ES2991026T3 - Anticuerpos de cadena pesada (VHH) contra claudina 18A2 y uso de los mismos - Google Patents

Anticuerpos de cadena pesada (VHH) contra claudina 18A2 y uso de los mismos Download PDF

Info

Publication number
ES2991026T3
ES2991026T3 ES19910759T ES19910759T ES2991026T3 ES 2991026 T3 ES2991026 T3 ES 2991026T3 ES 19910759 T ES19910759 T ES 19910759T ES 19910759 T ES19910759 T ES 19910759T ES 2991026 T3 ES2991026 T3 ES 2991026T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
amino acid
seq
acid sequence
sequence represented
cld18a2
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES19910759T
Other languages
English (en)
Inventor
Gaofeng Yao
Yali Lu
Zhenxing Zhou
Yilin Fang
Lina Zhu
Changkui Li
Hongta Zhang
Xiaofang Wen
Jiali Dong
Yanshan Huang
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Zhejiang Doer Biologics Co Ltd
Original Assignee
Zhejiang Doer Biologics Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zhejiang Doer Biologics Co Ltd filed Critical Zhejiang Doer Biologics Co Ltd
Application granted granted Critical
Publication of ES2991026T3 publication Critical patent/ES2991026T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3046—Stomach, Intestines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/10—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K40/11—T-cells, e.g. tumour infiltrating lymphocytes [TIL] or regulatory T [Treg] cells; Lymphokine-activated killer [LAK] cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/30—Cellular immunotherapy characterised by the recombinant expression of specific molecules in the cells of the immune system
    • A61K40/31—Chimeric antigen receptors [CAR]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/40—Cellular immunotherapy characterised by antigens that are targeted or presented by cells of the immune system
    • A61K40/41—Vertebrate antigens
    • A61K40/42—Cancer antigens
    • A61K40/4202—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/643—Albumins, e.g. HSA, BSA, ovalbumin or a Keyhole Limpet Hemocyanin [KHL]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/19—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles lyophilised, i.e. freeze-dried, solutions or dispersions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/20—Pills, tablets, discs, rods
    • A61K9/2004—Excipients; Inactive ingredients
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2809—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against the T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K40/00
    • A61K2239/31—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K40/00 characterized by the route of administration
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K40/00
    • A61K2239/38—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K40/00 characterised by the dose, timing or administration schedule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K40/00
    • A61K2239/46—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K40/00 characterised by the cancer treated
    • A61K2239/51—Stomach
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/567—Framework region [FR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/569—Single domain, e.g. dAb, sdAb, VHH, VNAR or nanobody®
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/72—Increased effector function due to an Fc-modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/734—Complement-dependent cytotoxicity [CDC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
    • C07K2319/21—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand containing a His-tag
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/31—Fusion polypeptide fusions, other than Fc, for prolonged plasma life, e.g. albumin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

Un nanocuerpo anti-CLD18A2. Una región determinante complementaria (CDR) del nanocuerpo anti-CLD18A2 comprende CDR1-CDR3 que tienen secuencias de aminoácidos como se muestra a continuación: CDR1 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por una de las SEQ ID NO. 4-11, CDR2 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por una de las SEQ ID NO. 19-26 y CDR3 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por una de las SEQ ID NO. 33-39. El nanocuerpo anti-CLD18A2 puede unirse específicamente al epítopo en CLD18A2, y la proteína de fusión correspondiente del mismo tiene buena especificidad y afinidad por CLD18A2, y tiene un efecto supresor tumoral obvio. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Anticuerpos de cadena pesada (VHH) contra claudina 18A2 y uso de los mismos
Campo técnico
La presente descripción se refiere al campo de la biología, en particular, a un VHH anti-CLD18A2 y a su uso.
Antecedentes
La claudina 18 (CLD18) es una proteína transmembrana con un peso molecular de aproximadamente 28 kiloDalton (kD), ubicada en la estrecha unión del epitelio y el endotelio, y estrechamente conectada entre las células adyacentes. Las claudinas de las superficies celulares de los tejidos epiteliales normales apenas pueden ponerse en contacto debido al denso espacio intercelular. Sin embargo, el espacio entre las células tumorales es relativamente escaso. Por lo tanto, las claudinas de las células tumorales se convierten en una diana potencial para los anticuerpos extracelulares y la inmunoterapia. La CLD18 tiene cuatro regiones hidrófobas, que sirven como regiones transmembrana para formar dos dominios extracelulares, en los que una región hidrófoba 1 y una región hidrófoba 2 forman un dominio extracelular circular 1, y una región hidrófoba 3 y una región hidrófoba 4 forman un dominio extracelular circular 2. Debido a diferentes empalmes de genes, la CLD18 puede convertirse en dos tipos de cuerpos empalmados: CLD18A1 y CLD18A2. CLD18A1 se expresa en el pulmón normal, mientras que CLD18A2 solo se expresa en las células gástricas. Más importante aún, CLD18A2 solo está presente en células epiteliales gástricas diferenciadas de vida corta, pero no en las células madre gástricas (Niimi T y col.Biol.2001;21(21):7380-7390.). Estas características muestran que CLD18A2 es una diana terapéutica clínicamente valiosa para el tratamiento del cáncer gástrico y otros tumores positivos para CLD18A2.
El documento EP 1948693 A1 describe un anticuerpo denominado 175D10 que se une específicamente a CLD18A2 pero no a CLD18A1 en ratones y seres humanos. 175D10 puede inducir CDC y ADCC contra las células que expresan CLD18A2, inhibiendo así el crecimiento tumoral y prolongando la supervivencia en un modelo de xenoinjerto que expresa CLD18A2. El anticuerpo quimérico correspondiente de 175D10, denominado ch-175D10, también se une específicamente a CLD18A2 pero no a CLD18A1, y puede inducir CDC y ADCC contra células que expresan CLD18A2, teniendo el ch-175D10 la tasa de destrucción específica más alta entre los anticuerpos quiméricos preparados en la serie.
Además, el documento WO 2018/006882 A1 describe una serie de anticuerpos que se unen específicamente a CLD18A2, y se preparan los anticuerpos quiméricos correspondientes. Un experimento de ADCC que compara las capacidades destructivas específicas de Ch-170D10 y Ch-163E12 del EP1948693A1 con Hu8E5-2I y Hu2B1-S54A del documento WO2018/006882A1 revela que el Hu8E5-2I y el Hu2B1-S54A muestran mejores habilidades de destrucción específicas contra CLD18A2.
La aplicación exitosa de los anticuerpos monoclonales en la detección del cáncer y en la terapia biológicamente dirigida ha provocado una revolución en la terapia tumoral. Sin embargo, los anticuerpos monoclonales tradicionales con un peso molecular excesivamente grande (alrededor de 150 kD) apenas pueden penetrar en los tejidos, lo que resulta en una baja concentración efectiva en el área del tumor y un efecto terapéutico insuficiente. Los anticuerpos tradicionales tienen un alto riesgo de inmunogenicidad, pero una vez que se humanizan, es difícil que los anticuerpos modificados conserven la afinidad de los anticuerpos originales. Además, muchos factores, como un largo período de desarrollo, un alto costo de producción y una baja estabilidad, limitaron la aplicación y popularización de los anticuerpos tradicionales totalmente humanizados en la práctica clínica. Los anticuerpos de cadena pesada (VHH) que surgieron recientemente incluyen los fragmentos funcionales de unión a antígenos más pequeños derivados de anticuerpos de cadena pesada en camellos adultos, con alta estabilidad y alta afinidad por la unión al antígeno. En comparación con los anticuerpos convencionales, los VHH tienen muchas propiedades únicas: 1) La secuencia que codifica los VHH tiene una alta homología con las familias de VH humanas 3 y 4, lo que las hace débiles en cuanto a inmunogenicidad; 2) El VHH tiene un peso molecular pequeño, solo alrededor de 15 kD, y la estructura simple del VHH facilita su expresión masiva en microorganismos y su purificación; 3) Los VHH pueden reconocer una gran cantidad de epítopos, incluidos algunos epítopos que están ocultos en las fisuras moleculares; 4) Debido a su pequeño peso molecular, los VHH pueden penetrar fácilmente en los tejidos y alcanzar posiciones difíciles de alcanzar con los anticuerpos convencionales; 5) Los VHH tienen una alta solubilidad y estabilidad en ambientes desnaturalizantes o de alta temperatura. Las propiedades únicas y el bajo costo de los VHH han ampliado considerablemente su gama de aplicación. Por lo tanto, los VHH tienen un gran valor en el tratamiento y diagnóstico de enfermedades y también tienen excelentes perspectivas de desarrollo en el diagnóstico y tratamiento de tumores dirigidos a anticuerpos.
Sin embargo, actualmente no hay ningún VHH específico dirigido al epítopo de CLD18A2. Por lo tanto, es de gran valor desarrollar nuevos VHH con altas especificidades y potencia contra CLD18A2.
Resumen
El alcance de la invención se define por las reivindicaciones adjuntas. Cualquier referencia a métodos de tratamiento o diagnóstico se considera una referencia a los compuestos y composiciones de la presente invención para su uso en un método de tratamiento o diagnóstico practicado en el cuerpo humano/animal. La presente descripción proporciona un VHH anti-CLD18A2 para resolver los problemas.
La presente descripción proporciona un VHH anti-CLD18A2. Una región determinante de la complementariedad (CDR -Complementarity Determining Región)no reivindicada del VHH anti-CLD18A2 incluye las CDR1-CDR3 que tienen secuencias de aminoácidos como se muestra a continuación: CDR1 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por una de la Id. de sec. n.° 4-11, CDR2 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por una de la Id. de sec. n.° 19-26 y CDR3 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por una de la Id. de sec. n.° 33-39.
Según la invención, la región CDR determinante de la complementariedad del VHH anti-CLD18A2 incluye las CDR1-CDR3 que tienen secuencias de aminoácidos como se muestra a continuación:
(1) CDR1 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la Id. de sec. n.° 4, CDR2 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la Id. de sec. n.° 19 y CDR3 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la Id. de sec. n.° 33; o
(2) CDR1 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la Id. de sec. n.° 5, CDR2 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la Id. de sec. n.° 20 y CDR3 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la Id. de sec. n.° 34; o
(3) CDR1 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la Id. de sec. n.° 6, CDR2 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la Id. de sec. n.° 21 y CDR3 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la Id. de sec. n.° 35; o
(4) CDR1 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la Id. de sec. n.° 7, CDR2 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la Id. de sec. n.° 22 y CDR3 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la Id. de sec. n.° 36; o
(5) CDR1 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la Id. de sec. n.° 8, CDR2 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la Id. de sec. n.° 23 y CDR3 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la Id. de sec. n.° 37; o
(6) CDR1 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la Id. de sec. n.° 9, CDR2 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la Id. de sec. n.° 24 y CDR3 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la Id. de sec. n.° 38; o
(7) CDR1 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la Id. de sec. n.° 10, CDR2 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la Id. de sec. n.° 25 y CDR3 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la Id. de sec. n.° 36; o
(8) CDR1 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la Id. de sec. n.° 11, CDR2 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la Id. de sec. n.° 26 y CDR3 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la Id. de sec. n.° 39.
En algunas realizaciones de la presente descripción, el VHH anti-CLD18A2 incluye una región marco FR(Frame Región),que incluye FR1-FR4 que tiene secuencias de aminoácidos como se muestra a continuación:
(1) FR1 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la Id. de sec. n.° 1, FR2 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la Id. de sec. n.° 12, FR3 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la Id. de sec. n.° 27 y FR4 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la Id. de sec. n.° 40; o
(2) FR1 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la Id. de sec. n.° 2, FR2 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la Id. de sec. n.° 13, FR3 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la Id. de sec. n.° 28 y FR4 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la Id. de sec. n.° 41; o
(3) FR1 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la Id. de sec. n.° 3, FR2 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la Id. de sec. n.° 14, FR3 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la Id. de sec. n.° 29 y FR4 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la Id. de sec. n.° 41; o
(4) FR1 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la Id. de sec. n.° 1, FR2 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la Id. de sec. n.° 15, FR3 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la Id. de sec. n.° 30 y FR4 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la Id. de sec. n.° 41; o
(5) FR1 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la Id. de sec. n.° 2, FR2 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la Id. de sec. n.° 16, FR3 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la Id. de sec. n.° 31 y FR4 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la Id. de sec. n.° 41; o
(6) FR1 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la Id. de sec. n.° 2, FR2 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la Id. de sec. n.° 13, FR3 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la Id. de sec. n.° 31 y FR4 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la Id. de sec. n.° 41; o
(7) FR1 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la Id. de sec. n.° 1, FR2 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la Id. de sec. n.° 17, FR3 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la Id. de sec. n.° 30 y FR4 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la Id. de sec. n.° 41; o
(8) FR1 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la Id. de sec. n.° 2, FR2 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la Id. de sec. n.° 18, FR3 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la Id. de sec. n.° 32 y FR4 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la Id. de sec. n.° 41.
En algunas realizaciones de la presente descripción, la secuencia de aminoácidos del VHH anti-CLD18A2 incluye:
a) una secuencia de aminoácidos representada por una de la Id. de sec. n.° 42-49; o
b) una secuencia de aminoácidos con al menos un 80 % de identidad de secuencia con una de la Id. de sec. n.° 42-49 y que tiene la función de la secuencia de aminoácidos definida en a).
En algunas realizaciones de la presente descripción, el VHH anti-CLD18A2 es un anticuerpo humanizado. Preferiblemente, la secuencia de aminoácidos del VHH anti-CLD18A2 está representada por una de la Id. de sec. n.° 67-90.
Otro aspecto de la presente descripción proporciona una proteína de fusión de un VHH anti-CLD18A2, que incluye un primer dominio y un segundo dominio para prolongar la semivida del VHHin vivoy/o tener un efecto de unión sobre las células efectoras, en donde el segundo dominio comprende uno o más fragmentos de albúmina sérica, fragmento de polietilenglicol y VHH que se une a HSA; y/o el segundo dominio comprende una región Fc de inmunoglobulina, preferiblemente seleccionada de una Fc de inmunoglobulina humana; y/o el segundo dominio es un dominio que es capaz de unirse al receptor CD3 presente en las células T.
En algunas realizaciones de la presente descripción, la inmunoglobulina se selecciona entre una o más de las IgG, IgA1, IgA2, IgD, IgE e IgM, y la IgG se selecciona entre uno o más de los subtipos IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4.
En algunas realizaciones de la presente descripción, la secuencia de aminoácidos de la región Fc de la inmunoglobulina se selecciona de una de la Id. de sec. n.° 91-95.
En algunas realizaciones de la presente descripción, se proporciona un péptido de conexión entre el primer dominio y el segundo dominio.
En algunas realizaciones de la presente descripción, el péptido conector se selecciona de una cadena polipeptídica flexible compuesta de alanina y/o serina y/o glicina, y la longitud del péptido conector es de 3-40 aminoácidos.
Otro aspecto de la presente descripción proporciona un polinucleótido aislado, que codifica el VHH o la proteína de fusión.
Otro aspecto de la presente descripción proporciona un vector de expresión, que incluye el polinucleótido aislado.
Otro aspecto de la presente descripción proporciona un sistema de expresión de anticuerpos, que incluye el vector de expresión o comprende el polinucleótido aislado.
Otro aspecto de la presente descripción proporciona un método para preparar el VHH o la proteína de fusión, que incluye las siguientes etapas: cultivar el sistema de expresión del anticuerpo en condiciones adecuadas para expresar el anticuerpo, expresar así el anticuerpo, y purificar y aislar el anticuerpo.
Otro aspecto no reivindicado de la presente descripción proporciona un inmunoconjugado, que incluye el VHH o la proteína de fusión.
En algunas realizaciones no reivindicadas de la presente descripción, el inmunoconjugado incluye además una porción de acoplamiento, y la porción de acoplamiento incluye uno o más de un marcador detectable, una citotoxina, un radioisótopo y una proteína biológicamente activa.
Otro aspecto no reivindicado de la presente descripción proporciona un kit de detección, que incluye el VHH, la proteína de fusión o el inmunoconjugado.
Otro aspecto de la presente descripción proporciona una composición farmacéutica, que incluye el VHH o la proteína de fusión.
En algunas realizaciones de la presente descripción, la composición farmacéutica incluye además un portador farmacéuticamente aceptable.
Otro aspecto no reivindicado de la presente descripción proporciona una célula, que incluye un polipéptido unido a la membrana, y la célula es un linfocito T, un macrófago o una célula NK. El polipéptido incluye un dominio de reconocimiento de antígenos, una región bisagra, una región transmembrana y un dominio de señal intracelular; el dominio de reconocimiento de antígenos incluye el VHH.
