FR2497228A1 - Procede de production d'une cholesteroloxydase et produit obtenu - Google Patents
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Abstract
L'INVENTION A TRAIT A UNE NOUVELLE CHOLESTEROLOXYDASE. ON OBTIENT CET ENZYME PAR UN PROCEDE QUI CONSISTE A CULTIVER UNE SOUCHE APPARTENANT A LA CLASSE DES BASIDIOMYCETES ET CAPABLE DE PRODUIRE DE LA CHOLESTEROLOXYDASE DANS UN MILIEU DE CULTURE POUR ACCUMULER LA CHOLESTEROLOXYDASE ET A RECUEILLIR LA CHOLESTEROLOXYDASE DU BOUILLON DU CULTURE RESULTANT. LA CHOLESTEROLOXYDASE EST UTILISEE NOTAMMENT EN ANALYSE MEDICALE POUR LE DOSAGE DU CHOLESTEROL DANS LE SERUM.
Description
La présente invention concerne une cholestérol-
oxydase nouvelle ainsi qu'un procédé permettant de l'obtenir. L'invention concerne plus particulièrement une nouvelle cholestérol-oxydase qui est douée d'une grande activité envers des L5-33 -hydroxystéroides, en particu- lier d'une grande activité d'oxydation du cholestérol
pour former la cholest-5-ène-3-one et du peroxyde d'hydro-
gène, et elle a également trait à un procédé de production de cette nouvelle cholestérol-oxydase par culture d'une
souche appartenant à la classe des basidiomycètes.
Au cours des dernières années, par suite des
progrès réalisés dans l'étude sur l'importance physiolo-
gique du cholestérol in vivo, une augmentation ou une diminution de la quantité de cholestérol dans le sérum a été considérée comme un critère important du point de
vue médical. Par exemple, il a été démontré qu'une élé-
vation extrême du taux de cholestérol dans le sérum
se manifestait dans le cas de maladies telles que l'arté-
riosclérose et l'hémorragie cérébrale. En conséquence, une élévation du taux de cholestérol sanguin, mise en évidence par son dosage, a été utilisée pour diagnostiquer des maladies telles que l'artériosclérose et l'hémorragie cérébrale. Ce dosage du cholestérol sérique a généralement
été effectué par une méthode chimique calorimétrique.
Toutefois, la méthode chimique calorimétrique nécessite une grande quantité de sang, des processus analytiques
compliqués et une longue période d'exécution. Par consé-
quent, cette méthode est désavantageuse et impraticable.
Il a été récemment mis au point pour le labora-
toire d'analyses médicales, une méthode dite enzymatique pour le dosage quantitatif du cholestérol du sérum,
conformément à laquelle on utilise une certaine cholestérol-
oxydase (enzyme) qui est capable d'oxyder le cholestérol
en présence d'oxygène pour former de la cholest-4-ène-3-
one et du peroxyde d'hydrogène, dont on effectue le
dosage quantitatif par colorimétrie. On peut donc déter-
miner la quantité ou la concentration du cholestérol dans le sérum par l'analyse quantitative du peroxyde
d'hydrogène ainsi produit.
La cholestérol-oxydase qu'il est connu d'utili-
ser pour la méthode enzymatique ci-dessus est, d'une manière générale, un enzyme qui oxyde le cholestérol en
présence d'oxygène pour former de la cholest-4-ène-3-
one et du peroxyde d'hydrogène. Ainsi, la particularité de la cholestéroloxydase classique est que l'un des produits formés par la réaction avec le cholestérol est
toujours la cholest-4-ène-3-one.
Les micro-organismes dont on connaît l'aptitude à produire cette cholestérol-oxydase sont des espèces appartenant au genre Nocardia /Clin. Chem. Vol. 19,
1350 - 1356 (1973)7, Brevibacterium sterolicum -Agric.
Biol. Chem. vol. 37, 2345 - 2350 (1973)7, des espèces du genre Streptomyces /-Chem. Pharm. Bull. vol. 21, 2057 - 2060 (1973)7 et Schizophillum commune /-brevet des Etats-Unis d'Amérique No 4 003 794 (1977)7. Il est bien connu que lorsque ces cholestérol-oxydases réagissent
avec des A5-33 -hydroxystéroides, il est toujours pro-
duit des A4-3-oxostéroides.
La présente invention a pour but de produire une nouvelle cholestéroloxydase utile dans la méthode enzymatique définie ci-dessus pour le dosage du cholestérol dans le sérum. La nouvelle cholestérol-oxydase conforme à l'invention se distingue, du point de vue enzymatique,
des cholestérol-oxydases connues en ce que les pro-
duits de sa réaction avec des A5-3( -hydroxystéroides
sont des 5-3-oxostéroides au lieu de A4-3-oxostéroides.
