ES2962407T3 - Inmunoestimulante para su uso contra patógenos - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a composiciones que comprenden una Mycobacterium inactivada o una fracción inmunogénica de la misma, para uso en la prevención de una infección en un sujeto, en donde la infección se selecciona del grupo que consiste en una infección parasitaria protozoaria y una infección bacteriana, con la condición de que que la infección no es causada por una Mycobacterium. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Inmunoestimulante para su uso contra patógenos

Campo de la invención

La invención se refiere al campo de enfermedades infecciosas e inmunología, específicamente a un inmunoestimulante de inmunidad entrenada para su uso contra patógenos. En particular, la invención se refiere a una composición que comprende unaMycobacterium bovisinactivada o una fracción inmunogénica de la misma para su uso en la prevención de enfermedades infecciosas distintas de micobacteriosis, en la que la infección es una infección parasitaria protozoaria o una infección bacteriana y en la que la composición no contiene ningún antígeno derivado de un agente infeccioso distinto deMycobacterium.La invención se define por las reivindicaciones adjuntas.

Antecedentes de la invención

Las enfermedades infecciosas están provocadas por microorganismos patógenos, tales como bacterias, virus, parásitos u hongos. Las enfermedades infecciosas humanas pueden transmitirse directamente de una persona a otra, o indirectamente, a través de un animal huésped intermedio. Además, las enfermedades zoonóticas son enfermedades infecciosas de animales que pueden provocar enfermedad cuando se transmiten a seres humanos. En ningún lugar del mundo las enfermedades infecciosas se han convertido todavía en una causa insignificante de enfermedad y muerte, ni siquiera si el número de muertes provocadas por patógenos y parásitos en todo el mundo está disminuyendo lentamente. En 1990, se estima que 16 millones de personas murieron a causa de infecciones (más trastornos maternos y nutricionales). En 2010, el número de muertes había disminuido hasta 15 millones (una disminución de tan sólo el 1 % al año), y la Organización Mundial de la Salud (OMS) prevé 13 millones de muertes atribuidas a estas causas en 2050 (Dye C. 2014, After 2015: infectious diseases in a new era of health and development. Phil. Trans. R. Soc. B 369: 20130426).

La leishmaniosis, la malaria, la enfermedad de Lyme (también conocida como borreliosis de Lyme) y la salmonelosis son ejemplos particulares de enfermedades infecciosas provocadas por parásitos o bacterias.

La leishmaniosis es una enfermedad provocada por parásitos del géneroLeishmania,que se transmite por la picadura de determinados tipos de flebótomos. La enfermedad también puede producirse en otros animales, incluyendo perros y roedores. En la actualidad, hay de aproximadamente de 4 a 12 millones de personas infectadas en unos 98 países y cada año se producen aproximadamente 2 millones de nuevos casos y entre 20.000 y 50.000 muertes cada año. El tratamiento se determina en función del lugar donde se adquiere la enfermedad, la especie deLeishmaniay el tipo de infección. Las empresas farmacéuticas han abandonado ocasionalmente el desarrollo de fármacos porque no sería rentable, ya que la enfermedad afecta principalmente a personas pobres. Sin embargo, organizaciones tales como la Iniciativa sobre Medicamentos para Enfermedades Desatendidas están facilitando activamente la búsqueda de productos terapéuticos novedosos. En 2016, no había disponible ninguna vacuna para seres humanos.

La malaria es una enfermedad infecciosa transmitida por mosquitos que afecta a seres humanos y otros animales provocada por protozoos parasitarios pertenecientes al géneroPlasmodium.La enfermedad está muy extendida en regiones tropicales y subtropicales, incluyendo gran parte de África subsahariana, Asia y Latinoamérica. En 2016, hubo 216 millones de casos de malaria en todo el mundo, lo que dio como resultado unas 731.000 muertes. La resistencia a los fármacos plantea un problema creciente en el tratamiento de la malaria del siglo XXI. La única vacuna aprobada en 2015 es RTS,S. Requiere cuatro inyecciones, y tiene una eficacia relativamente baja (26-50 %). La enfermedad de Lyme, también conocida como borreliosis de Lyme, es una enfermedad infecciosa provocada por bacterias del géneroBorreliaque se transmite por garrapatas. La enfermedad de Lyme es la enfermedad más común transmitida por garrapatas en el hemisferio norte. Se estima que afecta a 300.000 personas al año en los Estados Unidos y a 65.000 personas al año en Europa. Los antibióticos son el tratamiento primario. Se comercializó una vacuna contra la enfermedad de Lyme en los Ee .UU. entre 1998 y 2002. Sin embargo, se retiró del mercado debido a las escasas ventas y a rumores sobre los efectos adversos.

La salmonelosis es una enfermedad infecciosa provocada por bacterias del géneroSalmonella.La salmonelosis es una de las causas más comunes de diarrea a nivel global. En 2015, se produjeron 90.300 muertes a causa de salmonelosis no tifoidea y 178.000 muertes a causa de salmonelosis tifoidea en todo el mundo. En Europa, es la segunda enfermedad transmitida por alimentos más común. Pueden administrarse antibióticos adecuados para destruir las bacterias, pero en la mayoría de los casos son innecesarios. Existen recomendaciones específicas sobre la elección del antibiótico para evitar fomentar la resistencia a los antibióticos. Un estudio de 2014 sometió a prueba una vacuna en pollos que ofreció una protección eficiente contra la salmonelosis.

El documento WO 2010/127132 A1 da a conocer el uso de las bacterias probióticasBacillus coagulanspara reforzar el sistema inmunitario.

Los documentos US 2017/151319 A1 y EP 2687227 A1 dan a conocer el uso de una composición inmunogénica que comprendeMycobacterium bovisinactivada junto con otros agentes inmunogénicos derivados de varios microorganismos infecciosos diferentes deMycobacteriumpara su uso en la prevención de una infección bacteriana y para modular el sistema inmunitario.

Por tanto, existe la gran necesidad en la técnica de desarrollar nuevos tratamientos preventivos alternativos que puedan prevenir eficazmente una enfermedad infecciosa en seres humanos y en animales, particularmente tratamientos preventivos que puedan prevenir una infección parasitaria o una infección bacteriana.

Sumario de la invención

Los autores de la presente invención han hallado sorprendentemente que una composición que comprendeMycobacterium bovisinactivada térmicamente puede proporcionar un efecto protector contra infecciones distintas de la tuberculosis (TB). La composición se ha usado con éxito en la protección contra infecciones parasitarias protozoarias e infecciones bacterianas. En particular, la administración de laMycobacteriuminactivada ha demostrado propiedades protectoras prometedoras en sujetos infectados con protozoos del géneroLeishmaniaoPlasmodium,o en la que la infección bacteriana está provocada por bacterias del géneroBorreliaoSalmonella.Por tanto, la invención se refiere a una composición que comprende unaMycobacterium bovisinactivada o una fracción inmunogénica de la misma, para su uso en la prevención de una infección en un sujeto, en la que la infección se selecciona del grupo que consiste en una infección parasitaria protozoaria y una infección bacteriana, en la que la composición no contiene ningún antígeno derivado de un agente infeccioso distinto deMycobacterium,siempre que la infección no esté provocada por unaMycobacterium.La invención se define por las reivindicaciones adjuntas.

Descripción de las figuras

Figura 1. Porcentaje de parasitemia en ratones Balb/c tratados y de control (n=3). *Diferencias estadísticamente significativas (p < 0,05; prueba de la U de Mann-Whitney) entre grupos en el mismo momento tras la infección. Figura 2. Niveles relativos de Arbp0/ARNr 18S dePlasmodiumen hígado y sangre de ratones tratados y de control (n=3). Las diferencias con los controles fueron estadísticamente significativas (**p < 0,01 y ***p<0,001; prueba de la U de Mann-Whitney).

Figura 3. Medición de lesiones en las patas. A los ratones se les inocularon 104 promastigotes deLeishmania amazonensis.La evolución de la lesión se evaluó semanalmente.

Figura 4. Carga deLeishmaniamedia (±EEM) determinada mediante diluciones limitantes en bazo y ganglio linfático poplíteo de ratones inoculados con 104 promastigotes deLeishmania amazonensis.

Figura 5. Número medio (±DE) de amastigotes deLeishmaniacon inmunomarcaje positivo mediante métodos inmunohistoquímicos en ganglio linfático poplíteo de ratones inoculados con 104 promastigotes deLeishmania amazonensis(gris claro: grupo inmunizado; gris oscuro: grupo de control). *Diferencias estadísticamente significativas (p < 0,05; prueba de la U de Mann-Whitney) entre grupos.

Figura 6. Carga de B.burgdorferimedia (±EEM) determinada mediante PCR en articulación, vejiga, corazón, bazo y oreja de ratones tratados y de control (n=3). Las diferencias con los controles fueron estadísticamente significativas (*p < 0,05 y **p < 0,01; prueba de la U de Mann-Whitney).

Figura 7. Porcentaje de animales con signos clínicos compatibles con la exposición con 106 UFC de S.entericaen cerdos tratados conM. bovisinactivada (grupo tratado), infectados pero no tratados (grupo de control) y animales no tratados ni infectados (grupo no infectado). *Diferencias estadísticamente significativas (p < 0,05; prueba de la U de Mann-Whitney) entre grupo de control y grupo tratado.

Figura 8. Peso medio (±EEM) de los cerdos tratados conM. bovisinactivada (grupo tratado) e infectados pero no tratados (grupo de control), ambos expuestos con 106 UFC de S.enterica,y animales no tratados ni infectados (grupo no infectado). *Diferencias estadísticamente significativas (p < 0,05; prueba de la U de Mann-Whitney) entre grupo de control y grupo tratado.

Figura 9. Porcentaje de animales con diferentes tipos de lesiones macroscópicas compatibles con la infección con S.entericaen varias localizaciones en cerdos tratados conM. bovisinactivada (grupo tratado), cerdos infectados pero no tratados (grupo de control) y animales no tratados ni infectados (grupo no infectado). *Diferencias estadísticamente significativas (p < 0,05; prueba de la U de Mann-Whitney) entre grupo de control y grupo tratado.

Descripción detallada de la invención

En un primer aspecto, la invención se refiere a una composición que comprende unaMycobacterium bovisinactivada o una fracción inmunogénica de la misma, para su uso en la prevención de una infección en un sujeto, en la que la infección se selecciona del grupo que consiste en una infección parasitaria protozoaria y una infección bacteriana, en la que la composición no contiene ningún antígeno derivado de un agente infeccioso distinto deMycobacterium,siempre que la infección no esté provocada por unaMycobacterium.

El término "Mycobacterium”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a un género de bacterias acidorresistentes de la familiaMycobacteriaceaeque no pueden teñirse mediante el procedimiento de tinción de Gram. El géneroMycobacteriumse identifica en la base de datos del NCBI por la ID taxonómica: 1763.

