FR3086540A1 - Procede de traitement de la peau ridee par injection de particules de copolymere dibloc - Google Patents

Abstract

L'invention concerne un procédé de traitement de la peau présentant des signes de vieillissement cutané comprenant l'administration par injection dans la peau d'une composition liquide comprenant, dans un milieu physiologiquement acceptable, des particules de polymère dibloc acide hyaluronique-b-polypeptide hydrophobe, le bloc acide hyaluronique ayant de 5 à 5000 unités d'acide hyaluronique, le bloc polypeptide hydrophobe ayant de 5 à 500 unités peptidiques. Les particules peuvent comprendre un polymère dibloc additionnel segment hydrophile-b-polypeptide hydrophobe.

Description

La présente invention concerne un procédé de traitement de la peau, en particulier de la peau ridée, comprenant l’injection dans la peau d’une composition liquide comprenant des particules de polymère bloc d’acide hyaluronique.

Au cours du processus de vieillissement, il apparaît différents signes sur la peau, très caractéristiques de ce vieillissement, se traduisant notamment par une modification de la structure et des fonctions cutanées. Les principaux signes cliniques du vieillissement cutané sont notamment l'apparition de ridules et de rides profondes, en augmentation avec l'âge.

L’acide hyaluronique est le composant principal de la matrice extracellulaire de la peau et son rôle est important pour l’homéostasie de la peau. L’enzyme hyaluronidase présente dans la peau est impliquée dans la dégradation (hydrolyse) de l’acide hyaluronique. La diminution de la quantité d’acide hyaluronique peut influencer sur la qualité de la peau. Il est connu, par exemple de la publication « Anti skin aging benefits of exopolymers from Aureobasidium pullulans SM2001 », Kyung Hu Kim and al, Journal of Cosmetic Science, 65, p 285-298 (sept/oct 2014) que l’inhibition de la hyaluronidase présente un intérêt dans le domaine de la cosmétique notamment comme action anti-âge, et particulièrement antirides.

L’acide hyaluronique est également connu comme composant principal des produits de comblement (fillers) utilisés pour la chirurgie esthétique par injection comme décrit par exemple dans les articles « The Hyaluronic Acid Fillers », Greene, J. J. et al Facial Plastic Surgery Clinics 23 (4), 423 et « The science of hyaluronic acid dermal fillers » Tezel, A. et al Journal of cosmetic and laser therapy : official publication of the European Society for Laser Dermatology 2008, 10 (1), 35.

Toutefois, la durée de vie de tels produits de comblement est limitée en raison de la dégradation de l’acide hyaluronique par la hyaluronidase présente dans la peau.

Les inventeurs ont découvert que des particules de polymère dibloc d’acide hyaluroniqueb-polypeptide hydrophobe présentent une activité anti-hyaluronidase, en particulier antihyaluronidase-1, et permettent ainsi d’atténuer les signes de vieillissement cutanés, en particulier les rides de la peau.

Des polymères diblocs d’acide hyaluronique et de polypeptides ainsi que leurs particules micellaires sont décrits dans le document WO 2010/049611.

Il n’est pas connu de particules de polymère capable d’inhiber la hyaluronidase, notamment la hyaluronidase-1.

En outre, comme démontré dans les exemples décrits ci-après, les particules utilisées selon la présente invention ont une activité inhibitrice de hyaluronidase-1 supérieure à celle des inhibiteurs connus que sont le polystyrène sulfonate et le néomycine sulfate.

Du fait de la bonne activité inhibitrice de hyaluronidase-1, les particules de polymère dibloc utilisées selon l’invention ont un intérêt particulier pour traiter la peau par injection. En effet, les particules ont une durée de vie plus longue que celle des produits de comblement classiques à base d’acide hyaluronique.

De façon plus précise, l’invention a pour objet un procédé de traitement, en particulier cosmétique, de la peau présentant des signes de vieillissement cutané, en particulier de la peau ridée, comprenant l’administration par injection dans ou à travers la peau d’une composition liquide, en particulier stérile, comprenant, dans un milieu aqueux physiologiquement acceptable, des particules de polymères diblocs acide hyaluronique-bpolypeptide hydrophobe tels que décrits ci-après.

De plus, les inventeurs ont découvert que l’activité inhibitrice hyaluronidase des particules de polymère dibloc acide hyaluronique-b-polypeptide hydrophobe pouvait être modulée en associant au sein des particules un polymère dibloc additionnel (dénommé deuxième polymère bloc par la suite) de type segment hydrophile-b-polypeptide hydrophobe tel que décrit ci-après.

Aussi, l’invention a également pour objet une composition liquide, en particulier stérile, comprenant, dans un milieu aqueux physiologiquement acceptable, des particules d’un mélange d’un premier polymère dibloc acide hyaluronique-b-polypeptide hydrophobe et d’un deuxième polymère dibloc segment hydrophile-b-polypeptide hydrophobe tels que décrits ci-après.

La présente invention peut être mise en œuvre pour le traitement et/ou la réduction des effets inesthétiques du vieillissement de la peau.

Le procédé conforme à la présente invention s’avère ainsi avantageux pour le traitement de la peau présentant des signes de vieillissement cutané et/ou de photo-vieillissement cutané.

Il permet ainsi de traiter les signes cutanés du vieillissement ou du photo-vieillissement choisis parmi la peau ridée, la peau présentant une altération de ses propriétés viscoélastiques ou biomécaniques, la peau présentant une altération dans la cohésion de ses tissus, la peau amincie, la peau présentant une altération de son aspect de surface et/ou de grain.

Avantageusement, le procédé conforme à l’invention concerne le traitement de la peau ridée.

En particulier, le procédé conforme à l’invention est un procédé cosmétique et non thérapeutique.

Le procédé selon l'invention est en particulier destiné à traiter la peau humaine du visage et/ou du corps et/ou à diminuer ou effacer les signes du vieillissement cutané, en particulier à réduire ou effacer les rides et/ou les ridules de la peau.

Par « polymère dibloc », on entend une structure linéaire dans laquelle un premier bloc et un deuxième bloc sont reliés par une de leurs extrémités.

Polymère bloc d’acide hyaluronique

L'acide hyaluronique est un glycosaminoglycane linéaire composé d'unités répétitives de D-acide glucuronique et de N-acetyl-D-glucosamine liées entre elles par des liaisons glycosidiques alternées beta-1,4 et beta-1,3.