Par exemple, les produits de la réaction de la nouvelle cholestéroloxydase avec le cholestérol ne sont pas la cholest-4-ène-3-one et le peroxyde d'hydrogènemais
la.cholest-5-ène-3-one et le peroxyde d'hydrogène.
Conformément à l'invention, la nouvelle cholestérol-oxydase est produite par culture d'une souche qui appartient à la classe des basidiomycetes et qui est capable de produire de la cholestérol-oxydase dans
un milieu de culture, et isolement de la cholestérol-
oxydase du filtrat de culture.
On a expérimenté une large gamme de souches de la classe des basidiomycètes afin de trouver des souches productrices de cholestéroloxydase. Chaque souche a été cultivée de la manière usuelle dans un milieu (pH ,8) contenant 2 % de glucose, 0,3 % d'extrait de levure, 1 % de polypeptone, 0,3 % de KH2PO4 et 0,1 % de MgSO4.7H20. Le bouillon de culture a été filtré et le filtrat a été utilisé comme source d'enzyme pour la mesure de l'activité en cholestérol-oxydase. On a trouvé dans cette étude que les souches appartenant aux genres Lentinus, Oudemansiella, Flammulina, Lepiota, Coprinus, Psilocybe, Gloeocystidium, Phellinus, Auricularia et Poria étaient capables de produire de la cholestérol-oxydase
conformément à l'invention.
Des espèces plus particulières appartenant à ces genres sont par exemple Lentinus edodes FERM-P 5776, Oudemansiella radicate FERM-F 5777, Oudemansiella mucida FERM-P 5778, Flammulina velutipes FERM-P 5779, Lepiota procera FERM-P 5780, Coprinus comatus FERM-P 5781,
Psilocybe coprophila FERM-P 5782, Gloeocystidium chryso-
creas FERM-P 5783, Phellinus gilvus FERM-P 5784, Auricularia polytricha FERM-P 5785 et Poria epimiltina
FERM-P 5804.
Toutes ces souches ont été déposées à l'Institut FERM (Fermentation Research Institute), au Japon, sous les numéros FERM indiqués ci-dessus, et sont accessibles
au public qui peut se les procurer librement.
Les caractéristiques de ces souches sont les suivantes: (a) Lentinus edodes FERM-P 5776 Péridium: hémisphérique ou réniforme, de 6 à cm de diamètre. Cuticule d'un brun foncé, à écailles
dentelées imbriquées et rompue en un réseau de fissures.
Chair compacte, coriace, blanche et légèrement déformée
à sec. Lamelles: sinueuses, assez rapprochées et blanches.
Stipe: 3-4 cm de longueur, 10 mm d'épaisseur. Coriace, surface inférieure en dehors de l'anneau brun pâle, fibreuse. Dessus blanc, lisse ou strié. Spores: blanches
en masse, cylindriques à ellipsoldales, mesurant 5-7 x 3,5 im.
(b) Oudemansiella radicate FERM-P 5777 Péridium: 5-9 cm de diamètre. Tout d'abord en forme de cloche, finalement plat avec une légère gibbosité centrale. Cuticule d'un brun grisâtre pâle, très visqueuse à l'état humide, ridée radialement. Chair mince, d'un blanc grisâtre. Lamelles: larges, sub-distantes et adnées. Stipe: creux, 5 d 12 cm de longueur, 4 à 9 mm d'épaisseur. Brun grisâtre pâle, poudreux, devenant strié verticalement, souvent tordu. Rétréci vers le sommet, longuement renflé, 5-30 cm de longueur. Spores: blanches en masse,eliipsoidales ou globuleuses, lisses, mesurant -24 x 14-18 gm. Baside: 45-55 x 11-13 Am avec 2 ou 4 spores. (c) Oudemansiella mucida FERM-P 5778 Peridium: 3-6 cm de diamètre. Hémisphérique et mince à la périphérie. D'un blanc brillant prenant souvent une couleur peau au centre. Cuticule très visqueuse à l'état humide. Poudreux et brillant si un temps sec
persiste. Marge striée. Chair blanche, molle, gélatineuse.
Lamelles: blanches, larges, sub-distantes et adnées.
Stipe: 3-6 cm de longueur, 3-7 mm d'épaisseur. Dur, cartilagineux, blanc et strié au-dessus de l'anneau membraneux large. Court, s'amincissant vers le haut à partir de la base. Spores: blanches en masse, ellipsoidales
ou globuleuses, lisses, mesurant 20-23 x 16-18 jm.
Baside: 70-100 x 20-30 gm, avec 4 spores.
(d) Flammulina velutipes FERM-P 5779 Péridium: d'abord convexe puis aplati. 2-8 cm
de diamètre. Cuticule très visqueuse à l'état humide.
Ocre-jaune, avec une couleur pâle à la périphérie.