El géneroMycobacteriumincluyeMycobacteriumseleccionada del grupo que consiste enM. africanum, M. bovis, M. canetti, M. caprae, M. microti, M. mungi, M. orygis, M. pinnipedii, M. suricattae, M. tuberculosis, M. avium, M. avium paratuberculosis, M. avium silvaticum, M. avium “hominissuis”, M. colombiense, M. indicus pranii, M. intacellulare, M. smegmatis, M. phlei, M. fortuitum, M. lufu, M. paratuberculosis, M. habana, M. scrofulaceiu, M. gordonae, M. ulcerans. M. asiaticum, M. gastri, M. kansasii, M. hiberniae, M. icosiumassiliensis, M. nonchromogenicum, M. terrae, M. triviale, M. ulcerans, M. pseudoshottsii, M. shottsii, M. triplex, M. genavense, M. florentinum, M. lentiflavum, M. palustre, M. kubicae, M. parascrofulaceum, M. heidelbergense, M. interjectum, M. simiae, M. arabiense, M. aromaticivorans, M. aquaticum, M. bacteremicum, M. bohemicum, M. botniense, M. branderi,M. celatum,M. chimaera,M. conspicuum,M. cookie,M. doricum,M. farcinogenes,M. haemophilum,M. heckeshornense, M. lacus, M. leprae, M. lepraemurium, M. lepromatosis, M. liflandii, M. Ilatzerense, M. malmoense M. marinum, M. neoaurum, M. monacense, M. montefiorense, M. murale, M. nebraskense, M. saskatchewanense, M. sediminis, M. scrofulaceum, M. shimoidei, M. szulgai, M. talmoniae, M. tusciae, M. xenopi, M. yongonense, M. intermedium, M. abscessus, M. bolletii, M. chelonae, M. immunogenum, M. stephanolepidis, M. boenickei, M. brisbanense, M. cosmeticum, M. fortuitum subesp. Acetamidolyticum, M. houstonense, M. mageritense, M. neworleansense, M. peregrinum, M. porcinum, M. senegalense, M. septicum, M. aubagnese, M. mucogenicum,M. phocaicum,M. austroafricanum,M. diernhoferi,M. frederiksbergense,M. hodleri,M. neoaurum,M. parafortuitum,M. aurum,M. vaccae,M. chitae,M. fallax,M. agri,M. aichiense,M. alvei,M. arupense,M. barrassiae, M. brumae, M. canariasense, M. chubuense, M. conceptionense, M. confluentis, M. duvalii, M. elephantis, M. flavescens, M. gadium, M. gilvum, M. hassiacum, M. holsaticum, M. iranicum, M. komossense, M. madagascariense, M. massiliense, M. massilipolynesiensis, M. moriokaense, M. obuense, M. psychrotolerans, M. pulveris, M. pyrenivorans, M. goodie, M. wolinskyi, M. sphagni, M. thermoresistibile, M. vanbaalenii, M. arosiense, M. aubagnense,M. clorophenolicum,M. fluoroanthenivorans,M. kumamotonense,M. novocastrense,M. parmense,M. poriferae, M. rhodesiae, M. seoulense y M. tokaiense.

El géneroMycobacteriumtambién incluye miembros del complejoMycobacterium tuberculosis(MTBC). Tal como se usa en el presente documento, el "complejoMycobacteriumtuberculosis (MTBC)” se entiende en el presente documento como un grupo genéticamente relacionado de especies deMycobacteriumque pueden provocar tuberculosis en un sujeto. Incluye:M. tuberculosis, M. africanum, M. orygis, M. bovis(incluyendo la cepa Bacillus Calmette-Guérin (BCG) deM. bovis), M. microti, M. canetti, M. caprae, M. pinnipedii, M. suricattaeyM. mungi.El géneroMycobacteriumtambién incluye bacterias seleccionadas del grupo que consiste enM. smegmatis, M. phlei, M. fortuitum, M. lufu, M. paratuberculosis, M. habana, M. scrofulaceiu, M. gordonae, M. ulcerans. M. asiaticum, M. gastri, M. kansasii, M. hiberniae, M. icosiumassiliensis, M. nonchromogenicum, M. terrae, M. triviale, M. ulcerans, M. pseudoshottsii, M. shottsii, M. triplex, M. genavense, M. florentinum, M. lentiflavum, M. palustre, M. kubicae, M. parascrofulaceum, M. heidelbergense, M. interjectum, M. simiae, M. arabiense, M. aromaticivorans, M. aquaticum, M. bacteremicum, M. bohemicum, M. botniense, M. branderi, M. celatum, M. chimaera, M. conspicuum, M. cookie, M. doricum,M. farcinogenes,M. haemophilum,M. heckeshornense,M. lacus,M. leprae,M. lepraemurium,M. lepromatosis, M. liflandii, M. Ilatzerense, M. malmoense M. marinum, M. neoaurum, M. monacense, M. montefiorense, M. murale, M. nebraskense, M. saskatchewanense, M. sediminis, M. scrofulaceum, M. shimoidei, M. szulgai, M. talmoniae, M. tusciae, M. xenopi, M. yongonense, M. intermedium, M. abscessus, M. bolletii, M. chelonae, M. immunogenum, M. stephanolepidis, M. boenickei, M. brisbanense, M. cosmeticum, M. fortuitum subesp. Acetamidolyticum, M. houstonense, M. mageritense, M. neworleansense, M. peregrinum, M. porcinum, M. senegalense,M. septicum,M. aubagnese,M. mucogenicum,M. phocaicum,M. austroafricanum,M. diernhoferi,M. frederiksbergense,M. hodleri,M. neoaurum,M. parafortuitum,M. aurum,M. vaccae,M. chitae,M. fallax,M. agri,M. aichiense, M. alvei, M. arupense, M. barrassiae, M. brumae, M. canariasense, M. chubuense, M. conceptionense, M. confluentis, M. duvalii, M. elephantis, M. flavescens, M. gadium, M. gilvum, M. hassiacum, M. holsaticum, M. iranicum, M. komossense, M. madagascariense, M. massiliense, M. massilipolynesiensis, M. moriokaense, M. obuense, M. psychrotolerans, M. pulveris, M. pyrenivorans, M. goodie, M. wolinskyi, M. sphagni, M. thermoresistibile,M. vanbaalenii,M. arosiense,M. aubagnense,M. clorophenolicum,M. fluoroanthenivorans,M. kumamotonense, M. novocastrense, M. parmense, M. poriferae, M. rhodesiae, M. seoulense y M. tokaiense.

LaMycobacteriumde la composición para su uso según el primer aspecto de la invención esM. bovis. M. bovisse identifica en la base de datos del NCBI por la ID taxonómica: 1765.

En una realización particular, laMycobacteriumes el aislado de campo deM. bovisMB1, MB3 o MB4, cuyas secuencias genómicas se han depositado en el Archivo Europeo de Nucleótidos con los números de registro CDHF01000001 a CDHF01000049; CDHH01000001 a CDHH01000094; o CDHE01000001 a CDHE01000118, respectivamente (de la Fuenteet al.,Complete Genome Sequences of Field Isolates ofMycobacterium bovisandMycobacteriumcaprae, Genome Announc, mayo/junio de 2015, vol. 3, número 3, e00247-15, y de la Fuenteet al.,Comparative Genomics of Field Isolates ofMycobacterium bovisandM. capraeProvides Evidence for Possible Correlates with Bacterial Viability and Virulence, PLoS Negl Trop Dis 9(11): e0004232). Estos aislados se obtuvieron originalmente a partir de jabalí (MB3, MB4) y ganado vacuno (MB1). El estudio se centró en la provincia de Ciudad Real, España. Se trata de una zona de alta densidad de ungulados, estando el lado occidental de la provincia compuesto por zonas de caza esparcidas y áreas naturales protegidas, con infección con TB persistente en granjas extensivas de ganado. En una realización particular, laMycobacteriumes unaM. bovisclasificada dentro del espoligotipo SB0339, según la notación de la base de datos de espoligotipos deMycobacterium bovis(www.mbovis.org). En una realización particular, la secuencia genómica de laMycobacteriumde la invención tiene una homología de secuencia de al menos el 70 %, de al menos el 75 %, de al menos el 80 %, de al menos el 85 %, de al menos el 90 %, de al menos el 95 %, de al menos el 96 %, de al menos el 97 %, de al menos el 98 %, de al menos el 99 % con la secuencia genómica del aislado de campo deM. bovisMB4. En una realización preferida, laMycobacteriumes el aislado de campo deM. bovisMB1. En otra realización preferida, laMycobacteriumes el aislado de campo deM. bovisMB4.

En otra realización particular, laMycobacteriumde la composición para su uso según la invención esM bovisBCG inactivada. En una realización preferida, laMycobacteriumes la cepa de referencia danesa deM. bovis(CCUG 27863).

Tal como se usa en el presente documento, el término “inactivada” se refiere a una célula muerta o inactivada de un microorganismo que ya no puede formar una única colonia en una placa que tiene un medio específico para dicho microorganismo, y también engloba lisados, fracciones o extractos del microorganismo. La inactivación de una célula se refiere a un procedimiento de transformar una célula de viable a no viable. El término “viable” o “viabilidad”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a la capacidad de una célula para mantenerse por sí misma o recuperar sus potencialidades y sobrevivir hasta que pueda dividirse. Por tanto, una célula que es viable indica que la célula puede sobrevivir y dividirse; a la inversa, una célula que no es viable indica que la célula no puede sobrevivir ni dividirse. Se apreciará que las células no viables incluyen células muertas. La viabilidad puede determinarse mediante varios ensayos que son convencional en la técnica. Estos incluyen ensayos de citólisis o fuga a través de membrana, tales como el ensayo de lactato deshidrogenasa, el ensayo de yoduro de propidio, el ensayo de azul de tripano y el ensayo de 7-aminoactinomicina D, así como ensayos genómicos y proteómicos que someten a prueba la activación de rutas de estrés usando micromatrices de ADN y chips de proteínas. La viabilidad también puede determinarse verificando la ausencia de células después de su cultivo en un medio de cultivo apropiado. Por tanto, unaMycobacteriuminactivada es diferente a unaMycobacteriumatenuada o atenuada viva, en la que las células están vivas y son viables.

En una realización, laMycobacteriumde la composición para su uso según la invención se inactiva a través de un procedimiento seleccionado del grupo que consiste en inactivación por microondas, inactivación por presión, inactivación por ácido, inactivación por base, alcohol inactivación, inactivación por peróxido e inactivación térmica. El término “inactivación por microondas”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a la inactivación de células usando ondas de radiofrecuencia, que habitualmente se usan a una frecuencia de 2450 MHz. Normalmente, las microondas producidas por un horno microondas “doméstico” (2,45 GHz) inactivan por completos los cultivos bacterianos, las micobacterias, los virus y las esporas deG. stearothermophilusen el plazo de 60 segundos a 5 minutos en función del organismo en exposición. Por ejemplo, se obtuvo una inactivación completa deMycobacterium boviscon 4 minutos de exposición a microondas (600 W, 2450 MHz) (Rosaspina S, Salvatorelli G, Anzanel D. The bactericidal effect of microwaves onMycobacterium bovisdried on scalpel blades. J. Hosp. Infect.

1994;26:45-50).

El término “inactivación por presión”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a la inactivación de células usando presión. En la técnica se conocen bien métodos adecuados para la inactivación por presión e incluyen, sin limitación, homogeneización, por ejemplo, usando una homogeneizadora o una prensa francesa. Por ejemplo, la inactivación de células puede lograrse usando una adecuados de alta presión a una presión de 1.500 2.000 bar y 15-20 pulsos/min durante 10 min.

El término “inactivación por ácido”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a la inactivación de células mediante la reducción del pH. Esto se logra normalmente añadiendo un ácido a las células o al medio que las contiene y posteriormente neutralizando las células o el medio. Se prefieren ácidos fuertes con el fin de inactivar las células, e incluyen, sin limitación, ácido clorhídrico (HCl), ácido yodhídrico (HI), ácido bromhídrico (HBr), ácido perclórico (HCO4), ácido nítrico (HNO3) y ácido sulfúrico (H2SO4). La fuerza de un ácido se refiere a su capacidad para, o tendencia a, perder un protón. Por ejemplo, la inactivación puede lograrse añadiendo H2SO4 a las células hasta alcanzar una concentración de 80 mM, incubando las células a 55 °C durante 4 h y neutralizando mediante la adición de NaOH 10 M hasta que el pH sea de 7.

De manera análoga, el término “inactivación por base”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a la inactivación de células mediante el aumento del pH. Esto se logra normalmente añadiendo una base a las células o al medio que las contiene y posteriormente neutralizando las células o el medio. Se prefieren bases fuertes con el fin de inactivar las células, e incluyen, sin limitación, hidróxido de potasio (KOH), hidróxido de bario [Ba(OH)2], hidróxido de cesio (CsOH), hidróxido de sodio (NaOH), hidróxido de estroncio [Sr(OH)2], hidróxido de calcio [Ca(OH)2], hidróxido de litio (LiOH) e hidróxido de rubidio (RbOH). La fuerza de una base se refiere a su capacidad para desprotonar un ácido. Por ejemplo, la inactivación puede lograrse añadiendo NaOH a las células hasta alcanzar una concentración de 80 mM, incubando las células a 55 °C durante 4 h y neutralizando mediante la adición de H2SO4 al 96%hasta que el pH sea de 7.

El término “alcohol inactivación”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a la inactivación de células usando alcohol. Un alcohol es un compuesto hidroxilado orgánico con el grupo funcional -OH unido a un átomo de carbono saturado, e incluye etanol, metanol, isopropanol, butanol; preferiblemente etanol. Por ejemplo, la inactivación de células puede lograrse preparando una dilución 1:1 del cultivo celular con etanol al 96 % e incubando a 37 °C durante 1 h. Posteriormente, se elimina el etanol mediante evaporación en un evaporador rotatorio o rotavapor.