Le bloc d’acide hyaluronique comprend de 5 à 5000 unités d’acide hyaluronique, de préférence de 10 à 500 unités, et préférentiellement de 10 à 50 unités.

Le bloc polypeptide hydrophobe peut être constitué de polypeptides issus de la polycondensation de composés acides aminés choisis parmi l’alanine, l’isoleucine, la leucine, la phénylalanine, la proline, la pyrrolysine, la sérine, la valine, le glutamate de benzyle, le glutamate d'alkyle(C-|-C22). la trifluoroacétyl-lysine, l’hydroxyalkyl(C-|-C22)asparagine, l’hydroxyalkyl(C-|-C22)-^asP^artamide, l’aspartate de benzyle.

Le bloc polypeptide hydrophobe peut être constitué d’un polypeptide choisi parmi la poly(alanine), la poly(isoleucine), la poly(leucine), la poly(phénylalanine), la poly(proline), la poly(pyrrolysine), la poly(sérine), la poly(valine), le poly(glutamate de benzyle), le poly(glutamate d'alkyle(C-|-C22)). I^a poly(trifluoroacétyl-lysine), la poly(hydroxyalkylC(C-|-C22)-^asP^ara9i^ne). I^a poly(hydroxyalkyl(C-|-C22)-^asP^artamide), le poly(aspartate de benzyle).

De préférence, le polypeptide hydrophobe est choisi parmi la poly(alanine), la poly(isoleucine), la poly(leucine), la poly(phénylalanine), la poly(valine), le poly(glutamate de benzyle), la poly(trifluoroacétyl-lysine), le poly(aspartate de benzyle).

Selon un mode de réalisation préféré, le polypeptide hydrophobe est le poly(glutamate de benzyle).

Le bloc polypeptide hydrophobe comprend de 5 à 500 unités peptidiques, de préférence de 10 à 100 unités, et préférentiellement de 20 à 50 unités peptidiques.

On entend par bloc hydrophobe un bloc insoluble dans l’eau à 25 °C à 1 % en poids.

Avantageusement, le polymère dibloc est tel que le rapport massique bloc d’acide hyaluronique/ bloc polypeptide hydrophobe peut aller entre 0,2 et 5, de préférence entre 0,5 et 2.

Avantageusement, les polymères diblocs utilisés selon l'invention présentent un poids moléculaire moyen en poids (Mw) allant de 1000 à 50 000 g/mole.

Le poids moléculaire peut être mesuré par chromatographie d’exclusion stérique. L’éluant utilisé est le DMSO contenant 1 g/L LiBr. La colonne utilisée est une combinaison de trois colonnes ayant pour références commerciales : TSKgel HHR-L ; G3000HHR(7.8*300) ; G2000HHR(7.8*300) de chez TOSOH. Le débit d’éluant est de 0.5ml/min avec une pression à 9 x 10® Pa (90 bars) à 80°C. Le produit à la sortie de la colonne est détecté avec un réfractomètre et par la diffusion de lumière multiangle.

Selon un mode de réalisation de l’invention, les particules de polymère dibloc acide hyaluronique-b-polypeptide hydrophobe peuvent comprendre un polymère dibloc additionnel (appelé aussi deuxième polymère dibloc) segment hydrophile-b-polypeptide hydrophobe.

Ainsi, les particules comprennent un mélange d’un premier polymère dibloc acide hyaluronique-b-polypeptide hydrophobe et d’un deuxième polymère dibloc segment hydrophile-b-polypeptide hydrophobe.

Le deuxième polymère dibloc additionnel est distinct du premier polymère dibloc.

Avantageusement, les particules peuvent comprendre un mélange des premier et deuxième polymère blocs selon un ratio massique premier polymère bloc/deuxième polymère bloc allant de 0,25 à 4.

Le segment hydrophile du polymère bloc additionnel est choisi parmi, ou constitué de :

a) le poly(éthylène glycol) ayant un poids moléculaire allant de 1 KDa à 500 KDa, de préférence allant de 2 kDa à 100 kDa ;

b) un polysaccharide choisi parmi le dextran, le chitosane, la laminarine, le pullulane, les alginates, l'héparine, l'héparane sulfate, le chondroïtine sulfate, la pectine, le xylane, l'amylose, l'amylopectine, l’agarose , le polysaccharide ayant un degré de polymérisation allant de 5 à 5000, de préférence allant de 10 à 500.

De préférence, le segment hydrophile est constitué de poly(éthylène glycol).

Le poly(éthylène glycol) peut être fonctionnalisé en bout de chaîne par un groupement choisi parmi les groupements méthoxy, amine, alcool, thiol, alcyne, azide, maléimide, et de préférence par un groupement méthoxy.

Ledit segment est hydrophile en conditions physiologiques : il est soluble dans l’eau à 25 °C à 1 % en poids.

Le bloc polypeptide hydrophobe est similaire à celui décrit précédemment pour le polymère bloc acide hyaluronique-b-polypeptide hydrophobe.

Selon un mode préféré de réalisation, le premier polymère dibloc comprend un segment de liaison reliant les deux blocs tels que décrits précédemment et ci-après.

Le segment de liaison est notamment issu de la réaction d’un groupe azoture et d’un groupe alcyne, et a par exemple pour la structure suivante :

N^=N

* désignant les points de fixation avec un bloc du polymère

Le mode de préparation des polymères utilisés selon l’invention est connu et notamment décrit dans le WO-A-2010/049611, dans l’ouvrage Peptide-Based Materials , Cheng, J. & Deming, T. J., edition Timothy Deming (ISBN 978-3-642-27138-0) et dans les articles « Biocompatibility study of two diblock copolymeric nanoparticles for biomedical applications by in vitro toxicitytesting », Goni-de-Cerio F. et al, J Nanopart Res (2013) 15:2036; “Amphiphilic PEO-b-PBLG Diblock and PBLG-b-PEO-b-PBLG Triblock Copolymer Based Nanoparticles: Doxorubicin Loading and In Vitro Evaluation” Kakkar D. et al, Macromolecular Bioscience, 2015, 15, 124-137.

La synthèse des polymères diblocs met en œuvre des réactions chimiques bien contrôlées, en particulier les réactions de « chimie-click » permettant un couplage efficace et quantitatif dans des conditions douces.

