ES2912471T3 - Métodos predictivos de dilatación de la aorta ascendente y kits para su uso en los métodos - Google Patents
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Abstract
Un método in vitro para diagnosticar dilatación de la aorta ascendente en un sujeto que comprende (i) determinar el nivel de expresión de miR-718 circulante en una muestra de sangre de dicho sujeto, y (ii) comparar el nivel de expresión obtenido en (i) con un valor de referencia, en el que si el nivel de expresión de miR-718 circulante está disminuido con respecto al valor de referencia, entonces se le diagnostica al sujeto dilatación de la aorta ascendente.
Description
DESCRIPCIÓN
Métodos predictivos de dilatación de la aorta ascendente y kits para su uso en los métodos
Campo de la invención
La presente invención se refiere al campo técnico de diagnóstico, particularmente a métodos para diagnosticar dilatación de la aorta ascendente, determinar la probabilidad de padecer dilatación de la aorta ascendente, predecir la progresión de la dilatación de la aorta ascendente y a kits útiles para llevar a cabo dichos métodos.
Antecedentes de la invención
La válvula aórtica bicúspide (VAB) representa la malformación cardiaca congénita más común y está asociada comúnmente con tanto el desarrollo de disfunción de la válvula aórtica como la dilatación progresiva de la aorta ascendente. En pacientes con VAB, la dilatación de la aorta está asociada con regurgitación aórtica y también con el riesgo de disección aórtica, y en consecuencia el requisito frecuente de cirugía aórtica profiláctica. Las causas de la dilatación de la aorta se han debatido durante varios años, y se han sugerido cambios en las características de flujo dentro la aorta ascendente como causa principal. Sin embargo, los mecanismos implicados no se han dilucidado completamente.
Hoy en día, en la práctica clínica el diagnóstico de VAB y dilatación de la aorta ascendente se realiza exclusivamente basándose en técnicas de imagen (es decir ecocardiografía, TAC, resonancia magnética) y la posterior interpretación por un experto. Además, también es importante tener en consideración que tanto la VAB como la dilatación de la aorta se presentan normalmente como estados clínicos asintomáticos y las causas moleculares que subyacen a ambas cardiopatologías se desconocen.
Se ha dado a conocer que pacientes que padecen miocardiopatía dilatada pueden distinguirse de pacientes que padecen miocardiopatía isquémica o estenosis aórtica basándose en la expresión de microARN específicos en muestras miocárdicas (Ikeda S. et al. Physiol Genomics 2007; 31:367-373).
Otros autores han dado a conocer que diferentes etiologías de enfermedad de aneurisma aórtico torácico pueden distinguirse determinando el nivel de moléculas de miARN específico en tejido de aneurisma aórtico torácico ascendente y muestras de plasma (Ikonomidis J.S. et al. J Thorac Cardiovasc Surg 2013; 145:1326-1333), y que el tamaño de los aneurismas aórticos torácicos puede predecirse determinando niveles de microARN en sangre o plasma (documento WO 2014/004889 A2).
El documento US 2013/289141 A1 da a conocer el uso de microalineamientos de miR universal para determinar el nivel de expresión de moléculas de microARN en una muestra de tejido de pacientes que padecen aneurismas aórticos torácicos.
Estudios previos han analizado la expresión de miARN en segmentos de tejido aórtico de pacientes con VAB y modelos animales; Nigam et al. (Nigam V. et al. J Heart Valve Dis 2010; 19:459-465), determinaron que miR-26a, miR-30b y miR-195 estaban disminuidos en las valvas de válvulas aórticas de pacientes que requerían reemplazo de válvula aórtica debido a estenosis aórtica, en comparación con los que requerían reemplazo debido a insuficiencia aórtica, ambas patologías asociadas con VAB. Yanagawa et al. (Yanagawa B. et al. J Thorac Cardiovasc Surg 2012; 144:256-262) determinaron, usando células intersticiales valvulares porcinas y valvas de válvulas humanas, que la regulación por disminución de miR-141 en valvas bicúspides estenóticas regula la calcificación de valvas mediada por BMP-2. Wu et al. (Wu J. et al. J Am Coll Cardiol 2016; 67:2965-2977), realizaron una comparación por parejas de la expresión de miARN entre muestras aórticas gravemente dilatadas y menos dilatadas de aspecto normal, asociando la regulación diferencial de la agrupación génica de miR-17 con la predisposición a la dilación a través de la desregulación de la ruta de TIMP-MMP. De este modo, aunque la determinación de la expresión del perfil de miARN en muestras de tejido proporciona información valiosa con respecto a los mecanismos fisiopatológicos que subyace a las enfermedades, en la mayoría de los casos esta firma de expresión no puede extrapolarse al torrente sanguíneo.
Por tanto, es necesario el desarrollo de un método de examen rápido y sencillo que pueda realizarse de un modo no sesgado, de alto rendimiento para el diagnóstico rápido de VAB y dilatación de la aorta ascendente.
Sumario de la invención
Los autores de la presente invención han identificado el miARN circulante libre de células, miR-718, como biomarcador para la dilatación de la aorta ascendente en muestras de sangre y también para predecir la progresión de un sujeto que padece dicha enfermedad. Fuera del alcance de la invención reivindicada, los autores han identificado tres miARN circulantes (miR-130a-3p, miR-122-5p y miR-486-5p) que permiten diagnosticar válvula aórtica bicúspide en una muestra de sangre de un sujeto. El método de diagnóstico basado en suero de la invención puede servir como complemento al ecocardiograma para el examen de VAB, particularmente en poblaciones grandes.
Por tanto, la invención se refiere en un primer aspecto a un método in vitro para diagnosticar dilatación de la aorta ascendente en un sujeto que comprende
(i) determinar el nivel de expresión de miR-718 circulante en una muestra de sangre de dicho sujeto, y
(ii) comparar el nivel de expresión obtenido en (i) con un valor de referencia,
en el que si el nivel de expresión de miR-718 circulante está disminuido con respecto al valor de referencia, entonces se le diagnostica al sujeto dilatación de la aorta ascendente.
En un segundo aspecto, la presente invención se refiere a un método in vitro para determinar la probabilidad de que un sujeto padezca dilatación de la aorta ascendente que comprende
(i) determinar el nivel de expresión de miR-718 circulante en una muestra de sangre de dicho sujeto, y
(ii) comparar el nivel de expresión obtenido en (i) con un valor de referencia,
en el que si el nivel de expresión de miR-718 circulante está disminuido con respecto al valor de referencia, entonces el sujeto muestra alta probabilidad de padecer dilatación de la aorta ascendente o
en el que si el nivel de expresión de miR-718 circulante es igual a o está aumentado con respecto al valor de referencia, entonces el sujeto muestra baja probabilidad de padecer dilatación de la aorta ascendente.
En un tercer aspecto, la invención se refiere a un método in vitro para determinar el pronóstico o para monitorizar la progresión de un sujeto que padece dilatación de la aorta ascendente que comprende:
(i) determinar el nivel de expresión de miR-718 circulante en una muestra de sangre de dicho sujeto, y
(ii) comparar el nivel de expresión obtenido en (i) con un valor de referencia obtenido del mismo sujeto en un punto de tiempo anterior
en el que si el nivel de expresión de miR-718 circulante está disminuido con respecto al valor de referencia, entonces el sujeto muestra mal pronóstico o
en el que si el nivel de expresión de miR-718 circulante está aumentado con respecto al valor de referencia, entonces el sujeto muestra buen pronóstico.
En un aspecto adicional, la invención se refiere a un kit que comprende reactivos adecuados para la determinación del nivel de expresión de miR-718, en el que los oligonucleótidos que se hibridan específicamente con miR-718 comprenden al menos el 50% de la cantidad total de los oligonucleótidos que forman el kit.
En otro aspecto, la invención se refiere al uso de un kit para diagnosticar dilatación de la aorta ascendente en un método de la invención, o para determinar la probabilidad de que un sujeto padezca dilatación de la aorta ascendente en un método de la invención o para determinar el pronóstico o para monitorizar la progresión de un sujeto que padece dilatación de la aorta ascendente en un método de la invención, en el que el kit comprende reactivos adecuados para la determinación del nivel de expresión de miR-718.
Breve descripción de las figuras
Figura 1. Gráfico de volcán que representa las diferencias en los niveles de expresión circulantes de miARN dependiendo de (A) la morfología bicúspide o tricúspide de la válvula aórtica y (B) la morfología de la válvula junto con la dilatación de la aorta. Se representa gráficamente el cambio en veces logarítmico frente a -log10 (valor de P). Figura 2. La expresión de miR-122-5p, miR-130a-3p y miR-486-5p se ven influidas por la morfología de la válvula aórtica. (A) Se llevó a cabo la validación de los candidatos de miARN para la morfología aórtica mediante RT-qPCR. ** Valores significativos (p<0,001; prueba de la t para datos independientes). (B) Red de miARN-gen interactiva con respecto a la ruta de señalización de TGF-beta. VAT; válvula aórtica tricúspide, VAB; válvula aórtica bicúspide, TGF; factor de crecimiento transformante.
Figura 3. La expresión circulante de miR-718 se ve afectada por la dilatación de la aorta ascendente. (A) Validación mediante RT-qPCR del efecto de la dilatación aórtica ascendente en los niveles de expresión de miR-130a-3p y miR-718 en plasma. Se analizaron los efectos específicos de la morfología de las valvas y dilatación aórtica para miR-130a-3p (B) y miR-718 (C). ** Valores significativos (p<0,001; prueba de la t para datos independientes). Las barras con letras diferentes son significativamente diferentes (ANOVA de una vía, prueba de Tukey, p<0,05).
Figura 4. La expresión circulante de miR-718 está inversamente correlacionada con el diámetro de la aorta ascendente.
Descripción detallada de la invención
1. Definiciones
El término “dilatación de la aorta ascendente”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a un trastorno vascular degenerativo debido a la remodelación destructiva de la pared aórtica y la degradación de las proteínas de la matriz extracelular, conduciendo al reclutamiento y la infiltración de células del sistema inmunitario mediados por la secreción de moléculas de adhesión. La aorta ascendente se origina más allá de la válvula aórtica y termina justo antes de la arteria braquiocefálica (tronco braquiocefálico). La dilatación de la aorta ascendente es una dilatación de la primera parte de la aorta torácica. Por convención común, dilatación aórtica se refiere a una dimensión que es mayor que el percentil 95° para la edad, el sexo y el tamaño corporal de una persona normal. La dilatación de la aorta ascendente puede deberse o bien a un defecto innato o a uno adquirido. A modo de ejemplo, en la tabla 1 se muestran causas no limitativas de dilatación de la aorta ascendente.
Tabla 1. Etiologías de la dilatación de la aorta ascendente
La dilatación de la aorta ascendente es un proceso muy indolente ya que tarda muchos años en desarrollarse y es asintomático inicialmente. En pacientes que desarrollan un aneurisma aórtico ascendente secundariamente a un trastorno sistémico, los signos de la enfermedad primaria son los que conducen a un médico a buscar la dilatación tal como en síndrome de Marfan. De lo contrario, esta patología permanece silenciosa hasta que se producen sus complicaciones catastróficas o cuando se observa casualmente en obtención de imágenes cardiovasculares relacionada con otras causas. Pueden prevenirse estas complicaciones examinando pacientes asintomáticos. Los acontecimientos que se temen incluyen rotura o disección aórtica, hemorragia pericárdica, taponamiento cardiaco y oclusión de ramificaciones aórticas. Además, algunos pacientes, en una menor proporción, también pueden desarrollar hematomas intramurales o úlceras aórticas penetrantes.
El experto en la técnica conoce métodos para determinar la dilatación de la aorta e incluyen, sin limitación, obtención de imágenes tal como ultrasonidos, escáner CT, obtención de imágenes por resonancia magnética (MRI), ecocardiografía o rayos X del tórax.
El término “diámetro aórtico ascendente”, tal como se usa en el presente documento, se refiere al diámetro de la aorta ascendente que puede evaluarse mediante diferentes métodos conocidos por el experto en la técnica tales como, sin limitación, obtención de imágenes por resonancia magnética (MRI), tomografía computarizada de múltiples detectores (MDCT) o ecocardiografía. Se dan a conocer métodos adecuados para la obtención de imágenes y la medición de la aorta ascendente en Goldstein S.A. et al. (Goldstein S. A. et al. Am Soc Echocardiogr 2015; 28:119-82). En una realización preferida el diámetro aórtico ascendente se mide mediante ecocardiografía. En otra realización preferida el diámetro aórtico ascendente se mide desde el borde delantero de la pared de la raíz anterior hasta el borde delantero de la raíz de la pared aórtica posterior en la diástole final (Goldstein S. A. et al. Am Soc Echocardiogr 2015; 28:119-82). Dicho diámetro es diferente dependiendo del género y la edad. El diámetro aórtico ascendente puede ser el diámetro de la luz o el diámetro total (luz pared) de la aorta ascendente.
