormente se pueden escalar hasta y crecer de forma continua para fabricar 4-HB, GBL, BDO y/o THF. Los procedimientos de crecimiento ilustrativos incluyen, por ejemplo, fermentacion de alimentacion discontinua y separacion discontinua; fermentacion de alimentacion discontinua y separacion continua, o fermentacion continua y separacion continua. Todos estos procesos son bien conocidos en la tecnica. Emplear los productores de 4-HB permite la biosmtesis simultanea de 4-H^by la conversion qmmica en GBL, BDO y/o t Hf empleando los anteriores procedimientos de hidrogenacion simultaneos con metodos de cultivos continuos tales como fermentacion. Son tambien conocidos en la tecnica otros procedimientos de hidrogenacion y se pueden aplicar igualmente a los metodos de la divulgacion.

Los procedimientos de fermentacion son particularmente utiles para la produccion biosintetica de cantidades comerciales de 4-HB y/o BDO. En general, y como con procedimientos de cultivo no continuos, la produccion continua y/o casi continua de 4-HB o BDO incluira cultivar un organismo productor de 4-HB o BDO no natural de la invencion en nutrientes y medio suficientes para sostener y/o sostener casi el crecimiento en fase exponencial. El cultivo continuo en dichas condiciones puede incluir, por ejemplo, 1 d^ a, 2, 3, 4, 5, 6 o 7 dfas o mas. Ademas, el cultivo continuo puede incluir 1 semana, 2, 3, 4 o 5 o mas semanas y hasta varios meses. Como alternativa, los microorganismos de la divulgacion pueden cultivarse durante horas, si resulta adecuado para una aplicacion concreta. Debe entenderse que las condiciones de cultivo continuas y/o casi continuas pueden incluir tambien todos los intervalos de tiempo entre estos periodos ilustrativos.

Son bien conocidos en la tecnica los procedimientos de fermentacion. En resumen, la fermentacion para la produccion biosintetica de 4-HB, BDO u otros productos derivados de 4-HB de la divulgacion se puede utilizar en, por ejemplo, fermentacion de alimentacion discontinua y separacion discontinua; fermentacion de alimentacion discontinua y separacion continua, o fermentacion continua y separacion continua. Los ejemplos de procedimientos de fermentacion discontinua y continua bien conocidos en la tecnica se ilustran adicionalmente a continuacion en los Ejemplos.

Ademas, con respecto a los procedimientos de fermentacion anteriores utilizando los productores de 4-HB o BDO de la divulgacion para la produccion continua de cantidades sustanciales de 4-HB y BDO monomericos, respectivamente, los productores de 4-HB tambien pueden, por ejemplo, someterse simultaneamente a procedimientos de smtesis qmmica como se ha descrito anteriormente para la conversion qmmica del 4-HB monomerico en, por ejemplo, GBL, BDO y/o THF. Los productores de BDO pueden, de manera similar, por ejemplo, someterse simultaneamente a procedimientos de smtesis qmmica como se ha descrito anteriormente para la conversion qmmica de BDO en, por ejemplo, THF, GBL, pirrolidonas y/u otros compuestos de la familia BDO. Ademas, los productos de los productores de 4-HB y BDO pueden separarse del cultivo de fermentacion y someterse secuencialmente a conversion qmmica, como se divulga en el presente documento.

En resumen, se puede llevar a cabo la hidrogenacion de GBL en el caldo de fermentacion como se describe en Frost et al., Biotechnology Progress 18: 201-211 (2002). Otro procedimiento para la hidrogenacion durante la fermentacion incluye, por ejemplo, los metodos descritos en, por ejemplo, la patente de Estados Unidos N° 5.478.952. Este metodo se ilustra ademas en los ejemplos siguientes.

Por tanto, la invencion proporciona adicionalmente un metodo de fabricacion de Y-butirolactona (GBL), tetrahidrofurano (THF) o 1,4-butanodiol (BDO). El metodo incluye fermentar un organismo microbiano que no se produce naturalmente que tiene las rutas biosinteticas del acido 4-hidroxibutanoico (4-HB) y 1,4-butanodiol (BDO), las rutas comprenden al menos un acido nucleico exogeno que codifica la 4-hidroxibutanoato deshidrogenasa, semialdelmdo succmico deshidrogenasa independiente de CoA, succinil-CoA sintetasa, semialdehndo succmico deshidrogenasa dependiente de CoA, 4-hidroxibutirato:CoA transferasa, glutamato: semialdehndo succmico transaminasa, glutamato descarboxilasa, 1,4-butanodiol semialdehndo deshidrogenasa independiente de CoA, 1,4-butanodiol semialdehndo deshidrogenasa dependiente de CoA, 1,4-butanodiol alcohol deshidrogenasa, tanto dependiente de CoA como independiente de CoA, en condiciones sustancialmente anaerobias durante un periodo de tiempo suficiente para producir 1,4-butanodiol (BDO), GBL o THF, comprendiendo la fermentacion una fermentacion de alimentacion discontinua y separacion discontinua; fermentacion de alimentacion discontinua y separacion continua, o fermentacion continua y separacion continua.

Ademas de la biosmtesis de 4-HB, BDO y otros productos de la divulgacion como se ha descrito en el presente documento, se pueden utilizar tambien los organismos microbianos no naturales y los metodos de la invencion en diversas combinaciones entre sf y con otros organismos microbianos y metodos bien conocidos en la tecnica para conseguir la biosmtesis del producto mediante otras rutas. Por ejemplo, una alternativa para producir BDO diferente que usan los productores de 4-HB y las etapas qmmicas o diferentes que usan los productores de BDO es directamente mediante la adicion de otro organismo microbiano capaz de convertir 4-HB o un producto de 4-HB ilustrado en el presente documento en BDO.

Uno de dichos procedimientos incluye, por ejemplo, la fermentacion de un organismo microbiano productor de 4-HB de la divulgacion para producir 4-HB, como se describe anteriormente y a continuacion. A continuacion, se puede usar el 4-HB como un sustrato para un segundo organismo microbiano que convierte 4-HB en, por ejemplo, BDO, GBL y/o THF. El 4-HB se puede anadir directamente a otro cultivo del segundo organismo, o el cultivo original de los productores de 4-HB se puede agotar de estos organismos microbianos por, por ejemplo, separacion celular, y despues, la adicion posterior del segundo organismo del caldo de fermentacion se puede utilizar para producir el producto final sin etapas de purificacion intermedias. Un segundo organismo ilustrativo que tiene la capacidad de utilizar bioqmmicamente 4-HB como sustrato para la conversion de BDO, por ejemplo, es Clostridium acetobutylicum (vease, por ejemplo, Jewell et al., Current Microbiology, 13:215-19 (1986)).

En otras divulgaciones, los organismos microbianos no naturales y los metodos de la divulgacion se pueden ensamblar en una amplia variedad de subrutas para conseguir la biosmtesis de, por ejemplo, 4-HB y/o BDO como se ha descrito. En estas divulgaciones, se pueden segregar rutas biosinteticas para un producto deseado en diferentes organismos microbianos y los diferentes organismos microbianos se pueden cultivar simultaneamente para producir el producto final. En dicho esquema biosintetico, el producto de un organismo microbiano es el sustrato de un segundo organismo microbiano hasta que se sintetiza el producto final. Por ejemplo, se puede llevar a cabo la biosmtesis de BDO como se ha descrito anteriormente para construir un organismo microbiano que contiene las rutas biosinteticas para la conversion de un sustrato tal como succinato endogeno mediante 4-HB en el producto final BDO. Como alternativa, tambien puede producirse BDO biosinteticamente a partir de organismos microbianos mediante cultivo simultaneo o fermentacion simultanea usando dos organismos en el mismo recipiente. Siendo un primer organismo microbiano un productor de 4-HB con genes para producir 4-HB a partir de acido succmico, y siendo un segundo organismo microbiano un productor de BDO con genes para convertir 4-HB en BDO.

Con las ensenanzas y directrices que se proporcionan en el presente documento, los expertos en la materia entenderan que existe una amplia variedad de combinaciones y permutaciones de organismos microbianos que no se producen naturalmente y los metodos de la divulgacion junto con los otros organismos microbianos, con el cultivo simultaneo de otros organismos microbianos que no se producen naturalmente que tienen subrutas y con combinaciones de otros procedimientos qmmicos y/o bioqmmicos bien conocidos en la tecnica para producir productos de 4-HB, BDO, GBL y THF.

Un metodo informatico para identificar y disenar alteraciones metabolicas que favorecen la biosmtesis de un producto es la infraestructura informatica OptKnock, Burgard et al., Biotechnol Bioeng, 84: 647-57 (2003). OptKnock es un programa de modelacion y simulacion metabolica que sugiere estrategias de delecion de genes que dan como resultado microorganismos geneticamente estables que producen un exceso del producto diana. Espedficamente, la infraestructura examina la totalidad de la red metabolica y/o bioqmmica de un microorganismo con el fin de sugerir manipulaciones geneticas que fuercen la bioqmmica deseada a ser un subproducto obligatorio del crecimiento celular. Al acoplar la produccion bioqmmica con el crecimiento de la celula a traves de deleciones genicas u otras perturbaciones de los genes funcionales estrategicamente situadas, las presiones de seleccion sobre el crecimiento impuestas por las cepas disenadas por ingeniena genetica despues de largos penodos de tiempo en un biorreactor conducen a mejoras en el rendimiento como resultado de la produccion bioqmmica acoplada al crecimiento obligatoria. Finalmente, cuando se realizan las deleciones genicas, existe una posibilidad poco importante de que las cepas disenas reviertan a su estado original porque los genes seleccionados por OptKnock se eliminan completamente del genoma. Por tanto, esta metodologfa informatica se puede utilizar bien para identificar rutas alternativas que conducen a la biosmtesis de 4-HB y/o BDO o bien utilizarse en relacion con organismos microbianos no naturales para optimizacion adicional de la biosmtesis de 4-HB y/o BDO.

En resumen, OptKnock es un termino que se utiliza en el presente documento para referirse a un metodo y sistema informatico para modelar el metabolismo celular. El programa OptKnock se refiere a una infraestructura de modelos y metodos que incorporan restricciones concretas a los modelos de analisis del balance de flujo (FBA). Estas restricciones incluyen, por ejemplo, informacion cinetica cualitativa, informacion cualitativa reguladora, y/o datos experimentales de micromatrices de ADN. OptKnock tambien calcula soluciones a diversos problemas metabolicos mediante, por ejemplo, estrechar los lfmites de flujo derivados de los modelos de balance de flujo y, posteriormente, sondear los lfmites de rendimiento de las redes metabolicas en la presencia de adiciones o deleciones de genes. La infraestructura informatica OptKnock permite la construccion de formulaciones modelo que permiten una consulta efectiva de los lfmites de rendimiento de las redes metabolicas, y proporciona metodos para resolver los problemas de programacion lineal entera mixta. Los metodos de modelacion y simulacion metabolica citados en el presente documento como OptKnock se describen en, por ejemplo, la solicitud de patente estadounidense con numero de serie 10/043.440, presentada el 10 de enero de 2002, y en la patente internacional n° PCT/US02/00660, presentada el 10 de enero de 2002.

Otro metodo informatico para identificar y disenar alteraciones metabolicas que favorecen la produccion biosintetica de un producto es un sistema de modelacion y simulacion metabolica denominado SimPheny®. Este sistema y metodo informatico se describe en, por ejemplo, la solicitud de patente estadounidense con numero de serie 10/173.547, presentada el 14 de junio de 2002, y en la solicitud de patente internacional n° PCT/US03/18838, presentada el 13 de junio de 2003.

SimPheny es un sistema informatico que se puede utilizar para producir un modelo de red in silico y para simular el flujo de masa, energfa o carga a traves de las reacciones qmmicas de un sistema biologico para definir un espacio de soluciones que contiene todas y cada una de las posibles funcionalidades de las reacciones qmmicas del sistema, determinando de esta forma una gama de actividades permitidas por el sistema biologico. Este enfoque se denomina como modelacion basada en restricciones, porque el espacio de soluciones esta definido por restricciones tales como la estequiometna conocida de las reacciones incluidas, asf como por la termodinamica de las reacciones y las restricciones de capacidad asociadas con los flujos maximos a traves de las reacciones. El espacio definido por estas restricciones se puede interrogar para determinar las capacidades fenotfpica y conductual del sistema biologico o de sus componentes bioqmmicos. Los metodos de analisis tales como el analisis convexo, la programacion lineal y el calculo de rutas extremas descritos, por ejemplo, en Schilling et al., J. Theor. Biol. 203:229 248 (2000); Schilling et al., Biotech. Bioeng. 71:286-306 (2000) y Schilling et al., Biotech. Prog. 15:288-295 (1999), se pueden utilizar para determinar dichas capacidades fenotfpicas. Como se describe en los siguientes Ejemplos, esta metodologfa de calculo se utilizo para identificar y analizar las rutas biosinteticas de 4-HB, tanto posibles como optimas, en organismos microbianos no productores de 4-HB.

Tal como se ha descrito anteriormente, un metodo basado en restricciones utilizado en los programas informaticos aplicables a la invencion es el analisis del balance de flujo. En analisis del balance de flujo se basa en equilibrar los flujos en estado estacionario, y se puede implementar como se describe en, por ejemplo, Varma y Palsson, Biotech. Bioeng. 12:994-998 (1994). El enfoque del balance de flujo se ha aplicado a redes de reacciones para simular o predecir propiedades sistemicas de, por ejemplo, el metabolismo de los adipocitos tal y como se describe en Fell y Small, J. Biochem. 138:781-786 (1986), secrecion de acetato desde E. coli en condiciones de maximizacion de ATP como se describe en Majewski y Domach, Biotech. Bioeng. 35:732-738 (1990) o la secrecion de etanol por levaduras como se describe en Vanrolleghem et al., Biotech. Prog. 12:434-448 (1996). Ademas, este enfoque se puede utilizar para predecir o simular el crecimiento de E. coli en una variedad de fuentes de carbono unico, asf como el metabolismo de H. influenzae como se describe en Edwards y Palsson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:5528-5533 (2000) , Edwards y Palsson, J. Biol. Chem. 274:17410-17416 (1999) y Edwards et al., Nature Biotech. 19:125-130 (2001) .

Una vez que se ha definido el espacio de soluciones, se puede analizar para determinar posibles soluciones en diferentes condiciones. Este enfoque informatico es coherente con la realidad biologica porque los sistemas biologicos son flexibles y pueden alcanzar el mismo resultado de muchas formas diferentes. Los sistemas biologicos estan disenados mediante mecanismos evolutivos que han sido restringidos por restricciones fundamentales que deben afrontar todos los sistemas vivos. Por tanto, la estrategia de modelado basado en restricciones abarca estas realidades generales. Ademas, la capacidad de imponer continuamente restricciones adicionales sobre un modelo de red mediante el endurecimiento de las restricciones da como resultado una reduccion en el tamano del espacio de soluciones, mejorando de esta forma la precision, por lo que se puede predecir el comportamiento fisiologico o el fenotipo.

Con las ensenanzas y directrices que se proporcionan en el presente documento, un experto en la tecnica podra aplicar diferentes infraestructuras informaticas para la modelacion y simulacion metabolica para disenar e implementar la biosmtesis de 4-HB, BDO, GBL, THF y otros compuestos de la familia BDO en organismos hospedadores microbianos diferentes a E. coli y levadura. Dichos metodos de modelacion y simulacion metabolica incluyen, por ejemplo, los sistemas informaticos anteriormente ilustrados como SimPheny® y OptKnock. Para ilustracion de la invencion, algunos metodos se han descrito en el presente documento con referencia a la infraestructura informatica OptKnock para modelacion y simulacion. Los expertos en la materia sabran como aplicar la identificacion, diseno e implementacion de las alteraciones metabolicas usando OptKnock a cualquiera otra de estas infraestructuras informaticas de modelacion y simulacion y metodos bien conocidos en la tecnica.

La capacidad de una celula u organismo para producir un producto bioqmmico de forma biosintetica se puede ilustrar en el contexto de los lfmites de produccion bioqmmica de una red metabolica tfpica calculada usando un modelo in silico. Estos lfmites se obtienen fijando la tasa o tasas de recaptacion del sustrato o sustratos limitantes a sus valores experimentalmente determinados, y calculando las tasas maximas y mmimas de produccion bioqmmica para cada nivel de crecimiento que se puede alcanzar. La produccion de un producto bioqmmico deseado generalmente esta en competencia directa con la formacion de recursos intracelulares. En estas circunstancias, una velocidad de produccion bioqmmica mejorada necesariamente dara como resultado tasas de crecimiento inferiores a las maximas. Las desactivaciones sugeridas mediante los programas de modelacion y simulacion metabolica tales como OptKnock estan disenadas para restringir los lfmites de la solucion permitidos, forzando un cambio en el comportamiento metabolico de la cepa natural. Aunque los lfmites reales de solucion para una cepa dada se ampliaran o se restringiran a medida que la tasa o tasas de recaptacion de sustrato aumenten o disminuyan, cada punto experimental estara dentro de los lfmites de la solucion calculada. Las representaciones graficas, tales como las que permiten predicciones exactas de lo cerca que estan las cepas disenadas de sus lfmites de comportamiento tambien indican todo lo que se puede mejorar.

