ES2991800T3 - Oligonucleótidos para inducir la expresión del UBE3A paterno - Google Patents

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Maj Hedtjärn
Marius Hoener
Ravi Jagasia
Mads Aaboe Jensen
Christoph Patsch
Lykke Pedersen
Søren Vestergaard Rasmussen
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Abstract

La presente invención se refiere a oligonucleótidos que son capaces de inducir la expresión de la ubiquitina-proteína ligasa E3A (UBE3A) a partir del alelo paterno en neuronas animales o humanas. Los oligonucleótidos se dirigen al supresor del alelo paterno UBE3A mediante hibridación con el ARN no codificante largo SNHG14 aguas abajo de SNORD109B. La presente invención se refiere además a composiciones farmacéuticas y métodos para el tratamiento del síndrome de Angelman. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Oligonucleótidos para inducir la expresión del UBE3A paterno
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a oligonucleótidos (oligómeros) que son complementarios e hibridan al SNHG14 cadena abajo de SNORD109B, conduciendo a la inducción de la expresión paterna de la proteína ubiquitina ligasa E3A (UBE3A) en un animal o ser humano. La presente invención se refiere además a composiciones farmacéuticas y métodos para el tratamiento del síndrome de Angelman.
ANTECEDENTES
El síndrome de Angelman es un trastorno neurogenético causado por la deleción o inactivación de los genes UBE3A en el cromosoma 15q11.2 de herencia materna. La copia paterna del gen UBE3A está sujeta a impronta genómica y silenciamiento en neuronas por un transcrito endógeno antisentido del UBE3A, denominado SNHG14 (también conocido como UBE3A-ATS) (Meng et al.2012 Hum Mol Genet. Vol.21 pp. 3001-12). Otros tipos celulares distintos de las neuronas parecen expresar el gen UBE3A tanto del alelo materno como del paterno.
El síndrome de Angelman se caracteriza por una grave discapacidad intelectual y del desarrollo, trastornos del sueño, convulsiones, movimientos espasmódicos, anomalías en el EEG, risa o sonrisa frecuentes y profundos trastornos del lenguaje.
El WO 2012/064806 divulga un método para inducir la expresión del UBE3A en una célula mediante el uso de un inhibidor de la topoisomerasa. El método puede utilizarse para tratar el síndrome de Angelman. No se divulgan oligonucleótidos antisentido.
El WO 2014/004572 divulga oligonucleótidos con modificaciones de 2'-O-metoxietil-ARN (MOE) dirigidos a UBE3A-ATS de ratón. Los oligonucleótidos sólo se prueban en ensayos relacionados con ratones. En la región cadena abajo del MBII-52 del ARNsno (también conocido como SNORD115) y cadena arriba del pre-ARNm del UBE3A no hay conservación entre el ratón y el ser humano. Por lo tanto, los oligonucleótidos dirigidos al UBE3A-ATS de ratón no pueden traducirse en oligonucleótidos que funcionen en el ser humano. No se han descrito oligonucleótidos dirigidos contra la UBE3A-ATS humana.
OBJETIVO DE LA INVENCIÓN
La presente invención identifica nuevos oligonucleótidos que inducen la expresión del UBE3A paterno humano en neuronas sin afectar significativamente a la expresión de los transcritos paternos SNORD115, SNORD116 y SNRPN.
RESUMEN DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a oligonucleótidos dirigidos a un ácido nucleico capaz de suprimir la expresión del UBE3A y tratar o prevenir enfermedades relacionadas con la disminución de la actividad del UBE3A, en particular en células neuronales.
Por consiguiente, en un primer aspecto la invención proporciona oligonucleótidos antisentido que comprenden una secuencia de nucleótidos contigua de 10 a 30 nucleótidos de longitud con al menos un 98 % de complementariedad con la parte del ARN no codificante largo del SNHG14 humano correspondiente a la posición 25278410 a 25419462 en el cromosoma 15 humano versión GRCh38.p2 para su uso en el tratamiento o prevención del síndrome de Angelman en un sujeto. Esta región también se parece a la SEQ ID NO: 1. El oligonucleótido es un oligonucleótido antisentido, preferentemente con un diseño de gápmero. El oligonucleótido es capaz de inducir la expresión de UBE3A, en particular la expresión de UBE3A paterna en una neurona, por degradación, reducción o eliminación del supresor UBE3A, en particular por reducción del transcrito de ARN no codificante largo SNHG14 cadena abajo de SNORD109B. Se logra la reexpresión de UBE3A, sin afectar significativamente la expresión de SNORD115. La degradación del ácido nucleico diana se logra preferentemente a través del reclutamiento de nucleasas.
En un aspecto adicional, la invención proporciona un oligonucleótido antisentido capaz de inducir la expresión de UBE3A paterno humano para uso en el tratamiento o prevención del síndrome de Angelman en un sujeto, en donde el oligonucleótido antisentido comprende una secuencia de nucleótidos contigua que es 100% complementaria a una región del ácido nucleico diana de la posición 1 a 55318 de la SEQ ID NO: 1, en donde el oligonucleótido es de 15 a 20 nucleótidos de longitud o de 17 a 22 nucleótidos de longitud, en donde el oligonucleótido comprende uno o más nucleósidos modificados, en donde el uno o más nucleósidos modificados es un nucleósido modificado con azúcar 2', en donde el uno o más nucleósidos modificados con azúcar 2' se selecciona independientemente del grupo que consiste en 2'-O-alquil-ARN, 2'-O-metil-ARN, 2'-alcoxi-RN, 2'-O-metoxietil-ARN, 2'-amino-ADN, 2'-fluoro-ADN, ácido arabino nucleico (ANA), 2'-fluoro-ANA y nucleósidos de LNA, en donde el oligonucleótido comprende al menos un enlace internudeosídico modificado, en donde el enlace internudeosídico modificado es un enlace fosforotioato, en donde el oligonucleótido es un gapmero de la fórmula F-G-F' en donde cada una de las regiones F y F' consiste independientemente en 2, 3, 4 o 5 unidades de nucleósido modificadas y la región G consiste en 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 unidades de nucleósido. En un aspecto adicional, la invención proporciona un conjugado para uso en el tratamiento o prevención del síndrome de Angelman en un sujeto, el conjugado que comprende un oligonucleótido antisentido de la invención y al menos una porción conjugada unida covalentemente al oligonucleótido.
En un aspecto adicional, la invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden los oligonucleótidos o conjugados de la invención y diluyentes, portadores, sales y/o adyuvantes farmacéuticamente aceptables.
En un aspecto adicional, la invención proporciona métodos para la inducciónin vitrode la expresión de UBE3A en una célula diana donde se suprime la expresión de UBE3A paterna, mediante la administración de un oligonucleótido, conjugado o composición de la invención en una cantidad eficaz a la célula.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1: La cadena superior ilustra la región del transcrito SNHG14 cadena abajo de SNORD109B (UBE3A-ATS) donde las cajas negras indican la ubicación de los oligonucleótidos de ratón probados. La cadena inferior ilustra la región codificante de UBE3A, donde las cajas negras indican exones. El exón 1 se ubica alrededor de 160kb. Los oligonucleótidos se colocan en la región antisentido del Exón 9 (posicionado a ~ 97kb), Exón 10 (posicionado a ~ 92kb), Exón 13 (posicionado a ~ 77kb) y el extremo 5' del Exón 16 (posicionado a ~60kb).
Figura 2: Representación de la capacidad de los oligonucleótidos, probados en el Ejemplo 2, para inducir la reexpresión de UBE3A en cultivos de células neuronales humanas. Oligonucleótidos complementarios a la región de ARN no codificante largo de SNHG14 humano entre SNORD109B y la región cadena arriba de la región codificante de UBE3A (posición 1 a 55318 de la SEQ ID NO: 1) se indican con • no superposición.
Oligonucleótidos complementarios a la región del ARN no codificante largo de SNHG14 humano que es antisentido al pre-ARNm de UBE3A (posición 55319 a 141053 de la SEQ ID NO: 1) se indican con ▲ superposición. Los oligonucleótidos de la Tabla 3 con protección para humanos y monos rhesus se indican en la parte inferior de cada gráfica como
. La conservación entre humanos:rhesus:ratón se indica mediante
. Las concentraciones de oligonucleótidos fueron 0.2, 1 y 5 microM como se indica en el lado derecho de cada gráfica.
DEFINICIONES
Oligonucleótidos
El término "oligonucleótido", tal como se utiliza en la presente, se define como una molécula que comprende dos o más nucleósidos enlazados covalentemente. Estos nucleósidos unidos covalentemente también pueden denominarse moléculas u oligómeros de ácido nucleico. Los oligonucleótidos suelen fabricarse en el laboratorio mediante síntesis química en fase sólida seguida de purificación. Cuando se hace referencia a una secuencia del oligonucleótido, se hace referencia a la secuencia u orden de las fracciones nucleobásicas, o modificaciones de las mismas, de los nucleótidos o nucleósidos enlazados covalentemente. El oligonucleótido de la invención es artificial y se sintetiza químicamente, y suele purificarse o aislarse. El oligonucleótido de la invención puede comprender uno o más nucleósidos o nucleótidos modificados.
Oligonucleótidos antisentido
El término "oligonucleótido antisentido", tal como se utiliza en la presente, se define como oligonucleótidos capaces de modular la expresión de un gen diana hibridándose a un ácido nucleico diana, en particular a una secuencia contigua en un ácido nucleico diana. Los oligonucleótidos antisentido no son esencialmente de doble cadena y, por tanto, no son ARNsi. Preferiblemente, los oligonucleótidos antisentido de la presente invención son de cadena única.
Secuencia de nucleótidos contiguos
El término "secuencia de nucleótidos contiguos" se refiere a la región del oligonucleótido que es complementaria al ácido nucleico diana. El término se utiliza indistintamente en la presente con el término "secuencia de nucleobases contiguas" y el término "secuencia de motivos oligonucleotídicos". En algunas realizaciones, todos los nucleótidos del oligonucleótido están presentes en la secuencia de nucleótidos contiguos. En algunas realizaciones, el oligonucleótido comprende la secuencia de nucleótidos contiguos y puede, opcionalmente, comprender otro(s) nucleótido(s), por ejemplo una región enlazadora de nucleótidos que puede utilizarse para unir un grupo funcional a la secuencia de nucleótidos contiguos. La región enlazadora de nucleótidos puede o no ser complementaria al ácido nucleico diana.
Nucleótidos
Los nucleótidos son los componentes básicos de los oligonucleótidos y polinucleótidos y, a efectos de la presente invención, incluyen nucleótidos naturales y no naturales. En la naturaleza, los nucleótidos, como los de ADN y ARN, contienen una fracción de azúcar ribosa, una fracción de nucleobase y uno o varios grupos fosfato (ausentes en los nucleósidos). Los nucleósidos y nucleótidos también pueden denominarse indistintamente "unidades" o "monómeros".
Nucleósido modificado
El término "nucleósido modificado" o "modificación de nucleósido", tal como se utiliza en la presente, se refiere a nucleósidos modificados en comparación con el nucleósido de ADN o ARN equivalente mediante la introducción de una o más modificaciones de la fracción de azúcar o de la fracción de (nucleo)base. En una realización preferida, el nucleósido modificado comprende una fracción de azúcar modificada. El término nucleósido modificado también puede utilizarse en la presente de forma intercambiable con el término "análogo de nucleósido" o "unidades" o "monómeros" modificados.
Enlace internucleósido modificado
El término "enlace internucleosídico modificado" se define como se entiende en general por el experto en la técnica
como enlaces distintos de los enlaces fosfodiéster (PO), que acoplan covalentemente dos nucleósidos entre sí. Los nucleótidos con enlace internucleosídico modificado también se denominan "nucleótidos modificados". En algunas realizaciones, el enlace internucleosídico modificado incrementa la resistencia a las nucleasas del
oligonucleótido en comparación con un enlace fosfodiéster. En los oligonucleótidos naturales, el enlace internucleosídico incluye grupos fosfato que crean una unión fosfodiéster entre nucleósidos adyacentes. Los enlaces internucleosídicos modificados son en particular útiles en la estabilización de oligonucleótidos para usoin vivo,y pueden servir para proteger frente a la escisión de nucleasas en regiones de nucleósidos de ADN o ARN en el oligonucleótido de la invención, por ejemplo, dentro de la región de hueco de un oligonucleótido gámpero, así como en regiones de nucleósidos modificados.
En una realización, el oligonucleótido comprende uno o más enlaces internucleosídicos modificados del fosfodiéster natural a un enlace que es, por ejemplo, más resistente al ataque de nucleasas. La resistencia a las nucleasas se puede determinar incubando el oligonucleótido en suero sanguíneo o usando un ensayo de resistencia a las nucleasas (por ejemplo, fosfodiesterasa de veneno de serpiente (SVPD)), ambos son bien conocidos en la técnica. Los enlaces internucleosídicos capaces de potenciar la resistencia a las nucleasas de un oligonucleótido se denominan enlaces internucleosídicos resistentes a las nucleasas. En realizaciones preferidas, se modifican al menos un 50 % de los enlaces internucleosídicos en el oligonucleótido, o la secuencia de nucleótidos
contiguos del mismo, se modifican, tal como al menos un 60 %, tal como al menos un 70 %, tal como al menos un 80 o tal como al menos un 90 % de los enlaces internucleosídicos en el oligonucleótido, o la secuencia de nucleótidos contiguos del mismo. En algunas realizaciones se modifican todos los enlaces
internucleosídicos del oligonucleótido, o la secuencia de nucleótidos contiguos del mismo. Se reconocerá que, en algunas realizaciones, los nucleósidos que unen el oligonucleótido de la invención a un grupo funcional no nucleotídico, tal como un conjugado, pueden ser fosfodiéster. En algunas realizaciones, todos los enlaces internucleosídicos del oligonucleótido, o la secuencia de nucleótidos contiguos del mismo, son enlaces internucleosídicos resistentes a las nucleasas.
Los enlaces internucleosídicos modificados se pueden seleccionar del grupo que comprende fosforotioato, difosforotioato y boranofosfato. En realizaciones preferidas, los enlaces internucleosídicos modificados son compatibles con el reclutamiento de la RNasaH del oligonucleótido de la invención, por ejemplo, fosforotioato, difosforotioato o boranofosfato.
En algunas realizaciones, el enlace intemucleosídico comprende azufre (S), tal como un enlace internudeosídico de fosforotioato.
Un enlace internucleosídico de fosforotioato es en particular útil debido a la resistencia a las nucleasas, la farmacocinética beneficiosa y la facilidad de fabricación. En realizaciones preferidas, al menos un 50 % de los enlaces internucleosídicos en el oligonucleótido, o la secuencia de nucleótidos contiguos del mismo, son fosforotioato, tal como al menos un 60 %, tal como al menos un 70 %, tal como al menos un 80 o tal como al menos un 90 % de los enlaces internucleosídicos en el oligonucleótido, o la secuencia de nucleótidos contiguos del mismo son fosforotioato. En algunas realizaciones, todos los enlaces internucleosídicos del oligonucleótido, o la secuencia de nucleótidos contiguos del mismo, son fosforotioato.
En algunas realizaciones, el oligonucleótido comprende uno o más enlaces internucleosídicos neutros, en particular un enlace internucleosídico seleccionado de fosfotriéster, metilfosfonato, MMI, amida-3, formacetal o tioformacetal.
En el WO2009/124238 se divulgan otros enlaces internucleosídicos. En una realización, el enlace internucleosídico se selecciona de los conectores divulgados en el WO2007/031091. En particular, el enlace internucleosídico se puede seleccionar de -O-P(O)2-O-, -O-P(O,S)-O-, -O-P(S)z-O-, -S-P(O)z-O-, -S-P(O,S)-O-, -S-P(S)z-O-, -O-P(O)2-S-, -O-P(O,S)-S-, -S-P(O)<2>-S-, -O-PO(RH)-O-, 0-PO(OCH<3>)-O-, -O-PO(NR<h>)-O-, -O-PO(OCH<2>CH<2>S-R)-O-, -O-PO(BHa)-O-, -O-PO(NHR<h>)-O-, -OP(O)2-NR<h>-, -NR<h>-P(O)2-O-, -NR<h>-CO-O-, -NR<h>-CO-NR<h>-, y/o el enlace internucleosídico puede seleccionarse del grupo que consiste en: -O-CO-O-, -O-CO-NRH-, -NR<h>-CO-CH2-, -O-CHz-CO-NRH-, -O-CH2-CH2-NR<h>-, -CO-NR<h>-CH2-, -CH2-NR<h>CO-, -O-CH2-CH2-S-, -S-CH2-CH2-O-, -S-CH2-CH2-S-, -CH2-SO2-CH2-, -CH2-CO-NR<h>-, -O-CH2-CH2-NR"-CO -, -CH2-NCH3-O-CH2-, donde RH se selecciona de hidrógeno y alquilo de C1-4.
Los enlaces resistentes a las nucleasas, tales como los enlaces de fosfotioato, son en particular útiles en regiones de oligonucleótidos capaces de reclutar nucleasas cuando forman un dúplex con el ácido nucleico diana, tal como la región G para gápmeros, o la región de nucleósidos no modificados de los oligómeros de cabeza y oligómeros de cola. Sin embargo, los enlaces de fosforotioato también pueden ser útiles en regiones que no reclutan nucleasas y/o en regiones potenciadoras de la afinidad, como las regiones F y F' de los gápmeros, o la región de nucleósidos modificados de los oligómeros de cabeza y oligómeros de cola.
No obstante, cada una de las regiones de diseño puede comprender enlaces internucleosídicos distintos de fosforotioato, tales como enlaces fosfodiéster, en particular en regiones donde los nucleósidos modificados, tales como el LNA, protegen el enlace frente a la degradación por nucleasa. La inclusión de enlaces fosfodiéster, tales como uno o dos enlaces, en particular entre o contiguos a unidades de nucleósidos modificados (típicamente en las regiones de reclutamiento no de nucleasas) puede modificar la biodisponibilidad y/o biodistribución de un oligonucleótido; véase el WO2008/113832.
En una realización, todos los enlaces internucleosídicos en el oligonucleótido son enlaces fosforotioato y/o boranofosfato. Preferentemente, todos los enlaces internucleosídicos en el oligonucleótido son enlaces fosforotioato.
Nucleobase
El término nucleobase incluye la fracción de purina (por ejemplo, adenina y guanina) y pirimidina (por ejemplo, uracilo, timina y citosina) presente en nucleósidos y nucleótidos que forman uniones de hidrógeno en la hibridación de ácidos nucleicos. En el contexto de la presente invención, el término nucleobase también abarca nucleobases modificadas que pueden diferir de las nucleobases naturales, pero que son funcionales durante la hibridación de ácidos nucleicos. En este contexto, "'nucleobase" se refiere tanto a las nucleobases naturales, tales como adenina, guanina, citosina, timidina, uracilo, xantina y hipoxantina, como a las variantes no naturales. Tales variantes se describen, por ejemplo, en Hiraoet al.(2012) Accounts of Chemical Research vol 45 página 2055 y Bergstrom (2009) Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry Suppl. 371.4.1.
En algunas realizaciones, la fracción de nucleobase se modifica cambiando la purina o pirimidina en una purina o pirimidina modificada, como una purina sustituida o pirimidina sustituida, tal como una nucleobase seleccionada entre isocitosina, pseudoisocitosina, 5-metilcitosina, 5-tiozolo-citosina, 5-propinil-citosina, 5-propinil-uracilo, 5-bromouracilo, 5-tiazolo-uracilo, 2-tiouracilo, 2'tiotimina, inosina, diaminopurina, 6-aminopurina, 2-aminopurina, 2,6-diaminopurina y 2-cloro-6-aminopurina.
Las fracciones de nucleobase pueden indicarse mediante el código de letras de cada nucleobase correspondiente, por ejemplo A, T, G, C o U, en donde cada letra puede incluir opcionalmente nucleobases modificadas de función equivalente. Por ejemplo, en los oligonucleótidos ejemplificados, las fracciones de nucleobase se seleccionan entre A, T, G, C y 5-metilcitosina. Opcionalmente, para los gámperos de LNA, se pueden utilizar nucleósidos de LNA de 5-metilcitosina.
Oligonucleótido modificado
El término oligonucleótido modificado describe un oligonucleótido que comprende uno o más nucleósidos modificados con azúcar y/o enlaces internucleósidos modificados. El término «oligonucleótido quimérico" es un término que se ha utilizado en la literatura para describir oligonucleótidos con nucleósidos modificados.
