FR2935711A1 - Clone cellulaire stable exprimant un prion - Google Patents

Abstract

L'invention concerne un clone cellulaire issu de la lignée MovS6, ledit clone cellulaire exprimant une protéine prion PrP et étant capable de supporter la réplication ou la propagation de la forme pathologique PrPsc de ladite PrP, caractérisé en ce qu'il présente une stabilité du titre en marqueur de l'infection par un agent transmissible non conventionnel (ATNC) sur une période comprise entre le 6ème et le 100ème passage.

Description

La présente invention concerne un clone cellulaire issu de la lignée MovS6 exprimant une protéine prion PrP et capable de supporter la réplication ou la propagation de la forme pathologique PrPsc de ladite PrP, ainsi que son application, notamment à une méthode d'évaluation et/ou de contrôle in vitro de l'efficacité d'un procédé d'obtention ou de traitement d'un produit biologique ou à une méthode d'évaluation et/ou de contrôle in vitro d'une procédure de décontamination ou à une méthode d'évaluation ou screening de composés dotés d'une activité modulatrice de l'infectiosité liée aux "agents transmissibles non conventionnels" ATNC. Etat de la technique : Les encéphalopathies spongiformes transmissibles (EST) regroupent un ensemble de maladies génétiques ou acquises caractérisées par une dégénérescence du système nerveux central (SNC). La forme la plus fréquente chez l'homme est la maladie de Creutzfeldt-Jakob (MCJ), mais il existe également des EST chez de nombreux mammifères (notamment la tremblante du mouton et l'encéphalopathie spongiforme bovine). L'agent étiologique de ces maladies est classé dans la catégorie des "agents transmissibles non conventionnels" (ATNC). La signature de la maladie est la présence d'une protéine extracellulaire, appelée protéine prion (PrP), qui est transformée au cours de la maladie en une forme insoluble, résistante aux protéases telles que la protéinase K, et qui s'accumule dans le système nerveux central. Cette forme anormale pathologique de la PrP, appelée PrPsc, est co-purifiée avec l'infectiosité et son accumulation précède l'apparition des lésions histologiques. Elle résulte d'une modification de la conformation de la protéine prion PrP. Il n'a pas été mis en évidence de modification de l'expression du gène codant pour la PrP, ni d'altération de sa traduction (Prusiner, Biochemistry 1992 ; 31 :12277-88 ). Les données actuellement disponibles ne permettent pas de démontrer que l'agent transmissible responsable des EST se trouve sous une forme infectante dans les dérivés sanguins (Brown et al., 2001, Semin Hematol.;38 (4 Suppl 9):2-6).

Toutefois, on ne peut conclure à son absence, cette incertitude résultant, d'une part, de la probable concentration très faible dans le sang et, d'autre part, de la très longue période d'incubation cliniquement silencieuse caractéristique de ces maladies, qui précède l'apparition des signes cliniques.

En outre, l'exceptionnelle résistance des ATNC empêche le recours à des procédés d'inactivation classiquement mis en oeuvre, tels que le traitement solvant/détergent Tween-TNBP, qui ont fait la preuve de leur efficacité pour réduire la charge virale des dérivés sanguins, tels que les protéines cryoprécipitables du plasma (facteur VIII, facteur von Willebrand, etc.). Etant donné que l'obtention ou le traitement de produits biologiques, tels que les protéines plasmatiques de la coagulation, doit incorporer des étapes d'élimination/inactivation virales en vue d'un usage thérapeutique, l'industrie pharmaceutique des médicaments dérivés du sang cherche aujourd'hui à évaluer le risque théorique de transmission du variant de la MCJ par les produits dérivés du sang. Actuellement, la méthode de titrage de l'infectiosté liée aux ATNC classiquement mise en oeuvre utilise une méthode de titrage in vivo chez le hamster doré, par injection intracérébrale de différentes dilutions d'un produit à tester chargé en ATNC. Selon le nombre d'animaux atteints dans les différents groupes correspondant aux dilutions effectuées, on peut calculer un titre infectieux et établir le facteur de réduction d'un procédé donné à partir d'une référence non traitée. Cependant, cette méthode présente l'inconvénient d'être longue (environ un an), coûteuse et peu compatible avec un développement à l'échelle industrielle dont on veut connaître rapidement l'efficacité vis-à-vis de l'élimination du prion. En outre, il est souvent nécessaire d'introduire une étape de concentration de l'agent infectieux de façon à augmenter la sensibilité des méthodes de titrage. Toutes les procédures de concentration d'agents infectieux responsables de l'EST passent aujourd'hui par une purification de la PrPsc. D'autres méthodes ont été proposées pour le titrage in vitro des agents infectieux des EST.

Les techniques de détection de la PrPsc par Western-Blot (Mac Gregor, Transfusion J. Medecine 2001 ; 11, 3-14) ou par ELISA nécessitent généralement une digestion préalable de l'échantillon à analyser par la Protéinase K, ou une dénaturation par des agents chaotropiques pour distinguer la protéine pathologique (PrPsc) de la protéine normale (PrP). Une autre méthode de titrage a récemment été développée basée sur l'utilisation des anticorps spécifiques de la PrPsc ne reconnaissant pas la PrP (Korth et al, Nature 1997 Nov6, 390 (6655) : 74-7). Le brevet US 6,150,583 décrit quant à lui la production d'animaux transgéniques exprimant 10 une PrP marquée par un épitope hétérologue exposé ou non à la surface de la protéine prion, selon la conformation de cette dernière. Le procédé appelé PMCA (Protein misfolding cyclic amplification), décrit dans le document Saborio et al. (Nature ; 2001, 411, 810-3) prévoit la mise en contact de formes pathologiques provenant d'un tissu ou d'un fluide issu d'un animal contaminé avec une 15 forme non pathologique de la protéine d'ATNC, afin de convertir cette dernière en une forme pathologique. La méthode de la PMCA, bien qu'encore en développement, s'avère au moins aussi sensible que le bioessai. Néanmoins elle ne fournit aucune preuve sur l'infectiosité de la PrPsc détectée et s'avère difficile à mettre en oeuvre avec des matrices plasmatiques. En outre il a été rapporté une reproductibilité incertaine et des résultats 20 faussement positifs. Le document WO 2005/022148 décrit une méthode de titrage in vitro, appelée TCIA ("tissue culture infectivity assay"), d'un ATNC dans un produit biologique, au moyen de la mise en contact de cellules transgéniques stables supportant la réplication dudit ATNC avec le produit biologique, puis la culture de ces cellules pendant un ou plusieurs passages pour 25 amplifier la quantité d'ATNC présente dans le produit biologique par réplication de 1ATNC. Plus précisément, le TCIA consiste à mettre en contact des dilutions successives d'un homogénat infectieux (par exemple la souche de tremblante 127-S) avec des cellules en culture sur plaque multi-puits, à raison de 5 puits par dilution. Le nombre de puits positifs est alors évalué par détection de la PrPsc (marqueur indissociable de l'infectiosité) au bout de 8 à 10 passages, et le titre déterminé par la méthode de Spearman - Karber. La reproductibilité des titres obtenus à partir d'un même échantillon infectieux (homogénat de cerveau) montre la faisabilité d'une telle approche. Toutefois, la lignée cellulaire utilisée dans cette méthode de titrage in vitro, la lignée MovS6, est constituée d'une population hétérogène de cellules. A terme, cette hétérogénéité est susceptible d'altérer la stabilité de la lignée et par voie de conséquence la reproductibilité du procédé TCIA.

Il existe donc encore un fort besoin de disposer d'un ou plusieurs clones stables issus de la lignée MovS6 afin d'améliorer la stabilité du procédé TCIA dans le temps.

Résumé de l'invention : L'invention fournit maintenant un nouveau clone cellulaire issu de la lignée MovS6 exprimant une protéine prion PrP et capable de supporter la réplication ou la propagation de la forme pathologique PrPsc de ladite PrP, caractérisé en ce qu'il présente une stabilité de sa production de PrPsc sur une période au moins comprise entre le 6' et le 100èC1e passage, préférentiellement entre le 6ème et le 47ème passage.

Les inventeurs ont en effet en mis en évidence qu'il est possible de disposer de clone répondant fortement à l'infection et montrant une stabilité de production de PrPsc, c'est-à-dire sans variation significative du niveau de production de PrPsc.

De préférence, le lysat cellulaire issu de culture infectée de ce clone, possède, à partir de 6 semaines après l'infection, un titre en marqueur de l'infection supérieur ou égal à 3 logio TCID50 par million de cellules, de préférence supérieur ou égal à 4 logio TCID50 par million de cellules, de préférence supérieur ou égal à 6 logio TCID50 par million de cellules, de préférence supérieur à 7 logio TCID50 par million de cellules.30 Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, le lysat cellulaire d'une culture infectée possède, à partir de 6 semaines un titre en marqueur de l'infection supérieur à 3 logio TCID50/millions de cellules, de préférence compris entre 4,5 logio TCID50 et 6 logio TCID50 par million de cellules.

Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, le lysat cellulaire d'une culture infectée possède, à partir de 6 semaines possède un titre en marqueur de l'infection supérieur à 3 logio TCID50 par million de cellules, de préférence compris entre 4,5 logio TCID50 et 5,5 logio TCID50 par million de cellules.

Dans un autre mode de réalisation, le lysat cellulaire issu de culture infectée de ce clone, possède, à partir de 6 semaines après l'infection, un titre en marqueur de l'infection supérieur ou égal à 2 logio unités Western Blot/million de cellules (uWB/million de cellules), de préférence supérieur ou égal à 3 logio uWB/million de cellules.

De manière particulièrement préférée, le clone cellulaire de l'invention est désigné MovS6-4 dans les résultats expérimentaux exposés ci-dessous, et a été déposé le 22 février 2008 sous le numéro CNCM I-3922 à la Collection Nationale de Cultures des Microorganismes (CNCM, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, F-75724 Paris Cedex 15, FRANCE). 20 L'invention vise également une méthode in vitro de détection et/ou titrage de l'infectiosité d'un agent transmissible non conventionnel (ATNC) dont le marqueur est une protéine de conformation pathologique, dans un échantillon, comportant les étapes consistant â : i) mettre ledit échantillon en contact avec un clone cellulaire tel que décrit ci-dessus, 25 ii) cultiver lesdits clones cellulaires pour amplifier la quantité d'ATNC présente dans ledit échantillon par réplication dudit ATNC, iii) déterminer la présence et/ou la quantité de 1ATNC dans l'échantillon, l'étape ii) de culture étant réalisée pendant un ou plusieurs passages. 10 15 30 Avantageusement, l'étape (iii) comporte les étapes suivantes : a) mettre en contact l'ATNC ainsi amplifié à l'issue de l'étape ii) avec une source de substrat pour la PrP et / ou l'ATNC, b) incuber le milieu réactionnel permettant la transformation du conformère non pathologique de la PrP en conformère pathologique et/ou l'amplification de l'ATNC, c) désagréger les agrégats éventuellement formés lors de l'étape i) ou ii), d) déterminer la présence et/ou la quantité de l'ATNC dans l'échantillon, les étapes (a) à (c) constituant un cycle d'opérations qui est répété au moins deux fois avant l'étape (d). Un autre objet de l'invention est une méthode in vitro d'évaluation et/ou de contrôle d'un procédé d'obtention ou de traitement d'un produit biologique ou d'un matériel susceptible d'être contaminé par un ATNC, méthode dans laquelle on applique audit produit biologique ou matériel, (A) en amont et (B) en aval dudit procédé, une méthode de titrage telle que définie ci-dessus, et en ce que l'on compare les deux valeurs (A) et (B) de titre obtenues.

L'invention vise également une méthode in vitro d'évaluation et/ou de contrôle d'une procédure de décontamination d'un produit biologique ou d'un matériel, méthode dans laquelle on applique audit produit biologique ou matériel, (A) en amont et (B) en aval de ladite procédure, une méthode de titrage telle que définie ci-dessus, et en ce que l'on compare les deux valeurs (A) et (B) de titre obtenues.

Encore un autre objet de l'invention est une méthode in vitro d'évaluation d'un composé susceptible d'inhiber l'infectiosité d'un produit biologique infectieux, méthode dans laquelle on applique audit produit biologique infectieux, (A) en présence et (B) en absence dudit composé à évaluer, une méthode de titrage telle que définie ci-dessus, et en ce que l'on compare les deux valeurs (A) et (B) de titre obtenues.

Encore un autre objet de l'invention est une méthode in vitro de diagnostic d'une encéphalopathie spongiforme transmissible chez un sujet humain ou animal non-humain, comprenant la détection de la présence dans un échantillon biologique dudit sujet, d'un agent transmissible non conventionnel (ATNC) qui est une protéine de conformation pathologique , par la méthode telle que définie ci-dessus.

Le clone cellulaire de l'invention permet la production stable dans le temps et d'un matériel infectieux synthétique et standardisé de type prion, immédiatement disponible puisqu'il a été détecté dans le cytosol (lysat) et dans le surnageant de culture infectée.

Légende de la Figure :

La figure est un autoradiogramme montrant la détection de la PrPsc dans le lysat cellulaire de 13 clones (numérotés de 1 à 13) avec PM : indicateur de poids moléculaire. Description détaillée de l'invention :

Définitions Par lignée MovS6 , on désigne une lignée cellulaire exprimant la protéine prion PrP, 15 provenant d'un isolement de cellules réalisé à partir d'un ganglion de racine dorsale de souris transgénique sur-exprimant le gène de la PrP ovine. La souris transgénique sur-exprimant le gène de la PrP ovine dont provient la lignée cellulaire MovS6 est issue d'un croisement entre une souris tg301 sur-exprimant le gène de la PrP ovine (Vilotte et al. (2001), J. Virol. Vol. 75, p5977-5984) et une souris prp0/0 exprimant l'antigène T (Tag) du 20 SV40 (Schwarz et al. (1991), Bio Cell vol. 73 :7-14). La fabrication de la lignée cellulaire MovS6 est décrite dans le document Archer et al. (2004), J. Virol., p. 482-490. La lignée cellulaire MovS6 est une population hétérogène de cellules, non seulement en terme de propriétés fonctionnelles, mais aussi de propriétés biologiques. En effet, le ganglion de la racine dorsale à partir duquel elle a été isolé réunit des populations 25 cellulaires différentes, notamment des cellules gliales, différents types de neurones, etc.

Dans le cadre de l'invention, l'expression clone cellulaire issu de la lignée MovS6 représente l'ensemble des cellules filles dérivées par divisions cellulaires d'une cellule mère unique appartenant à la lignée MovS6, et possédant un patrimoine génétique identique 30 à celui de la cellule mère. 10 L'isolement des clones peut se faire au moyen d'une technique connue de l'homme du métier, par exemple par dilution limite ou en cytomètre en flux, cette liste n'étant pas limitative.

Une protéine prion PrP est généralement une sialoglycoprotéine ancrée à la membrane plasmique par un phosphatidyl glycolipide (GPI), présente à l'état naturel dans les cellules et impliquée dans leur fonctionnement normal. La forme normale de la protéine, c'est-à-dire non pathologique, est généralement appelée Prpc. Elle est impliquée dans le développement du système nerveux chez l'embryon. Chez l'adulte, elle est exprimée essentiellement dans le cerveau et la moelle épinière (neurones et glie). Elle est impliquée dans les processus de différenciation et d'adhésion des cellules. Elle aurait aussi un rôle protecteur antioxydant et vis-à-vis de la mort cellulaire programmée (apoptose). Cette protéine aurait également un rôle dans le repliement d'autres protéines.

La forme pathologique PrPsc de la PrP désigne généralement un isoforme de la protéine non pathologique et représente le marqueur des maladies à prions. Cette forme pathologique, associée à des propriétés physico-chimiques à la protéine prion qui se traduisent notamment par une plus -grande résistance aux moyens de désinfection et de stérilisation habituels (chaleur, produits chimiques, enzymes, etc). La protéine prion pathologique acquiert ainsi des capacités d'auto-agrégation et peut ainsi former des dépôts, notamment dans le cerveau, provoquant la mort neuronale. L'agent responsable de la réplication ou propagation de la protéine prion pathologique serait la protéine prion pathologique elle-même car capable de se propager ou multiplier de façon exponentielle , en déformant les protéines prion saines en protéines prion pathologique. La forme dite pathologique de la PrP, est donc la forme de la protéine dont la conformation est corrélée à l'apparition d'une EST chez l'animal humain ou non-humain infecté.

Par capable de supporter la réplication ou la propagation de la forme pathologique PrPsc de ladite PrP on désigne la faculté du clone cellulaire de l'invention de produire des protéines prion pathologiques à partir de protéines prion non pathologiques, transformées en protéines pathologiques en présence de l'ATNC. La forme pathologique de la protéine prion produite est détectée dans le cytosol (lysat) ou dans le surnageant de culture. Tout ou partie de cette forme pathologique cytosolique peut être récupérée dans le lysat cellulaire.

