FR3065735A1 - Dispositif de culture microbiologique comprenant un feuillet d'hydrogel polysaccharidique deshydrate - Google Patents

Abstract

La présente invention appartient au domaine de la microbiologie et de la culture de microorganismes. Elle a trait plus spécifiquement aux solutions alternatives proposées aux milieux de culture gélosés traditionnels. Dans ce contexte, elle propose un dispositif de culture microbiologique, comprenant : - une pièce en matériau absorbant ayant une face supérieure au moins sensiblement plane et incorporant dans son épaisseur une composition de milieu de culture déshydratée, - reposant sur ladite pièce en matériau absorbant, un feuillet d'hydrogel polysaccharidique déshydraté et réhydratable à des températures comprises entre 5°C et 40°C ; ledit feuillet d'hydrogel déshydraté étant apposé directement sur la face supérieure de ladite pièce en matériau absorbant, ou indirectement au travers d'une membrane perméable intercalaire.

Description

(54) DISPOSITIF DE CULTURE MICROBIOLOGIQUE COMPRENANT UN FEUILLET D'HYDROGEL POLYSACCHARIDIQUE DESHYDRATE.

©) La présente invention appartient au domaine de la microbiologie et de la culture de microorganismes. Elle a trait plus spécifiquement aux solutions alternatives proposées aux milieux de culture géloses traditionnels. Dans ce contexte, elle propose un dispositif de culture microbiologique, comprenant:

- une pièce en matériau absorbant ayant une face supérieure au moins sensiblement plane et incorporant dans son épaisseur une composition de milieu de culture déshydratée,

- reposant sur ladite pièce en matériau absorbant, un feuillet d'hydrogel polysaccharidique déshydraté et réhydratable à des températures comprises entre 5°C et 40°C ; ledit feuillet d'hydrogel déshydraté étant apposé directement sur la face supérieure de ladite pièce en matériau absorbant, ou indirectement au travers d'une membrane perméable intercalaire.

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DISPOSITIF DE CULTURE MICROBIOLOGIQUE COMPRENANT UN FEUIUUET D’HYDROGEL POLYSACCHARIDIQUE DESHYDRATE

La présente invention appartient au domaine de la microbiologie et de la culture de microorganismes sur milieux solides et semi-solides. Elle a trait plus spécifiquement aux solutions alternatives proposées aux milieux de culture gélosés traditionnels, destinés notamment à la culture, la détection et/ou l’identification de microorganismes présents dans un échantillon à analyser.

Dans le domaine du diagnostic clinique ou vétérinaire, ainsi que celui du contrôle microbiologique industriel (en particulier dans les industries agroalimentaire, pharmaceutique et cosmétique), les supports de culture solides et semi-solides -plus communément désignés par milieux (de culture) gélosés ou géloses nutritives - constituent des outils précieux pour la détection et l’étude des microorganismes potentiellement pathogènes et/ou infectieux.

Apparus à la fin du XIX^eme siècle avec l’utilisation de l’agar agar comme agent gélifiant, les milieux de culture solidifiés ont rapidement et profondément révolutionné la pratique de la microbiologie. Dès lors, les microorganismes à détecter, à identifier et/ou à étudier ont été appréhendés, observés et manipulés à échelle macroscopique, sous forme de colonies, c’est-à-dire des amas cellulaires visibles à l’œil nu et poussant à la surface de ces milieux de culture solides. Ce faisant, de nouvelles perspectives analytiques et expérimentales ont vu le jour, et des améliorations et simplifications de techniques préexistantes ont été rendues possibles.

A cet égard, on citera tout particulièrement les techniques d’isolement de microorganismes sur milieu gélosé, qui restent aujourd’hui encore très largement employées dans de nombreuses méthodes d’analyses microbiologiques, compte tenu de leur grande simplicité d’exécution. Il s’agit essentiellement des techniques d’isolement par épuisement, de la technique des quadrants.

Ces techniques d’isolement sur milieu gélosé consistent à disperser, sur la surface du milieu de culture solide, les cellules d’un dépôt d’échantillon biologique à analyser. Cette dispersion est exécutée, par exemple, grâce à des moyens/outils mécaniques que l’on fait glisser sur la surface du milieu de culture selon un parcours particulier. A l’issue de ce processus de dispersion, les cellules arrivées à la fin du parcours d’étalement se retrouvent individualisées, séparées les unes des autres. Chacune de ces cellules individualisées se développe alors pour former in fine une colonie de culture pure, c’est-àdire un amas cellulaire renfermant des microorganismes, tous génétiquement identiques. Chaque colonie pourra alors faire l’objet d’une analyse morphologique (examen de la forme de la colonie, son élévation, la régularité des bords...), directement sur ce même milieu de culture ou sur d’autres milieux. Ces cellules pourront aussi être collectées à des fins de conservation en vue d’analyses complémentaires ultérieures.

Outre le fait d’offrir aux microorganismes un support adapté à leur croissance et développement, les milieux de culture gélifiés/solidifiés, classiquement à baseO de gélose, ont l’avantage de pouvoir présenter des niveaux de dureté et des états de surface qui les rendent parfaitement adaptés aux opérations d’isolement et d’étalement des cellules, et en particulier aux forces de pression et de friction exercées par les outils et instrumentations développés à cet effet (cf. par exemple, EP 0 242 114, WO 2005/071055).

Les milieux de culture gélosés connaissent cependant quelques inconvénients majeurs. A ce titre, on notera une préparation, qui lorsqu’elle est artisanale, requiert du temps (au moins une heure) et de nombreuses opérations (pesage des ingrédients, dissolutions, autoclavage, coulage, répartition en boites de Pétri). Egalement, comme cela est le cas pour les milieux de culture liquides, ces milieux solides ou semi-solides sont extrêmement sensibles à toute forme de contamination biologique. Enfin, du fait de la grande difficulté pour en assurer la stérilité, les milieux gélosés « artisanaux » doivent être préparés de façon extemporanée ou quasi-extemporanée.

Il existe également des milieux gélosés produits industriellement. Ces milieux gélosés prêts à l’emploi ont des durées de péremption courtes, qui ne dépassent guère quelques mois. Cette durée de péremption limitée peut notamment s’expliquer pour partie par la présence d’eau dans les milieux. Par ailleurs, pour en garantir une stérilité optimale et un niveau de performances acceptable, ils sont soumis à des mesures draconiennes en termes de conditionnement (traitement stérilisant aux UV, double emballage...), d’acheminement et de conservation (un stockage entre 2°C et 8°C, à l’abri de la lumière). Ces nombreuses contraintes impactent sur les coûts de vente et d’utilisation des milieux gélosés industriels.

Pour remédier aux inconvénients précités, des alternatives aux milieux de culture gélosés ont été proposées. Il s’agit en particulier de dispositifs de culture microbiologique prêts à l’emploi, industriellement produits, qui ont la particularité d’intégrer des compositions nutritives, éventuellement sélectives et/ou discriminantes, déshydratées et activables par simple (ré)hydratation. De ce fait, outre des modalités de conservation/stockage peu contraignantes (à l’abri de l’humidité et des fortes températures), leur durée de péremption peut atteindre plusieurs années.

A ce titre, la compagnie 3M (Etats-Unis) propose une gamme de dispositifs de culture microbiologique industriels dénommée Petrifilm™ Ces dispositifs, notamment décrits dans EP 0 070 310 ou EP 0 620 844 ou encore EP 0 832 180, sont formées de deux films étanches à l’eau, apposés l’un sur l’autre. A l’interface, la face interne de chacun des deux films est recouverte d’une composition adhésive permettant d’y faire adhérer une fine couche de poudre(s) hydrosoluble(s) à froid.

Pour certains des dispositifs Petrifilm™, l’une des faces internes des films est recouverte d’une première poudre, qui correspond à une composition de milieu de culture déshydratée et micronisée. L’autre face interne est quant à elle recouverte d’une seconde poudre, qui correspond à un agent gélifiant (tel que la gomme de guar et/ou la gomme de xanthane) micronisé.

Pour d’autres dispositifs Petrifilm™, les deux faces internes sont recouvertes d’une même poudre, formée par un mélange entre une composition de milieu de culture déshydratée et micronisée, et un agent gélifiant également micronisé.

Ces dispositifs Petrifilm™ sont destinés à la détection et/ou au dénombrement de microorganismes présents dans un échantillon à analyser. Pour ce faire, le dispositif de culture est ouvert en soulevant le film supérieur, transparent. Un volume d’échantillon à analyser (liquide ou préalablement rendu liquide) d’une grande fluidité, éventuellement préalablement dilué et fluidisé, est déposé au centre du film inférieur. Le film supérieur est repositionné sur le film inférieur. Au contact de l’eau présent dans l’échantillon à analyser, le gélifiant forme un hydrogel qui améliore la fixation des cellules au support de culture. Cette même eau permet aussi de solubiliser et d’activer le milieu de culture. En comprimant quelque peu l’échantillon entre les deux films, l’échantillon est étalé sur une plus grande surface de culture. Le dispositif de culture microbiologique est finalement incubé à la température et pendant la durée prescrites avant la lecture des résultats.

De par leur conception, les dispositifs Petrifilm™ ne permettent pas de mettre en œuvre les méthodes d’isolement et/ou les méthodes d’étalement comme on pourrait le faire sur un milieu de culture gélosé, et ne sont pas compatibles avec les outils et instrumentations développés à cet effet (cf. par exemple, EP 0 242 114, WO 2005/071055).

On connaît également les dispositifs de culture Compact Dry™, développés par la compagnie NISSUI PHARMACEUTICAL (Japon), dont le support de culture microbiologique est formé par une feuille en matériau fibreux absorbant, intégrant dans sa masse une composition nutritive déshydratée, éventuellement également sélective et/ou discriminante (cf. par exemple, EP 1 179 586).

