HUT60741A

HUT60741A - Process for producing ammonium salts of n5-methyl-5,6,7,8-tetrahydrofolic acid, for separating (6rs)-diastereoisomer mixtures and for producing (6r)- and (6s)-alkali metal and alkali-earth metal salts

Info

Publication number: HUT60741A
Application number: HU911186A
Authority: HU
Inventors: Fabrizio Marazza; Jean Jacques
Original assignee: Sapec S A Fine Chemicals Barbe
Priority date: 1990-04-12
Filing date: 1991-04-11
Publication date: 1992-10-28
Also published as: AU635831B2; US5194611A; JPH0725876A; CA2040397A1; US5382581A; IL97826A0; ATE124043T1; FI911763L; HU911186D0; DE59105758D1; CH680731A5; IE911224A1; FI911763A7; EP0455013B1; AU7429791A; EP0455013A1; FI911763A0; MX25305A; JP2525965B2; ES2075247T3

Description

A találmányunk tárgya szintén eljárás az N⁵-metil-5,6,7,8-tetrahidrofolsav-ammónium-sók (6RS)-diasztereoizomer elegyeinek az egyes (6R)- és (6S)-diasztereoizomerekké való szétválasztására, valamint ezeknek a megfelelő (6R)- vagy (6S)-alkálifém- vagy alkáliföldfém-sókká való átalakítására.

Az N⁵-metil-5,6,7,8-tetrahidrofolsav, amelyet részben N⁵-metil-THF-ként rövidítünk, az uralkodó cirkuláló alakja redukált folátoknak emlős állatoknál.

Fennáll az igény arra, hogy ezt a természetes metabolitot gyógyászati készítményben hatóanyagként alkalmazzák, például vitaminként foláthiányos állapotok esetén. Az N⁵-metil-THF-t tartalmazó gyógyászati készítményeket alkalmazzák rák leküzdésére alkalmas vegyületek szinergetikus befolyásolására és/vagy a rák leküzdésénél alkalmazott vegyületek toxicitásának a csökkentésére és/vagy az emberi és/vagy állati sejtek védelmére. Az N⁵-metil-THF ilyen készítményekben általában 1 mg és 500 mg közötti, különösen 5 mg és 150 mg közötti mennyiségben van jelen adagolási egységenként. A készítmény előnyösen parenterális és/vagy orális gyógyászati készítmény. Ezzel kapcsolatban utalunk a leírásunk végén felsorolt 1- 5 számú irodalmi hivatkozásokra.

Az N^-metil-THF természetes alakjának az abszolút konfigurációja megfelel az (A) képletnek, és ezt (6S,L)-ként definiáljuk, a (6S) a pterin gyűrűrendszer Cg szénatomjának a konfigurációjára vonatkozik, és az L a glutamát-oldallánc a• · * · · · •·· ·· ······· ·· helyzetű szénatomjának a konfigurációját jelöli.

Az N⁵-metil-THF kereskedelemben hozzáférhető alakjait folsav kémiai redukálásával állítják elő, ezek (6RS)-diasztereoizomer-elegyek, amelyben a glutamát-oldallánc L konfigurációjú.

Az N⁵-metil-THF (6R)-diasztereoizomerjének a funkciójáról nem egyértelműek a vélemények. Feltehető, hogy az N⁵-metil-THF nem természetes (6R)-diasztereoizomerje inért, és változatlan formában válik ki (például a 13. számú irodalom). Ugyanakkor az is feltételezhető, hogy a nem természetes (6R)-diasztereoizomer emlősöknek, így az embereknek a sejtmembránján keresztül a folát-transzprotrendszerrel interferál (például 6. és 8. számú irodalom).

Az N⁵-metil-THF egyes (6S)- és (6R)-diasztereoizomerjei mg-nyi mennyiségekben állíthatók elő bizonytalan tisztaságban, vagy komplex enzimatikus reakciókkal (például 6. számú irodalom) vagy indirekt úton a megfelelő N⁵, N¹⁰-metilén-THF izomerek redukálásával, amelyeket a (6RS)-elegy kromatográfiás elválasztásával nyerhetünk (7. és 9. számú irodalom).

Az 5,6,7,8-tetrahidrofolsavat a THF jelöléssel rövidítjük.

