ES2897717T3

ES2897717T3 - Sistema de señalización

Info

Publication number: ES2897717T3
Application number: ES16703833T
Authority: ES
Inventors: Martin Pule; Shaun Cordoba
Original assignee: Autolus Ltd
Current assignee: Autolus Ltd
Priority date: 2015-02-05
Filing date: 2016-02-04
Publication date: 2022-03-02
Anticipated expiration: 2036-02-04
Also published as: EP3253783B1; GB201501936D0; WO2016124930A1; US20180016335A1; US10604570B2; EP3253783A1

Abstract

Un sistema de señalización de receptor de antígeno quimérico (CAR) que comprende; (i) un componente de direccionamiento que comprende un dominio de unión a antígeno, un dominio transmembrana y un primer dominio de heterodimerización; y (ii) un componente de señalización intracelular que comprende un dominio de señalización y un segundo dominio de heterodimerización; en donde la heterodimerización espontánea entre el primer y el segundo dominio de heterodimerización provoca que el componente de direccionamiento y el componente de señalización formen un complejo de CAR funcional, en donde el primer y el segundo dominio de heterodimerización comprenden: (i) dominios de cremallera de leucina; (ii) dominios de DDD1 y AD1; (iii) dominios de Barnasa y Barnstar; o (iv) dominios de RNasa pancreática humana y de péptido S.

Description

DESCRIPCIÓN

Sistema de señalización

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un sistema de señalización de receptores de antígenos.

Antecedentes de la invención

Tradicionalmente, los linfocitos T específicos de antígeno se han generado por expansión selectiva de linfocitos T de sangre periférica específicos de forma nativa para el antígeno diana. Sin embargo, es difícil y a menudo imposible seleccionar y expandir grandes cantidades de linfocitos T específicos para la mayoría de los antígenos de cáncer. La terapia génica con vectores de integración brinda una solución a este problema, ya que la expresión transgénica del receptor de antígeno quimérico (CAR; del inglés, Chimeric Antigen Receptor) permite la generación de grandes cantidades de linfocitos T específicos para cualquier antígeno de superficie mediante transducción de vectores víricos ex vivo de una población masiva de linfocitos T de sangre periférica.

Los receptores de antígeno quiméricos son proteínas que injertan la especificidad de un ligante de antígeno, tal como un anticuerpo monoclonal (mAb), con la función efectora de un linfocito T. Su forma habitual es la de una proteína de dominio transmembrana de tipo I con un extremo amino terminal que reconoce el antígeno, un espaciador, un dominio transmembrana, todo ello conectado a un endodominio compuesto que transmite señales de supervivencia y activación de linfocitos T (véase la Figura 1A).

La forma más común de estas moléculas son fusiones de fragmentos variables monocatenarios (scFv) procedentes de anticuerpos monoclonales que reconocen un antígeno diana, fusionados mediante un espaciador y un dominio transmembrana a un endodominio de señalización. Dichas moléculas dan como resultado la activación de los linfocitos T en respuesta al reconocimiento por el scFv de su diana. Cuando los linfocitos T expresan dicho CAR, reconocen y destruyen las células diana que expresan el antígeno diana. Se han desarrollado varios CAR contra antígenos asociados a tumores y las estrategias de transferencia adoptiva usando tales linfocitos T que expresan CAR están actualmente en ensayo clínico para el tratamiento de diversos cánceres.

Se han notificado diversas toxicidades de los estudios con CAR y existen toxicidades teóricas adicionales. Tales toxicidades incluyen toxicidad inmunológica causada por la activación intensa sostenida de los linfocitos T CAR que da como resultado un síndrome de activación de macrófagos (MAS; del inglés, macrophage activation syndrome) y toxicidad "en la diana fuera del tumor" (en inglés, "On-target off-tumour"), es decir, reconocimiento del antígeno diana en tejidos normales.

Se presume que MAS está causado por la activación impulsada por antígenos persistente y la proliferación de linfocitos T que a su vez liberan abundantes citocinas inflamatorias conduciendo a la hiperactivación de macrófagos y un ciclo de avance de la activación inmunitaria. Es característico un gran pico en la IL-6 sérica y el síndrome puede dar como resultado una enfermedad sistémica grave requiriendo el ingreso en UCI.

La toxicidad en la diana fuera del tumor se ha notificado con otros CAR, por ejemplo, un grupo de pacientes tratados con un CAR contra el antígeno del carcinoma de células renales CAIX desarrolló una toxicidad biliar inesperada y limitante del tratamiento. Se han notificado dos muertes con los estudios de CAR: un paciente murió de un síndrome de dificultad respiratoria que se manifestó inmediatamente después de la infusión de una dosis grande de linfocitos T CAR anti-ERBB2 de 3a generación; un paciente adicional murió en un estudio diferente tras una posible tormenta de citocinas tras el tratamiento de LLC (en inglés, CLL) con un CAR anti-CD19 de segunda generación.

Estas toxicidades son muy difíciles de predecir, incluso con los estudios detallados de animales o el trabajo de primates no humanos. Esencialmente, a diferencia de las moléculas pequeñas y los productos biológicos, los linfocitos T CAR no tienen una semivida y no se puede cesar la administración y esperar a que el agente se degrade/se excrete. Los linfocitos T CAR son autónomos y pueden injertar y proliferar. Por tanto, la toxicidad puede ser progresiva y fulminante.

Un aspecto clave de estas toxicidades es la sobreactivación inmunológica, es decir, sobreactivación de los linfocitos T CAR.

Los genes suicidas son elementos expresados genéticamente que condicionalmente pueden destruir las células que los expresan. Entre los ejemplos se incluyen la timidina quinasa del virus del herpes simple, que hace a las células susceptibles a Ganciclovir; la Caspasa 9 inducible, que hace a las células susceptibles de un homodimerizador molecular pequeño y CD20 y RQR8, que hace a las células susceptibles a Rituximab.

Esta tecnología añade una cierta cantidad de seguridad a la terapia con linfocitos T CAR, aunque hay limitaciones. En primer lugar, es un enfoque binario en donde todos los linfocitos T CAR se destruyen tras la adición de la entidad suicida. Además, las terapias medicinales a menudo tienen una ventana terapéutica. Con un gen suicida la potencia del producto no puede ajustarse, de modo que pueda lograrse eficacia con una toxicidad tolerable. En segundo lugar, no está claro si un gen suicida ayudaría con alguna de las toxicidades inmunitarias descritas anteriormente: por ejemplo, para cuando se ha desencadenado un síndrome de activación de macrófagos, es posible que ya no necesiten los linfocitos T CAR para perpetuarse y que el gen suicida ya no sea útil. Los síndromes de liberación de citocinas más agudos probablemente sucedan demasiado deprisa como para que el gen suicida trabaje. Por último, los genes suicidas no son "infalibles", es decir, el estado por defecto para los linfocitos T CAR es estar activos.

El documento WO14/12761 describe un CAR que comprende un primer y un segundo par de dimerización, los cuales se heterodimerizan para formar un CAR con interruptor activado condicionalmente activo, controlado farmacológicamente. Sin embargo, este sistema requiere el uso de un agente externo. Por ejemplo, una rapamicina o un análogo. Véanse, por ejemplo, los documentos WO96/41865, WO99/36553 y WO01/14387.

Otros ejemplos de CAR que comprenden pares de dimerización se describen, por ejemplo, en los documentos WO15/150771 y WO16/030691.

Por tanto, hay una necesidad de métodos alternativos para controlar los linfocitos T CAR que no estén asociados con las desventajas y problemas mencionados anteriormente.

Sumario de aspectos de la invención

Los presentes inventores han encontrado que es posible separar los componentes de reconocimiento de antígenos y de señalización de un CAR para producir un sistema en el que la señalización se produzca únicamente cuando los componentes de reconocimiento de antígenos y de señalización dimericen y formen un complejo de CAR funcional.

El alcance de la presente invención es como se define en las reivindicaciones adjuntas.

Por tanto, en un primer aspecto, la presente invención se refiere a un sistema de señalización de receptor de antígeno quimérico (CAR) que comprende;

(i) un componente de direccionamiento que comprende un dominio de unión a antígeno, un dominio transmembrana y un primer dominio de heterodimerización; y

(ii) un componente de señalización intracelular que comprende un dominio de señalización y un segundo dominio de heterodimerización;

en donde la heterodimerización espontánea entre el primer y el segundo dominio de heterodimerización provoca que el componente de direccionamiento y el componente de señalización formen un complejo de CAR funcional, en donde el primer y el segundo dominio de heterodimerización comprenden (a) dominios de cremallera de leucina; (b) dominios de DDD1 y AD1; (c) dominios de Barnasa y Barnstar; o (d) dominios de RNasa pancreática humana y de péptido S.

El primer y el segundo dominio de heterodimerización son capaces de dimerizarse entre sí de forma espontánea. La heterodimerización se produce solo con el primer y segundo dominio de heterodimerización, sin la necesidad de ninguna molécula separada que actúe como un “inductor” de la dimerización.

El sistema de señalización de CAR puede comprender una pluralidad de componentes de señalización, cada uno comprendiendo un dominio de señalización y un segundo dominio de heterodimerización, en donde cada uno de los segundos dominios de heterodimerización reconoce el mismo primer dominio de heterodimerización, pero los dominios de señalización comprenden diferentes endodominios de señalización.

