FR2666033A1 - Procede de preparation de systemes porteurs pour des matieres biologiquement actives et utilisation de ces systemes. - Google Patents

Abstract

L'invention concerne un procédé de préparation de systèmes porteurs pour la fixation par liaison covalente de matières biologiquement actives, constitués par une matière de support solide, en soi connue, dont la surface est garnie d'une couche de polymère, le polymère contenant les groupements fonctionnels appropriés pour la liaison covalente; la matière de support est enduite d'un mélange d'une dispersion de polymère filmogène DF et d'une dispersion non filmogène DNF, l'une au moins des deux dispersions de polymère renfermant les groupements fonctionnels appropriés pour la liaison covalente.

Description

L'invention concerne un procédé de préparation de systèmes porteurs pour

des matières biologiquement actives fixées par liaison covalente à la surface

revêtue de polymère des matières de support.

Le brevet européen nô O 071 704 propose des "Systèmes à grande surface pour la fixation de substrats contenant des groupes nucléophiles" Dans ce cas, les motifs réactifs pour la liaison des substrats contenant les systèmes nucléophiles font partie d'un latex polymère qui est préparé par polymérisation en émulsion et qui est constitué par des particules de latex de 0,03 à 6 pm de grosseur, le latex polymère étant agrégé lui- même en système à grande surface et/ou étant fixé à une matière

porteuse à grande surface.

Au cas o la liaison mutuelle des particules individuelles de latex ne s'effectue pas par formation d'un film, leur jonction les unes aux autres ou au support peut se produire, d'après ce brevet EP-C, par des liaisons covalentes Le cas échéant, la liaison covalente des particules de latex peut être aussi renforcée par l'introduction de nucléophiles multifonctionnels Il est également fait mention de l'addition de faibles quantités d'une substance filmogène molle, par exemple de particules de latex de plus basse température de transition vitreuse La précipitation au moyen des unités biologiquement actives & fixer elles-mêmes doit être considérée comme particulièrement préférée Dans le brevet EP cité, les groupes fonctionnels X sont définis précisément comme des constituants de monoméres Z'-(R,)-X, les groupes X étant susceptibles de réaction covalente avec les groupes nucléophiles, en particulier les groupes amino, hydroxy et thiol des matières biologiquement actives à fixer, dans la gammne de p H physiologiquement pertinente ( 5,0 9,0 environ), à des températures inférieures à

'C et en milieu aqueux.

La demande DE-A 20 16 729 prévoit, pour la préparation d'enzymes insolubles sous forme active, un procédé dans lequel un copolymère est traité par une solution d'enzyme et une réticulation transversale du complexe enzyme-polymère et/ou une neutralisation des

groupes chimiques réactifs restants sont effectuées.

L'enseignement de cette demande de brevet publiée avant examen comprend la dissociation de toute structure particulaire dans la mesure o elle existe à la suite de la préparation par dissolution des copolyméres dans des solvants Il n'est donc pas concevable qu'une structure particulaire soit présente lors de la formation du film Si tant est que des dépôts ou précipités font l'objet de l'enseignement de cette demande, ils ne sont pas le résultat direct du procédé de polymérisation, mais des produits résultant d'une réticulation (externe) de la matière polymère formee, ce

qui diminue plutôt la possibilité d'obtention.

Il ne manque pas de publications donnant une vue d'ensemble de l'état de la technique concernant l'immobilisation de matières biologiquement actives sur des supports polymères (cf Encyclopaedia of Polymer Science and Engineering, vol 2, pp 55-59, John -Wiley

1985; Characterization of Immobilized Biocatalysts, Ed.

K Buchholz, Dechema-Monographien n'1724-1731, vol 84, Verlag Chemie 1984; Methods in Enzymology, Ed W B. Jokoby, vol 104, pp 3-369, Academic Press 1984; Biotechnology, Ed H J Rehm & G Reed, vol 7 a, pp.

347-464, Verlag Chemie 1987).

Ce dernier document de référence fait observer qu'en dépit de la multiplicité des techniques d'immobilisation offertes, il n'y a pas de technique particulière qui puisse prétendre être applicable de façon universelle avec un résultat idéal Lorsque l'immobilisation conduit à l'inclusion (entrapment) des motifs biologiquement actifs à l'intérieur de la matrice porteuse, on doit s'attendre à des difficultés d'obtention en conséquence de la résistance à la diffusion pour les substrats: effet qui, parmi d'autres, a une influence marquée sur la constante de Michaelis (apparente) L"'entrapping" classique est donc limité, en ce qui concerne son efficacité, à des substrats et à des produits de faible poids moléculaire, pour lesquels la résistance au transport en masses reste limitée Les effets de diffusion interne Jouent, de façon bien compréhensible, un rôle déterminant lorsqu'il s'agit d'enzymes fixées à

l'intérieur d'un système porteur contenant des pores.

Les avantages et les inconvénients de supports poreux et non poreux sont confrontés dans "Biotechnology" (op cit p 353) Dans le cas de supports non poreux, l'avantage des faibles limitations liées à la diffusion est contrebalancé par l'inconvénient de la petite surface active et, en conséquence, de la faible charge d'enzyme, par la contrainte à l'utilisation de petites particules porteuses et par les difficultés à la manipulation, en particulier dans le mode opératoire continu Dans le cas de supports poreux, la grande surface interne et la forte charge d'enzyme, ainsi que la protection relative contre les influences défavorables extérieures sur l'activité sont certes des avantages, mais il faut leur opposer les problèmes de diffusion liés à la grande surface interne, les coûts élevés qu'entraîne entre autres le contrôle inéluctable

des dimensions des cavités, et éventuellement les-

problèmes de pression de liquide qui sont en rapport

avec la tendance à la gélification.

De façon idéale, les structures biologiquement actives doivent être fixées à un support ayant une surface aussi grande que possible, de telle manière qu'une part aussi faible que possible des structures biologiquement actives reste exclue de l'interaction avec les substrats, c'est-à-dire qu'il existe des possibilités d'accès optimales pour les molécules du substrat. La solution proposée par le brevet européen précité représente une approche de cet idéal, en ce sens qu'elle met à disposition des supports à grande surface qui présentent les fonctions de liaison pour la fixation de la matière biologiquement active, en particulier d'enzymes, d'anticorps, etc, au voisinage de la surface Une solution également intéressante est fournie par le brevet US 4 710 525 qui décrit des latex

polymères redispersables qui ont une structure à noyau-

enveloppe et qui possèdent dans l'enveloppe les groupes fonctionnels pour la fixation covalente des matières

biologiquement actives.

Malgré cela, il restait à mettre à disposition des systèmes porteurs polymères encore plus performants pour la fixation covalente de matières biologiquement actives, garantissant une utilisation, aussi proche que possible de l'optimum, des matières biologiquement actives, coûteuses en règle générale C'est pourquoi la présente invention concerne un procédé de préparation de systèmes porteurs à surface revêtue de polymère pour la fixation par liaison covalente de matières biologiquement actives, le polymère contenant les groupes fonctionnels qui conviennent pour la liaison covalente, et une matière de support en soi connue étant enduite d'un mélange d'une dispersion de polymère filmogène DF et d'une dispersion de polymère non

filmogène DNF.

La mntière de support Conviennent, comme matières de support, les supports développés selon l'état de la technique (cf. Biotechnology, vol 7 A, op cit pp 351-367, 411-412;

Dechema-Monographien, vol 84, op cit, pp 49-72).

Entrent en ligne de compte, à cet égard, des matières de support aussi bien inorganiques qu'organiques En tant O 10 que supports de provenance inorganique, on citera par exemple l'oxyde d'aluminium, le bioxyde de zirconium, la magnésie, le bioxyde de silicium, le verre, des minéraux sous différentes variantes, par exemple des argiles telles que l'attapulgite, la bentonite, ainsi que le kieselguhr, la pierre ponce, etc, des matières céramiques, le sable, le bioxyde de titane, des métaux, comme par exemple des matières ferromagnétiques, à l'état greffé comme à l'état non greffé Sont par ailleurs intéressantes des matières porteuses organiques d'origine naturelle, comme par exemple des polysaccharides (cellulose, dextrane, amidon, agar-agar, agarose, alginate, carraghénate, chitine, chitosane), ainsi que des protéines telles que le collagène, la gélatine, l'albumine, la soie, etc et différentes

variantes du charbon.

En tant que supports polymères synthétiques, on citera le polystyrène, les polyacrylates et polyamides, les polymères d'anhydride maléique, les polymeres vinyliques et allyliques et les polyamides Certaines préférences se sont manifestées dans la technique en ce qui concerne la geométrie des supports On mentionnera par exemple la forme sphérique facile à manipuler, par exemple avec un diamètre de 1 à 10 mm, en particulier de l'ordre de 6 mm A cet égard, des billes de polystyrène

sont particulièrement préférées.

Nais il faut aussi prendre en considération, comme surfaces enductibles dans le sens de la présente invention, celles de corps de forme non sphérique ou non strictement régulière, par exemple de granules, de bâtonnets, ainsi que de masses développées dans le sens d'une proportion élevée de la surface, ayant par exemple une structure en nid d'abeilles, mises au point par exemple comme supports de catalyseurs, et également des surfaces de récipients, comme par exemple des surfaces de verres On citera par ailleurs des produits en feuille, à base de cellulose ou de matières textiles

(par exemple de soie), par exemple des papiers enduits.

En général, les matières de support classiques satisfont à la condition préalable d'être chimiquement inertes (ou activables dans le sens rigoureux) dans les

conditions de la fixation.

En cas d'utilisation à des fins de diagnostic, il est également conseillé d'utiliser, pour la présente invention, des perles ou billes d'environ 0,01 à 10 mm de diamètre, de préférence la gamme de perles de 0,1 a 0,6 mm, ainsi que des grosseurs de 0,01 à 10 mm déjà utilisées dans les applications diagnostiques, en

particulier dans la gamme de 6 à 7 mm.

Pour ce qui est de la surface, on doit disposer de surfaces du support de 0,03 mm 2 à 100 cm 2, de préférence de mm à 10 cm 2 En cas d'utilisation de supports plans, on peut partir de formes carrées ou rectangulaires, mais il est aussi possible d'utiliser des formes circulaires,

par exemple les paillettes de filtration en soi connues.

Des formes irrégulières sont également possibles.