Parmi les réactions de « chimie-click », on peut citer, par exemple, les cycloadditions d'espèces insaturées (par exemple, les cycloadditions 1 ,3- dipolaires azide-alcyne, les réactions de Diels Aider entre un diène et un diénophile), les réactions impliquant un groupe carbonyle électrophile, de type non aldol (par exemple, formation d'éthers d'oxime à partir d'une oxyamine, d'hydrazones à partir d'une hydrazine, ou de thiosemicarbazones à partir d'une thiosemicarbazine), les réactions mettant en jeu un groupement thiol (formation de thioéthers à partir d'un alcène et de disulfures mixtes), les réactions impliquant des fonctions acides thiocarboxyliques ou thioesters (formation des liaisons thioesters et amides) et les ligations de Staudinger impliquant des fonctions phosphine et azide. Chacun des groupes fonctionnels cités ci-dessus peut être introduit indifféremment sur le groupement polypeptide ou sur le groupement polysaccharide pour le couplage.

De façon connue, des polymères diblocs polysaccharide-b-polypeptide peuvent être préparé selon un procédé de synthèse comprenant les étapes consistant à :

- soumettre ledit polysaccharide à une amination réductrice de manière à introduire une fonction alcyne à une extrémité de la chaîne polysaccharidique,

- introduire une fonction azoture à une extrémité de la chaîne polypeptidique, et

- coupler la chaîne polysaccharidique et la chaîne polypeptidique dans un solvant commun.

Selon une autre alternative, ledit procédé de synthèse comprend les étapes consistant à :

- introduire une fonction alcyne à une extrémité de la chaîne polypeptidique,

- soumettre ledit polysaccharide à une amination réductrice de manière à introduire une fonction azoture à une extrémité de la chaîne polysaccharidique, et

- coupler la chaîne polypeptidique et la chaîne polysaccharidique dans un solvant commun.

L'amination réductrice peut être effectuée, par exemple, à l'aide d'une amine telle que la propargylamine en présence d'un agent réducteur tel que le borocyanohydrure de sodium. La fonction azoture peut être introduite à l'extrémité de la chaîne polypeptidique à l'aide d'un agent bifonctionnel, tel que le 3- azidoaminopropane, la fonction aminée servant à amorcer la polymérisation par ouverture de cycle du monomère NCA de l'acide aminé correspondant. La longueur du bloc polypeptide peut ainsi être contrôlée par le rapport molaire monomère NCA/agent bifonctionnel.

Formation des particules en dispersion aqueuse :

Les premier et deuxième polymères diblocs décrits précédemment sont des composés amphiphiles aptes à s'auto-assembler pour former des particules de type vésicules micellaires en dispersion aqueuse.

Ces particules présentent une bonne stabilité, notamment après un stockage d’un mois à la température ambiante (25 °C).

Les particules de polymère dibloc (vésicules micellaires) peuvent être préparées par différents procédés usuels tels que, par exemple, la dissolution directe, l'hydratation de film, le procédé d'émulsification/diffusion ou la nanoprécitation. On utilisera de préférence la nanoprécipitation, qui consiste à mélanger une solution de polymère dibloc ou d’un mélange de polymères diblocs le cas échéant, dans un solvant organique miscible à l'eau. L'introduction d'une solution organique du copolymère dibloc dans l'eau sous agitation modérée induit simultanément une séparation de phases et un auto-assemblage qui progresse au fur et à mesure que le solvant organique diffuse dans la phase aqueuse, celleci étant en excès par rapport à la phase organique. Un solvant organique approprié est, par exemple, le diméthylsulfoxyde (DMSO) ou le formamide. Après élimination du solvant organique par évaporation et/ou dialyse, on récupère les particules (vésicules) directement en dispersion aqueuse. La taille des particules peut être modulée en ajustant le procédé d'émulsification/diffusion ou de nanoprécitation (sens d'ajout, nature du solvant organique, volume des phases, concentration en copolymère...).

Pour préparer les particules de mélange des premier et deuxième polymères diblocs, on effectue d’abord le mélange des premier et deuxième polymères diblocs dans ledit solvant organique puis on prépare les particules avec ce mélange des deux polymères diblocs.

La taille moyenne en volume des particules de polymère dibloc peut aller de 10 nm à 1 pm, de préférence de 10 à 500 nm et préférentiellement de 20 à 100 nm.

La taille moyenne peut être mesurée par analyse de la diffusion dynamique de lumière.

La composition utilisée selon l’invention est une composition liquide et comprend un milieu aqueux physiologiquement acceptable.

Par « milieu physiologiquement acceptable », on entend un milieu dénué de toxicité et compatible avec l’injection à travers la peau.

Par « composition liquide », on entend une composition s’écoulant sous son propre poids instantanément.

En particulier, la composition selon l’invention est une composition adaptée à une administration par injection dans la peau pour son utilisation pour estomper les rides de la peau.

Avantageusement, la composition selon l’invention est une composition stérile.

Par « stérile », on entend qualifier un environnement apte à garantir à la composition l’innocuité requise pour une administration dans ou à travers la peau, notamment intraépidermique et/ou intradermique et/ou sous-cutanée. En particulier, il est essentiel que la composition formée du milieu physiologiquement acceptable contenant les particules de polymère dilbloc et devant être administrée selon une technique d’injection, par exemple selon la technique de mésothérapie, soit dénuée de tout corps contaminant susceptible d’initier une réaction secondaire indésirable au niveau de l’organisme hôte.

Pour obtenir une composition stérile, le milieu physiologiquement acceptable liquide et les particules de polymère dibloc formant la composition administrable selon l’invention peuvent être soumis, de manière réunie ou séparée, à un processus de stérilisation selon une des méthodes conventionnelles bien connues de l’homme de l’art, telles que par exemple chauffage en autoclave, irradiations ionisantes telles que les faisceaux d’électrons et rayons gamma.

La composition liquide comporte un milieu aqueux physiologiquement acceptable.

La composition peut comprendre un solvant ou un mélange de solvants physiologiquement acceptables, comme par exemple les monoalcools en C2-C6, et de préférence choisis parmi l'éthanol, le propanol et l'isopropanol, des polyols tels que le glycérol, le propylèneglycol, le polyéthylèneglycol, l'hexylèneglycol, la glycérine, et le pentanediol, et des mélanges de ceux-ci.