En un segundo aspecto, la presente invención proporciona una construcción de ácido nucleico que codifica un sistema de señalización de CAR de acuerdo con el primer aspecto de la invención, en donde la construcción de ácido nucleico comprende la estructura siguiente:

A-X-B

en la cual

A y B son secuencias de ácido nucleico que codifican un componente de direccionamiento o un componente de señalización tal como se define en el segundo o tercer aspecto de la presente invención; y

X es una secuencia de ácido nucleico que codifica un sitio de escisión,

de modo que A es escindido de B después de la traducción.

La construcción de ácido nucleico puede tener una de las siguientes estructuras:

a) AbD - espaciador - TM - endo - Het1 - coexpr- Het2 - SD

b) AbD - espaciador - TM - endo - Het1 - coexpr- SD - Het2

c) Het2 - SD - coexpr - AbD - espaciador - TM - endo - Het1 o

d) SD - Het2 - coexpr - AbD - espaciador - TM - endo - Het1

en las que

AbD es una secuencia de ácido nucleico que codifica el dominio de unión a antígeno de la molécula de direccionamiento; el espaciador es una secuencia de ácido nucleico que codifica un espaciador de la molécula de direccionamiento; TM es una secuencia de ácido nucleico que codifica el dominio de transmembrana de la molécula de direccionamiento; endo es una secuencia de ácido nucleico que codifica el endodominio de la molécula de direccionamiento;

Het1 es una secuencia de ácido nucleico que codifica el motivo de heterodimerización de la molécula de direccionamiento; coexpr es una secuencia de ácido nucleico que codifica un sitio de escisión;

Het2 es una secuencia de ácido nucleico que codifica el motivo de heterodimerización de la molécula de señalización; y SD es una secuencia de ácido nucleico que codifica el dominio de señalización de la molécula de señalización.

La construcción de ácido nucleico puede codificar múltiples componentes de señalización tal como se define en el primer aspecto de la presente invención, en donde los múltiples componentes de señalización están separados por sitios de escisión, de modo que los múltiples componentes de señalización se escinden después de la traducción.

En un tercer aspecto, la presente invención proporciona un vector que comprende una construcción de ácido nucleico de acuerdo con el segundo aspecto de la presente invención.

El vector puede ser un vector retrovírico o un vector lentivírico o un transposón.

En un cuarto aspecto, la presente invención proporciona una célula que comprende un sistema de señalización de CAR de acuerdo con el primer aspecto de la presente invención.

La célula puede comprender una construcción de ácido nucleico de acuerdo con el segundo aspecto de la presente invención o un vector de acuerdo con el tercer aspecto de la presente invención.

La célula puede ser un linfocito T o un linfocito NK.

En un quinto aspecto, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende una pluralidad de células de acuerdo con el cuarto aspecto de la invención.

En un sexto aspecto, la presente invención proporciona una composición farmacéutica de acuerdo con el quinto aspecto de la invención para usar en el tratamiento y/o prevención de una enfermedad.

En un séptimo aspecto, la presente invención se refiere a un método para tratar y/o prevenir una enfermedad, que comprende la etapa de administrar una composición farmacéutica de acuerdo con el quinto aspecto de la invención a un sujeto.

El método puede comprender las siguientes etapas:

(i) aislamiento de una muestra que contiene un linfocito T o un linfocito NK de un sujeto;

(ii) transducción o transfección de los linfocitos T o los linfocitos NK con una construcción de ácido nucleico de acuerdo con el segundo aspecto de la presente invención o un vector de acuerdo con el tercer aspecto de la presente invención; y

(iii) administrar los linfocitos T o los linfocitos NK de (ii) al sujeto.

En un octavo aspecto, la presente invención se refiere al uso de una composición farmacéutica de acuerdo con el quinto aspecto de la presente invención en la fabricación de un medicamento para el tratamiento y/o prevención de una enfermedad.

La enfermedad puede ser cáncer.

En un noveno aspecto, la presente invención proporciona un método para fabricar una célula de acuerdo con el cuarto aspecto de la invención, que comprende la etapa de introducir una construcción de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera del segundo aspecto de la presente invención o un vector de acuerdo con el tercer aspecto de la presente invención, en la célula.

La célula puede ser de una muestra aislada de un sujeto.

El sistema de señalización de CAR de la presente invención proporciona varias ventajas en comparación con las moléculas de CAR clásicas. Por ejemplo, se puede evitar el impedimento histérico de segundos mensajeros porque los dominios de señalización pueden ser independientes unos de otros (es decir, se proporcionan en componentes de señalización separados).

Además, es posible incluir una pluralidad de diferentes moléculas de señalización y se pueden proporcionar uno o más dominios de señalización diferentes en componentes de señalización separados. En este caso, cada dominio de señalización puede estar próximo a la membrana. Esta proximidad a la membrana es óptima para la señalización. Esto difiere de un CAR clásico, en el que el dominio de señalización tiene demasiado impedimento histérico y el elemento más distante puede estar demasiado lejos de la membrana.

Es posible amplificar la señal de activación de los linfocitos T mediante el reclutamiento de múltiples componentes de señalización para cada molécula de reconocimiento del antígeno. Esto resulta especialmente útil para la detección de antígenos de baja densidad.

Es posible “sintonizar” la mezcla de señales coestimuladoras que recibe el linfocito T. Por ejemplo, podría resultar favorable para el linfocito T recibir un nivel elevado de señal OX40, cantidades intermedias de señal Zeta y cantidades pequeñas de CD28. Una señal de este tipo podría conducir, por ejemplo, a un rechazo lento pero constante de un tumor y, de este modo, se evitaría la toxicidad inmunitaria y se fomentaría la persistencia de los linfocitos T.

Descripción de las figuras

Figura 1 -(a) Diagrama esquemático que ilustra un CAR clásico. (b) a (d): Diferentes generaciones y permutaciones de endodominios de CAR: (b) los diseños iniciales transmitían señales ITAM en solitario a través del endodominio FceR I-y o CD3Z, mientras que los diseños posteriores transmitían (c) una o (d) dos señales coestimuladoras adicionales en el mismo endodominio compuesto.

Figura 2 - Concepto de zipCAR. El componente de direccionamiento es una proteína de transmembrana de tipo I cuyo ectodominio comprende un dominio de reconocimiento de la diana y un espaciador, y cuyo endodominio comprende un motivo de heterodimerización (HD1). El componente de señalización es una proteína intracelular y comprende un motivo de heterodimerización (HD2) fusionado con un dominio de señalización. Aunque los dos componentes son proteínas separadas, se ensamblan después de la expresión para formar un CAR funcional.

Figura 3 - (a) Un zipCAR basado en una cremallera de leucina que comprende cremalleras de leucina ácidas/básicas. En este caso, el componente de direccionamiento homodimérico reclutará dos componentes de señalización. (b) Un zipCAR basado en DDD1/AD1. En este caso, debido a que la interacción de DDD1/AD1 es trimérica, el dominio de direccionamiento homodimérico reclutará cuatro dominios de señalización.

Figura 4 - Construcciones de zipCAR. (a) Una construcción bicistrónica para evaluar un zipCAR con cremallera de leucina ácida/básica. (b) Una construcción de control para el zipCAR con cremallera de leucina que es idéntica a la construcción (a) con la excepción de que la cremallera de leucina del componente de señalización se ha eliminado. (c) Una construcción bicistrónica para evaluar el zipCAR basado en DDD1/AD1. (d) Una construcción de control para el zipCAR con DDD1/AD1 que es idéntica a la construcción (c) con la excepción de la eliminación del segmento AD1 del componente de señalización.

Figura 5 - Expresión y función del zipCAR con cremallera de leucina ácida/básica. (a) La expresión de una línea celular BW5 no traducida, zipCAR con cremallera de leucina de control y zipCAR con cremallera de leucina se muestra como una tinción de células BW5 con CD33-Fc recombinante. (b) Liberación de IL2 del zipCAR con cremallera de leucina y el zipCAR con cremallera de leucina de control como respuesta a un antígeno análogo para diferentes relaciones del efector respecto a la diana.

Figura 6 - Expresión y función del zipCAR con DDD1/AD1. (a) La expresión de una línea celular BW5 no traducida, zipCAR con cremallera de leucina de control y zipCAR con cremallera de leucina se muestra como una tinción de células BW5 con CD33-Fc recombinante. (b) Liberación de IL2 del zipCAR con DDD1/AD1 y el zipCAR con DDD1/AD1 de control como respuesta a un antígeno análogo para diferentes relaciones del efector respecto a la diana.

Figura 7 - zipCAR con múltiples componentes de señalización. Los múltiples componentes de señalización interaccionan con el componente o componentes de direccionamiento de modo que se puedan transmitir una multitud de señales.

Figura 8 - zipCAR con múltiples componentes de señalización con motivos de heterodimerización alterados. Se expresan múltiples componentes de señalización que interaccionan con el componente o componentes de direccionamiento. Los dominios de heterodimerización de los diferentes componentes de señalización (HD2) tienen diferentes afinidades por los dominios de heterodimerización de los componentes de direccionamiento (HD1). De este modo se pueden transmitir una multitud de señales en trans donde se puede modular la intensidad promedio de cada señal.

Figura 9 - zipCAR con múltiples componentes de direccionamiento. Se expresan múltiples componentes de direccionamiento diferentes y cada componente de direccionamiento reconoce un antígeno diferente. Los componentes de señalización son capaces de interaccionar con cada componente de direccionamiento y, por lo tanto, una célula que exprese un sistema de señalización de CAR de este tipo es capaz de reconocer cada uno de los antígenos reconocidos por los componentes de direccionamiento.