Chair blanc jaunâtre, molle, épaisse au centre. Lamelles: blanc ou jaune pâle. Larges, non attachées au pied ou sinuées et assez rapprochées. Stipe: 3-10 cm de longueur, 2-8 mm d'épaisseur. Dur, rétréci vers le bas depuis l'apex, recourbée souvent tordu, Brun foncé, jaune et poudreux à l'apex, densément velouteux. Chair fibreuse, creuse au stade final. Spores: blanches en masse, cylindriques à ellipsoidales, lisses, mesurant 5-8 x 3-4 am. Cystide: 33-66 x 9-25 am, avec cheilocystide
et pleurocystide.
(e) Lepiota procera FERM-P 5780 Péridium: d'abord ovoïde, puis s'aplatissant
en présentant une protubérance légère à proéminente.
Périphérie mince, rabattue et frangée. 10-20 cm de dia-
mètre. Cuticule uniformément brune au départ, se rompant
en écailles grossières à mesure que le péridium s'épanouit.
Chair blanche, molle, spongieuse, pas très épaisse.
Lamelles: blanches et distantes. Stipe: long, épais et creux. S'amincit vers le haut à partir de la base bulbeuse. Brun clair, à zones concentriques d'écailles brunes, avec un anneau épais près de l'apex. Spores: blanches en masse, ellipsoidales, lisses, mesurant 17-19 x
11-14 Dam.
(f) Coprinus comatus FERM-P 5781 Péridium: d'abord cylindrique puis s'élargissant en dessous, en prenant la forme d'une cloche, la marge se fendant à mesure que le péridium s'épanouit. 3-5 cm de diamètre, 6-10 cm de hauteur. Cuticule d'un brun pâle
avec de grandes écailles laineuses velues imbriquées.
Chair blanche, mince sauf au centre, fragile. Lamelles libres, de couleur progressivement blanche, rose pâle
et noire, produisant un liquide noir par auto-digestion.
Stipe: 15-25 cm de hauteur, 10-15 mm d'épaisseur.
Blanc et légèrement fibreux, avec un anneau blanc disposé assez bas, visible mais disparaissant rapidement. Base bulbeuse. Spores: noir brunâtre en masse, ellipsoïdales,
lisses, mesurant 11-14 x 6-8,um.
(g) Psilocybe coprophila FERM-P 5782 Péridium: 2-3 cm de diamètre. Hemisphérique puis dilaté. Cuticule non visqueuse,couleur d'ombre à brun foncé, non striée. Pourvue d'une pellicule détachable non gélatineuse. Chair mince, de couleur ombre à brun foncé. Lamelles: larges, serrées et adnées, distance
2-3 mm. D'abord de couleur pâle puis d'un brun livide.
Stipe: 5-7 cm de longueur, 3-4 cm d'épaisseur, à cuticule brillante glabre, blanche ou de la couleur du chapeau avec une teinte pâle, creux. Spores: brun-violet en masse, ellipsoidales, mesurant 6-7 x 3-4 gm. Cheilocystide
fusiforme, mesurant 17-20 x 5 -7 em.
(h) Gloeocystidium chrysocreas FERM-P 5783
Corps fructifère: 4-8 x 2-3 cm transversalement.
Tous les corps fructifères sont tournés en arrière sur du bois, et il n'y a pas de péridium. Se propageant sur l'écorce, on ne peut pas le détacher. Surface de couleur jaune d'oeuf, lisse ou présentant quelques verrues mamelonnées et des fissures à l'état sec. Chair d'un vert jaunâtre, 120300 Nom d'épaisseur. Marge mince et coriacée. Mycélium constitutif dressé, espacement de 2 Nom, avec beaucoup de grandes cellules en forme de sac mesurant 15-20 x 6-9 gm. Les grandes cellules en forme de sac prennent une couleur rose par addition d'une solution de KOH. Spores: blanches en masse, ellipsoldales,
lisses, mesurant 4-5 x 2-3 gNm.
(i) Phellinus gilvus FERM-P 5784 Stipe absent. Péridium: semi-circulaire, avec
chevauchement. 5-8 cm transversalement, 5-10 mm d'épais-
seur. Cuticule d'un brun jaunâtre en peau de poisson,
hérissé de poils courts. Dessous d'un brun jaunâtre.
Chair brun jaunâtre, ressemblant à du liège. Pores: 3-5 mm de longueur, ostioles en petit cercle, au nombre de 6 à 7 dans des limites de 1 mm de longueur. Spores
incolores, globuleuses, lisses, mesurant 4-5 x 2-3 Nm.
Cystide: abondante, à membrane épaisse, longuement
cunéiforme, mesurant 25-30 x 3-6 Nom.
(j) Auricularia polytricha FERM-P 5785
Corps fructifère tourné en arrière sur du bois.