Pour ce faire, une suspension alcoolique est préparée en mélangeant, dans de l’éthanol, une composition de milieu de culture, un adhésif soluble à la fois dans l’eau et dans l’éthanol (par exemple, le poly[oxyde d’éthylène] et l’hydroxypropylcellulose) et un agent gélifiant soluble dans l’eau mais insoluble dans l’éthanol (par exemple, la gomme de caroube, la gomme de guar, la carragénine, l’hydroxyéthylcellulose). Cette suspension alcoolique est utilisée pour imprégner la feuille en matériau fibreux absorbant. Après séchage, ladite feuille forme un support de culture déshydraté, prêt à l’emploi, de longue conservation, activable par simple réhydratation.

Ces dispositifs Compact Dry™ sont destinés à la détection et/ou au dénombrement de microorganismes présents dans un échantillon à analyser. Pour ce faire, un volume d’échantillon à analyser (liquide ou préalablement rendu liquide) d’une grande fluidité, éventuellement préalablement dilué, est ensemencé à l’aide d’une pipette sur le support de culture en recouvrant un maximum de surface. Le dispositif de culture est alors incubé pendant la durée et à la température prescrites, avant lecture des résultats.

Les techniques d’isolement ainsi que les techniques d’étalement classiquement utilisées sur les milieux gélosés ne sont difficilement réalisables avec ce type de support de culture. En effet, du fait de leur nature fibreuse, ces supports de culture ont une surface irrégulière avec de nombreuses aspérités qui entravent le glissement continu et régulier des outils et instruments habituellement utilisés pour étaler et disperser les cellules sur la surface d’un milieu gélosé classique. Egalement, les cellules ont tendance à se développer en profondeur dans l’épaisseur du support poreux, ce qui peut rendre difficile la visualisation/identification des colonies formées.

Dans WO 2015/104501, la Demanderesse propose aussi des dispositifs de culture microbiologique prêts à l’emploi, dédiés à la détection, à l’identification et/ou à l’énumération de microorganismes. Ces dispositifs sont également basés sur un support de culture en matériau fibreux et absorbant incorporant, dans son épaisseur, une composition de milieu de culture. L’incorporation de la composition de milieu de culture déshydratée dans l’épaisseur du support de culture est réalisée par une technique d’imprégnation à sec. Comme pour les dispositifs Compact Dry™, du fait de leur nature fibreuse, ces supports de culture ont une surface irrégulière avec de nombreuses aspérités ; ces dispositifs ne sont donc pas compatibles avec les techniques et les outils développés jusqu’à présent pour l’isolement et l’étalement des cellules sur la surface d’un milieu gélosé classique.

Egalement, comme pour les dispositifs Compact Dry™, les cellules se développent en profondeur dans l’épaisseur du support poreux.

Pour remédier à ces défauts, dans WO 2014/013089 et WO 2015/107228, la Demanderesse propose de recouvrir cette surface fibreuse d’une couche superficielle apte à en parfaire l’état de surface.

Dans WO 2014/013089, il est ainsi proposé d’utiliser une membrane de (micro)filtration aux pores suffisamment étroites pour empêcher la diffusion des cellules vers les couches sous-jacentes, et pour former par la même occasion une surface de rendu relativement lisse. Ladite membrane de (micro)filtration peut être réalisée à base de un ou plusieurs matériaux choisis parmi le latex, le polytétrafluoroéthylène, le poly(vinylidène) fluoride, le polycarbonate, le polystyrène, le polyamide, le polysulfone, le polyéthersulfone, la cellulose, la nitrocellulose.

En alternative, dans WO 2015/107228, il est proposé un recouvrement par une couche poreuse de composition comprenant un mélange de pigments de kaolin, de talc, de dioxyde de titane, et/ou de carbonate de calcium, et d’un liant de type latex styrène butadiène, latex styrène acrylique ou carboxyle méthyle cellulose.

Malgré des résultats biologiques probants, de tels supports de culture sont commercialement peu viables à l’heure actuelle, notamment car leur fabrication à échelle industrielle nécessiterait d’importants investissements financiers.

La présente invention a ainsi pour objet de proposer un dispositif de culture microbiologique qui, tout en offrant une durée de péremption longue, y compris à température ambiante, procure une réelle alternative aux milieux de culture gélosé traditionnels, tant sur le plan de la fertilité que sur la compatibilité avec les opérations mécaniques d’étalement et de dispersion des cellules.

Un autre objectif de la présente invention est de pouvoir proposer un dispositif de culture microbiologique qui soit compatible avec les contraintes d’une exploitation industrielle et commerciale, notamment en termes de coût de production et de rentabilité. En particulier, la présente invention vise à proposer un dispositif de culture microbiologique de conception et de fabrication adaptées aux installations et moyens de production actuellement utilisés dans l’industrie des milieux et dispositifs de culture microbiologique.

La présente invention propose donc un dispositif de culture microbiologique comprenant :

- une pièce en matériau absorbant ayant une face supérieure au moins sensiblement plane et incorporant dans son épaisseur une composition de milieu de culture déshydratée (sèche ou séchée),

- reposant sur ladite pièce en matériau absorbant, un feuillet d’hydrogel polysaccharidique déshydraté et réhydratable à température ambiante, en particulier à des températures comprises entre 5°C et 40°C ; ledit feuillet d’hydrogel déshydraté étant apposé directement sur la face supérieure de ladite pièce en matériau absorbant, ou indirectement au travers d’une membrane perméable intercalaire.

Selon l’invention, ledit feuillet d’hydrogel polysaccharidique déshydraté a été préparé par déshydratation d’une couche d’hydrogel de composition à base d’eau et d’au moins un gélifiant polysaccharidique. Ce feuillet d’hydrogel déshydraté a la particularité d’être réhydratable à température ambiante, c’est-à-dire qu’il recouvre sa texture et ses propriétés d’hydrogel par simple absorption d’une composition aqueuse, sans nécessiter aucun traitement thermique additionnel.

Lors de son utilisation, le dispositif de culture microbiologique selon l’invention doit être hydraté pour être activé. Pour ce faire, la pièce en matériau absorbant est imbibée avec une quantité d’eau ou une composition aqueuse. La composition de milieu de culture, initialement présente dans un état sec, est ainsi solubilisée et activée. Au contact même de la pièce en matériau absorbant, ou au travers d’une membrane perméable intercalaire, le feuillet d’hydrogel polysaccharidique déshydraté se réhydrate à son tour, presque instantanément et à température ambiante. En se gonflant du liquide provenant de la pièce en matériau absorbant, le feuillet d’hydrogel se restructure pour donner une fine couche d’hydrogel (ou pellicule d’hydrogel) gorgée d’une composition de milieu de culture solubilisée et activée. L’ensemencement de l’échantillon à analyser sur le feuillet d’hydrogel polysaccharidique peut être effectué aussi bien avant qu’après réhydratation de ce dernier.

Dans ce système réhydraté, la couche d’hydrogel polysaccharidique procure à la surface du dispositif de culture microbiologique un effet de lubrification qui facilite les opérations mécaniques d’étalement et de dispersion des cellules. Egalement, par sa consistance molle, elle favorise l’implantation des microorganismes au plus près des ingrédients nutritifs et des agents actifs du milieu de culture. Quant à la pièce en matériau absorbant, outre son rôle dans la conservation et la distribution de la composition de milieu de culture, sa structure participe à la rigidité et la fermeté globales de la surface du dispositif de culture microbiologique, assurant sa compatibilité à l’égard des forces de pression et de friction qu’exercent les outils et instrumentations utilisés pour étaler et disperser les cellules.

Avant d’aller plus loin dans la description de l’invention, les définitions ciaprès sont données afin de faciliter la compréhension de l’exposé de l’invention.

L’expression « milieu de culture » fait référence à une composition nutritive permettant la croissance et le développement de cellules, plus particulièrement des bactéries, des moisissures et/ou des levures. Ces milieux permettent de répondre aux besoins nutritionnels des microorganismes à cultiver. Schématiquement, on trouve dans leur composition :

de l’eau (généralement de l’eau distillée ou déionisée) stérile, au moins un glucide, à titre de source carbonée et d’énergie, ainsi que d’autres éléments nutritifs (notamment, acides aminés, facteurs de croissance, vitamines, minéraux, oligo-éléments, sels de fer, citrate de sodium, chlorure de sodium...) apportés sous la forme de compositions chimiquement complexes telles que des mélanges de peptones (de lait, de viande et/ou de fécules de pomme de terre, de maïs...), des extraits de levures, de sérum, et/ou des extraits de tissus d’origine animale ou végétale...

également divers sels, permettant d’établir une osmolarité adéquate au milieu, et de tamponner le pH.

Un milieu de culture au sens de la présente invention peut éventuellement démontrer une certaine sélectivité à l’égard de microorganismes cibles, c’est-à-dire qu’il favorise le développement de ces microorganismes cibles plutôt que celui de la flore annexe, et/ou qu’il inhibe et/ou ralentit le développement de la flore annexe. Cet effet sélectif peut notamment être obtenu grâce à l’emploi d’agents à effet inhibiteur pour la flore annexe ou d’agents à effet activateur pour les microorganismes cibles. Egalement, un milieu de culture au sens de la présente invention peut éventuellement démontrer des aptitudes de discrimination permettant de différencier, de distinguer visuellement les différentes catégories de microorganismes poussant sur ce même milieu de culture. A cet effet, le milieu de culture intègre avantageusement une composante chromogénique et/ou fluorogénique permettant une observation visuelle des microorganismes en fonction d’activités métaboliques particulières qu’ils expriment.

La composition et la formulation de nombreux milieux de culture sont décrites notamment dans le HANDBOOK OF MICROBIOLOGICAL MEDIA (2010 ; 4ème Edition).