La infraestructura matematica OptKnock se ilustra en el presente documento para detectar deleciones de genes que llevan a la biosmtesis de productos y, particularmente, a la biosmtesis de productos acoplada con el crecimiento. El procedimiento construye un modelo metabolico basado en restricciones que estrecha la gama de posibles fenotipos que puede mostrar un sistema celular mediante la imposicion sucesiva de restricciones fisicoqmmicas de control, Price et al., Nat. Rev. Microbiol., 2: 886-97 (2004). Tal como se ha descrito anteriormente, los modelos y simulaciones basados en restricciones son bien conocidos en la tecnica y por lo general implican la optimizacion de una diana celular espedfica, sometida a la estequiometna de la red, para sugerir una distribucion de flujo probable.

En resumen, la maximizacion de un objetivo celular cuantificado como flujo de reaccion agregado para una red metabolica estacionaria que comprende un conjunto N={1, . . . , N} de metabolitos y un conjunto M={1, . . . , M} de reacciones metabolicas se expresa matematicamente de la siguiente forma:

m a x im iz a r sometido a

Vsustrato _ Vsustrato_captaci6n mmol/gD^V'h

{sustrato(s) limitante(s)} Vatp — Vatp_principal mmol/QDW' h

Vj =20 W ■ _

V / t {reaccion irrev.}

donde Sy es el coeficiente estequiometrico del metabolite i en la reaccion j, Vj es el flujo de la reaccion j, Vsustrato_captacion representa la tasa o tasas de recaptacion teoricas o medidas del sustrato o sustratos limitantes, y Vatp_principal es el ATP de mantenimiento necesario no asociado al crecimiento. El vector v incluye tanto los flujos internos como los externos. En este estudio, se considera frecuentemente que el objetivo celular es la obtencion de precursores biosinteticos en las proporciones necesarias para la formacion de biomasa, Neidhardt, F. C. et al., Escherichia coli and Salmonella: Cellular and Molecular Biology, 2a ed. 1996, Washington, D.C.: ASM Press. 2 v. (xx, 2822, lxxvi). Los flujos por lo general se indican por 1 gDWh (gramo de peso seco multiplicado por hora) de tal manera que la formacion de la biomasa se expresa como g de biomasa producida/gDWh o 1/h.

El modelado de las deleciones genicas, y dicha eliminacion de reacciones, utiliza en primer lugar la incorporacion de variables binarias a la estructura teorica basada en restricciones, Burgard et al., Biotechnol. Bioeng., 74: 364-375 (2001), Burgard et al., Biotechnol. Prog., 17: 791-797 (2001). Estas variables binarias

suponen un valor de 1 si la reaccion j esta activa y un valor de 0 si esta inactiva. La siguiente restriccion,

garantiza que el flujo de la reaccion, Vj, se ajusta a cero solamente si la variable yj es igual a cero. Como alternativa, cuando yj es igual a uno, Vj puede tomar cualquier valor entre un lfmite inferior Vjmin y un lfmite superior Vjmax. En el presente documento, Vjmin y Vjmax se identifican minimizando y maximizando, respectivamente, cada flujo de reaccion sometido a las restricciones de la red anteriormente descritas, Mahadevan et al., Metab. Eng., 5: 264-76 (2003). Las desactivaciones de genes/reacciones optimas se identifican resolviendo un problema de optimizacion de dos niveles que selecciona el conjunto de reacciones activas (yj=1) de tal forma que una solucion de crecimiento optimo de la red resultante produce un exceso del producto qmmico de interes. Desde el punto de vista matematico, este problema de optimizacion de dos niveles se expresa en forma del siguiente problema de optimizacion entero mixto de dos niveles:

Maximizar Vquimica (OptKnock) Vj

sometido a maximizar Vbiomasa

Vj

M

sometido a

Z /=i V / = f t Vsustrato =

V sustrato_captacion V / £ {sustrato(s)

limitante(s)} Vatp — Vatp_principal J VBiomasa — Vbiomasa

donde Vquimico es la produccion del producto diana deseado, por ejemplo, succinato u otro producto bioqufmico, y K es el numero de desactivaciones permisibles. Destacar que poner el valor de K en cero devuelve la solucion de biomasa maxima de la red completa, mientras que poner el valor de K en uno identifica la unica desactivacion de gen/reaccion (y =0) de tal forma que la red resultante implica la maxima sobreproduccion dado su maximo rendimiento de biomasa. La restriccion final garantiza que la red resultante cumple un mfnimo rendimiento de biomasa. Burgard et al., Biotechnol. Bioeng., 84: 647-57 (2003), proporcionan una descripcion mas detallada de la formulacion del modelo y del procedimiento de resolucion. Los problemas que contienen cientos de variables binarias se pueden resolver en unos pocos minutos o en varias horas usando CPLEX 8.0, GAMS: The Solver Manuals. 2003: GAMS Development Corporation, que se puede acceder a traves de GAMS, Brooke et al., GAMS Development Corporation (1998), un entorno de modelado, en una estacion de trabajo IBM RS6000-270. La infraestructura OptKnock ya ha sido capaz de identificar estrategias de delecion de genes prometedoras para la produccion bioqufmica en exceso, Burgard et al., Biotechnol. Bioeng., 84: 647-57 (2003), Pharkya et al., Biotechnol. Bioeng., 84: 887-899 (2003), y establece un marco sistematico que abarca de forma natural futuras mejoras en marcos de modelizacion metabolica y reguladora.

Cualquier solucion del problema OptKnock de dos niveles anteriormente descrito proporcionara un conjunto de reacciones metabolicas a perturbar. La eliminacion de cada reaccion dentro del conjunto o la modificacion metabolica puede dar como resultado 4-HB o BDO como producto obligado durante la fase de crecimiento del organismo. Como las reacciones son conocidas, una solucion del problema OptKnock de dos niveles tambien proporcionara el gen o genes asociados que codifican una o mas enzimas que catalizan cada reaccion dentro del conjunto de reacciones. La identificacion de un conjunto de reacciones y sus correspondientes genes que codifican los enzimas que participan en cada reaccion es generalmente un proceso automatizado, que se realiza mediante la correlacion de las reacciones con una base de datos de reacciones que incluye relaciones entre enzimas y genes codificantes.

Una vez identificado, el conjunto de reacciones a perturbar para obtener la produccion de 4-HB o BDO se implementa en la celula u organismo diana mediante la perturbacion funcional de al menos un gen que codifica cada reaccion metabolica dentro del conjunto. Un medio especialmente util para conseguir la perturbacion funcional del conjunto de reaccion es mediante la delecion de cada gen de codificacion. Sin embargo, en algunos casos, puede ser beneficioso perturbar la reaccion mediante otras anomalfas geneticas entre las que se incluyen, por ejemplo, mutacion, delecion de regiones reguladoras tales como promotores o sitios de union a cis de los factores reguladores, o mediante truncamiento de la secuencia de codificacion en cualquiera de numerosas ubicaciones. Estas ultimas anomalfas, que dan como resultado la delecion completa del conjunto genico pueden ser utiles, por ejemplo, cuando se desea una evaluacion rapida del acoplamiento del succinato o cuando es menos probable que ocurra la reversion genica.

Para identificar soluciones productivas adicionales para el problema OptKnock de dos niveles anteriormente descrito que proporcione conjuntos adicionales de reacciones a perturbar o modificaciones metabolicas que puedan dar como resultado una biosfntesis, incluyendo la biosfntesis de 4-HB u otro producto bioqufmico acoplada al crecimiento, se puede implementar otro metodo de optimizacion, denominado de cortes enteros. Este metodo progresa resolviendo el problema OptKnock anteriormente ilustrado de forma iterativa con la incorporacion de una restriccion adicional que se denomina corte entero en cada iteracion. La restriccion de corte entero evita eficazmente que el procedimiento de resolucion seleccione exactamente el mismo conjunto de reacciones identificado en cualquier iteracion anterior que obligatoriamente acopla la biosfntesis del producto con el crecimiento. Por ejemplo, si una modificacion metabolica acoplada con el crecimiento anteriormente identificada especifica que las reacciones 1, 2, y 3 se deber perturbar, entonces, la siguiente restriccion impide las mismas reacciones se consideren simultaneamente en posteriores soluciones: yi+y2+y3 > 1. El metodo de corte entero es bien conocido en la tecnica y se puede encontrar descrito en, por ejemplo, la referencia, Burgard et al., Biotechnol. Prog., 17: 791-797 (2001). Analogamente a todos los metodos descritos en el presente documento con referencia a su uso combinado con la infraestructura informatica OptKnock para modelizacion y simulacion metabolica, el metodo de corte entero para reducir la redundancia en el analisis informatico iterativo tambien se puede aplicar a otras infraestructuras informaticas bien conocidas en la materia incluyendo, por ejemplo, SimPheny®.

Las restricciones del tipo anterior impiden la identificacion de conjuntos de reaccion mas grandes que incluyen conjuntos ya identificados. Por ejemplo, el uso del metodo de optimizacion de corte entero anterior en una iteracion posterior impedirfa la identificacion de un cuadruple conjunto de reacciones que especifique que las reacciones 1, 2, y 3 se deben perturbar, ya que estas reacciones se han identificado con anterioridad. Para garantizar la identificacion de todos los posibles conjuntos de reacciones que conducen a la produccion biosintetica de un producto, se puede utilizar una modificacion del metodo de corte entero.

En resumen, el procedimiento de corte entero modificado comienza con la iteracion 'cero' que calcula la produccion maxima del producto bioqufmico deseado para el crecimiento optimo con una red natural. Este calculo corresponde a una solucion OptKnock con K igual a 0.

A continuacion, se consideran desactivaciones simples y se introducen dos conjuntos de parametros, objstoreiter e ystoreiter,j, para guardar la funcion objetivo (vquimico) e informacion se activacion-desactivacion de la reaccion (yj), respectivamente, en cada iteracion, iter. A continuacion, las siguientes restricciones se anaden sucesivamente a la formulacion OptKnock en cada iteracion.

En la ecuacion anterior, £ y M son numeros pequenos y grandes, respectivamente. En general, £ se puede ajustar a aproximadamente 0,01 y M se puede ajustar a aproximadamente 1000. Sin embargo, tambien se pueden utilizar numeros mas grandes y/o mas pequenos que los citados. M garantiza que la restriccion solamente puede ser vinculante para estrategias de desactivacion anteriormente identificadas, mientras que £ garantiza que la adicion de desactivaciones a una estrategia previamente identificada debe llevar a un aumento de al menos £ en la produccion bioqufmica durante el crecimiento optimo. Esta estrategia pasa a deleciones dobles cuando una estrategia de delecion unica no consigue mejorar la cepa natural. Despues se consideran las deleciones triples cuando ninguna estrategia de delecion doble mejora la cepa natural, y asf sucesivamente. El resultado final es una lista ordenada, representada por la produccion bioqufmica deseada en el crecimiento optimo, de diferentes estrategias de delecion que se diferencian entre si como mfnimo en una inactivacion. Este procedimiento de optimizacion, asf como la identificacion de una amplia variedad de conjuntos de reacciones que, cuando se perturban, conducen a la biosfntesis, incluyendo la produccion acoplada con el crecimiento, de un producto bioqufmico. Con las ensenanzas y directrices que se proporcionan en el presente documento, los expertos en la materia entenderan que los metodos y disenos de la ingenierfa metabolica ilustrada en el presente documento se pueden aplicar analogamente para identificar nuevas rutas biosinteticas y/o al acoplamiento obligatorio entre el crecimiento de la celula o el microorganismo y cualquier producto bioqufmico.

Los metodos anteriormente ilustrados e ilustrados adicionalmente en los Ejemplos siguientes permiten la construccion de las celulas y organismos que producen de forma biosintetica, incluyendo el acoplamiento obligado entre la produccion de un producto bioqufmico deseado y el crecimiento de la celula u organismo disenados para contener las alteraciones geneticas deseadas. En este sentido, se han identificado alteraciones geneticas que dan como resultado la biosfntesis de 4-HB y 1,4-butanodiol. Las cepas de microorganismos construidas con las alteraciones metabolicas identificadas producen niveles elevados de 4-HB o BDO en comparacion con los microorganismos sin modificar. Estas cepas se pueden utilizar provechosamente para la produccion comercial de 4-HB, BDO, THF y GBL, por ejemplo, en un proceso de fermentacion continuo sin estar sometidas a presiones de seleccion negativa.

Por tanto, los metodos informaticos descritos en el presente documento permiten la identificacion e implementacion de modificaciones metabolicas que se identifican mediante un metodo in silico seleccionado para OptKnock o SimPheny. El conjunto de modificaciones metabolicas puede incluir, por ejemplo, la adicion de una o mas rutas enzimaticas biosinteticas y/o la perturbacion funcional de una o mas reacciones metabolicas entre las que se incluyen, por ejemplo, la perturbacion por delecion del gen.

La aplicacion del metodo OptKnock para identificar rutas adecuadas para la produccion del 1,4-butanodiol (BDO) acoplada al crecimiento se describe en los Ejemplos V-VII. Tal como se ha descrito anteriormente, la metodologfa OptKnock se desarrollo sobre la base de que las redes microbianas mutantes pueden evolucionar hacia sus fenotipos de crecimiento maximo previstos por el modelo cuando se someten a periodos prolongados se seleccion por crecimiento. En otras palabras, la estrategia aprovecha la capacidad del organismo para autooptimizarse bajo presion selectiva. La infraestructura OptKnock permite la enumeracion exhaustiva de combinaciones de deleciones de genes que fuerzan un acoplamiento entre la produccion bioqufmica y el crecimiento de la celula en funcion de la estequiometrfa de la red. La identificacion de desactivaciones de genes/reacciones optimas requiere la resolucion de un problema de optimizacion de dos niveles que selecciona el conjunto de reacciones activas de tal forma que una solucion de crecimiento optimo de la red resultante produce un exceso del producto bioqufmico de interes (Burgard et al. Biotechnol. Bioeng.84:647-657 (2003)).

La produccion bioqufmica acoplada con el crecimiento se puede visualizar en el contexto de los lfmites de produccion bioqufmica de una red metabolica tfpica. Estos lfmites se obtienen a partir de un modelo in silico fijando la tasa o tasas de recaptacion del sustrato o sustratos limitantes a sus valores experimentalmente determinados, y calculando las tasas maximas y mfnimas de produccion bioqufmica para cada nivel de crecimiento que se puede alcanzar. La produccion implica basicamente todo lo que es posible abarcando todos los fenotipos biologicos potenciales disponibles para una cepa dada. Aunque se producen excepciones, tfpicamente, la produccion de un producto bioqufmico deseado esta en competencia directa con la formacion de recursos intracelulares (vease la figura 5, region gris). Asf, un rendimiento bioqufmico mejorado necesariamente dara como resultado un crecimiento inferior al maximo. Adicionalmente, la aplicacion de presiones de seleccion por crecimiento puede impulsar el rendimiento de produccion no acoplada al crecimiento de una cepa hacia un genotipo de baja produccion (punto A, figura 5), independientemente de su punto de partida inicial. La desactivacion sugerida por OptKnock esta disenada para restringir el Kmite admisible de la solucion, forzando un cambio en el comportamiento metabolico como se representa en la figura 5 (region cian). La estrategia de la ingeniena de evolucion se puede aplicar para impulsar el rendimiento de una cepa disenada mediante OptKnock hacia el Kmite situado mas a la derecha. Esto dara como resultado una cepa de produccion elevada que debena ser intrmsecamente estable para presiones de seleccion por crecimiento adicionales (punto B, figura 5).

Se uso un modelo estequiometrico in silico del metabolismo de E. coli para identificar los genes esenciales de las rutas metabolicas, como se ha ilustrado y descrito anteriormente en, por ejemplo, las publicaciones de patente de Estados Unidos US 2002/0012939, US 2003/0224363, US 2004/0029149, US 2004/0072723, US 2003/0059792, US 2002/0168654 y US 2004/0009466, y en la patente de Estados Unidos. n° 7.127.379. Como se divulga en el presente documento, la infraestructura matematica OptKnock se aplico para detectar deleciones de genes que condudan a una produccion de BDO acoplada al crecimiento (veanse los Ejemplos V-VII). Se determinaron inicialmente estrategias mediante un modelo reducido de la red metabolica de E. coli. Este modelo “pequeno” incluye las funcionalidades metabolicas clave de la red, eliminando de esta forma la redundancia asociada con las redes metabolicas a escala genomica. Se presto atencion a garantizar que el modelo no se habfa reducido hasta el punto de no incluir rutas potencialmente activas que teman dianas viables. En su conjunto, el modelo reducido contema 262 reacciones y su implementacion redujo el tiempo de CPU de OptKnock CPU en aproximadamente diez veces en comparacion con la aplicacion de OptKnock al modelo a escala genomica de E. coli (Reed et al., Genome Biol. 4:R54 (2003)).

