ES2791364T3

ES2791364T3 - Secreción de polipéptidos que contienen hemo

Info

Publication number: ES2791364T3
Application number: ES14844701T
Authority: ES
Inventors: Rachel Fraser; Simon Christopher Davis; Patrick O'rielly Brown
Original assignee: Impossible Foods Inc
Current assignee: Impossible Foods Inc
Priority date: 2013-09-11
Filing date: 2014-09-11
Publication date: 2020-11-04
Anticipated expiration: 2034-09-11
Also published as: WO2015038796A2; EP3044320A2; WO2015038796A3; SI3044320T1; US20210070842A1; EP3044320B1; PT3044320T; CN105745332A; EP3722431A1; LT3044320T; CY1122898T1; RS60259B1; EP3044320A4; DK3044320T3; US20170342132A1; PL3044320T3; US20230365657A1; US20170342131A1; HUE049764T2; HRP20200447T1

Abstract

Método de producción de un polipéptido que contiene hemo seleccionado del grupo que consiste en una leghemoglobina, una eritrocruorina, una hemoglobina no simbiótica, una flavohemoglobina, una protoglobina, una cianoglobina, una globina I de Hell's gate, una hemoglobina bacteriana, una mioglobina de ciliado, una protoglobina, globina truncada 2/2, HbN, HbO y Glb3, comprendiendo dicho método hacer crecer una planta recombinante, comprendiendo dicha planta recombinante al menos un ácido nucleico exógeno que codifica para dicho polipéptido que contiene hemo, en el que dicha planta es de una especie distinta de Nicotiana, y purificar dicho polipéptido que contiene hemo de un tejido de dicha planta.

Description

DESCRIPCIÓN

Secreción de polipéptidos que contienen hemo

Campo técnico

Esta invención se refiere a métodos y material para producir polipéptidos que contienen hemo, y más particularmente, para producir polipéptidos que contienen hemo en células bacterianas recombinantes tales como células de Bacillus o en plantas recombinantes o células de planta.

Antecedentes

Existe la continua necesidad de métodos para producir proteínas a gran escala con fines industriales y alimentarios. Las especies de Bacillus pueden usarse en la producción de enzimas industriales tales como lipasas y proteasas. Además, pueden producirse varios aditivos alimentarios tales como glucoamilasa, lipasas y amilasas en estos huéspedes, lo que proporciona un largo historial de uso seguro en la industria alimentaria. La especie Bacillus puede secretar altos niveles de proteína en los medios que rodean a las bacterias. También pueden usarse especies de plantas, tales como Nicotiana tabacum o Glycine max, para la producción de proteínas.

Los polipéptidos que contienen hemo pueden ser difíciles de secretar, ya que el cofactor debe insertarse en el polipéptido y permanecer asociado con el polipéptido durante todo el proceso de secreción en su configuración original. La especie Bacillus puede usar dos sistemas diferentes para secretar proteínas (SEC y TAT). La ruta SEC despliega la proteína a medida que pasa a través de la membrana celular. El sistema TAT puede secretar las proteínas en el estado plegado. Sin embargo, no está claro si una hemoproteína recombinante que contiene un grupo hemo unido de manera no covalente puede expresarse, secretarse y plegarse de manera apropiada por el sistema de Bacillus, hasta que se realice con éxito.

El documento WO98/12913 A1 da a conocer la modificación por ingeniería genética de plantas para una utilización y asimilación potenciada de oxígeno, en particular plantas transgénicas modificadas por ingeniería genética para expresar proteínas de globina tales como hemoglobina, mioglobina y hemoproteínas.

Sumario

La presente invención se refiere a los elementos tal como se formulan en las reivindicaciones 1-12.

Este documento da a conocer una célula de bacteria recombinante (por ejemplo, una célula de Bacillus tal como una célula de Bacillus subtilis, Bacillus megaterium o Bacillus licheniformis) que puede secretar un polipéptido que contiene hemo. La célula incluye al menos un ácido nucleico exógeno, comprendiendo el ácido nucleico exógeno unas secuencias de ácido nucleico primera y segunda, en el que la primera secuencia de ácido nucleico codifica para un péptido señal y la segunda secuencia de ácido nucleico codifica para un polipéptido que contiene hemo, en el que la primera y la segunda secuencias de ácido nucleico se ligan operativamente para producir un polipéptido de fusión que comprende el péptido señal y el polipéptido que contiene hemo. El ácido nucleico exógeno también puede incluir una tercera secuencia de ácido nucleico que codifica para una etiqueta tal como una etiqueta de afinidad. La célula puede secretar el polipéptido que contiene hemo de la célula, y tras la secreción, el péptido señal se retira del polipéptido que contiene hemo. El péptido señal puede comprender o consistir en una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 60% de identidad con respecto a un péptido señal expuesto en la SEQ ID NO: 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91 ó 93. Por ejemplo, el péptido señal puede comprender o consistir en una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 60% de identidad de secuencia de aminoácidos con respecto a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 55 o a los residuos 1-52 de la SEQ ID NO: 55

Este documento también presenta un método para producir un polipéptido que contiene hemo. El método incluye cultivar una célula de bacteria recombinante (por ejemplo, una célula de Bacillus tal como una célula de Bacillus subtilis, Bacillus megaterium o Bacillus licheniformis) en un medio de cultivo en condiciones que permitan al polipéptido que contiene hemo que se secrete en el medio de cultivo, comprendiendo la célula de bacteria recombinante al menos un ácido nucleico exógeno, comprendiendo el ácido nucleico exógeno unas secuencias de ácido nucleico primera y segunda, en el que la primera secuencia de ácido nucleico codifica para un péptido señal y la segunda secuencia de ácido nucleico codifica para un polipéptido que contiene hemo, en el que las secuencias de ácido nucleico primera y segunda se ligan operativamente para producir un polipéptido de fusión que comprende el péptido señal y el polipéptido que contiene hemo, y en el que, tras la secreción del polipéptido de fusión de la célula en el medio de cultivo, el péptido señal se retira del polipéptido que contiene hemo. El método puede incluir además recuperar el polipéptido que contiene hemo del medio de cultivo. El péptido señal puede comprender o consistir en una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 60% de identidad con respecto a un péptido señal expuesto en la SEQ ID NO: 33, 35, 37, 39, 41,43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61,63, 65, 67, 69, 71,73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91 ó 93. Por ejemplo, el péptido señal puede comprender o consistir en una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 60% de identidad de secuencia de aminoácidos con respecto a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 55 o a los residuos 1-52 de la SEQ ID NO: 55.

Adicionalmente, este documento da a conocer una planta recombinante o célula vegetal (una planta o célula de planta Glycine max, Zea mays, Hordeum vulgare o Arabidopsis thaliana) que produce un polipéptido que contiene hemo. La planta o célula vegetal puede incluir al menos un ácido nucleico exógeno que codifica para un polipéptido que contiene hemo, en la que la planta o célula vegetal es de una especie distinta de Nicotiana. El ácido nucleico exógeno puede incluir además un elemento de control regulador tal como un promotor (por ejemplo, un promotor específico de tejido tal como hojas, raíces, tallos o semillas). El ácido nucleico exógeno también puede codificar para un péptido señal que selecciona como diana el polipéptido que contiene hemo a una ubicación subcelular tal como un esferosoma, una vacuola, un plástido (por ejemplo, cloroplasto) u otro orgánulo.

Este documento también presenta un método de producción de un polipéptido que contiene hemo seleccionado del grupo que consiste en una Ieghemoglobina, una eritrocruorina, una hemoglobina no simbiótica, una flavohemoglobina, una protoglobina, una cianoglobina, una globina I de Hell’s gate, una hemoglobina bacteriana, una mioglobina de ciliado, una protoglobina, globina truncada 2/2, HbN, HbO y Glb3. El método incluye hacer crecer una planta recombinante (por ejemplo, una planta Glycine max, Zea mays, Hordeum vulgare o Arabidopsis thaliana), comprendiendo la planta recombinante al menos un ácido nucleico exógeno que codifica para el polipéptido que contiene hemo, en el que la planta es de una especie distinta de Nicotiana, y purificar el polipéptido que contiene hemo de un tejido de la planta.

Este documento da a conocer además un vector que incluye una secuencia de polinucleótido que codifica para un polipéptido que contiene hemo; y una secuencia de polinucleótido que codifica para un péptido señal, en la que el péptido señal comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 60% de identidad de secuencia de aminoácidos con respecto a un péptido señal enumerado en la tabla 1. Por ejemplo, el péptido señal puede incluir una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 60% de identidad de secuencia de aminoácidos con respecto a la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 55 o a los residuos 1-52 de la SEQ ID NO: 55. En algunos casos, el péptido señal comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de los residuos 1-52 de la SEQ ID NO: 55. La secuencia de polinucleótido que codifica para el polipéptido que contiene hemo puede ligarse operativamente a un promotor.

Aún más, este documento da a conocer una composición que incluye un polipéptido purificado que contiene hemo; y una célula de Bacillus recombinante (por ejemplo, una célula de Bacillus subtilis, Bacillus megaterium o Bacillus licheniformis) o una célula vegetal recombinante distinta de una célula de la planta Nicotiana (por ejemplo, un componente que no se produce de manera natural de una célula de Bacillus recombinante o una célula vegetal recombinante). En algunos casos, el polipéptido que contiene hemo no se produce de manera natural en la célula huésped. La célula vegetal puede ser, por ejemplo, una célula de la planta Glycine max, una célula de planta la Zea mays o una célula de la planta Arabidopsis thaliana. La composición puede incluir al menos 1 parte por mil millones de dicho componente de la célula o como máximo el 1% (p/p) del componente de la célula.

Este documento también da a conocer un vector que comprende un secuencia de polinucleótido que codifica para un polipéptido que contiene hemo, un péptido señal; y una etiqueta, en el que la expresión de la secuencia de polinucleótido en una célula huésped produce una proteína de fusión que contiene el polipéptido que contiene hemo, el péptido señal y la etiqueta (por ejemplo, una etiqueta de afinidad tal como un etiqueta 6-histidina o una etiqueta detectable), y organismos genéticamente modificados que contienen un vector de este tipo. El vector puede incluir además una secuencia de polinucleótido que codifica para al menos uno de: a) un ligador de aminoácidos entre la secuencia que codifica para la etiqueta y la secuencia que codifica para el polipéptido que contiene hemo; y b) un ligador de aminoácidos entre la secuencia que codifica para el péptido señal y la secuencia que codifica para el polipéptido que contiene hemo.

Este documento da a conocer un método para secretar un polipéptido que contiene hemo de una bacteria (por ejemplo, una célula de Bacillus tal como una célula de Bacillus subtilis, Bacillus megaterium o Bacillus licheniformis) que incluye cultivar una bacteria recombinante en condiciones que permitan al polipéptido que contiene hemo que se secrete de la bacteria, comprendiendo la bacteria recombinante un ácido nucleico exógeno que codifica para el polipéptido que contiene hemo, un péptido señal y una etiqueta.

Este documento también da a conocer un polipéptido de fusión purificado que incluye un polipéptido que contiene hemo y una etiqueta. El polipéptido puede incluir además un ligador entre la etiqueta y el polipéptido que contiene hemo. En algunos casos, la etiqueta puede ubicarse en el extremo C-terminal del polipéptido que contiene hemo o bien directamente unido al extremo C-terminal o bien a través de un ligador.

A menos que se especifique lo contrario, en cualquiera de los métodos, las composiciones, las células bacterianas recombinantes, plantas recombinantes o células vegetales, o los vectores, el polipéptido que contiene hemo puede seleccionarse del grupo que consiste en una androglobina, una citoglobina, globina E, globina X, globina Y, una hemoglobina, una mioglobina, una leghemoglobina, una eritrocruorina, una hemoglobina beta, una hemoglobina alfa, una hemoglobina no simbiótica, una flavohemoglobina, una protoglobina, una cianoglobina, una globina I de Hell’s gate, una hemoglobina bacteriana, una mioglobina de ciliado, una histoglobina, una neuroglobina, una protoglobina y una globina truncada (por ejemplo, globina truncada 2/2, HbN, HbO o Glb3). Por ejemplo, el polipéptido que contiene hemo puede tener al menos el 60% de identidad de secuencia con respecto a una secuencia de aminoácidos expuesta en las SEQ ID NO: 1-31.

En el presente documento también se da a conocer un vector que comprende una secuencia de polinucleótido que codifica para un polipéptido que contiene hemo, por ejemplo, una globina, y una secuencia de polinucleótido que codifica para un péptido señal. En algunas variantes, el péptido señal es para una ruta secretora. En algunas de tales variantes, el péptido señal puede denominarse péptido señal o péptido señal de secreción. En algunas variantes, el péptido señal se refiere a dicho polipéptido que contiene hemo, por ejemplo, una globina, en una ruta secretora. En algunas variantes, el péptido señal comprende al menos el 60% de identidad de secuencia de aminoácidos con respecto a un péptido señal enumerado en la tabla 1. En algunas variantes, el péptido señal comprende al menos el 60% de identidad de secuencia de aminoácidos con respecto a un péptido señal de PhoD (por ejemplo, al menos aproximadamente el 65, el 70, el 75, el 76, el 77, el 78, el 79, el 80, el 81, el 82, el 83, el 84, el 85, el 86, el 87, el 88, el 89, el 90, el 91, el 92, el 93, el 94, el 95, el 96, el 97, el 98, el 99 o el 100% de identidad de secuencia de aminoácidos). En alguna variante, el péptido señal es un péptido señal de PhoD. En algunas variantes, la secuencia de polinucleótido que codifica para un polipéptido que contiene hemo, por ejemplo, una globina, se liga operativamente a un promotor. En algunas variantes, el polipéptido que contiene hemo se selecciona del grupo que consiste en: androglobina, citoglobina, globina E, globina X, globina Y, hemoglobina, mioglobina, leghemoglobina, eritrocruorina, hemoglobina beta, hemoglobina alfa, hemoglobina no simbiótica, flavohemoglobina, protoglobina, cianoglobina, hemoglobina no simbiótica, globina I de Hell’s gate, hemoglobina bacteriana, mioglobina de ciliado, flavohemoglobina, histoglobina, neuroglobinas, protoglobina, globina truncada 2/2, HbN, HbO y Glb3. En el presente documento también se da a conocer un organismo genéticamente modificado que comprende un vector que comprende una secuencia de polinucleótido que codifica para un polipéptido que contiene hemo, por ejemplo, una globina, y una secuencia de polinucleótido que codifica para un péptido señal. En algunas variantes, el organismo genéticamente modificado es una especie gram positiva de bacterias. En algunas variantes, el organismo genéticamente modificado es de la especie Bacillus. En algunas variantes, el organismo genéticamente modificado se selecciona del grupo que consiste en Bacillus subtilis, Bacillus megaterium y Bacillus licheniformis. En algunas variantes, el organismo genéticamente modificado es de la especie Nicotiana. En algunas variantes, el organismo genéticamente modificado es Nicotiana tabacum.

En un aspecto, la divulgación proporciona una composición que no se produce de manera natural que es un sucedáneo de carne, que comprende un polipéptido purificado que contiene hemo, por ejemplo, una globina, y un componente de una célula huésped que incluye una pared celular, un compartimento subcelular (tal como complejo de Golgi, retículo endoplasmático o núcleo), ácido nucleico, proteína, ADN genómico y/o una membrana plasmática. El polipéptido que contiene hemo es una globina que no se produce de manera natural en dicha célula huésped. La célula huésped se selecciona del grupo que consiste en célula de la planta Glycine max, célula de la planta Zea mays y célula de la planta Arabidopsis thaliana. En algunas realizaciones, la composición comprende al menos 1 parte por mil millones de dicha parte de la célula huésped. En algunas realizaciones, la composición comprende como máximo el 1% (p/p) de dicha parte de una célula huésped. El polipéptido que contiene hemo se selecciona del grupo que consiste en: leghemoglobina, eritrocruorina, hemoglobina no simbiótica, flavohemoglobina, protoglobina, cianoglobina, globina I de Hell’s gate, hemoglobina bacteriana, mioglobina de ciliado, protoglobina, globina truncada 2/2, HbN, HbO y Glb3. En algunas realizaciones, el polipéptido que contiene hemo comprende al menos el 60% de identidad de secuencia de aminoácidos con respecto a una secuencia de aminoácidos expuesta en las SEQ ID NO: 1-17 ó 21-31 (por ejemplo, al menos aproximadamente el 65, el 70, el 75, el 76, el 77, el 78, el 79, el 80, el 81, el 82, el 83, el 84, el 85, el 86, el 87, el 88, el 89, el 90, el 91, el 92, el 93, el 94, el 95, el 96, el 97, el 98, el 99 o el 100% de identidad de secuencia de aminoácidos). En algunas realizaciones, el polipéptido que contiene hemo comprende una etiqueta, por ejemplo, se une de manera covalente a una etiqueta, por ejemplo, en el extremo C-terminal o N-terminal. En algunas realizaciones, un producto cárnico consumible comprende un polipéptido que contiene hemo tal como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, un producto cárnico consumible comprende al menos el 0,001% (p/p) del polipéptido que contiene hemo. En algunas realizaciones, el producto cárnico consumible comprende como máximo el 10% (p/p) de la globina. En algunas realizaciones, el producto cárnico consumible comprende una réplica seleccionada del grupo que consiste en: una réplica de grasa, una réplica de tejido conjuntivo y una réplica de músculo, o cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, el producto cárnico consumible recapitula con precisión características clave asociadas con el cocinado y el consumo de un producto cárnico equivalente derivado de animales. En algunas realizaciones, el polipéptido que contiene hemo se secreta de dicha célula huésped.

La divulgación describe un método para purificar un polipéptido que contiene hemo, por ejemplo, una globina, de una célula vegetal que comprende insertar un polinucleótido que comprende un polinucleótido que codifica para un polipéptido que contiene hemo, por ejemplo, una globina, en una célula vegetal, y purificar el polipéptido que contiene hemo. En algunas variantes, el polinucleótido comprende además una secuencia que codifica para una etiqueta. En algunas variantes, la célula vegetal es de la especie Nicotiana. En algunas variantes, la célula vegetal es de Nicotiana tabacum. En algunas variantes, la célula vegetal es de Glycine max. En algunas variantes, la célula vegetal se selecciona del grupo que consiste en Nicotiana tabacum, Glycine max, Zea mays y Arabidopsis thaliana. En algunas variantes, el polipéptido que contiene hemo se selecciona del grupo que consiste en: androglobina, citoglobina, globina E, globina X, globina Y, hemoglobina, mioglobina, leghemoglobina, eritrocruorina, hemoglobina beta, hemoglobina alfa, hemoglobina no simbiótica, flavohemoglobina, protoglobina, cianoglobina, hemoglobina no simbiótica, globina I de Hell’s gate, hemoglobina bacteriana, mioglobina de ciliado, flavohemoglobina, histoglobina, neuroglobinas, protoglobina, globina truncada 2/2, HbN, HbO y Glb3. En algunas variantes, el polipéptido que contiene hemo es una globina. En algunas variantes, la globina es leghemoglobina. En algunas variantes, la globina es hemoglobina. En algunas variantes, el polipéptido que contiene hemo comprende al menos el 60% de identidad de secuencia de aminoácidos con respecto a una secuencia de aminoácidos expuesta en la figura 9 (por ejemplo, al menos aproximadamente el 65, el 70, el 75, el 76, el 77, el 78, el 79, el 80, el 81, el 82, el 83, el 84, el 85, el 86, el 87, el 88, el 89, el 90, el 91, el 92, el 93, el 94, el 95, el 96, el 97, el 98, el 99 o el 100% de identidad de secuencia de aminoácidos). En algunas variantes, el método comprende además combinar un polipéptido que contiene hemo con un producto cárnico consumible. En algunas variantes, el producto cárnico consumible comprende una réplica seleccionada del grupo que consiste en: una réplica de grasa, una réplica de músculo y una réplica de tejido conjuntivo, o cualquier combinación de los mismos. En algunas variantes, el producto cárnico consumible comprende al menos el 0,001% (p/p) de dicho polipéptido que contiene hemo, por ejemplo, una globina. En algunas variantes, el producto cárnico consumible comprende como máximo el 10% (p/p) de dicho polipéptido que contiene hemo. En algunas variantes, el producto cárnico consumible recapitula con precisión características clave asociadas con el cocinado y el consumo de un producto cárnico equivalente derivado de animales.

En el presente documento se da a conocer un método para purificar un polipéptido endógeno que contiene hemo, por ejemplo, una globina, de una planta que comprende alterar los niveles de expresión de un polipéptido endógeno que contiene hemo en una planta, y purificar el polipéptido que contiene hemo de dicha planta. En algunas variantes, la alteración aumenta los niveles de expresión del polipéptido endógeno que contiene hemo. En algunas variantes, la alteración aumenta los niveles de expresión de dicho polipéptido endógeno que contiene hemo en una hoja, una semilla, un grano, o cualquier combinación de los mismos. En algunas variantes, la alteración comprende alterar los niveles de expresión de una proteína en la ruta de producción del polipéptido endógeno que contiene hemo. En algunas variantes, la planta es de la especie Nicotiana. En algunas variantes, la célula vegetal es de Nicotiana tabacum. En algunas variantes, la célula vegetal es de Glycine max. En algunas variantes, la célula vegetal se selecciona del grupo que consiste en: Nicotiana tabacum, Glycine max, Zea mays y Arabidopsis thaliana. En algunas variantes, el polipéptido que contiene hemo es una globina seleccionada del grupo que consiste en: hemoglobina, leghemoglobina, hemoglobina no simbiótica y Glb3. En algunas variantes, la globina es leghemoglobina. En algunas variantes, la globina es hemoglobina. En algunas variantes, el polipéptido que contiene hemo comprende al menos el 60% de identidad de secuencia de aminoácidos con respecto a una secuencia de aminoácidos enumerada en la figura 9 (por ejemplo, al menos aproximadamente el 65, el 70, el 75, el 76, el 77, el 78, el 79, el 80, el 81, el 82, el 83, el 84, el 85, el 86, el 87, el 88, el 89, el 90, el 91, el 92, el 93, el 94, el 95, el 96, el 97, el 98, el 99 o el 100% de identidad de secuencia de aminoácidos). En algunas variantes, el polipéptido que contiene hemo comprende una etiqueta.

En el presente documento se da a conocer un método para secretar un polipéptido que contiene hemo de una bacteria que comprende insertar un polinucleótido que comprende un polinucleótido que codifica para un polipéptido que contiene hemo y un péptido señal en una bacteria, y secretar dicho polipéptido que contiene hemo de dicha bacteria. En algunas variantes, la bacteria es de la especie Bacillus. En algunas variantes, la bacteria es Bacillus subtilis. En algunas variantes, el polipéptido que contiene hemo se selecciona del grupo que consiste en: androglobina, citoglobina, globina E, globina X, globina Y, hemoglobina, mioglobina, leghemoglobina, eritrocruorina, hemoglobina beta, hemoglobina alfa, hemoglobina no simbiótica, flavohemoglobina, protoglobina, cianoglobina, globina I de Hell’s gate, hemoglobina bacteriana, mioglobina de ciliado, histoglobina, neuroglobinas, globina truncada 2/2, HbN, HbO y Glb3. En algunas variantes, el polipéptido que contiene hemo es una globina. En algunas variantes, la globina es leghemoglobina. En algunas variantes, la globina es hemoglobina. En algunas variantes, el polipéptido que contiene hemo comprende al menos el 60% de identidad de secuencia de aminoácidos con respecto a una secuencia de aminoácidos enumerada en la figura 9 (por ejemplo, al menos aproximadamente el 65, el 70, el 75, el 76, el 77, el 78, el 79, el 80, el 81, el 82, el 83, el 84, el 85, el 86, el 87, el 88, el 89, el 90, el 91, el 92, el 93, el 94, el 95, el 96, el 97, el 98, el 99 o el 100% de identidad de secuencia de aminoácidos). En algunas variantes, el péptido señal es un péptido señal para una ruta secretora. En algunas variantes, el péptido señal se refiere a dicho polipéptido que contiene hemo en una ruta secretora. En algunas variantes, el péptido señal comprende al menos aproximadamente el 60% de identidad de secuencia de aminoácidos con respecto a un péptido señal enumerado en la tabla 1 (por ejemplo, al menos aproximadamente el 65, el 70, el 75, el 76, el 77, el 78, el 79, el 80, el 81, el 82, el 83, el 84, el 85, el 86, el 87, el 88, el 89, el 90, el 91, el 92, el 93, el 94, el 95, el 96, el 97, el 98, el 99 o el 100% de identidad de secuencia de aminoácidos). En algunas variantes, la secuencia de polinucleótido codifica para un péptido señal que comprende al menos el 60% de identidad de secuencia de aminoácidos con respecto a un péptido señal de PhoD (por ejemplo, al menos aproximadamente el 65, el 70, el 75, el 76, el 77, el 78, el 79, el 80, el 81, el 82, el 83, el 84, el 85, el 86, el 87, el 88, el 89, el 90, el 91, el 92, el 93, el 94, el 95, el 96, el 97, el 98, el 99 o el 100% de identidad de secuencia de aminoácidos). En algunas variantes, la secuencia de polinucleótido codifica para un péptido señal de PhoD. En algunas variantes, el método comprende además purificar el polipéptido que contiene hemo. En algunas variantes, el método comprende además combinar dicho polipéptido purificado que contiene hemo con un producto cárnico consumible. En algunas variantes, el producto cárnico consumible comprende una réplica de grasa, una réplica de músculo y una réplica de tejido conjuntivo, o cualquier combinación de los mismos. En algunas variantes, el producto cárnico consumible comprende al menos el 0,001% (p/p) de dicho polipéptido purificado que contiene hemo. En algunas variantes, el producto cárnico consumible comprende como máximo el 10% (p/p) de dicho polipéptido purificado que contiene hemo. En algunas variantes, el producto cárnico consumible recapitula con precisión características clave asociadas con el cocinado y el consumo de un producto cárnico equivalente derivado de animales.

En el presente documento se da a conocer un método para secretar un polipéptido que contiene hemo de una bacteria que comprende alterar los niveles de expresión de un polipéptido endógeno que contiene hemo en una bacteria, y purificar dicho polipéptido que contiene hemo de dicha bacteria. En algunas variantes, la alteración aumenta los niveles de expresión de dicho polipéptido endógeno que contiene hemo. En algunas variantes, la alteración comprende alterar los niveles de expresión de una proteína en la ruta de producción de dicho polipéptido endógeno que contiene hemo. En algunas variantes, la bacteria es de la especie Bacillus. En algunas variantes, la bacteria es Bacillus subtilis. En algunas variantes, el polipéptido que contiene hemo se selecciona del grupo que consiste en: hemoglobina, flavohemoglobina, cianoglobina, globina I de Hell’s gate, hemoglobina bacteriana, HbN y HbO. En algunas variantes, el polipéptido que contiene hemo es hemoglobina. En algunas variantes, el polipéptido que contiene hemo comprende al menos el 60% de identidad de secuencia de aminoácidos con respecto a una secuencia de aminoácidos enumerada en la figura 9 (por ejemplo, al menos aproximadamente el 65, el 70, el 75, el 76, el 77, el 78, el 79, el 80, el 81, el 82, el 83, el 84, el 85, el 86, el 87, el 88, el 89, el 90, el 91, el 92, el 93, el 94, el 95, el 96, el 97, el 98, el 99 o el 100% de identidad de secuencia de aminoácidos). En algunas variantes, el polipéptido que contiene hemo comprende una etiqueta. En algunas variantes, el método comprende además purificar el polipéptido que contiene hemo. En algunas variantes, el método comprende además combinar el polipéptido purificado que contiene hemo con un producto cárnico consumible. En algunas variantes, el producto cárnico consumible comprende una réplica de grasa, una réplica de músculo y una réplica de tejido conjuntivo, o cualquier combinación de los mismos.

Breve descripción de los dibujos

Las características novedosas de la divulgación se exponen con particularidad en las reivindicaciones adjuntas. Se obtendrá una mejor comprensión de las características y ventajas de la presente invención haciendo referencia a la siguiente descripción detallada que expone realizaciones ilustrativas, en las que se utilizan los principios, y los dibujos adjuntos de los que:

La figura 1 contiene tres geles SDS-PAGE de las proteínas después de la purificación por afinidad con Ni-NTA del sedimento celular, que muestra una comparación del efecto de un péptido señal de secreción (PhoD) sobre la expresión citosólica de la hemoglobina Aquifex aeolicus (AaHb). La figura 1A es el control de vector vacío. La figura 1 B es sin el péptido señal de secreción y la figura 1C es con el péptido señal de secreción.

La figura 2 es un gráfico que presenta el contenido de hemo de un polipéptido expresado de manera citosólica (AaHb). La línea correspondiente al vector vacío es la línea con el pico más bajo. La línea correspondiente al polipéptido sin péptido señal es la línea con el pico más alto. La línea correspondiente al polipéptido con el péptido señal de PhoD es la línea con el segundo pico más alto.

