ES2823951T3

ES2823951T3 - Producto de arcilla y usos del mismo

Info

Publication number: ES2823951T3
Application number: ES13843869T
Authority: ES
Inventors: Jonathan Broomhead; Fang Chi; Ron Cravens; George Robert Goss; Richard Jaffee; Sara Leann Johnston; Michael Mcpherson; Ronda Jean Williams
Original assignee: Oil Dri Corp of America
Current assignee: Oil Dri Corp of America
Priority date: 2012-10-02
Filing date: 2013-10-02
Publication date: 2021-05-10
Anticipated expiration: 2033-10-02
Also published as: KR20150095623A; HUE052368T2; PL2906238T3; RU2673233C2; CN105163752B; WO2014055672A1; BR112015007549A2; RU2015116892A; KR102188209B1; CA2896698A1; MX2015004254A; EP2906238A4; CN105163752A; BR112015007549B1; EP2906238A1; JP2015532302A; US20200155595A1; PH12015500757A1; US20140099373A1; EP3711774A1

Abstract

Una mezcla que comprende una arcilla, una levadura y un glutamato para utilizar en un método para tratar una enfermedad entérica causada por unas endotoxinas o exotoxinas bacterianas en un animal.

Description

DESCRIPCIÓN

Producto de arcilla y usos del mismo

Sector de la técnica

La solicitud se refiere a una mezcla de arcilla, un producto de levadura y opcionalmente, glutamato y usos de la misma, en particular para disminuir los efectos de una enfermedad entérica.

Estado de la técnica

Clostridium es un género bacteriano que secreta toxinas que causan enfermedades en aves de corral, animales y seres humanos. Los patógenos bacterianos anaeróbicos son una carga económica grave para la industria agrícola. Las bacterias de la familia del Clostridium representan una carga particular, porque estas bacterias causan enfermedades graves en aves de corral y otros animales domésticos económicamente valiosos. Los esfuerzos previos para controlar estos organismos han dependido de las medidas sanitarias y la administración de antibióticos en el pienso animal.

La enteritis necrótica (EN; en inglés, NE) es la enfermedad bacteriana más común y devastadora económicamente en las poblaciones modernas de pollos para consumo. Es una enfermedad infecciosa causada por Clostridium perfringens, que es una bacteria anaeróbica Gram positiva, que se puede encontrar en el suelo, arena, polvo y en niveles bajos, en el intestino de aves sanas. Clostridium perfringens solo causa EN cuando se transforma de un tipo que no produce toxinas a un tipo que produce toxinas.

Hay cinco tipos de C. perfringens (A, B, C, D y E) que producen varias toxinas (alfa, beta, épsilon, iota y CPE). Se cree que la toxina a, una enzima (fosfolipasa C) es la clave para la aparición de EN. Sin embargo, un estudio reciente ha demostrado que un aislado que no produce la toxina a sigue causando la enfermedad. Además, recientemente se ha identificado una nueva toxina llamada NetB en la enfermedad que causan los aislados de C. perfringens. El intestino de las aves infectadas es friable y se encuentra distendido con gas y lesiones macroscópicas causadas por toxinas. En la forma aguda de EN, a menudo las aves mueren antes de mostrar signos clínicos. Sin embargo, en su forma subclínica, la enfermedad es mucho más perjudicial económicamente para el productor. Los síntomas de la enfermedad observados comúnmente varían con la edad de las aves.

Sigue existiendo una necesidad en la técnica de un método seguro, económico y eficaz para proteger a los animales domésticos criados intensivamente, incluyendo aves, tales como los pollos, de la infección por las especies de Clostridium. Los clostridia provocan enfermedades que causan tanto sufrimiento humano como pérdidas económicas en la ganadería. Una manera rentable de intervenir en estas enfermedades ayudaría en los sistemas de gestión de enfermedades.

La cita o identificación de cualquier documento en esta solicitud no debería interpretarse como una admisión de que dicha referencia está disponible como técnica anterior a la presente invención.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a una antitoxina, un inmunomodulador, un componente que proporciona energía a las células de la mucosa o una combinación de los mismos, que puede ser útil para disminuir los efectos de las enfermedades basadas en Clostridia o coccidia u otras enfermedades entéricas o mediante la mejora en general de la salud o función gastrointestinal.

Los solicitantes han demostrado in vitro que ciertas arcillas pueden adsorber toxinas de Clostridium difficile y Clostridium perfringens. Los solicitantes han demostrado in vivo que ciertas arcillas o formulaciones de arcilla pueden aliviar la enteritis necrótica en pollos, una enfermedad asociada con Clostridium perfringens. Los solicitantes encuentran que las arcillas o las formulaciones de arcilla pueden unirse a las toxinas clostridiales in vitro y que las arcillas o las formulaciones de arcilla pueden aliviar la enfermedad causada por Clostridium perfringens y probablemente otras enfermedades causadas por clostridia. Niveles en el intestino de aves sanas. Clostridium perfringens solo causa EN cuando se transforma de un tipo que no produce toxinas a un tipo que produce toxinas.

El documento US 2006/0239992 desvela un método para la prevención y el tratamiento de infecciones fúngicas y por tanto, se describe la micosis invasiva consiguiente en especies de mamíferos y aves.

Los documentos WO 2010/083336 y US 2010/189871 se refieren a la composición que comprende levaduras y/o componentes de levaduras y métodos para la producción y utilización de los mismos.

El documento US 2010/0189871 proporciona una combinación utilizada para absorber toxinas en piensos.

El documento EP2314172 proporciona un aditivo para la alimentación de ganado y constituciones de una composición de pienso para ganado.

Los siguientes sitios web desvelan componentes de levaduras y arcillas:

- http://web.arch¡ve.org/web/20120421153919/http://www.admani.com/C¡tdS¡m/C¡ tr¡St¡m%20Index.htm [consultado el 08-04-2016]

- http://www.lab-inter.com/document/9381 Spec Citrisim.pdf [consultado el 08-04-2016]

- http://web.arch¡ve.org/web/20120130035143/http://agritrad¡ng-¡nvestment.com/?p=16 [consultado el 03-03-2016]

Objeto de la invención

Los solicitantes han demostrado in vitro que ciertas arcillas pueden adsorber toxinas de Clostridium difficile y Clostridium perfringens. Los solicitantes han demostrado in vivo que ciertas arcillas o formulaciones de arcilla pueden aliviar la enteritis necrótica en pollos, una enfermedad asociada con Clostridium perfringens. Los solicitantes encuentran que las arcillas o las formulaciones de arcilla pueden unirse a las toxinas clostridiales in vitro y que las arcillas o las formulaciones de arcilla pueden aliviar la enfermedad causada por Clostridium perfringens y probablemente otras enfermedades causadas por clostridia.

Los solicitantes también encontraron que las arcillas pueden adsorber la exotoxina producida por Clostridium difficile y Clostridium perfringens. Se encontró que una mezcla, que es una combinación de arcilla, un producto de levadura y una forma de aminoácido funcional, ayuda a disminuir los efectos de la enteritis necrótica en pollos de engorde cuando se utilizó un modelo de desafío que incluyó C. perfringens y coccidia (Eimeria maxima).

La presente invención se refiere a una antitoxina, un inmunomodulador y un componente que proporciona energía a las células de la mucosa o una combinación de los mismos. Ventajosamente, la antitoxina puede ser una arcilla, un inmunomodulador puede ser un producto de levadura y un componente que proporciona energía a las células puede ser un aminoácido funcional tal como un glutamato. En una realización ventajosa particular, la arcilla puede ser una arcilla de montmorillonita de calcio, el producto de levadura puede ser un producto de la levadura de Pichia guilliermondii y el aminoácido funcional puede ser glutamato monosódico ("MSG"). En otra realización ventajosa, la mezcla puede comprender aproximadamente de un 50 a un 90% (p/p) de una antitoxina, aproximadamente del 10 al 50% (p/p) de un inmunomodulador que puede ser un producto de levadura y aproximadamente de un 0,01 a un 15% (p/p) de un glutamato.

En una realización particularmente preferida, la composición o mezcla puede ser aproximadamente un 80% (p/p) de arcilla, aproximadamente un 10% (p/p) de un producto de levadura y aproximadamente un 10% (p/p) de un glutamato o un 60% (p/p) de arcilla, aproximadamente un 35% (p/p) de un producto de levadura y aproximadamente un 5% (p/p) a aproximadamente un 10% (p/p) de un glutamato.

La presente invención también abarca las composiciones y/o mezclas desveladas en el presente documento utilizadas como complementos dietéticos. En una realización, el complemento puede ser de aproximadamente un 0,05% (p/p) a aproximadamente un 0,35% (p/p) del pienso, aproximadamente un 0,15% (p/p) a aproximadamente un 0,25% (p/p) del pienso o aproximadamente un 0,25% (p/p) del pienso.

Por consiguiente, es un objeto de la invención no abarcar dentro de la invención ningún producto, proceso de fabricación del producto o método de utilización del producto previamente conocidos, de manera que los solicitantes se reserven el derecho y por la presente divulgan una exención de responsabilidad de cualquier producto, proceso o método previamente conocido. Cabe destacar adicionalmente que la invención no pretende abarcar dentro del alcance de la invención ningún producto, proceso o fabricación del producto o método de utilización del producto, que no cumpla con la descripción escrita y los requisitos de habilitación de la USPTO (35 U.S.C. §112, primer párrafo) o la EPO (Artículo 83 de la EPC), de manera que los solicitantes se reservan el derecho y por la presente divulgan una exención de responsabilidad de cualquier producto descrito anteriormente, proceso de fabricación del producto o método de utilización del producto.

Se observa que en esta divulgación y particularmente en las reivindicaciones y/o párrafos, las expresiones tales como "comprende", "comprendido", "que comprende" y similares pueden tener el significado que se le atribuye en la ley de patentes de los Estados Unidos; por ejemplo, pueden significar "incluye", "incluido", "que incluye" y similares; y que expresiones como "que consiste esencialmente en" y "consiste esencialmente en" tienen el significado que se les atribuye en la ley de patentes de EE. UU., por ejemplo, permiten elementos que no se recitan explícitamente, pero excluyen elementos que se encuentran en la técnica anterior o que afectan a una característica básica o novedosa de la invención.

Estas y otras realizaciones se divulgan o son evidentes a partir de la siguiente descripción detallada.

Descripción de las figuras

La siguiente descripción detallada, dada a modo de ejemplo, pero no destinada a limitar la invención únicamente a las realizaciones específicas descritas, se puede entender mejor conjuntamente con los dibujos adjuntos.

La Fig. 1 representa un esbozo esquemático de un diseño experimental.

La Fig. 2 representa una comparación de las ganancias de peso corporal total de los pollos de engorde alimentados con productos de la marca Amlan International de Oil-Dri Corporation of America ("Amlan"), tales como un producto 100% de arcilla, (B), el producto de arcilla mezclado con un ácido orgánico y un extracto de planta (Y), una mezcla de arcilla y un producto de levadura (C), una mezcla de la arcilla, el producto de levadura y glutamato monosódico (D), en comparación con el antibiótico virginiamicina (VM) y desafiados con Clostridium perfringens (CP) para inducir enteritis necrótica. Los pesos corporales se determinaron a partir del día de infección con E. maxima hasta 2 días tras la infección de CP. Se infectó a las aves con 10.000 ooquistes esporulados de E. maxima en el día 14 tras la eclosión. Después de 4 días de la infección con E. maxima, las aves, excepto las del tratamiento de control, se inocularon con 1*109 UFC de CP.

La Fig. 3 muestra una comparación de las ganancias de peso corporal en pollos de engorde alimentados con productos Amlan tales como B, Y, C, D y se compararon con el antibiótico VM. Las ganancias de peso corporal se determinaron desde el día de la infección con CP hasta 7 días después de la infección con CP. Se infectó a las aves con 10.000 ooquistes esporulados de E. maxima en el día 14 tras la eclosión. Después de 4 días de la infección con E. maxima, se inoculó a las aves con 1 x109 UFC de CP.