Péridium: en forme d'oreille ou en forme de coupole très irrégulière. 3-6 cm transversalement, 2-3 cm de hauteur, environ 10 mm d'épaisseur. Surface supérieure brune à pubescence dressée, surface inférieure d'un brun violacé pâle. Si un temps sec persiste, le dessus prend une teinte brun rougeâtre,tandis que le dessous prend une teinte d'un brun violacé et devient poudreux et brillant. Toutefois, le corps fructifère ne se dessèche pratiquement pas. Chair gélatineuse, coriacée et d'une épaisseur d'environ 10 mm. Baside: cylindrique avec 4 spores, 60-70 x 4-5 gm. Spores: incolores,
ellipsoidales, recourbées et étroites à la base. Dimen-
sions 8-12 x 3-5 Dm.
(k) Poria epimiltina FERM-P 5804 Tous les corps fructifères sont tournés en arrière sur du bois, et il n'y a pas de péridium. Le champignon étant aplati et s'étalant sur le bois, il
est difficile de le détacher. 6-8 cm transversalement.
Le bois prend une couleur orangé-3aunâtre vif. Orangé-
jaunatre, excepté la couleur du bord externe qui est d'un brun violacé. Chair orangé-jaunâtre. Pores - grisâtres
et allongés. Les ostioles sont petites et polygonales.
Parois des pores: minces. Spores: incolores, ellipsoi-
dales, lisses, mesurant environ 3,5 x 2 gm. Cystide absente. L'identification de ces espèces a été effectuée d'après les ouvrages suivants "Coloured Illustrations of Fungi of Japan", volume I et volume II, édités par Rokuya Imazeki et Tsugio Hongo (publiés par Hoiku-Sha, Osaka, Japon) 1965 et "Mycological flora of Japan", édité par- Seiya Ito (publié par Yoken-Do, Tokyo, Japon), volume 2,
N0 4, 1955.
L'une quelconque des souches appartenant aux genres mentionnés ci-dessus est capable de produire de la cholestéroloxydase conformément à l'invention, dans un milieu contenant ou non du cholestérol, et on peut donc
l'utiliser dans la mise en oeuvre de l'invention.
Dans la production de cholestéroloxydase confor-
mément à l'invention, une souche appartenant à la classe
des basidiomycètes et capable de produire de la cholestérol-
oxydase est cultivée dans des conditions aérobies dans un milieu nutritif d'une manière bien connue pour la culture de chLampignons de la classe des basidiomyc tes. La culture peut être effectuée en milieu solide ou en milieu liquide, mais une culture en milieu liquide est préférable pour la
production industrielle sur une grande échelle.
En ce qui concerne le milieu de culture, on peut
utiliser un milieu naturel ou synthétique contenant diver-
ses substances nutritives connues, par exemple une source
de carbone, une source d'azote, un sel organique ou inor-
ganique, etc. La source de carbone peut être, par exemple, du glucose, du fructose, des mélasses de glycérol, des mélasses résiduaires ou divers amidons, par exemple de l'amidon soluble, de l'amidon de mais, de la fécule de pomme de terre, etc. En ce qui concerne les sources d'azote, on peut utiliser, par exemple, l'urée, un extrait de levure, un extrait de maltose, la peptone, l'extrait soluble de mais (ESM), le soja en poudre, le soja dégraissé, etc. Comme sels organiques ou inorganiques, on peut mentionner
des phosphates, des sulfates, etc. de potassium, de magné-
sium, de fer, etc. Le cas échéant, d'autres matières utiles à la croissance telles que des vitamines et des activateurs de croissance peuvent être ajoutés au milieu de culture. De
préférence, le pH du milieu de culture est égal à 4 - 7.
Le milieu contient avantageusement, par exemple, 2 % d'amidon soluble, 0, 3 % d'extrait de levure, 1 % de
polypeptone, 0,3 % de KH2PO4 et 0,1 % de MgSO4.7H20.
En général, la culture est conduite à 20-350C pendant 2 à 10 jours dans des conditions aérobies. Les
conditions particulières doivent naturellement être choi-
sies en fonction de la souche et du milieu de culture par-
ticuliers, en vue d'obtenir la production maximale de
cholestéroloxydase.
La cholestéroloxydase de l'invention est produite
et accumulée dans le bouillon de culture. Lorsque la cul-
ture est terminée, le bouillon de culture est soumis à une filtration, une séparation centrifuge, etc., pour séparer
le mycélium et pour obtenir un filtrat contenant la choles-
téroloxydase. Pour isoler la cholestéroloxydase du filtrat
et pour la purifier, on peut utiliser des opérations con-
venables connues dans la pratique pour l'isolement et la
purification de l'enzyme, telles que précipitation frac-
tionnée, dialyse, adsorption-6lution, chromatographie, etc.
ou, conjointement, deux ou plus de deux de ces opérations.