La figura 3 contiene dos geles SDS-PAGE de las proteínas después de la purificación por afinidad con Ni-NTA de los medios, que muestra una comparación del efecto de un péptido señal de secreción (PhoD) sobre la expresión secretora de un polipéptido (AaHb). La figura 3A es el control de vector vacío. La figura 3B es con el péptido señal de secreción.

La figura 4 es la secuencia del polipéptido de fusión que contiene la secuencia PhoD (texto en negrita)-sitio de escisión de proteasa sintética (texto en cursiva, ASAA)-AaHb (subrayado)-His6 (doble subrayado) (SEQ ID NO: 94). Se muestra el sitio de reconocimiento predicho de peptidasa I señal (SPI) (SEQ ID NO: 95), con el sitio de escisión indicado. La secuenciación N-terminal (SEQ ID NO: 96) del polipéptido secretado presente en los medios después de la expresión citosólica de un polipéptido de fusión PhoD-AaHb indicó que el extremo N-terminal correspondía al extremo N-terminal de la proteína AaHb.

La figura 5 representa el contenido de hemo de un polipéptido secretado (después de la expresión del polipéptido de fusión PhoD-AaHb). La línea correspondiente al vector vacío es la línea con el pico más bajo. La línea correspondiente al polipéptido secretado después de la expresión del polipéptido de fusión que incluía el péptido señal de PhoD es la línea con el pico más alto.

La figura 6 ilustra 1) detección de dos polipéptidos de fusión a modo de ejemplo (PhoD-yjbl e YwbN-yjbl) en el sedimento celular tras la expresión de un polipéptido endógeno (yjbI) fusionado con uno de los dos péptidos de señalización diferentes (PhoD o YwbN), y 2) detección de medios de los polipéptidos, que demuestra la escisión apropiada de los péptidos señal.

La figura 7 ilustra 1) detección de dos polipéptidos de fusión a modo de ejemplo (PhoD-LGB2 y PhoD-HGbI) en el sedimento celular tras la expresión de dos polipéptidos heterólogos (LGB2 y HGbI) fusionados con el péptido de señalización (PhoD), y 2) detección de medios de los polipéptidos, que demuestra la escisión apropiada del péptido señal.

La figura 8 ilustra la detección de medios de un polipéptido (AaHb) después de la fusión con un subconjunto de varios péptidos de señalización de secreción a modo de ejemplo diferentes (PhoD, TipA, WapA, WprA, YmaC, YolA, YuiC, YwbN, AppB y BglS), expresión y escisión del péptido señal de secreción. Las etiquetas indican el péptido señal de secreción que se fusionó con el extremo 5’ del polipéptido antes de la escisión.

La figura 9 contiene las secuencias de aminoácidos de polipéptidos a modo de ejemplo que contienen hemo (SEQ ID NO: 1-31).

Descripción detallada

Polipéptidos

Esta divulgación describe composiciones y métodos para la expresión de un polipéptido en una célula huésped (por ejemplo, bacterias y/o plantas). Un polipéptido puede referirse a subunidades o dominios de un polipéptido. Un polipéptido de la divulgación puede ser un polipéptido que contiene hemo. El término polipéptido que contiene hemo puede referirse a todas las proteínas o subunidades proteína que pueden unirse de manera covalente o no covalente a un resto hemo. Los polipéptidos que contienen hemo pueden transportar o almacenar oxígeno. En algunos casos, el polipéptido de la divulgación puede ser una globina. Los polipéptidos pueden comprender el pliegue de la globina, que puede comprender una serie de ocho hélices alfa. Un polipéptido puede comprender una globina alfa y/o una globina beta. Un polipéptido puede comprender una estructura superior característica (por ejemplo, el “pliegue de mioglobina”) generalmente asociada con globinas. Un polipéptido puede ser un oligómero. Los polipéptidos pueden ser monómeros, dímeros, trímeros, tetrámeros y/u oligómeros de orden superior. En algunos casos, un polipéptido puede ser un polipéptido que contiene hierro.

Un polipéptido de la divulgación puede incluir, pero no se limita a, androglobina, citoglobina, globina E, globina X, globina Y, hemoglobina, mioglobina, leghemoglobinas, eritrocruorinas, hemoglobinas beta, hemoglobinas alfa, hemoglobinas no simbióticas, flavohemoglobinas, protoglobinas, cianoglobinas, citoglobina, globina I de Hell’s gate, hemoglobinas bacterianas, mioglobinas de ciliado, histoglobinas, neuroglobinas, clorocruorina, eritrocruorina, protoglobina, globina truncada 2/2, HbN, HbO, Glb3 y citocromos, proteínas ribosómicas, actina, hexocinasa, lactato deshidrogenasa, fructosa-bisfosfato aldolasa, fosfofructocinasas, triosa-fosfato isomerasas, fosfoglicerato cinasas, fosfoglicerato mutasas, enolasas, piruvato cinasas, proteasas, lipasas, amilasas, glicoproteínas, lectinas, mucinas, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasas, piruvato descarboxilasas, actinas, factores de elongación de la traducción, histonas, ribulosa-1,5-bisfosfato carboxilasa oxigenasa (rubisco), ribulosa-1,5-bisfosfato carboxilasa oxigenasa activasa (rubisco activasa), albúminas, glicininas, conglicininas, globulinas, vicilinas, conalbúmina, gliadina, glutelina, gluten, glutenina, hordeína, prolamina, faseolina (proteína), proteinoplasto, secalina, extensinas, gluten de Triticeae, colágenos, zeína, cafirina, avenina, deshidrinas, hidrofilinas, proteínas abundantes en embriogénesis tardía, proteínas no plegadas de manera nativa, cualquier proteína de almacenamiento de semillas, oleosinas, caloleosinas, esteroleosinas u otras proteínas con esferosoma, proteína A de almacenamiento vegetativo, proteína B de almacenamiento vegetativo, globulina 8S de almacenamiento de semillas de mungo, globulina, globulinas de guisante y albúminas de guisante. En algunos casos, un polipéptido de la divulgación puede comprender o puede ser un polipéptido enumerado en la figura 9. En algunos casos, puede introducirse un polipéptido en una célula huésped. Por ejemplo, un polipéptido puede expresarse, secretarse y/o purificarse de bacterias tales como de la especie Bacillus. Un polipéptido puede expresarse y/o purificarse de una planta.

Un polipéptido enumerado en la figura 9 puede expresarse, pero no puede secretarse y/o plegarse de manera apropiada, usando los métodos de la divulgación. Un polipéptido enumerado en la figura 9 puede expresarse, pero no puede ubicarse correctamente en la célula usando los métodos de la divulgación. Un polipéptido enumerado en la figura 9 puede expresarse, pero no puede mantener niveles de actividad comparables a un polipéptido de tipo natural. Un polipéptido enumerado en la figura 9 puede mantener al menos aproximadamente el 1, el 5, el 10, el 20, el 30, el 40, el 50, el 60, el 70, el 80, el 90, el 100% del nivel de actividad de un polipéptido de tipo natural. Un polipéptido enumerado en la figura 9 puede mantener como máximo aproximadamente el 1, el 5, el 10, el 20, el 30, el 40, el 50, el 60, el 70, el 80, el 90 o el 100% del nivel de actividad de un polipéptido de tipo natural. Un polipéptido que comprende al menos aproximadamente el 10, el 20, el 30, el 40, el 50, el 60, el 70, el 80, el 90 o el 100% de identidad de secuencia de aminoácidos con respecto a un polipéptido enumerado en la figura 9 puede expresarse, pero no puede secretarse y/o plegarse de manera apropiada usando los métodos de la divulgación. Un polipéptido que comprende como máximo aproximadamente el 10, el 20, el 30, el 40, el 50, el 60, el 70, el 80, el 90 o el 100% de identidad de secuencia de aminoácidos con respecto a un polipéptido enumerado en la figura 9 puede expresarse, pero no puede secretarse y/o plegarse de manera apropiada usando los métodos de la divulgación. Un polipéptido que comprende como máximo aproximadamente el 10, el 20, el 30, el 40, el 50, el 60, el 70, el 80, el 90 o el 100% de identidad de secuencia de aminoácidos con respecto a un polipéptido enumerado en la figura 9 puede expresarse, pero no puede mantener la actividad en comparación con un polipéptido de tipo natural. Un polipéptido que comprende como máximo aproximadamente el 10, el 20, el 30, el 40, el 50, el 60, el 70, el 80, el 90, el 100% de identidad de secuencia de aminoácidos con respecto a un polipéptido enumerado en la figura 9 puede expresarse, pero puede contener menos cofactor con hemos en comparación con un polipéptido de tipo natural.

En algunos casos, una secuencia de un polipéptido que va a expresarse en una célula huésped puede ser una secuencia que comprende al menos aproximadamente el 10, el 20, el 30, el 40, el 50, el 60, el 70, el 80, el 90 o el 100% de identidad de secuencia de aminoácidos con respecto a una secuencia de polipeptido endógeno, por ejemplo, un polipéptido endógeno que contiene hemo, de la célula huésped. En algunos casos, una secuencia de un polipéptido que va a expresarse en una célula huésped puede ser una secuencia que comprende como máximo aproximadamente el 10, el 20, el 30, el 40, el 50, el 60, el 70, el 80, el 90 o el 100% de identidad de secuencia de aminoácidos con respecto a una secuencia de polipeptido endógeno de la célula huésped. Por ejemplo, un polipéptido puede ser una secuencia polipeptídica encontrada en un animal, un mamífero, un vertebrado, un invertebrado, una planta, un hongo, una bacteria, una levadura, un alga, una arquea, un organismo genéticamente modificado tal como una bacteria o levadura genéticamente modificada. Una secuencia polipeptídica puede sintetizarse químicamente y/o sintetizarse mediante síntesis in vitro.

Una secuencia polipeptídica puede ser una secuencia de un polipéptido, por ejemplo, un polipéptido que contiene hemo, encontrado en plantas. Los ejemplos no limitativos de plantas pueden incluir cereales tales como, por ejemplo, maíz, avena, arroz, trigo, cebada, centeno, triticale, teff, semillas oleaginosas incluyendo semilla de algodón, semilla girasol, semilla de cártamo, crambe, camelina, mostaza, colza, verduras de hoja tales como, por ejemplo, lechuga, espinaca, col rizada, berza, grelos, acelga, hojas de mostaza, diente de león, brócoli, repollo, caña de azúcar, árboles, tubérculos tales como mandioca, batata, patata, zanahorias, remolachas, nabos, plantas de la familia de las legumbres, tales como, por ejemplo, trébol, guisantes tales como caupíes, guisantes ingleses, guisantes amarillos, guisantes verdes, judías tales como, por ejemplo, semilla de soja, habas, habas de Lima, judías rojas, garbanzos, semillas de mungo, judías pintas, lentejas, altramuces, mezquite, algarrobo, soja y cacahuetes, coco, veza (Vicia), Stylo (Stylosanthes), Arachis, Indigofera, Acacia, Leucaena, Cyamopsis y Sesbania. Las plantas no consumidas habitualmente por seres humanos, incluyendo cultivos de biomasa, incluyendo, por ejemplo, pastos, miscanto, tabaco, Arundo donax, caña energética, sorgo, otras hierbas, alfalfa, mazorca de maíz, alga parda u otras algas marinas. Los polipéptidos que pueden encontrarse en cualquier organismo en el reino vegetal pueden usarse en la presente divulgación. En algunos casos, la planta puede ser soja. En algunos casos, la planta puede ser cebada.

En algunos casos, una secuencia polipeptídica puede ser una secuencia, por ejemplo, una secuencia polipeptídica que contiene hemo, encontrada en metazoos. Por ejemplo, una secuencia polipeptídica de la divulgación puede ser una secuencia polipeptídica encontrada en mamíferos tales como vaca, cerdo, rata, perro o caballo. En algunos casos, la secuencia polipeptídica proviene de la vaca. En algunos casos, la secuencia polipeptídica proviene del cerdo. En algunos casos, una secuencia polipeptídica puede ser una secuencia encontrada en protistas. Por ejemplo, una secuencia polipeptídica de la divulgación puede ser una secuencia polipeptídica encontrada en protistas tales como algas. En algunos casos, una secuencia polipeptídica puede ser una secuencia encontrada en arqueas. Por ejemplo, una secuencia polipeptídica de la divulgación puede ser una secuencia polipeptídica encontrada en arqueas tales como halobacterias o Pyrococcus. En algunos casos, una secuencia polipeptídica puede ser una secuencia encontrada en eubacterias. Por ejemplo, una secuencia polipeptídica de la divulgación puede ser una secuencia polipeptídica encontrada en eubacterias tales como Bacillus, Clostridium o Escherichia.

Tal como se usa en el presente documento, el término “proteína que contiene hemo” incluye cualquier polipéptido que puede unirse de manera covalente o no covalente a un resto hemo. En algunas realizaciones, el polipéptido que contiene hemo es una globina y puede incluir un pliegue de globina, que comprende una serie de siete a nueve hélices alfa. Las proteínas de tipo globina pueden ser de cualquier clase (por ejemplo, clase I, clase II o clase III) y, en algunas realizaciones, pueden transportar o almacenar oxígeno. Por ejemplo, un polipéptido que contiene hemo puede ser un tipo no simbiótico de hemoglobina o una leghemoglobina. Un polipéptido que contiene hemo puede ser un monómero, es decir, una cadena polipeptídica individual, o puede ser un dímero, un trímero, tetrámero y/o oligómeros de orden superior. La vida útil del estado de Fe2+ oxigenado de un polipéptido que contiene hemo puede ser similar al de mioglobina o puede excederlo en un 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 100% o más.

Los ejemplos no limitativos de polipéptidos que contienen hemo pueden incluir una androglobina, una citoglobina, una globina E, una globina X, una globina Y, una hemoglobina, una mioglobina, una eritrocruorina, una hemoglobina beta, una hemoglobina alfa, una protoglobina, una cianoglobina, una histoglobina, una neuroglobina, una clorocruorina, una hemoglobina truncada (por ejemplo, HbN, HbO, una globina truncada 2/2, una hemoglobina 3 (por ejemplo, Glb3)), un citocromo o una peroxidasa.

Los polipéptidos que contienen hemo pueden ser de mamíferos (por ejemplo, animales de granja tales como vacas, cabras, ovejas, cerdos, bueyes o conejos), aves, plantas, algas, hongos (por ejemplo, levadura u hongos filamentosos), ciliados o bacterias. Por ejemplo, un polipéptido que contiene hemo puede ser de un mamífero tal como un animal de granja (por ejemplo, una vaca, una cabra, una oveja, un cerdo, un buey o un conejo) o un ave tal como un pavo o un pollo. Los polipéptidos que contienen hemo pueden ser de una planta tal como Nicotiana tabacum o Nicotiana silvestris (tabaco); Zea mays (maíz), Arabidopsis thaliana, una legumbre tal como Glycine max (semilla de soja), Cicer arietinum (garbanzo), variedades de Pisum sativum (guisante) tales como guisantes de huerta o guisantes de azúcar, variedades de Phaseolus vulgaris de judías comunes tales como judías verdes, judías negras, judías blancas, alubias o judías pintas, variedades de Vigna unguiculata (caupíes), Vigna radiate (semillas de mungo), Lupinus albus (altramuz) o Medicago sativa (alfalfa); Brassica napus (colza); Triticum sps. (trigo, incluyendo granos de trigo, y espelta); Gossypium hirsutum (algodón); Oryza sativa (arroz); Zizania sps. (arroz salvaje); Helianthus annuus (girasol); Beta vulgaris (remolacha azucarera); Pennisetum glaucum (mijo perla); Chenopodium sp. (quinoa); Sesamum sp. (sésamo); Linum usitatissimum (lino); u Hordeum vulgare (cebada). Los polipéptidos que contienen hemo pueden aislarse de hongos tales como Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Magnaporthe oryzae, Fusarium graminearum o Fusarium oxysporum. Los polipéptidos que contienen hemo pueden aislarse de bacterias tales como Escherichia coli, Bacillus subtilis, Synechocistis sp., Aquifex aeolicus, Methylacidiphilum infernorum o bacterias termófilas tales como Thermophilus.

Se conocen las secuencias y la estructura de numerosos polipéptidos que contienen hemo. Véase, por ejemplo, Reedy et al., Nucleic Acids Research, 2008, vol. 36, ejemplar de base de datos D307-D313 y la base de datos de proteínas con hemo disponible en Internet en la página http://hemeprotein.info/heme.php.

Una hemoglobina no simbiótica puede ser de una planta seleccionada del grupo que consiste en semilla de soja, semilla de soja germinada, alfalfa, lino dorado, judía negra, judía de careta, alubia, garbanzo, semilla de mungo, caupíes, judías pintas, guisantes en vaina, quinoa, sésamo, girasol, granos de trigo, espelta, cebada, arroz salvaje o arroz.

Cualquiera de los polipéptidos que contienen hemo descritos en el presente documento puede tener al menos el 60% (por ejemplo, al menos el 65%, el 70%, el 75%, el 80%, el 85%, el 90%, el 95%, el 97%, el 98%, el 99% o el 100%) de identidad de secuencia con respecto a la secuencia de aminoácidos del correspondiente polipéptido que contiene hemo de tipo natural o fragmentos del mismo que contienen un motivo de unión a hemo. Por ejemplo, un polipéptido que contiene hemo puede tener al menos el 60% de identidad de secuencia con respecto a una secuencia de aminoácidos expuesta en la figura 9, incluyendo una hemoglobina no simbiótica tal como la de Vigna radiata (SEQ ID NO: 1), Hordeum vulgare (SEQ ID NO: 5), Zea mays (SEQ ID NO: 13), Oryza sativa subsp. japonica (arroz) (SEQ ID NO: 14) o Arabidopsis thaliana (SEQ ID NO: 15), una globina I de Hell’s gate tal como la de Methylacidiphilum infernorum (SEQ ID NO: 2), una flavohemoproteína tal como de Aquifex aeolicus (SEQ ID NO: 3), una leghemoglobina tal como la de Glycine max (SEQ ID NO: 4), Pisum sativum (SEQ ID NO: 16) o Vigna unguiculata (SEQ ID NO: 17), una peroxidasa dependiente de hemo tal como la de Magnaporthe oryzae (SEQ ID NO: 6) o Fusarium oxysporum (SEQ ID NO: 7), una citocromo c peroxidasa de Fusarium graminearum (SEQ ID NO: 8), una hemoglobina truncada de Chlamydomonas moewusii (SE^qID NO: 9), Tetrahymena pyriformis (SEQ ID NO: 10, truncada de grupo I), Paramecium caudatum (SEQ ID NO: 11, truncada de grupo I), una hemoglobina de Aspergillus niger (SEQ ID NO: 12), o una proteína de mioglobina de mamífero tal como la mioglobina de Bos taurus (^sE^qID NO: 18), mioglobina de Sus scrofa (SEQ ID NO: 19), mioglobina de Equus caballus (SEQ ID NO: 20), una hemoglobina truncada de Synechocystis PCC6803 (SEQ ID NO: 21), una hemoglobina truncada de Synechococcus sp. PCC 7335 (SEQ ID nO: 22), una hemoglobina de Nostoc commune (SEQ ID NO: 23), una hemoglobina de Vitreoscilla stercoraria (SEQ ID NO: 24), una hemoglobina de Corynebacterium glutamicum (SEQ ID NO: 25), una hemoglobina truncada de Bacillus subtilis (SEQ ID NO: 26), una hemoglobina truncada de Bacillus megaterium (SEQ ID NO: 27), una flavohemoglobina de Saccharomyces cerevisiae (SEQ ID NO: 28), una hemoglobina no simbiótica de Nicotina tobaccum (SEQ ID NO: 29), una hemoglobina no simbiótica de Medicago sativa (SEQ ID NO: 30) o una hemoglobina no simbiótica de Glycine max (SEQ ID NO: 31).

La identidad en porcentaje entre dos secuencias de aminoácidos puede determinarse de la siguiente manera. En primer lugar, se alinean las secuencias de aminoácidos usando el programa BLAST 2 Sequences (Bl2seq) de la versión independiente de BLASTZ que contiene la versión 2.0.14 de BLASTP. Esta versión independiente de BLASTZ puede obtenerse de la página web de Fish & Richardson (por ejemplo, www.fr.com/blast/) o de la página web del Centro Nacional del Gobierno de los Estados Unidos para Información de Biotecnología (www.ncbi.nlm.nih.gov). Pueden encontrarse instrucciones que explican cómo usar el programa Bl2seq en el archivo de instrucciones que acompaña a BLASTZ. Bl2seq realiza una comparación entre dos secuencias de aminoácidos usando el algoritmo de BLASTP. Para comparar dos secuencias de aminoácidos, las opciones de Bl2seq se establecen de la siguiente manera: -i se establece para un archivo que contiene la primera secuencia de aminoácidos que va a compararse (por ejemplo, C:\seq1.txt); -j se establece para un archivo que contiene la segunda secuencia de aminoácidos que va a compararse (por ejemplo, C:\seq2.txt); -p se establece para blastp; -o se establece para cualquier nombre de archivo deseado (por ejemplo, C:\output.txt); y todas las otras opciones se dejan en su valor por defecto. Por ejemplo, pueden usarse los siguientes comandos para generar un archivo de salida que contiene una comparación entre dos secuencias de aminoácidos: C:\Bl2seq -i c:\seq1.txt -j c:\seq2.txt -p blastp -o c:\output.txt. Si las dos secuencias comparadas comparten homología, entonces el archivo de salida designado presentará aquellas regiones de homología como las secuencias alineadas. Si las dos secuencias comparadas no comparten homología, entonces el archivo de salida designado no presentará secuencias alineadas. Pueden seguirse procedimientos similares para secuencias de ácido nucleico excepto si se usa blastn.

Una vez alineadas, se determina el número de coincidencias contando el número de posiciones en las que está presente un residuo de aminoácido idéntico en ambas secuencias. La identidad en porcentaje se determina dividiendo el número de coincidencias entre la longitud de la secuencia de aminoácidos del polipéptido de cadena completa seguido por multiplicar el valor resultante por 100. Se observa que el valor de identidad en porcentaje se redondea a la décima más cercana. Por ejemplo, 78,11, 78,12, 78,13 y 78,14 se redondean hacia abajo hasta 78,1, mientras que 78,15, 78,16, 78,17, 78,18 y 78,19 se redondean hacia arriba hasta 78,2. También se observa que el valor de longitud siempre es un número entero.

Se apreciará que varios ácidos nucleicos pueden codificar para un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos particular. El código degenerado del código genético se conoce bien en la técnica; es decir, para muchos aminoácidos, existe más de un triplete de nucleótidos que sirve como codón para el aminoácido. Por ejemplo, pueden modificarse codones en la secuencia codificante para una enzima dada de modo que se obtiene la expresión óptima en una especie particular (por ejemplo, bacterias u hongo), usando tablas de sesgo de codón apropiadas para esas especies.

Los polipéptidos que contienen hemo pueden extraerse del material fuente (por ejemplo, extraerse de tejido animal, o biomasa de plantas, hongos, algas o bacterias, o del sobrenadante de cultivo para proteínas secretadas) o de una combinación de materiales fuente (por ejemplo, múltiples especies vegetales). La leghemoglobina se encuentra fácilmente disponible como un subproducto no usado de cultivos primarios de legumbres (por ejemplo, semilla de soja, alfalfa o guisante). La cantidad de leghemoglobina en las raíces de estos cultivos en los Estados Unidos excede el contenido de mioglobina de toda la carne roja consumida en los Estados Unidos.

En algunas realizaciones, los extractos de polipéptidos que contienen hemo incluyen uno o más polipéptidos que no contienen hemo del material fuente (por ejemplo, otras proteínas de animales, plantas, hongos, algas o bacterias) o de una combinación de materiales fuente (por ejemplo, diferentes animales, plantas, hongos, algas o bacterias).

Un polipéptido de la divulgación (por ejemplo, una globina, un polipéptido que contiene hemo o una proteína que contiene hierro), puede denominarse polipéptido “purificado”. Un polipéptido de la divulgación puede purificarse de otros componentes del material fuente (por ejemplo, otras proteínas de animales, plantas, hongos, algas o bacterias). Un polipéptido purificado puede referirse a un polipéptido que se ha enriquecido en una composición, se ha manipulado de alguna manera para retirar residuos no deseados (por ejemplo, residuos celulares, ADN genómico y/u otros polipéptidos) y/o se retira de la célula huésped en la que se sintetizó (por ejemplo, transcribió/tradujo) (por ejemplo, lisis celular). Un polipéptido “purificado” puede ser un polipéptido extraído de su célula huésped. En algunas variantes, un polipéptido “purificado” es al menos el 1% puro, por ejemplo, al menos el 2%, el 5%, el 10%, el 15%, el 20%, el 25%, el 30%, el 35%, el 40%, el 45%, el 50%, el 55%, el 60%, el 65%, el 70%, el 75%, el 80%, el 85%, el 90%, el 95% o el 99% puro. Las proteínas pueden separarse en función de su peso molecular, por ejemplo, mediante cromatografía de exclusión molecular, ultrafiltración a través de membranas o centrifugación por densidad. En algunos casos, las proteínas pueden separarse en función de su carga superficial, por ejemplo, mediante precipitación isoeléctrica, cromatografía de intercambio aniónico o cromatografía de intercambio catiónico. Las proteínas también pueden separarse en función de su solubilidad, por ejemplo, mediante precipitación con sulfato de amonio, precipitación isoeléctrica, extracción con tensioactivos, detergentes o disolventes. Las proteínas también pueden separarse por su afinidad con otra molécula usando, por ejemplo, cromatografía de interacción hidrófoba, tintes reactivos o hidroxiapatita. La cromatografía de afinidad también puede incluir el uso de anticuerpos que tienen afinidad de unión específica para el polipéptido que contiene hemo, del anticuerpo a la proteína, níquel-NTA para proteínas recombinantes etiquetadas con His, lectinas para unirse a restos de azúcares en una glucoproteína u otras moléculas que se unen específicamente a la proteína.

Hemoglobina

La hemoglobina (Hb) puede ser el principal constituyente de un eritrocito que puede llevar oxígeno desde los pulmones por todo el cuerpo. Cuando está contenida en glóbulos rojos, la Hb humana puede existir como una estructura tetramérica compuesta de dos ap-dímeros ligados a oxígeno, teniendo cada uno un peso molecular de aproximadamente 32 kD. Cada subunidad a y p de cada dímero puede tener una cadena proteínica y una molécula con hemo. La hemoglobina o “Hb” puede referirse a (a) un pigmento respiratorio que contiene hierro encontrado en glóbulos rojos de vertebrados que comprende una globina compuesta de cuatro subunidades (un tetrámero) cada una de las cuales se liga a una molécula con hemo, que funciona en el transporte de oxígeno a los tejidos después de su conversión para dar la forma oxigenada en las branquias o los pulmones, y que ayuda en el transporte de dióxido de carbono de vuelta a las branquias o los pulmones después de la entrega de su oxígeno. Una hemoglobina puede referirse a una hemoglobina producida de manera recombinante; ap-dímeros de hemoglobina, hemoglobina reticulada de manera intermolecular o intramolecular, así como versiones modificadas de las hemoglobinas descritas en la divulgación, que pueden incluir, pero no se limitan a, modificaciones que aumentan o disminuyen la afinidad por el oxígeno de la hemoglobina (por ejemplo, tal como sustituyendo una alanina, valina, leucina o fenilalanina por histidina en la posición E7 (por ejemplo, posición 62 de la SEQ ID NO: 4)). Véase, por ejemplo, Hargrove et al., J. Mol. Biol. (1997) 266, 1032-1042. Todas las hemoglobinas pueden ser capaces de unirse a hemo. Una hemoglobina puede ser una variante de hemoglobina. Las variantes de hemoglobina pueden comprender mutaciones, sustituciones, adiciones y/o deleciones de aminoácidos. Las variantes de hemoglobina pueden incluir hemoglobina Kansas, hemoglobina S, hemoglobina C, hemoglobina E, hemoglobina D-Punjab, hemoglobina O-Arab, hemoglobina G-Philadelphia, hemoglobina Hasharon, hemoglobina Lepore y hemoglobina M.

Leghemoglobina

En algunos casos, la secuencia (aminoácido y/o ácido nucleico) de una leghemoglobina puede ser una secuencia de leghemoglobina vegetal. Diversas especies de legumbres y sus variedades, por ejemplo, semilla de soja, haba, haba de Lima, caupíes, guisantes ingleses, guisantes amarillos, altramuz, judía roja, garbanzos, cacahuete, alfalfa, heno de algarroba, trébol, lespedeza y judía pinta, comprenden nódulos de raíz que fijan nitrógeno en las que la leghemoglobina puede desempeñar un papel clave en controlar las concentraciones de oxígeno. Las leghemoglobinas de diferentes especies pueden ser homólogas y tener propiedades de color similares. Algunas especies vegetales pueden expresar varias isoformas de leghemoglobina (por ejemplo, la semilla de soja tiene cuatro isoformas de leghemoglobina). Variaciones mínimas en una secuencia de aminoácidos precisa pueden modificar la carga global de la proteína a un pH particular y pueden modificar la conformación estructural precisa de un grupo hemo que contiene hierro en la leghemoglobina. En algunos casos, puede sustituirse una alanina, valina, leucina o fenilalanina por una histidina en la posición 62 de la SEQ ID NO: 4. Las diferencias en la conformación estructural del grupo hemo de diferentes leghemoglobinas pueden influir en las velocidades de oxidación y reducción del hierro del hemo. Estas diferencias pueden contribuir en las propiedades de generación de color y sabor de diferentes leghemoglobinas.