Le titre en marqueur de l'infection par un ATNC est déterminé par la dose d'infectiosité dans un échantillon qui permet l'infection dans 50% des essais d'inoculation. La dose d'infectiosité est visualisée par le titre d'un marqueur de l'infection, par exemple la PrP. Le titre en marqueur de l'infection peut être déterminé par la méthode de titrage décrite dans le document WO 04/02179. Le titre en marqueur de l'infection peut également être déterminé par des méthodes bien connues de l'homme du métier. Par exemple, des dilutions sériées du matériel à titrer sont injectées par voie intracérébrale, ceci à raison d'une dilution du matériel par groupe d'animaux. Suivant le temps d'incubation de la maladie dans chaque groupe d'animaux et le nombre d'animaux atteints, on peut en déduire un titre infectieux par des méthodes statistiques connues de l'homme du métier, comme par exemple et de préférence la méthode de Karber ou encore celle de Spearman-Karber.

Par stabilité du titre en marqueur de l'infection on désigne une productivité en agent infectieux (PrPsc) qui ne décline pas significativement au cours du temps, c'est-à-dire qu'aucune perte significative de productivité ne peut être mesurée. Une perte significative est une diminution de la productivité en agent infectieux supérieure ou égale à 1 logio uWB/ml. Un "passage" est généralement le repiquage de tout ou partie des cellules d'une boîte de culture dans une autre boîte contenant du milieu de culture neuf. Chaque passage permet contrôler l'effectif d'une population cellulaire et de lui fournir une quantité de substrat adaptée à son effectif.

Par TCID50 on désigne la dose infectieuse qui entraine l'infection de 50% des inoculations testées. Ces doses sont mesurées préférentiellement au moyen du procédé TCIA.

Par uWB (Unité Western-blot) on désigne une quantité de PrPsc détectable par Westernblot. Généralement, il existe une différence de sensibilité entre les méthodes de titrage par Western-blot et par TCIA. Compte-tenu de cette différence, un titre en marqueur de l'infection supérieur ou égal à 2 logio unités Western Blot/million de cellules (uWB/million de cellules), de préférence supérieur ou égal à 3 logio uWB/million de cellules est équivalent à un titre en infectiosité supérieur ou égal 3.5 log l O, de préférence supérieur ou égal à 5 logio TCID50/ml

Dans le cadre de l'invention, le terme "ATNC" représente tout agent transmissible non conventionnel, tels que ceux responsables chez l'être humain de la MCJ familiale ou sporadique, de la maladie du Kuru ou du variant MCJ, ou bien encore ceux responsables chez les animaux d'EST naturelles, telles que la tremblante ovine, l'encéphalopathie spongiforme bovine ou féline, le dépérissement chronique des cervidés ou l'encéphalopathie spongiforme du vison, ou enfin de souches d'EST expérimentalement adaptées à l'animal de laboratoire. Dans le contexte de l'invention, 1'ATNC est également désigné par le terme agent infectieux . Par échantillon , on désigne toute source de matière susceptible d'être contaminée par un ATNC. Une telle source de matière peut par exemple être un liquide, un produit alimentaire, une boisson, un produit cosmétique ou un produit issu du génie génétique, une molécule susceptible de moduler l'infectiosité d'un ATNC, cette liste n'étant pas limitative. De préférence il s'agit d'un échantillon biologique, par exemple un liquide biologique ou un tissu ou extrait de tissu. Un tel tissu peut être un tissu du cerveau, de colonne vertébrale, ou tissu tonscillaire, cette liste n'étant pas limitative. L'échantillon peut également être une composition dérivée d'une source humaine ou animale, comme les hormones de croissance ou les extraits cellulaires, comme les extraits pituitaires. Une telle composition peut en effet être contaminée par un ATNC. Dans le cas d'un liquide biologique, celui-ci peut être le sang, la lymphe, l'urine ou le lait, cette liste n'étant pas limitative. De manière préférentielle, l'échantillon est un produit sanguin ou un dérivé, par exemple un dérivé plasmatique ou un concentré de protéine plasmatique. Le clone cellulaire de l'invention peut avantageusement être mis en oeuvre dans une méthode in vitro de détection et/ou de titrage de l'infectiosité d'un agent transmissible non conventionnel (ATNC) dont le marqueur est une protéine de conformation pathologique, dans un échantillon.

Mise en contact du clone cellulaire avec l'échantillon à tester : Le clone cellulaire de l'invention est mis en contact avec l'échantillon susceptible d'être infecté par un ATNC à tester, ou avec un matériel infectieux contenant 1'ATNC en tant que matériel de référence, par exemple des extraits de cerveaux d'animaux infectés par un ATNC, tels qu'un prion d'ovin. La mise en contact est réalisée selon des méthodes connues de l'homme du métier (voir WO/2005/022148 ou aussi par exemple Archer et al. Journal of Virology, Jan. 2004, p. 482-490), Le clone cellulaire est ensuite cultivé pendant un ou plusieurs passages pour permettre à 1'ATNC de se répliquer ou se propager. De manière avantageuse, le clone cellulaire peut être mis en contact avec au moins une dilution de l'échantillon susceptible d'être infecté par 1'ATNC dans une solution aqueuse biologiquement acceptable, en particulier avec plusieurs dilutions, tout particulièrement avec des dilutions sériées ou successives. Ces dilutions permettent d'affiner la quantification de l'infectiosité dans l'échantillon testé. Plusieurs réplicats de clones peuvent être mis en contact avec la même dilution du produit 25 biologique, afin de permettre une résolution statistique plus fine des résultats.

Culture des clones cellulaires (étape ii)) : L'étape de culture des clones cellulaires potentiellement infectés par le produit biologique, selon toute technique connue de l'homme du métier, est requise pour la réplication de l'ATNC, donc pour amplifier une quantité d'ATNC insuffisante initialement pour être détectée. Dans un exemple de réalisation, l'étape ii) de culture des clones cellulaires effectuée pour amplifier la quantité d'ATNC présente dans ledit échantillon biologique par réplication de l'ATNC, est réalisée en milieu DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) + Ham-F12 (Life Technologies, Cergy Pontoise, France) (4 :1) complémenté en glutamine et sérum de veau foetal (5% final). Les cellules sont incubées à 37°C sous 5% de CO2. Un passage des cellules (avec un taux de réensemencement (split ratio) de : 1 pour 10, soit 1 cellule sur 10 remise en culture) est réalisé chaque semaine. Le produit résultant de la mise en culture des clones cellulaires contient la PrP sous sa forme pathologique, dont la quantité est supérieure à la quantité initialement présente dans l'échantillon biologique, si celui-ci en contient. La PrP sous sa forme pathologique et l'ATNC s'accumulent au sein des cellules infectées, puis sont excrétés dans le milieu de culture ou exposés à la surface des cellules. L'étape ii) de culture peut être réalisée pendant un ou plusieurs passages, par exemple entre 2 et 10 passages, de préférence entre 4 et 10 passages.

Détermination de la présence et/ou de la quantité de prion ou d'ATNC (étape iii)) : Le procédé peut comprendre directement une étape de détermination de la présence et/ou de la quantité de prion ou d'ATNC (étape iii)), ou être couplé à une mise en contact avec une source de substrat pour la PrP et/ou l'ATNC. 12 Mise en contact avec une source de substrat pour la PrP et/ou l'ATNC (étape a)) :

L'étape ii) de la méthode de l'invention peut être suivie de la mise en contact du produit résultant de la mise en culture des cellules avec une source de substrat pour le conformère non-pathologique de la PrP et / ou l'ATNC amplifiés durant l'étape ii).

Cette source de substrat peut être apportée par exemple sous la forme d'un produit d'origine animale, par exemple un homogénat de cerveau sain, ou encore de matériel issu de culture in vitro. Ce matériel peut être par exemple issu de cellules, telles que MovS, N2A (Weissmann et al. (2003), PNAS vol.100 n°20 p1666-11671), Rov par exemple, ou encore des levures, des mycètes, ou des bactéries, cette liste n'étant pas limitative. Ce matériel issu de culture in vitro peut être exprimé dans divers compartiments cellulaires, comme le compartiment extracellulaire (par exemple le surnageant, les exosomes, cette liste n'étant pas limitative) et/ou des compartiments membranaires et/ou cytosoliques (lysat de cellules par exemple). Cette étape a pour fonction de permettre l'amplification in vitro la PrPsc et / ou de l'ATNC récolté au cours de l'étape ii) s'accompagnant de la conversion de la forme non-pathologique de la PrP (contenue dans le substrat) en forme pathologique, une autoconversion de la forme non-pathologique étant théoriquement impossible. La PrP sous sa forme pathologique initie ainsi la transformation de la forme non-pathologique en forme pathologique.

En fin de réaction de conversion, la forme non-pathologique non convertie n'est pas détectée par le système de détection, comme il sera expliqué plus loin.