Otro aspecto de la presente descripción proporciona el VHH, la proteína de fusión o la composición farmacéutica para su uso en el diagnóstico, tratamiento o prevención de una enfermedad asociada con células que expresan CLD18A2. En algunos casos de la presente descripción, la enfermedad asociada con las células que expresan CLD18A2 se selecciona de un tumor, y el tumor se selecciona del grupo que consiste en cáncer gástrico, cáncer de esófago, cáncer de páncreas, cáncer de pulmón, cáncer de ovario, cáncer de colon, cáncer de hígado, cáncer de cabeza y cuello y cáncer de vesícula biliar.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 muestra la curva de unión (Elisa) de la proteína de fusión Anti-C18.2-Fc de la presente descripción contra el antígeno de la superficie celular CLD18A2.
La Figura 2 muestra la actividad CDC de la proteína de fusión Anti-C18.2-Fc de la presente descripción.
La Figura 3 muestra la actividad CDC de la proteína de fusión Anti-C18.2-Fc de la presente descripción.
La Figura 4 muestra la actividad ADCC de la proteína de fusión Anti-C18.2-Fc de la presente descripción.
La Figura 5 muestra el efecto inhibidor de la proteína de fusión Anti-C18.2-Fc de la presente descripción sobre el crecimiento tumoral en ratonesin vivo.
La Figura 6 muestra la curva de unión de la proteína de fusión anti-CLDN18xCD3 de la presente descripción contra CHO-S-CLD18A2.
La Figura 7 muestra la curva de unión de la proteína de fusión anti-CLDN18xCD3 de la presente descripción contra las células Jurkat.
La Figura 8 muestra el efecto destructor de la proteína de fusión anti-CLDN18xCD3 de la presente descripción sobre NUGC-4-CLD18A2 invitro.
La Figura 9 muestra el efecto destructor de la proteína de fusión anti-CLDN18xCD3 de la presente descripción sobre el NUGC-4-CLD18A1in vitro.
La Figura 10 muestra el efecto inhibidor de la proteína de fusión anti-CLDN18xCD3 de la presente descripción sobre el crecimiento tumoral en ratonesin vivo.
La Figura 11 muestra los resultados de la liberación de citocinasin vitrodespués de que el NUGC-4-CLD18A2 y el NUGC-4-CLD18A1 se trataran con células aC18.2-CAR-T de la presente descripción.
La Figura 12 muestra el efecto inhibidor de las células aC18.2-CAR-T de la presente descripción sobre el crecimiento tumoral en ratonesin vivo.
Descripción detallada
Después una investigación en profundidad, la presente descripción proporciona un VHH capaz de unirse específicamente al epítopo de CLD18A2 y, además, proporciona una proteína de fusión que incluye el VHH. La proteína tiene una buena especificidad y afinidad por Cl D18A2 y tiene un efecto de supresión tumoral notable. La presente descripción se completa sobre esta base.
El término “ anticuerpo” o “ inmunoglobulina” en el presente documento, ya sea que se refiera a un anticuerpo de cadena pesada o a un anticuerpo de 4 cadenas convencional, se usa como término general para incluir un anticuerpo de longitud completa, una cadena sencilla del mismo y todas sus porciones, dominios o fragmentos (incluidos, entre otros, los dominios o fragmentos de unión al antígeno, tales como los dominios VHH o los dominios VH/VL, respectivamente). Además, el término “ secuencia” tal como se usa en el presente documento (por ejemplo, en términos tales como “ secuencia de inmunoglobulina” , “ secuencia de anticuerpos” , “ secuencia de dominio variable único” , “ secuencia de VHH” o “ secuencia de proteínas” ) generalmente debe entenderse que incluye tanto una secuencia de aminoácidos correspondiente como una secuencia de ácido nucleico o secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia, a menos que se requiera una explicación más limitada en el presente documento.
El término “ anticuerpo monoclonal” se refiere a un anticuerpo compuesto por una sola molécula. Los anticuerpos monoclonales muestran especificidad de unión única y afinidad por epítopos específicos.
El término “ dominio” (de polipéptido o proteína) se refiere a una estructura proteica plegada que puede mantener su estructura terciaria independientemente del resto de la proteína. En términos generales, un dominio es responsable de una única propiedad funcional de una proteína y, en muchos casos, puede añadirse, eliminarse o transferirse a otras proteínas sin perder las funciones del resto de la proteína y/o el dominio.
Los términos “ anticuerpo de cadena pesada (VHH)” y “ nanocuerpo” tienen el mismo significado y se refieren a la región variable de la cadena pesada de un anticuerpo, un anticuerpo de cadena pesada (VHH) que consiste solo en una región variable de cadena pesada. El “ anticuerpo de cadena pesada (VHH)” o “ nanocuerpo” es uno de los fragmentos de unión al antígeno más pequeños con funciones completas. Por lo general, un anticuerpo de cadena pesada (VHH) que consiste en solo una región variable de cadena pesada se construye clonando la región variable de la cadena pesada que carece naturalmente de cadenas ligeras y la región constante de cadena pesada 1 (CH1) del suero de alpaca.
El término “ anticuerpo de cadena pesada (VHH)” se refiere a un dominio de inmunoglobulina que consiste esencialmente en cuatro “ regiones marco” , que se denominan “ región marco 1” o “ FR1” , “ región marco 2” o “ FR2” , “ región marco 3” o “ FR3” y “ región marco 4” o “ FR4” en la técnica y en lo sucesivo. Las regiones marco están separadas por tres “ regiones determinantes de la complementariedad” o “ CDR” que se denominan “ región determinante de la complementariedad 1” o “ CDR1” , “ región determinante de la complementariedad 2” o “ CDR2” y “ región determinante de la complementariedad 3” o “ CDR3” en la técnica y en lo sucesivo. Por lo tanto, la estructura o secuencia general de un anticuerpo de cadena pesada (VHH) se puede expresar de la siguiente manera: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4. Los anticuerpos de cadena pesada (VHH) tienen sitios de unión al antígeno que dotan al anticuerpo de especificidad para los antígenos.
Los términos “ anticuerpo de dominio único de cadena pesada” , “ dominio VHH” , “VHH” , “ fragmento de anticuerpo VHH” , “ anticuerpo VHH” y “ nanocuerpo” (“ Nanobody” es una marca comercial de Ablynx NY, Gante, Bélgica) se pueden usar indistintamente.
El término “ sistema de numeración IMGT” se refiere a un sistema de información integrado específicamente para la inmunoglobulina (IG), el receptor de células T (TCR) y el complejo principal de histocompatibilidad (MHC) de humanos y otros vertebrados, a saber, THE INTERNATIONAL IMMUNOGENETICS INFORMATION SYSTEM ® (Lafranc y col., 2003, Dev.Comp.Immunol. 27(1):55-77). Inicie sesión en IMGT (http://www.imgt.org/IMGT_vquest) para analizar los genes de la cadena ligera y pesada de un anticuerpo para determinar las regiones marco (FR) y las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de la región variable. La “ posición” de CDR en la estructura del dominio variable de la inmunoglobulina se conserva entre las especies y existe en una estructura denominada bucle. Por lo tanto, CDR y el marco se pueden identificar fácilmente mediante el uso de un sistema de numeración que alinea las secuencias de los dominios variables según las características estructurales. Esta información puede usarse para trasplantar y reemplazar un residuo de CDR de inmunoglobulinas de una especie en el marco de un aceptor normalmente derivado de anticuerpos humanos. A menos que se especifique lo contrario, en la especificación, las reivindicaciones y los dibujos de la presente descripción, los VHH anti-CLD18A2 se numeran siguiendo el método de numeración IMGT para determinar las regiones CDR y las regiones FR.
El término “ unión específica” significa una unión que es selectiva para un determinado antígeno y puede distinguirse de interacciones no deseadas o no específicas. La capacidad de un módulo de unión al antígeno para unirse a determinantes antigénicos específicos se puede obtener mediante un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) u otras técnicas bien conocidas por los expertos en la materia, tales como la resonancia de plasmones superficiales (BIAcore) (Liljeblad y col., Glyco J17, 323-329 (2000)) y la inmunofluorescencia.
El término “ anticuerpo humanizado” se refiere a una molécula que tiene un sitio de unión al antígeno derivado sustancialmente de una inmunoglobulina de una especie no humana, y la estructura de inmunoglobulina restante de la molécula se basa en la estructura y/o secuencia de una inmunoglobulina humana. El sitio de unión al antígeno puede incluir un dominio variable completo fusionado a un dominio constante, o solo una región determinante de la complementariedad (CDR) injertada en una región marco apropiada en el dominio variable. El sitio de unión al antígeno puede ser de tipo salvaje o estar modificado por una o más sustituciones de aminoácidos, por ejemplo, modificado para que sea más similar a las inmunoglobulinas humanas. Algunos anticuerpos humanizados retienen todas las secuencias de CDR intactas (por ejemplo, un VHH humanizado que contiene las tres CDR de alpaca). Algunos otros anticuerpos humanizados hacen que una o más CDR cambien en comparación con los anticuerpos originales.
El término “ función efectora” cuando se refiere a anticuerpos se refiere a actividades biológicas que pueden atribuirse a la región Fc del anticuerpo y varían con el isotipo del anticuerpo. Ejemplos de funciones efectoras de los anticuerpos incluyen la unión a C1q y la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), la unión al receptor Fc, la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC), la fagocitosis celular dependiente de anticuerpos (ADCP), la secreción de citocinas, la regulación a la baja de los receptores de la superficie celular (como los receptores de las células B) y la activación de las células B.
La expresión “ citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos” o “ADCC” se refiere a una forma de citotoxicidad en donde las inmunoglobulinas secretadas se unen a los receptores Fc (FcR) presentes en ciertas células citotóxicas (como las células asesinas naturales (NK), los neutrófilos y los macrófagos) y dotan a las células efectoras citotóxicas de la capacidad de unirse específicamente a las células diana que portan el antígeno y, a continuación, destruir las células diana que utilizan una citotoxina. Los anticuerpos “ arman” las células citotóxicas y son absolutamente necesarios para matarlas. Las células NK, las principales células que median la ADCC, solo expresan FcyRIII, mientras que los monocitos expresan FcyRI, FcyRII y FcyRIII. Se sabe que el FcR se expresa en células hematopoyéticas (véase, por ejemplo, Ravetch y Kinet, 1991, Annu. Rev. Immunol. 9:457-92). Para evaluar la actividad de ADCC de una molécula diana, se puede realizar un ensayo de ADCC¡n vitro(véanse, por ejemplo, las patentes estadounidenses números 5.500.362 y 5.821.337). Las células efectoras adecuadas para el ensayo incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y células asesinas naturales (NK).
El término “ citotoxicidad dependiente del complemento” o “ CDC” es otro método de destrucción celular dirigido por anticuerpos. Para la activación del complemento, la IgM es el isotipo más eficaz. Tanto la IgG1 como la IgG3 también son muy eficaces para dirigir los CDC a través de la vía clásica de activación del complemento. Preferiblemente, en esta cascada, la formación de complejos antígeno-anticuerpo conduce a la exposición de múltiples sitios de unión a C1q adyacentes a los dominios c H2 de las moléculas de anticuerpo participantes (por ejemplo, moléculas de IgG) (C1q es uno de los tres subcomponentes del complemento C1). Preferiblemente, los sitios de unión a C1q expuestos convierten la interacción C1q-IgG previamente de baja afinidad en una interacción de alta afinidad, lo que desencadena una cascada que incluye una serie de otras proteínas del complemento y provoca la liberación quimiotáctica/activadora de C3a y C5a de las células efectoras. La cascada del complemento finalmente forma un complejo de ataque a la membrana, que crea poros en la membrana celular para permitir que el agua y los solutos entren y salgan libremente de la célula.
El término “ CD3” se refiere al complejo de múltiples subunidades de la proteína CD3 humana. El complejo CD3 está compuesto por 6 cadenas polipeptídicas diferentes. Estas cadenas polipeptídicas incluyen la cadena CD3 (SwissProt P09693), la cadena CD38 (SwissProt P04234), dos cadenas CD3 (SwissProt P07766) y un homodímero de cadena CD3 (SwissProt 20963) asociado con las cadenas a y p del receptor de células T. El término “ CD3” incluye cualquier variante, isómero y ortólogo de CD3 que las células (incluidas las células T) expresen de forma natural o que puedan expresarse en células transfectadas con genes o ADNc que codifican estos polipéptidos, a menos que se indique lo contrario. El grupo de diferenciación 3 (CD3) en la superficie de las células T es un correceptor de los receptores de las células T y ayuda a la activación de las células T citotóxicas.
La “ identidad de secuencia” entre dos secuencias polipeptídicas indica el porcentaje de aminoácidos idénticos entre las secuencias. La “ similitud de secuencia” indica el porcentaje de aminoácidos conservadores idénticos o representativos entre diferentes secuencias. Los expertos en la materia conocen métodos para evaluar el grado de identidad de secuencia entre secuencias de aminoácidos o secuencias de nucleótidos. Por ejemplo, la identidad de la secuencia de aminoácidos normalmente se mide usando un software de análisis de secuencias. Por ejemplo, el programa BLAST de la base de datos del NCBI se puede usar para determinar la identidad.
Los términos “ receptor de antígeno quimérico” y “ CAR” son receptores artificiales que imitan la función del TCR y están compuestos por un dominio de reconocimiento de antígenos, una región bisagra, una región transmembrana y un dominio de señal intracelular conectados en secuencia. Cuando el antígeno (receptor) de la superficie de la célula tumoral se une al anticuerpo (ligando) del receptor de antígeno quimérico, la señal se transmite a la célula a través de la región bisagra y la región transmembrana. El dominio de señal intracelular convierte entonces la señal en una señal de activación para activar las células efectoras. Las células efectoras destruyen las células tumorales secretando perforina o citocinas. Al mismo tiempo, las propias células efectoras también se amplifican para mejorar aún más el efecto de destrucción inmunológica.
La “ cantidad eficaz” de un agente se refiere a la cantidad necesaria para provocar cambios fisiológicos en las células o tejidos a los que se administra el agente.
Una “ cantidad terapéuticamente eficaz” de un agente, tal como una composición farmacéutica, se refiere a una cantidad para lograr los resultados terapéuticos o preventivos deseados con la dosis y el período de tiempo necesarios. Por ejemplo, una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente puede eliminar, reducir, retrasar, minimizar o prevenir los efectos adversos de una enfermedad.
Un “ individuo” o “ sujeto” es un mamífero. Los mamíferos incluyen, pero no se limitan a, animales domesticados (tales como vacas, ovejas, gatos, perros y caballos), primates (humanos y primates no humanos tales como monos), conejos y roedores (tales como ratones y ratas). Preferiblemente, el individuo o sujeto es un ser humano.
El término “ composición farmacéutica” se refiere a una formulación que hace que el ingrediente activo contenido en ella sea biológicamente activo y no contiene otros ingredientes que tengan una toxicidad inaceptable para un sujeto al que se administra la composición.
El término “ transportador farmacéuticamente aceptable” se refiere a ingredientes distintos de los ingredientes activos de la composición farmacéutica que no son tóxicos para el sujeto. Los portadores farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no se limitan a, tampones, excipientes, estabilizantes o conservantes.
El término “tratamiento/prevención” (y sus variantes gramaticales) se refiere a un intento de cambiar el curso natural de una enfermedad en un individuo a tratar, y puede ser para la prevención o la intervención clínica implementada durante el curso de la patología clínica. Los efectos terapéuticos deseados incluyen, pero se limitan a, prevenir la aparición o recurrencia de una enfermedad, aliviar los síntomas, reducir cualquier consecuencia patológica directa o indirecta de la enfermedad, prevenir la metástasis, ralentizar la velocidad de progresión de la enfermedad, mejorar o aliviar el estado de la enfermedad y evitar o mejorar el pronóstico. En algunos casos, el anticuerpo de la presente descripción se usa para retrasar la formación de una enfermedad o retrasar la progresión de una enfermedad.
El término “ antígeno” es un antígeno predeterminado al que se puede unir selectivamente un anticuerpo. El antígeno diana puede ser un polipéptido, una proteína, un ácido nucleico, una célula, un lípido, un hapteno u otro compuesto sintético o de origen natural. En algunas realizaciones de la presente descripción, el antígeno diana es una célula que expresa CLD18A2, más preferiblemente, el antígeno diana es una porción de la molécula CLD18A2 expresada.
El término “ método de cribado sustractivo de células enteras” es una tecnología de cribado de alto rendimiento desarrollada en la tecnología de visualización de fagos en los últimos años. El método de cribado sustractivo de células enteras utiliza células pareadas durante la exploración sustractiva de una biblioteca de fagos, y los péptidos cortos que se unen a las células diana con alta afinidad se pueden analizar en poco tiempo.