En otros casos, la secuencia (aminoácido y/o ácido nucleico) de un polipéptido que contiene hemo puede ser de un organismo no vegetal, tal como de animales (por ejemplo, una vaca, un cerdo, un perro, una rata o un caballo), pescado, arqueas, protistas, bacterias, hongo, eubacterias, metazoos o levadura.

Variantes

Un polipéptido de la divulgación puede ser una variante (por ejemplo, comprende una mutación tal como una sustitución de aminoácido, por ejemplo, una sustitución de aminoácido no conservativa o conservativa, una deleción de aminoácido, una inserción de aminoácido o una secuencia no nativa). En algunos casos, una variante de polipéptido puede ser una variante de un polipéptido enumerado en la figura 9 (véase, por ejemplo, las SEQ ID NO: 1-31). En algunos casos, una variante de polipéptido puede incluir como máximo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40 ó 50 mutaciones. En algunos casos, una variante de polipéptido comprende al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40 ó 50 o más mutaciones. En algunos casos, puede mutarse al menos el 1, el 2, el 3, el 4, el 5, el 6, el 7, el 8, el 9, el 10, el 20, el 30, el 40 o el 50% de la secuencia de un polipéptido de la divulgación. En algunos casos, puede mutarse como máximo el 1, el 2, el 3, el 4, el 5, el 6, el 7, el 8, el 9, el 10, el 20, el 30, el 40 o el 50% de la secuencia de un polipéptido de la divulgación. En algunos casos, un polipéptido de la divulgación puede comprender al menos aproximadamente el 10, el 20, el 30, el 40, el 50, el 60, el 65, el 70, el 75, el 76, el 77, el 78, el 79, el 80, el 81, el 82, el 83, el 84, el 85, el 86, el 87, el 88, el 89, el 90, el 91, el 92, el 93, el 94, el 95, el 96, el 97, el 98, el 99 o el 100% de identidad de secuencia de aminoácidos con respecto a un polipéptido que se produce de manera natural de la divulgación. En algunos casos, un polipéptido de la divulgación puede comprender como máximo aproximadamente el 10, el 20, el 30, el 40, el 50, el 60, el 65, el 70, el 75, el 76, el 77, el 78, el 79, el 80, el 81, el 82, el 83, el 84, el 85, el 86, el 87, el 88, el 89, el 90, el 91, el 92, el 93, el 94, el 95, el 96, el 97, el 98, el 99 o el 100% de identidad de secuencia de aminoácidos con respecto a un polipéptido que se produce de manera natural de la divulgación.

En algunos casos, el polipéptido de la divulgación comprende una secuencia no nativa (por ejemplo, una etiqueta o un marcador). Una etiqueta puede unirse de manera covalente a la secuencia polipeptídica del polipéptido. La etiqueta puede unirse al extremo N-terminal o al extremo C-terminal, o a un aminoácido intermedio. La etiqueta puede insertarse en la secuencia polipeptídica (por ejemplo, en un bucle superficial accesible al disolvente). Los ejemplos de etiquetas pueden incluir, pero no se limitan a, etiquetas de afinidad (por ejemplo, myc, proteína de unión a maltosa o 6xhis, péptidos quelantes de metal tales como módulos de histidina-triptófano que permiten la purificación sobre metales inmovilizados, dominios de proteína A que permiten la purificación sobre inmunoglobulina inmovilizada y el dominio utilizado en el sistema de purificación por extensión/afinidad de FLAGS), y etiquetas fluorescentes (por ejemplo, proteína verde fluorescente).

Una etiqueta puede ser una composición detectable mediante medios espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, inmunoquímicos, químicos u otros físicos. Por ejemplo, las etiquetas adecuadas para su uso en la presente divulgación pueden incluir biotina, digoxigenina o haptenos, así como proteínas que pueden hacerse detectables, tintes fluorescentes (por ejemplo, isotiocianato de fluoresceína, rojo Texas, rodamina, y similares), radiomarcadores (por ejemplo, 3H, 125I, 35S, 14C o 32P), tintes (por ejemplo, alexa, cy3, cy5), conjugados químicos (por ejemplo, puntos cuánticos), enzimas (por ejemplo, peroxidasa del rábano, fosfatasa alcalina y otras usadas habitualmente en un ELISA) y marcadores colorimétricos tales como oro coloidal, vidrio coloreado o perlas de plástico (por ejemplo, poliestireno, polipropileno, látex, etc.).

Una etiqueta puede detectarse. Por ejemplo, cuando la etiqueta es radioactiva, los medios para la detección pueden incluir un contador de centelleo o una película fotográfica, como en autorradiografía. Cuando la etiqueta es una etiqueta fluorescente, puede detectarse excitando el fluorocromo con la longitud de onda apropiada de luz y detectando la fluorescencia resultante. La fluorescencia puede detectarse visualmente mediante el uso de detectores electrónicos tales como dispositivos de carga acoplada (CCD) o fotomultiplicadores, y similares. De manera similar, las etiquetas enzimáticas pueden detectarse proporcionando los sustratos apropiados para la enzima y detectando el producto de reacción resultante. Las etiquetas colorimétricas o quimioluminiscentes pueden detectarse simplemente observando el color asociado con la etiqueta.

En algunos casos, una etiqueta puede ser un péptido señal. Un péptido señal puede ser una secuencia peptídica presente normalmente en el extremo N-terminal de polipéptidos secretores o de membrana recién sintetizados que dirige al polipéptido a través de o hacia una membrana celular de la célula (la membrana plasmática en procariotas o la membrana del retículo endoplasmático en eucariotas). Posteriormente puede retirarse (por ejemplo, mediante una proteasa). En particular, el péptido señal puede ser capaz de dirigir al polipéptido hacia la ruta secretora de una célula. En algunos casos, el péptido señal es un péptido señal de ruta secretora. En algunos de tales casos, el péptido señal puede denominarse péptido señal o péptido señal de secreción.

Los ejemplos de péptidos señal pueden incluir, pero no se limitan a, los péptidos señal enumerados en la tabla 1 (SEQ ID NO: 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71,73, 75,77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91 ó 93). Los nucleótidos entre paréntesis en la tabla 1 pueden incluirse o no y, por tanto, el péptido señal puede tener o no los residuos codificados por los nucleótidos. Por ejemplo, en algunos casos, la secuencia de ácido nucleico expuesta en la SEQ ID NO: 42 no incluye los últimos 9 nucleótidos (es decir, sólo contendría los nucleótidos 1-84 de la SEQ ID NO: 42) y, por consiguiente, el péptido señal expuesto en la SEQ ID NO: 43 no incluye los últimos tres residuos (es decir, el péptido señal sólo contendría los aminoácidos 1-28 de la SEQ ID NO: 43). Por ejemplo, en algunos casos, la secuencia de ácido nucleico expuesta en la SEQ ID NO: 44 no incluye los últimos 6 nucleótidos (es decir, sólo contendría los nucleótidos 1-96 de la SEQ ID NO: 44) y, por consiguiente, el péptido señal expuesto en la SEQ ID NO: 45 no incluye los últimos dos residuos (es decir, el péptido señal sólo contendría los aminoácidos 1-32 de la SEQ ID NO: 45). Por ejemplo, en algunos casos, la secuencia de ácido nucleico expuesta en la SEQ ID NO: 54 no incluye los últimos 12 nucleótidos (es decir, sólo contendría los nucleótidos 1-156 de la SEQ ID NO: 54) y, por consiguiente, el péptido señal expuesto en la SEQ ID NO: 55 no incluye los últimos cuatro residuos (es decir, el péptido señal sólo contendría los aminoácidos 1-52 de la SEQ ID NO: 55). En algunos casos, un péptido señal puede comprender PhoD (por ejemplo, SEQ ID NO: 55 o los residuos 1-52 de la SEQ ID NO: 55). De manera similar, los péptidos señal de las SEQ ID NO: 59, 63, 65, 67, 71, 73, 75, 77, 79, 83, 85, 87 ó 93 pueden carecer de uno a cuatro aminoácidos C-terminales.

En algunos casos, un péptido señal puede ser un péptido señal variante. Un péptido señal puede ser una variante de los péptidos señal enumerados en la tabla 1 (S^eQ ID NO: 33, 35, 37, 39, 41,43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75,77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91 ó 93). En algunos casos, un péptido señal variante comprende al menos aproximadamente el 5, el 10, el 15, el 20, el 25, el 30, el 35, el 40, el 45, el 50, el 55, el 60, el 65, el 70, el 75, el 76, el 77, el 78, el 79, el 80, el 81, el 82, el 83, el 84, el 85, el 86, el 87, el 88, el 89, el 90, el 91, el 92, el 93, el 94, el 95, el 96, el 97, el 98, el 99 o el 100% de identidad de secuencia de aminoácidos con respecto a un péptido señal (por ejemplo, un péptido señal enumerado en la tabla 1). Por ejemplo, un péptido señal variante puede tener al menos aproximadamente el 20, el 25, el 30, el 35, el 40, el 45, el 50, el 55, el 60, el 65, el 70, el 75, el 76, el 77, el 78, el 79, el 80, el 81, el 82, el 83, el 84, el 85, el 86, el 87, el 88, el 89, el 90, el 91, el 92, el 93, el 94, el 95, el 96, el 97, el 98, el 99 o el 100% de identidad de secuencia con respecto a uno cualquiera de los péptidos señal expuestos en la tabla 1. En algunos casos, un péptido señal variante puede comprender como máximo aproximadamente el 5, el 10, el 15, el 20, el 25, el 30, el 35, el 40, el 45, el 50, el 55, el 60, el 65, el 70, el 75, el 76, el 77, el 78, el 79, el 80, el 81, el 82, el 83, el 84, el 85, el 86, el 87, el 88, el 89, el 90, el 91, el 92, el 93, el 94, el 95, el 96, el 97, el 98, el 99 o el 100% de identidad de secuencia de aminoácidos con respecto a un péptido señal (por ejemplo, un péptido señal enumerado en la tabla 1). En algunos casos, el sitio de escisión entre el péptido señal y el polipéptido puede derivarse del péptido señal. En algunos casos, el sitio de escisión puede ser un sitio de escisión de proteasa sintética. La escisión del péptido señal puede dar como resultado un polipéptido de la divulgación que comprende todos, algunos o ninguno de los péptidos señal. La escisión del sitio de escisión de proteasa sintética puede dar como resultado un polipéptido de la divulgación que comprende todos, algunos o ninguno de los sitios de escisión de proteasa sintética. Tabla 1: Péptidos señal a modo de ejemplo

Protoporfirinas

Un polipéptido puede unirse a un tetrapirrol (por ejemplo, protoporfirina). Un polipéptido puede unirse a una protoporfirina con su porción de unión a protoporfirina (por ejemplo, dominio). Un polipéptido puede unirse a una protoporfirina a medida que el polipéptido está traduciéndose/plegándose. Un polipéptido puede unirse a una protoporfirina después de que el polipéptido se traduzca/pliegue. Un polipéptido puede permanecer unido a una protoporfirina después de que se haya ubicado de manera subcelular (por ejemplo, ubicado en un compartimento subcelular, secretado).

Las protoporfirinas pueden comprender cadenas laterales que incluyen grupos metilo, grupos ácido propiónico y grupos vinilo. Las estructuras de protoporfirina adecuadas pueden incluir, pero no se limitan a, diyododeuteroporfirina, mesoporfirina, metaloporfirinas y protoporfirina IX. En algunos casos, un polipéptido puede unirse a más de una protoporfirina. Un polipéptido puede unirse a una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez o más protoporfirinas.

Una protoporfirina puede ser una protoporfirina IX. La protoporfirina IX (PpIX), feoforbida, un fotosensibilizador que se produce de manera natural, puede ser el precursor inmediato de hemo en la ruta biosintética de hemo. La protoporfirina IX puede denominarse hemo. El hemo puede comprender un anillo de protoporfirina y un átomo de hierro, en el que el átomo de hierro se coordina por los miembros del anillo (por ejemplo, el átomo de hierro está dentro del anillo). En algunos casos, la protoporfirina puede ser un hemo A, hemo B, hemo C, hemo D, hemo I, hemo M, hemo O o hemo S. En algunos casos, una protoporfirina puede coordinarse a un átomo distinto de hierro (es decir, metaloporfirina). Otros átomos pueden incluir, por ejemplo, zinc, gadolinio, magnesio, manganeso, cobalto, níquel, estaño y cobre.

Vectores y organismos genéticamente modificados

Ácidos nucleicos exógenos

La divulgación describe un ácido nucleico exógeno que codifica para un polipéptido de la divulgación (por ejemplo, un polipéptido que contiene hemo, una globina). Un ácido nucleico exógeno puede codificar para cualquiera de los polipéptidos que contienen hemo descritos en el presente documento, por ejemplo, un polipéptido que contiene hemo que tiene al menos aproximadamente el 60% de identidad (por ejemplo, al menos el 65%, el 75%, el 80%, el 85%, el 90%, el 95%, el 99% de identidad) con respecto a una de las secuencias de aminoácidos enumeradas en la figura 9). Un ácido nucleico exógeno puede ser ARN o ADN, y puede ser monocatenario, bicatenario y/u optimizado por codón. Una secuencia de ácido nucleico exógeno que codifica para un polipéptido de la divulgación puede transcribirse y/o traducirse. El término “polinucleótido” puede usarse de manera intercambiable en el presente documento con “ácido nucleico exógeno”.

El término “exógeno” tal como se usa en el presente documento con referencia a un ácido nucleico (o una proteína) y un huésped se refiere a un ácido nucleico que no se produce en (y no puede obtenerse de) una célula de ese tipo particular ya que se encuentra en la naturaleza o una proteína codificada por un ácido nucleico de este tipo. Por tanto, se considera que un ácido nucleico que no se produce de manera natural es exógeno con respecto al huésped una vez en el huésped. Es importante destacar que los ácidos nucleicos que no se producen de manera natural pueden contener subsecuencias de ácido nucleico o fragmentos de secuencias de ácido nucleico que se encuentran en la naturaleza siempre que el ácido nucleico como conjunto no exista en la naturaleza. Por ejemplo, una molécula de ácido nucleico que contiene una secuencia de ADNc dentro de un vector de expresión es un ácido nucleico que no se produce de manera natural, y por tanto es exógeno con respecto a una célula huésped una vez se introduce en el huésped, ya que esa molécula de ácido nucleico como conjunto (ADNc más ADN de vector) no existe en la naturaleza. Por tanto, se considera que cualquier vector, plásmido que se replica de manera autónoma o virus (por ejemplo, retrovirus, adenovirus o virus del herpes) que como conjunto no existe en la naturaleza es un ácido nucleico que no se produce de manera natural. Se deduce que los fragmentos de ADN genómico producidos mediante PCR o tratamiento con endonucleasa de restricción así como ADNc se consideran como un ácido nucleico que no se produce de manera natural ya que existen como moléculas independientes no encontradas en la naturaleza. También se deduce que cualquier ácido nucleico que contiene un elemento regulador (por ejemplo, una secuencia de promotor y/o una secuencia señal) y una secuencia que codifica para un polipéptido que contiene hemo (por ejemplo, ADNc o ADN genómico) en una disposición no encontrada en la naturaleza es un ácido nucleico que no se produce de manera natural. Un ácido nucleico que se produce de manera natural puede ser exógeno con respecto a un huésped particular (por ejemplo, bacterias o planta). Por ejemplo, un cromosoma completo aislado de una célula de la planta x es un ácido nucleico exógeno con respecto a una célula de la planta y una vez que se introduce el cromosoma en una célula de la planta y.

En cambio, el término “endógeno” tal como se usa en el presente documento con referencia a un ácido nucleico (por ejemplo, un gen) (o una proteína) y un huésped se refiere a un ácido nucleico (o proteína) que no se produce en (y puede obtenerse de) ese huésped particular ya que se encuentra en la naturaleza. Además, una célula “que expresa de manera endógena” un ácido nucleico (o proteína) expresa ese ácido nucleico (o proteína) tal como lo hace un huésped del mismo tipo particular ya que se encuentra en la naturaleza. Además, un huésped “de producción endógena” o que “produce de manera endógena” un ácido nucleico, una proteína u otro compuesto produce ese ácido nucleico, proteína o compuesto tal como lo hace un huésped del mismo tipo particular ya que se encuentra en la naturaleza.

El código degenerado del código genético puede permitir variaciones de la secuencia de nucleótidos, mientras que aún produce un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos idéntica que la del polipéptido codificado por la secuencia de polinucleótido nativa. Las variaciones en la secuencia de polinucleótido pueden personalizarse para cualquier organismo de interés. En algunos casos, un polinucleótido que codifica para un polipéptido puede optimizarse por codón para la expresión en una bacteria (por ejemplo, una bacteria gram positiva tal como B. subtilis). En algunos casos, un polinucleótido que codifica para un polipéptido puede optimizarse por codón para la expresión en una planta (por ejemplo, N. tabacum).

La frecuencia de codones sinónimos individuales para aminoácidos relacionados varía ampliamente de genoma a genoma entre eucariotas y procariotas. Estas diferencias en patrones de elección de codones pueden contribuir a los niveles de expresión globales de genes individuales modulando las tasas de elongación de péptidos.

Vectores bacterianos

Tal como se describe en el presente documento, un ácido nucleico exógeno puede incluir un ácido nucleico que codifica para un péptido señal y un ácido nucleico que codifica para un polipéptido que contiene hemo. En algunos casos, el ácido nucleico exógeno es un vector. Un vector puede ser adecuado para la expresión en un procariota (por ejemplo, bacterias).

En general, los vectores dados a conocer en el presente documento comprenden secuencias de control reguladoras, (por ejemplo, secuencias de control transcripcionales o traduccionales) requeridas para la expresión del polipéptido. Las secuencias de control reguladoras adecuadas pueden incluir, pero no se limitan a, origen de replicación, promotor, potenciador, regiones de unión al represor, sitios de inicio de la transcripción, sitio de unión al ribosoma, sitios de inicio de la traducción o sitios de terminación para la transcripción y traducción.

En algunas variantes, el vector puede comprender una secuencia de polinucleótido que codifica para dos o más polipéptidos (por ejemplo, polipéptidos que contienen hemo o enzimas de la ruta de biosíntesis de hemo), que pueden estar presentes en el mismo vector. En algunas variantes, cuando están presentes en el mismo vector, los polinucleótidos se disponen de tal manera que forman un operón (es decir, la transcripción de los polinucleótidos generará un ARN mensajero policistrónico). En algunos casos, los dos o más polinucleótidos pueden disponerse en el mismo vector de tal manera que se ligan operativamente a su propio promotor.

El origen de la replicación (generalmente denominado secuencia ori) puede permitir la replicación del vector en una célula huésped. La elección de ori puede depender del tipo de células huésped que se emplean. Cuando las células huésped son procariotas, el vector de expresión puede comprender una replicación autónoma que dirige la ori del vector dentro de las células procariotas. Los ejemplos no limitativos de esta clase de ori incluyen pMBl, pUC, ColE1 así como otros orígenes bacterianos.

La célula huésped puede comprender un polinucleótido que codifica para un polipéptido de la divulgación para producción recombinante, en la que el polipéptido puede ligarse a una secuencia señal funcional (por ejemplo, una secuencia que codifica para un péptido señal). Las secuencias que codifican para péptidos señal pueden incluir, por ejemplo, aquellas derivadas de spA, phoA, proteína de unión a ribosa, pelB, ompA, ompT, dsbA, torA, torT y tolT, los péptidos señal enumerados en la tabla 1 o los péptidos señal de la ruta de secreción de TAT en bacterias. También se incluyen dentro del alcance de la divulgación secuencias señal derivadas de células eucariotas que también funcionan como secuencias señal en células huésped procariotas.

Los vectores pueden comprender un marcador seleccionable tal como un gen que codifica para una proteína necesaria para la supervivencia o el crecimiento de una célula huésped transformada con el vector. Un gen marcador puede transportarse en otra secuencia de polinucleótido introducida conjuntamente en la célula huésped. Sólo aquellas células huésped en las que se ha introducido un gen seleccionable pueden sobrevivir y/o crecer en condiciones selectivas. Los genes de selección típicos pueden codificar proteína(s) que (a) confieren resistencia al tratamiento con antibióticos u otras toxinas (por ejemplo, ampicilina, kanamicina, neomicina, G418, metotrexato, etc.); (b) deficiencias auxotróficas del complemento; o (c) suministro de nutrientes críticos no disponible a partir de medios complejos.

El vector puede comprender una secuencia de polinucleótido que codifica para una etiqueta. Una secuencia de etiqueta puede estar en marco con respecto a la secuencia codificante del polipéptido de la divulgación, de tal manera que tras la traducción de la secuencia, el polipéptido de la divulgación se une de manera covalente, por ejemplo, se fusiona, a la etiqueta (por ejemplo, es una proteína de fusión). La etiqueta puede separarse del polipéptido de la divulgación mediante un ligador, por ejemplo, un ligador polipeptídico. Un vector puede comprender una secuencia de polinucleótido que codifica para un ligador entre la secuencia que codifica para la etiqueta y la secuencia que codifica para el polipéptido de la divulgación.

Los vectores descritos en el presente documento pueden obtenerse usando métodos de clonación recombinante y/o mediante síntesis química. Las técnicas de clonación recombinante pueden incluir PCR, digestión con endonucleasa de restricción y ligación. Pueden usarse datos de secuencia, que pueden localizarse en las bases de datos públicas o privadas, para obtener un vector deseado mediante cualquier medio de síntesis. Adicionalmente, usando técnicas de restricción y ligación, pueden escindirse secuencias apropiadas de diversas fuentes de ADN e integrarse en relación operativa con las secuencias exógenas que van a expresarse según la presente divulgación.

En algunos casos, el vector puede comprender un elemento regulador (también denominado elemento de control regulador en el presente documento). Un elemento regulador puede incluir, por ejemplo, origen de replicación, promotores, cajas TATA, potenciadores, sitios de unión al ribosoma, regiones de unión al represor, sitios de inicio de la transcripción, sitios de terminación de la transcripción, secuencias no nativas (por ejemplo, etiquetas) y regiones sin traducir. En algunos casos, el elemento regulador puede ser un promotor. Un promotor puede ser constitutivo, inducible y/o específico de tejido. Los promotores a modo de ejemplo pueden incluir tanto promotores constitutivos como promotores inducibles. Un promotor natural puede modificarse mediante reemplazo, sustitución, adición o eliminación de uno o más nucleótidos sin cambiar su función.

En algunas variantes, además de una secuencia promotora, la secuencia de polinucleótido también incluye una región de terminación de la transcripción en el sentido de 3’ de la secuencia de ácido nucleico que codifica para el polipéptido para proporcionar una terminación eficiente. En algunas variantes, la región de terminación puede obtenerse a partir del mismo gen que la secuencia promotora, mientras que en otras variantes puede obtenerse a partir de otro gen.

En algunos casos, el vector puede comprender una secuencia de polinucleótido que codifica para un polipéptido de la divulgación y una etiqueta. En algunos casos, la etiqueta puede ser un péptido señal.

En algunas variantes, una vez que se obtiene la forma deseada de un polipéptido, una secuencia de ácido nucleico, un homólogo, una variante o fragmento del mismo, puede modificarse de varias maneras. Cuando la secuencia implica regiones flanqueantes no codificantes, las regiones flanqueantes pueden someterse a resección, mutagénesis, etc. Por tanto, pueden realizarse transiciones, transversiones, deleciones e inserciones en la secuencia que se produce de manera natural.

En algunas variantes particulares, un polinucleótido que codifica para un polipéptido puede incluir la secuencia codificante para al menos un polipéptido (por ejemplo, globina), o variante(s), fragmento(s) o variante(s) de corte y empalme del mismo: (i) en aislamiento; (ii) en combinación con secuencias codificantes adicionales; tales como secuencias codificantes de proteínas de fusión o péptidos señal, en las que la secuencia codificante del polipéptido es la secuencia codificante dominante; y/o (iii) en combinación con secuencias no codificantes, tales como elementos de control, tales como elementos promotores y terminadores o regiones sin traducir en 5’ y/o 3’, eficaces para la expresión de la secuencia codificante en un huésped adecuado.

En algunas variantes, puede introducirse un polinucleótido que codifica para un polipéptido, junto con secuencias promotoras y de control apropiadas, en células huésped bacterianas para permitir que las células expresen al menos un polipéptido (por ejemplo, globina) o una variante del mismo.

Pueden incorporarse en vectores fragmentos de polinucleótidos naturales o sintéticos que codifican para un polipéptido (por ejemplo, un polipéptido que contiene hemo, una globina), que pueden introducirse en, y replicarse en, una célula bacteriana. Puede usarse cualquier vector siempre que pueda replicarse y sea viable en las células en las que se introduce. Puede insertarse la secuencia de ADN apropiada en un plásmido o vector mediante cualquier método adecuado. En general, la secuencia de ADN se inserta en un sitio o sitios de endonucleasa de restricción apropiado(s) mediante técnicas de biología molecular recombinante.

En algunos casos, la divulgación describe un organismo genéticamente modificado. En algunos casos, un organismo genéticamente modificado puede comprender un polipéptido de la divulgación. Un organismo genéticamente modificado puede comprender un polinucleótido que codifica para un polipéptido que contiene hemo.

Vectores vegetales

La presente divulgación describe vectores para la introducción de ácido nucleico exógeno en un método según la divulgación que pueden encontrar uso en la expresión de un ácido nucleico en una célula vegetal, tejidos vegetales específicos tales como la hoja, la raíz, la semilla o el grano, o un compartimento específico de una célula vegetal. En el presente documento se dan a conocer células vegetales y plantas transgénicas que comprenden al menos un ácido nucleico exógeno. Tal como se describe en el presente documento, un ácido nucleico exógeno puede incluir un ácido nucleico que codifica para un péptido señal y un ácido nucleico que codifica para un polipéptido que contiene hemo. Una planta o célula vegetal puede transformarse teniendo un constructo integrado en su genoma, es decir, puede transformarse de manera estable. Las células transformadas de manera estable mantienen normalmente el ácido nucleico introducido con cada división celular. Una planta o célula vegetal también puede transformarse de manera transitoria de tal manera que el constructo no se integra en su genoma. Las células transformadas de manera transitoria pierden normalmente todo o alguna porción del constructo de ácido nucleico introducido con cada división celular de tal manera que el ácido nucleico introducido no puede detectarse en células hijas después de un número suficiente de divisiones celulares. Las plantas y células vegetales transgénicas tanto transformadas de manera transitoria como transformadas de manera estable pueden ser útiles en los métodos descritos en el presente documento.

Normalmente, las células vegetales transgénicas usadas en los métodos descritos en el presente documento constituyen parte o toda de una planta completa. Tales plantas pueden hacerse crecer de una manera adecuada para las especies en consideración, o bien en una cámara de crecimiento, en un invernadero o en un campo. Las plantas transgénicas pueden cultivarse según se desee para un fin particular, por ejemplo, introducir un ácido nucleico recombinante en otras líneas, transferir un ácido nucleico recombinante a otras especies o producir el polipéptido deseado. Alternativamente, las plantas transgénicas pueden propagarse de manera vegetativa para aquellas especies susceptibles a tales técnicas. La progenie incluye descendientes de una planta o línea de plantas particular siempre que la progenie herede el transgén. La progenie de una planta instantánea incluye semillas formadas en plantas de la generación F1, F2, F3, F4, F5, F6 y posteriores, o semillas formadas en plantas de la generación BC1, BC2, BC3 y posteriores, o semillas formadas en plantas de la generación F1BC1, F1BC2, F1BC3 y posteriores. Las semillas producidas por una planta transgénica pueden hacerse crecer y luego autosembrarse (o cruzarse y autosembrarse) para obtener semillas homocigotas para el ácido nucleico exógeno.

Las células vegetales transgénicas que se hacen crecer en cultivo de suspensión, o cultivo de tejidos u órganos, pueden ser útiles para la extracción de polipéptidos. Pueden usarse técnicas de cultivo de tejidos sólidos y/o líquidos. Cuando se usa un medio sólido, pueden colocarse células vegetales transgénicas directamente sobre el medio o pueden colocarse sobre una película de filtro que luego se pone en contacto con el medio. Cuando se usa un medio líquido, pueden colocarse células vegetales transgénicas sobre un dispositivo de flotación, por ejemplo, una membrana porosa que está en contacto con el medio líquido. El medio sólido se elabora normalmente a partir de medio líquido al añadir agar. Por ejemplo, un medio sólido puede ser medio Murashige y Skoog (MS) que contiene agar y una concentración adecuada de una auxina, por ejemplo, ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D), y una concentración adecuada de una citocinina, por ejemplo, cinetina.