El término “inactivación por peróxido”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a la inactivación de células usando peróxido. Un peróxido es un compuesto que contiene un enlace sencillo oxígeno-oxígeno o el anión peróxido, O22', e incluye peróxido de hidrógeno (H2O2), superóxidos, dioxigenilos, ozonos y ozónidos. Por ejemplo, la inactivación de células puede lograrse incubando las células en H2O2 al 1,5% (v/v) a 37 °C durante 1 h. Posteriormente, se elimina el H2O2 tratando las células con catalasa.

El término “inactivación térmica” o “inactivación por calor”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a la inactivación de células usando altas temperaturas. Habitualmente, esto se logra aumentando la temperatura de las células o del medio que las contiene hasta más de 50 °C.

En una realización preferida, laMycobacteriumde la composición para su uso según la invención se inactiva a través de inactivación térmica. La inactivación térmica puede lograrse mediante diferentes medios, por ejemplo, sin limitación, mediante incubación en un baño de agua o mediante esterilización en autoclave de laMycobacterium.En una realización incluso más preferida, el procedimiento de inactivación térmica para inactivar laMycobacteriumde la composición para su uso según la invención comprende calentar laMycobacteriuma una temperatura de entre 50 °C y 150 °C, entre 60 °C y 120 °C, entre 65 °C y 100 °C, entre 70 °C y 90 °C, entre 75 °C y 85 °C, y más preferiblemente entre 80 °C y 85 °C durante un periodo de entre 15 minutos y 90 minutos, entre 20 minutos y 60 minutos, entre 25 y 50 minutos, entre 30 y 45 minutos; más preferiblemente en un baño de agua. En una realización preferida, el tratamiento térmico se aplica durante un periodo de 45 minutos, 40 minutos, 35 minutos y más preferiblemente durante 30 minutos. En una realización más preferida, el procedimiento de inactivación térmica comprende calentar laMycobacteriumen un baño de agua a una temperatura de entre 80 °C y 85 °C durante un periodo de entre 30 minutos y 45 minutos.

En una realización preferida, la composición comprende células inactivada deMycobacterium,preferiblemente células completas. En otra realización, la composición comprende lisados celulares deMycobacterium.

En el contexto de la presente invención, el término “fracción” se refiere a una parte de laMycobacteriumque conserva su inmunogenicidad después del procedimiento de inactivación, es decir, es una fracción inmunogénica. En una realización particular, la fracción inmunogénica se selecciona del grupo que consiste en: un residuo del tratamiento de la cepa deMycobacteriumcon una glicosidasa (residuo desglicosilado); un residuo de la digestión de la cepa deMycobacteriummediante una ADNasa y/o una ARNasa; un residuo del tratamiento de la cepa deMycobacteriumcon una proteasa; un residuo del tratamiento de la cepa deMycobacteriumcon, sucesivamente, una glicosidasa, una ADNasa y/o una ARNasa, y finalmente una proteasa; y un residuo del tratamiento de dicha cepa deMycobacteriumcon una proteasa (como la sustilisina, por ejemplo) y una ADNasa.

Tal como se usa en el presente documento, los términos “prevención”, “que previene”, “preventivo” y “prevenir” se refieren a la capacidad de una sustancia, una composición o un medicamento dado para evitar, minimizar o dificultar la aparición o el desarrollo de una infección. El término “tratamiento preventivo”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier tipo de terapia que tiene como objetivo prevenir o reducir la susceptibilidad a una afección clínica tal como se describe en el presente documento. En una realización preferida, la prevención se refiere al tratamiento profiláctico (es decir, una terapia para reducir la susceptibilidad a una afección clínica) de un trastorno o una afección tal como se define en el presente documento. Por tanto, “tratamiento”, “tratar” y sus términos equivalentes se refieren a obtener un efecto farmacológico o fisiológico deseado, que cubren cualquier tratamiento profiláctico de una afección patológica en cuanto a prevenir de manera completa o parcial un trastorno o un síntoma del mismo.

Las composiciones de la invención se usan para la prevención de una enfermedad infecciosa. Una enfermedad infecciosa está provocada por la infección de un agente.

El término “infección”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a una invasión por bacterias, protozoos u otros microorganismos, que hace referencia a la proliferación o presencia no deseada de la invasión de microbios patógenos en un organismo huésped. Incluye el crecimiento excesivo de microbios que están presentes normalmente en o sobre el cuerpo de un vertebrado u otro organismo. Más generalmente, una infección microbiana puede ser cualquier situación en la que la presencia de una(s) población/poblaciones microbiana(s) está dañando a un vertebrado huésped. Por tanto, una infección microbiana existe cuando está presentes números excesivos de una población microbiana en o sobre el cuerpo de un vertebrado, o cuando los efectos de la presencia de una(s) población/poblaciones microbiana(s) están dañando a las células o a otro tejido de un vertebrado.

La composición de la invención tiene utilidad particular en la prevención de enfermedades provocadas por patógenos. Se contempla que la composición descrita en el presente documento será útil en la prevención de enfermedades de mamíferos, por ejemplo, animales de granja incluyendo: ganado vacuno; caballos; cabras; ovejas; y cerdos, y mascotas domésticas incluyendo: gatos; y perros, así como animales salvajes como simios, monos, ratas, ratones, conejos y jabalíes. La composición de la invención también puede usarse en la prevención de enfermedades humanas provocadas por patógenos. La composición de la invención también es útil para su uso en vertebrados tales como peces, aves y reptiles. Por tanto, el término “sujeto” en el contexto de la presente invención se refiere a cualquier vertebrado incluyendo, sin limitación, peces, aves, reptiles, mamíferos tales como ganado vacuno, caballos, cabras, ovejas, cerdos, gatos, perros, simios, monos, ratas, ratones, conejos, jabalíes y seres humanos. En una realización preferida, el vertebrado es un mamífero, más preferiblemente un adulto.

La infección que va a prevenirse en el contexto de la presente invención no está provocada por unaMycobacterium.Enfermedades asociadas con una infección conMycobacterium,tal como se usa en el presente documento, se refieren a cualquier enfermedad resultante de la infección con cualquier micobacteria, incluyendo la tuberculosis. El término “tuberculosis” comprende infecciones debidas aMycobacterium tuberculosisy/oMycobacterium bovis;tuberculosis respiratoria tal como tuberculosis de pulmón, laringe, tráquea y bronquio, tuberculosis de ganglios linfáticos intratorácicos, pleuritis tuberculosa, tuberculosis respiratoria primaria y otras tuberculosis respiratorias; tuberculosis del sistema nervioso tal como meningitis tuberculosa, tuberculosis de meninges, leptomeningitis tuberculosa, tuberculoma meníngeo y otras tuberculosis del sistema nervioso; tuberculosis de huesos y articulaciones, tuberculosis del sistema genitourinario, linfadenopatía periférica tuberculosa, tuberculosis de intestinos, peritoneo y glándulas mesentéricas, tuberculosis de piel y tejido subcutáneo, tuberculosis de ojo, oreja o glándulas suprarrenales, y tuberculosis miliar (Clasificación Internacional de Enfermedades, 10a revisión, bloques A15-A19).

La infección que va a prevenirse con la composición de la invención se selecciona del grupo que consiste en una infección parasitaria protozoaria y una infección bacteriana no provocada por unaMycobacterium.El término “protozoo” se refiere a eucariotas unicelulares, ya sea independientes o parasitarios, que se alimentan por heterotrofia de materia orgánica tal como otros microorganismos o residuos y tejidos orgánicos. Los organismos parasitarios protozoarios pueden invadir, colonizar y, en condiciones apropiadas, provocar una enfermedad en un animal. Los ejemplos de parásitos protozoarios incluyenLeishmania donovani, Plasmodium falciparum, Giardia lamblia, Trypanosoma gambienseyTrypanosoma cruzi.Véase generalmente Robbinset al.,Pathologic Basis of Disease (Saunders, 1984) 273-75, 360-83. Los términos “bacteria”, “bacterias” o “infección bacteriana” se refieren a células bacterianas tanto gramnegativas como grampositivas que pueden infectar y provocar una enfermedad en un huésped, así como producir síntomas relacionados con la infección en el huésped infectado, tal como fiebre u otros signos de inflamación, síntomas intestinales, síntomas respiratorios, deshidratación, y similares. En una realización, las bacterias son bacterias gramnegativas. En otra realización, las bacterias son bacterias grampositivas. En otra realización, las bacterias son bacterias grampositivas junto con bacterias gramnegativas. En otra realización, hay una única especie bacteriana que infecta o provoca la enfermedad. En aún otra realización, hay una especie bacteriana diferente de un género bacteriano que infecta o provoca la enfermedad. En todavía otra realización, hay especies bacterianas diferentes de géneros bacterianos diferentes que infectan o provocan la enfermedad.

En una realización particular, la infección parasitaria protozoaria está provocada por un protozoo del género seleccionado del grupo que consiste enAcanthamoeba, Babesia, Balamuthia, Balantidium, Blastocystis, Cryptosporidium, Cyclospora, Dientamoeba, Entamoeba, Giardia, Isospora, Leishmania, Naegleria, Plasmodium, Rhinosporidium, Sarcocystis, Toxoplasma, Trichomonas, Trypanosomay combinaciones de los mismos. En otra realización particular, la infección es una infección bacteriana provocada por una bacteria del género seleccionado del grupo que consiste enAcinetobacter, Actinobacillus, Aeromonas, Aggregatibacter, Agrobacterium, Anaplasma, Bacillus, Bordetella, Borrelia, Brucella, Burkholderia, Campylobacter, Chlamydia, Chromobacterium, Clostridium, Corynebacterium, Cyanobacteria, Enterobacter, Enterococcus, Erwinia, Escherichia, Francisella, Fusobacterium, Haemophilus, Helicobacter, Klebsiella, Lactobacillus, Legionella, Listeria, Micrococcus, Moraxella, Mycoplasma, Neisseria, Nitrosomas, Nocardia, Obesumbacterium, Pantoea, Pasteurella, Pediococcus, Porphyromonas, Prevotella, Proteus, Pseudomonas, Ralstonia, Rickettsia, Rhisobium, Rhodobacter, Salmonella, Serratia, Shigella, Staphylococcus, Streptococcus, Tannerella, Treponema, Tsukamurella, Vibrio, Xenorhabdus, Yersiniay combinaciones de las mismas.

En una realización preferida, la infección parasitaria protozoaria o la infección bacteriana está provocada por protozoos del géneroLeishmaniaoPlasmodium,o por bacterias del géneroBorreliaoSalmonella.

Los parásitos del géneroLeishmaniason responsables de la enfermedad leishmaniosis. Se transmiten por flebótomos del géneroPhlebotomusyLutzomyiay sus huéspedes primarios son los vertebrados;Leishmaniainfecta habitualmente a hiracoideos, cánidos, roedores y seres humanos y provoca una enfermedad que afecta a la piel, la mucosa o las vísceras. El géneroLeishmaniaincluye 53 especies, de las cuales 20 infectan a seres humanos. El géneroLeishmaniase identifica en la base de datos del NCBI por la ID taxonómica: 5658. Ejemplos no limitativos de especies deLeishmaniason:L. aetiopica, L. amazonensis, L. arabica, L. archibaldi, L. aristedesi, L. chagasi, L. donovani, L. enriettii, L. forattinii, L. gerbilli, L. hertigi, L. infantum, L. killicki, L. major, L. mexicana, L. siamensis, L. tropica, L. turanica, L. adleri, L. agamae, L. ceramodactyli, L. deanei, L. garnhami, L. gulikae, L. gymnodactyli, L. hemidactyli, L. herreri, L. hoogstraali, L. nicollei, L. senegalensis, L. tarentolae, L. braziliensis, L. colombiensis, L. equatorensis, L. guyanensis, L. lainsoni, L. naiffi, L. panamensis, L. peruviana, L. pifanoi, L. shawi, L. utingensis,L. venezuelensis, L. enrittii complex, L. enrittii, L. martiniquensis.En una realización preferida, laLeishmaniaesL. amazonensis(ID taxonómica del NCBI: 5659).