La Fig. 4 representa un efecto de los productos dietéticos de Amlan en las puntuaciones de lesiones intestinales. La Fig. 5A representa una respuesta de anticuerpos séricos contra el antígeno de la toxina a a los 7 días tras la infección de C. perfringens.

La Fig. 5B representa una respuesta de anticuerpos séricos contra el antígeno de la toxina a a los 14 días tras la infección de C. perfringens.

La Fig. 6A representa una respuesta de anticuerpos séricos contra el antígeno de la toxina NetB a los 7 días tras la infección de C. perfringens.

La Fig. 6B representa una respuesta de anticuerpos séricos contra el antígeno de la toxina NetB a los 14 días tras la infección de C. perfringens.

La Fig. 7A representa un efecto de la complementación dietética con productos de Amlan sobre la toxina sérica. Los sueros se recogieron a los 2 días tras la infección de C. perfringens y se utilizaron para medir los niveles de toxina a mediante ELISA.

La Fig. 7B representa un efecto de la complementación dietética con productos de Amlan sobre la toxina sérica. Los sueros se recogieron a los 2 días tras la infección de C. perfringens y se utilizaron para medir los niveles de toxina NetB mediante ELISA.

La Fig. 8A representa una comparación de la conversión alimenticia desde el Día 0-21 en un segundo experimento in vivo. En este experimento los pollos de engorde, excepto aquellos en el grupo sin desafío (Sin EN), se les desafió ^{a inducir enteritis necrótica y se les alimentó sin el producto} (En), ^{una mezcla de la arcilla, el producto de levadura}y glutamato monosódico como el en el experimento anterior (D), una arcilla, producto de levadura y glutamato monosódico con diferentes tasas de inclusión (D8) y aquellas dos formulaciones utilizando un producto de levaduras diferente (DX y D8X), estos productos se compararon con el antibiótico viginiamicina (VM). En este experimento, el día 14 a los pollos de engorde desafiados por vía oral con aproximadamente 5.000 ooquistes de E. maxima (una cepa de coccidia) los días 19, 20 y 21 se les dio un cultivo de caldo de C. perfringens 108 ufc/ml aislado de un caso clínico de enteritis necrótica que produce toxinas tanto alfa como Net B (excepto para el tratamiento de control sin desafío (Sin EN)). El experimento duró 28 días. En general, la conversión alimenticia para las aves alimentadas con los diferentes productos Amlan fue intermedia entre las de los tratamientos EN o VM del día 0 al 21. Sin embargo, las aves alimentadas con el producto D8X no siguieron este patrón que tiene la conversión alimenticia tan pobre, estadística y numéricamente, como las del tratamiento de EN para este período de tiempo.

La Fig. 8B representa la conversión alimenticia del Día 14 - 21. La conversión alimenticia para las aves alimentadas desafiadas alimentadas del tratamiento DX fue significativamente mejor que para las aves en el tratamiento EN (desafiadas pero alimentadas sin producto) para el periodo de tiempo de los días 14 - 21 y fue estadísticamente igual a la dieta con VM añadido.

La Fig. 8C representa la conversión alimenticia del Día 0-28. Todos los productos excepto el D8X fueron significativamente mejores que EN sin producto. Los productos D y DX fueron los mejores de los productos probados, similares a las aves en el tratamiento VM y no estadísticamente diferentes a las aves no desafiadas de EN.

La Fig. 9A representa la ganancia de peso del Día 0-28. VM mejoró la ganancia en comparación con el control EN sin ningún producto. D8 fue estadísticamente igual y numéricamente mejor en comparación con VM. Todos los demás productos resultaron intermedios entre EN sin producto y VM.

La Fig. 9B representa la ganancia de peso del Día 14-28. La ganancia siguió patrones similares para los días 14 -28 que para los días 0 - 28, excepto que D8 fue numéricamente igual a VM.

La Fig. 10 representa las puntuaciones de las lesiones. Las puntuaciones de lesiones para las aves alimentadas con D8 y D8X fueron más bajas que las de las aves alimentadas con VM y pueden no haber resultado estadísticamente diferentes a las de las aves no desafiadas con EN.

La Fig. 11 representa la mortalidad de EN. Todos los productos excepto D disminuyeron la mortalidad en comparación con las aves desafiadas de EN sin producto y fueron iguales a las alimentadas con VM.

La Fig. 12A representa una comparación de las ganancias de peso corporal en pollos de engorde en un tercer estudio in vivo determinado a partir del día de infección con Eimeria maxima hasta los 2 días tras la infección de C. perfringens. Se infectó a las aves con 10.000 ooquistes esporulados de E. maxima en el día 14 tras la eclosión. Después de 4 días de la infección con Eimeria maxima, se inoculó a las aves con 1*109 UFC de C. perfringens. En este experimento hay un grupo de control sin desafío (Cont), un grupo desafiado a inducir enteritis necrótica pero alimentado sin producto (EN), la formulación D de producto en una inclusión a un 0,35, 0,25, 0,15 y 0,05 % (D35, D25, D15 y D05), también se incluyen los productos que combinan los ingredientes en diferentes tasas (DS, DSF, D8 y D8F) y el grupo final que recibió 20 g/907,18474 kg de virginiamicina en la dieta (VM).

La Fig. 12B representa una comparación del aumento de porcentaje en las ganancias de peso corporal en comparación con las aves en el control de desafío de enteritis necrótica sin producto. (EN es el grupo desafiado a inducir enteritis necrótica pero alimentado sin producto; VM es el grupo que recibió 20 g/907,18474 kg de virginiamicina en la dieta).

La Fig. 13A muestra una comparación de las ganancias de peso corporal en pollos de engorde. Las ganancias de peso corporal se determinaron comenzando el día de la infección de C. perfringens y finalizando a los 7 días tras la infección de C. perfringens.

La Fig. 13B representa una comparación del aumento de porcentaje en las ganancias de peso corporal en comparación con el control de desafío de enteritis necrótica sin producto.

La Fig. 14 representa un efecto de los productos dietéticos sobre las puntuaciones de lesiones intestinales, las puntuaciones son un promedio de 5 aves por grupo examinado el d 2 tras la infección de C. perfringens.

La Fig. 15A representa una respuesta de anticuerpos séricos contra el antígeno de la toxina a a los 2 días tras la infección de C. perfringens.

La Fig. 15B representa una respuesta de anticuerpos séricos contra el antígeno de la toxina a a los 7 días tras la infección de C. perfringens.

La Fig. 16A representa una respuesta de anticuerpos séricos contra el antígeno de la toxina NetB a los 2 días tras la infección de C. perfringens.

La Fig. 16B representa una respuesta de anticuerpos séricos contra el antígeno de la toxina NetB a los 7 días tras la infección de C. perfringens.

La Fig. 17A representa un efecto de la complementación dietética sobre los niveles de toxina a séricos. Los sueros se recogieron el d-2 tras la infección de C. perfringens y se utilizaron para medir los niveles de toxina a mediante el ensayo enzimático de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA; del inglés, enzyme-linked immunosorbent assay).

La Fig. 17B representa un efecto de la complementación dietética con sobre los niveles de la toxina NetB. Los sueros se recogieron el d-2 tras la infección de C. perfringens y se utilizaron para medir los niveles de toxina NetB mediante ELISA.

Las Figs. 18A-B representan la producción de citocinas en los linfocitos intraepiteliales del yeyuno a los 2 días tras la infección de C. perfringens.

Las Figs. 18C-D representan la producción de citocinas en los linfocitos intraepiteliales del yeyuno de aves a los 2 días tras la infección de C. perfringens.

Las Figs. 19A-C representan la producción de citocinas en el bazo de aves a los 2 días tras la infección de C. perfringens.

Las Figs. 19D-F representan la producción de citocinas en el bazo de aves a los 2 días tras la infección de C. perfringens.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se refiere a una antitoxina, un inmunomodulador y un componente que proporciona energía a las células de la mucosa o una combinación de los mismos, que puede ser útil para disminuir los efectos de la enfermedad Clostridial.

Clostridium es un género bacteriano que secreta toxinas que causan enfermedades en aves de corral, animales y seres humanos. Los solicitantes examinaron dos especies de Clostridium, Clostridium difficile y Clostridium perfringens y encontraron que las arcillas pueden absorber la exotoxina producida por ambas. Las enfermedades de C. difficile son comunes en humanos y cerdos y la enfermedad de C. perfringens es común en el ganado vacuno y es especialmente prominente en pollos y se conoce como enteritis necrótica (EN). Una mezcla que es una combinación de arcilla, un producto de levadura y una forma de aminoácido funcional, se examinó y se encontró que ayuda a disminuir los efectos de la enteritis necrótica en pollos de engorde cuando se utilizó un modelo de desafío que incluyó C. perfringens y coccidiosis (Eimeria maxima).

Anteriormente se informó de que las altas concentraciones de fibra dietética o dietas de trigo integral, dietas altas en proteína cruda, especialmente de altas concentraciones de proteína animal o harina de pescado o altas concentraciones de los aminoácidos glicina o metionina, aumentaron el riesgo de altos niveles de las bacterias C. perfringens y por tanto, aumentaron la probabilidad de enteritis necrótica (Williams, R. B. 2005 Intercurrent coccidiosis and necrotic enteritis of chickens: rational, integrated disease management by maintenance of gut integrity. Avian Path.

34:159-180). En la investigación de los solicitantes, los productos que fueron una mezcla de una arcilla, una fuente compleja de carbono reducido y un ácido orgánico o fueron una arcilla orgánica, no mejoraron el rendimiento de los pollos de engorde sobre la arcilla sola cuando les desafió a inducir enteritis necrótica.

Los solicitantes realizaron varios experimentos in vivo examinando productos para ayudar a aliviar la enteritis necrótica. Los solicitantes observaron los efectos de seis productos diferentes en comparación a sin ningún producto o con virginiamicina. En un experimento, cuando se desafió a las aves con Clostridium perfringens todos los productos disminuyeron las puntuaciones de lesiones en comparación con las aves desafiadas con C. perfringens que no fueron tratadas con ningún producto. Un producto (Y) fue igual a la virginiamicina y dos productos (CC, B) no fueron significativamente diferentes a la virginiamicina. Cuando se comparó la mortalidad en aves desafiadas con C. perfringens solo la virginiamicina fue significativamente mejor que sin producto, pero el producto CC no fue significativamente diferente de la virginiamicina. Observando la conversión alimenticia (pienso: ganancia) del día 14 -28 (el período de tiempo afectado principalmente por el desafío de C. perfringens), dos productos evaluados (BFA, BT) tuvieron una conversión alimenticia numéricamente más pobre que las aves desafiadas sin producto, mientras que los productos restantes fueron numérica pero no significativamente más pobres que la virginiamicina. Para la ganancia de peso desde el día 14 - 28, solo las aves alimentadas con B tuvieron una ganancia de peso significativamente mayor que las aves alimentadas sin producto. Debido a que no hubo un producto que fuera consistentemente el mejor en todos los criterios de respuesta en este experimento, los productos se clasificaron según su actuación en los principales criterios de respuesta (Tabla A). Esta fue una clasificación basada en la clasificación del producto en cada uno de los cuatro criterios de respuesta: 1) ganancia de peso de los días 14 - 28; 2) conversión alimenticia de los días 14 - 28; 3) puntuación de lesiones; y 4) mortalidad por enteritis necrótica. No hubo ningún intento de ponderar un criterio de respuesta más que otro ni ningún intento de análisis estadístico en esta clasificación.

Tabla A. Clasificación simple de tratamientos basada en la puntuación de lesiones, mortalidad por enteritis necrótica y ganancia de peso en d 14 - 28 y proporción de conversión alimenticia con un desafío de Clostridium perfringens.