En algunas variantes, la divulgación describe un método en el que las células de Agrobacterium comprenden un vector que comprende elementos de secuencia, que son esenciales para el mantenimiento y la replicación del plásmido en células de Escherichia coli y/o Agrobacterium, y para la transferencia de un ADN-T a una célula vegetal, y además una región de ADN-T, que comprende la secuencia codificante de un polipéptido que está bajo control de elementos reguladores funcionales en una planta y, opcionalmente, un gen marcador seleccionable vegetal.

En cualquiera de los métodos de transformación, el vector puede incluir un marcador seleccionable vegetal tal como un marcador seleccionable basado en antibióticos (por ejemplo, espectinomicina, kanamicina, estreptomicina). Un marcador seleccionable vegetal puede ser un marcador de proteína fluorescente y/o un marcador colorimétrico (por ejemplo, LacZ). En algunos casos, un marcador seleccionable vegetal puede comprender una péptido deformilasa. La péptido deformilasa puede hidrolizar el grupo N-formilo en una metionina de inicio. La actividad de la péptido deformilasa puede ser esencial para la viabilidad celular. Una péptido deformilasa puede originarse a partir de varios genes incluyendo DEF1 y DEF2. Las plantas que expresan un marcador seleccionable de péptido deformilasa pueden ser resistentes a los inhibidores de péptido deformilasa (por ejemplo, actinonina). Los genes de marcador seleccionable pueden escindirse. La escisión puede producirse mediante recombinación específica de sitio (por ejemplo, recombinación de Cre, Int), transposones (por ejemplo, transposones de la familia Ac/Ds), meganucleasas (por ejemplo, endonucleasas de alojamiento, I-sceI), recombinación homóloga intracromosómica, las endonucleasas Cas9/CRISPR y/o dedos de zinc. Véase, por ejemplo, la discusión a continuación sobre recombinación homóloga.

En algunos casos, se utiliza la rotura específica de sitio en el genoma de la planta o bien para potenciar en gran medida la mutación/el reemplazo basado en recombinación homóloga dirigida de secuencias endógenas (es decir, para reprogramar un gen de globina) o bien para potenciar en gran medida las tasas de mutación o recombinación en sitios específicos (por ejemplo, promotor de genes de globina o promotor de genes de globina/promotor de un gen altamente expresado en el endospermo para redireccionar la expresión de la globina a semillas u otros tejidos seleccionados como diana). La rotura específica de sitio puede producirse mediante TALENS (endonucleasas derivadas de factores de transcripción de plantas que explotan un sistema simple para diseñar elementos de reconocimiento de ADN para crear endonucleasas sintéticas con especificad suficientemente alta para escindir un solo sitio genómico in vivo) o el sistema Cas9/Crispr.

En algunos casos, un vector puede comprender uno o más de los siguientes elementos de ácido nucleico: a) un primer elemento de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para un marcador seleccionable (por ejemplo, que puede ser funcional en las especies Escherichia coli y/o Agrobacterium); b) un segundo elemento de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos de un primer origen de replicación que puede ser funcional en Escherichia coli; c) un tercer elemento de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para una proteína iniciadora de la replicación; y/o d) un cuarto elemento de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos de un segundo origen de replicación, que puede ser diferente del primer origen de replicación y que es funcional en Agrobacterium, en el que los elementos de ácido nucleico anteriores se proporcionan en una molécula de polinucleótido circular y se separan mediante secuencias de nucleótidos espaciadoras que no tienen función en la replicación, el mantenimiento o la transferencia de ácidos nucleicos, y en el que dichas secuencias de nucleótidos espaciadoras representan menos del 20%, el 25%, el 30%, el 35%, el 40% o el 45% del tamaño total del vector.

La divulgación describe un método, en el que las secuencias reguladoras que funcionan en una planta o una célula vegetal incluyen un promotor que puede dirigir y/o controlar la expresión de un gene de interés. Los promotores adecuados pueden incluir promotores del virus del mosaico de Mirabilis (MMV), virus del mosaico de escrofulariáceas (FMV) o caulimovirus del rayado clorótico del cacahuete (PCLSV). Otros ejemplos de promotores adecuados pueden incluir un promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor, un promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor modificado, un promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor doble, un promotor 35S mínimo, promotor de nopalina sintasa, un promotor del virus del mosaico del caupí, un promotor de HT-CPMV, un promotor CPS2p de copalil sintasa del tabaco, un promotor de dihidrinina, un promotor de plastocianina, un promotor de 35S/HT-CPMV, promotores de transcrito de cadena completa (FLt), promotores de transcrito subgenómico y muchos otros promotores que se derivan de virus de ADN pertenecientes a la familia de virus Caulimoviridae.

Muchos de tales promotores pueden modificarse ligando múltiples copias, por ejemplo, dos copias, de su secuencia potenciadora en tándem para potenciar la actividad del promotor, tal como, pero sin limitarse a, promotor 35S de CaMV doble (35Sx2), promotor de MMV doble (MMVx2) o promotor de FMV doble (FMVx2). Pueden usarse fragmentos funcionales de estos promotores en el vector de la divulgación. También pueden usarse secuencias de nucleótidos que son al menos el 90%, el 95%, el 96%, el 97%, el 98%, el 99% o el 100% idénticas a estas secuencias promotoras y que son funcionales en permitir la expresión en plantas de la secuencia de nucleótidos ligada operativamente en los vectores de la divulgación.

Los vectores de expresión vegetales que pueden ser funcionales en una célula vegetal y que pueden usarse dentro del método de la presente divulgación con el fin de dirigir y/o controlar la expresión de un gen de interés en una planta también pueden comprender, si se desea, una región reguladora del promotor (por ejemplo, una expresión inducible o constitutiva, regulada por el entorno o el desarrollo, o específica de célula o tejido), un sitio de inicio de la transcripción, un sitio de unión al ribosoma, una señal de procesamiento de ARN, un sitio de terminación de la transcripción y/o una señal de poliadenilación. Los elementos reguladores que van a usarse dentro de los métodos de la divulgación pueden estar presentes en una molécula de vector (por ejemplo, vector binario) ligada operativamente a una secuencia de nucleótidos que codifica para un polipéptido de la divulgación. En algunos casos, un elemento regulador puede estar presente en la región de ADN-T de un vector binario (por ejemplo, un vector binario de tamaño mínimo).

En algunos casos, los promotores que controlan la expresión génica lo hacen de manera dependiente de tejido y según la etapa de desarrollo de la planta. Las secuencias de transgenes de la divulgación impulsadas por este tipo de promotores pueden expresarse en tejidos en los que se desea el producto transgénico, dejando el resto de los tejidos en la planta sin modificar mediante la expresión transgénica. Los promotores específicos de tejido pueden inducirse por factores endógenos o exógenos. Los ejemplos específicos de tejido pueden incluir, pero no se limitan a, promotores del gen de la beta-amilasa o gen de hordeína de la cebada (para la expresión génica en semillas), promotores de los genes pz7 y pz130 del tomate (para la expresión génica en ovarios), promotor del gen RD2 del tabaco (para expresión génica en raíces), promotor de TRX en el plátano y promotor de actina en el melón (para expresión génica en frutos). En algunas variantes, los promotores específicos de tejido pueden elegirse para dirigir la expresión del polipéptido a partes voluminosas y fácilmente cosechables de la planta tales como las semillas, los frutos, los tubérculos y las hojas.

Los vectores de expresión vegetales pueden comprender además una secuencia de nucleótidos que codifica para un péptido señal que puede dirigir la proteína recién expresada a una ubicación subcelular. Los péptidos señal que pueden usarse dentro de tales moléculas de vector pueden ser, por ejemplo, un secuencia de direccionamiento de vacuolas, una secuencia de direccionamiento de cloroplastos, una secuencia de direccionamiento de mitocondrias, una secuencia que induce la formación de cuerpos proteicos en una célula vegetal, una secuencia que induce el direccionamiento específico de la proteína fusionada en los mismos a un orgánulo específico dentro de la planta o célula vegetal, o una secuencia que induce la formación de esferosomas en una célula vegetal.

En algunos casos, la secuencia de direccionamiento puede ser un péptido señal para la exportación de una proteína al espacio extracelular. Los péptidos señal pueden ser péptidos transitorios que se ubican en el extremo N-terminal de una proteína y se escinden de manera cotraduccional durante la translocación a través de una membrana plasmática.

En algunas variantes, el péptido señal puede ser una secuencia que cuando se fusiona a una proteína da como resultado la formación de orgánulos de almacenamiento no secretores en el retículo endoplasmático.

Los ácidos nucleicos endógenos pueden modificarse mediante técnicas de recombinación homóloga. Por ejemplo, pueden usarse endonucleasas específicas de secuencia (por ejemplo, nucleasas de dedos de zinc (ZFN)) y meganucleasas para estimular la recombinación homóloga en genes vegetales endógenos. Véanse, por ejemplo, Townsend et al., Nature 459:442-445 (2009); Tovkach et al., Plant J., 57:747-75725 (2009); y Lloyd et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 102:2232-2237 (2005). También pueden usarse técnicas de edición del genoma de CRISPR Cas (Xie y Yang, Mol. Plant 2013, 6:1975-1983) y TALEN (Zhang et al., Plant Physiology 2013 161:20-27) para reemplazar un ácido nucleico endógeno.

En algunas variantes, el vector puede comprender además en la región de ADN-T un sitio de recombinación específica de sitio para la recombinación específica de sitio. En algunas variantes, el sitio de recombinación específica de sitio puede ubicarse en el sentido de 3’ del elemento regulador de la planta. En algunas variantes, el sitio de recombinación específica de sitio puede ubicarse en el sentido de 5’ del elemento regulador de la planta. En algunas variantes, el sitio de recombinación puede ser un sitio LoxP y una parte de un sistema de recombinación específica de sitio Cre-Lox. El sistema de recombinación específico de sitio Cre-Lox puede usar una recombinasa cíclica (Cre), que puede catalizar la recombinación entre sitios específicos (LoxP) que comprenden sitios de unión específicos para Cre.

En algunas variantes, el sitio de recombinación puede ser un sitio de destino Gateway. Por ejemplo, pueden clonarse polinucleótidos en un “vector de entrada” disponible comercialmente y recombinarse posteriormente en un “vector de destino”. El vector de destino puede usarse para el análisis de la actividad promotora de una secuencia de ácido nucleico dada o de varias secuencias, para el análisis de la función, para la ubicación de proteínas, para la interacción proteína-proteína, para el silenciamiento de un gen dado o para experimentos de purificación por afinidad. La tecnología de clonación Gateway puede adquirirse de Invitrogen Inc., EE.UU.

En algunas variantes, se crean lesiones dirigidas mediante recombinación homóloga u otras técnicas de edición génica en la proximidad de un ácido nucleico endógeno que codifica para una hemoproteína o globina y en la proximidad de promotores específicos de tejido deseados y se seleccionan mutantes para la expresión de la hemoproteína o globina endógena deseada en tejidos abundantes y accesibles. En algunas variantes, se crean lesiones dirigidas en la proximidad de promotores específicos de tejido deseados y se seleccionan mutantes para la expresión de la hemoproteína o globina endógen deseada en tejidos abundantes y accesibles. Los ejemplos de métodos para crear estas lesiones dirigidas incluyen, pero no se limitan a, TALENS y el sistema cas9/crispr tal como se comentó anteriormente.

En algunas variantes, las plantas resultantes pueden contener más proteína diana que la planta original. Por ejemplo, la planta resultante puede expresar más de 2X el nivel de la proteína diana nativa en comparación con la planta original. En algunas variantes, la planta resultante puede expresar la proteína diana nativa en un tejido, tal como la semilla o la hoja, en la que no se encuentra normalmente. La proteína diana nativa puede expresarse en un tejido que no se encuentra normalmente 1 vez, 2 veces, 3 veces, 4, veces, 5 veces, 6 veces, 7 veces, 8 veces, 9 veces, 10 veces o más mayor o menor que los niveles de la proteína diana nativa en el tejido en el que se encuentra normalmente. En algunas variantes, la proteína diana es una hemoglobina tal como la leghemoglobina de Glycine max (por ejemplo, SEQ ID NO: 4) o la hemoglobina no simbiótica de la cebada (SEQ ID NO: 5) producidas en plantas de soja o cebada modificadas por ingeniería genética, respectivamente.

En algunas variantes, la planta resultante no contiene ADN foráneo. En algunos casos, pueden usarse lesiones en la proximidad del polipéptido endógeno de la divulgación y/o promotores específicos de tejido para la modificación por ingeniería genética de la expresión del polipéptido de la divulgación. Los métodos para evaluar este tipo de modificación por ingeniería genética pueden incluir la selección para la producción del polipéptido endógeno.

Métodos de expresión en bacterias

La divulgación describe métodos para la expresión de un polipéptido (por ejemplo, globina) en una célula huésped (por ejemplo, bacterias). Las bacterias adecuadas para la expresión de un polipéptido de la divulgación pueden ser bacterias gram negativas o gram positivas. Por ejemplo, las bacterias pueden ser de una especie de Escherichia (por ejemplo, E. coli) o de una especie de Bacillus (por ejemplo, B. subtilis, B. licheniformis, B. lentus, B. brevis, B. stearothermophilus, B. alkalophilus, B. amyloliquefaciens, B. clausii, B. coagulans, B. circulans, B. lautus, B. megaterium o B. thuringiensis). En algunos casos, las bacterias adecuadas para la expresión de un polipéptido de la divulgación pueden ser B. subtilis.

En algunos casos, la expresión de un polipéptido puede incluir la introducción de un vector que comprende una secuencia de polinucleótido que codifica para el polipéptido en la célula huésped, y la inducción de la expresión del polipéptido.

En algunas variantes, los métodos de la divulgación describen una célula huésped que comprende una secuencia integrada de manera estable de interés (es decir, ácido nucleico que codifica para un polipéptido). Sin embargo, en casos alternativos, los métodos de la presente divulgación describen el mantenimiento de un vector de transformación extracromosómico de autorreplicación.

Los métodos de introducción del polinucleótido en células para la expresión de la secuencia de polinucleótido pueden incluir, pero no se limitan a, electroporación, transformación, transducción, bombardeo de alta velocidad con microproyectiles recubiertos de ADN, infección con ácidos nucleicos virales modificados (por ejemplo, fago); transformación mediada químicamente o competencia. En algunos casos, los polinucleótidos que codifican para un polipéptido de la divulgación pueden transcribirse in vitro, y el ARN resultante puede introducirse en la célula huésped.

Tras la introducción de un polinucleótido que comprende la secuencia codificante para un polipéptido de la divulgación, la célula huésped puede cultivarse en medios de nutrientes convencionales modificados según sea apropiado para activar promotores, seleccionar transformantes y/o amplificar la expresión de un polinucleótido que codifica para un polipéptido. Las condiciones de cultivo, tales como temperatura, pH y similares, pueden ser aquellas usadas previamente para la célula huésped seleccionada para la expresión. Puede considerarse que la progenie de células en las que se han introducido tales constructos de polinucleótido comprende el polinucleótido que codifica para un polipéptido.

En algunas variantes, el polipéptido o la variante del mismo puede expresarse como una proteína de fusión por la célula bacteriana huésped. Aunque la escisión del polipéptido de fusión para liberar la proteína deseada a menudo puede ser útil, no es necesaria. Los polipéptidos y las variantes de los mismos expresados y secretados como proteínas de fusión pueden mantener su función.

La expresión de un polipéptido de la divulgación puede comprender expresión transitoria y/o expresión constitutiva (por ejemplo, desarrollo de una línea celular estable).

Expresión de polipéptidos recombinantes

La expresión de un polipéptido puede comprender la inducción de la célula huésped para transcribir y/o traducir el polipéptido codificado en el polinucleótido introducido en la célula huésped. La inducción puede producirse después de que la célula huésped se haya cultivado durante al menos aproximadamente 0,1, 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 ó 20 o más horas. La inducción puede producirse después de que el cultivo de células huésped tenga una densidad óptica (D.O.) de al menos aproximadamente 0,1,0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4 ó 1,5 o más. La inducción puede producirse después de que el cultivo de células huésped tenga una densidad óptica (D.O.) de como máximo aproximadamente 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 2, 3, 5, 10 ó 20 o más. La inducción puede provocarse por la adición de sustancias químicas tales como IPTG, arabinosa o en respuesta a un nutriente limitante tal como nitrógeno, fósforo, glucosa u oxígeno. En algunos casos, el polipéptido se liga a un promotor, tal como aprE, liaG, lepA, cry3Aa o gsiB que conduce a la expresión constitutiva del polipéptido.

En algunos casos, pueden añadirse agentes químicos a los medios. En algunos casos, los agentes químicos pueden ayudar en la estabilidad, el contenido de hemo y/o la capacidad de plegamiento de proteínas del polipéptido expresado. Un agente químico puede comprender una molécula pequeña tal como un metal. Los ejemplos de metales adecuados para la adición a los medios pueden incluir fluoruros de hierro (difluoruro de hierro, trifluoruro de hierro), dicloruro de hierro, tricloruro de hierro, dibromuro de hierro, tribromuro de hierro, diyoduro de hierro, triyoduro de hierro, óxido de hierro, trióxido de dihierro, tetraóxido de trihierro, sulfuro de hierro, persulfuro de hierro, seleniuro de hierro, teluluro de hierro, nitruro de dihierro, pentacarbonilo de hierro, nonacarbonilo de dihierro, dodecacarbonilo de trihierro, dicloruro de hierro dihidratado, trifluoruro de hierro trihidratado, dibromuro de hierro hexahidratado, dicloruro de hierro tetrahidratado, nitrato de hierro hexahidratado, tricloruro de hierro hexahidratado, difluoruro de hierro tetrahidratado, sulfato de hierro heptahidratado, trinitrato de hierro nonahidratado, trisulfato de dihierro nonahidratado, cromato de hierro, citrato de hierro, gluconato de hierro, hexahidruro de hierro y magnesio, lactato de hierro, fosfato de hierro, pentacarbonilo de hierro, sulfato de hierro y amonio, citrato férrico y de amonio, oxalato férrico y difosfato de trihierro octahidratado.

Puede añadirse un agente químico a los medios a una concentración final de al menos aproximadamente 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 5,0, 10,0 o más milimolar. Puede añadirse un agente químico a los medios a una concentración final de como máximo aproximadamente 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 5,0, 10,0 o más milimolar.

En algunos casos, un agente químico puede ser un derivado de hemo. Un derivado de hemo puede aumentar el contenido de hemo del polipéptido expresado (por ejemplo, aumentar el número de moléculas de globina que comprenden un hemo). Los derivados de hemo adecuados pueden incluir ácido delta-aminolevulínico, derivados de hemo A, derivados de hemo B, derivados de hemo C, derivados de hemo O, precursores de hemo, derivados de hemo I, derivados de hemo M, derivados de hemo D y derivados de hemo S. Puede añadirse un derivado de hemo a los medios a una concentración final de al menos aproximadamente 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1.2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 5,0, 10,0 o más milimolar. Puede añadirse un derivado de hemo a los medios a una concentración final de como máximo aproximadamente 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1.3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 5,0, 10,0 o más milimolar. En algunos casos, no se añade derivado de hemo a los medios.

Después de la inducción del polipéptido, la célula huésped puede cultivarse durante un periodo de tiempo que favorezca los niveles de expresión máximos del polipéptido. Por ejemplo, un polipéptido puede expresarse durante al menos aproximadamente 0,1 horas, 0,5 horas, 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas,

8 horas, 9 horas, 10 horas, 11 horas, 12 horas, 13 horas, 14 horas, 15 horas, 16 horas, 17 horas, 18 horas,

19 horas, 20 horas, 21 horas, 22 horas, 23 horas, 24 horas, 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 7 días,

1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 7 semanas, 8 semanas, 9 semanas, 10 o más semanas. Un polipéptido puede expresarse en una célula huésped durante como máximo aproximadamente al menos aproximadamente 0,1 horas, 0,5 horas, 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 8 horas,

9 horas, 10 horas, 11 horas, 12 horas, 13 horas, 14 horas, 15 horas, 16 horas, 17 horas, 18 horas, 19 horas,

20 horas, 21 horas, 22 horas, 23 horas, 24 horas, 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 7 días, 1 semana,

2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 7 semanas, 8 semanas, 9 semanas, o 10 o más semanas.

Un polipéptido puede expresarse a una variedad de temperaturas. Un polipéptido puede expresarse a una temperatura de al menos aproximadamente 4, 10, 16, 18, 21, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38,

39, 40, 42, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ó 50°C. Un polipéptido puede expresarse a una temperatura de como máximo aproximadamente 4, 10, 16, 18, 21, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 42, 42, 43,

44, 45, 46, 47, 48, 49 ó 502C.

Las proteínas auxiliares tales como tiol-disulfuro oxidorreductasas o chaperonas pueden ser beneficiosas para ayudar al pliegue del polipéptido en su conformación activa. Las tiol-disulfuro oxidorreductasas y las proteína disulfuro isomerasas pueden catalizar la formación de los enlaces disulfuro correctos en la proteína. Se ha demostrado que la expresión del operón bdbDC en B. subtilis es beneficiosa para la producción de un polipéptido con enlaces disulfuro. Las chaperonas pueden ayudar al pliegue de la proteína secretora uniéndose a las regiones hidrófobas expuestas en los estados no plegados y evitando interacciones no favorables, y las prolilpeptidil cis-trans isomerasas ayudan en la formación de la conformación apropiada de la cadena peptídica adyacente a residuos de prolina. En algunas variantes, las células huésped pueden transformarse con un vector de expresión que codifica para al menos una tiol-disulfuro oxidorreductasa o chaperona.

En algunos casos, puede aumentarse la fracción de polipéptido plegado de manera adecuada mediante la adición de sustancia químicas al medio de crecimiento que reducen/oxidan los enlaces disulfuro y/o alteran el potencial rédox general, y/o sustancias químicas que alteran las propiedades del disolvente afectando de ese modo a la conformación y agregación de las proteínas. En algunos casos, un reactivo que reduce los enlaces disulfuro, tal como 2-mercaptoetanol, puede aumentar la fracción de proteína plegada correctamente. En algunos casos y dependiendo del medio usado, otros agentes de reducción u oxidación de disulfuro (por ejemplo, DTT, TCEP, glutatión reducido y oxidado, cisterna, cistina, cisteamina, tioglicolato, S2O3 , S2O4 , S2O5 , SO3 usados o bien solos o bien en combinación, pueden encontrar uso en la presente divulgación. Puede contemplarse que otros adyuvantes que alteran las propiedades del disolvente (por ejemplo, urea, DMSO, TWEEN®-80, etc.), añadidos al medio de crecimiento o bien solos o bien preferiblemente en combinación con agentes de reducción/oxidación de disulfuro, tales como PME, también pueden aumentar la fracción de proteína secretora plegada correctamente y encontrar uso en diversos casos de la presente divulgación. En algunos casos, puede usarse PME a concentraciones que oscilan entre 0,5 y 4 mM, o entre aproximadamente 0,1 mM y 10 mM.

El polipéptido puede recuperarse del cultivo (por ejemplo, mediante centrifugación, purificación, etc.), tal como se describe a continuación y en el presente documento.

Parámetros de fermentación

La presente divulgación describe procedimientos de fermentación para cultivar especies bacterianas. El cultivo puede lograrse en un medio de crecimiento que comprende un medio acuoso con sales minerales, factores de crecimiento orgánicos, el carbono y la fuente de material energético, oxígeno molecular (para bacterias aerobias y facultativas), y, por supuesto, un inóculo de partida de una o más especies de microorganismos particulares que van a emplearse.

Además del carbono y la fuente energética, oxígeno, nitrógeno asimilable y un inóculo del microorganismo, puede ser necesaria suministrar cantidades adecuadas en proporciones apropiadas de nutrientes minerales para garantizar el crecimiento de microorganismos apropiado, maximizar la asimilación del carbono y la fuente energética por las células en el procedimiento de conversión microbiana y lograr rendimientos celulares máximos con una densidad celular máxima en el medio de fermentación.

Pueden usarse diversos medios de cultivo. Pueden usarse medios de cultivo bacterianos convencionales. Los medios pueden incluir, además de nitrógeno, cantidades adecuadas de fósforo, magnesio, calcio, potasio, azufre y sodio, en formas iónicas y combinadas asimilables solubles adecuadas, y también pueden comprender determinados elementos traza tales como cobre, manganeso, molibdeno, zinc, hierro, boro y yodo, y otros, de nuevo en forma asimilable soluble adecuada.

En casos, la reacción de fermentación puede implicar un procedimiento aerobio en el que el oxígeno molecular necesario puede suministrarse mediante un gas que contiene oxígeno molecular tale como aire, aire enriquecido en oxígeno o incluso oxígeno molecular sustancialmente puro, siempre que mantenga el contenido del recipiente de fermentación con una presión parcial de oxígeno adecuada eficaz en ayudar al crecimiento de las especies de microorganismos de manera próspera. En efecto, mediante el uso de un sustrato hidrocarbonado oxigenado, puede reducirse el requerimiento de oxígeno para el crecimiento del microorganismo. Sin embargo, puede suministrarse oxígeno molecular para el crecimiento de organismos aerobios y, en menor medida, facultativos.

Aunque la tasa de aireación puede variar a lo largo de un intervalo considerable, la aireación puede llevarse a cabo generalmente a una tasa que está en el intervalo de desde aproximadamente 0,5 hasta 10 o desde aproximadamente 0,5 hasta 7 volúmenes (a la presión empleada y a 252C.) de gas que contiene oxígeno por volumen de líquido en el fermentador por minuto. Esta cantidad puede basarse en el aire del contenido de oxígeno normal que se suministra al reactor, y en cuanto a oxígeno puro, los intervalos respectivos pueden ser de desde aproximadamente 0,1 hasta 1,7, o desde aproximadamente 0,1 hasta 1,3 volúmenes (a la presión empleada y a 25°C) de oxígeno por volumen de líquido en el fermentador por minuto.

La presión empleada para el procedimiento de conversión microbiana puede variar ampliamente. Las presiones pueden estar generalmente dentro del intervalo de aproximadamente 0 a 50 psig, desde aproximadamente 0 hasta 30 psig o al menos ligeramente por encima de la presión atmosférica, como un equilibrio de coste de equipos y de funcionamiento frente a la solubilidad de oxígeno lograda. Las presiones mayores de la atmosférica pueden aumentar la concentración de oxígeno disuelto en el fermento acuoso, lo que a su vez puede ayudar a aumentar las tasas de crecimiento celular.

La temperatura de fermentación puede variar un poco, pero para la mayoría de especies bacterianas huésped usadas en el presente documento, la temperatura puede estar generalmente dentro del intervalo de desde aproximadamente 20°C hasta 40°C, o en el intervalo de desde aproximadamente 28°C hasta 37°C, dependiendo de la cepa de microorganismo elegida.

En algunos casos, los microorganismos pueden requerir una fuente de nitrógeno asimilable. La fuente de nitrógeno asimilable puede ser cualquier compuesto o compuestos que contiene(n) nitrógeno que puede(n) liberar nitrógeno en una forma adecuada para la utilización metabólica por el microorganismo. Aunque pueden emplearse una variedad de compuestos de fuente de nitrógeno orgánico, tales como hidrolizados de proteína, habitualmente pueden utilizarse compuestos que contienen nitrógeno baratos tales como amoniaco, hidróxido de amonio, urea y diversas sales de amonio tales como fosfato de amonio, sulfato de amonio, pirofosfato de amonio, cloruro de amonio o diversos otros compuestos de amonio. El propio gas de amoniaco puede ser conveniente para operaciones a gran escala, y puede emplearse burbujeándose a través del fermento acuoso (medio de fermentación) en cantidades adecuadas. Al mismo tiempo, también puede emplearse tal amoniaco para ayudar en el control del pH.

El intervalo de pH en el fermento microbiano acuoso (mezcla de fermentación) puede estar en el intervalo a modo de ejemplo de desde aproximadamente 2,0 hasta 8,0. Sin embargo, el intervalo de pH óptimo para determinados microorganismos puede depender de los medios empleados en cierta medida, así como el microorganismo particular, y por tanto cambiar un poco con el cambio en los medios.

El tiempo de retención promedio de la mezcla de fermentación en el fermentador puede variar considerablemente, dependiendo en parte de la temperatura de fermentación y el cultivo empleado. En algunas variantes, la fermentación puede llevarse a cabo de tal manera que el sustrato que contiene carbono puede controlarse como factor limitante, proporcionando de ese modo una buena conversión del sustrato que contiene carbono para dar células y evitando la contaminación de las células con una cantidad sustancial de sustrato sin convertir. El último puede no ser un problema con sustratos solubles en agua, dado que puede retirarse fácilmente cualquier traza restante. Sin embargo, puede ser un problema en el caso de sustratos no solubles en agua, y pueden usarse etapas de tratamiento del producto adicionales tales como etapas de lavado adecuadas. El tiempo necesario para lograr este nivel de sustrato limitante puede variar con el microorganismo particular y el procedimiento de fermentación que va a llevarse a cabo. La fermentación puede llevarse a cabo como una operación discontinua o continua, la operación alimentada discontinua puede usarse para facilitar el control, la producción de cantidades uniformes de productos y los usos más económicos de todos los equipos.