Comme exigence qui est imposée aux matières de support à utiliser selon l'invention en commun avec celles de l'état de la technique, on soulignera la stabilité mécanique, en particulier aux efforts de cisaillement Les matières doivent avoir une stabilité suffisante aux manipulations usuelles telles que la filtration, l'agitation, le secouage, ainsi qu'au transport et au stockage, et elles ne doivent pas produire une abrasion nuisible Pour faciliter la manipulation, une fixation de ces matières dans des supports est possible. Les dispersions de polymère Les dispersions de polymère, à savoir la dispersion non filmogène DNF et la dispersion filmogène DF, peuvent être obtenues de façon en soi connue, suivant les règles de la polymérisation en émulsion (cf H Rauch-Puntigam,

Th V 8 lker, "Acryl und Methacrylverbindungen", pp 217-

230, Springer-Verlag, 1967; Houben-Weyl, Methoden der

Organisohen Chemie, 4 ème édition, vol 14/1, pp 133-

390, Georg Thieme-Verlag 1961) L'exécution pratique peut s'effectuer par exemple en s'appuyant sur les demandes de brevet DE-OS 18 04 159, DE-OS 19 10 488 et De-OS 19 10 532 La grosseur désirée des particules de latex est réglée dans la pratique par la concentration d'émulsionnant au début de la polymérisation En général, la concentration d'émulsionnant au début de la polymérisation en émulsion se situe entre 0,005 et 0,5 % en poids par rapport à la charge de polymérisation totale Il est également possible de régler la grosseur de particules désirée par addition d'une quantité définie d'un latex de germination finement divisé La grosseur des particules de latex doit se situer entre 0,03 et 6 pm, de préférence entre 0,03 et 1 jm Comme émulsionnants, on peut utiliser les émuisionnants anioniques et non ioniques connus, par exemple des sulfates et des sulfonates, des phosphates et des phosphonates d'alcools gras, des sels alcalins d'acides gras à longue chaine, des sarcosides à longue chaîne, ainsi que des alcools gras oxéthylés, des phénols substitués, qui peuvent être en partie sulfones, ainsi que d'autres émulsionnants utilisés dans la polymérisation en émulsion (Houben-Weyl, Methoden der

Organischen Chemie, vol XIV/I, op cit).

L'utilisation de tensides cationiques n'est à conseiller que dans la mesure o ils dérivent de sels d'ammonium tertiaires ou quaternaires Par ailleurs, il est aussi possible d'utiliser des émulsionnants

susceptibles d'être fixés en liaison polymère.

Comme initiateurs, on peut également utiliser les initiateurs courants généralement employés dans la polymérisation en émulsion (cf J Brandrup, E H. Immergut, "Polymer Handbook", seconde édition, J Wiley & Sons; H Rauch-Puntigam, Th Vblker, "Acryl und Methacrylverbindungen", Springer-Verlag 1967) On mentionnera les peroxydes, les hydroperoxydes, les peracides et les composés azo Yiques, par exemple le peroxodisulfate de potassium, le peroxyde d'hydrogène, etc La concentration des initiateurs se situe en règle générale dans la gamme habituelle, par exemple de l'ordre de 0,01 à 1,0 % en poids par rapport aux monomères La teneur en matières solides de la dispersion peut se situer, selon la grosseur des

particules, entre 10 et 60 % en poids.

Les dispersions de polymères à utiliser selon l'invention peuvent être constituées en principe par les monomères connus, susceptibles de polymérisation en émulsion On mentionnera par exemple des polymères à base de: Acrylates ou méthacrylates, Styrène et dérivés du styrène, Esters vinyliques d'acides gras, tels que l'acétate de vinyle, le propionate de vinyle, Composés vinyliques halogénés, comme par exemple le chlorure de vinyle, le tétrafluoroéthylène, Composés vinylidéniques, ainsi que des copolymères tels par exemple que des copolymères du styrène avec le butadiène, des copolymères polyvinylidène/acétate de vinyle, etc En général, la polymérisation est déclenchée par un

initiateur radicalaire.

Le poids moléculaire des polymères (détermination par chromatographie par perméation du gel; cf Encyclopoedia of Polymer Science & Engineering, Bikales, Overberger et Menges, 2 ème éd, vol 10, pp 1-19, J Wiley 1987) ne s'est pas révélé d'une importance véritablement décisive Du point de vue de la pratique, les poids moléculaires des polymères se situent dans la gamme de

000 à 2 x 106, de préférence au-dessus de 50 000.

Un constituant indispensable d'un au moins des types de polymères utilisés est un minimum de groupes fonctionnels X qui conviennent pour la liaison covalente aux matières biologiquement actives De préférence, les motifs fonctionnels X font partie des dispersions non filmogènes DNF Il peut s'agir d'un groupe activable (groupe X'), qui exige un réactif activant supplémentaire Q; mais de préférence, le groupe fonctionnel X est capable de réagir directement avec des groupes nucléophiles de la matière biologiquement active, opportunément dans des conditions qui sont acceptables biologiquement, c'est-à-dire qui ne perturbent pas l'activité biologique dans son effet final En tant que conditions de ce genre, il y a lieu de considérer par exemple une gamme de p H physiologiquement pertinente du milieu aqueux, par exemple la gamme de p H de 5,0 à 9,0, en particulier de solutions tampons, ainsi que l'absence d'agents qui perturbent l'activité biologique et une gamme de température appropriée qui évite l'inactivation des protéines, par exemple au-dessous de 60 C, en

particulier au-dessous de 40 'C.

Des groupes carboxyle se trouvant sur le support T peuvent être fixés par liaison covalente aux groupes amino des matières biologiquement actives, par exemple de façon analogue à la méthode de synthèse des peptides, par exemple par la méthode du carbodiimide Des fonctions amide peuvent être activées au moyen de dialdéhyde glutarique ou par hydrazinolyse et diazotation, ce dernier procédé convenant aussi pour des esters Des groupes amino aromatiques sur le support peuvent aussi être activés par diazotation Des groupes amino aliphatiques peuvent être par exemple fixés par liaison covalente aux groupes amino de la matière biologiquement active au moyen d'aldéhyde glutarique, avec du D-cyclopenda-dialdo-l, 4-furannose ou au moyen de thiophosgène Conviennent, pour des groupes hydroxy, la

réaction avec des triazines halogénées ou avec du 1,1 '-

carbonyldiimidazole pour l'activation et, dans le cas de la configuration du glycol, la réaction avec le cyanure de brome donnant l'imidocarbonate (cf Biotechnology,

Ed H J Rehm & Reed, col 7 a, op cit).

Comme on l'a déjà mentionné, le groupe X représente de préférence une fonction activée, capable de réagir directement avec les groupes nucléophiles des matières

biologiquement actives.

Ainsi, X a de préférence la signification d'un groupe halogénure d'acide sulfonique, d'un groupe thioisocyanate, d'un ester activé, d'un groupe thiocarbonyldioxy, carbonylimidoyldioxy, halogénoéthoxy, halogénoacétoxy, oxiranne, aziridine, formyle, céto, acryloyle ou anhydride Entrent en ligne de compte, comme halogénures d'acides sulfoniques, les chlorures et les bromures; comme halogénoacétoxy, les composés fluorés, chlorés et bromes; comme composants ester des esters activés, ceux de composés hydroxylaminés, tels que du N-hydroxysuccinimide ou du Nhydroxyphtalimide, de phénols activés (au moyen de groupes attirant les électrons), notamment d'halogénophénols tels que le trichlorophénol ou de nitrophénols, de lactames hétérocycliques tels que la pyridone Une préférence il particulière est donnée aux groupes oxiranne, céto, formyle, chlorure d'acide sulfonique, thioisocyanate, ainsi qu'à des esters d'acides carboxyliques activés et

à des anhydrides carboxyliques.

Les monomères portant des groupes fonctionnels répondent de préférence à la formule

Z (R), X

dans laquelle X a la signification donnée précédemment, R est mis pour un élément d'écartement (spacer) chimiquement inerte entre le motif fonctionnel et le motif polymérisable, n est mis pour O ou 1 et

Z est mis pour un motif polymérisable.

La taille et le type de l'élément d'écartement R sont relativement peu critiques Des représentants typiques d'éléments d'écartement de ce genre sont par exemple des groupes alkylène en Cl à CIAO, de préférence en Cm à Ci, des atomes de carbone pouvant être éventuellement remplacés par des ponts éther ou encore des ramifications alkyle et/ou une substitution, par exemple

par une fonction hydroxy, pouvant être présentes.

Toutefois, R est de préférence linéaire En outre, d'autres motifs contenant des groupes bifonctionnels à l'origine (c'est-à-dire avant leur incorporation) peuvent être présents, une liaison par des groupes amide, ester, éther, thioether, urée, uréthane, sulfonamide ou similaires pouvant s'effectuer, aussi bien à l'extrémité du côté polymère qu'à l'extrémité fonctionnelle En général, l'élément d'écartement maintient, entre les groupes fonctionnels X et la chaîne principale du polymère, une distance de l'ordre de 0,5 à 4 nm Dans une série d'exemples, le groupe R peut manquer complètement, c'est-à-dire que N peut aussi

avoir la valeur 0.

Les motifs susceptibles de polymérisation radicalaire I sont par exemple des groupes vinyle, Z ayant par exemple la signification o O

CH = C C -

R 1 dans laquelle Ri est mis pour un atome d'hydrogène, pour un reste méthyle ou pour C Hz COOR=, CH 2 CONHR 2 ou CH CON (RU)2, R 2 représentant un reste alkyle à 1-4 atomes de carbone Par ailleurs, Z peut être un dérivé de l'acide maléique: o O I' CH/

CH M-

C on L'anhydride maléique et l'anhydride itaconique conviennent en outre comme motifs réactifs et en même

temps polymérisables.