Un “ epítopo” es un sitio en la superficie de una molécula de antígeno que es reconocido y unido por una sola molécula de anticuerpo, tal como una región localizada en la superficie del antígeno que es capaz de unirse a una o más regiones de unión al antígeno de un anticuerpo y que tiene actividad antigénica o inmunogénica para desencadenar una respuesta inmunitaria en animales como los mamíferos (por ejemplo, los seres humanos). El epítopo con actividad inmunogénica es la porción del polipéptido que desencadena una respuesta de anticuerpos en los animales. Un epítopo que tiene actividad antigénica es una porción de un polipéptido unida a un anticuerpo, tal como se determina mediante cualquier método bien conocido en la técnica, incluido, por ejemplo, mediante inmunoensayo. Los epítopos antigénicos no son necesariamente inmunogénicos. Los epítopos suelen estar compuestos por grupos de moléculas superficiales químicamente activas (como aminoácidos o cadenas laterales de azúcar) y tienen características estructurales tridimensionales específicas, así como características de carga específicas. Los epítopos pueden ser epítopos lineales o epítopos conformacionales. Los epítopos lineales están formados por secuencias de aminoácidos contiguas en las proteínas. Los epítopos conformacionales están formados por aminoácidos que no son contiguos en la secuencia de la proteína, sino que se unen después de que la proteína se pliega en una estructura tridimensional. Un epítopo inducido se forma cuando la estructura tridimensional de una proteína se altera después de la activación o unión a otra proteína o ligando. En ciertos casos, el epítopo CLD18A2 es una estructura tridimensional. En otras realizaciones, el epítopo CLD18A2 es una estructura lineal. En general, los antígenos tienen varios epítopos diferentes y reaccionan con muchos anticuerpos diferentes.
VHH
Un primer aspecto de la presente descripción proporciona un VHH anti-CLD18A2. Una región determinante de la complementariedad (CDR -Complementarity Determining Región)no reivindicada del VHH anti-CLD18A2 incluye las CDR1-CDR3 que tienen secuencias de aminoácidos como se muestra a continuación: CDR1 tiene una secuencia de aminoácidos representada por una de la Id. de sec. n.° 4-11, CDR2 tiene una secuencia de aminoácidos representada por una de la Id. de sec. n.° 19-26 y CDR3 tiene una secuencia de aminoácidos representada por una de la Id. de sec. n.° 33-39. Según la invención, CDR del VHH anti-CLD18A2 incluye CDR1-CDR3 que tienen secuencias de aminoácidos como se muestra a continuación:
(1) CDR1 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la Id. de sec. n.° 4, CDR2 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la Id. de sec. n.° 19 y CDR3 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la Id. de sec. n.° 33; o
(2) CDR1 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la Id. de sec. n.° 5, CDR2 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la Id. de sec. n.° 20 y CDR3 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la Id. de sec. n.° 34; o
(3) CDR1 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la Id. de sec. n.° 6, CDR2 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la Id. de sec. n.° 21 y CDR3 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la Id. de sec. n.° 35; o
(4) CDR1 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la Id. de sec. n.° 7, CDR2 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la Id. de sec. n.° 22 y CDR3 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la Id. de sec. n.° 36; o
(5) CDR1 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la Id. de sec. n.° 8, CDR2 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la Id. de sec. n.° 23 y CDR3 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la Id. de sec. n.° 37; o
(6) CDR1 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la Id. de sec. n.° 9, CDR2 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la Id. de sec. n.° 24 y CDR3 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la Id. de sec. n.° 38; o
(7) CDR1 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la Id. de sec. n.° 10, CDR2 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la Id. de sec. n.° 25 y CDR3 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la Id. de sec. n.° 36; o
(8) CDR1 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la Id. de sec. n.° 11, CDR2 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la Id. de sec. n.° 26 y CDR3 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la Id. de sec. n.° 39;
El antígeno VHH anti-CLD18A2 de la presente descripción puede incluir una región marco FR, que incluye FR1-FR4 que tiene secuencias de aminoácidos como se muestra a continuación:
(1) FR1 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la Id. de sec. n.° 1, FR2 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la Id. de sec. n.° 12, FR3 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la Id. de sec. n.° 27 y FR4 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la Id. de sec. n.° 40; o
(2) FR1 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la Id. de sec. n.° 2, FR2 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la Id. de sec. n.° 13, FR3 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la Id. de sec. n.° 28 y FR4 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la Id. de sec. n.° 41; o
(3) FR1 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la Id. de sec. n.° 3, FR2 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la Id. de sec. n.° 14, FR3 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la Id. de sec. n.° 29 y FR4 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la Id. de sec. n.° 41; o
(4) FR1 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la Id. de sec. n.° 1, FR2 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la Id. de sec. n.° 15, FR3 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la Id. de sec. n.° 30 y FR4 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la Id. de sec. n.° 41; o
(5) FR1 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la Id. de sec. n.° 2, FR2 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la Id. de sec. n.° 16, FR3 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la Id. de sec. n.° 31 y FR4 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la Id. de sec. n.° 41; o
(6) FR1 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la Id. de sec. n.° 2, FR2 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la Id. de sec. n.° 13, FR3 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la Id. de sec. n.° 31 y FR4 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la Id. de sec. n.° 41; o
(7)FR1 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la Id. de sec. n.° 1, FR2 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la Id. de sec. n.° 17, FR3 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la Id. de sec. n.° 30 y FR4 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la Id. de sec. n.° 41; o
(8) FR1 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la Id. de sec. n.° 2, FR2 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la Id. de sec. n.° 18, FR3 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la Id. de sec. n.° 32 y FR4 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la Id. de sec. n.° 41.
La secuencia de aminoácidos de VHH anti-CLD18A2 de la presente descripción puede incluir: a) una secuencia de aminoácidos representada por una de la Id. de sec. n.° 42-49; o b) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con una de la Id. de sec. n.° 42-49 y que tiene la función de la secuencia de aminoácidos definida en a). Específicamente, la secuencia de aminoácidos en b) se refiere específicamente a: un fragmento de polipéptido obtenido sustituyendo, eliminando o añadiendo uno o más (específicamente 1-50, 1-30, 1 20, 1-10, 1-5 o 1-3) aminoácidos en una secuencia de aminoácidos como se muestra en una de la Id. de sec. n.° 42 49, o añadiendo uno o más (específicamente 1-50, 1-30, 1-20, 1-10, 1-5 o 1-3) aminoácidos al N-terminal y/o C-terminal de una secuencia de aminoácidos como la que se muestra en una de SEQ ID No. 42-49, y que tiene una función (por ejemplo, la capacidad de unirse específicamente a CLD18A2) de un fragmento de polipéptido como se muestra en una de SEQ ID No. 42-49. La secuencia de aminoácidos de b) puede tener al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 93 %, al menos un 95 %, al menos un 97 % o al menos un 99 % de homología con una de la Id. de sec. n.° 42-49. El VHH anti-CLD18A2 de la presente descripción puede unirse específicamente a las células que expresan CLD18A2. Por ejemplo, el VHH anti-CLD18A2 puede unirse a células que expresan CLD18A2 o puede no unirse a células que no expresan CLD18A2 pero que expresan CLD18A1. Es decir, el VHH anti-CLD18A2 solo reconoce el CLD18A2 pero no el CLD18A1.
El VHH anti-CLD18A2 de la presente descripción puede ser un anticuerpo humanizado. La humanización puede reducir eficazmente la inmunogenicidad del anticuerpo. El VHH humanizado puede retener al menos una propiedad funcional del anticuerpo, por ejemplo, la capacidad de unirse específicamente al CLD18A2. En una realización específica de la presente descripción, la secuencia de aminoácidos del VHH humanizado anti-CLD18A2 está representada por una de la Id. de sec. n.° 67-90.
Proteína de fusión
Un segundo aspecto de la presente descripción proporciona una proteína de fusión de un VHH anti-CLD18A2, que incluye un primer dominio del VHH proporcionado en el primer aspecto de la presente descripción, y un segundo dominio para prolongar la semividain vivoy/o unirse a células efectoras. La proteína de fusión puede unirse específicamente a las células que expresan CLD18A2.
En el segundo dominio, el fragmento para prolongar la semivida invivoincluye un fragmento de albúmina sérica, un fragmento de polietilenglicol o un dominio de unión a HSA (por ejemplo, un VHH de unión a HSA) y similares. En el segundo dominio, el fragmento que se une a las células efectoras puede incluir una región Fc de inmunoglobulina, preferiblemente seleccionada de una región Fc de inmunoglobulina humana. La inmunoglobulina puede seleccionarse entre una o más de las IgG, IgA1, IgA2, IgD, IgE e IgM, y la IgG puede seleccionarse específicamente entre uno o más de los subtipos IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. La región Fc de la inmunoglobulina contenida en la proteína de fusión VHH permite que la proteína de fusión forme un dímero, al tiempo que prolonga la vida media de la proteína de fusióninvivo y aumenta las funciones mediadas por la Fc. En una realización específica de la presente descripción, la región Fc de la inmunoglobulina puede ser una región Fc de la IgG1 humana, más específicamente una secuencia Fc de la IgG1 de tipo silvestre, que puede introducirse con una mutación para alterar una función efectora mediada por el Fc, por ejemplo, a) una mutación para alterar la actividad de CDC mediada por Fc; b) una mutación para alterar la actividad de la ADCC mediada por Fc; o b) una mutación para alterar la actividad de la ADCP mediada por Fc. En otra realización específica de la presente descripción, la secuencia de aminoácidos de la región Fc de inmunoglobulina se selecciona de una de la Id. de sec. n.° 91-95. El segundo dominio es un dominio que se une al grupo de diferenciación 3 (CD3) en las células T. Preferiblemente, la molécula es un VHH anti-CD3 que tiene una secuencia de aminoácidos que se muestra en la Id. de sec. n.° 131.
En la proteína de fusión VHH anti-CLD18A2 de la presente descripción, se puede proporcionar un péptido de conexión entre el primer dominio y el segundo dominio. El péptido conector puede ser una cadena polipeptídica flexible compuesta de alanina (A) y/o serina (S) y/o glicina (G). La longitud del péptido conector puede ser de 3-40 aminoácidos, preferiblemente de 3-9 aminoácidos, 9-12 aminoácidos, 12-16 aminoácidos, 16-20 aminoácidos, 20-25 aminoácidos, 25-30 aminoácidos, 30-35 aminoácidos o 35-40 aminoácidos. En otra realización específica de la presente descripción, el péptido conector puede tener 8 o 15 o 35 aminoácidos.
En una realización preferida, al usar suero de personas sanas como fuente de complemento, el Anti-C18.2-Fc destruyó las células positivas para CLD18A2, y la proporción de lisis celular es mayor que la del control positivo ch-175D10.
En otra realización preferida, la proteína de fusión anti-CLDN18xCD3 tiene una porción de reconocimiento tumoral Anti-C18.2, y el otro brazo de la molécula es específico para los antígenos de las células T (brazo de unión a las células efectoras) (principalmente CD3). Al unirse a los antígenos diana al mismo tiempo, los linfocitos T se dirigen a las células tumorales y se activan en las células tumorales, donde los linfocitos T pueden realizar su función citolítica. La porción anti-CD3 puede unirse al CD3 en el complejo receptor del TCR en la superficie de las células T y puede proporcionar la primera señal para la activación de las células T (similar a la unión de los complejos MHC-péptido de las células presentadoras de antígenos al TCR), lo que facilita la activación de las células T. La proteína de fusión anti-CLDN18*CD3 contiene un dominio para la unión al CD3 y el enriquecimiento de las células T alrededor de las células tumorales y mejora la eficacia de destrucción de las células T en las células tumorales.
Polinucleótido aislado
Un tercer aspecto de la presente descripción proporciona un polinucleótido aislado, que codifica el VHH proporcionado por el primer aspecto de la presente descripción o la proteína de fusión proporcionada por el segundo aspecto de la presente descripción. El polinucleótido puede ser ARN, ADN, ADNc o similares. El método para proporcionar el polinucleótido aislado debe ser conocido por los expertos en la materia. Por ejemplo, el polinucleótido aislado puede prepararse mediante síntesis automática de ADN y/o tecnología de ADN recombinante, o puede aislarse de una fuente natural adecuada. En una realización específica de la presente descripción, la secuencia de ácido nucleico del polinucleótido aislado se muestra en una de la Id. de sec. n.°: 119-130.
Vector de expresión
Un cuarto aspecto de la presente descripción proporciona un vector de expresión, que incluye el polinucleótido aislado proporcionado por el tercer aspecto de la presente descripción. Los expertos en la materia deben conocer el método para construir el vector de expresión. Por ejemplo, el vector de expresión puede construirse mediante ADN recombinantein vitro,síntesis de ADN, recombinaciónin vivoy otros métodos. Más específicamente, el vector de expresión puede construirse insertando el polinucleótido aislado en un sitio de clonación múltiple de un vector de expresión. El vector de expresión de la presente descripción generalmente se refiere a varios vectores de expresión disponibles en el mercado que son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, los vectores de expresión pueden ser plásmidos bacterianos, bacteriófagos, plásmidos de levaduras, virus de células vegetales, virus de células de mamíferos tales como adenovirus y retrovirus, u otros vectores. El vector puede incluir además una o más secuencias reguladoras conectadas operativamente a la secuencia polinucleotídica, y las secuencias reguladoras pueden incluir una secuencia promotora adecuada. La secuencia promotora normalmente está conectada operativamente a la secuencia codificante de la secuencia de aminoácidos que se va a expresar. El promotor puede ser cualquier secuencia de nucleótidos que muestre actividad transcripcional en la célula hospedadora seleccionada, incluidos los promotores mutantes, truncados e híbridos, y puede obtenerse de genes que codifican polipéptidos extracelulares o intracelulares que son homólogos o heterólogos a la célula hospedadora. La secuencia reguladora puede incluir además una secuencia terminadora de la transcripción adecuada, que es una secuencia reconocida por la célula hospedadora para terminar la transcripción. La secuencia terminadora está conectada al extremo 3' de la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido. En la presente descripción se puede usar cualquier terminador que sea funcional en la célula hospedadora seleccionada.
En términos generales, un vector adecuado puede contener un origen de replicación que funcione en al menos un organismo, una secuencia promotora, un sitio conveniente para la enzima de restricción y uno o más marcadores seleccionables. Por ejemplo, estos promotores pueden incluir, pero no se limitan a, los promotores lac o trp de Escherichia coli(E. coli),el promotor PL del fago lambda, los promotores eucariotas (incluido el promotor temprano inmediato del CMV, el promotor de la timidina quinasa del HSV, los promotores del SV40 temprano y tardío, el promotor de la metanoloxidasa dePichia pastoris)y otros promotores bien conocidos que son capaces de controlar la expresión génica en procélulas cariotas o células eucariotas o virus. Los genes marcadores pueden usarse para proporcionar caracteres fenotípicos para la selección de células hospedadoras transformadas. Por ejemplo, los genes marcadores pueden incluir, pero no se limitan a, la dihidrofolato reductasa, la resistencia a la neomicina y la proteína verde fluorescente (GFP) para el cultivo de células eucariotas, o la resistencia a la tetraciclina o la resistencia a la ampicilina paraE. coli.Cuando se expresa el polinucleótido, el vector de expresión puede incluir además una secuencia potenciadora. La transcripción se potenciará si la secuencia potenciadora se inserta en el vector. Los potenciadores son factores de acción en cis del ADN, que contienen normalmente entre 10-300 pares de bases. Los potenciadores actúan sobre los promotores para mejorar la transcripción génica.
Sistema de expresión
Un quinto aspecto de la presente descripción proporciona un sistema de expresión de anticuerpos, que incluye el vector de expresión proporcionado por el cuarto aspecto de la presente descripción o incorpora el polinucleótido exógeno proporcionado por el tercer aspecto de la presente descripción en el genoma. Cualquier célula adecuada para la expresión de un vector de expresión puede actuar como célula hospedadora. Por ejemplo, la célula hospedadora puede ser una célula procariota, tal como una célula bacteriana; o una célula eucariota inferior, tal como una célula de levadura; o una célula eucariota superior, tal como una célula de mamífero, que incluye específicamente, pero no se limita a, E. coli y Streptomyces; o una célula bacteriana deSalmonella typhimurium;o una célula fúngica tal como una célula de levadura, una célula de hongo filamentoso o una célula vegetal; o una célula de insecto de Drosophila S2 o Sf9; o una o más de las células CHO, células COS, células HEK293 y una célula animal tal como una célula de melanoma de Bowes. El método para construir el sistema de expresión debe ser conocido por los expertos en la materia. Por ejemplo, los métodos para construir el sistema de expresión pueden incluir, pero no se limitan a, uno o más de los siguientes: microinyección, pistola génica, electroporación, transformación mediada por virus, bombardeo de electrones y precipitación con fosfato de calcio.