Leírtak indirekt eljárásokat az N⁵-metil-THF egyes diasztereoizomer jeinek az előállítására (10. és 11. számú irodalom) . Ezek az eljárások az (1) képletű N⁵,N¹⁰-metenil-THF’Cl“ •HC1, illetve a (2) képletű N⁵,N¹⁰-metenil-THF«Cl“ frakcionált kristályosításán alapulnak, amit követően az elválasztott egyes (6R)- és (6S)-diasztereoizomereket kémiailag N⁵-metil-THF-fé alakítják. Ezek az eljárások ipari méretekben lefolytathatók, ·· · ··· ··· » · · ♦ · hátrányuk azonban, hogy több kémiai lépést foglalnak magukban, ami gazdaságossági szempontból kevésbé vonzó.

Találmányunk feladatául tűztük ki egyszerű, olcsó, hatékony eljárás kidolgozását, amellyel az N⁵-metil-THF-származék (6RS)-diasztereoizomer-elegyét a tiszta, egyes (6R)- és (6S)-diasztereoizomerekké választhatjuk szét.

Meglepő módon azt tapasztaltuk, hogy ez a célkitűzés a találmányunk szerint megoldható az N⁵-metil-THF (6RS)-diasztereoizomer-elegye új ammóniumsójának a frakcionált kristályosításával.

A találmányunk szerinti elválasztási eljárás és az új ammóniumsók mellett a találmányunk magában foglal két eljárást az említett ammóniumsók előállítására. A találmányunk tárgyát képezi továbbá eljárás a (6R)- vagy (6S)-N⁵-metil-THF alkálifém- vagy alkáliföldfém-sóinak az előállítására a megfelelő találmány szerinti diasztereoizomer-tiszta ammóniumsókból.

A találmányunk jellemzőit a független igénypontokban ismertetjük. Az előnyös kiviteli alakokat az aligénypontokban mutatjuk meg.

A következőkben különböző kiviteli alakokat mutatunk be.

Az igénypontokban definiált kiviteli alakokat általában a leíró részben nem ismételjük meg.

Az első találmány szerinti eljárásban a találmány szerinti ammóniumsók előállításának céljából az N^-metil-THF-t előnyösen kalciumsója formájában vízbe visszük. Ezt követően nitrogéntartalmú bázist, így primer vagy szekunder alkil- vagy aril-amint adunk az elegyhez. A jelenlévő kalcium-kationt célszerűen oxál• ·· ·« ···· ·· ··· ·· ·· · · • ·· · · ·4 ··· • · · · · · ··· ·· ···· ··· ··

- 5 savnak a hozzáadagolásával kalcium-oxalát formájában választjuk le, majd ezt kiszűrjük. A vizes szűrlet tartalmazza az oldott ammóniumsót. A víznek csökkentett nyomáson való lepárlása vagy liofilizálás után az ammóniumsót kapjuk.

Az ammóniumsók találmány szerinti másik előállítási módja szerint az N⁵-metil-THF-t, azaz a karbonsavat célszerűen vízbe vagy víznek és etanolnak és/vagy metanolnak az elegyébe visszük. Eszerint az eljárás szerint az alkálifém- vagy alkáliföldfém-kationok leválasztásának és elválasztásának a lépése nem szükséges, mint azt az első eljárásban ismertettük. A második találmányunk szerinti eljárás további lépései megfelelnek az első eljárás lépéseinek.

A találmányunk szerinti ammóniumsókat előállíthatjuk megfelelő oszlopon ioncserélő gyantákkal is, az oszlopon például a kalcium-kationt a kívánt ammónium-ionra cseréljük ki.

Az előzőekben ismertetett eljárások egyike szerint előállított találmány szerinti ammóniumsókat ezt követően frakcionált kristályosításnak vetjük alá, amelynek során a (6RS)-diasztereoizomer-elegyet az egyes tiszta (6R)- és (6S)diasztereoizomerekké választjuk szét. Ennek során előnyösen 1 tömegrész találmány szerinti ammóniumsót 5 tömegrésznyi, 85 térfogat% etanolt és 15 térfogat% vizet tartalmazó eleggyel keverjük össze az ammóniumsó tömegére vonatkoztatva. Az ammóniumsótól függően szükséges lehet az elegynek 40 - 60 oC hőmérsékletre való melegítése, hogy tiszta oldatot kapjunk.