Ademas, la solucion del problema OptKnock de dos niveles proporciona solamente un conjunto de deleciones. Para enumerar todas las soluciones significativas, es decir, todos los conjuntos de desactivaciones que conducen a una formacion de la produccion acoplada al crecimiento, se puede implementar una tecnica de optimizacion denominada de cortes enteros. Esto conlleva resolver el problema OptKnock de forma iterativa con la incorporacion de una restriccion adicional que se denomina corte entero en cada iteracion, tal como se ha descrito anteriormente.

Para las rutas bioqmmicas que conducen al 1,4-butanodiol, se espera que la conversion de glucosa en BDO en E. coli derive de un total de tres etapas de reduccion intracelular a partir del semialdetndo succmico (vease la figura 6). E. coli produce de forma natural el semialdetndo succmico mediante el ciclo intermedio TCA, alfa-cetoglutarato, mediante la accion de dos enzimas, la glutamato:semialdehndo succmico transaminasa y glutamato descarboxilasa. Una ruta alternativa, utilizada por el anaerobio estricto Clostridium kluyveri para degradar el succinato, activa el succinato a succinil-CoA, y posteriormente convierte el succinil-CoA en semialdetndo succmico usando una semialdetndo succmico deshidrogenasa dependiente de CoA (Sohling y Gottschalk, Eur. J. Biochem. 212:121-127 (1993)). La conversion de succinato semialdetndo en BDO requiere en primer lugar la actividad de la 4-hidroxibutanoato (4-HB) deshidrogenasa, un enzima no natural para E. coli o levaduras, pero que se encuentra en diversas bacterias tales como C. kluyveri y Ralstonia eutropha (Lutke-Eversloh y Steinbuchel, FEMS Microbiol. Lett.

181:63-71 (1999); Sohling y Gottschalk, J. Bacteriol. 178:871-880 (1996); Valentin et al., Eur. J. Biochem.227:43-60 (1995); Wolff y Kenealy, Protein Expr. Purif. 6:206-212 (1995)). El precedente de la conversion de 4-HB en BDO se ha demostrado en el anaerobio estricto, Clostridium acetobutylicum, que cuando se alimento con 4-HB, demostro producir cuantitativamente BDO (Jewell et al., Current Microbiology 13:215-219 (1986)). Las biotransformaciones necesarias de 4-HB a BDO se suponen similares a las de la conversion de acido butmico en butanol habitual de las especies de Clostridia, que transcurre mediante un derivado de CoA (Girbal et al., FEMS Microbiology Reviews 17:287-297 (1995)).

Se divulga adicionalmente un microorganismo no natural que comprende una o mas perturbaciones genicas, las una o mas perturbaciones genicas se producen en genes que codifican un enzima obligatorio para acoplar la produccion de 1,4-butanodiol al crecimiento del microorganismo cuando la perturbacion del gen reduce la actividad de un enzima, en donde la una o mas perturbaciones genicas transmiten una produccion de 1,4-butanodiol acoplada al crecimiento estable en el microorganismo no natural. La una o mas perturbaciones genicas pueden ser, por ejemplo, las descritas en la Tabla 6 o 7. La una o mas perturbaciones genicas pueden comprender perturbaciones que comprenden una delecion del uno o mas genes, tales como los genes divulgados en la Tabla 6 o 7.

Como se divulga en el presente documento, el microorganismo no natural puede ser una bacteria, levadura u hongo. Por ejemplo, el microorganismo no natural puede ser una bacteria tal como Escherichia coli, Klebsiella oxytoca, Anaerobiospirillum succiniciproducens, Actinobacillus succinogenes, Mannheimia succiniciproducens, Rhizobium etli, Bacillus subtilis, Corynebacterium glutamicum, Gluconobacter oxydans, Zymomonas mobilis, Lactococcus lactis, Lactobacillus plantarum, Streptomyces coelicolor, Clostridium acetobutylicum, Pseudomonas fluorescens, y Pseudomonas putida. El microorganismo no natural tambien puede ser una levadura tal como Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces marxianus, Aspergillus terreus, Aspergillus niger, y Pichia pastoris.

Un microorganismo no natural de la divulgacion puede comprender un conjunto de modificaciones metabolicas que acoplan obligatoriamente la produccion de 1,4-butanodiol al crecimiento del microorganismo, comprendiendo el conjunto de modificaciones metabolicas la perturbacion de uno o mas genes seleccionados entre el conjunto de genes que comprenden adhE, IdhA, pflAB; adhE, IdhA, pflAB, mdh; adhE, IdhA, pflAB, mdh, mqo; adhE, IdhA, pflAB, mdh, aspA; adhE, mdh, IdhA, pflAB, sfcA; adhE, mdh, IdhA, pflAB, maeB; adhE, mdh, IdhA, pflAB, sfcA, maeB; adhE, IdhA, pflAB, mdh, pntAB; adhE, IdhA, pflAB, mdh, gdhA; adhE, IdhA, pflAB, mdh, pykA, pykF, dhaKLM, deoC, edd, yiaE, ycdW; y adhE, IdhA, pflAB, mdh, pykA, pykF, dhaKLM, deoC, edd, yiaE, ycdW, prpC, gsk, o un ortologo del mismo, en el que el microorganismo muestra una produccion de 1,4-butanodiol acoplada al crecimiento estable.

La divulgacion proporciona un microorganismo no natural que comprende un conjunto de modificaciones metabolicas obligadas para acoplar la produccion de 1,4-butanodiol al crecimiento del microorganismo, comprendiendo el conjunto de modificaciones metabolicas la perturbacion de uno o mas genes, o un ortologo del mismo, en el que el conjunto de modificaciones metabolicas comprende la perturbacion de adhE y IdhA, en el que el microorganismo muestra una produccion de 1,4-butanodiol acoplada al crecimiento estable. El conjunto de modificaciones metabolicas puede comprender ademas la perturbacion de mdh. El conjunto de modificaciones metabolicas puede comprender ademas la perturbacion de uno o mas genes seleccionados entre el conjunto de genes que comprenden mqo, aspA, sfcA, maeB, pntAB, y gdhA y puede incluir, por ejemplo, la perturbacion de sfcA y maeB. El conjunto de modificaciones metabolicas puede comprender ademas la perturbacion de uno o mas genes seleccionados entre el conjunto de genes que comprenden pykA, pykF, dhaKLM, deoC, edd, yiaE, ycdW, prpC, y gsk, incluyendo la perturbacion de todos los pykA, pykF, dhaKLM, deoC, edd, yiaE y ycdW, y puede comprender ademas la perturbacion de prpC y gsk. Cualquiera de los conjuntos de modificaciones metabolicas anteriormente descritas puede comprender ademas la perturbacion de pflAB. En una divulgacion particular, el conjunto de modificaciones metabolicas comprende la perturbacion de uno o mas genes seleccionados entre el conjunto de genes que comprenden adhE, IdhA, pflAB, mdh, y aspA, incluyendo hasta la totalidad de los genes adhE, IdhA, pflAB, mdh, y aspA.

Un microorganismo no natural de la divulgacion puede comprender ademas una ruta biosintetica 1,4-butanodiol (BDO) que comprende al menos un acido nucleico exogeno que codifica la 4-hidroxibutanoato deshidrogenasa, semialdehndo succmico deshidrogenasa independiente de CoA, succinil-CoA sintetasa, semialdehndo succmico deshidrogenasa dependiente de CoA, 4-hidroxibutirato:CoA transferasa, glutamato: semialdetndo succmico transaminasa, glutamato descarboxilasa, aldehndo deshidrogenasa independiente de CoA, aldehndo deshidrogenasa dependiente de CoA o alcohol deshidrogenasa, en el que el acido nucleico exogeno se expresa en cantidad suficiente para producir 1,4-butanodiol (BDO), como se divulga en el presente documento.

La divuglacion proporciona adicionalmente un metodo para producir un microorganismo no natural que tiene una produccion de 1,4-butanodiol acoplada al crecimiento estable identificando in silico un conjunto de modificaciones metabolicas que requieren la produccion de 1,4-butanodiol durante el crecimiento exponencial bajo un conjunto definido de condiciones, y modificar geneticamente un microorganismo para que contenga el conjunto de modificaciones metabolicas que requieren la produccion de 1,4-butanodiol. Dichos metodos pueden incluir adicionalmente la adicion de genes exogenos que expresan las actividades enzimaticas deseadas en un microorganismo. Dicho conjunto de modificaciones metabolicas se puede identificar por un metodo in silico seleccionado entre OptKnock o SimPheny (vease anteriormente y los Ejemplos V-VII).

Ademas, la invencion proporciona un metodo para producir 1,4-butanodiol acoplado al crecimiento de un microorganismo. El metodo puede incluir las etapas de cultivar en la fase de crecimiento exponencial, en cantidad suficiente de nutrientes y medio, un microorganismo no natural que comprende un conjunto de modificaciones metabolicas que acoplan obligatoriamente la produccion de 1,4-butanodiol al crecimiento del microorganismo, en el que el microorganismo muestra una produccion de 1,4-butanodiol acoplada al crecimiento estable, y aislar el 1,4-butanodiol producido a partir del microorganismo no natural. El conjunto de modificaciones metabolicas que comprende la perturbacion de uno o mas genes se puede seleccionar entre el conjunto de genes que comprenden adhE, IdhA, pflAB; adhE, IdhA, pflAB, mdh; adhE, IdhA, pflAB, mdh, mqo; adhE, IdhA, pflAB, mdh, aspA; adhE, mdh, IdhA, pflAB, sfcA; adhE, mdh, IdhA, pflAB, maeB; adhE, mdh, IdhA, pflAB, sfcA, maeB; adhE, IdhA, pflAB, mdh, pntAB; adhE, IdhA, pflAB, mdh, gdhA; adhE, IdhA, pflAB, mdh, pykA, pykF, dhaKLM, deoC, edd, yiaE, ycdW; y adhE, IdhA, pflAB, mdh, pykA, pykF, dhaKLM, deoC, edd, yiaE, ycdW, prpC, gsk, o un ortologo del mismo.

En una realizacion, la divulgacion proporciona un metodo para producir 1,4-butanodiol acoplado al crecimiento de un microorganismo. El metodo puede incluir las etapas de cultivar en la fase de crecimiento exponencial, en cantidad suficiente de nutrientes y medio, un microorganismo no natural que comprende un conjunto de modificaciones metabolicas que acoplan obligatoriamente la produccion de 1,4-butanodiol al crecimiento del microorganismo, comprendiendo el conjunto de modificaciones metabolicas la perturbacion de uno o mas genes, o un ortologo del mismo, en el que el conjunto de modificaciones metabolicas comprende la perturbacion de adhE y IdhA, en el que el microorganismo muestra una produccion de 1,4-butanodiol acoplada al crecimiento estable; y aislar el 1,4-butanodiol producido a partir del microorganismo no natural. En una divulgacion adicional, el conjunto de modificaciones metabolicas puede comprender ademas la perturbacion de mdh. En otra divulgacion, el conjunto de modificaciones metabolicas puede comprender ademas la perturbacion de uno o mas genes seleccionados entre el conjunto de genes que comprenden mqo, aspA, sfcA, maeB, pntAB, y gdhA y puede incluir, por ejemplo, la perturbacion de sfcA y maeB. En otra divulgacion mas, el conjunto de modificaciones metabolicas puede comprender ademas la perturbacion de uno o mas genes seleccionados entre el conjunto de genes que comprenden pykA, pykF, dhaKLM, deoC, edd, yiaE, ycdW, prpC, y gsk, incluyendo la perturbacion de todos los pykA, pykF, dhaKLM, deoC, edd, yiaE y ycdW, y puede comprender ademas la perturbacion de prpC y gsk. Cualquiera de los conjuntos de modificaciones metabolicas anteriormente descritas puede comprender ademas la perturbacion de pflAB.

En un metodo para producir BDO, el microorganismo no natural puede comprender ademas una ruta biosintetica 1,4-butanodiol (BDO) que comprende al menos un acido nucleico exogeno que codifica la 4-hidroxibutanoato deshidrogenasa, semialdel'ndo succmico deshidrogenasa independiente de CoA, succinil-CoA sintetasa, semialdel'ndo succmico deshidrogenasa dependiente de CoA, 4-hidroxibutirato:CoA transferasa, glutamato: semialdel'ndo succmico transaminasa, glutamato descarboxilasa, aldehndo deshidrogenasa independiente de CoA, aldehndo deshidrogenasa dependiente de CoA o alcohol deshidrogenasa, en el que el acido nucleico exogeno se expresa en cantidad suficiente para producir 1,4-butanodiol (BDO).

Se entiende que tambien se incluyen modificaciones que no afectan sustancialmente a la actividad de las diversas realizaciones de esta invencion dentro de la definicion de la invencion proporcionada en el presente documento. Por consiguiente, se pretende que los siguientes ejemplos ilustren, pero no limiten, la presente invencion.

EJEMPLO I

Biosintesis del acido 4-hidroxibutanoico

Este Ejemplo describe las rutas bioqmmicas para la produccion de 4-HB.

Los informes anteriores sobre la smtesis de 4-HB en microbios se han centrado en este compuesto como un compuesto intermedio en la produccion del plastico biodegradable poli-hidroxialcanoato (PHA) (patente de Estados Unidos n° 6.117.658). El uso de copolfmeros 4-HB/3-HB puede ser ventajoso comparado con el polfmero de poli-3-hidroxibutirato (PHB) mas habitual porque el plastico resultante es menos quebradizo (Saito y Doi, Intl. J. Biol. Macromol. 16:99-104 (1994)). La produccion del 4-HB monomerico descrito en el presente documento es fundamentalmente un proceso diferente por varios motivos: 1). El producto se secreta, a diferencia del PHA, que se produce intracelularmente, y permanece en la celula; 2) para los organismos que producen polfmeros de hidroxibutanoato, no se produce 4-HB libre, sino en su lugar el derivado de Coenzima A, que utiliza la polihidroxialcanoato sintasa; 3) en el caso del polfmero, la formacion de productos granulares altera la termodinamica; y 4) el pH extracelular no es un problema para la produccion del polfmero, mientras que resultara alterado si 4-HB esta presente en forma de acido libre o como base conjugada, y tambien el equilibrio entre 4-HB y GBL.

4-HB se puede producir por dos etapas de reduccion desde succinato, un metabolito central del ciclo TCA, con el semialdetndo succmico como el compuesto intermedio (figura 2). La primera de estas enzimas, la semialdetndo succmico deshidrogenasa, es natural para muchos organismos incluyendo E. coli, en el que se han encontrado las dos enzimas dependientes de NADH y NADPH (Donnelly y Cooper, Eur. J. Biochem.113:555-561 (1981); Donnelly y Cooper, J. Bacteriol. 145:1425-1427 (1981); Marek y Henson, J. Bacteriol. 170:991-994 (1988)). Existe tambien evidencia que respalda la actividad de la semialdel'ndo succmico deshidrogenasa en S. cerevisiae (Ramos et al., Eur. J. Biochem. 149:401-404 (1985)), y se ha identificado un posible gen por homologfa de secuencia. Sin embargo, la mayona de los informes indican que esta enzima progresa en la direccion de la smtesis de succinato, en oposicion a lo que se muestra en la figura 2 (Donnelly y Cooper, mas arriba; Lutke-Eversloh y Steinbuchel, FEMS Microbiol. Lett. 181:63-71 (1999)), participando en la ruta degradativa de of 4-HB y gamma-aminobutirato. Una ruta alternativa, utilizada por el anaerobio estricto Clostridium kluyveri para degradar el succinato, activa el succinato a succinil-CoA, y posteriormente convierte el succinil-CoA en semialdel'ndo succmico usando una semialdel'ndo succmico deshidrogenasa alternativa que se sabe que actua en esta direccion (Sohling y Gottschalk, Eur. J. Biochem.212:121-127 (1993)). Sin embargo, esta ruta tiene el coste energetico del ATP necesario para convertir el succinato a succinil-CoA.