Figura 10 - zipCAR con múltiples componentes de direccionamiento con diferentes dominios de heterodimerización. Se expresan múltiples componentes de direccionamiento diferentes y cada componente de direccionamiento reconoce un antígeno diferente. El dominio de heterodimerización de cada componente de direccionamiento (HD1) difiere de modo que cada componente de direccionamiento recluta componentes de señalización con una cinética diferente. Como consecuencia, la unión de diferentes antígenos análogos da como resultado diferentes intensidades de señalización.

Figura 11 - Secuencias de aminoácidos de las construcciones representadas en la Figura 4.

Figura 12 - Ilustración esquemática de un zipCAR “superCAR” con múltiples dominios de heterodimerización. Se modificó un componente de direccionamiento anti-CD19 para que expresara ocho dominios de heterodimerización. Se evaluó el efecto sobre la activación celular con varios componentes de señalización: marca de HA sola (control); marca de HA, dominio de heterodimerización y un TCRzeta; marca de HA, dominio de heterodimerización y dos dominios de TCRzeta; marca de HA, dominio de heterodimerización y tres dominios de TCRzeta.

Figura 13 - Liberación de IL2 del zipCAR superCAR con DDD1/AD1 que se muestra en la Figura 12 con varios componentes de señalización como respuesta a un antígeno análogo con diferentes niveles de expresión del antígeno diana.

Descripción detallada de la invención

RECEPTORES DE ANTÍGENO QUIMÉRICOS (CAR)

Los CAR clásicos, que se muestran esquemáticamente en la Figura 1, son proteínas transmembrana quiméricas de tipo I que conectan un dominio de reconocimiento de antígeno extracelular (ligante) con un dominio de señalización intracelular (endodominio). El ligante es típicamente un fragmento variable monocatenario (scFv) derivado de un anticuerpo monoclonal (mAb), pero puede basarse en otros formatos que comprenden un sitio de unión a antígeno de tipo anticuerpo o basado en un ligando. Puede ser necesario un dominio espaciador para aislar el ligante de la membrana y permitir una orientación adecuada. Un dominio espaciador común utilizado es el Fc de IgG1. Los espaciadores más compactos pueden ser suficientes, por ejemplo, el pedúnculo de CD8a e incluso solo la bisagra de IgG1 en solitario, dependiendo del antígeno. Un dominio transmembrana ancla la proteína en la membrana celular y conecta el espaciador al endodominio.

Los primeros diseños de CAR tenían endodominios derivados de las partes intracelulares de la cadena y de FceR1 o CD3Z. Por consiguiente, estos receptores de primera generación transmitieron la señal inmunológica 1, el cual fue suficiente para desencadenar la destrucción de linfocitos T de las células diana relacionadas, pero no pudo activar completamente al linfocito T para proliferar y sobrevivir. Para superar esta limitación, se han construido endodominios compuestos: la fusión de la parte intracelular de una molécula coestimuladora de linfocitos T con la de CD3Z da como resultado receptores de segunda generación que pueden transmitir una señal activadora y coestimuladora simultáneamente después del reconocimiento de antígeno. El dominio coestimulador más utilizado es el de CD28. Este suministra la señal coestimuladora más potente, es decir, la señal inmunológica 2 concretamente, que desencadena la proliferación de linfocitos T. También se han descrito algunos receptores que incluyen los endodominios de la familia de receptores de TNF, tales como los OX40 y 41BB estrechamente relacionados que transmiten señales de supervivencia. Incluso se han descrito ahora CAR más potentes de tercera generación que tienen endodominios capaces de transmitir señales de activación, proliferación y supervivencia.

Los ácidos nucleicos que codifican CAR pueden transferirse a linfocitos T usando, por ejemplo, vectores retrovirales. De esta manera, puede generarse una gran cantidad de linfocitos T específicos de antígeno para transferencia celular adoptiva. Cuando el CAR se une al antígeno diana, esto da como resultado la transmisión de una señal de activación al linfocito T en el que se expresa. Por tanto, el CAR dirige la especificidad y la citotoxicidad del linfocito T hacia las células que expresan el antígeno diana.

En un primer aspecto, la presente invención se refiere a un sistema CAR en el que el dominio de unión al reconocedor de antígeno/de unión a antígeno y el dominio transmembrana se proporcionan en una primera molécula (denominada en el presente documento "componente de direccionamiento"), que se localiza en la membrana celular. El dominio de señalización intracelular se proporciona en una segunda molécula intracelular (denominada en el presente documento "componente de señalización").

Cabe destacar que el componente de direccionamiento comprende un primer dominio de heterodimerización y el componente señalización comprende un segundo dominio de heterodimerización. El primer y el segundo dominio de heterodimerización son capaces de dimerizarse entre sí. La unión del primer y el segundo dominio de heterodimerización provoca la colocalización del componente de direccionamiento y el componente de señalización en la superficie celular. Esto forma un complejo de CAR funcional en la superficie celular y, por lo tanto, cuando el antígeno se une al dominio de unión a antígeno del componente de direccionamiento, se produce la señalización a través del componente de señalización.

En el presente documento la "colocalización" o "heterodimerización" de los componentes de direccionamiento y de señalización es análoga a la ligadura/reclutamiento del componente de señalización con el componente de direccionamiento a través de la unión del primer dominio de heterodimerización de la componente de direccionamiento y el segundo dominio de heterodimerización de la componente de señalización.

La señalización a través del componente de señalización puede determinarse mediante diversos métodos conocidos en la técnica. Tales métodos incluyen ensayar la transducción de señales, por ejemplo, ensayar niveles de proteínas tirosina quinasas (PTK) específicas, degradación de fosfatidilinositol 4,5-bifosfato (PIP²), activación de proteína quinasa C (PKC) y elevación de la concentración intracelular del ion calcio. Las lecturas funcionales, tales como la expansión clonal de linfocitos T, regulación positiva de marcadores de activación en la superficie celular, diferenciación en células efectoras e inducción de citotoxicidad o secreción de citocinas, también pueden utilizarse. Como ilustración, en los presentes ejemplos los inventores determinaron niveles de interleucina-2 (IL-2) producida por linfocitos T que expresan un componente de direccionamiento y un componente de señalización del sistema CAR de acuerdo con la presente invención tras la unión de antígeno al componente receptor en presencia de diversas concentraciones de un agente.

PRIMER Y SEGUNDO DOMINIO DE HETERODIMERIZACIÓN

El primer y el segundo dominio de heterodimerización del sistema CAR descritos en el presente documento pueden ser cualquier combinación de dominios que interaccionan dando como resultado la colocalización del componente de direccionamiento y el componente de señalización en la membrana celular.

Como tal, el primer dominio de heterodimerización y el segundo dominio de heterodimerización pueden ser capaces de unirse especificadamente uno a otro.

El sistema de señalización descrito en el presente documento no está limitado por la disposición de una pareja especifica de dominios de heterodimerización. El componente de direccionamiento puede comprender cualquier dominio de una pareja de dominios de heterodimerización dado siempre que el componente de señalización comprenda el dominio complementario correspondiente que permita al componente de direccionamiento y al componente de señalización colocalizarse en la membrana celular.

Los dominios de heterodimerización para su uso en el sistema CAR descritos en el presente documento no están limitados a los que interactúan en una relación de 1:1. Por ejemplo, los dominios de heterodimerización pueden interactuar para formar multímeros (por ejemplo, trímeros o tetrámeros). Los dominios pueden interactuar de una manera que un primer dominio de heterodimerización único se colocalice con múltiples (por ejemplo, 2 o 3) segundos dominios de heterodimerización. En el presente documento puede ser ventajoso tener un dominio de señalización que comprenda el segundo dominio de heterodimerización, de forma que múltiples componentes de señalización puedan colocalizarse con un único componente de direccionamiento. Esto puede ser ventajoso, por ejemplo, cuando se requiere un alto nivel de señalización al unirse el antígeno al componente de direccionamiento.

El componente de direccionamiento puede comprender una pluralidad de dominios de heterodimerización, de forma que interactúe con una pluralidad de componentes de señalización. Por ejemplo, el componente de direccionamiento puede comprender más de dos dominios de heterodimerización, tal como de 3 a 10 dominios de heterodimerización. La Figura 12 muestra un componente de direccionamiento que comprende 8 dominios de heterodimerización.

Por conveniencia, la expresión dominio de heterodimerización se usa en el presente documento para todos los dominios que median la colocalización de los componentes de direccionamiento y de señalización.

En la técnica se conoce una gran diversidad de dominios de heterodimerización apropiados, de los cuales se proporcionan ejemplos en el presente documento.

El primer y segundo dominio de heterodimerización para su uso en el presente sistema de señalización de CAR pueden ser cremalleras de leucina.

Las cremalleras de leucina son bien conocidas en la técnica (véase Hakoshima; Encyclopedia of Life Sciences; 2005, por ejemplo). La cremallera de leucina es una estructura súper secundaria que funciona como dominio de dimerización. Su presencia genera fuerzas de adhesión en hélices alfa paralelas. Una única cremallera de leucina consta de múltiples restos de leucina a intervalos de aproximadamente 7 restos, que forma una hélice alfa anfipática con una región hidrófoba a lo largo de un lado. Esta región hidrófoba proporciona un área para la dimerización, permitiendo que los motivos se "junten como en una cremallera" entre sí. Las cremalleras de leucina son normalmente de 20 a 40 aminoácidos de longitud, por ejemplo de aproximadamente 30 aminoácidos.