Inmunoconjugado
Un sexto aspecto, pero no reivindicado, de la presente descripción proporciona un inmunoconjugado, que incluye el VHH proporcionado por el primer aspecto de la presente descripción o la proteína de fusión proporcionada por el segundo aspecto de la presente descripción. El inmunoconjugado normalmente incluye una porción de acoplamiento, y la porción de acoplamiento puede incluir, pero no se limita a, uno o más de un marcador detectable, una citotoxina, un radioisótopo y una proteína biológicamente activa. El método para preparar el inmunoconjugado debe ser conocido por los expertos en la materia. Por ejemplo, el VHH y/o la proteína de fusión y la porción de acoplamiento pueden conectarse directamente o mediante un espaciador de una longitud adecuada para obtener el inmunoconjugado mediante reticulación química o expresión de fusión por ingeniería genética. Para fines terapéuticos, pueden ser adecuados los grupos efectores terapéuticos tales como los grupos radiactivos. Los grupos radiactivos se componen de radioisótopos o radionúclidos (por ejemplo, 3H, 14C, 15N, 33P, 35S, 90Y, 99Tc, 111ln, 123l, 125l, 131l, 201TI, 213Bi), una toxina o un grupo citotóxico tal como un agente citostático, o un grupo que incluye el mismo. Por otro lado, el polipéptido de la presente descripción se puede acoplar con un grupo marcador (polipéptido marcado), que luego se puede usar, por ejemplo, con fines de diagnóstico. Grupos marcadores adecuados pueden seleccionarse entre radioisótopos (tales como los mencionados anteriormente), grupos que contienen radioisótopos o radionúclidos, grupos fluorescentes (por ejemplo, proteínas fluorescentes (tales como GFP y RFP), colorantes, rodamina, fluoresceína y derivados de las mismas (tales como colorantes FITC y cianina)), grupos enzimáticos (por ejemplo, peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, p-galacacina) tosidasa), grupos quimioluminiscentes, grupos de biotina, partículas metálicas (por ejemplo, partículas de oro), partículas magnéticas (por ejemplo, que tienen un núcleo que contiene magnetita (Fe3O4) y/o maghemita (Fe2O3), grupos polipeptídicos predeterminados y similares.
Kit de detección
Un séptimo aspecto de la presente descripción, pero no reivindicado, proporciona un kit de detección, que incluye el VHH proporcionado por el primer aspecto de la presente descripción, la proteína de fusión proporcionada por el segundo aspecto de la presente descripción o el inmunoconjugado proporcionado por el sexto aspecto de la presente descripción. El kit puede incluir además un recipiente, un control (un control negativo o positivo), un tampón, un agente auxiliar y similares según sea necesario, que los expertos en la materia pueden seleccionar basándose en condiciones específicas.
La presente descripción proporciona además un método de detección, que puede usarse para detectar la proteína CLD18A2. El método de detección puede incluir: obtener una muestra de células y/o tejidos; disolver la muestra en un medio; y detectar la proteína CLD18A2 en la muestra disuelta. En una realización específica de la presente descripción, el objeto de detección puede ser una muestra que contiene células que existe en una solución de conservación celular. En otra realización específica de la presente descripción, el VHH se conjuga además con colorantes fluorescentes, productos químicos, polipéptidos, enzimas, isótopos o etiquetas que pueden usarse para la detección o pueden detectarse mediante otros reactivos.
Composición farmacéutica
Un octavo aspecto de la presente descripción proporciona una composición farmacéutica, que incluye el VHH anti-CLD18A2 proporcionado por el primer aspecto de la presente descripción, o la proteína de fusión VHH anti-CLD18A2 proporcionada por el segundo aspecto de la presente descripción.
La composición farmacéutica puede incluir además diversos portadores farmacéuticamente aceptables en la técnica. Los portadores farmacéuticamente aceptables no son tóxicos para el receptor a la dosis y concentración utilizadas, y pueden incluir específicamente, pero no se limitan a: tampones, tales como acetato, tris, fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes, incluidos ácido ascórbico y metionina; conservantes (como el cloruro de octadecildimetilbencilamonio); cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio; fenol, butanol o alcohol bencílico; éster alquílico del ácido p-hidroxibenzoico, tal como p-hidroxibenzoato de metilo o p-hidroxibenzoato de propilo; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol); proteínas, como la albúmina sérica, la gelatina o la inmunoglobulina; polímeros hidrófilos, tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos, tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos, incluyendo glucosa, manosa o dextrina; agentes quelantes, tales como EDTA; agentes acondicionadores de tensión, tales como trehalosa y cloruro de sodio; azúcares, tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; surfactantes, tales como polisorbato; contraiones formadores de sal, tales como sodio; complejos metálicos (como complejos de Zn-proteína); y/o surfactantes no iónicos, tales como TWEEN®, PLURONICS® o polietilenglicol (PEG). Las preparaciones farmacéuticas para la administración in vivo son generalmente estériles. Los expertos en la materia deben conocer los métodos para lograr la esterilidad de las preparaciones farmacéuticas. Por ejemplo, la esterilidad puede lograrse mediante métodos tales como el método de filtración por membrana estéril. Los expertos en la materia pueden seleccionar un portador farmacéuticamente aceptable adecuado según la forma de dosificación requerida de la composición farmacéutica, para preparar la composición farmacéutica en diferentes formas de dosificación. Por ejemplo, la composición farmacéutica de la presente descripción se puede preparar en diversas formas de dosificación, que incluyen, pero no se limitan a, comprimidos, inyecciones, agentes liofilizados y similares.
En la composición farmacéutica, el contenido de la proteína de fusión y el inmunoconjugado es normalmente una cantidad eficaz, y el contenido del ingrediente activo correspondiente a la cantidad eficaz se puede determinar según el sujeto a tratar y el modo de administración específico. Por ejemplo, basándose en la masa total de la composición farmacéutica, el contenido de la proteína de fusión y el inmunoconjugado puede ser de aproximadamente 0,01-99 %, 0,1-70 %, 1-30 %, 0,01-0,05 %, 0,05-0,1 %, 0,1-0,3 %, 0,3-0,5 %, 0,5-1 %, 1-3 %, 3-5 %, 5-10 %, 10-20 %, 20-30 %, 30-50 %, 50-70 % o 70-99 %.
La proteína de fusión, el inmunoconjugado y la composición farmacéutica de la presente descripción se pueden administrar como un único componente eficaz, o se pueden administrar en combinación, es decir, en combinación con otros agentes. Por ejemplo, la terapia de combinación puede ser la combinación de la proteína de fusión, el inmunoconjugado o la composición farmacéutica con al menos otro fármaco antitumoral. Para otro ejemplo, la combinación puede ser el uso combinado de la proteína de fusión, el inmunoconjugado o la composición farmacéutica con inhibidores de puntos de control inmunitario. Los inhibidores de puntos de control inmunitario incluyen, pero no se limitan a, uno o más inhibidores de PD-1, inhibidores de PD-L1 e inhibidores de CTLA-4, y los inhibidores pueden ser preferiblemente anticuerpos monoclonales.
Células que expresan receptores de antígenos quiméricos dirigidos a CLD18A2
Un noveno aspecto, pero no reivindicado, de la presente descripción proporciona una célula que expresa un receptor de antígeno quimérico (CAR -Chimeric Antigen Receptor)dirigido a CLD18A2. El CLD18A2 que se dirige a las células normalmente incluye un polipéptido que actúa como un receptor de antígeno quimérico, y el polipéptido puede incluir un dominio de reconocimiento de antígenos, una región bisagra, una región transmembrana y un dominio de señal intracelular. Los expertos en la materia deben conocer los métodos para construir el receptor de antígeno quimérico. Por ejemplo, la región transmembrana puede seleccionarse entre las siguientes: una proteína CD (tal como CD4, CD8, CD3 o CD28), una subunidad del receptor de células T (tal como a, p, y o 8), una subunidad del receptor de IL-2 (cadena a), una subunidad del receptor del factor de crecimiento nervioso de baja afinidad (LNGFR o p75) (cadena p o cadena gamma) o una subunidad del Fc receptor. En una realización específica de la presente descripción, la región transmembrana incluye un dominio transmembrana de CD4, CD8 o CD28. En otra realización específica de la presente descripción, la región transmembrana incluye una región transmembrana de CD4 o CD8 (por ejemplo, la cadena CD8a), como se describe en el número de referencia del NCBI: NP_001139345.1, o un fragmento del mismo). En otra realización específica de la presente descripción, el CAR incluye además una región bisagra entre el dominio de reconocimiento de antígenos y la región transmembrana. En otra realización específica de la presente descripción, la bisagra se selecciona entre<c>D8 (por ejemplo, CD8a) o los dominios CH2 y/o CH3 de IgG1 o IgG4. Ejemplos preferidos de dominios de señal intracelulares para el CAR pueden ser las secuencias citoplasmáticas de los receptores y correceptores de células T naturales (TCR -T Cell Receptors)que actúan sinérgicamente para iniciar la transducción de señales después de la unión al antígeno, o cualquier derivado o variante de estas secuencias, o cualquier secuencia sintética que tenga la misma función. Los dominios de señal intracelular se pueden dividir en dos categorías: los que inician la activación primaria dependiente del antígeno y los que actúan de manera independiente del antígeno para proporcionar señales secundarias o coestimuladoras. El dominio efector de activación primario puede contener un motivo de transducción de señales, que se conoce como motivo de activación basado en tirosina del inmunorreceptor (ITAM -Immunoreceptor Tyrosine-Based Activation Motif).ITAM es un motivo de transducción de señales bien definido, normalmente presente en la cola citoplasmática de una variedad de receptores y que actúa como un sitio de unión para las tirosinas quinasas syk/zap70. Como ejemplos no limitativos, los ejemplos de ITAM usados en la presente descripción pueden incluir los derivados de C<d>3, FcR, Fcrp, FcR, CD3, C<d>3, CD3, CD5, CD22, CD79a, CD79b y CD66d. En una realización específica de la presente descripción, el dominio de señal intracelular incluye un dominio de transducción de señales de CD3 (también denominado CD247). El TCR natural contiene moléculas de transducción de señales CD3, por lo que las construcciones de TCR que utilizan este dominio efector son muy similares a las construcciones de TCR que se encuentran en la naturaleza. En otra realización específica de la presente descripción, el dominio de transducción de señales de CD3 incluye una secuencia descrita en el número de referencia de NCBI: NP_932170, o un fragmento del mismo con actividad activadora o estimulante. Como se describe en la presente descripción, el dominio de señal intracelular también puede proporcionar señales secundarias o coestimuladoras. Las células T incluyen además moléculas coestimuladoras que se unen a ligandos coestimuladores afines en las células presentadoras de antígenos para mejorar las respuestas de las células T, por ejemplo, aumentando la activación de la proliferación, la diferenciación y similares. Por lo tanto, en una realización específica de la presente descripción, el dominio de señal intracelular incluye además un dominio coestimulador. En otra realización específica de la presente descripción, el dominio coestimulador incluye un dominio intracelular de una molécula coestimuladora, que se selecciona entre CD28, CD27, 4-1BB (CD137), OX40 (CD134), ICOS (CD278), CD30, CD40, PD-1 (CD279), CD2, CD7, NKG2C (CD94), B7-H3 (CD276), o cualquier combinación de los mismos. En otra realización más, el dominio coestimulador incluye un dominio intracelular de una molécula coestimuladora, que se selecciona entre CD28, CD27, 4-1BB, OX40, ICOS o cualquier combinación de los mismos. En otra realización específica de la presente descripción, el dominio coestimulador incluye el CD28, por ejemplo, como se describe en el número de referencia de NCBI: NP_006130, o un fragmento del mismo que tenga una actividad activadora o estimulante.
Los expertos en la materia deben conocer los métodos para construir células dirigidas a CLD18A2 a través del receptor de antígeno quimérico. Por ejemplo, las células pueden ser linfocitos T, macrófagos y/o células NK. Cuando el VHH se une al antígeno CLD18A2, los linfocitos T, los macrófagos y/o las células NK pueden activarse y/o estimularse para destruir las células que expresan CLD18A2.
En una realización preferida de la presente descripción, el dominio de reconocimiento de antígenos incluye el VHH proporcionado en el primer aspecto de la presente descripción, la bisagra se selecciona entre CD8, la región transmembrana es CD28 (etiquetada como CD28a en las realizaciones), el dominio coestimulador en el dominio de señal intracelular se selecciona entre CD28 (etiquetada como CD28b en las realizaciones) o una combinación de CD28 y CD137, y el dominio de señal intracelular incluye además un dominio de transducción de señales CD3. En una realización preferida, las células CAR-T dirigidas a CLD18A2 tienen efectos destructores obviosin vitroein vivo.
Uso
Un décimo aspecto de la presente descripción proporciona el VHH proporcionado por el primer aspecto de la presente descripción, la proteína de fusión proporcionada por el segundo aspecto de la presente descripción o la composición farmacéutica proporcionada por el octavo aspecto de la presente descripción, para su uso en el diagnóstico, tratamiento o prevención de enfermedades asociadas con las células que expresan CLD18A2.
La “ cantidad terapéuticamente eficaz” de VHH, la proteína de fusión, el inmunoconjugado y la composición farmacéutica proporcionada por la presente descripción preferiblemente da como resultado una reducción de la gravedad de los síntomas de la enfermedad, un aumento de la frecuencia y la duración de los períodos asintomáticos de la enfermedad o la prevención de lesiones o discapacidades causadas por el dolor de la enfermedad. Por ejemplo, para el tratamiento de tumores positivos para CLD18A2 (por ejemplo, cáncer gástrico), una “ cantidad terapéuticamente eficaz” inhibe preferiblemente el crecimiento celular o el crecimiento tumoral en al menos aproximadamente un 10 % en comparación con los sujetos no tratados, preferiblemente en al menos aproximadamente un 20 %, más preferiblemente en al menos aproximadamente un 30 %, más preferiblemente en al menos aproximadamente un 40 %, más preferiblemente en al menos aproximadamente un 50 %, más preferiblemente en al menos aproximadamente un 60 %, más preferiblemente en al menos aproximadamente un 70 % y más preferiblemente en al menos aproximadamente un 80 %. La capacidad de inhibir el crecimiento tumoral puede evaluarse en un sistema modelo animal que predice la eficacia en tumores humanos. Alternativamente, la capacidad para inhibir el crecimiento tumoral puede evaluarse examinando la capacidad para inhibir el crecimiento celular, y esta inhibición puede determinarse invitromediante ensayos bien conocidos por los expertos en la materia. Una cantidad terapéuticamente eficaz de VHH, proteínas de fusión, inmunoconjugados y composiciones farmacéuticas generalmente puede reducir el volumen del tumor o aliviar de otro modo los síntomas del sujeto. Los expertos en la materia pueden seleccionar una cantidad terapéuticamente eficaz adecuada según la situación real, por ejemplo, la edad del sujeto, la gravedad de los síntomas del sujeto y la composición específica o vía de administración seleccionada. La prescripción del tratamiento (por ejemplo, la decisión sobre la dosificación) puede ser determinada por un médico, y los factores que normalmente se consideran incluyen, pero no se limitan a, la enfermedad a tratar, el estado del paciente individual, el sitio de administración, la vía de administración y otros. Una cantidad eficaz preventiva se refiere a una cantidad eficaz para lograr un efecto preventivo deseado con una dosis y un período de tiempo necesarios. Habitualmente, pero no necesariamente, dado que la dosis preventiva se administra a un sujeto antes del inicio de la enfermedad o en una fase temprana de la enfermedad, la “ cantidad eficaz preventiva” es inferior a la “ cantidad terapéuticamente eficaz” . Ejemplos de enfermedades relacionadas con las células que expresan CLD18A2 que pueden diagnosticarse, tratarse y/o prevenirse mediante la presente descripción pueden incluir todos los tumores que expresan CLD18A2, incluyendo específicamente, pero sin limitarse a, el cáncer gástrico, el cáncer de esófago, el cáncer de páncreas, el cáncer de pulmón, el cáncer de ovario, el cáncer colorrectal, el cáncer de hígado, el cáncer de vesícula biliar y el cáncer de cabeza y cuello. Estos cánceres pueden ser cánceres en estadio temprano, cáncer en estadio intermedio o cáncer avanzado, como el cáncer metastásico.
Las realizaciones de la presente descripción se describirán a continuación a través de realizaciones ilustrativas. Los expertos en la materia pueden entender fácilmente otras ventajas y efectos de la presente descripción según los contenidos descritos en la especificación. La presente descripción también puede implementarse o aplicarse a través de otros modos de implementación específicos diferentes. Se pueden realizar diversas modificaciones o cambios en todos los detalles de la especificación basándose en diferentes puntos de vista y aplicaciones sin apartarse del espíritu de la presente descripción.