Le terme « échantillon » fait référence à un prélèvement effectué à des fins d’analyse ou à une petite partie ou petite quantité de ce prélèvement. L’invention vise plus spécifiquement des échantillons biologiques contenant ou suspectés de contenir des microorganismes à détecter et/ou à analyser. Ces échantillons biologiques peuvent être d’origine humaine, animale, végétale ou environnementale. Ils peuvent aussi avoir une origine industrielle et provenir de prélèvements opérés sur un produit manufacturé ou un produit en cours de fabrication, ou sur des instruments, des installations rencontrés dans un environnement industriel. Les secteurs industriels visés ici sont plus particulièrement les industries agroalimentaire, pharmaceutique, cosmétique et vétérinaire, les dispositifs médicaux, la microbiologie des contrôles environnementaux (eaux, air, surfaces).

Les termes « microorganismes » et « cellules » sont utilisés ici de façon équivalente et font référence à des bactéries, des levures, des moisissures et/ou des amibes.

Par « moyens/outils d’isolement/étalement », on entend les instruments mécaniques aptes à être utilisés dans la mise en œuvre des techniques d’isolement (par exemple, la technique d’épuisement, la technique des stries ou des cadrans), des techniques d’étalement ou de nappage cellulaire (par exemple, en vue d’un dénombrement cellulaire ou de la réalisation de tests de susceptibilité aux antibiotiques), comme ceux qui sont couramment utilisés sur les milieux de culture gélosés traditionnels. Ces instruments mécaniques, utilisés manuellement ou de façon automatisée, permettent de réaliser un ou plusieurs dépôts ponctuels de microorganismes sur la surface du milieu de culture, et en glissant sur cette surface, ils en étalent les cellules. A titre d’exemples non exhaustifs, on peut citer les oëses, les anses de platine, les tiges rodées, des billes, les étaloirs, les ringards ou râteaux.

Selon l’invention, le dispositif de culture microbiologique proposé est formé, pour l’essentiel, de la combinaison entre une pièce en matériau absorbant incorporant dans son épaisseur une composition de milieu de culture déshydratée, et un feuillet d’hydrogel polysaccharidique également déshydraté, ayant la capacité de se réhydrater à température ambiante. Par ses dimensions, le feuillet d’hydrogel polysaccharidique déshydraté recouvre tout ou partie la face supérieure de la pièce en matériau absorbant.

A propos de la pièce en matériau absorbant, qui compose la couche interne/profonde du dispositif de culture microbiologique selon l’invention et qui fait office de réservoir à une composition de milieu de culture déshydratée, sa structure, sa conception et ses dimensions sont largement décrites ou suggérées par EP 1 179 586, WO 2015/104501, WO 2014/013089, WO 2015/107228.

De nombreux matériaux absorbants, hydrophiles et non hydrosolubles, peuvent être utilisés pour réaliser la pièce en matériau absorbant d’un dispositif de culture microbiologique selon l’invention. Ces matériaux sont principalement choisis pour leur pouvoir absorbant, leur capacité de rétention des liquides aqueux et leur faculté à laisser les liquides aqueux les traverser.

Avantageusement et selon l’invention, ladite pièce en matériau absorbant est réalisée à partir d’un substrat de fibres courtes non-tissées, constituant un ensemble ayant une intégrité et une cohérence mécanique. Les substrats particulièrement adaptés sont en ίο fibre cellulosique naturelle (comme le coton) ou synthétique (comme la rayonne), en fibre cellulosique modifiée (par exemple, la carboxyméthylcellulose, la nitrocellulose), en fibre de polymères chimiques absorbants (tels que les sels de polyacrylate, les copolymères acrylate/acrylamide). Selon un mode de réalisation préféré, ladite pièce en matériau absorbant est en textile non-tissé réalisé en fibre de cellulose, notamment le coton.

L’incorporation d’une composition de milieu de culture dans la masse d’une pièce réalisée en matériau fibreux peut être réalisée de diverses façons.

Elle peut se faire par des techniques dites d’imprégnation en phase liquide (cf. par exemple, CN 102337324 ou WO 2005/061013). Ces techniques consistent à imbiber un matériau absorbant d’une composition de milieu de culture, formulée en solution dans un solvant volatile (par exemple, l’eau, un alcool). Une fois bien imbibé, le séchage du matériau absorbant est réalisé par évaporation du solvant.

Elle peut également se faire par des techniques dites d’imprégnation à sec. Ces techniques visent à transférer, dans l’épaisseur d’une pièce en matériau absorbant, une composition poudreuse, en l’occurrence un milieu de culture préparé sous la forme d’une poudre ou d’un assemblage de poudres. A cet effet, les particules de ladite composition poudreuse sont saupoudrées sur la surface de la pièce en matériau absorbant, puis sont mises en vibration, sous l’action d’ondes ultrasonores (cf. par exemple, FR 2 866 578) ou bien sous l’action d’un champ électrique alternatif (cf. par exemple, WO 2015/044605, WO 2010/001043 ou WO 99/22920). Ces particules pénètrent et s’enfoncent alors progressivement dans les cavités du corps poreux.

Pour la fabrication d’un dispositif de culture microbiologique selon l’invention, les techniques d’imprégnation à sec mettant en œuvre un champ électrique alternatif se sont révélées particulièrement adaptées pour permettre l’incorporation d’une composition de milieu de culture déshydratée dans l’épaisseur d’un matériau absorbant. De ce fait, les enseignements techniques dispensés par WO 2015/044605, WO 2010/001043 et WO 99/22920 font partie intégrante de la présente description.

Selon l’invention, la quantité de solution du milieu de culture activé (hydraté) et la concentration de ses constituants conditionnent, d’une part, le choix du matériau de la pièce en matériau absorbant (notamment au vu de sa capacité de rétention d’eau) et celui des dimensions de cette pièce en matériau absorbant et, d’autre part, la quantité de poudre de milieu de culture à y incorporer, et réciproquement.

Avantageusement, avant calandrage éventuel, ladite pièce en matériau absorbant présente une masse surfacique comprise entre 50 g.m'² et 150 g.m'², et préférentiellement entre 90 g.m'² et 110 g.m'², pour une épaisseur avantageusement encore comprise entre 0,5 mm et 10 mm, et plus préférentiellement entre 1 mm et 4 mm.

Selon un mode de réalisation préféré, une fois l’incorporation de la composition de milieu de culture déshydratée achevée, la pièce en matériau absorbant est avantageusement soumise à une opération de calandrage. Le calandrage, par la pression et la température de chauffe générées, améliore la rétention de la composition du milieu de culture déshydratée dans l’épaisseur de la pièce en matériau absorbant, ainsi que sa stabilité dans le temps. Le calandrage a également pour avantage d’améliorer la planéité de la surface de la pièce en matériau absorbant, et d’accroître le pouvoir capillaire de cette dernière.

Le calandrage se fait avantageusement à une température préconisée comprise entre 30°C et 60°C. Une température inférieure à 60°C permet de ne pas dénaturer les composés thermolabiles.

EPI 179 586, WO 2015/104501, WO 2014/013089 et WO 2015/107228, commentés plus haut dans la présente description, décrivent des supports de culture microbiologique qui intègrent également dans leurs structures des couches en matériau poreux incorporant une composition de milieu de culture déshydratée. Ces couches ainsi décrites peuvent donc être reprises telles quelles pour être utilisées dans la conception des dispositifs de culture microbiologique selon la présente invention.

Selon un mode de réalisation particulièrement préféré de la présente invention, la pièce en matériau absorbant incorporant dans son épaisseur une composition de milieu de culture déshydratée reprend avantageusement les caractéristiques techniques du support poreux imprégné à sec décrit par WO 2015/104501.

Avantageusement, la quantité de composition de milieu de culture formulée en poudre et incorporée dans l’épaisseur de la pièce en matériau absorbant est comprise entre 0,01 g.cm'³ et 0,1 g.cm'³, de préférence entre 0,02 g.cm'³ et 0,09 g.cm'³, et plus préférentiellement encore entre 0,03 g.cm'³ et 0,06 g.cm'³.

S’agissant du feuillet d’hydrogel polysaccharidique déshydraté constitutif d’un dispositif de culture microbiologique selon l’invention, sa composition et son épaisseur ont été choisies pour créer une structure de surface pleine, de faible épaisseur, ayant une intégrité et une tenue mécaniques suffisantes pour permettre une préhension et des manipulations faciles. Par ailleurs et de manière intrinsèque, ce feuillet d’hydrogel polysaccharidique déshydraté forme un matériau hyper-absorbant et réhydratable à température ambiante, en particulier à des températures comprises entre 5°C et 40°C, si bien qu’au contact de la pièce en matériau absorbant préalablement imbibée d’eau, il se gonfle de la composition de milieu de culture liquide et forme une couche d’hydrogel aux propriétés nutritives, éventuellement sélectives et/ou discriminantes. Sur cette couche d’hydrogel, les cellules inoculées sont ainsi déposées au plus près des constituants de la composition du milieu de culture.

Alors que les opérations d’étalement sont souvent traumatisantes pour les cellules, celles-ci étant généralement déplacées en dépit de leur adhérence au support de culture, avec un dispositif de culture microbiologique selon l’invention, grâce à la grande malléabilité de l’hydrogel (éventuellement des propriétés thixotropiques), les cellules ne sont pas brutalement décrochées de leur support mais sont entraînées en mouvement avec la micro-fraction d’hydrogel qui les entoure.

Selon l’invention, le feuillet d’hydrogel polysaccharidique déshydraté est avantageusement un feuillet d’hydrogel déshydraté de gellane, de xanthane, de gallactomannane, d’amidon et/ou d’un mélange de ces hydrogels. Ledit feuillet d’hydrogel déshydraté est obtenu par déshydratation d’une couche d’hydrogel de composition à base d’eau et d’au moins un gélifiant polysaccharidique. Ledit gélifiant polysaccharidique est préférentiellement choisi parmi une gomme de gellane, une gomme de xanthane, une gomme de galactomannane (par exemple, une gomme de graine de caroube ou une gomme de guar), de l’amidon et un mélange de ceux-ci.