El primer y/o segundo dominio de heterodimerización puede comprender la secuencia mostrada como la SEQ ID NO: 1 o 2. El primer dominio de heterodimerización puede comprender la secuencia mostrada como la SEQ ID NO: 1 y el segundo dominio de heterodimerización puede comprender la secuencia mostrada como la SEQ ID NO: 2, o viceversa.

SEQ ID NO: 1: QLEKELQALEKENAQLEWELQALEKELAQ

SEQ ID NO: 2: QLEKKLQALKKKNAQLKWKLQALKKKLAQ

En determinadas realizaciones, el primer y segundo dominio de heterodimerización pueden ser cremalleras de leucina ácidas (por ejemplo, la SEQ ID NO: 1) o básicas (por ejemplo, la SEQ ID NO: 2). En particular, cuando el primer dominio de heterodimerización es una cremallera de leucina ácida, la segunda heterodimerización es una cremallera de leucina básica, y viceversa.

El primer y segundo dominio de heterodimerización para su uso en el presente sistema de señalización de CAR pueden ser el dominio de dimerización y acoplamiento (DDD1) y el dominio de anclaje (AD1). Estos dominios y la interacción entre ellos son conocidos en la técnica (Rossi et al.; PNAS; 2006; 103(18); 6841-6846).

DDD1 es una estructura en hélice alfa corta procedente de la proteína quinasa A (PKA). AD1 es una estructura en hélice alfa corta procedente de las proteínas de anclaje de la quinasa A (las AKAP).

El dominio DDD1 puede comprender la secuencia mostrada como la SEQ ID NO: 3.

SEQ ID NO: 3: SHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA

El dominio AD1 puede comprender la secuencia mostrada como la SEQ ID NO: 4

SEQ ID NO: 4: VQIEYLAKQIVDNAIQQA

Dado que la interacción DDD1/AD1 es trimérica, un dominio AD1 presente en el componente de direccionamiento reclutará cuatro dominios de señalización que comprenden un dominio DDD1. Por lo tanto, en una realización particular, el componente de direccionamiento comprende un dominio AD1 y el componente de señalización comprende un dominio DDD1.

Los dominios de heterodimerización para su uso en el presente sistema de señalización de CAR pueden proceder de la ribonuclesa bacteriana (Barnasa) y de péptidos Barnstar.

La Barnasa es la proteína ribonucleasa de Bacillus amyloliquefaciens. Está compuesta por 110 aminoácidos. Barnstar funciona para inhibir la actividad nucleasa de la Barnasa y, por lo tanto, se une a Barnstar con una afinidad muy alta (una tasa de activación de 108 s-1 M-1).

Los dominios de heterodimerización para su uso en el presente sistema de señalización de CAR pueden proceder de RNasas pancreáticas humanas y de péptido S.

Las RNasas pancreáticas humanas son endonucleasas específicas de pirimidina. El péptido S es el fragmento proteolítico enzimáticamente inactivo de la RNasa A, que carece del sitio de unión a ARN.

La presente invención también abarca variantes de las secuencias de heterodimerización descritas en el presente documento que conservan la capacidad de dimerizar con el dominio de heterodimerización correspondiente. El dominio de heterodimerización puede ser una variante que tiene 5, 4, 3, 2 o 1 mutaciones de aminoácido (inserciones, sustituciones o adiciones) siempre que el dominio siga funcionando para provocar la colocalización del componente de direccionamiento y el componente de señalización en la membrana celular.

Una secuencia variante puede tener al menos el 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia con una secuencia de un dominio de heterodimerización descrito en el presente documento, siempre que la secuencia siga funcionando para provocar la colocalización del componente de direccionamiento y el componente de señalización en la membrana celular.

COMPONENTE DE DIRECCIONAMIENTO

La expresión componente de direccionamiento es análoga a 'componente receptor'.

La presente invención proporciona un componente de direccionamiento que comprende un dominio de unión a antígeno, un dominio espaciador opcional, un dominio transmembrana y un primer dominio de heterodimerización. Cuando se expresa en una célula, el componente de direccionamiento se localiza en la membrana celular. En este caso, el dominio de unión a antígeno de la molécula se orienta sobre la cara extracelular de la membrana y el primer dominio de heterodimerización se localiza en la cara intracelular de la membrana.

El componente de direccionamiento por tanto proporciona la función de unión a antígeno del sistema CAR de la presente invención.

DOMINIO DE UNIÓN A ANTÍGENO

El dominio de unión a antígeno es la porción de un CAR clásico que reconoce el antígeno. En el sistema de señalización de la presente invención la unión al antígeno se localiza dentro del componente de direccionamiento.

Se conocen numerosos dominios de unión a antígeno en la técnica, incluidos los basados en el sitio de unión a antígeno de un anticuerpo, miméticos de anticuerpos y receptores de linfocitos T. Por ejemplo, el dominio de unión a antígeno puede comprender: un fragmento variable monocatenario (scFv) derivado de un anticuerpo monoclonal; un ligando natural del antígeno diana; un péptido con suficiente afinidad por la diana; un ligante de dominio único tal como uno de camélido; un ligante artificial solo, como un Darpin; o una cadena sencilla derivada de un receptor de linfocitos T.

Se conocen diversos antígenos asociados a tumor (AAT; en inglés, TAA), como se muestra a continuación en la Tabla 1. El dominio de unión a antígeno utilizado en la presente invención puede ser un dominio que sea capaz de unirse a un AAT como se indica en la misma.

T l 1

DOMINIO TRANSMEMBRANA

El dominio transmembrana es la secuencia de un CAR clásico que se extiende por la membrana. En el sistema de señalización de la presente invención el dominio transmembrana se localiza en el componente de direccionamiento. Puede comprender una hélice alfa hidrófoba. El dominio transmembrana puede obtenerse de CD28, que da una buena estabilidad de receptor.

PÉPTIDO SEÑAL

El componente de direccionamiento del sistema CAR descrito en el presente documento puede comprender un péptido señal, para que cuando el componente de direccionamiento se expresa en una célula, tal como un linfocito T, la proteína naciente se dirige al retículo endoplasmático y posteriormente a la superficie celular, donde se expresa.

El núcleo del péptido señal puede contener un largo tramo de aminoácidos hidrófobos que tiene tendencia a formar una única hélice alfa. El péptido señal puede empezar con un tramo corto de aminoácidos cargados positivamente, que ayuda a reforzar la topología adecuada del polipéptido durante la translocación. Al final del péptido de señal normalmente hay un tramo de aminoácidos que reconoce y escinde la peptidasa señal. La peptidasa señal puede escindir durante o después de completarse la translocación, para generar un péptido de señal libre y una proteína madura. Después, los péptidos de señal libres se digieren por proteasas específicas.

El péptido señal puede estar en el extremo amino de la molécula.

El péptido señal puede comprender la secuencia mostrada como la SEQ ID NO: 5, 6 u 7 o una variante de la misma que tiene 5, 4, 3, 2 o 1 mutación(ones) de aminoácido (inserciones, sustituciones o adiciones) con la condición de que el péptido señal aún funcione para causar la expresión del CAR en la superficie celular.

SEQ ID NO: 5: MGTSLLCWMALCLLGADHADG

El péptido señal de la SEQ ID NO: 5 es compacto y altamente eficaz. Se predice que proporcione aproximadamente un 95 % de escisión después de la glicina terminal, dando una eliminación eficaz por la peptidasa señal.

SEQ ID NO: 6: MSLPVTALLLPLALLLHAARP

El péptido señal de la SEQ ID NO: 6 se deriva de la IgG1.

SEQ ID NO: 7: MAVPTQVLGLLLLWLTDARC

El péptido señal de la SEQ ID NO: 7 se deriva de la CD8.

DOMINIO ESPACIADOR

El sistema CAR descrito en el presente documento puede comprender una secuencia espadadora para conectar el dominio de unión a antígeno con el dominio transmembrana en el componente de direccionamiento. Un espaciador flexible permite que el dominio de unión a antígeno se oriente en diferentes direcciones para posibilitar la unión.

La secuencia espaciadora puede, por ejemplo, comprender una región Fc de IgG1, una bisagra de IgG1 o un pedúnculo de CD8 humana o el pedúnculo de c D8 de ratón. El espaciador puede comprender, como alternativa, una secuencia enlazadora alternativa que tiene una longitud y/o propiedades espaciadoras de dominio similares como una región Fc de IgG1, una bisagra de IgG1 o un pedúnculo de CD8. Un espaciador de IgG1 humana puede alterarse para eliminar los motivos de unión a Fc.

Los ejemplos de secuencias de aminoácidos para estos espaciadores se dan a continuación:

SEQ ID NO: 8 (bisagra-CH2CH3 de lgG1 humana)

AEPKSPDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMIARTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFN WYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTIS KAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVL DSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKKD SEQ ID NO: 9 (pedúnculo de CD8 humana):

TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDI SEQ ID NO: 10 (bisagra de IgG1 humana):

AEPKSPDKTHTCPPCPKDPK SEQ ID NO: 11 (ectodominio de CD2)

KEITNALETWGALGQDIN LDIPSFQMSDDIDDIKWEKTSDKKKIAQFRKEKETFKEKDTYKLF KNGTLKIKHLKTDDQDIYKVSIYDTKGKNVLEKIFDLKIQERVSKPKISWTCINTTLTCEVMNG TDPELNLYQDGKHLKLSQRVITHKWTTSLSAKFKCTAGNKVSKESSVEPVSCPEKGLD SEQ ID NO: 12 (ectodominio de CD34)

SLDNNGTATPELPTQGTFSNVSTNVSYQETTTPSTLGSTSLHPVSQHGNEATTNITETTVKF TSTSVITSVYGNTNSSVQSQTSVISTVFTTPANVSTPETTLKPSLSPGNVSDLSTTSTSLATS PTKPYTSSSPILSDIKAEIKCSGIREVKLTQGICLEQNKTSSCAEFKKDRGEGLARVLCGEEQ ADADAGAQVCSLLLAQSEVRPQCLLLVLANRTEISSKLQLMKKHQSDLKKLGILDFTEQDVA SHQSYSQKT COMPONENTE DE DIRECCIONAMIENTO QUE COMPRENDE UNA PLURALIDAD DE PRIMEROS DOMINIOS DE HETERODIMERIZACIÓN

El componente de direccionamiento descrito en el presente documento puede comprender una pluralidad de primeros dominios de heterodimerización y por tanto ser capaz de reclutar más de un componente de señalización.