Antes de describir adicionalmente las realizaciones específicas de la presente descripción, se entiende que el alcance de la presente descripción no se limita a las realizaciones específicas que se describen a continuación; también debe entenderse que la terminología de la descripción se usa para describir las realizaciones específicas y no para limitar el alcance de la descripción;
Cuando las realizaciones proporcionan valores numéricos, debe entenderse que se pueden seleccionar dos puntos finales de cada intervalo numérico y uno cualquiera entre los dos, a menos que se indique lo contrario. A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente descripción tienen el mismo significado que entiende comúnmente un experto en la técnica. Además del método, el equipo y el material específicos utilizados en las realizaciones, cualquier método, equipo y material de la tecnología existente similar o equivalente al método, equipo y material mencionados en las realizaciones de la presente descripción pueden usarse para realizar la invención según el conocimiento de la tecnología existente y el registro de la invención por parte de los expertos en la materia.
A menos que se indique lo contrario, los métodos experimentales, los métodos de detección y los métodos de preparación descritos en la presente descripción emplean todos técnicas convencionales de biología molecular, bioquímica, estructura y análisis de la cromatina, química analítica, cultivo celular, tecnología de ADN recombinante en el campo técnico y campos relacionados. Estas técnicas están bien descritas en la literatura existente. Para obtener más información, véase Sambrook y col. MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Segunda edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 y Tercera edición, 2001; Ausubel y col., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, New York, 1987 y actualizaciones periódicas; La serie METHODS IN ENZYMOLOGY, Academic Press, San Diego; Wolffe, CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION, Tercera Edición, Academic Press, San Diego, 1998; METHODS IN ENZYMOLOGY, Vol. 304, Chromatin (P.M. Wassarman y A.P. Wolffe, eds.), Academic Press, San Diego, 1999; y METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, vol. 119, Chromatin Protocols (P. B. Becker, ed.) Humana Press, Totowa, 1999 y similares.
Realización 1: Construcción y detección de cepas celulares que expresan CLD18A2
Los vectores pCDNA3.1 (Life Technologies) que contienen los genes de longitud completa de CLD18A1 (secuencia de aminoácidos, Id. de sec. n.° 96) y CLD18A2 (secuencia de aminoácidos, Id. de sec. n.° 97) se extraen respectivamente con un kit de extracción de plásmidos maxiprep (Biomiga). Los plásmidos se someten a filtración estéril y después se electrotransfectan en células CHO-S. Se añade G418 (sigma) mientras se coloca en placas de 96 pocillos para detectar las tinciones celulares transfectadas de forma estable con CHO-S-CLD18A1 y CHO-S-CLD18A2. Las tinciones celulares transfectadas de manera estable en la placa de 96 pocillos se seleccionan, luego se amplifican gradualmente en las condiciones de cultivo con G418 añadido y se detectan mediante transferencia por puntos con el anticuerpo anti-claudina 18 [34H14L15] (ABCAM) para identificar los clones positivos para CLD18A1 y CLD18A2. NUGC-4-CLD18A1 y NUGC-4-CLD18A2 se construyen mediante el mismo método. Las células de adenocarcinoma gástrico NUGC-4 se adquieren de Wuhan GeneCreate Biological Engineering Co., Ltd. La línea celular de adenocarcinoma gástrico NUGC-4 es CLD18A2 negativa según el resultado de la detección.
Realización 2: Construcción de la biblioteca de VHH anti-CLD18A2
Una alpaca sana(Vicugna pacos)se inmuniza con las células transfectadas de forma estable CHO-S-CLD18A2 en la Realización 1 a razón de 1,0 x 107 células/ml, y se inmuniza con 1 ml del adyuvante completo de Freund (Sigma). Veintiún días después, la alpaca se inmuniza nuevamente para un total de 3 inmunizaciones con el fin de estimular las células B para que expresen anticuerpos específicos del antígeno. Una semana después de tres vacunaciones, se extraen 30 ml de sangre de alpaca mediante un tubo de extracción de sangre al vacío. Los linfocitos se aíslan usando el medio de aislamiento de linfocitos (Tianjin HaoyangHuake Biological Technology Co., Ltd.), y el ARN total se extrae con Trizol. Se transcriben de forma inversa 3 |jg de ARN total en ADNc con un kit de transcripción inversa (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante. El VHH se amplifica mediante PCR de nido con los siguientes cebadores: el cebador ascendente 5'-CTTGGTGTCCTGCTGC-3' (Id. de sec. n.° 110) y el cebador descendente 5'-GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC-3' (Id. de sec. n.° 111) de la primera ronda de PCR; la segunda ronda de PCR usa la primera ronda de PCR como plantilla, el cebador ascendente es 5'-CATGCCATGACTGTGGCCCAGGCGCAGKTGCAGKTGCAGKTGCAGCGTGGC-3' (Id. de sec. n.° 112), y el cebador descendente es 5' -CATGCGCCATGCGCGCGGCCGCCGCCGGCCGCCGGCCGGCCGCCGGCCGCCATGGTCGGC G-3' (Id. de sec. n.° 113) o 5'-CATGCCATGACTCGCGCCGGCCGCCGCCGTCTTGTGTTGTTG G-3' (Id. de sec. n.° 114) para la amplificación. Los fragmentos de ácido nucleico VHH diana se recuperan, se digieren mediante la endonucleasa de restricciónSfíl(NEB) y se insertan en un vector de presentación en fagos pcomb3xSS (plásmido Addgene n.° 63890); RRID: Addgene_63890) digerido por la misma endonucleasa y conectado por la ligasa T4 (Takara). El producto de ligación se transforma en células electrocompetentes ER2738 para construir una biblioteca de VHH anti-CLD18A2. La muestra se coloca en placas mediante dilución en gradiente y se determina que el contenido de la biblioteca es de 1,23 x 108. Al mismo tiempo, se seleccionan aleatoriamente 24 clones para la detección por PCR, y los resultados muestran que la tasa de inserción de la biblioteca construida es del 100 %.
Realización 3: Detección e identificación del VHH anti-CLD18A2
3.1 Detección de VHH anti-CLD18A2:
La biblioteca de VHH anti-CLD18A2 construida está empaquetada con los fagos auxiliares M13KO7 (NEB), y el valor de los fagos recombinantes de la biblioteca de visualización es de 5,7 x 1013 UFP/ml. Las células CHO-S-CLD18A2 (18 ml, 7 x 105/ml) y CHO-S (15 ml, 3 x 106/ml) se centrifugan a 300 g durante 5 minutos a 4 °C. Después la centrifugación, se retira el sobrenadante del medio y las células se resuspenden con PBS. Después una segunda centrifugación, las células se bloquean con leche en polvo descremada al 2 % (diluida con PBS) a temperatura ambiente durante 1 h. Se añade una biblioteca de fagos recombinantes (aproximadamente 5,7 x 1011 PFU) a las células CHO-S bloqueadas (aproximadamente 4,5 x 107 células), y las células se incuban durante 30 minutos a temperatura ambiente para realizar dos cribados sustractivos de células enteras. El sobrenadante se añade a células transfectadas de forma estable con CHO-S-CLD18A2 prebloqueadas (aproximadamente 1,5 x 107). Las células se incuban a temperatura ambiente durante 1 hora para su unión. Después otra centrifugación, las células se resuspenden y se lavan con PBS 5 veces. Los fagos lavados se unen a las células, seguido de incubación con 1 ml de tampón b Sa (pH 2,2) de glicina-HCl 0,1 M a 1 mg/ml durante 10 minutos para la elución, la centrifugación para obtener el sobrenadante y la neutralización con Tris-Cl a pH 8,0 1 M. La concentración de los fagos es de 3,6 x 105 UF/ ml. El eluyente del fago se amplifica y el valor es de 1 x 1013 UFP/ml.
Se seleccionan 2 x 1011 fagos recombinantes de PFU de la biblioteca amplificada en la primera ronda de cribado y se incuban a temperatura ambiente durante 30 minutos con 3 x 107 células c HO-S bloqueadas para el cribado sustractivo. Después la centrifugación a 300 g durante 5 minutos a 4 °C, el sobrenadante se incuba con 1 x 107 células CHO-S-CLD18A1 bloqueadas a temperatura ambiente durante 30 minutos, y el cribado sustractivo se lleva a cabo de nuevo. Después el cribado sustractivo, el sobrenadante se incuba con 1,5 x 107 células CHO-S-CLD18A2 bloqueadas a temperatura ambiente durante 1 hora para su unión. Después de centrifugar a 300 g durante 5 minutos a 4 °C, volver a suspender y lavar con PBS. Después de lavar con PBS 5 veces, incubar con 500 pl de BSA de 1 mg/ml de Gly-HCl 0,1 M (pH 2,2) durante 10 minutos para la elución. Después la centrifugación a 300 g durante 5 minutos a 4 °C, el sobrenadante se neutraliza con Tris-Cl a pH 8,0 1 M. La concentración de fagos de la segunda ronda de cribado es de 6 x 105 UFP/ml. El eluyente del fago de la segunda ronda de cribado se amplifica y se almacena en glicerol al 50 %.
3.2 La primera ronda de detección mediante un inmunoensayo ligado a enzimas fágicas (ELISA):
Se seleccionan ochenta clones de la placa de ensayo de valoración de fagos, se eluyen en la segunda ronda de cribado, se cultivan en una placa de 96 pocillos y se infectan y empaquetan con fagos auxiliares M13KO7 para acumular fagos recombinantes en el sobrenadante. El CHO-S, el CHO-S-CLD18A1 y el CHO-S-CLD18A2 se colocan en placas de 96 pocillos a 5 x 105 células por pocillo y se bloquean con BSA al 3 % a temperatura ambiente durante 1 h. Las placas de 96 pocillos correspondientes a las tres células bloqueadas se centrifugan con una centrífuga de placas a 2000 rpm durante 10 minutos antes de retirar cuidadosamente los sobrenadantes. El sobrenadante del fago recombinante monoclonal se diluye tres veces con BSA al 3 % en placas de 96 pocillos, luego se añade a placas de 96 pocillos previamente revestidas con las tres células a razón de 50 pl por pocillo y se incuba durante 1 h a temperatura ambiente. Después lavar con PBS 3 veces, añadir 100 pl de anticuerpo HRP-anti-M13 diluido (Sino Biological Inc.) a cada pocillo e incubar a temperatura ambiente durante 1 h. Después lavar con PBS 3 veces, añadir sustrato de TMB e incubar a 37 °C. Después de incubar durante 5 minutos para desarrollar el color, añadir ácido sulfúrico 1 M para terminar la reacción y leer la densidad óptica a 450 nm (OD450 nm). Basándose en los resultados de ELISA de las tres placas de 96 pocillos de CHO-S, CHO-S-CLD18A1 y CHO-S-CLD18A2, aquellas con un valor de densidad óptica (OD) superior a 1,5 veces el del pocillo negativo (el pocillo correspondiente a CHO-S) se identifican como positivas. Se seleccionan los clones que son negativos en CHO-S-CLD18A1 y positivos en CHO-S-CLD18A2.
3.3 La segunda ronda de detección mediante inmunoensayo ligado a enzimas (ELISA) con un sobrenadante de expresión de E. coli:
Los clones seleccionados según los resultados de las placas de 96 pocillos de células CHO-S, CHO-S-CLD18A1 y CHO-S-CLD18A2 se cultivan. Los plásmidos pcomb3xss que contienen una sola secuencia de VHH se extraen y se transforman en E.coli,respectivamente, para expresar el huésped Rosetta DE3. Los clones de expresión respectivos se seleccionan y cultivan, luego se inducen con IPTG 0,2 mM a 30 °C durante la noche para facilitar la filtración de las proteínas expresadas en el periplasma al sobrenadante del medio de cultivo. El sobrenadante del medio de cultivo de 16 clones se examina de nuevo mediante ELISA: se añaden 100 pl/pocillo de su anticuerpo anti-etiqueta de ratón diluido 1:5000 (R&D Systems, Inc), se incuba a temperatura ambiente durante 1 h, se lava, se añaden 100 pl/pocillo de anticuerpo IgG antiratón HRP-cabra diluido 1:10000 (Thermo Scientific), se incuba durante 1 h a temperatura ambiente y se añade TMB para que adquiera color después del lavado. El control negativo es un clon transfectado con el plásmido negativo. Los resultados de ELISA celular se muestran en la Tabla 1, y los clones de unión específica se seleccionan adicionalmente. Estos clones se secuencian respectivamente. Se realiza la alineación de la secuencia de aminoácidos. Se eliminan los clones con secuencias idénticas y finalmente se obtienen 8 clones diferentes. La Tabla 1 muestra ilustrativamente los clones de unión específica obtenidos.
Tabla 1
Realización 4: Evaluación e identificación preliminares del VHH anti-CLD18A2
4.1 Expresión y purificación del VHH anti-CLD18A2 en el huésped A. coli
El plásmido positivo obtenido mediante el cribado sirve como plantilla en PCR. El cebador ascendente es 5'-gtttaactttaagaaggagatatatgcaggtgcagctcagctggagtct-3' (Id. de sec. n.° 115) y el cebador descendente es 5'-ggccgcaagcttgtcgacggagctcgaattcgaattctaatggtgatggtgatggt-3' (Id. de sec. n.° 116), y la amplificación por PCR se realiza con la ADN polimerasa GVP8 de alta fidelidad (General Biosystems (Anhui) Corporation Limited). La secuencia del péptido señal se retiene en el extremo 5' de las secuencias, y la secuencia codificante de la etiqueta His se conserva en el extremo 3' de la secuencia. El producto de la PCR se somete a electroforesis y se recupera una banda de aproximadamente 500 bp por escisión del gel. El producto de PCR recuperado se conecta con el vector pET32a+ (Novagen, digerido con las endonucleasasNdeI y EcoRI) usando un kit de recombinación (Novoprotein Scientific Inc). El plásmido de expresión deE. colise construye y se transforma en el TOP10F competente paraE. coli,se extiende en placas resistentes a la ampicilina y se cultiva durante la noche en una incubadora a 37 °C. Se seleccionan los clones de las placas resistentes a la ampicilina, respectivamente. Los plásmidos se extraen y se secuencian para confirmar la inserción correcta de la secuencia en el vector pET32a+.
El plásmido de expresión deE. coliconfirmado mediante secuenciación se transforma en el huésped de expresión de E.coliRosetta (DE3) para construir una cepa de expresión de E. coli. Los clones recombinantes se recogen de la placa resistente a la ampicilina, se cultivan y se inducen para que se expresen durante la noche con IPTG 1 mM a 30 °C. El cultivo de bacterias que se induce durante la noche se somete a ultrasonicación. Después la centrifugación a 12000 g durante 10 minutos a 4 °C, el sobrenadante se extrae y se purifica mediante columna cromatográfica de Ni (Bestchrom Biotechnology Co., Ltd ), y la pureza final de la proteína es superior al 90 %.
4.2 Unión específica de VHH anti-CLD18A2
CHO-S, CHO-S-CLD18A1 y CHO-S-CLD18A2 se siembran en placas de 96 pocillos a 5 x 105 células por pocillo y se bloquean con BSA al 3 % a temperatura ambiente durante 1 h. El VHH anti-CLD18A2 purificado con His-tag se diluye a 2 |jg/ml, se añaden 100 j l a las células bloqueadas y se incuba durante 1 h a temperatura ambiente. Después el lavado, se añadieron 100 pl/pocillo de anticuerpo antihis-atiqueta de ratón diluido 1:5000 (R&D Systems, Inc) y se incubaron a temperatura ambiente durante 1 h. Después el lavado, se añadieron 100 jl/pocillo de anticuerpo IgG antiratón HRP-cabra diluido a 1:10000 (Thermo Scientific) y se incubó durante 1 h a temperatura ambiente. Después el lavado, se añadió TMB para desarrollar el color. El valor de DO se mide a 450 nm. Los resultados se muestran en la tabla 2.
Tabla 2
4.3 Evaluación de la afinidad del VHH anti-CLD18A2
Las células CHO-S-CLD18A2 se siembran en una placa de 96 pocilios a 5 x 105 células por pocilio y se bloquean con BSA al 3 % a temperatura ambiente durante 1 h. El VHH anti-CLD18A2 purificado fusionado con una etiqueta de histidina se diluye en gradientes con BSA al 1 %, se añade a las células bloqueadas y se incuba durante 1 h a temperatura ambiente. Después el lavado, se añadieron 100 pl/pocillo de anticuerpo antihis-atiqueta de ratón diluido 1:5000 (R&D Systems, Inc) y se incubaron a temperatura ambiente durante 1 h. Después el lavado, se añadieron 100 pl/pocillo de anticuerpo IgG antiratón HRP-cabra diluido a 1:10000 (Thermo Scientific) y se incubó durante 1 h a temperatura ambiente. Después el lavado, se añadió TMB para desarrollar el color. El valor de DO se detecta a 450 nm. El software GraphPad Prism v5.0 se utiliza para el procesamiento de datos y el análisis de mapeo, y el valor de EC50 del VHH anti-CLD18A2 contra el CLD18A2 en las células se obtiene para reflejar la afinidad del<v>H<h>por el CLD18A2. Los resultados se muestran en la Tabla 3.