Com plem entariedad
El término complementariedad describe la capacidad de emparejamiento de bases de Watson-Crick de los nucleósidos/nucleótidos. Los pares de bases de Watson-Crick son guanina (G)-citosina (C) y adenina (A)-timina (T)/uracilo (U). Se entenderá que los oligonucleótidos pueden comprender nucleósidos con nucleobases modificadas, por ejemplo, la 5-metilcitosina se utiliza a menudo en lugar de la citosina, y como tal el término complementariedad abarca el emparejamiento de bases Watson Crick entre nucleobases no modificadas y modificadas (véase por ejemplo Hiraoetal.,(2012) Accounts of Chemical Research vol 45 página 2055 y Bergstrom (2009) Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry Suppl. 371.4.1).
El término "% complementario", tal como se utiliza en la presente, se refiere al número de nucleótidos en porcentaje de una secuencia de nucleótidos contigua en una molécula de ácido nucleico (por ejemplo, oligonucleótido) que, en una posición dada, son complementarios (es decir, forman pares de bases de Watson Crick con) una secuencia de nucleótidos contigua, en una posición dada de una molécula de ácido nucleico separada (por ejemplo, el ácido nucleico diana). El porcentaje se calcula contando el número de bases alineadas que forman pares entre las dos secuencias, dividiendo por el número total de nucleótidos del oligonucleótido y multiplicando por 100. En una comparación de este tipo, una nucleobase/nucleótido que no se alinea (forma un par de bases) se denomina emparejamiento erróneo.
El término "completamente complementario" se refiere al 100 % de complementariedad.
Hibridación
El término "hibridar" o "hibrida", tal como se usa en la presente, se debe entender como dos cadenas de ácido nucleico (por ejemplo, un oligonucleótido y un ácido nucleico diana) que forman enlaces de hidrógeno entre pares de bases en cadenas opuestas, formando así un dúplex. La afinidad de la unión entre dos cadenas de ácido nucleico es la fuerza de la hibridación. A menudo se describe en términos de la temperatura de fusión (Tm) definida como la temperatura a la que la mitad de los oligonucleótidos se duplican con el ácido nucleico diana. En condiciones fisiológicas, Tm no es estrictamente proporcional a la afinidad (Mergny y Lacroix, 2003,Oligonucleotides 13:515-537). La energía libre de Gibbs de estado estándar AG° es una representación más precisa de la afinidad de unión y está relacionada con la constante de disociación (Kd) de la reacción por AG°= -RTIn (Kd), donde R es la constante de gas y T es la temperatura absoluta. Por lo tanto, un AG° muy bajo de la reacción entre un oligonucleótido y el ácido nucleico diana refleja una fuerte hibridación entre el oligonucleótido y el ácido nucleico diana. AG° es la energía asociada con una reacción donde las concentraciones acuosas son 1M, el pH es 7 y la temperatura es 37°C. La hibridación de oligonucleótidos a un ácido nucleico diana es una reacción espontánea y para reacciones espontáneas AG° es menor que cero. AG° se puede medir experimentalmente, por ejemplo, mediante el uso del método de calorimetría de titulación isotérmica (ITC) como se describe en Hansen et al., 1965, Chem. Comm. 36-38 y Holdgate et al., 2005, Drug Discov Today. El experto sabrá que hay equipos comerciales disponibles para las mediciones de AG°. AG° también se puede estimar numéricamente utilizando el modelo del vecino más cercano como se describe en SantaLucia, 1998, Proc Natl Acad Sci, EE. UU. 95: 1460-1465 utilizando parámetros termodinámicos derivados adecuadamente descritos por Sugimoto et al., 1995, Biochemistry 34:11211-11216 y McTigue et al., 2004, Biochemistry 43:5388-5405. Con el fin de tener la posibilidad de modular su diana de ácido nucleico deseada mediante hibridación, los oligonucleótidos de la presente invención se hibridan con un ácido nucleico diana con valores AG° estimados por debajo de -10 kcal para oligonucleótidos que tienen una longitud de 10-30 nucleótidos. En algunas modalidades, el grado o la fuerza de hibridación se mide por la energía libre de Gibbs de estado estándar AG°. Los oligonucleótidos pueden hibridarse con un ácido nucleico diana con valores AG° estimados por debajo del intervalo de -10 kcal, tal como por debajo de -15 kcal, tal como por debajo de -20 kcal y tal como por debajo de -25 kcal para oligonucleótidos que tienen una longitud de 8-30 nucleótidos. En algunas modalidades, los oligonucleótidos se hibridan con un ácido nucleico diana con un valor AG° estimado de -10 a -60 kcal, tal como -12 a -40, tal como de -15 a -30 kcal o-16 a -27 kcal tal como -18 a -25 kcal.
La diana
La diana se refiere a la proteína que se desea modular.
Ácido nucleico diana
Un ácido nucleico diana es la diana prevista con la que se hibrida el oligonucleótido de la invención, y puede ser, por ejemplo, un gen, un ARN, un ARN no codificante, un ARN no codificante largo, un ARNm y pre-ARNm, un ARNm maduro o una secuencia de ADNc. En algunas realizaciones, el ácido nucleico objetivo es un ARN no codificante o un ARN no codificante largo, o una subsecuencia del mismo. Para la aplicaciónin vivooin vitro ,el oligonucleótido de la invención es capaz de disminuir el nivel del transcrito SNHG14 en dirección 3' de SNORD109B y de este modo, aliviar la supresión del transcrito de UBE3A paterno en la célula diana prevista. La secuencia contigua de nucleobases del oligonucleótido de la invención es complementaria al ácido nucleico objetivo, medido a lo largo del oligonucleótido, opcionalmente con la excepción de uno o dos apareamientos erróneos, y opcionalmente excluyendo las regiones enlazadoras basadas en nucleótidos que pueden enlazar el oligonucleótido a un grupo funcional opcional como un conjugado.
Secuencia diana
El oligonucleótido comprende una secuencia contigua de nucleótidos que es complementaria o hibrida con una subsecuencia de la molécula de ácido nucleico diana. El término "secuencia diana", tal como se utiliza en la presente, se refiere a una secuencia de nucleótidos presente en el ácido nucleico diana que comprende la secuencia de nucleobases complementaria al oligonucleótido de la invención. En algunas realizaciones, la secuencia diana consiste en una región en el ácido nucleico diana que es complementaria a la secuencia de nucleótidos contiguos del oligonucleótido de la invención. En algunas realizaciones, la secuencia diana es más larga que la secuencia complementaria de un único oligonucleótido y, por ejemplo, puede representar una región preferente del ácido nucleico diana que se puede seleccionar por varios oligonucleótidos de la invención.
El oligonucleótido de la invención comprende una secuencia de nucleótidos contiguos que es complementaria al ácido nucleico diana, tal como una secuencia diana.
El oligonucleótido comprende una secuencia de nucleótidos contiguos de al menos 8 nucleótidos que es complementaria a, o se hibrida a, una secuencia diana presente en la molécula de ácido nucleico diana. La secuencia de nucleótidos contiguos (y por lo tanto la secuencia diana) comprende al menos 8 nucleótidos contiguos, tal como 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 nucleótidos contiguos, tal como de 12 a 25, tal como de 14 a 18 nucleótidos contiguos.
Célula diana
El término célula diana, tal como se utiliza en la presente, se refiere a una célula que expresa el ácido nucleico diana. En algunas realizaciones, la célula diana puede serin vivooin vitro.En algunas realizaciones, la célula diana es una célula de mamífero, tal como una célula de roedor, tal como una célula de ratón o una célula de rata, o una célula de primate, tal como una célula de mono o una célula humana. En realizaciones preferidas, la célula diana es una célula neuronal.
Variante natural
El término "variante natural" se refiere a variantes del transcrito SNHG14 cadena abajo del gen SNORD109B o transcritos que se originan a partir de los mismoslocigenéticos que el ácido nucleico diana, pero que pueden diferir, por ejemplo, en virtud de la degeneración del código genético que causa una multiplicidad de codones en el ARN no codificante largo. Por lo tanto, el oligonucleótido de la invención se puede diseñar para seleccionar al ácido nucleico diana y las variantes naturales del mismo.
Modulación de la expresión
El término "modulación de la expresión", tal como se utiliza en la presente, se debe entender como un término general para la capacidad de un oligonucleótido de alterar la cantidad de proteína UBE3A en comparación con la cantidad de UBE3<a>antes de la administración del oligonucleótido. De forma alternativa, la modulación de la expresión se puede determinar por referencia a un experimento de control donde no se administra el oligonucleótido de la invención. La modulación efectuada por el oligonucleótido está relacionada con su capacidad para reducir, eliminar, retirar, prevenir, decrecer, disminuir, o terminar la supresión del transcrito UBE3A paterno, por ejemplo, por degradación o retirada del transcrito SNHG14 no codificante cadena abajo del SNORD109B o por bloqueo o prevención de la actividad de la polimerasa asociada con el transcrito SNHG14 cadena abajo del SNORD109B. La modulación también se puede ver como la capacidad del oligonucleótido para restaurar, incrementar, o potenciar la expresión del UBE3A paterno, por ejemplo, mediante la eliminación o el bloqueo de los mecanismos inhibidores afectados por el transcrito SNHG14 no codificante cadena abajo del SNORD109B.
Nucleósidos modificados de alta afinidad
Un nucleósido modificado de alta afinidad es un nucleótido modificado que, cuando se incorpora en el oligonucleótido potencia la afinidad del oligonucleótido por su diana complementaria, por ejemplo como se mide por la temperatura de fusión (Tm). Un nucleósido modificado de alta afinidad de la presente invención produce preferentemente un aumento de la temperatura de fusión entre 0,5 y 12 °C, más preferentemente entre 1,5 y 10 °C y más preferentemente entre 3 y 8°C por nucleósido modificado. Son conocidos en la técnica numerosos nucleósidos modificados de alta afinidad e incluyen, por ejemplo, muchos nucleósidos sustituidos en 2' así como ácidos nucleicos bloqueados (LNA) (véase, por ejemplo, Freier & Altmann; Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429-4443 y Uhlmann; Curr. Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213).
Modificaciones de azúcar
El oligómero de la invención puede comprender uno o más nucleósidos que tienen una porción de azúcar modificado,es decir,una modificación de la porción de azúcar en comparación con la porción de azúcar ribosa que se encuentra en el ADN y el ARN.
Se han realizado numerosos nucleósidos con modificación de la porción de azúcar ribosa, principalmente con el objetivo de mejorar ciertas propiedades de los oligonucleótidos, tal como la afinidad y/o la resistencia a las nucleasas.
Estas modificaciones incluyen aquellas en las que se modifica la estructura del anillo de ribosa, por ejemplo, mediante reemplazo con un anillo de hexosa (HNA), o un anillo bicíclico, que típicamente tiene un puente birradiclo entre los carbonos C2 y C4 en el anillo de ribosa (LNA), o un anillo de ribosa no unido que típicamente carece de un enlace entre los carbonos C2 y C3 (por ejemplo, UNA). Otros nucleósidos modificados con azúcar incluyen, por ejemplo, ácidos nucleicos de biciclohexosa (WO2011/017521) o ácidos nucleicos tricíclicos (WO2013/154798). Los nucleósidos modificados también incluyen nucleósidos donde la porción de azúcar se reemplaza con una porción sin azúcar, por ejemplo, en el caso de ácidos nucleicos peptídicos (PNA) o ácidos nucleicos de morfolino.
Las modificaciones del azúcar también incluyen modificaciones realizadas mediante la alteración de los grupos sustituyentes en el anillo de ribosa a grupos distintos del hidrógeno, o el grupo 2'-OH que se encuentra naturalmente en los nucleósidos de ADN y ARN. Los sustituyentes se pueden, por ejemplo, introducir en las posiciones 2', 3', 4' o 5'. Los nucleósidos con porciones modificadas con azúcar también incluyen nucleósidos modificados en 2', tal como nucleósidos sustituidos en 2'. De hecho, se ha prestado mucha atención al desarrollo de nucleósidos 2' sustituidos, y se ha encontrado que numerosos nucleósidos 2' sustituidos tienen propiedades beneficiosas cuando se incorporan a oligonucleótidos, tal como una mayor resistencia a los nucleósidos y una mayor afinidad.
Nucleósidos modificados en 2'.
Un nucleósido modificado con azúcar en 2' es un nucleósido que tiene un sustituyente distinto de H o -OH en la posición 2' (nucleósido sustituido en 2') o comprende un birradiclo enlazado en 2', e incluye nucleósidos sustituidos en 2' y nucleósidos (puenteado de birradiclo 2' - 4') de LNA . Por ejemplo, el azúcar modificado en 2' puede proporcionar una afinidad de unión mejorada y/o una mayor resistencia a la nucleasa al oligonucleótido. Ejemplos de nucleósidos modificados sustituidos en 2' son 2'-O-alquil-ARN, 2'-O-metil-ARN, 2' -alcoxi-RN, 2'-O-metoxietil-ARN (Moe), 2' -amino-ARN, 2'-Fluoro-ARN y 2'-fluoro-ANA (F-ANA). Para obtener más ejemplos, consulte, por ejemplo, Freier & Altmann; Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429-4443 y Uhlmann; Curr. Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213; y Deleavey y Damha, Chemistry and Biology 2012, 19, 937. Más adelante se muestran ilustraciones de algunos nucleósidos modificados sustituidos en 2'.
Nucleósidos de ácidos nucleicos bloqueados (LNn).
Los nucleósidos de LNA son nucleósidos modificados que comprenden un grupo enlazador (denominado bi rradiclo o puente) entre C2' y C4' del anillo de azúcar ribosa de un nucleótido. Estos nucleósidos también se denominan ácido nucleico puenteado o ácido nucleico bicíclico (BNA) en la bibliografía.
En algunas modalidades, el nucleósido modificado o los nucleósidos de LNA del oligómero de la invención tienen una estructura general de la fórmula I o II:
en donde W se selecciona de -O-, -S-, -N(Ra)-, -C(RaRb)-, tal como, en algunas modalidades -O-;
B designa una nucleobase o porción de nucleobase modificado;
Z designa un enlace internucleosídico a un nucleósido adyacente, o un grupo 5'-terminal;
Z* designa un enlace internucleosídico a un nucleósido adyacente, o un grupo 3'-terminal;
X designa un grupo seleccionado de la lista que consiste en -C(R a Rb)-, -C(R a)=C(Rb)-, - C(R a)=N-, -O-, -Si(R a)2-, -S-, -SO2-, -N(R a)- y >C=Z
En algunas modalidades, X se selecciona del grupo que consiste en: -O-, -S-, NH-, NRaRb, -CH2-, CRaRb, -C(=CH2)-y -C(=CRaRb)-En algunas modalidades, X es -O-Y designa un grupo seleccionado del grupo que consiste en -C(R a Rb)-, -C(R a)=C(Rb)-, - C(R a)=N-, -O-, -Si(R a)2-, -S-, -SO2-, -N(R a)- y >C=Z
En algunas modalidades, Y se selecciona del grupo que consiste en: -CH2-, -C(RaRb)-, - CH2CH2-, -C(RaRb)-C(RaRb)-, -CH2CH2CH2-, -C(RaRb)C(RaRb)C(RaRb)-, -C(Ra)=C(Rb)-, y -C(Ra)=N-En algunas realizaciones, Y se selecciona del grupo que consiste en: -CH2-, -CHRa-, - CHCH3-, CRaRbo -X-Y- en conjunto designan un grupo enlazador bivalente (también denominado radícula) en conjunto designan un grupo enlazador bivalente que consiste en 1, 2, 3 o 4 grupos/átomos seleccionados del grupo que consiste en -C(R a Rb)-, -C(R a)=C(Rb)-, -C(R a)=N-, -O-, -Si(R a)2-, -S-, -SO2-, -N(R a)-, y >C=Z,
En algunas modalidades, -X-Y- designa un birradiclo seleccionado de los grupos que consisten en: -X-CH2-, -X-CRaRb-, -X-CHRa', -X-C(HCH<3>)-, -O-Y-, -O-CH2-, -S-CH2-, -NH-CH2-, -O-CHCH3-, -CH2-O-CH2, -O-CH(CH<3>CH<3>)-, -O-CH2-CH2-, OCH2-CH2-CH2-,-O-CH2OCH2-,-O-NCH2-, -C(=CH2)-CH2-, -NRa-CH2-, N-O-CH2, -S-CRaRb- y -S-CHRa-.
En algunas realizaciones -X-Y- designa -O-CH2- u -O-CH(CH<3>)-.
en donde Z se selecciona de -O-, -S- y -N(Ra)-,
y Ra y, cuando está presente Rb, cada uno se selecciona independientemente de hidrógeno, alquilo de C1-6 opcionalmente sustituido, alquenilo de C2-6 opcionalmente sustituido, alquinilo de C2-6 opcionalmente sustituido, hidroxi, alcoxi de C1-6 opcionalmente sustituido, alcoxialquilo de C2-6, alqueniloxi de C2-6, carboxi, alcoxicarbonilo de C1-6, alquilcarbonilo de C1-6, formilo, arilo, ariloxi-carbonilo, ariloxi, arilcarbonilo, heteroarilo, heteroariloxi-carbonilo, heteroariloxi, heteroarilcarbonilo, amino, mono y di(alquilo de C1-<6>)amino, carbamoilo, mono y di(alquil de C1-6) -amino-carbonilo, amino-alquilaminocarbonilo de C1-6, mono y di(alquil de C1-6)amino-alquil-aminocarbonilo de C1-6, alquilcarbonilamino de C1-6, carbamido, alcanoiloxi de Ci<-6>, sulfono, alquilsulfoniloxi de Ci<-6>, nitro, azido, sulfanilo, alquiltio de Ci<-6>, halógeno, donde arilo y heteroarilo pueden estar opcionalmente sustituidos y dos sustituyentes gemínales Ra y Rb designan junto con metileno pueden estar opcionalmente sustituidos (CH2), en donde todos los grupos quimétricos pueden ser encontrados en la orientación o S.
en donde R<1>, R<2>, R<3>, R<5>y R5* se seleccionan independientemente del grupo que consiste en: hidrógeno, alquilo de C1-6 opcionalmente sustituido, alquenilo de C2-6 opcionalmente sustituido, alquinilo de C2-6 opcionalmente sustituido, hidroxi, alcoxi de C1-6, alcoxialquilo de C2-6, alqueniloxi de C2-6, carboxi, alcoxicarbonilo de C1-6, alquilcarbonilo de C1-6, formilo, arilo, ariloxi-carbonilo, ariloxi, arilcarbonilo, heteroarilo, heteroariloxi-carbonilo, heteroariloxi, heteroarilcarbonilo, amino, mono y di(alquilo de C1-<6>)amino, carbamoílo, mono y di(alquil de C1-6)-amino-carbonilo, amino-alquilaminocarbonilo de C1-6, mono y di(alquil de C1-6)amino- -alquil-aminocarbonilo de C1-6, alquilcarbonilamino de C1-6, carbamido, alcanoíloxi de C1-6, sulfono, alquilsulfoniloxi de C1-6, nitro, azido, sulfanilo, alquiltio de C1-6, halógeno, donde arilo y heteroarilo se pueden sustituir opcionalmente, y donde dos sustituyentes geminales designan juntos pueden ser oxoxo, imino, o metileno opcionalmente sustituido.
En algunas modalidades, R<1>, R<2>, R<3>, R<5>y R5* se seleccionan independientemente de alquilo C1-6, tal como metilo e hidrógeno.
En algunas modalidades, R<1>, R<2>, R<3>, R<5>y R5* son todos hidrógeno.
En algunas modalidades, R<1>, R<2>, R<3>, son todos hidrógeno, y cualquiera de R<5>y R5* también es hidrógeno y el otro de R<5>y R5*es distinto de hidrógeno, tal como alquilo de C1-6 tal como metilo.
En algunas modalidades, Ra es hidrógeno o metilo. En algunas modalidades, cuando está presente, Rb es hidrógeno o metilo.
En algunas modalidades, uno o ambos de Ra y Rb es hidrógeno
En algunas modalidades, uno de Ra y Rb es hidrógeno y el otro es distinto de hidrógeno
En algunas modalidades, uno de Ra y Rb es metilo y el otro es hidrógeno
En algunas modalidades, tanto Ra como Rb son metilo.
En algunas modalidades, el birradiclo -X-Y- es -O-CH2-, W es O, y todos de R<1>, R<2>, R<3>, R<5>y R5* son todos hidrógeno. Estos nucleósidos de LNA se divulgan en WO99/014226, WO00/66604, WO98/039352 y WO2004/046160, e incluyen lo que comúnmente se conoce como nucleósidos de beta-D-oxi LNA y alfa-L-oxi lNa .
En algunas modalidades, el birradiclo -X-Y- es -S-CH2-, W es O, y todos de R<1>, R<2>, R<3>, R<5>y R5* son todos hidrógeno. Estos nucleósidos de LNA de tio se divulgan en WO99/014226 y WO2004/046160.
En algunas modalidades, el birradiclo -X-Y- es -NH-CH2-, W es O, y todos de R<1>, R<2>, R<3>, R<5>y R5* son todos hidrógeno. Estos nucleósidos de LNA de amino se divulgan en WO99/014226 y WO2004/046160.