Incubation du milieu réactionnel et/ou amplification de l'ATNC (étape b)) Dans un mode de réalisation préféré, l'étape (a) est suivie d'une incubation du produit de la culture cellulaire de l'étape (ii) avec une source de substrat pour la PrP et / ou de l'ATNC pendant une durée suffisante pour permettre à au moins une partie des protéines possédant une forme non pathologique, d'être transformée en une forme pathologique de la protéine, et à l'ATNC de s'amplifier. De préférence, chaque étape d'incubation est effectuée pendant une durée comprise entre 10 secondes et 4 heures, préférentiellement entre 20 minutes et 1 heure, et de manière particulièrement préférée pendant 30 minutes. Le milieu d'amplification est avantageusement constitué d'un tampon (PBS lx), NaCl 150mM, Triton 1%) additionné de substrat de PrP non pathologique (par exemple d'un volume 10 fois supérieur au volume de l'échantillon à amplifier). Séparation des agrégats : Il s'avère que les protéines converties en formes pathologiques (type PrPs°) peuvent s'agréger entre elles et aux autres particules de forme pathologique (PrPs°), empêchant la conversion d'autres protéines de forme non pathologique en forme pathologique. Ceci est un inconvénient car la méthode pourrait ainsi être ralentie par le faible nombre de foyers de conversion présents dans le milieu réactionnel. Ainsi, l'étape c) de la méthode de l'invention consiste en la désagrégation des agrégats éventuellement formés lors des étapes précédentes, de manière à libérer les particules de PrP de forme pathologique pour que celles-ci puissent convertir d'autres protéines non pathologiques. De nombreuses méthodes peuvent être utilisées pour désagréger les agrégats durant l'étape c) de la méthode de l'invention. On peut citer à titre d'exemple le traitement avec un solvant (comme le dodecyl sulfate de sodium, le dimethylsulfoxide, l'acétonitrile, la guanidine, l'urée, le trifluoroéthanol, l'acide trifuroacétique dilué, l'acide formique dilué, cette liste n'étant pas limitative), la modification des caractéristiques physico-chimiques de la solution, telles que le pH, la température, la force ionique, la constante diélectrique, ainsi que les méthodes physiques, comme la sonication, l'irradiation au laser, la congélation/décongélation, l'incubation en autoclave, la haute pression, l'homogénéisation douce, ou encore d'autres sources d'irradiation, cette liste n'étant pas limitative. Préférentiellement, on utilise la sonication. La sonication est une méthode connue de l'homme du métier, et souvent mise en oeuvre dans les méthodes de purification de la PrP" en permettant d'augmenter la solubilité des agrégats. La désagrégation est mise en oeuvre pendant un temps suffisant pour permettre à au moins une partie des agrégats formés pendant la mise en contact de l'étape iii) et l'incubation /amplification. Il est possible que tous les agrégats ne soient pas désagrégés lors de la mise en oeuvre d'une seule étape de désagrégation. Dans ce cas, la concentration de protéines pathologiques augmente au fur et à mesure des étapes de désagrégation. La durée de l'étape de désagrégation est aisément déterminable par l'homme du métier, et elle peut dépendre de la méthode de désagrégation choisie. De manière préférentielle, la durée de l'étape de désagrégation est comprise entre 1 seconde et 60 minutes, plus préférentiellement entre 5 secondes et 30 minutes, et plus particulièrement entre 5 secondes et 30 secondes. Avantageusement, les étapes a) à c) sont répétées au moins 2 fois, préférentiellement entre 5 et 100 fois, de préférence entre 20 et 60 fois.

Ce cycle d'étapes iii) à v) répétés entre 2 et 100 fois constitue une série de cycle d'amplifications. Une série peut également être répétée plusieurs fois. Dans ce cas, la nouvelle série sera initiée à partir d'un volume de la série précédente à la place de l'échantillon d'ATNC initial. Détection des protéines : L'étape d) de détection des protéines pathologiques de PrP peut être effectuée par toute méthode connue de l'homme du métier. La détection spécifique de la PrPsc peut être réalisée par une première étape de séparation des deux isoformes PrPc et PrPsc. Cette séparation est effectuée sur la base de propriétés biochimiques de la PrPsc qui permettent de la distinguer des protéines non pathologiques, en particulier le fait que la PrPsc est résistante aux traitements à base de protéases et est moins soluble voire insoluble même en présence de détergents. Ainsi, la première étape après l'amplification est de préférence la séparation de la PrPc (forme normale soluble non pathologique de la PrP) de l'échantillon, qui peut être effectuée par exemple au moyen de traitement par protéase, par exemple la protéinase K, ou par centrifugation pour séparer les formes solubles (PrPc) des formes insolubles (PrPsc). Dans un mode de réalisation particulier, la digestion par la protéinase K (PK) est une étape préalable au Western Blot, car elle conduit à la digestion principalement la PrPc et pas ou peu de la PrPsc. C'est en effet une propriété de la PrPsc que d'être davantage résistante à la PK comparativement à la PrPc. L'étape de détection ultérieure ne détecte donc plus la forme non pathologique de la protéine car celle-ci a été digérée par la protéase. L'étape de détection peut être effectuée à l'aide des méthodes suivantes : immunocytochimie (par exemple par marquage des cellules ou Facscan) ou immunochimie (comme le Western-blot ou un test ELISA), procédé d'immunoblot après une étape de SDS-PAGE, test de radioactivité, test de fluoresence, microscopie électronique, et test de turbidimétrie pour détecter les agrégats, ainsi que des tests structurels incluant la RMN (résonance magnétique nucléaire), le dichroïsme circulaire, la spectroscopie de Raman, l'absorption UV, un anticorps monoclonal reconnaissant la forme pathologique de la protéine, cette liste n'étant pas limitative.

Il est également possible de détecter la forme pathologique des protéines au moyen d'un anticorps reconnaissant spécifiquement la forme pathologique et pas la forme non pathologique. Pour rendre sa détection plus aisé, cet anticorps peut être lui-même marqué pour en rendre la détection plus aisée. Un tel anticorps peut être par exemple l'anticorps 15B3 (Korth et al., 1997, Nature 1997 Nov6, 390 (6655) : 74-7). L'utilisation d'un tel anticorps est pertinent pour détecter par cytométrie de flux la protéine prion présente sur la surface des cellules infectées vivantes Titrage des A TNC : La détection de la forme pathologique de la PrP peut être associée à une détermination de la quantité de PrPsc présent dans l'échantillon. Le titrage peut être effectué au moyen de toute méthode de titrage connue de l'homme du métier. En particulier il peut être effectué sur le modèle des méthodes décrites dans les documents WO2005022148 et WO2006117483 (notamment les exemples de référence A et B). L'ensemble des résultats de Western-blot pour les différentes dilutions et les différents réplicats peut être analysé par une méthode statistique connue de l'homme du métier permettant d'établir un titre infectieux, comme par exemple la méthode de Spearman Karber (Schmidt N.J., Emmous R.W., Diagnostic Procedures for viral, ricketsial and chlaveydial Infection, 1989, 6ème Edition). Dans un mode de réalisation de l'invention, la méthode de calcul du titre est la méthode de Spearman û Karber. Cette méthode suppose la dilution de l'échantillon à tester selon une progression géométrique, c'est-à-dire de raison constante entre les dilutions successives, et un ensemencement d'un volume constant (en général 0,150 ml) de chaque dilution dans cinq puits au moins. Le facteur de dilution le plus couramment utilisé est le facteur décimal. Pour que la formule de Spearman-Karber soit applicable, il est nécessaire d'utiliser un nombre constant de puits ensemencés à l'aide de chaque dilution, un facteur de dilution constant et une gamme de dilutions suffisamment large pour encadrer à la fois les dilutions de part et d'autres desquelles cent pour cent des puits donneront une réaction positive, et les dilutions de part et d'autre desquelles cent pour cent des puits donneront une réaction négative. Si une ou plusieurs de ces conditions ne sont pas satisfaites, on suppose parfois que pour un facteur de dilution constant, la dilution supérieure ou inférieure venant après la dernière effectuée aurait donné le résultat souhaité. Une telle "fabrication" de données ne repose sur 17 aucun fondement théorique, mais si elle est appliquée avec suffisamment de prudence, elle n'est pas dangereuse. Cependant, il est préférable de répéter le titrage avec une gamme plus appropriée de dilutions, ce qui est indispensable s'il y a de graves lacunes dans les données. Selon la formule de Spearman-Karber: Logio dose médiane = (Xo) - (d/2) + dS (r;/n;) où: Xo= logio de la valeur réciproque de la dilution la plus basse à laquelle tous les inoculums d'épreuve sont positifs. d= log10 du facteur de dilution, dit aussi pas de dilution (c'est-à-dire la différence entre les intervalles des logarithmes de dilution). n nombre d'inoculums d'épreuve utilisés à chaque dilution . R;= nombre d'inoculums positifs d'épreuve (sur ni). S (r;/n;) =S (P) = somme de la proportion d'épreuves positives commençant à la dilution la plus basse et donnant cent pour cent de résultats positifs.