La segunda enzima de la ruta, 4-hidroxibutanoato deshidrogenasa, no es natural para E. coli o levaduras, pero que se encuentra en diversas bacterias tales como C. kluyveri y Ralstonia eutropha (Lutke-Eversloh y Steinbuchel, mas arriba; Sohling y Gottschalk, J. Bacteriol. 178:871-880 (1996); Valentin et al., Eur. J. Biochem. 227:43-60 (1995); Wolff y Kenealy, Protein Expr. Purif. 6:206-212 (1995)). Se sabe que estas enzimas son dependientes de NADH, con lo que se supone que pueden existir formas dependientes de NADPH. Una ruta adicional hacia 4-HB desde alfacetoglutarato se ha demostrado en E. coli dando como resultado la acumulacion de poli(acido 4-hidroxibutmco) (Song et al., Wei Sheng Wu Xue. Bao. 45:382-386 (2005)). La cepa recombinante necesita la sobreexpresion de tres genes heterologos, PHA sintasa (R. eutropha), 4-hidroxibutirato deshidrogenasa (R. eutropha) y 4-hidroxibutirato:CoA transferasa (C. kluyveri), junto con dos genes naturales de E. coli: glutamatensemialdelmdo succmico transaminasa y glutamato descarboxilasa. Las etapas 4 y 5 de la figura 2 pueden llevarse a cabo alternativamente mediante una alfa-cetoglutarato descarboxilasa tal como la identificada en Euglena gracilis (Shigeoka et al., Biochem. J. 282(Pt2):319-323 (1992); Shigeoka y Nakano, Arch. Biochem. Biophys. 288:22-28 (1991); Shigeoka y Nakano, Biochem J.292(Pt 2):463-467 (1993)). Sin embargo, esta enzima aun no se ha aplicado para alterar la produccion de 4-HB o polfmeros relacionados en ningun organismo.

La direccionalidad notificada de la semialdel'ndo succmico deshidrogenasa condujo a la investigacion de la termodinamica del metabolismo de 4-HB. Espedficamente, este estudio investigo si las reacciones implicadas en la conversion del succinato o succinil-CoA en 4-HB eran termodinamicamente favorables, o no lo eran, (es dedr, AGt<0) en las tipicas condiciones fisiologicas presentes en E. coli y S. cerevisiae. Se supone que todas las reacciones de oxidacion/reduccion utilizan NADH, aunque los resultados para la supuesta utilizacion de NADPH senan similares. Se calcularon las energfas libres de Gibbs estandar de formacion (AGf°) para cada compuesto de la figura 2 basandose en el metodo de contribucion de grupos (Mavrovouniotis, M. L., J. Biol. Chem. 266:14440-14445 (1991)). Cada energfa de Gibbs estandar de formacion se transformo a continuacion para obtener un criterio de cambio espontaneo a la presion, temperatura, pH y fuerza ionica especificados (Alberty, R. A., Biochem. Biophys. Acta 1207:1-11 (1994)) (ecuacion 1).

r - T1 - N

^{AG A l,p H ) = AG"} ^{( / = 0) N„ RT In( 1 O'”" ) - 2,915V / - ----- ~f=- (1)} f 1 ⁱ nji

Donde AGfo es la ene^a de Gibbs estandar de formacion, Nh es el numero de atomos de hidrogeno en el compuesto, R es la constante universal de los gases, T es constante a 298 K, z es la carga de la molecula al pH de interes, I es la fuerza ionica en M, y B es una constante igual a 1,6 L0,5/mol0,5.

La Ecuacion 1 revela que tanto el pH intracelular como la fuerza ionica tienen un papel para determinar la factibilidad termodinamica. Normalmente, el pH intracelular de las celulas esta muy bien regulado, incluso cuando hay grandes variaciones en el pH del cultivo. El pH intracelular de E. coli y S. cerevisiae se han notificado en la bibliografia. E. coli mantiene un pH intracelular de 7,4-7,7 durante las condiciones de crecimiento tfpicas en tampones neutros, pero puede disminuir a 7,2 en un medio a pH 6, e incluso bajar hasta 6,9 para un pH externo de 5 (Riondet et al., Biotechnology Tech. 11:735-738 (1997)). Sin embargo, el crecimiento de E. coli queda fuertemente inhibido a un pH externo inferior a 6. El pH de las levaduras muestra una variacion mayor. Durante la fase de crecimiento exponencial, el pH interno de S. cerevisiae se ha medido en el intervalo de 6,7-7,0 para un pH externo controlado a 5,0 (Dombek e Ingram, Appl. Environ. Microbiol. 53:1286-1291 (1987)). Por otra parte, en celulas en reposo, el pH interno baja por debajo de 6 cuando el pH externo es 6 o inferior (Imai y Ohno, J. Biotechnol. 38:165-172 (1995)). Este analisis supone un pH intracelular de 7,4 para E. coli y 6,8 para S. cerevisiae. Tambien se supone una fuerza ionica de 0,15 (Valenti et al., mas arriba).

Las energfas de Gibbs de formacion transformadas se calcularon en el estado estandar (pH=7,0, I=0) y para los estados fisiologicos de E. coli (pH=7,4, I=0,15) y S. cerevisiae (pH=6,8, I=0,15). Las energfas de Gibbs de reaccion (AGr) transformadas se calcularon a continuacion calculando la diferencia de AGf entre productos y reactivos. Las energfas de Gibbs de las reacciones transformadas necesarias para convertir succinato o succinil-CoA en 4-HB se proporcionan en la Tabla 2. A resaltar que el error estandar, Uf,est, para la AGf calculada mediante la teona de contribucion de grupos es de 4 kcal/mol. Esta incertidumbre sobre el valor de AGr, Ur,est, se puede calcular como la norma euclidea de la incertidumbre de AGf para cada compuesto (ecuacion).

Donde n es el coeficiente estequiometrico e i es el compuesto. Para las reacciones examinadas, esta incertidumbre es de aproximadamente 8 kcal/mol.

Tabla 2. Energfa libre de Gibbs de reaccion (kcal/mol) para diferentes valores de pH y fuerza ionica. La primera columna esta en condiciones estandar, mientras que las demas se han ajustado de acuerdo con la ecuacion 1. La temperatura es constante a 298 K. Las barras de error de estos valores son de aproximadamente 8 kcal/mol, calculado mediante la ecuacion 2. Abreviaturas: suc, succinato; sucsa, semialdehndo succrnico; succoa, succinil-CoA; Pi, fosfato inorganico.

Despues de considerar la posible incertidumbre en los calculos de los inventores, la Tabla 2 revela que es mas probable que la reaccion de la semialdetndo succrnico deshidrogenasa (etapa 1 de la figura 2) encuentre una barrera termodinamica. Tambien se estudio si esta reaccion se puede acercar a la factibilidad termodinamica variando las concentraciones supuestas de los metabolitos participates. Por ejemplo, las energfas de Gibbs estandar suponen concentraciones de 1 M para todos los compuestos participates (excepto el agua). En un entorno anaerobio, NADH estara presente en una concentracion varias veces superior a la de NAD. Suponiendo [NADH]=5x[NAD], los inventores calcularon el efecto sobre AGt usando la ecuacion

Este cambio dio como resultado una diferencia de solo aproximadamente 1 kcal/mol en los valores de delta G para la semialdetdo succmico deshidrogenasa. Tambien se utilizo la ecuacion 3 para calcular otros efectos sobre AGt, tales como una concentracion de succinato elevada para impulsar las reacciones. Una diferencia de 1000 veces en las concentraciones de succinato y semialdetndo succmico contribuyo a aproximadamente 5 kcal/mol a delta G. Tomado conjuntamente con una incertidumbre supuesta de 8 kcal/mol, la posibilidad de que la semialdetndo succmico deshidrogenasa actue en la direccion del semialdetndo succmico en algun conjunto de condiciones fisiologicas no se puede eliminar. Asf, los autores siguen considerando la ruta directa desde succinato hasta 4-HB en su analisis teorico posterior.

Se analizaron en dos microbios las capacidades de produccion microbiana de 4-hidroxibutirato, Escherichia coli y Saccharomyces cerevisiae, usando los modelos metabolicos in silico de cada organismo. Las rutas potenciales para dar 4-HB progresan mediante un compuesto de succinato, succinil-CoA, o alfa-cetoglutarato como se muestra en la figura 2.

La primera etapa en la ruta de produccion de 4-HB desde succinato implica la conversion de succinato en semialdetndo succmico mediante un semialdetndo succmico deshidrogenasa dependiente de NADH o NADPH. En E. coli, gabD es una semialdetndo succmico deshidrogenasa dependiente de NADP que forma parte de una agrupacion de genes implicada en la captacion y degradacion del 4-aminobutirato (Niegemann et al., Arch. Microbiol.

160:454-460 (1993); Schneider et al., J. Bacteriol. 184:6976-6986 (2002)). Se cree que sad codifica el enzima para la actividad de la semialdetndo succmico deshidrogenasa dependiente de NAD (Marek and Henson, mas arriba). S. cerevisiae contiene solamente la semialdetndo succmico deshidrogenasa dependiente de NADPH, teoricamente asignada a UGA2, que se encuentra en el citosol (Huh et al., Nature 425:686-691 (2003)). Los calculos del rendimiento maximo suponiendo la ruta del succinato para dar 4-HB tanto en E. coli como en S. cerevisiae requiere solamente la asuncion de que se ha anadido una 4-HB deshidrogenasa no natural a sus redes metabolicas.

La ruta desde succinil-CoA hasta 4-hidroxibutirato se describe en la patente de Estados Unidos n° 6.117.658 como parte de un proceso para fabricar polihidroxialcanoatos que comprenden unidades monomericas de 4-hidroxibutirato. Clostridium kluyveri es un ejemplo de organismo conocido que tiene actividad semialdetndo succmico deshidrogenasa dependiente de CoA (Sohling y Gottschalk, mas arriba; Sohling y Gottschalk, mas arriba). En este estudio, se supone que dicha enzima, derivada de C. kluyveri u otro organismo, se expresa en E. coli o S. cerevisiae junto con una 4-HB deshidrogenasa no natural o heterologa para completar la ruta desde succinil-CoA hasta 4-HB. La ruta desde alfa-cetoglutarato hasta 4-HB se ha demostrado en E. coli dando como resultado la acumulacion de poli(acido 4-hidroxibutmco) hasta un 30% del peso celular seco (Song et al., mas arriba). Como E. coli y S. cerevisiae tienen de forma natural o endogena glutamato:semialdetndo succmico transaminasa y glutamato descarboxilasa (Coleman et al., J. Biol. Chem. 276:244-250 (2001)), la ruta desde AKG hasta 4-HB se puede completar en ambos organismos suponiendo solamente que esta presente una 4-HB deshidrogenasa no natural.

EJEMPLO II

Produccion de acido 4-hidroxibutanoico en E. coli

Este Ejemplo describe los rendimientos biosinteticos del acido 4-hidroxibutanoico resultantes de cada ruta bioqmmica.

En esta seccion, se calcularon los rendimientos teoricos maximos de 4-HB procedente de glucosa suponiendo que cada una de las tres rutas metabolicas representadas graficamente en la figura 2 son funcionales en E. coli. Un modelo metabolico a escala genomica de E. coli, similar al descrito en Reed et al., Genome Biol. 4:R54 (2003), se uso como base para el analisis. Se calculo la ganancia energetica, en terminos de moleculas de ATP producidas, de cada ruta de rendimiento maximo suponiendo condiciones anaerobias, salvo que se indique otra cosa. Se supone que el 4-hidroxibutirato sale de E. coli mediante el mecanismo de cotransporte paralelo de protones, como es el caso de la mayona de los acidos organicos. Es tambien posible que GBL se secrete por difusion simple, y, en este caso, el rendimiento energetico sena mas favorable que en el caso considerado aqrn. Tambien se investigo el impacto de la especificidad del cofactor (es decir, la dependencia de NADH o NADPH) de los enzimas participates sobre el rendimiento maximo y el rendimiento energetico de cada ruta.

En las Tablas 3 A-C se muestran los resultados del analisis. Desde un punto de vista energetico y de rendimiento, la ruta del succinato a 4-HB es la mas prometedora con la condicion que se puedan superar las preocupaciones termodinamicas planteadas en el Ejemplo I. Espedficamente, los calculos revelan que el rendimiento maximo teorico de 4-HB a partir de glucosa es de 1,33 mol/mol (0,77 g/g; 0,89 moles C/moles C) suponiendo que la ruta de 4-HB a succinato es funcional. Ademas, la produccion anaerobia de 4-HB mediante succinato dana como resultado una produccion neta de 1,8, 1,5, o 1,1 mol de ATP por glucosa dependiendo de la especificidad del cofactor supuesta de los enzimas participates. Estos rendimientos energeticos son comparables con los 2,0 ATP por glucosa que se pueden obtener mediante fosforilacion del sustrato debido a la produccion de etanol o lactato sugiriendo el potencial de la produccion anaerobia de homo-4-HB en E. coli.

La ruta de la succinil-CoA de 4-HB es la segunda ruta mas prometedora cuando se considera el rendimiento maximo y el rendimiento energetico. Se puede conseguir en E. coli un rendimiento de 1,33 mol/mol de 4-HB si al menos una de las etapas de la ruta se supone dependiente de NADH. Sin embargo, como esta ruta requiere la formacion de succinil-CoA, su rendimiento energetico es considerablemente menor que el de la ruta del succinato. Se anticipa un requerimiento de oxfgeno a altos rendimientos de 4-HB si se supone que las etapas de la semialdetndo sucdnico deshidrogenasa dependiente de CoA y de la 4-HB deshidrogenasa dependen de NADPH. En este caso, la produccion de 4-HB en el rendimiento maximo no dana como resultado una ganancia neta de ATP y no podna soportar las demandas de mantenimiento energetico necesarias para la supervivencia de E. coli. Por tanto, se podna originar algo de energfa de la fosforilacion oxidativa para permitir la produccion homofermentativa de 4-HB. La ruta del alfa-cetoglutarato hacia 4-HB es la menos favorable de las tres rutas potenciales con un rendimiento maximo conseguible de 1,0 mol de 4-HB por mol de glucosa. Ademas del rendimiento maximo menor, esta ruta requiere la utilizacion de 1,5 moles de oxfgeno por mol de glucosa convertido en 4-HB. El rendimiento energetico de esta ruta no se ve afectado por la supuesta especificidad del cofactor de la 4-HB deshidrogenasa.

Tabla 3. La estequiometna global de conversion del sustrato a 4-HB suponiendo que las rutas de produccion de A) succinato, B) succinil-CoA, o C) alfa-cetoglutarato son funcionales en E. coli. La glucosa y el oxfgeno se captan mientras que el resto de moleculas se producen.

A) Ruta del succinato

B) Ruta de la succinil-CoA

C) Ruta del alfa-cetoglutarato

A fin de corroborar las predicciones de calculo propuestas en este informe, las cepas que expresan una ruta completa hacia 4-HB se pueden construir y someter a ensayo. La corroboracion se lleva a cabo con E. coli (Ejemplo II) y S. cerevisiae (Ejemplo III). En E. coli, los genes relevantes se expresan en un operon sintetico tras un promotor inducible en un plasmido con un numero de copias medio o alto; por ejemplo, el promotor PBAD que se induce por arabinosa, en un plasmido de la serie pBAD (Guzman et al., J. Bacteriol. 177:4121-4130 (1995)). En S. cerevisiae, los genes se integran en el cromosoma tras del promotor PDC1, sustituyendo el gen natural de la piruvato carboxilasa. Se ha notificado que esto da como resultado una mayor expresion de los genes extranos que desde un plasmido (Ishida et al., Appl. Environ. Microbiol. 71:1964-1970 (2005)), y garantizaran tambien la expresion durante las condiciones anaerobias.

Las celulas que contienen construcciones relevantes se hacen crecer en medios mmimos que contienen glucosa, con adicion de arabinosa en el caso de E. coli que contiene genes expresados con el promotor PBAD. Se toman muestras periodicas para evaluar la expresion genica y un analisis de actividad enzimatica. Se llevaron a cabo ensayos de actividad enzimatica en extractos de celulas brutas utilizando procedimientos bien conocidos en la materia. Como alternativa, se pueden utilizar ensayos basados en la oxidacion de NAD(P)H, que se producen en todas las etapas de reaccion de las deshidrogenasas y se pueden detectar mediante espectrofotometna. Ademas, se pueden usar anticuerpos para detectar el nivel de enzimas concretas. En lugar de, o ademas de, medidas de actividad enzimatica, se puede aislar el ARN de muestras paralelas y el transcripto del gen de interes se puede medir mediante PCR con transcriptasa inversa. Cualesquiera de las construcciones que caredan de expresion del transcripto detectable se volvieron a analizar para asegurar que los acidos nucleicos codificables se habfan incorporado en una forma expresable. Cuando se detectan los transcriptos, este resultado indica cualquiera de una carencia de traduccion o la produccion de un enzima inactiva. Se puede emplear adicionalmente una variedad de metodos bien conocidos en la tecnica, tales como la optimizacion de codones, la genomanipulacion de un sitio de union a ribosoma fuerte, el uso de un gen procedente de una especie diferente, y la prevencion de la N-glicosilacion (para la expresion de enzimas bacterianas en levadura) mediante conversion de restos Asn en Asp. Una vez que se detectaron todas las actividades enzimaticas requeridas, la siguiente etapa es medir la produccion de 4-HB in vivo. Se hacen crecer cultivos en matraces de cultivo por triplicado tanto anaerobia como microaerobicamente, dependiendo de las condiciones requeridas (vease anteriormente), y se toman muestras periodicas. Los acidos organicos presentes en los sobrenadantes del cultivo se analizaron mediante HPLC utilizando la columna Aminex AH-87X. El tiempo de elucion de 4-HB se determinara usando un patron adquirido de un proveedor de sustancias qmmicas.