En algunas modalidades, el birradiclo -X-Y- es -O-CH2-CH2- o -O-CH2-CH2- CH2-, W es O, y todos de R<1>, R<2>, R<3>, R<5>y R5* son todos hidrógeno. Estos nucleósidos de LNA se divulgan en WO00/047599 y Morita et al, Bioorganic & Med.Chem. Lett. 1273-76, e incluyen lo que comúnmente se conoce como ácidos nucleicos puenteados 2'-O-4' C-etileno (ENA).
En algunas modalidades, el birradiclo -X-Y- es -O-CH2-, W es O, y todos de R<1>, R<2>, R<3>, y uno de R<5>y R5* son hidrógeno, y el otro de R<5>y R5* es distinto de hidrógeno tal como alquilo de C1-6, tal como metilo. Estos nucleósidos de LNA sustituidos en 5' se divulgan en WO2007/134181.
En algunas modalidades, el birradiclo -X-Y- es -O-CR a Rb-, en donde uno o ambos de R a y Rb son distintos de hidrógeno, tal como metilo, W es O, y todos de R<1>, R<2>, R<3>, y uno de R<5>y R5* son hidrógeno, y el otro de R<5>y R5* es distinto de hidrógeno tal como alquilo de C1-6, tal como metilo. Estos nucleósidos de LNA modificados con bis se divulgan en WO2010/077578.
En algunas modalidades, el birradiclo -X-Y- designa el grupo enlazador bivalente -O-CH(CH<2>OCH<3>)- (ácido nucleico bicíclico 2' O-metoxietilado - Seth et al., 2010, J. Org. Chem. Vol. 75(5) págs. 1569-81). En algunas modalidades, el birradiclo -X-Y- designa el grupo enlazador bivalente -O-CH(CH<2>CH<3>)- (ácido nucleico bicíclico de 2'O-etilo - Seth et al., 2010, J. Org. Chem. Vol. 75(5) págs. 1569-81). En algunas modalidades, el birradiclo -X-Y- es -O-CHRa-, W es O, y todos de R<1>, R<2>, R<3>, R<5>y R5* son todos hidrógeno. Estos nucleósidos de LNA sustituidos en 6' se divulgan en WO10036698 y WO07090071.
En algunas modalidades, el birradiclo -X-Y- es -O-CH(CH<2>OCH<3>)-, W es O, y todos de R<1>, R<2>, R<3>, R<5>y R5* son todos hidrógeno. Estos nucleósidos de LNA también se conocen como MOE cíclicas en la técnica (cMOE) y se divulgan en WO07090071.
En algunas modalidades, el birradiclo -X-Y- designa el grupo enlazador bivalente -O-CH(CH<3>)-. - en cualquiera de la configuración R- o S-. En algunas modalidades, el birradiclo -X-Y- en conjunto designa el grupo enlazador bivalente -O-CH2-O-CH2- (Seth et al., 2010, J. Org. Chem.). En algunas modalidades, el birradiclo -X-Y- es -O-CH(CH<3>)-, W es O, y todos de R<1>, R<2>, R<3>, R<5>y R5* son todos hidrógeno. Estos nucleósidos de LNA de metil en 6' también se conocen como nucleósidos cET en la técnica, y pueden ser estereoisómeros (S)cET o (R)cET, como se divulga en WO07090071 (beta-D) y WO2010/036698 (alfa-L).
En algunas modalidades, el birradiclo -X-Y- es -O-CR a Rb-, en donde ni en Ra ni en Rb es hidrógeno, W es O, y todos de R<1>, R<2>, R<3>, R<5>y R5* son todos hidrógeno. En algunas modalidades, Ra y Rb son ambos metilo. Estos nucleósidos de LNA disustituidos en 6' se divulgan en WO 2009006478.
En algunas modalidades, el birradiclo -X-Y- es -S-CHRa-, W es O, y todos de R<1>, R<2>, R<3>, R<5>y R5* son todos hidrógeno. Estos nucleósidos de LNA de tio sustituidos en 6' se divulgan en WO11156202. En algunas modalidades de LNA de tio sustituido en 6', Ra es metilo.
En algunas modalidades, el birradiclo -X-Y- es -C(=CH2)-C(R a Rb)-, tal como -C(=CH2)-CH2- , o - C(=CH2)-CH(CH<3>)-W es O, y todos de R<1>, R<2>, R<3>, R<5>y R5* son todos hidrógeno. Estos nucleósidos de LNA de vinil carbo se divulgan en WO08154401 y WO09067647.
En algunas modalidades, el birradiclo -X-Y- es -N(-ORa)-, W es O, y todos de R<1>, R<2>, R<3>, R<5>y R5* son todos hidrógeno. En algunas modalidades, Ra es alquilo de C1-6 tal como metilo. Estos nucleósidos de LNA también se conocen como LNA sustituidos con N y se divulgan en WO2008/150729. En algunas modalidades, el birradiclo -X-Y- conjuntamente designa el grupo enlazador bivalente -O-NRa-CH<3>-(Seth et al., 2010, J. Org. Chem.). En algunas modalidades, el birradiclo -X-Y- es -N(Ra)-, W es O, y todos de R<1>, R<2>, R<3>, R<5>y R5* son todos hidrógeno. En algunas modalidades, Ra es alquilo de C1-6 tal como metilo.
En algunas modalidades, uno o ambos de R<5>y R5* es hidrógeno y, cuando se sustituye, el otro de R<5>y R5* es alquilo de C1-6 tal como metilo. En esta modalidad, R<1>, R<2>, R<3>, pueden ser todos hidrógeno, y el birradiclo -X-Y- se puede seleccionar de -O-CH2- o -O-C(HCR a)-, tal como -O-C(HCH3)-.
En algunas modalidades, el birradiclo es -Cr a Rb-O-Cr a Rb-, tal como CH2-O-CH2-, W es O y todos de R<1>, R<2>, R<3>, R<5>y R5* son todos hidrógeno. En algunas modalidades, Ra es alquilo de C1-6 tal como metilo. Estos nucleósidos de LNA también se conocen como nucleótidos restringidos conformacionalmente (CRN) y se divulgan en WO2013036868.
En algunas modalidades, el birradiclo es -O-CR a Rb-O-CR a Rb-, tal como O-CH2-O-CH2-, W es O y todos de R<1>, R<2>, R<3>, R<5>y R5* son todos hidrógeno. En algunas modalidades, Ra es alquilo de C1-6 tal como metilo. Estos nucleósidos de LNA también se conocen como nucleótidos COC y se divulgan en Mitsuoka et al., Nucleic Acids Research 200937(4), 1225-1238.
Se reconocerá que, a menos que se especifique, los nucleósidos de LNA pueden estar en la estereoisoforma beta-D o alfa-L.
En el Esquema 1 se presentan determinados ejemplos de nucleósidos de LNA.
Como se ilustra en los ejemplos, en modalidades preferidas de la invención los nucleósidos de LNA en los oligonucleótidos son nucleósidos de beta-D-oxi-LNA.
Degradación mediada por nucleasa
La degradación mediada por nucleasa se refiere a un oligonucleótido que puede mediar la degradación de una secuencia de nucleótidos complementaria cuando forma un dúplex con una secuencia de este tipo.
En algunas realizaciones, el oligonucleótido puede actuar por medio de la degradación mediada por nucleasa del ácido nucleico diana, donde los oligonucleótidos de la invención pueden reclutar una nucleasa, en particular una endonucleasa, preferentemente endorribonucleasa (RNasa), tal como RNasa H. Los ejemplos de diseños de oligonucleótidos que actúan por medio de mecanismos mediados por nucleasas son oligonucleótidos que típicamente comprenden una región de al menos 5 o 6 nucleósidos de ADN y están flanqueados en un lado o en ambos lados por nucleósidos potenciadores de la afinidad, por ejemplo gápmeros, oligómeros de cabeza y oligómeros de cola
actividad y reclutamiento de la RNasa H
La actividad RNasa H de un oligonucleótido antisentido se refiere a su capacidad para reclutar RNasa H cuando está en un dúplex con una molécula de ARN complementaria. El WO01/23613 proporcionamétodos in vitropara determinar la actividad RNasaH, que pueden usarse para determinar la capacidad de reclutar RNasaH. Típicamente, se considera que un oligonucleótido es capaz de reclutar RNasa H si, cuando se le proporciona una secuencia de ácido nucleico diana complementaria, tiene una tasa inicial, medida en pmol/l/min, de al menos un 10 % o más de un 20 % del valor de la tasa inicial determinada cuando se usa un oligonucleótido que tiene la misma secuencia de bases que el oligonucleótido modificado que se está sometiendo a prueba, pero que contiene solo monómeros de ADN, con enlaces fosforotioato entre todos los monómeros en el oligonucleótido, y usando la metodología
proporcionada por el ejemplo 91 - 95 del WO01/23613.
Gápmero
El término gápmero como se usa en la presente se refiere a un oligonucleótido antisentido que comprende una región de oligonucleótidos de reclutamiento de RNasa H (hueco) que está flanqueada en 5' y 3' por uno o más nucleósidos modificados potenciadores de la afinidad (flancos). En la presente se describen diversos diseños de gápmeros. Los oligómeros de cabeza y los oligómeros de cola son oligonucleótidos que pueden reclutar RNasa H donde falta uno de los flancos, es decir, solo uno de los extremos del oligonucleótido comprende nucleósidos modificados potenciadores de la afinidad. Para los oligómeros de cabeza falta el flanco 3' (es decir, el flanco 5' comprende nucleósidos modificados potenciadores de la afinidad) y para los oligómeros de cola falta el flanco 5' (es decir, el flanco 3' comprende nucleósidos modificados potenciadores de la afinidad).
Gápmero de LNn
El término gápmero de LNA es un oligonucleótido gápmero en el que al menos uno de los nucleósidos modificados potenciadores de la afinidad es un nucleósido de LNA.
Gápmero de alas mixtas
El término gápmero de ala mixta se refiere a un gápmero de LNA en donde las regiones de flanco comprenden al menos un nucleósido de LNA y al menos un nucleósido no modificado de LNA, tal como al menos un nucleósido modificado sustituido en 2', tal como, por ejemplo, nucleósidos de 2'-O-alquil-ARN, 2'-O-metil-ARN, 2'-alcoxi-RN, 2'-O-metoxietil-ARN (MOE), 2'-amino-ARN, 2'-Fluoro-ARN y 2'-F-ANA. En algunas modalidades, el gápmero de ala mixta tiene un flanco que comprende nucleósidos de LNA (por ejemplo, 5' o 3') y el otro flanco (3' o 5' respectivamente) comprende nucleósidos modificados sustituidos en 2'.
Conjugado
El término conjugado, tal como se utiliza en la presente, se refiere a un oligonucleótido que está unido covalentemente a una fracción no nucleotídica (fracción conjugada o región C o tercera región).
La conjugación del oligonucleótido de la invención con una o más fracciones no nucleotídicas puede mejorar la farmacología del oligonucleótido, por ejemplo, afectando a la actividad, distribución celular, captación celular o estabilidad del oligonucleótido. En algunas realizaciones, la fracción conjugada modifica o potencia las propiedades farmacocinéticas del oligonucleótido mejorando la distribución celular, biodisponibilidad, metabolismo, excreción, permeabilidad y/o captación celular del oligonucleótido. En particular, el conjugado puede dirigir el oligonucleótido a un órgano, tejido o tipo celular específico y potenciar así la eficacia del oligonucleótido en ese órgano, tejido o tipo de células. Al mismo tiempo, el conjugado puede servir para reducir la actividad del oligonucleótido en tipos de células, tejidos u órganos no diana, por ejemplo, la actividad fuera de objetivo o la actividad en tipos de células, tejidos u órganos no objetivo. Los WO 93/07883 y WO 2013/033230 proporcionan fracciones conjugadas adecuadas. El WO 2012/143379 proporciona un método de administración de un fármaco a través de la barrera hematoencefálica por conjugación con un fragmento de anticuerpo con afinidad por el receptor de transferrina.
Los conjugados de oligonucleótidos y su síntesis también han sido objeto de exhaustivas revisiones por parte de Manoharan en Antisense Drug Technology, Principles, Strategies, and Applications, S.T. Crooke, ed., Ch. 16, Marcel Dekker, Inc., 2001 and Manoharan, Antisense and Nucleic Acid Drug Development, 2002, 12, 103.
En una realización, la fracción no nucleotídica (fracción conjugada) se selecciona del grupo formado por carbohidratos, ligandos del receptor de superficie celular, sustancias farmacéuticas, hormonas, sustancias lipófilas, polímeros, proteínas, péptidos, toxinas (por ejemplo, toxinas bacterianas), vitaminas, proteínas víricas (por ejemplo, cápsides) o combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, la fracción no nucleotídica es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo, como un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que facilita el suministro a través de la barrera hematoencefálica, en particular un anticuerpo o fragmento de anticuerpo dirigido al receptor de transferrina.
Enlazadores
Un enlace o enlazador es una conexión entre dos átomos que une un grupo químico o segmento de interés a otro grupo químico o segmento de interés a través de uno o más enlaces covalentes. Las porciones conjugadas se pueden unir al oligonucleótido directamente o a través de una porción enlazadora (por ejemplo, enlazador o anclaje). Los enlazadores sirven para conectar covalentemente una tercera región, por ejemplo, una porción conjugado (Región C), a una primera región, por ejemplo, un oligonucleótido (región A).
En algunas modalidades de la invención, el conjugado o conjugado de oligonucleótido de la invención puede comprender opcionalmente una región enlazadora (segunda región o región B y/o región Y) que se coloca entre el oligonucleótido (región A o primera región) y la porción conjugada (región C o tercera región).
La región B se refiere a enlazadores bioescindibles que comprenden o consisten en un enlace fisiológicamente lábil que es escindible en condiciones normalmente encontradas o análogas a las encontradas dentro de un cuerpo de mamífero. Las condiciones bajo las cuales los enlazadores fisiológicamente lábiles experimentan transformación química (por ejemplo, escisión) incluyen condiciones químicas tal como pH, temperatura, condiciones o agentes oxidativos o reductores, y concentración de sal encontrada en o análoga a las encontradas en células de mamífero. Las condiciones intracelulares de mamíferos también incluyen la presencia de actividad enzimática normalmente presente en una célula de mamífero tal como de enzimas proteolíticas o enzimas hidrolíticas o nucleasas. En una modalidad, el enlazador bioescindible es susceptible a la escisión por nucleasa S1. En una modalidad preferida, el enlazador susceptible a nucleasa comprende entre 1 y 10 nucleósidos, tal como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 nucleósidos, más preferentemente entre 2 y 6 nucleósidos y lo más preferentemente entre 2 y 4 nucleósidos enlazados que comprenden al menos dos enlaces fosfodiéster consecutivos, tal como al menos 3 o 4 o 5 enlaces fosfodiéster consecutivos. Preferentemente, los nucleósidos son ADN o ARN. Los enlazadores bioescindibles que contienen fosfodiéster se describen con más detalle en WO 2014/076195.
La región Y se refiere a enlazadores que no son necesariamente bioescindibles, pero que sirven principalmente para conectar covalentemente una porción conjugada (región C o tercera región), a un oligonucleótido (región A o primera región). Los enlazadores de región Y pueden comprender una estructura de cadena o un oligómero de unidades de repetición tal como etilenglicol, unidades de aminoácidos o grupos aminoalquilo. Los conjugados de oligonucleótidos de la presente invención se pueden construir de los siguientes elementos regionales A-C, A-B-C, A-BY-C, A-Y-B-C o A-Y-C. En algunas modalidades, el enlazador (región Y) es un aminoalquilo, tal como un grupo aminoalquilo de C2 - C36, que incluye, por ejemplo, grupos aminoalquilo de C6 a C12. En una modalidad preferida, el enlazador (región Y) es un grupo aminoalquilo de C6.
Control
Por el término "control", cuando se utiliza en relación con las mediciones del efecto de un oligonucleótido, se entiende generalmente que el control es un individuo o célula diana no tratada o un individuo o célula diana tratada con un oligonucleótido no objetivo (simulación). Sin embargo, también se puede tratar de un individuo tratado con los cuidados habituales.
Tratamiento
El término "tratamiento", como se usa en la presente, se refiere tanto al tratamiento de una enfermedad existente (por ejemplo, una enfermedad o trastorno como se denomina en la presente), como a la prevención de una enfermedad, es decir, profilaxis. Por lo tanto, se reconocerá que el tratamiento como se menciona
en la presente, en algunas realizaciones, puede ser profiláctico.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
La diana
Un aspecto de la invención es modular el nivel de expresión de la proteína UBE3A de cerdo, primate o humana, en particular para aumentar la expresión de la expresión de UBE3A paterna en células neuronales, en particular en células neuronales humanas. La proteína UBE3A humana existe en varias isoformas que se enumeran en Uniprot nr. Q05086. Varias mutaciones en el gen materno UBE3A pueden dar lugar al síndrome de Angelman.
El ácido nucleico diana para los oligonucleótidos de la invención es ARN, en particular un ARN no codificante largo. El ARN no codificante largo al que se dirigen los oligonucleótidos de la presente invención es SNHG14 humano (también conocido como UBE3A-ATS con número de entrada Ensembl ENSG00000224078, versión GRCh38.p2). En particular, el ácido nucleico diana es la región cadena abajo de SNORD109B correspondiente a la posición 25278410 a 25419462 en el cromosoma 15 (SEQ ID NO: 1). En el mono Rhesus (Macaca mulatta), el supresor UBE3A se define como la región corriente abajo de SNORD109A correspondiente a la posición 4222848 a 4373084 (cadena directa) en el cromosoma 7 utilizando el montaje Ensembl MMUL 1.0 (SEQ ID NO: 2).
En algunas modalidades, el ácido nucleico diana es la SEQ ID NO: 1, o variantes de origen natural de la misma.
En determinadas modalidades, el ácido nucleico diana corresponde a regiones que se conservan entre humanos (SEQ ID NO: 1) y mono Rhesus (SEQ ID NO: 2). En determinadas modalidades, el ácido nucleico diana corresponde a regiones que se conservan entre el ser humano (SEQ ID NO:1), el mono Rhesus (SEQ ID NO: 2) y ratón (SEQ ID NO: 3).
En determinadas modalidades, el ácido nucleico diana es la región que es antisentido al pre-ARNm de UBE3A, esta región corresponde a la posición 55319 a 141053 de la SEQ ID NO: 1.
En determinadas modalidades, el ácido nucleico diana es la región cadena abajo de SNORD109B y cadena arriba de la región que es antisentido al pre-ARNm de UBE3A, esta región corresponde a la posición 1 a 55319 de la SEQ ID NO: 1.
En algunas modalidades, el ácido nucleico diana está presente en una célula, tal como una célula de mamífero, en particular una célula humanain vitrooin vivo(la célula diana). En determinadas modalidades, la célula diana es una neurona, preferentemente una célula neuronal humana.
La secuencia diana puede ser una subsecuencia del ácido nucleico diana. En algunas modalidades, el oligonucleótido se dirige a la subsecuencia seleccionada del grupo que consiste en la región antisentido del exón 9, exón 10, exón 13, exón 14, intrón 14, exón 15, intrón 15 y exón 16 de UBE3A. En algunas modalidades, el oligonucleótido o la secuencia de nucleótidos contigua se hibrida o es complementaria a una molécula de ácido nucleico de cadena simple seleccionada del grupo que consiste en las posiciones: 55319-76274, 77483-77573, 92157-93403 y 97056-97354 de la SEQ ID NO: 1. En algunas modalidades, el oligonucleótido o la secuencia de nucleótidos contigua se hibrida o es complementaria a una molécula de ácido nucleico de cadena simple seleccionada del grupo que consiste en las posiciones: 60821-60849, 77567-77583, 92323-92339 y 97156-97172 de la SEQ ID NO: 1.
En algunas modalidades, el ácido nucleico diana es una región correspondiente a las posiciones 9200-9250 de la SEQ ID NO: 1.
En algunas modalidades, el ácido nucleico diana es una región correspondiente a las posiciones 11505-11555 de la SEQ ID NO: 1.
En algunas modalidades, el ácido nucleico diana es una región correspondiente a las posiciones 15100-15150 de la SEQ ID NO: 1.
En algunas modalidades, el ácido nucleico diana es una región correspondiente a las posiciones 30590-30740 de la SEQ ID NO: 1.
En algunas modalidades, el ácido nucleico diana es una región correspondiente a las posiciones 46380-46430 de la SEQ ID NO: 1.