Pour illustrer le schéma de formule Z-R-X, on mentionnera les exemples suivants o%

CH O C CH 2

CH = C CO NH (CH 2)5 C O N I

C CH 2

0 t

Z R X

(Ester activé polymérisable avec élément d'écartement)

CH 2 = CH CO O CH 2 CH CH 2

Z R X

(Acrylate de glycidyle) 13- C Ha = CCH 3CO O CH 2 CH= O C CHM C 1 Il z R X (Méthacrylate de 2-(chloroacétoxy)-éthyle) CH= = C(C Hm) CO O CGSH C 13 (Méthacrylate de 2,4,5-trichlorophényle) R = O C Hm = C(CH 3) COO CH 3 CH Br (M Xthacrylate de bromoéthyle) /ok C Hm = CH C Hm O CHCH C-C Hm

Z R X

(Allylglycidyléther) C Hm=C (CH 3) -COO-CHZ-CHOH-CH=-O (CH=) 4-O-CH-1- CH CH= z R X (Produit d'addition d'acide méthacrylique sur le diglycidyléther de 1,4-butanediol)

CH==CH-COO-CH CH 3-O-CSNH-(CH 3) -N=C=S

(Produit d'addition d'ester 2-hydroxyéthylique d'acide acrylique sur le 1,6-hexanediisothiocyanate)

CH 2 = CH O CO CH 3 C 1

(Ester vinylique d'acide chloracétique)

CH CO

il (CH 3)3 C

CH CO C

Z R Cr Cls X

(Ester pentachlorophénylique d'acide 4-maléimido-

butyrique) CH 3 = C(CH 3) COO CG Hz S Om CH 3 (Méthacrylate de ( 4-methylsulfinylphényle)

CH = CH COO CH 3 C _ C H

(Acrylate de propargyle) Dispersions du type polyacrylate Les dispersions de polymères du type acrylate sont constituées en règle générale par des (méth)acrylates monomères de formule C Hz = C = C OR 3 l Il R, O dans laquelle R 1 a les significations données précédemment et dans laquelle RE est mis pour un reste alkyle éventuellement ramifié à 1-18 atomes de carbone, en particulier à 1-8 atomes de carbone ou pour un reste cycloalkyle à 3-12 termes cycliques, notamment pour un reste méthyle, éthyle, propyle, butyle, et surtout pour

un reste 7-butyle ou 2-éthylhexyle (cf H Rauch-

Puntigam, Acryl und Methacrylverbindungen, Springer

Verlag 1967, pp 217-230).

Entrent notamment en ligne de compte, en tant que comonoméres essentiellement hydrophobes, des diènes tels que le butadiène, le chloroprène ou l'isoprène, Il est par ailleurs possible de copolymériser des composés vinyliques activés, comme des esters vinyliques d'acides gras tels que l'acétate de vinyle et le propionate de vinyle, des éthers vinyliques, des éthers allyliques et des esters allyliques, l'acroléine, la vinylméthylcétone, des hétérocycles contenant des groupements vinyle tels que le vinylimidazole, le vinylpyrrolidène, la vinylpyridine, le vinylcarbazole, le styrène et ses dérivés, en particulier des dérivés alkylés tels que l'a-méthylstyrène, le vinyltoluene, etc, mais il faut alors tenir compte du fait que les copolymères peuvent avoir des interactions dues à des groupements (indésirables) avec les matières biologiquement actives à fixer Eu égard à la possibilité d'une action d'haptène, il peut être par exemple Judicieux, dans des cas déterminés, de renoncer complètement à l'utilisation de monoméres contenant des

groupements aromatiques.

En général, la part des (méth)acrylates monomères précités est prédominante dans les polymères formant la dispersion DF ou DNF du type acrylate En règle générale, leur proportion s'élève à plus de 50 % en poids et dans la mesure o ils représentent des composants de polymère non fonctionnalisés elle peut atteindre

99,9 % en poids, de préférence 99 % en poids.

L'une au moins des deux dispersions DF et DNF contient les monoméres déj à décrits précédemment, renfermant des groupements fonctionnels X ou des groupements activables X' La part de monoméres à groupements fonctionnels X dans les polymères des

dispersions DF ou DNF peut être de 0,1 à 80 % en poids.

En général, la part des (méth)acrylates monomères répondant à la formule donnée ci-dessus s'élève à 1-40 %

en poids.

Outre les monoméres fonctionnalisés, les polymères peuvent aussi contenir d'autres comonomeres, par exemple des monoméres nettement hydrophiles, en particulier de formule CH 2 = C Q, dans laquelle Ri a la signification R 1 donnée précédemment et Q est mis pour les restes - CN, COOR (R 4 représentant des ions hydrogène, sodium, O I potassium ou ammonium) ou Q est mis pour C-N Ra R, o Rr et Rs sont mis chacun pour un atome d'hydrogène ou pour un reste alkyle correspondant à Ru ou forment, avec l'atome d'azote, un hétérocycle pentagonal ou hexagonal contenant éventuellement d'autres atomes d'azote ou d'oxygène, ou Q est mis pour un reste alkyle éventuellement ramifié à 2-8 atomes de carbone qui renferme au moins un groupement -OH ou -N Rs Rr (avec les significations données ci- dessus), de préférence en fin

de chaîne.

La part des monoméres hydrophiles, qui peuvent apporter une solidité de fixation améliorée et une meilleure adéquation à des applications spécialisées, se situe, dans la mesure o ils sont présents dans les polymères, entre 0,5 et 30 % en poids, de préférence entre 1 et 20 % en poids (par rapport aux monoméres utilisés). Outre les composants monoméres décrits ci-dessus, les polymères peuvent encore contenir des monomères réticulants Par "monomères réticulants", on entend par exemple, commne d'habitude, les monomères qui contiennent deux doubles liaisons réactives ou plus dans la molécule, comme par exemple des diols ou des polyols estérifiés avec l'acide acryliue ou, de préférence, l'acide méthacrylique, ainsi que des composes allyliques, comm par exemple le méthacrylate d'allyle, le cyanurate de triallyle, etc On mentionnera par exemple le diméthacrylate d'éthylèneglycol, le diméthacrylate de 1,4- butanediol, le diméthacrylate de

triglycol et le triméthacrylate de triméthylolpropane.

La part de réticulant se situe en règle générale entre O et 50 % en poids, de préférence entre 2 et 20, en particulier entre 5 et 20 % en poids par rapport à la

totalité des monomeres.

La teneur des dispersions DF ou DNF en polymere se

situe en règle générale entre 10 et 60 % en poids.

Dispersions du type polystyrène La préparation de dispersions de styrène est décrite en détail dans Houben-Weyl, Methoden der organischen Chemie, 4 ème édition, vol XIV/1, Georg Thieme Verlag 1961, pp 834-839 Conviennent en particulier, comme émulsionnants, les savons animaux, comme par exemple l'oléate de sodium, mais aussi des savons de résine ainsi que des alkylsulfonates et des émulsionnants à activité cationique, normalement dans des quantités de 2

à 6 % en poids par rapport à la quantité d'eau.

Entrent avant tout en ligne de compte comme initiateurs, ici aussi, ceux qui sont solubles dans l'eau, par exemple du type des sels de peroxydisulfates, ainsi que des systèmes redox, ordinairement dans des quantités de 0,01 à 0,2 % en poids par rapport aux monomères Comme régulateurs, on peut utiliser ceux qui sont employés d'habitude, par exemple des régulateurs au soufre, normalement dans des quantités de 0,05 à 2 % en poids par rapport aux monomères On choisit avantageusement, pour la réaction de déclenchement avec

des peroxydisulfates, un milieu faiblement acide (p H 3-

6) De façon avantageuse, on s'efforce, au cours de la polymérisation, d'exclure l'oxygène de l'air, par exemple en opérant dans une atmosphère d'un gaz

protecteur tel que l'azote.

Comme comonomères pour le styrène ou pour les dérivés du styrène susceptibles de polymérisation radicalaire et connus en soi, on peututiliser les monomères mentionnés dans la section "Dispersions du type acrylate", le rôle des <méth)acrylates monoméres pouvant être rempli par le

styrène et/ou ses dérivés et vice versa.

C'est ainsi qu'en général, la part de styrène ou de dérivés du styrène dans les polymères s'élèvera à plus de 50 % en poids et pourra atteindre 100 % en poids En particulier, des copolymères du type styrène- butadiène sont également intéressants S'agissant de copolyméres du type styrène-butadiène, par variation des proportions à partir d'un rapport pondéral 1:1, il est possible, de façon connue, de déplacer le spectre de caractéristiques dans le sens du "plus dur" (plus forte proportion de styrène) ou dans le sens du "plus mou" (cf par exemple Houben-Weyl, 4 ème édition, op cit, vol XIV/1, pp 147,

327).

Dispersions du type polyester vinylique d'acide gras Entrent en ligne de compte, comme monomères de ce type, ceux qui répondent à la formule H

CH=C O C R,

dans laquelle R, est mis pour un reste alkyle à 1-6 atomes de carbone, en particulier à 1 ou 2 atomes de carbone, c'est-à-dire l'acétate et le propionate de vinyle. Comme monomères, on peut utiliser par exemple des oléfines éventuellement halogénées telles que l'éthylène, le chlorure de vinyle, d'autres esters vinyliques tels que des diesters vinyliques d'acide phosphonique, des (méth)acrylates du genre déjà mentionné (cf "Dispersions du type polyacrylate"), du (méth)acrylonitrile, etc (cf Houben-Weyl, op cit,

4 ème édition, vol 14/2, p 704, vol 14/1, pp 911-

918) La polymérisation s'effectue en général suivant les procédés déjà mentionnés, en ce qui concerne par exemple les émulsionnants, les initiateurs et les régulateurs La polymérisation est avantageusement

conduite dans la gamme de p H de 4 à 5.

Les copolymères de polyvinylidène sont

particulièrement intéressants.

Dispersions du type halogénure de polyvinyle Entrent avant tout en ligne de compte, comme monomères de ce type, le chlorure de vinyle et en

particulier le chlorure de vinylidène (Houben-Weyl, op.

cit, pp 887, 891-905) Comme composants du type acrylate, on mentionnera l'ester méthylique, l'ester éthylique, l'ester butylique, l'ester octyliue, l'ester

nonylique, l'ester 2-éthylhexylique et l'ester 3,5,5-

triméthylhexylique d'acide acrylique, ainsi que l'ester

méthylique d'acide méthacrylique et le méthacrylamide.

En général, la part de comonomères du type acrylate et/ou de (méth)acrylonitrile, d'ester vinylique (ou de chlorure de vinyle) dans le cas de copolymères de vinylidène s'élève à 10-20 % en poids, la température de ramollissement s'abaissant en général à une valeur

désirée.

La polymérisation des composés vinyliques halogénés s'effectue elle aussi conformément aux modes opératoires déjà mentionnés Conviennent en particulier, comme émulsionnants, des sels alcalins d'acides gras ou des alkyl ou acrylsulfonates, ainsi que des émulsionnants d'oxyde de polyéthylène non ionogènes Conviennent, comme initiateurs, les composés "per" usuels, en

particulier les initiateurs redox.