La pluralidad de primeros dominios de heterodimerización puede estar presente en un único dominio intracelular del componente receptor.

El componente de direccionamiento puede comprender un número adecuado de dominios transmembrana, de modo que cada primer dominio de unión se orienta sobre la cara intracelular de la membrana celular. Por ejemplo, el componente de direccionamiento puede comprender 3, 5, 7, 9, 11 o más dominios transmembrana. De esta manera, un componente de direccionamiento único puede reclutar múltiples componentes de señalización que amplifican la señalización en respuesta al antígeno.

Los primeros dominios de heterodimerización pueden ser cada uno de ellos variantes que tienen una afinidad diferente por el segundo dominio de heterodimerización del componente de señalización.

COMPONENTES DE DIRECCIONAMIENTO MÚLTIPLES

El sistema de CAR descrito en el presente documento puede comprender dos o más componentes de direccionamiento, cada uno reconociendo diferentes antígenos, pero formando parte del mismo dominio de heterodimerización intracelular. Tal sistema de CAR sería capaz de reconocer múltiples antígenos (Figuras 9 y 10). Esto podría ser útil, por ejemplo, para evitar un escape tumoral.

Los primeros dominios de heterodimerización de los componentes de direccionamiento descritos en el presente documento pueden diferir en restos que dictan su afinidad por el segundo dominio de heterodimerización del componente de señalización. De esta manera, un sistema de CAR puede ajustarse de modo que la señalización en respuesta a un antígeno es mayor o menor que la respuesta a otro (Figura 10). Esto podría ser útil, por ejemplo, cuando se actúa sobre dos antígenos tumorales simultáneamente pero uno se expresa en una densidad mayor que el otro. La respuesta a este antígeno podría ajustarse a la baja para evitar la toxicidad causada por sobreestimulación.

Los métodos adecuados para alterar los restos de aminoácidos del primero o segundo dominio de heterodimerización de modo que se altere la afinidad de unión entre los dos dominios, son conocidos en la técnica e incluyen sustitución, adición y eliminación de aminoácidos utilizando mutagénesis tanto dirigida como aleatoria. Los métodos para determinar la afinidad de unión entre un primer dominio de heterodimerización y un segundo dominio de heterodimerización son también bien conocidos en la técnica e incluyen la predicción bioinformática de las interacciones proteína-proteína, electroforesis de afinidad, resonancia del plasmón superficial, interferometría de biocapa, interferometría de polarización dual, dispersión de luz estática y dispersión de luz dinámica.

COMPONENTE DE SEÑALIZACIÓN INTRACELULAR

La presente invención también proporciona un componente de señalización intracelular que comprende un dominio de señalización y un segundo dominio de heterodimerización. El componente de señalización intracelular es una molécula soluble y por tanto, se localiza en el citoplasma cuando se expresa en una célula, por ejemplo, un linfocito T.

No se produce señalización a través del dominio de señalización del componente de señalización intracelular a menos que esté colocalizado con el componente de direccionamiento proporcionado por la presente invención.

DOMINIO DE SEÑALIZACIÓN INTRACELULAR

El dominio de señalización intracelular es la porción de transmisión de señales de un CAR clásico. En el sistema de señalización de la presente invención el dominio de señalización intracelular (dominio de señalización) forma parte del componente de señalización intracelular. Cuando se expresa en una célula, por ejemplo un linfocito T, el componente de direccionamiento unido a la membrana y el componente de señalización intracelular se acercan a través de la interacción entre el primer y segundo dominio de heterodimerización. Después del reconocimiento del antígeno, el grupo de receptores, CD45 y CD148 nativos se excluyen de la sinapsis y se transmite una señal a la célula.

Como tal, el dominio de señalización del componente de señalización intracelular es análogo al endodominio de una molécula de CAR clásica.

El componente del dominio de señalización utilizado de forma más habitual es el del endodominio de CD3-zeta, que contiene 3 ITAM. Este transmite una señal de activación al linfocito T después de que se una al antígeno. CD3-zeta puede no proporcionar una señal de activación completamente competente y podría ser necesaria una señalización coestimuladora adicional. Por ejemplo, pueden utilizarse CD28 y OX40 quiméricos con CD3-Zeta para transmitir una señal proliferativa/de supervivencia o pueden utilizarse los tres juntos (ilustrado en la Figura 1B).

El componente de señalización descrito en el presente documento comprende un dominio de señalización, puede comprender el endodominio de CD3-Zeta en solitario, el endodominio de CD3-Zeta con el de CD28 u OX40 o el endodominio de CD28 y el endodominio de OX40 y de CD3-Zeta (Figura 1).

El componente de señalización puede comprender uno o más de los siguientes: un endodominio de ICOS, un endodominio de CD27, un endodominio de BTLA, un endodominio de CD30, un endodominio de GITR y un endodominio de HVEM.

El componente de señalización de un sistema CAR descrito en el presente documento puede comprender la secuencia mostrada como la SEQ ID NO: 13 a 21 o una variante de las mismas que tiene al menos el 80 % de identidad de secuencia.

SEQ ID NO: 13 - Endodominio de CD3 Z

RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGL

YNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR SEQ ID NO: 14 - Endodominios de CD28 y CD3 Zeta

SKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQ LYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKG ERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR SEQ ID NO: 15 - Endodominios de CD28, 0X40 y CD3 Zeta

SKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRDQRLPPDAHKPPGGGSFR TPIQEEQADAHSTLAKIRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDP EMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYD ALHMQALPPR SEQ ID NO: 16 - Endodominio de ICOS

CWLTKKKYSSSVHDPNGEYMFMRAVNTAKKSRLTDVTL SEQ ID NO: 17 - Endodominio de CD27

QRRKYRSNKGESPVEPAEPCHYSCPREEEGSTIPIQEDYRKPEPACSP SEQ ID NO: 18 - Endodominio de BTLA

RRHQGKQNELSDTAGREINLVDAHLKSEQTEASTRQNSQVLLSETGIYDNDPDLCFRMQE GSEVYSNPCLEENKPGIVYASLNHSVIGPNSRLARNVKEAPTEYASICVRS SEQ ID NO: 19 - Endodominio de CD30

HRRACRKRIRQKLHLCYPVQTSQPKLELVDSRPRRSSTQLRSGASVTEPVAEERGLMSQP LMETCHSVGAAYLESLPLQDASPAGGPSSPRDLPEPRVSTEHTNNKIEKIYIMKADTVIVGT VKAELPEGRGLAGPAEPELEEELEADHTPHYPEQETEPPLGSCSDVMLSVEEEGKEDPLPT AASGK SEQ ID NO: 20 - Endodominio de GITR

QLGLHIWQLRSQCMWPRETQLLLEVPPSTEDARSCQFPEEERGERSAEEKGRLGDLWV

SEQ ID NO: 21 - Endodominio de HVEM

CVKRRKPRGDVVKVIVSVQRKRQEAEGEATVIEALQAPPDVTTVAVEETIPSFTGRSPNH

Una secuencia variante puede tener al menos un 80 %, un 85 %, un 90 %, un 95 %, un 98 % o un 99 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 13 a 21, siempre que la secuencia proporcione un dominio de señalización intracelular eficaz.

El componente de señalización intracelular puede comprender una pluralidad de dominios de señalización, por ejemplo, de 2 a 5 dominios de señalización, que pueden ser iguales o diferentes. En particular, el componente de señalización puede comprender 2 o 3 copias del mismo dominio de señalización intracelular.

COMPONENTES DE SEÑALIZACIÓN MÚLTIPLES

El sistema de señalización de la presente invención puede comprender una pluralidad de componentes de señalización, cada uno comprendiendo un dominio de señalización y un segundo dominio de heterodimerización, en donde cada segundo dominio de unión está unido por el mismo primer dominio de unión del componente receptor pero los dominios de señalización comprenden diferentes endodominios (Figuras 7 y 8). De esta manera, pueden activarse múltiples endodominios distintos de forma simultánea. Esto es ventajoso con respecto a un dominio de señalización compuesto, ya que cada dominio de señalización permanece sin que otros dominios de señalización lo estorben.

Si cada componente de señalización comprende un segundo dominio de heterodimerización que difiere en restos que alteran su afinidad por el primer dominio de heterodimerización del componente receptor, los componentes de señalización que comprenden diferentes dominios de señalización se ligarán al primer dominio de unión con diferentes cinéticas (Figura 8). Esto permite un mayor control sobre la señalización en respuesta a la unión a antígeno por el componente receptor según se reclutan diferentes componentes de señalización para el componente receptor en diversas cinéticas/dinámicas. Esto es ventajoso dado que, en vez de una proporción igual fija de señal transmitida por un endodominio compuesto, una señal de activación de linfocitos T puede requerir diferentes proporciones de distintas señales inmunológicas.