Los oligonucleótidos de la invención
La invención se refiere a oligonucleótidos capaces de modular la expresión de UBE3A paterna, en particular la inducción o regulación positiva de UBE3A expresada por vía paterna en células neuronales. La modulación se logra hibridando con un ácido nucleico diana ubicado en el transcrito SNHG14 de ARN no codificante largo cadena abajo de SNORD109B. En determinadas modalidades, el oligonucleótido de la invención se hibrida con una subsecuencia del ácido nucleico diana de la SEQ ID NO: 1 con un AG° por debajo de -10 kcal, tal como con un AG° entre -10 a -60 kcal, tal como -12 a -40, tal como de -15 a -30 kcal o-16 a -27 kcal tal como -18 a -25 kcal.
El oligonucleótido de la invención es un oligonucleótido antisentido que se dirige al transcrito SNHG14 de cerdo, mono rhesus y/o humano cadena abajo de SNORD109B.
En algunas modalidades, el oligonucleótido antisentido de la invención es capaz de modular la expresión de la diana mediante la eliminación, interferencia o disminución del supresor de la diana. Preferentemente, los oligonucleótidos de la invención inducen la expresión de UBE3A en una célula, en particular la expresión de UBE3A paterna en una neurona, por degradación o eliminación del transcrito SNHG14 cadena abajo de SNORD109B. En algunas modalidades, los oligonucleótidos de la invención son capaces de aumentar la expresión de UBE3A en al menos 20% en comparación con el nivel de expresión de UBE3A en una célula neuronal tratada con solución salina o un oligonucleótido no dirigido, más preferentemente en al menos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 80%, 100%, 120%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200%, 210%, 220%, 230%, 240% o 250% en comparación con el nivel de expresión de UBE3A en una célula neuronal tratada con solución salina o un oligonucleótido no dirigido. En modalidades adicionales, los oligonucleótidos de la invención son capaces de disminuir el nivel del transcrito SNHG14 cadena abajo de SNORD109B (en particular la parte del transcrito que es antisentido a la región de pre-ARNm de UBE3A) en al menos 20% en comparación con el nivel del transcrito SNHG14 cadena abajo de SNORD109B en una célula neuronal tratada con solución salina o un oligonucleótido no dirigido, más preferentemente en al menos 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 95% en comparación con el nivel del transcrito SNHG14 cadena abajo de SNORD109B en una célula neuronal tratada con solución salina o un oligonucleótido no dirigido, sin reducir los niveles de SNORD115 en más de 0%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 12%, 14%, 16%, 18%, 20%, 25% o 30% en comparación con el nivel de SNORD115 en una célula tratada con solución salina o un oligonucleótido no dirigido. Los transcritos SNRPN y SNORD116 se ubican corriente arriba del transcrito SNORD115, por lo tanto, si el transcrito SNORD115 no se reduce por el oligonucleótido, es muy probable que se reduzcan los transcritos SNRPN y SNORD116 tampoco. En una modalidad adicional, los niveles de transcritos SNRPN y SNORD116 no se reducen en más de 0%, 1%, 2%, 3%,4%, 5%,6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 12%, 14%, 16%, 18%, 20%, 25% o 30% en comparación con el nivel de SNRPN y SNORD116 en una célula tratada con solución salina o un oligonudeótido no dirigido.
La modulación diana se desencadena por la hibridación entre una secuencia de nucleótidos contigua del oligonucleótido y el ácido nucleico diana. En algunas modalidades, el oligonucleótido de la invención comprende apareamientos erróneos entre el oligonucleótido y el ácido nucleico diana. A pesar de los apareamientos erróneos, la hibridación con el ácido nucleico diana aún puede ser suficiente para mostrar una modulación deseada de la expresión de UBE3A. La afinidad de unión reducida resultante de apareamientos erróneos se puede compensar ventajosamente mediante un mayor número de nucleótidos en el oligonucleótido y/o un mayor número de nucleósidos modificados capaces de aumentar la afinidad de unión a la diana, tal como nucleósidos modificados en 2', que incluyen LNA, presentes dentro de la secuencia de oligonucleótidos.
Un aspecto de la presente invención se refiere a un oligonucleótido antisentido que comprende una secuencia de nucleótidos contigua de 10 a 30 nucleótidos de longitud con al menos 98%, tal como 100% de complementariedad con la posición 25278410 a 25419462 en el cromosoma humano 15.
En algunas modalidades, el oligonucleótido comprende una secuencia contigua que es al menos 98% o 100% complementaria con una región del ácido nucleico diana que se muestra como la SEQ ID NO: 1, 2 o 3.
En una modalidad preferida, el oligonucleótido de la invención, o la secuencia de nucleótidos contigua de este, es completamente complementario (100% complementario) a una región del ácido nucleico diana que se muestra como la SEQ ID NO: 1, o en algunas modalidades puede comprender uno o dos apareamientos erróneos entre el oligonucleótido y el ácido nucleico diana.
En algunas modalidades, la secuencia de oligonucleótidos es 100% complementaria a una región de ácido nucleico diana correspondiente presente en la SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2. En algunas modalidades, la secuencia de oligonucleótidos es 100% complementaria a una región de ácido nucleico diana correspondiente presente en la SEQ ID NO: 1, 2 y 3.
En algunas modalidades, el oligonucleótido comprende una secuencia de nucleótidos contigua de 10 a 30 nucleótidos de longitud con al menos 90% de complementariedad, tal como 100% de complementariedad, con una región de ácido nucleico diana correspondiente presente en la SEQ ID NO: 1, en donde la región de ácido nucleico diana se selecciona del grupo que consiste en la región A1 a A3649 en la tabla 1
Tabla 1: Regiones de la SEQ ID NO 1 que se pueden dirigir utilizando el oligonucleótido de la invención
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En algunas modalidades, el oligonucleótido comprende una secuencia de nucleótidos contigua de 10 a 30 nucleótidos de longitud con al menos 90% de complementariedad, tal como 100% de complementariedad, con una región de ácido nucleico diana correspondiente presente en la SEQ ID NO: 1, en donde la región de ácido nucleico diana se selecciona del grupo que consiste en la región B1 a B400 en la tabla 2
Tabla 2: Regiones de la SEQ ID NO 1 que se pueden dirigir utilizando el oligonucleótido de la invención
En determinadas modalidades, el oligonucleótido o la secuencia de nucleótidos contigua es complementaria a una región (o subsecuencia)(o subsecuencia) del ácido nucleico diana, en donde la región de ácido nucleico diana se selecciona del grupo que consiste en la posición 1589-10889, 46089-53989 y 60789-62489 de la SEQ ID NO: 1. En una modalidad, el oligonucleótido comprende una secuencia de nucleótidos contigua de 10 a 30 nucleótidos de longitud con al menos 90%, tal como 100% complementaria a una secuencia de ácido nucleico diana de la posición 55319 a 141053 de la SEQ ID NO: 1.
En una modalidad, el oligonucleótido comprende una secuencia de nucleótidos contigua de 10 a 30 nucleótidos de longitud con al menos 90%, tal como 100% complementaria a una secuencia de ácido nucleico diana de la posición 1 a 55318 de la SEQ ID NO: 1.
En algunas modalidades, el oligonucleótido comprende una secuencia de nucleótidos contigua de 10 a 30 nucleótidos de longitud con al menos 90% de complementariedad con una subsecuencia del ácido nucleico diana que se selecciona del grupo que corresponde a las posiciones : 55319-76274, 77483-77573, 92157-93403 y 97056 97354 de la SEQ ID NO: 1.
En algunas modalidades, el oligonucleótido es una secuencia de nucleótidos contigua de 10 a 30 nucleótidos de longitud con al menos 90% complementaria a una subsecuencia del ácido nucleico diana seleccionado del grupo correspondiente a las posiciones: 60821-60849, 77567-77583, 92323-92339 y 97156-97172 de la SEQ ID NO: 1.
En algunas modalidades, el oligonucleótido es una secuencia de nucleótidos contigua de 10 a 30 nucleótidos de longitud con al menos 90% de complementariedad con una subsecuencia del ácido nucleico diana que corresponde a las posiciones: 5218-5240 de la SEQ ID NO: 1.
En algunas modalidades, el oligonucleótido es una secuencia de nucleótidos contigua de 10 a 30 nucleótidos de longitud con al menos 90% de complementariedad con una subsecuencia del ácido nucleico diana que corresponde a las posiciones: 5782-5803 de la SEQ ID NO: 1.
En algunas modalidades, el oligonucleótido es una secuencia de nucleótidos contigua de 10 a 30 nucleótidos de longitud con al menos 90% de complementariedad con una subsecuencia del ácido nucleico diana que corresponde a las posiciones: 8113-8139 de la SEQ ID NO: 1.
En algunas modalidades, el oligonucleótido es una secuencia de nucleótidos contigua de 10 a 30 nucleótidos de longitud con al menos 90% de complementariedad con una subsecuencia del ácido nucleico diana que corresponde a las posiciones: 9200-9250 de la SEQ ID NO: 1.
En algunas modalidades, el oligonucleótido es una secuencia de nucleótidos contigua de 10 a 30 nucleótidos de longitud con al menos 90% de complementariedad con una subsecuencia del ácido nucleico diana que corresponde a las posiciones: 11505-11555 de la SEQ ID NO: 1.
En algunas modalidades, el oligonucleótido es una secuencia de nucleótidos contigua de 10 a 30 nucleótidos de longitud con al menos 90% de complementariedad con una subsecuencia del ácido nucleico diana que corresponde a las posiciones: 13223-13242 de la SEQ ID NO: 1.
En algunas modalidades, el oligonucleótido es una secuencia de nucleótidos contigua de 10 a 30 nucleótidos de longitud con al menos 90% de complementariedad con una subsecuencia del ácido nucleico diana que corresponde a las posiciones 15100-15150 de la SEQ ID NO: 1.
En algunas modalidades, el oligonucleótido es una secuencia de nucleótidos contigua de 10 a 30 nucleótidos de longitud con al menos 90% de complementariedad con una subsecuencia del ácido nucleico diana que corresponde a las posiciones 15113-15180 de la SEQ ID NO: 1.
En algunas modalidades, el oligonucleótido es una secuencia de nucleótidos contigua de 10 a 30 nucleótidos de longitud con al menos 90% de complementariedad con una subsecuencia del ácido nucleico diana que corresponde a las posiciones 29635-29705 de la SEQ ID NO: 1.
En algunas modalidades, el oligonucleótido es una secuencia de nucleótidos contigua de 10 a 30 nucleótidos de longitud con al menos 90% de complementariedad con una subsecuencia del ácido nucleico diana que corresponde a las posiciones 30590-30740 de la SEQ ID NO: 1.
En algunas modalidades, el oligonucleótido es una secuencia de nucleótidos contigua de 10 a 30 nucleótidos de longitud con al menos 90% de complementariedad con una subsecuencia del ácido nucleico diana que corresponde a las posiciones 39800-39855 de la SEQ ID NO: 1.
En algunas modalidades, el oligonucleótido es una secuencia de nucleótidos contigua de 10 a 30 nucleótidos de longitud con al menos 90% de complementariedad con una subsecuencia del ácido nucleico diana a las posiciones 44435-44460 de la SEQ ID NO: 1.
En algunas modalidades, el oligonucleótido es una secuencia de nucleótidos contigua de 10 a 30 nucleótidos de longitud con al menos 90% de complementariedad con una subsecuencia del ácido nucleico diana a las posiciones 45245-45270 de la SEQ ID NO: 1.
En algunas modalidades, el oligonucleótido es una secuencia de nucleótidos contigua de 10 a 30 nucleótidos de longitud con al menos 90% de complementariedad con una subsecuencia del ácido nucleico diana a las posiciones 46380-46430 de la SEQ ID NO: 1.
En algunas modalidades, el oligonucleótido es una secuencia de nucleótidos contigua de 10 a 30 nucleótidos de longitud con al menos 90% de complementariedad con una subsecuencia del ácido nucleico diana a las posiciones 68915-68940 de la SEQ ID NO: 1.
En algunas modalidades, el oligonucleótido comprende o consiste en 8 a 35 nucleótidos de longitud, tal como de 10 a 30, tal como 11 a 22, tal como de 12 a 18, tal como de 13 a 17 o 14 a 16 nucleótidos contiguos de longitud. En una modalidad preferida, el oligonucleótido comprende o consiste en 15 a 20 nucleótidos de longitud.
En algunas modalidades, el oligonucleótido o la secuencia de nucleótidos contigua de este comprende o consiste en 22 o menos nucleótidos, tal como 20 o menos nucleótidos, tal como 18 o menos nucleótidos, tal como 14, 15, 16 o 17 nucleótidos. Se debe entender que cualquier intervalo dado en la presente incluye los puntos finales del intervalo. Por consiguiente, si se dice que un oligonucleótido incluye de 10 a 30 nucleótidos, se incluyen tanto 10 como 30 nucleótidos.
En algunas modalidades, la secuencia de nucleótidos contigua comprende o consiste en 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 nucleótidos contiguos de longitud. En una modalidad preferida, el oligonucleótido comprende o consiste en 16, 17, 18 o 19 nucleótidos de longitud.
En algunas modalidades, el oligonucleótido antisentido o la secuencia de nucleótidos contigua comprende o consiste en de 10 a 30 nucleótidos de longitud con al menos 90% de identidad, preferentemente 100% de identidad con una secuencia que se selecciona del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 4 a 150 (ver secuencias de motivos enumeradas en la tabla 3 en la sección de Ejemplos).
En algunas modalidades, el oligonucleótido antisentido o la secuencia de nucleótidos contigua comprende o consiste en de 10 a 30 nucleótidos de longitud con al menos 90% de identidad, preferentemente 100% de identidad con una secuencia que se selecciona del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 4 a 818 (ver secuencias de motivos enumeradas en la tabla 3 en la sección de Ejemplos).
En algunas modalidades, el oligonucleótido antisentido o la secuencia de nucleótidos contigua comprende o consiste en de 10 a 30 nucleótidos de longitud con al menos 90% de identidad, preferentemente 100% de identidad con una secuencia que se selecciona del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 4 a 678 (ver secuencias de motivos enumeradas en la tabla 3 en la sección de Ejemplos).
En algunas modalidades, el oligonucleótido antisentido o la secuencia de nucleótidos contigua comprende o consiste en de 10 a 30 nucleótidos de longitud con al menos 90% de identidad, preferentemente 100% de identidad con una secuencia que se selecciona del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 166, 167, 167 o 169 (ver secuencias de motivos enumeradas en la tabla 3 en la sección de Ejemplos).
En algunas modalidades, el oligonucleótido antisentido o la secuencia de nucleótidos contigua comprende o consiste en de 10 a 30 nucleótidos de longitud con al menos 90% de identidad, preferentemente 100% de identidad con una secuencia que se selecciona del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 570, 571, 572, 679, 680, 681,682 y 683 (ver secuencias de motivos enumeradas en la tabla 3 en la sección de Ejemplos).
En algunas modalidades, el oligonucleótido antisentido o la secuencia de nucleótidos contigua comprende o consiste en de 10 a 30 nucleótidos de longitud con al menos 90% de identidad, preferentemente 100% de identidad con una secuencia que se selecciona del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 34, 186, 187, 188, 573, 574, 575, 576, 572, 684, 685, 686, 687, 688, 689, 690, 691,692, 963, 964, 965 y 696 (ver secuencias de motivos enumeradas en la tabla 3 en la sección de Ejemplos).
En algunas modalidades, el oligonucleótido antisentido o la secuencia de nucleótidos contigua comprende o consiste en de 10 a 30 nucleótidos de longitud con al menos 90% de identidad, preferentemente 100% de identidad con una secuencia que se selecciona del grupo que consiste en la SEQ ID n O: 35, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 209 y 210 o SEQ ID NO: 582, 583 y 584 (ver secuencias de motivos enumeradas en la tabla 3 en la sección de Ejemplos).
En algunas modalidades, el oligonucleótido antisentido o la secuencia de nucleótidos contigua comprende o consiste en de 10 a 30 nucleótidos de longitud con al menos 90% de identidad, preferentemente 100% de identidad con una secuencia que se selecciona del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 221,222, 223, 224, 225, 585, 586, 587, 588, 589, 698, 699,700, 701, 702, 703, 704, 705, 706, 707, 708, 709, 710, 711, 712, 713, 714, 715, 716, 717 y 718 (ver secuencias de motivos enumeradas en la tabla 3 en la sección de Ejemplos).
En algunas modalidades, el oligonucleótido antisentido o la secuencia de nucleótidos contigua comprende o consiste en de 10 a 30 nucleótidos de longitud con al menos 90% de identidad, preferentemente 100% de identidad con una secuencia que se selecciona del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 236, 237, 238, 239, 240 y 590.
En algunas modalidades, el oligonucleótido antisentido o la secuencia de nucleótidos contigua comprende o consiste en de 10 a 30 nucleótidos de longitud con al menos 90% de identidad, preferentemente 100% de identidad con una secuencia que se selecciona del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 241, 591 y 719 (ver secuencias de motivos enumeradas en la tabla 3 en la sección de Ejemplos).
En algunas modalidades, el oligonucleótido antisentido o la secuencia de nucleótidos contigua comprende o consiste en de 10 a 30 nucleótidos de longitud con al menos 90% de identidad, preferentemente 100% de identidad con una secuencia que se selecciona del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 46, 47, 48, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304,305, 613, 614, 615, 616, 617, 618, 619, 620, 621, 622, 623, 624, 625, 626,627, 628, 629, 630, 631,632, 721,722, 723, 724, 725, 726, 727, 728, 729, 730, 731,732, 734, 735, 736, 737, 738, 739, 740, 741,742, 743, 744, 745, 746, 747, 748, 749, 750, 751,752, 753, 754, 755, 756, 757, 758, 759, 760, 761,762, 763, 764, 765, 766, 767, 768, 769, 770, 771,772, 773, 774, 775, 776, 777, 778, 779, 780, 781,782, 783, 784, 785, 786, 787, 788, 789, 790, 791,792, 793, 794, 795, 796, 797, 798, 799, 800, 800, 800, 800, 800, 801, 801, 802, 803, 804, 805, 806 y 807 (ver secuencias de motivos enumeradas en la tabla 3 en la sección de Ejemplos).
En algunas modalidades, el oligonucleótido antisentido o la secuencia de nucleótidos contigua comprende o consiste en de 10 a 30 nucleótidos de longitud con al menos 90% de identidad, preferentemente 100% de identidad con una secuencia que se selecciona del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 331, 332, 638, 639, 640, 808, 809, 810, 811, 812, 813, 814 y 815 (ver secuencias de motivos enumeradas en la tabla 3 en la sección de Ejemplos).
En algunas modalidades, el oligonucleótido antisentido o la secuencia de nucleótidos contigua comprende o consiste en de 10 a 30 nucleótidos de longitud con al menos 90% de identidad, preferentemente 100% de identidad con una secuencia que se selecciona del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 409, 410, 411,642, 643, 644, 645, 646, 816, 818 y 818 (ver secuencias de motivos enumeradas en la tabla 3 en la sección de Ejemplos).
Se entiende que las secuencias de nucleobases contiguas (secuencia de motivo) se pueden modificar para, por ejemplo, aumentar la resistencia a la nucleasa y/o la afinidad de unión al ácido nucleico diana. Las modificaciones se describen en las definiciones y en la sección "Diseño de oligonucleótidos". La Tabla 3 enumera los diseños preferidos de cada secuencia de motivos.
Diseño de oligonucleótidos
El diseño de oligonucleótidos se refiere al patrón de modificaciones de azúcar de nucleósidos en la secuencia de oligonucleótidos. Los oligonucleótidos de la invención comprenden nucleósidos modificados con azúcar y también pueden comprender nucleósidos de ADN o ARN. En algunas modalidades, el oligonucleótido comprende nucleósidos modificados con azúcar y nucleósidos de ADN. La incorporación de nucleósidos modificados en el oligonucleótido de la invención puede mejorar la afinidad del oligonucleótido por el ácido nucleico diana. En ese caso, los nucleósidos modificados se pueden denominar nucleótidos modificados que mejoran la afinidad.
En una modalidad, el oligonucleótido comprende al menos 1 nucleósido modificado, tal como al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15 o al menos 16 nucleósidos modificados. En una modalidad, el oligonucleótido comprende de 1 a 10 nucleósidos modificados, tal como de 2 a 9 nucleósidos modificados, tal como de 3 a 8 nucleósidos modificados, tal como de 4 a 7 nucleósidos modificados, tal como 6 o 7 nucleósidos modificados. En algunas modalidades, al menos 1 de los nucleósidos modificados es un ácido nucleico bloqueado (LNA), tal como al menos 2, tal como al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7 o al menos 8 de los nucleósidos modificados son LNA. En una modalidad adicional, todos los nucleósidos modificados son LNA.