En una realización preferida se ha usado el índice de tamaño aórtico para clasificar a los sujetos como que tienen dilatación aórtica. El índice de tamaño aórtico (Davies R.R. et al. Ann Thorac Surg, 81 (2006): 169-177) tiene en cuenta el área de superficie corporal, minimizando por tanto la clasificación de aorta normal como dilatada patológicamente y viceversa. En una realización preferida de la invención un sujeto que tiene un diámetro aórtico mayor de 21 mm/m2 se considera que padece dilatación de la aorta ascendente.
El término “válvula aórtica bicúspide” o “VAB”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a una anomalía cardiaca congénita. Mientras que una válvula aórtica tricúspide (VAT) normal consiste en tres valvas funcionales, una VAB está formada por sólo dos. En la enfermedad de VAB dos de las valvas valvulares aórticas se fusionan durante el desarrollo dando como resultado una válvula que es bicúspide, en lugar de la configuración tricúspide normal. En muchos casos, una válvula aórtica bicúspide no provocará problemas. Sin embargo, VAB está asociada con complicaciones valvulares (regurgitación o estenosis aórtica) así como complicaciones vasculares tales como dilatación de la aorta ascendente más allá de la unión sinotubular y un gran porcentaje de pacientes desarrollará complicaciones serias. Si éstas se vuelven lo suficientemente graves, pueden requerir cirugía cardiaca. El experto en la técnica conoce métodos para diagnosticar VAB e incluyen, sin limitación, obtención de imágenes por resonancia magnética o ecocardiografía.
El término “muestra de sangre”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a un material biológico aislado de la sangre de un sujeto. La muestra de sangre puede ser sangre completa, plasma o suero. La muestra de sangre contiene cualquier material biológico adecuado para detectar ARN, particularmente miARN, y es un material que comprende material genético del sujeto. La muestra puede comprender material celular y/o no celular del sujeto, preferiblemente material no celular. En la presente invención, la muestra comprende material genético, por ejemplo, ADN, ADN genómico (ADNg), ADN complementario (ADNc), ARN, ARN nuclear heterogéneo (ARNnh), ARNm, etc., del sujeto en estudio. En la presente invención la muestra comprende miARN. Los expertos en la técnica conocen bien métodos para obtener muestras de sangre. En una realización preferida la muestra de sangre es una muestra de plasma.
El término “nivel de expresión disminuido”, tal como se usa en el presente documento en relación con el nivel de expresión de un miARN, particularmente miR-718, miR-122-5p o miR-486-5p, se refiere a una situación en la que el nivel de expresión de dicho miARN está disminuido al menos el 5%, al menos el 10%, al menos el 20%, al menos el 30%, al menos el 40%, al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 90% o al menos el 100% en comparación con el valor de referencia correspondiente.
La expresión “determinar la probabilidad” o “predecir”, tal como se usa en el presente documento en el contexto del método de predicción de la invención, se refiere a la predicción de que un sujeto padece dilatación de la aorta ascendente. Tal como entenderá el experto en la técnica, no se busca habitualmente que tal determinación sea correcta para todos (es decir, el 100%) de los sujetos que van a identificarse. Sin embargo, el término requiere que pueda identificarse una parte estadísticamente significativa de los sujetos (por ejemplo, una cohorte en un estudio de cohortes). El experto en la técnica puede determinar fácilmente si una parte es estadísticamente significativa usando varias herramientas de evaluación estadística bien conocidas, por ejemplo, determinación de intervalos de confianza, determinación de valores de p, prueba de la t de Student, prueba de Mann-Whitney, etc. Los detalles se encuentran en Dowdy y Wearden, Statistics for Research, John Wiley and Sons, Nueva York 1983. Intervalos de confianza preferidos son de al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 97%, al menos el 98% o al menos el 99%. Los valores de p son preferiblemente 0,1, 0,05, 0,01, 0,005 o 0,0001. Más preferiblemente, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80% o al menos el 90% de los sujetos de una población pueden identificarse adecuadamente mediante el método de la presente invención.
La expresión “determinar el pronóstico” o “monitorizar la progresión”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a la predicción de un desenlace médico, por ejemplo, un mal o buen desenlace (por ejemplo probabilidad de supervivencia a largo plazo, supervivencia global, supervivencia específica de enfermedad, supervivencia libre de progresión o supervivencia libre de enfermedad). Un “pronóstico negativo”, o “mal pronóstico”, o “mal desenlace”, incluye una predicción de recaída, progresión de la enfermedad, mortalidad o la necesidad de un tratamiento quirúrgico. Un “pronóstico positivo”, o “buen pronóstico”, o “buen desenlace”, incluye estabilización de la enfermedad. Tal como entenderán los expertos en la técnica, no es necesario que la predicción sea correcta, aunque se prefiere que sí, para el 100% de los sujetos que van a evaluarse. Sin embargo, el término requiere que pueda identificarse que una parte estadísticamente significativa de los sujetos tengan una probabilidad aumentada de tener un desenlace dado. El experto en la técnica puede determinar fácilmente si una parte es estadísticamente significativa usando varias herramientas de evaluación estadística bien conocidas, por ejemplo, determinación de intervalos de confianza, determinación de valores de p, prueba de la t de Student, prueba de Mann-Whitney, etc. Los detalles se encuentran en Dowdy y Wearden, Statistics for Research, John Wiley and Sons, Nueva York 1983. Intervalos de confianza preferidos son de al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 97%, al menos el 98% o al menos el 99%. Los valores de p son preferiblemente 0,1, 0,05, 0,01, 0,005 o 0,0001. Más preferiblemente, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80% o al menos el 90% de los sujetos de una población pueden identificarse adecuadamente mediante el método de la presente invención. Cualquier parámetro que esté ampliamente aceptado para determinar el pronóstico de un paciente puede usarse en la presente invención incluyendo, sin limitación, el tiempo de supervivencia global.
El término “diagnosticar” o “diagnóstico”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a la evaluación de la probabilidad según la cual un sujeto padece una patología específica (en este caso, que padece dilatación de la aorta ascendente). Tal como entenderá el experto en la técnica, tal evaluación puede no ser correcta para el 100% de los sujetos que van a diagnosticarse, aunque preferiblemente sí lo es. Sin embargo, el término requiere poder identificar una parte estadísticamente significativa de los sujetos.
El término “alta probabilidad”, tal como se usa en el presente documento en el método de predicción de la invención, se refiere a la situación en la que el sujeto muestra al menos el 5%, al menos el 10%, al menos el 20%, al menos el 30%, al menos el 40%, al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 90%, al menos el 100% de probabilidades de desarrollar o padecer una enfermedad, particularmente dilatación de la aorta ascendente.
El término “nivel de expresión aumentado”, tal como se usa en el presente documento en relación con el nivel de expresión de un miARN, particularmente miR-718 o miR-130a-3p, se refiere a una situación en la que el nivel de expresión de dicho miARN está aumentado al menos el 5%, al menos el 10%, al menos el 20%, al menos el 30%, al menos el 40%, al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 90% o al menos el 100% en comparación con el valor de referencia correspondiente.
El término “kit” o “kit de partes”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a una entidad de componentes físicamente separados, que están previstos para uso individual, pero en relación funcional entre sí. El kit de la invención es un producto que contiene los diferentes reactivos necesarios para llevar a cabo los diferentes métodos de la invención envasados de modo que se permite su transporte y almacenamiento. Los materiales adecuados para envasar los componentes del kit incluyen cristal, plástico (polietileno, polipropileno, policarbonato y similares), botellas, viales, papel, envueltas y similares. Adicionalmente, los kits de la invención pueden contener instrucciones para el uso simultáneo, secuencial o separado de los diferentes componentes que están en el kit. Dichas instrucciones pueden estar en forma de material impreso o en forma de un soporte electrónico que puede almacenar instrucciones de manera que pueda leerlas un sujeto, tal como medios de almacenamiento electrónico (discos magnéticos, cintas y similares), medios ópticos (CD-ROM, DVD) y similares. Adicional o alternativamente, los medios pueden contener direcciones de Internet que proporcionan dichas instrucciones.
El término “nivel de expresión” se refiere a la medición de la cantidad de un ácido nucleico, por ejemplo ARN o ARNm, o de una proteína. Tal como se usa en el presente documento, el nivel de expresión se refiere a la medición de la cantidad de ARN, más particularmente miARN, incluso más particularmente miR-718, miR-130a-3p, miR-122-5p o miR-486-5p.
El término “baja probabilidad”, tal como se usa en el presente documento en el método de predicción de la invención, se refiere a la situación en la que el sujeto muestra al menos el 5%, al menos el 10%, al menos el 20%, al menos el 30%, al menos el 40%, al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 90%, al menos el 100% de probabilidades de no desarrollar o padecer una enfermedad, particularmente dilatación de la aorta ascendente.
Los términos “miARN” o “microARN”, usados de manera intercambiable en el presente documento, son ARN endógenos, algunos de los cuales se sabe que regulan la expresión de genes que codifican para proteínas al nivel postranscripcional. Tal como se usa en el presente documento, el término “miARN” se refiere a cualquier tipo de ARN microinterferente, incluyendo pero sin limitarse a, microARN endógeno y microARN artificial. Normalmente, los miARN endógenos son ARN pequeños codificados en el genoma que pueden modular la utilización productiva de ARNm. Un miARN maduro es una molécula de ARN monocatenario de aproximadamente 21-23 nucleótidos de longitud que es complementaria a una secuencia diana, y se hibrida con la secuencia de ARN diana inhibiendo su traducción. Los propios miARN están codificados por genes que se transcriben a partir de ADN pero no se traducen en proteína (ARN no codificante); en su lugar se procesan a partir de transcritos primarios conocidos como primiARN para dar estructuras de tallo-bucle pequeñas denominadas pre-miARN y finalmente para dar miARN funcional. Las moléculas de miARN maduras son parcialmente complementarias a una o más moléculas de ARN mensajero (ARNm), y su función principal es regular por disminución la expresión génica. Además de su función intracelular, los miARN pueden exportarse o liberarse por las células a la sangre circulante en formas muy estables. El término “miARN circulante”, tal como se usa en el presente documento, también conocido como “miARN libre de células”, se refiere a miARN extracelular que circula en el torrente sanguíneo.
Los pre-miARN se denominan “mir”, mientras que los miARN maduros se denominan “miR”. Este prefijo va seguido por un guión y un número, indicando a menudo este último el orden de denominación. Los miARN con secuencias casi idénticas excepto por uno o dos nucleótidos se anotan con una letra minúscula adicional. Los pre-miARN que conducen a miARN maduros idénticos al 100% pero que están ubicados en diferentes lugares en el genoma se indican con un sufijo de guión-número adicional. La especie de origen se designa con un prefijo de tres letras. Algunos “mir” pueden tener dos productos maduros. Por ejemplo, hsa-mir-122 tiene dos productos maduros, denominados hsa-miR-122-5p y hsa-miR-122-3p. El producto maduro anotado con 5p surge del brazo en 5' del precursor de horquilla de mir-122, y el producto maduro anotado con 3p surge del brazo en 3' del precursor de horquilla de mir-122. Se describen convenciones de nomenclaturas usadas para describir secuencias de miARN en Ambros V et al., ARN, 2003, 9:277-279.
El término “miR-718”, tal como se usa en el presente documento, se refiere al miARN humano tal como se define en la base de datos mIRBase de la Universidad de Manchester (http://www.mirbase.org/index.shtml) (versión 21 de junio de 2014) con el número de registro MIMAT0012735, así como a los homólogos del mismo incluyendo, sin limitación, los definidos en la base de datos mencionada anteriormente que incluyen miR-718 de perro (número de registro MIMAT0009939), miR-718 de ratón (número de registro MIMAT0003514) y miR-718 de chimpancé (número
de registro MIMAT0012821).
El término “miR-130a-3p”, tal como se usa en el presente documento, se refiere al miARN humano tal como se define en la base de datos mIRBase de la Universidad de Manchester (http://www.mirbase.org/index.shtml) (versión 21 de junio de 2014) con el número de registro MIMAT0000425 (correspondiente a la secuencia madura hsa-miR-130a-3p) en el que la secuencia madura se corta del brazo en 3' del precursor de horquilla. El término “miR-130a-3p” se refiere también a homólogos del miARN humano incluyendo, sin limitación, los definidos en la base de datos mencionada anteriormente que incluyen miR-130a-3p de ratón (número de registro MIMAT0000141) y miR-130a-3p de rata (número de registro MIMAT0000836).