El géneroPlasmodiumse refiere en el presente documento a un género de parásitos unicelulares, muchos de los cuales provocan malaria en sus huéspedes. El géneroPlasmodiumse identifica en la base de datos del NCBI por la ID taxonómica: 5820. Los parásitosPlasmodiumpueden infectar a una amplia gama de huéspedes vertebrados incluyendo reptiles, aves y mamíferos. Ejemplos no limitativos de especies dePlasmodiumque pueden provocar enfermedades en vertebrados son:P. accipiteris, P. achiotense, P. achromaticum, P. acuminatum, P. adunyinkai, P. aegyptensis, P. aeuminatum, P. agamae, P. alloelongatum, P. anasum, P. anomaluri, P. arachniformis, P. ashfordi, P. atheruri, P. audaciosum, P. aurulentum, P. australis, P. attenuatum, P. azurophilum, P. balli, P. bambusicolai, P. basilisci, P. beebei, P. beltrani, P. berghei, P. bertii, P. bigueti, P. bitis, P. biziurae, P. booliati, P. bouillize, P. bowiei, P. brodeni, P. brasilianum, P. brasiliense, P. brumpti, P. brucei, P. brygooi, P. bubalis, P. bucki, P. bufoni, P. buteonis, P. capistrani, P. carinii, P. cathemerium, P. causi, P. cephalophi, P. cercopitheci, P. chabaudi, P. chalcidi, P. chiricahuae, P. circularis, P. circumflexum, P. clelandi, P. cordyli, P. cnemaspi, P. cnemidophori,P. coatneyi,P. coggeshalli,P. colombiense,P. columbae,P. corradettii,P. coturnixi,P. coulangesi,P. cuculus, P. cyclopsi, P. cynomolgi, P. diminutivum, P. diploglossi, P. dissanaikei, P. divergens, P. dominicana, P. draconis,P. durae,P. effusum,P. egerniae,P. elongatum,P. eylesi,P. fabesia,P. fairchildi,P. falciparum,P. falconi, P. fallax, P. fieldi, P. fischeri, P. foleyi, P. formosanum, P. forresteri, P. floridense, P. fragile, P. galbadoni, P. garnhami, P. gallinaceum, P. gemini, P. georgesi, P. giganteum, P. giganteumaustralis, P. giovannolai, P. Girardi, P. gonderi, P. globularis, P. gologoense, P. gonatodi, P. gracilis, P. griffithsi, P. guangdong, P. gundersi, P. guyannense, P. heischi, P. hegneri, P. hermani, P. herodiadis, P. heteronucleare, P. hexamerium, P. holaspi, P. holti, P. huffi, P. hylobatid, P. incertae, P. icipeensis, P. iguana, P. inconstans, P. inopinatum, P. inui, P. japonicum, P. jefferi, P. jiangi, P. josephinae, P. joyeuxi, P. juxtanucleare, P. kempi, P. kentropyxi, P. knowlesi, P. koreafense, P. lacertiliae, P. lagopi, P. lainsoni, P. landauae, P. leanucteus, P. lemuris, P. lepidoptiformis, P. limnotragi, P. lionatum, P. lophurae, P. loveridgei, P. lutzi, P. lygosomae, P. mabuiae, P. mackerrasae, P. mackiei, P. maculilabre, P. maior, P. majus, P. malariae, P. marginatum, P. matutinum, P. megaglobularis, P. megalotrypa, P. melanoleuca, P. melanipherum, P. mexicanum, P. michikoa, P. minasense, P. minuoviride, P. modestum, P. morulum, P. multiformis, P. murinus, P. narayani, P. necatrix, P. neotropicalis, P. neusticuri, P. nucleophilium, P. octamerium, P. odocoilei, P. osmaniae, P. ovale, P. paddae, P. papernai, P. paranucleophilum, P. parvulum, P. pedioecetii, P. pelaezi, P. percygarnhami, P. pessoai, P. petersi, P. pifanoi, P. pinotti, P. pinorrii, P. pitheci, P. pitmani, P. polare, P. pulmophilum, P. pythonias, P. quelea, P. reichenowi, P. relictum, P. rhadinurum, P. rhodaini, P. robinsoni, P. rousetti, P. rousseloti, P. rouxi, P. sandoshami, P. sasai, P. saurocaudatum, P. schweitzi, P. scelopori, P. scorzai, P. semiovale, P. semnopitheci, P. shortii, P. siamense, P. silvaticum, P. simium, P. simplex, P. smirnovi,P. stutionis,P. tanzaniae,P. tenue,P. tejerai,P. telfordi,P. tomodoni,P. torrealbai,P. toucan,P. traguli,P. tribolonoti, P. tropiduri, P. tumbayaensis, P. tyrio, P. uilenbergi, P. uluguruense, P. uncinatum, P. uranoscodoni, P. utingensis,P. uzungwiense,P. watteni,P. wenyoni,P. vacuolatum,P. vastator,P. vaughani,P. vautieri,P. venkataramiahii, P. vinckei, P. vivax, P. Volans, P. voltaicum, P. wenyoni, P. yoelii, P. youngi, P. zonuriae.En una realización preferida, laPlasmodiumse selecciona del grupo que consiste enP. berghei, P. falciparum, P. vivax, P. ovale, P. malariaeyP. knowlesi.En otra realización, laP. ovalese selecciona deP. ovale curtisiyP. ovale wallikeri.En una realización más preferida, laPlasmodiumesP. berghei(ID taxonómica del NCBI: 5821), incluso más preferiblementeP. bergheiANKA (ID taxonómica del NCBI: 5823).

Tal como se usa en el presente documento, el términoBorreliahace referencia a un género de bacterias del filo espiroquetas. El géneroBorreliase identifica en la base de datos del NCBI por la ID taxonómica: 138. Provoca borreliosis, una enfermedad zoonótica transmitida por vectores transmitida principalmente por garrapatas y por piojos, en función de la especie. Los ejemplos de especies del géneroBorreliaincluyen, sin limitación:B. afzelii, B. americana, B. andersonii, B. anserina, B. baltazardii, B. bavariensis, B. bissettii, B. brasiliensis, B. burgdorferi, B. californiensis,B. carolinensis,B. caucasica,B. coriaceae,B. crocidurae,B. dugesii,B. duttonii,B. garinii,B. graingeri, B. harveyi, B. hermsii, B. hispanica, B. japonica, B. kurtenbachii, B. latyschewii, B. lonestari, B. lusitaniae,B. mazzottii,B. merionesi,B. microti,B. miyamotoi,B. parkeri,B. persica,B. queenslandica,B. recurrentis, B. sinica, B. spielmanii, B. tanukii, B. theileri, B. tillae, B. turcica, B. turdi Fukunaga, B. turicatae, B. valaisiana, B. venezuelensisyB. vincentii.En una realización preferida, laBorreliaesB. burgdorferi(ID taxonómica del NCBI: 139).

El términoSalmonella,tal como se usa en la presente invención, hace referencia a bacterias gramnegativas con forma de bastón (bacilos) de la familiaEnterobacteriaceae.El géneroSalmonellase identifica en la base de datos del NCBI por la ID taxonómica: 590. ComprendeSalmonella bongoriySalmonella enterica,así como subespecies deSalmonella entericatales como: S.e. enterica, S. e. salamae, S. e. arizonae, S. e. diarizonae, S. e. houtenae y S. e. indica.También incluye serotipos comoSalmonella entericasubesp.entericaserotipotyphimurium(abreviada comoSalmonella typhimurium).Los ejemplos de serotipos deSalmonellaincluyen, sin limitación: S.Paratyphi A, S. Paratyphi A var. Durazzo, S. Paratyphi B, S. Paratyphi B var. Odense,S.Java, S. Limete, S. Typhimurium, S. Typhimurium var. Copenhagen, S. Agama, S. Abortus-equi, S. Abortus-ovis, S. Agona, S. Brandenburg, S. Bredeney, S. Derby, S. Heidelberg, S. Saintpaul, S. Salinatis, S. Stanley, S. Paratyphi C, S. Choleraesuis, S. Choleraesuis var. Kunzendorf, S. Decatur, S. Typhisuis, S. Bareilly, S. Infantis, S. Menston, S. Montevideo, S. Oranienburg, S. Thompson, S. Bovismorbificans, S. Newport, S. Typhi, S. Ndolo, S. Dublin, S. Enteritidis, S. Gallinarum,S. Pullorum,S. Panama,S. Miami,S. Sendai,S. Anatum,S. Give,S. London,S. Meleagridis, S.Cambridge, S. Newington, S. Minneapolis, S. Senftenberg, S. Simsbury, S. Aberdeen, S. Cubana, S. Poona, S. Heves, S. Onderstepoort, S. Brazil, S. Hvittingfoss, S. Kirkee, S. Adelaidey S.Locarno.En una realización preferida, laSalmonellase selecciona del grupo que consiste enSalmonella enterica y Salmonella typhimurium;más preferiblementeSalmonella enterica(ID taxonómica del NCBI: 28901).

En otra realización particular, la infección parasitaria protozoaria está provocada por un protozoo seleccionado del grupo que consiste enAcanthamoebaspp.,Balamuthia mandrillaris, Babesia divergens, Balantidium coli, Blastocystisspp.,Cryptosporidiumspp.,Cyclospora cayetanensis, Dientamoeba fragilis, Entamoeba histolytica, Giardia lamblia, Isospora belli, Leishmaniaspp.,Naegleria fowleri, Plasmodium berghei, Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium ovale, Plasmodium malariae, Plasmodium knowlesi, Rhinosporidium seeberi, Sarcocystis bovihominis, Sarcocystis suihominis, Toxoplasma gondii, Trichomonas vaginalis, Trypanosoma brucei y Trypanosoma cruzi.

En otra realización particular, la infección bacteriana que va a tratarse con la composición de la invención está provocada por una bacteria seleccionada del grupo que consiste enAeromonas hydrophila, Aeromonas salmonicida, Acinetobacter baumannii, Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Agrobacterium tumefaciens, Anaplasmaspp.,Bacillus anthracis, Bacillus cereus, Bacillus subtilis, Borrelia burgdorferi, Bordetella pertussis, Brucella abortus, Burkholderia cepacia, Campylobacter jejuni, Chlamydia trachomatis, Chromobacterium violaceum, Clostridium botulinum, Clostridium tetani, Corynebacterium diphtheria, Enterobacter agglomeran, Enterococcus faecalis, Erwinia carotovora, Erwinia chrysanthemi, Escherichia coli, Francisella tularensis, Fusobacterium nucleatum, Haemophilus influenzae, Helicobacter pylori, Lactobacillus plantarum, Legionella pneumophila, Listeria monocytogenes, Klebsiella pneumoniae, Mycoplasma pneumoniae, Micrococcus luteus, Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae, Nitrosomas europaea, Nocardia carnea, Obesumbacterium proteus, Pantoea stewartii, Pediococcus acidilactici, Prevotella intermedia, Porphyromonas gingivalis, Pseudomonas aureofaciens, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas phosphoreum, Pseudomonas syringae, Ralstonia solanacearum, Rhisobium etli, Rhisobium leguminosarum, Rhodobacter sphaeroides, Rickettsiaspp.,Salmonella enterica, Salmonella typhimurium, Serratia liguefaciens, Serratia marcescens, Shigella sonnei, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus enteritis, Streptococcus pneumoniae, Tannerella forsythensis, Treponema denticola, Treponema pallidum, Tsukamurella pulmonis, Vibrio anguillarum, Vibrio fischeri, Vibrio cholerae, Vibrio harveyi, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio alginolyticus, Vibrio vulnificus, Xenorhabdus nematophilus, Yersinia enterocolitica, Yersinia pestis, Yersinia pseudotuberculosis, Yersinia medievalis, Yersinia ruckeriy combinaciones de las mismas.

En una realización incluso más preferida la infección está provocada por los protozoosLeishmania amazonensisoPlasmodium berghei,o por las bacteriasBorrelia burgdorferioSalmonella enterica.En una realización, la infección está provocada por los protozoosPlasmodium berghei,preferiblemente la cepa dePlasmodium bergheiANKA.