En una modalidad, el oligonucleótido de la invención puede comprender modificaciones, que se seleccionan independientemente de estos tres tipos de modificaciones (azúcar modificado, nucleobase modificada y enlace internucleosídico modificado) o una combinación de estos. Preferentemente, el oligonucleótido comprende uno o más nucleósidos modificados con azúcar, tal como nucleósidos modificados con azúcar en 2'. Preferentemente, el oligonucleótido de la invención comprende el uno o más nucleósidos modificados con azúcar en 2' seleccionados independientemente del grupo que consiste en 2'-O-alquil-ARN, 2'-O-metil-ARN, 2'-alcoxi-RRN, 2'-O-metoxietil-ARN, 2' -amino-ARN, 2'-fluoro-ARN, ácido arabino nucleico (ANA), 2'-fluoro-ANA y nucleósidos de LNA. Incluso más preferentemente, el uno o más nucleósidos modificados es LNA.
En una modalidad adicional, el oligonucleótido comprende al menos un enlace internucleosídico modificado. En una modalidad preferida, los enlaces internucleosídico dentro de la secuencia de nucleótidos contigua son enlaces internucleosídicos de fosforotioato o boranofosfato.
En algunas modalidades, el oligonucleótido de la invención comprende al menos un nucleósido modificado que es un 2-MOE-ARN, tal como 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 unidades de nucleósido 2-MOE-ARN. En algunas modalidades, al menos uno de dicho nucleósido modificado es 2'-fluoro ADN, tal como 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 unidades de nucleósido 2' -fluoro ADN.
En algunas modalidades, el oligonucleótido de la invención comprende al menos una unidad de LNA, tal como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 unidades de LNA, tal como de 2 a 6 unidades de LNA, tal como de 3 a 7 unidades de LNA, 4 a 8 unidades de LNA o 3, 4, 5, 6 o 7 unidades de LNA. En algunas modalidades, todos los nucleósidos modificados son nucleósidos de LNA. En una modalidad adicional, el oligonucleótido puede comprender tanto beta-D-oxi-LNA como una o más de las siguientes unidades de LNA: tio-LNA, amino-LNA, oxi-LNA y/o ENA en las configuraciones beta-D o alfa-L o combinaciones de estas. En una modalidad adicional, todas las unidades de citosina de LNA son 5-metil-citosina. En una modalidad preferida, el oligonucleótido o la secuencia de nucleótidos contigua tiene al menos 1 unidad de LNA en el extremo 5' y al menos 2 unidades de LNA en el extremo 3' de la secuencia de nucleótidos.
En algunas modalidades, el oligonucleótido de la invención comprende al menos una unidad de LNA y al menos un nucleósido modificado sustituido en 2'.
En algunas modalidades de la invención, el oligonucleótido comprende tanto nucleósidos modificados con azúcar en 2' como unidades de ADN. Preferentemente, el oligonucleótido comprende tanto unidades de LNA como de ADN.
Preferentemente, el total combinado de unidades de LNA y ADN es 8-30, tal como 10 - 25, preferentemente 12 22, tal como 12 - 18, incluso más preferentemente 11-16. En algunas modalidades de la invención, la secuencia de nucleótidos del oligonucleótido, tal como la secuencia de nucleótidos contigua, consiste en al menos una o dos unidades de LNA y las unidades de nucleótidos restantes son unidades de ADN. En algunas modalidades, el oligonucleótido comprende solo nucleósidos de LNA y nucleósidos de origen natural (tal como ARN o ADN, más preferentemente nucleósidos de ADN), opcionalmente con enlaces internucleosídicos modificados tal como fosforotioato.
En una modalidad de la invención, el oligonucleótido de la invención es capaz de reclutar RNasa H.
Diseño de gápmero
En una modalidad preferida, el oligonucleótido de la invención tiene un diseño o estructura de gápmero también denominado en la presente simplemente "gápmero". En una estructura gápmero, el oligonucleótido comprende al menos tres regiones estructurales distintas: un flanco 5', un hueco y un flanco 3', orientación F-G-F' en '5 -> 3'. En este diseño, las regiones flanqueantes F y F' (también denominadas regiones de ala) comprenden un tramo contiguo de nucleósidos modificados, que son complementarios al ácido nucleico diana de UBE3A, en tanto que la región de hueco, G, comprende un tramo contiguo de nucleótidos que son capaces de reclutar una nucleasa, preferentemente una endonucleasa tal como RNasa, por ejemplo, RNasa H, cuando el oligonucleótido está en dúplex con el ácido nucleico diana. Los nucleósidos que son capaces de reclutar una nucleasa, en particular RNasa H, se pueden seleccionar del grupo que consiste en ADN, alfa-L-oxi-LNA, 2'-Flouro-ANA y UNA. Las regiones F y F', que flanquean los extremos 5' y 3' de la región G, comprenden preferentemente nucleósidos de reclutamiento no nucleasa (nucleósidos con una estructura endo 3'), más preferentemente uno o más nucleósidos modificados que mejoran la afinidad. En algunas modalidades, el flanco 3' comprende al menos un nucleósido de LNA, preferentemente al menos 2 nucleósidos de LNA. En algunas modalidades, el flanco 5' comprende al menos un nucleósido de LNA. En algunas modalidades, tanto las regiones flanqueantes 5' como 3' comprenden un nucleósido de LNA. En algunas modalidades, todos los nucleósidos en las regiones flanqueantes son nucleósidos de LNA. En otras modalidades, las regiones flanqueantes pueden comprender tanto nucleósidos de LNA como otros nucleósidos (flancos mixtos), tal como nucleósidos de ADN y/o nucleósidos modificados no de LNA, tal como nucleósidos sustituidos en 2'. En este caso, el hueco se define como una secuencia contigua de al menos 5 nucleósidos de reclutamiento de RNasa H (nucleósidos con una estructura endo 2', preferentemente ADN) flanqueada en el extremo 5' y 3' por un nucleósido modificado que mejora la afinidad, preferentemente LNA, tal como beta-D-oxi-LNA. En consecuencia, los nucleósidos de la región flanqueante 5' y la región flanqueante 3' que son adyacentes a la región de hueco son nucleósidos modificados, preferentemente nucleósidos de reclutamiento no nucleasa. En oligonucleótidos con flancos mixtos donde los flancos comprenden ADN, los nucleósidos 5' y 3' son nucleósidos modificados.
Región F
La región F (flanco 5' o ala 5') unida al extremo '5 de la región G comprende, contiene o consiste en al menos un nucleósido modificado tal como al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7 nucleósidos modificados. En una modalidad, la región F comprende o consiste en de 1 a 7 nucleósidos modificados, tal como de 2 a 6 nucleósidos modificados, tal como de 2 a 5 nucleósidos modificados, tal como de 2 a 4 nucleósidos modificados, tal como de 1 a 3 nucleósidos modificados, tal como 1, 2, 3 o 4 nucleósidos modificados. En una modalidad adicional, se pueden unir nucleósidos adicionales al extremo '5 de la región F, lo que representa una región D que comprende preferentemente 1, 2 o 3 unidades de nucleósidos, tal como nucleósidos de ADN. La región D puede asumir la función de un enlazador bioescindible (B) descrito en la definición de "enlazadores ".
En algunas modalidades, los nucleósidos modificados en la región F tienen una estructura endo 3'.
En una modalidad, uno o más de los nucleósidos modificados en la región F son nucleósidos modificados en 2'.
En una modalidad adicional, uno o más de los nucleósidos modificados en 2' en la región F se seleccionan de unidades de 2'-O-alquil-ARN, unidades de 2'-O-metil-ARN, unidades de 2' -amino-ARN, unidades de 2'-fluoro-ARN, unidades de 2'-alcoxi-RN, unidades de MOE, unidades de LNA, unidades de ácido arabino nucleico (ANA) y unidades de 2'-fluoro-ARN.
En una modalidad de la invención, todos los nucleósidos modificados en la región F son nucleósidos de LNA. En una modalidad adicional, los nucleósidos de LNA en la región F se seleccionan independientemente del grupo que consiste en oxi-LNA, tio-LNA, amino-LNA, cET y/o ENA, en las configuraciones beta-D o alfa-L o combinaciones de estas. En una modalidad preferida, la región F tiene al menos 1 unidad de beta-D-oxi LNA, en el extremo 5' de la secuencia contigua.
Región G
La región G (región de hueco) preferentemente comprende, contiene o consiste en al menos 4, tal como al menos 5, tal como al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15 o al menos 16 nucleósidos consecutivos capaces de reclutar la nucleasa mencionada anteriormente, en particular RNasaH. En una modalidad adicional, la región G comprende, contiene o consiste en de 5 a 12, o de 6 a 10 o de 7 a 9, tal como 8 unidades de nucleótidos consecutivas capaces de reclutar la nucleasa mencionada anteriormente.
Las unidades de nucleósidos en la región G, que son capaces de reclutar nucleasa se seleccionan en una modalidad del grupo que consiste en ADN, alfa-L-LNA, ADN alquilado C4'(como se describe en PCT/EP2009/050349 y Vester et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 18 (2008) 2296 - 2300), nucleósidos derivados de arabinosa como ANA y 2'F-ANA (Mangos et al. 2003 J. AM. CHEM. SOC. 125, 654-661), UNA (ácido nucleico desbloqueado) (como se describe en Fluiter et al., Mol. Biosyst., 2009, 10, 1039). UNA es un ácido nucleico desbloqueado, típicamente donde se ha eliminado el enlace entre C2 y C3 de la ribosa, formando una porción de "azúcar" desbloqueada.
En una modalidad adicional, al menos una unidad de nucleósido en la región G es una unidad de nucleósido de ADN, tal como de 1 a 16 unidades de ADN, tal como 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 unidades de ADN, preferentemente de 2 a 13 unidades de ADN, tal como de 4 a 12 unidades de ADN, más preferentemente de 5 a 11, o de 10 a 16, 11 a 15 o 12 a 14 unidades de ADN. En algunas modalidades, la región G consiste en 100% de unidades de ADN. En una modalidad preferida, G consiste en, más preferiblemente, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 unidades de ADN.
En modalidades adicionales, la región G puede consistir en una mezcla de ADN y otros nucleósidos capaces de mediar la escisión de RNasa H. La región G puede consistir en al menos 50% de ADN, más preferentemente 60 %, 70% u 80 % de ADN, e incluso más preferentemente 90% o 95% de ADN.
En una modalidad adicional, al menos una unidad de nucleósido en la región G es una unidad de nucleósido alfa-L-LNA, tal como al menos una unidad alfa-L-LNA, tal como 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o 9 unidades alfa-L-LNA. En una modalidad adicional, la región G comprende que al menos un alfa-L-LNA es una unidad de alfa-L-oxi-LNA. En una modalidad adicional, la región G comprende una combinación de ADN y unidades de nucleósidos de alfa-L-LNA.
En algunas modalidades, el tamaño de la secuencia contigua en la región G puede ser más largo, tal como 15, 16, 17, 18, 19 o 20 unidades de nucleósidos.
En algunas modalidades, los nucleósidos en la región G tienen una estructura endo 2'.
Región F'
La región F (flanco 3' o ala 3') unida al extremo '3 de la región G comprende, contiene o consiste en al menos un nucleósido modificado tal como al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7 nucleósidos modificados. En una modalidad, la región F' comprende o consiste en de 1 a 7 nucleósidos modificados, tal como de 2 a 6 nucleósidos modificados, tal como de 2 a 4 nucleósidos modificados, tal como de 1 a 3 nucleósidos modificados, tal como 1, 2, 3 o 4 nucleósidos modificados. En una modalidad adicional, nucleósidos adicionales unidos al extremo '3 de la región F', lo que representa una región D', que comprende preferentemente 1, 2 o 3 unidades de nucleósidos, tal como nucleósidos de ADN. La región D' puede asumir la función de un enlazador bioescindible (B) descrito, en la sección "enlazadores".
En algunas modalidades, los nucleósidos modificados en la región F' tienen una estructura endo 3'.
En una modalidad preferida, los nucleósidos modificados en la región F' son LNA.
En una modalidad adicional, los nucleósidos modificados en la región F' se seleccionan de unidades de 2'-O-alquil-ARN, unidades de 2'-O-metil-ARN, unidades de 2' -amino-ARN, unidades de 2'-fluoro-ARN, unidades de 2' -alcoxi-RN, unidades de MOE, unidades de LNA, unidades de ácido arabino nucleico (ANA) y unidades de 2'-fluoro-ARN.
En una modalidad de la invención, todos los nucleósidos modificados en la región F' son nucleósidos de LNA. En una modalidad adicional, los nucleósidos de LNA en la región F' se seleccionan independientemente del grupo que consiste en oxi-LNA, tio-LNA, amino-LNA, cET y/o ENA, en las configuraciones beta-D o alfa-L o combinaciones de estas. En una modalidad preferida, la región F' tiene al menos 2 unidad de beta-D-oxi LNA, en el extremo 3' de la secuencia contigua.
Región D y D'
La región D y D' se pueden unir al extremo 5' de la región F o al extremo 3' de la región F', respectivamente.
La región D o D' puede comprender independientemente 1, 2, 3, 4 o 5 nucleótidos adicionales, que pueden ser complementarios o no complementarios al ácido nucleico diana. A este respecto, el oligonucleótido de la invención, en algunas modalidades, puede comprender una secuencia de nucleótidos contigua capaz de modular la diana que está flanqueada en el extremo 5' y/o 3' por nucleótidos adicionales. Estos nucleótidos adicionales pueden servir como un enlazador bioescindible susceptible a nucleasas (ver definición de enlazadores). En algunas modalidades, los nucleótidos de extremo 5' y/o 3' adicionales están unidos con enlaces fosfodiéster, y pueden ser ADN o ARN. En otra modalidad, los nucleótidos del extremo 5' y/o 3' adicionales son nucleótidos modificados que pueden incluirse, por ejemplo, para mejorar la estabilidad de la nucleasa o para facilitar la síntesis. En una modalidad del oligonucleótido de la invención, comprende una región D y/o D' además de la secuencia de nucleótidos contigua.
El oligonucleótido gápmero de la presente invención se puede representar mediante las siguientes fórmulas:
F-G-F'; en particular F1-7-G4-12-F'1-7
D-F-G-F', en particular D1-3-F1-7-G4-12-F'1-7
F-G-F'-D', en particular F1-7-G4-12-F'1-7-D'1-3
D-F-G-F'-D', en particular D1-3-F1-7-G4-12-F'1-7-D'1-3
El número y los tipos preferidos de nucleósidos en las regiones F, G y F', D y D' se han descrito anteriormente. El diseño del oligonucleótido individual también puede tener un profundo impacto en las propiedades del oligonucleótido en su uso para modular la expresión de UBE3A.
En algunas modalidades, el oligonucleótido es un gapmero que consiste en 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 nucleótidos de longitud, en donde cada una de las regiones F y F' consiste independientemente en 2, 3 o 4 unidades de nucleósidos modificadas complementarias a una parte del ARN no codificante largo de SNHG14 humano que es antisentido al pre-ARNm de UBE3A (el ácido nucleico diana) y la región G consiste en 10, 11, 12, 13, 14 o 15 unidades de nucleósidos, capaces de reclutar nucleasa cuando están en dúplex con el ácido nucleico diana.
En modalidades adicionales, el oligonucleótido es un gápmero en donde cada una de las regiones F y F' consiste independientemente en 2, 3, 4 o 5 unidades de nucleósido modificadas, tal como unidades de nucleósido que contienen un azúcar 2'-O-metoxietil-ribosa (2'-MOE) o unidades de nucleósido que contienen un azúcar 2' -fluorodesoxirribosa y/o unidades de LNA, y la región G consiste en 9, 10, 11, 12,13, 14 o 15 unidades de nucleósido, tal como unidades de ADN u otros nucleósidos de reclutamiento de nucleasa tal como alfa-L-LNA o una mezcla de ADN y nucleósidos de reclutamiento de nucleasa.
En una modalidad específica adicional, el oligonucleótido es un gápmero en donde cada una de las regiones F y la región F' consiste en dos unidades de LNA cada una, y la región G consiste en 10, 11, 12, 13, 14 o 15 unidades de nucleósido, preferentemente unidades de ADN. Los diseños específicos de gápmero de esta naturaleza incluyen 2-10-2, 2-11-2, 2-12-2, 2-13-2, 2-14-2 y 2-15-2.
En una modalidad específica adicional, el oligonucleótido es un gapmero en donde cada una de las regiones F y F' consiste independientemente en tres unidades de LNA, y la región G consiste en 10, 11, 12,13, 14 o 15 unidades de nucleósidos, preferiblemente unidades de ADN. Los diseños específicos de gápmero de esta naturaleza incluyen 3-10-3, 3-11-3, 3-12-3, 3-13-3, 3-14-3 y 3-15-3.
En una modalidad específica adicional, el oligonucleótido es un gapmero en donde cada una de las regiones F y F' consiste en cuatro unidades de LNA cada una, y la región G consiste en 10, 11, 12,13, 14 o 15 unidades de nucleósido, preferentemente unidades de ADN. Los diseños específicos de gápmero de esta naturaleza incluyen 4-10-4, 4-11-4, 4-12-4, 4-13-4, 4-14-4 y 4-15-4.
Los diseños específicos de gápmero de esta naturaleza incluyen diseños F-G-F' seleccionados de un grupo que consiste en un hueco con 10 nucleósidos e independientemente de 1 a 4 nucleósidos modificados en las alas que incluyen 1-10-1, 2-10-1, 1-10-2, 1-10-3, 3-10-1, 1-10-4, 4-10-1, 2-10-2, 2-10-3, 3-10-2, 2-10-4, 4-10-2, 3-10-3, 3 10-4, 4-10-3 y 4-10-4 gápmeros.
Los diseños específicos de gápmero de esta naturaleza incluyen diseños F-G-F' seleccionados de un grupo que consiste en un hueco con 11 nucleósidos e independientemente de 1 a 4 nucleósidos modificados en las alas que incluyen, 1-11-1, 2-11-1, 1-11-2, 1-11-3, 3-11-1, 1-11-4, 4-11-1, 2-11-2, 2-11-3, 3-11-2, 2-11-4, 4-11-2, 3-11-3, 3-11 4, 4-11-3 y 4-11-4 gápmeros.
Los diseños específicos de gápmero de esta naturaleza incluyen diseños F-G-F' seleccionados de un grupo que consiste en un hueco con 12 nucleósidos que incluyen, 1-12-1, 2-12-1, 1-12-2, 1-12-3, 3-12-1, 1-12-4, 4-12-1, 2 12-2, 2-12-3, 3-12-2, 2-12-4, 4-12-2, 3-12-3, 3-12-4, 4-12-3 y 4-12-4 gápmeros.
Los diseños específicos de gápmero de esta naturaleza incluyen diseños F-G-F' seleccionados de un grupo que consiste en un hueco con 13 nucleósidos e independientemente de 1 a 4 nucleósidos modificados en las alas que incluyen 1-13-1, 1-13-2, 1-13-3, 3-13-1, 1-13-4, 4-13-1,2-13-1,2-13-2, 2-13-3, 3-13-2, 2-13-4, 4-13-2, 3-13-3, 3-13 4, 4-13-3 y 4-13-4 gápmeros.
Los diseños específicos de gápmero de esta naturaleza incluyen diseños F-G-F' seleccionados de un grupo que consiste en un hueco con 14 nucleósidos e independientemente de 1 a 4 nucleósidos modificados en las alas que incluyen 1-14-1, 1-14-2, 2-14-1, 1-14-3, 3-14-1, 1-14-4, 4-14-1,2-14-2, 2-14-3, 3-14-22-14-4, 4-14-2, 3-14-3, 3-14 4 y 4-14-3 gápmeros.
Los diseños específicos de gápmero de esta naturaleza incluyen diseños F-G-F' seleccionados de un grupo que consiste en un hueco con 15 nucleósidos e independientemente de 1 a 4 nucleósidos modificados en las alas que incluyen 1-15-1, 1-15-2, 2-15-1, 1-15-3, 3-15-1, 1-15-4, 4-15-1,2-15-2, 2-15-3, 3-15-22-15-4, 4-15-2, 3-15-3, 3-15 4 y 4-15-3 gápmeros.
Los diseños específicos de gápmero de esta naturaleza incluyen diseños F-G-F 'seleccionados de un grupo que consiste en un hueco con 16 nucleósidos e independientemente de 1 a 4 nucleósidos modificados en las alas que incluyen 1-16-1, 1-16-2, 2-16-1, 1-15-3, 3-16-1, 1-16-4, 4-16-1,2-16-2, 2-16-3, 3-16-22-16-4, 4-16-2, 3-16-3, 3-16 4 y 4-16-3 gápmeros.
En algunas modalidades, el diseño F-G-F' se selecciona de 2-10-4, 3-10-3 y 4-10-2.
En algunas modalidades, el diseño F-G-F' se selecciona de 2-11-4, 3-11-2, 3-11-3 y 4-11-2.
En algunas modalidades, el diseño F-G-F' se selecciona de 2-12-2, 2-12-3, 2-12-4, 3-12-2, 3-12-3 y 4-12-2. En algunas modalidades, el diseño F-G-F' se selecciona de 2-13-2, 2-13-3, 2-13-4, 3-13-3 y 4-13-2.