Se puede implementar la ruta independiente de CoA y someterse a ensayo para corroboracion. En este caso, los genes expresados en exceso son los de la semialdetdo sucdnico deshidrogenasa natural de cada organismo, y de la 4-hidroxibutanoato deshidrogenasa de Ralstonia eutropha. Una vez detectadas las actividades enzimaticas como se ha descrito anteriormente, las cepas se someten a ensayo para determinar la produccion de 4-HB. Se puede obtener tambien la corroboracion implementando la ruta dependiente de CoA. La semialdetdo sucdnico deshidrogenasa dependiente de CoA y la 4-hidroxibutanoato deshidrogenasa procedente de Clostridium kluyveri se expresan como se ha descrito anteriormente. Ademas, se puede llevar tambien a cabo la sobreexpresion de succinil-CoA sintetasa natural, para canalizar mas succinato hacia la ruta heterologa. Finalmente, si la produccion de 4-HB es desfavorable, se pueden probar diferentes condiciones de cultivo, tales como un cambio en el estado de la oxigenacion que pueda manipular la proporcion NAD(P)H/NAD(P).

EJEMPLO III

Produccion de acido 4-hidroxibutanoico en levaduras

Este Ejemplo describe los rendimientos biosinteticos del acido 4-hidroxibutanoico resultantes de cada ruta bioqmmica en S. cerevisiae.

En esta seccion, se calcularon los rendimientos maximos teoricos de 4-HB a partir de glucosa suponiendo que cada una de estas tres rutas metabolicas representadas graficamente en la figura 2 son funcionales en S. cerevisiae. Se uso como base del analisis un modelo metabolico a escala genomica de S. cerevisiae, similar al descrito en Forster et al. (Genome Res. 13:244-253 (2003)). Se calculo la ganancia energetica de cada ruta de rendimiento maximo suponiendo condiciones anaerobias salvo que se indique lo contrario. Se supone que el 4-hidroxibutirato sale de S. cerevisiae mediante el mecanismo de cotransporte paralelo de protones, como es el caso de la mayona de los acidos organicos. Tambien se investigo el impacto de la especificidad del cofactor (es decir, la dependencia de NADH o NADPH) de los enzimas participates sobre el rendimiento maximo y el rendimiento energetico de cada ruta.

En las Tablas 4 A-C se muestran los resultados del analisis. Analogamente a E. coli, la ruta del succinato a 4-HB es la mas prometedora con la condicion que se puedan superar las preocupaciones termodinamicas planteadas en el Ejemplo I. Los calculos revelan que el rendimiento maximo teorico de 4-HB a partir de glucosa es de 1,33 mol/mol (0,77 g/g; 0,89 mol C/mol C) en S. cerevisiae. Ademas, la produccion anaerobia de 4-HB mediante succinato dana como resultado una produccion neta de 1,4, 1,1, o 0,5 mol de ATP por glucosa dependiendo de la especificidad del cofactor supuesto de los enzimas participates.

La ruta de la succinil-CoA a 4-HB es la segunda ruta mas favorable. Se puede conseguir un rendimiento maximo de 1,33 mol de 4-HB/mol de glucosa en S. cerevisiae sin tener en cuenta la especificidad del cofactor. Sin embargo, la generacion de energfa neta en el rendimiento maximo teorico es posible solo si se supone que las etapas de la semialdehndo succmico deshidrogenasa dependiente de CoA y la 4-HB deshidrogenasa son dependientes de NADPH. Si alguna etapa es dependiente de NADPH, no se obtendra ATP neto de la produccion de 4-HB anaerobia y se requerina una fuente de energfa alternativa (por ejemplo, la fosforilacion oxidativa) para soportar el crecimiento y el mantenimiento celular. La ruta del alfa-cetoglutarato hacia 4-HB es la menos favorable de las tres rutas potenciales en S. cerevisiae aunque el rendimiento maximo de 1,1-1,2 mol de 4-HB por mol de glucosa es ligeramente mayor que el que se encontro en E. coli. Sin embargo, esta ruta requiere una captacion de oxfgeno de 0,8-0,9 mol de oxfgeno por mol de glucosa para convertirse en energeticamente neutra.

Tabla 4. La estequiometna global de conversion del sustrato a 4-HB en S. cerevisiae, suponiendo las rutas de produccion de A) succinato, B) succinil-CoA, o C) alfa-cetoglutarato son funcionales en S. cerevisiae. La glucosa y el oxfgeno se captan mientras que el resto de moleculas se producen.

A) Ruta del succinato

B) Ruta de la succinil-CoA

C) Ruta del alfa-cetoglutarato

EJEMPLO IV

Biosintesis del acido 4-hidroxibutanoico. v-butirolactona y 1,4-butanodiol

Este Ejemplo describe la produccion biosintetica de acido 4-hidroxibutanoico, Y-butirolactona y 1,4-butanodiol usando fermentacion y otros bioprocesos.

Se describen a continuacion los metodos para integrar de la etapa de fermentacion de 4-HB en un proceso completo para la produccion de GBL, 1,4-butanodiol (BDO) y tetrahidrofurano (THF) purificados. Como 4-HB y GBL estan en equilibrio, el caldo de fermentacion contendra ambos compuestos. A un pH bajo, este equilibrio se desplaza para favorecer GBL. Por tanto, la fermentacion puede funcionar a pH 7,5 o menos. Tras la retirada de la biomasa, la corriente de producto entra en una etapa de separacion en la que se retira el GBL y la corriente restante enriquecida en 4-HB se recircula. Finalmente, GBL se destila para eliminar cualquier impureza. El proceso funciona en uno de tres modos: 1) fermentacion de alimentacion discontinua y separacion discontinua; 2) fermentacion de alimentacion discontinua y separacion continua; 3) fermentacion continua y separacion continua. En la figura 4 se muestran esquematicamente los dos primeros de estos modos. Los procedimientos de fermentacion integrada descritos a continuacion se usan tambien para las celulas productoras de BDO de la invencion para la biosmtesis de BDO y los productos de la familia de BDO posteriores.

Protocolo de fermentacion para producir 4-HB/GBL (discontinua): El organismo de produccion se hace crecer en un biorreactor de 10 l en el que se burbujea una mezcla de N2/CO2, utilizando 5 l de caldo que contiene 5 g/l de fosfato de potasio, 2,5 g/l de cloruro de amonio, 0,5 g/l de sulfato de manganeso, y 30 g/l de solucion de mafz macerado, y una concentracion inicial de glucosa de 20 g/l. A medida que las celulas crecen y utilizan la glucosa, se alimenta mas glucosa al 70% al biorreactor a una tasa aproximadamente igual al consumo de glucosa en equilibrio. La temperatura del biorreactor se mantiene a 30 grados C. El crecimiento continua durante aproximadamente 24 horas, hasta que 4-HB alcanza una concentracion de entre 20-200 g/l, siendo la densidad celular entre 5 y 10 g/l. El pH no esta controlado, y disminuira normalmente a pH 3-6 al final del ciclo. Tras la finalizacion del periodo de cultivo, el contenido del fermentador se pasa a traves de una unidad de separacion celular (por ejemplo, una centnfuga) para eliminar las celulas y los desechos celulares, y el caldo de fermentacion se transfiere a una unidad de separacion del producto. El aislamiento de 4-HB y/o GBL tendna lugar mediante procedimientos de separacion convencionales empleados en la tecnica para separar los productos organicos de soluciones acuosas diluidas, tales como la extraccion lfquido-lfquido utilizando un disolvente organico inmiscible en agua (por ejemplo, tolueno) para proporcionar una solucion organica de 4-HB/GBL. La solucion resultante se somete a continuacion a metodos de destilacion convencionales para eliminar y recircular el disolvente organico y para proporcionar GBL (punto de ebullicion 204-205° C) que se afsla como un lfquido purificado.

Protocolo de fermentacion para producir 4-HB/GBL (completamente continuo): El organismo de produccion se hace crecer en primer lugar en modo discontinuo utilizando el equipo y la composicion del medio descrito anteriormente, excepto que la concentracion inicial de glucosa es de 30-50 g/l. Cuando la glucosa se agoto, se suministro de forma continua medio de alimentacion de la misma composicion a una velocidad de entre 0,5 l/h y 1 l/h, y el lfquido se retiro a la misma velocidad. La concentracion de 4-HB en el biorreactor sigue siendo constante a 30-40 g/l, y la densidad celular permanece constante entre 3-5 g/l. La temperatura se mantuvo a 30 grados C, y el pH se mantuvo a 4,5 utilizando NaOH y HCl concentrado, segun sea necesario. El biorreactor se hace funcionar de forma continua durante un mes, con muestras tomadas cada dfa para asegurar la consistencia de la concentracion de 4-HB. En modo continuo, el contenido del fermentador se retiro constantemente a medida que se suministraba medio de alimentacion nuevo. Se sometio a continuacion la corriente de salida, que contema celulas, medio, y productos de 4-HB y/o GBL, a procedimientos de separacion de productos en continuo, con o sin retirada de celulas y desechos celulares, y tendna lugar mediante metodos convencionales de separacion continua empleados en la tecnica para separar los productos organicos de soluciones acuosas diluidas, tales como la extraccion continua lfquido-lfquido utilizando un disolvente organico inmiscible en agua (por ejemplo, tolueno) para proporcionar una solucion organica de 4-HB/GBL. La solucion resultante se somete posteriormente a metodos de destilacion continua convencionales para eliminar y recircular el disolvente organico y para proporcionar GBL (punto de ebullicion 204 205° C) que se afsla como un lfquido purificado.

Protocolo de reduccion de g BL: Una vez que se aislo y purifico GBL tal como se ha descrito anteriormente, se sometio a continuacion a protocolos de reduccion tales como aquellos bien conocidos en la tecnica (referencias citadas) para producir 1,4-butanodiol o tetrahidrofurano (THF) o una mezcla de los mismos. Los catalizadores de hidrogenacion heterogeneos u homogeneos combinados con GBL bajo presion de hidrogeno son bien conocidos por proporcionar los productos 1,4-butanodiol o tetrahidrofurano (THF) o una mezcla de los mismos. Es importante senalar que la mezcla de producto de 4-HB/GBL que se separo del caldo de fermentacion, como se ha descrito anteriormente, puede someterse directamente, antes del aislamiento y la purificacion de GBL, a estos mismos protocolos de reduccion para proporcionar los productos 1,4-butanodiol o tetrahidrofurano o una mezcla de los mismos. Los productos resultantes, 1,4-butanodiol y THF, se aislaron y purificaron a continuacion mediante procedimientos bien conocidos en la materia.

Protocolo de fermentacion e hidrogenacion para producir BDO o THF directamente (discontinuo): Se hacen crecer las celulas en un biorreactor de 10 l en el que se burbujea una mezcla de N2/CO2, utilizando 5 l de caldo que contiene 5 g/l de fosfato de potasio, 2,5 g/l de cloruro de amonio, 0,5 g/l de sulfato de magnesio, y 30 g/l de solucion de mafz macerado, y una concentracion inicial de glucosa de 20 g/l. A medida que las celulas crecen y utilizan la glucosa, se alimenta mas glucosa al 70% al biorreactor a una tasa aproximadamente igual al consumo de glucosa en equilibrio. La temperatura del biorreactor se mantiene a 30 grados C. El crecimiento continua durante aproximadamente 24 horas, hasta que 4-HB alcanza una concentracion de entre 20-200 g/l, siendo la densidad celular entre 5 y 10 g/l. El pH no esta controlado, y disminuira normalmente a pH 3-6 al final del ciclo. Tras la finalizacion del periodo de cultivo, el contenido del fermentador se pasa a traves de una unidad de separacion celular (por ejemplo, una centnfuga) para eliminar las celulas y los desechos celulares, y el caldo de fermentacion se transfiere a una unidad de reduccion (por ejemplo, recipiente de hidrogenacion), donde la mezcla de 4-HB/GBL se redujo directamente a cualquiera de 1,4-butanodiol o THF o una mezcla de los mismos. Tras finalizar el procedimiento de reduccion, el contenido del reactor se transfiere a una unidad de separacion del producto. El aislamiento de 1,4-butanodiol y/o THF tendna lugar mediante procedimientos de separacion convencionales empleados en la tecnica para separar los productos organicos de soluciones acuosas diluidas, tales como la extraccion lfquido-lfquido utilizando un disolvente organico inmiscible en agua (por ejemplo, tolueno) para proporcionar una solucion organica de 1,4-butanodiol y/o THF. La solucion resultante se sometio a continuacion a metodos de destilacion convencionales para eliminar y recircular el disolvente organico y para proporcionar 1,4-butanodiol y/o THF, que se aislaron como lfquidos purificados.

Protocolo de fermentacion e hidrogenacion para producir BDO o THF directamente (completamente continuo): Las celulas se hacen crecer en primer lugar en modo discontinuo utilizando el equipo y la composicion del medio descritos anteriormente, excepto que la concentracion inicial de glucosa es de 30-50 g/l. Cuando la glucosa se agoto, se suministro de forma continua medio de alimentacion de la misma composicion a una velocidad de entre 0,5 l/h y 1 l/h, y el lfquido se retiro a la misma velocidad. La concentracion de 4-HB en el biorreactor sigue siendo constante a 30-40 g/l, y la densidad celular permanece constante entre 3-5 g/l. La temperatura se mantuvo a 30 grados C, y el pH se mantuvo a 4,5 utilizando NaOH y HCl concentrado, segun sea necesario. El biorreactor se hace funcionar de forma continua durante un mes, con muestras tomadas cada dfa para asegurar la consistencia de la concentracion de 4-HB. En modo continuo, el contenido del fermentador se retiro constantemente a medida que se suministraba medio de alimentacion nuevo. La corriente de salida, que contema celulas, medio, y productos de 4-HB y/o GBL, se paso a continuacion a traves de una unidad de separacion celular (por ejemplo, una centnfuga) para eliminar las celulas y los desechos celulares, y el caldo se fermentacion se transfirio a una unidad de reduccion continua (por ejemplo, recipiente de hidrogenacion), donde la mezcla de 4-HB/GBL se redujo directamente a cualquiera de 1,4-butanodiol o THF o una mezcla de los mismos. Tras finalizar el procedimiento de reduccion, el contenido del reactor se transfiere a una unidad de separacion continua del producto. El aislamiento de 1,4-butanodiol y/o THF tendna lugar mediante procedimientos de separacion continua convencionales empleados en la tecnica para separar los productos organicos de soluciones acuosas diluidas, tales como la extraccion lfquido-lfquido utilizando un disolvente organico inmiscible en agua (por ejemplo, tolueno) para proporcionar una solucion organica de 1,4-butanodiol y/o THF. La solucion resultante se sometio a continuacion a metodos de destilacion continua convencionales para eliminar y recircular el disolvente organico y para proporcionar 1,4-butanodiol y/o THF, que se aislaron como lfquidos purificados.

Protocolo de fermentacion para producir BDO directamente (discontinuo): El organismo de produccion se hace crecer en un biorreactor de 10 l en el que se burbujea una mezcla de N2/CO2, utilizando 5 l de caldo que contiene 5 g/l de fosfato de potasio, 2,5 g/l de cloruro de amonio, 0,5 g/l de sulfato de magnesio, y 30 g/l de solucion de mafz macerado, y una concentracion inicial de glucosa de 20 g/l. A medida que las celulas crecen y utilizan la glucosa, se alimenta mas glucosa al 70% al biorreactor a una tasa aproximadamente igual al consumo de glucosa en equilibrio. La temperatura del biorreactor se mantiene a 30 grados C. El crecimiento continua durante aproximadamente 24 horas, hasta que BDO alcanza una concentracion de entre 20-200 g/l, siendo la densidad celular generalmente entre 5 y 10 g/l. Tras la finalizacion del periodo de cultivo, el contenido del fermentador se pasa a traves de una unidad de separacion celular (por ejemplo, una centnfuga) para eliminar las celulas y los desechos celulares, y el caldo de fermentacion se transfiere a una unidad de separacion del producto. El aislamiento de BDO tendna lugar mediante procedimientos de separacion convencionales empleados en la tecnica para separar los productos organicos de soluciones acuosas diluidas, tales como la extraccion lfquido-lfquido utilizando un disolvente organico inmiscible en agua (por ejemplo, tolueno) para proporcionar una solucion organica de BDO. La solucion resultante se somete a continuacion a metodos de destilacion convencionales para eliminar y recircular el disolvente organico y para proporcionar GBL (punto de ebullicion 228-229° C) que se afsla como un lfquido purificado.