La composición para su uso según la invención puede administrarse por cualquier vía, incluyendo tópica (local), enteral (efecto en todo el sistema, pero administrada a través del tracto gastrointestinal) o parenteral (acción sistémica, pero administrada por vías distintas del tracto gastrointestinal). Los ejemplos incluyen, sin limitación, vía oral, sublingual, intravenosa, intranasal, intraperitoneal, mucosa, intrapulmonar, enteral, parenteral, tópica, rectal o combinaciones de las mismas. Un experto en la técnica seleccionaría una vía de administración apropiada para la composición de la presente invención. Puede encontrarse una revisión de las diferentes formas para la administración de principios activos en Tratado de Farmacia Galenica, C. Fauli i Trillo, Luzan 5, S.A. de Ediciones, 1993 y en Remington's Pharmaceutical Sciences (A.R. Gennaro, Ed.), 20a edición, Williams & Wilkins PA, EE.UU. (2000).

En una realización preferida, la composición para su uso según la invención se administra por vía oral, sublingual, intranasal, mucosa, intrapulmonar, parenteral o combinaciones de las mismas. En una realización incluso más preferida, la composición para su uso según la invención se administra por vía oral y/o parenteral. En una realización, la composición se administra por vía oral. En otra realización, la composición se administra por vía parenteral, preferiblemente por una vía parenteral seleccionada del grupo que consiste en vía intravenosa, intramuscular, subcutánea e intradérmica.

La composición para su uso según la invención puede formularse para su administración por vía oral, sublingual, intranasal, intramuscular, subcutánea, mucosa, intrapulmonar, intravenosa, intradérmica o combinaciones de las mismas.

Las formulaciones de la invención pueden producirse siguiendo métodos conocidos en la técnica (véase “Remington, the Science and practice of pharmacy”, 21a edición, 2005, Ed. Lippincott Williams & Wilkins). A modo de ejemplo, la composición farmacéutica de la presente invención puede formularse para su administración usando una minibomba o por una vía mucosa, por ejemplo, como aerosol o pulverización nasal para inhalación o disolución ingerible, o por vía parenteral en la que la composición se formula mediante una forma inyectable, para su administración, por ejemplo, por vía intravenosa, intramuscular, intradérmica o subcutánea. En una realización preferida, la formulación es una forma inyectable. Más preferiblemente, la formulación se inyecta por vía intradérmica. En otra realización preferida, la formulación es una composición aceptable por vía oral. Cuando el agente ha de administrarse por vía mucosa a través de la mucosa gastrointestinal, debe poder permanecer estable durante el tránsito a través del tracto gastrointestinal; por ejemplo, debe ser resistente a la degradación proteolítica, estable al pH ácido y resistentes a los efectos detergentes de la bilis.

Cuando sea apropiado, las composiciones pueden administrarse mediante inhalación, en forma de un supositorio u óvulo vaginal, por vía tópica en forma de una loción, una disolución, una crema, una pomada o un polvo para espolvorear, mediante el uso de un parche cutáneo, por vía oral en forma de comprimidos que contienen excipientes tales como almidón o lactosa, o en cápsulas u óvulos o bien solos o bien mezclados con excipientes, o en forma de elixires, disoluciones o suspensiones que contienen agentes saborizantes o colorantes, o pueden inyectarse por vía parenteral, por ejemplo, por vía intravenosa, intramuscular, intradérmica o subcutánea. Para la administración parenteral, las composiciones pueden usarse mejor en forma de una disolución acuosa estéril que puede contener otras sustancias, por ejemplo, suficientes sales o monosacáridos para hacer que la disolución sea isotónica con la sangre. Para la administración bucal o sublingual, las composiciones pueden administrarse en forma de comprimidos o pastillas que pueden formularse de manera convencional.

En una realización particular, la composición para su uso según la invención contiene entre 1*1°2 y 1x1012 bacterias según ufc, o entre 1*1°3 y 1*1°11 ufc, o entre 1*1°4 y 1*1°1° ufc, o entre 1*1°5 y 1*1°9 ufc, o entre 1*1°6 y 1*1°8 ufc. Lo más preferiblemente, la composición para su uso según la invención contiene entre 1*1°6y 1*1°7 ufc. La cantidad precisa de un microorganismo en una vacuna o composición inmunogénica eficaz para proporcionar un efecto protector puede ser determinada por un experto en la técnica. Las dosis eficaces de las composiciones y los agentes terapéuticos de la presente invención varían en función de muchos factores diferentes, incluyendo el medio de administración, el sitio diana, el estado fisiológico del vertebrado, si el paciente es un ser humano o un animal, y si existen otros medicamentos concomitantes. Es necesario titular las dosificaciones apropiadas para optimizar la seguridad y la eficacia. La cantidad de inmunógeno depende de si también se administra adyuvante, requiriéndose mayores dosificaciones en ausencia de adyuvante. El momento de las administraciones puede variar significativamente desde una vez al día, hasta una vez al año, hasta una vez cada década. Una pauta típica consiste en una inmunización seguida de administraciones de refuerzo a intervalos de 6 semanas. Otra pauta consiste en una inmunización seguida de administraciones de refuerzo 1, 2 y 12 meses después. Otra pauta cosiste en una administración cada dos meses de por vida. Alternativamente, pueden proporcionarse administraciones de refuerzo de forma irregular según indique el seguimiento de la respuesta inmunitaria. En una realización preferida, la pauta consiste en administraciones cada cuatro semanas, preferiblemente dos administraciones cada cuatro semanas.

En una realización particular, la composición para su uso según la invención no comprende ningún adyuvante. En una realización preferida, la composición está en PBS.

En una realización particular, la composición para su uso según la invención comprende un adyuvante. El término “adyuvante”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a una sustancia que, cuando se añade a un agente inmunogénico, mejora o potencia inespecíficamente una respuesta inmunitaria al agente en un huésped receptor tras la exposición a la mezcla. Los adyuvantes adecuados incluyen, sin limitación, adyuvantes formados por sales de aluminio (alumbre), tales como hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio, sulfato de aluminio, etc., formulaciones de emulsiones de aceite en agua o agua en aceite tales como adyuvante completo de Freund (CFA) así como adyuvante incompleto de Freund (IFA); geles minerales; copolímeros de bloque, Avridine™, SEAM62, adyuvantes formados por componentes de la pared celular bacteriana tales como adyuvantes incluyendo liposacáridos (por ejemplo, lípido A o monofosforil lípido A (MLA), dimicolato de trehalosa (TDM), y componentes del esqueleto de la pared celular (CWS), proteínas de choque térmico o derivados de las mismas, adyuvantes derivados de toxinas bacterianas de ribosilación de ADP; saponinas tales como ISCOM (complejos inmunoestimulantes), quimiocinas, quimiocinas y citocinas tales como interleucinas (IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-12, etc.), interferones (tales como interferón gamma), factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF), factor de necrosis tumoral (TNF), defensinas 1 ó 2, RANTES, MIP1-alfa, muramil péptidos tales como N-acetil-muramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP), N-acetil-normuramil-L-alanil-D-isoglutamina (nor-MDP), N-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutaminil-L-alanina-2-(1'-2'-dipalmitoil-s-n-glicero-3-hidroxifosforiloxi)-etilamina (MTP-PE) etc.; adyuvantes derivados de la familia de moléculas de CpG, dinucleótidos CpG y oligonucleótidos sintéticos que comprenden motivos CpG, y adyuvantes sintéticos tales como PCPP, alumbre y similares, hidróxido de aluminio, N-acetilmuramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP), N-acetil-normuramil-L-alanil-D-isoglutamina, MTP-PE y RIBI, que contienen tres componentes extraídos de bacterias, monofosforil lípido A, dimicolato de trehalosa y esqueleto de la pared celular (MPL+TDM+CWS) en una emulsión de escualeno con Tween 8° al 2 %. Otros ejemplos de adyuvantes incluyen DDA (bromuro de dimetildioctadecilamonio) y Qui1A. En una realización particular, el adyuvante es un adyuvante oleaginoso de oleato de manida y aceite mineral. En otra realización, el adyuvante es una emulsión de agua en aceite.

En una realización, la composición no contiene ningún antígeno derivado de un agente infeccioso distinto deMycobacterium,preferiblemente no contiene ningún antígeno derivado del agente infeccioso que provoca la infección que va a prevenirse.

La expresión “un antígeno derivado de un agente infeccioso” significa que el antígeno se obtiene a partir de un agente infeccioso específico (es decir, un agente infeccioso específico es la fuente del antígeno) o es un análogo sintético del mismo, de manera que el antígeno derivado del agente infeccioso es reconocido por el mismo anticuerpo o los mismos anticuerpos que el antígeno que todavía forma parte del agente infeccioso de origen.

1°

En otra realización, la composición no comprende ningún antígeno seleccionado del grupo que consiste en un antígeno derivado de dornasa, levedurina, oidiomicina, priones, estreptocinasas, toxoideStreptococcus,toxoide diftérico, toxoide tetánico, lisados inactivado deAscaris lumbricoides, Aspergillusspp.,Aspergillus flavus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus terreus, Candidaspp.,Candida albicans, Candida glabrata, Candida parapsilosis, Chlamydiaspp.,Chlamydia pneumoniae, Chlamydia psittaci, Chlamydia trachomatis, Cryptosporidiumspp.,Dermatophytes, Entamoeba hystolitica, Enterobius vermicularis, Enterococcus faecalis, Epidermophyton floccosum, Escherichia coli, Giardia lamblia, Haemophilus influenzae, Microsporum canis, Mycobacterium leprae, Mycobacterium tuberculosis, Neisseria gonorrhoeae,virus del papiloma humano, virus de la poliomielitis,Proteusspp.,Proteus mirabilis, Proteus penerii, Proteus vulgaris, Salmonellaspp.,Salmonella bongori, Salmonella enterica, Serratiaspp.,Serratia liquefaciens, Serratia marcencens, Shigellaspp.,Shigella flexneri, Shigella sonnei, Staphylococcusspp.,Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Strongyloides stercoralis, Streptococcusspp.,Streptococcus bovis, Streptococcus viridans, Streptococcus equinus, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Toxoplasma gondii, Trichomonas vaginalis,tricofitina,Trichophytonspp.,Trichophyton rubrum, Trichophyton tonsurans, Trichophyton mentagrophytes,virus de la fiebre amarilla, virus de la hepatitis B, virus de la rubéola, virus de la varicela zóster, virus de la viruela, virus de la parotiditis, virus del sarampión, virus del herpes, virus de la vacuna, análogos sintéticos de dichos antígenos y combinaciones de los mismos.

Preferiblemente, la composición de la invención no comprende ningún lisado, preferiblemente un lisado inactivado, seleccionado del grupo que consiste en un lisado deAscaris lumbricoides, Aspergillusspp.,Aspergillus flavus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus terreus, Candidaspp.,Candida albicans, Candida glabrata, Candida parapsilosis, Chlamydiaspp.,Chlamydia pneumoniae, Chlamydia psittaci, Chlamydia trachomatis, Cryptosporidiumspp.,Dermatophytes, Entamoeba hystolitica, Enterobius vermicularis, Enterococcus faecalis, Epidermophyton floccosum, Escherichia coli,Giardia lamblia,Haemophilus influenzae,Microsporum canis,Mycobacterium leprae,Mycobacterium tuberculosis, Neisseria gonorrhoeae,virus del papiloma humano, virus de la poliomielitis,Proteusspp.,Proteus mirabilis, Proteus penerii, Proteus vulgaris, Salmonellaspp.,Salmonella bongori, Salmonella enterica, Serratiaspp.,Serratia liquefaciens, Serratia marcencens, Shigellaspp.,Shigella flexneri, Shigella sonnei, Staphylococcusspp.,Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Strongyloides stercoralis, Streptococcusspp.,Streptococcus bovis, Streptococcus viridans, Streptococcus equinus, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Toxoplasma gondii, Trichomonas vaginalis,tricofitina,Trichophytonspp.,Trichophyton rubrum,Trichophyton tonsurans,Trichophyton mentagrophytes, virus de la fiebre amarilla, virus de la hepatitis B, virus de la rubéola, virus de la varicela zóster, virus de la viruela, virus de la parotiditis, virus del sarampión, virus del herpes, virus de la vacuna y combinaciones de los mismos.