En algunas modalidades, el diseño F-G-F' se selecciona de 2-14-2, 2-14-4, 3-14-3 y 4-14-2.
En algunas modalidades, el diseño F-G-F' se selecciona de 2-15-2 y 2-16-2.
En algunas modalidades, el diseño F-G-F' se selecciona de los diseños indicados en la tabla 3.
En todos los casos, el diseño F-G-F' puede incluir además la región D y/o D', que puede tener 1, 2 o 3 unidades de nucleósidos, tal como unidades de ADN. Preferentemente, los nucleósidos en la región F y F' son nucleósidos modificados, en tanto que los nucleótidos en la región G son preferentemente nucleósidos no modificados. En cada diseño, el nucleósido modificado preferido es LNA.
En otra modalidad, todos los enlaces internucleosídicos en el hueco en un gápmero son enlaces fosforotioato y/o boranofosfato. En otra modalidad, todos los enlaces internucleosídicos en los flancos (región F y F') en un gápmero son enlaces fosforotioato y/o boranofosfato. En otra modalidad preferida, todos los enlaces internucleosídicos en la región D y D' en un gápmero son enlaces fosfodiéster.
Para gápmeros específicos tal como se divulga en la presente, cuando los residuos de citosina (C) se anotan como 5-metil-citosina, en diversas modalidades, una o más de las C presentes en el oligonucleótido pueden ser residuos de C no modificados.
Otros diseños de gápmero se divulgan en WO2004/046160 y WO2007/146511.
Para determinadas modalidades de la invención, el oligonucleótido se selecciona del grupo de compuestos de oligonucleótido en la tabla 3.
Para determinadas modalidades de la invención, el oligonucleótido se selecciona del grupo de compuestos de oligonucleótido con CMP-ID-NO: 4_1 a 150_2.
Para determinadas modalidades de la invención, el oligonucleótido se selecciona del grupo de compuestos de oligonucleótido con CMP-ID-NO: 4_1 a 678_1.
Para determinadas modalidades de la invención, el oligonucleótido se selecciona del grupo de compuestos de oligonucleótido con CMP-ID-NO: 4_1 a 818_1 (ver secuencias de oligonucleótidos enumeradas en la tabla 3 en la sección de Ejemplos).
Para determinadas modalidades de la invención, el oligonucleótido es un compuesto de oligonucleótido con CMP-ID-NO: 155_1 o 165_1.
Para determinadas modalidades de la invención, el oligonucleótido se selecciona del grupo de compuestos de oligonucleótido con CMP-ID-NO: 169_52, 169_50 o 169_56.
Para determinadas modalidades de la invención, el oligonucleótido se selecciona del grupo de compuestos de oligonucleótido con CMP-ID-NO: 172_1, 272_1, 572_7, 572_6 o 572_5.
Para determinadas modalidades de la invención, el oligonucleótido es un compuesto de oligonucleótido con CMP-ID-NO: 175_1.
Para determinadas modalidades de la invención, el oligonucleótido es un compuesto de oligonucleótido con CMP-ID-NO: 178_1.
Para determinadas modalidades de la invención, el oligonucleótido se selecciona del grupo de compuestos de oligonucleótido con CMP-ID-NO: 573_8, 186_1 o 187_1.
Para determinadas modalidades de la invención, el oligonucleótido es un compuesto de oligonucleótido con CMP-ID-NO: 186_1.
Para determinadas modalidades de la invención, el oligonucleótido se selecciona del grupo de compuestos de oligonucleótido con CMP-ID-NO: 200_1, 204_1,206_1, 35_2 o 209_1.
Para determinadas modalidades de la invención, el oligonucleótido se selecciona del grupo de compuestos de oligonucleótido con CMP-ID-NO: 585_1, 585_8, 586_9, 586_5, 586_8, 586_4 o 586_6.
Para determinadas modalidades de la invención, el oligonucleótido es un compuesto de oligonucleótido con CMP-ID-NO: 233_1.
Para determinadas modalidades de la invención, el oligonucleótido es un compuesto de oligonucleótido con CMP-ID-NO: 237_8o 590_13.
Para determinadas modalidades de la invención, el oligonucleótido es un compuesto de oligonucleótido con CMP-ID-NO: 220_1.
Para determinadas modalidades de la invención, el oligonucleótido se selecciona del grupo de compuestos de oligonucleótido con CMP-ID-NO: 591_1, 592_2, 592_4 o 241_9.
Para determinadas modalidades de la invención, el oligonucleótido se selecciona del grupo de compuestos de oligonucleótido con CMP-ID-NO: 597_4, 598_4, 39_1 o 602_1.
Para determinadas modalidades de la invención, el oligonucleótido es un compuesto de oligonucleótido con CMP-ID-NO: 39_1.
Para determinadas modalidades de la invención, el oligonucleótido es un compuesto de oligonucleótido con CMP-ID-NO: 611_7.
Para determinadas modalidades de la invención, el oligonucleótido es un compuesto de oligonucleótido con CMP-ID-NO: 271_1 o 278_1.
Para determinadas modalidades de la invención, el oligonucleótido se selecciona del grupo de compuestos de oligonucleótido con CMP-ID-NO: 616_4, 621_2, 621_1,622_3, 622_5, 622_4, 624_3, 624_5, 287_1,625_6, 626_7, 626_8, 626_9, 48_1, 631_6, 631_1, 303_1, 304_6 o 304_10.
Para determinadas modalidades de la invención, el oligonucleótido es un compuesto de oligonucleótido con CMP-ID-NO: 636_8.
Para determinadas modalidades de la invención, el oligonucleótido se selecciona del grupo de compuestos de oligonucleótido con CMP-ID-NO: 638_8, 639_5, 331_1 o 640_4.
Para determinadas modalidades de la invención, el oligonucleótido se selecciona del grupo de compuestos de oligonucleótido con CMP-ID-NO: 359_1, 361_1, 361_5, 362_1 o 641_5.
Para determinadas modalidades de la invención, el oligonucleótido se selecciona del grupo de compuestos de oligonucleótido con CMP-ID-NO: 378_1, 379_1, 399_1.
Para determinadas modalidades de la invención, el oligonucleótido se selecciona del grupo de compuestos de oligonucleótido con CMP-ID-NO: 403_1, 405_1,642_12, 642_13, 644_3 o 646_16.
Para determinadas modalidades de la invención, el oligonucleótido es un compuesto de oligonucleótido con CMP-ID-NO: 85_1 o 425_5.
Para determinadas modalidades de la invención, el oligonucleótido es un compuesto de oligonucleótido con CMP-ID-NO: 116_1.
Para determinadas modalidades de la invención, el oligonucleótido es un compuesto de oligonucleótido con CMP-ID-NO: 123_1 o 124_1.
Para determinadas modalidades de la invención, el oligonucleótido es un compuesto de oligonucleótido con CMP-ID-NO: 126_2.
Método de fabricación
En un aspecto adicional, la invención proporciona métodos para fabricar los oligonucleótidos de la invención que comprenden hacer reaccionar unidades de nucleótidos y formar así unidades de nucleótidos contiguas enlazadas covalentemente comprendidas en el oligonucleótido. Preferentemente, el método utiliza química de fosforamidita (ver, por ejemplo, Caruthers et al, 1987, Methods in Enzymology vol. 154, páginas 287-313). En una modalidad adicional, el método comprende además hacer reaccionar la secuencia de nucleótidos contigua con una porción de conjugación (ligando). En un aspecto adicional, se proporciona un método para fabricar la composición de la invención, que comprende mezclar el oligonucleótido u oligonucleótido conjugado de la invención con un diluyente, disolvente, portador, sal y/o adyuvante farmacéuticamente aceptable.
Composición farmacéutica
En un aspecto adicional, la invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden cualquiera de los oligonucleótidos y/o conjugados de oligonucleótidos mencionados anteriormente y un diluyente, portador, sal y/o adyuvante farmacéuticamente aceptable. Un diluyente farmacéuticamente aceptable incluye solución salina tamponada con fosfato (PBS) y las sales farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no se limitan a, sales de sodio y potasio.
WO 2007/031091 proporciona ejemplos adecuados y preferidos de diluyentes, portadores y adyuvantes farmacéuticamente aceptables. Las dosificaciones, formulaciones, vías de administración, composiciones, formas de dosificación, combinaciones con otros agentes terapéuticos, formulaciones de profármacos adecuados también se proporcionan en WO2007/031091.
Los oligonucleótidos o conjugados de oligonucleótidos de la invención se pueden mezclar con sustancias activas o inertes farmacéuticamente aceptables para la preparación de composiciones o formulaciones farmacéuticas. Las composiciones y métodos para la formulación de composiciones farmacéuticas dependen de una serie de criterios, que incluyen, pero no se limitan a, vía de administración, extensión de la enfermedad o dosis a administrar. En algunas modalidades, el oligonucleótido o conjugado de oligonucleótidos de la invención es un profármaco. En particular, con respecto a los conjugados de oligonucleótidos, la porción de conjugado se escinde del oligonucleótido una vez que el profármaco se administra al sitio de acción, por ejemplo, la célula diana.
Aplicaciones
Los oligonucleótidos de la invención se pueden utilizar como reactivos de investigación para, por ejemplo, terapias y profilaxis.
En la investigación, estos oligonucleótidos se pueden utilizar para modular específicamente la síntesis de la proteína UBE3A en células (por ejemplo, cultivos celularesin vitro)y animales experimentales, facilitando así el análisis funcional de la diana o una evaluación de su utilidad como diana para la intervención terapéutica. La modulación diana se logra degradando o inhibiendo un modulador del gen o ARNm que produce la proteína. Para la terapéutica, un animal o un ser humano, sospechoso de tener una enfermedad o trastorno, que puede tratarse mediante la modulación de la expresión de UBE3A.
En la presente se describen métodos para tratar o prevenir una enfermedad, que comprenden administrar una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz de un oligonudeótido, un conjugado de oligonudeótidos o una composición farmacéutica de la invención a un sujeto que padece o es susceptible a la enfermedad.
La invención se refiere a un oligonucleótido, una composición o un conjugado como se define en la presente para su uso como un medicamento.
El oligonucleótido, conjugado de oligonucleótido o una composición farmacéutica de acuerdo con la invención se administra típicamente en una cantidad eficaz.
La invención también proporciona el uso del oligonucleótido o conjugado de oligonucleótidos de la invención como se describe para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un trastorno como se menciona en la presente, o para un método de tratamiento de un trastorno como se menciona en la presente.
La enfermedad o trastorno, como se menciona en la presente, se asocia con la expresión de UBE3A. En algunas modalidades, la enfermedad o trastorno puede estar asociado con una mutación en el gen UBE3A materno. En algunas modalidades, el ácido nucleico diana es un regulador del gen UBE3A paterno.
Los métodos de la invención se emplean preferentemente para el tratamiento o la profilaxis contra enfermedades causadas por niveles y/o actividad anormales de UBE3A. La enfermedad puede estar causada, en particular, por niveles reducidos y/o actividad de la proteína UBE3A.
La invención se refiere además al uso de un oligonucleótido, conjugado de oligonucleótidos o una composición farmacéutica como se define en la presente para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de niveles y/o actividad anormales de UBE3A, en particular niveles bajos y/o actividad de UBE3a .
La invención se refiere a oligonucleótidos, conjugados de oligonucleótidos o composiciones farmacéuticas para uso en el tratamiento del síndrome de Angelman.
Administración
Los oligonucleótidos o composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden administrar por vía tópica (tal como, a la piel, inhalación, oftálmica u ótica) o enteral (tal como, por vía oral o a través del tracto gastrointestinal) o parenteral (tal como, intravenosa, subcutánea, intramuscular, intracerebral, intracerebroventricular o intratecal). En una modalidad preferida, el oligonucleótido o las composiciones farmacéuticas de la presente invención se administran mediante una vía parenteral que incluye inyección o infusión intravenosa, intraarterial, subcutánea, intraperitoneal o intramuscular, intratecal o intracraneal, por ejemplo, administración intracerebral o intraventricular. En una modalidad, el oligonucleótido activo o conjugado de oligonucleótidos se administra intracerebral o intracerebroventricular. En otra modalidad, el oligonucleótido activo o conjugado de oligonucleótidos se administra por vía intratecal.
La invención también proporciona el uso del oligonucleótido o conjugado de oligonucleótidos de la invención como se describe para la fabricación de un medicamento en donde el medicamento está en una forma de dosificación para administración intratecal.
La invención también proporciona el uso del oligonucleótido o conjugado de oligonucleótidos de la invención como se describe para la fabricación de un medicamento en donde el medicamento está en una forma de dosificación para administración intracerebral o intraventricular.
La invención también proporciona el uso del oligonucleótido o conjugado de oligonucleótidos de la invención como se describe para la fabricación de un medicamento en donde el medicamento está en una forma de dosificación para administración intracerebroventricular.
Terapias de combinación
En algunas modalidades, el oligonucleótido, conjugado de oligonucleótidos o composición farmacéutica de la invención es para su uso en un tratamiento de combinación con otro agente terapéutico. El agente terapéutico puede ser, por ejemplo, medicación anticonvulsiva.
EJEMPLOS
Materiales y métodos
Tabla 3: Lista de oligonucleótidos o secuencias de nucleobases contiguas complementarias a la SEQ ID NO: 1 (secuencias de motivos indicadas por la SEQ ID NO), diseños de oligonucleótidos realizados a partir de estos, así como compuestos de oligonucleótidos específicos (indicados por la CMP ID NO) diseñados en función de la secuencia de motivos.
Los diseños se refieren al diseño de gápmero, F-G-F', donde cada número representa la cantidad de nucleósidos modificados consecutivos, por ejemplo, nucleósidos modificados en 2' (primer número = flanco 5'), seguido de la cantidad de nucleósidos de ADN (segundo número = región de hueco), seguido de la cantidad de nucleósidos modificados, por ejemplo, nucleósidos modificados en 2' (tercer número = flanco 3'), opcionalmente precedidos o seguidos por regiones repetidas adicionales de ADN y LNA, que no son necesariamente parte de la secuencia contigua que es complementaria al ácido nucleico diana. Para algunos oligonucleótidos en la tabla 3, los flancos son flancos mixtos, dichos flancos comienzan y terminan con un nucleósido modificado en 2', en estos casos, la región de hueco es el número superior a 5 que no se ubica en el extremo 5' o 3' del diseño.
Para los compuestos de oligonucleótidos, las letras mayúsculas representan los nucleósidos de LNA beta-D-oxi, las letras minúsculas representan los nucleósidos de ADN, todos los LNA C son 5-metil citosina y las 5-metil citosinas de ADN se presentan por "e", todos los enlaces internucleosídicos son enlaces internucleosídico de fosforotioato.
Oligonucleótidos con una indicación EX-EX como Inicio en la SEQ ID NO: 1 son oligonucleótidos que abarcan exón-exón diseñados para ser complementarios a través de las uniones exón-exón de SNHG14-023 (ENST00000554726). Los oligonucleótidos abarcan principalmente el exón2 y el exón3 (es decir, son complementarios a una región en el exón2 y una región en el exón 3)
Síntesis de oligonucleótidos
La síntesis de oligonucleótidos es generalmente conocida en la técnica. Más adelante se muestra un protocolo que se puede aplicar. Los oligonucleótidos de la presente invención se pueden haber producido mediante métodos ligeramente variables en términos de aparato, soporte y concentraciones utilizadas.
Los oligonucleótidos se sintetizan en soportes universales de uridina utilizando el enfoque de fosforamidita en un sintetizador MerMade12 o un sintetizador de ADN/ARN Oligomaker a una escala de 1-4 |jmol. Al final de la síntesis, los oligonucleótidos se escinden del soporte sólido usando amoníaco acuoso durante 5-16 horas a 60 °C. Los oligonucleótidos se purifican por HPLC de fase inversa (RP-HPLC) o por extracciones en fase sólida y se caracterizan por UPLC, y la masa molecular se confirma adicionalmente por ESI-MS.
Elongación del oligonucleótido:
El acoplamiento de p-cianoetil-fosforamiditas (ADN-A(Bz), ADN-G (ibu), ADN-C (Bz), ADN-T, LNA-5-metil-C (Bz), LNA-A (Bz), LNA-G (dmf), LNA-T o enlazador amino-C6) se realiza mediante el uso de una solución de 0.1 M de la amidita protegida con 5'-O-DMT en acetonitrilo y DCI (4,5-dicianoimidazol) en acetonitrilo (0.25 M) como activador. Para el ciclo final se puede usar una fosforamidita con modificaciones deseadas, por ejemplo, un enlazador C6 para unir un grupo conjugado o un grupo conjugado como tal. La tiolación para la introducción de enlaces fosfortioato se lleva a cabo mediante el uso de hidruro de xantano (0.01 M en acetonitrilo/piridina 9:1). Los enlaces fosfodiéster se pueden introducir usando yodo 0.02 M en THF/piridina/agua 7:2:1. El resto de los reactivos son los que se usan típicamente para la síntesis de oligonucleótidos.
Purificación por RP-HPLC:
Los compuestos crudos se purifican por RP-HPLC preparativa en una columna Phenomenex Jupiter C18 10j 150x10 mm. Se utiliza acetato de amonio 0.1 M pH 8 y acetonitrilo como amortiguadores a una velocidad de flujo de 5 mL/min. Las fracciones recolectadas se liofilizan para proporcionar el compuesto purificado típicamente como un sólido blanco.
abreviaturas:
DCI:
4,5-Dicianoimidazol
DCM:
Diclorometano
DMF:
Dimetilformamida
DMT:
4,4'-Dimetoxitritil
THF:
Tetrahidrofurano
Bz:
Benzoilo
Ibu:
Isobutirilo
RP-HPLC:
Cromatografía líquida de alta resolución de fase inversa
Ensayo Tm
Los dúplex diana de oligonucleótidos y ARN se diluyen hasta 3 mM en 500 ml de agua libre de RNasa y se mezclan con 500 ml de amortiguador 2x Tm (NaCl 200 mM, Ed TA 0,2 mM, nafosfato 20 mM, pH 7,0). La solución se calienta a 95 °C durante 3 min y luego se deja recocer a temperatura ambiente durante 30 min. Las temperaturas de fusión dúplex (Tm) se miden en un espectrofotómetro Lambda 40 UV/VIS equipado con un programador de temperatura Peltier PTP6 utilizando el software PE Templab (Perkin Elmer). La temperatura se eleva de 20 ° C a 95 ° C y luego baja a 25 ° C, registrando la absorción a 260 nm. La primera derivada y los máximos locales tanto de la fusión como del recocido se utilizan para evaluar la Tm dúplex.
Preparación de cultivos de células de neuronas corticales primarias de ratón
Se prepararon cultivos de neuronas corticales primarias a partir de cerebros de embriones de ratón de 15 días de edad de acuerdo con el procedimiento estándar. En resumen, las placas de cultivo se revistieron con poli-L-lisina (50 |jg/ml de poli-L-lisina, tetraborato de Na 10 mM, amortiguador de pH 8) durante 2-3 horas a temperatura ambiente. Las placas se lavaron con IxPBS antes de su uso. Los cerebros de embriones de ratón recolectados se diseccionaron y homogeneizaron con una cuchilla de afeitar y se sumergieron en 38 ml de medio de disección (HBSS, Hepes 0.01 M, penicilina/estreptomicina). Entonces, se añadieron 2 ml de tripsina y las células se incubaron durante 30 min a 37 °C y se centrifugaron. Las células se disolvieron en 20 ml de DMEM (+ FBS al 10%) y se pasaron a través de una jeringa para una homogeneización adicional. Esto fue seguido de centrifugación a 500 rpm durante 15 minutos. Las células se disolvieron en DMEM (+ FBS al 10%) y se sembraron en placas de 96 pocillos (0.1 x 10A6 células/pocillo en 100 jl). Los cultivos de células neuronales estaban listos para su uso directamente después de la siembra.
Cribado de oligonucleótidos en cultivos de células de neuronas corticales primarias de ratón
Las células se cultivaron en medio de crecimiento (medio Gibco Neurobasal, suplemento B27, Glutamax, Pencillinestreptomicina) en placas de 96 pocillos y se incubaron con oligonucleótidos durante 3 días a las concentraciones deseadas. El ARN total se aisló de las células y la eficacia de inactivación se midió mediante análisis de qPCR usando el kit qScript™ XLT One-Step RT-qPCR ToughMix ®, Low ROX™ de Quanta Bioscience (95134-500). Se utilizaron ensayos taqman comerciales de Thermo Fisher Scientific para medir Ube3a_ATS, incluido GAPDH, para la normalización.
Generación de cultivos de células neuronales primarias humanas
Cualquier línea celular en cualquier punto de tiempo descrito se incubó a 37°C, concentración de CO2 al 5% y humedad relativa del 95%.