Ainsi, par exemple, un non-solvant tel que l'alcool, l'acétone, etc. est ajouté au filtrat en une quantité de -80 % en volume/volume pour provoquer la précipitation de l'enzyme. A titre de variante ou en outre, un relargage peut aussi être effectué par addition d'un sel inorganique
hydrosoluble tel que sulfate d'ammonium, chlorure de cal-
cium, etc. au filtrat en quantité représentant une concen-
tration de 20 à 80 % en poids/volume, pour provoquer la précipitation de l'enzyme. Le précipité est soumis à une dialyse, un traitement sur "Sephadex" (par exemple colonne de "Sephadex G-25") et/ou une ultrafiltration pour obtenir une solution brute de l'enzyme. La solution brute est
adsorbée sur une colonne de "DEAE-Sephadex A-50" préalable-
ment équilibrée avec un tampon au phosphate 0,01 M à pH 7,0.
Ensuite, l'élution est effectuée avec un tampon au phos-
phate 0,1-0,2 M à pH 7,0. Les fractions actives sont re-
cueillies et dialysées pendant la nuit vis-à-vis d'un tampon 1 0 à l'acétate 0,01 M à pH 4,0. Ensuite, la solution d'enzyme est à nouveau adsorbée sur une colonne de "SP-Sephadex C-50" préalablement équilibrée avec un tampon à l'acétate 0,01 M
à pH 4,0 et l'élution est conduite avec un tampon à l'acé-
tate 0,01 M à pH 5,0. Les fractions actives sont recueil- lies, dialysées vis-à-vis de tampon au phosphate 0,01 M
(pH 7,0) et la solution dialysée de l'enzyme est concen-
trée avec une membrane de collodion et est lyophilisée en
donnant l'enzyme purifié sous la forme d'une poudre.
Les propriétés physiques et chimiques de l'en-
zyme (cholestéroloxydase) ainsi obtenu conformément à
l'invention sont illustrées ci-dessous en regard des des-
sins annexés sur lesquels:
les figures 1-a à 1-k sont des graphiques repré-
sentant le pH optimal des enzymes de l'invention. Le pH est porté en abscisses et l'activité relative (%) est
portée en ordonnées. Les triangles correspondent à un tam-
pon au chlorhydrate de glycine; les cercles correspondent à un tampon à l'acétate; les points correspondent à un tampon au phosphate de potassium et les x correspondent à
un tampon au borate.
Les figures 2-a à 2-ksont des graphiques repré-
sentant la température optimale des enzymes de l'invention.
Les températures (en OC) sont portées en abscisses et les
activités relatives (%) sont portées en ordonnées.
Les figures 3-a à 3-k sont des graphiques repré-
sentant la stabilité du pH des enzymes de l'invention. Les pH sont portés en abscisses et les activités relatives (%)
sont portées en ordonnées.
Les figures 4-a à 4-k sont des graphiques illus-
trant la thermostabîlité des enzymes de l'invention. Les températures sont portées en 'C et les activités relatives
(%) sont portées en abscisses.
Sur les figures 1 et 3, un tampon au chlorhydrate de glycine, un tampon à l'acétate, un tampon au phosphate
de potassium et un tampon au borate ont été utilisés, res-
pectivement, pour maintenir les valeurs de pH de 2,0 à 3,0,
de 4,0 à 5,0; de 6,0 à 8,0 et de 9,0 à 10,0.
La figure 5-b est un diagramme montrant les pro-
duits de réaction, déterminés par chromatographie en phase
liquide sous haute pression, lorsque l'enzyme de l'inven-
tion agit sur du cholestérol. La figure 5-a est un diagramme montrant les échantillons authentiques.
Sur ces graphiques, les cholestéroloxydases pro-
duites par Lentinus edodes FERM-P 5776, Oudemansiella radicate FERM-P 5777, Oudemansiella mucida FERM-P 5778, Flammulina velutipes FERMI-P 5779, Lepiota procera FERM-P 5780, Coprinus comatus FERM-P 5781, Psilocybe coprophila FERM-P 5782, Gloeocystidium chrysocreas FERM-P 5783, Phellinus gilvus FERM-P 5784, Auricularia polytricha FERM-P 5785 et Poria epimiltina FERM-P 5804 sont identifiées, respectivement, par les lettres a, b, c, d, e, f, g, h, i,
i et k adjointes aux numéros des figures.
1. Actions et spécificité du substrat A l'encontre des cholestéroloxydases classiques produites par Nocardia, Brevibacterium, Streptomyces et Schizophyllum, la cholestéroloxydase de l'invention oxyde
des A5-3(-hydroxystéroides pour former des A5-3-oxostérol-
des avec production concomitante de peroxyde d'hydrogène.