La sommation commence à la dilution Xo. L'écart-type estimatif est calculé à l'aide de la formule suivante: Log écart-type = d*I (E(p*(1-p)/(ni-1))) Avec p = r;/n; = proportion d'épreuves positives (c'est-à-dire de cupules d'inoculum présentant une réaction) à chaque dilution.

La méthode de l'invention permet de quantifier l'infectiosité liée aux ATNC sur une gamme de 4 log, c'est-à-dire de 10000 unités infectieuses in vitro. Ceci peut, par exemple, permettre de satisfaire aux critères de validation de l'efficacité des procédés d'obtention de produits biologiques vis-à-vis de l'élimination des ATNC. Applications de la méthode de détection ou titrage de l'infectiosité liée aux ATNC : L'invention concerne également l'application de la méthode de titrage selon l'invention à une méthode d'évaluation et/ou de contrôle in vitro d'un procédé d'obtention ou de traitement d'un produit biologique susceptible d'être contaminé par un ATNC. Cette méthode d'évaluation et/ou de contrôle est caractérisée en ce qu'on applique au produit biologique, en amont et en aval dudit procédé, une méthode de titrage selon l'invention, telle que décrite précédemment, et en ce que l'on compare les deux valeurs de titre obtenues. Par comparaison entre les deux mesures, on détermine le degré d'élimination ou le facteur de réduction de dATNC. En particulier, la méthode de titrage selon l'invention a la capacité d'être aisément applicable à tout type de procédé d'obtention ou de purification de produits biologiques, en particulier de produits sanguins, tels que les dérivés de plasma sanguins, utilisant par exemple les chromatographies ou la nanofiltration, en particulier les chromatographies décrites dans les documents EP 0 3 59 593 et WO 02/092632. Ainsi, la mise en oeuvre de la méthode de l'invention permet d'évaluer et/ou de contrôler l'efficacité d'un procédé (ou d'une partie d'un procédé) d'obtention ou de traitement, voire de purification, de tout produit biologique, susceptible d'être contaminé par un ATNC, dans l'élimination de cet ATNC, grâce à un titrage utilisant des lignées cellulaires transgéniques spécifiques, favorisant la réplication de dATNC, mises en contact avec un matériel infectieux ou potentiellement infectieux contenant dATNC à tester. On mesure les quantités d'ATNC en amont et en aval du procédé (ou de la partie du procédé) dont on veut apprécier l'efficacité à l'égard de dATNC. Par comparaison des deux mesures, on détermine le degré d'élimination de l'agent pathogène. Ainsi, la mise en oeuvre de la présente méthode peut être effectuée au cours d'un procédé d'obtention d'un produit biologique ou dans le cadre d'un traitement d'élimination de dATNC suivant l'obtention du produit biologique.

L'invention concerne également l'application de la méthode de titrage selon l'invention à une méthode d'évaluation et/ou de contrôle in vitro d'une procédure de décontamination d'un matériel. Dans ce cas, on détermine le titre en ATNC d'un produit biologique contenant un ATNC au moyen de la méthode de titrage selon l'invention. On met ensuite en contact ce produit biologique infecté avec le matériel à décontaminer puis on applique la procédure de décontamination à ce matériel. Enfin, on détermine à nouveau le titre du produit biologique ayant subi la procédure de décontamination. Les deux mesures de titre effectuées en amont et en aval de la procédure de décontamination sont comparées pour évaluer l'efficacité de la procédure de décontamination. Le matériel peut, par exemple, être un matériel de purification, en particulier une colonne de chromatographie, ou encore être la sanitisation d'une colonne de chromatographie à l'aide de soude. L'invention concerne également l'application de la méthode de titrage selon l'invention à une procédure de sélection et/ou méthode d'évaluation d'un composé permettant de réduire le titre du matériel infectieux. Dans ce cas, on détermine le titre en ATNC d'un produit biologique contenant un ATNC au moyen de la méthode de titrage selon l'invention. On met ensuite en contact ce produit biologique infecté avec le composé à tester puis on détermine à nouveau le titre du produit biologique ayant subi la procédure de décontamination. Les deux mesures de titre effectuées en amont et en aval de la mise en contact de l'échantillon avec le composé à tester sont comparées.

L'invention concerne également l'application de la méthode de titrage selon l'invention à une procédure de sélection et/ou méthode d'évaluation d'un composé susceptible de moduler l'infectiosité d'un ATNC. Dans ce cas, on détermine le titre en ATNC d'un produit biologique contenant un ATNC, en présence puis en absence du composé à évaluer, au moyen de la méthode de titrage selon l'invention. Les modalités de la mise en présence du composé sont déterminées selon que l'action du composé prévient l'initiation d'un cycle infectieux ou bloque un cycle infectieux déjà initié. Dans tous les cas, on détermine le titre du produit biologique avec et sans traitement avec le produit à tester. Les deux mesures de titre effectuées sont comparées pour évaluer l'activité modulatrice de l'infectiosité d'un ATNC du composé.

L'invention concerne également l'application de la méthode de titrage selon l'invention à une méthode d'identification d'un composé permettant de moduler la transformation de la forme non-pathologique en la forme pathologique de 1'ATNC, par exemple la transformation de PrP en PrP". Dans ce cas, on détermine le titre en ATNC d'un produit biologique contenant un ATNC au moyen de la méthode de titrage selon l'invention. On met ensuite en contact ce produit biologique infecté avec le composé à tester puis on applique la méthode de titrage de l'invention afin de déterminer à nouveau le titre du produit biologique. Les deux mesures de titre effectuées en amont et en aval de la mise en contact avec le composé sont comparées pour évaluer l'efficacité du composé à tester.

Matériel infectieux et standardisé de type prion produit par le clone cellulaire Le lysat cellulaire ou surnageant de culture produit par le clone cellulaire de l'invention peut être standardisé en unités infectieuses par dose par des méthodes connues de l'homme du métier. Des stocks de lysat cellulaire infectés peuvent par exemple être préparés pour contenir 3 logio TCID50 par millilitre. La disponibilité de stocks standardisés permet alors la stricte comparaison de résultats d'essais distincts. En outre, il peut être stabilisé par congélation, séchage, lyophilisation, atomisation, en présence éventuellement de substances connues de l'homme du métier et destinées a éviter une perte du titre infectieux selon le mode de stabilisation mis en oeuvre. Avantageusement, ce lysat cellulaire ou surnageant de culture peut être utilisé en tant qu'inoculum infectant pour une méthode d'évaluation et/ou de contrôle d'un procédé d'obtention ou de traitement d'un produit biologique susceptible d'être contaminé par un ATNC, en particulier un procédé de purification de dérivés du plasma sanguin, en particulier encore les chromatographies ou la nanofiltration. Avantageusement, ce lysat cellulaire ou surnageant de culture peut être utilisé en tant 25 qu'inoculum infectant pour une méthode d'évaluation et/ou de contrôle d'une procédure de décontamination d'un matériel susceptible d'être contaminé par un ATNC.

Avantageusement, ce lysat cellulaire ou surnageant de culture peut être utilisé en tant qu'inoculum infectant pour une méthode d'évaluation d'un compose inhibant l'infectiosité d'un ATNC. Avantageusement, le matériel infectieux (c'est-à-dire l'inoculum préparé à partir du clone cellulaire de l'invention) permet de s'affranchir de l'utilisation de collections de cerveaux ovins ou bovins infectés par la Tremblante du Mouton ou l'Encéphalopathie Spongiforme Bovine. Le matériel infectieux peut être utilisé en tant qu'inoculum infectant dans une méthode d'évaluation et/ou de contrôle in vitro d'une procédure de décontamination d'un matériel.