Avantageusement et selon l’invention, le feuillet d’hydrogel polysaccharidique déshydraté est obtenu par déshydratation d’une couche d’hydrogel polysaccharidique préalablement préparée en mélangeant à un litre d’eau, 0,1 à 30 g d’au moins un gélifiant polysaccharidique.

Selon un premier mode de réalisation préféré, le feuillet d’hydrogel polysaccharidique déshydraté est obtenu par déshydratation d’une couche d’hydrogel de gellane, préalablement préparée en mélangeant à un litre d’eau, 10 à 20 g de gomme de gellane et, préférentiellement, 13 à 15 g de gomme de gellane.

Selon une variante de réalisation, le feuillet d’hydrogel polysaccharidique déshydraté est obtenu par déshydratation d’une couche d’hydrogel de xanthane, préalablement préparée en mélangeant à un litre d’eau, 0,2 à 10 g de gomme de xanthane, de préférence de l’ordre de 0,5 g de gomme de xanthane.

Selon une deuxième variante de réalisation, le feuillet d’hydrogel polysaccharidique déshydraté est obtenu par déshydratation d’une couche d’hydrogel de xanthane et de gallactomannane, préalablement préparée à partir d’un mélange de gomme de xanthane et de gomme de graine de caroube. Le ratio pondéral [gomme de xanthane]/[gomme de graine de caroube] est avantageusement comprise entre 1:2 et 2:1, de préférence de l’ordre de 1:1.

Selon une troisième variante de réalisation, le feuillet d’hydrogel polysaccharidique déshydraté est obtenu par déshydratation d’une couche d’hydrogel d’amidon, de préférence d’amidon de pomme de terre, préalablement préparée en mélangeant à un litre d’eau, 0,5 à 15 g d’amidon.

Selon une quatrième variante de réalisation, le feuillet d’hydrogel polysaccharidique déshydraté est obtenu par déshydratation d’une couche d’hydrogel de gellane et d’amidon, de préférence d’amidon de pomme de terre, préalablement préparée à partir d’un mélange de gomme de gellane et d’amidon. Le ratio pondéral [gomme de gellane]/[amidon] est avantageusement compris entre 40:1 et 2:3.

A partir d’une composition d’hydrogel polysaccharidique, un feuillet polysaccharidique déshydraté peut être préparé de multiples façons. Par exemple, l’hydrogel peut être coulé ou étalé en une couche continue sur une surface non-adhérente. Cette couche continue peut également être obtenue par une méthode de couchage. La couche d’hydrogel est ensuite séchée/déshydratée, puis découpée à la forme et aux dimensions souhaitées.

La préparation du feuillet d’hydrogel polysaccharidique déshydraté peut également être effectuée par une méthode de moulage, suivie d’une étape de déshydratation.

Selon un mode préféré de réalisation de l’invention, le feuillet d’hydrogel polysaccharidique déshydraté est avantageusement renforcé structurellement par voie chimique au moyen d’un additif de renfort choisi parmi le glycérol, l’éthylène glycol et le polyéthylène glycol. L’ajout dudit additif de renfort est effectué au cours de la préparation de la composition d’hydrogel polysaccharidique. Avantageusement, cet ajout est effectué à l’étape de mélange du gélifiant et de l’eau, préalable à l’étape de déshydratation.

Dans ce contexte, un feuillet d’hydrogel polysaccharidique déshydraté selon l’invention comprend, en outre, au moins un additif de renfort choisi parmi le glycérol, l’éthylène glycol et le polyéthylène glycol.

Avantageusement et selon l’invention, ledit additif de renfort est du glycérol.

Selon un mode de réalisation de l’invention particulièrement préféré, ledit feuillet d’hydrogel polysaccharidique déshydraté est un feuillet d’hydrogel de gellane déshydraté comprenant, en outre, du glycérol.

Un tel feuillet d’hydrogel polysaccharidique déshydraté est préparé à partir de gomme de gellane et de glycérol. Le ratio pondéral [gomme de gellanej/glycérol utilisé dans cette préparation est avantageusement compris entre 2:1 et 1:8, préférentiellement entre 2:7 et 2:9, et est typiquement de l’ordre de 1:4.

Selon un mode de réalisation avantageux de l’invention, ledit feuillet d’hydrogel polysaccharidique déshydraté comprend, en outre, au moins un agent durcisseur choisi parmi les sels de cation divalent. De préférence, l’agent durcisseur est choisi parmi le chlorure de magnésium (MgCl₂), le chlorure de calcium (CaCl₂), le sulfate de magnésium (MgSCL) et le chlorure de manganèse (MnCl₂). Avantageusement et selon l’invention, l’agent durcisseur est MgCl₂.

Avantageusement et selon l’invention, ledit feuillet d’hydrogel polysaccharidique déshydraté est un feuillet d’hydrogel de gellane déshydraté comprenant, en outre, au moins un agent durcisseur choisi parmi MgCfi, CaCh, MgSCL et MnCfi. L’agent durcisseur est avantageusement MgCh. Le ratio pondéral gellane/MgCf est avantageusement compris entre 100:1 et 3:2, préférentiellement entre 30:1 et 1:3, et est typiquement de l’ordre de 15: 1.

Un tel feuillet d’hydrogel polysaccharidique déshydraté est préparé à partir de gomme de gellane et de MgCfi. Le ratio pondéral [gomme de gellanej/MgCh utilisé dans cette préparation est avantageusement compris entre 100:1 et 3 :2, préférentiellement entre 30:1 et 1:3, et est typiquement de l’ordre de 15: 1.

Selon un mode de réalisation particulier de l’invention, ledit feuillet d’hydrogel polysaccharidique déshydraté est un feuillet d’hydrogel de gellane déshydraté comprenant, en outre, au moins un agent plastifiant comme, par exemple, une huile de silicone. L’utilisation d’un agent plastifiant permet d’obtenir des hydrogels déshydratés de plus grandes souplesse et flexibilité. L’avantage est ainsi de pouvoir préparer de grandes surfaces d’hydrogel déshydraté, par exemple en de longues bandes pouvant être mises en rouleaux et conservées ainsi jusqu’à leur découpe en feuillets aux dimensions appropriées aux dispositifs de culture microbiologique selon l’invention.

L’incorporation de l’agent plastifiant est effectuée au cours de la préparation de la composition d’hydrogel polysaccharidique. Avantageusement, cette incorporation est effectuée à l’étape de mélange du gélifiant et de l’eau, préalablement à l’obtention du feuillet polysaccharidique déshydraté.

Selon un mode particulier de réalisation de l’invention, le feuillet d’hydrogel polysaccharidique déshydraté incorpore dans son épaisseur des composés chromogéniques et/ou fluorogéniques permettant une observation visuelle des microorganismes en fonction d’activités métaboliques particulières qu’ils expriment. Ces composés peuvent être, par exemple, des substrats synthétiques permettant la mise en évidence d’activités enzymatiques définies, des indicateurs colorés de pH.

L’incorporation des composés chromogéniques et/ou fluorogéniques est effectuée au cours de la préparation de la composition d’hydrogel polysaccharidique.

Avantageusement, cette incorporation est effectuée à l’étape de mélange du gélifiant et de l’eau, préalablement à l’obtention du feuillet polysaccharidique déshydraté.

Avantageusement et selon l’invention, outre la pièce en matériau absorbant et le feuillet d’hydrogel polysaccharidique déshydraté, un dispositif de culture microbiologique selon l’invention peut également comprendre une membrane perméable intercalaire, disposée entre ladite pièce en matériau absorbant et ledit feuillet d’hydrogel polysaccharidique déshydraté.

La composition, la conception et l’épaisseur de cette membrane perméable intercalaire sont choisies de sorte que cette dernière entrave le moins possible le transfert des liquides entre la pièce en matériau absorbant et le feuillet d’hydrogel polysaccharidique déshydraté ou la couche d’hydrogel polysaccharidique réhydraté. A cet égard, elle peut être réalisée à partir d’un substrat en fibre cellulosique naturelle (comme le coton) ou synthétique (comme la rayonne), en fibre cellulosique modifiée (par exemple, la carboxyméthylcellulose, la nitrocellulose), en fibre de polymères chimiques absorbants (tels que les sels de polyacrylate, les copolymères acrylate/acrylamide) ou en fibres protéiques stables (comme la soie, la laine).

Dans le cadre de la présente invention, cette membrane perméable intercalaire, optionnelle, peut être utilisée à des fins très diverses, comme par exemple :

pour apporter un renfort mécanique et/ou une rigidité supplémentaire à l’ensemble du système, ou uniquement au feuillet d’hydrogel polysaccharidique déshydraté et à la couche d’hydrogel polysaccharidique réhydraté, pour améliorer le contact de la pièce en matériau absorbant avec le feuillet d’hydrogel polysaccharidique déshydraté et /ou avec la couche d’hydrogel polysaccharidique réhydraté, pour faire office de couche réservoir pour la conservation de composés particuliers, destinés à être mélangés à la composition de milieu de culture solubilisée en provenance de la pièce en matériau absorbant avant d’être acheminés vers la couche d’hydrogel polysaccharidique réhydraté, pour améliorer le contraste et l’observation des colonies poussant à la surface du dispositif de culture microbiologique.

Selon un mode particulier de réalisation, ladite membrane perméable intercalaire est utilisée en vue d’améliorer le contraste et l’observation des colonies poussant à la surface du dispositif de culture microbiologique. A cet effet, elle est choisie suffisamment opaque à la lumière et d’une grande blancheur (par exemple, une blancheur CIE au moins égale à 65).