Par exemple, lorsque l'enzyme de la présente invention
agit directement sur du cholestérol, de la cholest-5-ène-
3-one est produite en même temps que du peroxyde d'hydro-
gène. La figure 5-b est un diagramme montrant les produits réactionnels lorsque cet enzyme agit sur du cholestérol,
et lorsque les produits extraits au chloroforme sont dé-
veloppés par chromatographie en phase liquide sous haute pression. La figure 5-a est un diagramme illustrant les échantillons authentiques. En conséquence, il est évident que le produit réactionnel, lorsque l'enzyme de la présente
invention agit sur du cholestérol, est la cholest-5-ène-3-
one et non la cholest-4-ène-3-one. Il est connu que les
cholestéroloxydases classiques catalysent tant les réac-
tions d'oxydation que les réactions d'isomérisation. Au contraire, la cholestéroloxydase de l'invention ne catalyse que la séquence d'oxydation et convertit le cholestérol en cholest-5-ène-3-one, comme cela est confirmé par comparaison avec la matière synthétisée chimiquement d'après le spectre infrarouge, le spectre ultraviolet, le point de fusion,
la rotation optique et la chromatographie sur couche mince.
Jusqu'à présent, une cholestéroloxydase ne catalysant que la séquence d'oxydation n'avait pas été rapportée. La cholestéroloxydase de l'invention agit uniquement sur le
groupe hydroxyle au niveau de la position 3P du cholestérol.
Un test effectué, par exemple, par décomposition du peroxyde d'hydrogène libéré par déshydrogénation de la position 33 avec une peroxydase, mise en contact de l'oxygène ainsi engendré avec un chromogène pour former une couleur, et mesure du spectre d'absorption dans la portion du spectre correspondant à la lumière visible, a montré que cet enzyme agissait sur divers stéroides, en plus du cholestérol, tels que des stérols ayant un groupe hydroxyle en position 3f,
par exemple le P-cholestanol le campestérol, le P-cyto-
stérol, le stigmastzrol, le 5c-prégnane-3!3,20b-diol, la
déhydro-épiandrostérone; La prégnénolone et l'ergostérol.
Cet enzyme n'agit pas sur des stérols portant un groupe
hydroxyle dans d'autres positions.
2. pH optimal et stabilité du pH
Les figures 1-a à 1-k sont dles graphiques illus-
trant le pH optimal des enzymes de l'invention. Le pHl optimal de chacun des enzymes de l'invention est proche
de 5-7. Les figures 3-a à 3-k sont des graphiques illus-
trant la stabilité du pH des enzymes de l'invention traités à chaque pH pendant 60 minutes à 37 Co Les enzymes de l'invention sont stables à un pH de 3 - 8, notamment à un
pH de 5 - 7.
3. Température optimale et thermostabilité
Les figures 2-a à 2-k sont des graphiques illus-
trant la température optimale des enzymes de l'invention.
La température optimale des enzymes de l'invention est pro-
che de 40-45 C, notamment d'environ 40 C. Les figures 4-a à 4-k sont des graphiques montrant la thermostabilité des
enzymes de l'invention, avec traitement à un pH de 7,0 pen-
dant 10 minutes. Les enzymes de l'invention sont stables
jusqu'à 40-500 C.
4. Détermination de l'activité enzymatique L'activité enzymatique est déterminée par dosage du peroxyde d'hydrogène produit par la réaction de la
solution d'enzyme sur le cholestérol constituant le substrat.
La méthode est basée sur la succession des réactions ci- après: le cholestérol est oxydé par la cholestéroloxydase
en cholest-5-ène-3-one avec dégagement de peroxyde d'hydro-
gène, qui se combine avec la 4-amino-antipyrine et le
phénol en présence de peroxydase en donnant une quinone-
imine, matière colorante présentant un maximum d'absorption
à 500 nm. Pour conduire cette réaction, on utilise un mé-
lange réactionnel, de volume final égal à 3,0 ml, composé
de 0,1 ml de la solution d'enzyme, de 2 gmoles de choles-
térol dans 0,1 ml d'éthanol, de 250 gmoles de tampon au phosphate, pH 7,0, de 2,46 gmoles de 4-amino-antipyrine,
de 42 gmoles de phénol et de 24 unités de peroxydase ex-
traite du raifort. La réaction est conduite à 37 C pendant
minutes avec agitation par secousses. Une unité d'acti-
vité de cholestéroloxydase est définie comme étant la
quantité de l'enzyme qui catalyse l'oxydation d'une micro-
mole de cholestérol par minute à 37 C.
5. Effet d'inhibiteurs, etc.
L'activité des enzymes de l'invention est nette-
ment inhibée par Cu2+ et Hg2+. L'inhibition produite par ces ions métalliques est presque totalement empêchée par
*2+ 2+ 2+ 2+
l'addition de glutathion. Les ions Ca, Ba, Co2, Ni,
Mg2+, Mn2+ et Fe2+ n'inhibent pas l'activité de l'enzyme.
L'addition de détergents, par exemple 0,01 % de "Triton
X-100", inhibe presque complètement l'activité enzymatique.
Divers chélateurs de métaux tels que I'EDTA, la o-phénanthro-
line, l'a,o'-dipyridyle et la /-hydroxyquinoléine ne sont
pas inhibiteurs.