Tabla 3
Realización 5: Humanización de VHH anti-CLD18A2
El método de humanización se completa con el método de trasplante de marco universal de humanización del VHH establecido por Vincke C y col. (Vincke C, Loris R, Saerens D, Martinez-Rodriguez S, Muyldermans S, Conrath K. J Biol Chem. 2009;284(5): 3273-3284). El marco general de VHH humanizado h-NbBcII10FGLA (código PDB: 3EAK) se diseña basándose en la homología de secuencia, y la región CDR correspondiente se reemplaza por la región CDR del VHH anti-CLD18A2. Los aminoácidos individuales de la región FR2 se humanizan adicionalmente según la secuencia del anticuerpo humanizado DP-47. Se formaron al menos 3 variantes humanizadas por cada VHH anti-CLD18A2. Las secuencias de anticuerpos antes y después de la humanización se muestran en la Tabla 4:
Tabla 4
Realización 6: Preparación de anticuerpos VHH anti-CLD18A2 utilizando células de mamífero
6.1 Expresión y purificación de la proteína de fusión VHH y Fc anti-CLD18A2 (Anti-C18.2-Fc)
La secuencia positiva obtenida mediante el cribado y la secuencia humanizada sirven como plantillas. El cebador ascendente es 5'-gtgctgctgtgggtgccaggatccaccgggcaggtgcagctcgtggagtc-3' (Id. de sec. n.° 117) y el cebador descendente es 5'-gcaggacttgggctcagaagacacggtgaccagggtcccctggcc-3' (Id. de sec. n.° 118), y la amplificación por PCR es realizada con la ADN polimerasa GVP8 de alta fidelidad (General Biosystems (Anhui) Corporation Limited). El producto de PCR se somete a electroforesis y se recupera una banda de aproximadamente 400 bp por escisión del gel. El producto de PCR recuperado se conecta con el vector pCDNA3.1 que contiene un péptido señal y una secuencia de IgG1Fc humana (secuencia de aminoácidos de la sec. n.° 91), para construir un plásmido de expresión celular en donde el VHH anti-CLD18A2 se fusiona con el Fc de IgG1 humano. El plásmido de expresión celular en donde el VHH anti-CLD18A2 se fusiona con el Fc de la IgG1 humana se extrae utilizando el kit de extracción maxiprep de plásmidos sin endotoxinas (Biomiga). El plásmido y el reactivo de transfección PEI (Polysciences, Inc.) se mezclan uniformemente a 1:3, y después se dejan reposar durante 30 minutos. La mezcla se añade a las células HEK293F, se incuba en una incubadora con agitación a 37 °C y con un 5 % de CO<2>durante 7 días y se centrifuga para recoger el sobrenadante. El sobrenadante se ajusta a pH 7,0 y, a continuación, se carga en una columna de afinidad por la proteína A (Bestchrom Biotechnology Co., Ltd.) y, a continuación, se eluye con un 100 % de Gly-HCl 0,1 M (pH 3,0); el eluyente se añade previamente con Tris-HCl 1 M al 10 % (pH 8,5). Diluyendo el eluyente al 100 % hasta una conductividad de 4 ms/cm, ajustando el pH a 5,5, centrifugando (8000 rpm, 4 °C, 10 minutos), ajustando el pH del sobrenadante a 5,0 y cargando la muestra en una columna cromatográfica DSP (Bestchrom Biotechnology Co., Ltd.), los eluyentes del 0-60 % (NaAc 20 mM, NaCl 0,5 M, pH 5,0) se eluyen en gradientes lineales a un caudal de 2 ml/min durante 15 min.
6.2 Expresión y purificación del anticuerpo de control positivo ch-175D10
El anticuerpo quimérico (ch-175D10 en la patente US-9751934B2) está compuesto por la cadena pesada (Id. de sec. n.° 118 en US-9751934B2), y la cadena ligera (Id. de sec. n.° 125 en US-9751934B2) se usa como control. La secuencia de polinucleótidos de ch-175D10 está conectada con el vector pCDNA3.1. La transfección transitoria, la expresión y la purificación de las células HEK293F se realizan mediante el mismo método que en la Realización 6.1.
6.3 Análisis comparativo de la agregación entre la proteína de fusión Anti-C18.2-Fc y el anticuerpo de control positivo ch-175D10
La pureza de Anti-C18.2-Fc y del anticuerpo de control ch-175D10 se detecta mediante análisis SEC-HPLC-UV. Detector: Agilent 1100 LC; longitud de onda de detección: 214 nm; fase móvil: 150 mM pH 7,0 PB 5 % de isopropanol; columna cromatográfica: Superdex 200 Aumento 5/150 GL; tiempo de corrida: 15 min; temperatura de la columna: 25 °C.
Tabla 5
A partir de los resultados de la Tabla 5, la proteína de fusión Anti-C18.2-Fc de la presente descripción tiene una agregación significativamente menor que la ch-175D10 de control.
Realización 7: Caracterización de la función de la proteína de fusión Anti-C18.2-Fc
7.1 Caracterización de la afinidad de la proteína de fusión anti-C18.2-Fc con CLD18A2
Las proteínas de fusión anti-C18.2-Fc se diluyen en gradientes con BSA al 1 %, y el anticuerpo secundario anti-IgG Fc humano (Novex) HRP-cabra se diluye a 1:20000. El método ELISA celular es el mismo que el descrito en la Realización 3.2. El software GraphPad Prism v5.0 se utiliza para el procesamiento de datos y el análisis de mapeos. La curva de unión y el valor de EC50 de Anti-C18.2-Fc contra CLD18A2 en las células se obtienen para reflejar la afinidad del anticuerpo por CLD18A2.
Los resultados se muestran en la Figura 1. Las afinidades de anti-C18.2-Hu19V1-Fc y de anti-C18.2-Hu19v3-Fc son similares a las de Anti-C18.2-19-Fc, que son mejores que las del control positivo ch-175d10. Los valores de CE50 de Anti-C18.2-19-Fc, anti-C18.2-Hu19v1-Fc, anti-C18.2-Hu19v3-Fc y ch-175D10 son 0,71 nM, 0,82 nM, 0,41 nM y 2,59 nM, respectivamente. Los resultados muestran que la humanización de VHH anti-C18.2 no conduce a cambios significativos en la afinidad.
7.2 Ensayo de CDC
El suero de donantes sanos se utiliza como fuente de complemento. El suero incubado a 65 °C durante 30 minutos sirve como control sérico inactivado. Células NUGC-4-CLD18A2 se coloca en una placa de 96 pocillos a 5 * 104 por pocillo. La muestra de proteína de fusión anti-C18.2-Fc, el control negativo (fragmento Fc de IgG1 sin región Fab, secuencia de aminoácidos de la sec. n.° 91) y el anticuerpo de control positivo ch-175D10 se diluyen en gradientes con el medio y, a continuación, se añaden a placas de 96 pocillos, de modo que la concentración final disminuye de 750 nM a 0,05 nM en gradientes. Después incubar a 37 °C durante 30 minutos, añadir un 5 % de suero sano de origen humano o suero de control inactivado, respectivamente, e incubar a 37 °C durante 4 h. La liberación de LDH se detecta con el kit de detección de LDH (Dojindo Chemical Technology (Shanghai) Co., Ltd.) y se lleva a cabo según las instrucciones del fabricante. Los resultados se muestran en las Figuras 2-3.
7.3 Ensayo de ADCC
Células mononucleares de sangre periférica (PBMC -Peripheral Blood Mononuclear Cells)aisladas de sangre humana de donantes sanos se lavan y se resuspenden en medio 1640 suplementado con suero bovino fetal (FBS) al 5 %. La proteína de fusión Anti-C18.2-Fc y el control positivo ch-175d10 que se van a probar se diluyen con medio FBS 1640 al 5 % a 500 nM y se añaden 50 pl a placas de 96 pocillos. NUGC-4-CLD18A2 se lava y se resuspende con medio FBS 1640 al 5 % y se configura para tener una densidad celular de aproximadamente 2 x 105/ml, añadiendo 50 pl a las placas de 96 pocillos correspondientes. Las células PBMC resuspendidas se añadieron a 100 pl/pocillo y se ajustaron a 1 x 105 células por pocillo. Como resultado, la relación entre las células efectoras y las células diana (relación E: T) es de 10:1. Después incubar en una incubadora a 37 °C durante 4 h, se detecta la liberación de LDH con el kit de detección de LDH (Dojindo Chemical Technology (Shanghai) Co., Ltd.) y se lleva a cabo según las instrucciones del fabricante. El resultado de evaluación se muestra en la Figura 4.
7.4 La actividad inhibidora de la proteína de fusión sobre el crecimiento tumoral en ratones modelo se compara con la del control positivo y el control negativo
En este experimento, se utilizan ratones portadores de tumores con modelos tumorales de xenoinjerto establecidos por tejido de cáncer gástrico derivado de pacientes (xenoinjerto derivado del paciente, PDX) para determinar el efecto antitumoral de la proteína de fusión. Los ratones que tienen un volumen tumoral de aproximadamente 100 mm3 se dividen aleatoriamente en grupos, con 4-6 ratones en cada grupo experimental. Quince días después del trasplante del tumor, los ratones se tratan con diferentes proteínas y diferentes dosis. Durante la administración se monitorizan los cambios en el volumen tumoral y el peso corporal de los ratones en cada grupo. La frecuencia de dosificación es de 2 veces/semana y la frecuencia de monitorización es de 2 veces/semana durante 5 semanas continuas. La dosis y la vía de administración se muestran en la Tabla 6. Medición del volumen tumoral: el eje largo más grande (L) y el eje ancho más grande (W) del tumor se miden con un calibrador Vernier, y el volumen del tumor se calcula según la siguiente fórmula:
V=L<x>W2/2
Tabla 6
Los resultados del experimento se muestran en la Figura 5. A medida que pasa el tiempo, el volumen tumoral de los ratones inoculados con Anti-C18.2-Hu6v3-Fc y anti-C18.2-Hu19V3-Fc está bien controlado en comparación con el de los grupos de control sin un aumento significativo. El resultado indica que el anti-C18.2-Hu6v3-Fc y el anti-C18.2-Hu19v3-Fc tienen efectos obvios de inhibición tumoral.
Realización 8: Construcción, expresión y purificación de vectores de proteína de fusión anti-CLDN18*CD3
8.1 Diseño de secuencia de la proteína de fusión anti-CLDN18 * CD3
La proteína de fusión anti-CLDN18xCD3 es un anticuerpo VHH biespecífico dirigido a CLD18A2 y CD3, que está compuesto por VHH anti-CLD18A2 y anti-CD3: la secuencia del VHH anti-CLD18A2 se describe en la presente descripción, y la secuencia del VHH anti-CD3 se describe en el documento WO2016/180982. VHH anti-CLD18A2 y anti-CD3 están unidos por una secuencia GS (Id. de sec. n.° 132). Para facilitar la purificación, se añade una etiqueta His C-terminal a la proteína de fusión anti-CLDN18 * CD3 y al v Hh anti-CD3.
8.2 Construcción, expresión y purificación de vectores de proteína de fusión anti-CLDN18*CD3
Las secuencias de la proteína de fusión anti-CLDN18xCD3 y del VHH anti-CD3 son optimizadas y sintetizadas por General Biosystems (Anhui) Corporation Limited. Los productos digeridos conXholy EcoRI se conectan con el vector de expresión pPIC9 utilizando la ligasa T4 (Takara), se transforman en el TOP10F deE. colicompetente, se esparcen en placas resistentes a la ampicilina y se cultivan durante la noche en una incubadora a 37 °C. Se seleccionan los clones de las placas resistentes a la ampicilina, respectivamente. Los plásmidos se extraen y se secuencian para confirmar la inserción correcta de la secuencia en el vector pPIC9. El plásmido de expresión confirmado por secuenciación se transforma enPichia pastorisGS115. Los clones recombinantes se recogen de la placa MD, se cultivan y se inducen con metanol para su expresión. El cultivo inducido durante la noche se centrifuga a 12000 g durante 10 minutos a 4 °C, el sobrenadante se extrae y se purifica mediante columna de Ni (Bestchrom Biotechnology Co., Ltd.) y la pureza final de la proteína es superior al 90 %.
Realización 9: Caracterización de la función de la proteína de fusión anti-CLDN18*CD3
9.1 Especificidad de unión celular de la proteína de fusión anti-CLDN18 * CD3
Jurkat (adquirido en el banco de células de la colección del Comité de Cultivos Tipo de la Academia de Ciencias de China) sirve como célula CD3 positiva, y la CHO-S-CLD18A2 construida en la realización 1 sirve como célula positiva para CLD18A2, para determinar la actividad de unión celular de la proteína de fusión anti-CLDN18xCD3 construida y expresada en la presente descripción.
Las células CHO-S-CLD18A2 y Jurkat se siembran en placas de 96 pocillos a 5 x 105/ml por pocillo, y se bloquean con BSA al 3 % durante 1 h a temperatura ambiente. La proteína de fusión anti-CLDN18xCD3 purificada, los VHH anti-C18.2-6 y anti-C18.2-19 preparados en la Realización 4, y el VHH anti-CD3 se diluyen en gradientes con BSA al 1 %, y después se añaden a las células prebloqueadas respectivamente, y después se incuban a temperatura ambiente durante 1 h. El siguiente proceso experimental es el mismo que en la Realización 4.3. GraphPad Prism v5.0 se utiliza para el procesamiento de datos y el análisis de mapeo para evaluar la afinidad de la proteína de fusión anti-CLDN18*CD3 contra las células CHO-S-CLD18A2 y Jurkat. Los resultados mostrados en las Figuras 6-7 indican que la proteína de fusión anti-CLDN18xCD3 tiene una buena actividad de unión con las células positivas para CLD18A2 y las células positivas para CD3. Unión de células positivas de CLD18A2: la CE50 del anti-CLDN18xCD3-Hu6V3 (Id. de sec. n.° 133) es de 6,50 nM, y la EC50 del anti-CLDN18xCD3-hu19v3 (Id. de sec. n.° 134) es de 4,60 nM; Unión de células Jurkat CD3 positivas: la CE50 del anti-CLDN18*CD3-Hu6v3 es de 9,39 nM y la EC50 del anti-CLDN18*CD3-hu19v3 es de 10,36 nM.
9.2 Evaluaciónin vitrode la destrucción celular de la proteína de fusión anti-CLDN18*CD3
Para evaluar el efecto destructor celular de la proteína de fusión anti-CLDN18xCD3, la presente descripción usa células T (Miao Tong (Shanghai) Biological Technology Co., Ltd.) como células efectoras para la prueba de citotoxicidad.
La proteína de fusión anti-CLDN18*CD3 se diluye en gradientes y se añaden 50 |jl a cada pocilio. Las células CLD18A2 y CLD18A1 transfectadas de forma estable se lavan y se resuspenden con medio FBS 1640 al 5 % (Gibco) y se preparan hasta una densidad celular de aproximadamente 2 x 105/ml. Se añadieron 50 j l por pocillo de las células a las placas de 96 pocillos correspondientes. Los linfocitos T humanos de donantes sanos se resuspenden en medio FBS 1640 al 5 % a razón de 1 x 105 células por pocillo, de modo que la relación E:T es de 10:1. Después incubar en una incubadora a 37 °C durante 4 h, se detecta la liberación de LDH con el kit de detección de LDH (Dojindo Chemical Technology (Shanghai) Co., Ltd.) y se lleva a cabo según las instrucciones del fabricante. Se evalúa el efecto de destrucción celular de la proteína de fusión anti-CLDN18xCD3.
En el experimento de citotoxicidadin vitro,el anti-CLDN18*CD3-Hu6v3 y el anti-CLDN18*CD3-Hu19v3 tienen notables efectos destructivos sobre el NUGC-4-CLD18A2, que expresa en gran medida el CLD18A2 (Figura 8), con una CE50 de 26,15 pM y 20,73 pM, respectivamente. Para células NUGC-4-CLD18A1, la proteína de fusión anti-CLDN18*CD3 no tiene un efecto destructivo notable (Figura 9). Los resultados muestran que la proteína de fusión anti-CLDN18*CD3 tiene un efecto destructivo específico en las células NUGC-4-CLD18A2in vitrocon la participación de los linfocitos T, y básicamente no es tóxica para las células que no expresan CLD18A2.