Si se desea, puede añadirse parte o todo el carbono y la fuente de material energético y/o parte de la fuente de nitrógeno asimilable tal como amoniaco al medio mineral acuoso antes de la alimentación del medio mineral acuoso en el fermentador. De hecho, cada una de las corrientes introducidas en el reactor puede controlarse a una tasa predeterminada, o en respuesta a una necesidad que puede determinarse mediante la monitorización de, tal como concentración del carbono y el sustrato energético, pH, oxígeno disuelto, oxígeno o dióxido de carbono en los efluentes gaseosos del fermentador, la densidad celular que puede medirse mediante la transmitancia de luz, o similares. Las tasas de alimentación de los diversos materiales pueden variarse para obtener una tasa de crecimiento celular tan rápida como sea posible, consistente con la utilización eficiente del carbono y la fuente energética, para obtener un rendimiento de células de microorganismo con respecto a la carga de sustrato tan alto como sea posible, y para obtener la mayor producción de la proteína deseada por volumen unitario.

En un lote, pueden esterilizarse inicialmente los equipos, el reactor o el medio de fermentación, el recipiente o receptáculo, las tuberías, los dispositivos de enfriamiento o circulación concomitantes, y similares, normalmente empleando vapor a aproximadamente 121 °C durante al menos aproximadamente 15 minutos. El reactor esterilizado puede inocularse con un cultivo del microorganismo seleccionado en presencia de todos los nutrientes requeridos, incluyendo oxígeno, y el sustrato que contiene carbono.

Métodos de secreción en bacterias

En algunos casos, puede secretarse un polipéptido expresado de una célula huésped (por ejemplo, bacterias). La secreción de un polipéptido puede comprender la liberación del polipéptido de una célula o un compartimento subcelular en una célula (por ejemplo, núcleo, pared celular, membrana plasmática). La secreción puede producirse a través de las membranas plasmáticas, que pueden rodear células y/o compartimentos subcelulares. En algunos casos, la secreción puede referirse a la liberación de un polipéptido a la envoltura celular. En algunos casos, la secreción puede referirse a la liberación de un polipéptido al espacio extracelular (por ejemplo, en los medios de cultivo).

Una célula huésped de la divulgación puede comprender rutas secretoras, que pueden comprender un número de proteínas que funcionan juntas para secretar una proteína. En algunos casos, la célula huésped puede comprender una ruta secretora de translocación de doble arginina (TAT). En algunos casos, un organismo puede comprender una ruta secretora de SEC. La ruta secretora de TAT puede comprender la secreción de polipéptidos (por ejemplo, globinas) en un estado plegado. La ruta secretora de TAT puede transportar proteínas a través de una membrana plasmática (por ejemplo, capa lipídica, es decir, bicapa lipídica).

La divulgación describe factores de secreción y métodos que pueden usarse en células huésped para mejorar el obstáculo para la secreción de proteínas y la producción de proteínas en forma secretada, en particular cuando los polipéptidos se introducen de manera recombinante y se expresan por la célula huésped. La presente divulgación describe los factores de secreción TatC y TatA derivados de Bacillus subtilis. En particular, el péptido TatAdCd y TatAyCy, así como los genes que codifican para ellos también son factores de secreción adecuados. El PhoD de B. subtilis puede secretarse mediante la ruta de translocación de doble arginina. TatAdCd es de mayor importancia para la secreción de PhoD, mientras que TatAyCy puede no requerirse para este procedimiento.

Expresión de polipéptidos en plantas

Un polipéptido puede expresarse en plantas monocotiledóneas y/o plantas dicotiledóneas. Las técnicas para la introducción de ácidos nucleicos en plantas se conocen en la técnica, e incluyen, sin limitación, transformación mediada por Agrobacterium, transformación mediada por vectores virales, electroporación y transformación mediante bombardeo de partículas (también denominada transformación mediante biolística). Véanse, por ejemplo, las patentes estadounidenses n.os 5.538.880; 5.204.253; 6.329.571; y 6.013.863; Richards et al., Plant Cell. Rep.

20:48-20 54 (2001); Somleva et al., Crop Sci. 42:2080-2087 (2002); Sinagawa-Garcia et al., Plant Mol Biol (2009) 70:487-498; y Lutz et al., Plant Physiol., 2007, vol. 145, págs. 1201-1210. En algunos casos, puede usarse la transformación intergénica de plástidos como método de introducción de un polinucleótido en una célula vegetal. En algunos casos, el método de introducción de un polinucleótido en una planta comprende la transformación de cloroplastos. En algunos casos, las hojas y/o los tallos pueden ser el tejido diana del polinucleótido introducido. Si se usa una célula o un tejido cultivado como tejido receptor para la transformación, las plantas pueden regenerarse a partir de los cultivos transformados si se desea, mediante técnicas conocidos por los expertos en la técnica.

Otros métodos adecuados para introducir polinucleótidos incluyen electroporación de protoplastos, administración mediada por polietilenglicol de ADN desnudo en protoplastos vegetales, transformación génica directa a través de imbibición (por ejemplo, introducción de un polinucleótido en una planta deshidratada), transformación para dar protoplastos (que puede comprender la transferencia de un polinucleótido a través de descargas osmóticas o eléctricas), transformación química (que puede comprender el uso de una composición de polibreno-espermidina), microinyección, transformación de la ruta del tubo de polen (que puede comprender la administración de un polinucleótido al óvulo de la planta), transformación mediante liposomas, método de transformación del ápice del brote (que puede comprender la introducción de un polinucleótido en el brote y la regeneración del brote), método de transformación de transformación de Agrobacterium asistida por sonicación (SAAT), infiltración (que puede comprender una inmersión floral, o una inyección mediante jeringa en una parte particular de la planta (por ejemplo, hoja)), transformación mediada por carburo de silicio (SCMT) (que puede comprender la adición de fibras de carburo de silicio al tejido de la planta y el polinucleótido de interés), electroporación y electroforesis.

Un polipéptido puede expresarse en muchas especies de plantas diferentes, incluyendo, por ejemplo, granos tales como, por ejemplo, maíz, avena, arroz, trigo, cebada, centeno, triticale, teff, semillas oleaginosas incluyendo semilla de algodón, semilla de girasol, semilla de cártamo, crambe, camelina, mostaza, colza, verduras de hoja tales como, por ejemplo, lechuga, espinaca, col rizada, berza, grelos, acelga, hojas de mostaza, diente de león, brócoli, repollo, caña de azúcar, árboles, tubérculos tales como mandioca, batata, patata, zanahorias, remolachas, nabos, plantas de la familia de las legumbres, tales como, por ejemplo, trébol, guisantes tales como caupíes, guisantes ingleses, guisantes amarillos, guisantes verdes, judías tales como, por ejemplo, semilla de soja, habas, habas de Lima, judías rojas, garbanzos, semillas de mungo, judías pintas, lentejas, altramuces, mezquite, algarrobo, soja y cacahuetes, coco, veza (Vicia), Stylo (Stylosanthes), Arachis, Indigofera, Acacia, Leucaena, Cyamopsis y Sesbania. Las plantas no consumidas habitualmente por seres humanos, incluyendo cultivos de biomasa, incluyendo, por ejemplo, pastos, miscanto, tabaco, Arundo donax, caña energética, sorgo, otras hierbas, alfalfa, mazorca de maíz, alga parda u otras algas marinas. Los polipéptidos que pueden encontrarse en cualquier organismo en el reino vegetal pueden usarse en la presente divulgación. En algunos casos, la planta puede ser soja (Glycine max). En algunos casos, la planta puede ser cebada (Hordeum vulgare). En algunos casos, la planta puede ser Nicotiana tabacum. En algunos casos, la planta o célula vegetal no es una planta o célula de la planta Nicotiana.

En algunos casos, la variedad, línea de cultivo o variedad de cultivo de Nicotiana tabacum puede ser el registro de N. tabacum PM016, PM021, PM92, PM102, PM132, PM204, PM205, PM215, PM216 o PM217 depositado en NCIMB, Aberdeen, Escocia, o DAC Mata Fina, P02, BY-64, AS44, RG17, RG8, HB04P, Basma Xanthi BX 2A, Coker 319, Hicks, McNair 944 (m N 944), Burley 21, K149, Yaka JB 125/3, Kasturi Mawar, NC 297, Coker 371 Gold, P02, Wislica, Simmaba, Turkish Samsun, AA37-1, B13P, F4 del cruce BU21 x Hoja Parado line 97, Samsun NN, Izmir, Xanthi NN, Karabalgar, Denizli y P01.

Especies y cepas de Agrobacterium

La divulgación describe cepas de Agrobacterium para su uso en métodos para producir un polipéptido mediante la expresión de una secuencia que puede expresarse (por ejemplo, una secuencia que codifica para un polipéptido de la divulgación). Puede usarse una de las cepas de Agrobacterium para infiltrar una variedad de planta preseleccionada con el fin de optimizar el rendimiento del polipéptido. En determinados casos, la especie Agrobacterium que puede usarse en el método según la divulgación puede incluir, pero no se limita a, Agrobacterium tumefaciens, Agrobacterium rhizogenes, Agrobacterium radiobacter, Agrobacterium rubi, Argobacterium vitis. En algunas variantes, al menos una cepa de Agrobacterium comprende Agrobacterium tumefaciens. La especie Agrobacterium usada puede ser de tipo natural (por ejemplo, virulenta) o una cepa desarmada. Las cepas de Agrobacterium adecuadas pueden incluir cepas de tipo natural (por ejemplo, tales como Agrobacterium tumefaciens) o cepas en las que se muta uno o más genes para aumentar la eficiencia de transformación (por ejemplo, tales como cepas de Agrobacterium en las que la expresión génica de vir y/o la inducción del mismo se altera debido a la presencia de genes virA o virG mutantes o quiméricos), cepas de Agrobacterium que comprenden una copia extra del gen virG, tales como el supergén virG derivado de pTiBo542, ligado a un plásmido de múltiples copias. Otras cepas adecuadas pueden incluir, pero no se limitan a: A. tumefaciens C58C1, A136; LBA4011, LBA4404; EHA101; EHA105; AGL1; y A281. En algunos casos, la cepa de Agrobacterium seleccionada puede ser AGL1, EHA105, GV2260, GV3101 o Chry5.

En algunos casos, pueden usarse múltiples suspensiones de células de Agrobacterium, cada una expresando diferentes genes, para producir el polipéptido, o para potenciar el nivel de expresión de un polipéptido de la divulgación. En tales casos, si se contempla que las células de Agrobacterium en las diferentes suspensiones de células de Agrobacterium pueden ser la misma cepa o cepas diferentes. Alternativa o adicionalmente, una sola cepa de Agrobacterium puede comprender una pluralidad de secuencias que comprenden diferentes polinucleótidos, particularmente polinucleótidos que codifican para polipéptidos de la divulgación. Los diferentes genes pueden estar comprendidos dentro de una sola molécula de ácido nucleico (por ejemplo, un solo vector) o pueden proporcionarse en diferentes vectores. Un ejemplo no limitativo de un segundo gen que puede expresarse en la planta huésped es un gen que codifica para un supresor del silenciamiento, de origen viral.

La expresión de un polipéptido en una célula huésped (por ejemplo, célula vegetal) puede producirse durante al menos aproximadamente 0,1 horas, 0,5 horas, 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 8 horas, 9 horas, 10 horas, 11 horas, 12 horas, 13 horas, 14 horas, 15 horas, 16 horas, 17 horas, 18 horas, 19 horas, 20 horas, 21 horas, 22 horas, 23 horas, 24 horas, 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 7 días, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 7 semanas, 8 semanas, 9 semanas, 10 semanas, 15 semanas, 20 semanas, 30 o más semanas. Un polipéptido puede expresarse en una célula huésped durante como máximo aproximadamente al menos aproximadamente 0,1 horas, 0,5 horas, 1 hora, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 8 horas, 9 horas, 10 horas, 11 horas, 12 horas, 13 horas, 14 horas, 15 horas, 16 horas, 17 horas, 18 horas, 19 horas, 20 horas, 21 horas, 22 horas, 23 horas, 24 horas, 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 7 días, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 7 semanas, 8 semanas, 9 semanas o 10 semanas, 15 semanas, 20 semanas, 30 o más semanas.

Un polipéptido puede expresarse a una variedad de temperaturas. Un polipéptido puede expresarse a una temperatura de al menos aproximadamente 4, 10, 16, 18, 21, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 42, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ó 50°C. Un polipéptido puede expresarse a una temperatura de como máximo aproximadamente 4, 10, 16, 18, 21, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 42, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ó 502C.

Potenciamiento de polipéptidos endógenos

La divulgación describe la producción potenciada de un polipéptido endógeno (por ejemplo, un polipéptido endógeno que contiene hemo). La producción potenciada de un polipéptido endógeno puede lograrse mediante la modulación de la ruta que produce el polipéptido endógeno. La modulación puede referirse a la modulación de la transcripción, traducción, ubicación subcelular, ubicación para diferentes tejidos, tiempo de expresión, plegamiento, afinidad por parejas de unión, y similares. La modulación puede producirse a nivel de ADN (por ejemplo, inactivación del gen, inserción de un elemento potenciador/promotor). La modulación puede producirse a nivel de ARN (por ejemplo, silenciamiento del gen mediante interferencia de ARN). La modulación puede producirse a nivel de proteína (por ejemplo, modulación mediante inhibidores alostéricos, grupos de unión de moléculas pequeñas).

En algunos casos, la modulación puede referirse a la alteración de la actividad y/o los niveles del polipéptido endógeno en al menos aproximadamente 1 vez, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 10 veces, 20 veces, 50 veces o 100 veces o más mayor o menor con respecto a los niveles de tipo natural del polipéptido endógeno. En algunos casos, la modulación puede referirse a la alteración de la actividad y/o los niveles del polipéptido endógeno en como máximo aproximadamente 1 vez, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 10 veces, 20 veces, 50 veces o 100 veces o más mayor o menor con respecto a los niveles de tipo natural del polipéptido endógeno. En algunos casos, la modulación puede referirse a la alteración de la actividad y/o los niveles del polipéptido endógeno en al menos aproximadamente el 5, el 10, el 20, el 30, el 40, el 50, el 60, el 70, el 80, el 90 o el 100% de los niveles de tipo natural del polipéptido endógeno. En algunos casos, la modulación puede referirse a la alteración de la actividad y/o los niveles del polipéptido endógeno en al menos aproximadamente el 5, el 10, el 20, el 30, el 40, el 50, el 60, el 70, el 80, el 90 o el 100% de los niveles de tipo natural del polipéptido endógeno.

En algunos casos, pueden modularse los polipéptidos en la ruta de biosíntesis de hemo que pueden producir el cofactor de hemo. Véase, por ejemplo, Tanaka y Tanaka, Annu. Rev. Plant Biol. 2007. 58:321-46, que describe modificaciones para la ruta de biosíntesis de tetrapirrol en plantas. La modulación de polipéptidos en la ruta de biosíntesis de hemo puede ser a nivel de ADN, ARN o proteína. En algunos casos, la modulación de otros polipéptidos en la ruta puede referirse al aumento de los niveles y/o la actividad de un activador de la ruta. En algunos casos, la modulación de otros polipéptidos en la ruta puede referirse a la disminución de los niveles y/o la actividad de un supresor de la ruta.

En algunos casos, la modulación puede referirse a la alteración de la actividad y/o los niveles de polipéptidos en la ruta de biosíntesis de hemo (incluyendo el cofactor de hemo que se asocia con un polipéptido que contiene hemo de la divulgación) en al menos aproximadamente 1 vez, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 10 veces, 20 veces, 50 veces o 100 veces o más mayor o menor con respecto a los niveles de tipo natural del polipéptido en la ruta. En algunos casos, la modulación puede referirse a la alteración de la actividad y/o los niveles de polipéptidos en la ruta de biosíntesis de hemo (incluyendo el cofactor de hemo) en como máximo aproximadamente 1 vez, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 10 veces, 20 veces, 50 veces o 100 veces o más mayor o menor con respecto a los niveles de tipo natural del polipéptido en la ruta. En algunos casos, la modulación puede referirse a la alteración de la actividad y/o los niveles de polipéptidos en la ruta de biosíntesis de hemo (incluyendo el cofactor de hemo) en al menos aproximadamente el 5, el 10, el 20, el 30, el 40, el 50, el 60, el 70, el 80, el 90 o el 100% de los niveles de tipo natural del polipéptido en la ruta. En algunos casos, la modulación puede referirse a la alteración de la actividad y/o los niveles de polipéptidos en la ruta de biosíntesis de hemo (incluyendo el cofactor de hemo) en al menos aproximadamente el 5, el 10, el 20, el 30, el 40, el 50, el 60, el 70, el 80, el 90 o el 100% de los niveles de tipo natural del polipéptido en la ruta.

En algunos casos, la modulación puede referirse a la alteración de los niveles de expresión de un polipéptido endógeno en una ubicación específica de la célula huésped. Por ejemplo, los niveles de expresión de un polipéptido endógeno pueden alterarse en una hoja, una semilla, un grano, un tallo, un xilema, un estambre y un pétalo, o cualquier combinación de los mismos.

Métodos de purificación

Un polipéptido expresado y/o secretado de la divulgación puede recuperarse (por ejemplo, del medio de cultivo o de un tejido vegetal). Por ejemplo, cuando el polipéptido expresado que contiene hemo se secreta de las células bacterianas, el polipéptido puede purificarse del medio de cultivo. En algunos casos, las células huésped que expresan el polipéptido pueden retirarse de los medios antes de la purificación del polipéptido (por ejemplo, mediante centrifugación).

Cuando el polipéptido recombinante expresado deseado no se secreta de una célula huésped, puede romperse la célula huésped y liberarse el polipéptido en un “extracto” acuoso que puede ser la primera etapa de purificación. Las células huésped de expresión pueden recogerse de los medios antes de la ruptura celular. La ruptura celular puede realizarse usando cualquier medio adecuado, tal como mediante digestión con lisozimas o beta-glucanasa, trituración, sonicación, homogeneización, molienda o forzando las células a alta presión.

Un polipéptido recuperado puede purificarse. La purificación puede lograrse por medio de lavado/fraccionamiento con una sal (por ejemplo, sulfato de amonio) o a pH bajo (normalmente menos de 3) o procedimientos cromatográficos (por ejemplo, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de inducción de carga hidrófoba, cromatografía de exclusión molecular, etc.). Durante la purificación, la abundancia acumulada en masa de componentes proteicos distintos de la proteína especificada, que pueden ser una sola especie de proteína monomérica o multimérica, puede reducirse en un factor de 2 o más, 3 o más, 5 o más, 10 o más, 20 o más, 50 o más, 100 o más, o 1000 o más con respecto a la materia prima de la que se aisló la proteína especificada.

En algunos casos, un polipéptido puede recuperarse de un fermentador. El caldo de fermentación puede comprender generalmente residuos celulares, incluyendo células, diversos sólidos suspendidos y otros contaminantes de biomasa, así como el producto proteico deseado, que pueden retirarse del caldo de fermentación. Los procedimientos adecuados para tal retirada pueden incluir técnicas de separación sólido-líquido convencionales (por ejemplo, centrifugación, filtración, diálisis, microfiltración, filtración rotaria a vacío u otros procedimientos conocidos) para producir un filtrado libre de células. En algunas variantes, puede ser aceptable para concentrar adicionalmente el caldo de fermentación o el filtrado libre de células antes del procedimiento de purificación y/o cristalización usando técnicas tales como ultrafiltración, evaporación y/o precipitación. En algunos casos, el polipéptido se purifica adicionalmente para reducir la abundancia acumulada en masa de componentes proteicos distintos de la proteína especificada, que pueden ser una sola especie de proteína monomérica o multimérica, en un factor de 2 o más, 3 o más, 5 o más, 10 o más, 20 o más, 50 o más, 100 o más, o 1000 o más con respecto a la materia prima de la que se aisló la proteína especificada. La purificación puede lograrse por medio de lavado/fraccionamiento con una sal (por ejemplo, sulfato de amonio) o a pH bajo (normalmente menos de 3) o procedimientos cromatográficos (por ejemplo, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad, cromatografía de interacción hidrófoba y/o cromatografía de inducción de carga hidrófoba, etc.).

Caracterización de un polipéptido

Un polipéptido purificado puede caracterizarse para determinar su pureza, contenido de hemo, estado de oligomerización, estabilidad, degradación, afinidad de unión, y similares. Para algunas aplicaciones, los polipéptidos (por ejemplo, globinas) producidos usando la presente divulgación puede ser muy puros (por ejemplo, teniendo una pureza de más del 99%). Un polipéptido purificado puede caracterizarse para determinar su olor, sabor y color.

El polipéptido purificado puede ser al menos aproximadamente el 1, el 2, el 3, el 4, el 5, el 6, el 7, el 8, el 9, el 10, el 20, el 30, el 40, el 50, el 60, el 70, el 80, el 90, el 91, el 92, el 93, el 94, el 95, el 96, el 97, el 98, el 99 o el 100% puro. El polipéptido purificado puede ser como máximo aproximadamente el 1, el 2, el 3, el 4, el 5, el 6, el 7, el 8, el 9, el 10, el 20, el 30, el 40, el 50, el 60, el 70, el 80, el 90, el 91, el 92, el 93, el 94, el 95, el 96, el 97, el 98, el 99 o el 100% puro. El polipéptido purificado puede comprender al menos aproximadamente el 0,01, el 0,05, el 0,1, el 0,2, el 0,3, el 0,4, el 0,5, el 0,6, el 0,7, el 0,8, el 0,9, el 1, el 2, el 3, el 4, el 5, el 6, el 7, el 8, el 9, el 10, el 20, el 30, el 40, el 50, el 60, el 70, el 80, el 90, el 91, el 92, el 93, el 94, el 95, el 96, el 97, el 98 o el 99% de impurezas. El polipéptido purificado puede comprender como máximo aproximadamente el 0,01, el 0,05, el 0,1, el 0,2, el 0,3, el 0,4, el 0,5, el 0,6, el 0,7, el 0,8, el 0,9, el 1, el 2, el 3, el 4, el 5, el 6, el 7, el 8, el 9, el 10, el 20, el 30, el 40, el 50, el 60, el 70, el 80, el 90, el 91, el 92, el 93, el 94, el 95, el 96, el 97, el 98 o el 99% de impurezas. El polipéptido purificado puede comprender al menos aproximadamente 0,001, 0,005, 0,01, 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 partes por millón de impurezas. El polipéptido purificado puede comprender como máximo aproximadamente 0,001,0,005, 0,01, 0,05, 0,1,0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 partes por millón de impurezas. El polipéptido purificado puede comprender al menos aproximadamente 0,001,0,005, 0,01, 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 partes por mil millones de impurezas. El polipéptido purificado puede comprender como máximo aproximadamente 0,001, 0,005, 0,01,0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 partes por mil millones de impurezas.

En algunos casos, la globina purificada puede someterse a prueba para determinar su actividad, estado de oligomerización, plegamiento de proteína apropiado, estabilidad, estructura secundaria y/o contenido de hemo. La actividad, el estado de oligomerización, el plegamiento de proteína y/o la estabilidad pueden determinarse mediante varios métodos incluyendo espectroscopía, ELISA, ensayos de unión, ultracentrifugación analítica, dicroísmo circular, cristalografía de rayos X, resonancia de plasmón superficial, espectrometría de masa o RMN.

Un polipéptido de esta divulgación puede tener propiedades similares a una mioglobina aislada de tejidos animales. En una variante, puede pedirse a un grupo de personas que califique una mioglobina aislada de un tejido animal, según las propiedades que describen la mioglobina. Estas calificaciones pueden usarse como indicación de las propiedades de la mioglobina derivada de tejido animal. El polipéptido de la presente divulgación puede compararse entonces con la globina derivada de animal para determinar cómo de similar es el polipéptido de esta divulgación con respecto a la mioglobina derivada de tejido animal. Así, en algunos casos, el polipéptido se califica como similar con respecto a la mioglobina derivada de tejido animal según la evaluación humana. En algunas variantes, el polipéptido es indistinguible de la mioglobina derivada de tejido animal para un ser humano.

En algunos casos, los polipéptidos de esta divulgación se comparan con mioglobina derivada de tejido animal basándose en lecturas de olfatómetro. En diversas variantes, el olfatómetro puede usarse para evaluar la concentración de olor y los umbrales de olor, los superumbrales de olor con respecto a un gas de referencia, puntuaciones de escala hedónica para determinar el grado de apreciación o la intensidad relativa de olores. En algunas variantes, el olfatómetro permite el entrenamiento y la evaluación automática de paneles de expertos. En algunos casos, el producto consumible es un producto que provoca lecturas de olfatómetro similares o idénticas. En algunas variantes, la similitud es suficiente para superar el umbral de detección de la percepción humana.

La cromatografía de gases-espectrometría de masas (CG-EM) es un método que combina las características de la cromatografía de gases-líquidos y la espectrometría de masas para separar e identificar sustancias diferentes dentro de una muestra de prueba. En algunas variantes, la CG-EM puede usarse para evaluar las propiedades de polipéptidos de esta divulgación. Por ejemplo, pueden aislarse sustancias químicas volátiles del espacio de cabeza alrededor de la mioglobina derivada de tejido animal. Estas sustancias químicas pueden identificarse usando CG-EM. Por tanto, se crea un perfil de las sustancias químicas volátiles en el espacio de cabeza alrededor de la mioglobina derivada de tejido animal. En algunos casos, puede evaluarse adicionalmente cada pico de la CG-EM. Por ejemplo, un ser humano podría calificar la experiencia de oler la sustancia química responsable de un determinado pico. Esta información podría usarse para refinar adicionalmente el perfil. La CG-EM podría usarse entonces para evaluar las propiedades de un polipéptido de la divulgación. El perfil de CG-EM podría usarse para refinar el polipéptido.

El contenido de hemo puede referirse al porcentaje de moléculas de polipéptido que comprenden la cantidad correcta de restos hemo. Por ejemplo, si un polipéptido de la divulgación se une a un resto hemo, entonces el contenido de hemo puede referirse al número de polipéptidos que se unen al resto hemo. El contenido de hemo de un polipéptido puede ser al menos aproximadamente el 1, el 2, el 3, el 4, el 5, el 6, el 7, el 8, el 9, el 10, el 20, el 30, el 40, el 50, el 60, el 70, el 75, el 80, el 85, el 90, el 95 o el 100%. El contenido de hemo de un polipéptido puede ser como máximo aproximadamente 1, el 2, el 3, el 4, el 5, el 6, el 7, el 8, el 9, el 10, el 20, el 30, el 40, el 50, el 60, el 70, el 75, el 80, el 85, el 90, el 95 o el 100%. En algunos casos, el contenido de hemo puede expresarse como razón molar de concentración de polipéptido con respecto a concentración de hemo. El contenido de hemo de la razón molar puede ser al menos aproximadamente 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:20, 1:30 ó 1:40 o menos. El contenido de hemo de la razón molar puede ser como máximo aproximadamente 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:20, 1:30 ó 1:40 o menos. El contenido de hemo puede ser 1 vez, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 10 veces, 15 veces, 20 veces, 30 veces o 40 veces o más menor que el contenido de hemo de un polipéptido completamente ocupado (por ejemplo, el polipéptido está ocupado al 100% con hemo). El contenido de hemo puede ser 1 vez, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 10 veces, 15 veces, 20 veces, 30 veces o 40 veces o más mayor que el contenido de hemo de un polipéptido completamente desocupado (por ejemplo, el polipéptido está ocupado al 0% con hemo). El contenido de hemo puede determinarse mediante un número de métodos incluyendo espectroscopía (Raman, UV-Vis), resonancia paramagnética electrónica (RPE), ensayos de desnaturalización de proteínas, ensayos de robo de hemo y ensayos de reducción de hemo.

Métodos para el uso de un polipéptido en un producto cárnico consumible

La divulgación describe métodos para el uso de un polipéptido de la divulgación en un producto cárnico consumible. Los productos consumibles pueden competir con, complementar o reemplazar alimentos de origen animal. Por ejemplo, los productos consumibles pueden ser réplicas de carne elaboradas completamente a partir de fuentes vegetales. Los productos consumibles pueden elaborarse para imitar el corte o aspecto de carne tal como se vende actualmente. Por ejemplo, un producto consumible puede ser visualmente similar a o indistinguible de carne de vacuno picada o un corte particular de carne de vacuno. Alternativamente, los productos consumibles pueden elaborarse con una apariencia o un aspecto único. Por ejemplo, el producto consumible puede contener patrones o marcados que se basan en la estructura del producto consumible. En algunos casos, los productos consumibles pueden parecer similares a productos cárnicos tradicionales después de prepararse. Por ejemplo, puede producirse un producto consumible que es más grande que un corte tradicional de carne de vacuno pero que, después de que el producto consumible se trocee y cocine parece el mismo que una carne cocinada tradicional. En algunos casos, el producto consumible puede parecerse a una forma de carne tradicional en dos dimensiones, pero no en una tercera. Por ejemplo, el producto consumible puede parecerse a un corte de carne en dos dimensiones (por ejemplo, cuando se observa desde la parte superior), pero puede ser mucho más grande (o grueso) que el corte tradicional. Un producto cárnico consumible (por ejemplo, sucedáneo) puede tener características físicas similares que la carne tradicional (sabor, textura, fuerza, nutrientes). En algunos casos, un producto cárnico consumible puede comprender una característica de pérdida de cocinado similar a la de la carne. En algunas variantes, un producto cárnico consumible puede comprender un contenido de grasas y proteínas similar ya que la carne de vacuno picada tiene la misma reducción en tamaño cuando se cocina como carne de vacuno picada real. Los métodos de producción de un producto cárnico consumible se describen en el documento PCT/US2012/046560.