Producto Clasificación

Virginiamicina 1

CC 2

B 3

Y 4

CA 5

BT 6

BFA 6

Sin producto 7

Basándose en los resultados de este y de trabajos in vitro e in vivo anteriores, los solicitantes creían que los productos a base de arcilla podrían ayudar a disminuir los efectos de la enteritis necrótica en las aves de corral, pero no tenían un producto específico que obviamente fuera mejor que el resto. Por tanto, se realizó otro estudio in vivo. En este estudio, los productos c A, BT y BFA no se utilizaron más debido a su clasificación. Dado que B se clasificó más alto que CA, la mezcla de CC se cambió para utilizar B y la proporción de la mezcla se cambió para el nuevo experimento (el nuevo producto C).

Se realizó un experimento de seguimiento en el que se examinaron aves desafiadas con C. perfringens o C. perfringens + aflatoxina. Los tres productos de prueba fueron: B, Y o C. Los tres productos de prueba redujeron la enfermedad. Esto se demostró principalmente en la ganancia durante el período de desafío desde el día 10 - 24 en aves a las que se había desafiado con C. perfringens ya que los productos B, Y o virginiamicina mejoraron la ganancia en comparación con la dieta sin producto, siendo Y estadísticamente igual a la alimentación con virginiamicina. Con este desafío, no hubo diferencias significativas para la proporción pienso:ganancia entre productos, excepto para la virginiamicina. Cuando el desafío de la enteritis necrótica se combinó con el desafío de aflatoxina (1 ppm), hubo más efecto de los productos. Para la ganancia de peso durante el período de desafío (d 14 - 24), las aves alimentadas con cualquier producto tuvieron una ganancia de peso mayor que aquellas alimentadas sin producto. La alimentación B tuvo el mayor efecto sobre la ganancia, significativamente mayor que los otros productos, incluida la virginiamicina. La proporción pienso:ganancia también fue mejor para las aves alimentadas con B o el producto C que aquellas alimentadas sin producto (Tabla B).

La presente invención también abarca antitoxinas, levaduras, productos de levadura o productos de tipo levadura y materiales de tipo MSG, además de las realizaciones preferidas desveladas en el presente documento. Otros materiales que se cree que son antitoxinas pueden incluir también otras arcillas o minerales, levaduras o productos de levadura o componentes de levadura o productos de tipo levadura tales como otras fuentes de fibra, beta glucanos o enzimas.

Como se utiliza en el presente documento, arcilla puede referirse a cualquiera de los tipos de arcilla, tal como los silicatos. Los silicatos pueden incluir filosicilatos, nesosilicatos, ciclosilicatos, sorosilicatos, inosilicatos y tectosilicatos. Los filosilicatos pueden incluir micas, cloritas, caolinitas, esmectitas (arcillas de bentonita), hormitas, talcos y serpentinitas. Los tectosilicatos pueden incluir cuarzo, zeolitas y feldespatos.

En una realización ventajosa, la arcilla es una esmectita (arcilla de bentonita). Las esmectitas incluyen, pero sin limitación, esmectitas trioctaédricas y esmectitas dioctaédricas. Las esmectitas trioctaédricas incluyen, pero sin limitación, saponita, hectorita, estevensita y sauconita. Las esmectitas dioctaédricas incluyen, pero sin limitación, montmorillonita, beidelita y nontronita. La montmorillonita incluye, pero sin limitación, montmorillonita de sodio y montmorillonita de calcio.

Como se utiliza en el presente documento, levadura puede referirse a levaduras (tales como Ascomycota y Basidiomycota), fragmentos de levadura, productos de levadura o productos similares a la levadura. En particular, el término levadura abarca no solo levaduras (como Ascomycota y Basidiomycota), fragmentos de levadura, productos de levadura o productos similares a la levadura, sino también cualquiera que pueda actuar como una levadura. Como se utiliza en el presente documento, levadura puede referirse también a fuentes de productos de levadura o productos de fermentación de levadura, mananos de levadura o levadura completa o componentes de la célula de levadura (tal como, aunque no de forma limitativa, la pared celular de levadura) o mezclas de los mismos o levaduras o componentes de levadura de otras especies de levadura.

En una realización ventajosa, el beta glucano puede ser un beta 1,3 glucano. En otra realización ventajosa, el beta glucano puede ser un beta glucano bacteriano o un beta 1,3 glucano bacteriano.

Otros inmunomoduladores pueden incluir también levaduras o productos de levadura o componentes de levadura u otras fibras, inmunoglobulinas o fuentes de inmunoglobulinas, quitinas o corticosteroides. Otras fuentes de energía para la mucosa intestinal pueden incluir también proteínas funcionales, ácido glutámico, treonina o fuentes de proteínas funcionales tales como el plasma o péptidos funcionales. Como se utiliza en el presente documento, péptidos pueden ser una cadena corta de aminoácidos, tales como 2-4 moléculas de glutamato o combinaciones de diferentes aminoácidos con o sin glutamato.

La presente invención implica agregar también calor a entre 300 y 800 grados C a la arcilla durante hasta una hora.

La presente invención también implica calentar la arcilla, ya que puede afectar a la eficacia de la arcilla. Esto se puede hacer estáticamente utilizando un horno de mufla o dinámicamente en un horno rotatorio o secador instantáneo.

La realización preferida de este producto puede ser de aproximadamente de un 50 a un 90% (p/p) de una antitoxina, tal como arcilla, aproximadamente de un 5 a un 50% (p/p) de un inmunomodulador, que puede ser un producto de levadura y aproximadamente de un 0,01 a un 15% (p/p) de un glutamato. En una realización especialmente preferida, el producto puede ser aproximadamente un 80 % (p/p) de una antitoxina, tal como arcilla, aproximadamente un 10 % (p/p) de un inmunomodulador, que puede ser un producto de levadura y aproximadamente un 10 % (p/p) de un glutamato.

La antitoxina puede ser una arcilla de montmorillonita de calcio, ventajosamente calentada hasta una temperatura de entre 100 - 800 grados C, ventajosamente entre 400 - 800 grados C, para disminuir la humedad y que se triture hasta un tamaño de partícula fino. Este procesamiento, calentamiento a entre 100 y 800 grados C y/o molienda fina (con un tamaño de partícula promedio de aproximadamente entre 20 y 50 micrómetros) se ha demostrado que aumenta la capacidad de unión de toxinas de la arcilla a través de múltiples toxinas. El producto de levadura puede ser una Pichia guilliermondii o un producto de levadura de Saccharomyces cerevisiae o un producto de otra especie de levadura. El glutamato monosódico es una forma del aminoácido glutamato.

En una realización ventajosa, la mezcla puede ser de aproximadamente un 80% (p/p) de arcilla, aproximadamente un 30% (p/p) a aproximadamente un 35% (p/p) de un producto de levadura y aproximadamente un 5% (p/p) a aproximadamente un 10% (p/p) de un glutamato.

En una realización particularmente ventajosa, la arcilla puede ser una arcilla de montmorillonita, preferentemente una arcilla adsorbente de montmorillonita altamente refinada y más preferentemente Calibrin®-Z. En otra realización particularmente ventajosa, el producto de levadura puede ser preferiblemente un producto de manano de levadura. En otra realización particularmente ventajosa, el glutamato es glutamato monosódico.

En una realización particularmente preferida, la mezcla puede ser de aproximadamente un 60 % (p/p) de arcilla, aproximadamente un 30% (p/p) de un producto de levadura y aproximadamente un 10% (p/p) de un glutamato o un 60% (p/p) de arcilla, aproximadamente alrededor de un 35% (p/p) de un producto de levadura y aproximadamente un 5% (p/p) a aproximadamente un 10% (p/p) de un glutamato.

En una realización particularmente ventajosa, la arcilla puede ser una arcilla de montmorillonita, preferentemente una arcilla adsorbente de montmorillonita altamente refinada y más preferentemente Calibrin®-Z. En otra realización particularmente ventajosa, el producto de levadura puede ser un producto de manano de levadura, incluyendo los productos de manano de Pichia guilliermondii o los productos de levadura de Saccharomyces cerevisiae. En otra realización particularmente ventajosa, el glutamato es glutamato monosódico.

La presente invención también abarca las mezclas desveladas en el presente documento utilizadas como complementos dietéticos. En una realización, el complemento puede ser de aproximadamente un 0,05% (p/p) a aproximadamente un 0,35% (p/p) del pienso, aproximadamente un 0,15% (p/p) a aproximadamente un 0,25% (p/p) del pienso o aproximadamente un 0,25% (p/p) del pienso.

Además de la realización preferida, se pueden sustituir otros materiales capaces de unirse a toxinas por los productos de Amlan, tales como otras arcillas o minerales adsobentes, tierras de diatomeas, silicatos, zeolitas, atapulgitas, hormitas o estos materiales o combinaciones de estos materiales (incluyendo el material base para los productos Amlan) fabricados con otros procesos (incluido el aumento o la disminución de la temperatura o el tiempo de secado o el contenido de humedad final, materiales calcinados o materiales triturados hacia un tamaño de partícula mayor o menor) se pueden utilizar con la advertencia de que podría requerirse más del producto que no es de Amlan y/o que el producto que no es de Amlan podría resultar menos eficaz.

La arcilla se puede calent r a aproximadamente 100 C, aproximadamente 125 ° , aproximadamente 150 °C, aproximadamente 175 °C, aproximadamente 200 °C aproximadamente 225 °C, aproximadamente 250 °C, aproximadamente 275 °C, aproximadamente 300 °C aproximadamente 325 °C, aproximadamente 350 °C, aproximadamente 375 °C, aproximadamente 400 °C aproximadamente 425 °C, aproximadamente 450 °C, aproximadamente 475 °C, aproximadamente 500 °C aproximadamente 525 °C, aproximadamente 550 °C, aproximadamente 575 °C, aproximadamente 600 °C aproximadamente 625 °C, aproximadamente 650 °C, aproximadamente 675 °C, aproximadamente 700 °C aproximadamente 725 °C, aproximadamente 750 °C, aproximadamente 775 °C, aproximadamente 800 °C aproximadamente 825 °C, aproximadamente 850 °C, aproximadamente 875 °C, aproximadamente 900 °C, aproximadamente 925 °C, proximadamente 950 °C o aproximadamente 1000 °C. Se puede calentar durante 1 ninuto hasta 4 horas.

El tamaño de partícula promedio de la arcilla puede ser tan pequeño como 1 micrómetro a tan grande como 500 micrómetros. El tamaño de partícula promedio puede ser ventajosamente de entre 20 y 50 micrómetros.

Otras fuentes de productos de levadura o productos de fermentación de levadura, mananos de levadura o levadura completa o componentes de la célula de levadura (tal como, aunque no de forma limitativa, la pared celular de levadura) o mezclas de los mismos o levaduras o componentes de levadura de otras especies de levadura también se pueden utilizar. También se podrían usar fuentes oligosacáridos de manano y/o beta glucanos u otros componentes principales de levadura, que incluyen pero se limitan a, otras fuentes de fibra o carbohidratos. Otras fuentes de prebióticos o mezclas de prebióticos se pueden utilizar también para la presente invención.

Otras fuentes de glutamato, ácido glutámico o cualquiera de sus sales u otros aminoácidos generadores de energía (incluyendo aunque no de forma limitativa: a-cetoglutarato, glutamina, aspartato o los aminoácidos de cadena ramificada, ácido L-glutámico o L-glutamina), otros aminoácidos funcionales, péptidos funcionales o proteínas funcionales o nucleótidos también se contemplan para la presente invención.

El porcentaje de inclusión de los materiales puede aumentar o disminuir con respecto a los de la realización preferida.

Si bien se ha demostrado que la realización preferida tiene valor contra la enteritis necrótica inducida por la inoculación esofágica con coccidiosis (Eimeria maxima) y Clostridium perfringens, podría tener efectos similares contra otras especies de Clostridia o de Coccidia u otras enfermedades entéricas o mejorando en general la salud o función gastrointestinal en cualquier especie de aves de corral u otras especies como perros, gatos, cerdos, ganado vacuno, ovejas, cabras, caballos y seres humanos y especies acuáticas tales como camarones o pescado de piscifactoría. Otras posibles enfermedades a las que ayudar, podrían ser la infección del hombre y de los animales por Clostridia difficile, enfermedad crónica del intestino del hombre, enfermedad hemorrágica del intestino de las vacas, enterotoxemia de los terneros, cerdos y ovejas, shigelosis del hombre y de los animales o diarrea del viajero u otras enfermedades causadas por endotoxinas bacterianas o transmitidas por alimentos o agua o exotoxinas de animales o del hombre.