El término “miR-122-5p”, tal como se usa en el presente documento, se refiere al miARN humano tal como se define en la base de datos mIRBase de la Universidad de Manchester (http://www.mirbase.org/index.shtml) (versión 21 de junio de 2014) con el número de registro MIMAT0000421 (correspondiente a la secuencia madura hsa-miR-122-5p), en el que la secuencia madura se corta del brazo en 5' del precursor de horquilla. El término “miR-122-5p” se refiere también a homólogos del miARN humano incluyendo, sin limitación, los definidos en la base de datos mencionada anteriormente que incluyen miR-122-5p de ratón (número de registro MIMAT0000246) y miR-122-5p de rata (número de registro MIMAT0000827).
El término “miR-486-5p”, tal como se usa en el presente documento, se refiere al miARN humano tal como se define en la base de datos mIRBase de la Universidad de Manchester (http://www.mirbase.org/index.shtml) (versión 21 de junio de 2014) con el número de registro MIMAT0002177 (correspondiente a la secuencia madura hsa-miR-486-5p), en el que la secuencia madura se corta del brazo en 5' del precursor de horquilla. El término “miR-486-5p” se refiere también a homólogos del miARN humano incluyendo, sin limitación, los definidos en la base de datos mencionada anteriormente que incluyen miR-486-5p de macaco rhesus (número de registro MIMAT0006344) y miR-486-5p de caballo (número de registro MIMAT0013186).
La expresión “válvula aórtica bicúspide no dilatada”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a un sujeto que tiene una válvula aórtica bicúspide o bien asintomática o bien que padece síntomas de la enfermedad de vAb , pero que no padece dilatación de la aorta ascendente.
La expresión “sujeto sano con válvula aórtica tricúspide no dilatada”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a un sujeto sano que tiene una válvula aórtica con una morfología normal (es decir una válvula aórtica tricúspide) y que no padece dilatación de la aorta ascendente.
El término “oligonucleótido”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a un ácido nucleico que tiene preferiblemente al menos 10 nucleótidos, preferiblemente al menos 15 nucleótidos, preferiblemente al menos 20 nucleótidos, preferiblemente al menos 25 nucleótidos y preferiblemente no más de 100 nucleótidos, incluyendo polirribonucleótidos, polidesoxirribonucleótidos y combinaciones de los mismos. El término “oligonucleótido” también se refiere a moléculas formadas por nucleótidos convencionales unidos por enlaces convencionales fosfodiéster así como variantes de los mismos incluyendo modificaciones en purinas o pirimidinas o modificaciones en ribosas o desoxirribosas diseñadas para aumentar la estabilidad del oligonucleótido. Alternativa o adicionalmente, los oligonucleótidos pueden contener enlaces modificados tales como fosfotriéster, fosforotioato, metilfosfonato, etc., o pueden ser ácidos nucleicos peptídicos (PNA). El experto en la técnica conoce bien métodos para sintetizar oligonucleótidos.
El término “tratamiento farmacológico”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a un tratamiento que comprende la administración de un fármaco a un sujeto para prevenir, aliviar y/o curar una enfermedad, o para aliviar, reducir o eliminar uno o más síntomas asociados con dicha enfermedad, o para aliviar, reducir o eliminar un factor de riesgo para la progresión de dicha enfermedad, por ejemplo tratando una enfermedad concomitante.
La expresión “reactivo adecuado para la determinación del nivel de expresión de un miARN”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier compuesto o conjunto de compuestos que permite la determinación específica del nivel de expresión de un miARN mediante métodos de detección bien conocidos por el experto en la técnica.
La expresión “reactivo adecuado para la determinación del nivel de expresión de un ARN de referencia”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier compuesto o conjunto de compuestos que permite la determinación específica del nivel de expresión de un ARN de referencia mediante métodos de detección bien conocidos por el experto en la técnica.
El término “valor de referencia” o “nivel de referencia”, tal como se usa en el presente documento en el contexto de los métodos de la invención, se refiere a un valor usado como referencia para los valores/datos de nivel de expresión obtenidos de muestras de sangre de sujetos a los que va a diagnosticársele una enfermedad o que van a clasificarse como que tienen una alta o baja probabilidad de padecer una enfermedad, o que tienen un buen o mal pronóstico. El valor de referencia o nivel de referencia según cualquiera de los métodos de la invención puede ser un valor absoluto; un valor relativo; un valor que tiene un límite superior y/o inferior; un intervalo de valores; un valor promedio; una mediana de valores, un valor medio o un valor en comparación con un valor inicial o de control particular. Un valor de referencia puede basarse en un valor de muestra individual, tal como por ejemplo, un valor
obtenido a partir de una muestra del sujeto que está sometiéndose a prueba, pero en un punto anterior en el tiempo. El valor de referencia puede basarse en un número grande de muestras, tal como de una población de sujetos del grupo coincidente de edad cronológica, o basarse en un grupo de muestras incluyendo o excluyendo la muestra que va a someterse a prueba. Se tienen en cuenta diversas consideraciones cuando se determina el valor de referencia del marcador. Entre tales consideraciones están la edad, el peso, el sexo, el estado físico general del paciente y similares. Por ejemplo, se toman como grupo de referencia cantidades iguales de un grupo de al menos 2, al menos 10, al menos 100 a preferiblemente más de 1000 sujetos, preferiblemente clasificados según las consideraciones anteriores, por ejemplo según diversas categorías de edad.
El término “sujeto” o “individuo” o “animal” o “paciente” o “mamífero” quiere decir cualquier sujeto, particularmente un sujeto mamífero, para el que se desea el diagnóstico o pronóstico. Los sujetos mamíferos incluyen seres humanos, animales domésticos, animales de granja, y animales de zoológicos, para deportes o de compañía tales como perros, gatos, cobayas, conejos, ratas, ratones, caballos, ganado, vacas, y así sucesivamente. En una realización preferida de la invención, el sujeto es un mamífero. En una realización más preferida de la invención, el sujeto es un ser humano.
El término “válvula aórtica tricúspide”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a la morfología normal de la válvula aórtica, que es una válvula en el corazón humano entre el ventrículo izquierdo y la aorta que tiene normalmente tres cúspides o valvas.
2. Método para diagnosticar dilatación de la aorta ascendente
Los autores de la presente invención han encontrado que el miARN circulante miR-718 es un biomarcador para la identificación de dilatación de la aorta ascendente en pacientes.
Por tanto, en un primer aspecto, la invención se refiere a un método in vitro para diagnosticar dilatación de la aorta ascendente en un sujeto (primer método de la invención), comprendiendo dicho método
(i) determinar el nivel de expresión de miR-718 circulante en una muestra de sangre de dicho sujeto, y
(ii) comparar el nivel de expresión obtenido en (i) con un valor de referencia,
en el que si el nivel de expresión de miR-718 circulante está disminuido con respecto al valor de referencia, entonces se le diagnostica al sujeto dilatación de la aorta ascendente.
En una primera etapa del método de la invención para diagnosticar dilatación de la aorta ascendente, el nivel de expresión de miR-718 circulante se determina en una muestra de sangre de un sujeto cuyo diagnóstico va a determinarse.
Antes de analizar la muestra, a menudo será deseable realizar una o más operaciones de preparación sobre dicha muestra dirigida a separar la molécula que va a determinarse (ARN, en particular miARN) de otras moléculas que se encuentran en la muestra. Normalmente, estas operaciones de preparación de la muestra incluyen manipulaciones tales como concentración, suspensión, extracción de material intracelular, por ejemplo, ácidos nucleicos de muestras de células completas/tejido y similares, reacciones de amplificación de ácidos nucleicos, fragmentación, transcripción, marcaje y/o extensión. Los ácidos nucleicos, especialmente el ARN pueden aislarse usando cualquier técnica conocida en la técnica. Hay dos métodos principales para aislar ARN: (i) extracción basada en fenol y (ii) unión basada en matriz de sílice o filtro de fibra de vidrio (GFF). Los reactivos basados en fenol contienen una combinación de desnaturalizantes e inhibidores de ARNasa para la alteración de células y tejidos y la posterior separación del ARN de los contaminantes. Los procedimientos de aislamiento basados en fenol pueden recuperar especies de ARN en el intervalo de 10-200 nucleótidos, por ejemplo, miARN, ARNr 5S, ARNr 5,8S y ARNnp U1. Si se purificó una muestra de ARN “total” mediante el procedimiento de GFF o columna de matriz de sílice popular, pueden eliminarse de la misma ARN pequeños. Sin embargo, procedimientos de extracción tales como los que usan Trizol o TriReagent, purificarán todos los ARN, grandes y pequeños, y son los métodos recomendados para aislar ARN total de muestras biológicas que contendrán miARN/ARNip. Estos métodos normalmente los conoce bien un experto en la técnica. Hay también kits comerciales disponibles para la purificación de miARN incluyendo, sin limitación, el kit miRNeasy Mini de Qiagen, kits de aislamiento de miARN de Life Technologies, el kit de aislamiento de microARN mirPremier de Sigma-Aldrich y el kit de aislamiento de miARN High Pure de Roche.
El nivel de expresión de miR-718 se determina en una muestra de sangre de un sujeto, en el que dicha muestra es cualquier muestra de sangre que comprende ácidos nucleicos, particularmente que comprende miARN circulante. En una realización particular, la muestra de sangre es una muestra libre de células. En una realización preferida la muestra de sangre es una muestra de plasma.
La determinación de los niveles de ARN, en particular los niveles de miARN, puede llevarse a cabo mediante cualquier método conocido en la técnica tal como qPCR, transferencia de tipo Northern, transferencia puntual de ARN, TaqMan, métodos basados en etiqueta tales como análisis en serie de la expresión génica (SAGE) incluyendo variantes tales como LongSAGE y SuperSAGE, microalineamientos. La determinación de los niveles de ARNm
también puede llevarse a cabo mediante hibridación in situ de fluorescencia (FISH). La detección puede llevarse a cabo en muestras individuales o en microalineamientos de tejido. En una realización particular, los niveles de expresión de miR-718 en una muestra de sangre de un sujeto al que va a diagnosticarse dilatación de la aorta ascendente se determinan mediante PCR en tiempo real (RT-PCR). En otra realización particular, los niveles de expresión de miR-718 se determinan mediante microalineamiento de miARN.
Con el fin de normalizar los valores de expresión de miARN entre las diferentes muestras, es posible comparar los niveles de expresión del miARN de interés en las muestras de prueba con la expresión de un ARN de control o ARN de referencia. Por tanto, en el contexto de la invención, el término nivel de expresión “normalizado” se refiere al nivel de expresión de un miARN, particularmente miR-718, en relación con el nivel de expresión de un único ARN de control o referencia, o un conjunto particular de ARN de referencia o control.
Un “ARN de control” o un “ARN de referencia”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a un ARN cuyo nivel de expresión no cambia o cambia sólo en cantidades limitadas en muestras bajo análisis con respecto a muestras de control. En el análisis de miARN circulantes, pueden usarse diversas estrategias para la normalización de datos, que van desde el uso de controles de ARN pequeño o miARN endógeno particulares, adiciones conocidas de moléculas externas o medidas de tendencia central. Cuando se cuantifican miARN celulares, se usan actualmente controles de ARN pequeño estable como ARN de referencia. Estos incluyen ARN no codificantes pequeños, y específicamente ARN nuclear pequeño y ARN nucleolar pequeño tal como SNORD44 (RNU44), SNORD48 (RNU48) y RNU6-1 (Mamm U6). Para miARN séricos, hay pruebas crecientes de que los ARN pequeños mencionados anteriormente son altamente variables o no pueden detectarse de manera estable, conduciendo por tanto a la búsqueda de miARN de control estables adecuados que puedan detectarse firmemente en suero humano. La elección más común podría ser el uso de un miARN que no varía considerablemente entre individuos. En una realización preferida, se realizan adiciones conocidas de un miARN sintético en la preparación de ARN para ayudar a monitorizar la recuperación de ARN y la eficacia de transcripción inversa. Ejemplos de adiciones conocidas de controles son miméticos de miARN de cel-miR-39 o cel-miR-54 de C. elegans que pueden detectarse fácilmente mediante RT-PCR en tiempo real. En una realización, se calcula la cuantificación de la expresión de miARN relativa según el método de ciclo umbral (Ct) comparativo usando cel-miR-54 o cel-miR-39 como adiciones conocidas de controles. Se determinan los resultados finales según la fórmula 2-ACt, en donde los valores de ACT de la muestra se determinan restando el valor de Ct del gen diana del valor del miARN de control. En una realización preferida el ARN de referencia es el ARN nuclear pequeño U6 (ARNnp U6).