La composición de la invención no comprende ningún protozoo o lisado protozoario del género seleccionado del grupo que consiste enAcanthamoeba, Babesia, Balamuthia, Balantidium, Blastocystis, Cryptosporidium, Cyclospora, Dientamoeba, Entamoeba, Giardia, Isospora, Leishmania, Naegleria, Plasmodium, Rhinosporidium, Sarcocystis, Toxoplasma, Trichomonas, Trypanosomay combinaciones de los mismos. La composición de la invención no comprende ninguna bacteria o lisado bacteriano del género seleccionado del grupo que consiste enAcinetobacter,Actinobacillus, Aeromonas, Aggregatibacter, Agrobacterium, Anaplasma, Bacillus, Bordetella, Borrelia, Brucella, Burkholderia, Campylobacter, Chlamydia, Chromobacterium, Clostridium, Corynebacterium, Cyanobacteria, Enterobacter, Enterococcus, Erwinia, Escherichia, Francisella, Fusobacterium, Haemophilus, Helicobacter, Klebsiella, Lactobacillus, Legionella, Listeria, Micrococcus, Moraxella, Mycoplasma, Neisseria, Nitrosomas, Nocardia, Obesumbacterium, Pantoea, Pasteurella, Pediococcus, Porphyromonas, Prevotella, Proteus, Pseudomonas, Ralstonia, Rickettsia, Rhisobium, Rhodobacter, Salmonella, Serratia, Shigella, Staphylococcus, Streptococcus, Tannerella, Treponema, Tsukamurella, Vibrio, Xenorhabdus, Yersiniay combinaciones de los mismos.

La composición de la invención no comprende ningún antígeno seleccionado del grupo que consiste en un antígeno derivado de una bacteria perteneciente a los génerosStaphylococcus, Streptococcus, Enterococcus, Corynebacterium, Bacillus, Listeria, Clostridium, Actinomyces, Nocardia, Escherichia, Proteus, Klebsiella, Serratia, Enterobacter, Salmonella, Shigella, Pseudomonas, Burkholderia, Stenotrophomonas, Acinetobacter, Vibrio, Campylobacter, Helicobacter, Bacteroides, Neisseria, Moraxella, Haemophilus, Bordetella, Brucella, Francisella, Pasteurella, Yersinia, Legionella, Gardnerella, Treponema, Leptospira, Borrelia, Mycoplasma, Rickettsia, Chlamydia,un análogo sintético de dichos antígenos y combinaciones de los mismos; o un antígeno derivado de un virus perteneciente a las familiasAdenoviridae, Arenaviridae, Bunyaviridae, Coronaviridae, Filoviridae, Flaviviridae, Hepadnaviridae, Deltavirus, Caliciviridae, Herpesviridae, Orthomyxoviridae, Papovaviridae, Paramyxoviridae, Parvoviridae, Picornaviridae, Poliovirus, Poxiviridae, Reoviridae, Retroviridae, Rhabdoviridae, Togaviridae,un análogo sintético de dichos antígenos y combinaciones de los mismos; o un antígeno derivado de un hongo y levadura pertenecientes a los génerosSporothrix, Aspergillus, Blastomyces, Candida, Coccidioides, Cryptococcus, Histoplasma, Pneumocystis,un análogo sintético de dichos antígenos y combinaciones de los mismos; o un antígeno derivado de un protozoo perteneciente a los génerosCriptosporidia, Cyclospora, Entamoeba, Naegleria, Giardia, Leishmania, Plasmodium, Toxoplasma, Trichomonas, Trypanosoma, Microsporidia, Isospora,un análogo sintético de dichos antígenos y combinaciones de los mismos; o un antígeno derivado de un helminto, trematodo, cestodo, nematodo, un análogo sintético de dichos antígenos y combinaciones de los mismos.

En otra realización, laMycobacteriumes el único inmunógeno de la composición.

En una realización particular, la composición para su uso según la invención se administra como parte de un producto farmacéutico, un producto veterinario, un producto alimenticio o un producto nutritivo.

Tal como se usa en la presente invención, la expresión “composición farmacéutica” se refiere a una formulación que se ha adaptado para administrar una dosis predeterminada de uno o varios agentes terapéuticamente útiles a una célula, un grupo de células, un órgano, un tejido o un animal en el que se busca un efecto terapéutico directo o indirecto de la composición. La composición farmacéutica de la invención contiene una cantidad eficaz farmacéutica de una composición, que se entiende en el presente documento como una cantidad que puede proporcionar un efecto terapéutico, y que puede ser determinada por el experto en la técnica mediante medios habitualmente usados. La cantidad de laMycobacteriuminactivada para su uso según la invención o una fracción de la misma variará en función del sujeto y el modo de administración particular. Los expertos en la técnica apreciarán que las dosificaciones pueden determinarse con la guía de The Pharmacological Basis of Therapeutics de Goodman and Goldman, novena edición (1996), anexo II, págs. 1707-1711, y de The Pharmacological Basis of Therapeutics de Goodman y Goldman, décima edición (2001), anexo II, págs. 475-493.

Las composiciones pueden ser para uso humano o animal en medicina humana y veterinaria y comprenderán normalmente uno cualquiera o más de un diluyente, portador o excipiente farmacéuticamente aceptable. El término “portador” se refiere a un diluyente o excipiente con el que se administra el principio activo. Los portadores o diluyentes aceptables para uso terapéutico se conocen bien en la técnica farmacéutica, y se describen, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A. R. Gennaro edit. 1985). La elección del portador, excipiente o diluyente farmacéutico pueden seleccionarse en función de la vía de administración prevista y la práctica farmacéutica convencional. Por ejemplo, tales portadores farmacéuticos pueden ser líquidos estériles, tales como agua y aceites, incluyendo aquellos derivados del petróleo, de origen animal, vegetal o sintético, tales como aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sésamo y similares. Como portadores se usan preferiblemente agua o disoluciones acuosas de solución salina y disoluciones acuosas de dextrosa y glicerol, particularmente para disoluciones inyectables. Las composiciones pueden comprender como, o además del, portador, excipiente o diluyente cualquier carga, lubricante, agente de suspensión, agente de recubrimiento, agente solubilizante adecuado. En la composición farmacéutica pueden proporcionarse conservantes, estabilizadores, tintes e incluso agentes saborizantes. Los ejemplos de conservantes incluyen benzoato de sodio, ácido sórbico y ésteres de ácido p-hidroxibenzoico. También pueden usarse antioxidantes y agentes de suspensión. Puede haber diferentes requisitos de composición/formulación en función de los diferentes sistemas de administración.

En una realización particular, la composición se administra como parte de una composición nutritiva o un producto nutracéutico que comprende la composición para su uso según la invención. El término “composición nutritiva” de la presente invención se refiere al alimento que afecta de manera beneficiosa a una o más funciones del cuerpo, para proporcionar una mejor salud y bienestar. Por consiguiente, una composición nutritiva de este tipo puede estar destinada para la prevención y/o el tratamiento de una enfermedad o un factor causante de enfermedad. Por tanto, el término “composición nutritiva” de la presente invención puede usarse como sinónimo de alimento funcional o alimentos con fines nutricionales particulares, o alimento médico. Una composición nutritiva es similar a la de un alimento convencional y consumido como parte de una dieta normal. Preferiblemente, el alimento o producto nutritivo comprende al menos entre el 0,1 % y el 99,9 %, entre el 1 % y el 99 %, entre el 10 % y el 90 %, entre el 20 % y el 80 %, entre el 30 % y el 70 %, entre el 40 % y el 60 % de laMycobacteriuminactivada para su uso según la invención o una fracción de la misma. Ejemplos no limitativos de productos alimenticios adecuados que pueden usarse en la presente invención son cereales, productos a base de cereales fermentados, otros polvos a base de cereales, leche artificial de nutrición clínica, pan, dulces o caramelos, formulaciones de pienso para animales, formulaciones dietética sintéticas o semisintéticas, leche artificial para bebés, leche artificial de nutrición clínica, harinas, pan, dulces, caramelos o chicles. Por “producto nutracéutico”, una palabra derivada de nutrición y farmacéutico, se refiere a un producto preparado a partir de un alimento, pero que puede encontrarse en forma de una pastilla, un polvo y/o cualquier otra forma de dosificación no asociada habitualmente con un alimento y que tiene propiedades beneficiosas para el tratamiento y/o la prevención de enfermedades.

En una realización particular, la composición se administra como parte de un pienso para animales. El término “pienso para animales” incluye todos los materiales naturales y productos terminados de cualquier origen que, por separado o mezclados de manera conveniente entre sí, son adecuados para, o están destinados a, la ingesta por parte de un animal. El pienso para animales para un animal monogástrico comprende normalmente concentrados así como vitaminas, minerales, enzimas, microbios de alimentación directa, aminoácidos y/u otros ingredientes alimentarios (tal como en una premezcla), mientras que el pienso para animales para rumiantes comprende generalmente forraje (incluyendo forraje celulósico y forraje ensilado) y puede comprender además concentrados así como vitaminas, minerales, enzimas, microbios de alimentación directa, aminoácidos y/u otros ingredientes alimentarios (tal como en una premezcla). Un aditivo de pienso para animales es un producto enzimático formulado que puede comprender además, por ejemplo, vitaminas, minerales, enzimas, aminoácidos, conservantes y/o antibióticos; es decir, una premezcla. El aditivo de pienso para animales/premezcla se mezcla normalmente en un molino para pienso con concentrados y/o forraje tal como proteína vegetal, legumbres u otro material vegetal. El pienso para animales se alimenta normalmente como pienso granulado a los animales monogástricos. Ejemplos de animales son no rumiantes y rumiantes. Los animales rumiantes incluyen, por ejemplo, animales tales como ovejas, cabras, ganado, por ejemplo, ganado vacuno, vacas y terneros, ciervos, yaks, camellos, llamas y canguros. Los animales no rumiantes incluyen animales monogástricos incluyendo, pero sin limitarse a, cerdos o ganado porcino (incluyendo, pero sin limitarse a, lechones, cerdos en crecimiento y cerdas); aves de corral tales como pavos, patos, codornices, gallinas de Guinea, avestruces, ocas, palomas (incluyendo pichones) y pollos (incluyendo, pero sin limitarse a, pollos de engorde (denominados en el presente documento pollos de engorde), pollitos, gallinas ponedoras (denominadas en el presente documento ponedoras)); caballos (incluyendo, pero sin limitarse a, caballos de tamaño pequeño, caballos de tamaño grande y caballos de tamaño mediano).

En una realización particular, la invención se refiere a composiciones para su uso según la invención en forma liofilizada, secada por congelación o secada, que pueden obtenerse mediante cualquier método convencional conocido en la técnica.

La invención se describirá a modo de los siguientes ejemplos que deben considerarse simplemente ilustrativos y no limitativos del alcance de la invención.

Ejemplos

1. Preparación del inmunoestimulante.

Se usó el aislado de campo deM. bovisMB4 obtenido originalmente de un jabalí infectado de manera natural para la preparación de vacuna inactivada (VI) deM. bovis.La VI deM. bovisse preparó siguiendo la metodología descrita previamente (Garridoet al.,2011, Protection against tuberculosis in Eurasian wild boar vaccinated with heatinactivatedMycobacterium bovis.PLoS One 6: e24905). La cepa de M.bovisusada es un cultivo de primer nivel de pase aislado de un jabalí infectado de manera natural en medio Coletsos. Antes de la inactivación, se prepararon diluciones en serie de diez veces y se sembraron en 7H9 solidificado en agar con OADC por cuadruplicado para evaluar el número de UFC en el inóculo. El inóculo se inactivó usando un baño de agua a 80-85 °C durante 30 45 minutos. Se cultivaron cuatro alícuotas de la vacuna inactivada para confirmar la ausencia de M.bovisviable. Se ajustaron los viales de inmunoestimulante a aproximadamente 107 bacterias según el recuento de unidades formadoras de colonias (UFC)/ml en solución salina tamponada con fosfato (PBS).

La secuencia genómica del aislado de campo deM. bovisMB4 se ha depositado en el Archivo Europeo de Nucleótidos con los números de registro CD<h>E01000001 a CDHE01000118 (de la Fuenteet al.,Complete Genome Sequences of Field Isolates ofMycobacterium bovisandMycobacterium caprae,Genome Announc, Mayo/Junio de 2015, vol. 3, número 3, e00247-15, y de la Fuenteet al.,Comparative Genomics of Field Isolates ofMycobacterium bovisandM. capraeProvides Evidence for Possible Correlates with Bacterial Viability and Virulence, PLoS Negl Trop Dis 9(11): e0004232).