Se realizó un estudio para examinar los efectos de varios productos sobre los signos clínicos de la enteritis necrótica en pollos de engorde. Los productos incluyeron algunos que los solicitantes habían probado previamente y una nueva combinación de producto que los solicitantes no habían usado previamente en animales. Los productos probados anteriormente fueron: 1) un producto 100 % de arcilla, (B); 2) el producto de arcilla mezclado con un ácido orgánico y un extracto de planta (Y); 3) una mezcla de la arcilla y un producto de levadura (C). El producto no probado anteriormente fue una mezcla de arcilla, el producto de levadura y glutamato monosódico (D). Todos estos productos se probaron en dos concentraciones, 0,25% y 0,5% de la dieta. La virginiamicina (22 ppm), un antibiótico que se usa comúnmente para prevenir la enteritis necrótica en aves de corral, también se incluyó como un tratamiento para la comparación.

Los pollos alimentados con la dieta complementada con una combinación de arcilla, un producto de levadura y glutamato monosódico y coinfectados con E. maxima y C. perfringens para inducir enteritis necrótica mostraron una ganancia de peso corporal aumentada significativa, una puntuación de lesiones reducida, una potenciación de los niveles de anticuerpos séricos hacia la toxina a o la toxina NetB y una disminución de los niveles de toxina a en suero. Esto no solo fue significativamente mejor en comparación con aquellos sin producto, sino que a menudo mejor en comparación con otros productos probados.

Habitualmente, la adición de D en un 0,25% de la dieta mostró un mejor rendimiento que D en un 0,5% de las dietas, esto indica que existe la necesidad de equilibrar estos ingredientes para proporcionar la respuesta óptima.

La incorporación de la mezcla de arcilla, producto de levadura y opcionalmente, glutamato, de la presente invención en un pienso o agua para animales, esto se puede realizar de una manera conocida por un experto en la técnica. En una realización preferida, la mezcla de arcilla, producto de levadura y opcionalmente, glutamato, de la invención, se incorpora en una premezcla. La premezcla incluye preferentemente la mezcla de arcilla, producto de levadura y opcionalmente, glutamato, un vehículo fisiológicamente aceptable y opcionalmente un pienso. La premezcla habitualmente está en una forma relativamente concentrada y se adapta para que se diluya con otro material, tal como uno o más de los otros vehículos, vitaminas y suplementos minerales y pienso, para formar el pienso final para animales. La premezcla incluye preferentemente la mezcla de arcilla, producto de levadura y opcionalmente, glutamato, en una concentración en el intervalo desde 0,1 a un 70% en peso, preferentemente de un 0,5 a un 50% en peso, más preferentemente aproximadamente un 0,25% en peso. La concentración óptima dependerá de si el tratamiento es preventivo, de control o correctivo y si la mezcla de arcilla, producto de levadura y opcionalmente, glutamato, de la invención es el único activo o si se usa en terapia concomitante con otros materiales y la especie. y edad o etapa de la vida del receptor.

En una realización preferida, la composición concentrada de la mezcla de arcilla, producto de levadura y opcionalmente, glutamato, está en una forma de liberación controlada. La forma de liberación controlada incluirá la mezcla de arcilla, producto de levadura y opcionalmente, glutamato y un material polimérico para proporcionar una liberación controlada de la mezcla de arcilla, producto de levadura y opcionalmente, glutamato, a partir del sistema de liberación controlada y es particularmente útil en composiciones para la adición al material de pienso sólido. Como resultado de la formulación de liberación controlada, la liberación de la mezcla de arcilla, producto de levadura y opcionalmente, glutamato, puede retrasarse para que se produzca principalmente en el duodeno. Un polímero de liberación controlada también puede minimizar el rechazo de la composición debido al sabor o utilizarse para supositorios rectales.

En la presente invención, la expresión, "sistema de liberación controlada" se utiliza en el mismo contexto e incluye la misma gama de ejemplos que se citan en "Controlled Drug Delivery" (Robinson y Lee, 1987). Muchos otros sistemas de liberación controlada sensibles al pH que se conocen en la técnica (Robinson y Lee, 1987) se pueden sustituir por el polímero de ácido acrílico o el copolímero de acrilamida y ácido acrílico. Por ejemplo, sistemas celulósicos solubles y aniónicos o reticulados insolubles y aniónicos; o polímeros aniónicos solubles y aniónicos o y reticulados insolubles derivados de cualquier polímero de ácido acrílico genérico y/o sus derivados. Se prefieren tales polímeros reticulados e insolubles, dado que se hinchan y también es menos probable que se metabolicen.

La invención también proporciona una composición de pienso para animales que comprende la mezcla de arcilla, producto de levadura y opcionalmente, glutamato, de la invención y un pienso. La mezcla de arcilla, producto de levadura y opcionalmente glutamato, está presente preferentemente en una cantidad desde 0,0001 a un 25% de la composición de pienso total y preferentemente de un 0,0001 a un 5% de la composición de pienso total, más preferentemente aproximadamente un 0,25% de la composición de pienso total.

En otra realización preferida, la mezcla de arcilla, producto de levadura y opcionalmente, glutamato, se puede formular para la adición al agua de bebida de los animales.

La mezcla de arcilla, producto de levadura y opcionalmente, glutamato, se administra preferentemente en cantidades desde 0,05 a 5000 mg/kg de peso corporal/día, más preferentemente de 100 a 1000 mg/kg/día.

Entre los ejemplos de vehículos adecuados inertes para utilizar en composiciones para la administración de la mezcla de arcilla, producto de levadura y opcionalmente, glutamato, se incluyen, pero sin limitación, agua, aceite de oliva, aceite de cacahuete, aceite de sésamo, aceite de girasol, aceite de cártamo, aceite de maní, aceite de coco, parafina líquida, etilenglicol, propilenglicol, polietilenglicol, etanol, propanol, isopropanol, glicerol, alcoholes grasos, triglicéridos, alcohol polivinílico, acetato de polivinilo parcialmente hidrolizado y mezclas de los mismos.

Las formas sólidas para la administración oral o rectal pueden contener aglutinantes, edulcorantes, agentes desintegrantes, diluyentes, aromatizantes, agentes de recubrimiento, conservantes, lubricantes y/o agentes retardadores farmacéutica o veterinariamente aceptables. Los aglutinantes adecuados incluyen goma arábiga, gelatina, almidón de maíz, goma de tragacanto, alginato de sodio, carboximetilcelulosa o polietilenglicol. Los edulcorantes adecuados incluyen sacarosa, lactosa, glucosa o glucósidos flavonoides tales como neohesperidina dihidrocalcona. Los agentes desintegrantes adecuados pueden incluir almidón de maíz, metilcelulosa, polivinilpirrolidona, goma xantana, bentonita, ácido algínico o agar. Los diluyentes adecuados incluyen lactosa, sorbitol, manitol, dextrosa, caolín, celulosa, carbonato cálcico, silicato cálcico o fosfato dicálcico. Los aromatizantes apropiados incluyen aceite de menta, aceite de gaulteria, aromas de cereza, naranja o frambuesa. Los agentes de revestimiento adecuados incluyen polímeros o copolímeros de ácido acrílico y/o ácido metacrílico y/o sus ésteres y/o sus amidas, ceras, alcoholes grasos, zeína, goma laca o gluten. Los conservantes adecuados incluyen benzoato de sodio, vitamina E, a-tocoferol, ácido ascórbico, metilparabenos, propilparabenos o bisulfato sódico. Los lubricantes adecuados incluyen estearato magnésico, ácido esteárico, oleato sódico, cloruro sódico o talco. Los agentes retardadores adecuados incluyen monoestearato de glicerilo o diestearato de glicerilo.

Las suspensiones para la administración oral o rectal pueden comprender adicionalmente agentes dispersantes y/o agentes de suspensión. Los agentes de suspensión adecuados incluyen carboxilmetilcelulosa sódica, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, polivinilpirrolidona, alginato de sodio o alcohol cetílico. Los agentes dispersantes adecuados incluyen lecitina, ésteres de polioxietileno o ácidos grasos tales como ácido esteárico, mono o dioleato, estearato o laurato de polioxietilen sorbitol, mono o dioleato, estearato o laurato de polioxietilen sorbitano y similares.

La composición de la mezcla de arcilla, producto de levadura y opcionalmente, glutamato, puede comprender adicionalmente uno o más agentes emulsionantes. Los agentes emulsionantes adecuados incluyen agentes dispersantes como se ha ejemplificado anteriormente o gomas naturales, tales como goma arábiga o goma tragacanto.

Las composiciones para la administración en el método de la invención se pueden preparar por medios conocidos en la técnica para la preparación de composiciones (tales como en la técnica de las composiciones veterinarias y farmacéuticas) incluyendo la mezcla, trituración, homogeneización, agentes de suspensión, disolución, emulsión, dispersión y en donde se adecuado, la mezcla de los principios activos junto con excipientes seleccionados, diluyentes, vehículos y adyuvantes.

Para la administración oral, la composición farmacéutica o veterinaria puede estar en forma de comprimidos, grageas, píldoras, trociscos, cápsulas, elixires, polvos, incluyendo polvos liofilizados, soluciones, gránulos, suspensiones, emulsiones, jarabes y tinturas. También se pueden preparar formas de liberación lenta o de liberación retardada, por ejemplo, en forma de partículas recubiertas, comprimidos multicapa o microgránulos.

La presente invención se ilustrará adicionalmente en los siguientes Ejemplos que se facilitan solo con fines ilustrativos.

Ejemplo 1: Sumario de toxinas / enfermedad clostridial, eficacia del producto prototipo

Se probaron diversos adsorbente de toxinas contra 2 Clostridium spp. in vitro e in vivo.

Se realizó un ensayo de adsorción in vitro con toxina alfa con tres muestras de arcillas pulverizadas: una bentonita cálcica (CBEN; del inglés, calcium bentonite), una tierra de Fullers de tipo atapulgita (AFE; del inglés, attapulgite-type Fullers Earth) y una tierra de Fullers tratada térmicamente (HTF; del inglés, heat treated Fullers Earth). La toxina alfa se produce por C. perfringens, en los intestinos de las aves de corral durante condiciones de estrés, dando como resultado la enteritis necrótica. Se probaron cinco niveles de toxina (0, 5, 10, 50 y 100 pg/ml) y tres niveles de cada arcilla (0, 0,5% y 1,0%) juntos en 50 pl de solución tampón fosfato, se incubaron, se centrifugaron y se determinó la unión midiendo la hidrólisis del agar de lecitina de yema de huevo resultante de la toxina alfa no unida. Todos los productos se unen a la toxina en algún nivel. La Tabla 1 muestra un sumario de los resultados. La disminución de la proporción de aglutinante respecto a toxina dio como resultado la separación de las eficiencias de unión de las arcillas, teniendo CBEN mayor eficiencia de unión que las otras dos arcillas (aproximadamente 2 veces más eficiente). En conjunto, la unión in vitro de la toxina alfa fue mejor para CBEN, seguida de AFE y HTF.

T l 1 - A r i n xin lf . rfrin n

Se ensayaron varias arcillas para determinar su actividad contra 2 toxinas A y B de C. difficile (AFE, una atapulgita tratada con ácido (ATA), CBEN y una bentonita cálcica tratada térmicamente (HCBN). Tanto las arcillas (como polvos finos) como las toxinas (las toxinas purificadas se diluyeron a concentraciones finales de 2000 unidades de citotoxicidad por ml para la toxina A y 10.000 unidades de citotoxicidad por ml para la toxina B) se añadieron a varias concentraciones diferentes. Las arcillas se pusieron en suspensión con la toxina y se incubaron. A continuación, los sólidos se eliminaron por centrifugación. El sobrenadante (líquido sobrante, en donde todavía permanecería la toxina activa) se añadió a un cultivo celular (células de ovario de hámster chino) y se registró el daño. Más daño celular significaba menos actividad de la arcilla. Menos daño celular significó más actividad contra la toxina.