La dispersion filmogène DF La dispersion filmogène DF se caractérise par le fait qu'au cours du séchage, c'est-à-dire pendant l'évaporation du milieu liquide, en règle générale un milieu aqueux, la température de transition vitreuse Tg est dépassée La température de transition vitreuse Tg peut être assimilée en première approximation à la température de transition vitreuse du polymère séché, à condition que le polymère ne présente pas de propriétés hydroplastiques, c'est-à-dire qu'il ne soit pas ramolli par l'eau en raison de sa composition (Le température de transition vitreuse Tg d'un copolyn Mre peut être déduite des contributions des monomères (Cf R Vieweg, F Esser, Kunststoff-Handbuch, vol IX, Polymethacrylate, pp 333-342, Carl Hanser Verlag 1975; H. F Mark et al, Ed Encyclopoedia of Polymer Science & Technology, vol 7, pp 531, 544, John Wiley 1987; T G. Fox, Bull Am Phys Soc, 1, 123, 1956) Mais en général, il suffit de connaître la température minimale de formation du film (TXF) pour choisir les dispersions de polymères appropriées ou les monomères contenus dans ceux-ci En accord avec les connaissances de l'homme de l'art (d'après lesquelles la TMF représente la grandeur caractéristique déterminante pour la tendance d'une dispersion de polymère à former un film, dont la valeur (en 'C) doit être dépassée lors du séchage), la TMF de

la dispersion filmogène DF sera opportunément fixée au-

dessous de 60 'C, de préférence au-dessous de 40 'C et en particulier audessous de 30 *'C La détermination de la

TMF est effectuée conformément à la DIN 35 787.

Particulièrement préférées sont des dispersions filmogènes DF à base de dispersions de (méthacrylate) qui satisfont aux conditions exposées ci-dessus (cf. Houben-Weyl, 4 ème édition, vol XIV/1, op cit, p.

1408).

La dispersion filmogène DF peut être choisie dans les classes de polymères définies précédemment, étant entendu que le polymère correspond aux règles exposées ci-dessus Dans la pratique, la température de transition vitreuse Tg des polymères ne dépassera pas la valeur 30 'C, c'est-à-dire qu'il s'agit de polymères relativement "mous" (on trouvera par exemple les températures de transition vitreuse Tg d'homopolymères dans Brandrup-Immergut, Polymer Handbook, 2 ème éd, J. Wiley) Par copolymérisation de monomères appropriés, on peut préparer un large éventail de latex avec des duretés du film échelonnées de façon continue On mentionnera particulièrement des dispersions DP ayant la composition suivante: esters d'acide méthacrylique et d'alcools en C^-C, en particulier méthacrylate de méthyle, dans des proportions de 20 à 80 % en poids, notamment de 20 à 60 % en poids, et esters d'acides acryliques et d'alcools en Ci-C dans des proportions de à 20 % en poids, par rapport à la totalité du polymère. La dispersion non filmogène DNF La dispersion aqueuse non filmogène a pour caractéristique fondamentale que la température de durcissement des polymères se situe au-dessus de la température de formation du film D'après le langage courant, on peut qualifier de "dur" le polymère de la dispersion non filmogène Cela suppose la prédominance de monoméres dits "durs", dont la liste peut être établie d'après les points de ramollissement des homopolymères (cf Houben-Weyl, 4 ème édition, op cit, vol XIV/1, p 1034) Les polyesters d'acide méthacrylique sont notoirement "plus durs" que les polyesters d'acide acrylique La "dureté" commence par diminuer avec la grandeur croissante des restes alcool,

puis elle augmente de nouveau à partir de l'ester n-

dodécylique dans la série des esters méthacryliques et à partir de l'ester n-octylique dans la série des esters acryliques Le méthacrylate de méthyle, le styrène et ses dérivés doivent par exemple être considérés comme

des monomères "durs".

A la place de l'utilisation de monomères "durs", par exemple du type du méthacrylate de méthyle ou du styrène et de ses dérivés, la dispersion non filmogène peut aussi être composée en combinant des monomères "mous" en soi avec des teneurs plus élevées en monomères réticulants, par exemple avec 5 % en poids au moins et jusqu'à 50 % en poids de ceux-ci De tels polymères ne

forment pas de film compact.

De préférence, les dispersions non filmogènes DNF sont constituées par des polymères contenant plus de 60 % en poids de monomères "durs" tels que le méthacrylate de méthyle ou le styrène et ses dérivés La teneur des dispersions en polymère se situe en règle générale dans

la gamme de 10 à 60 % en poids.

La dispersion non filmogène DNF présente en général des grosseurs de particules dans la gamme de 0,03 à 5 gm, de préférence de 0,1 à 2 gm La dispersion filmogene DF a en général des grosseurs de particules dans la gamme de 0,02 à 5 gm, de préférence de 0,04 à 0,5 jim La détermination de la grosseur de particules est effectuée par spectroscopie de corrélation photonique avec le Nano-Sizer TDX de la firme Coulter Electronics Ltd, Luton Beds Comme règle pratique de dimensionnement, on peut considérer que les particules de la dispersion non filmogène doivent être en moyenne plus grosses, d'un facteur de 1,2 à 20, que celles de la dispersion filmogène, étant de préférence 1,5 à 10 fois, et

notamment 2 à 5 fois plus grosses.

Le rapport quantitatif des deux types de dispersions utilisés dans le cadre de l'invention est compris d'une manière avantageuse entre 50: 50 parties en poids et 99 parties en poids de dispersion non filmogène D F pour 1 partie en poids de dispersion filmogène DF, en particulier entre 60 parties en poids de DNF pour 40 parties en poids de DF et 95 parties en poids de DNF pour 5 parties en poids de DF, et notamment entre 65 parties en poids de DNF pour 35 parties en poids de DF et 90 parties en poids de DNF pour 10 parties en poids de DF, sur la base du polymère sec Il en résulte la découverte surprenante suivante: la valeur déduite de considérations théoriques pour une limite supérieure appropriée du composant polymère filmogène (polymère FE) dans le mélange se situe aux alentours de 26 % en volume environ (pour ce qui est ici considéré présentement, les pourcentages en volume peuvent être assimilés aux

pourcentages en poids en première approximation).

Avec une différence croissante de la grosseur des particules, on peut s'attendre à ce que le système existant réellement se rapproche de la forme idéale de l'empilement de sphères le plus dense des particules de la DNF, les particules de la DF se trouvant dans les coins On devrait donc en déduire qu'avec un facteur croissant dans le rapport des grosseurs de particules, il faut abaisser la proportion du composant filmogène au-dessous de la limite de 26 % en volume à admettre théoriquement, en faveur de la formation d'une matière poreuse ou afin d'éviter le remplissage des vides possibles géométriquement Mais il s'est révélé en fait que la valeur précitée de 26 % en volume environ de polymère de la DF peut être dépassée dans une mesure importante sans que se produise l'effet de bourrage, probablement en raison du fait que le système existant réellement s'écarte de la forme idéale de l'empilement

de sphères le plus dense.

Préparation des systèmes porteurs La préparation des systèmes porteurs selon l'invention pour la fixation par liaison covalente de matières biologiquement actives s'effectue par enduction de la matière de support avec un mélange de la dispersion de polymère filmogène DF et de la dispersion de polymère non filmogène DNF, de préférence dans les rapports indiqués ci-dessus L'enduction peut être effectuée de façon connue en soi, par exemple par pulvérisation ou immersion, de préférence en mélange, mais une application individuelle (pulvérisation

séquentielle) est également possible.

On a obtenu par exemple des résultats particulièrement satisfaisants par l'application du mélange de dispersions au moyen d'un dispositif pulvérisateur Dans une forme de réalisation particulièrement favorable, on procède à la pulvérisation des mélanges de dispersions sur une matière de support en forme de perles ou de sphères (cf. supra), de façon avantageuse dans un tambour de dragéification, avec apport simultané d'air L'enduction de plus petites particules nécessite un séchage particulièrement poussé, de façon a éviter une agglutination des particules Conviennent à cet effet des appareils spéciaux A fort débit d'air, par exemple des appareils à couche fluidisée ou des appareils de revêtement à tambours perforés Pour l'opération de revêtement, les paramètres opératoires, par exemple la vitesse de pulvérisation, le débit et les paramètres de l'air entrant, doivent être adaptés aux propriétés particulières de la matière constituant le noyau et du

mélange de dispersions.

Sur la base d'une définition de la "couche" comme étant "l'épaisseur d'une couche monomoléculaire", les limites de dimensionnement suivantes ont donné des résultats satifaisants: environ 1 couche à 1000 couches, de préférence 1 couche à 100 couches Comme règle pratique, on peut aussi appliquer le rapport des masses des corps de support et de l'enduit: d'après cela, un rapport des masses de la matière de support à l'enduit (à l'état séché) de 1:50 à 10 000:1 conduit à des

résultats valables.

Les matières biologiquement actives Les matières biologiquement actives, dont la fixation à des supports solides est effectuée selon de multiples points de vue dans la recherche scientifique et dans l'industrie, se rangent dans de nombreuses classes différentes C'est ainsi par exemple qu'une classification d'après des critères chimiques est possible, par exemple d'après les groupes fonctionnels, notamment en amino-acides, peptides et protéines ou en nucléosides, nucléotides et polynucléotides (saccharides), auquel cas comme cela est à son tour évident il faudrait faire la distinction entre les types de composés de bas poids moléculaire et de poids moléculaire élevé Des composés polymères peuvent susciter un intérêt particulier, en premier lieu des protéines, des lipoprotéines, des polysaccharides (mucopolysaccharide), des acides nucléiques tels que

l'ADN et l'ARN, des lipoïdes.

Dans de nombreux cas, le choix des mécanismes de fixation disponibles, comme par exemple par liaison covalente, polaire (ionique), complexo-chimique, hydrophobe ou par occlusion, est également dicté par le type des groupes fonctionnels Par ailleurs, une classification d'après l'activité biologique est pertinente: d'après cela, on peut faire par exemple une distinction entre biocatalyseurs tels que complexes enzymatiques, facteurs sanguins, hormones (substances messagères), substances à activité immunologique telles qu'antigènes et anticorps (par exemple anticorps monoclonaux) D'autre part, la fixation peut aussi s'appliquer à des unités définissables morphologiquement (et aussi fonctionnellement le plus souvent), telles que des organites, par exemple des mitochondries, des virus, des cellules entières et des éléments de cellules, des hybrides cellulaires, par exemple des cellules bactériennes, des cellules eucaryotes Enfin, il s'offre aussi une classification des matières immobilisées selon l'utilisation technique prévue C'est ainsi par exemple qu'outre l'emploi de biocatalyseurs, l'utilisation dans le diagnostic et dans la chromatographie (d'affinité) est intéressante Les systèmes selon l'invention conviennent aussi remarquablement à l'application dans le "triage des cellules" et dans la thérapie de déplétion Dans ce cas, on part opportunément d'une modification dans laquelle il est fait par exemple usage d'un anticorps monoclonal ou d'un autre ligand qui est

dirigé sur le "site récepteur" en cause.