Cultivo de células madre pluripotentes inducidas humanas (hiPSC)
Se obtuvieron muestras de sangre humana entera de pacientes diagnosticados con el síndrome de Angelman. Los cultivos posteriores de células mononucleares de sangre periférica primarias (PMCS) se enriquecieron en eritroblastos. Las líneas de iPSC específicas del paciente se generaron reprogramando eritroblastos con el kit de reprogramación CytoTune-iPS Sendai (Thermo Fisher Scientific). Las líneas de iPSC derivadas se mantuvieron en condiciones libres de alimentadores utilizando Matrigel calificado para hESC (Corning) en mTESR1 (STEMCELL Technologies) con reemplazo diario del medio. Al alcanzar la confluencia, las colonias se disociaron en agrupamientos de células de 50 - 200 jm de tamaño utilizando el reactivo de disociación de células suaves (STEMCELL Technologies) y se subcultivaron en una proporción de 1:10 - 1:20 en presencia de Y-27632 10 jM (Calbiochem).
Diferenciación en células progenitoras neurales (NPC)
Tras la inducción de la diferenciación neural, las células derivadas de iPSC se mantuvieron en medio basal compuesto por volúmenes iguales de DMEM: medio F12 Glutamax y medio Neurobasal (Gibco, Invitrogen), complementado con 1x B27 (Gibco, Invitrogen), 1x N2 (Gibco, Invitrogen), beta-mercaptoetanol 0.1 mM (Gibco, Invitrogen) y los suplementos indicados.
Las células progenitoras neurales (NPC) se derivaron de hiPSC mediante inhibición dual de SMAD y de acuerdo con procedimientos publicados con ligeras modificaciones (Chambers et al. 2009 Nat Biotechnol. Vol. 3 págs. 275 80, Boissart et al., 2013 Transl Psychiatry. 3:e294). Las HiPSC se disociaron con Accutase (Innovative Cell Technologies Inc.) en una suspensión de células individuales y se resuspendieron en medio básico suplementado adicionalmente con 10 jM de Y-27632 (Calbiochem), 5 ng/ml de F<g>F (Peprotech), 10 jM de SB-431542 (Calbiochem) y 100 nM de LDN (Calbiochem). La suspensión de células individuales se transfirió a placas AggreWell800 (STEMCELL Technologies) que permiten la formación de agregados que consisten en 8000 células. Después de 5 días, los agregados neurales se transfirieron a placas revestidas con poli-L-ornitina (Sigma) y laminina (Roche) y se dejaron formar rosetas neurales bajo inhibición dual continua de SMAD (SB-431542 y LDN) en medio básico complementado con FGF. Las rosetas neuronales se aislaron selectivamente utilizando el reactivo de selección de rosetas neuronales STEMdiff™ (STEMCELL Technologies), se volvieron a colocar en placas revestidas con poli-L-ornitina y Laminin521 (BioLamina) y se expandieron en medio básico complementado con 10 ng/ml de FGF (Peprotech), 10 ng/ml de EGF (RnD) y 20 ng/ml de BDNF (Peprotech). Al alcanzar la confluencia, las células se disociaron enzimáticamente con tripsina/EDTA al 0.05% (Gibco, Invitrogen) y se subcultivaron. El pase continuo en medio básico complementado con FGF, EGF y BDNF conduce a una línea celular progenitora neural estable (línea NPC) dentro de 10 a 20 pases. Una línea celular progenitora neural estable se define por su capacidad de autorrenovación y por la expresión de los marcadores específicos de la etapa de desarrollo Sox2 y Nestin. Tras estímulos específicos, las NPC se diferencian en progenies neuronales (MAP2+, Tau+, HuC/D+) y astrogliales (GFAP+) (Dunkley et al., 2015 Proteomics Clin Appl. Vol. 7-8 págs. 684-94).
Cultivo NPC
Las condiciones para el cultivo de NPC se han descrito anteriormente y se utilizaron con ligeras modificaciones (Boissart et al., 2013 Transl Psychiatry. 3:e294). En resumen, las células se mantuvieron en placas revestidas con Laminin521 (BioLamina) y se cultivaron en medio básico [compuesto por volúmenes iguales de DMEM: medio F12 Glutamax y medio Neurobasal (Gibco, Invitrogen), complementado con 1x B27 (Gibco, Invitrogen), 1x N2 (Gibco, Invitrogen), beta-mercaptoetanol 0.1 mM (Gibco, Invitrogen)] y complementado con 10 ng/ml de FGF (Peprotech), 10 ng/ml de EGF (RnD) y 20 ng/ml de BDNF (Peprotech).
Diferenciación en cultivo de células neuronales
Para inducir la diferenciación neuronal de NPC, las células se disociaron con tripsina/EDTA al 0,05% (Gibco, Invitrogen) en una suspensión de células individuales y se sembraron en placas revestidas con Laminin521 (BioLamina) a una densidad de 12.000 células/cm2 y se mantuvieron en medio básico complementado con 200 ng/ml de Shh (Peprotech), 100 ng/ml de FGF8 (Peprotech) y 100 |jM de fosfato de ácido ascórbico (Sigma) durante un período de 7 días. Posteriormente, las células se volvieron a colocar en medio basal complementado con 20 ng/ml de BDNF (Peprotech), 10 ng/ml de GDNF (Peprotech), cAMP 0,5 mM (BIOLOG Life Science) y fosfato de ácido ascórbico 100<j>M (Sigma) a una densidad de 45.000 células/cm2 y se diferenciaron durante un período de 21 días. En el día 21 de la diferenciación, los cultivos neuronales diferenciados se volvieron a sembrar en el formato de placa compatible con el cribado. La reposición en placas se realizó disociando los cultivos con Accutase (Innovative Cell Technologies Inc.) en una suspensión de células individuales. Las células se sembraron a una densidad de 200.000 células/cm2 en presencia de Y-27632 10 j M (un inhibidor de cinasas Rho de Calbiochem permeable a las células, reversible) en las placas de microtitulación de 384 pocillos para el ensayo de cribado de oligonucleótidos finales. Los cultivos neuronales se diferenciaron adicionalmente durante 7 días adicionales en medio basal complementado con 20 ng/ml de BDNF (Peprotech), 10 ng/ml de GDNF (Peprotech), cAMP 0,5 mM (BIOLOG Life Science) y 100<j>M de fosfato de ácido ascórbico (Sigma). El medio de diferenciación se intercambió dos veces por semana. Después de un período de diferenciación total de 35 días, los cultivos de células neuronales estaban listos para el tratamiento con oligonucleótidos.
Cribado de oligonucleótidos en cultivos de células neuronales humanas - sistema de 384 pocillos
Para el cribado, las soluciones madre de oligonucleótidos se prediluyeron a las concentraciones indicadas con agua en placas de microtitulación de 384 pocillos (placa compuesta). El diseño de placa sirvió como molde de tratamiento. Se transfirieron dos microlitros de dilución de oligonucleótidos de cada pocillo de la placa de compuesto a una placa de cultivo respectiva. Toda la manipulación de líquidos se realizó en condiciones estériles en un flujo laminar utilizando un sistema robótico de laboratorio semiautomatizado (Beckmancoulter). Los cultivos de células neuronales se incubaron con oligonucleótidos durante 5 días sin cambio de medio. Posteriormente, los cultivos neuronales se lisaron y procesaron para el ensayo de qPCR con lisis celular lista en tiempo real y kit ARN Virus Master (Roche). La manipulación de líquidos se realizó utilizando un sistema robótico de laboratorio semiautomatizado (Beckmancoulter). Las muestras se analizaron mediante un sistema de PCR en tiempo real Lightcycler480 (Roche).
La actividad de los oligonucleótidos se evaluó mediante qPCR monitoreando la abundancia de transcritos de UBE3A utilizando los siguientes cebadores y sondas
UBE3a-Sense: Cebador directo: ATATGTGGAAGCCGGAATCT (SEQ ID NO: 837),
Cebador inverso: TCCCAGAACTCCCTAAT CAGAA (SEQ ID NO: 838),
Sonda interna etiquetada con tinte FAM: ATGACGGTGGCTATACCAGG (SEQ ID NO: 839)
La RT-qPCR se multiplexó con PPIA (peptidilprolil isomerasa A) como gen de mantenimiento para la normalización. Los cebadores y la sonda de PPIA etiquetados con el tinte VIC se compraron a Thermo Fisher Scientific (ID de ensayo Hs99999904_m1). Cada placa incluye un oligonucleótido no dirigido (simulado) como control negativo (TTGaataagtggaTGT (SEQ ID NO: 846)) y un oligonucleótido de referencia C<m>P ID NO: 41_1, lo que resulta en la regulación positiva del ARNm de UBE3A.
La selectividad de los oligonucleótidos se verificó mediante contracribado del transcrito SNORD 115, que se encuentra corriente arriba de SNORD109B en el cromosoma 15. La expresión de SNORD115 se monitoreó mediante qPCR utilizando los siguientes cebadores y sondas
Cebador directo: GGGTCAATGATGAGAACCTTAT (SEQ ID NO: 840),
Ceb ad o r inverso G G G C C T C A G C G T A A T C C T A T T (S E Q ID NO: 841),
Sonda interna etiquetada con el tinte FAM: T T C T G A A G A G A G G T G A T G A C T T A A A A (S E Q ID NO: 842) La R T -q P C R se multiplexó con P P IA (Therm o Fish er Scientific) tras el tratamiento con oligonucleótidos.
La reducción del transcrito S N H G 14 cadena abajo de S N O R D 109 B (también denom inado supresor U B E 3A ) se midió mediante R T -q P C R utilizando los siguientes cebadores y cebador directo de sonda: A T C C G A G G C A T G A A T C T C A C (S E Q ID NO: 843),
Ceb ad o r inverso: C A G G C C A A A A C C C T T G A T A A (S E Q ID NO: 844),
Sonda interna etiquetada con tinte FAM: T T G C T G A G C A T T T T T G C A T C (S E Q ID NO: 845)
La R T -q P C R se multiplexó con P P IA (Therm o Fish er Scientific).
Los datos se presentan como % de expresión promedio en relación con la sim ulación en todas las p lacas y se norm alizan al oligonucleótido de referencia para tener en cuenta la variación de placa a placa.
Cribado de oligonucleótidos en cultivos de células neuronales humanas - sistema de 96 pocilios
P ara el cribado, las soluciones madre de oligonucleótidos se prediluyeron a las concentraciones ind icadas con agua en p lacas de microtitulación de 96 pocillos (placa compuesta). El diseño de placa sirvió como molde de tratamiento. S e transfirieron dos microlitros de dilución de oligonucleótidos de cada pocillo de la placa de com puesto a una placa de cultivo respectiva. Toda la m anipulación de líquidos se realizó en condiciones estériles en un flujo lam inar utilizando un sistem a robótico de laboratorio sem iautom atizado (Beckm an Coulter). Los cultivos de célu las neuronales se incubaron con oligonucleótidos durante 5 d ías sin cam bio de medio. Posteriormente, los cultivos neuronales se lisaron y el A R N se purificó utilizando el kit de purificación de A R N Pure Link Pro96 ( 12173011 A ) LifeTechnologies. La m anipulación de líquidos se realizó utilizando un sistem a robótico de laboratorio sem iautom atizado (Beckm ancoulter). El a n á lis is de q P C R de U be3a y U b e 3 a -A T S se llevó a cabo en un sistem a de P C R en tiempo real V iiA ™ 7 Therm o Fish er Scientific utilizando el qScriptTM X L T 1-S te p R T -q P C R ToughMix Low R O X , de Q uanta (95134 -50 ).
S e utilizaron los siguientes cebadores y sondas:
q P C R U B E 3 a -S e n se :
Ceb ad o r directo: A T A T G T G G A A G C C G G A A T C T (S E Q ID NO: 697),
Ceb ad o r inverso: T C C C A G A A C T C C C T A A T C A G A A (S E Q ID NO: 698),
Sonda interna etiquetada con tinte FAM: A T G A C G G T G G C T A T A C C A G G (S E Q ID NO: 699) transcrito q P C R S N H G 14 cadena abajo de S N O R D 109 B (también denom inado supresor U B E3A ): Conjunto de cebadores y so ndas disponibles com ercialm ente de Therm oFisher: H s 01372957 _ m 1. Estos cebadores am plifican una se cu e n cia que abarca exón-exón de 87 pb en el transcrito de G en b an k A F400500.1
Transcripción QPCR GAPDH:
Conjunto de cebadores y so ndas disponibles com ercialm ente de Therm oFisher: S ím bolo genético: con los siguientes detalles del ensayo: RefSeq: NM _002046.3, Ubicación de exón de sonda:3, Tam año de amplicón: 122 pb. ID de ensayo TaqM an correspondiente: H s99999905_m 1.
La R T -q P C R para Ube3a y U b e 3 a -A T S se multiplexó con G A P D H como gen de mantenimiento para la norm alización. C a d a placa incluye un oligonucleótido no dirigido (sim ulado) como control negativo (T T G a a ta a g tg g a T G T (S E Q ID NO: 846)) y un oligonucleótido de referencia C M P ID n O: 21 _ 1 , lo que resulta en la regulación positiva del A R N m de U B E3A . A dem ás, se incluyó un panel de oligos que no se dirigen al transcrito U b3a o S N H G 14 cadena abajo de S N O R D 109 B (también denom inado supresor U B E3A ) para monitorear el ruido del ensayo y el riesgo de detectar falsos positivos. Estos se distribuyeron aleatoriam ente sobre las placas.
Oligonucleótidos de control:
Ejemplo 1 - Actividad de oligonucleótidos en cultivos de células neuronales primarias de ratón
Oligonucleótidos que se dirigen a la parte del ARN no codificante largo de SNHG14 que es antisentido al pre-ARNm de UBE3A (posición 55319 a 141053 de la SEQ ID NO: 1) se evaluaron para determinar su capacidad para reducir el transcrito de ARN no codificante largo SNHG14 que previene la expresión de UBE3A (también denominado supresor UBE3A o UBE3A-SUP en la tabla de datos) y su capacidad para inducir la reexpresión de ARNm de UBE3<a>en cultivos de células de neuronas corticales primarias de ratón, obtenidas como se describe en la sección "Materiales y métodos" anterior. La concentración de oligonucleótidos fue de 5 microM.
Los oligonucleótidos se cribaron de acuerdo con el protocolo para el cribado en cultivos de células de neuronas corticales de ratón descrito en la sección "Materiales y métodos". Los resultados se muestran en la tabla 4.
T l 4: A ivi li n l i n liv l l n r n l rim ri r n.
Ejemplo 2 - Actividad de oligonucleótidos en cultivos de células neuronales humanasLos oligonucleótidos que se dirigen a SNHG14 humano en la región cadena abajo de SNORD109B correspondiente a la posición 25278410 a 25419462 en el cromosoma 15 (SEQ ID NO: 1) se probaron en cultivos de células neuronales humanas derivadas de pacientes (ver protocolo en la sección "Materiales y métodos"). Se analizó la capacidad de los oligonucleótidos para reducir el transcrito SNHG14 en la región cadena abajo de SNORD109B (también denominado supresor UBE3A o UBE3A-SUP en la tabla de datos), sin afectar la expresión de SNORD115. Además, se analizó la capacidad para inducir la reexpresión de ARNm de UBE3A.
Los oligonucleótidos se cribaron de acuerdo con el protocolo para el cribado de oligonucleótidos en cultivos de células neuronales humanas descrito en la sección "Materiales y métodos" anterior.
Los resultados se muestran en la tabla 5. La expresión del ARNm de UBE3A se ha medido para todos los compuestos, mientras que la inactivación del supresor UBE3A y el mantenimiento de los niveles de SNORD1115 no se han analizado para todos los compuestos.
Table 5. Oligonucleotide activity in patient derived human neuronal cell cultures.
De los 187 compuestos probados, aproximadamente el 90%mostró reexpresión de UBE3A en comparación con el oligonucleótido simulado a la concentración de 5 micromolar. El número de oligonucleótidos capaces de inducir la reexpresión de UBE3A es mayor en la región entre la posición 1 a 55318 de la SEQ ID NO: 1 (región no superpuesta) y luego en la región complementaria a la región codificante de UBE3A (región superpuesta. La figura 2 grafica la distribución de los oligonucleótidos de acuerdo con su posición en el cromosoma 15 frente a la expresión de ARNm de UBE3A en relación con el oligonucleótido simulado.
Para los oligonucleótidos donde se ha probado SNORD115 no hay una regulación negativa significativa en comparación con los simulados a 1 y 5 microM.
Ejemplo 3 - Actividad de oligonucleótidos que se dirigen al transcrito SNHG14 en la región cadena abajo de SNORD109B y cadena arriba de la región antisentido al pre-ARNm de UBE3A
Los oligonucleótidos que se dirigen a la posición 4806-54939 de la SEQ ID NO: 1 se probaron en cultivos de células neuronales humanas derivadas de pacientes (ver protocolo en la sección "Materiales y métodos"). La capacidad de los oligonucleótidos para reducir el transcrito SNHG14 en la región cadena abajo de SNORD109B (también denominado supresor UBE3A o UBE3A-SUP en la tabla de datos. Además, se analizó la capacidad para inducir la reexpresión de ARNm de UBE3A.
Los oligonucleótidos se cribaron de acuerdo con el protocolo para el cribado de oligonucleótidos en cultivos de células neuronales humanas descrito en la sección "Materiales y métodos" - "Cribado de oligonucleótidos en cultivos de células neuronales humanas - sistema de 96 pocilios"
Los resultados se muestran en la tabla 6.
Tabla 6: Actividad de oligonucleótidos en cultivos de células neuronales humanas derivadas de pacientes.
E j e m p l o 4 - A c t i v i d a d d e o l i g o n u c l e ó t i d o s q u e s e d i r i g e n a l t r a n s c r i t o S N H G 1 4 e n l a r e g i ó n a n t i s e n t i d o a l p r e - A R N m d e U B E 3 A
Los oligonucleótidos que se dirigen a la posición 55337 -136214 de la S E Q ID NO: 1 se probaron en cultivos de célu las neuronales hum anas derivadas de pacientes (ver protocolo en la sección "M ateriales y métodos"). La capacidad de los oligonucleótidos para reducir el transcrito S N H G 14 en la región cadena abajo de S N O R D 109 B (también denom inado supresor U B E 3 A o U B E 3 A -S U P en la tabla de datos). A dem ás, se analizó la capacidad para inducir la reexpresión de A RN m de U B E3A .
Los oligonucleótidos se cribaron de acuerdo con el protocolo para el cribado de oligonucleótidos en cultivos de célu las neuronales hum anas descrito en la sección "M ateriales y métodos" - "Cribado de oligonucleótidos en cultivos de célu las neuronales hum anas - sistem a de 96 pocillos".
Los resultados se muestran en la tabla 7.
Tabla 7: Actividad de oligonucleótidos en cultivos de célu las neuronales hum anas derivadas de pacientes.
E j e m p l o 5 - A c t i v i d a d d e o l i g o n u c l e ó t i d o s q u e s e d i r i g e n a l t r a n s c r i t o S N H G 1 4 e n l a r e g i ó n c a d e n a a b a j o d e S N O R D 1 0 9 B y c a d e n a a r r i b a d e l a r e g i ó n a n t i s e n t i d o a l p r e - A R N m d e U B E 3 A
Los oligonucleótidos que se dirigen a la posición 5224-51257 de la SEQ ID NO: 1 se probaron en cultivos de células neuronales humanas derivadas de pacientes (ver protocolo en la sección "Materiales y métodos"). La capacidad de los oligonucleótidos para reducir el transcrito SNHG14 en la región cadena abajo de SNORD109B (también denominado supresor UBE3A o UBE3A-SUP en la tabla de datos. Además, se analizó la capacidad para inducir la reexpresión de ARNm de UBE3A.
Los oligonucleótidos se cribaron de acuerdo con el protocolo para el cribado de oligonucleótidos en cultivos de células neuronales humanas descrito en la sección "Materiales y métodos" "Cribado de oligonucleótidos en cultivos de células neuronales humanas - sistema de 96 pocilios" con las siguientes modificaciones:
Cebador UBE3a-Sense
Utilizando cebadores y sondas disponibles comercialmente de ThermoFisher: Hs00166580_m1 amplificando una secuencia de 94 pb en la posición 838 de la refseq ID NM_000462.3.
Cada placa incluye controles de PBS (en su lugar, en un ologinucleótido no dirigido) y un oligonucleótido de control positivo CMP ID NO: 271_1, lo que resulta en la regulación positiva del ARNm de UBE3A. No se incluyeron los oligonucleótidos de control adicionales.
Los datos se presentan como % de expresión promedio en relación con los controles de PBS en todas las placas y se normalizan al oligonucleótido de control positivo para gestionar la variación de placa a placa en los niveles de eficacia. Los resultados se muestran en la tabla 8.