ÁCIDO NUCLEICO

En el presente documento se describe un ácido nucleico que codifica el componente de direccionamiento del segundo aspecto y un ácido nucleico que codifica un componente de señalización del tercer aspecto.

Como se utilizan en el presente documento, las expresiones "polinucleótido", "nucleótido" y "ácido nucleico" pretenden ser sinónimas entre sí.

Un experto en la materia entenderá que numerosos polinucleótidos y ácidos nucleicos distintos pueden codificar el mismo polipéptido, como resultado de la degeneración del código genético. Además, debe entenderse que las personas expertas pueden, utilizando técnicas de rutina, hacer sustituciones de nucleótidos que no afecten a la secuencia de polipéptido codificada por los polinucleótidos descritos en este caso, para reflejar el uso de codones de cualquier organismo hospedador particular en el que se han de expresar los polipéptidos.

Los ácidos nucleicos de acuerdo con la invención pueden comprender ADN o ARN. Pueden ser monocatenarios o bicatenarios. Además, pueden ser polinucleótidos que incluyan dentro de ellos nucleótidos sintéticos o modificados. En la técnica se conocen varios tipos distintos de modificación de oligonucleótidos. Estas incluyen esqueletos de metilfosfonato y fosforotioato, adición de cadenas de acridina o polilisina en los extremos 3' y/o 5' de la molécula. Para los fines del uso como se describe en el presente documento, debe entenderse que los polinucleótidos pueden modificarse por cualquier método disponible en la técnica. Dichas modificaciones pueden llevarse a cabo para potenciar in vivo la actividad o vida útil de polinucleótidos de interés.

Los términos "variante", "homólogo" o "derivado" en relación con una secuencia de nucleótidos incluyen cualquier sustitución de, variación de, modificación de, reemplazo de, deleción de o adición de un (o más) ácido nucleico de o en la secuencia.

CONSTRUCCION DE ÁCIDO NUCLEICO

La presente invención también proporciona una construcción de ácido nucleico que codifica tanto el componente de direccionamiento como el componente de señalización.

La construcción de ácido nucleico puede producir un polipéptido que comprende el componente de direccionamiento y el componente de señalización unidos por un sitio de escisión. El sitio de escisión puede ser autoescindible, de modo que cuando se produce el polipéptido, se escinde inmediatamente en el componente receptor y el componente de señalización sin necesidad de ninguna actividad de escisión externa.

Por ejemplo, la presente invención proporciona una construcción de ácido nucleico que codifica un sistema de señalización de CAR de acuerdo con el primer aspecto de la invención, en donde la secuencia de ácido nucleico comprende la estructura siguiente:

A - X - B

en la que A y B son secuencias de ácido nucleico que codifican un componente de direccionamiento o un componente de señalización descritos en el presente documento; y X es una secuencia de ácido nucleico que codifica un sitio de escisión, de modo que A es escindido de B después de la traducción.

El sitio de escisión puede ser cualquier secuencia que permita que el polipéptido que comprende el componente de direccionamiento y el componente de señalización se separe.

El término "escisión" se usa en el presente documento por conveniencia, pero el sitio de escisión puede provocar que el componente de direccionamiento y el componente de señalización se separen en entidades individuales por un mecanismo que no sea la escisión clásica. Por ejemplo, para el péptido 2A autoescindible del virus de la fiebre aftosa (VFA) (véase más abajo), se han propuesto diversos modelos para explicar la actividad de "escisión": proteólisis por una proteinasa de la célula hospedadora, autoproteólisis o un efecto traduccional (Donnelly et al (2001) J. Gen. Virol. 82:1027-1041). El mecanismo exacto de tal "escisión" no es importante para los fines de la presente invención, siempre y cuando el sitio de escisión, cuando se coloca entre secuencias de ácido nucleico que codifican el componente de direccionamiento y el componente de señalización, provoque que el componente de direccionamiento y el componente de señalización se expresen como entidades separadas.

El sitio de escisión puede ser un sitio de escisión de furina.

La furina es una enzima que pertenece a la familia de la proproteína convertasa de tipo subtilisina. Los miembros de esta familia son proproteína convertasas que procesan proteínas precursoras latentes en sus productos biológicamente activos. La furina es una serina endoproteasa dependiente de calcio que puede escindir de forma eficaz proteínas precursoras en sus sitios de procesamiento de aminoácidos básicos emparejados. Los ejemplos de sustratos de furina incluyen la hormona proparatiroidea, el precursor del factor de crecimiento transformante beta 1, la proalbúmina, la probeta-secretasa, la metaloproteinasa de matriz de membrana de tipo 1, la subunidad beta del profactor de crecimiento nervioso y el factor de von Willebrand. La furina escinde proteínas justo cadena abajo de una secuencia diana de aminoácidos básicos (canónicamente, Arg-X-(Arg/Lys)-Arg') y está enriquecida en el aparato de Golgi.

El sitio de escisión puede ser un sitio de escisión del virus del grabado del tabaco (VGT).

La proteasa de VGT es una cisteína proteasa de elevada especificidad secuencial que es una proteasa de tipo quimotripsina. Es muy específica para su sitio de escisión diana y, por lo tanto, se usa con frecuencia para la escisión controlada de proteínas de fusión tanto in vitro como in vivo. El sitio de escisión del VGT consenso es ENLYFQ\S (donde '\' denota el enlace peptídico escindido). Las células de mamífero, tales como las células humanas, no expresan la proteasa de VGT. Por lo tanto, en realizaciones en las que la presente construcción de ácido nucleico comprende un sitio de escisión de VGT y se expresa en una célula de mamífero, la proteasa de VGT exógena también debe expresarse en la célula de mamífero.

El sitio de escisión puede codificar un péptido autoescindible.

Un "péptido autoescindible" se refiere a un péptido que funciona de tal manera que cuando se produce el polipéptido que comprende el componente de direccionamiento y el componente de señalización y el péptido autoescindible, se "escinde" o se separa inmediatamente en un primer y segundo polipéptido distinto y discreto sin la necesidad de ninguna actividad de escisión externa.

El péptido autoescindible puede ser un péptido autoescindible 2A de un aftovirus o un cardiovirus. La escisión primaria 2A/2B de los aftovirus y cardiovirus está mediada por la "escisión" de 2A en su propio extremo C. En los aftovirus, tales como los virus de la fiebre aftosa (VFA) y el virus de la rinitis equina A, la región 2A es una sección corta de aproximadamente 18 aminoácidos, que, junto con el resto N-terminal de la proteína 2B (un resto de prolina conservado) representa un elemento autónomo capaz de mediar la "escisión" en su propio extremo C (Donelly et al (2001), como anteriormente).

Se han descubierto secuencias "similares a 2A" en picornavirus que no sean aftovirus o cardiovirus, virus de insectos 'tipo picornavirus', rotavirus de tipo C y secuencias repetidas dentro de Trypanosoma spp, y una secuencia bacteriana (Donnelly et al (2001), como anteriormente). El sitio de escisión puede comprender una de estas secuencias de tipo 2A, tal como:

YHADYYKQRLIHDVEMNPGP (SEQ ID NO: 22)

HYAGYFADLLIHDIETNPGP (SEQ ID NO: 23)

QCTNYALLKLAGDVESNPGP (SEQ ID NO: 24)

ATNFSLLKQAGDVEENPGP (SEQ ID NO: 25)

AARQMLLLLSGDVETNPGP (SEQ ID NO: 26)

RAEGRGSLLTCGDVEENPGP (SEQ ID NO: 27)

TRAEIEDELIRAGIESNPGP (SEQ ID NO: 28)

TRAEIEDELIRADIESNPGP (SEQ ID NO: 29)

AKFQIDKILISGDVELNPGP (SEQ ID NO: 30)

SSIIRTKMLVSGDVEENPGP (SEQ ID NO: 31)

CDAQRQKLLLSGDIEQNPGP (SEQ ID NO: 32)

YPIDFGGFLVKADSEFNPGP (SEQ ID NO: 33)

El sitio de escisión puede comprender la secuencia de tipo 2A mostrada como la SEQ ID NO: 27 (RAEGRGSLLTCGDVEENPGP).

En el presente documento se describe un kit que comprende un ácido nucleico que codifica el componente de direccionamiento y/o un ácido nucleico que codifica un componente de señalización.

VECTOR

En el presente documento se describe un vector o kit o vectores, que comprende una o más secuencias/construcciones de ácido nucleico que codifica(n) un componente de direccionamiento y/o componente de señalización descritos en el presente documento. Tal vector puede utilizarse para introducir la(s) secuencia(s) de ácido nucleico en una célula hospedadora para que exprese el componente de direccionamiento y el componente de señalización del sistema CAR descrito en el presente documento.

El vector puede ser, por ejemplo, un plásmido o un vector viral, tal como un vector retrovírico o un vector lentivírico o un vector basado en transposón o ARNm sintético.

El vector puede tener la capacidad de transfectar o transducir un linfocito T o un linfocito NK.

CÉLULA

La presente invención también se refiere a una célula, tal como una célula inmunitaria que comprende el sistema CAR de acuerdo con el primer aspecto de la invención.

La célula puede comprender un ácido nucleico o un vector descritos en el presente documento.

La célula puede comprender un componente receptor y un componente de señalización descritos en el presente documento.

La célula puede comprender al menos un componente de direccionamiento descrito en el presente documento. Por ejemplo la célula puede comprender uno, dos, tres, cuatro, cinco hasta una pluralidad de componentes de direccionamiento.