A kapott tiszta oldatból a diasztereoizomert kristályo sítjuk, és ezt követően szűrjük. A kristályosítást jeges víznek • ·· ·· ···· ·· ··· ·· · · · · « ·« · ·· ♦ ··· • · · · · · ··· ·· ······· ··

- 6 a hőmérsékletén vagy hűtőszekrényben, vagy pedig 10 - 25 oC hőmérsékleten folytathatjuk le. Kívánt esetben a tiszta oldatot oltó kristállyal beolthatjuk, és ezt követően ultrahanggal kezelhetjük. Az így kapott anyalúgot előnyösen kis víztartalmú etanollal hígítjuk. Ebből a hígított oldatból a másik diasztereoizomert kikristályosítjuk és ezt követően szintén szűrjük. A kapott második anyalúgot bepároljuk és ismételten frakcionáltan kristályosítjuk.

Az, hogy melyik diasztereoizomer kristályosodik először, függ többek között az elválasztásra kerülő ammóniumsó természetétől. Az N⁵-metil-THF-ciklohexil-ammónium-só esetén először a (6R)-só kristályosod! ki. A (6S)-sót az anyalúgból a leírtak szerint kristályosíthatjuk. Az N⁵-metil-THF-diizopropil-ammónium-só esetén először a (6S)-só kristályosodik. A (6R)-sót ezután az anyalúgból kristályosíthatjuk.

Az így elválasztott diasztereoizomer-tiszta N⁵-metil-THF-ammónium-sókat az alkálifém- vagy alkáliföldfém-sókká, különösen a kalcium- vagy magnézium-sókká alakíthatjuk. E célból a megfelelő ammóniumsót előnyösen 1 térfogatrényi vízben oldjuk. Ezután az oldathoz a kívánt alkálifém- vagy alkáliföldfém-só vizes oldatát adjuk, így például kalcium-klorid-oldatot. A kapott reakcióelegy pH-értékét 6,0 és 7,0 közé állítjuk be. Az így kapott reakcióelegyet lehűtjük 0 - 10 oC hőmérsékletre, és előnyösen 1 órán át keverjük. Ezt követően a reakcióelegyhez az előzőekben megadott térfogatnyi vízre számítva 1,5 - 2,5 térfogatrész etanolt vagy acetont adunk, előnyösen keverés közben 30 - 90 perc alatt. Ennek során a megfelelő N⁵-metil- 7 -THF-alkálifém- vagy alkáliföldfém-só kiválik és szűrhető.

Az izomerek analízisét ismert módon királis nagynyomású folyadékkromatográfiás oszlopon végezzük (például a 12. irodalom szerint).

A találmány szerinti új ammóniumsók alkalmasak gyógyászati készítmények előállítására, amelyek alkalmasak az embereknél és/vagy állatoknál fellépő daganatok kezelésére és/vagy leküzdésére és/vagy a rák leküzdésére alkalmazott vegyületek szinergetikus befolyásolására és/vagy a rák leküzdésére alkalmazott vegyület toxicitásának a csökkentésére és/vagy az emberi és/vagy állati sejteknek a védelmére. A készítmények legalább egy (I') általános képletű hatásos N⁵metil-5,6,7,8-tetrahidrofolsav-ammónium-sót tartalmaznak a (6RS)-diasztereoizomer-elegy formájában vagy az egyes (6R)vagy (6S)-diasztereoizomerek formájában. Az (I') általános képletben

X' jelentése farmakológiailag elfogadható nitrogéntartalmú bázis, előnyösen primer, szekunder vagy tercier amin, valamint bázisos amino-karbonsav, különösen etanol-amin, trietanol-amin, 2-dimetil-amino-etanol, terc-butil-amin, lizin, különösen (L)-lizin és arginin, különösen (L)-arginin.

A készítmények tartalmaznak továbbá legalább egy (Ha) vagy (Ilb) általános képletű (6R)- vagy (6S)-N⁵-metil-5,6,7,8-tetrahidrofolsav-alkálifém- és/vagy alkáliföldfém-sót, a képletben

Y jelentése alkálifém-kation vagy alkáliföldfém-kation,

- 8 különösen Ca²⁺ vagy Mg²⁺.

A készítményekben a hatóanyag mennyisége előnyösen 1 mg és 500 mg közötti, különösen 5 mg és 150 mg közötti adagolási egységenként. A készítmény előnyösen parenterális és/vagy orális gyógyászati készítmény.

A következő példák találmányunkat szemléltetik.