Tabla 8: Actividad de oligonucleótidos en cultivos de células neuronales humanas derivadas de pacientes.
E j e m p l o 6 - A c t i v i d a d d e o l i g o n u c l e ó t i d o s q u e a b a r c a n e x ó n - e x ó n
Los oligonucleótidos diseñados para ser complementarios a través de las uniones exón-exón de SNHG14-023 (ENST00000554726) se evaluaron para determinar su capacidad para reducir el transcrito SNHG14 en la región cadena abajo de SNORD109B (también denominado supresor UBE3A o UBE3A-SUP en la tabla de datos). Además, se analizó la capacidad para inducir la reexpresión de ARNm de UBE3A. Los oligonucleótidos abarcan principalmente el exón2 y el exón3 (es decir, son complementarios a una región en el exón2 y una región en el exón 3).
Los oligonucleótidos se cribaron de acuerdo con el protocolo para el cribado de oligonucleótidos en cultivos de células neuronales humanas descrito en la sección Ejemplo 5.
Los resultados se muestran en la tabla 9.
Tabla 9: Actividad de oligonucleótidos en cultivos de células neuronales humanas derivadas de pacientes.
<E j e m p l o 7 - P r u e b a d e e f i c a c i a y p o t e n c i a>in vitro<d e o l i g o n u c l e ó t i d o s s e l e c c i o n a d o s>
Con base en los cribados en los ejemplos 2 a 5 anteriores, se seleccionaron 52 oligonucleótidos para las pruebas de potencia y eficacia.
Los oligonucleótidos se cribaron en células derivadas de pacientes con AS humana como se describe en la sección de Materiales y Método "Cribado de oligonucleótidos en cultivos de células neuronales humanas - sistema de 96 pocillos" con las siguientes modificaciones:
Para cebadores y sondas UBE3a-Sense disponibles comercialmente de ThermoFisher:
Se utilizó Hs00166580_m1 amplificando una secuencia de 94 pb en la posición 838 de la refseq ID NM_000462.3.
Cada placa incluye controles de PBS (en su lugar, en un oligonucleótido no dirigido) y los oligonucleótidos de control positivo CMP ID NO: 186_1 y 39_1 identificados en cribados anteriores. No se incluyeron los oligonucleótidos de control adicionales descritos en la sección de materiales y método. Las concentraciones de prueba de oligonucleótidos fueron de 31.6 |jM a 1 nM usando una dilución semilogarítmica de 10 puntos. Todos los oligonucleótidos se probaron en 5 experimentos independientes en 5 semanas diferentes. En el proceso de control de calidad de datos, se eliminaron algunas placas del análisis si estos eran valores atípicos obvios, por ejemplo, no se detectó ningún producto de PCR. Después de esta filtración, hay un mínimo de tres experimentos independientes detrás de cada valor informado.
La EC50 (reexpresión de ARNm de UBE3A) y la IC50 (reducción del transcrito SNHG14 en la región cadena abajo de SNORD109B, también denominado supresor UBE3A o UBE3A-SUP en la tabla de datos) se determinaron después del ajuste de la curva utilizando un modelo de dosis-respuesta sigmoidal de 4 parámetros. El ajuste se ejecutó utilizando el motor de ajuste disponible dentro del software Biobook de IDBS (XLfit). A partir del ajuste de curva se determinó la regulación ascendente máxima obtenible de UBE3A (UBE3A Max Up) y la atenuación máxima obtenible de UBE3A-SUP (UBE3A-SUP max Kd). Ambos se muestran como % de control (células tratadas con PBS). Los resultados se muestran en la tabla 10, los valores se informan como medias geométricas de cada réplica biológica.
Tabla 10: Valores de EC50 e IC50 de oligonucleótidos y máxima regulación a la alta de UBE3A y atenuación del supresor de UBE3A.

Claims (32)

R E I V I N D I C A C I O N E S
1. Un oligonucleótido antisentido para uso en el tratamiento o prevención del síndrome de Angelman en un sujeto, en donde el oligonucleótido antisentido comprende una secuencia de nucleótidos contigua de 10 a 30 nucleótidos de longitud con 100% de complementariedad con la posición 25278410 a 25419462 en el cromosoma humano 15 (SEQ ID NO:1), en donde el oligonucleótido antisentido es capaz de inducir la expresión de UBE3A paterno humano.
2. Un conjugado para uso en el tratamiento o prevención del síndrome de Angelman en un sujeto, el conjugado que comprende un oligonucleótido antisentido y al menos una porción conjugada unida covalentemente al oligonucleótido, en donde el oligonucleótido antisentido comprende una secuencia de nucleótidos contigua de 10 a 30 nucleótidos de longitud con 100% de complementariedad con la posición 25278410 a 25419462 en el cromosoma humano 15 (SEQ ID NO:1), en donde el oligonucleótido antisentido es capaz de inducir la expresión de UBE3A paterno humano.
3. Una composición farmacéutica para uso en el tratamiento o prevención del síndrome de Angelman en un sujeto, la composición farmacéutica que comprende
(a) un oligonucleótido antisentido que comprende una secuencia de nucleótidos contigua de 10 a 30 nucleótidos de longitud con 100% de complementariedad con la posición 25278410 a 25419462 en el cromosoma humano 15 (SEQ ID NO:1), en donde el oligonucleótido antisentido es capaz de inducir la expresión de UBE3A paterno humano; o
(b) un conjugado que comprende el oligonucleótido antisentido de (a) y al menos una porción conjugada unida covalentemente al oligonucleótido;
y un diluyente, disolvente, portador, sal y/o adyuvante farmacéuticamente aceptable.
4. Un métodoin vitropara inducir la expresión de UBE3A en una célula diana donde se suprime la expresión de UBE3A paterna, el método que comprende administrar en una cantidad eficaz a la célula
(a) un oligonucleótido antisentido que comprende una secuencia de nucleótidos contigua de 10 a 30 nucleótidos de longitud con 100% de complementariedad con la posición 25278410 a 25419462 en el cromosoma humano 15 (SEQ ID NO:1), en donde el oligonucleótido antisentido es capaz de inducir la expresión de UBE3A paterno humano; o
(b) un conjugado que comprende el oligonucleótido antisentido de (a) y al menos una porción conjugada unida covalentemente al oligonucleótido; o
(c) una composición farmacéutica que comprende el oligonucleótido antisentido de (a) o el conjugado de (b), y un diluyente, disolvente, portador, sal y/o adyuvante farmacéuticamente aceptable.
5. El oligonucleótido para uso de la reivindicación 1, el conjugado para uso de la reivindicación 2, la composición farmacéutica para uso de la reivindicación 3 o el método de la reivindicación 4, en donde la secuencia de nucleótidos contigua es complementaria a una región del ácido nucleico diana de la SEQ ID NO: 1.
6. El oligonucleótido para uso de la reivindicación 1 o la reivindicación 5, el conjugado para uso de la reivindicación 2 o la reivindicación 5, la composición farmacéutica para uso de la reivindicación 3 o la reivindicación 5, o el método de la reivindicación 4 o la reivindicación 5, en donde la secuencia de nucleótidos contigua es 100% complementaria a una región del ácido nucleico diana de la posición 1 a 55318 de la SEQ ID NO: 1.
7. El oligonucleótido para uso de cualquiera de las reivindicaciones 1, 5 y 6, el conjugado para uso de cualquiera de las reivindicaciones 2, 5 y 6, la composición farmacéutica para uso de cualquiera de las reivindicaciones 3, 5 y 6, o el método de cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, en donde la secuencia de nucleótidos contigua es complementaria a una subsecuencia del ácido nucleico diana, en donde la subsecuencia se selecciona del grupo que consiste en las regiones indicadas en la tabla 1 o 2.
8. El oligonucleótido para uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 y 5 a 7, el conjugado para uso de cualquiera de las reivindicaciones 2 y 5 a 7, la composición farmacéutica para uso de cualquiera de las reivindicaciones 3 y 5 a 7, o el método de cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7, en donde el oligonucleótido comprende o consiste en 17 a 22 nucleótidos de longitud o 15 a 20 nucleótidos de longitud.
9. El oligonucleótido para uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 y 5 a 8, el conjugado para uso de cualquiera de las reivindicaciones 2 y 5 a 8, la composición farmacéutica para uso de cualquiera de las reivindicaciones 3 y 5 a 8, o el método de cualquiera de las reivindicaciones 4 a 8, en donde el oligonucleótido consiste en 20 nucleótidos de longitud.
10. El oligonucleótido para uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 y 5 a 9, el conjugado para uso de cualquiera de las reivindicaciones 2 y 5 a 9, la composición farmacéutica para uso de cualquiera de las reivindicaciones 3 y 5 a 9, o el método de cualquiera de las reivindicaciones 4 a 9, en donde el oligonucleótido comprende uno o más nucleósidos modificados.
11. El oligonucleótido para uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 y 5 a 10, el conjugado para uso de cualquiera de las reivindicaciones 2 y 5 a 10, la com posición farm acéutica para uso de cualquiera de las reivindicaciones 3 y 5 a 10, o el método de cualquiera de las reivindicaciones 4 a 10, en donde se usa 5-m etil citosina en lugar de citosina en el oligonucleótido.
12. El oligonucleótido para uso, el conjugado para uso, la com posición farm acéutica para uso o el método de la reivindicación 10 o la reivindicación 11 , en donde el uno o m ás nucleósidos m odificados es un nucleósido modificado con azúcar 2'.
13. El oligonucleótido para su uso, el conjugado para su uso, la com posición farm acéutica para su uso o el método de la reivindicación 12 , en donde el uno o m ás nucleósidos modificados con azúcar en 2' se seleccionan independientem ente del grupo que consiste en 2 '-O -a lq u il-A R N , 2 '-O -m etil-A R N , 2' -a lco x i-R N , 2'-O -m etoxietil-A R N , 2' -am ino -A R N , 2'-fluoro-A RN , ácido arabino nucleico (ANA), 2'-fluoro-A N A y nucleósidos de LNA.
14. El oligonucleótido para uso, el conjugado para uso, la com posición farm acéutica para uso o el método de cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13 , en donde el uno o m ás nucleósidos modificados es un nucleósido de 2'-O -m etoxietil-A RN .
15. El oligonucleótido para uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 y 5 a 14, el conjugado para uso de cualquiera de las reivindicaciones 2 y 5 a 14, la com posición farm acéutica para uso de cualquiera de las reivindicaciones 3 y 5 a 14, o el método de cualquiera de las reivindicaciones 4 a 14, en donde el oligonucleótido com prende al menos un enlace internucleosídico modificado.
16. El oligonucleótido para uso, el conjugado para uso, la com posición farm acéutica para uso o el método de la reivindicación 15 , en donde el enlace internucleosídico modificado es un enlace internucleosídico de fosforotioato.
17. El oligonucleótido para uso, el conjugado para uso, la com posición farm acéutica para uso o el método de la reivindicación 16, en donde al m enos 60 % de los e n laces internucleosídicos en el oligonucleótido son enlaces internucleosídicos de fosforotioato.
18. El oligonucleótido para uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 y 5 a 17 , el conjugado para uso de cualquiera de las reivindicaciones 2 y 5 a 17 , la com posición farm acéutica para uso de cualquiera de las reivindicaciones 3 y 5 a 17 , o el método de cualquiera de las reivindicaciones 4 a 17 , en donde el oligonucleótido es capaz de reclutar R N a sa H.
19. El oligonucleótido para uso, el conjugado para uso, la com posición farm acéutica para uso o el método de la reivindicación 18, en donde el oligonucleótido es un gápmero.
20. El oligonucleótido para uso, el conjugado para uso, la com posición farm acéutica para uso o el método de la reivindicación 18 o la reivindicación 19, en donde el oligonucleótido es un gápm ero de fórmula 5 '-F -G -F '-3 ', en donde la región F y F' com prenden independientem ente de 1 a 7 nucleósidos modificados y G es una región entre 6 y 16 nucleósidos que son ca p ace s de reclutar R N asa H .
21. El oligonucleótido para su uso, el conjugado para su uso, la com posición farm acéutica para su uso o el método de la reivindicación 20, en donde los nucleósidos m odificados son nucleósidos modificados con azúcar en 2'seleccionado s independientem ente del grupo que consiste en 2 '-O -a lq u il-A R N , 2 '-O -m etil-A R N , 2' -a lco x i-R N , 2'-O -m etoxietil-A RN, 2' -am ino -A R N , 2'-fluoro-A RN , ácido arabino nucleico (ANA), 2'-fluoro-A N A y nucleósidos de LNA.
22. El oligonucleótido para uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 y 5 a 21 , el conjugado para uso de cualquiera de las reivindicaciones 2 y 5 a 21 , la com posición farm acéutica para uso de cualquiera de las reivindicaciones 3 y 5 a 21 , o el método de cualquiera de las reivindicaciones 4 a 21 , en donde el oligonucleótido es un gápm ero de la fórmula F -G -F ' en donde cada una de las regiones F y F' consiste independientem ente en 2, 3, 4 o 5 unidades de nucleósido m odificadas y la región G consiste en 9, 10, 11 , 12 , 13 , 14 o 15 unidades de nucleósido.
23. El oligonucleótido para uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 y 5 a 20, el conjugado para uso de cualquiera de las reivindicaciones 2 y 5 a 22 , la com posición farm acéutica para uso de cualquiera de las reivindicaciones 3 y 5 a 22 , o el método de cualquiera de las reivindicaciones 4 a 22 , en donde el oligonucleótido es un gápm ero de la fórmula F -G -F ' en donde cada una de las regiones F y F' consiste independientem ente en 2, 3, 4 o 5 unidades de azú car 2'-O -m etoxietil-ribosa (2'-M O E), y la región G consiste en 9, 10, 11 , 12 , 13 , 14 o 15 unidades de A D N .
24. El oligonucleótido para uso, el conjugado para uso, la com posición farm acéutica para uso o el método de cualquiera de las reivindicaciones 20 a 23, en donde cada una de las regiones F y F'consiste independientem ente en 5 unidades de nucleósido de azúcar 2'-O -m etoxietil-ribosa (2'-M O E) y la región G consiste en 10 unidades de nucleósido de A DN .
25. Un oligonucleótido antisentido capaz de inducir la expresión de UBE3A paterno humano para uso en el tratamiento o prevención del síndrome de Angelman en un sujeto, en donde el oligonucleótido antisentido comprende una secuencia de nucleótidos contigua que es 100% complementaria a una región del ácido nucleico diana de la posición 1 a 55318 de la SEQ ID NO: 1, en donde el oligonucleótido es de 15 a 20 nucleótidos de longitud o de 17 a 22 nucleótidos de longitud, en donde el oligonucleótido comprende uno o más nucleósidos modificados, en donde el uno o más nucleósidos modificados es un nucleósido modificado con azúcar 2', en donde el uno o más nucleósidos modificados con azúcar 2' se selecciona independientemente del grupo que consiste en 2'-O-alquil-ARN, 2'-O-metil-ARN, 2'-alcoxi-RN, 2'-O-metoxietil-ARN, 2'-amino-ADN, 2'-fluoro-ADN, ácido arabino nucleico (ANA), 2'-fluoro-ANA y nucleósidos de LNA, en donde el oligonucleótido comprende al menos un enlace internucleosídico modificado, en donde el enlace internucleosídico modificado es un enlace fosforotioato, en donde el oligonucleótido es un gapmero de la fórmula F-G-F' en donde cada una de las regiones F y F' consiste independientemente en 2, 3, 4 o 5 unidades de nucleósido modificadas y la región G consiste en 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 unidades de nucleósido.
26. Un conjugado para uso en el tratamiento o prevención del síndrome de Angelman en un sujeto, el conjugado que comprende un oligonucleótido antisentido y al menos una porción conjugada unida covalentemente al oligonucleótido, en donde el oligonucleótido antisentido comprende una secuencia de nucleótidos contigua que es 100% complementaria a una región del ácido nucleico diana de la posición 1 a 55318 de la SEQ ID NO: 1, en donde el oligonucleótido es de 15 a 20 nucleótidos de longitud o de 17 a 22 nucleótidos de longitud, en donde el oligonucleótido comprende uno o más nucleósidos modificados, en donde el uno o más nucleósidos modificados es un nucleósido modificado con azúcar 2', en donde el uno o más nucleósidos modificados con azúcar 2' se selecciona independientemente del grupo que consiste en 2'-O-alquil-ARN, 2'-O-metil-ARN, 2'-alcoxi-RN, 2'-O-metoxietil-ARN, 2'-amino-ADN, 2'-fluoro-ADN, ácido arabino nucleico (ANA), 2'-fluoro-ANA y nucleósidos de LNA, en donde el oligonucleótido comprende al menos un enlace internucleosídico modificado, en donde el enlace internucleosídico modificado es un enlace fosforotioato, en donde el oligonucleótido es un gapmero de la fórmula F-G-F' en donde cada una de las regiones F y F' consiste independientemente en 2, 3, 4 o 5 unidades de nucleósido modificadas y la región G consiste en 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 unidades de nucleósido.
27. Una composición farmacéutica en el tratamiento o prevención del síndrome de Angelman en un sujeto, la composición farmacéutica que comprende
(i) un oligonucleótido antisentido que comprende una secuencia de nucleótidos contigua que es 100% complementaria a una región del ácido nucleico diana de la posición 1 a 55318 de la SEQ ID NO: 1, en donde el oligonucleótido es de 15 a 20 nucleótidos de longitud o de 17 a 22 nucleótidos de longitud, en donde el oligonucleótido comprende uno o más nucleósidos modificados, en donde el uno o más nucleósidos modificados es un nucleósido modificado con azúcar 2', en donde el uno o más nucleósidos modificados con azúcar 2' se selecciona independientemente del grupo que consiste en 2'-O-alquil-ARN, 2'-O-metil-ARN, 2'-alcoxi-RN, 2'-O-metoxietil-ARN, 2'-amino-ADN, 2'-fluoro-ADN, ácido arabino nucleico (ANA), 2'-fluoro-ANA y nucleósidos de LNA, en donde el oligonucleótido comprende al menos un enlace internucleosídico modificado, en donde el enlace internucleosídico modificado es un enlace fosforotioato, en donde el oligonucleótido es un gapmero de la fórmula F-G-F' en donde cada una de las regiones F y F' consiste independientemente en 2, 3, 4 o 5 unidades de nucleósido modificadas y la región G consiste en 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 unidades de nucleósido; o
(ii) un conjugado que comprende el oligonucleótido antisentido de (i) y al menos una porción conjugada unida covalentemente al oligonucleótido;
y un diluyente, disolvente, portador, sal y/o adyuvante farmacéuticamente aceptable.
28. Un métodoin vitropara inducir la expresión de UBE3A en una célula diana donde se suprime la expresión de UBE3A paterna, el método que comprende administrar en una cantidad eficaz a la célula
(i) un oligonucleótido antisentido que comprende una secuencia de nucleótidos contigua que es 100% complementaria a una región del ácido nucleico diana de la posición 1 a 55318 de la SEQ ID NO: 1, en donde el oligonucleótido es de 15 a 20 nucleótidos de longitud o de 17 a 22 nucleótidos de longitud, en donde el oligonucleótido comprende uno o más nucleósidos modificados, en donde el uno o más nucleósidos modificados es un nucleósido modificado con azúcar 2', en donde el uno o más nucleósidos modificados con azúcar 2' se selecciona independientemente del grupo que consiste en 2'-O-alquil-ARN, 2'-O-metil-ARN, 2'-alcoxi-RN, 2'-O-metoxietil-ARN, 2'-amino-ADN, 2'-fluoro-ADN, ácido arabino nucleico (ANA), 2'-fluoro-ANA y nucleósidos de LNA, en donde el oligonucleótido comprende al menos un enlace internucleosídico modificado, en donde el enlace internucleosídico modificado es un enlace fosforotioato, en donde el oligonucleótido es un gapmero de la fórmula F-G-F' en donde cada una de las regiones F y F' consiste independientemente en 2, 3, 4 o 5 unidades de nucleósido modificadas y la región G consiste en 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 unidades de nucleósido; o
(ii) un conjugado que comprende el oligonucleótido antisentido de (i) y al menos una porción conjugada unida covalentemente al oligonucleótido; o
(iii) una composición farmacéutica que comprende el oligonucleótido antisentido de (i) o el conjugado de (ii), y un diluyente, disolvente, portador, sal y/o adyuvante farmacéuticamente aceptable.
29. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 24 y 28, en donde la expresión de UBE3A aumenta en al menos 40% en comparación con un control.
30. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 24, 28 y 29, en donde el nivel del transcrito S N H G 14 cadena abajo de S N O R D 109 B se reduce en al m enos 30 % en com paración con un control.
31. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 24 y 28 a 30, en donde la célula objetivo es una célula neuronal.
32. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 24 y 28 a 31 , en donde la expresión de S N O R D 115 no se ve afectada significativam ente en com paración con un control.
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