En una segunda etapa del método de la invención para diagnosticar dilatación de la aorta ascendente, el nivel de expresión de miR-718 circulante en una muestra de sangre de un sujeto cuyo diagnóstico va a determinarse se compara con un valor de referencia, en el que si el nivel de expresión de miR-718 circulante está disminuido con respecto al valor de referencia, entonces se le diagnostica al sujeto dilatación de la aorta ascendente.
En una realización particular del primer método de diagnóstico de la invención, el valor de referencia es el nivel de expresión del miR-718 determinado en una muestra de sangre de un sujeto de control, en el que el sujeto de control es un sujeto sano o un sujeto al que no se le ha diagnosticado dilatación de la aorta ascendente. En otra realización, el valor de referencia es el nivel de expresión del miR-718 como valor promedio determinado en un grupo de sujetos sanos o en un grupo de sujetos a los que no se les ha diagnosticado dilatación de la aorta ascendente. Dicha muestra de valor de referencia se obtiene normalmente combinando cantidades iguales de muestras de una población de sujetos. En una realización particular preferida, el valor de referencia es el nivel de expresión de miR-718 determinado en una muestra de sangre de uno o más sujetos sanos con válvula aórtica tricúspide no dilatada. La dilatación de la aorta ascendente es una complicación vascular común de pacientes que padecen válvula aórtica bicúspide. Por tanto, en otra realización particular preferida, el valor de referencia es el nivel de expresión de miR-718 determinado en una muestra de sangre de uno o más sujetos que padecen una válvula aórtica bicúspide no dilatada. En otra realización, el valor de referencia es el nivel de expresión de miR-718 determinado en una muestra de sangre de uno o más sujetos que tienen un diámetro aórtico inferior a 19 mm/m2. Se han dado a conocer métodos para determinar la dilatación de la aorta ascendente en la sección de definiciones.
Una vez establecido el valor de referencia de expresión de miR-718, los niveles de expresión de miR-718 circulante expresado en una muestra de sangre de un sujeto que va a diagnosticarse pueden compararse con este valor de referencia, y por tanto asignarse como “aumentados”, “disminuidos” o “iguales”. Por ejemplo, un aumento en los niveles de expresión por encima del valor de referencia de al menos 1,1 veces, 1,5 veces, 5 veces, 10 veces, 20 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces, 60 veces, 70 veces, 80 veces, 90 veces, 100 veces o incluso más en comparación con el valor de referencia se considera como nivel de expresión “aumentado”. Por otro lado, una disminución en los niveles de expresión por debajo del valor de referencia de al menos 0,9 veces, 0,75 veces, 0,2 veces, 0,1 veces, 0,05 veces, 0,025 veces, 0,02 veces, 0,01 veces, 0,005 veces o incluso menos en comparación con el valor de referencia se considera como nivel de expresión “disminuido”. Los niveles de expresión pueden juzgarse “iguales” al valor de referencia si los niveles difieren con respecto al valor de referencia menos del 5%, menos del 4%, menos del 3%, menos del 2%, menos del 1%, menos del 0,5%, menos del 0,4%, menos del 0,3%, menos del 0,1%, menos del 0,05%, o menos.
Por tanto, según el primer método de diagnóstico de la invención, si hay una disminución en el nivel de expresión de miR-718 circulante en una muestra de sangre de un sujeto cuyo diagnóstico va a determinarse con respecto al valor
de referencia, entonces a dicho sujeto se le diagnostica dilatación de la aorta ascendente.
El experto en la técnica entenderá que el diagnóstico puede no ser correcto para el 100% de pacientes en estudio. Sin embargo, la expresión requiere que el método de diagnóstico proporcione resultados correctos para una parte estadísticamente significativa de los pacientes. La determinación de si el método de la invención proporciona predicciones estadísticamente significativas puede llevarse a cabo usando técnicas estadísticas convencionales tales como la determinación de intervalos de confianza, determinación del valor de p, prueba de la t de Student, prueba de Mann-Whitney. Intervalos de confianza adecuados son de al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 90%, al menos el 95%. Valores de p son, preferiblemente, 0,05, 0,01, 0,005. Aunque la dilatación de la aorta ascendente se produce más frecuentemente a una edad más joven en pacientes con válvulas aórticas bicúspides (VAB) que en pacientes con válvulas aórticas de tres valvas normales (VAT), los sujetos con VAT también pueden padecer dilatación de la aorta ascendente puesto que hay otras causas de esta enfermedad.
Por tanto, en una realización el sujeto al que se le diagnostica dilatación de la aorta ascendente es un sujeto que tiene una válvula aórtica bicúspide. En otra realización el sujeto al que se le diagnostica dilatación de la aorta ascendente es un sujeto que tiene una válvula aórtica tricúspide. En otra realización el sujeto al que se le diagnostica dilatación de la aorta ascendente tiene un diámetro aórtico superior a 21 mm/m2
3. Método para determinar la probabilidad de dilatación de la aorta ascendente
Los inventores han encontrado que los niveles de miR-718 circulante en una muestra de sangre también pueden usarse como marcador para determinar el riesgo de padecer dilatación de la aorta ascendente.
Por tanto, en otro aspecto, la invención se refiere a un método in vitro para determinar la probabilidad de que un sujeto padezca dilatación de la aorta ascendente (segundo método de la invención, o método de predicción de la probabilidad de dilatación de la aorta ascendente), comprendiendo dicho método
(i) determinar el nivel de expresión de miR-718 circulante en una muestra de sangre de dicho sujeto, y
(ii) comparar el nivel de expresión obtenido en (i) con un valor de referencia,
en el que si el nivel de expresión de miR-718 circulante está disminuido con respecto al valor de referencia, entonces el sujeto muestra alta probabilidad de padecer dilatación de la aorta ascendente o
en el que si el nivel de expresión de miR-718 circulante es igual a o está aumentado con respecto al valor de referencia, entonces el sujeto muestra baja probabilidad de padecer dilatación de la aorta ascendente.
En una primera etapa del segundo método de la invención, el nivel de expresión del miARN circulante miR-718 se determina en una muestra de sangre de un sujeto cuya probabilidad de padecer dilatación de la aorta ascendente va a determinarse.
Se han descrito anteriormente métodos para determinar el nivel de expresión de un miARN, particularmente miR-718, en el contexto del primer método de diagnóstico de la invención y también pueden aplicarse al segundo método de la invención. En una realización particular, los niveles de expresión de miARN, particularmente los niveles de miR-718, se determinan mediante rT-PCR. En otra realización, los niveles de expresión de miARN se determinan mediante microalineamiento de miARN.
Se han descrito anteriormente muestras adecuadas para determinar los niveles de expresión de miARN, particularmente los niveles de miR-718, en el contexto del primer método de diagnóstico de la invención y también pueden aplicarse al segundo método de la invención. En una realización particular, la muestra de sangre es una muestra de plasma.
En una segunda etapa del segundo método de la invención, el nivel de expresión de miR-718 circulante en una muestra de sangre de un sujeto cuya probabilidad de dilatación de la aorta ascendente va a determinarse se compara con un valor de referencia, en el que si el nivel de expresión de miR-718 circulante está disminuido con respecto al valor de referencia, entonces el sujeto muestra alta probabilidad de padecer dilatación de la aorta ascendente, y en el que si el nivel de expresión de miR-718 circulante es igual a o está aumentado con respecto al valor de referencia, entonces el sujeto muestra baja probabilidad de padecer dilatación de la aorta ascendente. En una realización particular del método de predicción de la probabilidad de dilatación de la aorta ascendente de la invención, el valor de referencia es el nivel de expresión del miR-718 determinado en una muestra de un sujeto de control, en el que el sujeto de control es un sujeto sano o un sujeto que no ha padecido dilatación de la aorta ascendente. En otra realización, el valor de referencia es el nivel de expresión del miR-718 como valor promedio determinado en un grupo de sujetos sanos o en un grupo de sujetos que no han padecido dilatación de la aorta ascendente. Dicha muestra de valor de referencia se obtiene normalmente combinando cantidades iguales de muestras de una población de sujetos. En una realización particular preferida, el valor de referencia es el nivel de
expresión de miR-718 determinado en una muestra de sangre de uno o más sujetos sanos con válvula aórtica tricúspide no dilatada. En otra realización particular preferida, el valor de referencia es el nivel de expresión de miR-718 determinado en una muestra de sangre de uno o más sujetos que padecen una válvula aórtica bicúspide no dilatada. En otra realización preferida el valor de referencia es el nivel de expresión de miR-718 determinado en una muestra de sangre de uno o más sujetos que tienen un diámetro aórtico inferior a 19 mm/m2 Se han dado a conocer métodos para determinar la dilatación de la aorta ascendente en la sección de definiciones.
Una vez establecido el valor de referencia de la expresión de miR-718, los niveles de expresión de miR-718 circulante expresado en una muestra de sangre de un sujeto cuya probabilidad de dilatación de la aorta ascendente va a determinarse pueden compararse con este valor de referencia, y por tanto asignarse un nivel de “aumentado” o “disminuido”, tal como se indicó anteriormente en el contexto del primer método de la invención.
Por tanto, según el segundo método de la invención, si hay una disminución en el nivel de expresión de miR-718 circulante en una muestra de sangre de un sujeto cuya probabilidad de dilatación de la aorta ascendente va a determinarse con respecto al valor de referencia, entonces dicho sujeto muestra una alta probabilidad de padecer dilatación de la aorta ascendente. Si no hay ninguna variación o hay un aumento en el nivel de expresión de miR-718 circulante en una muestra de sangre de un sujeto cuya probabilidad de dilatación de la aorta ascendente va a determinarse con respecto al valor de referencia, entonces dicho sujeto muestra una baja probabilidad de padecer dilatación de la aorta ascendente.
Se entiende que una alta probabilidad de desarrollar dilatación de la aorta ascendente significa que la situación en la que el sujeto muestra al menos el 5%, al menos el 10%, al menos el 20%, al menos el 30%, al menos el 40%, al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 90%, al menos el 100% de probabilidades de padecer dilatación de la aorta ascendente a lo largo del tiempo.
Se entiende que una baja probabilidad de desarrollar dilatación de la aorta ascendente significa la situación en la que el sujeto muestra al menos el 5%, al menos el 10%, al menos el 20%, al menos el 30%, al menos el 40%, al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 90%, al menos el 100% de probabilidades de no padecer dilatación de la aorta ascendente a lo largo del tiempo.
El experto en la técnica entenderá que la predicción puede no ser correcta para el 100% de los pacientes en estudio. Sin embargo, la expresión requiere que el método predicción proporcione resultados correctos para una parte estadísticamente significativa de los pacientes. La determinación de si el método de la invención proporciona predicciones estadísticamente significativas puede llevarse a cabo usando técnicas estadísticas convencionales tales como la determinación de intervalos de confianza, determinación del valor de p, prueba de la t de Student, prueba de Mann-Whitney. Intervalos de confianza adecuados son de al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 90%, al menos el 95%. Valores de p son, preferiblemente, 0,05, 0,01, 0,005. Las realizaciones dadas a conocer en el contexto del primer método de la invención también pueden aplicarse al segundo método de la invención.
4. Método para predecir la progresión de la dilatación de la aorta ascendente
La dilatación aórtica ascendente tiene una propensión a la disección y rotura, lo que la hace una enfermedad potencialmente mortal. Por tanto, la dilatación aórtica ascendente necesita una monitorización frecuente, con posible intervención quirúrgica profiláctica temprana.
Los autores de la presente invención han mostrado que los niveles de miR-718 no sólo son útiles para el diagnóstico de la dilatación de la aorta ascendente, sino que también este marcador puede monitorizarse tras habérsele diagnosticado al sujeto esta enfermedad y que el cambio con el tiempo de los niveles del marcador predicen si la dilatación de la aorta ascendente está progresando en el sujeto o no. Particularmente, los inventores encontraron que la expresión en plasma de miR-718 es un biomarcador de dilatación aórtica, estando asociados diámetros aumentados de la aorta ascendente con la regulación por disminución de miR-718.