Resultados: Ningún producto adsorbió la Toxina B (que se utilizó a una tasa 10x superior a la de la Toxina A). La Tabla 2 proporciona datos de ejemplo. AFE y ATA adsorbieron algo de Toxina A. La siguiente tabla proporciona un ejemplo de los resultados. Un 100 significa que no hubo una disminución medida de la adsorción de toxinas. Un 0 significa que no hubo actividad de toxinas.

Tabla 2 - Adsorción de la Toxina A B de C. difficile

Una ronda de seguimiento de pruebas que utilizó solo la Toxina B, en donde se utilizó arcilla al 2% y las toxinas cuantificadas en peso (no en unidades de citotoxicidad) mostró que todos los productos analizados tenían actividad en algún grado (Tabla 3). En esta tabla, la definición de actividad es inversa a la de la Tabla 2. Un 100 significa que no hubo actividad de toxinas. Un 0 significa que hubo mucha actividad de la toxina (es decir, citotoxicidad).

Tabla 3 - Adsorción de la Toxina B de C. difficile, Universidad de Arizona, 2010

Para los estudios in vivo, se utilizó para el desafío la cepa JGS4143, una cepa virulenta de campo EN. Se alimentó a los polluelos recién eclosionados de Cornish x Rock con una dieta de iniciación para polluelos sin antibióticos con un 16% de proteínas durante 7 días. El día 8, la dieta se cambió a un pienso basado en trigo, alto en proteínas (28%) que contiene un 60% de harina de pescado y zinc con 400 ppm. Las arcillas HCBEN, CBEN y CBEN probiótico se añadieron en un 1% o un 2% al pienso de los grupos individuales Antes del desafío (Día 14), el pienso se retiró durante 20 h. Comenzando el día 15, las aves se alimentaron (cada 12 h durante 3,5 días) un 1,25:1 pienso: mezcla de cultivos. A las aves supervivientes se les practicó una necropsia los días 18 y 19). Se contaron y puntuaron las lesiones macroscópicas y se recogieron muestras duplicadas frescas para cultivo bacteriológico y se fijaron en formalina tamponada con fosfato al 10% para histopatología. Los tejidos incluidos en parafina se seccionaron (5 pm), se tiñeron con hematoxilina y eosina, se examinaron mediante microscopía óptica y se asignaron puntuaciones de lesiones basadas en el grado de necrosis. Para obtener los resultados bacteriológicos semicuantitativos, se abrieron asépticamente segmentos de yeyuno recogidos de polluelos sometidos a necropsia sobre papel de aluminio estéril y se extrajo la mucosa raspando con portaobjetos de microscopio estériles. Los raspados de áreas con lesiones macroscópicas se sembraron en placas en agar sangre triptosa. Todas las colonias con morfología típica y patrón hemolítico se sembraron en estrías para aislamiento en agar sangre y se confirmaron como C. perfringens (Bacilos Gram positivos anaeróbicos con hemolisis de doble zona). Se realizaron estimaciones de la concentración de C. perfringens clasificando las colonias a partir de estrías secuenciales (por ejemplo, un 4 representa colonias en la estría 4).

Resultados: Ambas arcillas sin el probiótico mostraron una reducción significativa de la puntuación de lesiones o de placas. Todos los pollos estaban bastante enfermos, lo que se sospechaba se debía a la gran cantidad de inóculo y pienso utilizado.

Tabla 4 - Resultados de enteritis necrótica in vivo

Dado que no se utilizaron coccidia en el desarrollo de la enfermedad (la enteritis necrótica está asociada con la infección coccidial), se realizó un estudio utilizando un modelo coccidial.

Método: Se utilizaron doce tratamientos (TRT) con 8 réplicas de 8 aves en un experimento para evaluar los efectos de diferentes productos sobre la salud intestinal, el rendimiento del crecimiento y los efectos de la enteritis necrótica (EN) en pollos. Se evaluaron seis productos con un desafío de Clostridium perfringens y dos de estos productos también se evaluaron sin un desafío de clostridium perfringens (CP). Los pollos se alimentaron con dietas de tratamiento de 0 - 28 días de edad, con todas las aves recibiendo un desafío de coccidia oral el día 14 con un inóculo de coccidia mixto (~5000 ooquistes de E. maxima por ave). Las aves desafiadas también recibieron un cultivo de caldo de CP (108 ufc/ml) para inducir EN los días 19, 20 y 21.

Los tratamientos se enumeran en la Tabla 5.

T l - Tr mi n r l i n ri i n r i

Resultados: Todos los productos redujeron la enfermedad de alguna forma, dependiendo de la medición. La Tabla 6 muestra un orden de rendimiento clasificado. Si bien la virginiamicina (el fármaco utilizado para controlar la enteritis necrótica) fue numéricamente el mejor, los productos de arcilla en general no fueron significativamente diferentes.

Tabla 6 - Clasificación simple de tratamientos basada en la puntuación de lesiones, mortalidad por enteritis necrótica y ganancia de peso y proporción de conversión alimenticia en los d 14 - 28 de las aves con o sin n fí l ri i m rfrin n .

Dado que el número de parámetros medidos y los resultados son un tanto complicados, las siguientes tablas simplemente los enumeran.

Tabla 7. Puntuación de lesiones y mortalidad por enteritis necrótica en aves. Tratamiento ^{Puntuación de}

_lesionesbMortalidad por enteritis necrótica, %c 1. Sin producto, Sin CP 0,0 d 0,0 c

2. Producto 5, Sin CP 0,0 d 0,0 c

3. Producto 6, Sin CP 0,0 d 0,0 c

4. Virginiamicina, Sin CP 0,0 d 0,0 c

5. Sin producto, CP 0,8 a 15,6 a

6. Producto 1, CP 0,5 b 15,6 a

7. Producto 2, CP 0,3 bc 14 1 ab

8. Producto 3, CP 0,5 b 15,6 a

(continuación)

Tratamiento ^{Puntuación de}

_lesiones _b Mortalidad por enteritis necrótica, %c 9. Producto 4, CP 0,5 b 9,4 ab

10. Producto 5, CP 0,1 cd 9,4 ab

1,1. Producto 6, CP 0,4 bc 7,8 abc

12. Virginiamicina, CP 0,2 cd 6,3 bc

a Los números con diferentes letras son significativos al nivel p = 0,05.

b La puntuación se basó en una puntuación de 0 a 3, siendo 0 normal y 3 la más grave.

c Mortalidad determinada como causada por enteritis necrótica dividida por el número de aves que iniciaron el experimento (8/corral).______________________________________________________________________________

Tabla 8. Rendimiento del crecimiento de las aves

Ejemplo 2: Los efectos de la enteritis necrótica y la aflatoxina sobre el rendimiento del crecimiento, puntuación de lesiones y mortalidad en pollos de engorde jóvenes y productos para aliviarlos

Se sabe poco acerca de las posibles interacciones enteritis necrótica / aflatoxinas. Se realizó un estudio para investigar las posibles interacciones y la capacidad de varios productos prototipo para disminuir la enfermedad. La clave de producto B = arcilla LVM; Y= B ácido orgánico extracto de planta; C = B producto de levadura; Los 3 materiales de prueba redujeron la enfermedad.

Se utilizaron polluelos Cobb 500 (2640, machos) para determinar los efectos del desafío de la enfermedad y productos para disminuir esos efectos. Se utilizaron tres niveles de desafío; 1) sin desafío; 2) desafío de enteritis necrótica (CPP); y 3) CPP+1 ppm de aflatoxina B1. Los productos probados para aliviar los desafíos de la enfermedad fueron: 1) sin producto (NP); 2) un producto patentado a base de arcilla (B); 3) (Y); 4) C); y 5) virginiamicina (VM). En el d 24 de estudio, 22 pollos (igualados a 20 el d-7) por corral se asignaron a 15 tratamientos (arreglo factorial 3x5) con 8 réplicas (unidad experimental = corral). La diferencia significativa se fijó en p<0,05. Se tomaron pesos en d-0, 10 y 24 para calcular el consumo de pienso, ganancia y pienso: ganancia. Las aves consumieron pienso y agua ad libitum. En este estudio se observó que las respuestas negativas aumentadas a la combinación de EN y AFL como F1 (d-0-10), ganancia (d-10-24, d-0-24) y F:G (d-10-24) fueron cada vez más pobres a medida que el nivel de desafío pasó de sin desafío a desafío de CPP a desafío de CPP+AFL (p<0,05). Otras respuestas de crecimiento fueron peores que sin desafío o desafío de CPP cuando se aplicaron ambos CPP+AFL (p<0,05). La puntuación de lesiones fue mayor en las aves desafiadas con CPP, con o sin AFL (p<0,05). La alimentación de VM mejoró el rendimiento en aves desafiadas (p<0,05). En aves desafiadas de CPP, la adición de B o Y mejoró la F1 y la ganancia en comparación con NP; siendo Y igual a aquellos alimentados con VM durante el período de desafío (p<0,05). Las aves que recibieron B tuvieron la mayor ganancia y conversión alimenticia cuando se sometieron a desafío tanto con CPP como con AFL; la alimentación con Y, C y VM tuvo mayores ganancias que añadiendo NP (p<0,05). En conclusión, el aumento del nivel de desafío disminuyó el rendimiento de las aves. Las aves con enteritis necrótica alimentadas con Y obtuvieron una ganancia que fue igual a las alimentadas con VM durante el período de desafío. La alimentación de los productos a base de arcilla mejoró el rendimiento durante un desafío de CPP AFL.

Tablas 9 y 10- Tablas de datos, CQR

Ejemplo 3: Los efectos de la enteritis necrótica y la aflatoxina sobre el rendimiento del crecimiento, puntuaciones de lesiones y mortalidad en pollos de engorde jóvenes y productos para aliviarlos.

Se utilizaron polluelos Cobb 500 (2640, machos) para determinar los efectos del desafío de la enfermedad y productos para disminuir esos efectos. Se utilizaron tres niveles de desafío; 1) sin desafío; 2) desafío de enteritis necrótica (CPP); y 3) CPP+1 ppm de aflatoxina B1. Los productos probados para aliviar los desafíos de la enfermedad fueron: 1) sin producto (NP); 2) un producto patentado a base de arcilla (B); 3) un segundo producto patentado a base de arcilla (Y); 4) un tercer producto patentado a base de arcilla (C); y 5) virginiamicina (VM). En el d 24 de estudio, 22 pollos (igualados a 20 el día7) por corral se asignaron a 15 tratamientos (arreglo factorial 3x5) con 8 réplicas (unidad experimental = corral). La diferencia significativa se fijó en p<0,05. Se tomaron pesos en día 0, 10 y 24 para calcular el consumo de pienso, ganancia y pienso:ganancia. Las aves consumieron pienso y agua adlibitum. En este estudio se observó que las respuestas negativas aumentadas a la combinación de EN y AFL como Fl (d-0-10), ganancia (d-10-24, d-0-24) y F:G (d-10-24) fueron cada vez más pobres a medida que el nivel de desafío pasó de sin desafío a desafío de CPP a desafío de CPP+AFL (p<0,05). Otras respuestas de crecimiento fueron peores que sin desafío o desafío de CPP cuando se aplicaron ambos CPP+AFL (p<0,05). La puntuación de lesiones fue mayor en las aves desafiadas con CPP, con o sin AFL (p<0,05). La alimentación de VM mejoró el rendimiento en aves desafiadas (p<0,05). En aves desafiadas de CPP, la adición de B o Y mejoró la FI y la ganancia en comparación con NP; siendo Y igual a aquellos alimentados con VM durante el período de desafío (p<0,05). Las aves que recibieron B tuvieron la mayor ganancia y conversión alimenticia cuando se sometieron a desafío tanto con CPP como con AFL; la alimentación con Y, CL3 y VM tuvo mayores ganancias que añadiendo NP (p<0,05). En conclusión, el aumento del nivel de desafío disminuyó el rendimiento de las aves. Las aves con enteritis necrótica alimentadas con Y obtuvieron una ganancia que fue igual a las alimentadas con VM durante el período de desafío. La alimentación de los productos a base de arcilla mejoró el rendimiento durante un desafío de CPP AFL.