La conception des dispositifs de culture biologique selon l’invention et les modalités d’utilisation de ceux-ci permettent aux principaux éléments constitutifs, tels que notamment :

la pièce en matériau absorbant, le feuillet d’hydrogel polysaccharidique déshydraté, et l’éventuelle membrane perméable intercalaire, de pouvoir avantageusement être fabriqués, conditionnés et stockés séparément et de manière totalement indépendante. Ceci représente un réel atout industriel, tant d’un point de vue commercial que logistique. Ceci représente également un avantage significatif pour l’utilisateur qui dispose de la possibilité de combiner à dessein les différents éléments constitutifs du dispositif de culture microbiologique selon l’invention, et d’adapter par luimême le dispositif de culture microbiologique aux microorganismes auxquels il porte un intérêt tout particulier.

De façon similaire, un dispositif de culture microbiologique selon l’invention peut être conditionné et commercialisé sous différentes formes, notamment :

- un dispositif de culture microbiologique, composite, préalablement monté et assemblé, dans lequel la pièce en matériau absorbant est surmontée d’un feuillet d’hydrogel polysaccharidique déshydraté, avec éventuellement une membrane perméable intercalaire ;

- un dispositif de culture microbiologique en kit, que l’utilisateur assemblera par luimême ; un tel kit comprend au moins une pièce en matériau absorbant, au moins un feuillet d’hydrogel déshydraté, éventuellement au moins une membrane perméable intercalaire.

Que le dispositif de culture microbiologique selon l’invention soit conditionné préassemblé ou conditionné pour pouvoir être assemblé de façon extemporanée par un utilisateur, pour faciliter la manipulation de celui-ci :

la pièce en matériau absorbant, le feuillet d’hydrogel polysaccharidique déshydraté (ou la couche d’hydrogel polysaccharidique réhydraté), et T éventuelle membrane perméable intercalaire, peuvent avantageusement être maintenus solidaires entre eux par des moyens techniques avantageusement appliqués sur le pourtour de ces différents éléments, tels que :

- un système d’agrafe, d’épingle,

- une composition d’adhésif, appliquée linéairement ou ponctuellement,

- un système de blocage disposé à l’intérieur d’un réceptacle (par exemple, le réceptacle d’une boîte de Pétri) spécifiquement conçu pour recevoir ledit dispositif de culture microbiologique ; les différents éléments constitutifs du dispositif de culture microbiologique selon l’invention sont, dans ce cas, de forme et de dimensions adaptées à celles dudit réceptacle, et le rebord dudit réceptacle est muni sur sa(ses) face(s) inteme(s) d’organes mécaniques de rétention, de type ergots, faisant saillie hors de la surface.

L’invention concerne également un dispositif de culture microbiologique tel que précédemment décrit, et présenté sous la forme d’un kit à assembler. Un dispositif de culture microbiologique en kit à assembler, selon l’invention, comprend ainsi :

- au moins une pièce en matériau absorbant ayant une face supérieure au moins sensiblement plane et incorporant dans son épaisseur une composition de milieu de culture déshydratée,

- au moins un feuillet d’hydrogel polysaccharidique déshydraté et réhydratable à température ambiante, en particulier à des températures comprises entre 5°C et 40°C , et éventuellement

- optionnellement, au moins une membrane perméable intercalaire.

Selon un aspect particulier de la présente invention, celle-ci propose également un feuillet d’hydrogel polysaccharidique déshydraté et réhydratable à température ambiante, en particulier à des températures comprises entre 5°C et 40°C. Ledit feuillet d’hydrogel polysaccharidique déshydraté et réhydratable à température ambiante est destiné à être utilisé comme support de culture microbiologique.

Avantageusement, un feuillet d’hydrogel polysaccharidique déshydraté et réhydratable selon l’invention est caractérisé par tout ou partie des caractéristiques techniques ci-après listées :

- ledit feuillet d’hydrogel polysaccharidique déshydraté est un feuillet d’hydrogel déshydraté de gellane, de xanthane, de galactomannane, d’amidon ou un mélange de ceux-ci,

- ledit feuillet d’hydrogel polysaccharidique déshydraté a été préparé par déshydratation d’une couche d’hydrogel de composition à base d’eau et d’au moins un gélifiant polysaccharidique choisi parmi une gomme de gellane, une gomme de xanthane, une gomme de galactomannane, de l’amidon et un mélange de ceux-ci,

- ledit feuillet d’hydrogel polysaccharidique déshydraté est obtenu par déshydratation d’une couche d’hydrogel polysaccharidique préparée en mélangeant à un litre d’eau, 0,1 à 30 g d’au moins un des gélifiants polysacchandiques précédemment énoncés,

- ledit feuillet d’hydrogel polysacchandique déshydraté est obtenu par déshydratation d’une couche d’hydrogel de gellane, préalablement préparée en mélangeant à un litre d’eau, 10 à 20 g de gomme de gellane et, préférentiellement, 13 à 15 g de gomme de gellane,

- ledit feuillet d’hydrogel polysacchandique déshydraté est obtenu par déshydratation d’une couche d’hydrogel de xanthane, préalablement préparée en mélangeant à un litre d’eau, 0,2 à 10 g de gomme de xanthane,

- ledit feuillet d’hydrogel polysacchandique déshydraté est obtenu par déshydratation d’une couche d’hydrogel de xanthane et de gallactomannane, préalablement préparée à partir d’un mélange de gomme de xanthane et de gomme de graine de caroube,

- ledit feuillet d’hydrogel polysacchandique déshydraté est obtenu par déshydratation d’une couche d’hydrogel d’amidon, préalablement préparée en mélangeant à un litre d’eau, 0,5 à 15 g d’amidon,

- ledit feuillet d’hydrogel polysacchandique déshydraté est obtenu par déshydratation d’une couche d’hydrogel de gellane et d’amidon, préparée à partir d’un mélange de gomme de gellane et d’amidon, avec un ratio pondéral [gomme de gellane]/[amidon] compris entre 40:1 et 2:3,

- ledit feuillet d’hydrogel polysacchandique déshydraté est renforcé structurellement par voie chimique au moyen d’un additif de renfort choisi parmi le glycérol, l’éthylène glycol et le polyéthylène glycol,

- ledit feuillet d’hydrogel polysaccharidique déshydraté comprend, en outre, au moins un agent durcisseur choisi parmi les sels de cation divalent - notamment MgCl₂, CaCl₂, MgSO₄ et MnCl₂ -,

- ledit feuillet d’hydrogel polysaccharidique déshydraté comprend, en outre, au moins un agent plastifiant comme, par exemple, une huile de silicone.

D'autres buts, caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront au vu de la description qui va suivre et des exemples développés ci-après, qui se réfèrent aux figures annexées et dans lesquelles :

- la Figure 1 est une représentation schématisée d’un dispositif de culture microbiologique selon l’invention, et de son principe général d’utilisation ;

- la Figure 2 est une photographie montrant un exemple de feuillets d’hydrogel polysaccharidique déshydraté en fin de processus de séchage/déshydratation ;

- les Figures 3 à 13 rassemblent des photographies de cultures et d’isolements de souches bactériennes effectués sur des dispositifs de culture microbiologique selon l’invention.

Ces exemples ont pour but de faciliter la compréhension de l’invention, sa mise en œuvre et son utilisation. Ces exemples sont donnés à titre explicatif et ne sauraient limiter la portée de l’invention.

EXEMPLES

A/ - Dispositif de culture microbiologique selon l’invention, et principe général d’utilisation

Tel que représenté à la Figure 1, un dispositif de culture microbiologique selon l’invention se compose, en premier lieu, d’une pièce en matériau absorbant 1, plus ou moins épaisse et d’un feuillet 2, d’épaisseur moindre. Dans l’exemple représenté, ces deux éléments 1 et 2 sont de forme sensiblement carrée.

La pièce en matériau absorbant 1, réalisée en matériau hydrophile et non hydrosoluble, incorpore dans son épaisseur une composition de milieu de culture déshydratée. Le feuillet d’hydrogel polysaccharidique déshydraté 2 est quant à lui formé par séchage/déshydratation d’une couche d’hydrogel polysaccharidique, et sa structure mécanique peut être renforcée au moyen d’une armature fibreuse, par exemple un tissé.

La pièce en matériau absorbant 1 et le feuillet d’hydrogel polysaccharidique déshydraté 2 peuvent être fournis déjà préassemblés, solidarisés, ou bien alors sous la forme de deux éléments mécaniquement indépendants.

La conception et la fabrication de cette pièce en matériau absorbant 1 et de ce feuillet d’hydrogel polysaccharidique déshydraté 2 seront décrites plus en détails dans la suite des exemples.

A titre de caractéristique secondaire, un réceptacle 4 est associé au dispositif de culture microbiologique pour en faciliter la manipulation, notamment pour l’étape de réhydratation et activation du dispositif, et pour tout déplacement (par exemple, un transfert de la paillasse à l’incubateur).

L’utilisation d’un dispositif de culture microbiologique selon l’invention nécessite une activation du dispositif grâce à une hydratation par la pièce en matériau absorbant 1, par de l’eau 4.

Pour ce faire, le dispositif de culture microbiologique selon l’invention est placé à l’intérieur du réceptacle 4, avec le feuillet d’hydrogel polysaccharidique déshydraté 2 tourné vers le haut. Le réceptacle 4 étant de plus grande surface que celle du dispositif de culture, on verse l’eau 5 dans le réceptacle 4 en prenant soin de ne pas en verser directement sur le feuillet d’hydrogel polysaccharidique déshydraté 2. Le volume d’eau utilisé est plus ou moins calibré pour pouvoir humidifier suffisamment la pièce en matériau absorbant 1 et solubiliser la composition de milieu de culture qu’elle renferme.