Protocolo de fermentacion para producir BDO directamente (completamente continuo): El organismo de produccion se hace crecer en primer lugar en modo discontinuo utilizando el equipo y la composicion del medio descrito anteriormente, excepto que la concentracion inicial de glucosa es de 30-50 g/l. Cuando la glucosa se agoto, se suministro de forma continua medio de alimentacion de la misma composicion a una velocidad de entre 0,5 l/h y 1 l/h, y el lfquido se retiro a la misma velocidad. La concentracion de BDO en el biorreactor sigue siendo constante a 30-40 g/l, y la densidad celular permanece constante entre 3-5 g/l. La temperatura se mantuvo a 30 grados C, y el pH se mantuvo a 4,5 utilizando NaOH y HCl concentrado, segun sea necesario. El biorreactor se hace funcionar de forma continua durante un mes, con muestras tomadas cada dfa para asegurar la consistencia de la concentracion de BDO. En modo continuo, el contenido del fermentador se retiro constantemente a medida que se suministraba medio de alimentacion nuevo. Se sometio a continuacion la corriente de salida, que contema celulas, medio, y el producto de BDO, a procedimientos de separacion de productos en continuo, con o sin retirada de celulas y desechos celulares, y tendna lugar mediante metodos convencionales de separacion continua empleados en la tecnica para separar los productos organicos de soluciones acuosas diluidas, tales como la extraccion continua lfquido-lfquido utilizando un disolvente organico inmiscible en agua (por ejemplo, tolueno) para proporcionar una solucion organica de BDO. La solucion resultante se somete posteriormente a metodos de destilacion continua convencionales para eliminar y recircular el disolvente organico y para proporcionar BDO (punto de ebullicion 228 229° C) que se afsla como un lfquido purificado (pf 20° C).

EJEMPLOV

Estrategias de desactivacion procedentes de modelos in silico para la produccion de 1,4-butanodiol acoplada al crecimiento de Escherichia coli

Este ejemplo describe el diseno in silico de estrategias de desactivacion para generar la produccion de 1,4butanodiol acoplada al crecimiento de E. coli.

La estrategia para generar la produccion de BDO acoplada al crecimiento implica en primer lugar la demostracion de una ruta funcional que posteriormente se optimiza mediante la evolucion adaptiva e inserciones, deleciones, y sobreexpresiones dirigidas de genes. A continuacion se describen mas detalladamente estrategias de genomanipulacion de cepas identificadas mediante OptKnock para generar la produccion de BDO acoplada al crecimiento en cepas de Escherichia coli. Todas las implementaciones de OptKnock suponen que estan disponibles las actividades de todas los enzimas resenadas en la figura 6 para E. coli en todas las condiciones. Ademas, todas las etapas de reduccion de esta ruta se suponen dependientes de NADH, aunque se espera que algunos de los disenos sean de aplicacion independientemente de la especificidad del cofactor.

El rendimiento potencial de BDO de las rutas bioqmmicas para dar 1,4-butanodiol en E. coli se detalla a continuacion. Se utilizaron tres condiciones, anaerobias, anaerobias adicion de nitrato, y aerobias. Los rendimientos teoricos maximos de cada escenario, suponiendo que la produccion de BDO debe ser energeticamente neutra, se muestran en la Tabla 5. La Tabla 5 muestra los rendimientos teoricos maximos de 1,4-butanodiol (BDO) para cinco conjuntos de condiciones ambientales: 1) respiracion aerobia, 2) fermentacion anaerobia con produccion simultanea de acetato, 3) fermentacion anaerobia con produccion simultanea de etanol, 4) respiracion de nitrato que conduce a la formacion de nitrito, y 5) respiracion de nitrato que conduce a la formacion de amoniaco. Los valores negativos indican captacion del metabolito; los valores positivos indican secrecion del metabolito. Se suponen unidades molares, junto con la neutralidad energetica de la ruta. El rendimiento teorico maximo sin suponer neutralidad energetica es de 1,091 mol/mol (0,545 g/g) de glucosa para todos los casos. El mayor rendimiento se obtiene en condiciones aerobias, cuando se puede generar suficiente ATP para mantener la ruta energeticamente neutra con perdida minima de carbono mediante la respiracion. En el caso anaerobio, el rendimiento disminuye a medida que el ATP se fabrica mediante fosforilacion del sustrato, y se produce como subproducto acetato o etanol. La adicion controlada de nitrato puede proporcionar practicamente el mismo rendimiento que el oxfgeno, dependiendo la cantidad exacta de si se produce una reduccion adicional del nitrito a amoniaco.

Tabla 5. Rendimientos teoricos maximos de 1,4-butanodiol (BDO) para cinco conjuntos de condiciones ambientales.

Si se supone que fosfoenolpiruvato (PEP) carboxiquinasa funciona en la direccion desde el fosfoenolpiruvato hasta el oxaloacetato, la produccion de BDO se convierte en un generador de energfa, y el rendimiento teorico maximo para todos los escenarios pasa a ser de 0,545 g/g con el CO2 como unico subproducto. Se sabe que PEP carboxiquinasa produce oxaloacetato a partir de PEP en bacterias de rumiantes tales como Mannheimia succiniciproducens (Hong et al., Nat. Biotechnol. 22:1275-1281 (2004)). Sin embargo, se cree que el papel de la PEP carboxiquinasa en la produccion de oxaloacetato en E. coli es minoritario en comparacion con PEP carboxilasa, posiblemente debido a la mayor Km del bicarbonato de la PEP carboxiquinasa (Kim et al., Appl. Environ. Microbiol.

70:1238-1241 (2004)). Sin embargo, la actividad de la PEP carboxiquinasa natural de E. coli desde PEP en direccion al oxaloacetato se ha demostrado recientemente en mutantes ppc de K-12 (Kwon et al., J. Microbiol. Biotechnol.

16:1448-1452 (2006)).

En mas detalle, los disenos identificados para aumentar la produccion de BDO en E. coli se describen a continuacion. Se supone un requisito de mantenimiento energetico no asociado con el crecimiento de 7,6 mmol/gDW/h junto con una tasa de captacion de glucosa maxima espedfica de 20 mmol/gDW/h. Se supone que BDO se exporta mediante difusion. Se identificaron estrategias de desactivacion suponiendo que 1) PEP carboxiquinasa es irreversible y solamente funciona para convertir oxaloacetato en PEP y 2) PEP carboxiquinasa es reversible. Para ambos casos, el codigo de OptKnock descrito en Burgard et al. (Biotechnol. Bioeng. 84:647-657 (2003)) se modifico para permitir una respiracion limitada, no limitada, o ninguna, de nitrato. Anadir la posibilidad de respiracion de nitrato sirve para aumentar el rendimiento teorico maximo de BDO cuando se supone que la PEP carboxiquinasa es irreversible y tambien, en algunos casos, permite la seleccion de estrategias de desactivacion que no se seleccionanan de otra manera en condiciones anaerobias debido al rendimiento energetico desfavorable. Espedficamente, se anadieron seis reacciones de captacion de nitrato a la red de E. coli con Ifmites inferiores de 0, -2, -5, -10, -20, o -1000 mmol/gDW/h (el valor negativo significa captacion del metabolito en el modelo estequiometrico). Las restricciones dobles de OptKnock se ajustaron de acuerdo con ello, y se anadio una restriccion adicional que permitia activar solamente una reaccion de captacion de nitrato cada vez. OptKnock selecciona la cantidad de respiracion de nitrato optima para cada estrategia de desactivacion identificada. Finalmente, todas las simulaciones suponen que la reaccion catalizada por adhE en E. coli (esto es, acetil-CoA+NADH^-etanol+NAD) se ha eliminado. Como el acetil-CoA es un compuesto intermedio necesario para la produccion de BDO, casi todos los disenos OptKnock incluinan esta delecion, de todos modos, para evitar que la produccion de etanol compita con la produccion de BDO. La inclusion de esta delecion se realizo a priori para disminuir el tiempo de CPU en el procedimiento informatico.

Las estrategias de desactivacion derivadas mediante OptKnock se proporcionan en las Tablas 6 y 7 suponiendo que PEP carboxiquinasa es irreversible y reversible, respectivamente. En la presente memoria descriptiva, las estrategias de desactivacion se relacionan mediante abreviaturas de reaccion en mayusculas por razones de simplicidad. Los correspondientes genes que se debenan desactivar para evitar que se produzca una reaccion concreta en E. coli se proporcionan en la Tabla 8 junto con la estequiometna de la reaccion. Los nombres de los metabolitos correspondientes a la Tabla 8 se relacionan en la Tabla 9.

Tabla 6. Estra teg ias de desactivac ion derivadas m ed ian te O ptK nock, supon iendo que PEP carboxiqu inasa es irreversib le .

Tabla 6 (cont.)

G)

ro

Tabla 7. Estrategias de desactivacidn derivadas mediante OptKnock, suponiendo que PEP carboxiquinasa es reversible.

Tabla 7 (Cont.)

Tabla 8. Genes correspondientes a desactivar para evitar que se produzca una reaccion concreta en E. coli.

Tabla 9. Nombres de los metabolites correspondientes a las abreviaturas utilizadas en la Tabla 8.

Se aplicaron numerosos criterios para seleccionar los conjuntos de genes mas practicos como dianas de eliminacion. En primer lugar, los disenos se limitaron a incluir solamente desactivaciones que no reducen significativamente (esto es, >5%) el rendimiento teorico maximo de BDO en condiciones anaerobias, en presencia o ausencia de nitrato como aceptor de electrones. Dichas desactivaciones creanan un techo artificial para cualquier esfuerzo futuro de ingeniena metabolica, y esto, por tanto, es indeseable. Con este fin, se resolvieron una serie de problemas de programacion lineal (PL) que maximizaron el rendimiento en BDO para la red metabolica natural de E. coli suponiendo que cada reaccion se eliminara individualmente de la red. Tal como se usa en el presente documento, la referencia a una red natural de E. coli supone que la ruta de BDO esta disponible. El termino "natural” se utiliza por tanto como un nombre sustituto de red de E. coli. Las reacciones cuya delecion afectan negativamente el rendimiento maximo de BDO suponiendo que la PEP carboxiquinasa es reversible o irreversible se muestran en las Tablas 10 y 11, respectivamente. La Tabla 10 muestra reacciones que, cuando se suprimen, reducen el rendimiento teorico maximo de BDO en condiciones anaerobias en presencia o ausencia de nitrato, suponiendo que la PEP carboxiquinasa no puede utilizarse para producir oxaloacetato. La cepa AB3 contiene deleciones en ADHE, LDH_D, y PFLi. ‘ Inf indica que los requisitos de energfa no asociada con el crecimiento no se pueden satisfacer.

^{T ab la 10.} Reacciones que, cuando se suprimen, reducen el rendimiento teorico maximo de BDO en condiciones anaerobias e suponiendo que la PEP carboxiquinasa no puede utilizarse para producir oxaloacetato.

Tab la 10 (cont.)

La Tabla 11 muestra reacciones que, cuando se suprimen, reducen el rendimiento teorico maximo de BDO en condiciones anaerobias en presencia o ausencia de nitrato, suponiendo que la PEP carboxiquinasa puede utilizarse para producir oxaloacetato. ‘ Inf indica que los requisitos de energfa no asociada con el crecimiento no se pueden satisfacer.

^{Tab la 11.} Reacciones que, cuando se suprimen, reducen el rendimiento teorico maximo de BDO en condiciones anaerobias suponiendo que la PEP carboxiquinasa puede utilizarse para producir oxaloacetato.

Tab la 11 (cont.)

El analisis anteriormente descrito condujo a tres observaciones cnticas. Una observacion fundamental fue que la acetato quinasa y la fosfotransacetilasa son necesarias para conseguir el maximo rendimiento de BDO en todas las condiciones mediante la regeneracion de la acetil-CoA a partir del acetato producido por la 4-hidroxibutirato:acetil-CoA transferasa. Este hallazgo sugiere que la eliminacion de la formacion de acetato debido a la delecion de ackA-pta puede que no sea una opcion viable. As^ es probable que una cepa de exito haya tenido que proporcionar un entorno intracelular donde la conversion de acetato en acetil-CoA sea beneficiosa y termodinamicamente factible. Por otra parte, debena encontrarse un conjunto de enzimas capaces de realizar las reducciones de BDO necesarias sin pasar por un derivado de CoA o bien, debera aceptarse una produccion simultanea de 1 mol of acetato por mol de BDO.

Una segunda observacion fundamental fue que los enzimas del ciclo TCA citrato sintasa (CS), aconitasa (ACONT), e isocitrato deshidrogenasa (ICDHy) son necesarias para conseguir el maximo rendimiento de BDO en todas las condiciones. Esto indica que el flujo del ciclo TCA inverso desde oxaloacetato a succinato a succinil-CoA debe completarse en alguna medida mediante CS, ACONT, e ICDHy para una produccion maxima.

Una tercera observacion fundamental fue que sustituir la PEP carboxilasa por PEP carboxiquinasa en E. coli puede afectar positivamente el programa de BDO. El rendimiento maximo de BDO en condiciones anaerobias en presencia y ausencia de nitrato es del 3% y 12% inferior, respectivamente, si la PEP carboxilasa realiza la conversion de PEP en oxaloacetato en comparacion con la conversion realizada por PEP carboxiquinasa. Adicionalmente, en condiciones anaerobias sin adicion de nitrato, la PEP carboxiquinasa puede disminuir el requisito de actividad de la piruvato deshidrogenasa para una produccion de BDO maxima. Espedficamente, el rendimiento maximo de BDO disminuye un 11% si esta enzima tfpicamente aerobia no tiene actividad si se considera la PEP carboxiquinasa como irreversible en comparacion con una reduccion del 3% si la PEP carboxiquinasa puede catalizar la produccion de oxaloacetato. Una alternativa a la actividad piruvato deshidrogenasa se puede utilizar mediante el acoplamiento no natural de formiato deshidrogenasa, que puede catalizar la reduccion del formiato a dioxido de carbono, a la actividad de piruvato formiato liasa.

Los dos criterios siguientes aplicados para evaluar los disenos OptKnock fueron el numero de desactivaciones necesarias y el rendimiento de BDO previsto a crecimiento maximo. El analisis de las estrategias de seleccion uno, dos y tres de la Tabla 6 (esto es, PEP carboxiquinasa supuesta como irreversible) revelo que tan pocas desactivaciones eran insuficientes para evitar elevados rendimientos de acetato. Las proporciones de acetato/BDO previstas para los disenos de delecion uno, dos o tres, fue al menos 1,5. Incluso permitiendo cuatro deleciones, se consiguen solamente dos disenos, n° 99 y n° 100, con rendimientos de BDO previstos superiores a 0,35 g/g, y estos disenos sugieren la supresion del gen de la glicolisis, pgi, que codifica la fosfoglucoisomerasa. Dada la importancia prevista de la glicolisis en la fermentacion de E. coli, se decidio continuar con estos disenos de alto riesgo solamente como ultimo recurso. Adicionalmente, las deleciones sugeridas disminuyeron el rendimiento teorico maximo de los disenos n° 99 y n° 100 en un 8% y un 15%, respectivamente. La estrategia de cuatro deleciones de alto rendimiento que no afecto negativamente el rendimiento teorico maximo fue el diseno n° 129, que tema un rendimiento de BDO previsto a crecimiento maximo de solamente 0,26 g/g.

Solamente un diseno de cinco deleciones de la Tabla 6 satisface todos los criterios para un diseno de exito. Esta estrategia de desactivacion implica la eliminacion de ADHEr (alcohol deshidrogenasa), PFLi (piruvato formiato liasa), LDH_D (lactato deshidrogenasa), MDH (malato deshidrogenasa), y ASPT (aspartato transaminasa). Las desactivaciones sugeridas no reducen el rendimiento teorico maximo de BDO bajo ninguna de las condiciones examinadas. Se predice que una cepa disenada con estas desactivaciones conseguina un rendimiento de BDO para el crecimiento maximo de 0,37 g/g suponiendo condiciones anaerobias e irreversibilidad de PEP carboxiquinasa. Este diseno tiene varias propiedades deseables. De forma mas notable, evita que la red produzca altos rendimientos de los productos de fermentacion natural, etanol, formiato, lactato, y succinato. La prevencion de la produccion de homosuccinato mediante la delecion de MDH, en oposicion a la eliminacion de la PEP carboxilasa, fumarasa, o fumarato reductasa, es especialmente intrigante porque bloquea la ruta de fermentacion productora de energfa de oxaloacetato a succinato que podna aparecer si se supone que PEP carboxiquinasa es reversible sin afectar negativamente el rendimiento maximo de BDO. En este diseno, el succinato semialdeddo se puede fabricar mediante succinil-CoA o alfa-cetoglutarato. El succinil-CoA se forma a partir del succinato mediante la succinil-CoA sintetasa. El succinato se puede formar a partir tanto de las reacciones del ciclo TCA inverso (PEP carboxilasa, PEP carboxiquinasa, fumarasa, fumarato reductasa) y la derivacion del glioxilato (malato sintasa, isocitrato liasa).