1. példa (6RS)-N⁵-metil-THF-ciklohexil-ammónium-só előállítása

100 g (6RS)-N⁵-metil-THF-kalcium-sónak 800 ml vízben készített szuszpenziójához, amelyet nitrogén légkörben keverünk 40 oC hőmérsékleten, hozzáadunk 40 g ciklohexil-amint. A reakcióelegy hőmérséklete 60 oC-ra emelkedik, ekkor tiszta oldatot kapunk. Ezt követően a reakcióelegyhez 24 g oxálsav-dihidrátot adunk, 200 ml vízben és az elegyet 30 percig keverjük 0 oC hőmérsékleten. A képződött kalcium-oxalátot centrifugálással eltávolítjuk, és a visszamaradó oldatot 50 oC hőmérsékleten csökkentett nyomáson bepároljuk. így a nyers (6RS)-N^-metil-THF-ciklohexil-ammónium-sót kapjuk mézszerű, illetve üvegszerű szilárd termékként. A nagynyomású folyadékkromatográfiás analízis alapján a termék egyetlen csúcsot mutat.

2. példa

Az N⁵-metil-THF-ciklohexil-ammónium-só (6RS)-diasztereoizomer-elegyének az elválasztása

A) (6R)-N⁵-metil-THF-ciklohexil-ammőnium-só

Az 1. példa szerint előállított nyers (6RS)-N⁵-metil-THF-ciklohexil-ammónium-sót 550 ml, 85 térfogat% etanolt és 15 térfogat% vizet tartalmazó elegyben oldjuk 60 oC hőmérsékleten.

• ·· ♦ · ···· ·· ··· ·· · · · · « ·· · ··· ··· • · · · · · ··· ·· ···· ··· ··

A kapott tiszta oldatot lehűtjük szobahőmérsékletre, és egy előző reakcióból kapott kristályos (6R)-N⁵-metil-THF-ciklohexil-ammónium-sóval oltjuk be. A reakcióelegyet egy éjszakán át keverjük szobahőmérsékleten és 4 órán át 10 oC hőmérsékleten, majd a kiváló kristályos szilárd terméket szűréssel elválasztjuk. A kapott szilárd anyagot egyszer 85 %-os etanollal mossuk és 50 oC hőmérsékleten 2 órán át csökkentett nyomáson szárítjuk. így 30,9 g (6R)-N⁵-metil-THF-ciklohexil-ammónium-sót kapunk.

[a]_D = -7,3° (c = 1, 00,1 n NaOH)

RESOLVOSIL-oszlopon végzett analízis alapján a diasztereo izomer arány (6R)/(6S) = 96,5:3,5 (12. számú irodalom).

Fordított fázisú oszlopon végzett nagynyomású folyadékkromatográfiás analízis alapján a termék 100 %-os tisztaságú.

IR (KBr/cm^-1):

3300, 2950, 2860, 1660, 1610, 1390.

Elemanalízis:

C

H

N számított (%) (dihidrát) 55,42 7,99 18,46 kapott (%)

55,72

7,86

18,32

B: (6S) -N⁵-metil-THF-ciklohexil-ammónium-só

Az A szerinti szűrésből kapott anyalúgot 1200 ml abszolút etanollal hígítjuk. A kapott oldatot autentikus (6S)-N⁵-metil-THF-ciklohexil-ammónium-sóval oltjuk be. Az elegyet 24 órán • ·· ·· ···· ·· ·····»« ·· • ·· · ··· ·«· ♦ · · · · · ··· ·· ···· ·«· ·· át hagyjuk szobahőmérsékleten állni. A kiváló szilárd anyagot szűréssel elválasztjuk. A kapott terméket egyszer 94 %-os etanollal mossuk és csökkentett nyomáson 50 oC hőmérsékleten szárítjuk. így 23,7 g (6S)-N⁵-metil-THF-ciklohexil-ammónium-sót kapunk.

[ű]_D = +30,6° (c = 1, 0,01 n NaOH)

RESOLVOSIL-oszlopon végzett analízis alapján a diasztereoizomer arány (6R)/(6S) = 3:97 (12. számú irodalom).