Les biocatalyseurs immobilisés peuvent servir par exemple à la production ou à la transformation de

substrats de genres très différents, tels que des aminc-

acides, des peptides et des enzymes de sucres, des acides organiques, des antibiotiques, des stéroïdes, des nucléosides et des nucléotides, des lipides, des terpénoïdes et des produits chimiques organiques de base

(cf Ullmann, 5 ème édition, vol 9 A, op cit, pp 389-

390).

Comme matières à activité immunologique, on citera par exemple des microorganismes, tels que bactéries gram-positives et gram-négatives, spirochètes, mycoplasmes, mycobactéries, vibrions, actinomycètes, protozoaires, notamment protozoaires intestinaux, amibes, flagellés, sporozoaires, nématodes intestinaux et nématodes tissulaires (vers), trématodes (schistosomes, sangsues), cestodes, toxoplasmes, ainsi que champignons tels que sporotrichées, cryptococcus, blastomycètes, histoplasmas, coccidioïdes, candidas, virus et rickettsies, notamment de l'hépatite du chien, du papillome de Shope, de la grippe A + B, de la peste aviaire, de l'herpès, HIV, adéno-virus, virus du polyane, du sarcome de Rous, de la variole, poliovirus, virus de la rougeole, de la morve des chiens, de la leucémie, des oreillons, de la maladie de Newcastle, de la maladie de Sendai, de l'ECHO, de l'épidémie de la gueule et des pattes, de la psittacose, de la rage, de l'ectromélie, virus d'arbres; en outre, antigènes tissulaires et enzymes telles que chymotrypsinogène du

pancréas, procarboxypeptidase, glucose-oxydase, lactate-

déshydrogénase, uricase, amino-acide-oxydase, uréase, asparaginase, protéases, antigènes des cellules sanguines, substances des groupes sanguins et autres isoantigènes, notamment les plaquettes sanguines, les leucocytes, protéines plasmatiques, protéines du lait, protéines de la salive, protéines de l'urine, anticorps, y compris auto-anticorps On mentionnera en particulier des anticorps monoclonaux, qui sont dirigés sur des

antigènes, par exemple des genres suivants.

Classes Antigène d'antigènes Bactériens Toxoïde tétanique Polysaccharide de H influenza type b Toxine diphtérique Chlamydia trachomatis M leprae Lipopolysaccharide/endotoxine Pneumocoques LPS de P aeruginosa Exotoxine de P aeruginosa Classes d' antigènes Antigène Viraux Auto-immunes Tumoraux Tissus/sang Streptocoques groupe A, hydrate de carbone Nucléoprotéine de virus de grippe X 531 Virus de la rougeole Glycoprotéine D de HSV Virus de la rougeole, nucléocapside Virus de la maladie d'inclusion cellulaire Virus A de la grippe Antigène de virus de rubéole

HTLV I

Varicelle-zona H Bs Ag ADN double brin Cellules des îlots de Langerhans (diabète sucré) Myasthénie grave, antigénotypes Récepteur de thyréotropine Facteur de rhumatisme Récepteur d'acetylcholine Thyroïde Sperme Cancer du sein Cancer de la prostate Cancer des poumons Cancer de l'estomac Mélanome BD 2 (mélanome humain) Gliome Cancer du rectum Leucémie Cancer du col Rhésus D Antigène A des groupes sanguins

HLA-A,B,C,DR

Filaments intermédiaires Classes Antigène d'antigènes Divers Malaria Antigène de Forssman Erythrocytes de mouton Nitrophénol Dinitrophénol Trinitrophénol Keyhole limpet hemocyanin (KLH) Facteur de rhumatisme Insuline On mentionnera particulièrement les immunoglobulines de toutes catégories, notamment les types oligomères, en particulier Ig M, Ig E et Ig A. Fixation des matières biologiquement actives Fixation covalente La fixation covalente des matières biologiquement actives présuppose l'état intact des groupements réactifs X dans les polymères des dispersions DF et DNF et, par conséquent, une préparation et une manipulation avec les ménagements correspondants Une telle préparation avec ménagement est décrite par exemple dans

la demande EP-A O 071 704.

Les exemples qui suivent sont destinés à expliquer l'invention. Exem Dle 1 a) Préparation d'un latex de germination pour dispersions de polymères Latex de germination A Dans un récipient de polymérisation de 2 1, équipé d'un réfrigérant à reflux, d'un agitateur et d'un thermomètre, on introduit 2,90 g de méthacrylate de méthyle 2,90 g de méthacrylate d'isobutyle 0,30 g de diméthacrylate de glycol 3,60 g de peroxodisulfate d'ammonium 0,72 g de laurylsulfate de sodium dans 1482 g d'eau bidistillée et on chauffe à 80 'C A ce mélange, on ajoute un mélange de 171,00 g de méthacrylate de méthyle 171,00 g de méthacrylate d'isobutyle 18,00 g de diméthacrylate de glycol à 80 'C, goutte à goutte en l'espace de 2 h sous agitation L'agitation est poursuivie à 80 C pendant une période supplémentaire de 2 h Puis le mélange est refroidi à la température ambiante et filtré On obtient une dispersion qui est pratiquement dépourvue de coagulat, avec une teneur en matières solides d'environ % en poids, une viscosité (déterminée suivant la DIN 53 018) de 4 m Pa S et un rayon moyen de particules de

nm (déterminé au "Nanosizer Coulter").

b) Préparation d'un latex de germination pour dispersions de polymères Dans un pot de Witt, la charge préalable a été chauffée à 80 'C sous agitation, l'initiateur lperoxodisulfate d'ammonium ou sel sodique de l'acide 4,4 '-azobis-( 4-cyano)valériquel a été ajouté, puis la charge d'alimentation sous forme d'émulsion ou de mélange de monoméres a été introduite en une période déterminée 15 mn après la fin de l'alimentation, la dispersion a été refroidie à la température ambiante et filtrée. Latex de germination B Charge préalable: 1478,0 g d'eau 2,9 g de méthacrylate d'isobutyle 2,9 g de méthacrylate de méthyle 0,3 g de diméthacrylate de glycol 3,6 g de peroxodisulfate d'amm nium Charge d'alimentation (en l'espace de 20 mn): 168,1 g de méthacrylate d'isobutyle 168,1 g de méthacrylate de méthyle 17,7 g de diméthacrylate de glycol Teneur en matières solides: 21,1 %o en poids; p H = 2,4;

viscosité: 5 m Pa s; diamètre de particules: 480 nm.

Latex de germination C On a procédé comme dans l'exemple lb), à l'exception de ce qui suit: Charge préalable: 1485,0 g d'eau 0,72 g de laurylsulfate de sodium 3,6 g de peroxodisulfate d'ammonium Teneur en matières solides: 21,4 % en poids; p H = 2,3;

viscosité: 5 m Pa s; diamètre de particules: 270 nm.

Latex de germination D Charge préalable: 427,0 g d'eau 540,0 g de latex de germination B 9,0 g de solution de Titrisol p H 7 (Merck)

0,35 g de sel sodique d'acide 4,4 '-

azobis-( 4-cyano)valérique Charge d'alimentation: 585,0 g d'eau 0,88 g de laurylsulfate de sodium

2,12 g de sel sodique d'acide 4,4 '-

azobis-( 4-cyano)valérique 119,7 g de méthacrylate d'isobutyle 119,7 g de méthacrylate de méthyle

12,6 g de diméthacrylate de glycol.

Teneur en matières solides: 21,2 % en poids; p H = 6,2;

viscosité: 5 m Pa s; diamètre de particules: 730 nm.

Exemple 2

Préparation de la dispersion de polymère filmogène DF renfermant des groupements époxy en tant que groupements fonctionnels X Dans un récipient de polymérisation de 2 1, équipé d'un réfrigérant à reflux, d'un agitateur et d'un thermomètre, une solution composée de 7,50 g de tampon de phosphate, p H = 7,0 0,29 g de sel sodique d'acide 4,4 '-azobis-( 4-cyano)- valérique 0,48 g de laurylsulfate de sodium ,00 g d'un latex de germination de l'exemple 1 (= latex de germination A) 275,00 g d'eau distillée

est préparée et chauffée à 80 'C.

A cette solution, on a Joute goutte à goutte et sous agitation une émulsion composée de 210,00 g d'acrylate d'éthyle 75,00 g de méthacrylate de méthyle ,00 g de méthacrylate de glycidyle

1,76 g de sel sodique d'acide 4,4 '-azobis-( 4-cyano)-

valérique 0,73 g de laurylsulfate de sodium et 933,00 g d'eau distillée, à 80 'C en l'espace de 4 h. On agite la dispersion pendant 15 mn encore, on la laisse refroidir & la température ambiante et on la filtre On obtient une dispersion complètement dépourvue de coagulat, ayant une teneur en matières solides d'environ 20 % en poids, un p H de 7,0, une viscosité de 6

m Pa S et un rayon moyen de particules d'environ 240 nm.

Exem Dle 3 Préparation d'une dispersion aqueuse de polymère non filmogène DNF renfermant des groupements époxy en tant que groupements fonctionnels X Dans un récipient de polymérisation tel que décrit dans l'exemple 1, on introduit un mélange de 7,50 g de tampon de phosphate, p H = 7,0

0,29 g de sel sodique d'acide 4,4 '-azobis-( 4-cyano)-

valérique ,00 g de latex de germination A de l'exemple 1 et 340,00 g d'eau bidistillée et on le chauffe à 80 C A ce mélange, on ajoute en l'espace de 4 h, à 80 'C, une émulsion préparée à partir de ,00 g de méthacrylate de méthyle ,00 g d'acrylate d'éthyle ,00 g de méthacrylate de glycidyle

1,76 g de sel sodique d'acide 4,4 '-azobis-( 4-cyano)-

valérique 0,73 g de laurylsulfate de sodium

865,00 g d'eau bidistillée.

La dispersion est agitée pendant 15 mn encore à 80 C, puis refroidie à la température ambiante et filtrée On obtient une dispersion exempte de coagulat, ayant une teneur en matières solides d'environ 20 % en poids et un p H de 7,0, une viscosité de 6 m Pa S et un rayon de

particules d'environ 400 nm.