Le matériel peut, par exemple, être un matériel de purification, en particulier une colonne de chromatographie. La procédure de décontamination peut, par exemple, être la sanitisation d'une colonne de chromatographie l'aide de soude. L'invention concerne également l'utilisation du matériel infectieux en tant qu'inoculum infectant pour une méthode d'évaluation d'un compose modulant l'infectiosité d'un ATNC. Dans ce cas, la capacité modulatrice de l'infectiosité d'un ATNC, selon l'invention est testée en présence ou non du composé susceptible de moduler cette infectiosité l'infectiosité d'un ATNC. L'invention concerne également l'utilisation du matériel infectieux en tant qu'inoculum 20 infectant pour une méthode d'évaluation et/ou de contrôle d'une procédure de confinement de matériel infectieux, en particulier une procédure et un équipement de type P3. La méthode de l'invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui ne limite pas la portée de l'invention. 25 EXEMPLES :

Matériels et Méthodes 1 ° Cellules et matériel infectieux : Les cellules MovS6 (Archer F. et al. 2004) ont été sélectionnées comme cellules supportant la réplication des ATNC, et la souche de Scrapie 127-S adaptée aux souris transgéniques Tg301 a été utilisée comme source d'infectiosité naturelle (Vilotte JL et al. 2001). Les cellules étaient cultivées en milieu DMEM / Ham F-12 (3 :1) complémenté en glutamine (2mM final) et sérum de veau foetal (5% final).

La source d'infectiosité initiale consistait en un homogénat de cerveaux de souris infectées à 200 mg / ml (lot : LN-3326 au titre de 6.17 logio uWB/ml).

2° Culture : Les cellules MovS6 ont été mises en culture pour constituer après 15 jours d'incubation 2 banques primaires (codées : LC-19 et LC-21). Un aliquot de LC-19 a été décongelé et mis en culture pendant 3 passages pour permettre de constituer 3 banques secondaires, codées : LC-46, LC-47 et LC-48. Un aliquot de LC-46 a été décongelé et mis en culture pendant 2 passages pour constituer une banque tertiaire codée LC-59. 3° Comparaison de Titrage in vitro d'un échantillon de référence avec 2 lots de cellules MovS6 : Un aliquot des cellules lot LC-46 et LC-59 a été décongelé et entretenu en parallèle pendant 2 passages. Avec chacun de ces lots de cellules, des plaques de titrages au format 24 puits (2cm2/puit) ont alors été ensemencées en parallèle à raison de 100 000 cellules par puits.

Après 24 heures d'incubation, des dilutions sériées de l'homogénat de cerveaux de souris LN-3326 étaient préparées avec du milieu de culture et suivant un pas de dilution de 10 en 10 (de 10.1 à 10-8). Pour chaque dilution de l'inoculum, 5 puits de chacun des lots de cellules étaient infectés. Les cellules étaient mises en contact avec 150 gl des différentes dilutions de l'inoculum durant 24 heures, puis 1 ml de milieu de culture neuf était ajouté. Les cellules étaient 23 maintenues en culture 72 heures supplémentaires, jusqu'au premier passage où la totalité des cellules était re-ensemencée dans des puits de 10cm2 (format de plaque 6 puits). Lors de la poursuite des cultures cellulaires, le milieu de culture était changé une fois par semaine et les cellules repiquées avec un ratio de 1 sur 10. Les cellules non re- ensemmencées étaient conservées à -80°C sous forme de culot sec. Ces culots cellulaires conservés à chaque passage, permettaient de rechercher la PrPsc produite par les cellules. La détection de la PrPsc produite était réalisée directement par Western-blot

4° Détection de la PrPsc dans les cellules : Les échantillons de culots cellulaires étaient décongelés et repris dans 60gl de PBS. Les cellules étaient lysées par sonication pendant 15" à l'aide d'un bain à sonication (puissance:15W). 20 1 de lysat cellulaire soniqué étaient prélevés pour être traités par la Protéinase K. Le produit de la digestion était dénaturé puis analysé par électrophorèse en gel de poly-acrylamide en conditions dénaturantes (SDS-PAGE). Les protéines ayant migrées dans le gel étaient transférées sur une membrane PVDF par électrotransfert. La PrPsc présente sur les membranes était détectée par incubation avec l'anticorps 6H4 (Prionics) puis un anticorps secondaire marqué à la phosphatase alcaline (anticorps de chèvre anti-anticorps de souris ). Les membranes marquées étaient révélées par chemiluminescence. Un échantillon était considéré comme positif si le profil électrophorétique avec les trois formes de PrPsc glycosylée était visible sur les autoradiogrammes. Compte tenu des dilutions de l'échantillon dans les différents réactifs nécessaires au Western-blot, le volume d'échantillon effectivement déposé dans la piste du gel était de 4,35 l.

Pour chaque analyse par Western Blot, des témoins négatifs (cellules MovS6 non infectées) étaient traités en parallèle des échantillons. A chacun des passages cellulaires, l'ensemble des puits de plaques de culture était testé. Lorsque l'ensemble des réplicats de cultures cellulaires inoculées avec une dilution donnée de l'inoculum était retrouvé positif pour la PrPsc lors de deux passages successifs, ces cultures n'étaient plus testées lors des passages suivants.30 5° Reproductibilité d'un Titrage in vitro : Pour évaluer la reproductibilité du système de tirage in vitro, le titrage de l'échantillon de référence LN-3326 a été reproduit 2 autres fois avec pour chaque titrage un nouvel aliquot du lot de cellule LC-46. Les titrages étaient réalisés comme décrit ci-dessus. 6° Stabilité de la production de PrPsc par la cellule MovS6 (lot LC-46) infectée : Afin d'évaluer la stabilité de la production de PrPsc par des cellules MovS6 infectées, 5.105 cellules (lot LC-46) âgées de 4 passages après leur décongélation, ont été ensemencées sous 10ml de milieu de culture en flask de25cm2 et inoculée par une charge en PrPsc de 2.2logiouWB, soit avec une multiplicité d'infection (MOI) de 1:3100. La culture infectée a été maintenue pendant 23 passages avec chaque semaine un passage réalisé suivant un split ratio de 1:10. A chaque passage, à partir des cellules non ré-ensemencées, un aliquot de 3.106 cellules était conservé à -80°C sous forme d'un culot sec pour permettre d'effectuer en fin d'essai un titrage par Western-blot de la PrPsc dans les lysats cellulaires récoltés à différents passage. La PrPsc était dosée par dilution limite de l'aliquot et analyse par Western-blot comme décrit au paragraphe 4°. La première dilution de l'échantillon ne présentant plus de signaux spécifiques de la PrPsc était considérée comme contenant 1 unité Western Blot. Le titre de l'échantillon était alors calculé comme l'inverse de la dilution limite, en prenant en compte le volume de l'aliquot effectivement déposé sur le gel d'électrophorèse. Ainsi 3.106 cellules repris dans 60gl de PBS correspondait à 3.106cell/0.06m1 soit 50.106cell./ml. Dans les conditions d'analyse par Western Blot (WB) décrites au paragraphe 4, le signal observé sur la piste correspondant à l'échantillon non dilué dans la gamme de dilution, provenait de 4,35 1 de suspension de culot cellulaire repris en PBS et non diluée soit de 0,22.106 cellules. A titre d'exemple si la première dilution à laquelle le signal n'était plus détecté correspond à la dilution 1/81ème, le titre en PrPsc dans le culot cellulaire était de 81 uWB/4,35 1 soit 81x1000/4.35 = 18620 uWB/ml soit exprimé en logarithme décimal 4,27 logio Uwb/ml, ou encore 81/0.22 uWB/million de cellules, soit 368 uWB/million de cellules soit exprimé en logarithme décimal 2,57 logio uWB/million de cellules.30 Résultats Les résultats des titrages de l'homogénat de cerveaux de référence (lot LN-3326) avec chacun des lots de cellules MovS6 (LC-46 et LC-59) sont résumés dans les tableaux 1 et 2.