IR (KBr/cm^-1):	3300, 2940, 2860, 1610,	1390.
Elemanalízis:	számított (%)	kapott (%)
	(dihidrát)
C	55,42	55,72
H	7,99	7,86
N	18,46	18,32
3. példa

(68)-N⁵-metil-THF-kalcium-só előállítása

15,0 g (6S)-N⁵-metil-ciklohexil-ammónium-sót 120 ml vízben oldunk és szobahőmérsékleten nitrogén légkörben keverünk. 9,9 ml 2 m kalcium-klorid-oldat hozzáadagolása után a reakcióelegy pH-értékét 1 n nátrium-hidroxid-oldattal 6,8-ra állítjuk be. A kapott reakcióelegyet 0 oC hőmérsékleten 1 órán át keverjük. Ezután a reakcióelegyhez 40 perc alatt hozzáadunk 240 ml metanolt. A kapott kristályos szilárd anyagot szűréssel elválaszt- • ·4 ·« ······ ······« · * • «* · ······ • · · * · · «·· ·· ···· ····· juk és 85 %-os etanollal mossuk és csökkentett nyomáson 50 oC hőmérsékleten szárítjuk. így 10,4 g (6S)-N⁵-metil-THF-kalciun-sót kapunk.

[a]_D = +40° (c = 1 / 1 % NH₄OAc, pH 6,0)

UV (20 mg/1 1 % NH₄OAc-ban, pH 6,0):

^max ^{= 290 nm} ( ⁼ 28600) min ^{= 245 nitl} ^AmaxMmin ~ ³»⁷

RESOLVOSIL-oszlopon végzett analízis alapján a diasztereoizomer arány (6R)/(6S) =3:97 (12. irodalom). ⁴

4. példa (6R)-N⁵-metil-THF-kalcium-só előállítása

A cím szerinti vegyületet (6R)-N⁵-metil-THF-ciklohexil-ammónium-sóból állítjuk elő a 3. példában leírtak szerint.

Fordított fázisú oszlopon végzett nagynyomású folyadékkromatográfiás analízis alapján a termék 100 %-os tiszaságú.

[a]_D = -4,7° (c = 1 / 1 % NH₄0Ac, pH 6,0)

UV (20 mg/1 1 % NH₄OAc-ben, pH 6,0):

^max = ²⁹⁰ nm (í = 30200) min ^{= 245 nin}

AmaxMmin ^{= 3} » ⁸

RESOLVOSIL-oszlopon végzett analízis alapján a diasztereoizomer arány (6R)/(6S) =97:3 (12. irodalom).

5. példa (6RS) -N⁵-metil-THF-diizopropil-ammónium-só előállítása

5,0 g (6RS)-N⁵-metil-THF-kalcium-sónak 40 ml vízben készített szuszpenziójához, amelyet 40 oC hőmérsékleten nitrogén légkörben keverünk, hozzáadunk 2,03 g diizopropil-amint. A hőmérsékletet mintegy 55 oC-ra emeljük, így tiszta oldatot kapunk. Szobahőmérsékletre való lehűlés után az oldathoz 1,2 g oxálsav-dihidrátot adunk 10 ml vízben, és az elegyet 0 oC hőmérsékleten 30 percig keverjük. A képződött kalcium-oxalátot centrifugálással eltávolítjuk, és a visszamaradó oldatot 70 oC hőmérsékleten csökkentett nyomáson bepároljuk. így a nyers (6RS)-N⁵-metil-THF-diizopropil-ammónium-sót kapjuk mézszerű, illetve üvegszerű szilárd anyagként. A nagynyomású folyadékkromatográfiás analízis alapján a termék egyetlen csúcsot mutat.

6. példa

Az N⁵-metil-THF-diizopropil-ammónium-só (6RS)-diasztereoizomer-elegyének az elválasztása; a (6S)-N⁵-metil-THF-diizopropil-ammónium-só izolálása

Az 5. példa szerint előállított nyers (6RS)-N⁵-metil-THF diizopropil-ammónium-sót 27 ml, 85 térfogatrész etanolt és 15 térfogatrész vizet tartalmazó elegyben 60 oC hőmérsékleten oldjuk. A kapott tiszta oldatot lehűtjük szobahőmérsékletre, és ezen a hőmérsékleten keverjük 48 órán át. A kiváló szilárd anyagot centrifugálással elválasztjuk. A kapott terméket egyszer 85 %-os etanollal mossuk és csökkentett nyomáson 50 oC hőmérsékleten 2 órán át szárítjuk. így 1,07 g (6S)-N⁵-metil13

-THF-diizopropil-ammónium-sót kapunk.

RESOLVOSIL-oszlopon végzett analízis alapján a diasztereoizomer arány (6S)/(6R) =90:10 (12. irodalom).