Une autre façon d’opérer consiste à verser dans le fond du réceptacle 4, le volume d’eau approprié, puis d’y déposer la pièce en matériau absorbant 1, surmontée du feuillet d’hydrogel polysaccharidique déshydraté 2. On prendra soin de ne pas placer le feuillet d’hydrogel polysaccharidique déshydraté 2 directement en contact avec l’eau libre, de façon à ce que le dispositif soit effectivement hydraté uniquement par la pièce en matériau absorbant 1.

Lorsque le dispositif de culture microbiologique selon l’invention est fourni avec la pièce en matériau absorbant 1 et le feuillet d’hydrogel polysaccharidique déshydraté 2 sous la forme de deux éléments mécaniquement indépendants, l’étape d’hydratation peut alors être réalisée d’une troisième manière. La pièce en matériau absorbant 1 est alors placée à l’intérieur du réceptacle 4. Dans le réceptacle 4 et éventuellement directement sur cette pièce en matériau absorbant 1, on verse une quantité d’eau 5 suffisante pour bien imbiber la pièce en matériau absorbant 1. On vient ensuite en recouvrir la surface avec le feuille d’hydrogel polysaccharidique déshydraté 2.

Au cours de l’activation d’un dispositif de culture microbiologique selon l’invention, l’hydratation par la pièce en matériau absorbant 1 permet, dans un premier temps, de solubiliser la composition de milieu de culture contenue dans l’épaisseur de la pièce en matériau absorbant 1. Dans un deuxième temps, cette activation se poursuit par l’hydratation du feuillet d’hydrogel polysaccharidique déshydraté 2, appliqué sur la surface de la pièce en matériau absorbant 1. Cette réhydratation du feuillet d’hydrogel polysaccharidique déshydraté 2 fait apparaître, à la surface de la pièce en matériau absorbantl, une couche d’hydrogel polysaccharidique réhydraté 2’ et gonflé, non pas simplement par l’eau provenant de la pièce en matériau absorbant 1 mais plutôt par une solution de milieu de culture en provenance de la pièce en matériau absorbant 1.

Ainsi activé, le dispositif de culture cellulaire est prêt à recevoir l’échantillon à analyser. Une fois l’échantillon inoculé sur le dispositif, notamment par des opérations d’étalement et de dispersion des cellules, par exemple, au moyen d’une oëse 6, l’ensemble est incubé à une température et pour une durée établies, avant lecture des résultats.

Par sa consistance et sa texture bien particulières, la couche/pellicule d’hydrogel polysaccharidique réhydraté 2’ d’un dispositif de culture microbiologique selon l’invention permet de créer une surface de culture, à la fois lubrifiée et adhérente pour les cellules, apte à recevoir les microorganismes et permettre leur isolement par des opérations et moyens mécaniques habituellement utilisés pour étaler les cellules sur la surface d’un milieu gélosé classique. Par ailleurs, du fait de sa grande exposition aux échanges gazeux et aux phénomènes d’assèchement et à ses propriétés hyper-absorbantes, cette couche/pellicule d’hydrogel polysaccharidique 2’ va pouvoir s’auto-régénérer, tout au long de la période d’incubation et de façon continue, de la solution de milieu de culture provenant de la pièce en matériau absorbant 1.

Comme également représenté à la Figure 1, le dispositif de culture microbiologique peut également intégrer une membrane perméable intercalaire 3 venant s’intercaler entre la pièce en matériau absorbant 1 et le feuillet d’hydrogel polysaccharidique déshydraté 2. Réalisée dans un matériau perméable, cette membrane perméable intercalaire 3, optionnelle, peut être utilisée à des fins très diverses, comme par exemple :

pour apporter un renfort mécanique et/ou une rigidité supplémentaire à l’ensemble du système, ou alors uniquement au feuillet d’hydrogel polysaccharidique déshydraté 2 et à la couche d’hydrogel polysaccharidique réhydraté 2’, pour améliorer le contact de la pièce en matériau absorbant 1 avec le feuillet d’hydrogel polysaccharidique déshydraté 2 et/ou avec la couche d’hydrogel polysaccharidique réhydraté 2’, pour faire office de couche réservoir pour la conservation de composés particuliers destinés à être mélangés à la composition de milieu de culture solubilisée en provenance de la pièce en matériau absorbant 1, avant d’atteindre la couche d’hydrogel polysaccharidique réhydraté 2’, pour améliorer le contraste et l’observation des colonies poussant à la surface du dispositif de culture microbiologique.

B/ - Fabrication des différents éléments constitutifs d’un dispositif de culture microbiologique selon l’invention

Bl/ - La pièce en matériau absorbant intégrant dans son épaisseur une composition de milieu de culture déshydratée

S’agissant de la pièce en matériau absorbant 1 entrant dans la constitution d’un dispositif de culture microbiologique selon l’invention, celle-ci est façonnée à partir d’un support tridimensionnel, de structure ouverte, poreuse, apte à recevoir en son sein, aussi bien un liquide (en particulier, un liquide aqueux) que des particules solides de granulométrie adaptée.

Pour les exemples et les essais qui vont suivre, les dispositifs de culture microbiologique testés comprennent une pièce en matériau absorbant intégrant une composition de milieu de culture, sèche ou déshydratée, confectionné à partir du non-tissé Airlaid SCA95NN81, de la compagnie SCA (Suède). Ce non-tissé bicomposant PET/CoPET (Polyester/coPolyester) a été spécialement traité pour pouvoir être adhésivé, par simple pressage à chaud (calandrage), sans ajout de colle. Il se caractérise également par une masse surfacique, avant calandrage (ou non-calandré), de l’ordre de 95 g.m'² pour une épaisseur de 2 mm. A partir de ce non-tissé, des pièces d’à peu près 6 cm de côté ont été découpées.

L’incorporation d’une composition de milieu de culture déshydratée, dans la masse même de ces pièces en matériau fibreux, a été réalisée avec une technique d’imprégnation à sec. A cet effet, environ 0,2 g d’une composition de milieu de culture formulée sous forme de poudre est saupoudrée sur chaque pièce de non-tissé découpée. L’ensemble est placé entre deux électrodes appliquant un voltage de 3200 V.mm'¹, pendant 15 secondes, avec une humidité relative comprise entre 35 % et 45 %.

Une fois l’imprégnation à sec achevée, les pièces de non-tissés sont calandrées à 60°C en appliquant une pression de 3.10⁵ Pa.cm'².

B2/ - Les milieux de culture formulés en poudre

En vue de tester les dispositifs de culture microbiologique selon l’invention, différentes compositions de milieu de culture déshydratées ont été utilisées. Celles-ci reprennent la composition des milieux de culture gélosés distribués par la société bioMérieux (France), à l’exception de l’agar agar et autres agents texturants. Il s’agissait plus particulièrement des milieux de la gamme chromID® (par exemple, chromID® CPS Elite, chromID® S. aureus, chromID® P. aeruginosa, chromID® VRE, chromID® Salmonella Elite).

Les dispositifs de culture microbiologique selon l’invention, ainsi élaborés, ont alors pu être testés pour la détection et l’isolement de bactéries telles que Escherichia coli, Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Enterobacter cloacae, Clostridium freundii, Streptococcus agalactiae et Serratia marcescens.

Une sélection de résultats obtenus est présentée aux Figures 3 à 15, sous forme de photographies.

B3/ - Les feuillets d’hydrogel polysaccharidique déshydraté

Les feuillets d’hydrogel polysaccharidique déshydraté 2, qui entrent dans la constitution des dispositifs de culture microbiologique selon l’invention, sont conçus avant tout de telle façon que, une fois réhydratés, ils puissent offrir aux microorganismes un support adapté à leur croissance et développement. La composition et la consistance de ces feuillets d’hydrogel polysaccharidique déshydraté 2 ont également été spécifiquement étudiées pour obtenir des surfaces adaptées aux opérations d’isolement et d’étalement des cellules, que ces feuillets d’hydrogel polysaccharidique soient dans un état réhydraté ou déshydraté.

Pour les exemples et les essais qui vont suivre, les feuillets d’hydrogel polysaccharidique déshydraté 2 constitutifs de dispositifs de culture microbiologique selon l’invention ont été préparés en procédant selon la méthode générale ci-après.

a) Préparation des hydrogels polysaccharidiques :

- Faire chauffer 500 mL d’eau distillée stérile dans un flacon en verre sur plaque chauffante.

- Rajouter le(s) gélifiant(s) en quantité définie et attendre que le mélange soit homogène et translucide en continuant de chauffer (porter à ébullition).

Après dissolution complète, rajouter le glycérol, homogénéiser et ajouter le(s) sel(s) de cation divalent servant de liant et d’a gent durcisseur, homogénéiser et porter à ébullition.

- Répartir 7 ml dans des boîtes de Pétri de 47 mm de diamètre.

- Laisser refroidir sur la paillasse.

- Démouler les pièces d’hydrogel à l’aide d’un scalpel.

b) Déshydratation des hydrogels polysaccharidiques :

- Enserrer les pièces d’hydrogels entre deux feuilles de papier absorbant.

- Placer l’ensemble au four, à une température de l’ordre de 40°C, pendant environ 6 heures ; l’opération peut également être effectuée pendant au moins une nuit, dans une étuve à chaleur sèche, portée à 32°C.

La Figure 2 est un photographie montrant les feuillets d’hydrogel déshydraté à la sortie du four. Avant passage au four ou à l’étuve, l’épaisseur des pièces d’hydrogel est de l’ordre de 3 mm. Après déshydratation, les feuillets font moins d’I mm d’épaisseur.

Les feuillets d’hydrogel polysaccharidique déshydraté 2 d’un dispositif de culture de microbiologique selon l’invention ont été déclinés sous différentes versions, en faisant varier, notamment :

la nature du gélifiant polysaccharidique (par exemple, gomme de gellane, gomme de xanthane, gommes de galactomannane, amidon, alginate de sodium, pectine, méthylcellulose et hydroxyméthylcellulose), la proportion entre l’eau et le gélifiant, utilisée lors de l’étape de préparation des hydrogels polysaccharidiques, la nature et la quantité des éventuels agents durcisseurs utilisés dans la préparation des hydrogels polysaccharidiques, la nature et la quantité des additifs éventuellement utilisés pour améliorer les propriétés physico-chimiques des hydrogels polysaccharidiques (hydratés) et/ou des feuillets d’hydrogel polysaccharidique déshydraté.