6. Poids moléculaire Le poids moléculaire des enzymes de l'invention
est déterminé par filtration sur gel de "Sephadex G-150".
Les poids moléculaires des enzymes de l'invention sont esti-
més à une valeur d'environ 58 000 - 62 000, excepté le poids moléculaire de la cholestéroloxydase produite par Phellinus
gilvus FERM-P 5784, qui est d'environ 85 000.
L'invention est illustrée par les exemples sui-
vants, donnés à titre non limitatif.
Exemple 1
On a conduit l'incubation en chargeant 100 ml d'un milieu de culture d'ensemencement contenant 2 % de glucose, 0,3 % d'extrait de levure, 0,3 % de polypeptone, 0,1 % de KH2PO4 et 0,05 % de MgSO4.7H20 dans chacune de plusieurs fioles d'Erlenmeyer de 500 ml. Les fioles ont
été bouchées avec du coton et stérilisées pendant 20 mi-
nutes à 120 C. Après refroidissement, on a inoculé les fioles d'une manière classique avec la souche de Lentinus edodes FERM-P 5776 qui avait été cultivée séparément dans un milieu de culture incliné contenant 3 % de glucose, 0,5 % de "Ebios" et 1,5 % de gélose. Après incubation sous agitation par secousses pendant 7 jours à 27 C, le contenu
des fioles a été utilisé pour l'incubation subséquente.
litres d'un milieu liquide de culture contenant 2 % de glucose, 0,3 % d'extrait de levure, 1 % de polypeptone, 0,3 % de KH2PO4, 0,1 % de MgSO4. 7H20 et 0,5 % d'huile de soja, dans un appareil de fermentation à cuved'acier inoxydable de 30 litres, ont été stérilisés à 120 C pendant minutes, puis refroidis. Le milieu de culture contenu dans ledit appareil de fermentation à cuve a ensuite été inoculé avec le contenu recueilli des fioles indiquées ci-dessus. Le milieu a été soumis à une incubation aérobie sous agitation (200 tr/min) pendant 6 jours à 27 C, et à
une vitesse d'aération de 0,6 litre/litre/minute.
Ensuite, le bouillon de culture ainsi obtenu a
été filtré au moyen d'un filtre-presse. Ce filtrat de cul-
ture présentait une activité en cholestéroloxydase de 0,05 unité par ml. On a ajouté au filtrat (13 litres) du sulfate d'ammonium à 5 C jusqu'à 80 % de la saturation. Le précipité formé a été soumis à une dialyse vis-àvis de tampon au phosphate 0,01 M à un pH de 7,0 et, en outre, la solution
dialysée d'enzyme a été chargée sur une colonne de "DEAE-
Sephadex A-50" qui avait été préalablement équilibrée avec un tampon au phosphate 0,01 M à pH 7,0. L'élution a été effectuée avec un tampon au phosphate 0,2 M à pH 7,0 et
les fractions actives ont été recueillies, dialysées pen-
dant la nuit vis-à-vis de tampon au phosphate O,OO1M à pH 7,0 et lyophilisées. La préparation lyophilisée <1,5 g) ainsi obtenue présentaitune activité spécifique en choles-
téroloxydase de 0,15 unité par mg.
Exemple 2
On a cultivé Oudemansiella radicata FERM-P 5777 de la même manière que dans l'exemple 1 pour obtenir un
filtrat de culture présentant une activité en cholestérol-
oxydase de 1,10 unité. par ml. Le filtrat de culture a
ensuite été traité comme dans l'exemple 1 en vue de l'obten-
tion d'une préparation lyophilisée. La préparation lyophi-
lisée (2,0 g) présentait une activité spécifique en choles-
téroloxydase de 0,28 unité par mg.
Exemple 3
On a répété le mode opératoire de l'exemple 1, à la difference qu'on a cultivé Oudemansiella mucida
FERM-P 5778 dans le milieu principal composé de 2 % d'ami-
don soluble, 0,3 % d'extrait de levure, 1 % de polypeptone, 0,3 % de KH2PO4 et 0,1 % de MgSO4.7H20 et 0,5 % d'huile de soja pour obtenir un filtrat de culture présentant une activité en cholestéroloxydase de 0,11 unité par ml. On a traité le filtrat de culture comme dans l'exemple 1 pour obtenir une préparation lyophilisée (1,0 g) présentant une activité spécifique en cholestéroloxydase de 0,60 unité
par mg.
Exemple 4
En procédant de la même manière que dans l'exemple 1, on a cultivé Flammulina velutipes FERM-P 5779 pour obtenir
un filtrat de culture présentant une activité en cholestérol-
oxydase de 0,10 unité par ml. On a ensuite traité le filtrat
comme dans l'exemple 1 pour obtenir une préparation lyophi-
lisée (1,5 g) ayant une activité spécifique en cholestérol-
oxydase de 0,50 unité par mg.