7.példa (6RS)-N⁵-metil-THF·2-hidroxi-etil-ammónium-só előállítása g (6RS)-N⁵-metil-THF-nek 100 ml 85 %-os etanolban készített szuszpenziójához keverés közben hozzácsepegtetünk 3,9 ml etanol-amint, ekkor olajos szuszpenziót kapunk.

A kapott szuszpenziót 3 órán át keverjük 0 oC hőmérsékleten, majd a kiváló kristályos szilárd anyagot spatulával aprítjuk.

A kapott terméket szűréssel elválasztjuk és abszolút etanollal mossuk, majd csökkentett nyomáson 50 oC hőmérsékleten 90 percig szárítjuk. így 16,0 g (6RS)-N⁵-metil-THF’2-hidroxi

-etil-ammónium-sót kapunk.

Fordított fázisú oszlopon végzett nagynyomású folyadékkromatográfiás analízis alapján a termék 96,5 % tisztaságú.

UV (20 mg/1 1 % NH₄OAc-ban, pH 6,0):

\ax ^{= 290 nm} ^min ^{= 245 nm} ^Amax/^Amin ~ ³»⁵⁵

IR (KBr/cm^-1): 3360, 2940, 2860, 1610, 1390, 1330.

• ·· ·· ···· ·· ·«· ·· · · · · • ·· · ··· ··· ·«· ·· ······· ··

8. példa

Akut intravénás toxicitási vizsgálatok egereken

A vegyület	LD₅₀ (mg/kg)
(6RS)-N⁵-metil-THF-Ca²⁺	339
(6S)-N⁵-metil-THF«Ca²⁺	847
(6R)-N⁵-metil-THF·Ca²⁺	460

9. példa

Humán CCRF-CEM sejtek növekedésének a gátlása

Humán leukémia sejteket (CCRF-CEM) 72 órán át növekvő koncentrációjú (6R)-N^-metil-THF·Ca²⁺ jelenlétében hagyunk nőni. A következő táblázat mutatja a kontrolihoz viszonyított százalékos sejtnövekedést.

(6R)-N⁵-metil-THF-Ca²⁺

%-os növekedés

koncentrációja (umól)_______________(72 órás kísérlet)

0 (kontroll)	100
1	95
10	99
30	10
100	9,3

250

8,2 • · • ·· · · · · ··· • · · · · · ··· ·· ······· ··

- 15 Irodalmak:

1. Cortellaro M., Boschetti C. és Polli E., High dose methotrexate with N^-metil-THF rescue in acute leukémia and non-Hodgkin's lymphoma. Chemioterapia Oncologica 2, (N.4) (Dec. Suppl./1978) 311.

2. Mazzei T. és mtsai., High dose methotrexate therapy in high-risk trophoblastic tumors. Chemioterapia Oncologica 2, (N.4) (Dec. Suppl./1978) 289.

3. Novelli A. és mtsai., Clinical data on rescue of high dose methotrexate with N⁵-methyl-THF in humán solid tumors. Chemioterapia Oncologica 2, (N.4) (Dec. Suppl./1978) 289.

4. Reggev A. und Djerassi I., Rescue from high-dose methotrexate with N⁵-methyl-THF. Cancer treat. Rep. (1986) 70, 251.

5. Nigra E. és mtsai., Can folates improve the efficacy of

5-FU in a polychemotherapy schedule? A new treatment fór advanced colorectal cancer. Fifth NCI-EORT Symposium on new drugs in cancer therapy, Oct. 22-24, 1986, Amsterdam (Oncology Abstracts) (1987) 2, 273) .

• · · ·· ···· ·· ··· · · ·· · · • ·· · ··· ··· • · · · · · ··· ·· ······· · ·

6. Chello P.L. és mtsai., Further studies of stereospecificity at carbon 6 fór membráné transport of tetrahydrofolates. Biochem. Pharmacol. (1982) 31, 1527.

7. White J.C. és mtsai., Lack of stereospecificity at carbon of N⁵-methyl-THF transport in Ehrlich ascite tumor cells. Journal of Bioi. Chem. (1978) 253. 242-245.

8. White J.C. and I.D. Goldman., Lack of stereospecificity at carbon 6 of N⁵-methyl-THF transport: possible relevance to rescue regimens with methotrexate and leucovorin. Chemistry and Biology of Pteridines (Kisliuk/Brown eds./1979, 625.