Ejemplo 4: Los efectos de la enteritis necrótica, aflatoxina y virginiamicina sobre el rendimiento del crecimiento, puntuaciones de lesiones y mortalidad en pollos de engorde jóvenes

Un total de 2.112, machos, polluelos Cobb 500 se utilizaron para determinar los efectos del aumento de la concentración de aflatoxina (AFL; 0, 0,75, 1,5 ppm) en pollos de engorde con o sin enteritis necrótica o virginiamicina (VM). En el estudio de 23 días, 22 polluelos (igualados a 20 en el d-7) por corral se asignaron a 12 tratamientos (arreglo factorial 3x2x2) con 8 réplicas en un diseño de bloques aleatorizados completos; el corral fue la unidad experimentales. La diferencia significativa se fijó en p<0,05. Se tomaron pesos en d-0, 16 y 23 para calcular el consumo de pienso, ganancia y pienso:ganancia. Las aves consumieron pienso y agua ad libitum. La aflatoxina disminuyó la ganancia y la ingesta de pienso y dio como resultado más pobres pienso:ganancia, mortalidad y lesiones (p<0,05). La inducción de enteritis necrótica (CPP) utilizando arena contaminada con Clostridium perfringens y una dosis 10 x la vacuna contra la coccidiosis administrada el día-10 aumentó la puntuación de lesiones y disminuyó la ingesta y la ganancia de pienso (p<0,05). La adición de VM a las dietas mejoró la ganancia, el consumo de pienso y la conversión de pienso y disminuyó la mortalidad (p<0,05). Sin embargo, hubo interacciones (p<0,05) como las aves en desafío en el segundo período con CPP y alimentación con 0,75 ppm de AFL que tuvieron un efecto sinérgico negativo sobre la ganancia, si bien no se observó siquiera un efecto aditivo cuando las aves se alimentaron con 1,5 ppm de AFL. Con 1,5 ppm de AFL, las aves no desafiadas con CPP alimentadas con VM tuvieron una mayor ganancia que aquellas aves no alimentadas con VM, que fue igual a la ganancia de las aves desafiadas con o sin VM. Se observó una interacción similar (p<0,05) en el período de alimentación global, aunque VM ayudó a las aves desafiadas de CPP con 0,75 ppm en conjunto. La virginiamicina mejoró la conversión alimenticia con la mayor mejora con 1,5 ppm. La aflatoxina aumentó las puntuaciones de lesiones en las aves no desafiadas pero no en las desafiadas. VM aumentó las puntuaciones de lesiones en aves desafiadas pero no en aves no desafiadas (p<0,05). La aflatoxina y la enteritis necrótica disminuyen el rendimiento de los pollos de engorde e interactúan para disminuir la ganancia de peso; VM ayuda a mejorar la ganancia en aves desafiadas con 0,75 ppm de AFL pero no con 1,5 ppm de AFL.

Ejemplo 5: Efectos de los productos Amlan frente a los efectos de la enteritis necrótica en aves de engorde

El propósito de este Ejemplo fue evaluar el efecto de los productos Amlan sobre los signos clínicos de EN, inmunopatología y respuestas de citocinas en pollos de engorde coinfectados con Eimeria maxima y Clostridium perfringens en el modelo de enfermedad de enteritis necrótica (EN). Modelo de enfermedad EN utilizado para este ensayo (Park SS, Lillehoj HS, et al. Immunopathology and cytokine responses in broiler chickens coinfected with Eimeria maxima and Clostridium perfringens with the use of an animal model of necrotic enteritis. Avian Diseases 2008; 52:14-22; Jang SI, Lillehoj HS, et al. Vaccination with Clostridium perfringens recombinant proteins in combination with Montanide™ ISA 71 VG adjuvant increase protection against experimental necrotic enteritis in commercial broiler chickens. Vaccine 2012; 30: 5401-5406).

Materiales y métodos. Los productos Amlan fueron un producto 100% de arcilla (B), el producto de arcilla mezclado con un ácido orgánico y un extracto de planta (Y), una mezcla de arcilla y un producto de levadura (C), una mezcla de la arcilla, el producto de levadura y glutamato monosódico (D) y el antibiótico virginiamicina (VM). Los pollos fueron aves de engorde de un día (Ross/Ross) eclosionados en el criadero de Longeneckers (Elizabethtown, Pensilvania) transportados por camión de correo y alojados en unidades de cría de inicio. Las aves se mantuvieron en incubadoras en una instalación libre de Eimeria y se transfirieron a grandes jaulas colgantes en un lugar separado en donde se infectaron y mantuvieron hasta el final del período experimental para el estudio de infección del desafío directo. Todos los procedimientos respecto al transporte, la medición del peso corporal, la infección y la extracción de sangre y bazo se realizaron de acuerdo con las pautas establecidas para experimentos con animales.

Todas las aves se alimentaron con una ración basal comercial sin medicación de un 17 % de proteína cruda de 1-18 días de edad. El pienso se mezcló con los productos B, Y, C, D y VM respectivamente. A los 18 días de edad, el pienso se reemplazó con pienso comercial sin medicación que contiene un 24% de pienso de iniciación de proteína cruda.

Las cepas de Eimeria spp. se mantuvieron y propagaron de acuerdo con el procedimiento establecido. La E. maxima (41A) se limpió por flotación en hipoclorito sódico al 5 %, se lavó tres veces con PBS y se enumeró la viabilidad mediante azul tripán utilizando un hemocitómetro. El número de ooquistes se basa únicamente en ooquistes esporulados. El día 14, se inoculó a los pollos por vía esofágica con 10.000 de E. maxima utilizando una aguja de inoculación.

Cuatro días después de la infección con Eimeria, las aves de los grupos EN se inocularon por vía esofágica con 1 x 109 UFC Clostridium perfringens cada uno, utilizando una aguja de inoculación.

Las aves se pesaron justo antes del desafío con E. maxima (EM), 0 y 2 días tras el desafío de C. perfringens para calcular la ganancia de peso.

Para determinar una puntuación de lesiones, las aves (5 aves/grupo) se sacrificaron 2 días tras la infección de C. perfringens (CP). Se obtuvieron segmentos intestinales de aproximadamente 20 cm que se extienden 10 cm anterior y posterior al divertículo y se cortaron longitudinalmente. Las puntuaciones de las lesiones se evaluaron por 3 observadores independientes de 0 a 4 en orden ascendente de gravedad de la lesión.

En cada uno de los días 0, 2, 7 y 14 tras la infección de CP, se tomaron muestras de un total de 12 aves (5/grupo) para el suero para los títulos de anticuerpos (se recogen individualmente). Para los sueros, se obtuvieron muestras de sangre de aves individuales (3 ml/ave), se dejaron coagular durante la noche a 4 °C y se recogieron los sueros.

Las muestras de suero se analizaron para detectar anticuerpos contra clostridium utilizando un ELISA establecido. Brevemente, las placas de microtitulación se recubrieron durante la noche con 200 ng/pocillo del antígeno de clostridium recombinante, se lavó con PBS-Tween al 0,05% y se bloqueó con PBS-BSA al 1%. Se agregaron diluciones de suero, se incubaron con agitación suave continua, se lavaron y se unieron a los Ab detectados con IgG anti-pollo de conejo conjugada con peroxidasa (Sigma) y sustrato específico de peroxidasa. La densidad óptica (DO) se determinó a 450 nm utilizando un lector de microplacas (Bio-Rad, Richmond, California).

Las muestras de suero se analizaron para detectar antígenos contra la toxina a o NetB utilizando un ELISA establecido. Brevemente, las placas de microtitulación se recubrieron durante la noche con 0,5 pg/pocillo del mAb para la toxina a o la toxina NetB, se lavaron con PBS-Tween al 0,05% y se bloquearon con PBS-1 % b Sa . Se agregaron diluciones de suero de pollo, se incubaron con agitación suave continua, se lavaron y se unieron los Ab detectados con antitoxina a o toxina NetB de conejo conjugada con peroxidasa y sustrato específico de peroxidasa. La densidad óptica (DO) se determinó a 450 nm utilizando un lector de microplacas (Bio-Rad, Richmond, California).

Para el análisis estadístico, todos los valores se expresaron como media ± ETM. Los valores medios para la ganancia de peso corporal y la puntuación de lesiones se compararon entre grupos mediante la prueba de rango múltiple de Duncan seguido de un ANOVA, utilizando SPSS 15.0 para Windows (SPSS Inc., Chicago, Illinois). Las diferencias entre las medias se consideraron significativas con p<0,05.

Tabla 11. Diseño ex erimental

Se utilizaron 220 aves de engorde (20/grupo) y se alojaron en incubadoras con 2 Petersime de cría por unidad. La unidad de finalista fue una unidad de jaula colgante de 80 en donde se trasladó a las aves a los 18 días de edad.

Los pollos llegaron el día 0 y se trasladaron a las unidades Petersime el mismo día. Los pollos se trasladaron a jaulas grandes el día 18. Se infectó a las aves con 10.000 ooquistes esporulados de E. maxima el día 14 y se infectaron con 1 x109 UFC de C. perfringens el día 18. Se extrajo sangre los días 14, 18, 20, 25 y 32. Las lesiones se puntuaron el día 20. El peso corporal se determinó los días 14, 20 y 25 (véase, por ejemplo, la Fig. 1).

Como se muestra en la Fig. 2, los pollos alimentados con un 0,25% de D y un 0,5% de dieta complementada con D y se coinfectaron con E. maxima y C. perfringens exhibieron un peso corporal aumentado en comparación con los animales infectados que recibieron la dieta sin suplementación.

Como se muestra en la Fig. 3, los pollos alimentados con un 0,25% de dieta suplementada con D y coinfectados con E. maxima y C. perfringens mostraron el peso corporal aumentado en comparación con los animales infectados que recibieron la dieta sin complementación (grupo EN de control).

Como se muestra en la Fig. 4, las aves alimentadas con los grupos D (0,25%), D (0,5%) e Y (0,5%) mostraron una puntuación de lesiones significativamente reducida en comparación con el grupo de control EN.

Como se muestra en la Fig. 5A, los niveles de anticuerpos séricos contra toxina a (7 días tras la infección de C. perfringens) fueron significativamente mayores en el grupo D (0,25%) en comparación con el grupo de control EN infectado. Sin embargo, no hubo diferencias significativas en los niveles de anticuerpos entre otros grupos de dieta y el grupo de control de EN infectado.

Como se muestra en la Figura 5B, en aves alimentadas con la dieta suplementada con D (0,25%) y D (0,5%), la respuesta de anticuerpos séricos contra la toxina a (14 días tras la infección de C. perfringens) mostró aumentos notables en comparación con el grupo de control EN.

Como se muestra en la Fig. 6A, en aves alimentadas con D (0,25%), el anticuerpo sérico contra la toxina NetB (7 días tras la infección de C. perfringens) mostró aumentos en comparación con el grupo de control EN.

Como se muestra en la Figura 6B, en aves alimentadas con D (0,25%), el nivel de anticuerpos séricos contra la toxina NetB (14 días tras la infección de C. perfringens) mostró aumentos notables en comparación con el grupo de control EN.

Como se muestra en la Fig. 7A, los niveles de la toxina a en suero fueron significativamente más bajos en los grupos infectados con D (0,25%) y B (0,5%) en comparación con los controles de EN sin suplementación e infectados.

Como se muestra en la Figura 7B, los niveles séricos de la toxina NetB fueron más bajos en los grupos infectados con D (0,25%, 0,5%) y B (0,25%, 0,5%) en comparación con los controles de EN sin suplementación e infectados. Sin embargo, no hay diferencias significativas entre los grupos.

Para resumir este Ejemplo, los pollos alimentados desde la eclosión con una dieta normal o con una dieta suplementada con productos Amlan (C, Y, B, D y en comparación con el antibiótico VM) y la inmunidad contra EN se comparó entre los grupos experimentales y los de control EN. Los pollos alimentados con la dieta suplementada con D y coinfectados con E. maxima y C. perfringens mostraron una ganancia de peso corporal aumentada significativamente, una puntuación de lesiones reducida, una potenciación de los niveles de anticuerpos séricos hacia la toxina a o la toxina NetB y una disminución de los niveles de toxina a en suero.

Ejemplo 6: Eficacia comparativa de productos hacia Virginiamicina administrados en el pienso para el control de enteritis necrótica causada por Clostridiumperfringens en pollos de engorde

Tabla 12: Sumario

Consumo de pienso Conversión del pienso Ganancia de peso ^{Lesión (0}

_{3) de EN}Tratamiento D0-21 D14-21 D0-21 D14-21 D0-21 D14-21 Puntuación 1) Sinmed, sininfecc 5,480 a 2,870 a 1,773 c 1,685 0,386 a 0,212 a 0,0 2) Sinmed, infecc 5,220 a 2,714 ab 2,183 a 2,464 a 0,307 b 0,145 b 0,5 a 3) D infecc 4,959 ab 2,590 abc 2,086 ab 2,199 ab 0,305 b 0,156 b 0,3 abc 4) D8, infecc 5,310 ab 2,731 a 2,091 ab 2,331 a 0,327 b 0,153 b 0,3 bcd 5) DX, infecc 4,763 ab 2,347 bc 2,011 ab 1,964 bc 0,303 b 0,152 b 0,4 abc 6) D8X, infecc 5,191 ab 2,553 abc 2,185 a 2,276 a 0,319 b 0,157 ab 0,2 cd 7) VM. 20 g/t, infecc 4,733 b 2,312 c 1,947 bc 1,752 c 0,316b 0,171 a 0,5 ab Consumo de pienso Conversión del pienso Ganancia de peso EN % Tratamiento D0-28 D14-28 D0-28 D14-28 D0-28 D14-28 Mortalidad 1) Sinmed, sininfecc 7,474 a 4,863 a 1,807 c 1,781 c 0,621 a 0,447 a 0,0 c 2) Sinmed, infecc 7,022 ab 4,516 ab 2,254 a 2,470 a 0,465 c 0,303 c 10,9 a 3) D infecc 6,561 ab 4,192 bc 1,984 bc 1,994 bc 0,482 bc 0,333 bc 6,3 ab 4) D8, infecc 7,074 ab 4,495 ab 2,031 b 2,131 b 0,541 b 0,367 b 3,1 bc 5) DX, infecc 6,410 b 3,994 bc 1,992 bc 1,962 bc 0,495 bc 0,344 bc 4,7 bc 6) D8X, infecc 6,499 b 3,861 c 2,108 ab 2,096 b 0,489 bc 0,327 bc 4,7 be 7) VM. 20 g/t, infecc 6,313 b 2,891 bc 1,929 bc 1,797 c 0,512 b 0,367 b 1,6 bc

La clave del producto es:

La duración del estudio fue de 28 días y el animal diana fue un pollo de engorde.

Tabla 13: Tratamientos

Materiales y métodos:

Ración experimental: Se formuló una ración de iniciación de pollo de tipo comercial sin medicación compuesta con piensos comúnmente utilizados en los Estados Unidos. Esta ración (en forma de puré) se administró ad libitum desde la fecha de llegada de los polluelos hasta el Día 28 del estudio. La formulación de la dieta se incluyó en los datos de origen. Se prepararon piensos de tratamiento experimental a partir de este pienso de iniciación básico. Se documentaron las cantidades de todo el pienso basal y los artículos de prueba utilizados para preparar los lotes de tratamiento. Los piensos de tratamiento se mezclaron para asegurar una distribución uniforme de los respectivos artículos de prueba. El pienso se distribuyó entre jaulas del mismo tratamiento.

Se recogieron tres muestras: una del principio, del medio y del final del lote de la dieta de tratamiento y se mezclaron para formar una muestra compuesta. Se tomó una muestra compuesta del compuesto para cada tratamiento.

Animales: Se adquirieron pollos machos de engorde de un día de edad del criadero Cobb-Vantress, Cleveland, Georgia. La cepa fue Cobb X Cobb. Se registró la información del lote de gallinas reproductoras. En el criadero, las aves fueron sexuadas y recibieron las vacunas de rutina. En el estudio solo se utilizaron polluelos de apariencia sana. Se documentaron el número y la disposición de todas las aves no utilizadas para la asignación.

Alojamiento: A su llegada, los polluelos se criaron en jaulas en batería Petersime. En el alojamiento, las aves se alimentaron con los piensos de tratamiento. El espacio de suelo por animal era de 0,63 metros cuadrados/ave. El espacio de comedero por ave fue de 8 aves/comedero de 43 cm x 6,8 cm. El horno de gas/aire acondicionado controlado mediante termostato mantuvo una temperatura uniforme. Incluso se proporcionó iluminación. Se documentó el diagrama de la jaula.

Reparto de aves y aleatorización de jaulas: Las jaulas se bloquearon por ubicación en la batería con un tamaño de bloque igual al de los tratamientos (7 jaulas por bloque). El estudio comenzó cuando se colocaron las aves (día de la eclosión) (DOT 0), momento en el que se asignaron a las jaulas experimentales. Solo se seleccionaron aves sanas. En el DOT 0, los pesos corporales del grupo se registraron por jaula. No se reemplazó ninguna ave durante el curso del estudio.

Inducción de la enfermedad: El pienso y el agua estuvieron disponibles ad libitum durante todo el ensayo. En el DOT 14, todas las aves fueron inoculadas por vía oral con un inóculo coccidial que contenía aproximadamente 5.000 ooquistes de E. maxima por ave. Los procedimientos de inoculación de ooquistes coccidiales se describen en SPR SOP. A partir del DOT 19, todas las aves, excepto el Tratamiento 1, recibieron un cultivo de caldo de C. perfringens 108 ufc/ml. A las aves se les administró un cultivo de caldo fresco una vez al día durante 3 días (en los DOT 19, 20 y 21).

Pesos de los DOT 0, 14, 21 y 28: Todas las aves se pesaron en la jaula en los DOT 0, 14, 21 y 28. El pienso se pesó en el DOT 0 y el pienso restante se pesó en el DOT 14, 21 y 28. El ensayo finalizó el DOT 28.

Puntuación de lesiones intestinales de enteritis necrótica: En el DOT 21, se seleccionaron, sacrificaron, pesaron y examinaron tres aves de cada jaula para determinar el grado de presencia de lesiones de enteritis necrótica. La puntuación se basó en una puntuación de 0 a 3, siendo 0 normal y 3 la más grave.

Gestión: La instalación fue revisada minuciosamente para asegurar que todas las jaulas tuvieran agua y que hubiera pienso disponible en cada jaula. El intervalo de temperaturas del edificio se mantuvo a una temperatura adecuada para la edad de las aves. Incluso, la iluminación continua se proporcionó mediante lámparas fluorescentes colgadas verticalmente a lo largo de la pared. El pienso y el agua se administraron ad libitum.

De acuerdo con los procedimientos operativos estándar (SOP; del inglés, standard operating procedures), las jaulas se revisaron dos veces al día. Las observaciones incluidas fueron la disponibilidad de pienso y agua, control de temperatura y cualquier condición inusual. Las aves se observaron de cerca para detectar reacciones anormales. Cuando las aves muertas se retiraron de las jaulas, se registró el número de jaula, la fecha, el peso del ave, el sexo y la causa probable de muerte.

Análisis de datos: Se calcularon las medias por jaula de la ganancia de peso, consumo de pienso, conversión alimenticia, puntuaciones de lesiones y mortalidad.

La Fig. 8A representa la conversión alimenticia del Día 0-21. En general, la conversión alimenticia de las aves alimentadas con los diferentes tratamientos fue intermedia entre las del tratamiento EN (aves desafiadas a inducir enteritis necrótica pero alimentadas sin producto) o VM (aves desafiadas a inducir enteritis necrótica y alimentadas con virginiamicina) del día 0 al 21. Sin embargo, las aves alimentadas con el producto D8X no siguieron este patrón que tiene la conversión alimenticia tan pobre, estadística y numéricamente, como las del tratamiento con En sin producto para este período de tiempo.

La Fig. 8C representa la conversión alimenticia del Día 0-28. Todos los productos excepto el D8X fueron significativamente mejores que EN sin producto. Los productos D y DX fueron los mejores de los productos probados, similares a las aves en el tratamiento VM y no estadísticamente diferentes de las aves sin desafío de EN.

La Fig. 9B representa la ganancia de peso del Día 14-28. La ganancia siguió patrones similares para los días 14 - 28 como lo hicieron los días 0 - 28, excepto que D8 fue numéricamente igual a VM.

La Fig. 11 representa la mortalidad de EN. Todos los productos excepto D disminuyeron la mortalidad en comparación con las aves desafiadas de EN sin producto y fueron estadísticamente iguales a las alimentadas con VM.

Ejemplo 7: Efectos de los productos contra los efectos de la enteritis necrótica en aves de engorde

El propósito de este ejemplo fue evaluar diferentes fórmulas y dosis de los productos previamente descubiertos sobre los signos clínicos de la enteritis necrótica (EN), la inmunopatología y las respuestas de citocinas en pollos de engorde coinfectados con Eimeria maxima y Clostridium perfringens en un modelo de enfermedad de enteritis necrótica (EN). El modelo de enfermedad EN utilizado para este ensayo (Park SS, Lillehoj HS, et al. Immunopathology and cytokine responses in broiler chickens coinfected with Eimeria maxima and Clostridium perfringens with the use of an animal model of necrotic enteritis. Avian Diseases 2008; 52:14-22; Jang SI, Lillehoj HS, et al. Vaccination with Clostridium perfringens recombinant proteins in combination with Montanide™ ISA 71 Vg adjuvant increase protection against experimental necrotic enteritis in commercial broiler chickens. Vaccine 2012; 30: 5401-5406).

Materiales y métodos. Los productos fueron una mezcla de arcilla, un producto de levadura y glutamato monosódico en una fórmula que previamente se consideró efectiva (D), en el experimento actual se incluyó en cuatro tasas de inclusión diferentes (0.35, 0.25, 0.15 y 0.05%), también se incluyeron productos que contienen los mismos ingredientes que el producto anterior pero con cuatro formulaciones diferentes de ingredientes en la fórmula del Producto (denominados DS, DSF, D8 y D8F5). También se incluyó como tratamiento el antibiótico virginiamicina (VM). Los pollos fueron aves de engorde de un día (Ross/Ross) eclosionados en el criadero de Longeneckers (Elizabethtown, Pensilvania) transportados por camión de correo y alojados en unidades de cría de inicio. Las aves se mantuvieron en incubadoras en una instalación libre de Eimeria y se transfirieron a grandes jaulas colgantes en un lugar separado en donde se infectaron y mantuvieron hasta el final del período experimental para el estudio de infección del desafío directo. Todos los procedimientos respecto al transporte, la medición del peso corporal, la infección y la extracción de sangre y bazo se realizaron de acuerdo con las pautas establecidas para experimentos con animales.

Todas las aves se alimentaron con una ración basal comercial sin medicación de un 17 % de proteína cruda de 1-18 días de edad. El pienso se mezcló con el D en diferentes tasas de inclusión (0,35, 0,25, 0,15 y 0,05% de la dieta) o diferentes formulaciones del producto (DS, DSF, D8, D8F) incluidas en un 0,25% de la dieta. También se incluyó como tratamiento el antibiótico VM (22 ppm). A los 18 días, el pienso se reemplazó con pienso comercial sin medicación que contiene un 24% de pienso de iniciación de proteína cruda con productos de tratamiento añadidos como en la ración de CP al 17%.

Tabla 14. Diseño ex erimental

continuación

Se utilizaron 220 aves de engorde (20/grupo) y se alojaron en incubadoras Petersime. La unidad finalista fue una unidad de jaula colgante de 80 en donde las aves fueron trasladadas el día 18.

Como se muestra en las Figs. 12A-B, los pollos alimentados con dietas que contienen un 0,25% de producto D o un 0,25% de D8 mostraron unas ganancias de peso corporal aumentadas desde el día del desafío de Eimeria a 2 días tras la infección de CP, de un 25,4% o un 29,3%, respectivamente, en comparación con las aves infectadas que recibieron la dieta sin complementación (grupo de control EN).

Como se muestra en las Figs. 13A-B, los pollos alimentados con el 0,25% de dieta suplementada con D8 o D8F mostraron un aumento de un 20,18% y un 18,29% en las ganancias de peso corporal, respectivamente, en comparación con las aves infectadas que recibieron la dieta sin complementación (grupo de control EN).

Como se muestra en la Fig. 14, las aves alimentadas con D en los niveles de inclusión de 0,25, 0,15 o 0,05% o los grupos DSF, D8 y D8F mostraron una puntuación de lesiones significativamente reducida en comparación con las aves infectadas que recibieron la dieta sin suplementación.

Como se muestra en la Fig. 15A los niveles de anticuerpos séricos contra la toxina a fueron significativamente más altos en las aves alimentadas con D con una tasa de inclusión de un 0,05 o un 0,25% o DSF, D8 o D8F con una tasa de inclusión de un 0,25% o los grupos VM en comparación con las aves infectadas que recibieron la dieta sin suplementación (Grupo de control EN) el d 2 tras la infección de C. perfringens.

Como se muestra en la Fig. 15B el d 7 tras la infección de C. perfringens en aves alimentadas con la fórmula D al 0,25 o 0,05% de inclusión o el D8 o D8F al 0,25% de inclusión o la dieta suplementada con VM, la densidad óptica mostró aumentos notables en los anticuerpos frente a la toxina a en comparación con el grupo de control EN.

Como se muestra en la Fig. 16A, los niveles de anticuerpos séricos contra el antígeno de la toxina NetB fueron más altos el día 2 tras la infección de C. perfringens en aves que fueron alimentadas con el producto D a una tasa de inclusión de un 0,05 o 0,25% o el d 8 o D8F con una inclusión de 0,25% o VM, ya que la densidad óptica mostró aumentos en comparación con el grupo de control EN.

Como se muestra en la Fig. 16B, las aves alimentadas con la fórmula D a una tasa de inclusión de un 0,05 y un 0,25% o el DS, DSF, DSF, D8 y VM mostraron una mayor respuesta de anticuerpos séricos contra el antígeno de la toxina NetB a los 7 días tras la infección de C. perfringens.

Como se muestra en la Fig. 17A, los niveles séricos de toxina a el día 2 tras la infección de C. perfringens fue significativamente menor en las aves infectadas alimentadas con D (0,25%) en comparación con los controles infectados con EN sin suplementación. El nivel de toxina alfa sérica indica la gravedad de la infección por Clostridium. Este resultado puede indicar una reducción del nivel de la toxina alfa de C. perfringens mediante el producto a través de la acción directa o indirecta.

Como se muestra en la Figura 17B, los niveles séricos de toxina NetB en el día 2 tras la infección de C. perfringens fue sustancialmente menor (aunque no significativa estadísticamente) en las aves infectadas con EN alimentadas con D (0,25%) y D8 (0,25%) en comparación con los controles de EN sin suplementación e infectados. El nivel de toxina NetB indica la gravedad de la infección por Clostridium. Este resultado puede indicar una reducción del nivel de toxina NetB de C. perfringens mediante la acción directa o indirecta del producto.

Como se muestra en las Figs. 18A-B, la expresión de IL8 en linfocitos intraepiteliales disminuyó en los grupos ^{suplementados con todos los productos D,} Ds , ^{DSF, D8 o VM en comparación con las aves de control EN. La}expresión de linfocitos intraepiteliales (LITAF) disminuyó en el grupo suplementado con el producto D en los niveles de inclusión de 0,35, 0,25 o 0,15% o los productos DSF, D8, D8F o el antibiótico VM. La adición de DS en un 0,25% de la dieta mostró una disminución del nivel de LITAF.

Como se muestra en las Figs. 18C-D, la expresión de IL-6 e iNOS habitualmente disminuyó en los grupos suplementados con todos los productos D, DS, DSF, DS, DSF, D8 o el antibiótico VM en comparación con las aves de control EN. En general, estos resultados indican los efectos beneficiosos de alimentar a los pollos de engorde jóvenes con estos productos.

Como se muestra en las Figs. 19A-C, en el bazo la expresión de IL8 aumentó en los grupos suplementados con D8F. Si bien la expresión de LITAF disminuyó en el grupo suplementado con el producto Amlan D8 (0,25%) y D8F. Sin embargo, el grupo DSF mostró un nivel aumentado de LITAF. La expresión de TNFSF15 disminuyó en el grupo suplementado con el producto D de Amlan en todos los niveles de inclusión o los productos D8 o D8F o el antibiótico VM.

Como se muestra en las Figs. 19D-F, en el bazo no hubo diferencias significativas entre los grupos en la expresión de citocinas IL- 6. Mientras que la expresión de iNOS disminuyó en los grupos suplementados con el producto D en las tasas de inclusión de un 0,25% o un 0,05% o el producto D8F o el antibiótico VM. De forma adicional, la expresión de IL-1p disminuyó en el grupo suplementado con el producto D en las inclusiones de un 0,35 o un 0,15% o el producto DS o D8.

Para resumir este Ejemplo, los pollos se alimentaron desde el nacimiento con una dieta normal o una dieta que tenía adiciones de los productos D, DS, DSF, D8, D8F o VM y se comparó la inmunidad contra EN entre los grupos de control experimental y EN. Los pollos alimentados con un 0,25% de D o un 0,25% de dieta suplementada con D8 y coinfectados E. maxima y C. perfringens mostraron una ganancia de peso corporal significativamente mayor, una reducción de las puntuaciones de lesiones intestinales, una potenciación de los niveles de anticuerpos séricos hacia la toxina a o la toxina NetB y una disminución de los niveles de toxina a en suero. Los niveles de transcritos de genes para IL-6, IL8, iNOS y TNFSF15 en el intestino se redujeron en el grupo suplementado con un 0,25% del producto D, DS, DSF, D8 y D8F, respectivamente. Cuando se añadió un 0,25% del producto D a la dieta, las aves mostraron un nivel disminuido en la expresión de citocinas como TNFSF15 e iNOS en el bazo. Estos resultados indican los efectos beneficiosos de la adición de 0,25% de producto D o la suplementación de 0,25% de D8 sobre la mitigación de los efectos nocivos de la enfermedad de EN en pollos de engorde.

La Fig. 12A muestra una comparación de las ganancias de peso corporal en pollos de engorde determinadas desde el día de la infección con Eimeria maxima a 2 días tras la infección de C. perfringens. Se infectó a las aves con 10.000 ooquistes esporulados de E. maxima en el día 14 tras la eclosión. Después de 4 días de la infección con Eimeria maxima, se inoculó a las aves con 1*109 UFC de C.PCP. (Cont es el grupo de control sin desafío; (EN es el grupo desafiado a inducir enteritis necrótica pero alimentado sin producto; VM es el grupo que recibió 20 g/907,18474 kg de virginiamicina en la dieta)

La Fig. 12B representa una comparación del aumento de porcentaje en las ganancias de peso corporal en comparación con las aves en el control de desafío de enteritis necrótica sin producto basándose en 1.

La Fig. 13A representa una comparación de las ganancias de peso corporal en pollos de engorde. Las ganancias de peso corporal se determinaron a partir del día de infección de C. perfringens y terminando en 7 días tras la infección de C. perfringens.

La Fig. 13B representa una comparación del aumento de porcentaje en las ganancias de peso corporal en comparación con el control de desafío sin producto basándose en las Figs. 3-1.

La Fig. 16A representa una respuesta de anticuerpos séricos contra el antígeno de la toxina NetB a los 2 días tras la infección de C. perfringens.

La Fig. 16B representa una respuesta de anticuerpos séricos contra el antígeno de la toxina NetB a los 7 días tras la infección de C. perfringens.

La Fig. 17A representa un efecto de la complementación dietética sobre los niveles de toxina a séricos. Los sueros se recogieron el d-2 tras la infección de C. perfringens y se utilizaron para medir los niveles de toxina a mediante ELISA. La Fig. 17B representa un efecto de la complementación dietética con sobre los niveles de la toxina NetB. Los sueros se recogieron el d-2 tras la infección de C. perfringens y se utilizaron para medir los niveles de toxina NetB mediante ELISA.

Las Figs. 18C-D representan la producción de citocinas en los linfocitos intraepiteliales del yeyuno de aves a los 2 días tras la infección de C. perfringens.

Las Figs. 19A-C representan la producción de citocinas en el bazo de aves a los 2 días tras la infección de C. perfringens.

Las Figs. 19D-F representan la producción de citocinas en el bazo de aves a los 2 días tras la infección de C. perfringens.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una mezcla que comprende una arcilla, una levadura y un glutamato para utilizar en un método para tratar una enfermedad entérica causada por unas endotoxinas o exotoxinas bacterianas en un animal.

2. La mezcla para utilizar según la reivindicación 1 en donde la enfermedad entérica está causada por una bacteria Clostridium.

3. La mezcla para utilizar según la reivindicación 1, en donde el animal es una especie de ave de corral, un perro, un gato, un cerdo, un ganado vacuno, una oveja, una cabra, un caballo o un ser humano.

4. La mezcla para utilizar según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en donde el animal es una especie acuática, preferentemente un camarón o un pescado de piscifactoría.

5. La mezcla para utilizar según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la mezcla se administra como un complemento dietético.

6. La mezcla para utilizar según la reivindicación 5, en donde el suplemento es un 0,05 % (p/p) a un 0,35 % (p/p) del pienso, un 0,15% (p/p) a un 0,25% (p/p) del pienso o un 0,25% (p/p) del pienso.

7. La mezcla para utilizar según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la mezcla es un 50 a un 90 % (p/p) de la arcilla y un 5 a un 50 % (p/p) de la levadura, preferentemente un 80 % (p/p) de la arcilla y un 10 % (p/p) de la levadura.

8. La mezcla para utilizar según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la arcilla es una arcilla de montmorillonita cálcica.

9. La mezcla para utilizar según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde la arcilla es un mineral adsorbente, una tierra de diatomeas, un silicato, una zeolita, una atapulgita, una esmectitas (arcilla de bentonita) o una combinación de las mismas, preferentemente una saponita, hectorita, estevensita, sauconita, montmorillonita o una sal de la misma, beidelita o nontronita.

10. La mezcla para utilizar según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la arcilla se calienta a entre 100 °C a 800 °C.

11. La mezcla para utilizar según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la arcilla tiene un tamaño de partícula de 20 a 50 micrómetros.

12. La mezcla para utilizar según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la levadura es una levadura de Pichia guilliermondii o Saccharomyces cerevisiae.

13. La mezcla para utilizar según la reivindicación 12, en donde la levadura es una torta prensada de ácido cítrico, un producto de fermentación de levaduras o un componente de levaduras.

14. La mezcla para utilizar según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la mezcla es un 50 a un 90 % (p/p) de la arcilla, un 5 a un 50% (p/p) del producto de levadura y un 0,01 a un 15% (p/p) del glutamato, preferentemente un 80 % (p/p) de la arcilla, un 10 % (p/p) de la levadura, producto de levadura o producto similar a levadura y un 10 % (p/p) del glutamato.

15. La mezcla para utilizar según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el glutamato es glutamato monosódico, un ácido glutámico, a-cetoglutarato, glutamina, ácido L-glutámico o L-glutamina.