En algunos casos, un producto cárnico consumible puede comprender un polipéptido de la divulgación. Un polipéptido de la divulgación puede usarse como colorante o indicador de cocinado del producto cárnico consumible.

En algunos casos, la divulgación describe un método para expresar un polipéptido (por ejemplo, globina) en una célula huésped, secretar el polipéptido de la célula huésped, purificar el polipéptido secretado y mezclar el polipéptido purificado con grasas y lípidos para producir un sucedáneo de carne.

En algunos casos, la divulgación describe un método para potenciar la expresión de un polipéptido endógeno (por ejemplo, globina) en una célula huésped, purificar el polipéptido de la célula y mezclar el polipéptido purificado con grasas y lípidos para producir un sucedáneo de carne.

En algunos casos, la divulgación describe un método para expresar un polipéptido (por ejemplo, globina) en una célula huésped (por ejemplo, una planta), purificar el polipéptido secretado y mezclar el polipéptido purificado con grasas y lípidos para producir un sucedáneo de carne.

Composiciones

En algunos casos, la divulgación describe una composición que comprende un polipéptido de la divulgación. Una composición puede comprender medios en los que se secretó el polipéptido. Una composición puede comprender al menos aproximadamente el 0,001, el 0,005, el 0,01, el 0,05, el 0,1, el 0,5, el 1, el 2, el 3, el 4, el 5, el 6, el 7, el 8, el 9 o el 10% (p/p) o más de medios. Una composición puede comprender como máximo aproximadamente el 0,001, el 0. 005, el 0,01, el 0,05, el 0,1, el 0,5, el 1, el 2, el 3, el 4, el 5, el 6, el 7, el 8, el 9 o el 10% o más de medios. Una composición puede comprender al menos aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 o más partes por millón de medios. Una composición puede comprender como máximo aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 o más partes por millón de medios. Una composición puede comprender al menos aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 o más partes por mil millones de medios. Una composición puede comprender como máximo aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 o más partes por mil millones de medios.

Una composición puede comprender una célula huésped (por ejemplo, una bacteria). Una célula huésped de la composición puede ser la célula huésped de la que se expresa y/o secreta el polipéptido. Una composición puede comprender al menos aproximadamente el 0,001, el 0,005, el 0,01, el 0,05, el 0,1, el 0,5, el 1, el 2, el 3, el 4, el 5, el 6, el 7, el 8, el 9 o el 10% (p/p) o más de células huésped. Una composición puede comprender como máximo aproximadamente el 0,001, el 0,005, el 0,01, el 0,05, el 0,1, el 0,5, el 1, el 2, el 3, el 4, el 5, el 6, el 7, el 8, el 9 o el 10% de células huésped. Una composición puede comprender al menos aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 o más partes por millón de células huésped. Una composición puede comprender como máximo aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 o más partes por millón de células huésped. Una composición puede comprender al menos aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 o más partes por mil millones de células huésped. Una composición puede comprender como máximo aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 o más partes por mil millones de células huésped. Una composición puede ser al menos aproximadamente el 1, el 2, el 3, el 4, el 5, el 6, el 7, el 8, el 9, el 10, el 20, el 30, el 40, el 50, el 60, el 70, el 80, el 90, el 91, el 92, el 93, el 94, el 95, el 96, el 97, el 98, el 99 o el 100% libre de una célula huésped. Una composición puede ser como máximo aproximadamente el 1, el 2, el 3, el 4, el 5, el 6, el 7, el 8, el 9, el 10, el 20, el 30, el 40, el 50, el 60, el 70, el 80, el 90, el 91, el 92, el 93, el 94, el 95, el 96, el 97, el 98, el 99 o el 100% libre de una célula huésped.

Una composición puede comprender un componente de una célula huésped recombinante (por ejemplo, una célula bacteriana o célula vegetal recombinante). Un componente de una célula huésped puede incluir, por ejemplo, una pared celular, un compartimento subcelular (por ejemplo, complejo de Golgi, retículo endoplasmático o núcleo), ácido nucleico, proteína, ADN genómico y/ o una membrana plasmática. Para una célula bacteriana, un componente también puede incluir flagelos, y para una planta o célula vegetal, un componente puede ser cualquier parte de la planta tal como un brote, un tallo, una semilla, un grano, una hoja, tejido de xilema, una roseta, una raíz. Un componente de una célula huésped puede ser un componente de una célula huésped de la que se expresa y/o secreta el polipéptido. Por ejemplo, una composición puede incluir un componente que no se produce de manera natural de una célula huésped recombinante tal como una proteína de fusión o un ácido nucleico exógeno. Una composición puede comprender al menos aproximadamente el 0,001, el 0,005, el 0,01, el 0,05, el 0,1, el 0,5, el 1, el 2, el 3, el 4, el 5, el 6, el 7, el 8, el 9 o el 10% (p/p) o más de un componente de una célula huésped. Una composición puede comprender como máximo aproximadamente el 0,001, el 0,005, el 0,01, el 0,05, el 0,1, el 0,5, el 1, el 2, el 3, el 4, el 5, el 6, el 7, el 8, el 9 o el 10% de un componente de una célula huésped. Una composición puede comprender al menos aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 o más partes por millón del componente de una bacteria. Una composición puede comprender como máximo aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 partes por millón de un componente de una célula huésped. Una composición puede comprender al menos aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 o más partes por mil millones de un componente de una célula huésped. Una composición puede comprender como máximo aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 partes por mil millones de un componente de una célula huésped. Una composición puede ser al menos aproximadamente el 1, el 2, el 3, el 4, el 5, el 6, el 7, el 8, el 9, el 10, el 20, el 30, el 40, el 50, el 60, el 70, el 80, el 90, el 91, el 92, el 93, el 94, el 95, el 96, el 97, el 98, el 99 o el 100% libre de un componente de una célula huésped. Una composición puede ser como máximo aproximadamente el 1, el 2, el 3, el 4, el 5, el 6, el 7, el 8, el 9, el 10, el 20, el 30, el 40, el 50, el 60, el 70, el 75, el 80, el 85, el 90, el 91, el 92, el 93, el 94, el 95, el 96, el 97, el 98, el 99 o el 100% libre de un componente de una célula huésped.

Composiciones de producto cárnico consumible

En algunos casos, una composición de la divulgación puede comprender un producto cárnico consumible y una célula huésped (por ejemplo, bacteria, una parte de una bacteria y/o una parte de una planta). En algunos casos, una composición puede comprender además un polipéptido de la divulgación. En algunos casos, una composición comprende un polipéptido y un producto cárnico consumible (es decir, sucedáneo de carne) (tal como se describe en el documento PCT/US2012/046560).

Un producto cárnico consumible puede referirse a un producto similar a carne (por ejemplo, un sucedáneo de carne) que no está elaborado de carne. Un producto cárnico consumible puede referirse a un sucedáneo de carne que está elaborado de productos no animales (por ejemplo, una planta). Un producto cárnico consumible puede ser réplicas de carne elaboradas completamente a partir de fuentes de origen vegetal. Los productos consumibles también pueden elaborarse a partir de una combinación de fuentes de origen vegetal y fuentes de origen animal. Los productos consumibles pueden elaborarse para imitar el corte o aspecto de carne tal como se vende actualmente. Por ejemplo, un producto consumible puede ser visualmente similar a o indistinguible de carne de vacuno picada o un corte particular de carne de vacuno. En algunos casos, los productos consumibles parecen similares a productos cárnicos tradicionales después de prepararse. El producto cárnico consumible puede estar sustancialmente o completamente compuesto por componentes derivados de fuentes de origen no animal, que aún recapitula características clave asociadas con el cocinado y el consumo de un producto cárnico equivalente derivado de animales.

Una composición puede comprender un producto cárnico consumible y un polipéptido de la divulgación. Un producto cárnico consumible puede comprender al menos aproximadamente el 1, el 5, el 10, el 15, el 20, el 25, el 30, el 35, el 40, el 45, el 50, el 55, el 60, el 65, el 70, el 75, el 80, el 85, el 90, el 95 o el 100% (p/p) de uno o más polipéptidos de la divulgación. En algunos casos, un producto cárnico consumible puede comprender como máximo aproximadamente el 1, el 5, el 10, el 15, el 20, el 25, el 30, el 35, el 40, el 45, el 50, el 55, el 60, el 65, el 70, el 75, el 80, el 85, el 90, el 95 o el 100% de uno o más polipéptidos de la divulgación. Un producto cárnico consumible puede comprender al menos aproximadamente el 1, el 5, el 10, el 15, el 20, el 25, el 30, el 35, el 40, el 45, el 50, el 55, el 60, el 65, el 70, el 75, el 80, el 85, el 90, el 95 o el 100% peso/volumen de uno o más polipéptidos de la divulgación. En algunos casos, un producto cárnico consumible puede comprender como máximo aproximadamente el 1, el 5, el 10, el 15, el 20, el 25, el 30, el 35, el 40, el 45, el 50, el 55, el 60, el 65, el 70, el 75, el 80, el 85, el 90, el 95 o el 100% peso/volumen de uno o más polipéptidos de la divulgación.

Una composición puede comprender un producto cárnico consumible y una célula huésped (por ejemplo, bacteria). Una célula huésped de la composición puede ser la célula huésped de la que se expresa y/o secreta el polipéptido. Una composición puede comprender un producto cárnico consumible y al menos aproximadamente el 0,001, el 0,005, el 0,01, el 0,05, el 0,1, el 0,5, el 1, el 2, el 3, el 4, el 5, el 6, el 7, el 8, el 9 o el 10% (p/p) o más de células huésped. Una composición puede comprender un producto cárnico consumible y como máximo aproximadamente el 0,001, el 0,005, el 0,01, el 0,05, el 0,1, el 0,5, el 1, el 2, el 3, el 4, el 5, el 6, el 7, el 8, el 9 o el 10% de células huésped. Una composición puede comprender un producto cárnico consumible y al menos aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 o más partes por millón de célula huésped. Una composición puede comprender un producto cárnico consumible y como máximo aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 partes por millón de célula huésped. Una composición puede comprender un producto cárnico consumible y al menos aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 o más partes por mil millones de célula huésped. Una composición puede comprender un producto cárnico consumible y como máximo aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 partes por mil millones de célula huésped. Una composición puede comprender un producto cárnico consumible y ser al menos aproximadamente el 1, el 2, el 3, el 4, el 5, el 6, el 7, el 8, el 9, el 10, el 20, el 30, el 40, el 50, el 60, el 70, el 80, el 90, el 91, el 92, el 93, el 94, el 95, el 96, el 97, el 98, el 99 o el 100% libre de una célula huésped. Una composición puede comprender un producto cárnico consumible y ser como máximo aproximadamente el 1, el 2, el 3, el 4, el 5, el 6, el 7, el 8, el 9, el 10, el 20, el 30, el 40, el 50, el 60, el 70, el 80, el 90, el 91, el 92, el 93, el 94, el 95, el 96, el 97, el 98, el 99 o el 100% libre de una célula huésped.

Una composición puede comprender una parte de un producto cárnico consumible y un componente de una célula huésped (por ejemplo, una parte de una bacteria). Un componente de una célula huésped puede incluir una pared celular, un compartimento subcelular (por ejemplo, complejo de Golgi, retículo endoplasmático, núcleo), un flagelo, ácido nucleico, proteína, ADN genómico o una membrana plasmática. Un componente de una célula huésped puede ser una parte de una bacteria de la que se expresa y/o secreta el polipéptido. Una composición puede comprender un producto cárnico consumible y al menos aproximadamente el 0,001, el 0,005, el 0,01, el 0,05, el 0,1, el 0,5, el 1, el 2, el 3, el 4, el 5, el 6, el 7, el 8, el 9 o el 10% o más de una parte de una célula huésped. Una composición puede comprender un producto cárnico consumible y como máximo aproximadamente el 0,001, el 0,005, el 0,01, el 0,05, el 0,1, el 0,5, el 1, el 2, el 3, el 4, el 5, el 6, el 7, el 8, el 9 o el 10% de un componente de una célula huésped. Una composición puede comprender un producto cárnico consumible y al menos aproximadamente 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 o más partes por millón de una parte de una célula huésped. Una composición puede comprender un producto cárnico consumible y como máximo aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 partes por millón de un componente de una célula huésped. Una composición puede comprender un producto cárnico consumible y al menos aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 o más partes por mil millones de un componente de una célula huésped. Una composición puede comprender un producto cárnico consumible y como máximo aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 partes por mil millones de un componente de una célula huésped. Una composición puede comprender un producto cárnico consumible y ser al menos aproximadamente el 1, el 2, el 3, el 4, el 5, el 6, el 7, el 8, el 9, el 10, el 20, el 30, el 40, el 50, el 60, el 70, el 80, el 90, el 91, el 92, el 93, el 94, el 95, el 96, el 97, el 98, el 99 o el 100% libre de un componente de una célula huésped. Una composición puede comprender un producto cárnico consumible y ser como máximo aproximadamente el 1, el 2, el 3, el 4, el 5, el 6, el 7, el 8, el 9, el 10, el 20, el 30, el 40, el 50, el 60, el 70, el 80, el 90, el 91, el 92, el 93, el 94, el 95, el 96, el 97, el 98, el 99 o el 100% libre de un componente de una célula huésped.

Una composición puede comprender un producto cárnico consumible y un componente de una célula huésped (por ejemplo, planta, por ejemplo, una planta de tabaco, es decir, la especie Nicotiana tabacum, o una planta de soja, es decir, la especie Glycine max). En algunos casos, la célula huésped no es una planta Nicotiana. Una parte de una célula huésped puede incluir una pared celular, un compartimento subcelular (por ejemplo, complejo de Golgi, retículo endoplasmático, núcleo), un brote, un tallo, una hoja, una semilla, un grano, un xilema, una roseta, una raíz, ácido nucleico, proteína, ADN genómico y una membrana plasmática. Un componente de una célula huésped puede ser una parte de una planta de la que se expresa y/o secreta el polipéptido. Una composición puede comprender un producto cárnico consumible y al menos aproximadamente el 0,001, el 0,005, el 0,01, el 0,05, el 0,1, el 0,5, el 1, el 2, el 3, el 4, el 5, el 6, el 7, el 8, el 9 o el 10% o más de un componente de una célula huésped. Una composición puede comprender un producto cárnico consumible y como máximo aproximadamente el 0,001, el 0,005, el 0,01, el 0,05, el 0,1, el 0,5, el 1, el 2, el 3, el 4, el 5, el 6, el 7, el 8, el 9 o el 10% de un componente de una célula huésped. Una composición puede comprender un producto cárnico consumible y al menos aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 o más partes por millón de un componente de una célula huésped. Una composición puede comprender un producto cárnico consumible y como máximo aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 partes por millón de un componente de una célula huésped. Una composición puede comprender un producto cárnico consumible y al menos aproximadamente 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 o más partes por mil millones de un componente de una célula huésped. Una composición puede comprender un producto cárnico consumible y como máximo aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 partes por mil millones de un componente de una célula huésped. Una composición puede comprender un producto cárnico consumible y ser al menos aproximadamente el 1, el 2, el 3, el 4, el 5, el 6, el 7, el 8, el 9, el 10, el 20, el 30, el 40, el 50, el 60, el 70, el 80, el 90, el 91, el 92, el 93, el 94, el 95, el 96, el 97, el 98, el 99 o el 100% libre de un componente de una célula huésped. Una composición puede comprender un producto cárnico consumible y ser como máximo aproximadamente el 1, el 2, el 3, el 4, el 5, el 6, el 7, el 8, el 9, el 10, el 20, el 30, el 40, el 50, el 60, el 70, el 80, el 90, el 91, el 92, el 93, el 94, el 95, el 96, el 97, el 98, el 99 o el 100% libre de un componente de una célula huésped.

En algunos casos, la divulgación describe un producto consumible que puede estar sustancialmente o completamente compuesto por componentes derivados de fuentes de origen no animal, que aún recapitula características clave asociadas con el cocinado y el consumo de un producto cárnico equivalente derivado de animales. El producto cárnico equivalente puede ser una carne blanca o una carne oscura. El producto cárnico equivalente puede derivarse de cualquier animal. Los ejemplos no limitativos de animales usados para derivar el producto cárnico equivalente incluyen animales de granja tales como, por ejemplo, ganado vacuno, oveja, cerdo, pollo, pavo, oca, pato, caballo, perro o animales de caza (ya sean salvajes o de granja) tal como, por ejemplo, conejo, ciervo, bisonte, búfalo, jabalí, serpiente, faisán, codorniz, oso, alce, antílope, pichón, paloma, urogallo, zorro, jabalí, cabra, canguro, emú, caimán, cocodrilo, tortuga, marmota canadiense, marmota, zarigüeya, perdiz, ardilla, mapache, ballena, foca, avestruz, carpincho, nutria, cobaya, rata, ratones, topillo, cualquier variedad de insecto u otro artrópodo, marisco tal como, por ejemplo, pescado, cangrejo, langosta, ostra, mejillón, vieira, oreja de mar, calamar, pulpo, erizo de mar, tunicado y otros. Muchos productos cárnicos se derivan normalmente de músculos esqueléticos de un animal, pero se entiende que la carne también puede proceder de otros músculos u órganos del animal. En algunos casos, el producto cárnico equivalente es un corte de carne derivada de músculo esquelético. En algunas variantes, el producto cárnico equivalente es un órgano tal como, por ejemplo, un riñón, corazón, hígado, vesícula biliar, intestino, estómago, médula ósea, cerebro, timo, pulmón, lengua. Por consiguiente, en algunos casos, las composiciones del presente documento son productos consumibles similares a órganos o músculos esqueléticos.

En algunos casos, la divulgación describe productos de sucedáneo de carne que comprenden una o más de una primera composición que comprende una réplica de tejido muscular, una segunda composición que comprende una réplica de tejido adiposo y/o una tercera composición que comprende una réplica de tejido conjuntivo, en los que la una o más composiciones se combinan de una manera que recapitula la organización física de la carne. En otros casos, la presente divulgación describe composiciones para una réplica de tejido muscular (denominada en el presente documento “réplica de músculo”), una réplica de tejido adiposo (denominada en el presente documento “réplica de grasa”) y una réplica de tejido conjuntivo (denominada en el presente documento “réplica de tejido conjuntivo”). En algunos casos, las composiciones y los productos de sucedáneo de carne están compuestos principalmente o completamente por componentes derivados de fuentes de origen no animal. En variantes alternativas, la réplica de músculo, grasa y/o tejido conjuntivo, o los productos de sucedáneo de carne que comprenden una o más de dichas réplicas, se derivan parcialmente de fuentes de origen animal pero se complementan con componentes derivados de fuentes de origen no animal.

En algunos casos, los productos cárnicos pueden derivarse sustancialmente de fuentes de origen animal, pero que se complementan con una o más de una réplica de tejido muscular, una réplica de grasa y/o una réplica de tejido conjuntivo, en los que las réplicas pueden derivarse sustancialmente o completamente de fuentes de origen no animal. Un ejemplo no limitativo de un producto cárnico de este tipo es un producto de carne de vacuno picada ultramagra complementada con una réplica de grasa de origen no animal que puede mejorar la textura y la sensación en la boca a la vez que conserva los beneficios de salud de un producto consumible bajo en grasa animal. Tales variantes alternativas dan como resultado productos con propiedades que recapitulan más estrechamente características clave asociadas con la preparación y el consumo de carne, pero que son menos costosos y están asociados con un menor impacto medioambiental, menos impacto en el bienestar animal o beneficios de salud mejorados para el consumidor.

La organización física del producto de sucedáneo de carne puede manipularse controlando la ubicación, la organización, el ensamblaje o la orientación de las réplicas de músculo, grasa y/o tejido conjuntivo descritas en el presente documento. En algunos casos, el producto se diseña de tal manera que las réplicas descritas en el presente documento se asocian entre sí como en la carne. En algunos casos, el producto consumible se diseña de manera que, después del cocinado, las réplicas descritas en el presente documento se asocian entre sí como en la carne cocinada. En algunas variantes, una o más de las réplicas de músculo, grasa y/o tejido conjuntivo se combinan de tal manera que recapitula la organización física de diferentes cortes o preparaciones de carne. En una variante de ejemplo, las réplicas se combinan de tal manera que se aproxima a la organización física de carne picada natural. En otras variantes, las réplicas se combinan de tal manera que se aproxima a diferentes cortes de carne de vacuno, tales como, por ejemplo, lomo alto, filete miñón, asado londinense, entre otros.

Indicadores para cocinado de carne

En algunos casos, puede usarse un polipéptido de la divulgación en una composición de la divulgación como indicador para cocinado de carne. La liberación de odorizantes tras el cocinado es un aspecto importante del consumo de carne. En algunas variantes, el producto consumible es una réplica de la carne que se compone totalmente de productos de origen no animal que cuando se cocinan generan un aroma reconocible por los seres humanos como típico del cocinado de carne de vacuno. En algunos casos, el producto consumible cuando se cocina genera un aroma reconocible por los seres humanos como típico del cocinado de carne de cerdo. En algunos casos, el producto consumible es una réplica de la carne que se compone totalmente de productos de origen no animal que cuando se cocina genera un aroma reconocible por los seres humanos como típico del cocinado de beicon. En algunos casos, el producto consumible es una réplica de la carne que se compone totalmente de productos de origen no animal que cuando se cocina genera un aroma reconocible por los seres humanos como típico del cocinado de pollo. En algunas variantes, el producto consumible es una réplica de la carne que se compone totalmente de productos de origen no animal que cuando se cocina genera un aroma reconocible por los seres humanos como típico del cocinado de cordero. En algunos casos, el producto consumible es una réplica de la carne que se compone totalmente de productos de origen no animal que cuando se cocina genera un aroma reconocible por los seres humanos como típico del cocinado de pescado. En algunos casos, el producto consumible es una réplica de la carne que se compone totalmente de productos de origen no animal que cuando se cocina genera un aroma reconocible por los seres humanos como típico del cocinado de pavo. En algunos casos el producto consumible es una réplica de la carne que se compone principal o totalmente de componentes derivados de fuentes de origen no animal, con un odorizante que se libera tras el cocinado. En algunas variantes, el producto consumible es una réplica de la carne que se compone principal o totalmente de componentes derivados de fuentes de origen no animal, con un odorizante que se produce por reacciones químicas que tienen lugar tras el cocinado. En algunos casos, el producto consumible es una réplica de la carne que se compone principal o totalmente de componentes derivados de fuentes de origen no animal, que comprende un polipéptido de la divulgación y mezclas de proteínas, péptidos, aminoácidos, nucleótidos, azúcares y polisacáridos y grasas en combinaciones y disposiciones espaciales que permiten que estos compuestos experimenten reacciones químicas durante el cocinado para producir odorizantes y compuestos productores de sabor. En algunas variantes, el producto consumible es una réplica de la carne que se compone principal o totalmente de componentes derivados de fuentes de origen no animal (por ejemplo, un polipéptido de la divulgación), con un odorizante volátil o lábil que se libera tras el cocinado. En algunos casos, el producto consumible es un método para preparar una réplica de la carne en el que se calientan las réplicas de la carne compuestas principal o totalmente de componentes derivados de fuentes de origen no animal para liberar un odorizante volátil o lábil.

Los odorizantes liberados durante el cocinado de carne se generan por reacciones que pueden implicar como reactantes grasas, proteína, aminoácidos, péptidos, nucleótidos, ácidos orgánicos, compuestos de azufre, azúcares y otros hidratos de carbono. En algunos casos, un reactante puede ser un polipéptido de la divulgación (por ejemplo, una globina, una globina secretada). En algunos casos, los odorizantes que se combinan durante el cocinado de carne se identifican y ubican cerca entre sí en el producto consumible, de manera que tras el cocinado del producto consumible se combinan los odorizantes. En algunas variantes, los componentes de sabor y aroma característicos se producen durante el procedimiento de cocinado por reacciones químicas que implican aminoácidos, grasas y azúcares encontrados en plantas, así como en carne. En algunos casos, los componentes de sabor y aroma característicos se producen la mayoría durante el procedimiento de cocinado por reacciones químicas que implican uno o más aminoácidos, grasas, péptidos, nucleótidos, ácidos orgánicos, compuestos de azufre, azúcares y otros hidratos de carbono encontrados en plantas, así como en carne.

Algunas reacciones que generan odorizantes liberados durante el cocinado de carne pueden catalizarse por hierro, en particular el hierro del hemo, que puede estar compuesto (por ejemplo, unido) por un polipéptido de la divulgación. Por tanto, en algunos casos, algunos de los componentes de sabor y aroma característicos se producen durante el procedimiento de cocinado por reacciones químicas catalizadas por hierro. En algunas variantes, algunos de los componentes de sabor y aroma característicos se producen durante el procedimiento de cocinado por reacciones químicas catalizadas por hemo. En algunos casos, algunos de los componentes de sabor y aroma característicos se producen durante el procedimiento de cocinado por reacciones químicas catalizadas por el hierro del hemo en leghemoglobina. En algunos casos, algunos de los componentes de sabor y aroma característicos se producen durante el procedimiento de cocinado por reacciones químicas catalizadas por el hierro del hemo en una hemoproteína (por ejemplo, los polipéptidos enumerados en la figura 9, hemoglobina, mioglobina, neuroglobina, citoglobina, leghemoglobina, hemoglobina no simbiótica, globina I de Hell’s gate, hemoglobinas bacterianas, mioglobinas de ciliado, flavohemoglobinas, androglobina, citoglobina, globina E, globina X, globina Y, mioglobina, leghemoglobinas, eritrocruorinas, hemoglobinas beta, hemoglobinas alfa, hemoglobinas no simbióticas, protoglobinas, cianoglobinas, globina I de Hell’s gate, hemoglobinas bacterianas, mioglobinas de ciliado, histoglobinas y neuroglobinas, etc.).

Indicadores del color

El color de la carne es una parte importante de la experiencia de cocinado y consumo de la carne. Por ejemplo, los cortes de carne de vacuno son de un color rojo característico en estado crudo y pasan gradualmente a un color marrón durante el cocinado. Como otro ejemplo, las carnes blancas tales como el pollo o la carne de cerdo tienen un color rosa característico en su estado crudo y pasan gradualmente a un color blanco o amarronado durante el cocinado. La cantidad de la transición de color se usa para indicar la progresión del cocinado de carne de vacuno y valorar el tiempo y la temperatura de cocinado para producir el estado deseado de acabado. La divulgación describe un producto sucedáneo de carne no basado en carne que proporciona un indicador visual de progresión del cocinado. En algunos casos, el indicador visual es un indicador de color que experimenta una transición de color durante el cocinado. En casos particulares, el indicador de color recapitula la transición de color de un corte de carne a medida que la carne progresa de un estado crudo a un estado cocinado. En algunas variantes, el indicador de color proporciona un color rojo al producto sucedáneo de carne antes del cocinado para indicar un estado crudo y produce que el producto sucedáneo de carne pase a un color marrón durante la progresión del cocinado. En algunos casos, el indicador de color proporciona un color rosa al producto sucedáneo de carne antes del cocinado para indicar un estado crudo y produce que el producto sucedáneo de carne pase a un color blanco o marrón durante la progresión del cocinado.