Tableau n°l. Titrage de l'homogénat de cerveaux de souris infectées de référence (LN-3326) avec le lot de cellule LC-59. Passage Nombre de cultures infectées selon la dilution inoculée Titre n° (log TCID50/ml ) (puits / puits inoculés) infectés 10.1 10.2 10.3 10-4 10-5 Témoin nég. 1 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 < 0.3 2 NT 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 <2.3 3 5/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 2.3 4 5/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 2.3 5 NT 5/5 0/5 0/5 0/5 0/5 3.3 6 NT 5/5 0/5 0/5 0/5 0/5 3.3 7 NT 5/5 0/5 0/5 0/5 0/5 3.3 NT : Non testé Tableau n°2. Titrage de l'homogénat de cerveaux de souris infectées de référence (LN-3326) avec le lot de cellule LC-46. Nombre de cultures infectées selon la dilution inoculée Titre Passage (puits / puits inoculés) (log TCID50/ml ) n° infectés 10.2 10-3 10-4 10-5 10-6 Témoin nég. 1 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0 2 5/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 3,3 3 5/5 3/5 0/5 0/5 0/5 0/5 3.9 4 5/5 5/5 4/5 0/5 0/5 0/5 5.1 NT 5/5 5/5 5/5 0/5 0/5 6.3 6 NT NT 5/5 5/5 0/5 0/5 6.3 7 NT NT 5/5 5/5 0/5 0/5 6.3 NT : Non testé Les résultats du titrage répété de l'échantillon de référence LN-3326 sont résumés dans les 5 tableaux 3 et 4 ci-dessous :

Tableau n°3. Répétition du Titrage de l'homogénat de cerveaux de souris infectées de référence (LN-3326) avec le lot de cellule LC-46 Passage Nombre de cultures infectées selon la dilution inoculée Titre n° (logio TCID50/ml ) (puits infectés / puits inoculés) 2 10 3 10 4 10 5 10 6 10 7 Tém. nég. 1 2/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 2.7 2 5/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 3.3 3 5/5 5/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 4.3 4 5/5 5/5 5/5 0/5 0/5 0/5 0/5 5.3 5 NT 5/5 5/5 0/5 0/5 0/5 0/5 5.3 6 NT 5/5 5/5 3/5 1/5 0/5 0/5 6.1 7 NT 5/5 5/5 3/5 2/5 0/5 0/5 6.3 8 NT 5/5 5/5 4/5 2/5 0/5 0/5 6.5 9 NT NT 5/5 4/5 2/5 0/5 0/5 6.5 NT : Non testé

Tableau n°4. Répétition du Titrage de l'homogénat de cerveaux de souris infectées de référence (LN-3326) avec le lot de cellule LC-46 Passage Nombre de cultures infectées selon la dilution inoculée Titre n° (logio (puits infectés / puits inoculés) 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10' Tém. nég. TCID50/ml ) 3 5/5 5/5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5 4.3 4 5/5 5/5 3/5 0/5 0/5 0/5 0/5 4.9 NT 5/5 5/5 0/5 0/5 0/5 0/5 5.3 6 NT 5/5 5/5 3/5 1/5 0/5 0/5 6.1 7 NT 5/5 5/5 4/5 1/5 0/5 0/5 6.3 8 NT 5/5 5/5 4/5 1/5 0/5 0/5 6.3 5 NT : Non testé

Au cours de chacun de ces essais de titrage, aucune trace d'infectiosité n'a été observée dans aucun des 5 réplicats de cellules inoculées avec l'échantillon d'homogénat de cerveau non infecté (Témoin Nég.). Inversement une production de PrPsc croissante était observée avec les cellules inoculées avec l'échantillon de référence LN-3326. Ces résultats confirment que le système de titrage in vitro permet de mettre en évidence une production de PrPsc de novo par des cellules infectées.

L'échantillon d'homogénat de référence LN-3326 lors des répétitions du titrage avec le lot 15 de cellules LC-46 montre un titre infectieux moyen de 6.4 logio TCID50/ml (range 6.3 à 6.5 logio TCID50/ml). L'échantillon d'homogénat de référence LN-3326 lors du titrage avec le lot de cellules LC-59 montre un titre infectieux de 3.3 logio TCID50/ml. Le titre infectieux de l'échantillon de référence, mesuré avec les 2 lots de cellules : LC46 et 20 LC59, montre une différence de 3.1 logio. Cette différence est significative.

Cette différence de titre indique que le titre infectieux est dépendant du lot de cellule MovS6 utilisé pour le titrage in vitro.

7° Stabilité de la production de PrPsc par les cellules MovS6 : La cinétique du titre de la PrPsc mesuré dans une quantité constante de cellules MovS6 inoculées est résumée dans le tableau 5.

Tableau 5 : Titre en PrPsc mesuré dans un lysat de cellules infectées Nbe de Passage (PI) 6 10 12 17 19 20 22 23 Titre en logio 6.2 6.2 5.7 5.7 5.2 5.7 4.75 4.75 (uWB/ml) Légende : PI : post-inoculation Ces données indiquent un titre moyen 5,5 logio uWB/ml. L'écart type (6) est de 0,6 logio uWB/ml. La variation du titre en PrPsc dans le lysat cellulaire au cours du temps, exprimée par l'écart-type est supérieure à la variabilité de la méthode de titrage par Western-blot de 0,5 logio. Ces données indiquent donc une baisse significative du titre dans le lysat des cellules récoltées entre le 6ème passage et le 23èC1e passage après l'inoculation.

8° Sous clonage : Un aliquot de LC-46 a été décongelé et mis en culture pendant 8 jours. A partir de cette culture, un ensemencement de 5 plaques de 96 puits a été réalisé à raison de 0.3 cellule/puit. Après 37 jours de culture, 13 clones ont été isolés et re-ensemencés (split ratio : 100%) sur plaque 24 puits (2cm2/puit). Après 8 jours d'incubation, chacune de ces cultures a été partagée en 2 lots. Le premier a été entretenu en flacon de 25cm2 jusqu'à la constitution d'une pré-banque (LC-82-1 à LC-82-13) et l'autre déposé sur plaque 24 puits pour être infecté comme suit : Chaque culture de clone a été ajustée à 100 000 cellules/puits puis inoculée par une charge identique de PrPsc de 1.9 logio uWB. Ces cultures ont été maintenues durant 6 passages. Au terme de ce délai, les cellules de chaque culture étaient récoltées et ajustées à une concentration de 106 cellules/ml. Ces suspensions cellulaires ont été conservées à -80°C sous forme de culot sec.

8.1° Sélection des clones : Pour évaluer par Western-Blot l'intensité de la réponse à l'infection de chacun des clones, un aliquot de culot sec de chacun des clones a été décongelé, soniqué et analysé par Western-blot. La détection de la PrPsc dans les différents lysats de clone, est figurée sur l'autoradiogramme (Figure). Ces données montrent que la réponse à l'infection de chacun des clones, mesurée 6 semaines après l'inoculation, est hétérogène entre les clones. Les clones MovS6-13 et -10 ne présentent aucun signal spécifique de la PrPsc. Les clones MovS6- 2 û 3 û 5 û 7 û 8 û 9 û 12 présentent un signal spécifique de la PrPsc d'intensité moyenne. Les clones MovS6- 1 û 6 û 11 montrent un signal spécifique de la PrPsc de forte intensité.

Le clone MovS6-4 montre un signal spécifique de la PrPsc de très forte intensité. L'aliquot de cellules non infectées correspondant (LC-82-4) a été décongelé et entretenu en culture pour constituer une banque primaire (LC-91) et de 2 banques secondaires (LC-93 et LC-94). 8.2° Stabilité de la production de PrPsc par les cellules du clone MovS6-4 : Afin d'évaluer la stabilité de la production de PrPsc par des cellules MovS6-4 infectées, 5.105 cellules âgées de 2 passages après leur décongélation, ont été ensemencées sous 10ml de milieu de culture en flask de 25cm' et inoculée par une charge en PrPsc de 3.0 logiouWB, soit avec une multiplicité d'infection (MOI) de 1:500. La culture infectée a été maintenue pendant 37 passages avec chaque semaine un passage réalisé suivant un split ratio de 1:10. A chaque passage, à partir des cellules non ré-ensemencées, un aliquot était conservé à -80°C sous forme d'un culot sec pour permettre d'effectuer en fin d'essai un titrage par Western-blot de la PrPsc dans les lysats cellulaires récoltés à différents passage. Au terme de cet essai la PrPsc dans les lysats était titrée par dilution limite et Western-blot comme décrit au paragraphe 6°. 8.3° Comparaison de Titrage in vitro d'un échantillon de référence avec les cellules MovS6 et MovS6-4 : Un aliquot de cellules MovS6-4 (LC-94) a été décongelé et entretenu pendant 5 passages.

Des plaques de titrages au format 24 puits (2cm2/puit) ont alors été ensemencées à raison de 100 000 cellules par puits. Après 24 heures d'incubation, des dilutions sériées de l'homogénat de cerveaux de souris LN-3326 étaient préparées avec du milieu de culture et suivant un pas de dilution de 10 en 10 (de 104 à 10-8). Pour chaque dilution de l'inoculum, 5 puits de cellules étaient infectés.

Les cellules étaient mises en contact avec 150 ul des différentes dilutions de l'inoculum durant 24 heures, puis 1 ml de milieu de culture neuf était ajouté. Les cellules étaient maintenues en culture 72 heures supplémentaires, jusqu'au premier passage où la totalité des cellules était re-ensemencée dans des puits de 10cm2 (format de plaque 6 puits). Lors de la poursuite des cultures cellulaires, le milieu de culture était changé une fois par semaine et les cellules repiquées avec un ratio de 1 sur 10. Les cellules non reensemmencées étaient conservées à -80°C sous forme de culot sec. Ces culots cellulaires conservés à chaque passage, permettaient de rechercher la PrPsc produite par les cellules. La détection de la PrPsc produite était réalisée directement par Western-blot comme décrit au paragraphe 4° Résultats La cinétique du titre de la PrPsc mesurée dans une quantité constante de cellules MovS6-4 inoculées est résumée dans le tableau 6.