Por tanto, en otro aspecto, la invención se refiere a un método in vitro para determinar el pronóstico o para monitorizar la progresión de un sujeto que padece dilatación de la aorta ascendente (método predictivo de la progresión de la enfermedad de dilatación de la aorta ascendente de la invención, o tercer método de la invención), en el que el método comprende
(i) determinar el nivel de expresión de miR-718 circulante en una muestra de sangre de dicho sujeto, y
(ii) comparar el nivel de expresión obtenido en (i) con un valor de referencia obtenido del mismo sujeto en un punto de tiempo anterior
en el que si el nivel de expresión de miR-718 circulante está disminuido con respecto al valor de referencia, entonces el sujeto muestra mal pronóstico o
en el que si el nivel de expresión de miR-718 circulante está aumentado con respecto al valor de referencia, entonces el sujeto muestra buen pronóstico.
En una realización particular, el sujeto para el que va a predecirse la progresión de la dilatación de la aorta ascendente está siguiendo un tratamiento farmacológico. El tratamiento farmacológico para dilatación de la aorta ascendente de leve a moderada incluye betabloqueantes, inhibidores de ACE o tratamientos para prevenir y tratar factores de riesgo asociados con la dilatación de la aorta ascendente tales como hipertensión o dislipidemia.
En otra realización particular, el sujeto para el que va a predecirse la progresión de la dilatación de la aorta ascendente se ha sometido a un tratamiento quirúrgico, preferiblemente a una cirugía aórtica profiláctica. El tratamiento quirúrgico incluye, sin limitación, reemplazo de injerto de tubo, el procedimiento de Bentall (reemplazo de injerto de válvula completa con reimplantación de las arterias coronarias) o el procedimiento de recambio de válvula (reimplantación de válvula aórtica o remodelación de válvula aórtica). Tales procedimientos quirúrgicos los conocen bien los expertos en la técnica.
En una primera etapa del tercer método de la invención, el nivel de expresión del miARN circulante miR-718 se determina en una muestra de sangre de un sujeto para el que va a predecirse la progresión de la dilatación de la aorta ascendente.
Se han descrito anteriormente métodos para determinar el nivel de expresión de un miARN, particularmente miR-718 en el contexto del método de diagnóstico de la invención y son aplicables al tercer método de la invención. En una realización particular, los niveles de expresión de miARN, particularmente los niveles de miR-718, se determinan mediante RT-PCR. En otra realización, los niveles de expresión de miARN se determinan mediante microalineamiento de miARN.
Se han descrito anteriormente muestras adecuadas para determinar los niveles de expresión de miARN, particularmente los niveles de miR-718, en el contexto del método de diagnóstico de la invención y son aplicables al tercer método de la invención. En una realización particular, la muestra es una muestra de plasma.
En una segunda etapa del tercer método de la invención, el nivel de expresión de miR-718 circulante en una muestra de sangre de un sujeto para el que va a predecirse la progresión de la dilatación de la aorta ascendente se compara con un valor de referencia obtenido de una muestra obtenida del mismo sujeto en un punto de tiempo anterior, en el que si el nivel de expresión de miR-718 circulante está disminuido con respecto al valor de referencia, entonces el sujeto muestra mal pronóstico. Alternativamente, si el nivel de expresión de miR-718 circulante está aumentado con respecto al valor de referencia, entonces el sujeto muestra buen pronóstico.
En una realización particular del método según la invención para predecir la progresión de dilatación de la aorta ascendente, el valor de referencia es el nivel de expresión del miR-718 determinado en una muestra de sangre del sujeto para el que va a predecirse la progresión de la dilatación de la aorta ascendente antes de un procedimiento quirúrgico y/o antes de la administración de un tratamiento farmacológico.
Una vez establecido el valor de referencia de la expresión de miR-718, los niveles de expresión de miR-718 circulante expresados en una muestra de sangre de un sujeto cuya probabilidad de dilatación de la aorta ascendente va a determinarse pueden compararse con este valor de referencia, y por tanto asignarse un nivel de “aumentado” o “disminuido”, tal como se indicó anteriormente en el contexto del primer método de la invención.
Por tanto, según el tercer método de la invención, si hay un aumento en el nivel de expresión de miR-718 circulante en una muestra de sangre de un sujeto para el que va a predecirse la progresión de la dilatación de la aorta ascendente con respecto al valor de referencia, entonces el sujeto muestra buen pronóstico. Si hay una disminución en el nivel de expresión de miR-718 circulante en una muestra de sangre de un sujeto para el que va a predecirse la progresión de la dilatación de la aorta ascendente con respecto al valor de referencia, entonces el sujeto muestra mal pronóstico.
Un buen pronóstico de un sujeto que padece dilatación de la aorta ascendente se entiende como estabilización o remisión de la enfermedad, particularmente porque la dilatación de la aorta ha disminuido. Particularmente, un buen pronóstico se entiende como ausencia de aumento del diámetro de la aorta o una disminución del diámetro de la aorta en comparación con una medida previa, preferiblemente a los 6 y 12 meses tras el diagnóstico.
Un mal pronóstico de un sujeto que padece dilatación de la aorta ascendente se entiende como una predicción de recaída, progresión de la enfermedad, mortalidad o la necesidad de un tratamiento quirúrgico, particularmente porque la dilatación de la aorta ha aumentado. Particularmente, un mal pronóstico se entiende como un aumento del diámetro de la aorta en comparación con una medida previa, preferiblemente a los 6 y 12 meses tras el diagnóstico. Un mal pronóstico también se entiende como disección o rotura de la aorta ascendente.
El experto en la técnica entenderá que la predicción puede no ser correcta para el 100% de los pacientes en estudio. Sin embargo, la expresión requiere que el método de predicción proporcione resultados correctos para una parte estadísticamente significativa de los pacientes. La determinación de si el método de la invención proporciona predicciones estadísticamente significativas puede llevarse a cabo usando técnicas estadísticas convencionales
tales como la determinación de intervalos de confianza, determinación del valor de p, prueba de la t de Student, prueba de Mann-Whitney. Intervalos de confianza adecuados son de al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 90%, al menos el 95%. Valores de p son, preferiblemente, 0,05, 0,01, 0,005. Las realizaciones dadas a conocer en el contexto de los métodos primero y segundo de la invención también pueden aplicarse al tercer método de la invención.
5. Método para diagnosticar válvula aórtica bicúspide que no forma parte de la presente invención Los autores han encontrado que los miARN circulantes miR-130a-3p, miR-122-5p y miR-486-5p son biomarcadores independientes para la identificación de válvula aórtica bicúspide en pacientes.
Por tanto, se da a conocer un método in vitro para diagnosticar válvula aórtica bicúspide en un sujeto (que no forma parte de la presente invención), comprendiendo dicho método
(i) determinar el nivel de expresión de al menos un miARN circulante seleccionado del grupo que consiste en miR-130a-3p, miR-122-5p y miR-486-5p en una muestra de sangre de dicho sujeto, y (ii) comparar el nivel de expresión de dicho al menos un miARN circulante con un valor de referencia, en el que si el nivel de expresión de al menos un miARN circulante seleccionado de miR-122-5p y miR-486-5p está disminuido con respecto al valor de referencia o el nivel de expresión de miR-130a-3p está aumentado con respecto al valor de referencia, entonces se le diagnostica al sujeto válvula aórtica bicúspide.
En una primera etapa del método para diagnosticar válvula aórtica bicúspide que no forma parte de la presente invención, el nivel de expresión de al menos un miARN circulante seleccionado del grupo que consiste en miR-130a-3p, miR-122-5p y miR-486-5p se determina en una muestra de sangre de un sujeto cuyo diagnóstico va a determinarse.
La expresión “al menos un miARN circulante seleccionado del grupo que consiste en miR-130a-3p, miR-122-5p y miR-486-5p”, tal como se usa en el presente documento, significa que según el presente método que no forma parte de la presente invención el nivel de expresión de uno, dos o tres de dichos miARN puede determinarse. En una realización particular, el método que no forma parte de la presente invención comprende la determinación de los niveles de expresión de uno de dichos marcadores. En una realización del método que no forma parte de la presente invención, el marcador determinado es miR-130a-3p. En otra realización del método que no forma parte de la presente invención, el marcador determinado es miR-122-5p. En otra realización del método que no forma parte de la presente invención, el marcador determinado es miR-486-5p. En otra realización particular, el método que no forma parte de la presente invención comprende determinar el nivel de expresión de dos de dichos miARN, particularmente la determinación de los niveles de miR-130a-3p y miR-122-5p, o los niveles de miR-130a-3p y miR-486-5p, o los niveles de miR-122-5p y miR-486-5p. En otra realización particular, el método que no forma parte de la presente invención comprende determinar los niveles de expresión de los tres miARN, es decir los niveles de expresión de miR-130a-3p, miR-122-5p y miR-486-5p. En otra realización particular el método que no forma parte de la presente comprende determinar el nivel de expresión de miARN adicionales diferentes de miR-130a-3p, miR-122-5p y miR-486-5p.
Se han descrito anteriormente métodos para determinar el nivel de expresión de un miARN, particularmente miR-130a-3p, miR-122-5p o miR-486-5p, en el contexto del primer método de diagnóstico de la invención y pueden aplicarse al método que no forma parte de la presente invención. En una realización particular del método que no forma parte de la presente invención, los niveles de expresión de miARN, particularmente los niveles de miR-130a-3p, miR-122-5p o miR-486-5p se determinan mediante RT-PCR. En otra realización del método que no forma parte de la presente invención, los niveles expresión de miARN se determinan mediante microalineamiento de miARN. Se han descrito anteriormente muestras adecuadas para determinar los niveles de expresión de miARN, particularmente los niveles de miR-130a-3p, miR-122-5p o miR-486-5p, en el contexto del primer método de diagnóstico de la invención y pueden aplicarse al método que no forma parte de la presente invención. En una realización particular del método que no forma parte de la presente invención, la muestra es una muestra de plasma. Se han descrito anteriormente métodos adecuados para normalizar los valores de expresión de miARN entre las diferentes muestras en el contexto del primer método de diagnóstico de la invención y pueden aplicarse al método que no forma parte de la presente invención.
En una segunda etapa del método para diagnosticar válvula aórtica bicúspide que no forma parte de la presente invención, el nivel de expresión de al menos un miARN circulante seleccionado del grupo que consiste en miR-130a-3p, miR-122-5p y miR-486-5p en una muestra de sangre de un sujeto cuyo diagnóstico va a determinarse se compara con un valor de referencia, en el que si el nivel de expresión de al menos un miARN circulante seleccionado de miR-122-5p y miR-486-5p está disminuido con respecto al valor de referencia o el nivel de expresión de miR-130a-3p está aumentado con respecto al valor de referencia, entonces se le diagnostica al sujeto válvula aórtica bicúspide.
En una realización particular del método de diagnóstico que no forma parte de la presente invención, el valor de referencia es el nivel de expresión de miR-130a-3p, miR-122-5p o miR-486-5p determinado en una muestra de sangre de un sujeto de control, en el que el sujeto de control es un sujeto sano o un sujeto al que no se le ha diagnosticado válvula aórtica bicúspide. En otra realización del método que no forma parte de la presente invención, el valor de referencia es el nivel de expresión del miR-130a-3p, miR-122-5p o miR-486-5p como valor promedio determinado en un grupo de sujetos sanos o en un grupo de sujetos a los que no se les ha diagnosticado válvula aórtica bicúspide. Dicha muestra de valor de referencia se obtiene normalmente combinando cantidades iguales de muestras de una población de sujetos. En una realización preferida del método que no forma parte de la presente invención, el valor de referencia es el nivel de expresión de miR-130a-3p, miR-122-5p o miR-486-5p determinado en una muestra de sangre de uno o más sujetos sanos con válvula aórtica tricúspide, preferiblemente de sujetos sanos con válvula aórtica tricúspide no dilatada.
Una vez establecido el valor de referencia de la expresión de miR-130a-3p, miR-122-5p o miR-486-5p, los niveles de expresión de miR-130a-3p, miR-122-5p o miR-486-5p circulantes expresados en una muestra de sangre de un sujeto que va a diagnosticarse pueden compararse con este valor de referencia, y por tanto asignarse como “aumentado”, “disminuido” o “igual”. Por ejemplo, un aumento en los niveles de expresión por encima del valor de referencia de al menos 1,1 veces, 1,5 veces, 5 veces, 10 veces, 20 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces, 60 veces, 70 veces, 80 veces, 90 veces, 100 veces o incluso más en comparación con el valor de referencia se considera como nivel de expresión “aumentado”. Por otro lado, una disminución en los niveles de expresión por debajo del valor de referencia de al menos 0,9 veces, 0,75 veces, 0,2 veces, 0,1 veces, 0,05 veces, 0,025 veces, 0,02 veces, 0,01 veces, 0,005 veces o incluso menos en comparación con el valor de referencia se considera como nivel de expresión “disminuido”. Los niveles de expresión pueden juzgarse “iguales” al valor de referencia si los niveles difieren con respecto al valor de referencia menos del 5%, menos del 4%, menos del 3%, menos del 2%, menos del 1%, menos del 0,5%, menos del 0,4%, menos del 0,3%, menos del 0,1%, menos del 0,05%, o menos.