El determinante principal de la definición nutricional del color de la carne es la concentración de proteínas que portan hierro en la carne. En el componente de músculo esquelético de productos cárnicos, una de las principales proteínas que portan hierro es la mioglobina. Así, en algunos casos, la composición es un producto cárnico consumible (por ejemplo, una réplica) que comprende una proteína que porta hierro. En algunas variantes, la composición comprende aproximadamente el 0,05%, aproximadamente el 0,1%, aproximadamente el 0,2%, aproximadamente el 0,3%, aproximadamente el 0,4%, aproximadamente el 0,5%, aproximadamente el 0,6%, aproximadamente el 0,7%, aproximadamente el 0,8%, aproximadamente el 0,9%, aproximadamente el 1%, aproximadamente el 1,1%, aproximadamente el 1,2%, aproximadamente el 1,3%, aproximadamente el 1,4%, aproximadamente el 1,5%, aproximadamente el 1,6%, aproximadamente el 1,7%, aproximadamente el 1,8%, aproximadamente el 1,9%, aproximadamente el 2%, o más de aproximadamente el 2% de una proteína que porta hierro en peso seco o peso total. En algunos casos, la composición comprende al menos aproximadamente el 10% de un polipéptido de la divulgación. En algunos casos, la composición comprende como máximo aproximadamente el 10% de un polipéptido de la divulgación. En algunos casos, la proteína que porta hierro se ha aislado y purificado de una fuente. En otros casos, la proteína que porta hierro no se ha aislado ni purificado. En algunos casos, la fuente de la proteína que porta hierro es una fuente de origen animal, o una fuente de origen no animal tal como una planta, un hongo u organismos modificados genéticamente tales como, por ejemplo, bacterias o levadura. En algunos casos, la proteína que porta hierro es mioglobina. En algunos casos, la composición comprende un producto consumible que es una réplica de la carne a base de vegetales que tiene mioglobina animal añadida. Así, por ejemplo, una réplica de carne de ternera puede tener aproximadamente el 0,4-1% de mioglobina. En algunos casos, la proteína que porta hierro es leghemoglobina. En algunas variantes, la composición comprende un producto consumible que es una réplica de la carne a base de vegetales que tiene leghemoglobina añadida. Así, por ejemplo, una réplica de carne de ternera puede tener aproximadamente el 0,4-1% leghemoglobina. En algunos casos, la proteína que porta hierro es un citocromo. En algunas variantes, la composición comprende un producto consumible que es una réplica de la carne a base de vegetales que tiene un citocromo añadido. Así, por ejemplo, una réplica de carne de ternera puede tener aproximadamente el 0,4-1% de un citocromo. En algunos casos, el producto consumible es una réplica de la carne a base de vegetales que contiene hemoglobina. En algunos casos, la proteína que porta hierro es un polipéptido de la divulgación (por ejemplo, una globina).

Las proteínas que contienen hierro adicionales existen en la naturaleza. En algunos casos, la composición (por ejemplo, producto consumible) comprende una proteína que contiene hierro que no es mioglobina. En algunas variantes, la composición (por ejemplo, producto consumible) no contiene mioglobina. En algunos casos, las composiciones (por ejemplo, producto consumible) no contienen hemoglobina. En algunos casos, el producto consumible es una réplica de la carne que comprende una proteína que contiene hierro distinta de mioglobina o hemoglobina (por ejemplo, las globinas enumeradas en la figura 9, y descritas en el presente documento, por ejemplo, hemoglobina, mioglobina, neuroglobina, citoglobina, leghemoglobina, hemoglobina no simbiótica, globina I de Hell’s gate, hemoglobinas bacterianas, mioglobinas de ciliado, flavohemoglobinas).

En algunos casos, la composición comprende un producto consumible que es una réplica de la carne que se compone principal o totalmente de componentes derivados de fuentes de origen no animal, incluyendo una réplica de tejido muscular, una réplica de tejido adiposo, una réplica de tejido conjuntivo y leghemoglobina. En algunas variantes, la composición comprende un producto consumible que es una réplica de la carne que se compone principal o totalmente de componentes derivados de fuentes de origen no animal, que contiene una hemoproteína. En algunos casos, la composición comprende un producto consumible que es una réplica de la carne que se compone principal o totalmente de componentes derivados de fuentes de origen no animal, que contiene una leghemoglobina. En algunos casos, la composición comprende un producto consumible que es una réplica de la carne que se compone principal o totalmente de componentes derivados de fuentes de origen no animal, que contiene un miembro de la familia de proteínas globina. En algunos casos, la composición comprende un producto consumible que es una réplica de la carne que se compone principal o totalmente de componentes derivados de fuentes de origen no animal, con un alto contenido de hierro de una hemoproteína. En algunas variantes, el contenido de hierro es similar al de la carne. En algunos casos, el producto consumible tiene el color rojo distintivo de la carne, proporcionado tal color por la leghemoglobina.

Se usa leghemoglobina, en algunos casos, como un indicador de que el producto consumible está acabado de cocinar. En algunas variantes de la divulgación, se da a conocer un método para cocinar un producto consumible que comprende la detección de leghemoglobina que ha migrado desde el interior del producto consumible hasta la superficie cuando el producto se cocina. En algunas variantes de la divulgación, se describe un método para cocinar un producto consumible que comprende la detección del cambio de color de rojo a marrón cuando se cocina el producto.

El estado de oxidación del ion de hierro en la leghemoglobina puede ser importante para su color. La leghemoglobina con el hierro del hemo en el estado de oxidación 2 puede parecer de un color rojo intenso, mientras que la leghemoglobina con el hierro del hemo en el estado de oxidación 3 puede parecer rojo amarronado. Por tanto, usando leghemoglobina como fuente de color rojo en una réplica de la carne, por ejemplo, puede ser deseable reducir el hierro del hemo del estado 3 al estado 2. El hierro del hemo en leghemoglobina puede cambiarse del estado oxidado (+3) al estado reducido (+2) con reactivos reductores.

Una hemoproteína puede usarse, en algunos casos, como un indicador de que el producto consumible está acabado de cocinar. En algunos, se da a conocer un método para cocinar un producto consumible que comprende la detección de leghemoglobina que ha migrado desde el interior del producto consumible hasta la superficie cuando se cocina el producto. En algunos casos, se da a conocer un método para cocinar un producto consumible que comprende la detección del cambio de color de rojo a marrón cuando se cocina el producto.

Una hemoproteína (por ejemplo, hemoglobina, mioglobina, neuroglobina, citoglobina, leghemoglobina, hemoglobina no simbiótica, globina I de Hell’s gate, hemoglobinas bacterianas, mioglobinas de ciliado, flavohemoglobinas) puede usarse, en algunos casos, como un indicador de que el producto consumible está acabado de cocinar. Así, en algunos casos, la divulgación describe un método para cocinar un producto consumible que comprende la detección de leghemoglobina que ha migrado desde el interior del producto consumible hasta la superficie cuando se cocina el producto. La divulgación describe un método para cocinar un producto consumible que comprende la detección del cambio de color de rojo a marrón cuando se cocina el producto.

Productos alimenticios que comprenden polipéptido purificado

En algunos casos, un polipéptido de la divulgación (por ejemplo, un polipéptido que contiene hemo, una globina tal como leghemoglobina) se añade a la carne para mejorar las propiedades de la carne. Véanse, por ejemplo, los documentos WO 2014/110532, WO 2014/110539 y Wo 2013/010042. Por ejemplo, una disolución que contiene polipéptidos puede inyectarse en carne cruda o cocinada. En otro ejemplo, una disolución que comprende un polipéptido de la divulgación se hace gotear sobre la carne o un producto consumible para mejorar el aspecto. En algunos casos, la publicidad, fotografía o videografía de productos alimenticios tales como carne o un sucedáneo de carne se mejora con leghemoglobina.

Por ejemplo, pueden combinarse polipéptidos, leghemoglobina y hemoglobina, con otros componentes de la réplica de la carne a base de vegetales. En algunos casos, los polipéptidos se capturan en un gel que contiene otros componentes, por ejemplo, lípidos y/o proteínas. En algunos casos, se combinan múltiples geles con hemoproteínas no basadas en geles. En algunos casos, la combinación de los polipéptidos y los otros compuestos del producto consumible se realiza para garantizar que las hemoproteínas puedan difundirse a través del producto consumible. En algunas variantes, el producto consumible comprende una disolución que contiene hemoproteínas, por ejemplo, una disolución de leghemoglobina. En algunos casos, el producto consumible se remoja en una disolución que contiene hemoproteínas, por ejemplo, una disolución de leghemoglobina durante 1, 5, 10, 15, 20 ó 30 horas. En algunas variantes, el producto consumible se remoja en una disolución que contiene hemo, por ejemplo, una disolución de leghemoglobina durante 1,5, 10, 15, 30 ó 45 minutos.

Réplicas de músculo

Un gran número de productos cárnicos comprende una alta proporción de músculo esquelético. Por consiguiente, la presente divulgación describe una composición derivada de fuentes de origen no animal que replica o se aproxima a características clave de músculo esquelético animal. La presente divulgación también describe un producto sucedáneo de carne que comprende una composición derivada de fuentes de origen no animal que replica o se aproxima a músculo esquelético animal. Una composición de este tipo se denominará en el presente documento “réplica de músculo”. En algunos casos, la réplica de músculo y/o el producto sucedáneo de carne que comprende la réplica de músculo se deriva parcialmente de fuentes de origen animal. En algunos casos, la réplica de músculo y/o el producto sucedáneo de carne que comprende la réplica de músculo se deriva totalmente de fuentes de origen no animal.

Muchos productos cárnicos comprenden una alta proporción de músculo esquelético estriado en el que las fibras musculares individuales se organizan principalmente de una manera isotrópica. Por consiguiente, en algunas variantes, la réplica de músculo comprende fibras que están en cierta medida organizadas isotrópicamente. En algunos casos, las fibras comprenden un componente proteico. En algunos casos, las fibras comprenden aproximadamente el 1%, aproximadamente el 2%, aproximadamente el 5%, aproximadamente el 10%, aproximadamente el 15%, aproximadamente el 20%, aproximadamente el 30%, aproximadamente el 40%, aproximadamente el 50%, aproximadamente el 60%, aproximadamente el 70%, aproximadamente el 80%, aproximadamente el 90%, aproximadamente el 95%, aproximadamente el 99% o más de un componente prot El músculo esquelético animal contiene normalmente alrededor del 1% de mioglobina, pero puede ser como mucho el 7% de masa muscular en algunos músculos de ballena. En algunas variantes, la réplica de músculo comprende hemoglobinas de esta divulgación.

En algunos casos, el componente proteico comprende una o más proteínas aisladas purificadas. Por ejemplo, la una o más proteínas aisladas purificadas puede comprender la globulina 8S de semillas de soja verde, o la fracción de albúmina o globulina de semillas de guisante. Estas proteínas proporcionan ejemplos de proteínas con propiedades favorables para construir réplicas de la carne debido a su capacidad para formar geles con texturas similares a tejido adiposo o músculo animal. Los ejemplos de la una o más proteínas aisladas purificadas se describen en el presente documento. La lista de posibles candidatas es, en el presente documento, esencialmente abierta y puede incluir rubisco, cualquier proteína principal de almacenamiento de semillas, proteínas aisladas de hongos, bacterias, arqueas, virus o microorganismos modificados por ingeniería genética, o sintetizada in vitro. Las proteínas pueden diseñarse de manera artificial para emular propiedades físicas de tejido muscular animal. Las proteínas pueden diseñarse de manera artificial para emular propiedades físicas de tejido muscular animal. En algunas variantes, una o más proteínas aisladas purificadas representan aproximadamente el 0,1%, el 0,2%, el 0,5%, el 1%, el 2%, el 3%, el 4%, el 5%, el 6%, el 7%, el 8%, el 9%, el 10%, el 15%, el 20%, el 25%, el 30%, el 35%, el 40%, el 45%, el 50%, el

55%, el 60%, el 65%, el 70%, el 75%, el 80%, el 85%, el 90%, el 95%, el 99% o más del componente proteico en peso.

El músculo esquelético de animales, tales como ganado vacuno de carne, contiene normalmente cantidades sustanciales de glucógeno, que puede comprender del orden de >1% de la masa del tejido muscular en el momento de sacrificio. Después del sacrificio, una fracción de este glucógeno continúa metabolizándose produciendo productos incluyendo ácido láctico, que contribuye a reducir el pH del tejido muscular, una cualidad deseable en la carne. El glucógeno es un polímero ramificado de glucosa unido entre sí por enlaces alfa (1->4) glucosídicos en cadenas lineales, con puntos de ramificación que comprenden enlaces alfa (1->6) glucosídicos. Los almidones de plantas, particularmente amilopectinas, son también polímeros ramificados de glucosa unidos entre sí por enlaces alfa (1->4) glucosídicos en cadenas lineales, con puntos de ramificación que comprenden enlaces alfa (1->6) glucosídicos y, por tanto, pueden usarse como un análogo de glucógeno en la construcción de réplicas de la carne.

Por tanto, en algunos casos, el músculo o la réplica de la carne incluyen un almidón o una pectina.

Los componentes adicionales de tejido muscular animal incluyen sodio, potasio, calcio, magnesio, otros iones metálicos, ácido láctico, otros ácidos orgánicos, aminoácidos libres, péptidos, nucleótidos y compuestos de azufre.

Por tanto, en algunos casos, la réplica de músculo puede incluir sodio, potasio, calcio, magnesio, otros iones metálicos, ácido láctico, otros ácidos orgánicos, aminoácidos libres, péptidos, nucleótidos y compuestos de azufre.

En algunos casos, la concentración de sodio, potasio, calcio, magnesio, otros iones metálicos, ácido láctico, otros ácidos orgánicos, aminoácidos libres, péptidos, nucleótidos y/o compuestos de azufre en la réplica de músculo o el producto consumible están dentro de >10% de las concentraciones encontradas en un músculo o una carne que va a replicarse.

La divulgación describe métodos para elaborar una réplica de músculo. En algunos casos, la composición se conforma en fibras asimétricas antes de la incorporación en el producto consumible. En algunos casos, estas fibras replican fibras musculares. En algunos casos, las fibras son fibras tejidas. En otras variantes, las fibras son fibras extruidas. Por consiguiente, la presente divulgación describe métodos para producir fibras proteicas asimétricas o

tejidas. En algunos casos, las fibras se forman mediante extrusión del componente proteico a través de una extrusora.

En algunos casos, la extrusión puede realizarse usando una extrusora de doble husillo MPF19 (APV Baker, Grand Rapids, Mich.) con una boquilla de enfriamiento. La boquilla de enfriamiento puede enfriar el extruido antes de que el extruido vuelva a presión atmosférica, por tanto, se impide sustancialmente la expansión o el inflado del producto final. En el aparato MPF19, pueden añadirse por separado alimentación seca y líquido y mezclarse en el tambor giratorio. Los parámetros de extrusión pueden ser, por ejemplo: velocidad de husillo de 200 rpm, temperatura de producto en la boquilla de 150°C, velocidad de alimentación de 23 g/min, y velocidad de flujo de agua de 11 g/min. La temperatura de producto puede medirse durante la extrusión mediante un termopar en el extremo del tambor giratorio de extrusión. Pueden realizarse observaciones sobre el color, la opacidad, la estructura y la textura para cada muestra recogida. Las muestras recogidas pueden secarse opcionalmente a temperatura ambiente durante la noche, luego molerse hasta dar un polvo fino (con un tamaño de <60 de malla) usando una trituradora de alimentos Braun. El pH de las muestras puede medirse por duplicado usando suspensiones al 10% (p/v) de muestra en polvo en agua destilada.

Réplica de grasa

La grasa animal es importante para la experiencia de consumo de carne cocinada. Por consiguiente, la presente divulgación describe una composición derivada de fuentes de origen no animal que recapitula características clave de la grasa animal. Además, la presente divulgación describe un producto sucedáneo de carne que comprende una composición derivada de fuentes de origen no animal que recapitula grasa animal. Una composición de este tipo se denominará en el presente documento “réplica de grasa”. En algunos casos, la réplica de grasa y/o el producto sucedáneo de carne que comprende la réplica de grasa se derivan parcialmente de fuentes de origen animal.

En algunos casos, el producto sucedáneo de carne tiene un componente de grasa. En algunos casos, el contenido de grasa del producto consumible es del 1%, el 5%, el 10%, el 15%, el 20%, el 25%, el 30%, el 35%, el 40%, el 45%, el 50%, el 55% o el 60% de grasa. En algunas variantes, la réplica de grasa comprende un gel con gotitas de grasa suspendidas en el mismo. En algunos casos, el gel es un gel suave elástico que comprende proteínas y opcionalmente hidratos de carbono. En variantes particulares, las proteínas usadas en el gel son proteínas vegetales o microbianas. En algunos casos, las proteínas usadas en la réplica de grasa pueden incluir rubisco, cualquier proteína principal de almacenamiento de semillas, proteínas aisladas de hongos, bacterias, arqueas, virus o microorganismos modificados por ingeniería genética, o sintetizada in vitro. Las proteínas pueden diseñarse de manera artificial para emular propiedades físicas de la grasa animal. Las proteínas pueden diseñarse de manera artificial para emular propiedades físicas de la grasa animal.

Las gotitas de grasa usadas en algunas variantes de la presente divulgación pueden ser de una variedad de fuentes. En algunos casos, las fuentes son fuentes de origen no animal. En casos particulares, las fuentes son fuentes de origen vegetal. Los ejemplos no limitativos de aceites incluyen aceite de maíz, aceite de oliva, aceite de soja, aceite de cacahuete, aceite de nuez, aceite de almendra, aceite de sésamo, aceite de semilla de algodón, aceite de colza, aceite de canola, aceite de cártamo, aceite de girasol, aceite de linaza, aceite de algas, aceite de palma, aceite de palmiste, aceite de coco, aceite de babasú, manteca de karité, manteca de mango, manteca de cacao, aceite de germen de trigo, aceite de afrecho de arroz, aceites producidos por bacterias, algas, arqueas u hongos o bacterias, algas, arqueas u hongos modificados por ingeniería genética, triglicéridos, monoglicéridos, diglicéridos, esfingósidos, glicolípidos, lecitina, lisolecitina, ácidos fosfatídicos, ácidos lisofosfatídicos, ácido oleico, ácido palmitoleico, ácido palmítico, ácido mirístico, ácido láurico, ácido miristoleico, ácido caproico, ácido cáprico, ácido caprílico, ácido pelargónico, ácido undecanoico, ácido linoleico, ácido eicosanoico 20:1, ácido araquidónico, ácido eicosapentanoico, ácido docosahexanoico, ácido linoleico conjugado 18:2, ácido oleico conjugado, o ésteres de: ácido oleico, ácido palmitoleico, ácido palmítico, ácido mirístico, ácido láurico, ácido miristoleico, ácido caproico, ácido cáprico, ácido caprílico, ácido pelargónico, ácido undecanoico, ácido linoleico, ácido eicosanoico 20:1, ácido araquidónico, ácido eicosapentanoico, ácido docosahexanoico, ácido linoleico conjugado 18:2 o ácido oleico conjugado, o ésteres de glicerol de ácido oleico, ácido palmitoleico, ácido palmítico, ácido mirístico, ácido láurico, ácido miristoleico, ácido caproico, ácido cáprico, ácido caprílico, ácido pelargónico, ácido undecanoico, ácido linoleico, ácido eicosanoico 20:1, ácido araquidónico, ácido eicosapentanoico, ácido docosahexanoico, ácido linoleico conjugado 18:2, o ácido oleico conjugado, o derivados de triglicéridos de ácido oleico, ácido palmitoleico, ácido palmítico, ácido mirístico, ácido láurico, ácido miristoleico, ácido caproico, ácido cáprico, ácido caprílico, ácido pelargónico, ácido undecanoico, ácido linoleico, ácido eicosanoico 20:1, ácido araquidónico, ácido eicosapentanoico, ácido docosahexanoico, ácido linoleico conjugado 18:2 o ácido oleico conjugado.

En algunos casos, las gotitas de grasa se derivan de aceite de pulpa o semillas. En otros casos, la fuente puede ser levadura o moho. Por ejemplo, en una variante, las gotitas de grasa comprenden triglicéridos derivados de Mortierella isabellina.

En algunas variantes, los aceites vegetales se modifican para parecerse a grasas animales. Los aceites vegetales pueden modificarse con aromatizante u otros agentes para recapitular el sabor y el olor de la carne durante y después del cocinado. Por consiguiente, algunas variantes de la divulgación implican métodos para someter a prueba la semejanza cualitativa entre las propiedades de cocinado de grasa animal y las propiedades de cocinado de aceites vegetales en el producto consumible.

En algunos casos, la réplica de grasa comprende un componente proteico que comprende una o más proteínas aisladas purificadas. Las proteínas purificadas contribuyen al sabor y la textura de la réplica de la carne. En algunas variantes, las proteínas purificadas pueden estabilizar grasas emulsionadas. En algunos casos, las proteínas purificadas pueden formar geles tras la desnaturalización o reticulación enzimática, que replican el aspecto y la textura de la grasa animal. Los ejemplos y las variantes de las una o más proteínas aisladas purificadas se describen en el presente documento. En casos particulares, la una o más proteínas aisladas comprenden una proteína aislada de la familia de las legumbres de plantas. Los ejemplos no limitativos de plantas leguminosas se describen en el presente documento, aunque son posibles variaciones con otras legumbres. En algunos casos, la planta leguminosa es una planta de guisantes. En algunos casos, las proteínas aisladas purificadas estabilizan emulsiones. En algunos casos, las proteínas aisladas purificadas forman geles tras la reticulación o reticulación enzimática. En algunas variantes, las proteínas aisladas purificadas comprenden proteínas de almacenamiento de semillas. En algunos casos, las proteínas aisladas purificadas comprenden albúmina. En algunos casos, las proteínas aisladas purificadas comprenden globulina. En una variante particular, la proteína aislada purificada es una proteína de albúmina de guisante purificada. En otra variante particular, la proteína aislada purificada es una proteína de globulina de guisante purificada. En otra variante particular, la proteína aislada purificada es una globulina 8S de soja verde. En otra variante particular, la proteína aislada purificada es una oleosina. En otra variante particular, la proteína aislada purificada es una caloleosina. En otra variante particular, la proteína aislada purificada es rubisco. En algunas variantes, el componente proteico comprende aproximadamente el 0,1%, el 0,5%, el 1%, el 2%, el 5%, el 10%, el 15%, el 20%, el 25%, el 30%, el 35%, el 40%, el 45%, el 50%, el 55%, el 60%, el 65%, el 70%, el 75%, el 80%, el 85%, el 90% o más de la réplica de grasa en peso seco o peso total. En algunas variantes, el componente proteico comprende aproximadamente el 0,1-5%, aproximadamente el 0,5-10%, aproximadamente el 1-20%, aproximadamente el 5-30%, aproximadamente el 10-50%, aproximadamente el 20-70%, o aproximadamente el 30-90% o más de la réplica de grasa en peso seco o peso total. En algunas variantes, el componente proteico comprende una disolución que contiene una o más proteínas aisladas purificadas.

En algunos casos, la réplica de grasa comprende enzimas de reticulación que catalizan reacciones que conducen a reticulaciones covalentes entre proteínas. Pueden usarse enzimas de reticulación para crear o estabilizar la estructura y textura deseadas de la réplica de tejido adiposo, para imitar la textura deseada de una grasa animal deseada equivalente. Los ejemplos no limitativos de enzimas de reticulación incluyen, por ejemplo, transglutaminasa, lisil oxidasas u otras amino oxidasas (por ejemplo, lisil oxidasa de Pichia pastoris). En algunos casos, las enzimas de reticulación se aíslan y purifican de una fuente de origen no animal, cuyos ejemplos y versiones se describen en el presente documento. En algunos casos, la réplica de grasa comprende al menos el 0,0001%, o al menos el 0,001%, o al menos el 0,01%, o al menos el 0,1%, o al menos el 1% (p/v) de una enzima de reticulación. En variantes particulares, la enzima de reticulación es transglutaminasa.

La divulgación describe además métodos para elaborar una réplica de grasa. En algunos casos, las gotitas de grasa se suspenden en un gel. En algunas variantes, la presente divulgación describe métodos para producir gotitas de grasa suspendidas en el gel. La grasa puede aislarse y homogeneizarse. Por ejemplo, puede usarse una mezcla de disolvente orgánico para ayudar a mezclar un lípido. Luego puede eliminarse el disolvente. En este punto, el lípido puede congelarse, liofilizarse o almacenarse. Así, en algunas variantes, la divulgación describe un método para aislar y almacenar un lípido que se ha seleccionado para tener características similares a la grasa animal. Luego puede hidratarse la película o torta lipídica. La hidratación puede utilizar agitación o cambios de temperatura. La hidratación puede producirse en una disolución precursora para dar un gel. Después de la hidratación, puede tratarse la suspensión de lípidos por ultrasonidos o extruirse para alterar adicionalmente las propiedades del lípido en la disolución.

En algunos casos, la réplica de grasa se agrupa para aproximarse a la organización del tejido adiposo en la carne. En algunos casos, algunos o todos los componentes de la réplica de grasa se suspenden en un gel. En diversas variantes, el gel puede ser un gel proteínico, un hidrogel, un organogel o un xerogel. En algunas variantes, el gel puede espesarse hasta la consistencia deseada usando un agente basado en polisacáridos o proteínas. Por ejemplo, pueden usarse fécula, arrurruz, almidón de maíz, almidón de katakuri, almidón de patata, palmera de sagú, tapioca, alginina, goma guar, goma de algarrobo, goma de xantano, colágeno, claras de huevo, furcelarán, gelatina, agar, carragenano, celulosa, metilcelulosa, hidroximetilcelulosa, goma acacia, konjac, almidón, pectina, amilopectina o proteínas derivadas de legumbres, cereales, nueces, otras semillas, hojas, algas, bacterias u hongos, solos o en combinación, para espesar el gel, formando una arquitectura o estructura para el producto consumible.

En variantes particulares, la réplica de grasa es una emulsión que comprende una disolución de una o más proteínas y una o más grasas suspendidas en la misma como gotitas. En algunos casos, la emulsión se estabiliza por una o más enzimas de reticulación en un gel. En algunos casos, la una o más proteínas en disolución son proteínas aisladas purificadas. En algunos casos, las proteínas aisladas purificadas comprenden una fracción enriquecida en albúmina de guisante purificada. En algunas variantes, las proteínas aisladas purificadas comprenden una fracción enriquecida en globulina de guisante purificada. En algunos casos, las proteínas aisladas purificadas comprenden una fracción enriquecida en globulina 8S de soja verde purificada. En algunos casos, las proteínas aisladas purificadas comprenden una fracción enriquecida en rubisco. En algunos casos, la una o más grasas se derivan de aceites a base de vegetales. En algunos casos, la una o más grasas se derivan de unos o más de: aceite de maíz, aceite de oliva, aceite de soja, aceite de cacahuete, aceite de nuez, aceite de almendra, aceite de sésamo, aceite de semillas de algodón, aceite de colza, aceite de canola, aceite de cártamo, aceite de girasol, aceite de linaza, aceite de algas, aceite de palma, aceite de palmiste, aceite de coco, aceite de babasú, manteca de karité, manteca de mango, manteca de cacao, aceite de germen de trigo, aceite de afrecho de arroz, aceites producidos por bacterias, algas, arqueas u hongos o bacterias, algas, arqueas u hongos modificados por ingeniería genética, triglicéridos, monoglicéridos, diglicéridos, esfingósidos, glicolípidos, lecitina, lisolecitina, ácidos fosfatídicos, ácidos lisofosfatídicos, ácido oleico, ácido palmitoleico, ácido palmítico, ácido mirístico, ácido láurico, ácido miristoleico, ácido caproico, ácido cáprico, ácido caprílico, ácido pelargónico, ácido undecanoico, ácido linoleico, ácido eicosaonico 20:1, ácido araquidónico, ácido eicosapentanoico, ácido docosahexanoico, ácido linoleico conjugado 18:2, ácido oleico conjugado, o ésteres de: ácido oleico, ácido palmitoleico, ácido palmítico, ácido mirístico, ácido láurico, ácido miristoleico, ácido caproico, ácido cáprico, ácido caprílico, ácido pelargónico, ácido undecanoico, ácido linoleico, ácido eicosaonico 20:1, ácido araquidónico, ácido eicosapentanoico, ácido docosahexanoico, ácido linoleico conjugado 18:2, o ácido oleico conjugado, o ésteres de glicerol de ácido oleico, ácido palmitoleico, ácido palmítico, ácido mirístico, ácido láurico, ácido miristoleico, ácido caproico, ácido cáprico, ácido caprílico, ácido pelargónico, ácido undecanoico, ácido linoleico, ácido eicosaonico 20:1, ácido araquidónico, ácido eicosapentanoico, ácido docosahexanoico, ácido linoleico conjugado 18:2, o ácido oleico conjugado, o derivados de triglicéridos de ácido oleico, ácido palmitoleico, ácido palmítico, ácido mirístico, ácido láurico, ácido miristoleico, ácido caproico, ácido cáprico, ácido caprílico, ácido pelargónico, ácido undecanoico, ácido linoleico, ácido eicosaonico 20:1, ácido araquidónico, ácido eicosapentanoico, ácido docosahexanoico, ácido linoleico conjugado 18:2, o ácido oleico conjugado. En aún variantes incluso más particulares, la una o más grasas es un aceite de afrecho de arroz. En otra variante particular, la una o más grasas es un aceite de canola. En algunas variantes, la enzima de reticulación es transglutaminasa, lisil oxidasa u otra amino oxidasa. En algunas variantes, la enzima de reticulación es transglutaminasa. En variantes particulares, la réplica de grasa es una emulsión con alto contenido de grasa que comprende una disolución de proteínas de albúmina de guisante purificada emulsionada con el 40-80% de aceite de afrecho de arroz, estabilizada con el 0,5-5% (p/v) de transglutaminasa para dar un gel. En algunas variantes, la réplica de grasa es una emulsión con alto contenido de grasa que comprende una disolución de proteínas de globulina 8S de soja verde parcialmente purificada emulsionada con el 40-80% de aceite de afrecho de arroz, estabilizada con el 0,5-5% (p/v) de transglutaminasa para dar un gel. En algunas variantes, la réplica de grasa es una emulsión con alto contenido de grasa que comprende una disolución de proteínas de globulina 8S de soja verde parcialmente purificada emulsionada con el 40-80% de aceite de canola, estabilizada con el 0,5-5% (p/v) de transglutaminasa para dar un gel. En algunas variantes, la réplica de grasa es una emulsión con alto contenido de grasa que comprende una disolución de proteínas de albúmina de guisante purificada emulsionada con >40-80% de aceite de afrecho de arroz, estabilizada con el 0,0001-1% (p/v) de transglutaminasa para dar un gel. En algunas variantes, la réplica de grasa es una emulsión con alto contenido de grasa que comprende una disolución de proteínas de globulina 8S de soja verde parcialmente purificada emulsionada con el 40-80% de aceite de afrecho de arroz, estabilizada con el 0,0001 - 1% (p/v) de transglutaminasa para dar un gel. En algunas variantes, la réplica de grasa es una emulsión con alto contenido de grasa que comprende una disolución de proteínas de globulina 8S de soja verde parcialmente purificada emulsionada con el 40-80% de aceite de canola, estabilizada con el 0,0001 -1% (p/v) de transglutaminasa para dar un gel.