Tableau 6 : Titre (logio) de la PrPsc mesuré dans le lysat de cellules infectées. Passage 6 8 9 10 11 14 17 18 20 23 25 34 36 37 40 47 PI Titre 4.75 4.75 5.2 5.0 4.75 4.3 4.75 4.5 4.3 4.3 4.3 3.8 4.75 4.75 4.3 4.75 (uWB/ml) Ces données indiquent un titre moyen 4.6 logio uWB/ml. L'écart type (6) est de 0.3 logio uWB/ml. La variation du titre en PrPsc dans le lysat cellulaire au cours du temps, exprimée par l'écart-type est inférieure à la variabilité de la méthode de titrage par Western-blot de 0.5 logio. Ces données indiquent donc une stabilité du titre dans le lysat des cellules récoltées entre le 6ème passage et le 47eme passage après l'inoculation. Bien que ces données indiquent un titre mesuré par Western-blot et exprimé en unité Westerne Blot (uWB), on peut considérer que le titre infectieux des cellules infectées (lysats de cellules) est également stable au cours de la période étudiée. Compte tenu de l'écart de sensibilité entre les méthodes de titrage par Western Blot et TCIA, l'infectiosité entre les 6èCe et 47ème passage serait d'environ 6.2logio TCID50/ml.

Les résultats des titrages de l'homogénat de cerveaux de référence (lot LN-3326) avec les différents lots de cellules MovS6 et le clone MovS6-4 est résumé dans les tableaux 6.

Tableau n°6. Titrage de l'homogénat de cerveaux de souris infectées de référence (LN-3326) avec les différents lots de cellules MovS6 (LC-46, LC-59) et la clone MovS6-4 (lot LC-94). Cellule MovS6 MovS6 MovS6-4 Lot LC-59 LC-46 LC-94 TCID50/ml 3.3 logio 6.3 logio 6.5 logio 6.3 logio 4.7 logio L'échantillon d'homogénat de référence LN-3326 lors des répétitions du titrage avec les 20 cellules MovS6 (lot : LC-46) a montré un titre infectieux moyen de 6.4 logio TCIDso/ml (range 6.3 à 6.5 logio TCID50/ml) voir tableaux 3 et 4. L'échantillon d'homogénat de référence LN-3326 lors du titrage avec les cellules MovS6-4 a montré un titre infectieux de 4.7 logio TCID50/ml. Le titre infectieux de l'échantillon de référence, mesuré avec les 2 cellules MovS6 (lot LC-25 46) et MovS6-4, montre une différence de 1.7 logio. Cette différence est significative, elle confirme que le titre infectieux est dépendant de la cellule utilisée pour le titrage in vitro.

Conclusions Au cours de cette étude, 2 lots de cellules de la lignée MovS6, désignés respectivement ; LC-46 et LC-59, ont été utilisés. Ces 2 lots diffèrent par l'âge de leurs cellules à l'inoculation. Le lot LC-46 est âgé 5 passages et d'un seul cycle de congélation /décongélation tandis que le lot LC-59 est âgé de 7 passages et 2 cycles de congélation/décongélation. Les données de titrage de l'échantillon d'homogénat de cerveau de référence (LN-3326) ont montré que le titre infectieux d'un échantillon est dépendant du lot de cellule MovS6 utilisé. Le système de titrage, TCIA (tissue culture infectivity Assay), réalisé avec les cellules les plus âgées (lot : LC-59) se caractérisait en effet par une perte de sensibilité par rapport au système de titrage réalisé avec les cellules moins âgées (lot : LC-46). Par ailleurs les données de cette étude montrent qu'après inoculation des cellules MovS6 (lot LC-46), la production de PrPsc déclinait au cours du temps puisqu'une perte significative de productivité était observée entre le 6' et le 23èC1e passage post- inoculation. Ces 2 observations montrent un effet de l'âge des cellules, exprimé en nombre de passages et de cycles de congélation / décongélation, sur les propriétés biologiques de la lignée MovS6. Cet effet de l'âge consiste en une baisse de la permissivité des cellules à l'infection et une perte de productivité en PrPsc par les cellules infectées.

Les clones MovS6-1 et MovS6-10 ne présentaient aucune production de PrPsc à la 6ème semaine après l'inoculation alors qu'un niveau de production élevé était observé avec le clone MovS6-4.25

Claims (9)

1. Revendications1. Clone cellulaire issu de la lignée MovS6, ledit clone cellulaire exprimant une protéine prion PrP et étant capable de supporter la réplication ou la propagation de la forme pathologique PrPsc de ladite PrP, caractérisé en ce qu'il présente une stabilité du titre en marqueur de l'infection par un agent transmissible non conventionnel (ATNC) sur une période comprise entre le 6ème et le 100èC1e passage.
2. 2. Clone cellulaire selon la revendication 1, caractérisé en ce que le lysat cellulaire ou le surnageant de culture dudit clone cellulaire possède, à partir de 6 semaines après l'infection, un titre en marqueur de l'infection supérieur ou égal à 3 logio TCID50 par million de cellules, de préférence supérieur ou égal à 4 logio TCID50 par million de cellules, de préférence supérieur ou égal à 6 logio TCID50 par million de cellules, de préférence supérieur à 7 logio TCID50 par million de cellules.
3. 3. Clone cellulaire selon l'une quelconque des revendications précédentes, déposé le 22 février 2008 sous le numéro de dépôt CNCM I-3922 à la Collection Nationale de Cultures des Microorganismes.
4. 4. Méthode in vitro de détection et/ou titrage de l'infectiosité d'un agent transmissible non conventionnel (ATNC) dont le marqueur est une protéine de conformation pathologique, dans un échantillon, comportant les étapes consistant â : i) mettre ledit échantillon en contact avec un clone cellulaire tel que décrit dans l'une des revendications 1 à 3, ii) cultiver ledit clone cellulaire pour amplifier la quantité d'ATNC présente dans ledit échantillon par réplication dudit ATNC, iii) déterminer la présence et/ou la quantité de protéine pathologique et / ou d'ATNC dans l'échantillon, l'étape ii) de culture étant réalisée pendant un ou plusieurs passages.30
5. 5. Méthode selon la revendication 4, dans laquelle l'étape (iii) comprend les étapes suivantes: a) mettre en contact 1ATNC ainsi amplifié à l'issue de l'étape ii) avec une source de substrat pour la protéine pathologique et / ou 1ATNC, b) incuber le milieu réactionnel permettant la transformation du conformère non pathologique en conformère pathologique et/ou l'amplification de 1ATNC, c) désagréger les agrégats éventuellement formés lors de l'étape i) ou ii), d) déterminer la présence et/ou la quantité de protéine pathologique et / ou d'ATNC dans l'échantillon, les étapes (a) à (c) constituant un cycle d'opérations qui est répété au moins deux fois avant l'étape (d).
6. 6. Méthode in vitro d'évaluation et/ou de contrôle d'un procédé d'obtention ou de traitement d'un produit biologique ou d'un matériel susceptible d'être contaminé par un ATNC, méthode dans laquelle on applique audit produit biologique ou matériel, (A) en amont et (B) en aval dudit procédé, une méthode de titrage selon l'une quelconque des revendications 4 ou 5, et en ce que l'on compare les deux valeurs (A) et (B) de titre obtenues.
7. 7. Méthode in vitro d'évaluation et/ou de contrôle d'une procédure de décontamination d'un produit biologique ou d'un matériel, méthode dans laquelle on applique audit produit biologique ou matériel, (A) en amont et (B) en aval de ladite procédure, une méthode de titrage selon l'une quelconque des revendications 4 ou 5, et en ce que l'on compare les deux valeurs (A) et (B) de titre obtenues.
8. 8. Méthode in vitro d'évaluation d'un composé susceptible de moduler l'infectiosité d'un produit biologique infectieux, méthode dans laquelle on applique audit produit biologique infectieux, (A) en présence et (B) en absence dudit composé à évaluer, une méthode de titrage selon l'une quelconque des revendications 4 ou 5, et en ce que l'on compare les deux valeurs (A) et (B) de titre obtenues.
9. 9. Méthode in vitro de diagnostic d'une encéphalopathie spongiforme transmissible chez un sujet humain ou animal non-humain, comprenant la détection de la présence dans un échantillon biologique dudit sujet, d'un agent transmissible non conventionnel (ATNC) qui est une protéine de conformation pathologique, par la méthode telle que définie à l'une quelconque des revendications 4 ou 5.