9.3 Actividad inhibidora de tumores de la proteína de fusión anti-CLDN18*CD3
En la presente descripción, se utilizan ratones NSG portadores de tumores con modelos tumorales de xenoinjerto establecidos mediante tejido de cáncer gástrico derivado de pacientes (xenoinjerto derivado de pacientes, PDX) para evaluar el efecto inhibidor del tumor de la proteína de fusión anti-CLDN18xCD3. Cuando el tumor crece hasta aproximadamente 100 mm3, los ratones portadores del tumor se dividen aleatoriamente en grupos, con 5 ratones por grupo. A los ratones se les inyectan por vía intraperitoneal 2 x 107 células PBMC humanas sanas. Un día después, a los ratones portadores del tumor se les inyectan por vía intraperitoneal 5 jg (25 jg/m l en 200 j l de PBS) de proteína de fusión anti-CLDN18xCD3, una vez al día durante 4 semanas. El volumen del tumor se registra dos veces por semana.
Como se puede observar a partir de los resultados experimentales en la Figura 10, el anti-CLDN18xCD3-hu6v3 y el anti-CLDN18xCD3-hu19v3 tienen un efecto inhibidor notable sobre el crecimiento de los tumores trasplantados. A medida que pasa el tiempo, el volumen tumoral del grupo experimental disminuye gradualmente.
Realización 10: Uso de VHH dirigido específicamente a CLD18A2 en receptores de antígenos quiméricos
El VHH que se dirige específicamente a CLD18A2 en la presente descripción se usa para la construcción de receptores de antígenos quiméricos. La Tabla 7 enumera los receptores de antígenos quiméricos construidos y sus estructuras (dominio de reconocimiento de antígenos - región bisagra - región transmembrana - dominio de señal intracelular); la estructura de eGFP coexpresada no está en la lista).
Tabla 7
10.1 Construcción de un plásmido lentiviral para la expresión de VHH
Como ejemplo de construcción, la presente descripción usa un sistema de vectores lentivirales autoinactivantes de tercera generación, que consiste en tres plásmidos, a saber, un plásmido envuelto pMD2.G (adquirido en AddGene) que codifica la proteína VSV-G, un plásmido empaquetador psPAX2 (adquirido en AddGene) que codifica la proteína Gag/Pol y la proteína Rev, y un vector de expresión recombinante que codifica el gen diana CAR y construido en base a un vector vacío pWPol. T-eGFP (adquirido en AddGene). Basándose en pWPT-EGFP, la presente descripción construye un vector lentivírico universal para la expresión de VHH para facilitar las inserciones de diferentes secuencias de VHH para construir una estructura CAR completa. Además, la coexpresión del gen diana CAR y eGFP se realiza mediante T2A en el vector de expresión recombinante que codifica el gen diana CAR. T2A es un péptido 2A derivado del virus Thosea asigna. T2A tiene una función de “ autoempalme” y, por lo tanto, puede realizar la coexpresión de genes ascendentes y descendentes. La expresión de CAR se puede detectar indirectamente mediante la detección de eGFP.
Se sintetiza una secuencia (Id. de sec. n.° 141) que contiene un péptido señal CD8 y una bisagra CD28a-CD28b-CD3-T2A-EGFP, en donde se inserta un sitio de clonación múltiple entre el péptido señal CD8 y la bisagra CD8 para la inserción de VHH u otras secuencias de reconocimiento específicas. La secuencia sintetizada se liga con el vector pWPT-GFP (AddGene, también digerido) mediante la ligasa T4 (Takara) a través de los sitios de restricciónMlu1ysalIen ambos extremos. El producto de ligación se transforma en Top10F' y se recubre sobre placas resistentes a la ampicilina. Los clones se recogen, cultivan y secuencian. Se construye el vector universal pWPT-X-CAR-28Z CAR T. De manera similar, se sintetiza una secuencia (Id. de sec. n.° 142) que contiene un péptido señal CD8 y una bisagra CD28a-CD28b-CD137-CD3-T2A-EGFP, en donde se inserta un sitio de clonación múltiple entre el péptido señal CD8 y la bisagra CD8 para la inserción de VHH u otras secuencias de reconocimiento específicas. La secuencia sintetizada se inserta en el vector pWPT-GFP (también digerido) a través de los sitios de restricción Mlu1 y SalI en ambos extremos, para construir el vector universal CART pWPT-X-CAR-28-137Z.
10.2 Construcción del plásmido de lentivirus CAR anti-CLD18A2
El plásmido de expresión anti-C18.2-hu19V3-Fc sirve como plantilla. El par de cebadores incluye un cebador directo (Id. de sec. n.° 143) y un cebador inverso (Id. de sec. n.° 144). La amplificación por PCR se realiza con la ADN polimerasa de alta fidelidad GVP8 (General Biosystems (Anhui) Corporation Limited). El producto de PCR se somete a electroforesis y se recupera por escisión del gel. El vector universal CART pWPT-X-CAR-28Z se digiere doblemente con las endonucleasas NdeI (Takara) yPstI(Takara) y se recupera mediante electroforesis. El producto de PCR recuperado se conecta con el vector usando un kit de recombinación (Novoprotein Scientific Inc). El producto de ligación se transforma en Top10F' y se extiende sobre placas resistentes a la ampicilina. Los clones se recogen, cultivan y secuencian. Se construye el plásmido pWPT-AC18.2-hu19v3-28z de lentivirus CAR anti-CLD18A2. De manera similar, el plásmido pWPT-AC18.2-hu19v3-28-137z del lentivirus CAR anti-CLD18A2 se construye mediante la conexión del producto de PCR recuperado y el vector pWPT-X-CAR-28-137z de doble digestión conNdeI(Takara) y PstI (Takara). Basándose en las operaciones anteriores, se construyen pWPT-aC18.2-Hu6v3-28z y pWPT-aC18.2-HU6v3-28-137z.
10.3 Transfección del plásmido en lentivirus de empaquetamiento 293T
El empaquetado de lentivirus sigue los métodos convencionales, que se describen a continuación: Células HEK-293T<(ATCC) se plantan en una placa de cultivo de 10 cm a una densidad de 5 x 10>6<células y se cultivan en una incubadora>(37 °C, 5 % de CO<2>) durante la noche. El medio es DMEM (Gibco) que contiene un 10 % de suero bovino fetal (Gibco). El medio de cultivo se reemplaza con DMEM sin suero aproximadamente 2 horas antes de la transfección. Durante la transfección celular, también se requieren los plásmidos psPAX2 y pMD2.0G (que proporcionan proteína de membrana viral y proteína estructural) además de los plásmidos lentivirales que expresan CAR. Se usan 5 |jg del plásmido lentiviral con la secuencia diana CAR o el vector vacío, 3,75 jg de psPAX2 y 1,25 jg de pMD2.0G. Durante la transfección, la mezcla de los tres plásmidos anteriores se añade a 500 jL de medio MEM, y se añaden 25 jL de reactivo de transfección Lipofectamina 2000 (Thermo Fisher) a 500 jL de medio MEM en otro tubo de minicentrífuga. A continuación, el reactivo de transfección diluido se añade a la parte superior del plásmido diluido y se mezcla bien. Después de incubar a temperatura ambiente durante 20 minutos, la mezcla de plásmido y reactivo de transfección se añade a una placa de cultivo de 10 cm, después de agitar y mezclar bien, y se coloca en una incubadora a 37 °C. Después de 6 horas, el medio se reemplaza por un medio DMEM que contiene un 10 % de suero bovino fetal. Después de 3 días de transfección celular, se recoge el virus. El sobrenadante del cultivo que contiene el virus se transfiere a un tubo de centrífuga para centrifugar a 1500 rpm a 4 °C durante 5 min. Se extraen las células y, a continuación, el medio de cultivo que contiene el virus se filtra, se dispensa y se congela a -80 °C para su almacenamiento. Las células<HEK-293T se inoculan en DMEM que contiene suero bovino fetal al 10 % a una densidad celular de 1 x 10>5</ml y se>incuban en una placa de 96 pocillos a 100 jL/pocillo durante la noche (37 °C, 5 % de CO<2>). Al día siguiente, desechar 50 jl/pocillo del sobrenadante del cultivo y añadir 50 jl/pocillo del medio de cultivo fresco mencionado anteriormente (que contiene polibreno a una concentración final de 6 jg/m l) e incubar durante 30 minutos (37 °C, 5 % de CO<2>). Se añadieron 10 jl/pocillo de la solución madre del virus y se incubó a 37 °C con un 5 % de CO<2>. Después de 48 horas de infección, la eGFP se detecta mediante citometría de flujo. El número de células con una tasa positiva del 5-20 %<es apropiado, y se calcula que el título es de aproximadamente 2 x 10>6<U/ml.>
Realización 11: Células CAR-T dirigidas específicamente a CLD18A2
11.1 Preparación de aC18.2-CAR-T
Células mononucleares de sangre periférica humana (Miao Tong (Shanghai) Biological Technology Co., Ltd.) se obtienen de sangre periférica humana sana mediante centrifugación en gradiente de densidad y se clasifican mediante microperlas de CD3 (MiltenyiBiotec GmbH) según las instrucciones. Se añade el medio linfocítico Quantum007<(adquirido en PAA Laboratories GmbH) a una densidad de aproximadamente 1 x 10>6</ml para el cultivo, se mezcla con>el activador T humano CD3/CD28 de Dynabeads<™>(Thermofisher) en una proporción de perlas magnéticas celulares de 1:1, y se añade IL-2 humana recombinante (Novoprotein Scientific Inc) con una concentración final de 100 U/ml para estimular el cultivo durante 24 h. A continuación, las células T se infectan con el lentivirus recombinante anterior<(realización 10.3) a una MOI=5. Las células infectadas se someten a pases a una densidad de 5 x 10>5</ml cada dos>días, y se añade IL-2 humana recombinante con una concentración final de 100 U/ml al medio linfocítico. La citometría de flujo se realiza el octavo día de cultivo. Dado que la eGFP se coexpresa con CAR, las células positivas donde eGFP es detectable se consideran células positivas que expresan los receptores de antígenos quiméricos. Células T no infectadas sirven como control negativo. La tasa positiva de células T infectadas con virus que expresan diferentes receptores de antígenos quiméricos es de aproximadamente el 66,4 %.
11.2 Experimento de aniquilación de aC18.2-CAR-T
Se observa el efecto destructor de diferentes células aC18.2-CAR-T sobre las células NUGC-4-CLD18A2 y las células NUGC-4-CLD18A1 (línea celular CLD18A2 negativa)in vitro.Las relaciones E:T se establecen en 3:1, 1:1, y 1:3, respectivamente. El número de células diana es de 10000/pocillo. Cada grupo contiene 5 pocillos repetidos, y se calcula el valor promedio de los 5 pocillos repetidos. Después de 16 horas de cocultivo, el contenido de LDH en el sobrenadante se mide con el kit de detección de LDH (Dojindo Chemical Technology (Shanghai) Co., Ltd.), para evaluar el efecto destructivo. Los resultados de la Tabla 8 muestran que cuando la relación E:T es 3:1, las células aC18.2-CAR-T específicas son eficaces para matar las células positivas para CLD18A2, pero apenas eficaces para matar las células negativas para CLD18A2. Los resultados anteriores muestran que el aC18.2-CAR-T puede matar específicamente las células positivas para CLD18A2, y el efecto de destrucción se correlaciona positivamente con la relación E:T.
Tabla 8
11.3 Liberación de citocinas in vitro
Las células positivas para CLD18A2, las células NUGC-4-CLD18A2 y las células aC18.2-CAR-T, se cultivan conjuntamente en una proporción de 1:1. Después la incubación durante 24 h, se recolectan los sobrenadantes del cultivo y la IL-2 (R&D Systems, Inc.), el TNF-a (R&D Systems, Inc.) y el IFN-y (R&D Systems, Inc.) detectan las citocinas según las instrucciones del kit. Los resultados de la Figura 11 muestran que en NUGC-4-CLD18A2, la secreción de citocinas como IL-2, TNF-a e IFN-y durante la coincubación de aC18.2-CAR-T es significativamente mayor que la de las células negativas NUGC-4-CLD18A1.
11.4 Estudio farmacodinámico in vivo de aC18.2-CAR-t
Se establece un modelo de tumor trasplantado subcutáneo basado en el NUGC-4-CLD18A2. Ratones NOD/SCID son inoculados por vía subcutánea con 3x106 NUGC-4-CLD18A2. Cuando el volumen tumoral promedio de los ratones alcanza los 100-150 mm3, se inyectan 100 mg/kg de ciclofosfamida por vía intraperitoneal para eliminar las células inmunitarias de los ratones con NOD/SCID, de modo que los linfocitos T transgénicos transferidos de forma adoptiva puedan ejercer mejor la función antitumoral. Al día siguiente, se infunden 1,0 * 107 de células aC18.2-CAR-T Ac18.2-hu19v3-28-137z a través de la vena de la cola. Al mismo tiempo, el grupo Simulado que expresa 28-137Z sirve como control para observar y medir el crecimiento del tumor trasplantado por vía subcutánea. Los resultados de la Figura 12 muestran que las células aC18.2-CAR-T pueden inhibir significativamente el crecimiento de los tumores trasplantados con NUGC-4-CLD18A2.
En resumen, la presente descripción supera eficazmente varias deficiencias y tiene un alto valor de utilización industrial.
Las realizaciones mencionadas anteriormente solo se usan para describir ilustrativamente el principio y los efectos de la presente descripción y no limitan la presente descripción.

Claims (13)

REIVINDICACIONES
1. Un VHH anti-CLD18A2, en donde una región CDR determinante de la complementariedad del VHH anti-CLD18A2 comprende CDR1-CDR3 que tiene secuencias de aminoácidos como se muestra a continuación:
(1) CDR1 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la Id. de sec. n.° 4, CDR2 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la Id. de sec. n.° 19 y CDR3 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la Id. de sec. n.° 33; o
(2) CDR1 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la Id. de sec. n.° 5, CDR2 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la Id. de sec. n.° 20 y CDR3 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la Id. de sec. n.° 34; o
(3) CDR1 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la Id. de sec. n.° 6, CDR2 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la Id. de sec. n.° 21 y CDR3 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la Id. de sec. n.° 35; o
(4) CDR1 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la Id. de sec. n.° 7, CDR2 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la Id. de sec. n.° 22 y CDR3 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la Id. de sec. n.° 36; o
(5) CDR1 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la Id. de sec. n.° 8, CDR2 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la Id. de sec. n.° 23 y CDR3 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la Id. de sec. n.° 37; o
(6) CDR1 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la Id. de sec. n.° 9, CDR2 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la Id. de sec. n.° 24 y CDR3 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la Id. de sec. n.° 38; o
(7) CDR1 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la Id. de sec. n.° 10, CDR2 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la Id. de sec. n.° 25 y CDR3 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la Id. de sec. n.° 36; o
(8) CDR1 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la Id. de sec. n.° 11, CDR2 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la Id. de sec. n.° 26 y CDR3 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la Id. de sec. n.° 39.
2. El VHH anti-CLD18A2 según la reivindicación 1, que comprende además una región marco FR, y la región marco FR incluye FR1-FR4 que tiene secuencias de aminoácidos como se muestra a continuación: 12345678
(1) FR1 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la Id. de sec. n.° 1, FR2 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la Id. de sec. n.° 12, FR3 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la Id. de sec. n.° 27 y FR4 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la Id. de sec. n.° 40; o
(2) FR1 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la Id. de sec. n.° 2, FR2 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la Id. de sec. n.° 13, FR3 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la Id. de sec. n.° 28 y FR4 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la Id. de sec. n.° 41; o
(3) FR1 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la Id. de sec. n.° 3, FR2 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la Id. de sec. n.° 14, FR3 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la Id. de sec. n.° 29 y FR4 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la Id. de sec. n.° 41; o
(4) FR1 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la Id. de sec. n.° 1, FR2 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la Id. de sec. n.° 15, FR3 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la Id. de sec. n.° 30 y FR4 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la Id. de sec. n.° 41; o
(5) FR1 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la Id. de sec. n.° 2, FR2 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la Id. de sec. n.° 16, FR3 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la Id. de sec. n.° 31 y FR4 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la Id. de sec. n.° 41; o
(6) FR1 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la Id. de sec. n.° 2, FR2 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la Id. de sec. n.° 13, FR3 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la Id. de sec. n.° 31 y FR4 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la Id. de sec. n.° 41; o
(7) FR1 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la Id. de sec. n.° 1, FR2 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la Id. de sec. n.° 17, FR3 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la Id. de sec. n.° 30 y FR4 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la Id. de sec. n.° 41; o
(8) FR1 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la Id. de sec. n.° 2, FR2 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la Id. de sec. n.° 18, FR3 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la Id. de sec. n.° 32 y FR4 que tiene una secuencia de aminoácidos representada por la Id. de sec. n.° 41.