Réplica de tejido conjuntivo

El tejido conjuntivo animal proporciona características clave de textura que son un importante componente de la experiencia de consumo de carne. Por consiguiente, la presente divulgación describe una composición derivada de fuentes de origen no animal que recapitula características clave de tejido conjuntivo animal. La presente divulgación da a conocer además un producto sucedáneo de carne que comprende una composición derivada de fuentes de origen no animal que recapitula importantes características de textura y visuales de tejido conjuntivo animal. Una composición de este tipo se denominará en el presente documento “réplica de tejido conjuntivo”. En algunas variantes, la réplica de tejido conjuntivo y/o el producto sucedáneo de carne que comprende la réplica de tejido conjuntivo se derivan parcialmente de fuentes de origen animal.

El tejido conjuntivo animal puede dividirse generalmente en tejido de tipo fascia y de tipo cartílago. El tejido de tipo fascia es muy fibroso, resistente contra la extensión (tiene alto módulo de elasticidad), y tiene un alto contenido de proteínas, un contenido de agua moderado (aprox. el 50%) y un contenido de grasas y polisacáridos nulo o bajo. Por consiguiente, la presente divulgación describe una réplica de tejido conjuntivo que recapitula características clave del tejido de tipo fascia. En algunos casos, la réplica de tejido conjuntivo comprende aproximadamente el 50% de proteína en peso total, aproximadamente el 50% en peso líquido, y tiene un bajo componente de grasas y polisacáridos.

El contenido de proteínas de la mayoría del tejido conjuntivo de tipo fascia está compuesto principalmente de colágeno. El colágeno se caracteriza por una alta fracción de prolina y alanina, y también se agrupa para dar fibrillas alargadas o estructuras flexibles similares a varillas características. Las prolaminas son una familia de proteínas encontradas en fuentes de origen no animal, tales como fuentes de origen vegetal. Las prolaminas son muy abundantes en plantas y son similares en composición de aminoácidos al colágeno. Entre las proteínas que se sometieron a prueba para este fin, las prolaminas eran particularmente favorables debido a su bajo coste y su capacidad para formar fácilmente fibras o láminas cuando se hilan o extruyen. Los ejemplos no limitativos de proteínas de la familia de la prolamina incluyen, por ejemplo, zeína (encontrada en el maíz), estas incluyen hordeína de cebada, gliadina de trigo, secalina, extensinas de centeno, kafirina de sorgo, avenina de avena. En el tejido conjuntivo de tipo fascia, la familia de proteínas prolamina, de manera individual o combinaciones de las mismas, demuestra idoneidad para el componente proteico ya que son muy abundantes, similares en composición global de aminoácidos al colágeno (alta fracción de prolina y alanina) y susceptibles de procesarse para dar películas y fibras. Además de la zeína (encontrada en el maíz), estas incluyen hordeína de cebada, gliadina de trigo, secalina, extensinas de centeno, kafirina de sorgo, avenina de avena. Pueden ser necesarias otras proteínas para complementar las prolaminas con el fin de lograr especificaciones objetivo para propiedades fisicoquímicas y nutricionales. La lista de posibles candidatas es, en el presente documento, esencialmente abierta y puede incluir rubisco, cualquier proteína principal de almacenamiento de semillas, proteínas aisladas de hongos, bacterias, arqueas, virus o microorganismos modificados por ingeniería genética, o sintetizada in vitro. Las proteínas pueden diseñarse de manera artificial para emular propiedades físicas de tejido conjuntivo animal, colágeno de origen animal o recombinante, extensinas (glicoproteínas ricas en hidroxiprolina abundantes en las paredes celulares, por ejemplo, Arabidopsis thaliana, cuyos monómeros son moléculas flexibles similares a varillas “de tipo colágeno”). Las proteínas pueden diseñarse de manera artificial para emular propiedades físicas de tejido conjuntivo animal.

Los métodos para formar tejido conjuntivo de tipo fascia serán los practicados en la técnica con una preferencia hacia los métodos que producen estructuras fibrosas o de tipo fibroso por medios biológicos, químicos o físicos, de manera individual o en combinación, en serie o en paralelo, antes del conformado final. Estos métodos pueden incluir extrusión o hilado.

El tejido de tipo cartílago puede ser macroscópicamente homogéneo, resistente a la compresión, tiene mayor contenido de agua (hasta el 80%), menor contenido de proteínas (colágeno) y mayor contenido de polisacáridos (proteoglicanos) (aprox. el 10% de cada uno).

Con respecto a la composición, el tejido conjuntivo de tipo cartílago puede ser muy similar al tejido de tipo fascia con las razones relativas de cada uno ajustado a imitar más estrechamente el tejido conjuntivo de la “carne”.

Los métodos para formar tejido conjuntivo de tipo cartílago pueden ser similares a los del tejido conjuntivo de tipo fascia, pero con una preferencia hacia métodos que producen estructuras isotrópicamente homogéneas.

La grasa puede suspenderse en un gel. La presente divulgación describe métodos para producir gotitas de grasa suspendidas en el gel proteínico. La grasa puede aislarse de tejidos vegetales y emulsionarse. La emulsificación puede utilizar mezclado de alta velocidad, homogeneización, agitación o cambios de temperatura. La suspensión de lípidos puede tratarse por ultrasonidos o extruirse para alterar adicionalmente las propiedades del lípido en la disolución. En este punto, en algunos casos se añaden otros componentes del producto consumible a la disolución seguido por un agente de gelificación. En algunos casos, se añaden agentes de reticulación (por ejemplo, transglutaminasa o lisil oxidasa) para unir los componentes del producto consumible. En otras variantes, se añade el agente de gelificación y posteriormente se combina la suspensión de lípido/gel con componentes adicionales del producto consumible. En el tejido conjuntivo de tipo fascia, la familia de proteínas prolamina, individualmente o combinaciones de las mismas, demuestra idoneidad para el componente proteico ya que son muy abundantes, similares en composición global de aminoácidos al colágeno (alta fracción de prolina y alanina) y susceptibles a procesarse para dar películas. Además de la zeína (encontrada en el maíz), estas incluyen hordeína de cebada, gliadina de trigo, secalina, extensinas de centeno, kafirina de sorgo, avenina de avena. Pueden ser necesarias otras proteínas para complementar las prolaminas para lograr especificaciones objetivo para propiedades fisicoquímicas y nutricionales. La lista de posibles candidatas es, en el presente documento, esencialmente abierta y puede incluir cualquier proteína principal de almacenamiento de semillas, colágeno de origen animal o recombinante, extensinas (glicoproteínas ricas en hidroxiprolina abundantes en los monómeros de paredes celulares, por ejemplo, Arabidopsis thaliana, cuyos monómeros son moléculas flexibles similares a varillas “de tipo colágeno”).

En algunos casos, algunos o todos los componentes del producto consumible se suspenden en un gel. En diversos casos, el gel puede ser un hidrogel, un organogel o un xerogel. El gel puede espesarse usando un agente basado en polisacáridos o proteínas. Por ejemplo, pueden usarse fécula, arrurruz, almidón de maíz, almidón de katakuri, almidón de patata, palmera de sagú, tapioca, alginina, goma guar, goma de algarrobo, goma de xantano, colágeno, claras de huevo, furcelarán, gelatina, agar, carragenano, celulosa, metilcelulosa, hidroximetilcelulosa, goma acacia, konjac, almidón, pectina, amilopectina o proteínas derivadas de legumbres, cereales, nueces, otras semillas, hojas, algas, bacterias u hongos, solas o en combinación, para espesar el gel, formando una arquitectura o estructura para el producto consumible. Las enzimas que catalizan las reacciones que conducen a reticulaciones covalentes entre proteínas pueden usarse solas o en combinación para formar una arquitectura o estructura para el producto consumible. Por ejemplo, pueden usarse transglutaminasa, lisil oxidasas u otras amino oxidasas (por ejemplo, lisil oxidasa de Pichia pastoris (PPLO)), solas o en combinación, para formar una arquitectura o estructura para el producto consumible. En algunos casos, se combinan múltiples geles con diferentes componentes para formar el producto consumible. Por ejemplo, un gel que contiene una proteína con base vegetal puede asociarse con un gel que contiene una grasa de base vegetal. En algunos casos, las fibras o los aguijones de proteínas se orientan paralelos entre sí y luego se mantienen en su lugar por la aplicación de un gel que contiene grasas de base vegetal. Las composiciones de la divulgación pueden inflarse o expandirse mediante calentamiento, tal como friendo, horneando, calentando en microondas, calentando en un sistema de aire forzado, calentando en un túnel de aire, y similares.

En algunos casos, se combinan múltiples geles con diferentes componentes para formar el producto consumible. Por ejemplo, un gel que contiene una proteína con base vegetal puede asociarse con un gel que contiene una grasa de base vegetal. En algunas versiones, las fibras o los aguijones de proteínas se orientan paralelos entre sí y luego se mantienen en su lugar por la aplicación de un gel que contiene grasas de base vegetal.

En algunos casos la réplica de la carne no contiene productos animales, menos del 1% de gluten de trigo, no contiene metilcelulosa, no contiene carragenano, no contiene color caramelo ni harina de konjac, no contiene goma arábiga ni goma acacia. En algunas variantes, la réplica de la carne no contiene productos animales, no contiene gluten de trigo, no contiene metilcelulosa, no contiene carragenano, no contiene color caramelo ni harina de konjac, no contiene goma arábiga ni goma acacia. En algunas variantes, la réplica de la carne no contiene productos animales, no contiene aislado de proteína de soja, no contiene gluten de trigo, no contiene metilcelulosa, no contiene carragenano, no contiene color caramelo ni harina de konjac, no contiene goma arábiga ni goma acacia. En algunas variantes, la réplica de la carne no contiene productos animales, no contiene concentrado de proteína de soja, no contiene gluten de trigo, no contiene metilcelulosa, no contiene carragenano, no contiene color caramelo ni harina de konjac, no contiene goma arábiga ni goma acacia. En algunas variantes, la réplica de la carne no contiene productos animales, no contiene proteína de soja, no contiene gluten de trigo, no contiene metilcelulosa, no contiene carragenano, no contiene color caramelo ni harina de konjac, no contiene goma arábiga ni goma acacia. En algunas variantes, la réplica de la carne no contiene productos animales, no contiene tofu, no contiene gluten de trigo, no contiene metilcelulosa, no contiene carragenano, no contiene color caramelo ni harina de konjac, no contiene goma arábiga ni goma acacia. En algunas variantes, la réplica de la carne no contiene productos animales, no contiene tofu ni gluten de trigo. En algunas variantes, la réplica de la carne no contiene productos animales, no contiene proteína de soja ni gluten de trigo. En algunas variantes, la réplica de la carne no contiene metilcelulosa, no contiene carragenano, no contiene color caramelo, no contiene harina de konjac, no contiene goma arábiga ni goma acacia. En algunas variantes, la réplica de la carne no contiene productos animales ni menos del 5% de hidratos de carbono.

En algunas variantes, la réplica de la carne no contiene productos animales, no contiene proteína de soja, no contiene gluten de trigo, no contiene metilcelulosa, no contiene carragenano, no contiene color caramelo ni harina de konjac, no contiene goma arábiga ni goma acacia ni menos del 5% de hidratos de carbono. En algunas variantes, la réplica de la carne no contiene productos animales, ni menos del 1% de celulosa. En algunas variantes, la réplica de la carne no contiene productos animales, ni menos del 5% de hidratos de carbono insolubles. En algunas variantes, la réplica de la carne no contiene productos animales, no contiene proteína de soja, ni menos del 1% de celulosa. En algunas variantes, la réplica de la carne no contiene productos animales, no contiene proteína de soja, ni menos del 5% de hidratos de carbono insolubles. En algunas variantes, la réplica de la carne no contiene productos animales, no contiene gluten de trigo, ni menos del 1% de celulosa. En algunas variantes, la réplica de la carne no contiene productos animales, no contiene gluten de trigo, ni menos del 5% de hidratos de carbono insolubles.

El porcentaje de los diferentes componentes puede controlarse. Por ejemplo, pueden combinarse sustitutos con base no animal para músculo, tejido adiposo, tejido conjuntivo y componentes sanguíneos en diferentes razones y organizaciones físicas para aproximarse mejor al aspecto y tacto de la carne. Los diversos componentes pueden disponerse para garantizar la consistencia entre bocados del producto consumible. Los componentes pueden disponerse para garantizar que no se generan residuos del producto consumible. Por ejemplo, mientras que un corte tradicional de carne puede tener partes que no se comen normalmente, una réplica de la carne puede mejorarse por encima de la carne no incluyendo estas partes no comestibles. Una mejora de este tipo permite que todo el producto elaborado o enviado se consuma, lo que reduce los residuos y los costes de envío. Alternativamente, una réplica de la carne puede incluir partes no comestibles para imitar la experiencia de consumo de carne. Tales partes pueden incluir hueso, cartílago, tejido conjuntivo u otros materiales denominados habitualmente ternilla, o materiales incluidos que simulan estos componentes. En algunos casos, el producto consumible puede contener partes no comestibles simuladas de productos cárnicos que se diseñan para cumplir funciones secundarias. Por ejemplo, puede diseñarse un hueso simulado para dispersar calor durante el cocinado, haciendo que el cocinado del producto consumible sea más rápido o más uniforme que el de la carne. En otros casos, un hueso simulado también puede servir para mantener el producto consumible a una temperatura constante durante el envío. En otros casos, las partes no comestibles simuladas pueden ser biodegradables.

En algunos casos, las composiciones de sucedáneo de carne no contienen proteína animal, que comprende entre el 10-30% de proteína, entre el 5-80% de agua, entre el 5-70% de grasa, que comprenden una o más proteínas aisladas purificadas. En variantes particulares, las composiciones de sucedáneo de carne comprenden transglutaminasa. En algunos casos, el producto consumible contiene componentes para replicar los componentes de la carne. El componente principal de la carne es normalmente músculo esquelético. El músculo esquelético consiste normalmente en aproximadamente el 75% de agua, el 19% de proteína, el 2,5% de grasa intramuscular, el 1,2% de hidratos de carbono y el 2,3% de otras sustancias no proteicas solubles. Estas incluyen ácidos orgánicos, compuestos de azufre, compuestos nitrogenados, tales como aminoácidos y nucleótidos, y sustancias inorgánicas tales como minerales.

Por consiguiente, algunas variantes de la presente divulgación describen aproximaciones de replicación de esta composición para el producto consumible. Por ejemplo, en algunos casos, el producto consumible es una réplica de la carne a base de vegetales que puede comprender aproximadamente el 75% de agua, >19% de proteína, el 2,5% de grasa, el 1,2% de hidratos de carbono; y el 2,3% de otras sustancias no proteicas solubles. En algunos casos, el producto consumible es una réplica de la carne a base de vegetales que comprende entre el 60-90% de agua, el 10-30% de proteína, el 1-20% de grasa, el 0,1-5% de hidratos de carbono; y el 1-10% de otras sustancias no proteicas solubles. En algunos casos, el producto consumible es una réplica de la carne a base de vegetales que comprende entre el 60-90% de agua, el 5-10% de proteína, el 1-20% de grasa, el 0,1-5% de hidratos de carbono; y el 1-10% de otras sustancias no proteicas solubles. En algunos casos, el producto consumible es una réplica de la carne a base de vegetales que comprende entre >0-50% de agua, el 5-30% de proteína, >20-80% de grasa, el 0,1-5% de hidratos de carbono; y el 1-10% de otras sustancias no proteicas solubles. En algunos casos, la réplica contiene entre el 0,01% y el 5% en peso de una hemoproteína. En algunos casos, la réplica contiene entre el 0,01% y el 5% en peso de leghemoglobina. Alguna carne también contiene mioglobina, una hemoproteína, que representa la mayoría del color rojo y el contenido de hierro de alguna carne. En algunos casos, la réplica contiene entre el 0,01% y el 5% en peso de una hemoproteína. En algunos casos, la réplica contiene entre el 0,01% y el 5% en peso de leghemoglobina. Se entiende que estos porcentajes pueden variar en la carne, y pueden producirse las réplicas de la carne para aproximarse a la variación natural en la carne. Adicionalmente, en algunos casos, la presente divulgación describe réplicas de la carne mejoradas, que comprenden estos componentes en porcentajes normalmente no naturales. Por ejemplo, una réplica de la carne puede producirse con un contenido mayor que el contenido de grasa promedio típico. Los porcentajes de estos componentes también pueden alterarse para aumentar otras propiedades deseables.

En algunos casos, una réplica de la carne se diseña de manera que, cuando se concina, los porcentajes de componentes son similares a los de la carne cocinada. Así, en algunos casos, el producto consumible no cocinado tiene diferentes porcentajes de componentes que la carne no cocinada, pero cuando se cocina, el producto consumible es similar a la carne cocinada. Por ejemplo, una réplica de la carne puede elaborarse con un contenido mayor que el contenido de agua típico para carne cruda, pero cuando se cocina en un microondas, el producto resultante tiene porcentajes de componentes similares a la carne cocinada sobre un fuego.

En algunas variantes, el producto consumible es una réplica de la carne con un contenido menor que el contenido de agua típico para la carne. En algunos casos, las divulgaciones describen métodos para hidratar una réplica de la carne para producir la réplica de la carne que tiene un contenido similar a la carne. Por ejemplo, una réplica de la carne con un contenido de agua que podría ser bajo para la carne, por ejemplo, el 1%, el 10%, el 20%, el 30%, el 40% o el 50% de agua, se hidrata hasta aproximadamente el 75% de agua. Luego, una vez hidratada, en algunos casos, la réplica de la carne se cocina para consumo humano.

Aunque se han mostrado y descrito realizaciones preferidas de la presente invención en el presente documento, resultará evidente para los expertos en la técnica que tales realizaciones se proporcionan sólo a modo de ejemplo. Numerosas variaciones, cambios y sustituciones se les ocurrirán ahora a los expertos en la técnica sin apartarse de la presente divulgación. Debe entenderse que pueden emplearse diversas alternativas a las realizaciones de la invención descritas en el presente documento en la práctica de la invención. Se pretende que las siguientes reivindicaciones definan el alcance de la divulgación y que los métodos y las estructuras dentro del alcance de estas reivindicaciones y sus equivalentes estén cubiertos de ese modo.

Ejemplos

Ejemplo 1: método de producción y caracterización de un polipéptido que contiene hemo

Se produjo un plásmido que comprendía la secuencia de polinucleótido de Aquifex aeolicus que codifica para hemoglobina (AaHb), en el que la secuencia de nucleótidos estaba optimizada por codón para E. coli. Se subclonó el plásmido en un vector de expresión pBE-S proporcionado en el sistema de expresión de proteínas secretoras de B.subtilis (Takara Bio). Este vector contenía la secuencia promotora de aprE para fomentar la expresión constitutiva de AaHb en B. subtilis y una etiqueta de 6-histidina C-terminal. Se sintetizó un polinucleótido que codifica para el péptido señal de secreción a partir de la proteína PhoD de B. subtilis dependiente de la translocación de doble arginina (Tat) y se clonó en marco en el extremo 5’ de AaHb, reemplazando el péptido señal de secreción de aprE dentro de la estructura principal de pBE-S. Para genera un constructo de expresión citosólico de AaHb, se delecionó el péptido señal de secreción de aprE del extremo 5’ del marco de lectura abierto de AaHb usando PCR inversa seguido por ligación.

Los plásmidos de expresión se transformaron en la cepa de B.subtilis RIK1285. La expresión AaHb se monitorizó haciendo crecer cepas transformadas en medio LB, 10 pg/ml de kanamicina, FeCl30,1 mM y 20 pg/ml de ácido daminolevulínico. La expresión se llevó a cabo a 37°C, con agitación a 200 RPM durante 24 horas. Después de la expresión, se recogió el cultivo y se separó el polipéptido secretado de las bacterias.

Se monitorizó la expresión citosólica y secretada de AaHb mediante purificación por afinidad con Ni-NTA del sedimento celular y el sobrenadante de los medios seguido por SDS-PAGE y tinción con Coomassie de las fracciones de elución. Se monitorizó la carga de hemo mediante análisis de UV-Vis de fracciones que contienen AaHb purificadas.

Tal como se muestra en la figura 1, se comparó la expresión citosólica de AaHb en B.subtilis con (figura 1C) y sin (figura 1B) un péptido señal de secreción. El péptido de secreción de PhoD no interrumpió la expresión citosólica del polipéptido de AaHb. Se sometió a prueba AaHb citosólico para determinar el contenido de hemo usando espectroscopía de UV-Vis. Tal como se muestra en la figura 2, la adición del péptido señal de PhoD no interfiere con la unión del hemo de AaHb en el citosol.

Tal como se muestra en la figura 3, cuando se fusionó el polipéptido de AaHb al péptido de secreción de PhoD, la proteína de fusión se secretó de manera eficaz fuera de la célula huésped (figura 3^b, carriles A, B). Adicionalmente, se demostró que el péptido de secreción de PhoD se escindió de manera apropiada dado que ambas formas del polipéptido (escindida y no escindida) se ubicaron en la fracción de sedimento celular (por ejemplo, dentro de la célula huésped) (figura 3B, carril “sedimento celular”). Sin embargo, sólo se secretó la versión escindida del polipéptido de fusión de AaHb, lo que indicó la función apropiada del péptido señal de PhoD.

En apoyo de la efectividad del péptido señal de PhoD, se realizó la secuenciación de proteína N-terminal en el polipéptido secretado. La figura 4 representa la secuencia de proteínas de la secuencia de la proteína de fusión PhoD-AaHb (que también comprende una etiqueta de His6). Se retiró una banda de proteínas del gel para el análisis de secuenciación de proteína N-terminal. Esta banda correspondía a la proteína secretada debido a su abundancia y el tamaño en el gel. Los resultados de la secuenciación N-terminal indicaron que el péptido de PhoD se escindió de manera eficaz (por ejemplo, el tamaño no era debido a degradación no específica) en el sitio correcto dado que el extremo N-terminal de los resultados de secuenciación coincidía con el sitio de corte predicho de la proteasa.

El AaHb secretado se purificó adicionalmente para determinar el contenido de hemo monitorizando la absorbancia de UV-Vis de AaHb purificado a partir de los medios. La figura 5 ilustra los efectos del péptido señal de PhoD sobre el contenido de hemo del AaHb secretado. El AaHb secretado estaba unido a hemo, tal como se evidenció por un pico de absorción pronunciado a aproximadamente 415 nm.

Tomados en conjunto, estos resultados sugieren que el péptido señal de PhoD no interfiere con la secreción citosólica de un polipéptido, se escinde de manera apropiada, mejora la secreción de un polipéptido y mantiene el contenido de hemo del polipéptido secretado.

Ejemplo profético 1: método de uso de un polipéptido en un producto cárnico consumible

En algunos casos, un polipéptido en esta divulgación se expresará y purificará tal como se describe en el ejemplo 1. En algunos casos, un análogo de tejido muscular se construirá con el polipéptido y la proteína vicilina de guisante usando reticulación con transglutaminasa.

En algunos casos, un análogo de tejido muscular se construirá mediante formación con calor/frío de geles de proteína vicilina de guisantes purificada. El polipéptido que contiene hemo se mezclará por completo con el tejido muscular parcialmente gelificado tras el enfriamiento hasta temperatura ambiente.

En algunos casos, un análogo de tejido muscular se construirá extruyendo conjuntamente polipéptido que contiene hemo con proteína vicilina de guisantes purificada.

En algunos casos, un análogo de tejido adiposo se construirá emulsionado proteínas de albúmina de guisante, aceite de coco y lecitina a través de homogeneización de alta presión seguido por un tratamiento con calor/frío. El polipéptido que contiene hemo se mezclará por completo con el tejido adiposo parcialmente gelificado tras el enfriamiento hasta temperatura ambiente.

En algunos casos, un análogo de tejido conjuntivo se preparará con una fuente de proteína zeína mediante extrusión o electrohilado.

En algunos casos, una réplica de carne de vacuno picada (por ejemplo, producto cárnico consumible) se preparará combinando el análogo de músculo que comprende un polipéptido purificado de la divulgación con cantidades variables del análogo de tejido adiposo y el análogo de tejido conjuntivo. En algunos casos, los diferentes tejidos pueden combinarse usando una picadora de carne. El producto cárnico consumible resultante puede cocinarse antes del consumo. El procedimiento de cocinado inducirá que el color rojo del producto cárnico consumible cambie a color marrón, indicando el cocinado. En algunos casos, el color rojo del producto cárnico consumible es debido al polipéptido que contiene hemo purificado de la divulgación. El procedimiento de cocinado catalizará la liberación de

Claims

REIVINDICACIONES

i . Método de producción de un polipéptido que contiene hemo seleccionado del grupo que consiste en una leghemoglobina, una eritrocruorina, una hemoglobina no simbiótica, una flavohemoglobina, una protoglobina, una cianoglobina, una globina I de Hell’s gate, una hemoglobina bacteriana, una mioglobina de ciliado, una protoglobina, globina truncada 2/2, HbN, HbO y Glb3, comprendiendo dicho método hacer crecer una planta recombinante, comprendiendo dicha planta recombinante al menos un ácido nucleico exógeno que codifica para dicho polipéptido que contiene hemo, en el que dicha planta es de una especie distinta de Nicotiana, y purificar dicho polipéptido que contiene hemo de un tejido de dicha planta.
2. Método según la reivindicación 1, en el que dicho tejido comprende hojas, raíces, tallos o semillas.
3. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en el que dicho polipéptido que contiene hemo tiene al menos el 60% de identidad de secuencia con respecto a una secuencia de aminoácidos expuesta en las SEQ ID NO: 1-17 ó 21-31.
4. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que dicha planta es una planta Glycine max, Zea mays o Arabidopsis thaliana.
5. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que el método es para producir un sucedáneo de carne, y comprende además mezclar el polipéptido purificado con grasas y/o lípidos para producir un sucedáneo de carne.
6. Composición que comprende:

(a) un polipéptido purificado que contiene hemo seleccionado del grupo que consiste en una leghemoglobina, una eritrocruorina, una hemoglobina no simbiótica, una flavohemoglobina, una protoglobina, una cianoglobina, una globina I de Hell’s gate, una hemoglobina bacteriana, una mioglobina de ciliado, una protoglobina, globina truncada 2/2, HbN, HbO y Glb3; y (b) un componente de una célula huésped de planta recombinante de la que se expresa y/o secreta el polipéptido, en el que dicha célula huésped es una célula de la planta Glycine max, una célula de la planta Zea mays o una célula de la planta Arabidopsis thaliana,

en la que el polipéptido que contiene hemo era exógeno a dicha célula;

en la que el componente incluye una pared celular, un compartimento subcelular (tal como complejo de Golgi, retículo endoplasmático o núcleo), ácido nucleico, proteína, ADN genómico y/o una membrana plasmática;

en la que la composición es un sucedáneo de carne.
7. Composición según una cualquiera de las reivindicaciones 6, en la que dicha composición comprende al menos 1 parte por mil millones de dicho componente de dicha célula.
8. Composición según una cualquiera de las reivindicaciones 6-7, en la que dicha composición comprende como máximo el 1% (p/p) de dicho componente de dicha célula.
9. Composición según una cualquiera de las reivindicaciones 6-8, en la que dicho polipéptido que contiene hemo tiene al menos el 60% de identidad de secuencia con respecto a una secuencia de aminoácidos expuesta en las SEQ ID NO: 1-17 ó 21-31.
10. Método según la reivindicación 1, en el que la planta recombinante se elaboró usando TALENS.
11. Método según la reivindicación 1, en el que la planta recombinante se elaboró usando un sistema Cas9/Crispr.
12. Método según la reivindicación 1, en el que la planta recombinante se elaboró usando transformación mediada por Agrobacterium.