La composition liquide peut comprendre un agent isotonique qui peut être choisi parmi les sucres et le chlorure de sodium.

Le milieu aqueux peut représenter de 30 % à 99 % en poids par rapport au poids total de la composition, de préférence de 50 % à 99 % en poids.

Les particules de polymère dibloc décrites précédemment peuvent être présentes dans la composition liquide en une teneur allant de 0,1 à 20 % en poids, par rapport au poids total de la composition, et de préférence allant de 0,1 à 10 % en poids.

Pour des raisons manifestes, la composition liquide destinée à être administrée dans la peau est suffisamment fluide pour faciliter l’injection avec une pression modérée.

La composition liquide a de préférence, au moment de l’injection, une viscosité inférieure à 100 Pa.s (100.000 cps), et de préférence intérieure à 10 Pa.s (10.000 cps) mesurée à 20 °C.

La composition liquide utilisée selon l’invention peut comporter outre les particules de polymère dibloc tout excipient habituellement utilisé dans le domaine des solutions injectables.

Les particules de polymère dibloc utilisées selon l’invention contribuent à limiter la dégradation de l’acide hyaluronique libre et permettent ainsi de prolonger la durée de vie des produits de comblement les contenant.

Comparativement, les acides hyaluroniques réticulés couramment utilisés dans les produits de comblement sont difficiles à injecter dans la peau.

Ainsi, la composition liquide peut comprendre notamment de l’acide hyaluronique libre, réticulé ou non réticulé (c’est-à-dire d’acide hyaluronique non copolymérisé avec un autre monomère non réticulant), ou l’un de ses sels, en particulier sous forme de sel de sodium. Comme acide hyaluronique libre on peut utiliser ceux vendus sous les dénominations commerciales Belotero® soft ou Esthelis® de chez Merz Aesthetics ; Emervel® de chez Galderma ; Juvederm® de chez Allergan ; Filorga NCTH 135HA de chez Filorga.

Le poids moléculaire de l'acide hyaluronique libre peut aller de notamment de 10 000 à 8 000 000 daltons, en particulier de 50 000 à 3 millions de daltons.

L’acide hyaluronique libre peut être présent dans la composition liquide en une teneur allant de 0,0001% à 25% en poids, par rapport au poids total de la composition, de préférence allant de 0,001 à 10% en poids, et préférentiellement allant de 1 à 3% en poids.

La composition peut être injectée en utilisant un quelconque des modes connus de l’homme du métier.

L’invention a également pour objet un système de traitement de la peau présentant des signes de vieillissement cutané, en particulier de la peau ridée, comportant :

- un conditionnement contenant au moins une dose d’une composition liquide telle que définie ci-dessus et,

- un dispositif d’injection dans ou à travers la peau dédié à l’administration de ladite dose.

Par « zone de traitement » on entend au sens de la présente invention une zone de la peau ayant reçu une partie de la composition.

Le système peut comporter un dispositif d’injection adapté à une injection intraépidermique et/ou intradermique et/ou sous-cutanée.

Le dispositif d’injection peut être choisi parmi une seringue, un ensemble de microseringues, un dispositif laser, hydraulique ou un scalpel.

Dans une variante de réalisation, le dispositif d’injection peut être adapté à la technique de la mésothérapie.

La mésothérapie est une technique de traitement par injection intraépidermique et/ou intradermique et/ou sous-cutanée de produit(s) actif(s).

La composition est administrée selon cette technique par injection sous forme de multiples gouttelettes de faible taille au niveau de l’épiderme, de la jonction dermo-épidermique et/ou du derme afin, notamment, de réaliser un nappage sous-cutané. La technique de mésothérapie est notamment décrite dans l’ouvrage « Traité de mésothérapie » de Jacques LE COZ, édition Masson, 2004.

La mésothérapie faite sur le visage est également appelée mésolift, ou également sous le terme anglosaxon de « mesoglow ».

L’administration par injection intraépidermique et/ou intradermique et/ou sous-cutanée selon l’invention vise à injecter une composition de l’invention dans une région épidermique, dermo-épidermique et/ou dermique.

L’injection peut être effectuée à travers une aiguille habituellement utilisée pour réaliser une injection intraépidermique et/ou intradermique et/ou sous-cutanée, par exemple convenant pour la mésothérapie.

Une aiguille d’un système selon l’invention peut présenter un diamètre variant de 0,26 à 0,4 mm, et une longueur variant de 4 à 13 mm.

En particulier, l’aiguille convenant à l’invention peut présenter un diamètre de 0,3 mm et une longueur de 6 mm.

L’aiguille est avantageusement à usage unique.

Avantageusement, l’aiguille est associée à une seringue ou tout autre dispositif permettant de délivrer à travers l’aiguille ladite composition injectable. Selon une variante de réalisation, un cathéter peut être intercalé entre l’aiguille et la seringue.

De façon connue, la seringue peut être actionnée manuellement par le praticien ou bien par un support de seringue comme les pistolets.

On peut utiliser un pistolet injecteur à compression hydropneumatique à hausse fréquence d’injection.

Ainsi, un pistolet injecteur convenant à l’invention peut être, par exemple, tel que décrit dans les brevets EP 1 208 858 ou US 5 300 029 introduits ici par référence.

En fonction du dispositif d’injection mis en œuvre, la composition liquide peut être injectée sous forme de gouttelettes.

Avantageusement, les gouttelettes peuvent posséder un volume moyen variant de 0,01 à 0,2 ml en particulier de 0,05 à 0,15 ml.

Le système de traitement peut comporter un pistolet injecteur, notamment un pistolet injecteur à compression hydropneumatique à haute fréquence d’injection.

Selon un mode de réalisation, l’étape d’injection peut être réitérée sur tout ou partie de la surface à traiter. La répétition des injections permet de créer un nappage de sorte que la composition de l’invention est distribuée de manière homogène dans la région cutanée à traiter.

La composition est avantageusement injectée au niveau des rides et des ridules.

Il y a plusieurs techniques d’injection. Par exemple, dans le cas d’une injection par mésothérapie, on peut utiliser la micro-poncture (piqûres à distance rapprochée) ou le multipoint (piqûres en plusieurs points plus espacés).

Les injections répétées peuvent être également réalisées au point par point manuellement. Les points de piqûres peuvent être espacés par exemple d’une distance variant de 5 mm à 1 cm.