2. Efecto inmunoprotector contra el parásito de la malaria,Plasmodiumspp.

2.1. Diseño del estudio

Se obtuvieron ratones Balb/c hembra de cinco semanas de edad (N= 3/grupo). Los ratones se trataron con dos dosis de 0,05 ml que contenían, cada una, 500.000 bacterias según el recuento de UFC en PBS, con un mes de diferencia. Los grupos de control se trataron con dos dosis de 0,05 ml de PBS, con un mes de diferencia. Después de la inmunización, se realizó una inoculación intraperitoneal de 107 glóbulos rojos parasitados conPlasmodium bergheiANKA a un grupo o se dejó sin infectar como control.

Se obtuvieron frotis de sangre de los ratones para determinar la parasitemia, usando microscopía óptica después de la tinción con el kit Hemacolor® (EMD Millipore, Alemania). Cuando la parasitemia alcanzó >10% y se observó exflagelación (4-6 exflagelaciones/campo), se sacrificaron los ratones para recoger muestras de hígado y sangre para verificar la infección conPlasmodium.El ARN se extrajo inmediatamente usando el kit de purificación GRS FullSample (GRiSP, Oporto, Portugal), se cuantificó usando un espectrofotómetro ND-1000 (NanoDrop ND1000, Thermo Fisher Scientific, Whaltman, MA) y se almacenó a -80 °C. Usando tres réplicas biológicas de cada condición (tratado y no tratado), se usó el ARN total (50 ng/|il para cada muestra de los ratones) para sintetizar ADNc usando el kit de síntesis de ADNc iScript™ (Bio-Rad, CA, EE.UU.). Se realizaron reacciones de qPCR de 10 |il por triplicado usando el kit IQ™ SYBR® Green Supermix (Bio-rad, CA, E<e>.UU.) en un termociclador de PCR en tiempo real CFX96 Touch (Bio-Rad, CA, EE.UU.). Se usaron las siguientes condiciones: un ciclo inicial de desnaturalización a 95 °C durante 10 min; seguido de 45 ciclos de 95 °C durante 15 segundos y 55 °C durante 45 segundos para amplificar el ARNr 18S dePlasmodium.Se tomaron lecturas de fluorescencia a 62 °C después de cada ciclo y se realizó una curva de fusión (60-95 °C). Para determinar la eficiencia de reacción, se construyeron curvas de calibración con diluciones en serie de 5 veces de ADNc sintetizado a partir de ARN total de un conjunto de muestras. Los niveles relativos de expresión de las muestras de los ratones se normalizaron usando Arbp0 (55 °C) y proteína S7 ribosómica (60 °C) como gen de referencia, y la expresión génica se analizó mediante el software CFX Manager™ (Bio-Rad, CA, EE.UU.). Los resultados de los ratones tratados y de control se compararon mediante la prueba de Mann-Whitney para valores no paramétricos (P < 0,05).

2.2. Resultados

El porcentaje de parasitemia se redujo significativamente en los ratones tratados en comparación con los controles (p<0,05) el día 3 tras la infección. Específicamente, se observó un retraso de 1 día en los tres ratones tratados con el inmunoestimulante inactivado por calor deM. bovis(figura 1).

Los niveles relativos dePlasmodium bergheien hígado y sangre de ratones tratados eran significativamente inferiores en comparación con los ratones de control (p<0,001 y p<0,01, respectivamente) al final del experimento (figura 2).

3. Efecto inmunoprotector contra el parásito de la leishmaniosis,Leishmaniaspp.

3.1. Diseño del estudio

En este estudio se usaron dieciocho ratones Balb/c hembra de cuatro semanas de edad (N= 9/grupo). Los ratones tratados recibieron por vía oral dos dosis deM. bovisinactivada de 0,05 ml que contenían, cada una, 500.000 bacterias según el recuento de UFC a un intervalo de 4 semanas. A los grupos de control se les administraron dos dosis de 0,05 ml de PBS, con un mes de diferencia. Todos los ratones fueron infectados posteriormente mediante inoculación intraplantar en las patas derechas con 10.000 promastigotes deLeishmania amazonensisen un volumen final de 0,05 ml 4 semanas después de la segunda dosis de inmunización.

El crecimiento de las lesiones se determinó semanalmente midiendo los diámetros de las patas derechas e izquierdas con un plicómetro hasta que la medida fue 3 veces el valor previo a la inoculación, siendo ese momento en el que se sacrificaron y se sometieron a necropsia.

Además de la observación clínica de los ratones experimentales, al final del experimento se estimó la eficacia antileishmaniosis del inmunoestimulante determinando la carga parasitaria mediante el ensayo de dilución limitante tal como se describió previamente (Buffetet al.,1995, Culture microtitration: a sensitive method for quantifyingLeishmania infantumin tissues of infected mice. Antimicrob Agents Chemother 39: 2167-2168). Brevemente, los ganglios linfáticos poplíteos y los bazos se extrajeron, pesaron y homogeneizaron en medio de Schneider (Sigma-Aldrich, Misuri, EE.u U.) complementado con FBS inactivada por calor al 20 %, orina humana estéril al 2 %, HEPES 20 mM, L-glutamina al 1 % y penicilina 100 U/ml estreptomicina 100 mg/ml (Lonza Group, Basilea, Suiza). Los homogeneizados orgánicos se filtraron a través de un filtro celular para garantizar una suspensión de una sola célula. Se realizaron diluciones adicionales del homogeneizado en el mismo medio hasta una concentración final de 10 mg/ml; se añadieron 200 ml/pocillo de esta suspensión celular al primer pocillo de una placa de cultivo de 96 pocillos (Corning Inc., NY, EE.UU.) y se realizaron diluciones en serie de 4 veces a lo largo de la placa. Las placas se incubaron durante 2 semanas a 26 °C y se evaluó la presencia de parásitos mediante microscopía. La carga parasitaria (número de parásitos/g de órgano) se calculó tal como se describe (Buffetet al.,1995, Culture microtitration: a sensitive method for quantifyingLeishmania infantumin tissues of infected mice. Antimicrob Agents Chemother 39: 2167-2168).

Se deshidrataron muestras fijadas en formalina de ganglio linfático poplíteo, bazo y almohadilla de pata derecha a través de una serie gradual de alcohol con respecto a xilol, se incrustaron en cera de parafina y se procesaron de manera rutinaria para inmunohistoquímica (IHC) usando el método de complejo avidina-biotina-peroxidasa (ABC). Brevemente, se agotó la actividad de peroxidasa endógena mediante la incubación con peróxido de hidrógeno al 0,3 % en metanol durante 30 minutos a temperatura ambiente (aproximadamente 25 °C). Los cortes se cubrieron con suero de cabra normal al 20 % (Vector Laboratories, Burlingame, CA, EE.UU.) en solución salina tamponada con fosfato (PBS) 0,01 M a temperatura ambiente durante 30 minutos. Después del bloqueo, los cortes se incubaron con un anticuerpo de conejoanti-Leishmania spp.(cortesía del Instituto de Salud Carlos III, Majadahonda, España) en una dilución 1:50 a 4 °C durante la noche (aproximadamente 18 horas). Luego se incubaron los cortes durante 30 minutos a temperatura ambiente con Ac secundario de cabra biotinilado anti-IgG de conejo (Vector Laboratories) diluido 1:200 en solución salina tamponada con Tris 0,05 M (TBS; pH 7,6) que contenía suero de cabra normal al 10%. Todos los cortes tisulares se trataron finalmente con complejo<a>B<c>(kit Vectastain ABC Elite; Vector Laboratories) durante 1 hora a temperatura ambiente, luego se enjuagaron en TBS y se incubaron con la disolución cromógena (kit de sustrato NovaRED; Vector Laboratories). Finalmente, los portaobjetos se contratiñeron con hematoxilina de Harris. Se realizó la evaluación cuantitativa de los amastigotes en campos de 0,2 mm2.

Los resultados de los ratones tratados y de control se compararon mediante la prueba de Mann-Whitney para valores no paramétricos (P < 0,05).

3.2. Resultados

Los animales presentaban edema y necrosis con un aumento del grosor de la almohadilla de la pata derecha durante 60 días aproximadamente después de la inoculación de parásitos en ambos grupos. El crecimiento medio de la lesión de la pata fue creciente durante el periodo evaluado. Sin embargo, la inmunización con un inmunoestimulante inactivado por calor deM. bovisadministrado por vía oral no dio como resultado un aumento menos pronunciado del grosor de la pata durante el experimento, y se observaron diferencias no significativas entre grupos (figura 3).

En cultivo, los promastigotes aparecen en el ganglio linfático poplíteo a las 24 horas y en el bazo a los 4 días. Estos promastigotes se mantuvieron hasta los 21 días de incubación. En el ganglio linfático poplíteo, se observó aislamiento positivo en todos los ratones de ambos grupos, lo que confirma la infección. Sin embargo, en el bazo, se hallaron diferencias significativas entre ambos grupos infectados (p < 0,05); por tanto, se observó aislamiento de promastigotes en todos los ratones del grupo de control (100 %), pero sólo en 5/9 ratones del grupo tratado (55 %).

Las cargas deLeishmaniaen bazo y ganglio linfático poplíteo fueron mayores en el grupo de control que las observadas en el grupo tratado, aunque esta reducción de la carga de promastigotes en el grupo tratado no fue significativa (P > 0,05) (figura 4).

La reducción en amastigotes deLeishmaniadetectadain situmediante IHC en ganglio linfático poplíteo fue significativa (P=0,092) en los ratones tratados en comparación con los controles (figura 5). Se realizó detección inmunohistoquímica del antígeno deLeishmaniaspp. en la almohadilla de la pata izquierda, pero el mayor número de amastigotes en esta localización en todos los animales infectados imposibilitó su cuantificación.

4. Efecto inmunoprotector contra la bacteria de la enfermedad de Lyme,Borrelia burgdorferi.

4.1. Diseño del estudio

Se trataron por vía oral doce ratones C3H/HeN hembra de seis semanas de edad (N = 5/grupo) con dos dosis deM. bovisinactivada de 0,05 ml que contenían, cada una, 500.000 bacterias según el recuento de UFC a un intervalo de 4 semanas. A los grupos de control se les administraron dos dosis de 0,05 ml de PBS, con un mes de diferencia. Todos los ratones fueron infectados posteriormente mediante inyecciones subcutáneas de 105 espiroquetas en 100 |il de medio BSK-H por ratón. Las cepas usadas para la infección de ratones de laboratorio se caracterizaron y seleccionaron basándose en sus tipos de ospC tal como se describió previamente (Rudenkoet al.,2013, Detection ofBorrelia burgdorferi sensu strictoospC alleles associated with human Lyme borreliosis worldwide in non-humanbiting tickIxodes affinisand rodent hosts in southeastern United States. Appl Environ Microbiol 79:1444-1453). La presencia de espiroquetas en biopsias de oreja se determinó a intervalos semanales mediante PCR con el fin de determinar el punto final del experimento. A la 3a semana después de la infección, se confirmó la presencia de espiroquetas en todas las muestras de biopsia de oreja independientemente del tipo de ospC de la cepa usada para la infección. A la 6a semana, los ratones se sacrificaron y se sometieron a necropsia, y se obtuvieron muestras de articulación, vejiga, corazón, bazo y oreja.