3. El VHH anti-CLD18A2 según la reivindicación 1, en donde una secuencia de aminoácidos del VHH anti-CLD18A2 comprende:
a) una secuencia de aminoácidos representada por una de las Id. de sec. n.° 42-49; o b) una secuencia de aminoácidos con al menos un 80 % de identidad de secuencia con una de las Id. de sec. n.° 42-49 y que tiene una función de la secuencia de aminoácidos definida en a).
4. El anti-CLD18A2 VHH según la reivindicación 1, en donde
el VHH anti-CLD18A2 es un anticuerpo humanizado, y
preferiblemente, una secuencia de aminoácidos del VHH anti-CLD18A2 está representada por una de las Id. de sec. n.° 67-90.
5. Una proteína de fusión de un VHH anti-CLD18A2, que comprende un primer dominio del VHH anti-CLD18A2 según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, y
un segundo dominio para prolongar la semivida in vivo y/o tener un efecto de unión sobre las células efectoras;
en donde el segundo dominio comprende uno o más fragmentos de albúmina sérica, fragmento de polietilenglicol y VHH que se une a HSA; y/o el segundo dominio comprende una región Fc de inmunoglobulina, preferiblemente seleccionada de una región Fc de inmunoglobulina humana; y/o, el segundo dominio es un dominio que es capaz de unirse al CD3 presente en las células T.
6. La proteína de fusión según la reivindicación 5, en donde
la inmunoglobulina se selecciona de una o más de IgG, IgA1, IgA2, IgD, IgE e IgM, y la IgG se selecciona de uno o más de los subtipos IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4; y/o,
una secuencia de aminoácidos de la región Fc de inmunoglobulina se selecciona de una de las Id. de sec. n.° 91-95; y/o,
se proporciona un péptido conector entre el primer dominio y el segundo dominio, en donde el péptido conector se selecciona preferiblemente de una cadena polipeptídica flexible compuesta de alanina y/o serina y/o glicina, y
la longitud del péptido conector es preferiblemente de 3-40 aminoácidos.
7. Un polinucleótido aislado, que codifica el VHH según una cualquiera de las reivindicaciones 1- 4 o la proteína de fusión según una cualquiera de las reivindicaciones 5-6.
8. Un vector de expresión que comprende el polinucleótido aislado según la reivindicación 7.
9. Un sistema de expresión de anticuerpos, que comprende el vector de expresión según la reivindicación 8 o el polinucleótido aislado según la reivindicación 7.
10. Un método para preparar el VHH según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4 o la proteína de fusión según una cualquiera de las reivindicaciones 5-6, que comprende las siguientes etapas:
cultivar el sistema de expresión de anticuerpo según la reivindicación 9 en condiciones adecuadas para expresar el anticuerpo, expresando de este modo el anticuerpo, y
purificar y aislar el anticuerpo.
11. Una composición farmacéutica, que comprende el VHH según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, o la proteína de fusión según una cualquiera de las reivindicaciones 5-6.
12. El VHH según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, la proteína de fusión según una cualquiera de las reivindicaciones 5-6, o la composición farmacéutica según la reivindicación 11 para su uso como medicamento.
13. El VHH según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, la proteína de fusión según una cualquiera de las reivindicaciones 5-6, o la composición farmacéutica según la reivindicación 11 para su uso según la reivindicación 12, en donde el medicamento es para su uso en el diagnóstico, tratamiento o prevención de enfermedades asociadas con células que expresan CLD18A2 seleccionadas de un tumor, y el tumor se selecciona del grupo que consiste en cáncer gástrico, cáncer de esófago, cáncer de páncreas, cáncer de pulmón, cáncer de ovario, cáncer de colon, cáncer de hígado, cáncer de cabeza y cuello y cáncer de vesícula biliar.
ES19910759T 2019-01-15 2019-12-06 Anticuerpos de cadena pesada (VHH) contra claudina 18A2 y uso de los mismos Active ES2991026T3 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910033995.4A CN111434692B (zh) 2019-01-15 2019-01-15 抗cld18a2纳米抗体及其应用
PCT/CN2019/123537 WO2020147451A1 (zh) 2019-01-15 2019-12-06 抗cld18a2纳米抗体及其应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2991026T3 true ES2991026T3 (es) 2024-12-02

Family

ID=71580029

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES19910759T Active ES2991026T3 (es) 2019-01-15 2019-12-06 Anticuerpos de cadena pesada (VHH) contra claudina 18A2 y uso de los mismos

Country Status (7)

Country Link
US (1) US11560427B2 (es)
EP (1) EP3913001B1 (es)
JP (1) JP7061235B2 (es)
CN (4) CN114106183B (es)
AU (1) AU2019422629B2 (es)
ES (1) ES2991026T3 (es)
WO (1) WO2020147451A1 (es)

Families Citing this family (34)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111235113A (zh) * 2020-01-21 2020-06-05 南京北恒生物科技有限公司 包含嵌合抗原受体的免疫细胞及其用途
CN114222761B (zh) * 2020-07-14 2024-02-20 浙江道尔生物科技有限公司 一种抗cld18a2的单域抗体
CN114057890A (zh) * 2020-07-31 2022-02-18 南京北恒生物科技有限公司 新型共刺激结构域及其用途
CN114075286A (zh) * 2020-08-21 2022-02-22 张家港博泽利斯生物技术有限公司 一种抗人cxcr1蛋白单克隆抗体的制备方法
US20240034784A1 (en) * 2020-09-30 2024-02-01 Nanjing GenScript Biotech Co., Ltd. Antibodies targeting human claudin 18.2 and uses thereof
US20240109963A1 (en) * 2020-11-16 2024-04-04 Ab Therapeutics, Inc. Multispecific antibodies and uses thereof
CN112480248B (zh) * 2020-11-24 2023-05-05 三优生物医药(上海)有限公司 与cld18a2特异性结合的分子
CN114605539B (zh) * 2020-12-09 2024-01-02 南京融捷康生物科技有限公司 人源化的抗IL-4Rα单域抗体及其应用
US11795224B2 (en) * 2021-03-24 2023-10-24 China Medical University Hospital Anti-T-cell nanobody and nucleic acid encoding sequence thereof, and uses of the same
CN115403671B (zh) * 2021-05-28 2026-03-20 南京北恒生物科技有限公司 靶向Claudin18.2的纳米抗体及其用途
CN113444178B (zh) * 2021-06-17 2022-12-02 南京蓝盾生物科技有限公司 抗cd70内化的抗体、抗体偶联物及其应用
CN115611983A (zh) * 2021-07-14 2023-01-17 三优生物医药(上海)有限公司 Cldn18.2结合分子及其用途
CN113754770B (zh) * 2021-10-21 2023-11-03 江苏诺迈博生物医药科技有限公司 一种特异性结合人ctla4的抗体及包含其的药物和试剂盒
CN116253793A (zh) * 2021-12-10 2023-06-13 深圳先进技术研究院 一种纳米抗体及其制备方法和应用
CN118139892A (zh) * 2022-01-14 2024-06-04 浙江道尔生物科技有限公司 一种三靶点抗肿瘤药物、其制备方法及其应用
CN115043934B (zh) * 2022-03-31 2023-06-27 深圳市人民医院 靶向新冠病毒的纳米抗体及其制备方法和应用
CN114507287B (zh) * 2022-04-20 2022-07-05 苏州百道医疗科技有限公司 一种抗cldn18.2重组兔单克隆抗体及其应用
AU2023276514A1 (en) * 2022-05-27 2024-12-05 Shenzhen Immunofoco Biotechnology Co., Ltd. Chimeric antigen receptor containing cldn18.2 single domain antibody and application thereof
CN115724972B (zh) * 2022-09-06 2024-08-20 河北森朗生物科技有限公司 抗cd123的纳米抗体、嵌合抗原受体及其应用
TW202440623A (zh) * 2022-11-28 2024-10-16 美商艾洛基因醫療公司 靶向密連蛋白１８﹒２之嵌合抗原受體及結合劑以及其用途
CN116003606B (zh) * 2023-01-03 2023-06-20 上海百英生物科技股份有限公司 一种tigit纳米抗体及其制备方法与应用
WO2025035310A1 (zh) * 2023-08-11 2025-02-20 香港北恒生物科技有限公司 工程化免疫细胞及其用途
CN117304318B (zh) * 2023-08-25 2025-01-24 上海交通大学医学院附属仁济医院 Claudin18.2特异性分子影像探针及其制备方法和应用
CN117304323A (zh) * 2023-09-28 2023-12-29 南京蓬勃生物科技有限公司 结合Claudin 18.2的结合部分及其应用
CN117660527B (zh) * 2023-10-19 2024-07-23 上海交通大学医学院附属瑞金医院 一种ABCA7-Floxp小鼠模型的构建方法和应用
CN117417441B (zh) * 2023-10-19 2024-05-07 江苏大方生物工程有限公司 一条抗新城疫病毒的重组纳米抗体及其表达工程菌株和制备方法
CN117551199B (zh) * 2023-11-16 2024-04-19 杭州荣谷生物科技有限公司 一种Claudin18.2纳米抗体的制备方法及其应用
CN117843804B (zh) * 2023-12-29 2024-08-20 北京贝来药业有限公司 单域抗体串联分子及其序列、产品、制备和应用
CN117866903B (zh) * 2024-03-12 2024-06-04 北京贝来药业有限公司 单域抗体修饰的干细胞及其在疾病治疗中用途
CN117866904B (zh) * 2024-03-12 2024-06-07 北京贝来药业有限公司 基于单域抗体基因修饰的干细胞对于多种的疾病的制药用途
CN117860786B (zh) * 2024-03-12 2024-06-04 北京贝来药业有限公司 基因修饰间充质干细胞在多种疾病中的制药用途和诊断用途
WO2026006639A1 (en) * 2024-06-26 2026-01-02 Rutgers, The State University Of New Jersey Antigen binding molecules targeting transferrin receptor 1
WO2026030445A1 (en) 2024-07-30 2026-02-05 Wisconsin Alumni Research Foundation Degradation targeting agents and uses thereof
CN118580356B (zh) * 2024-08-02 2025-01-07 晟临生物医药(上海)有限公司 抗Claudin18.2的纳米抗体、嵌合抗原受体及其应用

Family Cites Families (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
EP1400536A1 (en) 1991-06-14 2004-03-24 Genentech Inc. Method for making humanized antibodies
EP1790664A1 (en) * 2005-11-24 2007-05-30 Ganymed Pharmaceuticals AG Monoclonal antibodies against claudin-18 for treatment of cancer
AU2016202322B2 (en) * 2005-11-24 2018-03-08 Astellas Pharma Inc. Monoclonal antibodies against claudin-18 for treatment of cancer
EP1997832A1 (en) * 2007-05-29 2008-12-03 Ganymed Pharmaceuticals AG Monoclonal antibodies against Claudin-18 for treatment of cancer
WO2013167153A1 (en) * 2012-05-09 2013-11-14 Ganymed Pharmaceuticals Ag Antibodies useful in cancer diagnosis
WO2013174404A1 (en) * 2012-05-23 2013-11-28 Ganymed Pharmaceuticals Ag Combination therapy involving antibodies against claudin 18.2 for treatment of cancer
HRP20200019T1 (hr) * 2013-03-18 2020-04-03 Astellas Pharma Inc. Terapija koja uključuje antitijela protiv klaudina 18.2 za liječenje raka
EP3057989A1 (en) * 2013-10-17 2016-08-24 ARSANIS Biosciences GmbH Cross-reactive staphylococcus aureus antibody sequences
CN120137055A (zh) * 2014-07-17 2025-06-13 恺兴生命科技(上海)有限公司 靶向cld18a2的t淋巴细胞及其制备方法和应用
WO2016165762A1 (en) * 2015-04-15 2016-10-20 Ganymed Pharmaceuticals Ag Drug conjugates comprising antibodies against claudin 18.2
WO2016180468A1 (en) 2015-05-11 2016-11-17 Biontech Cell & Gene Therapies Gmbh Claudin-18.2-specific immunoreceptors and t cell epitopes
CA3155409A1 (en) 2015-05-13 2016-11-17 Ablynx N.V. T cell recruiting polypeptides based on cd3 reactivity
AU2017294276B2 (en) * 2016-07-08 2024-08-01 Crage Medical Co., Limited Antibody for anti-claudin 18A2 and use thereof
WO2018009882A1 (en) * 2016-07-08 2018-01-11 Uchicago Argonne, Llc Functionalized foams
CN107793478B (zh) * 2016-09-06 2023-05-02 华道(上海)生物医药有限公司 一种抗cd19抗体及其制备方法和用途
CN107893052B (zh) * 2016-09-09 2023-11-03 科济生物医药（上海）有限公司 融合蛋白及其应用
CN107987170B (zh) * 2016-10-27 2018-12-18 浙江道尔生物科技有限公司 一种用于治疗肠道疾病的融合蛋白
CN110352068A (zh) * 2016-12-02 2019-10-18 南加利福尼亚大学 合成的免疫受体及其使用方法
CN108853144A (zh) * 2017-05-16 2018-11-23 科济生物医药（上海）有限公司 Toll样受体激动剂与免疫效应细胞的联用
CN108659130B (zh) * 2018-05-28 2021-09-10 长春力太生物技术有限公司 一种抗癌胚抗原纳米抗体及其应用
CN111867630B (zh) * 2018-06-17 2023-10-13 上海健信生物医药科技有限公司 靶向cldn18.2的抗体、双特异性抗体、adc和car及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN113817061A (zh) 2021-12-21
JP7061235B2 (ja) 2022-04-27
AU2019422629B2 (en) 2022-10-06
CN116333141A (zh) 2023-06-27
EP3913001A1 (en) 2021-11-24
CN114106183B (zh) 2023-06-23
CN113817061B (zh) 2022-11-04
CN114106183A (zh) 2022-03-01
AU2019422629A1 (en) 2021-09-02
EP3913001A9 (en) 2022-01-12
CN111434692A (zh) 2020-07-21
US20220259303A1 (en) 2022-08-18
EP3913001C0 (en) 2024-09-11
EP3913001B1 (en) 2024-09-11
CN116333141B (zh) 2025-10-03
CN111434692B (zh) 2021-12-31
JP2022516809A (ja) 2022-03-02
WO2020147451A1 (zh) 2020-07-23
US11560427B2 (en) 2023-01-24
EP3913001A4 (en) 2022-08-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2991026T3 (es) Anticuerpos de cadena pesada (VHH) contra claudina 18A2 y uso de los mismos
JP7594161B2 (ja) 修飾ｉｌ－２ポリペプチドを含むポリペプチド及びその使用
JP7000660B2 (ja) Ｒｏｒ１抗体組成物及び関連の方法
KR20200037250A (ko) 세포에 의해 발현되는 생물학적 활성을 조절하는 항체
RU2744862C2 (ru) Антитело против pd-l1
CN116731188A (zh) 抗pd-l1和vegf双特异性抗体及其应用
US20250353914A1 (en) Antigen-binding proteins and related methods of use
US11896619B2 (en) Compositions and methods for immunotherapy of NPM1c-positive cancer
JP7725066B2 (ja) ヒト化抗ｐｄ－ｌ１抗体
KR20240006506A (ko) 항-백시니아 바이러스 항원 항체 및 관련 조성물 및 방법
TW202144432A (zh) 磷脂醯肌醇蛋白聚糖－２結合部分、嵌合抗原受體及其用途
KR20230042090A (ko) 항-cd22 단일 도메인 항체 및 치료학적 작제물
WO2026061484A1 (en) NKp80-BINDING PROTEINS AND USES THEREOF
KR20250085636A (ko) 신규 항-myct1 인간항체 및 이의 용도
WO2025133609A1 (en) Polypeptide binding glypican-3
WO2024111635A1 (ja) 血液がんに対する抗体
KR20250001441A (ko) 인간화 항-myct1 항체 및 이의 용도
HK40123869A (zh) 针对血液癌的抗体
WO2026022767A1 (ko) B7-h3을 표적하는 항체, 및 이를 포함하는 키메라 항원 수용체
JP2025542097A (ja) 抗ａｆｐ／ｈｌａ０２ ｔｃｒ様抗体及びその使用
CN120500502A (zh) Trop2单域抗体、融合蛋白及其应用
HK40096481A (zh) 抗-gprc5d抗体、结合gprc5d和cd3的双特异性抗原结合分子及其用途
HK40084778A (en) Compositions and methods for immunotherapy of npm1c-positive cancer
CN117377687A (zh) 抗癌组合疗法中的ltbr激动剂