Selon un mode de réalisation, un procédé de l’invention peut être effectué en plusieurs séances espacées l’une de l’autre de quelques jours par exemple de 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 jours à quelques semaines, par exemple 1, 2, 3, 4 semaines.

Selon un mode de réalisation, la ou les étape(s) d’administration par injection peuvent être avantageusement effectuée(s) au moyen d’un pistolet injecteur, notamment un pistolet injecteur à compression hydropneumatique à haute fréquence d’injection tel que défini précédemment.

Selon un mode particulier de réalisation, les régions cutanées avantageusement traitées par un procédé de l’invention peuvent être le contour des lèvres, la peau du visage et du cou, plus particulièrement des joues, du décolleté.

La présente invention peut être mise en œuvre pour le traitement et/ou la réduction des effets inesthétiques du vieillissement de la peau.

Le procédé conforme à la présente invention s’avère ainsi avantageux pour le traitement de la peau présentant des signes de vieillissement cutané et/ou de photo-vieillissement cutané.

Il permet ainsi de traiter les signes cutanés du vieillissement ou du photo-vieillissement choisis parmi la peau ridée, la peau présentant une altération de ses propriétés viscoélastiques ou biomécaniques, la peau présentant une altération dans la cohésion de ses tissus, la peau amincie, la peau présentant une altération de son aspect de surface et/ou de grain, dans un dispositif pour administration sous-cutanée intradermique et/ou intraépidermique.

Avantageusement, le procédé conforme à l’invention concerne le traitement de la peau ridée.

Bien entendu, l'homme du métier veillera à choisir ce ou ces éventuels composés additionnels et/ou leur quantité de manière telle que les propriétés anti-rides de la composition selon l'invention ne soient pas, ou substantiellement pas, altérées par l'adjonction envisagée.

L’application de la composition selon l’invention se fait selon les techniques habituelles, par exemple par application (notamment de crèmes, de gels, de sérums, de lotions) sur la peau destinée à être traitée, en particulier la peau du visage et/ou du cou, notamment la peau du contour de l’oeil. Dans le cadre de ce procédé, la composition peut être, par exemple, une composition de soin ou une composition de maquillage de la peau, en particulier de fond de teint.

L’invention va maintenant être décrite en référence aux exemples suivants donnés à titre illustratif et non limitatif.

Exemple 1 : Synthèse du copolymère bloc HA-b-PBLG

Etape 1 : synthèse de polyfL-qlutamate de benzyle) avec une fonction azoture (PBLGazoture)

g (19 mmol) de N-carboxyanhydride de L-glutamate de γ-benzyle ont été introduits sous atmosphère d'argon dans un ballon de type schlenk préalablement flammé sous vide, et dissous dans 60 ml de dichlorométhane anhydre. La solution a été agitée 10 minutes et 60 mg (0,59 mmol) de 1-azido-3-aminopropane ont été ajoutés au moyen d'une seringue purgée à l'azote. La solution a été agitée 40 heures sous vide à température ambiante. Le polymère formé a été récupéré par précipitation dans l'éther diéthylique puis séché sous vide. La masse de produit récupérée est 3,1 g.

Analyse H RMN (CDCI₃ : acide trifluoroacétique deutérié, 85 : 15) conforme au produit attendu.

Etape 2: synthèse d’acide hyaluronique avec une fonction alcyne (HA-alcyne)

NaCNBH

Tampon acétate pH=5.6 jours

L'acide hyaluronique (2,2 g ; 6.10^-4 mol) possédant un degré de polymérisation moyen en nombre égal à 15 a été solubilisé dans un tampon acétate (pH= 5,6) à une concentration massique de 2 %. 2,82 ml (4,4.10^-2 mol) de propargylamine et 2,77 g (4,4.10^-2 mol) de borocyanohydrure de sodium ont été ajoutés au milieu sous agitation. Après 5 jours de réaction à 50°C et sous agitation, le mélange réactionnel a été concentré à l'évaporateur rotatif et précipité dans 400 ml de méthanol froid. Le solide a été récupéré par centrifugation et lavé au méthanol refroidi. Le précipité a été séché sous vide pendant 2 jours. La masse de produit récupéré est 2 g.

Analyse ¹H RMN (D2O) conforme au produit attendu.

Etape 3 :

HA-alcyne + PBLG-azoture

CuSO4 Ascorbate de sodium

DMSO, N , 50°C, 24h

Acide hyaluronique alcyné (1,5 g ; 0,3 mmol) et PBLG azoture (1,32 g ; 0,2mmol) ont été solubilisés dans 50 ml de diméthylsulfoxyde (DMSO) anhydre à 60°C. Le mélange a été agité et CUSO4.5H2O (100 mg, 0,4 mol) et sodium L-ascorbate (125 mg ; 0,7 mmol) ont été ajoutés sous atmosphère d'azote. Le mélange réactionnel a été laissé sous agitation à 40 °C pendant 12 heures. Le mélange a été dialysé avec une solution d’acide éthylène diamine tétraacétique (EDTA) dans l’eau (1L, 20g/ml) pendant 3 jour en utilisant une membrane de dialyse 6 Spectra/Por® caractérisée par un seuil de coupure de 100kDa (de chez Spectrum Laboratories), puis avec l’eau purifiée MillQ pendant 3 jours. Le mélange a été concentré par ultrafiltration, et le copolymère obtenu a été récupéré par précipitation dans le méthanol et séché sous vide. On a obtenu 2 g de polymère.

Analyse H RMN (DMSO deutérié) conforme au produit attendu.

Exemple 2 : Synthèse de copolymère bloc PEG-b-PBLG

Le a- aminoéthyl-co-méthoxy polyoxyethylene CH3-O-(CH2CH2O)_n-CH2CH2NH2 n ~ 270 Mw=12 kDa (vendu sous la dénomination SUNBRIGHT® ME-100EA parla société NOF) (3 g, 0,25 mM) a été solubilisé dans 30 ml de diméthyl formamide (DMF) sec. Le Ncarboxyanhydride de γ-benzyl-L-glutamate (2,63 g, 10 mM) a été solubilisé dans 26,3 ml de DMF sec, puis ajouté goutte-à-goutte dans la solution de polyéthylène glycol amine. Le mélange a été agité à 40°C pendant 48 heures, puis concentré par cryodistillation. Le produit a été précipité dans le diéthyléther froid et séché sous vide pour obtenir 3,8 g de produit sous forme de poudre blanche.

Analyse 1 H-RMN (DMF-d7) conforme au produit attendu

Exemple 3 : Préparation de dispersion aqueuse de particules de polymère bloc

On a préparé 5 dispersions aqueuses de particules (P1 à P5) ayant les compositions en polymères blocs des exemples 1 et 2 suivantes (teneurs en % pourcentage massique par rapport au poids total de polymères)

Particules	HA-b-PBLG	PEG-b-PBLG	taille	Polydispersité de taille
P1	100	-	33,6 nm	0,156
P2	70	30	38,2nm	0,09
P3	50	50	48,6nm	0,2
P4	30	70	48,5nm	0,12
P5	-	100	81,6nm	0,13

Les dispersions de particules de polymères blocs ont été préparées selon le protocole suivant :

Les copolymères (HA-b-PBLG, PEG-b-PBLG ou mélange des deux polymères selon les proportions relatives citées dans le tableau ci-dessus) (masse totale 0,1g) ont été solubilisés dans 0,9 g de diméthyl sulfoxyde (DMSO). Le tampon phosphate saline (137 mM NaCI, 10 mM phosphate, pH=7.2, 9 ml) a été chauffé à 60°C. La solution de copolymères dans DMSO a été ajoutée dans le tampon phosphate sous agitation, et le mélange a été agité à 60°C pendant 1 heure. La solution a été dialysée avec 1L de solution tampon phosphate saline pendant 3 jours pour avoir la dispersion aqueuse de particules de polymère dans le tampon et sans DMSO. Le volume de la solution a été réajusté à 10 ml par ultrafiltration contre une membrane de dialyse à 100 kDa pour avoir une dispersion aqueuse de particules à la concentration de 10 mg/ml.

La taille des particules obtenues a été mesurée par la diffusion dynamique de lumière, avec l’appareil Zetasizer de chez Malvern à la température ambiante et à l’angle de 123°.

Exemple 4 : Evaluation in vitro de l’inhibition de hyaluronidase-1 des particules de polymère bloc

L’activité d’inhibition de hyaluronidase-1 a été mesurée en utilisant le test ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay).

Ce test consiste à suivre la dégradation d’acide hyaluronique par l’hyaluronidase-1 dans une solution contenant les particules de polymère bloc.

Dans ce test, l’intensité de la densité optique (le signal) dépend de la masse moléculaire de HA présente dans le milieu (le principe est décrit la publication « Molecular mass dependence of hyaluronan detection by sandwich ELISA-like assay and membrane blotting using biotinylated hyaluronan binding protein” de H. Yuan et al, Glycobiology 2013 Nov;23(11):1270-80).

Aussi, lors de la dégradation d’un échantillon d’acide hyaluronique, l’intensité de la densité optique va diminuer. Plus la densité optique est faible, plus l’acide hyaluronique est dégradé (poids moléculaire plus faible).

Protocole :

Le test ELISA est fait avec le kit Hyaluron duoset ELISA de chez R&D system en suivant les instructions du fournisseur. Toutes les mesures de densité optique ont été faites 6 fois sur le même échantillon pour calculer la valeur moyenne et l’écart type de mesure.

On a utilisé :

- un tampon acétate (10 mM, pH=4) de chez GE lifescience.

- Hyaluronidase-1 human recombinant (HYAL1) de chez R&D system.

- L’acide hyaluronique de masse moléculaire d’environ 1000 kDa (HA-1000kDa) de chez Lifecore.

Une solution à 1 mg/ml de HA-1000k Da a été préparée dans un tampon phosphate saline (150 mM NaCI, 10 mM phosphate, pH=7.2).

Une solution à 10 pg/ml d’HYALI a été préparée dans le tampon acétate.

Acide hyaluronique dégradé au contact de HYAL1 :

pL de solution HA-1000kDa, 5pL de solution HYAL1 et 985pL de tampon acétate ont été mélangés, et le mélange a été agité à 37°C pendant 20 minutes. Le mélange a été testé en ELISA en diluant 20 fois avec la solution de dilution du kit. On a noté la densité optique mesurée (DO HA) : celle-ci est quasi nulle.

Contrôle = acide hyaluronique sans dégradation (HA-1000kDa) :

pL de solution HA-1000kDa, 990 pL de tampon acétate ont été mélangés, et le mélange a été agité à 37°C pendant 20 minutes. Le mélange a été testé en ELISA en diluant 20 fois avec la solution de dilution du kit. On a noté la densité optique mesurée (DO contrôle).

On a ensuite testé les dispersions de particules P1 à P5 dans la même condition que celle qui permet de dégrader complètement l’acide hyaluronique HA-1000kDa.

Pour cela, chaque particules P1 à P5 l’inhibiteur a été ajouté à différentes doses dans la condition de dégradation.

Avec les mesures de densité optiques obtenues pour chacune des particules testées, on a défini l’efficacité d’enzyme en présence des particules.

Efficacité d’enzyme = (DO contrôle - DO particules) / (DO contrôle - DO HA)

La valeur de la densité optique mesurée diminue lorsque l’acide hyaluronique est dégradé (hydrolysé).

Protocole de la mesure d’efficacité d’enzyme en présence d’inhibiteur:

Une solution à 1mg/ml de HA-1000kDa a été préparée dans le tampon phosphate saline (150mM NaCI, 10mM phosphate, pH=7.2). Une solution à 10 pg/ml d’HYALI a été préparéé dans le tampon acétate Les solutions de l’inhibiteur (particules de polymère) à 100 pg/ml et 10pg/ml (en matière active de polymère) ont été préparées dans le tampon acétate. L’activité d’enzyme ont été mesuré en présence de l’inhibiteur à plusieurs concentrations : 10 ; 3,3 ; 1,1 ; 0.37 ; 0.12 ; 0.04 ; 0.01 pg/ml dans le mélange de dégradation.

10pL de solution HA-1000kDa, 5pL de solution HYAL1, 100 ou 33 ou 11 pL respectivement de solution d’inhibiteur à 100 pg/ml et 885 ou 952 ou 974 pL respectivement de tampon acétate ont été mélangés et agités à 37°C pendant 20 min. (le mélange final contient respectivement 10 ou 3.3 ou 1.1 pg/ml de l’inhibiteur).

D’autre part, 10pL de solution HA-1000kDa, 5pL de solution HYAL1, 37 ou 12 ou 4 ou 1 pL respectivement de solution d’inhibiteur à 10pg/ml et 948 ou 973 ou 981 ou 984 pL respectivement de tampon acétate ont été mélangés et agités à 37°C pendant 20 min. (le mélange final contient respectivement 0,37 ou 0,12 ou 0,04 ou 0.01 pg/ml de l’inhibiteur). Chacun des mélanges préparés a été testé en ELISA en le diluant 20 fois avec la solution de dilution du kit.

On a également testé deux références connues d’inhibiteur de hyaluronidase-1 :

- Polystyrène sulfonate (PSS) (Mw d’environ 75 000 ; référence 561223 de chez Aldrich) [activité inhibitrice décrite dans l’article Differential selectivity of hyaluronidase inhibitors toward acidic and basic hyaluronidases” Isoyama, T.; et al.. Glycobiology 2006, 16 (1), 11]

- néomycine sulfate [activité inhibitrice décrite dans l’article “The use of neomycin trisulfate to inhibit enzyme-mediated glycosaminoglycan degradation in bioprosthetic heart valves” Raghavan, D et al ; Biomaterials 2007, 28 (18), 2861]

Pour chaque dose d’inhibiteur testée, l’activité d’enzyme a été évaluée comme indiqué précédemment.

On a également déterminé la concentration critique pour une inhibition à 50% (IC 50) à partir des courbes de l’activité enzymatique en fonction des concentrations d’inhibiteur.

Les résultats obtenus sont décrits dans les figures.

La figure 1 montre les résultats d’efficacité enzymatique pour chacune des particules P1, P2, P3, P4, P5 en fonction de leur concentration.

La figure 2 montre les résultats d’efficacité enzymatique des particules P1, du polystyrène sulfonate et du néomycine sulfate en fonction de leur concentration.

Particules	IC 50 (en pg/ml)
P1	0,156 ±0,007
P2	0,410 ±0,035
P3	6,067 ± 0,786
P4	>10
P5	>10

Les résultats obtenus montrent que l’efficacité de particules pour inhiber la hyaluronidase1 augmente en fonction de la teneur en acide hyaluronique présent dans la particule.

Les particules P1 ont une activité d’inhibition de la hyaluronidase-1 supérieur à celle des deux références Polystyrène sulfonate et néomycine sulfate

Exemple 5 :

On prépare la composition suivante qui est ensuite conditionnée dans un flacon sous atmosphère stérile.

Dispersion aqueuse de particules P1 de l’exemple 3 0,5 g MA

Glycerol 5 g

Eau qsp 100 g

Une composition similaire est également préparée en utilisant l’une des dispersions de particules P2, P3 ou P4 de l’exemple 3.

Cette composition injectable est utilisée pour un traitement de l’épiderme ridé par la technique d’injection avec une seringue à une profondeur d’0,5 mm sous la zone surface.

On observe après injection une diminution des rides à la surface de la peau.

Exemple 6 :

On prépare la composition suivante qui est ensuite conditionnée dans un flacon sous atmosphère stérile.

Dispersion aqueuse de particules P1 de l’exemple 3

Gel hyaluronate de sodium (Belotero® soft de chez Merz Aesthetics) mg MA ml* * soit 20 mg MA de hyaluronate de sodium

Une composition similaire est également préparée en utilisant l’une des dispersions de 5 particules P2, P3 ou P4 de l’exemple 3.

Cette composition injectable est utilisée pour un traitement de l’épiderme ridé par la technique d’injection avec une seringue à une profondeur d’0,5 mm sous la zone surface.

On observe après injection une diminution des rides à la surface de la peau.

Claims (24)

1. REVENDICATIONS

   1. Procédé cosmétique de traitement de la peau présentant des signes de vieillissement cutané, en particulier de la peau ridée, comprenant l’administration par injection dans ou à travers la peau d’une composition liquide comprenant, dans un milieu aqueux physiologiquement acceptable, des particules de polymères dibloc acide hyaluronique-bpolypeptide hydrophobe, le bloc acide hyaluronique ayant de 5 à 5000 unités d’acide hyaluronique, le bloc polypeptide hydrophobe ayant de 5 à 500 unités peptidiques.
2. 2. Procédé selon la revendication précédente, caractérisé en ce que le bloc d’acide hyaluronique a de 10 à 500 unités d’acide hyaluronique, de préférence de 10 à 50 unités.
3. 3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que les particules comprennent un deuxième polymère dibloc segment hydrophile-b-polypeptide hydrophobe, le segment hydrophile étant choisi parmi :

   a) le poly(éthylène glycol) ayant un poids moléculaire allant de 1 KDa à 500 KDa, de préférence allant de 2 kDa à 100 kDa ;

   b) un polysaccharide choisi parmi le dextran, le chitosane, la laminarine, le pullulane, les alginates, l'héparine, l'héparane sulfate, le chondroïtine sulfate, la pectine, le xylane, l'amylose, l'amylopectine, l’agarose , le polysaccharide ayant un degré de polymérisation allant de 5 à 5000, de préférence allant de 10 à 500 ;

   le bloc polypeptide du deuxième polymère dibloc ayant de 5 à 500 unités peptidiques.
4. 4. Procédé selon la revendication précédente, caractérisé en ce que le segment hydrophile est le poly(éthylène glycol) ayant un poids moléculaire allant de 1 KDa à 500 KDa, de préférence allant de 2 kDa à 100 kDa.
5. 5. Procédé selon la revendication 3 ou 4, caractérisé en ce que le poly(éthylène glycol) est fonctionnalisé en bout de chaîne par un groupement choisi parmi les groupements méthoxy, amine, alcool, thiol, alcyne, azide, maléimide, et de préférence par un groupement méthoxy.
6. 6. Procédé selon l’une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce le bloc polypeptide hydrophobe est constitué de polypeptide issu de la polycondensation de composés acides aminés choisis parmi l’alanine, l’isoleucine, la leucine, la phénylalanine, la proline, la pyrrolysine, la sérine, la valine, le glutamate de benzyle, le glutamate d'alkyle(C-|-C22). la trifluoroacétyl-lysine, l’hydroxyalkyl(C-|-C22)-^asP^ara9i^ne. l’hydroxyalkyl(C-|-C22)-^asP^artamide, l’aspartate de benzyle.
7. 7. Procédé selon l’une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce le bloc polypeptide hydrophobe est constitué de polypeptide choisi parmi la poly(alanine), la poly(isoleucine), la poly(leucine), la poly(phénylalanine), la poly(proline), la poly(pyrrolysine), la poly(sérine), la poly(valine), le poly(glutamate de benzyle), le poly(glutamate d'alkyle(C-|-C22)). la poly(trifluoroacétyl-lysine), la poly(hydroxyalkylC(C-|C22)-^asP^ara9i^ne). la poly(hydroxyalkyl(C-|-C22)-aspartamide), le poly(aspartate de benzyle) ; et de préférence choisi parmi la poly(alanine), la poly(isoleucine), la poly(leucine), la poly(phénylalanine, la poly(valine), le poly(glutamate de benzyle), la poly(trifluoroacétyl-lysine, le poly(aspartate de benzyle).
8. 8. Procédé selon l’une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le bloc polypeptide hydrophobe est le poly(glutamate de benzyle).
9. 9. Procédé selon l’une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le bloc polypeptide hydrophobe a de 10 à 100 unités peptidiques, de préférence de 20 à 50 unités peptidiques.
10. 10. Procédé selon l’une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que les particules de polymère bloc sont sous forme de dispersion aqueuse.
11. 11. Procédé selon l’une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la composition comprend de l’acide hyaluronique libre, réticulé ou non réticulé, ou l’un de ses sels.
12. 12. Procédé selon l’une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que ladite composition est une composition stérile.
13. 13. Composition liquide comprenant, dans un milieu aqueux physiologiquement acceptable, des particules d’un mélange d’un premier polymère dibloc acide hyaluronique-bpolypeptide et d’un deuxième polymère dibloc segment hydrophile-b-polypeptide hydrophobe, le bloc acide hyaluronique ayant de 5 à 5000 unités d’acide hyaluronique, le bloc polypeptide hydrophobe des premier et deuxième polymères diblocs ayant de 5 à 500 unités peptidiques, le segment hydrophile étant choisi parmi :

    a) le poly(éthylène glycol) ayant un poids moléculaire allant de 1 KDa à 500 KDa, de préférence allant de 2 kDa à 100 kDa ;

    b) un polysaccharide choisi parmi le dextran, le chitosane, la laminarine, le pullulane, les alginates, l'héparine, l'héparane sulfate, le chondroïtine sulfate, la pectine, le xylane, l'amylose, l'amylopectine, l’agarose , le polysaccharide ayant un degré de polymérisation allant de 5 à 5000, de préférence allant de 10 à 500.
14. 14. Composition selon la revendication précédente, caractérisée en ce que le bloc d’acide hyaluronique a de 10 à 500 unités d’acide hyaluronique, de préférence de 10 à 50 unités.
15. 15. Composition selon la revendication 13 ou 14, caractérisée en ce que le segment hydrophile est le poly(éthylène glycol) ayant un poids moléculaire allant de 1 KDa à 500 KDa, de préférence allant de 2 kDa à 100 kDa.
16. 16. Composition selon la revendication 13 ou 15, caractérisée en ce que le poly(éthylène glycol) est fonctionnalisé en bout de chaîne par un groupement choisi parmi les groupements méthoxy, amine, alcool, thiol, alcyne, azide, maléimide, et de préférence par un groupement méthoxy.
17. 17. Composition selon l’une quelconque des revendications 13 à 16, caractérisée en ce le bloc polypeptide hydrophobe est constitué de polypeptide issu de la polycondensation de composés acide aminé choisis parmi l’alanine, l’isoleucine, la leucine, la phénylalanine, la proline, la pyrrolysine, la sérine, la valine, le glutamate de benzyle, le glutamate d'alkyle(C-|-C22). la trifluoroacétyl-lysine, l’hydroxyalkyl(C-|-C22)-^asP^ara9i^ne. l’hydroxyalkyl(C-|-C22)-^asP^artamide, l’aspartate de benzyle, et leurs mélanges.
18. 18. Composition selon l’une quelconque des revendications 13 à 17, caractérisée en ce le bloc polypeptide hydrophobe est constitué de polypeptide choisi parmi la poly(alanine), la poly(isoleucine), la poly(leucine), la poly(phénylalanine), la poly(proline), la poly(pyrrolysine), la poly(sérine), la poly(valine), le poly(glutamate de benzyle), le poly(glutamate d'alkyle(C-|-C22)). la poly(trifluoroacétyl-lysine), la poly(hydroxyalkylC(C-|C22)-^asP^ara9i^ne). la poly(hydroxyalkyl(C-|-C22)-aspartamide), le poly(aspartate de benzyle) ; et de préférence choisi parmi la poly(alanine), la poly(isoleucine), la poly(leucine), la poly(phénylalanine, la poly(valine), le poly(glutamate de benzyle), la poly(trifluoroacétyl-lysine, le poly(aspartate de benzyle).
19. 19. Composition selon l’une quelconque des revendications 13 à 18, caractérisée en ce que le bloc polypeptide hydrophobe est le poly(glutamate de benzyle).
20. 20. Composition selon l’une quelconque des revendications 13 à 19, caractérisée en ce que le bloc polypeptide hydrophobe a de 10 à 100 unités peptidiques, de préférence de 20 à 50 unités peptidiques.
21. 21. Composition selon l’une quelconque des revendications 13 à 20, caractérisée en ce que les particules de polymères diblocs sont présentes en une teneur allant de 0,1 à 20 % en poids, par rapport au poids total de la composition, et de préférence allant de 0,1 à 10 % en poids.
22. 22. Composition selon l’une quelconque des revendications 13 à 21, caractérisée en ce qu’elle contient de l’acide hyaluronique libre, réticulé ou non réticulé, ou l’un de ses sels.
23. 23. Composition selon l’une quelconque des revendications 13 à 22, caractérisée en ce 5 qu’elle est stérile.
24. 24. Système de traitement de la peau présentant des signes de vieillissement cutané, en particulier de la peau ridée, comportant :

    - un conditionnement contenant au moins une dose d’une composition liquide selon 10 l’une des revendications 13 à 23 et,

    - un dispositif d’injection dans ou à travers la peau dédié à l’administration de ladite dose.