Exeniple 4 Préparation d'une dispersion de polymère filmogène DF renfermant des groupements époxy en tant que groupements fonctionnels X Charge préalable: 272,0 g d'eau 0,48 g de laurylsulfate de sodium 7,5 g de solution de Titrisol, p H 7 (Kerck) ,0 g de latex de germination C

0,29 g de sel sadique d'acide 4,4 '-

* azobis-( 4-cyano)-valèrique Charge d'alimentation (en l'espace de 240 mn): 932,0 g d'eau 0,73 g de laurylsulfate de sodium

1,76 g de sel sadique d'acide 4,4 '-

azobis ( 4-cyano>-valérique 210,0 g d'acrylate d'éthyle ,0 g de méthacrylate de méthyle

,0 g de méthacrylate de glycidyle.

Teneur en matières solides: 20,2 % en poids, p H = 7,3; viscosité: 5 m Pa s; diamètre de particules: 560 nm; TMF: -C.

Exemple 5

Préparation d'une dispersion de polymère non filmogène DNF renfermant des groupements fonctionnels X contenant

des groupements époxy.

La charge d'alimentation se compose d'une émulsion 1 et d'une émulsion 2 dans le rapport 70:30 SO, qui sont

ajoutées goutte à goutte successivement.

Charge préalable: 407,0 g d'eau 9,0 g de solution de Titrisol, p H 7 (Merck) 36,0 g de latex de germination C

0,35 g de sel sodique d'acide 4,4 '-

azobis ( 4-cyano)-valérique Emulsion 1: 726,0 g d'eau (en 168 mn) 0,61 g de laurylsulfate de sodium

1,48 g de sel sodique d'acide 4,4 '-

azobis ( 4-cyano)-valérique 163,8 g de méthacrylate de méthyle ,6 g d'acrylate d'éthyle 12,6 g de méthacrylate d'allyle Emulsion 2: 311,0 g d'eau (en 72 mn) 0,27 g de laurylsulfate

0,64 g de sel sodique d'acide 4,4 '-

azobis-( 4-cyano)-valérique 64,8 g d'acrylate d'éthyle

43,2 g de méthacrylate de glycidyle.

Teneur en matières solides: 20,8 % en poids, p H: 7,3; viscosité: 5 m Pa s; diamètre de particules: 760 nm; TIF

> 50 'C.

Exemple 6

Préparation d'une dispersion de polymère filmogène DF Charge préalable: 560,0 g d'eau 1,12 g de laurylsulfate de sodium

0,98 g de sel sodique d'acide 4,4 '-

azobis-( 4-cyano)-valérique Charge d'alimentation (en l'espace de 240 mn): 860,0 g d'eau 4,2 g de laurylsulfate de sodium

0,98 g de sel sodique d'acide 4,4 '-

azobis-( 4-cyano)-valérique 420,0 g d'acrylate d'éthyle 180,0 g de méthacrylate de méthyle Teneur en matières solides: 28,7 % en poids, p H = 6,7; viscosité: 6 m Pa s; diamètre de particules: 82 nm; TXF: 8 C.

Exemple 7

Préparation d'une dispersion de polymère non filmogène DNF Charge préalable: 1411,0 g d'eau 37,5 g de solution de Titrisol, p H 7 ('erck) 1200,0 g de latex de germination D

1,18 g de sel sodique d'acide 4,4 '-

azobis-( 4-cyano)-valérique.

Après addition de l'initiateur, on commence par ajouter goutte à goutte, en l'espace de 120 mn, une émulsion composée de: 1830,0 g d'eau 2,92 g de laurylsulfate de sodium ,29 g de sel sodique d'acide 4,4 '- azobis-( 4-cyano)-valérique 313,5 g de méthacrylate d'isobutyle 313,5 g de méthacrylate de méthyle 33,0 g de diméthacrylate de glycol (charge d'alimentation 1), puis, en l'espace de 60 mn, simultanément: a) un mélange de monoméres composé de 126,0 g de méthacrylate de glycidyle 102,0 g de méthacrylate de méthyle 12,0 g de diméthacrylate de glycol et b) une solution de 601,0 g d'eau ,0 g de méthacrylamide 1,7 '7 g de sel sodique d'acide 4,4 '- azobis-( 4-cyano)-valèrique

(charge d'alimentation 2).

Teneur en matières solides: 20,8 % en poids, p H = 7,7; viscosité: 5 m Pa s; diamètre de particules: 1120 nm; TXF

> 60 'C.

Exemple 8 Préparation d'une dispersion de polymère non filmogène DNF La charge

d'alimentation est constituée par une émulsion 1 et une émulsion 2 dans le rapport 4: 1, qui

sont ajoutées goutte à goutte successivement.

Charge préalable: 559,0 g d'eau 0,42 g de laurylsulfate de sodium

0,98 g de sel sodique d'acide 4,4 '-

azobis-( 4-cyano)-valérique Emulsion 1: 679,0 g d'eau (en 192 mn) 3,36 g de laurylsultate de sodium

0,78 g de sel sodique d'acide 4,4 '-

azobis-( 4-cyano)-valérique 456,0 g de méthacrylate de méthyle 24,0 g de méthacrylate d'allyle Emulsion 2: 177,0 g d'eau (en 48 mn) 0,84 g de laurylsulfate de sodium

0,2 g de sel sodique d'acide 4,4 '-

azobis-( 4-cyano)-valérique 84,0 g d'acrylate d'éthyle

36,0 g de méthacrylate de méthyle.

Teneur en matières solides: 29,6 % en poids, p H = 6,7; viscosité: 5 m Pa s; diamètre de particules: 204 nm; TXF

> 50 'C.

Exemple 9

Préparation d'une dispersion de polymère filmogène DF Charge préalable: 560,0 g d'eau 1,12 g de laurylsulfate de sodium 0,98 g de sel sodique d'acide 4,4 '- azobis-( 4-cyano)-valérique Charge d'alimentation (en 240 mn): 860,0 g d'eau 4,2 g de laurylsulfate de sodium

0,98 g de sel sodique d'acide 4,4 '-

azobis-( 4-cyano)-valérique 420,0 g d'acrylate d'éthyle

,0 g de méthacrylate de méthyle.

Teneur en matières solides: 28,7 % en poids, p H: 6,7; viscosité: 6 m Pa s; diamètre de particules: 82 nm; TXF: 8 C.

Exemple 10

Préparation d'une dispersion de polymère filmogène DF 920 g d'eau, 29 g d'un isononylphénol éthoxylé (degré d'éthoxylation 100), 346 g d'acrylate d'éthyle, 146 g de méthacrylate de méthyle et 6 g d'acide mnéthacrylique sont chargés préalablement dans un pot de Witt et l'appareil est balayé avec Nk La polymérisation a été déclenchée par addition de 0,5 g de peroxodisulfate d'ammonium, de 0,7 g de pyrosulfite de sodium et de 0,01 g de sulfate ferreux Après le dépassement du maximum de température, on a refroidi à 40 C et ajouté g de l'émulsionnant mentionné ci-dessus, 346 g d'acrylate d'éthyle, 146 g de méthacrylate de méthyle et 6 g d'acide acrylique et la polymérisation a été déclenchée de nouveau par addition de 0,7 g de pyrosulfite de sodium et de 0,5 g de peroxodisulfate d'ammonium Après le dépassement du maximum de température, on a refroidi à la température ambiante, on a réglé le p H à 7,0 avec Na OH et on a dilué

avec de l'eau à une teneur en matières solides de 30 %.

Teneur en matières solides: 30 %; diamètre de particules: nm; viscosité: 20 m Pa s; TMF: 7 C.

Exemple 11

Préparation de mélanges prêts à l'emploi de dispersion filmogène DF et de dispersion non filmogène DNF On obtient des mélanges prêts à l'emploi en mélangeant les dispersions de polymères des exemples 2 et 3 dans les rapports (indiqués en % en poids) que l'on

trouvera dans les tableaux 1 à 7 suivants.

34 ml des mélanges de dispersions sont dilués avec de

l'eau désionisée à un volume final de 200 ml.

Exemple 12

Enduction de perles de polystyrène avec une suspension

de polymère.

a) L'appareil pulvérisateur est chargé avec 6 8 ml des

mélanges prêts à l'emploi de l'exemple 11.

b) Une bassine de dragéification (diamètre 145 mm, deux plaques de répartition) est chargée de 150 sphères de polystyrène (sphères Spherotech fournies par Spherotech-Vertrieb Gmb H, Fulda, RFA) d'un diamètre de 6,35 mm La bassine a été mise en rotation à 50-70 tr/mn, 5 à 7 ml du mélange prêt à l'emploi étant pulvérisés sur les sphères tandis qu'elles étaient en mouvement à l'intérieur de la bassine de dragéification Le traitement de pulvérisation a été appliqué à la température ambiante pendant 30 mn environ, au cours desquelles un jet d'air non chauffé (Fbhn électr) était soufflé dans la bassine de

dragéification pour évaporer l'humidité.

c) Après l'achèvement de l'opération d'enduction, les perles enduites sont conservées à -15 'C dans un flacon de polystyrène fermé, jusqu'à leur utilisation, par

exemple pour l'immobilisation d'anticorps.

On enduit de façon analogue des granulés minéraux, par exemple de carbonate de calcium, d'oxyde d'aluminium, de dioxyde de titane, d'Aerosil R avec le même bon résultat.

Exemple 13

Immobilisation d'anticorps monoclonaux sur des perles de polystyrène enduites des dispersions DNF/DF a) 1000 pg d'un anticorps monoclonal de la souris <dirigé vers une hormone polypeptidique humaine d'un poids moléculaire d'environ 30 000) ont été dissous dans 20 ml d'une solution tampon de phosphate de

potassium 0,3 molaire (p H = 8,0).

b) Cette préparation d'anticorps est appliquée sur 100 perles enduites selon l'exemple 12, placées dans un becher. c) On abandonne ce mélange à 23 C pendant une nuit sans agitation. d) La fraction aqueuse de ce mélange est éliminée par filtration à la trompe sous vide et les perles restantes sont lavées à trois reprises avec, chaque fois, 80 ml de PBS (tampon standard, p H = 7,2 par addition de chlorure de sodium) L'opération de lavage comprend une faible agitation pendant 5 mn, suivie de filtration à la trompe de la phase aqueuse, les perles

restant dans le récipient utilisé.

e) Après le troisième lavage, on envoie sur les perles ml d'une solution tampon, qui contient 1 % en poids d'albumine sérique dans du PBS (p H = 7,2) On abandonne ce mélange pendant une nuit à 23 C sans l'agiter.

f) On procède au lavage, comme en b).

g) Les perles chargées sont conservées au réfrigérateur

à + 5-C jusqu'à leur utilisation.