Los lfmites de la solucion de BDO comparado con la biomasa para las estrategias de desactivacion de ADHEr, PFLi, LDH_D, MDH, ASPT se muestran en las Figs. 7A y 7B, suponiendo la irreversibilidad o reversibilidad de la PEP carboxiquinasa, respectivamente. Se debe tener en cuenta que los lfmites de la solucion se obtienen usando un modelo a escala genomica del metabolismo de E. coli en oposicion al modelo reducido, porque dichos calculos requieren muchos recursos de CPU. Los lfmites de la solucion revelan que el acoplamiento del BDO con el crecimiento es solido con respecto a la asuncion de la reversibilidad de la PEP carboxiquinasa. Sin embargo, la delecion de la bomba de protones transhidrogenasa (THD2) o glutamato deshidrogenasa (GLUDy) puede ser necesaria para conseguir un acoplamiento obligatorio del crecimiento celular con la produccion de BDO. El unico aspecto negativo del diseno es que las deleciones de MDH y ASPT disminuyen el rendimiento maximo de ATP en la produccion de BDO ligeramente (~20%) si se supone la reversibilidad de la PEP carboxiquinasa. Esto hace que la solucion de crecimiento optimo de la estrategia de diseno este por debajo de la lmea negra de BDO vs. biomasa de la red natural de la figura 7B. Sin embargo, este hallazgo sugiere la posibilidad de genomanipular un equilibrio optimo de la actividad de MDH cuando hay suficiente cantidad presente para garantizar una produccion eficaz de BDO, pero al mismo tiempo lo suficientemente limitada para evitar que el succinato se convierta en el producto principal de la fermentacion. A destacar que se preve que el succinato sea el producto de fermentacion principal de la red natural y se supone la reversibilidad de la PEP carboxiquinasa.

Las Tablas 10 y 11 listan reacciones cuya delecion afecta negativamente el rendimiento maximo de BDO en una cepa intermedia, denominada como AB3, que carece de ADHEr, LDH_D, y PFLi, asf como una cepa que carece de ASPT y MDH ademas de las deleciones de AB3. A destacar que las deleciones sugeridas otorgan gran importancia a la obtencion de piruvato deshidrogenasa, citrato sintasa, y actividad de aconitasa en condiciones completamente anaerobias. Si se puede conseguir suficiente actividad piruvato deshidrogenasa, una alternativa es dejar PFLi intacto y complementar su actividad con una formiato deshidrogenasa no natural que captura un equivalente reductor mientras convierte el formiato en dioxido de carbono.

La Figura 8 y la Tabla 12 representan graficamente los intervalos de flujo que la red de E. coli puede conseguir cuando alcanza bien el rendimiento maximo de BDO (casos 1-4) o el rendimiento maximo de biomasa (caso 5) en condiciones anaerobias. Los casos 1 y 2 suponen que no se han producido deleciones de genes. El caso 2 muestra intervalos de flujo mas restringidos que el caso 1 porque se ha impuesto una restriccion adicional que refuerza el rendimiento maximo de BDO. Los casos 3 y 4 son analogos a los casos 1 y 2, salvo que los flujos codifican las reacciones de ADHEr, ASPT, LDH_D, MDH, y PFLi se han ajustado a cero. En el caso 5 se muestran los intervalos de flujo, suponiendo una maximizacion del rendimiento de biomasa en presencia de desactivaciones de ADHE, ASPT, LDH_D, MDH, y PFLi.

La Tabla 12 muestra los intervalos de flujos metabolicos centrales que se pueden conseguir en condiciones anaerobias suponiendo que la PEP carboxiquinasa es reversible. Los valores de flujo en negrita se configuran como restricciones del sistema. Se consideran cinco casos: Caso 1, rendimiento maximo de BDO de la red natural; Caso 2, rendimiento maximo de ATP suponiendo rendimiento maximo de BDO de la red natural; Caso 3, rendimiento maximo de BDO de la red con flujos a traves de ADHEr, ASPT, LDH_D, MDH, y PFLi ajustados a cero; Caso 4, rendimiento maximo de ATP suponiendo el rendimiento maximo de BDO de la red con flujos a traves de ADHEr, ASPT, LDH_D, MDH, y PFLi ajustados a cero; y Caso 5, rendimiento maximo de biomasa de la red con flujos a traves de ADHEr, AS^pT, LDH_D, MDH, y PFLi ajustados a cero.

Tabla 12. Intervalos de flujos metabolicos centrales que se pueden conseguir en condiciones anaerobias suponiendo que la PEP carboxiquinasa es reversible. Las reacciones que se suponen inactivas en los casos 3, 4, y 5 se indican en negrita.

Los dos primeros disenos de cuatro deleciones (n° 92 y n° 93) relacionados en la Tabla 7 (esto es, PEP carboxiquinasa supuesta reversible) se consideran mas adelante debido a sus rendimientos de BDO previstos relativamente elevados. El diseno n° 92 (ADHEr, HEX1, PFLi, y PGI) necesitana desactivaciones adicionales que eliminaran la produccion de succinato y lactato y el rendimiento maximo de BDO del diseno n° 93 (ADHEr, e Da , NADH6, PGI) solamente fue el 90% del maximo teorico de la red natural. Ambos disenos requieren la eliminacion de PGI que, como se ha mencionado anteriormente, se descarto por indeseable debido a la importancia prevista de la glucolisis sobre la fermentacion. El diseno n° 98 (ADHEr, ATPS4r, FDH2, NADH6) fue el primer diseno de cuatro deleciones que requiere la eliminacion de la ATP sintasa sin requerir adicionalmente la desactivacion de PGI. Sin embargo, este diseno tambien requerina la delecion de genes para evitar la produccion de lactato y succinato para aumentar el rendimiento de BDO previsto a crecimiento maximo. Tras analisis posterior, se descubrio que casi todos los disenos prometedores de la Tabla 7 se podfan mejorar garantizando que las deleciones (es decir, ADHEr, LDH_D, MDH, ASPT, y PFLi) tambien se habfan implementado, si no se habfa especificado ya.

Los siguientes esfuerzos se centraron a continuacion en identificar las deleciones de reacciones que pudieran suministrar el conjunto fundamental (esto es, ADHEr, LDH_D, MDH, ASPT, PFLi). La Tabla 13 muestra genes de E. coli conocidos responsables de catalizar las reacciones diana para su eliminacion. La designacion "[c]” se refiere a citosolico. Los genes que codifican estas reacciones, junto las reacciones del conjunto fundamental, se proporcionan en la Tabla 13. El efecto de las deleciones adicionales sobre los lfmites de la solucion de BDO versus biomasa se muestra en la figura 9. De forma notable, el acoplamiento entre el BDO y la produccion de biomasa se vuelve cada vez mas pronunciado a medida que se acumulan deleciones adicionales. El rendimiento de BDO previsto a crecimiento maximo tras acumular todas las deleciones es de 0,46 g/g. Finalmente, ninguna de las deleciones afecto negativamente el rendimiento teorico maximo de BDO.

Tabla 13. Genes de E. coli conocidos responsables de catalizar las reacciones diana para su eliminacion.

En los resultados mostrados en la Tabla 13, OptKnock identifica reacciones a eliminar de un organismo para potenciar la produccion bioqmmica. Cualquier combinacion (esto es, al menos una y como maximo todas) de las deleciones de genes relacionadas podna tener, teoricamente, el efecto deseado de garantizar que la correspondiente reaccion no es funcional en E. coli. La estrategia experimental mas practica para eliminar las reacciones marcadas para su eliminacion se debe determinar caso por caso.

EJEMPLO VI

Generacion de cepas genomanipuladas

Para validar las predicciones informaticas del Ejemplo V, las cepas se construyeron, se hicieron evolucionar, y se sometieron a ensayo. Escherichia coli K-12 MG1655 sirve como la cepa natural en la que se introducen las deleciones. Las cepas se construyeron mediante la incorporacion de deleciones en marco usando recombinacion homologa usando el sistema X-Red recombinasa de (Datsenko y Wanner, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:6640-6645 (2000)). El enfoque implica la sustitucion de una secuencia cromosomica (esto es, el gen marcado para eliminacion) por un gen de resistencia a antibioticos seleccionable, que posteriormente se elimina a su vez. Las desactivaciones se integran una por una en la cepa receptora. Despues de cada delecion no permanece ningun marcador de resistencia a farmacos ni cicatrices, lo que permite la acumulacion de multiples mutaciones en cada cepa diana. La tecnologfa de delecion elimina completamente el gen marcado para eliminacion de tal forma que se reduce sustancialmente la posibilidad de que los mutantes construidos reviertan al tipo natural. Durante las etapas iniciales del desarrollo de la cepa, los genes no nativos que permiten la produccion de BDO se expresan en un operon sintetico tras un promotor inducible en un plasmido con un numero de copias medio o alto; por ejemplo, el promotor PBAD que se induce por arabinosa, en un plasmido de la serie pBAD (Guzman et al., J. Bacteriol. 177:4121-4130 (1995)). Se sabe que este promotor es muy facil de titular, permitiendo afinar la expresion en un intervalo de 1000 veces el intervalo de concentraciones de arabinosa. Si la produccion de BDO tiene exito, estos genes posteriormente se integran en el cromosoma para promover la estabilidad.

Las cepas genomanipuladas se caracterizan por la medicion de la tasa de crecimiento, tasa de captacion de sustrato, y tasa de secrecion de productos/subproductos. Se anticipo inicialmente que estas cepas mostranan tasas de crecimiento suboptimas hasta que sus redes metabolicas se hubieran ajustado a sus funcionalidades ausentes. Para permitir este ajuste, las cepas evolucionan de forma adaptativa. Al someter las cepas a evolucion adaptativa, la tasa de crecimiento celular se convierte en la presion de seleccion principal y las celulas mutantes se ven impulsadas a recolocar sus flujos metabolicos para aumentar sus tasas de crecimiento. Se ha demostrado recientemente esta reprogramacion del metabolismo para varios mutantes de E. coli que habfan evolucionado de forma adaptativa sobre distintos sustratos para alcanzar tasas de crecimiento previstas a priori mediante un modelo in silico (Fong y Palsson, Nat. Genet. 36:1056-1058 (2004)). Si las predicciones de OptKnock tuvieran exito, las mejoras en el crecimiento conseguidas por la evolucion adaptiva van acompanadas de las tasas de produccion de BDO mejoradas. La evolucion adaptativa se realiza por triplicado (realizado en paralelo) debido a las diferencias en los patrones evolutivos usados como testigos previamente en E. coli (Fong y Palsson, mas arriba, 2004; Fong et al., J. Bacteriol. 185:6400-6408 (2003); Ibarra et al., Nature 420:186-189 (2002)) que potencialmente podnan dar como resultado una cepa con cualidades de produccion superiores a las demas. Las evoluciones iw actuan durante un periodo de 2-6 semanas, dependiendo de la mejora en la tasa de crecimiento obtenida. En general, las evoluciones q43 se detienen una vez que se obtiene un fenotipo de crecimiento estable.

Tras el proceso de evolucion adaptativa, las cepas nuevas se vuelven a caracterizar por la medicion de la tasa de crecimiento, tasa de captacion de sustrato, y tasa de secrecion de productos/subproductos. Estos resultados se comparan con las predicciones de OptKnock representando graficamente los rendimientos de crecimiento y produccion reales a lo largo de la produccion anteriormente descrita. Las combinaciones de diseno OptKnock/evolucion de mas exito se seleccionan para investigacion adicional, y se caracterizan en fermentaciones de laboratorio tanto continuas como discontinuas. El concepto de produccion bioqmmica acoplada al crecimiento que esta detras del enfoque OptKnock tambien da como resultado la generacion de productores en exceso geneticamente estables. Por tanto, los cultivos se mantienen en modo continuo durante un mes para evaluar su estabilidad a largo plazo. Se toman muestras periodicamente para garantizar que el rendimiento y la productividad se mantienen durante la totalidad del proceso.

EJEMPLO VII

Cepas OptKnock para la produccion del BDO

Como se describe en los Ejemplos V y VI, la aplicacion de la metodologfa OptKnock se ha aplicado a la generacion de dianas de delecion prometedoras que generan cepas productoras de BDO. OptKnock identifica reacciones a eliminar de un organismo para acoplar los rendimientos de produccion bioqmmica y de biomasa. El diseno proporciona una lista de las reacciones metabolicas que se deben considerar para su eliminacion mediante OptKnock. Tambien se proporcionaron los genes de E. coli conocidos que codifican los enzimas que catalizan cada reaccion para describir que modificaciones geneticas se deben implementar para conseguir los fenotipos de produccion acoplada al crecimiento previstos. Evidentemente, si nuevos descubrimientos revelan que otros genes del genoma de E. coli pueden transmitir una o mas de las funcionalidades de reaccion consideradas para eliminacion en un diseno dado, entonces, estos genes debenan eliminarse junto con los descritos en el presente documento. A destacar que evitar la actividad de solamente un subconjunto (esto es, al menos una y como maximo todas) de las reacciones en cada uno de los disenos puede ser a veces suficiente para transmitir un fenotipo de produccion acoplada al crecimiento. Por ejemplo, si un diseno requiere la eliminacion de una reaccion particular cuya actividad in vivo no es suficiente para desacoplar el crecimiento de la produccion de BDO, entonces, los genes que codifican los enzimas que catalizan esta reaccion pueden dejarse intactos. Ademas, cualquier combinacion (esto es, al menos una y como maximo todas) de las deleciones de genes relacionadas para una reaccion dada podna tener, teoricamente, el efecto deseado de garantizar que la reaccion no es funcional en E. coli.

En la Tabla 6 y 7 se relacionan multiples estrategias de delecion para potenciar el acoplamiento entre la produccion de 1,4-butanodiol y el crecimiento de E. coli suponiendo que PEP carboxiquinasa es irreversible y reversible, respectivamente. Un diseno (esto es, ADHEr, ASPT, MDH, LDH_D, PFLi) surgio como el mas prometedor que satisfada multiples criterios. Las deleciones sugeridas 1) condujeron a un elevado rendimiento de BDO previsto a crecimiento maximo, 2) requirio un numero de desactivaciones razonable, 3) no tuvo un efecto perjudicial sobre el rendimiento teorico maximo de BDO, 4) consiguio un acoplamiento fuerte entre la produccion de BDO y el crecimiento celular, y 5) era solido con respecto a la reversibilidad o irreversibilidad de la PEP carboxiquinasa. La siguiente lista especifica el conjunto mmimo de deleciones genicas necesarias previstas para convertir BDO en el principal producto de fermentacion de E. coli:

adhE (b1421), ldhA (b1380).

pflAB (b0902, b0903) no esta incluido en el conjunto mmimo porque su delecion fuerza una dependencia de la piruvato deshidrogenasa para proporcionar cantidad suficiente de acetil-CoA para el crecimiento celular y un equivalente de reduccion para el piruvato. Como la actividad de la piruvato deshidrogenasa es baja en condiciones anaerobias y esta inhibida por concentraciones elevadas de NADH, una alternativa plausible a la delecion pflAB es anadir una formiato deshidrogenasa no natural a E. coli que recoja el pode reductor que se pierde por otra parte mediante la secrecion del formiato. Sin embargo, la adicion de pflAB al conjunto de delecion mmimo proporciona: adhE (b1421), ldhA (b1380), pflAB (b0902, b0903).

mdh (b3236) no esta incluido en el conjunto mmimo porque hay multiples deleciones que pueden evitar que el succinato se convierta en el producto de fermentacion principal de E. coli en oposicion a BDO. Los ejemplos incluyen los genes que codifican la fumarasa y/o fumarato reductasa. Sin embargo, la eliminacion de la malato deshidrogenasa parece ser la eleccion mas logica para atenuar la produccion de succinato ya que deja intacta una ruta para la conversion del producto derivado de glioxolato, malato, en BDO. La adicion de la malato deshidrogenasa al conjunto mmimo proporciona:

adhE (b1421), ldhA (b1380), pflAB (b0902, b0903), mdh (b3236).