Las célula T puede ser células T o linfocitos T que son un tipo de linfocitos que desempeñan un papel central en la inmunidad mediada por células. Se pueden distinguir de otros linfocitos, tales como los linfocitos B y los linfocitos citolíticos naturales (linfocitos NK), por la presencia de un receptor de linfocitos T (TCR; del inglés, T-cell receptor) en la superficie celular. Hay diversos tipos de linfocitos T, tal como se resume a continuación.

Los linfocitos T auxiliares (linfocitos TH) ayudan a otros glóbulos blancos en los procesos inmunológicos, incluyendo la maduración de linfocitos B en células plasmáticas y linfocitos B de memoria y la activación de linfocitos T citotóxicos y macrófagos. Los linfocitos TH expresan CD4 en su superficie. Los linfocitos t H se activan cuando las moléculas MHC de clase II les presentan antígenos peptídicos en la superficie de las células presentadoras de antígenos (APC; del inglés, antigen presenting cells). Estas células pueden diferenciarse en uno de varios subtipos, incluyendo TH1, TH2, TH3, TH17, Th9 o TFH, que secretan diferentes citocinas para facilitar diferentes tipos de respuestas inmunitarias.

Los linfocitos T citolíticos (linfocitos TC o CTL) destruyen las células infectadas por virus y células tumorales y también están implicados en el rechazo de trasplantes. Los c Tl expresan el CD8 en su superficie. Estas células reconocen sus dianas al unirse al antígeno asociado con MHC de clase I, que está presente en la superficie de todas las células nucleadas. A través de IL-10, la adenosina y otras moléculas secretadas por los linfocitos T reguladores, las células CD8+ pueden inactivarse a un estado anérgico, que previene enfermedades autoinmunitarias tales como la encefalomielitis autoinmunitaria experimental.

Los linfocitos T de memoria son un subconjunto de linfocitos T específicos de antígeno que persisten a largo plazo después de que se resuelve una infección. Se expanden rápidamente a un gran número de linfocitos T efectores tras la reexposición a su antígeno relacionado, proporcionando así al sistema inmune "memoria" contra infecciones pasadas. Los linfocitos T de memoria comprenden tres subtipos: linfocitos T de memoria central (linfocitos TCM) y dos tipos de linfocitos T efectores de memoria (linfocitos TEM y linfocitos TEMRA). Los linfocitos de memoria pueden ser CD4+ o CD8+. Los linfocitos T de memoria típicamente expresan la proteína de la superficie celular CD45RO.

Los linfocitos T reguladores (linfocitos Treg), anteriormente conocido como linfocitos T supresores, son cruciales para el mantenimiento de la tolerancia inmunológica. Su función principal es detener la inmunidad mediada por linfocitos T hacia el final de una reacción inmunitaria y suprimir linfocitos T autorreactivos que escaparon al proceso de selección negativa en el timo.

Se han descrito dos clases principales de linfocitos Treg CD4+: los linfocitos Treg naturales y los linfocitos Treg adaptativos.

Los linfocitos Treg de origen natural (también conocidos como linfocitos Treg CD4+CD25+FoxP3+) surgen en el timo y se han relacionado con interacciones entre los linfocitos T en desarrollo con células dendríticas mieloides (CD11c+) y plasmacitoides (CD123+) que se han activado con TSLP. Los linfocitos Treg de origen natural se pueden distinguir de otros linfocitos T por la presencia de una molécula intracelular llamada FoxP3. Las mutaciones del gen FOXP3 pueden prevenir el desarrollo de linfocitos T reguladores, causando la enfermedad autoinmunitaria letal IPEX.

Los linfocitos Treg adaptativos (también conocidos como linfocitos Tr1 o linfocitos Th3) pueden originarse durante una respuesta inmunitaria normal.

La célula puede ser un linfocito citolítico natural (o linfocito NK). Los linfocitos NK forman parte del sistema inmunitario innato. Los linfocitos NK proporcionan respuestas rápidas a las señales innatas de las células infectadas por virus de manera independiente del MHC.

Los linfocitos NK (que pertenecen al grupo de las células linfoides innatas) se definen como linfocitos granulares grandes (LGL) y constituyen el tercer tipo de células diferenciadas del progenitor linfoide común que genera linfocitos B y T. Se sabe que los linfocitos NK se diferencian y maduran en la médula ósea, ganglio linfático, bazo, amígdalas y timo, donde a continuación, entran en la circulación.

Las células CAR descritas anteriormente pueden ser cualquiera de los tipos de células mencionados anteriormente.

Los linfocitos T o NK que expresan las moléculas del sistema CAR de acuerdo con el primer aspecto de la invención pueden crearse ex vivo de la propia sangre periférica del paciente (1a parte) o en el escenario de un trasplante de células madre hematopoyéticas de sangre periférica del donante (2a parte) o de sangre periférica de un donante no relacionado (3a parte).

Como alternativa, los linfocitos T o NK que expresan las moléculas del sistema CAR descrito en el presente documento pueden derivarse de la diferenciación ex vivo de células progenitoras inducibles o células progenitoras embrionarias a linfocitos T o NK. Como alternativa, se puede usar una línea de linfocitos T inmortalizada que conserva su función lítica y pueda actuar como un agente terapéutico.

En todas estas realizaciones, las células CAR se generan mediante la introducción de ADN o ARN que codifica el componente de direccionamiento y el componente de señalización por uno de muchos medios, incluyendo la transducción con un vector viral, la transfección con ADN o ARN.

La célula CAR descrita en el presente documento puede ser un linfocito T o NK ex vivo de un sujeto. El linfocito T o NK puede ser de una muestra de células mononucleares de sangre periférica (CMSP). Los linfocitos T o NK pueden activarse y/o expandirse antes de su transducción con el ácido nucleico que codifica las moléculas que proporcionan el sistema CAR descrito en el presente documento, por ejemplo, mediante tratamiento con un anticuerpo monoclonal anti-CD3.

El linfocito T o NK descrito en el presente documento puede fabricarse mediante:

(i) aislamiento de una muestra que contiene linfocitos T o NK procedente de un sujeto u otras fuentes enumeradas anteriormente; y

(ii) transducción o transfección de los linfocitos T o NK con una o más secuencias de ácido nucleico que codifica(n) el componente de direccionamiento y/o componente de señalización del sistema CAR descrito en el presente documento.

A continuación, los linfocitos T o NK pueden purificarse, por ejemplo, seleccionarse basándose en la expresión del dominio de unión a antígeno del polipéptido de unión a antígeno.

En el presente documento se describe un kit que comprende un linfocito T o NK que comprende el sistema CAR descrito en el presente documento.

COMPOSICIÓN FARMACÉUTICA

La presente invención también se refiere a una composición farmacéutica que contiene una pluralidad de células que expresan los componentes del sistema CAR del primer aspecto de la invención. La composición farmacéutica puede comprender adicionalmente un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable. La composición farmacéutica puede comprender opcionalmente uno o más polipéptidos y/o compuestos farmacéuticamente activos adicionales. Tal formulación puede, por ejemplo, estar en una forma adecuada para infusión intravenosa.

MÉTODOS DE TRATAMIENTO

En el presente documento se describe un método para tratar y/o prevenir una enfermedad que comprende la etapa de administrar las células descritas en el presente documento (por ejemplo, en una composición farmacéutica como se ha descrito anteriormente) a un sujeto.

Un método para tratar una enfermedad se refiere al uso terapéutico de las células descritas en el presente documento. En el presente documento, las células se pueden administrar a un sujeto que tenga una enfermedad o afección existente para disminuir, reducir o mejorar al menos un síntoma asociado con la enfermedad y/o para frenar, reducir o bloquear la progresión de la enfermedad.

El método para prevenir una enfermedad se refiere al uso profiláctico de las células descritas en el presente documento. En el presente documento, tales células se pueden administrar a un sujeto que aún no ha contraído la enfermedad y/o que no muestra ningún síntoma de la enfermedad, para prevenir o afectar a la causa de la enfermedad o para reducir o prevenir el desarrollo de al menos un síntoma asociado con la enfermedad. El sujeto puede tener una predisposición o puede creerse que está en riesgo de desarrollar la enfermedad.

El método puede implicar las etapas de:

(i) aislar una muestra que contiene linfocitos T o NK;

(ii) transducir o transfectar tales células con una secuencia de ácido nucleico o vector descritos en el presente documento;

(iii) administrar las células de (ii) a un sujeto.

La muestra que contiene linfocitos T o NK puede ser aislada de un sujeto u otras fuentes, por ejemplo como se describe anteriormente. Los linfocitos T o NK pueden ser aislados a partir de la propia sangre periférica del sujeto (1er grupo), o en el contexto de un trasplante de células madre hematopoyéticas de sangre periférica del donante (2° grupo), o de sangre periférica de un donante no relacionado (3er grupo).

En el presente documento se describe una célula CAR para usar en el tratamiento y/o prevención de una enfermedad. También se proporciona el uso de una célula CAR descrita en el presente documento en la fabricación de un medicamento para el tratamiento y/o prevención de una enfermedad.

La enfermedad a tratar y/o prevenir mediante los métodos descritos en el presente documento pueden ser una infección, tal como una infección viral.

Los métodos descritos en el presente documento pueden ser también para el control de respuestas inmunitarias patológicas, por ejemplo, en enfermedades autoinmunitarias, alergias y rechazo de injerto contra huésped.

Los métodos pueden ser para el tratamiento de una enfermedad cancerosa, tal como cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer de endometrio, cáncer de riñón (células renales), leucemia, cáncer de pulmón, melanoma, linfoma no Hodgkin, cáncer de páncreas, cáncer de próstata y cáncer de tiroides.

Las células CAR de la presente invención pueden ser capaces de destruir células diana, tales como células cancerosas. La célula diana puede ser reconocible por la expresión de un AAT, por ejemplo, la expresión de un AAT proporcionado anteriormente en la Tabla 1.

Las células CAR y las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento pueden ser para utilizarse en el tratamiento y/o prevención de las enfermedades descritas anteriormente.

La invención se describirá ahora con más detalle mediante Ejemplos, que pretenden servir para ayudar a un experto en la materia a llevar a cabo la invención y de ninguna manera pretenden limitar el alcance de la invención.

Ejemplos

Ejemplo 1 - Producción de zipCAR

Se construyeron dos zipCAR diferentes (véase la Figura 3).

zipCAR con cremallera de leucina

Se construyó un zipCAR de modo que el componente de direccionamiento reconociera a CD33 a través de un scFv anti-CD33 y tuviera un endodominio que comprendiera la cremallera de leucina P1 básica. Este endodominio estaba conectado con el dominio de transmembrana mediante una secuencia conectora intracelular corta derivada de CD4.

Este componente de direccionamiento se coexpresó con un dominio de señalización que comprendía la cremallera de leucina P1 ácida como dominio de heterodimerización fusionado mediante un conector de serina-glicina corto con un dominio de señalización que comprendía el endodominio CD3-Zeta.

Ambos componentes se coexpresaron en el mismo vector retrovírico usando el péptido autoescindible FMD-2A (véase la Figura 4).

zipCAR con DDD1/AD1

El zipCAR con DDD1/AD1 se construyó de manera análoga al zipCAR con cremallera de leucina. El endodominio del componente de direccionamiento comprendía DDD1 y el componente de señalización era una fusión entre AD1 y el endodominio CD3-Zeta (véase la Figura 4).

Para cada zipCAR, el componente de direccionamiento y el componente de señalización son independientes entre sí tras la traducción inicial y la autoescisión por parte del péptido FMD-2A. El componente de direccionamiento se dirige hacia la superficie celular mediante su péptido señal y se ancla en la membrana mediante su dominio de transmembrana, mientras que el componente de señalización permanece en solución en el citosol. A continuación, los dos componentes se asocian mediante sus dominios de heterodimerización respectivos.

Se generaron construcciones de control para cada sistema de zipCAR. Estas fueron idénticas a las construcciones de zipCAR correspondientes, con la excepción de que los dominios de heterodimerización de los componentes de señalización se eliminaron (véase la Figura 4). Por tanto, no se pudo producir la asociación intracelular.

La secuencia de aminoácidos de cada una de las construcciones descritas se muestra en la Figura 11.

La línea de linfocitos T de murino BW5 se tradujo con cada una de las construcciones de zipCAR y de control respectivas. La expresión del dominio de direccionamiento de CAR se pudo detectar mediante la tinción de los linfocitos T con la fusión CD33-Fc recombinante, la tinción con anticuerpo secundario adecuado y el análisis de los linfocitos T mediante citometría de flujo (véanse las Figuras 5 y 6).

A continuación, los linfocitos T se estimularon con microesferas recubiertas con el antígeno análogo (CD33) con diferentes relaciones de las microesferas respecto a los linfocitos T. Se midió la liberación de IL-2 después de esta estimulación con el antígeno. Los zipCAR respondieron al antígeno mientras que las construcciones de control no respondieron (véanse las Figuras 5 y 6).

Ejemplo 2 - Producción de zipCAR superCAR

Se construyó un zipCAR con DDD1/AD1, en el que el componente de direccionamiento comprendía un scFv contra CD19, un espaciador de IgGFc y ocho dominios de heterodimerización (Figura 12). El componente de direccionamiento se evaluó en combinación con varios componentes de señalización diferentes que tenían 0, 1, 2 o 3 copias del dominio de señalización TCR zeta. Debido a que DD1 se une a AD1 con una estequiometría 2:1, estos dominios de señalización proporcionaron 0, 16, 32 y 48 copias del dominio TCR zeta, respectivamente, para cada componente de direccionamiento de 8 dominios de heterodimerización.

Como control, se construyó un CAR de formato no zipCAR clásico, que tenía dos copias de TCR zeta (Figura 12: IgG_Zeta).

La línea de linfocitos T de murino BW5 se tradujo con cada zipCAR y la construcción de control y se estimuló con células SupT1 que expresaban el antígeno análogo (CD19) con diferentes concentraciones: baja, media y alta. Estas células SupT1 se modificaron para que expresaran CD19 con diferentes niveles mediante el uso de péptidos señal subóptimos y/o la introducción de motivos de retención citoplasmática derivados de Tyrp-1 (insertados cerca de la membrana) o glicoproteína E3-19k de adenovirus (insertada en el extremo C). Se midió la liberación de IL-2 después de la estimulación con el antígeno.

Los resultados se muestran en la Figura 13. Se observó que los zipCAR superCAR que comprendían 16 o 32 copias de TCR zeta por componente de direccionamiento (IgGx4AD1+DDD1-Z e IgGx4AD1+Z-DDD1-Z, respectivamente) proporcionaron una mayor respuesta al antígeno que el CAR clásico equivalente que comprendía dos copias de TCR zeta por molécula.

Para los expertos en la técnica, serán evidentes varias modificaciones y variaciones de los métodos y sistemas descritos de la invención sin alejarse del alcance de la invención. Aunque la invención se ha descrito en conexión con realizaciones preferidas específicas, se debe entender que la invención tal como se reivindica no se debería limitar indebidamente a tales realizaciones específicas. Es más, se pretende que varias modificaciones de los modos descritos para poner en práctica la invención, que son obvias para los expertos en biología molecular, biología celular o campos relacionados, queden incluidas dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un sistema de señalización de receptor de antígeno quimérico (CAR) que comprende;

en donde la heterodimerización espontánea entre el primer y el segundo dominio de heterodimerización provoca que el componente de direccionamiento y el componente de señalización formen un complejo de CAR funcional,

en donde el primer y el segundo dominio de heterodimerización comprenden:

(i) dominios de cremallera de leucina;

(ii) dominios de DDD1 y AD1;

(iii) dominios de Barnasa y Barnstar; o

(iv) dominios de RNasa pancreática humana y de péptido S.

2. El sistema de señalización de CAR de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende una pluralidad de componentes de señalización, comprendiendo cada uno un dominio de señalización y un segundo dominio de heterodimerización, en donde cada uno de los segundos dominios de heterodimerización reconoce el mismo primer dominio de heterodimerización, pero los dominios de señalización comprenden diferentes endodominios de señalización.

3. Una construcción de ácido nucleico que codifica un sistema de señalización de CAR de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en donde la construcción de ácido nucleico comprende la estructura siguiente

A-X-B

en la cual

A es una secuencia de ácido nucleico que codifica un componente de direccionamiento; y B es una secuencia de ácido nucleico que codifica un componente de señalización; y

X es una secuencia de ácido nucleico que codifica un sitio de escisión, de modo que A es escindido de B después de la traducción.

4. La construcción de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 3, que tiene una de las estructuras siguientes: a) AbD - espaciador - TM - endo - Het1 - coexpr- Het2 - SD

b) AbD - espaciador - TM - endo - Het1 - coexpr- SD - Het2

c) Het2 - SD - coexpr - AbD - espaciador - TM - endo - Het1 o

d) SD - Het2 - coexpr - AbD - espaciador - TM - endo - Het1

en las que

AbD es una secuencia de ácido nucleico que codifica el dominio de unión a antígeno de la molécula de direccionamiento; el espaciador es una secuencia de ácido nucleico que codifica un espaciador de la molécula de direccionamiento;

TM es una secuencia de ácido nucleico que codifica el dominio de transmembrana de la molécula de direccionamiento; endo es una secuencia de ácido nucleico que codifica el endodominio de la molécula de direccionamiento;

Het2 es una secuencia de ácido nucleico que codifica el motivo de heterodimerización de la molécula de señalización; y SD es una secuencia de ácido nucleico que codifica el dominio de señalización intracelular de la molécula de señalización.

5. Un vector que comprende una construcción de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 3 o 4.

6. El vector de acuerdo con la reivindicación 5, el cual es un vector retrovírico o un vector lentivírico o un transposón.

7. Una célula que comprende el sistema de señalización de CAR de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2.

8. La célula de acuerdo con la reivindicación 7, la cual es un linfocito T o un linfocito NK.

9. Una composición farmacéutica que comprende una pluralidad de células de acuerdo con la reivindicación 7 u 8.

10. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 9 para usar en el tratamiento y/o prevención de una enfermedad.

11. La composición farmacéutica para usar de acuerdo con la reivindicación 10, en donde el método comprende las siguientes etapas:

(ii) transducción o transfección de los linfocitos T o linfocitos NK con una construcción de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 3 o 4 o un vector de acuerdo con la reivindicación 5 o 6; y

(iii) administración de los linfocitos T o linfocitos NK de (ii) al sujeto.

12. La composición farmacéutica para usar de acuerdo con la reivindicación 10, en donde la enfermedad es cáncer.

13. Un método para fabricar una célula de acuerdo con la reivindicación 7 u 8, que comprende la etapa de introducir: una construcción ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 3 o 4 o un vector de acuerdo con la reivindicación 5 o 6, en una célula ex vivo.

14. El método de acuerdo con la reivindicación 13, en donde la célula es de una muestra aislada de un sujeto.