B4/ - La membrane perméable intercalaire (optionnelle)

En vue d’améliorer le contraste et l’observation des colonies poussant à la surface du dispositif de culture microbiologique, une membrane opaque à la lumière et d’une grande blancheur (par exemple, une blancheur CIE au moins égale à 65) peut être intercalée entre la pièce en matériau absorbant et le feuillet d’hydrogel polysaccharidique déshydraté. Cette membrane perméable intercalaire peut consister en une feuille de papier absorbant, de composition cellulosique.

C/ - Evaluation des dispositifs de culture microbiologique selon l’invention

Pour les feuillets d’hydrogel polysaccharidique déshydraté qui présentent une surface pleine, une intégrité structurelle et la tenue mécanique satisfaisante, des essais ont été menés en vue d’évaluer leur capacité à pouvoir constituer des supports de culture microbiologique à la fois performants et compatibles avec les opérations et les moyens mécaniques d’étalement et de dispersion des cellules.

Dans ce contexte, des cultures bactériennes ont été réalisées notamment avec des souches d’Escherichia coli, d’Enterococcus faecalis, de Proteus mirabilis de

Staphylococcus aureus, de Serratia marcescens, de Pseudomonas aeruginosa, d’Enterobacter cloacae, Clostridium freundii et de Cronobacter sakazaki. En fonction des bactéries d’intérêt à cultiver, les feuillets d’hydrogel polysaccharidique déshydraté à tester sont associés à des pièces en matériau absorbant incorporant dans leur épaisseur une composition de milieu de culture déshydratée particulière. La particularité de cette composition de milieu de culture déshydratée réside dans le fait qu’elle a été choisie pour pouvoir être adaptée à la croissance et au développement des bactéries d’intérêt, et qu’elles intègrent des composantes chromogéniques facilitant l’identification visuelle de ces bactéries d’intérêt.

Pour ce faire, les pièces en matériau absorbant, qui incorporent dans leur épaisseur une composition de milieu de culture déshydratée, sont placées dans des boîtes de Pétri de 90 mm de diamètre, puis humidifiées avec 6-7 mL d’eau distillée stérile. On surmonte alors ces pièces en matériau absorbant d’un feuillet d’hydrogel polysaccharidique déshydraté. Une fois l’hydratation de la pièce en matériau absorbant réalisée, le milieu de culture activé et la couche d’hydrogel polysaccharidique régénérée, le dispositif de culture microbiologique est ensemencé par 10 pl d’une solution calibrée à une charge bactérienne théorique de 10⁷ ufc.ml'¹. L’échantillon cellulaire est déposé au moyen d’une première oëse sur le premier cadran de la surface d’hydrogel. Le deuxième cadran est ensemencé avec une nouvelle oëse en étirant plusieurs stries à partir du premier cadran. Le troisième cadran est ensemencé comme le deuxième sans changer d’oëse. Le quatrième cadran est ensemencé par des stries non étirées à partir du second cadran.

Les boîtes sont placées dans une jarre avec un peu d’eau de façon à ce que les dispositifs de culture microbiologique ne se dessèchent pas. L’ensemble est alors incubé à 37°C pendant, 24 heures.

Quelques-uns des résultats obtenus ont été compilés et présentés aux Figures 3 à 13, sous la forme de photographies.

A la Figure 3, sont exposées des photographies de cultures et d’isolements d’//. coli menés sur des dispositifs de culture microbiologique dont les feuillets d’hydrogel polysaccharidique déshydraté ont été obtenus à partir d’hydrogels de gellane 13 g/L (c’est-à3065735 dire 13 g de gomme de gellane pour llitre d’eau), de structure renforcée au glycérol, à raison de 43 mL/L (c’est-à-dire 43 mL de glycérol par litre d’eau utilisé dans la préparation de l’hydrogel), et durcis avec :

3A : du MgCl₂, à raison de 1 g/L (c’est-à-dire 1 g de MgCl₂ par litre d’eau utilisé dans la préparation de l’hydrogel) ou 3B : du MgSO₄, à raison de 1 g/L.

La gomme de gellane utilisée ici pour préparer les feuillets d’hydrogel polysaccharidique déshydraté est du Gelrite®, distribué par la société CARL ROTH GmbH, Allemagne.

Que l’agent durcisseur soit du MgCl₂ ou du MgSO₄, les résultats obtenus sont très similaires. Les colonies d’A. coli poussent à la surface du feuillet d’hydrogel. Elles présentent une très belle taille et une très belle coloration. Leur morphotype correspond à celle des colonies d’A coli poussant sur une gélose chromogénique de référence telle que le chromID® CPS Elite.

A la Figure 4, sont exposées des photographies d’une culture et d’un isolement d’A coli menés sur un dispositif de culture microbiologique dont le feuillet d’hydrogel polysaccharidique déshydraté a été obtenu à partir d’un hydrogel de gellane 15 g/L, de structure renforcée au glycérol, à raison de 43 mL/L, et durci avec du CaCl₂, à raison de 1 g/L.

La gomme de gellane utilisée ici est du Gelrite®.

Par rapport aux exemples précédents, les colonies d’A coli apparaissent plus petites, avec une légère diffusion de la coloration en périphérie.

A la Figure 5, est exposée une photographie de cultures et d’isolements d’A coli menés sur des dispositifs de culture microbiologique dont les feuillets d’hydrogel polysaccharidique déshydraté ont été obtenus à partir d’hydrogels de gellane 15 g/L, de structure renforcée au glycérol, à raison de 43 mL/L, et durcis avec :

5A : du MgCl₂, à raison de 1 g/L, ou 5B : du MgCl₂, à raison de 5 g/L.

La gomme de gellane utilisée ici est du Gelzan™, distribué par la société CP KELCO, Etats-Unis.

Avec 1 g/L de MgCl₂, les colonies d’A. coli poussant à la surface du feuillet d’hydrogel, présentent une très belle taille et une très belle coloration. Leur morphotype correspond à celle des colonies d’A. coli poussant sur une gélose chromogénique de référence telle que le chromID® CPS Elite (Figure 5, partie 5C).

Avec 5 g/L de MgCl₂, les colonies sont plus petites.

Sans MgCl₂, les colonies sont très diffuses (Figure 5, partie 5D).

A la Figure 6, sont exposées des photographies de cultures et d’isolements (PE. faecalis menés sur des dispositifs de culture microbiologique dont les feuillets d’hydrogel polysaccharidique déshydraté ont été obtenus à partir d’hydrogels de gellane 15 g/L, de structure renforcée au glycérol, à raison de 43 mL/L, et durcis avec :

6A : du MgCl₂, à raison de 1 g/L,

6B : du MgCl₂, à raison de 2 g/L, ou

6C : du MgCl₂, à raison de 5 g/L.

La gomme de gellane utilisée ici est du Gelzan™.

Les colonies d’A. faecalis poussant à la surface du feuillet d’hydrogel, sont identiques, en taille, en couleur et en morphotype, aux colonies d’A. faecalis poussant sur une gélose chromogénique de référence telle que le chromID® CPS Elite.

A la Figure 7, sont exposées des photographies de cultures et d’isolements de P. mirabilis menés sur des dispositifs de culture microbiologique dont les feuillets d’hydrogel polysaccharidique déshydraté ont été obtenus à partir d’hydrogels de gellane 15 g/L, de structure renforcée au glycérol, à raison de 43 mL/L, et durcis avec :

7A : du MgCl₂, à raison de 1 g/L,

7B : du MgCl₂, à raison de 2 g/L, ou

7C : du MgCl₂, à raison de 5 g/L.

La gomme de gellane utilisée ici est du Gelrite®.

Les colonies de P. mirabilis poussant à la surface du feuillet d’hydrogel sont identiques, en taille, en couleur et en morphotype, aux colonies de P. mirabilis poussant sur une gélose chromogénique de référence telle que le chromID® CPS Elite.

A la Figure 8, est exposée une photographie de cultures et d’isolements d'E. coli menés sur des dispositifs de culture microbiologique dont les feuillets d’hydrogel polysaccharidique déshydraté ont été obtenus à partir d’hydrogels de gellane à 13 g/L ou 15 g/L, de structure renforcée au glycérol, à raison de 43 mL/L, et durcis avec du CaCf utilisé à 1 g/L ou 2 g/L :

8A, 8 A’ : gomme de gellane 13 g/L, CaCl₂ 1 g/L,

8B, 8B’ : gomme de gellane 13 g/L, CaCl₂ 2 g/L,

8C, 8C’ : gomme de gellane 15 g/L, CaCl₂ 1 g/L,

8D, 8D’ : gomme de gellane 15 g/L, CaCl₂ 2 g/L

La gomme de gellane utilisée ici est du Gelzan™.

Les quatre dispositifs de culture microbiologique testés ici donnent des résultats très similaires. Par rapport aux exemples de la Figure 5, dans lesquels MgCl₂ est utilisé pour durcir les hydrogels, E. coli forme ici des colonies de taille légèrement plus petites.

A la Figure 9, est exposée une photographie de cultures et d’isolements d’E. faecalis menés sur des dispositifs de culture microbiologique dont les feuillets d’hydrogel polysaccharidique déshydraté ont été obtenus à partir d’hydrogels de gellane 15 g/L, de structure renforcée au glycérol, à raison de 43 mL/L, et durcis avec :

- 9A:	du CaCl2 1 g/L
- 9B :	du CaCl2 2 g/L
- 9C :	du CaCl2 3 g/L

La gomme de gellane utilisée ici est du Gelzan™.

Alors que les exemples précédents correspondant à la Figure 8 laissent présager un certain avantage à utiliser MgCl₂ plutôt que CaCl₂ pour la culture d’//. coli, ce constat est moins évident pour la culture d’//. faecalis.

A la Figure 10, sont exposées des photographies d’une culture et d’un isolement d’E. coli menés sur un dispositif de culture microbiologique dont le feuillet d’hydrogel polysaccharidique déshydraté a été obtenu à partir d’un hydrogel de gellane 15 g/L, de structure renforcée au glycérol, à raison de 43 mL/L, et durci avec du MnCl₂, à raison de 1 g/L.

La gomme de gellane utilisée ici est du Gelrite®.

Par rapport à une culture d'E coli sur le milieu de référence chromID CPS Elite, les colonies d'E. coli apparaissent ici plus petites, mais leur coloration est notablement intensifiée par le CaCl₂.

A la Figure 11, sont exposées des photographies de cultures et d’isolements d’E. coli menés sur des dispositifs de culture microbiologique dont les feuillets d’hydrogel polysaccharidique déshydraté ont été obtenus à partir d’hydrogels polysaccharidiques de compositions variées :

- 11 Ai : gomme de gellane 15 g/L (plus précisément du Phytagel™, distribué par la société Sigma Aldrich, Etats-Unis), Glycérol 43mL/L, MgCl₂ 1 g/L,

- 11A₂ : gomme de gellane 30 g/L (Phytagel™), Glycérol 43mL/L, MgCl₂ 1 g/L,

- 1 lBi : gomme de gellane 25 g/L (Gelrite®), Glycérol 43mL/L, MgCl₂ 1 g/L,

- 11B₂ : gomme de gellane 20 g/L (Gelrite®), Glycérol 43mL/L, MgCl₂ 1 g/L,

- 11B₃ : gomme de gellane 8 g/L (Gelrite®), Glycérol 43mL/L, MgCl₂ 1 g/L,

- 11B₄ : gomme de gellane 6 g/L (Gelrite®), Glycérol 43mL/L, MgCl₂ 1 g/L,

- 1 lCi : gomme de gellane 20 g/L (Gelzan™), Glycérol 43mL/L, MgCl₂ 1 g/L,

- 11C₂ : gomme de gellane 8 g/L (Gelzan™), Glycérol 43mL/L, MgCl₂ 1 g/L,

- llDi : gomme de xanthane 0,5 g/L, distribuée par la société SIGMA ALDRICH,

France,

- 11D₂ : gomme de xanthane 10 g/L

- 11Ει, 1 lEf : amidon de pomme de terre 0,5 g/L, distribué par la société CARL ROTH

GmbH, Allemagne.

- 11E₂, 11ë₂’ : amidon de pomme de terre 15 g/L

A la Figure 12, sont exposées des photographies de cultures et d’isolements d’E. coli menés sur des dispositifs de culture microbiologique dont les feuillets d’hydrogel polysaccharidique déshydraté ont été obtenus à partir d’hydrogels de gellane 15 g/L (en l’occurrence, du Gelrite®), durcis avec du MgCl₂ à raison de 1 g/L, et dont la structure a été renforcée au glycérol à différentes concentrations :

- 12A : 32 mL/L

- 12B : 52 mL/L

- 12C : 62 mL/L

En augmentant la concentration de glycérol des hydrogels, E. coli forment de plus grosses colonies, qui semblent néanmoins moins bombées et plus étalées sur les hydrogels.

A la Figure 13, sont exposées des photographies de cultures et d’isolements de microorganismes menés sur des dispositifs de culture microbiologique dont les feuillets d’hydrogel polysaccharidique déshydraté ont été obtenus à partir d’un hydrogel de Gelzan™ 15 g/L, durcis avec du MgCh, à raison de 1 g/L.

Ces dispositifs de culture microbiologique ont été testés également avec succès pour la culture et la détection de Streptococcus agalactiae (13 A), de Serratia marcescens, (13B), et pour la co-culture et la co-détection de S. marcescens et S. aureus (13C).

Claims (16)

1. REVENDICATIONS

   1. Dispositif de culture microbiologique, comprenant :

   - une pièce en matériau absorbant (1) ayant une face supérieure au moins sensiblement plane et incorporant dans son épaisseur une composition de milieu de culture déshydratée,

   - reposant sur ladite pièce en matériau absorbant (1), un feuillet d’hydrogel polysaccharidique déshydraté (2) et réhydratable à des températures comprises entre 5°C et 40°C ; ledit feuillet d’hydrogel déshydraté (2) étant apposé directement sur . la face supérieure de ladite pièce en matériau absorbant (1), ou indirectement au travers d’une membrane perméable intercalaire (3).
2. 2. Dispositif de culture microbiologique selon la revendication 1, dans lequel ledit feuillet d’hydrogel polysaccharidique déshydraté (2) est un feuillet d’hydrogel déshydraté de gellane, de xanthane, de galactomannane, d’amidon et/ou d’un mélange de ceux-ci.
3. 3. Dispositif de culture microbiologique selon la revendication 1 ou 2, dans lequel ledit feuillet d’hydrogel polysaccharidique déshydraté (2) a été préparé par déshydratation d’une couche d’hydrogel de composition à base d’eau et d’au moins un gélifiant polysaccharidique choisi parmi une gomme de gellane, une gomme de xanthane, une gomme de galactomannane, de l’amidon et un mélange de ceux-ci.
4. 4. Dispositif de culture microbiologique selon la revendication 3, dans lequel ledit feuillet d’hydrogel polysaccharidique déshydraté (2) est obtenu par déshydratation d’une couche d’hydrogel polysaccharidique préparée en mélangeant à un litre d’eau, 0,1 à 30 g d’au moins un gélifiant polysaccharidique.
5. 5. Dispositif de culture microbiologique selon l’une quelconque des revendications 1 à 4, dans lequel ledit feuillet d’hydrogel polysaccharidique déshydraté (2) est obtenu par déshydratation d’une couche d’hydrogel de gellane, préalablement préparée en mélangeant à un litre d’eau, 10 à 20 g de gomme de gellane et, préférentiellement, 13 à 15 g de gomme de gellane.
6. 6. Dispositif de culture microbiologique selon l’une quelconque des revendications 1 à 4, dans lequel ledit feuillet d’hydrogel polysaccharidique déshydraté (2) est obtenu par • déshydratation d’une couche d’hydrogel de xanthane, préalablement préparée en mélangeant à un litre d’eau, 0,2 à 10 g de gomme de xanthane.
7. 7. Dispositif de culture microbiologique selon l’une quelconque des revendications 1 à 4, dans lequel ledit feuillet d’hydrogel polysaccharidique déshydraté (2) est obtenu par déshydratation d’une couche d’hydrogel de xanthane et de gallactomannane, préalablement préparée à partir d’un mélange de gomme de xanthane et de gomme de graine de caroube.
8. 8. Dispositif de culture microbiologique selon l’une quelconque des revendications 1 à 4, dans lequel ledit feuillet d’hydrogel polysaccharidique déshydraté (2) est obtenu par déshydratation d’une couche d’hydrogel d’amidon, préalablement préparée en mélangeant à un litre d’eau, 0,5 à 15 g d’amidon.
9. 9. Dispositif de culture microbiologique selon l’une quelconque des revendications 1 à 4, dans lequel ledit feuillet d’hydrogel polysaccharidique déshydraté (2) est obtenu par déshydratation d’une couche d’hydrogel de gellane et d’amidon, préparée à partir d’un mélange de gomme de gellane et d’amidon, avec un ratio pondéral [gomme de gellane]/[amidon] compris entre 40:1 et 2:3.
10. 10. Dispositif de culture microbiologique selon la revendication 4, dans lequel ledit feuillet d’hydrogei polysaccharidique déshydraté (2) est renforcé structurellement par voie chimique au moyen d’un additif de renfort choisi parmi le glycérol, l’éthylène glycol et le polyéthylène glycol.
11. 11. Dispositif de culture microbiologique selon l’une quelconque des revendications y

    précédentes, dans lequel ledit feuillet d’hydrogel polysaccharidique déshydraté (2) comprend, en outre, au moins un agent durcisseur choisi parmi les sels de cation divalent.
12. 12. Dispositif de culture microbiologique selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel ledit feuillet d’hydrogel polysaccharidique déshydraté (2) comprend, en outre, au moins un agent durcisseur choisi parmi le chlorure de magnésium (MgCl₂), le chlorure de calcium (CaCl₂), le sulfate de magnésium (MgSO₄) et le chlorure de manganèse (MnCl₂).
13. 13. Dispositif de culture microbiologique selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel ledit feuillet d’hydrogel polysaccharidique déshydraté (2) ’ comprend, en outre, au moins un agent plastifiant.
14. 14. Dispositif de culture microbiologique selon l’une quelconque des revendications 10 à 12, caractérisé en ce que, non-calandrée, ladite pièce en matériau absorbant (1) présente une masse surfacique comprise entre 50g.m² et 150 g.m'², pour une épaisseur comprise

    5 entre 0,5 mm et 10 mm.
15. 15. Dispositif de culture microbiologique en kit à assembler, comprenant :

    - au moins une pièce en matériau absorbant (1) ayant une face supérieure au moins sensiblement plane et incorporant dans son épaisseur une composition de milieu de culture déshydratée,

    10 - au moins un feuillet d’hydrogel polysaccharidique déshydraté (2) et réhydratable à des températures comprises entre 5°C et 40°C, et

    - optionnellement, au moins une membrane perméable intercalaire (3).
16. 16. Dispositif de culture microbiologique en kit à assembler selon la revendication 15, permettant le montage d’un dispositif de culture microbiologique tel que défini par l’une

    15 quelconque des revendications 1 à 14.

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