El gen, mqo, que codifica una malato:quinona-oxidorreductasa, se cree que cataliza la oxidacion de malato a oxalactato (van der Rest et al., J. Bacteriol. 182:6892-6899 (2000)). Sin embargo, si se demuestra que tambien cataliza la formacion de malato a partir de oxaloacetato, su eliminacion sera necesaria para garantizar que no evita la delecion de mdh. Esto conduce al conjunto de delecion:

adhE (b1421), ldhA (b1380), pflAB (b0902, b0903), mdh (b3236), mqo (b2210).

aspA queda fuera del conjunto mmimo porque existe la duda de si la aspartato desaminasa puede transportar flujo suficiente para evitar la delecion de la malato deshidrogenasa. Sin embargo, aunque este escenario es ciertamente posible, entonces la lista minima de deleciones necesarias se convierte en:

adhE (b1421), IdhA (b1380), pflAB (b0902, b0903), mdh (b3236), aspA (b4139).

Para los calculos anteriores, se supone que los enzimas malicas dependientes de NADH y NADPH de E. coli operan de forma irreversible, catalizando solamente la conversion del malato en dioxido de carbono y piruvato. Si estas enzimas pueden catalizar tambien la formacion de malato a partir de piruvato y dioxido de carbono, los genes que codifican una o ambas enzimas malicas deberan eliminarse para evitar que el succinato se convierta en el producto de fermentacion principal. Esto conduce al siguiente conjunto de deleciones:

adhE (b1421), mdh (b3236), IdhA (b1380), pflAB (b0902, b0903), sfcA (b1479)

adhE (b1421), mdh (b3236), IdhA (b1380), pflAB (b0902, b0903), maeB (b2463)

adhE (b1421), mdh (b3236), IdhA (b1380), pflAB (b0902, b0903), sfcA (b1479), maeB (b2463)

El conjunto mmimo de deleciones se puede complementar con deleciones adicionales destinadas a refinar el acoplamiento de la produccion de BDO con el crecimiento celular. Estos conjuntos de deleciones se relacionan a continuacion.

adhE (b1421), ldhA (b1380), pflAB (b0902, b0903), mdh (b3236), pntAB (b1602, b1603)

adhE (b1421), ldhA (b1380), pflAB (b0902, b0903), mdh (b3236), gdhA (b1761)

adhE (b1421), ldhA (b1380), pflAB (b0902, b0903), mdh (b3236), pykA (b1854), pykF (b1676), dhaKLM (b1198, b1199, b1200), deoC (b4381), edd (b1851), yiaE (b3553), ycdW (b1033)

adhE (b1421), ldhA (b1380), pflAB (b0902, b0903), mdh (b3236), pykA (b1854), pykF (b1676), dhaKLM (b1198, b1199, b1200), deoC (b4381), edd (b1851), yiaE (b3553), ycdW (b1033), prpC (b0333), gsk (b0477)

Las cepas que tienen las deleciones indicadas en este Ejemplo se pueden complementar con deleciones adicionales si se descubre que las deleciones sugeridas no reducen la actividad de sus correspondientes reacciones en la medida que exige alcanzar la produccion de BDO acoplada al crecimiento o si los genes de E. coli naturales, mediante evolucion adaptativa o mutagenesis, consiguen mutaciones que transmitan actividades capaces de evitar las estrategias de diseno propuestas.

Puntos divulgados:

1. Un microorganismo no natural que comprende una o mas perturbaciones genicas, produciendose dicha una o mas perturbaciones genicas en genes que codifican para una enzima obligatoria para acoplar la produccion de 1,4-butanodiol al crecimiento de dicho microorganismo cuando dicha perturbacion genica reduce una actividad de dicha enzima, mediante lo cual dicha una o mas perturbaciones genicas confieren produccion de 1,4-butanodiol acoplada al crecimiento estable a dicho microorganismo no natural.

2. El microorganismo no natural del punto 1, en el que dicha una o mas perturbaciones genicas comprenden una modificacion metabolica enumerada en la tabla 6 o 7.

3. El microorganismo no natural del punto 1, en el que dicha una o mas perturbaciones genicas comprenden una delecion de dicho uno o mas genes.

4. El microorganismo no natural del punto 1, en el que dicho microorganismo no natural se selecciona del grupo de microorganismos que tienen una modificacion metabolica enumerada en la tabla 6 o 7.

5. El microorganismo no natural del punto 1, en el que dicho microorganismo comprende una bacteria, levadura u hongo.

6. El microorganismo no natural del punto 5, en el que dicha bacteria comprende una especie seleccionada de Escherichia coli, Klebsiella oxytoca, Anaerobiospirillum succiniciproducens, Actinobacillus succinogenes, Mannheimia succiniciproducens, Rhizobium etli, Bacillus subtilis, Corynebacterium glutamicum, Gluconobacter oxydans, Zymomonas mobilis, Lactococcus lactis, Lactobacillus plantarum, Streptomyces coelicolor, Clostridium acetobutylicum, Pseudomonas fluorescens y Pseudomonas putida.

7. El microorganismo no natural del punto 5, en el que dicha levadura comprende una especie seleccionada de Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces marxianus, Aspergillus terreus, Aspergillus niger y Pichia pastoris.

8. Un microorganismo no natural que comprende un conjunto de modificaciones metabolicas obligatorias para acoplar la produccion de 1,4-butanodiol al crecimiento de dicho microorganismo, comprendiendo dicho conjunto de modificaciones metabolicas perturbacion de uno o mas genes, o un ortologo de los mismos, en el que dicho conjunto de modificaciones metabolicas comprende perturbacion de adhE y ldhA, en el que dicho microorganismo presenta produccion de 1,4-butanodiol acoplada al crecimiento estable.

9. El microorganismo no natural del punto 8, en el que dicho conjunto de modificaciones metabolicas comprende ademas perturbacion de mdh.

10. El microorganismo no natural del punto 9, en el que dicho conjunto de modificaciones metabolicas comprende ademas perturbacion de uno o mas genes seleccionados del conjunto de genes que comprende mqo, aspA, sfcA, maeB, pntAB y gdhA.

11. El microorganismo no natural del punto 10, en el que dicho conjunto de modificaciones metabolicas comprende perturbacion de sfcA y maeB.

12. El microorganismo no natural del punto 9, en el que dicho conjunto de modificaciones metabolicas comprende ademas perturbacion de uno o mas genes seleccionados del conjunto de genes que comprende pykA, pykF, dhaKLM, deoC, edd, yiaE, ycdW, prpC y gsk.

13. El microorganismo no natural del punto 12, en el que dicho conjunto de modificaciones metabolicas comprende perturbacion de pykA, pykF, dhaKLM, deoC, edd, yiaE y ycdW.

14. El microorganismo no natural del punto 13, en el que dicho conjunto de modificaciones metabolicas comprende ademas perturbacion de prpC y gsk.

15. El microorganismo no natural de cualquiera de los puntos 9-14, en el que dicho conjunto de modificaciones metabolicas comprende ademas perturbacion de pflAB.

16. El microorganismo no natural del punto 8, en el que dicho conjunto de modificaciones metabolicas comprende perturbacion de uno o mas genes seleccionados del conjunto de genes que comprende adhE, ldhA, pflAB, mdh y aspA.

17. El metodo del punto 8, en el que dicho conjunto de modificaciones metabolicas comprende perturbacion de los genes adhE, ldhA, pflAB, mdh y aspA.

18. El microorganismo no natural del punto 8, en el que dicho microorganismo comprende ademas una ruta biosintetica de 1,4-butanodiol (BDO), comprendiendo dicha ruta al menos un acido nucleico exogeno que codifica para 4-hidroxibutanoato deshidrogenasa, semialdehndo succmico deshidrogenasa independiente de CoA, succinil-CoA sintetasa, semialdehndo succmico deshidrogenasa dependiente de CoA, 4-hidroxibutirato:CoA transferasa, glutamato:semialdehndo succmico transaminasa, glutamato descarboxilasa, aldehndo deshidrogenasa independiente de CoA, aldehndo deshidrogenasa dependiente de CoA o alcohol deshidrogenasa, en el que dicho acido nucleico exogeno se expresa en cantidades suficientes para producir 1,4-butanodiol (BDO).

19. El microorganismo no natural del punto 8, en el que dicha perturbacion de uno o mas genes comprende una delecion.

20. El microorganismo no natural del punto 8, en el que dicho microorganismo comprende una bacteria, levadura u hongo.

21. El microorganismo no natural del punto 20, en el que dicha bacteria comprende una especie seleccionada de E. coli, K. oxytoca, A. succiniciproducens, A. succinogenes, M. succiniciproducens, R. etli, B. subtilis, C. glutamicum, G. oxydans, Z. mobilis, L. lactis, L. plantarum, S. coelicolor, C. acetobutylicum, P. fluorescens y P. putida.

22. El microorganismo no natural del punto 20, en el que dicha levadura comprende una especie seleccionada de S. cerevisiae, S. pombe, K. lactis, K. marxianus, A. terreus, A. niger y P. pastoris.

23. Un metodo de produccion de un microorganismo no natural que tiene produccion de 1,4-butanodiol acoplada al crecimiento estable, que comprende:

(a) identificar in silico un conjunto de modificaciones metabolicas que requieren produccion de 1,4-butanodiol durante el crecimiento exponencial, y

(b) modificar por ingeniena genetica un microorganismo para que contenga dicho conjunto de modificaciones metabolicas que requieren produccion de 1,4-butanodiol.

24. El metodo del punto 23, en el que dicho conjunto de modificaciones metabolicas se identifican mediante un metodo in silico seleccionado de OptKnock o SimPheny.

25. El metodo del punto 23, en el que dicho conjunto de modificaciones metabolicas comprende perturbacion funcional de una o mas reacciones metabolicas.

26. El metodo del punto 25, en el que dichas modificaciones metabolicas se perturban mediante delecion genica. 27. El metodo del punto 25, en el que dicho microorganismo no natural comprende un microorganismo que tiene una modificacion metabolica seleccionada del conjunto de modificaciones metabolicas enumeradas en la tabla 6 o 7.

28. El metodo del punto 23, que comprende ademas cultivar dicho microorganismo modificado por ingeniena genetica.

29. El metodo del punto 28, que comprende ademas evolucionar de manera adaptativa dicho microorganismo modificado por ingeniena genetica o en condiciones que requieren produccion de 1,4-butanodiol.

30. El metodo del punto 23, en el que dicho microorganismo no natural comprende una bacteria, levadura u hongo.

31. El metodo del punto 30, en el que dicha bacteria comprende una especie seleccionada de E. coli, K. oxytoca, A. succiniciproducens, A. succinogenes, M. succiniciproducens, R. etli, B. subtilis, C. glutamicum, G. oxydans, Z. mobilis, L. lactis, L. plantarum, S. coelicolor, C. acetobutylicum, P. fluorescens y P. putida.

32. El microorganismo no natural del punto 30, en el que dicha levadura comprende una especie seleccionada de S. cerevisiae, S. pombe, K. lactis, K. marxianus, A. terreus, A. niger y P. pastoris.

33. Un microorganismo producido mediante el metodo del punto 23 o 29.

34. Un metodo de produccion de 1,4-butanodiol acoplado al crecimiento de un microorganismo, que comprende:

(a) cultivar en fase de crecimiento exponencial en una cantidad suficiente de nutrientes y medios un microorganismo no natural que comprende un conjunto de modificaciones metabolicas obligatorias para el acoplamiento de la produccion de 1,4-butanodiol al crecimiento de dicho microorganismo, comprendiendo dicho conjunto de modificaciones metabolicas perturbacion de uno o mas genes, o un ortologo de los mismos, en el que dicho conjunto de modificaciones metabolicas comprende perturbacion de adhE y ldhA, en el que dicho microorganismo presenta produccion de 1,4-butanodiol acoplada al crecimiento estable; y

(b) aislar 1,4-butanodiol producido a partir de dicho microorganismo no natural.

35. El metodo del punto 34, en el que dicho conjunto de modificaciones metabolicas comprende ademas perturbacion de mdh.

36. El metodo del punto 35, en el que dicho conjunto de modificaciones metabolicas comprende ademas perturbacion de uno o mas genes seleccionados del conjunto de genes que comprende mqo, aspA, sfcA, maeB, pntAB y gdhA.

37. El metodo del punto 36, en el que dicho conjunto de modificaciones metabolicas comprende perturbacion de sfcA y maeB.

38. El metodo del punto 35, en el que dicho conjunto de modificaciones metabolicas comprende ademas perturbacion de uno o mas genes seleccionados del conjunto de genes que comprende pykA, pykF, dhaKLM, deoC, edd, yiaE, ycdW, prpC y gsk.

39. El metodo del punto 38, en el que dicho conjunto de modificaciones metabolicas comprende perturbacion de pykA, pykF, dhaKLM, deoC, edd, yiaE y ycdW.

40. El metodo del punto 39, en el que dicho conjunto de modificaciones metabolicas comprende ademas perturbacion de prpC y gsk.

41. El metodo de cualquiera de los puntos 34-40, en el que dicho conjunto de modificaciones metabolicas comprende ademas perturbacion de pflAB.

42. El metodo del punto 34, en el que dicho conjunto de modificaciones metabolicas comprende perturbacion de uno o mas genes seleccionados del conjunto de genes que comprende adhE, ldhA, pflAB, mdh y aspA.

43. El metodo del punto 34, en el que dicho conjunto de modificaciones metabolicas comprende perturbacion de los genes adhE, IdhA, pflAB, mdh y aspA.

44. El metodo del punto 34, en el que dicho microorganismo no natural comprende ademas una ruta biosintetica de 1,4-butanodiol (BDO), comprendiendo dicha ruta al menos un acido nucleico exogeno que codifica para 4-hidroxibutanoato deshidrogenasa, semialdehndo succmico deshidrogenasa independiente de CoA, succinil-CoA sintetasa, semialdehndo succmico deshidrogenasa dependiente de CoA, 4-hidroxibutirato:CoA transferasa, glutamatê semialdelmdo succmico transaminasa, glutamato descarboxilasa, aldehfdo deshidrogenasa independiente de CoA, aldehfdo deshidrogenasa dependiente de CoA o alcohol deshidrogenasa, en el que dicho acido nucleico exogeno se expresa en cantidades suficientes para producir 1,4-butanodiol (BDO).

Claims

REIVINDICACIONES

1. Metodo para fabricar un producto posterior de 4-hidroxibutirato o 1,4-butanodiol, que comprende:

(a) cultivar en fase de crecimiento exponencial en una cantidad suficiente de nutrientes y medios un microorganismo no natural que comprende perturbacion de los genes adhE, IdhA, pflAB y mdh, en el que dicho microorganismo expresa al menos un acido nucleico exogeno que codifica para una enzima en una ruta biosintetica de 4-hidroxibutirato o 1,4-butanodiol en cantidades suficientes para producir 4-hidroxibutirato o 1,4-butanodiol, codificando dicho al menos un acido nucleico exogeno para 4-hidroxibutanoato deshidrogenasa, semialdetudo succmico deshidrogenasa independiente de CoA, succinil-CoA sintetasa, semialdetudo succmico deshidrogenasa dependiente de CoA, 4-hidroxibutirato:CoA transferasa, glutamato:semialdetndo succmico transaminasa, glutamato descarboxilasa, aldetudo deshidrogenasa independiente de CoA, aldetudo deshidrogenasa dependiente de CoA o alcohol deshidrogenasa, y en el que dicho microorganismo produce 4-hidroxibutirato o 1,4-butanodiol;

(b) aislar opcionalmente 4-hidroxibutirato o 1,4-butanodiol; y

(c) convertir qmmicamente 4-hidroxibutirato o 1,4-butanodiol en el producto posterior.

2. Metodo segun la reivindicacion 1, en el que el microorganismo presenta produccion de 1,4-butanodiol acoplada al crecimiento estable.

3. Metodo segun la reivindicacion 1 o 2, en el que el producto posterior es gamma-butirolactona.

4. Metodo segun la reivindicacion 3, que comprende ademas la etapa de aislar gamma-butirolactona.

5. Metodo segun la reivindicacion 3 o 4, en el que la gamma-butirolactona se convierte qmmicamente a partir de 4-hidroxibutirato.

6. Metodo segun la reivindicacion 3 o 4, en el que la gamma-butirolactona se convierte qmmicamente a partir de 1,4-butanodiol.

7. Metodo segun la reivindicacion 1 o 2, en el que el producto posterior es tetrahidrofurano.

8. Metodo segun la reivindicacion 1 o 2, en el que el producto posterior es pirrolidona.

9. Metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en el que el 1,4-butanodiol, 4-hidroxibutirato o gamma-butirolactona se afsla a partir de un cultivo de fermentacion.

10. Metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en el que el 1,4-butanodiol o gammabutirolactona se purifica mediante destilacion.