Exemple 14

Dosage radio-immunométrique de l'antigène (hormone polypeptidique humaine, poids moléculaire 30 000 environ) a) Les sphères de polystyrène qui ont été obtenues dans l'exemple 13 sont placées dans de petits tubes à essais à fond en forme de calotte ( 9,6 mm de

diamètre), à raison d'une perle par tube à essais.

b) On y ajoute 100 ptl d'un traceur radioactif (anticorps monoclonaux différents qui sont dirigés vers l'antigène précité et qui ont été marqués avec '" 21 I dans l'ordre de grandeur d'environ 50 000 coups par minute). c) Immédiatement après l'addition du traceur, on ajoute pl de l'antigène, jusqu'aux concentrations

indiquées ci-après (cf tableaux).

d) Le mélange est remué pendant 3 h à la température ambiante ( 21 C) au moyen d'une machine agitatrice

orbitale tournant à 300 tr/mn.

e) La fraction aqueuse de la charge d'incubation est

éliminée par filtration à la trompe sous vide.

f) Chaque tube à essais avec sa perle est lavé à trois reprises avec, chaque fois, 1 ml de solution tampon ( 2 % en poids d'albumine de sérum bovin dans un tampon de Tris 0,2 molaire de p H 8,5, avec 1,2 % en poids

d'émulsionnant Tween 20).

g) Les petits tubes à essais sont soumis à un comptage dans un compteur à scintillations gamma (Typ Multi

Crystal Gamma Counter LB 2103).

Les résultats ainsi obtenus sont présentés dans les

tableaux 1 à 7 (voir ci-après).

Discussion des résultats Comme le montrent les valeurs figurant dans les tableaux 1 à 7, le revêtement selon l'invention des sphères ou perles de polystyrène avec le mélange des dispersions DF et DNF produit une amélioration considérable, à savoir une chute du coefficient de variation, parallèlement à une certaine augmentation ( 9585 cpm: 16 636 cpm) de la plage des résultats des

essais aux plus fortes concentrations utilisées.

En revanche, aux plus faibles concentrations du produit analysé, la différence entre l'enduction exclusive avec la dispersion filmogène DF et l'enduction avec le mélange de dispersions filmogène et non filmogène DNF ne se traduit pas par une augmentation

manifeste de la sensibilité de l'essai.

Les meilleurs résultats sont obtenus avec des perles qui sont enduites, conformément à l'invention, d'un mélange de dispersions qui contient 10 à 20 % en poids de la dispersion filmogène DF En comparaison de perles de polystyrène non enduites (qui doivent être considérées comme représentant l'état de la technique), des perles de polystyrène enduites du mélange de la dispersion filmogène DF et de la dispersion non filmogène DNF présentent une augmentation au moins quadruple des valeurs mesurées de coups par minute (cpm) dans la gamme de concentration inférieure et moyenne du produit analysé, augmentation qui se poursuit même jusque dans la seconde concentration à partir du haut Même à la plus forte concentration, on observe une augmentation du facteur 2,5 environ des valeurs mesurées de cpm Le progrès atteint d'après l'invention dans la technique de l'essai immunologique sur corps solides peut donc être considéré comme clairement démontré, TABLEAU 1: Résultats avec des perles de polystyrène non enduites après 5 mn coefficient de variation Moyenne 3,3 11,9 22,4

157,8 %

43,0 %

39,3 %

13,8 %

,1 % 56,9 204,2 929,6

43,5 %

16,1 %

3089,9

9585,7

29,6 %

Concentration d'antigène (ng/ml) o 0,016 0,062 0,218 0,700 2,980 11,80 , 80 cpm Mesures 0,6 0,0 9,3 11,8 17,0 6,8 23,2 ,7 13,2 52,4 52,3 56,9 213, 7 205,6 193,1

1299,8

750,0 738,8

2891,3

2724,6

10872,2

11561,9

6322,9

(A TABLEAU 2: Résultats avec des perles de polystyrène qui n'étaient enduites que de la dispersion non filmogène DNF (de l'exemple 3) cpm coefficient Concentration Mesures après 5 mn Moyenne de variation d'antigène (ng/ml) 23,6

22,4 28,8 21,3 % O

29,3 52,3

47,1 44,8 20,0 % 0, 016

34,8 93,5

87,9 90,1 3,4 % 0, 062

88,9 269,4

278,2 274,6 1,7 % 0,218

276,2 889,6

853,6 882,4 3,0 % 0,700

904,0

3227,2

3266,7 3242,5 0,7 % 2,980

3233,4

10768,1

11230,9 11016,4 2,2 % 11,80

11051,1

23203,6

23339,7 23266,7 0,3 % 50,80

23258,4

TABLEAU 3:

résultats avec des perles de poly 3 tyrène qui étaient enduites d'un mélange des dispersions DNF (de l'exemple 3) et DF (de l'exemple 2) dans le rapport : 10 %/o en poids cpm Mesures après 5 mn 19,7 23,6 28,6 66,8 68,9 57,4 133,6 124,2 117,0 371,3 345,5 364,6

1108,7

1151,4

1121,0

4165,3

4076,9

4203,4

13811,1

14083,3

14100,2

27782,0

28631,9

29383,4

Moyenne 24,0 64,4 ,0 360,5

1127,4

4148,6

13998,1 '

28598,4

Coefficient de variation

18,7 %

9,6 % 6,7 % 3,8 % 2,0 % 1,6 % 1,2 % 2,8 % Concentration d'antigène (ng/ml) 0,016 0,062 0,218 0,700 2,980 11,80 ,80 TABLEAU 4: Résultats avec des perles de polystyrène qui avaient mélange des dispersions DNF et DF dans le rapport de (cf ex 2 et 3) été enduites d'un poids 80: 20 cpm Mesures après mn 24,7 24,6 ,8 51,4 58,7 56,8 117,0 ,4 111,6 350,3 348,8 336,3

1054,3

1044,9

1124,7

3981,6

3904,3

3940,4

13249,4

12887,8

13074,8

27895,8

29123,3

28097,4

Moyenne 28,4 ,7 114,7 345,2

1074,7

3941,7

13070,7

28372,2

Coefficient de variation

22,7 %

6,8 % 2,5 % 2,3 % 4,1 % 1,0 % 1,4 % 2,4 % Concentration d'antigène (ne/ml) o 0,016 0,062 0,218 0,700 2,980 11,80 ,80 TABLEAU 5: R 6 sultats avec des perles de polystyrène qui étaient enduites d'un poids de 50 % de chacune des dispersions DF et DNF (cf ex 2 et 3) cpm Mesures après 5 mn 78,6 28,9 32,6 57,3 52,9 57,3 99,8 104,6 109,8 338,1 322,2 321,9 982,4

1006,4

1048,2

3531,1

3741,1

3749,6

12408,6

12242,5

12463,8

26464,6

26530,6

27838,8

Moyenne 46,7 ,7 104,8 327,4

1012,4

3673,7

12371,6

26944,0

Coefficient de variation

46,7 %

,2 % 4,8 % 2,9 % 3,3 % 3,4 % 0,9 % 2,9 % Concentration d'antigène (ng/ml) 0,016 0,062 0,218 0,700 2,980 11,80 ,80 un 1 TABLEAU 6: Résultats avec des perles de polystyrène qui étaient enduites d'un mélange des dispersions DF et DNF dans le rapport de poids 80: 20 (cf ex 2 et 3) cpm Mesures après 5 mn 18,7 27,6 33,0 47,6 54,8 56,3 103,9 , 9 94,8 304,7 294,0 303,7 865,8 870,4 919,3

3396,1

3231,9

3326,0

11132,8

10865,5

10899,1

22130,6

22364,9

22313,9

Moyenne 26,4 52,9 98,2 300,8 885,2

3317,7

10965,4

Coefficient de variation

27,3 %

8,9 % ,1 % 2,0 % 3,4 % 2,5 % 1,4 % 0,6 %

22269,8

Concentration d'antigène (ng/ml) o O 0,016 0,062 0,218 0,700 2,980 11,80 ,80 TABLEAU 7: Résultats avec des perles de polystyrène qui étaient exclusivement de la dispersion DF de l'exemple 2 enduites cpm Mesures après 5 mn 41,4 27,6 39,9 42,9 49,8 47,6 ,9 ,1 68,8 241,8 243,6 229,5 698,9 663,8 757,8

2747,1

2700,0

2543,3

8310,1

8138,1

7925,8

17829,9

15204,7

16635,9

Moyenne 36,3 46,8 78,3 238,3 706,9

2663,4

8124,4

16556,0

Co e ffioient de variation ,9 % 7,6 %

14,6 %

3,3 % 6,8 % 4,1 % 2,4 % 8,0 % Concentration d'antigène (ng/ml) 0,016 0, 062 0,218 0,700 2,980 11,80 ,80

Exemple 15

Enduction de la matière de support inerte sous forme de perles de polymère 700 g de polymère PMMA en perles, ayant une grosseur moyenne de particules de 310 pm, sont revêtus, dans l'appareil à couche fluidisée (Uniglatt, firme Glatt), du mélange de dispersions suivant: Dispersion non filogène de l'exemple 7 1225 g Dispersion filmogène de l'exemple 10 525 g (dilué & 20 % de substance sèche) 1750 g Rapport noyau/enveloppe = 2: 1 Conditions opératoires: Pression de pulvérisation: 1,8 bar Température de l'air entrant: 40 'C Température de l'air sortant: 23-25 'C Vitesse de pulvérisation: 8,75 g/mn Le produit obtenu est séché dans le vide pendant 24 h Il s'écoule librement; d'après une analyse granulométrique au tamis à secousses, 81,4 % (en poids)

du produit se situent dans la gamme de 0,3 & 0,6 mm.

Activité après fixation de trypsine: BAEE: 0,7 U/g caséine: 0,3 U/g

Exemple 16

Enduction de la matière de support inerte sous forme de perles de polymère 900 g de polymère PEMA en perles, ayant une grosseur moyenne de particules de 310 gm, sont revêtus, dans l'appareil & couche fluidisée (Uniglatt, firme Glatt), du mélange de dispersions suivant: Dispersion non filogène de l'exemple 7 3150 g Dispersion filmogène de l'exemple 4 1350 g (dilué à 20 % de substance sèche) 4500 g Rapport noyau/enveloppe = i: 1 Conditions opératoires: Pression de pulvérisation: 1,8 bar Température de l'air entrant: 40-50 C Température de l'air sortant: 19-23 'C Vitesse de pulvérisation: 11, 84 g/mn Le produit obtenu est séché dans le vide pendant 24 h Il s'écoule librement; 85,8 % (en poids) du produit se

situent dans la gamme granulométrique de 0,3 à 0,6 mm.