9. B.T. Kaufman és mtsai., Chromatographic separation of the diastereoisomers of dl,L-5,10-methylenetetrahydrofolate. Journal of Bioi. Chem. (1963) 238. 1498.

10. Verfahren zűr Herstellung von Tetrahydrofolaten,

348 641 számú közzétett európai szabadalmi bejelentés (1990), Eprova AG Schaffhausen/Svájc.

11. Derivés de 1¹acide tetrahydrofolique, procédé de préparation et utilisation dans la synthese de diasteréoisoméres 6S et 6R de folates reduits 90 03032 számú francia szabadalmi bejelentés, SAPEC SA Lugano / Svájc.

• ·· ·· ···· ·· ··· · ♦ ·· · · • ·· · ··« ··· • · · · · · ··· ·· ···· ··· ··

12. K.E. Choi és R.L. Schilsky, Resolution of the stereoisomers of Leucovorin and N⁵-methyl-THF by chiral HPLC. Anal. Biochem. (1988) 168. 398.

13. D.G. Weír és mtsai., The absorption of the diastereoisomers of N⁵-methyl-THF in mán: a carrier-mediated process.

Clinical science and molecular medicine (1973) 45, 625.

Claims

Szabadalmi igénypontok

1. Eljárás az (I) általános képletű (6RS)-N5-metil-5,6,7,8-tetrahidrofolsav-ammónium-sóinak - a képletben X jelentése nitrogéntartalmú bázis, előnyösen primer, szekunder vagy tercier-amin, vagy bázisos amino-karbonsav, különösen ciklohexil-amin, diizopropil-amin, benzil-amin, ammónia, etanol-amin, trietanol-amin, 2-dimetil-amino-etanol, terc-butil-amin, lizin, különösen (L)-lizin és arginin, különösen (L)-arginin - előállítására, azzal jellemezve, hogy a (6RS)-N⁵-metil-5,6,7,8-tetrehidrofolsavat alkálifém- vagy alkáliföldfém-sója, különösen Ca²⁺- vagy Mg²⁺-sója formájában oldószerbe, előnyösen vízbe visszük, majd az elegyhez nitrogéntartalmú bázist adunk, előnyösen 2 - 2,5 molekvivalensnyi mennyiségben, és ez a bázis előnyösen primer, szekunder vagy tercier amin vagy bázisos amino-karbonsav, különösen ciklohexil-amin, diizopropil-amin, benzil-amin, ammónia, etanol-amin, trietanol-amin, 2-dimetil-amino-etanol, terc-butil-amin, lizin, különösen (L)-lizin és arginin, különösen (L)-arginin, majd az eredeti, az előzőekben felsorolt alkálifém- vagy alkáliföldfém-kationokat tartalmazó sókat megfelelő savnak, például kénsavnak vagy oxálsavnak a hozzáadagolásával rosszul oldódó sókká alakítjuk, illetve ilyen só formájában leválasztjuk, majd a kapott rosszul oldódó sót elválasztjuk, például szűréssel és végül az oldószert például csökkentett nyomáson való lepárlással vagy liofilizá19 lássál eltávolítjuk.
2. Eljárás az (I) általános képletű (6RS)-N⁵-metil-5,6,7,8-tetrahidrofolsav-ammónium-sóinak - a képletben X jelentése nitrogéntartalmú bázis, előnyösen primer, szekunder vagy tercier-amin, vagy bázisos amino-karbonsav, különösen ciklohexil-amin, diizopropil-amin, benzil-amin, ammónia, etanol-amin, trietanol-amin, 2-dimetil-amino-etanol, terc-butil-amin, lizin, különösen (L)-lizin és arginin, különösen (L)-arginin előállítására, azzal jellemezve, hogy a (6RS)-N⁵-metil-5,6,7,8-tetrahidrofolsavat legalább egy oldószerbe, előnyösen vízbe visszük, majd az elegyhez nitrogéntartalmú bázist adunk, előnyösen 2-2,5 mólekvivalensnyi mennyiségben, és a bázis előnyösen primer, szekunder vagy tercier amin vagy bázisos amino-karbonsav, különösen ciklohexil-amin, diizopropil-amin, benzilamin, ammónia, etanol-amin, trietanol-amin, 2-dimetil-amino-etanol, terc-butil-amin, lizin, különösen (L)-lizin és arginin, különösen (L)-arginin, majd az oldószert például csökkentett nyomáson való lepárlással vagy liofilizálással eltávolítjuk.
3. Eljárás az (I) általános képletű N⁵-metil-5,6,7,8tetrahidrofolsav-ammónium-sók (6RS)-diasztereoizomer elegyeinek - a képletben