Exemple 5
On a répété le mode opératoire de l'exemple 1, à la différence qu'on a cultivé Lepiota procera FERM-P 5780
pendant 7 jours pour obtenir un filtrat de culture présen-
tant une activité en cholestéroloxydase de 0,05 unité par
ml. On a traité le filtrat comme dans l'exemple 1 pour obte-
nir une préparation lyophilisée (2,5 g) ayant une activité spécifique en cholestéroloxydase de 0,12 unité par mg.
Exemple 6
On a répété le mode opératoire de l'exemple 3, à la différence qu'on a cultivé Coprinus comatus FERM-P 5781 pendant 5 jours pour obtenir un filtrat de culture présentant une activité en cholestéroloxydase de 0,10 unité par ml. On a traité le filtrat comme dans l'exemple 1 pour
obtenir une préparation lyophilisée (1,0 g) ayant une acti-
vité spécifique en cholestéroloxydase de 0,40 unité par mg.
Exemple 7
On a répété le mode opératoire de l'exemple 3, à la différence qu'on a cultivé Psilocybe coprophila FER4-P 5782 pendant 5 jours pour obtenir un filtrat de culture présentant une activité en cholestéroloxydase de 0,10 unité par ml. On a traité le filtrat comme dans l'exemple 1 pour
obtenir une préparation lyophilisée (1,5 g) ayant une acti-
vité spécifique en cholestéroloxydase de 0,50 unité par mg.
Exemple 8
On a répété le mode opératoire de l'exemple 3, à la diff4rence qu'on a cultivé Gloeocystidium chrysocreas FERM-P 5783 pendant 4 jours pour obtenir un filtrat de culture présentant une activité en cholestéroloxydase de 1,3 unité par ml. On a traité le filtrat comme dans l'exemple 1 pour obtenir une préparation lyophilisée (1,5 g) ayant une activité spécifique en cholestéroloxydase de 6,0 unités
par mg.
Exemple 9
On a répété le mode opératoire de l'exemple 1, à la différence qu'on a cultivé Phellinus gilvus FERM-P 5784 pendant 4 jours pour obtenir un filtrat présentant une activité en cholestéroloxydase de 0,20 unité par ml. On a traité le filtrat comme dans l'exemple 1 pour obtenir une
préparation lyophilisée (2,0 g) ayant une activité spécifi-
que en cholestéroloxydase de 1,0 unité par mg.
Exemple 10
On a répété le mode opératoire de l'exemple 3, à la différence qu'on a cultivé Auricularia polytricha FERM-P 5785 pendant 5 jours pour obtenir un filtrat de culture présentant une activité en cholestéroloxydase de 0, 10 unité par ml. On a traité le filtrat comme dans l'exemple 1 pour
obtenir une préparation lyophilisée (2,0 g) ayant une acti-
vité spécifique en cholestéroloxydase de 0,52 unité par mg.
Exemple 11
On a répété le mode opératoire de l'exemple 3, à la différence qu'on a cultivé Poria epimiltina FERM-P 5804 dans le milieu.principal pendant 6 jours pour obtenir un
filtrat de culture présentant une activité en cholestérol-
oxydase de 0,16 unité par ml. On a traité le filtrat comme dans l'exemple 1 pour obtenir une préparation lyophilisée (1,5 g) ayant une activité spécifique en cholestéroloxydase
de 0,45 unité par mg.
Claims (4)
1. Procédé de production d'une cholestérol-
oxydase, caractérisé en ce qu'il consiste à cultiver une souche appartenant à la classe des basidiomycètes et capable de produire de la cholestéroloxydase dans un milieu
de culture pour accumuler la cholestéroloxydase et à re-
cueillir la cholestéroloxydase du bouillon de culture résultant.
2. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'on utilise une souche appartenant au genre Lentinus, Oudemansiella, Flammulina, Lepiota, Coprinus, Psilocybe,
Gloeocystidium, Phellinus, Auricularia ou Poria.
3. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'on utilise une souche choisie dans le groupe formé des espèces Lentinus edodes FERM- P 5776, Oudemansiella radicata FERM-P 5777, Oudemansiella mucida FERM-P 5778, Flammulina velutipes FERM-P 5779, Lepiota procera FERM-P 5780, Coprinus comatus FERM-P 5781, Psilocybe coprophila FERM-P 5782, Gloeocystidium chrysocreas FERM-P 5783, Phellinus gilvus FERM-P 5784, Auricularia polytricha FERM-P
5785 et Poria epimiltina FERM-P 5804.
4. Une cholestéroloxydase produite par une souche
de la classe des basidiomycètes et caractérisée par une.
haute activité d'oxydation du cholestérol en présence d'oxy-
gène pour former de la cholest-5-ène-3-one et du peroxyde d'hydrogène.
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