Activité après fixation de trypsine: BAEE: 3,9 U/g caseine: 1,04 U/g

Exemple 17

Fixation de trypsine sur le produit de l'exemple 16 500 mg de trypsine (de bovin art n' 24 579, 40 v/mg; E Merck, D-6100 Darmstadt) sont dissous dans 10 ml de tampon de phosphate de potassium 1 M (p H 7,5) et ajoutés

à 5 g du produit selon l'exemple 16.

* Le mélange est légèrement remué pendant 10 S et abandonné à + 23 'C pendant 72 h Après quoi, on le lave à sept reprises avec, chaque lois, 10 volumes d'eau désionisée et à trois reprises avec, chaque lois, 10 volumes de tampon de phosphate 0,1 X (contenant 500 ppm d'acide phydroxybenzoïque à des fins de conservation et

2 % de 2-propanol).

A l'état lavé (sur verre fritté au-dessus du vide),

on obtient un rendement au mouillé de 5,6 g.

Activité à l'égard de BAEE: 3,2 U/g caséine: 0,36 U/g En comparaison de l'état de la technique, on n'observe

aucune perte d'activité.

Détermination de l'activité Activité à l'égard de la caséine (substrat de poids moléculaire élevé) Substrat A 20 g de caséine de Hammarstein (art n' 2242, E. Merck, D-65100 Darmstadt), on ajoute 350 ml d'eau désionisée et 32 ml de Na OH 0,5 M et on agite à 60 'C jusqu'à ce que la caséine soit dissoute Après refroidissement a la température ambiante, le p H est réglé & 8,0 par addition de HC 1 0,1 M Puis le volume est complété à 500 ml avec de l'eau désionisée (il y a lieu de noter qu'en raison de l'agrégation de caséine, la

solution est toujours un peu trouble).

Détermination ml de solution de substrat et 2 g du produit de l'exemple 17 sont agités, à 37 'C et à un p H de 8,0, dans un réacteur équipé d'un thermostat et d'un p H-stat En même temps, la quantité de substrat hydrolyse est notée en fonction du temps, au moyen de la consommation de Na OH 0,O 1 N. Au bout de 10 mn d'incubation, le produit est recueilli dans un récipient de verre fritté (porosité n 2) et le même produit est mis en incubation pendant 10 autres mn La déclaration de l'activité est faite

d'après le 4 ème cycle.

Activité à l'égard de chlorhydrate d'ester éthylique de N-benzoyl-Larginine (BAEE, substrat de bas poids moléculaire) Une ( 1) unité (U) d'activité enzymatique vis-a-vis de BAEE est la quantité d'enzyme qui hydrolyse 1 micromole de BAEE par minute à p H 8 et 34 'C (cf A Lauwers et al,

Pharmaceutical Enzymes, Verlag Scientia, Ghent).

Substrat

Une solution à 1 % de BAEE (art n'1672; E Merck, D-

6100 Darmstadt) est dissoute dans du tampon de phosphate

de potassium 0,05 M (p H 7,5).

Incubation ml de solution de substrat et 2 g du produit de l'exemple 17 (quantité pesée à l'état humide) sont

titrés avec Na OH 0,1 X à 37 'C et à un p H de 7,5.

Temps d'incubation: 10 mn. La déclaration de l'activité est faite d'après le 4 ème cycle.

Exemple 18

Enduction de la matière de support inerte sous forme de perles de polymère 900 g de polymère PNMA en perles, ayant une grosseur moyenne de particules de 310 pm, sont revêtus de 1575 g de la dispersion de l'exemple 5 dans l'appareil à couche

fluidisée (Uniglatt, firme Glatt).

Rapport noyau/enveloppe: 3: 1 Conditions opératoires: Pression de pulvérisation: 1,8 bar Température de l'air entrant: 40-45 'C Température de l'air sortant: 20-23 'C

Vitesse de pulvérisation: 8,75 g/mn.

Le produit obtenu est séché pendant 24 h dans le vide Il s'écoule librement; 62,2 % (en poids) du produit se situent dans la gamme granulometrique de 0,3 à 0,6 mm. Activité après fixation de trypsine: BAEE: 0,3 U/g caséine: 0,9 U/g

Exemple 19

Enduction de la matière de support inerte sous forme de perles de polymère 775 g de polymère PMMA en perles (Plexidon x 449), ayant un diamètre moyen de particules de 100 Hm, sont revêtus du mélange de dispersions suivant dans l'appareil à couche fluidisée (Uniglatt, firme Glatt): Dispersion de l'exemple 6 1808,33 g Dispersion de l'exemple 8 775,00 g 2583,33 g Rapport noyau/enveloppe: 1: 1 Conditions opératoires: Pression de pulvérisation: 2 bar Température de l'air entrant: 40-45 'C Température de l'air sortant: 22-25 'C Vitesse de pulvérisation: 10,5 g/mn Séchage: 24 h dans le vide

Le produit obtenu s'écoule librement et il est blanc.

Le diamètre moyen des particules est de 189 pm.

Exemple 20

De la même manière que dans les exemples 2 et 3, on prépare des dispersions filmogênes et non filmogènes avec la modification que le méthacrylate de glycidyle est remplacé à chaque fois par la même teneur en poids des monoméres suivants: a) anhydride méthacrylique b) acroléine c) méthacrylate de 2-(acétoacétoxy>éthyle d) acrylamidoglycolate de méthyle e) méthacrylate de 2- (chloroacétoxy)éthyle f) méthacrylate de 2-chlorcéthyle Les dispersions obtenues sont, conformément à

l'invention, comparables à celles des exemples 2 et 3.

Elles sont de même aptes à la préparation de matières de support pour des systèmes biologiquement actifs comme dans les exemples 11 et 12 et fournissent des résultats similaires.

Claims (21)

REVENDICATIONS

1. Procédé de préparation de systèmes porteurs pour la fixation par liaison covalente de matières biologiquement actives, constitués par une matière de support solide, en soi connue, dont la surface est garnie d'une couche de polymère, le polymère contenant les groupements fonctionnels appropriés pour la liaison covalente, caractérisé en ce que la matière de support est enduite d'un mélange d'une dispersion de polymère filmogène DF et d'une dispersion non filmogène DNF, l'une au moins des deux dispersions de polymère renfermant les groupements fonctionnels appropriés pour

la liaison covalente.

2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en

ce qu'on utilise une matière de support inorganique.

3 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en

ce qu'on utilise une matière de support organique.

4. Procédé selon l'une quelconque des revendications

1 à 3, caractérisé en ce qu'on utilise des particules sphériques.

5 Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce qu'on utilise des sphères ayant un diamètre dans la

gamme de 0,01 à 10 mm.

6. Procédé selon la revendication 2 ou 3, caractérisé en ce qu'on utilise des produits plats à

base de cellulose ou de textiles ou des fibres de verre.

7. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les dispersions de polymères sont choisies dans le groupe constitué par les polyacrylates, le polystyrène et les polymères d'alkylstyrène, les polyesters vinyliques, les composés polyvinyliques

halogénés, ainsi que par des copolymères.

8. Procédé selon l'une quelconque des revendications

1 à 7, caractérisé en ce que les dispersions de polymères ont une teneur en monomères portant des groupements fonctionnels, de formule

Z (R),, X

dans laquelle X est mis pour un groupement halogénure d'acide sulfonique, thioisocyanate, thiocarbonyldioxy, carbonylimidoyldioxy, halogénoéthoxy, aziridine, époxy, formyle, céto, acryloyle, anhydride ou ester activé, en tant que groupement fonctionnel, R est mis pour un élément d'écartement chimiquement inerte (spacer), nest mis pour O ou 1 et

Zest mis pour un motif polymérisable.

9. Procédé selon la revendication 1 ou 8, caractérisé en ce que les groupements fonctionnels appropriés pour la liaison covalente sont des

constituants de la dispersion non filmogène DNF.

10. Procédé selon l'une quelconque des

revendications 1 et 7 à 9, caractérisé en ce que la

teneur du polymère en monomères fonctionnels s'élève à 0,1-80 % en poids par rapport à la totalité des monoméres.

11. Procédé selon l'une quelconque des

revendications 1 et 7 à 10, caractérisé en ce que les

dispersions de polymères sont constituées par des polyacrylates qui se composent, pour au moins 50 % en poids par rapport à la totalité des monoméres, de monomères de formule

CH 2 = C C OR 3

l dans laquelle Ru est mis pour un atome d'hydrogène, un reste méthyle ou un groupement CH 3-COOR=, o R 2 est un reste alkyle à 1-4 atomes de carbone, R 3 est mis pour un reste alkyle éventuellement ramifié à 1- 18 atomes de carbone ou pour un reste cycloalkyle à

3-12 termes cycliques.

12. Procédé selon la revendication 1 ou 7, caractérisé en ce que la dispersion filmogène DF a une température minimale de formation de film (selon la DIN 53 787) de moins de 60 'C, de préférence de moins de 'C.

13. Procédé selon la revendication 1 ou 7, caractérisé en ce que la température de durcissement du polymère constituant la dispersion non filmogène DNF se

situe au-dessus de la température de formation de film.

14. Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que la température de durcissement de la

dispersion non filmogène DNF est d'au moins 30 'C.

15 Procédé selon la revendication 7 ou 12, caractérisé en ce que les particules de la dispersion filmogène DF ont une grosseur moyenne dans la gamme de

0,02 à 5 pm.

16. Procédé selon la revendication 7 ou 13, caractérisé en ce que les particules de la dispersion non filmogène DNF ont une grosseur moyenne dans la gamme

de 0,04 à 5 gm.

17. Procédé selon l'une quelconque des

revendications 1, 15 et 16, caractérisé en ce que les

particules de la dispersion non filmogêne DNP sont en moyenne plus grosses, d'un facteur de 1,2 à 20, que

celles de la dispersion filmogène DF.

18. Procédé selon l'une quelconque des

revendications 1 et 7 à 17, caractérisé en ce que lors

de l'application, la dispersion non filmogène DNF est, à la dispersion filmogène DF, dans un rapport de 50 parties en poids: 50 parties en poids à 99 parties en

poids: 1 partie en poids.

19 Procédé selon l'une quelconque des

revendications 1 à 18, caractérisé en ce que la matière

de support est enduite de la dispersion de polymère filmogène DF et de la dispersion de polymère non

filmogène par immersion ou pulvérisation.

20 Procédé selon la revendication 19, caractérisé en ce qu'on utilise, pour l'immersion ou la

pulvérisation, le mélange de dispersions de polymères.

21. Utilisation des systèmes porteurs préparés selon

l'une quelconque des revendications de procédé 1 à 20

pour la fixation par liaison covalente de matières

biologiquement actives.