La detección de infección con B.burgdorferise realizó usando amplificación por PCR directa de ADN de B.burgdorferia partir de material tisular murino. El ADN total de las muestras murinas se purificó usando el kit tisular DNeasy (Qiagen, Hilden, Alemania) estrictamente según las recomendaciones del fabricante. Se usó el kit MasterTaq (Eppendorf, Hamburgo, Alemania) para la amplificación por PCR anidada de fragmentos del gen de flagelina usando los siguientes cebadores específicos de genes previamente descritos: Fla out F-5'-AARGAATTGGCAGTTCAATC-3' (SEQ ID NO: 1) y Fla out R-5'-GCATTTTCWATTTTAGCAAGTGATG-3' (SEQ ID NO: 2) y Fla inn F-5'-ACATATTCAGATGCAGACAGAGGTTCTA-3' (SEQ ID NO: 3), y Fla inn R-5'-GAAGGTGCTGTAGCAGGTGCTGGCTGT-3' (SEQ ID NO: 4) (Clarket al.,2005, Molecular identification and analysis ofBorrelia burgdorferi sensu latoin lizards in the southeastern United States. Appl Environ Microbiol 71:2616-2625). Todos los ensayos de qPCR se realizaron con un dispositivo LightCycler 480 (Roche, Basilea, Suiza). Se usaron FastStart Universal SYBR Green Master (ROX) de Roche y los cebadores específicos de genes FlaF1 (AAGCAAATTTAGGTGCTTTCCAA) (SEQ ID NO: 5) y FlaR1 (GCAATCATTGCCATTGCAGA) (SEQ ID NO: 6) para amplificar un fragmento de 154 pb de longitud con un programa que consistía en una etapa de desnaturalización inicial de 3 min a 95 °C y 50 ciclos de amplificación de 30 s a 95 °C seguido de 1 min a 60 °C. Los cebadores directo e inverso usados para el análisis por qPCR del gen de mantenimiento de p-actina de ratón fueron 5'-AGA GGG AAA TCG TGC GTG AC-3' (SEQ ID NO: 7) y 5'-CAA TAG TGA TGA CCT GGC CGT-3' (SEQ ID NO: 8), respectivamente. La carga de espiroquetas en los tejidos se normalizó con respecto a la actina de ratón usando métodos previamente descritos (Daiet al.,2009, Antibodies against a tick protein, Salp15, protect mice from the Lyme disease agent. Cell Host Microbe 6:482-492). La cuantificación se realizó usando el método de CT comparativo (Sequence Detector User Bulletin 2; Applied Biosystems) y se notificó como la diferencia en veces en relación con el gen de mantenimiento. Para calcular el cambio en veces (aumento o disminución), se restó el CT del gen de mantenimiento (p-actina murina) del CT del gen diana para dar lugar al ACT.

Los resultados de los ratones tratados y de control se compararon mediante la prueba de Mann-Whitney para valores no paramétricos (P < 0,05).

4.2. Resultados

La carga deB. burgdorferise redujo en los ratones tratados en comparación con los controles, pero las diferencias no siempre fueron significativas. Por tanto, la inmunización con VI deM. bovisen ratones produjo una disminución significativa de B.burgdorferien los tejidos del 61 % en articulación (sitio preferible para la acumulación de espiroquetas), del 57,4 % en vejiga y del 47,5 % en corazón (figura 6). Se excluyeron muestras de sangre de los experimentos debido a la concentración insuficiente del ADN extraído.

5. Efecto inmunoprotector contra la bacteria de la salmonelosis,Salmonella enterica.

5.1. Diseño del estudio

Se usaron treinta lechones hembra híbridos Landrace x Large White de 10 días de edad con pesos homogéneos, obtenidos de una granja de producción de cerdos. Nueve animales se trataron por vía oral con la fracción soluble en agua de “alperujo” (un subproducto sólido del método de centrifugación en dos fases para la extracción de aceite de oliva) y posteriormente se infectaron con S.entéricapor vía intratraqueal. Nueve animales se trataron por vía oral con dos dosis deM. bovisinactivada de 2 ml que contenían, cada una, 107 bacterias según el recuento de UFC/ml a un intervalo de 4 semanas (grupo tratado) y nueve animales no fueron tratados (grupo de control). Todos ellos fueron infectados por vía intratraqueal con 106 UFC de S.entéricaen un volumen final de 1 ml 4 semanas después de la segunda dosis de inmunización. Otros tres animales no se trataron ni se infectaron con S.entérica(grupo no infectado).

Se recogieron muestras de todos los individuos a los 0, 1, 2, 7, 14 y 21 días tras la infección (dpi). Se midió el peso el primer día de cada semana (día 0, 7, 14, 21 dpi). Después de estos 21 días, los animales se sacrificaron y se sometieron a necropsia para el examen póstumo. Los resultados de los ratones tratados y de control se compararon mediante la prueba de Mann-Whitney para valores no paramétricos (P < 0,05).

5.2. Resultados

Con respecto a las incidencias clínicas observadas durante el estudio, cabe señalar que comenzaron a observarse dificultades respiratorias, incluyendo estornudos y tos, a partir del 2 dpi. La mayoría de los síntomas fueron inmunoestimulantes entre los dpi 8 y 14 con claros signos clínicos de depresión y apatía en los grupos infectados, aunque más generalizados en el grupo de control que en el grupo tratado. El porcentaje de animales con signos clínicos también fue mayor en el grupo de control (figura 7).

El peso de los animales aumentó progresivamente a lo largo de la experiencia en todos los grupos (figura 8). Los animales del grupo de control no infectado son los que alcanzan el peso más alto, seguido de los animales del grupo tratado, mientras que los animales del grupo de control presentaron los pesos más bajos. El dpi 21, el grupo tratado tenía una media de 3,25 kg más que el grupo de control. Aunque hubo ligeras diferencias, se observaron valores estadísticamente significativos entre el grupo tratado en comparación con el grupo de control a partir del dpi 7. Los animales no tratados y expuestos con S.enterica(grupo de control) presentaron neumonía grave con focos necróticos que afectaban a cuatro o más lóbulos, hidrotórax, hidropericarditis, nódulos mediastinales congestivos y congestión de la mucosa fúndica gástrica, esplenomegalia, hepatomegalia, adenomegalia mesentérica y gastrohepática. Sin embargo, los animales tratados y expuestos conS. enterica(grupo tratado) presentaron únicamente cambios vasculares moderados, una ligera bronconeumonía que afectaba a un menor número de lóbulos y nódulos mediastinales congestivos con algunas áreas necróticas. Los animales no infectados no mostraron lesiones compatibles con la infección con S.enterica(figura 9).

Claims (15)

1. REIVINDICACIONES

   i.Composición que comprende unaMycobacterium bovisinactivada o una fracción inmunogénica de la misma, para su uso en la prevención de una infección en un sujeto, en la que la infección se selecciona del grupo que consiste en una infección parasitaria protozoaria y una infección bacteriana, en la que la composición no contiene ningún antígeno derivado de un agente infeccioso distinto deMycobacterium,siempre que la infección no esté provocada por unaMycobacterium.
2. 2. Composición para su uso según la reivindicación 1, en la que laMycobacterium bovises aislado de campo deM. bovisMB4 (números de registro del Archivo Europeo de Nucleótidos CDHE01000001 a CDHE01000118) oM. bovisBCG.
3. 3. Composición para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en la que laMycobacterium bovisse inactiva a través de un procedimiento seleccionado del grupo que consiste en inactivación térmica, inactivación por microondas, inactivación por presión, inactivación por ácido, inactivación por base, inactivación por etanol e inactivación por peróxido.
4. 4. Composición para su uso según la reivindicación 3, en la que laMycobacteriumse inactiva a través de inactivación térmica.
5. 5. Composición para su uso según la reivindicación 4, en la que el procedimiento de inactivación térmica comprende calentar laMycobacteriumen un baño de agua a una temperatura de entre 80 °C y 85 °C durante un periodo de entre 30 minutos y 45 minutos.
6. 6. Composición para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en la que la infección parasitaria protozoaria está provocada por un protozoo del género seleccionado del grupo que consiste enAcanthamoeba, Babesia, Balamuthia, Balantidium, Blastocystis, Cryptosporidium, Cyclospora, Dientamoeba, Entamoeba, Giardia, Isospora, Leishmania, Naegleria, Plasmodium, Rhinosporidium, Sarcocystis, Toxoplasma, Trichomonas, Trypanosomay combinaciones de los mismos; o en la que la infección bacteriana está provocada por una bacteria del género seleccionado del grupo que consiste enAcinetobacter, Actinobacillus, Aeromonas, Aggregatibacter, Agrobacterium, Anaplasma, Bacillus, Bordetella, Borrelia, Brucella, Burkholderia, Campylobacter, Chlamydia, Chromobacterium, Clostridium, Corynebacterium, Cyanobacteria, Enterobacter, Enterococcus, Erwinia, Escherichia, Francisella, Fusobacterium, Haemophilus, Helicobacter, Klebsiella, Lactobacillus, Legionella, Listeria, Micrococcus, Moraxella, Mycoplasma, Neisseria, Nitrosomas, Nocardia, Obesumbacterium, Pantoea, Pasteurella, Pediococcus, Porphyromonas, Prevotella, Proteus, Pseudomonas, Ralstonia, Rickettsia, Rhisobium, Rhodobacter, Salmonella, Serratia, Shigella, Staphylococcus, Streptococcus, Tannerella, Treponema, Tsukamurella, Vibrio, Xenorhabdus, Yersiniay combinaciones de las mismas.
7. 7. Composición para su uso según la reivindicación 6, en la que la infección parasitaria protozoaria está provocada por un protozoo seleccionado del grupo que consiste enAcanthamoebaspp.,Balamuthia mandrillaris, Babesia divergens, Balantidium coli, Blastocystisspp.,Cryptosporidiumspp.,Cyclospora cayetanensis, Dientamoeba fragilis, Entamoeba histolytica, Giardia lamblia, Isospora belli, Leishmaniaspp.,Naegleria fowleri, Plasmodium berghei, Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium ovale, Plasmodium malariae, Plasmodium knowlesi, Rhinosporidium seeberi, Sarcocystis bovihominis, Sarcocystis suihominis, Toxoplasma gondii, Trichomonas vaginalis, Trypanosoma brucei, Trypanosoma cruziy combinaciones de los mismos; o en la que la infección bacteriana está provocada por una bacteria seleccionada del grupo que consiste enAeromonas hydrophila, Aeromonas salmonicida, Acinetobacter baumannii, Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Agrobacterium tumefaciens, Anaplasmaspp.,Bacillus anthracis, Bacillus cereus, Bacillus subtilis, Borrelia burgdorferi, Bordetella pertussis, Brucella abortus, Burkholderia cepacia, Campylobacter jejuni, Chlamydia trachomatis, Chromobacterium violaceum, Clostridium botulinum, Clostridium tetani, Corynebacterium diphtheria, Enterobacter agglomeran, Enterococcus faecalis, Erwinia carotovora, Erwinia chrysanthemi, Escherichia coli, Francisella tularensis, Fusobacterium nucleatum, Haemophilus influenzae, Helicobacter pylori, Lactobacillus plantarum, Legionella pneumophila,Listeria monocytogenes,Klebsiella pneumoniae,Mycoplasma pneumoniae,Micrococcus luteus, Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae, Nitrosomas europaea, Nocardia carnea, Obesumbacterium proteus, Pantoea stewartii, Pediococcus acidilactici, Prevotella intermedia, Porphyromonas gingivalis, Pseudomonas aureofaciens, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas phosphoreum, Pseudomonas syringae, Ralstonia solanacearum, Rhisobium etli, Rhisobium leguminosarum, Rhodobacter sphaeroides, Rickettsiaspp.,Salmonella enterica, Salmonella typhimurium, Serratia liguefaciens, Serratia marcescens, Shigella sonnei, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus enteritis, Streptococcus pneumoniae, Tannerella forsythensis, Treponema denticola, Treponema pallidum, Tsukamurella pulmonis, Vibrio anguillarum, Vibrio fischeri, Vibrio cholerae, Vibrio harveyi, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio alginolyticus, Vibrio vulnificus, Xenorhabdus nematophilus, Yersinia enterocolitica, Yersinia pestis, Yersinia pseudotuberculosis, Yersinia medievalis, Yersinia ruckeriy combinaciones de las mismas.
8. 8. Composición para su uso según la reivindicación 6, en la que la infección parasitaria protozoaria está provocada por protozoos del géneroLeishmaniaoPlasmodium,o en la que la infección bacteriana está provocada por bacterias del géneroBorreliaoSalmonella.
9. 9. Composición para su uso según la reivindicación 8, en la que los protozoos sonLeishmania amazonensisoPlasmodium berghei,o en la que las bacterias sonBorrelia burgdorferioSalmonella entérica.
10. 10. Composición para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en la que el sujeto es un vertebrado.
11. 11. Composición para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en la que la composición se administra por vía oral, sublingual, intranasal, mucosa, intrapulmonar, parenteral o combinaciones de las mismas.
12. 12. Composición para su uso según la reivindicación 11, en la que la composición se administra por vía oral y/o parenteral.
13. 13. Composición para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en la que la composición se formula para su administración por vía oral, sublingual, intranasal, intramuscular, subcutánea, mucosa, intrapulmonar, intradérmica, intravenosa o combinaciones de las mismas.
14. 14. Composición para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en la que la composición comprende además un adyuvante.
15. 15. Composición para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en la que la composición se administra como parte de un producto farmacéutico, un producto veterinario, un producto alimenticio o un producto nutritivo.