Por tanto, según el método que no forma parte de la presente invención, si hay una disminución en el nivel de expresión de miR-122-5p o miR-486-5p circulante en una muestra de sangre de un sujeto cuyo diagnóstico va a determinarse con respecto al valor de referencia, entonces a dicho sujeto se le diagnostica válvula aórtica bicúspide. Por tanto, según el método que no forma parte de la presente invención, si hay un aumento en el nivel de expresión de miR-130a-3p circulante en una muestra de sangre de un sujeto cuyo diagnóstico va a determinarse con respecto al valor de referencia, entonces a dicho sujeto se le diagnostica válvula aórtica bicúspide.
El experto en la técnica entenderá que el diagnóstico puede no ser correcto para el 100% de los pacientes en estudio. Sin embargo, la expresión requiere que el método de diagnóstico proporcione resultados correctos para una parte estadísticamente significativa de los pacientes. La determinación de si el método proporciona predicciones estadísticamente significativas puede llevarse a cabo usando técnicas estadísticas convencionales tales como la determinación de intervalos de confianza, determinación del valor de p, prueba de la t de Student, prueba de Mann-Whitney. Intervalos de confianza adecuados son de al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 90%, al menos el 95%. Valores de p son, preferiblemente, 0,05, 0,01, 0,005.
Las realizaciones dadas a conocer en el contexto de los métodos primero, segundo y tercero de la invención también pueden aplicarse al método que no forma parte de la presente invención.
6. Kits de la invención y usos de los mismos
La invención también se refiere a kits para llevar a cabo los métodos de la invención. Por tanto, en un quinto aspecto, la invención se refiere a un kit que comprende reactivos adecuados para la determinación del nivel de expresión de miR-718, en los que los oligonucleótidos que se hibridan específicamente con miR-718 comprenden al menos el 50% de la cantidad total de los oligonucleótidos que forman el kit.
En realizaciones adicionales, los reactivos adecuados para la determinación de los niveles de expresión de dicho miARN comprenden al menos el 55%, al menos el 60%, al menos el 65%, al menos el 70%, al menos el 75%, al menos el 80%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98% o al menos el 99% de la cantidad total de los oligonucleótidos que forman el kit.
En otra realización, el kit comprende reactivos adecuados para la determinación del nivel de expresión de miR-718, miR-130a-3p y un miARN adicional seleccionado de miR-122-5p y miR-486-5p. En otra realización, el kit comprende reactivos adecuados para la determinación del nivel de expresión de miR-718, miR-122-5p y un miARN adicional seleccionado de miR-130a-3p y miR-486-5p. En otra realización, el kit comprende reactivos adecuados para la determinación del nivel de expresión de miR-718, miR-486-5p y un miARN adicional seleccionado de miR-130a-3p y miR-122-5p. En otra realización el kit comprende reactivos adecuados para la determinación del nivel de expresión de miR-718, miR-130a-3p, miR-122-5p y miR-486-5p.
En una realización preferida, los reactivos adecuados para la determinación del nivel de expresión de un miARN son oligonucleótidos que se hibridan específicamente con dicho miARN.
En una realización preferida, los oligonucleótidos que se hibridan específicamente con miR-718 comprenden al
menos el 55%, al menos el 60%, al menos el 65%, al menos el 70%, al menos el 75%, al menos el 80%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98% o al menos el 99% de la cantidad total de los oligonucleótidos que forman el kit.
En una realización preferida, los oligonucleótidos que se hibridan específicamente con miR-130a-3p comprenden al menos el 1%, al menos el 5%, al menos el 10%, al menos el 15%, al menos el 20%, al menos el 25%, al menos el 30%, al menos el 35%, al menos el 40% o al menos el 45% de la cantidad total de los oligonucleótidos que forman el kit.
En una realización preferida, los oligonucleótidos que se hibridan específicamente con miR-122-5p comprenden al menos el 1%, al menos el 5%, al menos el 10%, al menos el 15%, al menos el 20%, al menos el 25%, al menos el 30%, al menos el 35%, al menos el 40% o al menos el 45% de la cantidad total de los oligonucleótidos que forman el kit.
En una realización preferida, los oligonucleótidos que se hibridan específicamente con miR-486-5p comprenden al menos el 1%, al menos el 5%, al menos el 10%, al menos el 15%, al menos el 20%, al menos el 25%, al menos el 30%, al menos el 35%, al menos el 40% o al menos el 45% de la cantidad total de los oligonucleótidos que forman el kit.
En una realización preferida, los oligonucleótidos que se hibridan específicamente con miR-718, miR-130a-3p, miR-122-5p y miR-486-5p comprenden juntos al menos el 50%, al menos el 55%, al menos el 60%, al menos al menos el 65%, al menos el 70%, al menos el 75%, al menos el 80%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98% o al menos el 99% de la cantidad total de los oligonucleótidos que forman el kit. Estos oligonucleótidos son ácidos nucleicos específicos de secuencia, de manera que sólo cuantifican la secuencia que se hibrida con los mismos y no todo el ADN bicatenario. El oligonucleótido puede ser un cebador o una sonda. Deben usarse sondas para determinar el nivel de expresión por medio de PCR. Una sonda es un oligonucleótido que tiene una secuencia definida que puede hibridarse específicamente con una secuencia complementaria de un ácido nucleico, de modo que puede usarse para detectar e identificar secuencias complementarias o sustancialmente complementarias en ácidos nucleicos. La longitud de la sonda de la invención puede variar dentro de un gran intervalo aunque por motivos prácticos, se prefieren sondas que tienen una pequeña longitud de menos de 10 nucleótidos, preferiblemente al menos 15 nucleótidos, preferiblemente al menos 20 nucleótidos, preferiblemente al menos 25 nucleótidos y, preferiblemente no más de 100 nucleótidos, más preferiblemente comprendidas entre 15 bases y 30 bases, preferiblemente entre 16 bases y 22 bases.
Alternativa o adicionalmente, los oligonucleótidos usados pueden contener enlaces modificados tales como enlaces fosfodiéster, fosfotriéster, fosforotioato, fosforoditioato, fosforoselenoato, fosforodiselenoato, fosforoanilotioato, fosforoamidato, metilfosfonato, boranofosfonato, así como combinaciones de los mismos, o son ácidos nucleicos peptídicos (PNA), en los que los diferentes nucleótidos están unidos por enlaces amida.
En el caso de que el oligonucleótido sea una sonda, dicha sonda puede tener en su extremo 3' un fluoróforo y en su extremo 5' una molécula que bloquea su emisión de fluorescencia (extintor). Dicha sonda se hibrida específicamente en la parte central del producto de PCR que va a obtenerse.
El kit puede contener un conjunto de uno o más pares de cebadores de oligonucleótido diseñados para amplificar específicamente los miARN de los métodos de la invención.
La presente invención proporciona además un kit que contiene un microalineamiento que tiene oligonucleótidos de sonda específicos de miARN.
Los microalineamientos contenidos en el kit pueden incluir también oligonucleótidos de sonda que reconocen específicamente ARN adecuados para fines de normalización. En determinadas realizaciones el kit contiene además una muestra de control. Esta muestra puede derivarse de una célula, tejido o sujeto normal o de control, por ejemplo, uno que presenta, por ejemplo, rasgos normales. En realizaciones adicionales, los kits de la invención contienen instrucciones para su uso. En una realización alternativa, la presente invención proporciona un kit que contiene un conjunto de uno o más pares de cebadores de oligonucleótido diseñados para amplificar específicamente los miARN de una firma de miARN identificada usando los métodos de la invención en un ensayo de reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa, preferiblemente una reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa cuantitativa en tiempo real.
La expresión “se hibridan específicamente” se refiere a condiciones tales que permiten la hibridación de dos polinucleótidos de cadena sencilla, de secuencia complementaria o que tienen un alto grado de similitud, en condiciones rigurosas o condiciones moderadamente rigurosas, produciendo una única molécula bicatenaria mediante apareamiento de bases.
La “rigurosidad” de reacciones de hibridación puede determinarla fácilmente un experto habitual en la técnica, y generalmente es un cálculo empírico dependiente de la longitud de la sonda, la temperatura de lavado y la
concentración de sal. En general, sondas más largas requieren mayores temperaturas para un apareamiento apropiado, mientras que sondas más cortas necesitan menores temperaturas. La hibridación generalmente depende de la capacidad del ADN desnaturalizado para volver a aparearse cuando están presentes hebras complementarias en un entorno por debajo de su temperatura de fusión. Cuando mayor es el grado de homología deseada entre la sonda y secuencia que puede hibridarse, mayor es la temperatura relativa que puede usarse. Como resultado, se deduce que mayores temperaturas relativas tenderían a hacer que las condiciones de reacción fuesen más rigurosas, mientras que menores temperaturas que fuesen menos rigurosas. Para detalles adicionales y una explicación de la rigurosidad de reacciones de hibridación, véase Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995). Se identifican condiciones rigurosas y condiciones moderadamente rigurosas por Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Nueva York: Cold Spring Harbor Press, 1989.
En otra realización, el kit comprende además reactivos adecuados para la determinación del nivel de expresión de uno o más ARN de referencia y/o reactivos adecuados para la determinación del nivel de expresión de uno o más genes constitutivos.
El término “ARN de referencia” se ha definido en el contexto de la presente invención. El término “gen constitutivo”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a un gen de mantenimiento que codifica para una proteína expresada de manera constitutiva y que lleva a cabo funciones celulares esenciales. Los genes de mantenimiento adecuados para su uso como patrones internos incluyen, pero no se limitan a, miosina, p-2-microglobulina, ubiquitina, proteína ribosómica 18S, ciclofilina, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) y actina.
Los kits de la invención también contienen otros reactivos que permiten determinar el nivel de expresión de un miARN pero que no son específicos para dicho miARN, por ejemplo reactivos para la extracción de material de ARN, etc., por ejemplo, cebadores para la síntesis del ADNc correspondiente por medio de RT, reactivos para la amplificación de ADN tales como ADN polimerasas, dNTP, tampones, etc.
En otro aspecto, la invención se refiere al uso de un kit para diagnosticar dilatación de la aorta ascendente en un método según la invención, o para determinar la probabilidad de que un sujeto padezca dilatación de la aorta ascendente en un método según la invención o para determinar el pronóstico o para monitorizar la progresión de un sujeto que padece dilatación de la aorta ascendente en un método según la invención, en el que el kit comprende reactivos adecuados para la determinación del nivel de expresión de miR-718 tal como se define en la reivindicación 9.
La invención se detalla a continuación por medio de los siguientes ejemplos que son meramente ilustrativos y de ningún modo limitativos del alcance de la invención.
EJEMPLOS
Métodos
Población de estudio
Los participantes incluidos en este estudio pertenecen a una cohorte de pacientes con VAB incluidos de manera prospectiva y a los que se realiza el seguimiento en las instalaciones del inventor. Tras su inclusión, se introdujeron los participantes de manera prospectiva en una base de datos específica, se sometieron a extracción de sangre y dieron su consentimiento informado por escrito. Se almacenaron las muestras hasta que se necesitaran en el banco de muestras biológicas del inventor (Biobanc IISPV - HUSJR). Se realizó el diagnóstico de VAB cuando se visualizaban claramente dos valvas aórticas, con o sin un rafe, o bien en la vista de eje corto paraesternal de un ecocardiograma transtorácico, en un ecocardiograma transesofágico o bien en una resonancia magnética cardiaca. El mismo observador realizó o supervisó las exploraciones.
El diseño de este estudio se compone de dos evaluaciones con el fin de determinar los posibles miARN asociados con VAB y dilatación aórtica. En primer lugar, los inventores estudiaron la asociación de VAB con la modulación en el perfil de miARNoma circulante mediante la determinación, usando microalineamientos, de la expresión del perfil de miARN en plasma de pacientes a los que se les ha diagnosticado VAB (VABno-dil; n=9), VAB y dilatación aórtica (VABdil; n=9), y comparando con los perfiles de expresión de sujetos de control con válvula aórtica tricúspide (VAT) sanos (VATno-dil; n=6). Para esta fase, y con el fin de mejorar la potencia del estudio los inventores seleccionaron tres grupos compuestos por pacientes con características muy homogéneas (tabla 2), en cuanto a la exclusión de posibles factores de confusión tales como la edad, el sexo o el índice de masa corporal (IMC), así como se excluyeron pacientes con estenosis aórtica, hipertensión, diabetes mellitus o tratamiento farmacológico (incluyendo estatinas, ACE/ARII y/o p-bloqueantes). Además, se usó un diámetro aórtico inferior a 19 mm/m2 o superior a 21 mm/m2 como criterio para diferenciar entre los pacientes sin dilatación o con dilatación respectivamente.
Tabla 2. Características clínicas y ecocardiográficas de los pacientes incluidos en el microalineamiento.
Control VAB VABdil P
Edad (años) 41 ±4 33 ±3 41 ±4 0,177 Sexo (mascullno/femenino) (6/0) (6/0) (6/0) 1,000 Peso corporal (kg) 74,2 ±2,2 75,0 ±4,2 79,0 ±5,7 0,743 Hipertensión 0 (0%) 0 (0%) 0 (0%) 1,000 Hipercolesterolemia 0 (0%) 0 (0%) 2 (22,2%) 0,162 Fumador 1 (20,0%) 2 (22,2%) 3 (33,3%) 0,814 Estenosis aórtica (gradiente medio
>20 mm Hg) " 0 (0%) 0 (0%) 0 (0%) 1,00 Regurgitación aórtica (>ll) 0 (0%) 3 (33,3%) 6 (66,7%) 0,031* Gradiente de válvula aórtica (medio, 3,75 ± 0,3 4,6 ±0,8 7,22 ± 1,6 0,190 Diámetro diastólico del ventrículo
51,67 ± 1,5 50,75 ±1,0 55,11 ±1,3 0,050 Izquierdo (mm)
Diámetro sistólico del ventrículo 32,33 ± 0,9 31,88 ±2,7 33,78 ±1,4 0,484 izquierdo (mm)
Fracción de eyección ventrlcular 74,40 ± 3,2 71,25 ± 1,2 71,33 ±2,6 0,641 Izquierda {%)
Diámetro de la aorta ascendente
(mm/m2)_______________________ 15,05 ±0,4 15,74 ±0,7 23,35 ±1,1 <o,oor
* Valores significativos (p<0,05); ** Valores significativos (p<0,01); VAB, pacientes con válvula aórtica bicúspide; VABdil, pacientes con válvula aórtica bicúspide y dilatación aórtica.
En la segunda evaluación los inventores validaron mediante RT-qPCR los candidatos a miARN en una nueva cohorte de individuos comprendidos también por individuos con VAT (n=19) y VAB (n=24) (tabla 3). El grupo de VAB comprendía pacientes con VABno-dil (n=12) y VABdil (n=12). El grupo de VAT comprendía controles sanos VATno-dil (n=12) y un nuevo grupo de pacientes con VAT y dilatación aórtica (VATdil; n=7) con el fin de determinar los efectos específicos asociados con la morfología de las valvas o dilatación aórtica per se. Se excluyeron pacientes con síndrome de Marfan.
Tabla 3. Características clínicas y ecocardiográficas de la cohorte independiente usada en el estudio de validación.
VAT VATdil VAB VABdil P Edad (años) 39 ±3 65 ±3 33 ± 3 42 ±3 <0,001** Sexo (masculino/
femenino) (8/4) (5/2) (11/1) (6/6) 0,171 Peso corporal (kg) 70,1 ± 3,7 76,8 3,4 73,25 ±4,4 66,6 ±4,2 0,374 Hipertensión 0 (0%) 5 (71,4%) 1 (8,3%) 3 (25%) 0,002** Hipercoleste-rolemia 1 (8,3%) 1 (14,3%) 0 (0%) 0 (0%) 0,391 Fumador 0 (0%) 0 (0%) 1 (8,3%) 3 (25%) 0,105 Estenosis aórtica
(gradiente medio 0 (0%) 0 (0%) 1 (8,3%) 2 (16,7%) 0,507 >20 mm Hg)
Regurgitación
aórtica (>ll) 0 (0%) 4 (57,1%) 7 (46,7.3%) 4 (33,3%) 0,012* Gradiente de
válvula aórtica 3,4 ±0,2 3,0+ 0,1 6,7 ±1,0 16,5 ± 5,8 0,117 (medio, mm Hg)
Diámetro diastólico
del ventrículo 50,1 ± 1,2 53,0 2,2 54,8 ±2,0 52,3 ± 0,9 0,182 izquierdo (mm)
Diámetro sistólico
del ventrículo 29,9 ± 0,7 35,8 ±2,9 34,7 ±0,7 32,2 ± 0,7 0,048* izquierdo (mm)
Fracción de
eyección
ventricular 77,3 ± 1,6 61,0 ± 11,7 69,1 ±2,6 70,7 ± 1,2 0,063 izquierda (%)
Diámetro de la
aorta ascendente 15,9 ±0,6 23,2 ±0,9 17,6 ±0,8 25,1 ± 1,2 <0,001** (mm/m2)
* Valores significativos (p<0,05); ** Valores significativos (p<0,01); VAB, pacientes con válvula aórtica bicúspide; VABdil, pacientes con válvula aórtica bicúspide y dilatación aórtica.
Toma de muestras de sangre
Se recogieron muestras de sangre en condiciones de ayuno durante la noche y se procesaron en el plazo de 90 min después. Se centrifugaron las muestras a 1500 g durante 15 min para obtener plasma. Se almacenaron los plasmas a -80°C hasta que se necesitaran en el banco de muestras biológicas del inventor (Biobanc IISPV - HUSJR).
Extracción de ARN y preparación de microalineamientos de miARN
Se extrajo el ARN total de 250 pl de plasma usando el reactivo TRIzol según las instrucciones del fabricante (Invitrogen) y se purificó usando el minikit RNeasy (Qiagen). Para aumentar la recuperación de ARN, se añadió 1 pg de ARN portador MS2 a cada muestra de plasma. Se determinó la calidad del ARN total aislado usando el bioanalizador Agilent 2100.
Se evaluaron los niveles de expresión de miARN en plasma para 24 individuos usando microalineamientos de ARN humano 8x60k SurePrint G3 (Agilent Techonlogies) que cubrían 1205 miARN humanos (Sanger miRBase versión 16). Se desfosforilaron los miARN y se marcaron con cianina-3-citidina-bisfosfato incluyendo una adición conocida de disolución de marcaje (Agilent Technologies) para evaluar la eficacia de marcaje. Se hibridaron las muestras sobre los alineamientos incluyendo una adición conocida de disolución de hibridación (Agilent Technologies) para monitorizar la eficacia de hibridación. Se exploraron los alineamientos con un sistema de exploración de microalineamientos G2565CA con tecnología de alta resolución SureScan (Agilent Technologies) usando el software Scan Control. Para el procesamiento de datos se usaron los softwares Feature extraction 11.5.11 (Agilent Technologies) y GeneSpring 12.6.1. Se realizaron todas las etapas según el protocolo del fabricante.
Análisis mediante microalineamientos de los datos de expresión de miARN
Se normalizaron los datos de los microalineamientos usando el método de promedio de alineamientos múltiples robusto (RMA) (Irizarry RA. et al. Biostatistics 2003; 4:249-264), implementado en el paquete AgiMicroRna Bioconductor, y se determinaron los cambios en veces de miARN circulantes usando el modelo lineal implementado
en el paquete limma Bioconductor (Ritchie ME. et al. Nucleic Acids Res 2015; 43:e47). Se usó el método de Benjamini y Hochberg para ajustar los valores de P para múltiples pruebas y el control de la tasa de falso descubrimiento (Benjamini Y. y Hochberg Y. J R Stat Soc Ser B 1995; 57:289-300).
Cuantificación de microARN mediante qRT-PCR en tiempo real
Se validó la expresión de microalineamientos en una cohorte de pacientes independiente (n=43), que incluía controles con vAt sanos, pacientes con VAB, pacientes con VABdil y un grupo extra de individuos con VAT con dilatación aórtica. Para analizar la expresión de cada miARN, se realizó transcripción inversa usando el kit de transcripción inversa de microARN TaqMan (Applied Biosystems) y los cebadores de transcripción inversa específicos de miARN proporcionados con el ensayo de microARN TaqMan (Applied Biosystems). La concentración de ARN total final usada fue de 2,5 ng/|il. Se realizó la reacción a 16°C durante 30 min, 42°C durante 30 min y 85°C durante 5 min. Los inventores usaron 1,33 |il de ADNc obtenidos en una amplificación por qRT-PCR cuantitativa posterior usando la mezcla maestra de PCR universal TaqMan (Applied Biosystems) y la sonda específica asociada proporcionada en el kit de ensayo de microARN TaqMan (Applied Biosystems). Se usaron sondas Taqman específicas para cada gen: microARN-122-5p (miR-122-5p; hsa-mir-122-5p), 5'-UGGAGUGUGACAAUGGUGUUUG-3' (SEQ ID NO: 1), microARN-130a-3p (miR-130a-3p; hsa-mir-130a-3p), 5'-CAGUGCAAUGUUAAAAGGGCAU-3' (SEQ ID NO: 2), microARN-486-5p (miR-486-5p; hsa-mir-486-5p), 5'-UCCUGUACUGAGCUGCCCCGAG-3' (SEQ ID NO: 3) y microARN-718 (miR-718; hsa-mir-718), 5'-CUUCCGCCCCGCCGGGCGUCG-3' (SEQ ID NO: 4). Se normalizaron los resultados a la expresión del ARN nuclear pequeño U6 (ARNnp U6), que se usó como control endógeno. Se realizó la amplificación usando el sistema de PCR en tiempo real ABI Prism 7300 SDS (Applied Biosystems, Madrid, España) a 95°C durante 10 min, seguido por 40 ciclos de 95°C durante 15 s y 60°C durante 1 min. Se calculó el cambio en veces al nivel del miARN mediante la escala log 2 según la ecuación 2-AACt, en donde ACt=Ct miARN-Ct U6 y AACt=ACt muestras tratadas - ACt controles no tratados.
Análisis de enriquecimiento de rutas y funcionales de genes diana de miARN
Se predijeron los genes diana de miR-122, miR-130a y miR-486 usando DIANA-miRPath (v3; microrna.gr/tarbase) (Vlachos IS et al. Nucleic Acids Res 2015; 43:W460-466) y, basándose en el análisis de enriquecimiento se mapearon en las rutas de la Kyoto Encyclopaedia of Genes and Genomes (KEGG) y se priorizaron para las rutas de transducción de señales intracelulares que podían estar reguladas por los tres miARN.
Debido a los genes diana limitados identificados para miR-718, para este miARN los inventores combinaron los genes diana predichos por cuatro bases de datos, las bases de datos TargetScan (v7.0; targetscan.org) (Agarwal V et al. Elife 2015; 4:e05005), miRTarBase (versión de 2016; mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw) (Chou C-H et al. Nucleic Acids Res 2015; 44:D239-247), DIANA-microT-CDS (v3; microrna.gr/microT-CDS) (Vlachos IS et al. Nucleic Acids Res 2015; 43:W460-466) y miRDB (versión de 2016; mirdb.org) (Wong N. y Wang X. Nucleic Acids Res 2015; 43:D146-152). En este caso, se llevó a cabo la clasificación funcional de los genes diana con Gene Ontology (GO) y el análisis de rutas usando DAVID (david.ncifcrf.gov) (Huang DW et al. Nat Protoc 2009; 4:44-57) y WebGestalt (webgestalt.org) (Wang J et al. Nucleic Acids Res 2013; 41:W77-83), respectivamente.
Se usó Cytoscape, versión 3.0.1 (Shannon P. et al. Genome Res 2003; 13:2498-2504) para visualizar la interacción miARN-ARNm predicha. En las redes, las rutas de transducción de señales intracelulares están representadas por nodos con forma de hexágonos, los miARN están representados como nodos con forma de rectángulos y los genes diana están representados como nodos con forma redonda.
Análisis estadístico
Se compararon las medias de dos grupos usando la prueba de la t de Student. Se usaron pruebas de chi-cuadrado o la prueba exacta de Fisher, cuando era apropiado, para comparar las frecuencias de las variables categóricas. Se evaluaron los efectos de la morfología de las valvas y la dilatación aórtica usando ANOVA. Se utilizó la prueba de Tukey para comparaciones por parejas. Se usó correlación de Pearson para identificar relaciones lineales entre los niveles de expresión de miARN y el diámetro de la aorta ascendente. Se usaron modelos de regresión lineal hacia atrás para identificar factores de predicción independientes de la expresión circulante de miARN. Valores de p <0,05 se consideraron significativos. Se realizó el análisis estadístico usando el software SPSS, versión 21.0 (IBM, Chicago, IL, USA).
Resultados
1.- Identificación de perfiles de miARNoma circulante
Se realizó la obtención del perfil de expresión de miARN global en muestras de plasma de controles con VAT, pacientes con VABno-dil y con VABdil con el fin de identificar candidatos a miARN, cuyas expresiones estaban alteradas en VAB, debido a la morfología de las valvas y/o debido a la dilatación aórtica. Las características clínicas de los pacientes incluidos en esta fase se proporcionan en la tabla 1. Tras el procesamiento de los datos de microalineamientos correspondientes a los perfiles de expresión de miARN, se identificaron 260 miARN que se expresaban en al menos el 10% de las muestras. Los inventores realizaron una comparación por parejas entre grupos para identificar candidatos a miARN no sólo para VAB, sino también para dilatación aórtica. De este modo,
los inventores analizaron en primer lugar el efecto de la morfología de las valvas (comparando pacientes con VATnodii y VABno-dil) en el miARNoma, y tal como se notifica en el gráfico de volcán (figura 1A), se encontró que la expresión de miR-122-5p y miR-486-5p difiere significativamente del resto, indicando que los niveles de expresión de estos dos miARN en plasma podría estar asociado con la morfología de la válvula aórtica.
En un segundo análisis los inventores compararon los dos grupos más divergentes (VATno-dil y VABdil) con el fin de integrar la complejidad asociada con la morfología de las valvas y la dilatación de la aorta ascendente. Usando este análisis se encontró que la expresión de otros dos miARN, el miR-130a-3p y el miR-718 (figura 1B), eran significativamente diferentes entre los plasmas de pacientes con VATno-dil y VABdil pacientes.
2 - Validación mediante RT-qPCR de candidatos a miARN en una cohorte independiente
Se validaron mediante RT-qPCR los candidatos a miARN seleccionados usando el enfoque de microalineamiento en un nuevo conjunto (n=43) comprendido por controles sanos con VATno-dil, pacientes con VABno-dil, VABdil y, en con el fin de determinar el patrón específico asociado con la morfología de las valvas o dilatación aórtica per se, se incluyó un nuevo grupo de pacientes con VAT y dilatación aórtica (VATdil).
2.1- Los niveles de expresión de miR-122-5p, miR-130a-3p y miR-486-5p están asociados con la morfología de la válvula aórtica
Por un lado, los inventores compararon la expresión en plasma de los candidatos a miARN, miR-122-5p, miR-130a-3p, miR-486-5p y miR-718, dependiendo de la morfología de la valva con independencia de la presencia o ausencia de dilatación en la aorta ascendente (figura 2A).
Usando este estudio de validación los inventores corroboraron que la expresión de tres de los candidatos a miARN, miR-122-5p, miR-130a-3p, miR-486-5p, difiere significativamente entre el plasma de controles sanos con VAT y pacientes con VAB (VAB frente a vAt ), por tanto sus niveles de expresión circulantes estaban influidos por la morfología de la valva. Los inventores observaron que la morfología de valvas bicúspide estaba asociada con niveles circulantes disminuidos de miR-122-5p, miR-486-5p, en lugar de los niveles aumentados notificados para miR-130a-3p.
Con el fin de lograr un conocimiento profundo del papel biológico de miR-122, miR-130a y miR-486 en VAB, se realizó una categorización funcional de genes diana de miARN. Se predijeron las dianas de cada miARN seleccionado y basándose en un análisis de enriquecimiento se mapearon en rutas de KEGG y se priorizaron las rutas de transducción de señales intracelulares que podían estar reguladas por los tres miARN. Usando este enfoque los inventores identificaron la ruta de señalización de factor de crecimiento transformante-beta (TGF-P) como la más significativamente enriquecida (p=7,73*10‘7) con un total de 32 genes seleccionados como diana por los cuatro miARN seleccionados (figura 2B).
2.2 - Papel de la dilatación aórtica sobre los niveles de expresión de miR-130a-3p y miR-718 en plasma
Por otro lado, los inventores validaron si la modulación del perfil de expresión de miARN de miR-130a-3p y miR-718 en plasma estaría relacionado con la dilatación de la aorta. Los inventores analizaron en primer lugar el efecto de la dilatación aórtica sobre el miR-130a-3p y miR-718 comparando los niveles de expresión entre pacientes con dilatación y sin dilatación independientemente de la morfología de la válvula aórtica (n=43, figura 3A), y observaron que la regulación por incremento de la expresión de miR-130a-3p en plasma de pacientes con VAB estaba influida sólo por la morfología de la válvula aórtica y que la dilatación de la aorta no tenía efecto modulador. En cambio, los inventores observaron que la expresión en plasma de miR-718 se vio significativamente afectada por la dilatación de la aorta ascendente, y que este efecto promovido por la dilatación estaba escondiendo la consecuencia de expresión diferencial de la morfología de las valvas no observada en las comparaciones usadas en la validación previa.
Los inventores exploraron estos efectos mediados por la morfología y dilatación aórtica comparando la expresión de miR-130a-3p (figura 3B) y miR-718 (figura 3C) entre los cuatro subgrupos dependiendo de la morfología de las valvas y la dilatación de la aorta ascendente (VATno-dil, VATdil, VABno-dil y VABdil). Usando este análisis los inventores corroboraron que la expresión de miR-130a-3p regulada por incremento estaba asociada sólo con una morfología bicúspide de la válvula aórtica, y no se observó ningún efecto de la dilatación aórtica. Los inventores también corroboraron que la expresión de miR-718 regulada por disminución observada en pacientes con VAB era significativamente más acusada en presencia de dilatación aórtica en comparación con la ausencia de dilatación aórtica, con independencia de la morfología bicúspide o tricúspide de la válvula aórtica.
3.-La expresión de miR-718 en plasma es un factor de predicción de dilatación aórtica
El papel de miR-718 como biomarcador de dilatación aórtica estaba apoyado por la determinación de que la expresión en plasma de miR-718 estaba inversamente correlacionada con el diámetro de la aorta ascendente (R=-0,629, p=3,1*10'5 y figura 4), usando todos los pacientes incluidos en la cohorte de validación (n=43), independientemente de su morfología de las valvas (VAT y VAB) o la presencia o ausencia de dilatación aórtica (con dilatación y sin dilatación). Además, usando esta cohorte de validación, los inventores construyeron un modelo lineal multivariante usando el perfil de expresión de miR-718 como variables de predicción y la dilatación de la aorta
(representada como variable categórica o como el diámetro de la aorta ascendente) como variable de desenlace así como la edad y la hipertensión como posibles factores de confusión (tabla 4). Usando este análisis los inventores confirmaron que la expresión de miR-718 en plasma es un factor de predicción independiente de la dilatación de la aorta.
Tabla 4. Un resumen de los resultados del análisis de regresión lineal multivariante de los niveles de expresión de miR-718 como factor de predicción de dilatación aórtica.
Dilatación aórtica
P P
Edad (años) 0,317 0,118
Hipertensión 0,050 0,801
expresión de miR-718 -0,407 0,022*
Se realizó el análisis en la cohorte de validación independiente, que incluía VAT, VATdil, VAB y VABdil (n=43).* Valores significativos (p<0,05)
Con el fin de proporcionar una comprensión mejorada de la posible relevancia funcional de la regulación por disminución de miR-718, los inventores caracterizaron las supuestas funciones biológicas de este miARN basándose en la identificación de genes diana de miR-718. La red de interacción de miARN-gen predicha se compone del miR-718 y de 167 genes diana (datos no mostrados). Los inventores también realizaron un análisis de enriquecimiento funcional para predecir la posible función biológica de los genes diana de miR-718. Se usó DAVID para determinar las ontologías génicas (GO) asociadas con procesos biológicos que estarían sobrerrepresentadas dentro de los genes diana de miR-718 y los inventores encontraron que cuatro de los genes diana estaban significativamente enriquecidos para el GO, proceso biológico de “remodelación de vasos sanguíneos” (p=1,9*10‘2). Usando WebGestalt los inventores realizaron un análisis funcional basándose en las rutas que podrían estar asociadas con dianas de miR-718 e identificaron que 3 de los genes diana de miR-718 estaban significativamente enriquecidos para la “ruta de adhesión focal” (p=9,0*10‘4). El factor de crecimiento endotelial vascular A (VEGFA) es uno de los genes diana de miR-718 que están significativamente enriquecidos para la “ruta de adhesión focal”.
Claims (13)
- REIVINDICACIONESi. Un método in vitro para diagnosticar dilatación de la aorta ascendente en un sujeto que comprende(i) determinar el nivel de expresión de miR-718 circulante en una muestra de sangre de dicho sujeto, y(ii) comparar el nivel de expresión obtenido en (i) con un valor de referencia,en el que si el nivel de expresión de miR-718 circulante está disminuido con respecto al valor de referencia, entonces se le diagnostica al sujeto dilatación de la aorta ascendente.
- 2. El método según la reivindicación 1, en el que el valor de referencia es el nivel de expresión de miR-718 determinado en una muestra de sangre de uno o más sujetos que padecen una válvula aórtica bicúspide no dilatada o en una muestra de sangre de uno o más sujetos sanos con válvula aórtica tricúspide no dilatada.
- 3. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1o 2, en el que el sujeto al que se le diagnostica dilatación de la aorta ascendente se selecciona del grupo que consiste en un sujeto que tiene una válvula aórtica bicúspide y un sujeto que tiene una válvula aórtica tricúspide.
- 4. Un método in vitro para determinar la probabilidad de que un sujeto padezca dilatación de la aorta ascendente que comprende(i) determinar el nivel de expresión de miR-718 circulante en una muestra de sangre de dicho sujeto, y(ii) comparar el nivel de expresión obtenido en (i) con un valor de referencia,en el que si el nivel de expresión de miR-718 circulante está disminuido con respecto al valor de referencia, entonces el sujeto muestra alta probabilidad de padecer dilatación de la aorta ascendente oen el que si el nivel de expresión de miR-718 circulante es igual a o está aumentado con respecto al valor de referencia, entonces el sujeto muestra baja probabilidad de padecer dilatación de la aorta ascendente.
- 5. El método según la reivindicación 4, en el que el valor de referencia es el nivel de expresión de miR-718 determinado en una muestra de sangre de uno o más sujetos que tienen un diámetro aórtico ascendente inferior a 19 mm/m2.
- 6. Un método in vitro para determinar el pronóstico o para monitorizar la progresión de un sujeto que padece dilatación de la aorta ascendente que comprende:(i) determinar el nivel de expresión de miR-718 circulante en una muestra de sangre de dicho sujeto, y(ii) comparar el nivel de expresión obtenido en (i) con un valor de referencia obtenido del mismo sujeto en un punto de tiempo anterioren el que si el nivel de expresión de miR-718 circulante está disminuido con respecto al valor de referencia, entonces el sujeto muestra mal pronóstico oen el que si el nivel de expresión de miR-718 circulante está aumentado con respecto al valor de referencia, entonces el sujeto muestra buen pronóstico.
- 7. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la muestra de sangre es una muestra de plasma.
- 8. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el sujeto es un ser humano.
- 9. Un kit para su uso en el método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, que comprende reactivos adecuados para la determinación del nivel de expresión de miR-718, en el que los oligonucleótidos que se hibridan específicamente con miR-718 comprenden al menos el 50% de la cantidad total de oligonucleótidos que forman el kit.
- 10. El kit según la reivindicación 9, que comprende además reactivos adecuados para la determinación del nivel de expresión de uno o más ARN de referencia y/o reactivos adecuados para la determinación del nivel de expresión de uno o más genes constitutivos.
- 11. Uso de un kit para diagnosticar dilatación de la aorta ascendente en un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, o para determinar la probabilidad de que un sujeto padezca dilatación de la aorta ascendente en un método según una cualquiera de las reivindicaciones 4 o 5, o para determinar el pronóstico o para monitorizar la progresión de un sujeto que padece dilatación de la aorta ascendente en un método según la reivindicación 6, en el que el kit comprende reactivos adecuados para la determinación del nivel de expresión de miR-718.
- 12. Uso según la reivindicación 11, en el que los reactivos adecuados para la determinación del nivel de expresión de miR-718 son oligonucleótidos que se hibridan específicamente con dicho miR-718.
- 13. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 11 o 12, en el que el kit comprende además reactivos adecuados para la determinación del nivel de expresión de uno o más ARN de referencia y/o reactivos adecuados para la determinación del nivel de expresión de uno o más genes constitutivos.
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-
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