X jelentése nitrogéntartalmú bázis, előnyösen primer, szekunder vagy tercier-amin, vagy bázisos amino-karbonsav, különösen ciklohexil-amin, diizopropil»··· • · · · · · ··· ·· ··«···· · ·

- 20 -amin, benzil-amin, ammónia, etanol-amin, trietanol-amin, 2-dimetil-amino-etanol, terc-butil-amin, lizin, különösen (L)-lizin és arginin, különösen (L)-arginin az egyes (6R)- és (6S)-diasztereoizomerekké való szétválasztására, azzal jellemezve, hogy az említett (6RS)-diasztereoizomer-elegyet, amelyet például az 1. vagy 2. igénypont szerint állítottunk elő, különösen szilárd formában A oldószer -eleggyel keverjük össze, amely vizet és legalább egy vízzel elegyedő oldószert, előnyösen poláros oldószert, különösen egy- vagy többértékű 1-5 szénatomos alkoholt, például etanolt tartalmaz, majd a kapott elegyet tiszta oldattá alakítjuk, például 40 - 60 oC hőmérsékletre való melegítéssel, a kapott tiszta oldatból az egyik diasztereoizomert kristályosítjuk és elválasztjuk, majd az anyalúgot az előzőekben említett vízzel elegyedő oldószerrel vagy oldószerekkel hígítjuk, és ebből a hígított oldatból a másik diasztereoizomert kristályosítjuk és elválasztjuk.
4. A 3. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy az A oldószerelegy 50 - 95 térfogat%, előnyösen 75 - 95 térfogat%, különösen 85 térfogat% etanolt és visszamaradó mennyiségben vizet tartalmaz.
5. A 3. vagy 4. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy 1 tömegrész (6RS)-diasztereoizomer-elegyre számítva 3-10 tömegrész, különösen minegy 5 tömegrész A oldószerelegyet alkalmazunk.
6. A 3-5. igénypontok bármelyike szerinti eljárás azzal ···· jellemezve, hogy a tiszta oldatot oltókristállyal beoltjuk, és a beoltott oldatot adott esetben ultrahanggal kezeljük.
7. Eljárás a (Ha) és (Ilb) általános képletű (6R) - vagy (6S)-N⁵-metil-5,6,7,8-tetrahidrofolsav-alkálifém- vagy alkáliföldfém-sóinak - a képletben Y jelentése két alkálifémkation vagy egy alkáliföldfém-kation, különösen Ca²⁺ vagy Mg²⁺előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelő diasztereoizomer-tiszta (la) vagy (Ib) általános képletű N⁵-metil-5,6,7,8-tetrahidrofolsav-ammónium-sót - a képletben

X jelentése nitrogéntartalmú bázis, előnyösen primer, szekunder vagy tercier-amin, vagy bázisos amino-karbonsav, különösen ciklohexil-amin, diizopropil-amin, benzil-amin, ammónia, etanol-amin, trietanol-amin, 2-dimetil-amino-etanol, terc-butil-amin, lizin, különösen (L)-lizin és arginin, különösen (L)-arginin -, amelyet például a 3 - 6. igénypontok bármelyike szerint állítottunk elő, 1 térfogatrésznyi vízben oldjuk, a kapott oldathoz alkálifém- vagy alkáliföldfém-só vizes oldatát, előnyösen a megfelelő halogenidnek a vizes oldatát, különösen a megfelelő kloridnak, így például CaC12~nek vagy MgC12~nek a vizes oldatát adjuk, az így előállított B reakcióelegyet kever jük, előnyösen 0 - 10 oC hőmérsékleten, például mintegy 1 órán át, majd a kapott reakcióelegyhez 1,5 - 2,5 térfogatrész legalább egy poláros vízzel elegyedő szerves oldószert, előnyö sen etanolt vagy acetont adunk, előnyösen keverés közben

30 - 90 perc idő alatt, és a kiváló (Ha) vagy (Ilb) általános • w« * ♦ ···· ·· • · · ·· ·· · · • ·· t · ·· ·«· • · · · · · «·· · · ······· · · képletű alkálifém- vagy alkáliföldfém-sót elválasztjuk.
8. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a B reakcióelegy pH-értékét 6,0 - 7,0 értékre állítjuk be.

A meghatalmazott: