ES2827673T3 - Anticuerpos anti-Activina A y usos de los mismos - Google Patents

Anticuerpos anti-Activina A y usos de los mismos Download PDF

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Abstract

Un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a Activina A con una constante de equilibrio de disociación de unión (KD) de menos de 5 pM, opcionalmente con una KD de menos de 4 pM, según se mide en un ensayo de resonancia de plasmón superficial a 25 °C, en el que el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno comprende: dominios HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3, que tienen las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 164-166-168-148-150-152, respectivamente.

Description

DESCRIPCIÓN
Anticuerpos anti-Activina A y usos de los mismos
Campo de la invención
La presente se refiere a anticuerpos y a fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que son específicos para la Activina A, y a métodos de uso de los mismos, incluyendo métodos de uso de anticuerpos específicos para Activina A junto con un inhibidor de miostatina.
Antecedentes
Las activinas pertenecen a la superfamilia del factor de crecimiento transformante-beta (TGF-p) y ejercen una amplia gama de efectos biológicos sobre la proliferación, Diferenciación y apoptosis celular. Las activinas son homo o heterodímeros de InhibinapA, InhibinapB, InhibinapC e InhibinapE, diferentes combinaciones de las cuales crean los diversos miembros del grupo proteico de activina. Por ejemplo, la Activina A es un homodímero de InhibinapA, y la Activina B es un homodímero de InhibinapB, mientras que la Activina AB es un heterodímero de InhibinapA e Inhibina pB y la Activina AC es un heterodímero de InhibinapA e InhibinapC (Tsuchida, K. et al., Cell Commun Signal 7:15 (2009)).
La Activina A se une y activa complejos receptores en la superficie de las células conocidas como receptores de activina de tipo II (tipo IIA y tipo IIB, también conocidos como ActRIIA y ActRIIB, respectivamente). La activación de estos receptores conduce a la fosforilación de un receptor de activina de tipo I (por ejemplo, Alk4 o 7), que a su vez conduce a la fosforilación de las proteínas SMAD 2 y 3, la formación de complejos SMAD (con SMAD4) y la translocación del complejo SMAD con respecto al núcleo celular, donde SMAD2 y SMAD3 funcionan para regular la transcripción de diversos genes (Sozzani, S. y Musso, T., Blood 117(19):5013-5015 (2011)).
Numerosos ligandos diferentes se unen a y activan ActRIIB, incluyendo GDF8 (miostatina), Activina B, Activina AB, Inhibina A, Inhibina B, GDF3, GDF11, Nodal, BMP2, BMP4, BMP7, BMP9, y BMP10. El bloqueo de las interacciones de ActRIIB con sus ligandos puede producir efectos fisiológicos beneficiosos. Por ejemplo, GDF8 desempeña un papel central en el desarrollo y mantenimiento del músculo esquelético, actuando como un regulador negativo de la masa muscular (McPherron AC et al. (1997). Nature 387(6628):83-90). La administración de ActRIIB-Fc (es decir, la porción extracelular del receptor de tipo IIB, ActRIIB, estabilizada por fusión a un dominio Fc de IgG) conduce a aumentos significativos en la masa del músculo esquelético y mejora el peso muscular y las mediciones de la fuerza muscular en ratones (Lee SJ, et al. (2005) Proc Natl Acad Sci USA 102(50):18117-18122). La eficacia de ActRIIB-Fc se atenúa pero no se elimina en ratones sin Mstn (miostatina), lo que demuestra que otros ligandos de ActRIIB además de la miostatina, pueden funcionar como reguladores negativos del crecimiento muscular. Por lo tanto, existe la necesidad de inhibidores adicionales de la señalización de ActRIIB que puedan proporcionar beneficios clínicos.
Los documentos WO 2013/074557 y WO 2008/031061 divulgan anticuerpos anti-Activina A.
Breve sumario de la invención
La presente invención proporciona un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a Activina A con una constante de equilibrio de disociación de unión (Kd) de menos de 5 pM, opcionalmente con una KD de menos de 4 pM, según se mide en un ensayo de resonancia de plasmón superficial a 25 °C, en el que el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno comprende: dominios HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3, que tienen las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 164-166-168-148-150-152, respectivamente. Los anticuerpos de la invención son útiles, entre otras cosas, para inhibir la señalización mediada por Activina A, produciendo resultados clínicos beneficiosos a través de la inhibición de la señalización mediada por Activina A, por ejemplo, para tratar enfermedades y trastornos provocados por o relacionados con la actividad y/o señalización de Activina A. Los anticuerpos de la invención también tienen utilidad para su uso junto con inhibidores de otros ligandos de los receptores ActRIIA y ActRIIB, tales como inhibidores de GDF8.
Los anticuerpos de la invención pueden ser de longitud completa (por ejemplo, un anticuerpo IgG1 o IgG4) o pueden comprender únicamente una porción de unión a antígeno (por ejemplo, un fragmento Fab, F(ab')2 o scFv), y pueden modificarse para afectar a la funcionalidad, por ejemplo, para eliminar las funciones efectoras residuales (Reddy et al., J Immunol 164:1925-1933 (2000)).
Los anticuerpos aislados, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, se unen específicamente a Activina A con una constante de equilibrio de asociación de unión (Ka) de menos de 500 nM y una constante de equilibrio de disociación (Kd) de menos de 5 pM según lo medido en un ensayo de resonancia de plasmón superficial a 25 °C. En algunas realizaciones de la invención, los anticuerpos aislados, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, se unen específicamente a Activina A con una Kd de menos de aproximadamente 4 pM según lo medido en un ensayo de resonancia de plasmón superficial a 25 °C. En algunas realizaciones de la invención, los anticuerpos aislados, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, se unen específicamente a Activina A con una constante de equilibrio de asociación de unión (Ka) de menos de aproximadamente 500 nM.
La presente divulgación proporciona anticuerpos aislados, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que se unen específicamente a Activina A y bloquean la unión de al menos un receptor de Activina A a Activina A. En algunos casos, los anticuerpos aislados, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, bloquean la unión de Activina A a un receptor de Activina A con un valor de CI50 de menos de aproximadamente 80 pM, según lo medido en un bioensayo de unión a receptor/ligando in vivo a 25 °C. En algunos casos, los anticuerpos aislados, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, bloquean la unión de Activina A a un receptor de Activina A con un valor de CI50 de menos de aproximadamente 60 pM, según lo medido en un bioensayo de unión a receptor/ligando in vivo a 25 °C. La presente divulgación también proporciona anticuerpos aislados, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que se unen específicamente a Activina A y bloquean la activación de al menos un receptor de Activina A por Activina A. En algunos casos, los anticuerpos aislados, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, no bloquean significativamente la unión de Activina A a un receptor de Activina de tipo II. En algunos casos, los anticuerpos aislados, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, inhiben la unión de Activina A a un receptor de Activina A seleccionado del grupo que consiste en el receptor de Activina de tipo IIA (ActRIIA), el receptor de Activina de tipo IIB (ActRIIB), y el receptor de Activina de tipo I. En algunos casos, los anticuerpos aislados, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, inhiben la activación de la señalización mediada por activina A del complejo SMAD.
En el presente documento se describen anticuerpos, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que comprenden una región variable de cadena pesada (HCVR) que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO:2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 106, 114, 122, 130, 138, 154, 162, 170, 178, 186, 194 y 202, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tenga al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia.
También se describe en el presente documento un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo, que comprende una región variable de cadena ligera (LCVR) que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 10, 26, 42, 58, 74, 90, 146 y 210, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia.
En el presente documento se describe un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende un par de secuencias de HCVR y LCVR (HCVR/LCVR) seleccionado del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/74, 82/90, 98/90, 106/90, 114/90, 122/90, 130/90, 138/146, 154/146, 162/146, 170/146, 178/146, 186/146, 194/146 y 202/210.
También se describe en el presente documento un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo, que comprende un dominio CDR3 de cadena pesada (HCDR3) que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 8, 24, 40, 56, 72, 88, 104, 112, 120, 128, 136, 144, 160, 168, 176, 184, 192, 200, y 208, o una secuencia sustancialmente similar a la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia; y un dominio CDR3 de cadena ligera (LCDR3) que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 16, 32, 48, 64, 80, 96, 152 y 216, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia.
En ciertos casos, el anticuerpo o parte de unión a antígeno de un anticuerpo comprende un par de secuencias de aminoácidos de HCDR3/LCDR3 seleccionado del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 8/16, 24/32, 40/48, 56/64, 72/80, 88/96, 104/96, 112/96, 120/96, 128/96, 136/96, 144/152, 160/152, 168/152, 176/152, 184/152, 192/152, 200/152, y 208/216.
Se describe en el presente documento un anticuerpo, o fragmento del mismo, que comprende un dominio CDR1 de cadena pesada (HCDR1) que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 4, 20, 36, 52, 68, 84, 100, 108, 116, 124, 132, 140, 156, 164, 172, 180, 188, 196, y 204, o una secuencia sustancialmente similar a la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia; un dominio CDR2 de cadena pesada (HCDR2) que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID nO: 6, 22, 38, 54, 70, 86, 102, 110, 118, 126, 134, 142, 158, 166, 174, 182, 190, 198, y 206, o una secuencia sustancialmente similar a la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia; un dominio CDR1 de cadena ligera (LCDR1) que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 12, 28, 44, 60, 76, 92, 148 y 212, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia; y un dominio CDR2 de cadena ligera (LCDR2) que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 14, 30, 46, 62, 78, 94, 150 y 214, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia.
Ciertos anticuerpos ejemplares no limitantes y fragmentos de unión a antígeno comprenden dominios HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3, respectivamente, que tienen las secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en: SEQ ID NOs: 4-6-8-12-14-16 (por ejemplo, H4H10423P); 20-22-24-28-30-32 (por ejemplo, H4H10424P); 36-38-40-44-46-48 (por ejemplo, H4H10426P); 52-54-56-60-62-64 (por ejemplo, H4H10429P); 68-70-72-76-78-80 (por ejemplo, H4H10430P); 84-86-88-92-94-96 (por ejemplo, H4H10432P2; 100­ 102-104-92-94-96 (por ejemplo, H4H10433P2); 108-110-112-92-94-96 (por ejemplo, H4H10436P2); 116-118-120­ 92-94-96 (por ejemplo, H4H10437P2); 124-126-128-92-94-96 (por ejemplo, H4H10438P2); 132-134-136-92-94-96 (por ejemplo, H4H10440P2); 140-142-144-148-150-152 (por ejemplo, H4H10442P2); 156-158-160-148-150-152 (H4H10445P2); 164-166-168-148-150-152 (H4H10446P2); 172-174-176-148-150-152 (H4H10447P2); 180-182-184­ 148-150-152 (H4H10448P2); 188-190-192-148-150-152 (H4H10452P2); 196-198-200-148-150-152 (H4H10468P2); y 204-206-208-212-214-216 (H2aM10965N). Los anticuerpos y el fragmento de unión a antígeno de la invención comprenden: dominios HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3, que tienen las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 164-166-168-148-150-152, respectivamente.
En el presente documento se describe un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo que se une específicamente a Activina A, en el que el anticuerpo o fragmento comprende los dominios CDR de cadena pesada o ligera contenidos dentro de las secuencias de región variable de cadena pesada y ligera (HCVR/LCVR) seleccionadas del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/74, 82/90, 98/90, 106/90, 114/90, 122/90, 130/90, 138/146, 154/146, 162/146,170/146, 178/146, 186/146,194/146, y 202/210. Los métodos y técnicas para identificar las CDR dentro de las secuencias de aminoácidos de HCVR y LCVR se conocen bien en la técnica y pueden usarse para identificar las CDR dentro de las secuencias de aminoácidos de HCVR y/o LCVR específicas que se divulgan en el presente documento. Las convenciones de ejemplo que pueden usarse para identificar los límites de las CDR incluyen, por ejemplo, la definición de Kabat, la definición de Chothia y la definición de AbM. En términos generales, la definición de Kabat se basa en la variabilidad de secuencia, la definición de Chothia se basa en la ubicación de las regiones de bucles estructurales, y la definición de AbM es un término medio entre las estrategias de Kabat y Chothia. Véase, por ejemplo, Kabat, "Sequences of Proteins of Immunological Interest", National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991); Al-Lazikani et al., J Mol Biol 273:927-948 (1997); y Martin et al., PNAS (USA) 86:9268-9272 (1989). También hay disponibles bases de datos públicas para identificar secuencias de CDR dentro de un anticuerpo.
También se describen en el presente documento moléculas de ácido nucleico que codifican anticuerpos anti-Activina A o porciones de los mismos. Por ejemplo, moléculas de ácido nucleico que codifican cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCVR enumeradas en la Tabla 1; en ciertos casos, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de polinucleótidos seleccionada de cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos de HCVR enumeradas en la Tabla 2, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia con la misma.
También se describen en el presente documento moléculas de ácido nucleico que codifican cualquiera de las secuencias de aminoácidos de LCVR enumeradas en la Tabla 1; en ciertos casos, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de polinucleótidos seleccionada de cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos de LCVR enumeradas en la Tabla 2, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia con la misma.
También se describen en el presente documento moléculas de ácido nucleico que codifican cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCDR1 enumeradas en la Tabla 1; en ciertos casos, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de polinucleótidos seleccionada entre cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos de HCDR1 enumeradas en la Tabla 2, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia con la misma.
También se describen en el presente documento moléculas de ácido nucleico que codifican cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCDR2 enumeradas en la Tabla 1; en ciertos casos, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de polinucleótidos seleccionada entre cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos de HCDR2 enumeradas en la Tabla 2, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia con la misma.
También se describen en el presente documento moléculas de ácido nucleico que codifican cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCDR3 enumeradas en la Tabla 1; en ciertos casos, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de polinucleótidos seleccionada entre cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos de HCDR3 enumeradas en la Tabla 2, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia con la misma.
También se describen en el presente documento moléculas de ácido nucleico que codifican cualquiera de las secuencias de aminoácidos de LCDR1 enumeradas en la Tabla 1; en ciertos casos, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de polinucleótidos seleccionada entre cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos de LCDR1 enumeradas en la Tabla 2, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia con la misma.
También se describen en el presente documento moléculas de ácido nucleico que codifican cualquiera de las secuencias de aminoácidos de LCDR2 enumeradas en la Tabla 1; en ciertos casos, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de polinucleótidos seleccionada entre cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos de LCDR2 enumeradas en la Tabla 2, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia con la misma.
También se describen en el presente documento moléculas de ácido nucleico que codifican cualquiera de las secuencias de aminoácidos de LCDR3 enumeradas en la Tabla 1; en ciertos casos, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de polinucleótidos seleccionada entre cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos de LCDR3 enumeradas en la Tabla 2, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia con la misma.
También se describen en el presente documento moléculas de ácido nucleico que codifican una HCVR, en las que la HCVR comprende un conjunto de tres CDR (es decir, HCDR1-HCDR2-HCDR3), en las que el conjunto de secuencias de aminoácidos HCDR1-HCDR2-HCDR3 es como se define por cualquiera de los anticuerpos anti-Activina A ejemplares enumerados en la Tabla 1.
También se describen en el presente documento moléculas de ácido nucleico que codifican una LCVR, en las que la LCVR comprende un conjunto de tres CDR (es decir, LCDR1-LCDR2-LCDR3), en las que el conjunto de secuencias de aminoácidos LCDR1-LCDR2-LCDR3 es como se define por cualquiera de los anticuerpos anti-Activina A ejemplares enumerados en la Tabla 1.
También se describen en el presente documento moléculas de ácido nucleico que codifican tanto una HCVR como una LCVR, en las que la HCVR comprende una secuencia de aminoácidos de cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCVr enumeradas en la Tabla 1, y en las que la LCVR comprende una secuencia de aminoácidos de cualquiera de las secuencias de aminoácidos de LCVR enumeradas en la Tabla 1. En ciertos casos, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de polinucleótidos seleccionada de cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos de HCVR enumeradas en la Tabla 2, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia, y una secuencia de polinucleótidos seleccionada de cualquiera de las secuencias de ácido nucleico de LCVR enumeradas en la Tabla 2, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia con la misma. En ciertos casos, de acuerdo con este aspecto de la invención, la molécula de ácido nucleico codifica una HCVR y LCVR, en la que la HCVR y la LCVR derivan ambas del mismo anticuerpo anti-Activina A enumerado en la Tabla 1.
También se describen en el presente documento vectores de expresión recombinantes capaces de expresar un polipéptido que comprende una región variable de cadena pesada o ligera de un anticuerpo anti-Activina A. Por ejemplo, vectores de expresión recombinantes que comprenden cualquiera de las moléculas de ácido nucleico mencionadas anteriormente, es decir, moléculas de ácido nucleico que codifican cualquiera de las secuencias de HCVR, LCVR y/o CDR como se exponen en la Tabla 1. También se incluyen en la divulgación las células huésped en las que se han introducido dichos vectores, así como métodos para producir los anticuerpos o porciones de los mismos mediante el cultivo de las células huésped en condiciones que emiten la producción de los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo, y la recuperación de los anticuerpos y fragmentos de anticuerpo así producidos.
La presente invención incluye anticuerpos anti-Activina A que tienen un contenido de carbohidratos modificado. En algunas aplicaciones, puede ser útil la modificación para eliminar los sitios de glucosilación no deseados. En algunas aplicaciones, la modificación para alterar los patrones de glucosilación puede ser útil, por ejemplo, modificar un anticuerpo para que carezca de un resto fucosa presente en una cadena de oligosacáridos, por ejemplo, para aumentar la función de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) (véase Shield et al. J Biol Chem 277:26733 (2002)). En otras aplicaciones, puede hacerse una modificación de la galactosilación para modificar la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC). En algunas aplicaciones, los anticuerpos pueden tener patrones de glucosilación modificados para minimizar la función efectora. Por ejemplo, los anticuerpos pueden modificarse para obtener anticuerpos adicionalmente glucosilados o sialilados.
En otro aspecto, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo humano recombinante o fragmento del mismo de la invención que se une específicamente a Activina A y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En un aspecto relacionado, la invención presenta una composición que es una combinación de un anticuerpo anti-Activina A y un segundo agente terapéutico. En una realización, el segundo agente terapéutico es cualquier agente que se combine ventajosamente con un anticuerpo anti-Activina A. Los agentes ejemplares que pueden combinarse ventajosamente con un anticuerpo anti-Activina A incluyen, sin limitación, otros agentes que inhiben la actividad de Activina A (incluyendo otros anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, inhibidores peptídicos, antagonistas de molécula pequeña, etc.) y/o agentes que no se unen directamente a Activina A pero, a pesar de ello, interfieren con, bloquean o atenúan la señalización mediada por Activina A. En una realización, el agente terapéutico secundario inhibe, interfiere, bloquea y/o atenúa la actividad de otro ligando del receptor ActRIIA y/o ActRIIB (por ejemplo, GDF8, Activina B, Activina AB, Inhibina A, Inhibina B, GDF3, GDF11, Nodal, BMP2, BMP4 y/o BMP7). En una realización, el agente terapéutico secundario es un antagonista anti-GDF8 (por ejemplo, un anticuerpo anti-GDF8 humano o un fragmento de unión a antígeno del mismo). Los agentes anti-GDF8 ejemplares para su uso con los anticuerpos anti-Activina A de la invención incluyen un anticuerpo anti-GDF8 humano (por ejemplo, un anticuerpo anti-GDF8 que comprende cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR o CDR como se expone en el documento US 2011-0293630 A1 (por ejemplo, H4H1657N2, que es un anticuerpo anti-GDF8 con regiones determinantes de complementariedad de cadena pesada (HCDR) de una HCVR que comprende la SEQ ID NO:217 (por ejemplo, las secuencias CDR1, CDR2 y CDR3 expuestas en las SEQ ID NO:218, 219 y 220, respectivamente), y las regiones determinantes de complementariedad de cadena ligera (LCDR) de una LCVR que comprende la SEQ ID NO:221 (por ejemplo, las secuencias CDR1, CDR2 y CDR3 expuestas en las SEQ ID No :222, 223 y 224)). Las terapias de combinación y formulaciones conjuntas adicionales que implican los anticuerpos anti-Activina A de la presente invención se divulgan en otra parte del presente documento.
En un aspecto adicional de la divulgación, se proporciona una molécula de unión a antígeno que comprende un dominio de unión específico de Activina A y un dominio de unión específico de GDF8. En una realización de la invención, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo es un anticuerpo biespecífico que comprende un primer dominio variable que se une específicamente a Activina A y un segundo dominio variable que se une específicamente a GDF8.
En aún otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la invención para su uso en métodos terapéuticos para inhibir la actividad de Activina A, en el que los métodos terapéuticos comprenden administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo de la invención. El trastorno tratado es cualquier enfermedad o afección que se mejore, mitigue, inhiba o prevenga mediante la supresión, inhibición o reducción de la actividad o señalización de Activina A. Los anticuerpos anti-Activina A o fragmentos de anticuerpos de la divulgación pueden funcionar para bloquear la interacción entre Activina A y un receptor de Activina de tipo II (por ejemplo, un receptor de Activina de tipo IIA y/o un receptor de Activina de tipo IIB); entre Activina A y un receptor de Activina de tipo I; entre Activina A y un receptor tanto de tipo II como de tipo I; o inhibir de otro modo la actividad de señalización de Activina A.
También se describe en el presente documento el uso de un anticuerpo anti-Activina A o una porción de unión a antígeno de un anticuerpo de la invención en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad o trastorno relacionado o provocado por la actividad de Activina A en un paciente. La presente invención también proporciona un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la invención para su uso en métodos para aumentar la masa o fuerza muscular en un sujeto administrando al sujeto el anticuerpo de Activina A o fragmento de unión a antígeno del mismo. También se describen en el presente documento métodos para aumentar la masa o fuerza muscular en un sujeto administrando al sujeto una proteína de unión específica de Activina A y una proteína de unión específica de GDF8, o administrando al sujeto una molécula de unión a antígeno que comprende un dominio de unión específico de Activina A y un dominio de unión específico de GDF8.
La invención también incluye un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la invención para su uso en métodos para tratar, prevenir y/o mejorar una enfermedad o trastorno caracterizado por una disminución de la masa o fuerza muscular al administrar a un sujeto que lo necesite el anticuerpo anti-activina A o fragmento del mismo. También se describen en el presente documento métodos para tratar, prevenir y/o mejorar una enfermedad o trastorno caracterizado por una disminución de la masa o fuerza muscular mediante la administración a un sujeto que lo necesite de una proteína de unión específica de Activina A y una proteína de unión específica de GDF8 (por ejemplo, un anticuerpo anti-Activina A y un anticuerpo anti GDF8). También se describen en el presente documento métodos para tratar, prevenir y/o mejorar una enfermedad o trastorno caracterizado por disminución de la masa o fuerza muscular mediante la administración a un sujeto que lo necesite de una molécula de unión a antígeno que comprende un dominio de unión específico de Activina A y un dominio de unión específico de GDF8. Las enfermedades o trastornos caracterizados por una disminución de la masa o fuerza muscular que pueden tratarse, prevenirse y/o mejorarse usando los métodos descritos en el presente documento incluyen sarcopenia, caquexia (por ejemplo, caquexia idiopática o caquexia secundaria a otra afección (por ejemplo, cáncer, insuficiencia renal crónica o enfermedad pulmonar obstructiva crónica)), lesión muscular, desgaste y/o atrofia muscular (por ejemplo, provocados por o asociados con desuso, inmovilización, reposo en cama, lesión, tratamiento médico, intervención quirúrgica (por ejemplo, fractura de cadera, reemplazo de cadera y reemplazo de rodilla) y por necesidad de ventilación mecánica), cáncer, obesidad, diabetes, artritis, esclerosis múltiple, distrofia muscular, esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad de Parkinson, osteoporosis, osteoartritis, osteopenia y síndromes metabólicos (por ejemplo, uno o más de diabetes, obesidad, trastornos nutricionales, atrofia de órganos, enfermedad pulmonar obstructiva crónica y anorexia).
También se describen en el presente documento métodos para tratar, prevenir y/o mejorar enfermedades o trastornos provocados, promovidos, exacerbados, o agravados por la actividad de una molécula que contiene inhibina pA (por ejemplo, dímeros que contienen inhibina pA, por ejemplo, Activina A, Activina AB, etc.) administrando a un sujeto que lo necesite una proteína de unión específica para Activina A (es decir, dímero de inhibina pA), por ejemplo, un anticuerpo anti-Activina A o un fragmento de unión a antígeno del mismo. En el presente documento se describen métodos para tratar, prevenir y/o mejorar la fibrosis renal administrando a un sujeto que lo necesite un anticuerpo anti-Activina A. También se describen en el presente documento métodos para tratar, prevenir y/o mejorar la fibrosis renal provocada por enfermedad renal crónica (por ejemplo, como consecuencia de hipertensión, diabetes, glomerulonefritis, enfermedades hereditarias (tal como enfermedad renal poliquística), malformaciones del riñón, enfermedad autoinmune (por ejemplo, lupus), u obstrucciones (por ejemplo, cálculos renales, tumores, glándula prostática agrandada), o infecciones urinarias repetidas) administrando a un sujeto que lo necesite un anticuerpo anti-activina A. También se describen en el presente documento métodos para tratar, prevenir y/o mejorar la septicemia, insuficiencia cardíaca crónica, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, feocromocitoma benigno o maligno, fibromas uterinos/leiomiomas, preeclampsia, queloides, cicatrices hipertróficas, o hipertensión de la arteria pulmonar mediante la administración a una sujeto que lo necesite un anticuerpo anti-Activina A. También se describen en el presente documento métodos para tratar, prevenir y/o mejorar la caquexia provocada, promovida, exacerbada o agravada por la actividad de Activina A administrando a un sujeto que lo necesite un anticuerpo anti-Activina A. También se describen en el presente documento métodos para tratar, prevenir y/o mejorar la pérdida de peso provocada, promovida, exacerbada o agravada por la actividad de la activina A administrando a un sujeto que lo necesite un anticuerpo anti-activina A.
Otras realizaciones resultarán evidentes tras la revisión de la descripción detallada adjunta.
Breve descripción de las figuras
La figura 1 es una matriz que muestra los resultados de un ensayo de competencia cruzada de anticuerpos en el que se aplicó un primer anticuerpo anti-activina A ("Muestra de anticuerpo") a una punta de sensor recubierta de FC anti-humano, seguido de emersión en una solución de un segundo anticuerpo anti-activina A (1 j M) unido previamente a Activina A. Se representan las respuestas de unión (valores numéricos de 0,22 a 1,84) para cada combinación de anticuerpos ensayada. Las respuestas de unión presentadas en recuadros blancos con letra de color negro indican que no hay competencia por la unión de Activina A, lo que sugiere distintas regiones de unión.
Figura 2: El panel A muestra los efectos de 21 días de tratamiento con anticuerpo anti-GDF8 (H4H1657N2, 10 mg/kg o 30 mg/kg) sobre la fuerza tetánica máxima promedio en comparación con el anticuerpo de control de isotipo. Los datos se analizaron mediante el análisis de varianza unidireccional (ANOVA) seguido de la prueba de Tukey. *p <0,05 de significancia sobre el control de isotipo (n = 6, prueba t de Student no pareada); n.s. = no estadísticamente significativo en comparación con 30 mg/kg de isotipo. El panel B muestra el aumento de la fuerza tetánica máxima del músculo tibial anterior (TA) en ratones tratados con H4H1657N2 (10 mg/kg) frente a ratones tratados con anticuerpos de control de isotipo durante tres semanas (n = 6), cuando se estimulan con corriente eléctrica en un rango de frecuencias (40 a 100 Hz). Los datos se expresan como fuerza máxima promedio media ± SEM.
Figura 3: El panel A muestra el diseño de un experimento para evaluar los efectos de H4H1657N2 durante la fase de recuperación de la atrofia muscular inducida por la suspensión de los miembros posteriores. El panel B muestra el cambio porcentual en el peso de los músculos TA y gastrocnemio (GA) para los ratones tratados con H4H1657N2 y tratados con anticuerpos de control de isotipo después de la recuperación tras 7 días de suspensión de los miembros posteriores (HLS+7Rec) frente a ratones sin un periodo de recuperación tras 7 días de suspensión de los miembros posteriores (HLS) y ratones de control (control sin HLS). Los valores se expresan como el cambio porcentual medio sobre los valores de control no HLS ± SEM. Los datos se analizaron mediante el análisis de varianza unidireccional (ANOVA) seguido de la prueba de Tukey. * = p <0,05 de significancia sobre el grupo sin HLS. # = p <0,05 de significancia sobre el grupo HLS.
Figura 4: El panel A muestra los efectos de la administración del anticuerpo anti-Activina A H4H10446P2 sobre el peso corporal de ratones que sobreexpresan Activina A (frente al control de isotipo). Los datos se analizaron mediante un análisis de varianza bidireccional (ANOVA de medidas repetidas Prueba de comparación múltiple de Boneferroni) seguido de la prueba de Tukey. * = p <0,05 frente al control de isotipo; # = p <0,05 frente a Activina A Control de isotipo. El panel B muestra los efectos del anticuerpo anti-activina A H4H10446P2 sobre el peso de los músculos tibial anterior (TA) y gastrocnemio (GA) en ratones que sobreexpresan activina A (frente al control de isotipo). Los datos se analizaron mediante el análisis de varianza unidireccional (ANOVA) seguido de la prueba de Tukey. * = p <0,05 sobre Vector Control de isotipo; # = p <0,05 sobre Activina A Control de isotipo.
Descripción detallada
Antes de describir la presente invención, debe entenderse que la presente invención no se limita a los métodos ni condiciones experimentales particulares descritos, ya que dichos métodos y condiciones pueden variar. También debe entenderse que la terminología usada en el presente documento únicamente tiene el fin de describir realizaciones particulares, y no se pretende que sea limitante, ya que el alcance de la presente invención estará limitado únicamente por las reivindicaciones adjuntas.
A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que el que entiende comúnmente un experto habitual en la técnica a la que pertenece la presente invención. Como se usa en el presente documento, el término "aproximadamente", cuando se usa en referencia a un valor numérico indicado particular, significa que el valor puede variar con respecto al valor indicado en no más de un 1 %. Por ejemplo, como se usa en el presente documento, la expresión "aproximadamente 100" incluye 99 y 101 y todos los valores intermedios (por ejemplo, 99,1, 99,2, 99,3, 99,4, etc.).
Aunque puede usarse cualquier método y material similar o equivalente a los que se describen en el presente documento en la práctica o ensayo de la presente invención, a continuación se describen los métodos y materiales preferidos.
Proteínas de unión específicas de antígeno
La presente invención se refiere a composiciones que comprenden proteínas de unión específicas de antígeno. Más específicamente, la presente invención proporciona una composición que comprende una proteína de unión específica de Activina A.
Como se usa en el presente documento, la expresión "proteína de unión específica de antígeno" significa una proteína que comprende al menos un dominio que se une específicamente a un antígeno particular. Los ejemplos de categorías de proteínas de unión específicas de antígeno incluyen anticuerpos, porciones de unión a antígeno de los anticuerpos, péptidos que interactúan específicamente con un antígeno particular (por ejemplo, pepticuerpos), moléculas receptoras que interactúan específicamente con un antígeno particular, y proteínas que comprenden una porción de unión a ligando de un receptor que se une específicamente a un antígeno particular.
La presente invención incluye proteínas de unión específicas de antígeno que se unen específicamente a Activina A, es decir, "proteínas de unión específicas de Activina A". Las activinas son moléculas homo y heterodiméricas que comprenden subunidades beta, es decir, inhibina pA, inhibina pB, inhibina pC, y/o inhibina pE. La subunidad pA tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:226, y la subunidad pB tiene la secuencia de aminoácidos de s Eq ID NO:228. La activina A es un homodímero de dos subunidades pA; la activina B es un homodímero de dos subunidades pB; la activina AB es un heterodímero de una subunidad pA y una subunidad pB; y la Activina AC es un heterodímero de una subunidad pA y una subunidad pC. Una proteína de unión específica de Activina A puede ser una proteína de unión específica de antígeno que se une específicamente a la subunidad pA. Dado que la subunidad pA se encuentra en las moléculas de Activina A, Activina AB y Activina AC, una "proteína de unión específica de Activina A" puede ser una proteína de unión específica de antígeno que se une específicamente a Activina A, así como Activina AB y Activina AC (en virtud de su interacción con la subunidad pA). Por lo tanto, de acuerdo con una realización de la presente invención, una proteína de unión específica de Activina A se une específicamente a Activina A; o Activina A y Activina AB; o Activina A y Activina AC; o Activina A, Activina AB y Activina AC, pero no se une a otros ligandos de ActRIIB tales como Activina B, GDF3, GDF8, BMP2, BMP4, BMP7, BMP9, BMP10, GDF11, Nodal, etc. Por lo tanto, en una realización de la invención, una proteína de unión específica de Activina A se une específicamente a Activina A pero no se une significativamente a Activina B o Activina C. En otra realización, una proteína de unión específica de Activina A también puede unirse a Activina B (en virtud de una reacción cruzada con la subunidad pB, es decir, inhibina pB). En otra realización, una proteína de unión específica de Activina A es una proteína de unión que se une específicamente a Activina A pero no se une a ningún otro ligando de ActRIIB. En otra realización, una proteína de unión específica de Activina A es una proteína de unión y se une específicamente a Activina A y no se une a ninguna proteína morfogenética ósea (BMP) (por ejemplo, BMP2, BMP4, BMP6, BMP9, BMP10). En otra realización, una proteína de unión específica de Activina A es una proteína de unión que se une específicamente a Activina A pero no se une a ningún otro miembro de la superfamilia del factor de crecimiento transformante beta (TGFp).
También se describen en el presente documento proteínas de unión específicas de antígeno que se unen específicamente a GDF8, es decir, "proteínas de unión específicas de GDF8". El término "GDF8" (también denominado "factor 8 de crecimiento y diferenciación" y "miostatina") significa la proteína que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:225 (proteína madura). Las proteínas de unión específicas de GDF8 se unen específicamente a GDF8 pero no se unen a otros ligandos de ActRIIB tales como GDF3, BMP2, BMP4, BMP7, b Mp9, BMP10, GDF11, Activina A, Activina B, Activina AB, Nodal, etc.
En el contexto de la presente invención, moléculas tales como ActRIIB-Fc (por ejemplo, "ACE-031"), que comprenden la porción de unión al ligando del receptor ActRIIB, no se consideran "proteínas de unión específicas de Activina A" o "proteínas de unión específicas de GDF8", porque dichas moléculas se unen a múltiples ligandos además de a GDF8, Activina A y Activina AB.
Todas las referencias a proteínas, polipéptidos y fragmentos de proteína en el presente documento pretenden referirse a la versión humana de la proteína, polipéptido o fragmento de proteína respectivos a menos que se especifique explícitamente como de una especie no humana.
Moléculas de unión a antígeno con dos dominios de unión específicos de antígeno diferentes
La presente divulgación también incluye moléculas de unión a antígeno que comprenden dos dominios de unión específicos de antígeno diferentes. En particular, la presente divulgación incluye moléculas de unión a antígeno que comprenden un dominio de unión específico de Activina A y un dominio de unión específico de GDF8. El término "dominio de unión específico de antígeno", como se usa en el presente documento, incluye polipéptidos que comprenden o consisten en: (i) un fragmento de unión a antígeno de una molécula de anticuerpo, (ii) un péptido que interactúa específicamente con un antígeno particular (por ejemplo, un pepticuerpo), y/o (iii) una porción de unión a ligando de un receptor que se une específicamente a un antígeno particular. Por ejemplo, la presente invención incluye anticuerpos biespecíficos con un brazo que comprende un primer par de región variable de cadena pesada/región variable de cadena ligera (HCVR/LCVR) que se une específicamente a Activina A y otro brazo que comprende un segundo par de HCVR/LCVR que se une específicamente a GDF8.
Unión específica
El término "se une específicamente" o similares, como se usa en el presente documento, significa que una proteína de unión específica de antígeno, o un dominio de unión específico de antígeno, forma un complejo con un antígeno particular caracterizado por una constante de disociación (Kd) de 500 pM o menor, y no se une a otros antígenos no relacionados en condiciones de ensayo normales. Los "antígenos no relacionados" son proteínas, péptidos o polipéptidos que tienen menos de un 95 % de identidad de aminoácidos entre sí. En la técnica se conocen bien métodos para determinar si dos moléculas se unen específicamente entre sí e incluyen, por ejemplo, diálisis en equilibrio, resonancia de plasmón superficial y similares. Por ejemplo, una proteína de unión específica de antígeno, o un dominio de unión específico de antígeno, como se usa en el contexto de la presente invención, incluye moléculas que se unen a un antígeno particular (por ejemplo, Activina A y/o AB, o GDF8) o una porción de la misma con una Kd de menos de aproximadamente 500 pM, menos de aproximadamente 400 pM, menos de aproximadamente 300 pM, menos de aproximadamente 200 pM, menos de aproximadamente 100 pM, menos de aproximadamente 90 pM, menos de aproximadamente 80 pM, menos de aproximadamente 70 pM, menos de aproximadamente 60 pM, menos de aproximadamente 50 pM, menos de aproximadamente 40 pM, menos de aproximadamente 30 pM, menos de aproximadamente 20 pM, menos de aproximadamente 10 pM, menos de aproximadamente 5 pM, menos de aproximadamente 4 pM, menos de aproximadamente 2 pM, menos de aproximadamente 1 pM, menos de aproximadamente 0,5 pM, menos de aproximadamente 0,2 pM, menos de aproximadamente 0,1 pM, o menos de aproximadamente 0,05 pM, según se mide en un ensayo de resonancia de plasmón superficial.
Como se usa en el presente documento, una proteína de unión específica de antígeno, o un dominio de unión específico de antígeno "no se une" a una molécula específica (por ejemplo, "no se une a GDF11", "no se une a b MP9", "no se une a BMP10", etc.) si la proteína o el dominio de unión, cuando se prueba la unión a la molécula a 25 °C en un ensayo de resonancia de plasmón superficial, exhibe una Kd superior a 50,0 nM, o no presenta ninguna unión en tal ensayo o equivalente del mismo.
El término "resonancia de plasmón superficial", como se usa en el presente documento, se refiere a un fenómeno óptico que permite el análisis de interacciones en tiempo real por detección de alteraciones en concentraciones de proteína dentro de una matriz biodetectora, por ejemplo, usando el sistema BIAcore™ (Biacore Life Sciences division de GE Healthcare, Piscataway, NJ).
El término "Kd", como se usa en el presente documento, significa la constante de disociación en equilibrio de una interacción proteína-proteína particular (por ejemplo, una interacción anticuerpo-antígeno). A menos que se indique de otro modo, los valores de Kd divulgados en el presente documento se refieren a valores de Kd determinados por un ensayo de resonancia de plasmón superficial a 25 °C.
Anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de anticuerpos
Como se ha indicado anteriormente, una proteína de unión específica de antígeno puede comprender o consistir en un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo. Adicionalmente, en el caso de moléculas de unión a antígeno que comprenden dos dominios de unión específicos de antígeno diferentes, uno o ambos de los dominios de unión específicos de antígeno pueden comprender o consistir en un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo.
Como se usa en el presente documento, "un anticuerpo que se une a Activina" o un "anticuerpo anti-Activina A" incluye anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que se unen a un fragmento soluble de la proteína Activina A y también pueden unirse a un heterodímero de activina que contiene una subunidad pA de Activina.
El término "anticuerpo", como se usa en el presente documento, significa cualquier molécula o complejo molecular de unión a antígeno que comprende al menos una región determinante de complementariedad (CDR) que se une específicamente a o interactúa con un antígeno particular (por ejemplo, Activina A). El término "anticuerpo" incluye moléculas de inmunoglobulina que comprenden cuatro cadenas polipeptídicas, dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por enlaces disulfuro, así como multímeros de las mismas (por ejemplo, IgM). Cada cadena pesada comprende una región variable de cadena pesada (abreviada en el presente documento como HCVR o Vh) y una región constante de cadena pesada. La región constante de cadena pesada comprende tres dominios, Ch1, Ch2 y Ch3. Cada cadena ligera comprende una región variable de cadena ligera (abreviada en el presente documento como LCVR o Vl) y una región constante de cadena ligera. La región constante de cadena ligera comprende un dominio (Cl1). Las regiones Vh y Vl pueden subdividirse además en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de complementariedad (CDR), intercaladas con regiones que están más conservadas, denominadas regiones marco conservadas (FR). Cada Vh y Vl está compuesta por tres
CDR y cuatro FR, dispuestas desde el extremo amino hasta el extremo carboxi en el siguiente orden: FR1, CDR1,
FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. En diferentes realizaciones de la invención, las FR del anticuerpo anti-Activina A (o la porción de unión a antígeno del mismo) pueden ser idénticas a las secuencias de la línea germinal humana, o pueden modificarse natural o artificialmente. Una secuencia consenso de aminoácidos puede definirse basándose en un análisis paralelo de dos o más CDR.
El término "anticuerpo", como se usa en el presente documento, también incluye fragmentos de unión a antígeno de moléculas de anticuerpo completas. Los términos "porción de unión a antígeno" de un anticuerpo, "fragmento de unión a antígeno" de un anticuerpo, y similares, como se usan en el presente documento, incluyen cualquier polipéptido o glucoproteína de origen natural, obtenible enzimáticamente, sintético o modificado por ingeniería genética que se une específicamente a un antígeno para formar un complejo. Pueden obtenerse fragmentos de unión a antígeno de un anticuerpo, por ejemplo, a partir de moléculas de anticuerpo completas, usando cualquier técnica convencional adecuada tal como digestión proteolítica o técnicas de ingeniería genética recombinante que implican la manipulación y expresión de ADN que codifica dominios variables, y opcionalmente constantes, de anticuerpo. Dicho ADN se conoce y/o se puede adquirir fácilmente a partir de, por ejemplo, fuentes comerciales, bibliotecas de ADN (incluyendo, por ejemplo, fagotecas de anticuerpos), o puede sintetizarse. El ADN puede secuenciarse y manipularse químicamente o usando técnicas de biología molecular, por ejemplo, para disponer uno o más dominios variables y/o constantes en una configuración adecuada, o para introducir codones, crear residuos de cisteína, modificar, añadir o suprimir aminoácidos, etc.
Los ejemplos no limitantes de fragmentos de unión a antígeno incluyen: (i) fragmentos Fab; (ii) fragmentos F(ab')2;
(iii) fragmentos Fd; (iv) fragmentos Fv; (v) moléculas Fv monocatenarias (scFv); (vi) fragmentos dAb; y (vii) unidades de reconocimiento mínimo que consisten en los residuos de aminoácidos que imitan la región hipervariable de un anticuerpo (por ejemplo, una región determinante de complementariedad (CDR) aislada, tal como un péptido CDR3) o un péptido FR3-CDR3-FR4 restringido. Otras moléculas genomanipuladas, tales como anticuerpos específicos de dominio, anticuerpos de dominio único, anticuerpos de dominio suprimido, anticuerpos quiméricos, anticuerpos injertados con c Dr , diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, minicuerpos, nanocuerpos (por ejemplo, nanocuerpos monovalentes, nanocuerpos bivalentes, etc.), agentes inmunofarmacéuticos modulares pequeños (SMIP) y dominios
IgNAR variables de tiburón, también se incluyen dentro de la expresión "fragmento de unión a antígeno", como se usa en el presente documento.
Un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo típicamente comprenderá al menos un dominio variable. El dominio variable puede ser de cualquier tamaño o composición de aminoácidos y generalmente comprenderá al menos una CDR que está adyacente a o en fase con una o más secuencias marco. En fragmentos de unión a antígeno que tienen un dominio Vh asociado a un dominio Vl, los dominios Vh y Vl pueden situarse uno con respecto al otro en cualquier disposición adecuada. Por ejemplo, la región variable puede ser dimérica y contener los dímeros Vh-Vh, Vh-Vl o Vl-Vl. Como alternativa, el fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo puede contener un dominio Vh o Vl monomérico.
Un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo puede contener al menos un dominio variable unido covalentemente al menos a un dominio constante. Las configuraciones ejemplares no limitantes de dominios variables y constantes que pueden encontrarse dentro de un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo incluyen: (i) Vh-Ch1; (ii) Vh-Ch2; (iii) Vh-Ch3; (iv) Vh-Ch1-Ch2; (v) Vh-Ch1-Ch2-Ch3; (vi) Vh-Ch2-Ch3; (vii) Vh-Vl-Ch1; (ix) Vl-Ch2; (x) Vl-Ch3; (xi) Vl-Ch1-Ch2; (xii) Vl-Ch1-Ch2-Ch3; (xiii) Vl-Ch2-Ch3; y (xi configuración de dominios variables y constantes, incluyendo cualquiera de las configuraciones de ejemplo enumeradas anteriormente, los dominios variables y constantes pueden estar unidos directamente entre sí o pueden estar unidos mediante una región bisagra o enlazadora completa o parcial. Una región bisagra puede consistir en al menos 2 (por ejemplo, 5, 10, 15, 20, 40, 60 o más) aminoácidos que dan como resultado una unión flexible o semiflexible entre dominios variables y/o constantes adyacentes en una única molécula polipeptídica. Además, un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo puede comprender un homodímero o heterodímero (u otro multímero) de cualquiera de las configuraciones de dominio variable y constante enumeradas anteriormente en asociación no covalente entre sí y/o con uno o más dominios Vh o Vl monoméricos (por ejemplo, mediante uno o más enlaces disulfuro).
Como ocurre con las moléculas de anticuerpo completas, los fragmentos de unión a antígeno pueden ser monoespecíficos o multiespecíficos (por ejemplo, biespecíficos). Un fragmento de unión a antígeno multiespecífico de un anticuerpo típicamente comprenderá al menos dos dominios variables diferentes, en el que cada dominio variable puede unirse específicamente a un antígeno distinto o a un epítopo diferente en el mismo antígeno.
Cualquier formato de anticuerpo multiespecífico, incluyendo los formatos de anticuerpo biespecífico de ejemplo que se divulgan en el presente documento, puede adaptarse para su uso en el contexto de un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo de la presente invención usando técnicas rutinarias disponibles en la técnica.
Los anticuerpos de la presente invención pueden actuar mediante citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) o citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC). "Citotoxicidad dependiente del complemento" (CDC) se refiere a lisis de células que expresan antígeno por un anticuerpo de la invención en presencia del complemento. "Citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos" (ADCC) se refiere a una reacción mediada por células en la que las células citotóxicas no específicas que expresan receptores Fc (FcR) (por ejemplo, células asesinas naturales (NK), neutrófilos y macrófagos) reconocen el anticuerpo unido en una célula diana y de ese modo da lugar a la lisis de la célula diana. La CDC y la ADCC pueden medirse usando ensayos que se conocen bien y están disponibles en la técnica. (Véanse, por ejemplo, las patentes de EE.UU. N.° 5.500.362 y 5.821.337, y Clynes et al., p Na S USA 95:652-656 (1998)). La región constante de un anticuerpo es importante en la capacidad de un anticuerpo de fijar el complemento y mediar la citotoxicidad dependiente de células. Por lo tanto, el isotipo de un anticuerpo puede seleccionarse basándose en si se desea que el anticuerpo medie la citotoxicidad.
En ciertas realizaciones de la invención, los anticuerpos anti-Activina A de la invención son anticuerpos humanos. El término "anticuerpo humano", como se usa en el presente documento, pretende incluir anticuerpos que tienen regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana. Los anticuerpos humanos de la invención pueden incluir residuos de aminoácidos no codificados por las secuencias de inmunoglobulinas de la línea germinal humana (por ejemplo, mutaciones introducidas por mutagénesis aleatoria y de sitio in vitro o mediante mutación somática in vivo), por ejemplo, en las CDR y en particular CDR3. Sin embargo, el término "anticuerpo humano", como se usa en el presente documento, no pretende incluir anticuerpos en los que las secuencias de CDR derivadas de la línea germinal de otra especie de mamífero, tal como un ratón, se han injertado en secuencias marco humanas.
Los anticuerpos de la divulgación, en algunas realizaciones, pueden ser anticuerpos humanos recombinantes. El término "anticuerpo humano recombinante", como se usa en el presente documento, pretende incluir todos los anticuerpos humanos que se preparan, se expresan, se crean o se aíslan por medios recombinantes, tales como anticuerpos expresados usando un vector de expresión recombinante introducido por transfección en una célula huésped (que se describe en más detalle posteriormente), anticuerpos aislados de una biblioteca de anticuerpos humanos combinatorios y recombinante (que se describe con más detalle posteriormente), anticuerpos aislados de un animal (por ejemplo, un ratón) que es transgénico para los genes de inmunoglobulina humana (véase, por ejemplo, Taylor et al., Nucl Acids Res 20:6287-6295 (1992)) o anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados por cualquier otro medio que implique el corte y empalme de secuencias génicas de inmunoglobulina humana en otras secuencias de ADN. Dichos anticuerpos humanos recombinantes tienen regiones variables y constantes procedentes de secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana. En ciertas realizaciones, sin embargo, dichos anticuerpos humanos recombinantes se someten a mutagénesis in vitro (o, cuando se usa un animal transgénico para secuencias de Ig humana, mutagénesis somática in vivo) y, por lo tanto, las secuencias de aminoácidos de las regiones Vh y Vl de los anticuerpos recombinantes son secuencias que, aunque proceden de, y están relacionadas con, secuencias de Vh y Vl de línea germinal humana, no pueden existir de forma natural dentro del repertorio de la línea germinal de anticuerpos humanos in vivo.
Los anticuerpos humanos pueden existir en dos formas que se asocian a la heterogeneidad de bisagra. En una forma, una molécula de inmunoglobulina comprende una construcción de cuatro cadenas estable de aproximadamente 150-160 kDa en la que los dímeros se mantienen juntos mediante un enlace disulfuro intercatenario de la cadena pesada. En una segunda forma, los dímeros no están unidos mediante enlaces disulfuro intercatenarios y se forma una molécula de aproximadamente 75-80 kDa compuesta por una cadena ligera y pesada acopladas covalentemente (semianticuerpo). Estas formas han sido extremadamente difíciles de separar, incluso después de purificación por afinidad.
La frecuencia de aparición de la segunda forma en diversos isotipos de IgG intacta se debe, pero sin limitación, a diferencias estructurales asociadas al isotipo de la región bisagra del anticuerpo. Una sustitución de un único aminoácido en la región bisagra de la bisagra de IgG4 humana puede reducir significativamente la aparición de la segunda forma (Angal et al. Molecular Immunology 30:105 1993)) hasta los niveles típicamente observados usando una bisagra de IgG1 humana. La presente invención incluye anticuerpos que tienen una o más mutaciones en la región bisagra, Ch2 o Ch3, que pueden ser deseables, por ejemplo, en la producción, para mejorar el rendimiento de la forma de anticuerpo deseada.
Los anticuerpos de la invención son anticuerpos aislados. Un "anticuerpo aislado", como se usa en el presente documento, significa un anticuerpo que se ha identificado y separado y/o recuperado de al menos un componente de su entorno natural. Por ejemplo, un anticuerpo que se ha separado o eliminado de al menos un componente de un organismo, o de un tejido o célula en donde existe de forma natural o se produce de forma natural el anticuerpo, es un "anticuerpo aislado" para los fines de la presente invención. Un anticuerpo aislado también incluye un anticuerpo in situ dentro de una célula recombinante. Los anticuerpos aislados son anticuerpos que se han sometido al menos a una etapa de purificación o aislamiento. De acuerdo con ciertas realizaciones, un anticuerpo aislado puede estar sustancialmente libre de otro material celular y/o agentes químicos.
La presente invención incluye neutralizar y/o bloquear anticuerpos anti-Activina A. Un anticuerpo "neutralizante" o "bloqueante", como se usa en el presente documento, pretende hacer referencia a un anticuerpo cuya unión a Activina A: (i) interfiere con la interacción entre Activina A y un receptor de Activina A (por ejemplo, receptor de Activina de tipo IIA, receptor de Activina de tipo IIB, receptor de activina de tipo I, etc.); (ii) interfiere con la formación de complejos de receptor de activina-activina; y/o (iii) da como resultado la inhibición de al menos una función biológica de Activina A. La inhibición provocada por un anticuerpo neutralizante o bloqueante de Activina A no necesita ser completa siempre que sea detectable usando un ensayo apropiado. Los ensayos ejemplares para detectar la inhibición de la Activina A se describen en los Ejemplos de trabajo del presente documento.
Los anticuerpos anti-Activina A divulgados en el presente documento pueden comprender una o más sustituciones, inserciones y/o deleciones de aminoácidos en las regiones marco y/o CDR de los dominios variables de cadena pesada y ligera en comparación con las secuencias de la línea germinal correspondientes de las que derivan los anticuerpos. Dichas mutaciones pueden determinarse fácilmente comparando las secuencias de aminoácidos que se divulgan en el presente documento con secuencias de la línea germinal disponibles en, por ejemplo, bases de datos de secuencias de anticuerpos públicas. La presente divulgación incluye anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que se obtienen a partir de cualquiera de las secuencias de aminoácidos que se divulgan en el presente documento, en las que uno o más aminoácidos dentro de una o más regiones marco y/o CDR están mutados en el residuo o residuos correspondientes de la secuencia de la línea germinal de la que deriva el anticuerpo, o en el residuo o residuos correspondientes de otra secuencia de la línea germinal humana, o en una sustitución de aminoácidos conservadora del residuo o residuos de la línea germinal correspondientes (dichos cambios de secuencia se denominan en el presente documento colectivamente "mutaciones de la línea germinal"). Un experto habitual en la técnica, partiendo de las secuencias de la región variable de cadena pesada y ligera que se divulgan en el presente documento, puede producir fácilmente numerosos anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno que comprenden una o más mutaciones de la línea germinal individuales o combinaciones de las mismas. En ciertas realizaciones, todos los restos de la región marco y/o CDR dentro de los dominios Vh y/o Vl mutan de vuelta a los residuos encontrados en la secuencia de la línea germinal humana de la que se obtuvo el anticuerpo. En otras realizaciones, únicamente determinados residuos mutan de vuelta a la secuencia de la línea germinal original, por ejemplo, únicamente los residuos mutados encontrados dentro de los primeros 8 aminoácidos de FR1 o dentro de los últimos 8 aminoácidos de FR4, o únicamente los residuos mutados encontrados dentro de CDR1, CDR2 o CDR3. En otras realizaciones, uno o más del residuo o residuos marco y/o CDR están mutados en el residuo o residuos correspondientes de una secuencia de línea germinal diferente (es decir, una secuencia de línea germinal que es diferente de la secuencia de línea germinal de la cual se obtuvo originalmente el anticuerpo). Además, los anticuerpos de la presente divulgación pueden contener cualquier combinación de dos o más mutaciones de la línea germinal dentro de las regiones marco y/o CDR, por ejemplo, en las que ciertos residuos individuales están mutados en el residuo correspondiente de una secuencia de la línea germinal particular mientras que otros residuos determinados que difieren de la secuencia de la línea germinal original se mantienen o están mutados en el residuo correspondiente de una secuencia de la línea germinal diferente. Una vez obtenidos, los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno que contienen una o más mutaciones de la línea germinal pueden someterse a ensayo fácilmente con respecto a una o más propiedades deseadas tales como, especificidad de unión mejorada, mayor afinidad de unión, propiedades biológicas antagonista o agonistas mejoradas o potenciadas (según sea el caso), menor inmunogenicidad, etc. Los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno obtenidos de esta manera general están incluidos en la presente divulgación.
La presente divulgación también incluye anticuerpos anti-Activina A que comprenden variantes de cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCVR, LCVR, y/o CDR divulgadas en el presente documento que tienen una o más sustituciones conservadoras. Por ejemplo, la presente divulgación incluye anticuerpos anti-Activina A que tienen secuencias de aminoácidos de HCVr , LCVR, y/o CDR con, por ejemplo, 10 o menos, 8 o menos, 6 o menos, 4 o menos, etc., sustituciones conservadoras de aminoácidos con respecto a cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCVR, LCVR y/o CDR que se divulgan en el presente documento.
El término "epítopo" se refiere a un determinante antigénico que interactúa con un sitio de unión a antígeno específico en la región variable de una molécula de anticuerpo conocida como parátopo. Un único antígeno puede tener más de un epítopo. Por lo tanto, diferentes anticuerpos pueden unirse a diferentes áreas en un antígeno o puede tener diferentes efectos biológicos. Los epítopos pueden ser conformacionales o lineales. Un epítopo conformacional se produce por yuxtaposición espacial de aminoácidos de diferentes segmentos de la cadena de polipéptido lineal. Un epítopo lineal es uno producido por residuos de aminoácidos adyacentes en una cadena polipeptídica. En ciertas circunstancias, un epítopo puede incluir restos de sacáridos, grupos fosforilo o grupos sulfonilo en el antígeno.
El término "identidad sustancial" o "sustancialmente idéntico", cuando hace referencia a un ácido nucleico o fragmento del mismo, indica que, cuando se alinean de forma óptima con inserciones o deleciones de nucleótidos apropiadas con otro ácido nucleico (o su cadena complementaria), existe identidad de secuencia de nucleótidos en al menos aproximadamente un 95 % y, más preferentemente, al menos aproximadamente un 96 %, 97 %, 98 % o un 99 % de las bases nucleotídicas, según se mide mediante cualquier algoritmo bien conocido de identidad de secuencia, tal como FASTA, BLAST o Gap, como se analiza a continuación. Una molécula de ácido nucleico que tiene identidad sustancial con una molécula de ácido nucleico de referencia puede, en ciertos casos, codificar un polipéptido que tiene la misma secuencia de aminoácidos o una sustancialmente similar al polipéptido codificado por la molécula de ácido nucleico de referencia.
Aplicada a polipéptidos, el término "similitud sustancial" o "sustancialmente similar" significa que dos secuencias peptídicas, cuando se alinean de forma óptima, tal como mediante los programas GAP o BESTFIT usando ponderaciones de hueco predeterminadas, comparten al menos un 95 % de identidad de secuencia, incluso más preferentemente al menos un 98 % o un 99 % de identidad de secuencia. Preferentemente, las posiciones de los residuos que no son idénticas difieren por sustituciones de aminoácidos conservadoras. Una "sustitución de aminoácidos conservadora" es una en la que un residuo de aminoácido está sustituido por otro residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral (grupo R) con propiedades químicas similares (por ejemplo, carga o hidrofobia). En general, una sustitución de aminoácidos conservadora no cambiará sustancialmente las propiedades funcionales de una proteína. En los casos en los que dos o más secuencias de aminoácidos difieren entre sí por sustituciones conservadoras, el porcentaje de identidad de secuencia o grado de similitud puede ajustarse al alza para corregir la naturaleza conservadora de la sustitución. Los medios para hacer este ajuste son bien conocidos para los expertos en la técnica. Véase, por ejemplo, Pearson, W.R., Methods Mol Biol 24: 307-331 (1994). Los ejemplos de grupos de aminoácidos que tienen cadenas laterales con propiedades químicas similares incluyen (1) cadenas laterales alifáticas: glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; (2) cadenas laterales de hidroxilo alifáticas: serina y treonina; (3) cadenas laterales que contienen amida: asparagina y glutamina; (4) cadenas laterales aromáticas: fenilalanina, tirosina y triptófano; (5) cadenas laterales básicas: lisina, arginina e histidina; (6) cadenas laterales ácidas: aspartato y glutamato, y (7) cadenas laterales que contienen azufre que son cisteína y metionina. Son grupos de sustitución conservadora de aminoácidos preferidos: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina, glutamato-aspartato y asparagina-glutamina. Como alternativa, un reemplazo conservativo es cualquier cambio que tenga un valor positivo en la matriz de probabilidad logarítmica PAM250 divulgada en Gonnet et al., Science 256: 1443-1445 (1992). Un reemplazo "moderadamente conservador" es cualquier cambio que tiene un valor no negativo en la matriz de probabilidad logarítmica PAM250.
La similitud de secuencia para polipéptidos, que también se denomina identidad de secuencia, se mide típicamente usando un programa informático de análisis de secuencias. El programa informático de análisis de proteínas empareja secuencias similares usando medidas de similitud asignadas a diversas sustituciones, supresiones y otras modificaciones, incluyendo sustituciones de aminoácidos conservadoras. Por ejemplo, el programa informático GCG contiene programas tales como Gap y Bestfit que pueden usarse con parámetros por defecto para determinar la homología de secuencia o la identidad de secuencia entre polipéptidos muy relacionados, tales como polipéptidos homólogos de diferentes especies de organismos o entre una proteína de tipo silvestre y una muteína de la misma. Véase, por ejemplo, GCG Versión 6.1. Las secuencias polipeptídicas también pueden compararse usando FASTA usando parámetros por defecto o recomendados, un programa en GCG Versión 6.1. FASTA (por ejemplo, FASTA2 y FASTA3) proporciona alineaciones y porcentajes de identidad de secuencia de las regiones del mejor solapamiento entre las secuencias de consulta y de búsqueda (véase, por ejemplo, Pearson, W.R., Methods Mol Biol 132: 185-219 (2000)). Otro algoritmo preferente al comparar una secuencia de la divulgación con una base de datos que contiene una gran cantidad de secuencias de diferentes organismos es el programa informático BLAST, especialmente BLASTP o TBLASTN, usando parámetros por defecto. Véase, por ejemplo, Altschul et al., J Mol Biol 215:403-410 (1990) y Altschul et al., Nucleic Acids Res 25:3389-402 (1997).
Características biológicas de los anticuerpos
La presente divulgación incluye anticuerpos anti-Activina A y fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen a Activina A con alta afinidad. Por ejemplo, la presente divulgación incluye anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de anticuerpos que se unen a Activina A (por ejemplo, a 25 °C o a 37 °C) con una Kd de menos de aproximadamente 30 nM según se mide por resonancia de plasmón superficial, por ejemplo, usando el formato de ensayo como se define en el Ejemplo 3 del presente documento. En ciertas realizaciones, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de la presente divulgación se unen a Activina A con una Kd de menos de aproximadamente 25 nM, menos de aproximadamente 20 nM, menos de aproximadamente 15 nM, menos de aproximadamente 10 nM, menos de aproximadamente 5 nM, menos de aproximadamente 2 nM, menos de aproximadamente 1 nM, menos de aproximadamente 500 pM, menos de aproximadamente 250 pM, menos de aproximadamente 240 pM, menos de aproximadamente 230 pM, menos de aproximadamente 220 pM, menos de aproximadamente 210 pM, menos de aproximadamente 200 pM, menos de aproximadamente 190 pM, menos de aproximadamente 180 pM, menos de aproximadamente 170 pM, menos de aproximadamente 160 pM, menos de aproximadamente 150 pM, menos de aproximadamente 140 pM, menos de aproximadamente 130 pM, menos de aproximadamente 120 pM, menos de aproximadamente 110 pM, menos de aproximadamente 100 pM, menos de aproximadamente 95 pM, menos de aproximadamente 90 pM, menos de aproximadamente 85 pM, menos de aproximadamente 80 pM, menos de aproximadamente 75 pM, menos de aproximadamente 70 pM, menos de aproximadamente 65 pM, menos de aproximadamente 60 pM, menos de aproximadamente 55 pM, menos de aproximadamente 50 pM, menos de aproximadamente 45 pM, menos de aproximadamente 40 pM, menos de aproximadamente 35 pM, menos de aproximadamente 30 pM, menos de aproximadamente 25 pM, menos de aproximadamente 20 pM, menos de aproximadamente 15 pM, menos de aproximadamente 10 pM, menos de aproximadamente 9 pM, menos de aproximadamente 8 pM, menos de aproximadamente 7 pM, menos de aproximadamente 6 pM, menos de aproximadamente 5 pM, menos de aproximadamente 4 pM, o menos de aproximadamente 3 pM, según se mide mediante resonancia de plasmón superficial, por ejemplo, usando el formato de ensayo como se define en el Ejemplo 3 en el presente documento, o un ensayo sustancialmente similar.
La presente invención también incluye anticuerpos anti-Activina A y fragmentos de unión a antígeno de los mismos que inhiben la señalización celular mediada por Activina A. Por ejemplo, la presente invención incluye anticuerpos anti-Activina A que inhiben la activación de la vía de transducción de señales del complejo SMAD a través de la unión de Activina A a receptores de Activina de tipo I o II con un valor de CI50 de menos de aproximadamente 4 nM, según se mide en un bioensayo de bloqueo basado en células, por ejemplo, usando el formato de ensayo como se define en el Ejemplo 6 en el presente documento, o un ensayo sustancialmente similar. En ciertas realizaciones, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de la presente invención inhiben la activación de la vía de transducción de señales del complejo SMAD a través de la unión de Activina A a receptores de Activina de tipo I o II con un valor de CI50 de menos de aproximadamente 3 nM, menos de aproximadamente 2 nM, menos de aproximadamente 1 nm, menos de aproximadamente 500 pM, menos de aproximadamente 250 pM, menos de aproximadamente 240 pM, menos de aproximadamente 230 pM, menos de aproximadamente 220 pM, menos de aproximadamente 210 pM, menos de aproximadamente 200 pM, menos de aproximadamente 190 pM, menos de aproximadamente 180 pM, menos de aproximadamente 170 pM, menos de aproximadamente 160 pM, menos de aproximadamente 150 pM, menos de aproximadamente 140 pM, menos de aproximadamente 130 pM, menos de aproximadamente 120 pM, menos de aproximadamente 110 pM, menos de aproximadamente 100 pM, menos de aproximadamente 95 pM, menos de aproximadamente 90 pM, menos de aproximadamente 85 pM, menos de aproximadamente 80 pM, menos de aproximadamente 75 pM, menos de 70 pM, menos de aproximadamente 65 pM, menos de aproximadamente 60 pM, menos de aproximadamente 55 pM, menos de aproximadamente 50 pM, menos de aproximadamente 49 pM, menos de aproximadamente 48 pM, menos de aproximadamente 47 pM, menos de aproximadamente 46 pM, menos de aproximadamente 45 pM, menos de aproximadamente 44 pM, menos de aproximadamente 43 pM, menos de aproximadamente 42 pM, menos de aproximadamente 41 pM, menos de aproximadamente 40 pM, o menos de aproximadamente 39 pM, según se mide en un bioensayo de bloqueo basado en células, por ejemplo, usando el formato de ensayo como se define en el Ejemplo 6 en el presente documento, o un ensayo sustancialmente similar. En ciertas realizaciones, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de la presente invención inhiben la activación de señalización de Activina B interfiriendo con la unión de Activina B a receptores de Activina de tipo I o II con un valor de CI50 de menos de aproximadamente 50 nM, menos de aproximadamente 20 nM, menos de aproximadamente 10 nm, menos de aproximadamente 5 nM, o menos de aproximadamente 1 nM, según se mide en un bioensayo de bloqueo basado en células, por ejemplo, usando el formato de ensayo como se define en el Ejemplo 6 en el presente documento, o un ensayo sustancialmente similar. En ciertas realizaciones, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de la presente invención inhiben la activación de la vía de transducción de señales del complejo SMAD a través de la unión de Activina AB a receptores de Activina de tipo I o II con un valor de CI50 de menos de aproximadamente 500 pM, menos de aproximadamente 450 pM, menos de aproximadamente 440 pM, menos de aproximadamente 430 pM, menos de aproximadamente 420 pM, menos de aproximadamente 410 pM, menos de aproximadamente 400 pM, menos de aproximadamente 390 pM, menos de aproximadamente 380 pM, menos de aproximadamente 370 pM, menos de aproximadamente 360 pM, menos de aproximadamente 350 pM, menos de aproximadamente 340 pM, menos de aproximadamente 320 pM, menos de aproximadamente 310 pM, menos de aproximadamente 300 pM, menos de aproximadamente 290 pM, menos de aproximadamente 280 pM, menos de aproximadamente 270 pM, menos de aproximadamente 260 pM, menos de aproximadamente 250 pM, menos de aproximadamente 240 pM, menos de aproximadamente 230 pM, menos de aproximadamente 220 pM, menos de aproximadamente 210 pM, menos de aproximadamente 200 pM, menos de aproximadamente 190 pM, menos de aproximadamente 180 pM, menos de aproximadamente 170 pM, menos de aproximadamente 160 pM, menos de aproximadamente 150 pM, o menos de aproximadamente 140 pM, según se mide en un bioensayo de bloqueo basado en células, por ejemplo, usando el formato de ensayo como se define en el Ejemplo 6 en el presente documento, o un ensayo sustancialmente similar. En ciertas realizaciones, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de la presente divulgación inhiben la activación de la vía de transducción de señales del complejo SMAD a través de la unión de Activina AC a receptores de Activina de tipo I o II con un valor de CI50 de menos de aproximadamente 1 nM, menos de aproximadamente 900 pM, menos de aproximadamente 800 pM, menos de aproximadamente 750 pM, menos de aproximadamente 700 pM, menos de aproximadamente 650 pM, menos de aproximadamente 600 pM, o menos de aproximadamente 580 pM, según se mide en un bioensayo de bloqueo basado en células, por ejemplo, usando el formato de ensayo como se define en el Ejemplo 6 en el presente documento, o un ensayo sustancialmente similar.
Los anticuerpos de la presente divulgación pueden poseer una o más de las características biológicas mencionadas anteriormente, o cualquier combinación de las mismas. Otras características biológicas de los anticuerpos de la presente invención serán evidentes para un experto en la técnica a partir de una revisión de la presente divulgación que incluye los Ejemplos de trabajo del presente documento.
Anticuerpos anti-Activina A que comprenden variantes de Fc
De acuerdo con ciertas realizaciones de la presente invención, se proporcionan anticuerpos anti-Activina A que comprenden un dominio Fc que comprende una o más mutaciones que mejoran o reducen la unión del anticuerpo al receptor FcRn, por ejemplo, a pH ácido en comparación con pH neutro. Por ejemplo, la presente invención incluye anticuerpos anti-Activina A que comprenden una mutación en la región Ch2 o Ch3 del dominio Fc, en los que la mutación o mutaciones aumentan la afinidad del dominio Fc por FcRn en un entorno ácido (por ejemplo, en un endosoma en el que el pH varía de aproximadamente 5,5 a aproximadamente 6,0). Dichas mutaciones pueden dar como resultado un aumento de la semivida en suero del anticuerpo cuando se administran a un animal. Los ejemplos no limitantes de dichas modificaciones de Fc incluyen, por ejemplo, una modificación en la posición 250 (por ejemplo, E o Q); 250 y 428 (por ejemplo, L o F); 252 (por ejemplo, L/Y/F/W o T), 254 (por ejemplo, S o T), y 256 (por ejemplo, S/R/Q/E/D o T); o una modificación en la posición 428 y/o 433 (por ejemplo, H/L/R/S/P/Q o K) y/o 434 (por ejemplo, A, W, H, F o Y [N434A, N434W, N434H, N434F o N434Y]); o una modificación en la posición 250 y/o 428; o una modificación en la posición 307 o 308 (por ejemplo, 308F, V308F), y 434. En una realización, la modificación comprende una modificación en 428L (por ejemplo, M428L) y 434S (por ejemplo, N434S); una modificación en 428L, 259I (por ejemplo, V259I), y 308F (por ejemplo, V308F); una modificación en 433K (por ejemplo, H433K) y una modificación en 434 (por ejemplo, 434Y); una modificación en 252, 254, y 256 (por ejemplo, 252Y, 254T y 256E); una modificación en 250Q y 428l (por ejemplo, T250Q y M428L); y una modificación en 307 y/o 308 (por ejemplo, 308F o 308P). En aún otra realización, la modificación comprende una modificación en 265A (por ejemplo, D265A) y/o una modificación en 297A (por ejemplo, N297A).
Por ejemplo, la presente invención incluye anticuerpos anti-Activina A que comprenden un dominio Fc que comprende uno o más pares o grupos de mutaciones seleccionados del grupo que consiste en: 250Q y 248L (por ejemplo, T250Q y M248L); 252Y, 254T y 256E (por ejemplo, M252Y, S254T y T256E); 428L y 434S (por ejemplo, M428L y N434S); 2571 y 3111 (por ejemplo, P257I y Q3111); 2571 y 434H (por ejemplo, P257I y N434H); 376V y 434H (por ejemplo, D376V y N434H); 307A, 380A y 434A (por ejemplo, T307A, E380A y N434A); y 433K y 434F (por ejemplo, H433K y N434F). Todas las posibles combinaciones de las mutaciones del dominio Fc anteriores, y otras mutaciones dentro de los dominios variables del anticuerpo divulgados en el presente documento, se contemplan dentro del alcance de la presente invención.
La presente invención también incluye anticuerpos anti-Activina A que comprenden una región constante de cadena pesada (CH) quimérica, en los que la región CH quimérica comprende segmentos derivados de las regiones CH de más de un isotipo de inmunoglobulina. Por ejemplo, los anticuerpos de la invención pueden comprender una región CH quimérica que comprende parte o la totalidad de un dominio CH2 derivado de una molécula de IgG1 humana, IgG2 humana o IgG4 humana, en combinación con parte o la totalidad de un dominio CH3 derivado de una molécula de IgG1 humana, IgG2 humana o IgG4 humana. De acuerdo con ciertas realizaciones, los anticuerpos de la invención comprenden una región CH quimérica que tiene una región bisagra quimérica. Por ejemplo, una bisagra quimérica puede comprender una secuencia de aminoácidos de "bisagra superior" (residuos de aminoácidos de las posiciones 216 a 227 de acuerdo con la numeración EU) derivada de una región bisagra de IgG1 humana, IgG2 humana o IgG4 humana, en combinación con una secuencia "bisagra inferior" (residuos de aminoácidos de las posiciones 228 a 236 de acuerdo con la numeración EU) derivada de una región bisagra de IgG1 humana, IgG2 humana o IgG4 humana. De acuerdo con ciertas realizaciones, la región bisagra quimérica comprende residuos de aminoácidos derivados de una bisagra superior de IgG1 humana o IgG4 humana y residuos de aminoácidos derivados de una bisagra inferior de IgG2 humana. Un anticuerpo que comprende una región CH quimérica como se describe en el presente documento puede, en ciertas realizaciones, exhibir funciones efectoras de Fc modificadas sin afectar negativamente a las propiedades terapéuticas o farmacocinéticas del anticuerpo. (Véase, por ejemplo, la Sol. Provisional de EE.UU. N.° 61/759.578, presentada el 1 de febrero de 2013).
Cartografiado de epítopos y tecnologías relacionadas
La presente divulgación incluye anticuerpos anti-Activina A que interactúan con uno o más aminoácidos que se encuentran dentro de la Activina A (por ejemplo, dentro del sitio de unión al receptor de Activina de tipo II). El epítopo al que se unen los anticuerpos puede consistir en una sola secuencia contigua de 3 o más (por ejemplo, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más) aminoácidos ubicados dentro de la subunidad de Activina pA. Como alternativa, el epítopo puede consistir en una pluralidad de aminoácidos (o secuencias de aminoácidos) no contiguos ubicados dentro del dímero de Activina A.
Pueden usarse diversas técnicas conocidas para los expertos en la técnica para determinar si un anticuerpo "interactúa con uno o más aminoácidos" dentro de un polipéptido o proteína. Las técnicas ejemplares incluyen, por ejemplo, ensayo de bloqueo cruzado de rutina tal como el descrito en Antibodies, Harlow y Lane (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harb., NY), análisis mutacional de rastreo con alanina, análisis de transferencia de péptidos (Reineke, Methods Mol Biol 248:443-463 (2004)), y análisis de escisión de péptidos. Además, pueden emplearse métodos tales como escisión de epítopos, extracción de epítopos y modificación química de antígenos (Tomer, Protein Science 9:487-496 (2000)). Otro método que puede usarse para identificar los aminoácidos dentro de un polipéptido con el que interactúa un anticuerpo es el intercambio de hidrógeno/deuterio detectado por espectrometría de masas. En términos generales, el método de intercambio hidrógeno/deuterio implica el marcaje con deuterio de la proteína de interés, seguido de la unión del anticuerpo a la proteína marcada con deuterio. A continuación, el complejo de proteína/anticuerpo se transfiere a agua para permitir que tenga lugar el intercambio de hidrógenodeuterio en todos los residuos, excepto los residuos protegidos por el anticuerpo (que permanecen marcados con deuterio). Después de la disociación del anticuerpo, la proteína diana se somete a escisión por proteasa y análisis de espectrometría de masas, revelando de esta manera los residuos marcados con deuterio que corresponden a los aminoácidos específicos con los que interactúa el anticuerpo. Véase, por ejemplo, Ehring, Analytical Biochemistry 267(2):252-259 (1999); Engen y Smith, Anal. Chem. 73:256A-265A (2001).
La presente divulgación incluye además anticuerpos anti-Activina A que se unen al mismo epítopo que cualquiera de los anticuerpos ejemplares específicos descritos en el presente documento (por ejemplo, H4H10423P, H4H10424P, H4H10426P, H4H10429P, H4H10430P, H4H10432P2, H4H10433P2, H4H10436P2, H4H10437P2, H4H10438P2, H4H10440P2, H4H10442P2, H4H10445P2, H4H10446P2, H4H10447P2, H4H10448P2, H4H10452P2, H4H10468P2, H2aM10965N, etc.). Asimismo, la presente divulgación también incluye anticuerpos anti-Activina A que compiten por la unión a Activina A con cualquiera de los anticuerpos ejemplares específicos descritos en el presente documento (por ejemplo, H4H10423P, H4H10424P, H4H10426P, H4H10429P, H4H10430P, H4H10432P2, H4H10433P2, H4H10436P2, H4H10437P2, H4H10438P2, H4H10440P2, H4H10442P2, H4H10445P2, H4H10446P2, H4H10447P2, H4H10448P2, H4H10452P2, H4H10468P2, H2aM10965N, etc.). Por ejemplo, la presente divulgación incluye anticuerpos anti-Activina A que compiten de forma cruzada para unirse a Activina A con uno o más anticuerpos del "Grupo 1" como se define en el Ejemplo 5 en el presente documento (por ejemplo, H4H10423P, H4H10446P2, H4H10468P2 y H4H10442P2). La presente divulgación también incluye anticuerpos anti-Activina A que compiten de forma cruzada para unirse a Activina A con uno o más anticuerpos del "Grupo 2" como se define en el Ejemplo 5 en el presente documento (por ejemplo, H4H10429, H4H10430P, H4H10432P2, H4H10436P2, y H4H10440P2).
Puede determinarse fácilmente si un anticuerpo se une al mismo epítopo que, o compite por la unión con, un anticuerpo anti-activina A de referencia mediante el uso de métodos de rutina conocidos en la técnica e ilustrados en el presente documento. Por ejemplo, para determinar si un anticuerpo de ensayo se une al mismo epítopo que un anticuerpo anti-Activina A de referencia de la invención, se permite que el anticuerpo de referencia se una a Activina A (o un heterodímero que contenga una subunidad pA). A continuación, se evalúa la capacidad de un anticuerpo de ensayo para unirse a la activina A. Si el anticuerpo de ensayo es capaz de unirse a Activina A después de la unión de saturación con el anticuerpo anti-Activina A de referencia, se puede concluir que el anticuerpo de ensayo se une a un epítopo diferente al anticuerpo anti-Activina A de referencia. Por otro lado, si el anticuerpo de ensayo no puede unirse a Activina A después de la unión de saturación con el anticuerpo anti-Activina A de referencia, entonces el anticuerpo de ensayo puede unirse al mismo epítopo que el epítopo unido por el anticuerpo anti-Activina A de referencia de la invención. A continuación, puede realizarse experimentación de rutina adicional (por ejemplo, mutación de péptidos y análisis de unión) para confirmar si la ausencia observada de unión del anticuerpo de ensayo se debe, de hecho, a la unión al mismo epítopo que el anticuerpo de referencia o si el bloqueo estérico (u otro fenómeno) es responsable de la ausencia de la unión observada. Los experimentos de este tipo pueden realizarse usando ELISA, RIA, Biacore, citometría de flujo o cualquier otro ensayo cuantitativo o cualitativo de unión de anticuerpos disponible en la técnica. De acuerdo con ciertas realizaciones de la presente divulgación, dos anticuerpos se unen al mismo epítopo (o a epítopos solapantes) si, por ejemplo, un exceso en un factor de 1, 5, 10, 20 o 100 de un anticuerpo inhibe la unión del otro en al menos un 50 %, pero preferentemente en un 75 %, 90 % o incluso un 99 %, según se mide en un ensayo de unión competitiva (véase, por ejemplo, Junghans et al., Cancer Res. 50:1495-1502 (1990)). Como alternativa, se considera que dos anticuerpos se unen al mismo epítopo si esencialmente todas las mutaciones de aminoácido en el antígeno que reducen o eliminan la unión de un anticuerpo reducen o eliminan la unión del otro. Se considera que dos anticuerpos tienen "epítopos solapantes" si únicamente un subconjunto de las mutaciones de aminoácido que reducen o eliminan la unión de un anticuerpo reducen o eliminan la unión del otro.
Para determinar si un anticuerpo compite por la unión (o compite de forma cruzada por la unión) con un anticuerpo anti-Activina A de referencia, se realiza la metodología de unión descrita anteriormente en dos orientaciones: En una primera orientación, se permite que el anticuerpo de referencia se una unirse a la proteína Activina A (o un heterodímero que contiene una subunidad pA) en condiciones de saturación seguido de la evaluación de la unión del anticuerpo de ensayo a la molécula de Activina A. En una segunda orientación, se permite que el anticuerpo de ensayo se una a la activina A en condiciones de saturación seguido de la evaluación de la unión del anticuerpo de referencia a la activina A. Si, en ambas orientaciones, solo el primer anticuerpo (de saturación) es capaz de unirse a la Activina A, entonces se concluye que el anticuerpo de ensayo y el anticuerpo de referencia compiten por unirse a Activina A (véase, por ejemplo, el formato de ensayo descrito en el Ejemplo 4 en el presente documento, en el que un anticuerpo de Activina A de ensayo se captura en puntas de sensor que después se sumergen en una solución que contiene un anticuerpo de Activina A de referencia unido previamente a Activina A). Como apreciará un experto en la técnica, es posible que un anticuerpo que compite por la unión con un anticuerpo de referencia no se una necesariamente al mismo epítopo que el anticuerpo de referencia, sino que puede bloquear estéricamente la unión del anticuerpo de referencia mediante la unión a un epítopo solapante o adyacente.
Los anticuerpos anti-Activina A pueden unirse a un epítopo en la Activina A que está dentro o cerca del sitio de unión para un receptor de Activina de tipo II, bloquear directamente la interacción entre Activina A y un receptor de Activina de tipo II, y bloquear indirectamente la interacción entre Activina A y un receptor de Activina de tipo I. Los anticuerpos anti-Activina A pueden unirse a un epítopo en la Activina A que está dentro o cerca del sitio de unión del receptor de Activina de tipo I y bloquear directamente la interacción entre la Activina A y un receptor de activina de tipo I. En un caso, un anticuerpo anti-Activina A que se une a Activina A en o cerca del sitio de unión al receptor de Activina de tipo I no bloquea la interacción entre Activina A y un receptor de Activina A de tipo II.
Preparación de anticuerpos humanos
Los métodos para generar anticuerpos monoclonales, incluyendo anticuerpos monoclonales completamente humanos son conocidos en la técnica. Cualquiera de dichos métodos conocidos puede usarse en el contexto de la presente invención para preparar anticuerpos humanos que se unan específicamente a Activina A humana.
Usando la tecnología VELOCIMMUNE™, por ejemplo, o cualquier otro método conocido para generar anticuerpos monoclonales completamente humanos, se aíslan inicialmente anticuerpos quiméricos de alta afinidad contra Activina A humana que tienen una región variable humana y una región constante de ratón. Como en la siguiente sección experimental, los anticuerpos se caracterizan y seleccionan para las características deseables, incluyendo afinidad, selectividad, epítopo, etc. Si fuera necesario, las regiones constantes de ratón se reemplazan por una región constante humana deseada, por ejemplo, IgG1 o IgG4 de tipo silvestre o modificadas, para generar un anticuerpo anti-Activina A completamente humano. Aunque la región constante seleccionada puede variar de acuerdo con el uso específico, las características de unión a antígeno de alta afinidad y especificidad de diana residen en la región variable. En ciertos casos, los anticuerpos anti-Activina A completamente humanos se aíslan directamente de linfocitos B positivos a antígeno.
Bioequivalentes
Los anticuerpos anti-Activina A y los fragmentos de anticuerpos de la presente invención abarcan proteínas que tienen secuencias de aminoácidos que varían de las de los anticuerpos descritos pero que conservan la capacidad de unirse a la Activina A humana. Dichos anticuerpos variantes y fragmentos de anticuerpos comprenden una o más adiciones, deleciones o sustituciones de aminoácidos en comparación con la secuencia precursora, pero muestran actividad biológica que es esencialmente equivalente a la de los anticuerpos descritos. Asimismo, las secuencias de ADN que codifican el anticuerpo anti-Activina A de la presente invención abarcan secuencias que comprenden una o más adiciones, deleciones o sustituciones de nucleótidos en comparación con la secuencia divulgada, pero que codifican un anticuerpo anti-Activina A o fragmento de anticuerpo que es esencialmente bioequivalente a un anticuerpo anti-Activina A o fragmento de anticuerpo de la invención. Anteriormente se han analizado ejemplos de dichas secuencias variantes de aminoácido y ADN.
Dos proteínas de unión a antígeno, o anticuerpos, se consideran bioequivalentes si, por ejemplo, son equivalentes farmacéuticos o alternativas farmacéuticas cuya velocidad y grado de absorción no muestran una diferencia significativa cuando se administran a la misma dosis molar en condiciones experimentales similares, en una sola dosis o en múltiples dosis. Algunos anticuerpos se considerarán equivalentes o alternativas farmacéuticas si son equivalentes en el grado de su absorción pero no en su velocidad de absorción y aún pueden considerarse bioequivalentes porque dichas diferencias en la velocidad de absorción son intencionadas y se reflejan en el marcaje, no son esenciales para obtener las concentraciones eficaces del fármaco en el organismo en, por ejemplo, el uso crónico, y se consideran médicamente insignificantes para el producto farmacológico particular estudiado. En una realización, dos proteínas de unión a antígeno son bioequivalentes si no hay diferencias clínicamente importantes en su seguridad, pureza y potencia.
En una realización, dos proteínas de unión a antígeno son bioequivalentes si un paciente puede cambiarse una o más veces entre el producto de referencia y el producto biológico sin un aumento esperado en el riesgo de efectos adversos, incluyendo un cambio clínicamente significativo en la inmunogenicidad, o eficacia disminuida, en comparación con la terapia continuada sin dicho cambio.
En una realización, dos proteínas de unión a antígeno son bioequivalentes si ambas actúan por un mecanismo o mecanismos comunes de acción para la afección o afecciones de uso, en la medida en que dichos mecanismos sean conocidos.
La bioequivalencia puede demostrarse por métodos in vivo e in vitro. Las medidas de bioequivalencia incluyen, por ejemplo, (a) un ensayo in vivo en seres humanos u otros mamíferos, en el que se mide la concentración del anticuerpo o sus metabolitos en sangre, plasma, suero u otro líquido biológico como una función del tiempo; (b) un ensayo in vitro que se ha correlacionado con y es razonablemente predictivo de datos de biodisponibilidad in vivo en seres humanos; (c) un ensayo in vivo en seres humanos u otros mamíferos en el que se mide el efecto farmacológico agudo apropiado del anticuerpo (o su diana) en función del tiempo; y (d) en un ensayo clínico bien controlado que establece la seguridad, eficacia o biodisponibilidad o bioequivalencia de un anticuerpo.
Las variantes bioequivalentes de anticuerpos anti-Activina A de la invención pueden construirse, por ejemplo, generando diversas sustituciones de residuos o secuencias o suprimiendo residuos terminales o internos o secuencias no necesarias para la actividad biológica. Por ejemplo, pueden suprimirse residuos de cisteína no esenciales para la actividad biológica, o remplazarse por otros aminoácidos, para evitar la formación de puentes disulfuro intramoleculares innecesarios o incorrectos tras la renaturalización. En otros contextos, los anticuerpos bioequivalentes pueden incluir variantes de anticuerpo anti-Activina A que comprenden cambios de aminoácido que modifican las características de glucosilación de los anticuerpos, por ejemplo, mutaciones que eliminan o suprimen la glucosilación.
Selectividad de especie y reactividad cruzada de especie
La presente invención, de acuerdo con ciertas realizaciones, proporciona anticuerpos anti-Activina A que se unen a Activina A humana pero no a Activina A de otras especies. La presente invención también incluye anticuerpos anti-Activina A que se unen a Activina A humana y a Activina A de una o más especies no humanas. Por ejemplo, los anticuerpos anti-Activina A de la invención pueden unirse a Activina A humana y pueden unirse o no, según sea el caso, a uno o más de Activina A de ratón, rata, cobaya, hámster, jerbo, cerdo, gato, perro, conejo, cabra, oveja, vaca, caballo, camello, mono cynomolgus, tití, rhesus o chimpancé. De acuerdo con ciertas realizaciones ejemplares de la presente invención, se proporcionan anticuerpos anti-Activina A que se unen específicamente a Activina A humana (por ejemplo, Activina A o un heterodímero que contiene una subunidad pA) y Activina A de mono cynomolgus (por ejemplo, Macaca fascicularis).
Inmunoconjugados
La invención abarca anticuerpos monoclonales anti-Activina A humanos conjugados con un resto terapéutico ("inmunoconjugado"), tal como una citotoxina, un fármaco quimioterapéutico, un inmunodepresor o un radioisótopo. Los agentes citotóxicos incluyen cualquier agente que sea perjudicial para las células. En la técnica se conocen ejemplos de agentes citotóxicos y agentes quimioterapéuticos adecuados para formar inmunoconjugados (véase, por ejemplo, el documento WO 05/103081).
Anticuerpos multiespecíficos
Los anticuerpos de la presente invención pueden ser monoespecíficos, biespecíficos o multiespecíficos. Los anticuerpos multiespecíficos pueden ser específicos para diferentes epítopos de un polipéptido diana o pueden contener dominios de unión a antígeno específicos para más de un polipéptido diana. Véanse, por ejemplo, Tutt et al., J Immunol 147:60-69 (1991); Kufer et al., Trends Biotechnol 22:238-244 (2004). Los anticuerpos anti-Activina A de la presente invención pueden unirse a o expresarse conjuntamente con otra molécula funcional, por ejemplo, otro péptido o proteína. Por ejemplo, un anticuerpo o fragmento del mismo puede unirse de forma funcional (por ejemplo, por acoplamiento químico, fusión genética, asociación no covalente o de otro modo) a una o más entidades moleculares diferentes, tales como otro anticuerpo o fragmento de anticuerpo para producir un anticuerpo biespecífico o multiespecífico con una segunda especificidad de unión. Por ejemplo, la presente invención incluye anticuerpos biespecíficos en los que un brazo de una inmunoglobulina es específico para la Activina A humana o un fragmento de la misma, y el otro brazo de la inmunoglobulina es específico para una segunda diana terapéutica o está conjugado con un resto terapéutico. Una realización de la invención incluye anticuerpos biespecíficos en los que un brazo de una inmunoglobulina es específico para Activina A humana o un fragmento de la misma, y el otro brazo de la inmunoglobulina es específico para GDF8.
Un formato de anticuerpo biespecífico de ejemplo que puede usarse en el contexto de la presente invención implica el uso de un primer dominio Ch3 de inmunoglobulina (Ig) y un segundo dominio Ch3 de Ig, en el que el primer y el segundo dominio Ch3 de Ig difieren entre sí en al menos un aminoácido, y en el que al menos una diferencia de aminoácido reduce la unión del anticuerpo biespecífico a proteína A en comparación con un anticuerpo biespecífico que carece de la diferencia de aminoácido (véase, por ejemplo, la Patente de EE.UU. N.° 8.586.713). En una realización, el primer dominio Ch3 de Ig está unido a proteína A y el segundo dominio Ch3 de Ig contiene una mutación que reduce o anula la unión a proteína A tal como una modificación H95R (por numeración de exones IMGT; H435R por numeración EU). El segundo Ch3 puede comprender además una modificación en Y96F (por IMGT; Y436F por EU). Otras modificaciones adicionales que pueden encontrarse dentro del segundo CH3 incluyen: D16E, L18M, N44S, K52N, V57M y V82I (por IMGT; D356E, L358M, N384S, K392N, V397M y V422I por EU) en el caso de anticuerpos IgG1; N44S, K52N, y V82I (IMGT; N384S, K392N y V422I por EU) en el caso de anticuerpos IgG2; y Q15R, N44S, K52N, V57M, R69K, E79Q, V82I y L105P (por IMGT; Q355R, N384S, K392N, V397M, R409K, E419Q, V422I y L445P por EU) en el caso de anticuerpos IgG4. Dentro del alcance de la presente invención se contemplan variaciones en el formato de anticuerpo biespecífico descrito anteriormente.
Otros formatos biespecíficos ilustrativos que pueden usarse en el contexto de la presente invención incluyen, sin limitación, por ejemplo, formatos biespecíficos basados en scFv o de diacuerpo, fusiones IgG-scFv, dominio variable doble (DVD)-Ig, cuadroma, botón en ojal, cadena ligera habitual (por ejemplo, cadena ligera habitual con botón en ojal, etc.), CrossMab, CrossFab, (SEED)cuerpo, cremallera de leucina, duocuerpo, IgG1/IgG2, Fab de acción doble (DAF)-IgG y formatos biespecíficos de Mab2 (véase, por ejemplo, Klein et al., mAbs 4:6, 1-11 (2012), y las referencias citadas en el mismo, para una revisión de los formatos anteriores). También se pueden construir anticuerpos biespecíficos usando conjugación de péptido/ácido nucleico, por ejemplo, en los que se usan aminoácidos no naturales con reactividad química ortogonal para generar conjugados de anticuerpo-oligonucleótido específicos de sitio que después se autoensamblan en complejos multiméricos con composición, valencia y geometría definidas. (Véase, por ejemplo, Kazane et al., J Am Chem Soc. 135(1):340-346 (2013)).
Formulación terapéutica y administración
La invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden los anticuerpos anti-Activina A o fragmentos de unión a antígeno de los mismos de la presente invención. Las composiciones farmacéuticas de la invención se formulan con vehículos, excipientes y otros agentes adecuados que proporcionan una mejor transferencia, administración, tolerancia, y similares. Puede encontrarse una multitud de formulaciones apropiadas en el formulario conocido para todos los químicos farmacéuticos: Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA. Estas formulaciones incluyen, por ejemplo, polvos, pastas, ungüentos, gelatinas, ceras, aceites, lípidos, vesículas que contienen lípidos (catiónicos o aniónicos) (tales como LIPOFECTIN™), Life Technologies, Carlsbad, CA), conjugados de ADN, pastas de absorción anhidras, emulsiones de aceite en agua y agua en aceite, emulsiones de Carbowax (polietilenglicoles de diversos pesos moleculares), geles semisólidos y mezclas semisólidas que contienen Carbowax. Véase también Powell et al. "Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA, J Pharm Sci Technol 52:238-311 (1998).
La dosis de anticuerpo administrada a un paciente puede variar dependiendo de la edad y las dimensiones del paciente, la enfermedad diana, afecciones, vía de administración, y similares. La dosis preferida se calcula típicamente de acuerdo con el peso corporal o el área superficial del cuerpo. Cuando un anticuerpo de la presente invención se usa para tratar una afección o enfermedad asociada con la actividad de Activina A en un paciente adulto, puede ser ventajoso administrar por vía intravenosa el anticuerpo de la presente invención, normalmente en una única dosis de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 20 mg/kg de peso corporal, más preferentemente de aproximadamente 0,02 a aproximadamente 7, de aproximadamente 0,03 a aproximadamente 5, o de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 3 mg/kg de peso corporal. Dependiendo de la gravedad de la afección, pueden ajustarse la frecuencia y la duración del tratamiento. Las dosificaciones eficaces y posologías para administrar anticuerpos anti-Activina A pueden determinarse empíricamente; por ejemplo, puede monitorizarse el progreso del paciente por evaluación periódica, y ajustarse la dosis en consecuencia. Además, pueden realizarse aumentos de escala de las dosificaciones entre especies usando métodos bien conocidos en la técnica (por ejemplo, Mordenti et al., Pharmaceut Res 8:1351 (1991)).
Se conocen diversos sistemas de administración y pueden usarse para administrar la composición farmacéutica de la invención, por ejemplo, encapsulación en liposomas, micropartículas, microcápsulas, células recombinantes capaces de expresar un anticuerpo u otra proteína terapéutica de la invención, endocitosis mediada por receptor (véase, por ejemplo, Wu et al., J Biol Chem 262:4429-4432 (1987)). Los anticuerpos y otros componentes terapéuticamente activos de la presente invención también pueden administrarse mediante técnicas de terapia génica. Los métodos de introducción incluyen, pero sin limitación, las vías intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, intranasal, epidural y otras vías. La composición puede administrarse por cualquier vía conveniente, por ejemplo, por infusión o inyección en bolo, por absorción a través de revestimientos epiteliales o mucocutáneos (por ejemplo, mucosa oral, mucosa rectal e intestinal, etc.) y pueden administrarse junto con otros agentes biológicamente activos. La administración puede ser sistémica o local.
Una composición farmacéutica de la presente invención puede administrarse por vía subcutánea o por vía intravenosa con una aguja y una jeringa convencionales. Además, con respecto a la administración subcutánea, un dispositivo inyector de pluma tiene fácilmente aplicaciones en la administración de una composición farmacéutica de la presente invención. Tal dispositivo inyector de pluma puede ser reutilizable o desechable. Un dispositivo inyector de pluma reutilizable usa generalmente un cartucho reemplazable que contiene una composición farmacéutica. Una vez que se ha administrado toda la composición farmacéutica dentro del cartucho y que el cartucho está vacío, el cartucho vacío puede desecharse fácilmente y remplazarse con un nuevo cartucho que contiene la composición farmacéutica. El dispositivo inyector de pluma puede entonces reutilizarse. En un dispositivo inyector de pluma desechable, no hay cartucho reemplazable. Más bien, el dispositivo inyector de pluma desechable viene precargado con la composición farmacéutica mantenida en un depósito dentro del dispositivo. Una vez que el depósito se vacía de la composición farmacéutica, el dispositivo completo se desecha.
Numerosos dispositivos de administración de pluma y autoinyector reutilizables tienen aplicaciones en la entrega subcutánea de una composición farmacéutica de la presente invención. Los ejemplos incluyen, pero sin limitación, AUTOPEN™ (Owen Mumford, Inc., Woodstock, RU), pluma DISETRONIC™ (Disetronic Medical Systems, Bergdorf, Suiza), pluma HUMALOG MIX 75/25™, pluma HUMALOG™, pluma HUMALIN 70/30™ (Eli Lilly y Co., Indianápolis, IN), NOVOPEN™ I, II y III (Novo Nordisk, Copenhague, Dinamarca), NOVOPEN JUNIOR™ (Novo Nordisk, Copenhague, Dinamarca), pluma BD™ (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ), OPTIPEN™, OPTIPEN PRO™, OPTIPEN STARLET™ y OPTICLIK™ (sanofi-aventis, Frankfurt, Alemania), por nombrar solo algunos. Los ejemplos de dispositivos de administración de pluma desechables que tienen aplicaciones en la administración subcutánea de una composición farmacéutica de la presente invención incluyen, pero sin limitación, la pluma SOLOSTAR™ (sanofiaventis), FLEXPEN™ (Novo Nordisk) y KWIKPEN™ (Eli Lilly), el autoinyector SURECLICK™ (Amgen, Thousand Oaks, CA), PENLET™ (Haselmeier, Stuttgart, Alemania), EPIPEN (Dey, L.P.), y la pluma HUMIRA™ (Abbott Labs, Abbott Park IL), por nombrar solo algunos.
En ciertas situaciones, la composición farmacéutica puede administrarse en un sistema de liberación controlada. En una realización, puede usarse una bomba (véase Langer, anteriormente; Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng.
14:201 (1987)). En otra realización, pueden usarse materiales poliméricos; véase, Medical Applications of Controlled Release, Langer y Wise (eds.), 1974, CRC Pres., Boca Raton, Florida. En aún otra realización, se puede colocar un sistema de liberación controlada próximo a la diana de la composición, siendo necesaria, por lo tanto, solo una fracción de la dosis sistémica (véase, por ejemplo, Goodson, 1984, en Medical Applications of Controlled Release, anteriormente, vol. 2, pág. 115-138). Se analizan otros sistemas de liberación controlada en la revisión de Langer, Science 249:1527-1533 (1990).
Las preparaciones inyectables pueden incluir formas farmacéuticas para inyecciones intravenosas, subcutáneas, intracutáneas e intramusculares, infusiones por goteo, etc. Estas preparaciones inyectables pueden prepararse por métodos conocidos públicamente. Por ejemplo, las preparaciones inyectables pueden prepararse, por ejemplo, disolviendo, suspendiendo o emulsionando el anticuerpo o su sal descrita anteriormente en un medio acuoso estéril o un medio oleoso utilizado convencionalmente para inyecciones. Como medio acuoso para inyecciones, existen, por ejemplo, una solución salina fisiológica, una solución isotónica que contiene glucosa y otros agentes auxiliares, etc., que pueden usarse en combinación con un agente solubilizante apropiado tal como un alcohol (por ejemplo, etanol), un polialcohol (por ejemplo, propilenglicol, polietilenglicol), un tensioactivo no iónico [por ejemplo, polisorbato 80, HCO-50 (aducto de polioxietileno (50 mol) de aceite de ricino hidrogenado)], etc. Como medio oleoso, se emplean, por ejemplo, aceite de sésamo, aceite de soja, etc., que pueden usarse en combinación con un agente solubilizante tal como benzoato de bencilo, alcohol bencílico, etc. La inyección preparada de este modo se carga preferentemente en una ampolla apropiada.
Ventajosamente, las composiciones farmacéuticas para su uso oral o parenteral descritas anteriormente se preparan en formas farmacéuticas en una dosis unitaria adecuada para ajustarse a una dosis de los principios activos. Dichas formas farmacéuticas en una dosis unitaria incluyen, por ejemplo, comprimidos, píldoras, cápsulas, inyecciones (ampollas), supositorios, etc. La cantidad del anticuerpo mencionado anteriormente contenida generalmente es de aproximadamente 5 a aproximadamente 500 mg por forma farmacéutica en una dosis unitaria; especialmente en forma de inyección, se prefiere que el anticuerpo mencionado anteriormente esté contenido en aproximadamente 5 a aproximadamente 100 mg y en aproximadamente 10 a aproximadamente 250 mg para las otras formas farmacéuticas.
Usos terapéuticos de los anticuerpos
Los anticuerpos de la invención son útiles, entre otras cosas, para el tratamiento, prevención y/o mejora de cualquier enfermedad o trastorno asociado o mediado por la expresión, señalización o actividad de Activina A, o tratable bloqueando la interacción entre Activina A y un receptor de Activina A (por ejemplo, ActRIIA, ActRIIB, receptor de activina de tipo I, etc.) o inhibiendo de otro modo la actividad y/o señalización de Activina A. Por ejemplo, la presente divulgación proporciona métodos para tratar afecciones o aflicciones que pueden curarse, aliviarse o mejorarse aumentando la fuerza/potencia muscular y/o la masa muscular y/o la función muscular en un individuo, o alterando favorablemente el metabolismo (procesamiento de carbohidratos, lípidos y proteínas) uniendo específicamente la Activina A y no uniendo otros ligandos de ActRIIB, o uniendo específicamente la Activina A y GDF8 y no uniendo otros ligandos de ActRIIB. Por ejemplo, métodos para aumentar la fuerza/potencia muscular y/o la masa muscular y/o la función muscular en un sujeto, o para tratar una enfermedad o trastorno caracterizado por disminución de la masa o fuerza muscular en un sujeto, administrando al sujeto una proteína de unión específica de Activina A. También métodos para aumentar la fuerza/potencia muscular y/o la masa muscular y/o la función muscular en un sujeto, o para tratar una enfermedad o trastorno caracterizado por disminución de la masa o fuerza muscular en un sujeto, administrando al sujeto una proteína de unión específica de Activina A y una proteína de unión específica de g DF8. Cualquiera de las proteínas de unión específicas de Activina A y/o proteínas de unión específicas de GDF8 divulgadas o mencionadas en el presente documento pueden usarse en el contexto de estos aspectos de la divulgación. Por ejemplo, los métodos terapéuticos incluyen administrar a un sujeto un anticuerpo anti-Activina A y/o un anticuerpo anti-GDF8.
Por lo tanto, en el contexto de los métodos de tratamiento descritos en el presente documento, el anticuerpo antiactivina A puede administrarse como monoterapia (es decir, como el único agente terapéutico) o en combinación con uno o más agentes terapéuticos adicionales (por ejemplo, un anticuerpo anti-GDF8), cuyos ejemplos adicionales se describen en cualquiera parte del presente documento.
En los métodos que comprenden la administración de una proteína de unión específica de Activina A y una proteína de unión específica de GDF8 a un sujeto, la proteína de unión específica de Activina A y la proteína de unión específica de GDF8 pueden administrarse al sujeto al mismo tiempo o sustancialmente al mismo tiempo, por ejemplo, en una sola dosificación terapéutica, o en dos dosificaciones distintas que se administran simultáneamente o en un intervalo de tiempo menor de aproximadamente 5 minutos entre ellas. Como alternativa, la proteína de unión específica de Activina A y la proteína de unión específica de GDF8 pueden administrarse al sujeto secuencialmente, por ejemplo, en dosificaciones terapéuticas distintas, separadas entre sí en un intervalo de tiempo mayor de aproximadamente 5 minutos.
La presente divulgación incluye métodos para aumentar la fuerza/potencia muscular y/o la masa muscular y/o la función muscular en un sujeto, o para tratar una enfermedad o trastorno caracterizado por disminución de la masa o fuerza muscular en un sujeto, mediante la administración al sujeto de una molécula de unión a antígeno que comprende un dominio de unión específico de Activina A y un dominio de unión específico de GDF8. Puede usarse cualquiera de las moléculas de unión a antígeno divulgadas o mencionadas en el presente documento. Por ejemplo, los métodos terapéuticos incluyen administrar a un sujeto un anticuerpo biespecífico que comprende un primer dominio variable que comprende un par de HCVR/LCVR que se une específicamente a Activina A y un segundo dominio variable que comprende un par de HCVR/LCVR que se une específicamente a GDF8.
Las composiciones de la presente invención pueden administrarse a un sujeto junto con uno o más agentes terapéuticos adicionales, incluyendo, por ejemplo, inhibidores de factores de crecimiento, inmunosupresores, agentes antiinflamatorios, inhibidores metabólicos, inhibidores enzimáticos, y agentes citotóxicos/citostáticos. El uno o más agentes terapéuticos adicionales pueden administrarse antes, simultáneamente con o después de la administración de las proteínas de unión específicas de Activina A y GDF8 de la presente invención.
Los ejemplos de enfermedades, trastornos y afecciones que pueden tratarse con las composiciones de la presente invención incluyen, pero sin limitación, sarcopenia, caquexia (idiopática o secundaria a otras afecciones, por ejemplo, cáncer, insuficiencia renal crónica, o enfermedad pulmonar obstructiva crónica), lesión muscular, traumatismo muscular, desgaste muscular y atrofia muscular, por ejemplo, atrofia o desgaste muscular provocado por, o asociado a, inactividad (desuso), por ejemplo, muscular, inmovilización, reposo en cama, lesión, tratamiento médico o intervención quirúrgica (por ejemplo, fractura de cadera, reemplazo de cadera, reemplazo de rodilla, y otras lesiones de articulaciones, tendones o ligamentos, tales como desgarros en el ligamento cruzado anterior (ACL) y/o el ligamento colateral medial (MCL), etc.), distrofia muscular (por ejemplo, miotónica, de Duchenne, de Becker, de cinturas, facioescapulohumeral (FSHD, también conocida como enfermedad de Landouzy-Dejerine), congénita, oculofaríngea, distal, de Emery-Dreifuss, etc.), miopatía inducida por glucocorticoides, rehabilitación por ictus (por ejemplo, rehabilitación por hemiparesia por ictus) o por necesidad de ventilación mecánica. Las composiciones de la invención también se pueden usar para tratar, prevenir o mejorar enfermedades tales como cáncer, obesidad, diabetes, artritis, esclerosis múltiple, distrofia muscular, esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad de Parkinson, osteoporosis, osteoartritis, osteopenia y síndromes metabólicos (incluyendo, pero sin limitación, diabetes, obesidad, trastornos nutricionales, atrofia de órganos, enfermedad pulmonar obstructiva crónica y anorexia). Enfermedades, trastornos y afecciones adicionales que se pueden prevenir, tratar y/o mejorar usando composiciones de la presente invención incluyen septicemia, insuficiencia cardíaca crónica, feocromocitoma benigno y maligno, fibromas uterinos/leiomiomas, preeclampsia, queloides y cicatrices hipertróficas, e hipertensión arterial pulmonar.
Especificidad mejorada de unión y actividad
La presente divulgación incluye métodos para aumentar la fuerza/potencia muscular y/o la masa muscular y/o la función muscular en un sujeto, o para tratar una enfermedad o trastorno caracterizado por disminución de la masa o fuerza muscular en un sujeto, o para tratar una enfermedad o trastorno provocado, promovido o agravado por la actividad de Activina A, sin provocar efectos adversos asociados a la administración de moléculas que se unen a múltiples (por ejemplo, 3 o más) ligandos de ActRIIB. En otras palabras, los métodos que utilizan anticuerpos anti-Activina A o proteínas de unión a antígeno de los mismos (por ejemplo, en los que el anticuerpo anti-Activina A solo se une significativamente a la Activina A) pueden tratar una enfermedad o trastorno sin provocar efectos no deseados o adversos observados con moléculas que se unen múltiples ligandos de ActRIIB. Por ejemplo, la molécula clínica denominada ACE-031 (Acceleron Pharma, Inc., Cambridge, MA) es un multímero que consiste en la parte extracelular de ActRIIB fusionada a un dominio Fc de IgG (en el presente documento esta molécula también se denomina "ActRIIB-Fc"). ActRIIB-Fc se une a Activina A, así como a otros ligandos de ActRIIB tales como, por ejemplo, Activina B, GDF8, GDF11, BMP9, BMP10 y TGFp, y se sabe que provoca diversos efectos adversos cuando se administra a pacientes humanos. De manera significativa, los presentes inventores han descubierto inesperadamente que inhibir específicamente Activina A y GDF8 (por ejemplo, administrando un anticuerpo anti-Activina A y un anticuerpo anti-GDF8), mientras que no se inhiben otros ligandos de ActRIIB tales como Activina B, GDF11, BMP9, BMP10 y TGFp, produce un aumento en la masa muscular que es al menos equivalente al observado mediante la administración de ActRIIB-Fc, sin provocar los efectos adversos asociados con agentes aglutinantes tal como ActRIIB-Fc.
Terapias y formulaciones de combinación
La presente divulgación incluye composiciones y formulaciones terapéuticas que comprenden cualquiera de los anticuerpos anti-Activina A descritos en el presente documento en combinación con uno o más componentes terapéuticamente activos adicionales, y métodos de tratamiento que comprenden administrar dichas combinaciones a sujetos que lo necesiten. La presente divulgación también incluye composiciones y formulaciones terapéuticas que comprenden cualquiera de los anticuerpos anti-Activina A descritos en el presente documento en combinación con uno o más componentes terapéuticamente activos adicionales, y métodos de tratamiento que comprenden administrar dichas combinaciones a sujetos que lo necesiten. Por ejemplo, los anticuerpos anti-Activina A de la invención también se pueden administrar y/o formular conjuntamente en combinación con antivirales, antibióticos, analgésicos, corticoesteroides, esteroides, oxígeno, antioxidantes, quelatos metálicos, IFN-gamma y/o AINE. Los anticuerpos anti-Activina A de la invención también pueden administrarse como parte de un régimen de tratamiento que también incluye tratamiento con radiación y/o quimioterapia convencional (por ejemplo, en el contexto de métodos para tratar el cáncer o inhibir el crecimiento tumoral). Cualquiera de los componentes terapéuticamente activos adicionales mencionados anteriormente puede administrarse en combinación con cualquiera de los anticuerpos anti-Activina A de la presente invención para el tratamiento de cualquier enfermedad o trastorno en el que la administración de un anticuerpo anti-Activina A sea beneficiosa, incluyendo, por ejemplo, sarcopenia, caquexia, lesión muscular, desgaste muscular y atrofia muscular. Cualquiera de los componentes terapéuticamente activos adicionales mencionados anteriormente también puede administrarse en combinación con cualquiera de los anticuerpos anti-Activina A de la presente invención junto con un inhibidor de GDF8 (por ejemplo, un anticuerpo anti-GDF8).
El componente o componentes terapéuticamente activos adicionales se pueden administrar a un sujeto antes de la administración de un anticuerpo anti-Activina A de la presente invención. Por ejemplo, se puede considerar que un primer componente se administra "antes" de un segundo componente si el primer componente se administra 1 semana antes, 72 horas antes, 60 horas antes, 48 horas antes, 36 horas antes, 24 horas antes, 12 horas antes, 6 horas antes, 5 horas antes, 4 horas antes, 3 horas antes, 2 horas antes, 1 hora antes, 30 minutos antes, 15 minutos antes, 10 minutos antes, 5 minutos antes, o menos de 1 minuto antes de la administración del segundo componente. En otras realizaciones, el componente o componentes terapéuticamente activos adicionales se pueden administrar a un sujeto después de la administración de un anticuerpo anti-Activina A de la presente invención. Por ejemplo, se puede considerar que un primer componente se administra "después" de un segundo componente si el primer componente se administra 1 minuto después, 5 minutos después, 10 minutos después, 15 minutos después, 30 minutos después, 1 hora después, 2 horas después, 3 horas después, 4 horas después, 5 horas después, 6 horas después, 12 horas después, 24 horas después, 36 horas después, 48 horas después, 60 horas después, 72 horas después de la administración del segundo componente. En aún otras realizaciones, el componente o componentes terapéuticamente activos adicionales se pueden administrar a un sujeto concurrente con la administración del anticuerpo anti-Activina A de la presente invención. La administración "concurrente", para los fines de la presente invención, incluye, por ejemplo, la administración de un anticuerpo anti-Activina A y un componente terapéuticamente activo adicional a un sujeto en una forma de dosificación única, o en formas de dosificación separadas administradas al sujeto en aproximadamente 30 minutos o menos entre sí. Si se administran en formas de dosificación separadas, cada forma de dosificación puede administrarse por la misma vía (por ejemplo, tanto el anticuerpo anti-Activina A como el componente terapéuticamente activo adicional se pueden administrar por vía intravenosa, subcutánea, intravítrea, etc.); como alternativa, cada forma de dosificación puede administrarse mediante una vía diferente (por ejemplo, el anticuerpo anti-Activina A puede administrarse por vía local (por ejemplo, intravítrea) y el componente terapéuticamente activo adicional puede administrarse sistémicamente). En cualquier caso, la administración de los componentes en una forma dosificación única, en formas de dosificación separadas por la misma vía, o en formas de dosificación separadas por vías diferentes, se considera "administración concurrente", para los fines de la presente divulgación. Para los fines de la presente divulgación, la administración de un anticuerpo anti-Activina A "antes de", "concurrente con" o "después de" (como se han definido esos términos en el presente documento anteriormente) la administración de un componente terapéuticamente activo adicional se considera la administración de un anticuerpo anti-Activina A "en combinación con" un componente terapéuticamente activo adicional).
La presente invención incluye composiciones farmacéuticas en las que un anticuerpo anti-Activina A de la presente invención se formula conjuntamente con uno o más del componente o los componentes terapéuticamente activos adicionales como se describe en otra parte del presente documento.
Dosificación
La cantidad de principio activo (por ejemplo, anticuerpos anti-Activina A, anticuerpos anti-GDF8 administrados en combinación con anticuerpos anti-Activina A o anticuerpos biespecíficos que se unen específicamente a Activina A y GDF8) que puede administrarse a un sujeto es, generalmente, una cantidad terapéuticamente eficaz. Como se usa en el presente documento, la frase "cantidad terapéuticamente eficaz" significa una dosis de proteínas de unión específica de antígeno y/o moléculas de unión a antígeno, que da como resultado un aumento detectable en uno o más de los siguientes parámetros: peso corporal, masa muscular (por ejemplo, masa del músculo tibial anterior [TA], masa del músculo gastrocnemio [GA], masa del músculo cuádriceps [Cuád.], etc.), fuerza/potencia muscular y/o función muscular. Por ejemplo, una "cantidad terapéuticamente eficaz" de una proteína de unión específica de Activina A y/o una proteína de unión específica de GDF8 incluye, por ejemplo, una cantidad de proteína de unión específica de Activina A y/o proteína de unión específica de GDF8 que, cuando se administra a un sujeto de prueba, produce un aumento en la masa muscular TA o GA de al menos el 2 %, 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 % o más, en comparación con sujetos tratados con control, por ejemplo, como se ilustra en el Ejemplo 7, en el presente documento.
En el caso de los anticuerpos de la presente invención (por ejemplo, anticuerpos anti-Activina A o anticuerpos biespecíficos que se unen específicamente a Activina A y GDF8), una cantidad terapéuticamente eficaz puede ser de aproximadamente 0,05 mg a aproximadamente 600 mg; por ejemplo, aproximadamente 0,05 mg, aproximadamente 0,1 mg, aproximadamente 1,0 mg, aproximadamente 1,5 mg, aproximadamente 2,0 mg, aproximadamente 10 mg, aproximadamente 20 mg, aproximadamente 30 mg, aproximadamente 40 mg, aproximadamente 50 mg, aproximadamente 60 mg, aproximadamente 70 mg, aproximadamente 80 mg, aproximadamente 90 mg, aproximadamente 100 mg, aproximadamente 110 mg, aproximadamente 120 mg, aproximadamente 130 mg, aproximadamente 140 mg, aproximadamente 150 mg, aproximadamente 160 mg, aproximadamente 170 mg aproximadamente 180 mg, aproximadamente 190 mg, aproximadamente 200 mg, aproximadamente 210 mg aproximadamente 220 mg, aproximadamente 230 mg, aproximadamente 240 mg, aproximadamente 250 mg aproximadamente 260 mg, aproximadamente 270 mg, aproximadamente 280 mg, aproximadamente 290 mg aproximadamente 300 mg, aproximadamente 310 mg, aproximadamente 320 mg, aproximadamente 330 mg aproximadamente 340 mg, aproximadamente 350 mg, aproximadamente 360 mg, aproximadamente 370 mg aproximadamente 380 mg, aproximadamente 390 mg, aproximadamente 400 mg, aproximadamente 410 mg aproximadamente 420 mg, aproximadamente 430 mg, aproximadamente 440 mg, aproximadamente 450 mg aproximadamente 460 mg, aproximadamente 470 mg, aproximadamente 480 mg, aproximadamente 490 mg aproximadamente 500 mg, aproximadamente 510 mg, aproximadamente 520 mg, aproximadamente 530 mg aproximadamente 540 mg, aproximadamente 550 mg, aproximadamente 560 mg, aproximadamente 570 mg aproximadamente 580 mg, aproximadamente 590 mg, aproximadamente 600 mg, aproximadamente 610 mg aproximadamente 620 mg, aproximadamente 630 mg, aproximadamente 640 mg, aproximadamente 650 mg aproximadamente 660 mg, aproximadamente 670 mg, aproximadamente 680 mg, aproximadamente 690 mg aproximadamente 700 mg, aproximadamente 710 mg, aproximadamente 720 mg, aproximadamente 730 mg aproximadamente 740 mg, aproximadamente 750 mg, aproximadamente 760 mg, aproximadamente 770 mg aproximadamente 780 mg, aproximadamente 790 mg, aproximadamente 800 mg, aproximadamente 810 mg aproximadamente 820 mg, aproximadamente 830 mg, aproximadamente 840 mg, aproximadamente 850 mg aproximadamente 860 mg, aproximadamente 870 mg, aproximadamente 880 mg, aproximadamente 890 mg aproximadamente 900 mg, aproximadamente 910 mg, aproximadamente 920 mg, aproximadamente 930 mg aproximadamente 940 mg, aproximadamente 950 mg, aproximadamente 960 mg, aproximadamente 970 mg, aproximadamente 980 mg aproximadamente 990 mg, o aproximadamente 1000 mg, del anticuerpo respectivo.
La cantidad de anticuerpo de la presente invención (por ejemplo, anticuerpos anti-Activina A o anticuerpos biespecíficos que se unen específicamente a Activina A y GDF8) contenida en las dosis individuales puede expresarse en términos de miligramos de anticuerpo por kilogramo de peso corporal del paciente (es decir, mg/kg). Por ejemplo, los anticuerpos anti-Activina A y/o biespecíficos anti-activina A/anti-GDF8 de la presente invención pueden administrarse a un paciente en una dosis de aproximadamente 0,0001 a aproximadamente 50 mg/kg de peso corporal del paciente (por ejemplo, 0,1 mg/kg, 0,5 mg/kg, 1,0 mg/kg, 1,5 mg/kg, 2,0 mg/kg, 2,5 mg/kg, 3.0 mg/kg, 3,5 mg/kg, 4,0 mg/kg, 4,5 mg/kg, 5,0 mg/kg, 5,5 mg/kg, 6,0 mg/kg, 6,5 mg/kg, 7,0 mg/kg, 7,5 mg/kg, 8.0 mg/kg, 8,5 mg/kg, 9,0 mg/kg, 9,5 mg/kg, 10,0 mg/kg, 10,5 mg/kg, 11,0 mg/kg, 11,5 mg/kg, 12,0 mg/kg, 12,5 mg/kg, 13,0 mg/kg, 13,5 mg/kg, 14,0 mg/kg, 14,5 mg/kg, 15,0 mg/kg, 15,5 mg/kg, 16,0 mg/kg, 16,5 mg/kg, 17.0 mg/kg, 17,5 mg/kg, 18,0 mg/kg, 18,5 mg/kg, 19,0 mg/kg, 19,5 mg/kg, 20,0 mg/kg, etc.).
Las composiciones de la presente invención pueden comprender cantidades iguales de proteína de unión específica de Activina A y proteína de unión específica de GDF8. Como alternativa, la cantidad de proteína de unión específica de Activina A en la composición puede ser inferior o superior a la cantidad de proteína de unión específica de GDF8. Un experto habitual en la técnica, usando experimentación habitual, podrá determinar las cantidades apropiadas de los componentes individuales en las composiciones de la presente invención, que son necesarias para producir un efecto terapéutico deseado.
Regímenes de administración
De acuerdo con ciertas realizaciones de la presente invención, múltiples dosis de un principio activo (por ejemplo, un anticuerpo anti-Activina A, un anticuerpo anti-GDF8 administrado en combinación con un anticuerpo anti-Activina A, una composición farmacéutica que comprende una combinación de anticuerpo anti-Activina A y cualquiera de los agentes terapéuticamente activos adicionales mencionados en el presente documento, incluyendo, por ejemplo, un anticuerpo anti-GDF8, o un anticuerpo biespecífico que se une específicamente a Activina A y GDF8) se puede administrar a un sujeto durante un periodo de tiempo definido. Los métodos de acuerdo con este aspecto de la invención comprenden administrar secuencialmente a un sujeto múltiples dosis de un principio activo de la invención. Como se usa en el presente documento, "administrar secuencialmente" significa que cada dosis de un principio activo se administra al sujeto en un momento diferente en el tiempo, por ejemplo, en días diferentes separados por un intervalo predeterminado (por ejemplo, horas, días, semanas o meses). Los métodos pueden comprender administrar secuencialmente al paciente una única dosis inicial de un principio activo, seguida de una o más dosis secundarias del principio activo y, opcionalmente, seguida de una o más dosis terciarias del principio activo.
Los términos "dosis inicial", "dosis secundarias", y "dosis terciarias", se refieren a la secuencia temporal de administración del principio activo, por ejemplo, el anticuerpo anti-Activina A de la invención o de una terapia de combinación de la invención, por ejemplo, un anticuerpo anti-Activina A y un anticuerpo anti-GDF8. Por lo tanto, la "dosis inicial" es la dosis que se administra al inicio del régimen de tratamiento (también mencionada como la "dosis basal"); las "dosis secundarias" son las dosis que se administran después de la dosis inicial; y las "dosis terciarias" son las dosis que se administran después de las dosis secundarias. Las dosis inicial, secundaria y terciaria pueden contener todas la misma cantidad del principio activo, por ejemplo, un anticuerpo anti-Activina A, pero generalmente pueden diferir entre sí en términos de frecuencia de administración. En ciertas realizaciones, sin embargo, la cantidad del principio activo, por ejemplo, un anticuerpo anti-Activina A, contenida en las dosis inicial, secundaria y/o terciaria varía entre sí (por ejemplo, ajustada hacia arriba o hacia abajo según sea apropiado) durante el curso de tratamiento. En ciertas realizaciones, se administran dos o más dosis (por ejemplo, 2, 3, 4 o 5) al comienzo del régimen de tratamiento como "dosis de carga" seguidas de dosis posteriores que se administran con menos frecuencia (por ejemplo, "dosis de mantenimiento").
En ciertos casos ejemplares, cada dosis secundaria y/o terciaria se administra de 1 a 26 (por ejemplo, 1, 1 /, 2, 2 / , 3, 3 / , 4, 4 / , 5, 51/2, 6, 61/2, 7, 71/2, 8, 81/2, 9, 91/2, 10, 101/2, 11, 11 /, 12, 121/2, 13, 131/2, 14, 141/2, 15, 151/2, 16, 161/2, 17, 171/2, 18, 18 /, 19, 19 /, 20, 20 /, 21, 21 /, 22, 22 /, 23, 23 /, 24, 24 /, 25, 25 /, 26, 26 / o más) semanas después de la dosis inmediatamente anterior. La frase "la dosis inmediatamente anterior", como se usa en el presente documento, significa, en una secuencia de administraciones múltiples, la dosis del principio activo, por ejemplo, un anticuerpo anti-Activina A, que se administra a un paciente antes de la administración de la siguiente dosis de la secuencia sin dosis intermedias.
Los métodos pueden comprender administrar a un paciente cualquier número de dosis secundarias y/o terciarias de un principio activo de la invención, por ejemplo, un anticuerpo anti-Activina A. Por ejemplo, en ciertos casos, solo se administra al paciente una única dosis secundaria. En otros casos, se administran dos o más (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o más) dosis secundarias al paciente. Asimismo, en ciertos casos, solo se administra una dosis terciaria única al paciente. En otros casos, se administran dos o más (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o más) dosis terciarias al paciente.
En los casos que implican múltiples dosis secundarias, cada dosis secundaria puede administrarse con la misma frecuencia que las otras dosis secundarias. Por ejemplo, cada dosis secundaria puede administrarse al paciente de 1 a 2 semanas o de 1 a 2 meses después de la dosis inmediatamente anterior. De manera similar, en casos que implican múltiples dosis terciarias, cada dosis terciaria puede administrarse con la misma frecuencia que las otras dosis terciarias. Por ejemplo, cada dosis terciaria puede administrarse al paciente de 2 a 12 semanas después de la dosis inmediatamente anterior. En ciertos casos, la frecuencia con la que se administran las dosis secundarias y/o terciarias a un paciente puede variar durante el curso del régimen de tratamiento. La frecuencia de administración también puede ajustarse durante el curso de tratamiento por un médico dependiendo de las necesidades del paciente individual después de examen clínico.
La presente divulgación incluye regímenes de administración en los que se administran de 2 a 6 dosis de carga a un paciente una primera frecuencia (por ejemplo, una vez a la semana, una vez cada dos semanas, una vez cada tres semanas, una vez al mes, una vez cada dos meses, etc.), seguido de la administración de dos o más dosis de mantenimiento al paciente con menor frecuencia. Por ejemplo, si las dosis de carga se administran con una frecuencia de una vez al mes, entonces las dosis de mantenimiento pueden administrarse al paciente una vez cada seis semanas, una vez cada dos meses, una vez cada tres meses, etc.).
Usos de diagnóstico de los anticuerpos
Los anticuerpos anti-Activina A de la presente invención también pueden usarse para detectar y/o medir Activina A, o células que expresan Activina A en una muestra, por ejemplo, con fines de diagnóstico. Por ejemplo, un anticuerpo anti-Activina A, o un fragmento del mismo, puede usarse para diagnosticar una afección o enfermedad caracterizada por la expresión anómala (por ejemplo, sobreexpresión, subexpresión, ausencia de expresión, etc.) de Activina A.
Los ensayos de diagnóstico ejemplares para Activina A pueden comprender, por ejemplo, poner en contacto una muestra, obtenida de un paciente, con un anticuerpo anti-Activina A de la invención, en los que el anticuerpo anti-Activina A está marcado con un marcador detectable o molécula indicadora. Como alternativa, puede usarse un anticuerpo anti-Activina A no marcado en aplicaciones de diagnóstico en combinación con un anticuerpo secundario que está marcado en sí mismo de forma detectable. El marcador detectable o molécula indicadora puede ser un radioisótopo, tal como 3H, 14C, 32P, 35S o 125I; un resto fluorescente o quimioluminiscente tal como isotiocianato de fluoresceína, o rodamina; o una enzima tal como una fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa, peroxidasa de rábano picante o luciferasa. Los ensayos ejemplares específicos que pueden usarse para detectar o medir la Activina A en una muestra incluyen ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), radioinmunoensayo (RIA) y clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS).
Las muestras que pueden usarse en ensayos de diagnóstico de Activina A incluyen cualquier tejido o muestra de fluido que se puede obtener de un paciente que contiene cantidades detectables de proteína Activina A o fragmentos de la misma, en condiciones normales o patológicas. Generalmente, los niveles de Activina A en una muestra particular obtenida de un paciente sano (por ejemplo, un paciente que no padece una enfermedad o afección asociada con niveles o actividad anormales de Activina A) se medirán para establecer inicialmente un nivel basal o estándar de Activina A. A continuación, este nivel basal de Activina A se puede comparar con los niveles de Activina A medidos en muestras obtenidas de individuos que se sospecha que tienen una enfermedad o afección relacionada con Activina A.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos se presentan para proporcionar a los expertos en la técnica una divulgación y descripción completa de cómo preparar y usar los métodos y las composiciones de la invención, y no se pretende que limiten el alcance de lo que los inventores consideran su invención. Se han realizado esfuerzos para garantizar la precisión con respecto a los números utilizados (por ejemplo, cantidades, temperatura, etc.) pero deben tenerse en cuenta algunos errores y desviaciones experimentales. A menos que se indique de otro modo, las partes son partes en peso, el peso molecular es peso molecular promedio, la temperatura está en grados centígrados, y la presión es atmosférica o cercana a la atmosférica.
Ejemplo 1. Generación de anticuerpos humanos contra Activina A
Se administró directamente un inmunógeno que comprendía la proteína Activina A (dímero de inhibina-pA), con un adyuvante para estimular la repuesta inmunitaria, a un ratón VELOCIMMUNE® que comprendía ADN que codificaba las regiones variables de cadena pesada y cadena ligera kappa de inmunoglobulina humana. La respuesta inmunitaria del anticuerpo se controló mediante un inmunoensayo específico de Activina A. Cuando se consiguió una respuesta inmunitaria deseada, se recogieron los esplenocitos y se fusionaron con células de mieloma de ratón para conservar su viabilidad y formar líneas celulares de hibridoma. Las líneas celulares de hibridoma se cribaron y seleccionaron para identificar líneas celulares que producían anticuerpos específicos de Activina A. Usando esta técnica, se obtuvieron varios anticuerpos quiméricos anti-Activina A (es decir, anticuerpos que poseen dominios variables humanos y dominios constantes de ratón). Un anticuerpo ejemplar obtenido de esta manera es H2aM10965N. Los dominios variables humanos de los anticuerpos quiméricos se clonaron posteriormente en dominios constantes humanos para producir anticuerpos anti-Activina A completamente humanos como se describe en el presente documento.
También se aislaron anticuerpos anti-Activina A directamente de linfocitos B positivos a antígeno sin fusión a células de mieloma, como se describe en el documento US 2007/0280945A1. Usando este método, se obtuvieron varios anticuerpos anti-Activina A completamente humanos (es decir, anticuerpos que poseen dominios variables humanos y dominios constantes humanos); los anticuerpos ejemplares generados de esta manera se denominaron del siguiente modo: H4H10423P, H4H10429P, H4H10430P, H4H10432P2, H4H10440P2, H4H10442P2, H4H10436P2, y H4H10446P2.
Determinadas propiedades biológicas de los anticuerpos anti-Activina A ejemplares generados de acuerdo con los métodos de este Ejemplo se describen en detalle en los Ejemplos que se exponen a continuación.
Ejemplo 2. Secuencias de aminoácidos de región variable de cadena pesada y ligera
La Tabla 1 expone los pares de secuencias de aminoácidos de la región variable de cadena pesada y ligera de anticuerpos anti-Activina A seleccionados y sus identificadores de anticuerpo correspondientes. Los identificadores de secuencia de ácidos nucleicos correspondientes se exponen en la Tabla 2.
Tabla 1: Identificadores de secuencia de aminoácidos
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(continuación)
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Tabla 2: Identificadores de secuencia de ácidos nucleicos
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Los anticuerpos se denominan típicamente en el presente documento de acuerdo con la siguiente nomenclatura: prefijo Fc (por ejemplo, "HIM", "H2aM", "H4H"), seguido de un identificador numérico (por ejemplo, "10423", "10424", o "10426" como se muestra en las Tablas 1 y 2), seguido de un sufijo "P", "P2" o "N". Por lo tanto, de acuerdo con esta nomenclatura, un anticuerpo puede denominarse en el presente documento, por ejemplo, "H4H10423P", " H4H10432P2", "H2aM10965N", etc. Los prefijos H1M, H2M y H4H en las denominaciones de anticuerpo usadas en el presente documento indican la región Fc particular del anticuerpo. Por ejemplo, un anticuerpo "H2aM" tiene una Fc de IgG2a de ratón, mientras que un anticuerpo "H4H" tiene una Fc de IgG4 humana. Como apreciará un experto en la técnica, un anticuerpo que tiene un isotipo Fc particular puede convertirse en un anticuerpo con un isotipo Fc diferente (por ejemplo, un anticuerpo con un Fc de IgG2a de ratón puede convertirse en un anticuerpo con una IgG4 humana, etc.), pero en cualquier caso, los dominios variables (incluidas las CDR), que están indicados por los identificadores numéricos que se muestran en la Tabla 1, seguirán siendo los mismos, y se espera que las propiedades de unión sean idénticas o sustancialmente similares independientemente de la naturaleza del dominio Fc.
Construcciones de control utilizadas en los siguientes ejemplos
Se incluyeron moléculas de control de anti-activina A en los siguientes Ejemplos con fines comparativos. El anticuerpo de control denominado en el presente documento como Control 1 es un anticuerpo anti-Activina A humano con secuencias de dominio variable de cadena pesada y ligera de "A1" como se expone en el documento US 8.309.082. El Control 2 es un anticuerpo anti-receptor de Activina humana de tipo II B (mAb anti-ActR2B) divulgado como MOR8159 en la Solicitud de Patente de Ee .UU. N.° 2012/0237521 A1. El Control 3 es un anticuerpo monoclonal anti-activina A murino de R&D Systems, Mineápolis, MN (número de catálogo MAB3381). El Control 4 es una molécula del receptor de Activina de tipo IIB-fusión Fc (un dominio extracelular del receptor de Activina RIIB soluble producido con una proteína de fusión Fc de IgG1 humana C-terminal (E23-P133 de n P_001097 seguida de un enlazador Gly-Ser seguido de una proteína de fusión Fc de IgG1 humana C-terminal), cuya secuencia se proporciona como SEQ ID NO:227.
Ejemplo 3. Unión de anticuerpos a Activina A humana según lo determinado por resonancia de plasmón superficial
Se determinaron las afinidades de unión y las constantes cinéticas para la unión del antígeno a anticuerpos monoclonales anti-Activina A humana purificados seleccionados usando un ensayo de biosensor de resonancia de plasmón superficial en tiempo real (Biacore T200 o Biacore 4000, GE Healthcare Life Sciences, Piscataway, NJ) a 25 °C y a 37 °C. Los anticuerpos, expresados como Fc de ratón (prefijo H2aM) o Fc humano (prefijo H4H), se capturaron en sus respectivas superficies de sensor anti-Fc (formato de captura de mAb). Los anticuerpos anti-Activina A se capturaron en una superficie de anticuerpo policlonal de cabra anti-IgG de ratón (GE Healthcare, N.° BR-1008-38) o de anticuerpo monoclonal de ratón anti-IgG humana (GE Healthcare, N.° BR-1008-39) creada a través del acoplamiento de amina directo a un chip sensor Biacore CM5. Los experimentos cinéticos se realizaron usando HBS-EP (HEPES 10 mM, NaCl 150 mM, EDTA 3 mM, tensioactivo P20 al 0,05 %, a pH 7,4) o PBS-P (fosfato de sodio 10 mM, KCI 2,7 mM, NaCl 137 mM, NaN3 al 0,02 %, tensioactivo P20 al 0,05 %, pH 7,4), tanto como tampón de procesamiento como tampón de muestra. Las velocidades de asociación antígeno-anticuerpo se midieron inyectando varias concentraciones (diluciones de 4 veces que variaron de 50 a 0,2 nM) de Activina A (R&D Systems, N.° 338-AC-050/CF), Activina B (R&D Systems, N.° 659-AB-025/CF), Activina AB (R&D Systems, N.° 1006-AB-005), Activina AC (R&D Systems, N.° 4879-AC/CF), o Inhibina E (Novus Biologicals, N.° H00083729-P01) sobre la superficie del anticuerpo capturado. Se controló la asociación anticuerpo-antígeno durante 240 segundos mientras que se controló la disociación en tampón durante 600 segundos. Las constantes de velocidad de asociación y disociación cinética se determinaron procesando y ajustando los datos utilizando el software Scrubber versión 2.0c. A continuación, se calcularon las constantes de disociación de equilibrio de unión (Kd) y las semividas disociativas (t1/2) a partir de las constantes de velocidad cinética como: Kd (M) = kd/ka y ty2 (min) = [ln2/(60*kd)]. Se muestran parámetros de unión cinética para diferentes anticuerpos monoclonales anti-Activina A en las Tablas 3 a 10. (NB = no se observó unión en las condiciones usadas; NT = no ensayado).
Tabla 3: Características de unión de los anticuer os anti-Activina A a Activina ^A a 25 °C
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Tabla 4: Características de unión de los anticuer os anti-Activina A a Activina A a 37 °C
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Para los valores de kd que están en cursiva, no se observó disociación del analito en estas condiciones experimentales, por lo que el valor de kd se fijó en 5,0E-05 s-1
Tabla 5: Características de unión de los anticuer os anti-Activina A a Activina B a 25 °C
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Tabla 6: Características de unión de los anticuer os anti-Activina A a Activina B a 37 °C
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(continuación)
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Tabla 7: Características de unión de los anticuer os anti-Activina A a Activina AB a 25 °C
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Tabla 8: Características de unión de los anticuer os anti-Activina A a Activina AB a 37 °C
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Tabla 9: Características de unión de los anticuer os anti-Activina A â Activina AC a 25 °C
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Tabla 10: Características de unión de los anticuer os anti-Activina A a Activina AC a 37 °C
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Como se muestra en las Tablas 3 y 4, los anticuerpos anti-Activina A se unieron a Activina A con valores de Kd que variaban de menos de 3,18 pM (es decir, <3,18E-12) a 745 pM (es decir, 7,45E-10) a 25 °C, y con valores de Kd que variaban de menos de 2,18 pM (es decir, <2,18E-12) a 1,77 nM (1,77E-09) a 37 °C. Como se muestra en las Tablas 5 y 6, varios de los anticuerpos anti-Activina A (es decir, H4H10432P2, H4H10442P2, H4H10430P2, H4H10446P2 y H4H10468P2) no demostraron unión medible a Activina B a 25 °C o 37 °C. Algunos de los anticuerpos demostraron unión medible a Activina AB con valores de Kd que variaban de aproximadamente 18,5 pM (es decir, 1,85E-11) a 33,1 nM (es decir, 3,31E-08) a 25 °C (Tabla 7) y de aproximadamente 44,3 pM (es decir, 4,43E-11) a 24,2 nM (es decir, 2,42E-08) a 37 °C (Tabla 8). Algunos de los anticuerpos demostraron unión medible a Activina AC con valores de Kd que variaban de aproximadamente 99,7 pM (es decir, 9,97E-11) a 11,8 nM (es decir, 1,18E-08) a 25 °C (Tabla 9) y de aproximadamente 462 pM (es decir, 4,62E-10) a 22,5 nM (es decir, 2,25E-08) a 37 °C (Tabla 10). Además, ninguno de los anticuerpos anti-Activina A ensayados demostró una unión medible a la inhibina E (datos no mostrados).
Ejemplo 4. Unión de anticuerpos a miembros de la familia de TGF-beta según lo determinado por resonancia de plasmón superficial
Se ensayaron mAb de activina A para determinar la unión de reactividad cruzada a un panel de miembros de la familia de TGF-beta. Para el experimento de unión, se utilizó un instrumento Biacore 4000. Los anticuerpos H4H10429P, H4H10430P, H4H10436P2, H4H10442P2, H4H10446P2; Control 4 (la proteína de ectodominio soluble ActR2B producida con una etiqueta Fc de IgG1 humana C-terminal (ActR2B-hFc; SEQ ID NO:227)); y un anticuerpo de control de isotipo se capturaron en un chip biosensor Biacore CM4 que primero se derivatizó mediante acoplamiento de amina con un anticuerpo anti-Fc humano de ratón monoclonal (GE, N.° de catálogo BR-1008-39). Todos los estudios de unión de Biacore se realizaron en tampón de procesamiento HBS-T (HEPES 0,01 M a pH 7,4, NaCl 0,5 M, EDTA 3 mM, 0,5 mg/ml de seroalbúmina bovina, tensioactivo P20 al 0,05 % v/v). Los ligandos de miembros de la familia de TGF-beta humanos se adquirieron en R&D systems (Activina A, N.° 338-AC; Activina B, N.° 659-AB; Activina AB, N.° 1066-AB; Activina AC, N.° 4879-AC; BPM2, N.° 355-BM; hBMP4, N.° 314-BP; hBMP6, N.° 507-BP; hBMP7, N.° 354-BP; hBMP9, N.° 3209-BP; hBMP10, N.° 2926-BP; hGDF8, N.° 788-G8; hGDF11, N.° 1958-GD). Todas las mediciones de unión se realizaron a 37 °C. Se obtuvieron niveles de captura que variaban de 60 - 200 unidades de resonancia (RU) para cada uno de los anticuerpos o el receptor soluble. Sobre la superficie de los anticuerpos capturados se inyectaron los ligandos de la familia de TGF-beta a través de concentraciones que variaban de 3,1 nM a 200 nM. Los valores de unión para las inyecciones de analito 200 nM se muestran en la Tabla 11.
Tabla 11: Unión de anticuerpos monoclonales anti-Activina A a ligandos de la familia de TGF-p humanos a
37 °C
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Las respuestas de unión observadas de los anticuerpos de activina A capturados a los ligandos de la familia de TGF-beta inyectados a 200 nM podrían compararse con las respuestas de unión de un anticuerpo de control negativo (mAb de control de isotipo), que proporciona una medida de la unión no específica del nivel de fondo, y con las respuestas de unión de ActR2B-hFc, que se observó que se une a todo el panel de miembros de la familia de TGF-beta ensayados y, por lo tanto, sirve como una proteína de unión a ligando de control positivo (Tabla 11). A partir de esta comparación, se encontró que varios de los anticuerpos (por ejemplo, H4H10430, H4H10442, H4H20446) se unían a Activina A, Activina AB, Activina AC, pero no apreciablemente a Activina B o a los ligandos de BMP o GDF. También se encontró que algunos de los anticuerpos se unían con una reactividad cruzada más amplia a ligandos adicionales de la familia de TGF-beta. Por ejemplo, H4H10429P se unió apreciablemente a Activina A, Activina B, Activina AB, Activina AC y también a BMp9 y BMP10. H4H10436P2 mostró una unión apreciable a Activina A, Activina B, Activina AB, Activina AC, BMP2, BMP4, BMP7, BMP9, y BMP10. A partir de estos datos, se muestra que se pueden obtener anticuerpos con diferentes especificidades de unión a ligandos de la familia de TGF-beta después de inmunizar ratones con el ligando de Activina A.
Ejemplo 5. Análisis de competencia cruzada de anticuerpos anti-Activina A
Se realizó un ensayo de competencia cruzada para evaluar la capacidad de un panel de 9 anticuerpos (H4H10446P2, H4H10468P2, H4H10442P2, H4H10423P, H4H10430P, H4H10429P, H4H10432P2, H4H10436P2y H4H10440P2) para competir entre sí por la unión a Activina A humana. Dos anticuerpos de control de isotipo y dos anticuerpos de Activina A de control, Control 1 (un anticuerpo anti-Activina A humano con secuencias de dominio variable de cadena pesada y ligera de "A1" como se expone en el documento US 8.309.082) y Control 3 (MAB3381, disponible en R&D Systems, Inc., Mineápolis, MN) también se incluyeron en los ensayos. Todos los ensayos se realizaron a 25 °C con una velocidad de agitación de placa de microtitulación de 1000 rpm en tampón Octet HBST (HEPES 0,01 M a pH 7,4, NaCl 0,15 M, EDTA 3 mM, tensioactivo P20 al 0,05 % v/v, 0,1 mg/ml de BsA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante (ForteBio Corp., Menlo Park, CA). Brevemente, se capturó una cantidad de anticuerpo anti-Activina A que da una respuesta de unión de aproximadamente 1,8 nm en puntas de sensor Octet recubiertas con anticuerpo anti-Fc humano (Fortebio, N.° 18-0015) sumergiendo las puntas durante 5 minutos en una solución de 10 pg/ml de cada anticuerpo anti-Activina A. Cualquier sitio de unión anti-hFc restante en las puntas se bloqueó incubando las puntas en una solución de 50 pg/ml de anticuerpo irrelevante durante 5 minutos. A continuación, se sumergieron las puntas de sensor en pocillos que contenían una solución de Activina A 50 nM (R&D Systems, N.° 338-AC/CF) unida previamente con 1 pM de un segundo anticuerpo anti-Activina A. Se controló la unión del segundo anticuerpo de Activina A/solución de Activina A a la punta del sensor recubierta de anticuerpo de Activina A durante 5 minutos a 1000 rpm. Se comparó la respuesta de la unión del complejo mAb/Activina A a la punta de sensor recubierta con anti-Activina A y se determinó el comportamiento competitivo/no competitivo de diferentes anticuerpos monoclonales anti-Activina A. Los resultados se ilustran en la figura 1.
En la figura 1, las respuestas de unión competitiva se muestran en sombreado negro o gris claro e indican que los pares de anticuerpos correspondientes compiten entre sí por unirse a Activina A. Los recuadros de color gris claro con fuente de color negro representan la respuesta de unión para determinar la autocompetencia entre los mismos anticuerpos. Los recuadros de color negro con fuente de color blanco representan anticuerpos que compiten por la unión de Activina A en ambas direcciones, independientemente del orden de unión. Los recuadros de color gris oscuro con fuente de color negro representan lecturas de anticuerpos de control de isotipo (es decir, sin unión), lo que indica una falta de unión de los anticuerpos de control de isotipo a los complejos de anticuerpo anti-Activina A-Activina A (cuando los anticuerpos de control de isotipo están unidos a la punta de sensor Octet), o la falta de unión de los anticuerpos de control de isotipo a Activina A (cuando se utilizan anticuerpos de control de isotipo como segundo anticuerpo en los pocillos con Activina A). Los recuadros de color blanco con letra de color negro no representan competencia entre anticuerpos, lo que sugiere que los anticuerpos tienen distintos epítopos de unión en Activina A.
Cuatro anticuerpos, H4H10446P2, H4H10468P2, H4H10442P2 y H4H10423P, compiten bidireccionalmente entre sí por la unión a Activina A. Adicionalmente, estos cuatro anticuerpos no compiten con el Control 1 o el Control 3 por la unión. Tres de estos cuatro anticuerpos de Activina A, H4H10446P2, H4H10468P2 y H4H10442P2, no compiten de forma cruzada con ningún otro anticuerpo de Activina A. Uno de los cuatro anticuerpos (H4H10423P) también compite bidireccionalmente con H4H10430P por la unión a Activina A. Cinco anticuerpos, H4H10430P, H4H10429, H4H10432P2, H4H10436P2 y H4H10440P2, compiten bidireccionalmente entre sí por la unión a Activina A, así como con el Control 1 y el Control 3. Cuatro de estos cinco anticuerpos (es decir, H4H10429, H4H10432P2, H4H10436P2, y H4H10440P2) no compiten de forma cruzada con ningún otro anticuerpo de Activina A, mientras que H4H10423P también compite de forma cruzada con H4H10430P, tal como se ha indicado anteriormente.
Los resultados de este Ejemplo indican que los anticuerpos anti-activina A se pueden agrupar en dos "grupos" distintos en función de las características de unión del epítopo: el Grupo 1 incluye H4H10423P, H4H10446P2, H4H10468P2 y H4H10442P2. el Grupo 2 incluye H4H10429, H4H10430P, H4H10432P2, H4H10436P2, y H4H10440P2. Además, un anticuerpo de cada grupo, es decir, H4H10423P y H4H10430P, compite con los demás. Los resultados de este Ejemplo sugieren que los anticuerpos del Grupo 1 se unen a regiones distintas en la Activina A que los anticuerpos del Grupo 2.
Ejemplo 6. Inhibición de la activación del receptor mediada por Activina A y señalización del complejo SMAD con anticuerpos anti-Activina A
Para caracterizar adicionalmente los anticuerpos anti-Activina A, se desarrolló un bioensayo para detectar la activación de los receptores de Activina de tipo IIA y IIB (ActRIIA y ActRIIB, respectivamente) y la posterior fosforilación y activación de un receptor de activina de tipo I. La interacción entre ActRIIA y ActRIlB y la activina conduce a la inducción de diversos procesos celulares que incluyen la regulación del crecimiento, la metástasis de las células cancerosas y la diferenciación de las células madre embrionarias (Tsuchida, K. et al., Cell Commun Signal 7:15 (2009)). La fosforilación y activación del receptor de tipo I conduce a la fosforilación de las proteínas SMAD 2 y 3 que forman complejos SMAD activados que conducen a la regulación transcripcional de genes.
Para detectar la activación de la vía de transducción de señales del complejo SMAD a través de la unión de activina a los receptores de activina de tipo II, se transfectó una línea celular de rabdomiosarcoma A204 humano (ATCC, N.° HTB-82) con un plásmido indicador de Smad 2/3-luciferasa (CAGAx12-Luc; Dennler, 1998) para crear la línea celular A204/CAGAx12-Luc. Las células A204/CAGAx12-Luc se mantuvieron en McCoy 5A (Irvine Scientific, N.° 9090) complementado con suero fetal bovino (FBS) al 10 %, penicilina/estreptomicina/glutamina y 250 pg/ml de G418. Para el bioensayo, se sembraron células A204/CAGAx12-Luc en placas de ensayo de 96 pocillos a 10.000 células/pocillo en medio de suero bajo, FBS al 0,5 % y OPTIMEM (Invitrogen, N.° 31985-070), y se incubaron a 37 °C y CO2 al 5 % durante una noche. Para determinar la respuesta a la dosis de ligando, Activina A (R&D Systems, N.° 338-AC), Activina B (R&D Systems, N.° 659-AB), Activina AB (R&D Systems, N.° 1066-AB) y Activina AC (R&D Systems, N.° 4879-AC/CF) se diluyeron en serie a 1:3 de 100 a 0,002 nM y se añadieron a las células comenzando junto con un control que no contenía Activina. Se observó que la Activina A, Activina B, Activina AB y Activina AC activan la línea celular A204/CAGAx12-Luc con valores de CE50 de 99 pM, 47 pM, 19 pM, y 4,4 nM, respectivamente. Para medir la inhibición, los anticuerpos se diluyeron en serie a 1:3 partiendo de 100 a 0,002 nM, 1000 a 0,02 nM, o 300 a 0,005 nM, incluyendo muestras de control que contenían un anticuerpo de control de isotipo apropiado o ningún anticuerpo y se añadieron a las células con una concentración constante de Activina A 100 pM, Activina B 50 pM, Activina AB 30 pM o Activina AC 4 nM. También se usó como control de bloqueo positivo en este ensayo el Control 4 (ActRIIB-hFc; SEQ ID No:227). Después de 5,5 horas de incubación a 37 °C y CO2 al 5 %, se añadió sustrato OneGlo (Promega, N.° E6051) y a continuación se detectó la actividad luciferasa usando un instrumento Victor X (Perkin Elmer). Los resultados se analizaron mediante regresión no lineal (logística de 4 parámetros) con el software Prism 5 (GraphPad).
Como se muestra en la Tabla 12, los anticuerpos anti-Activina A bloquearon 100 pM de Activina A con valores de CI50 que variaban de 39 pM a 3,5 nM, mientras que el Control 1 se bloqueó con un valor de CI50 de 83 pM. Se probó un subconjunto de los anticuerpos anti-Activina A para bloquear la Activina B, AB y AC. Cuatro de los 9 anticuerpos analizados bloquearon 50 pM de Activina B con valores de CI50 que variaban de 130 pM a 100 nM. Cinco anticuerpos que se probaron para el bloqueo de Activina B solo se bloquearon a altas concentraciones de anticuerpos, mientras que el Control 1 no mostró ningún bloqueo de Activina B medible. Ocho anticuerpos ensayados bloquearon 30 pM de Activina AB con valores de CI50 que variaban de 100 pM a 8,2 nM, mientras que el Control 4 se bloqueó con un valor de CI50 de 540 pM. Un anticuerpo, H4H10423P, solo demostró un bloqueo débil de Activina AB. Siete de los 8 anticuerpos ensayados bloquearon 4 nM de Activina AC con valores de CI50 que variaban de 580 pM a 6,5 nM, mientras que el Control 4 se bloqueó con un valor de CI50 de 1,1 nM. Un anticuerpo, H4H10423P, no demostró ningún bloqueo de Activina AC. Los controles negativos tanto de IgG de ratón (control de isotipo de mlgG) como de IgG humana (control de isotipo de hlgG) no bloquearon la activación del ligando de los receptores.
Tabla 12: Inhibición de Activina A, Activina B, Activina AB, y Activina AC por anticuerpos anti-Activina A
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El bioensayo usando células A204/CAGAx12-Luc también podría estimularse por GDF8 (R&D Systems, cat. N.° 788-G8/CF) y GDF11 (R&D Systems, cat. N.° 1958-GD-010/CF). Para ensayar la inhibición funcional de estos ligandos con anticuerpos de activina A, el ensayo se realizó utilizando las condiciones descritas anteriormente pero sustituyendo GDF8 o GDF11 por el ligando activador, lo que dio como resultado valores de CE50 de 188 pM y 84 pM, respectivamente. En este ensayo, la activación mediante una concentración constante de GDF8 0,50 nM o GDF11 0,40 nM fue completamente bloqueada por el Control 4 con valores de CI50 de 298 pM y 214 pM, respectivamente. Usando estas mismas concentraciones constantes de ligandos, no se observó inhibición de GDF8 o GDF11 por los anticuerpos de activina A, H4H10446P2 y H4H10430P, cuando se ensayaron con hasta 100 nM de los anticuerpos. En un día separado, se ensayó la inhibición de los anticuerpos de activina A H4H10429P y H4H10436P2 en este ensayo en presencia de concentraciones constantes de GDF8250 pM o GDF11 250 pM, y no se observó inhibición después de la incubación de las células con hasta 150 nM de los anticuerpos de activina A ensayados; GDF8 y GDF11 solos en este ensayo exhibieron valores de CE50 de 124 pM y 166 pM, respectivamente. Estos datos demuestran que los anticuerpos de activina A H4H10446P2, H4H10430P, H4H10429P y H4H10436P2 no inhiben funcionalmente Gd F8 o GDF11.
Ejemplo 7. Estimulación de la hipertrofia del músculo esquelético usando anticuerpos de Activina A
Se evaluó la hipertrofia del músculo esquelético inducida por la administración de un antagonista específico de miostatina, el anticuerpo anti-GDF8 H4H1657N2 (véase el documento US 2011-0293630 A1), o una combinación de H4H1657N2 y diferentes anticuerpos anti-Activina A, en ratones CB17 SCID. El grado de hipertrofia se midió en relación con el tratamiento con un anticuerpo de control de isotipo compatible. También se incluyó en estos estudios el tratamiento con el dominio extracelular de ActRIIB humano, producido con un dominio Fc de IgG1 humana C-terminal (Control 4, SEQ ID No: 227). Se ha demostrado previamente que el Control 4 induce hipertrofia muscular in vivo y también se une y bloquea la actividad de múltiples ligandos miembros de la familia de TGF-beta (Souza, TA et al. Mol Endocrinol 22:2689-702 (2008); Lee, SJ et al. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 102(50): 18117-22 (2005)).
Se probaron un total de ocho anticuerpos anti-Activina A y el Control 1 en combinación con H4H1657N2 o en solitario en ocho estudios, en comparación con grupos de tratamiento de control de isotipo, Control 4, H4H1657N2 en solitario, o Control 2 (un anticuerpo anti-Activina RIIB que tiene VH/VL del anticuerpo MOR08159 descrito en el documento US 2010/0272734 A1). Para los estudios, ratones macho CB17 SCID (Taconic, N.° CB17SC-M) de aproximadamente 10 semanas de edad se dividieron uniformemente según el peso corporal en 6 grupos de 5 ratones. Se trataron grupos de ratones en cada estudio como se describe en la Tabla 13.
Tabla 13: Anticuer os controles ensa ados en estudios de hi ertrofia muscular in vivo
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(continuación)
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Para los estudios 1-5, 7, y 8, los anticuerpos y el Control 4 se administraron por vía subcutánea a una dosis de 10 mg/kg de cada proteína dos veces durante la primera semana del experimento (días 0 y 3) y una vez a una dosis de 10 mg/kg de cada proteína durante la segunda semana (día 7). Se administró por vía subcutánea una dosis final de anticuerpo o Control 4 durante la tercera semana (día 14) a 8 mg/kg para los estudios N.° 1 y N.° 2 o a 10 mg/kg para los estudios N.° 3 - N.° 8 (Tabla 13). El día 21, los ratones se sacrificaron y se midió el peso corporal total de cada ratón. Para el estudio 6, se administraron anticuerpos para los estudios anteriores 1-5 pero el tratamiento se extendió hasta el día 28 con una inyección adicional el día 21. Se diseccionaron y pesaron los músculos tibial anterior (TA) y gastrocnemio (GA) de cada ratón. El peso de los tejidos se normalizó con respecto al peso corporal inicial y se calculó el cambio porcentual medio de peso sobre el peso medio del grupo de tratamiento con anticuerpo de control de isotipo. Los resultados resumidos en las Tablas 14-21 se expresan como aumento porcentual medio sobre el control de isotipo ± error estándar de la media.
Tabla 14: Cambio porcentual del peso corporal y muscular en comparación con el tratamiento de control de isoti o Estudio 1
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Como se muestra en la Tabla 14, en el primer estudio, el Control 4 indujo una hipertrofia significativa en todos los músculos examinados, con aumentos de 45,80 ± 1,47 % en el peso de TA y 31,91 ± 1,4 % de GA en comparación con los ratones tratados con control de isotipo. El tratamiento con H4H1657N2 en solitario también indujo hipertrofia en el peso muscular de TA (aumento de 19,54 ± 2,67 %) y GA (aumento de 26,46 ± 3,63 %), pero fue menos eficaz que el Control 4. La combinación de H4H1657N2 H4H10442P2 indujo aumentos similares en el peso muscular promedio de TA (40,76 ± 2,59 %) y GA (30,62 ± 2,32 %) en comparación con los ratones tratados con el Control 4. Los tratamientos de combinación H4H1657N2/H4H10423p y H4H1657N2/H4H10432P2 no indujeron aumentos en el peso promedio de TA tan grandes como el inducido por los tratamientos con H4H16757N2/H4H10442P o los tratamientos con el Control 4.
Tabla 15: Cambio porcentual del peso corporal y muscular en comparación con el tratamiento de control de isoti o Estudio 2
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Como se muestra en la Tabla 15, en el segundo estudio, el Control 4 indujo hipertrofia en todos los músculos examinados, con aumentos de 43,47 ± 2,37 % en el peso promedio de TA y 29,24 ± 2,22 % en el peso muscular promedio de GA en comparación con los ratones tratados con control de isotipo. En este estudio, el tratamiento con H4H1657N2 en solitario también indujo aumentos en el peso muscular promedio de TA y GA (16,7 ± 2,73 % y 18,54 ± 3,48 %, respectivamente) en comparación con los ratones tratados con control de isotipo, pero estos aumentos promedio fueron menores que los observados para el grupo de tratamiento con Control 4. Los tratamientos de combinación H4H1657N2/H4H10429P y H4H1657N2/H4H10436P2 indujeron aumentos en TA promedio (34,14 ± 2,55 % y 29,31 ± 1,59 %, respectivamente) y GA promedio (26,24 ± 3,11 % y 26,55 ± 2,41 %, respectivamente), aumentos que estuvieron entre los aumentos observados para H4H1657N2 o el Control 4 en solitario. La combinación H4H1657N2/H4H10440P2 no indujo aumentos en el peso promedio de TA o GA tan grandes como los inducidos por las otras dos combinaciones en este estudio o por el tratamiento con Control 4.
Tabla 16: Cambio porcentual del peso corporal y muscular en comparación con el tratamiento de control de isoti o Estudio 3
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Como se muestra en la Tabla 16, en el tercer estudio, el Control 4 indujo hipertrofia en todos los músculos examinados, con aumentos de 39,90 ± 3,58 % en el peso muscular promedio de TA, y 34,01 ± 2,87 % en el peso muscular promedio de GA en comparación con los ratones tratados con control de isotipo. El tratamiento con H4H1657N2 en solitario también indujo aumentos en el peso muscular promedio de TA (14,19 ± 3,19 %) y GA (15,73 ± 0,58 %) en comparación con los ratones tratados con control de isotipo, pero estos aumentos promedio fueron menores que los observados para el grupo de tratamiento con Control 4. El tratamiento de combinación H4H1657N2/H4H10446P2 indujo aumentos similares en el peso muscular promedio de TA (40,01 ± 3,67 %) y GA (31,29 ± 2,60 %) que para los ratones tratados con el Control 4. El tratamiento de combinación con H4H1657N2/H4H10430P indujo aumentos en el peso muscular promedio de TA (28,30 ± 3,27 %) y GA (21,55 ± 2,30 %) que estaban entre los observados para H4H1657N2 en solitario y el tratamiento de combinación con H4H1657N2/H4H10446P2.
Tabla 17: Cambio porcentual del peso corporal y muscular en comparación con el tratamiento de control de isoti o Estudio 4
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Como se muestra en la Tabla 17, en el cuarto estudio, H4H1657N2 indujo hipertrofia en los músculos examinados, con un aumento de 21,05 ± 2,64 % en el peso muscular promedio de TA y 22,85 ± 2,28 % en el peso muscular promedio de GA en comparación con los ratones tratados con control de isotipo. En este estudio, el tratamiento con H4H10430P en solitario aumentó ligeramente el peso muscular en comparación con los ratones tratados con el control de isotipo, pero los valores no fueron estadísticamente significativos. El tratamiento de combinación de H4H1657N2 y H4H10430P a 10 mg/kg y 2 mg/kg, respectivamente, indujo aumentos en el peso muscular promedio de TA (39,02 ± 3,55 %) y GA (27,57 ± 1,26 %) que fueron mayores en el músculo TA que los observados para H4H1657N2 o H4H10430P en solitario. El tratamiento de combinación de H4H1657N2 y H4H10430P a 10 mg/kg y 10 mg/kg, respectivamente, indujo aumentos en el peso muscular promedio de TA (40,20 ± 2,48 %) y GA (22,46 ± 5,03 %) que fueron mayores en el músculo TA que los observados para H4H1657N2 o H4H10430P en solitario. El tratamiento de combinación de H4H1657N2 y H4H10430P a 10 mg/kg y 25 mg/kg, respectivamente, indujo aumentos en el peso muscular promedio de TA (44,92 ± 5,70 %) y GA (30,22 ± 2,97 %) que fueron mayores en el músculo TA que los observados para H4H1657N2 o H4H10430P en solitario.
Tabla 18: Cambio porcentual del peso corporal y muscular en comparación con el tratamiento de control de isoti o Estudio 5
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Como se muestra en la Tabla 18, en el quinto estudio, H4H1657N2 indujo hipertrofia en los músculos examinados, con un aumento de 25,4 ± 1,35 % en el peso muscular promedio de Ta y 22,82 ± 1,97 % en el peso muscular promedio de GA en comparación con los ratones tratados con control de isotipo. En este estudio, el tratamiento con H4H10446P2 en solitario indujo un bajo nivel de hipertrofia muscular con un aumento de 3,70 ± 1,67 % en el peso muscular promedio de TA y 2,70 ± 1,06 % en el peso muscular promedio de GA en comparación con los ratones tratados con control de isotipo. El tratamiento de combinación de H4H1657N2 y H4H10446P2 a 10 mg/kg y 2 mg/kg, respectivamente, indujo aumentos en el peso muscular promedio de TA (51,29 ± 4,20 %) y GA (39,24 ± 3,08 %) que fueron mayores que los observados para H4H1657N2 o H4H10446P2 en solitario. El tratamiento de combinación de H4H1657N2 y H4H10446P2, cada uno a una dosis de 10 mg/kg, indujo aumentos en el peso muscular promedio de TA (49,64 ± 4,08 %) y GA (35,56 ± 3,39 %) que fueron mayores que los observados para H4H1657N2 o H4H10446P2 en solitario. El tratamiento de combinación de H4H1657N2 y H4H10446P2 a 10 mg/kg y 25 mg/kg, respectivamente, indujo aumentos en el peso muscular promedio de TA (49,79 ± 5,46 %) y GA (35,14 ± 3,49 %) que fueron mayores que los observados para H4H1657N2 o H4H10446P2 en solitario.
Tabla 19: Cambio porcentual del peso corporal y muscular en comparación con el tratamiento de control de isoti o Estudio 6
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Como se muestra en la Tabla 19, en el sexto estudio, el Control 4 indujo hipertrofia en todos los músculos examinados, con aumentos de 47,34 ± 2,63 % en el peso promedio de TA y 32,17 ± 3,81 % en el peso muscular promedio de GA en comparación con los ratones tratados con control de isotipo. En este estudio, el tratamiento con H4H1657N2 en solitario también indujo aumentos en el peso muscular promedio de TA y GA de 17,21 ± 2,97 % y 21,57 ± 1,90 %, respectivamente, en comparación con los ratones tratados con control de isotipo, pero estos aumentos promedio fueron menores que los observados para el grupo de tratamiento con Control 4. En este estudio, el tratamiento con Control 1 en solitario indujo un bajo nivel de hipertrofia muscular con un aumento de 4,54 ± 2,25 % en el peso muscular promedio de TA y 2,72 1,30 % en el peso muscular promedio de GA en comparación con los ratones tratados con control de isotipo. El tratamiento de combinación de H4H1657N2 y el Control 1 a 10 mg/kg y 10 mg/kg, respectivamente, indujo aumentos en el peso muscular promedio de TA (30,06 ± 5,51 %) y GA (30,72 ± 3,64 %) que fueron mayores que los observados para H4H1657N2 o el Control 1 en solitario.
Tabla 20: Cambio porcentual del peso corporal y muscular en comparación con el tratamiento de control de isoti o Estudio 7
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Como se muestra en la Tabla 20, en el séptimo estudio, el Control 4 indujo hipertrofia en todos los músculos examinados, con aumentos de 34,43 ± 5,92 % en el peso promedio de TA y 14,86 ± 3,65 % en el peso muscular promedio de GA en comparación con los ratones tratados con control de isotipo. En este estudio, el tratamiento con Control 2 en solitario indujo hipertrofia en los músculos examinados, con aumentos de 36,75 ± 3,88 % en el peso promedio de TA y 26,41 ± 3,16 % en el peso muscular promedio de GA en comparación con los ratones tratados con control de isotipo. El tratamiento de combinación de H4H1657N2 y H4H10430P a 10 mg/kg y 10 mg/kg, respectivamente, indujo aumentos en el peso muscular promedio de TA (33,13 ± 2,02 %) y GA (22,82 ± 1,34 %) que estaban entre aumentos observados para ActRIIB-Fc en solitario y el Control 2 en solitario. El tratamiento de combinación de H4H1657N2 y H4H10446P2 a 10 mg/kg y 10 mg/kg, respectivamente, indujo aumentos en el peso muscular promedio de TA (41,28 ± 2,76 %) y GA (29,21 ± 2,62 %).
Tabla 21: Cambio porcentual del peso corporal y muscular en comparación con el tratamiento de control de isoti o Estudio 8
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Como se muestra en la Tabla 21, en el octavo estudio, el Control 4 indujo hipertrofia en todos los músculos examinados, con aumentos de 53,74 ± 5,31 % en el peso promedio de TA y 39,39 ± 4,56 % en el peso muscular promedio de GA en comparación con los ratones tratados con control de isotipo. En este estudio, el tratamiento con H4H1657N2 en solitario también indujo aumentos en el peso muscular promedio de TA y GA de 18,44 ± 2,30 % y 21,17 ± 1,72 %, respectivamente, en comparación con los ratones tratados con control de isotipo, pero estos aumentos promedio fueron menores que los observados para el grupo de tratamiento con Control 4. En este estudio, el tratamiento con Control 2 en solitario indujo hipertrofia en los músculos examinados, con aumentos de 39,90 ± 1,69 % en el peso promedio de TA y 25,87 ± 2,72 % en el peso muscular promedio de GA en comparación con los ratones tratados con control de isotipo. El tratamiento de combinación de H4H1657N2 y H4H10423P a 10 mg/kg y 25 mg/kg, respectivamente, indujo aumentos en el peso muscular promedio de TA (36,33 ± 3,67 %) y GA (28,18 ± 3,11 %) en comparación con los ratones tratados con control de isotipo. El tratamiento de combinación de H4H1657N2 y H4H10430P a 10 mg/kg y 25 mg/kg, respectivamente, indujo aumentos en el peso muscular promedio de TA (43,83 ± 1,56 %) y GA (31,24 ± 1,90 %) que estaban entre aumentos observados para el Control 4 en solitario y el Control 2 en solitario.
Estos estudios muestran que la administración de anticuerpos anti-Activina A con un inhibidor de miostatina puede aumentar aún más la hipertrofia del músculo esquelético en un grado significativamente mayor que el tratamiento con un inhibidor de miostatina en solitario a las dosis y frecuencias de inyección ensayadas.
Ejemplo 8. Bloqueo de la unión de Activina A usando anticuerpos de Activina A
La capacidad de los anticuerpos anti-Activina A seleccionados para bloquear la interacción de la Activina A con sus receptores, ActRIIB y ActRIIA, así como su antagonista endógeno, folistatina, se determinó usando un instrumento Biacore 3000. Para este experimento, el Control 4 (ActRIIB humano expresado con una etiqueta Fc humana C-terminal (SEQ ID:227)), ActRIIA humano expresado con una etiqueta Fc humana C-terminal (hActRIIA-Fc; R&D Systems, N.° 340-R2-100), o folistatina-288 (R&D Systems, N.° 5836-FS-025) se acoplaron con amina a una superficie de sensor Biacore CM5. La Activina A (R&D Systems, N.° 338-AC) a una concentración fija de 5 nM ya sea en solitario o mezclada con anticuerpos de Activina A, hActRIIA-Fc, hActRIIB-Fc, o anticuerpo de control de isotipo a una concentración final de 60 nM (exceso molar de 12 veces sobre Activina A) se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora. A continuación, se inyectaron las mezclas de anticuerpo-Activina A sobre las superficies del Control 4 acoplado a amina, hActRIIA-Fc, o folistatina-288 a un caudal de 20 ul/min. La señal de unión (RU) se midió 150 segundos después del inicio de la inyección, y esta señal se restó del valor de RU medido para una superficie de referencia de control negativo para determinar la señal de unión específica. El porcentaje de unión de Activina A libre sobre las superficies de receptor o antagonista en presencia de cada anticuerpo anti-Activina A se calculó como la relación de la señal de unión específica observada dividida por la señal de unión específica de Activina A 5 nM en presencia de ningún anticuerpo.
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Como se muestra en la Tabla 22, 6 de los 7 anticuerpos anti-Activina A ensayados y tanto el Control 1 como el Control 3 bloquearon la unión de Actina A a folistatina-288. Un anticuerpo, H4H10423P, no evitó la unión de Activina A a folistatina-288. El Control 4 y hActRIIA-Fc bloquearon la unión de Activina A a folistatina-288 a concentraciones más altas.
T l 2 : Bl l ni n A ivin A hA RIIA-F r n i r n i-A ivin A
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Como se muestra en la Tabla 23, 4 de los 7 anticuerpos anti-Activina A ensayados y tanto el Control 1 como el Control 3 bloquearon la unión de hActRIIA-Fc a Activina A. Tres anticuerpos, H4H10442P2, H4H10446P2 y H4H10423P, no evitaron la unión de Activina A a hActRIIA-Fc. El Control 4 y hActRIIA-Fc bloquearon la unión de Activina A a hActRIIA-Fc.
T l 24: Bl l ni n A ivin A hA RIIB-F r n i r n i-A ivin A
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Como se muestra en la Tabla 24, 4 de los 7 anticuerpos anti-Activina A ensayados y tanto el Control 1 como el Control 3 bloquearon la unión de Activina A a hActRIIB-Fc. Dos anticuerpos, H4H10442P2 y H4H10446P2, no evitaron la unión de Activina A a hActRIIB-Fc. Un anticuerpo, H4H10423P, demostró la capacidad de bloquear parcialmente la unión de Activina A a hActRIIB-Fc a concentraciones más altas de anticuerpo ensayado. Tanto hActRIIB-Fc como hActRIIA-Fc bloquearon la unión de Activina A a hActRIIB-Fc.
Ejemplo 9. Efectos de H4H1657N2 sobre la masa muscular y el rendimiento en el ejercicio
Se evaluaron los efectos del anticuerpo anti-GDF8 H4H1657N2 sobre la masa muscular y el rendimiento en el ejercicio en ratones C57BL/6 macho mayores (19 meses de edad).
Los ratones se asignaron al azar en cuatro grupos (n = 6-8/grupo), un grupo sedentario o de ejercicio que recibió dosis subcutáneas de H4H1657N2 o un anticuerpo de control de isotipo (10 mg/kg) dos veces por semana durante 21 días (6 inyecciones). Los ratones del grupo de ejercicio se colocaron en un régimen de ejercicio que incluía una sesión de entrenamiento al día, que consistía en 20 minutos en una cinta de correr Exer 6M (Columbus Instruments, Columbus, OH) a 10 m/min con una inclinación de 5°, cinco días a la semana durante tres semanas consecutivas. Al final de las tres semanas de tratamiento, se midió la resistencia en los cuatro grupos mediante una prueba de agotamiento en cinta de correr. Los datos se analizaron con un ANOVA bidireccional seguido de la prueba HSD de Tukey. El peso muscular se informó como peso normalizado (es decir, el peso muscular se normalizó con respecto al peso corporal medido al comienzo del experimento). Los resultados para el músculo cuádriceps se proporcionan en la Tabla 25 como % de cambio promedio para cada grupo (± error estándar de la media) en comparación con el grupo de anticuerpo de control de isotipo.
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Tal como se observa en la Tabla 25, el tratamiento con H4H1657N2 dio como resultado aumentos significativos en la masa de los músculos cuádriceps (p <0,01 de significancia sobre el control de isotipo para ambos grupos H4H1657N2). Se observaron aumentos en el peso del grupo muscular de los miembros posteriores (TA, GA), en ratones mayores ejercitados (17,4 %, 12,5 %, respectivamente) y sedentarios (14,1 %, 11,6 %, respectivamente), en comparación con un anticuerpo de control de isotipo. Se observó un ligero aumento en el peso muscular entre ratones mayores sedentarios y ejercitados que recibieron anticuerpo de control de isotipo, pero no fue estadísticamente significativo (Tabla 25).
Los efectos del tratamiento con H4H1657N2 sobre la resistencia al ejercicio también se examinaron en ratones macho C57BL/6 de 19 meses de edad (Tabla 26).
Tabla 26: Prueba de resistencia
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En ratones mayores ejercitados, H4H1657N2 también indujo aumentos significativos en la resistencia, según se midió por el tiempo de carrera en cinta de correr (73,2 min frente a 50,2 min) y la distancia (1,33 km frente a 0,93 km), en comparación con el grupo de control de isotipo (Tabla 26). Sin embargo, en ratones sedentarios, H4H1657N2 no aumentó significativamente la resistencia en comparación con el grupo de control de isotipo.
Como en el estudio del peso muscular, H4H1657N2 indujo aumentos significativos en la resistencia, según lo medido por el tiempo y la distancia de carrera en cinta de correr, solo en los ratones ejercitados, pero no en los ratones sedentarios. Estos resultados muestran que H4H1657N2 aumenta los resultados de rendimiento físico cuando se combina con el entrenamiento físico.
Ejemplo 10. Efectos de H4H1657N2 sobre la masa del músculo esquelético y la fuerza isométrica en ratones Se evaluó in vivo la capacidad de H4H1657N2 para inducir hipertrofia del músculo esquelético en ratones C57BL/6 macho de 9 semanas de edad.
Se administraron dosis subcutáneas repetidas de H4H1657N2 o un anticuerpo de control de isotipo, a 10 o 30 mg/kg, dos veces por semana durante 3 semanas (n = 6). El tratamiento con H4H1657N2 durante 21 días produjo aumentos en el peso corporal de 4,7 ± 2,3 % (n.s.) y 7,1 ± 1,5 % (n.s.), respectivamente, en comparación con los ratones que recibieron control de isotipo administrado en dosis iguales. El peso muscular individual se aumentó de la siguiente manera en comparación con el control de isotipo (10 mg/kg y 30 mg/kg): Tibial anterior (19,4 ± 4,9 %** y 20,6 ± 1,5 %**), Gastrocnemio: (14,9 ± 2,9 %** y 25,3 ± 1,9 %***), y cuádriceps (17,7 ± 3,6 %* y 26,2 ± 3,8 %**). (Todas las estadísticas por ANOVA unidireccional con prueba post hoc de Tukey [*p <0,05; ** p <0,01; *** p <0,001; n.s. = no estadísticamente diferente]).
El aumento de la masa muscular del tibial anterior (TA) se acompañó de un aumento de la fuerza isométrica ex vivo, lo que indica la capacidad de mantener tanto la función muscular como la masa. Los ratones previamente tratados con dosis subcutáneas repetidas de H4H1657N2 o anticuerpo de control de isotipo (a 10 mg/kg administrados dos veces a la semana durante 3 semanas, n = 6 por grupo) se anestesiaron individualmente y se mantuvieron bajo gas isoflurano mientras se extirpaba el músculo TA y se colocaba en un baño de aclarado de lactato oxigenado mantenido constantemente a 25 °C. El extremo superior del TA se ató firmemente a un montante sumergido en el baño mientras que el tendón distal se ató al brazo de palanca 305C (Cambridge Systems). La longitud óptima se determinó estirando ligeramente el TA y a continuación probando la fuerza producida por una estimulación de 1 Hz a un voltaje mínimo. Los músculos TA se estiraron y se estimularon repetidamente hasta que hubo una disminución de la fuerza y a continuación se relajaron en la posición anterior. A continuación, el voltaje se aumentó gradualmente en una serie de estimulaciones de 1 Hz para lograr la producción de fuerza máxima. Una vez que se determinaron la longitud y el voltaje óptimos, los músculos TA se estimularon durante 400 milisegundos a frecuencias crecientes (40­ 100 Hz) para determinar la fuerza tetánica máxima. Los músculos TA recibieron periodos de descanso de 2 minutos entre cada estimulación tetánica.
Los músculos TA de ratones tratados con un anticuerpo de control de isotipo a una dosis de 10 mg/kg y 30 mg/kg durante 21 días generaron una fuerza tetánica máxima promedio de 892,6 ± 37 y 906,1 ± 37,8, respectivamente. Los músculos TA de ratones tratados con H4H1657N2 generaron una fuerza tetánica máxima promedio de 1041,3 ± 31,7 y 1003,3 ± 35,7 mN, respectivamente. Estos valores de fuerza representan un aumento del 16,7 %* (10 mg/kg) y 10,7 % n.s (30 mg/kg) en la fuerza tetánica máxima promedio en comparación con el control de isotipo (figura 2A). El efecto general del fármaco del tratamiento con H4H1657N2 sobre la fuerza tetánica máxima fue estadísticamente diferente del control de isotipo a dosis de 10 mg/kg y 30 mg/kg (dosis de 10 mg/kg mostrada en la figura 2B). (Figura 2A: análisis estadístico por ANOVA unidireccional con prueba post hoc de Tukey [* p <0,05; n.s. = no estadísticamente diferente]. Figura 2B: análisis estadístico por ANOVa bidireccional y prueba post hoc de Sidak [p >0,0001]).
Ejemplo 11. H4H1657N2 mejora la recuperación de la atrofia inducida por la suspensión de los miembros posteriores (HLS)
Se evaluó el efecto de H4H1657N2 sobre la masa del músculo esquelético durante la fase de recuperación de 7 días de atrofia inducida por suspensión de los miembros posteriores (HLS) en ratones macho C57BL/6 de un año de edad.
El día 0, se suspendieron dieciocho ratones por la cola de modo que ambas patas traseras no pudieran tocar el suelo durante 7 días. Los ratones se alojaron en jaulas especiales con acceso libre a comida y agua. De manera simultánea, un grupo adicional de seis ratones se dejó en jaulas normales y sirvió como control (control sin HLS). El día 7, los ratones suspendidos se retiraron y se asignaron al azar por porcentaje de peso corporal perdido durante HLS en tres grupos (n = 6 cada uno). El día 7, se tomó el peso muscular del grupo de control sin HLS y un grupo de HLS (grupo HLS) para evaluar el porcentaje de atrofia en respuesta a HLS. Se permitió que los dos grupos HLS restantes (n = 6 cada uno) se recuperaran durante 8 días (es decir, del día 7 al día 15 del experimento) en jaulas normales y se trataron por vía subcutánea con dosis de 10 mg/kg de H4H1657N2 o un control de isotipo los días 7 y 10 (es decir, después de cero días y 3 días de recuperación) (HLS+7Rec+H4H1657N2 y HLS+7rec+control de isotipo, respectivamente). El día 15 (es decir, después de 8 días de recuperación), se tomó el peso muscular para evaluar el porcentaje de recuperación después de la atrofia inducida por HLS.
Como se observa en la figura 3B, siete días de HLS dieron como resultado una pérdida significativa de masa tanto en el tibial anterior (TA) como en el gastrocnemio (GA) (grupo HLS), en comparación con el grupo de control sin HLS (-13,7 %* y -14,8 %*, respectivamente). Después de 8 días de recuperación, el grupo HLS+7rec+control de isotipo mantuvo pérdidas de masa muscular de TA y GA (-6,3 % y -7,5 %) en comparación con el grupo de control sin HLS, mientras que el grupo de HLS+7Rec+H4H1657N2 mostró ganancias de masa (4,7 % y 5 %) en comparación con el grupo sin HLS.
Cuando se comparan los dos grupos de recuperación (es decir, HLS+7Rec+H4H1657N2 frente a HLS+7rec+control de isotipo), los efectos de H4H1657N2 sobre la masa de TA y GA no fueron estadísticamente diferentes de los efectos observados con el anticuerpo de control de isotipo. Sin embargo, mientras que la masa muscular del grupo de HLS+7rec+control de isotipo no fue estadísticamente diferente del grupo de contro1HLS o del grupo de control sin HLS, el grupo de HLS+7Rec+H4H1657N2 tuvo una masa de TA y GA estadísticamente mayor en comparación con el grupo de HLS. (Todas las estadísticas por ANOVA unidireccional con prueba post hoc de Tukey [* p <0,05 frente a sin HLS; ## p <0,01 frente a HLS).
Ejemplo 12. Inhibición de la activación del receptor de BMP de tipo I y II por anticuerpos anti-Activina A y ActRIIB-Fc
Las proteínas morfogenéticas óseas (BMP) pertenecen a la superfamilia de TGF-p y están implicadas en la regulación de muchos procesos fisiológicos activando complejos de receptores en la superficie celular que están compuestos por receptores de BMP tipos I y II. La activación de los receptores conduce a la fosforilación de las proteínas SMAD y la activación transcripcional de los genes que responden al ligando.
Se desarrolló un bioensayo para detectar la regulación de la señalización de BMP en células W-20-17, una línea celular estromal de médula ósea de ratón que previamente se ha mostrado que responde a BMP2. Las células se diseñaron para expresar de manera estable un indicador de luciferasa (es decir, un elemento que responde a BMP (BRE(2X)-luciferasa-IRES-GFP)), y se clasificaron para una alta expresión de GFP. La línea celular estable resultante se denomina W-20-17/BRE-luc y se mantuvo en FBS al 10 %, DMEM, Pen/Strep, y 200 pg/ml de G418. Estas células se utilizaron para medir la activación de BMP y la inhibición de esta activación por anticuerpos anti-Activina A y ActRIIB-hFc (Control 4, SEQ ID No:227).
Se evaluó la capacidad de cuatro anticuerpos anti-Activina A y ActRIIB-hFc para inhibir la señalización de BMP usando la línea celular W-20-17/BRE-luc. Para el bioensayo, se siembran células W-20-17/BRE-luc en placas de ensayo de 96 pocillos a 10.000 células/pocillo y se incuban a 37 °C y CO2 al 5 % durante una noche. Al día siguiente, BMp2, BMP4, BMP6 , BMP9 o BMP10 se diluyeron en serie a 1:3 y se añadieron a las células de 100 nM a 0,002 nM (sin incluir el control de BMP para las respuestas a la dosis). Para la inhibición de las BMP por anticuerpos anti-Activina A o ActRIIB-hFc, los anticuerpos o ActRIIB-hFc se diluyeron en serie a 1:3 de 1000 nM a 0,02 nM (incluyendo ningún anticuerpo, anticuerpo de control o control negativo para ActRIIB-hFc (es decir, una proteína irrelevante etiquetada con hFc, "Proteína de control")) y se añadieron a las células junto con BMP2 100 pM, BMP4 100 pM, BMP6 10 nM, BMP9 800 pM o BMP10 4 nM, tal como se indica. La actividad de luciferasa se detectó después de 5,5 horas de incubación a 37 °C y CO2 al 5 % con Victor X (Perkin Elmer), y los resultados se analizaron usando regresión no lineal (logística de 4 parámetros) con el software Prism 5 (GraphPad).
Como se muestra en la Tabla 27 a continuación, H4H10446P2 y H4H10430P no inhibieron ninguna de las BMP ensayadas, mientras que los otros anticuerpos de Activina A ensayados (H4H10429 y H4H10436P2) y ActRIIB-hFc mostraron alguna inhibición de algunas de las BMP. H4H10429P mostró la inhibición de BMP9 y BMP10 con valores de CI50 de 8,1 nM y 3,5 nM, respectivamente, pero no inhibió BMP2, BMP4 ni BMP6. H4H10436P2 mostró una inhibición débil de BMP2 y BMP4 a las concentraciones más altas del anticuerpo e inhibición de BMP10 con un valor de CI50 >100 nM, pero no mostró ninguna inhibición de BMP6 y BMP9. ActRIIB-hFc mostró la inhibición de BMP9 y BMP10 con valores de CI50 de 2 nM y 1 nM pero no inhibió BMP2, BMP4 ni BMP6. Ninguna de las moléculas de control (es decir, un anticuerpo de control de isotipo (mAb de control) y una proteína irrelevante etiquetada con hFc (proteína de control)) inhibieron ninguna de las BMP, mientras que b MP2, BMP4, BMP6 , BMP9 o BMP10 en solitario (es decir, sin anticuerpos o proteínas marcadas con hFc) activaron las células W-20-17/BRE-luc con valores de CE50 de 34 pM, 63 pM, 4,5 nM, 260 pM, y 2,5 nM, respectivamente.
T l 27. Inhi i i n r n i r ni-A ivin A A RII -hF BMP n l l W-2 -17BRE-l
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Ejemplo 13. El tratamiento con anticuerpo anti-Activina A H4H10446P2 reduce la fibrosis renal in vivo
El efecto de un anticuerpo anti-Activina A específico de la invención, H4H10446P2, sobre la fibrosis renal se determinó en un modelo de ratón con obstrucción ureteral unilateral (UUO) de fibrosis renal. El modelo UUO se desarrolló mediante la ligadura completa del uréter izquierdo manteniendo intacta la función del riñón derecho. Brevemente, se realizó una UUO en ratones bajo anestesia con ketamina/xilazina, por lo que se accedió al uréter izquierdo a través de una incisión en el costado, y se colocaron dos ligaduras en el tercio proximal del uréter usando hilo de seda 5-0 a 5 mm de distancia. Las cirugías simuladas se realizaron de manera similar sin colocar ligaduras en el uréter. En este modelo, se desarrolla fibrosis grave en el riñón en los 14 días posteriores a la UUO, que se evaluó midiendo el colágeno renal midiendo directamente la cantidad de hidroxiprolina en la muestra, lo que se conoce como método de hidroxiprolina. La hidroxiprolina es un componente específico de los colágenos, y representa aproximadamente el 14,4 % de la composición de aminoácidos del colágeno en la mayoría de los tejidos de mamífero (Cochrane et al., J Am Soc Nephrol 16:3623-30 (2005)). Para medir el contenido de colágeno a través del método de hidroxiprolina, las primeras muestras de riñón congeladas se secaron durante una noche utilizando una cámara de vacío. A continuación, las muestras de tejido de riñón seco se homogeneizaron en una solución de NaCl/NaHCO3 enfriada con hielo y a continuación se hidrolizaron usando HCl 6 M. Las muestras se secaron posteriormente usando una centrífuga de vacío y a continuación se rehidrataron usando HCl 0,1 M. La hidroxiprolina en las muestras rehidratadas se oxidó con cloramina T 300 mM (Sigma, N.° 857319) y, a continuación, se añade reactivo de Ehrlich [p-dimetilaminobenzaldehído 3,5 M (FW: 149,19, Sigma, N.° 39070) en ácido perclórico al 60 % (Sigma, N.° 311413)] para desarrollar el color. Finalmente, usando un espectrofotómetro. se midió la absorbancia de las muestras a 558 nm y se comparó con estándares de hidroxiprolina (Sigma, N.° H5534) de concentración conocida, para determinar el contenido de hidroxiprolina en el riñón. A continuación, el valor de hidroxiprolina medido se multiplicó por un factor de 6,94 para determinar el valor del colágeno. Catorce días después de la UUO, el peso del riñón seco disminuye como resultado del daño parenquimatoso. Se realizaron cirugías simuladas (n = 10) o UUO (n = 20) en ratones macho C57BL/6 de 16 semanas de edad (Taconic farms, Inc.). A continuación, los ratones, que se sometieron a cirugía de UUO, se dividieron en dos grupos. Cada grupo UUO recibió una inyección subcutánea de H4H10446P2 (40 mg/kg, n = 10) o un anticuerpo de control de isotipo (40 mg/kg, n = 10), que no se une a ninguna proteína de ratón conocida, comenzando un día antes las cirugías, y 1, 3, 6, 8, 10 y 13 días después de la cirugía. Los ratones que se sometieron a la cirugía simulada recibieron vehículo (PBS estéril) durante este tiempo usando el mismo programa que los grupos UUO. Todos los ratones se sacrificaron el día 14 después de la cirugía. Se midió el peso de los riñones, se congelaron rápidamente usando nitrógeno líquido y se mantuvieron a -80 °C hasta que se midió el contenido de colágeno. El contenido de colágeno renal se midió utilizando el método de hidroxiprolina y a continuación se expresó como colágeno renal total (|jg) o colágeno renal normalizado con respecto al peso del riñón (|jg/mg de peso seco). El análisis estadístico se realizó utilizando ANOVA unidireccional con la prueba de comparación múltiple de Turkey. Los resultados que incluían resúmenes de colágeno renal total, colágeno renal normalizado y peso seco del riñón para cada grupo de tratamiento se expresaron como media ± SEM en la Tabla 28 a continuación.
Tabla 28. Colágeno renal total, colágeno renal normalizado y peso seco del riñón en cada grupo (media ±
SEM
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Como se muestra en la Tabla 28, tanto el colágeno renal total como el colágeno renal normalizado con respecto al peso del riñón aumentaron significativamente en ratones UUO en comparación con los ratones operados de forma simulada. Los ratones UUO tratados con H4H10446P2 mostraron una reducción significativa tanto del colágeno renal total como del colágeno renal normalizado con respecto al peso del riñón (reducción de aproximadamente un 45 % del colágeno fibrótico) en comparación con los ratones UUO tratados con anticuerpos de control de isotipo, lo que indica que el anticuerpo anti-Activina A conduce a una disminución de la fibrosis en el riñón. Los ratones UUO tratados con H4H10446P2 mostraron un aumento en el peso seco del riñón en comparación con los ratones UUO tratados con anticuerpo de control de isotipo, lo que indica la conservación del parénquima en los ratones tratados con anticuerpo anti-Activina A.
Ejemplo 14. Efectos de H4H10446P2 sobre el peso corporal y la masa muscular en ratones que sobreexpresan Activina A
Para evaluar la eficacia de H4H10446P2 en la neutralización de niveles elevados de Activina A en ratones, se sobreexpresó Activina A en ratones C57BL/6 (10 semanas de edad) mediante administración hidrodinámica (HDD) de una construcción de ADN que codifica Activina A de longitud completa. Los ratones se asignaron al azar en tres grupos (n = 5-6/grupo); a uno se le inyectó una mezcla de solución salina/2,5 jg de un control de construcción de ADN en presencia de un anticuerpo de control de isotipo, y a dos grupos se les inyectó una mezcla de solución salina/2,5 jg de una construcción de ADN que contenía Activina A en presencia de un anticuerpo de control de isotipo o H4H10446P2. Las construcciones de ADN se inyectaron el día 0 y los anticuerpos se administraron los días 0 y 4 a 2,5 mg/kg (2 inyecciones) durante 7 días. El peso muscular se informó como peso normalizado (es decir, el peso muscular se normalizó con respecto al peso corporal medido al comienzo del experimento). Los resultados para el peso corporal se muestran como un cambio promedio del peso corporal de partida. Los resultados para los músculos tibial anterior (TA) y gastrocnemio (GA) se muestran en la figura 4 como cambio porcentual promedio para cada grupo (± error estándar de la media) en comparación con la administración HDD de un grupo de control de construcción anticuerpo de control de isotipo. Los datos se analizaron con ANOVA unidireccional o bidireccional seguido de la prueba HSD de Tukey.
Como se observa en la figura 4, siete días después de la HDD, la administración de Activina A en ratones tratados con un anticuerpo de control de isotipo dio como resultado disminuciones significativas en el peso corporal (-10,81 ± 2,46 %) y la masa de los músculos tibial y gastrocnemio (de -13,96 ± 1,85 % y de -10,34 ± 1,51 %, respectivamente) (p <0,01 de significancia sobre el control de isotipo). La administración de Activina A en ratones tratados con

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REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a Activina A con una constante de equilibrio de disociación de unión (Kd) de menos de 5 pM, opcionalmente con una KD de menos de 4 pM, según se mide en un ensayo de resonancia de plasmón superficial a 25 °C, en el que el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno comprende: dominios HCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3, que tienen las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 164-166-168-148-150-152, respectivamente.
2. El anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno comprende: (a) una HCVR que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 162; y (b) una LCVR que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 146.
3. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de las reivindicaciones 1 o 2, y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.
4. La composición farmacéutica de la reivindicación 3, que comprende además un antagonista de GDF8, en la que, opcionalmente, el antagonista de GDF8 se selecciona del grupo que consiste en una proteína de fusión inhibidora de GDF8, un anticuerpo anti-GDF8, y un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo anti-GDF8.
5. Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2 o una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 3 o la reivindicación 4 para su uso en el tratamiento, prevención o mejora de una enfermedad o trastorno caracterizado por disminución de la masa o fuerza muscular, en el que la enfermedad o trastorno caracterizado por disminución de la masa o fuerza muscular se selecciona del grupo que consiste en sarcopenia, caquexia, lesión muscular, desgaste/atrofia muscular, cáncer, obesidad, diabetes, artritis, esclerosis múltiple, distrofia muscular, esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad de Parkinson, osteoporosis, osteoartritis, osteopenia y síndrome metabólico.
ES14750421T 2013-07-30 2014-07-30 Anticuerpos anti-Activina A y usos de los mismos Active ES2827673T3 (es)

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