HUT64863A

HUT64863A - Biologically decomposing preparative for dosing tgf-beta active agent and method for preparing it

Info

Publication number: HUT64863A
Application number: HU9301163A
Authority: HU
Inventors: Wayne Gombotz
Original assignee: Bristol Myers Squibb Co
Priority date: 1992-04-24
Filing date: 1993-04-20
Publication date: 1994-03-28
Also published as: AU3699093A; FI931736A7; NO931431D0; CA2093836A1; NO931431L; HU9301163D0; ZA932661B; FI931736L; NZ247421A; JPH0625009A; EP0567391A1; FI931736A0

Description

A találmány tárgya biológiai körülmények között lebomló, transz formáló növekedési β-faktor (az alábbiakban rövidítve: TGF~P>) felszabadítására alkalmas készítmény, valamint az ilyen készítménnyel bevont, beültethető hordozóanyagból álló hordozórendszer, amely a TGF-^ hatóanyagot előre meghatározható, szabályzott ütemben szabadítja fel. A találmány ezek előállítására is vonatkozik. TGF-^ stabilizálására alkalmas készítményt ismertetünk.

A csont regeneráló növekedési képessége jelentős; számos klinikai indikációs területen azonban a csont gyógyulási folyamata károsodik; például, ha a csont veszteség igen nagy, s ennek következtében a csont nem képes regenerálódni; ilyenek továbbá a balesetek által előidézett váztorzulások, a váz torz kialakulása, rákbetegség, vagy rekonstrukciós jellegű kozmetikai sebészeti beavatkozás. Kritikus igény áll fenn ennek következtében beültetési eljárások kifejlesztésére a csont gyógyulásának fokozására, illetve elősegítésére számos klinikai helyzetben.

A váz erősítésére, illetve rekonstrukciójára szolgáló anyagokként elsősorban az autogén (a szervezeten belül kialakult) porcok és csontok

Ezen anyagok alkalmazásának azonban jönnek számításba.

több hátránya van, például a dőnor hely morbiditása, a beültethető anyagok korlátozott mennyisége és az implantátum előre nem látható felszívódása. Ennek következtében számos különféle anyagot vizsgáltak, amelyek a csont helyreállítása céljából mesterséges beültetésre alkalmazhatók. Ilyenek például a kerámiai • · · · · ·

- 3 anyagú, összetett készítmények, csontszármazékok, valamint természetes és szintetikus eredetű polimerek ZC. ü. Damien és J. R. Parsons: J. Appl. Biomat 2, 187-208 (1991 ).7.

Az ideális beültethető anyagnak bizonyos alapvető sajátságokkal kell rendelkeznie: biológiailag összeférhetőnek (összeegyeztethetőnek), steri1izá1hatónak kell lenniej oszteoindukciós sajátságokkal (a mezenchimás sejtek oszteoblasztokká történő fenotipusos átalakulásának serkentése csontképződéssel) és oszteokondukciós sajátságokkal (az új csont képződésére alkalmas hálózat) kell rendelkeznie. Porozitása és pórussűrűsége fontos szerepet játszanak az implantátum oszteokonduktiv sajátságaiban. Az anyagnak továbbá _az új csont növekvésével párhuzamosan le kell bomlania anélkül, hogy az új csont kialakulását zavarná. Az implantátumnak nem szabad előidéznie káros helyi szöveti reakciót, valamint nem szabad immunogénnek vagy szisztémásán toxikusnak lennie. Számos, jelenleg vizsgálatban lévő anyag a fenti követelményeket csak részben elégíti ki.

A politejsav (a továbbiakban rövidítve: PLA) polimert és a poli(tejsav-glikolsav) (rövidítve: PLPG) kopolimert kísérletileg alkalmazták a csont helyreállítására. Mindkét fenti anyag biológiailag kompatibilis (összeegyeztethető, összeférhető) és biológiai körülmények között lebomlik; egyes esetekben kimutatták, hogy elősegítik a csontsebek gyógyulását . 0. Hollinger: J. Biomed. Mater. Rés. 1 7 , 71 -82 ( 1983).7. E polimerek további vonzó sajátsága mechanikai erősségük, mely a terhelést viselő • · « ·· · · · ♦ · ·

- 4 csontok erősítése szempontjából lényeges. E polimerek azonban nem oszteoinduktivak (nem serkentik a csontképződést), és egyes esetekben porozitásúk hiánya meggátolhatja a csont behatolását az implantátumba /Á. Tencer és munkatársai: J. Orthop. Rés. 5_, 275-282 (1987 17 ·

Az ásványmentesitett (demineralizált) csontmatrix (röviden: DBM) olyan csontszármazék, amelyet hullák csontjainak sósavas demineralizálásával állítanak elő. Ennek különböző formáit - például poralakú, forgácsalakú és blokkformáit - állították elő. Kimutatták, hogy a DBM-nek oszteoindukciós (csontképződést kiváltó) hatása van Zí · A.

Gutterman és munkatársai: Collagen Rel. Rés. j?, 419-431 ( 1988); A. H. Reddi és W. A. Anderson: J. Cell Bioi. 69, 557-572 (1976); Η. E. Firschein és M. R. Urist: Clin. Orthop.

84, 263-275 ( 1972 17, igy klinikailag elsősorban az arccsont javulásának fokozására és az arccsont rekonstrukciójára alkalmazzák Z3. B.

Mulliken és munkatársai: Ann. Surg.

194, 366-372 ( 1981 17. Sok esetben azonban a DBM impl.antátumok esetében csóntfe1szivódás következik be. Egy újabb vizsgálatból azt következtették, hogy a demineralizált csont felszívódási sebessége (hányada) elfogadhatatlanul nagy, s ezért csak olyan esetekben szabad alkalmazni, amikor az implantátum primitív mezenchimális vagy csontképző sejtekben gazdag helyekre vezethető be ZD. M. Toriumi és munkatársai: Arch. Otolaryngol. Head Neck Surg. 116, 676-680 ( 199017.

A DBM implantátumok mechanikai erőssége nem • · · · «

- 5 elegendő, hogy olyan helyeken alkalmazzák, ahol az implantátum húzó hatásnak van kitéve. A huzási ellenállás és a sulyhordozó képesség kritikus jellegű lehet olyan implantátumok esetében, amelyek a végtagokban vagy az állkapocsban vannak elhelyezve. A DBM-ot különböző anyagokkal kombinálták olyan összetett termékek kialakítására, amelyek képesek az új csont képződésének elősegítésére az implantátum mechanikai sajátságainak javítása mellett. Ilyen természetes, összetett termékek például: a DBM és az autogén csontvelő együttese Zt. Green és munkatársai: Clin. Orthop. 205, 293-298 (1986); T. S. Lindholm és M. R. Urist: Clin. Orthop. 150, 288-300 (1980)^; a DBM és autogén csont összetétele [?. Kohler és A. Kreicbergs: Clin. Orthop. 218, 247-258 (1987 )_7. Számos szintetikus összetételt is előállítottak porózus poliszu1fonna1 /J . J. Vamdersteenhoven és M. Spector: J. Biomed. Mater. Rés. 17, 1003-1014 (1983),7; valamint DBM és hidroxiapatit összetételével Z5. G. Hopp és munkatársai: J. Orthop. Rés. 1_, 579-584 ( 196917. Ezekkel a rendszerekkel csak mérsékelt sikert értek el.

A csontképzés fokozásának céljából a figyelmet másrészt azoknak a mechanizmusoknak a megértésére koncentrálták, amelyek a gyógyulás folyamatát szabályozzák. Ismert, hogy a növekedési faktorok számos folyamatban, különösen a szöveti gyógyulásban szabályozzák a sejtfunkciókat. A transzformáló növekedési β-faktor (TGF-£>), a bázisos fibroblaszt növekedési faktor (bFGF), valamint a trombocitából származó növekedési faktor (PDGF) olyan polipeptid ····· « ·· • · · ··« ♦ · · · jellegű növekedési faktorok, amelyek a szövet helyreállási folyamatában központi szerepet töltenek be. E fehérjék közül, úgy látszik, a TGF-(b anyagcsalád (szupercsalád) kritikus szerepet játszik a csont gyógyulásában /G. F.

Pierce és munkatársai: J. Cell Bioi. 109, 429-440 (198917.

A TGF-25 kD molekulatömegü homodimer fehérje, amely a mezenchimális sejtek vándorlását, szaporodását és mátrix-szintézisét serkenti.

A szervezetben a TGF-^>

legnagyobb raktára a csont ZS .

M. Seydin és munkatársai:

J. Bioi.

Chem. 261 , 5693-5695 ( 1986)7;

csontképződést elősegítő képessége valószínűvé teszi, hogy csontveszteséggel járó betegségekben terápiás szer lehet /Ή. Noda és

J. Camilliere: Endocrinology 124, 2991-2207 (198917. Kimutatták, hogy a TGF-^> csonthártya közelében történő in vivő alkalmazása növeli a csont sűrűségét és a porcképződést ZM. E. Joyce és munkatársai: J. Cell Bioi. 110, 21 95 ( 1 990) ;

C. Marcelli és munkatársai: J. Boné Miner. Rés. 5, 10871096 ( 1990); E. J. Mackie és U. Trechsel: Boné 1 1, 295300 (199017· Kimutatták továbbá, hogy a TGF-β kiváltja a koponya kiterjedt csonthiányának csonttal való zárulását ZL. S. Beck és munkatársai: J. Boné and Miner. Rés. 6, 1257-1265 ( 1991 17.

Az ígéretes tapasztalatok ellenére is fennáll az igény hatásos módszer kialakítására, amelynek utján a TGF-^ a csonthiányok helyén felszabadítható, s igy a csont gyógyulását előmozdíthatja. A növekedési faktort stabilis formában denaturálódás, illetve biológiai aktivitásának vesztesége nélkül kell az alkalmazás helyére el• · ··· · ·· ·

- 7 juttatni. Szükség van továbbá olyan módszer kidolgozására, amelynek segítségével a TGF-^> hatóanyagnak a rendszerből való felszabadítása egy adott időszakon át előre meghatározható módon szabályzott mennyiségben és időtartammal megy végbe.

Ismertettek olyan fehérjehordozó rendszereket, amelyek nem bomló polimerekből készülnek (Folkman és munkatársai: 4 164 560 számú Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás) vagy lebomló PLPG kopolimerekből állnak (Kent és munkatársai: Vízben oldható aktív polipeptidek mikrokapszulázása, 4 675 189 számú Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás; Hutchinson: Folyamatos felszabadulást biztosító gyógyászati készítmények, 4 767 628 számú Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás; Gombotz és munkatársai: Szabályzott ütemü felszabadulást biztositó mikrogömbök előállítása igen alacsony hőmérsékleten, 5 019 400 számú Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás). Az ilyen tipusu rendszerek azonban vagy nem bomlanak le biológiai körülmények között, vagy mechanikai sajátságaik, morfológiájuk vagy porozitásúk nem megfelelő a csontváz sikeres erősítésére.

A fentiek alapján a találmány célja eljárás (módszer) kidolgozása a csont növekedésének serkentésére képes, implantálható, TGF-^> hatóanyagot hordozó rendszer kialakítására .

A jelen találmány tárgya biológiai körülmények között lebomló készítmény TGF-^ hatóanyag felszabadítására, implantálható hordozórendszer TGF-p felszabadítására, • · ··· · ·· valamint készítmény a TGF-^j aktivitásának stabilizálására.

A jelen találmány szerinti, biológiai körülmények között lebomló készítmény demineralizált csontmatrix (DBM) és valamilyen lebomló homopolimer vagy kopolimer - igy például poli(tejsav-koglikolsav) (PLGP) - keverékét tartalmazza, amelyben a T G F -£ oldott vagy diszpergált állapotban van. E készítmény képes a TGF-β hatóanyagot előre meghatározható, és idő szerint szabályzott módon felszabadítani. A TGF-^> ebből a készítményből biológiailag aktív (bioaktiv) vagy latens formában szabadulhat fel. A készítményhez más polimerek vagy vivőanyagok is adhatók a készítmény felszabadulási kinetikájának vagy más sajátságainak módosítása céljából. Az e készítményből felszabaduló TGF-^⁵ a

TGF-p anyagcsalád bármely tagja, különösen TGF

TGF vagy mórfogenetikus csontfehérje lehet.

A jelen találmány szerinti hordozórendszer valamely beültethető hordozóból áll, amely a találmány szerinti, biológiai körülmények között lebomló készítményt tartalmazza. A készítmény különféle formákban alakozható vagy önthető annak megtartásával, hogy a beültethető hordozó biológiailag lebomló vagy a biológiai körülmények között lebomló készítménnyel bevont, szilárd, le nem bomló hordozó legyen.

A találmány további tárgya TGF-p hatóanyag stabilizálására alkalmas készítmény. E készítmény valamilyen szerves savas puffért, például citromsavat vagy ecetsavat tartalmaz, és pH-értéke 2,5. E készítmény továbbá mannitot, emberi szérumalbumint, zselatint és/vagy nemíonos detergenst, • · ·· ··· például Tween-80 terméket is tartalmazhat. E készítményt oldat vagy liofilizált por alakjában tároljuk. Ha a készítmény olyan oldat, amely körülbelül 30 mM citromsavat és körülbelül 30 mg/ml mannitot tartalmaz, és pH-értékét körülbelül 2,5-ön tartjuk, akkor a készítmény a TGF-β hatóanyagot körülbelül 0,1 mg/ml-től körülbelül 1,0 mg/ml koncentrációtartományban 4 °C hőmérsékleten hosszú időn át (több mint hat hónapig) aktív molekulaként tartalmazza.

Ha a TGF hatóanyagot kisebb koncentrációkban alkalmaztuk, akkor további adalékanyagokat, például emberi szérumalbumint, zselatint és/vagy nemionos nedvesitőszert tettünk a pufferoldathoz.

Az alábbiakban rövid magyarázatot fűzűnk a csatolt rajzokhoz.

Az 1 . ábrában bemutatjuk a demineralizált csontporból az idő előrehaladása során felszabadult TGF-j??^ kumulatív százalékos értékét.

A 2. ábra egy TGF-^/DBM/PLPG implantátum vázlatos ábrázolása.

A 3. ábrában bemutatjuk egy demineralizált csontporból és PLPG-ből álló implantátumból az idő előrehaladásá val felszabaduló TGF-p „ kumulatív százalékos értékét.

A 4. ábra mutatja egy demineralizált csontporból

és PLPG-ből álló implantátumból felszabaduló TGF terhelés függvényében.

val a TGF

Az 5. ábrában bemutatjuk egy demineralizált csont• « · ·· ··· ··· porból és PLPG-ből álló implantátumból felszabaduló TGF-p^ kumulatív mennyiségét ( /jg TGF-j2)^/g implantátum) az idő előrehaladásával az implantátumban lévő DBM függvényében.

A 6. ábrában bemutatjuk különböző bevonatokkal kezelt, demineralizált csontporból és PLPG-ből álló implantátumból felszabaduló TGF-^)^ kumulatív százalékos értékét az idő előrehaladásával.

Mindezek alapján a jelen találmány a TGF-β hatóanyagot hordozó rendszerekre, készítményekre, valamint a TGF-£ hatóanyag stabilizálására irányul.

A jelen találmány szerinti, biológiai körülmények között lebomló készítmény legalább demineralizált csontmátrixot és biológiai körülmények között lebomló homopolimert vagy kopolimert - igy például poli(tejsav-glikolsav)-at tartalmaz, amelyben a T G F oldott vagy diszpergált állapotban van. Ez a készítmény képes a TGF-j·?? felszabadítására az idő szerinti előre meghatározható, szabályzott módon, az idő függvényében.

E bejelentésünkben a TGF-β olyan 25 kD molekulatömegű, homodimer fehérjére vonatkozik, amely a mezenchimális sejtek vándorlását, szaporodását és matrixszintézisét stimulálja. Azok a molekulák, amelyek a TGF-£> fehérje szupercsalád tagjai, megfelelnek e definíciónak; ilyenek például a TGF-^, TGF-5^) és a mór fogenetikus csont fehér je. A TGF-5^> a TGF- és TGF-^2 molekulák hibridje /Madisen és munkatársai a következő helyen: A transzformáló növekedési ^-faktorok kémiája, biológiája és terápiás jelentősége, (angolul), Anal. NY Acad. Sci. 593, 7-25 (199017.

• · ··« ···

- 1 1 A jelen találmány szerinti, biológiai körülmények között lebomló készítmény más polimereket is tartalmazhat, amelyek szerkezetének és sajátságainak kialakításához hozzájárulnak. A találmány szerinti készítményekben például politejsav, poli(tejsav-glikolsav), poliglikolsav, polikaprolakton, poli(hidroxi-vajsav), polianhidridek, poli(orto-észter)-ek, polikarbonátok, poliamidok, poliacetálok, poliaminosavak , valamint poli(ciano-akrilát)-ok lehetnek jelen. A felsorolt polimerek közül egy vagy több adható a jelen találmány szerinti, biológiai körülmények között lebomló készítményekhez. Ezenkívül a készítményhez olyan adalékanyagok is adhatók, amelyek utján a készítmény mechanikai sajátságai és a hatóanyag felszabadulásának kinetikája változtatható. Ilyen anyagok például: a lágyitószerek, igy a poli(oligo-L-1aktid), trietil-citrát, kollagén vagy a glicerin; valamint különböző molekulatömegü és típusú molekulák, igy laktid-glikolid kopolimerek, amelyek hozzáadásával a készítmény szilárdsága és lebomlási sebessége variálható.

A jelen találmány szerinti készítmények a TGF-£) hatóanyagot latens vagy bioaktiv formában, valamint fiziológiai szempontból elviselhető, illetve gyógyászati szempontból elfogadható származékai alakjában tartalmazhatják.

E leírásban a fiziológiai szempontból elviselhető és gyógyászati szempontból elfogadható fogalmak egymással kölcsönösen felcserélhetők, és olyan molekularészekre (molekulaegységekre) vonatkoznak, amelyek emlősöknek történő adagolás során a hatóanyag adagolásától • · « · · · ·· «·4 · ·« · kívánt hatáson kívül nem kívánt, káros mellékhatást nem okoznak .

A jelen találmányban vivőanyagon vagy mátrixon olyan anyagot értünk, amely alkalmas a hatásos vegyület adagolására, és amelynek gyógyászati szempontból el fogad hatónak kell lennie olyan értelemben, hogy a készítmény többi komponensével összeegyeztethető, és a befogadó szervezet számára káros hatása nincsen.

jelen találmány szerinti készítmények bármely ismert módon előállithatók: bármelyik módszer szerint úgy járunk el, hogy a hatásos vegyületet (vegyületeket) a vivőanyaggal érintkezésbe hozzuk (összekeverjük). E készítményekben a TGF-^> hatóanyag általában fiziológiai szempontból elviselhető vivőanyagban oldva vagy diszpergálva

Nyilvánvaló, hogy a fentebb említett komponenseken kívül a találmány szerinti készítmények szükséges esetben egy vagy több további komponenst igy például higitószereket, pufferanyagokat, kötőanyagokat, felületaktív szereket, tömöritőszereket (sűritőszereket), kenőanyagokat és tartósítószereket (igy antioxidánsokat) is tartalmazhatnak.

A jelen találmány szerinti hordozórendszer olyan beültethető hordozóanyagból áll, amely a biológiai körülmények között lebomló készítményt tartalmazza, mely utóbbiból a TGF-£> hatóanyag előre meghatározható, s az idő előrehaladása szerint szabályzott módon felszabadulhat.

A hordozórendszerben a beültethető hordozóanyag • · « 4 · r ·· • ·· 44 4 ··· · szilárd mátrixot képez, amely alkalmas arra, hogy beilleszszük, és/vagy az emlős szervezet valamely részéhez idomítsuk. Ez a hordozóanyag lehet valamely biológiai körülmények között lebomló hordozószer, amely a TGF-^ felszabadulása során és/vagy azt követően lassan lebomlik, vagy a szervezetben felszivódikj vagy lehet valamely szilárd, le nem bomló hordozószer, igy például valamilyen protézis, amely a jelen találmány szerinti, biológiai körülmények között lebomló készítménnyel van bevonva. E rendszer lehet továbbá olyan, biológiai körülmények között lebomló készítmény, amelyet oldószeres öntéssel vagy sajtolással alakítunk beültethető hordozóvá.

Az oldószeres öntést (formálást) úgy végezzük, hogy a polimert előbb megfelelő oldószerben oldjuk, majd az oldatot a TGF-^> hatóanyaggal, DBM-val és adott esetben más adalékanyagokkal összekeverjük. Az igy kapott keveréket öntőformába öntjük, s igy alakítjuk ki a kívánt implantátumot, például hengeres vagy filmformában. Ezután az oldószert elpárologtatjuk az implantátumról. Az oldószer párolgását meggyorsíthatjuk, ha az implantátumot vákuumba helyezzük.

A sajtoló (kompressziós) alakítást úgy végezzük, hogy a TGF-^ hatóanyagot és a DBM-ot előbb szárított polimer részecskékkel keverjük, majd a szárított keveréket formázó mintába helyezzük, és préseléssel alakítjuk ki az implantátumot .

A fentebb leirt hordozórendszer lehetővé teszi specifikus TGF-fe hatóanyagot felszabadító készítmények ·· · ♦ 4 · · · • ·· »«·»·· 4 beültetését a szervezet különböző helyeire, ahol azután a TGF-^> hatóanyag felszabadulása előre meghatározott módon szabályozható.

A találmány egyik megvalósítása szerint a beültethető rendszer képes a TGF-^ hatóanyag eljuttatására valamilyen csonthiány helyére. A hordozórendszer itt olyan hatású, mint egy lebomló rácsozat, növekedés bekövetkezhet. A szilárd amelyen az uj csonthordozót vagy bevonjuk alakítjuk ki, amelyet a TGF-^ hatóanyaggal, vagy DBM-ból előzőleg TGF-p⁵ hatóanyaggal együtt liofilizáltunk, és ezt követően PLPG mátrixba ágyazzuk. E rendszer a TGF-j?>

hatóanyagot aktív vagy latens formában, különböző adagok bán és különböző sebességgel szabadítja fel, és olyan porozitással rendelkezik, amely a csont belenövekedésével összeegyeztethető.

A találmány egyik előnyös megvalósítása szerint a beültethető rendszernek olyan mechanikai sajátságai és jellemzői vannak, amelyek lehetővé teszik, hogy a szervezet valamely helyére varrjuk vagy más módon beillesszük, és húzóhatásnak (feszítésnek) ellenálljon.

A jelen találmány egy további megvalósítása szerint biológiailag lebomló készítményt úgy alakítunk ki, hogy DBM-ot egy TGF-|> hatóanyagot tartalmazó oldatban szuszpendálunk. Ez a szuszpenzió lehetővé teszi bizonyos mennyiségű TGF-β beépülését a csontporba. Ezután a szuszpenziót liofilizálva adszorbeált T G F hatóanyagot tartalmazó, száraz DBM-port kapunk. PLPG-oldatot úgy állítunk elő, hogy poli(tejsav-glikolsav ) kopolimert valamilyen oldószer15 ben, például diklór-metánban, acetonban vagy kloroformban oldunk.

Az adszorbeált TGF-^> hatóanyagot tartalmazó, szárított DBM-port a PLPG-oldathoz adva szuszpenziót készítünk, amelyet ezt követően öntőformába öntünk, és megszáritjuk, vagy beültethető hordozó bevonására alkalmazzuk. A biológiai körülmények között lebomló készítmény tartalmazhat polimereket, vagy bevonható polimerekkel mechanikus sajátságainak módosítására vagy a hatóanyagnak a készítményből vagy a hordozórendszerből történő felszabadulási kinetikájának a módosítására.

A találmány egy másik megvalósítása abban áll, hogy a beültethető hordozót oldószerek nélkül, például kompressziós formálással állítjuk elő.

A felszabadult TGF-^> mennyisége és felszabadulásának sebessége a rendszerben lévő TGF-£) vagy DBM mennyiségének változtatásával előre meghatározható és megbízható módon szabályozható.

Kimutatták, hogy DBM és növekedési faktorok kombinációja serkenti a csont növekedését /Toriumi és munkatársai: J. Long Term Effects on Med. Implants 1_, 53-77 ( 1991 ).7. Az ismertetett rendszereknek azonban számos hiányossága van: igy például a növekedési faktor csontporból való felszabadulásának a kinetikája igen kevéssé szabályozható .

A növekedési faktor felszabadulási sebességének szabályzása lényeges lehet a csontnövekedés serkentése szempontjából. Kis mennyiségű TGF—kezdeti felszabadulása •1 ·**» ·** ·'* · • ·« ··· *«· · az implantátumból kémiai vonzás utján az adott helyen oszteoblasztok halmozódását válthatja ki. Későbbiekben az új sejtek halmozódása kisebb mértékű lehet, mint a csontképződés a beültetett hordozóban vagy a beültetett hordozó körül.

A jelen találmány szerinti, biológiai körülmények között lebomló készítmények és hordozórendszerek lehetővé teszik a TGF-^> felszabadulási kinetikájának pontos szabályozását, valamint biológiai aktivitásának megőrzését. A jelen találmány előnyös megvalósítása segítségével a leirt rendszerek megfelelő szilárdsággal rendelkeznek ahhoz, hogy a szükséges helyre bevarrjuk, és azon a helyen megmaradjanak a csontképződési folyamat során.

A jelen találmány értelmében TGF-^> stabilizálására alkalmas készítményt alakítottunk ki. TGF-^ hatóanyagot izoláltunk, és 2,5 pH-érték mellett 5 mM sósavval tisztítottuk. A molekula azonban ebben az oldatban az idő előrehaladásával labilissá válik. Ha T G F 5 mM sósavval előállított készítményeit 4 °C hőmérsékleten tároljuk, akkor fordított fázisú magasnyomású folyadékkromatográfiával (HPLC) vizsgálva a felszálló ág csúcsának mérete folyamatosan növekedik. Ha a TGF-^ hatóanyagot ebben a formában lefagyasztjuk, akkor jelentős mértékű aggregáció következik be (amint ezt a Western blotting vizsgálat mutatja).

A jelen találmány értelmében azt találtuk, hogy ha TGF.^ és TGF-5^> hatóanyagot specifikus körülmények között liofilizálunk, akkor a TGF-P hatóanyagot a bomlással és aggregációval szemben stabilizálhatjuk.

Ha TGF-f> hatóanyagot 0,1 mg/ml vagy ennél nagyobb koncentrációban, körülbelül 10-50 mM koncentrációjú szerves savban - például citromsavban vagy ecetsavban - liofilizálunk, amely körülbelül 20-40 mg/ml mannitot tartalmaz 2,5 pH-érték mellett, akkor a fehérje biológiai aktivitását teljes mértékben megtartja, amint ez a növekedés gátlásának mérésével (GIA módszer) vagy szaporodási mérésekkel igazolható. Továbbá a TGF-^> hatóanyag koncentrációja sem csökken, amint ezt az ELI5A módszerrel végzett meghatározás mutatja.

Az ilyen készítményben stabilizált TGF-^^ és TGF-5P hatóanyag fordított fázisú HPLC elemzése azt mutatta, hogy mindkét fehérje stabilis, és liofilizálás után, valamint hónapos tárolás után a felszálló ág csúcsának mérete nem növekedett. A Western biot elemzés megmutatta, hogy a fehérjék aggregációja nem ment végbe.

A jelen találmány egy előnyös megvalósítása szerint továbbá kimutattuk, hogy

TGF- ^7 hatóanyag mM koncentrációjú, mannitot tartalmazó citromsavas oldatban napon át 4 °C hőmérsékleten tartva stabilis maradt.

Ugyanebben a pufferoIdatbán -70 °C hőmérsékleten a TGF-f^ hatóanyag észrevehető bomlást nem mutatott.

c i óban,

Ha a TGF-^ hatóanyagot alacsonyabb koncentrápéldául 1 /ug/ml koncentrációban használtuk fel a készítmény kialakítására a fentebb leirt citromsav-mannit pufferoldattal, akkor mind a biológiai ak t i v i tásbán, mind a fehérjekoncentrációkban jelentős veszteséget ·· * · · ·· · • ·· ··· ··«* ··· ·♦ ·»·**··* észleltünk. Ez valószinűleg a TGF-p?^ hatóanyag tároló fiolák falán végbemenő adszorpciójának a következménye. A TGF-f> hatóanyagban fellépő ilyen veszteség megelőzhető volt úgy, hogy a készítményhez körülbelül 6 mg/ml koncentrációban emberi szérumalbumint vagy zselatint adtunk. Szilikonizált üvegfiolák alkalmazása, valamint körülbelül 0,01 %

R nemionos nedvesitőszer (Tween 80 ) hozzáadása a készítményhez kiküszöbölte a TGF-j2> hatóanyag koncentrációjának és aktivitásának a csökkenését.

A találmányt az alábbi, nem korlátozó jellegű példákban részletesen ismertetjük.

1. példa

TGF-^>^ hatóanyagot tartalmazó deminera 1 i zált csontmatrix (DBM) részecskék előállítása

Porított DBM-ből (beszerzési helye: Northwest Tissue Center, Seattle, WA) sósavas extrakcióval és ezt követő 1iofi1izál ássa1 54 mg tömegű mintát készítünk, így végül olyan port kapunk, amelynek részecskemérete 74 /jm-től 640 /jm-ig terjed. Az igy kapott DBM-ot 2 ml, 30 mM koncentrációjú nátrium-citrát-pufferο 1dathoz adjuk, amely 30 mg/ml koncentrációban mannitot tartalmaz, és pH-értéke 2,5. Az igy kapott szuszpenzióhoz 25 yug TGF-| hatóanyagot (beszerzési helye: Bristol-Myers Squibb Pharmaceutical Research Institute, Seattle) és 40 yul J-vel jelzett TGF-^-et adunk, majd a szuszpenziót 12 órán át 4 °C hőmérsékleten egyensúlyozzuk, ezt követően folyékony nitrogénben megfagyasztjuk, és liofilizáljuk. Ezután a minta teljes mennyiségét ismét felvesszük 4 ml foszfáttal ·· · ♦ · · pufferolt konyhasóoldatban (rövidítve PBS), amely 1% emberi szérumalbumint tartalmaz (beszerzési helye: Sigma Chemical

Co.), pH értéke 7,4, és rázás közben 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk. A mintát különböző időpontokban centrifugáljuk, a felülúszót eltávolítjuk, és friss PBS-val helyettesítjük.

A felülúszóban lévő TGF-^> mennyiségét gamma-számlálóval meghatározzuk. E meghatározást meghatározott időpontokban ismételve kapjuk a TGF-^ DBM-ból nak kvantitatív értékeit.

végbemenő felszabaduláséAz 1. ábra mutatja, hogy a TGE^ a

DBM-ból az első 10 órán belül teljes mennyiségében felszabadul.

2. példa

Pufferoldat előállítása, amelynek segítségével a TGF-^>^ hatóanyag 1 i o f i 1 i zálha t ó , és stabilis marad mg/ml

A TGF-^>,| hatóanyagot 30 mM koncentrációjú, mannitot tartalmazó, 2,5 pH-értékü pufferoldattal

Centricon típusú mikrokoncentráló berendezésben (Amicon) kezeljük.

Különböző koncentrációjú oldatokat készítünk, amelyekben a TGF-^)

0,001 mg/ml közötti.

és TGF-5jö töménysége 1,0 mg/ml és

Egyes oldatok, amelyek koncentrációja

0,001 mg/ml TGF-^> , további adalékanyagokat, igy 6 mg/ml emberi szérumalbumint, 6 mg/ml zselatint (Sigma) vagy

0,01 %

R nemionos nedvesitőszert (Tween 80 , Sigma) is tartalmaztak.

Az 1,0 ml térfogatú mintákat 2 ml térfogatú ü vegfiolákba helyezve 1iofi1izá1juk. Különböző méréseket alkalmaztunk a TGF-j?) stabilitásának kiértékelésére: igy a tott fázisú HPLC-elemzést, ELISA-módszert, a Western biot fordi-

- 20 gélelemzést, valamint a növekedés gátlásának meghatározását.

E vizsgálatok eredményei arra utalnak, hogy 30 mM citromsavat és 30 mg/ml mannitot tartalmazó, 2,5 pH-értékű készítmény a 100 /ug/ml vagy ennél magasabb koncentrációkban jelenlévő TGF-hatóanyagot stabilizálta. Ennél alacsonyabb, például 0,001 mg/ml koncentrációjú TGF-β stabilizálásához további adalékanyagok váltak szükségessé a TGF-{b hatóanyag fiolán végbemenő adszorpciójának a meggátlására. Az ilyen liofilizált készítményekben mind a TGF-^, mind a TGF-5£) 4 °C hőmérsékleten tárolva több mint 6 hónapig stabilis. Ez a példa mutatja, hogy a TGF-β liofilizálással stabilizálható, és e célra alkalmazható számos kiszerelési formát tesz lehetővé.

3. példa

Po1i(tejsav-glikolsav) kopolimer mátrixba ágyazott, TGF —12> hatóanyagot tartalmazó DBM részecskék előállítása

1,2 g poli(tejsav-glikolsav) kopolimert (PLPG) ml diklór-metánhoz adva 30 t ömeg/tér f ogat ?ó-os oldatot készítünk (a kopolimer két komponensét

50:50 arányban tartalmazza, beszerzési helye:

Birmingham

Polymers,

Inc.

Birmingham, AL). Ebből az oldatból 2,25 ml-t adunk az

1. példa szerint előállított, liofilizált DBM/TGF-^ mintához. Az így kapott szuszpenziót polipropilén öntőformába öntjük, és az oldószert szobahőmérsékleten 2 nap alatt elpárologtatjuk. Az oldószer maradékát úgy távolitjuk el, hogy a mintát vákuum-exszikkátorban tartjuk 24 órán • ·

- 21 át. Az igy kapott, makroporózus mátrix PLPG-val bevont DBM/TGF-β^ részecskékből áll. Az egységek megközelítőleg 26 tömegszázalék DBM-ot tartalmaznak. Az igy kapott implantátumok eléggé porózusak ahhoz, hogy a csont benövését lehetővé tegyék (ez letapogató elektronmikroszkóppal mér hető). A pórusok mérete körülbelül 10 /um-től körülbelül 300 /um-ig terjed. Az implantátumot vázlatosan mutatja a 2. ábra.

Mértük a TGF-p^ felszabadulását a szárított implantátumokból. így kapott eredményeinket a 3. ábrán mutatjuk be. Az implantátum alkalmas a TGF-β hatóanyagnak több mint 300 óra alatt végbemenő, szabályzott ütemü felszabaditására.

E példa igazolja, hogy

TGF—DBM-ból végbemenő felszabadulása jelentős mértékben lassítható, ha a DBMval együttesen liofilizált TGF-^^ hatóanyagot PLPG mátrixba ágyazzuk.

4. példa

Csupán TGF~P^ hatóanyagot és

PLPG kopolimert tartalmazó implantátum előállítása mg TGF-f^ mintát 2 ml mM nátrium-citrát-pufferoldathoz adunk, mely utóbbi 30 mg/ml mannitot tartalmáz, és pH-értéke 2,5.

Az igy kapott keveréket liofilizáljuk, s igy lényegében az példában leirt készítményhez jutunk, amely azonban

DBM-ot nem tartalmaz.

Ezt követően a liofilizált TGF-^-et 30%-os diklór-metános

PLPG-oldatban szuszpendá1juk, öntőformába öntjük, és beszáradni hagyjuk.

A szárítás során az igy kapott implantátum elkülönül; letapogató elektronmikroszkóppal végzett vizsgálat szerint porozitása csekély.

E példa azt mutatja, hogy a TGF-^^ hatóanyagot DBM nélkül tartalmazó PLPG implantátum nem marad ép állapotban, és morfológiai sajátságai csontregeneráló rendszer szempontjából nem kívánatosak.

5. példa

Poli(tejsav-glikolsav) kopolimer mátrixba ágyazott,

TGF-p^ hatóanyagot tartalmazó DBM-részecskék előállítása változó TGF-^ tartalommal

Három különböző, liofilizált készítményt állítunk elő, amelyek a TGF-^)^ hatóanyagot a DBM-hez viszonyítva különböző arányban tartalmazzák (500 yug TGF-^ 1 g DBM-hoz viszonyítva; 1000 yUg TGF-^ 1 g DBM-hez viszonyítva; és 2000 yug TGF-fb.j 1 g DBM-hoz viszonyítva). Az igy kapott termékeket PLPG-vel a 4. példában leírtak szerint öntőformába helyezzük. Az igy kapott készítmények 26 tömegé DBMot tartalmaznak, azonban a TGF-p hatóanyagot különböző koncentrációkban tartalmazzák: a TGF-β^ hatóanyag mennyisége 1 g implantátumra vonatkoztatva 78 ^ug/g, 174 yug/g, illetve 440 /jg/g. A 4. ábrában látható a TGF-felszabadulása ezekből az implantátumokból. A TGF-^ terhelés (mennyiség) növekvésével az adott idő alatt felszabaduló TGF-^^ mennyisége is növekszik. Ez azt igazolja, hogy a TGF-j^ ^-nek az implantátumokból felszabaduló mennyisége a TGF — jS terhelés változtatásával szabályoz ható.

• ·

6. példa

Poli(tejsav-glikolsav) kopolimer mátrixba ágyazott, TGF-β hatóanyagot tartalmazó DBM-részecskék előállítása változó DBM tartalommal

Két különböző, liofilizált TGF-^/DBM mintát állítunk elő, amelyek megközelítőleg azonos mennyiségű TGF-^)^ hatóanyagot, azonban különböző mennyiségű DBM-ot tartalmaznak. Az implantátumokat a 4. példában leirt módon állítjuk elő. Az igy kapott implantátumok 35 tömegé, illetve 26 tömeg?ó DBM-ot tartalmaznak. Az 5. ábra mutatja a felszabadult TGF-^> kumulatív százalékos értékét az idő függvényében. Az implantátum DBM-tartalmának növekedésével az implantátumból felszabadult TGF-|5 kumulatív százalékos értéke is növekedett. E példa azt mutatja, hogy a TGF-^ felszabadulásának kinetikája az implantátum DBM-terhelésének változtatásával szabályozható.

7. példa

Po1i(tejsav-g1iko1sav) kopolimer mátrixba ágyazott, TGF-f) hatóanyagot tartalmazó DBM-részecskék előállítása olyan módon, hogy a kapott részecskéket a felszabadulás sebességének szabályzása céljából különböző polimerekkel vonjuk be

A 6. példában leirt módon implantátumokat állítunk elő, amelyek körülbelül 26 tömegé DBM-ot tartalmaznak, és 1 g DBM-hez viszonyítva 1000 yug TGF-p^ hatóanyagot tartalmaznak. A felszabadulás kinetikájának további szabályzása céljából az implantátumokat különböző bevonatokkal kezeljük. E bevonatok: 10%-os PLPG-oldatj 10?á-os PLP G-

- 24 -oldat, amely 20 tömeg% mannitot tartalmaz^ és 10 °í oligo-L-laktid-oldat (az oldószer valamennyi esetben diklór-metán; az oligo-L-laktidot a Boehringer Ingelheim cégtől szereztük be). A bevonatokat úgy készítjük, hogy az implantátumokat előbb folyékony nitrogénbe, majd a bevonásra alkalmazott oldatba merítjük, s utána a mintákat levegőn szárítjuk. A 6. ábra mutatja az ezen mintákból felszabadult TGF-pkumulatív százalékos értékét. A felszabadulás leggyorsabban a bevonat nélküli és az oligo-L-laktiddal bevont implantátumokból ment végbe. Az oligo-L-laktid az előzőleg felszabadult mennyiséget körülbelül 50 órás mennyiségre csökkentette, és ezen idő elteltével jelentős felszabadulás már nem volt megfigyelhető. Az implantátumnak

10%-os PLPG-oldattal végzett bevonása jelentős mértékben csökkentette a kezdetben felszabaduló TGF-β^ mennyiségét.

adtunk, akkor a TGF-p^ felszabadulása bevonathoz mannitot fokozódott a PLPG-t valószínűleg azért, nagyobb. E példa azt

Ha a PLPG önmagában tartalmazó bevonathoz képest mert a PLPG-mannit bevonat porozitása mutatja, hogy az implantátumból végbemenő TGF-p felszabadulás kinetikája különösen kezdetben az implantátumok különböző bevonatokkal végzett kezelése utján szabályozható.

8. példa

DBM/PLPG implantátumból felszabaduló TGF-p^ hatóanyag kötési képességének (aktivitásának) meghatározása az ELISA-módszer alkalmazásával

A 4. példában leirt módon implantátumot készítünk, azonban ^^J-vel jelzett TGF-phozzáadása nélkül. A TGF• ·

- 25 hatóanyagot 48 órán át felszabadulni hagyjuk % emberi szérumalbumint tartalmazó PBS-oldatban, és a hatóanyag koncentrációját enzimmel kapcsolt immunszorbens méréssel (EL ISA-módszerrel) meghatározzuk. Az ELISA-módszerrel egy anti-TGF~p> monoklón 1011 antitestnek a TGF-^ molekulával végbemenő kötődését mérjük. (Az antitest-molekulát a Bristol-Myers Squibb, Seattle cégnél állították elő.) Ha a TGE-p hatóanyag kötési képességét (kötőképességét) nem tartja meg, akkor ezt az az eredmény jelzi, hogy a kapott fehérje inaktív.

E vizsgálat eredményei azt mutatták, hogy az implantátumból a TGF-^i olyan formában szabadult fel, amely monoklón antitesthez való kötőképességét megtartotta.

9. példa

DBM/PLPG implantátumból felszabaduló hatóanyag biológiai aktivitásának a meghatározása a növekedésgátlás mérésével

A 8. példában leirt ELISA-módszerben használt puffer egy részét visszatartottuk a növekedésgátlás (GIA) meghatározására. A GIA módszer alkalmas a TGF-^ biológiai aktivitásának (röviden: bioaktivitásának) a mérésére.

E GIA-méréshez menyét tüdejéből származó epiteliális sejteket alkalmaztunk (az American Type Culture Collection intézménynél elhelyezett minta lajstromszáma CCL-64), amelyek TGF-^> hatóanyaggal szemben rendkívül érzékenyek. A meghatározást annak az alapján végeztük, hogy a sejtben egy tetrazóliumsó kék színű formazántermékké alakul, s ez mutatja, hogy a sejt életben van.

• · ··

E vizsgálat eredményei arra utalnak, hogy az implantátumból felszabaduló TGF-βteljes mennyisége biológiai aktivitását

-meghatározás szerint) (az ELISAmegtartja.

E példa igazolja, hogy a TGF-^ hatóanyag DBM/PLPG implantátumba ágyazható, és abból biológiailag aktív alakban szabadul fel.

10. példa

Poli(tejsav-glikolsav) kopolimer mátrixba ágyazott,

TGF-^^ hatóanyagot tartalmazó DBM-részecskék előállítása további adalékanyagokkal

4. példa szerint implantátumot állítunk elő tömeg% oligo-L-laktid hozzáadásával. Szárítás után úgy találtuk, hogy a terméket sokkal könnyebb volt eltávolítani az öntőformából, és a termék rugalmasabb volt, mint az oligo-L-laktid nélkül előállított hasonló implantátumok.

E példa arra utal, hogy az implantátumok egyéb adalékanyagok hozzáadásával, például oligo-L-laktiddal, kollagénnel vagy glicerinnel is előállíthatok, s ilyen utón a kapott implantátum mechanikai sajátságai és a hatóanyag felszabadulása módosítható.

Az adalékanyagok fentebb leírt, rövid felsorolása nem korlátozó jellegüj számos más, szintetikus vagy természetes eredetű anyag használható e célra.

11. példa

TGF-hatóanyagot tartalmazó DBM/PLPG implantátum előállítása préseléssel (kompressziós kialakítással)

Az 5. példában leirt módon 1000 /jg/g TGF-^ hatóanyagot tartalmazó DBM-ből liofilizált készítményt állítunk ··

elő. Az igy kapott terméket mozsárban kézzel őröljük, és üvegbot segítségével szárított PLPG-vel keverjük. így végeredményként 26 tömeg% DBM-ot tartalmazó keveréket kapunk. E keveréket köralakú korongon (Carver Laboratory Press Test Cylinder) 172000 kPa nyomáson szobahőmérsékleten 10 percig préseljük. Az igy kapott implantátum ép és könnyen kezelhető.

felszabadulását meghatároztuk, és sokkal gyorsabbnak találtuk, mint az oldószeres öntéssel kapott hasonló implantátum esetében. E példa azt mutatja, hogy oldószermentesen végzett préseléssel TGF-|b hatóanyagot hordozó implantátumot állíthatunk elő.

12. példa

TGF-p . hatóanyagot tartalmazó DBM/PLPG hordozó rendszerből felszabaduló összes fehérjetartalom meghatározása

A 4. példa szerint implantátumot állítunk elő, és a TGF-p hatóanyagot emberi szérumaibumint nem tartalmazó PBS-oldatban felszabadulni hagyjuk. A pufferoldatban felszabadult fehérje összes mennyiségét bicinchoninsavval mérve határoztuk meg (beszerzési helye: Pierce, Rockford, IL). Ez a mérőmódszer 20 ^ug/ml koncentrációban jelenlévő fehérjére érzékeny, tehát nem alkalmas a TGF kimutatására a pufferoldatban. Ha a DBM-ben a fehérjekomponensek jelentős mértékben lebomlanak, akkor ez a bicinchoninsavval kimutatható. A bicinchoninsavas elemzés megmutatta, hogy a DBM kimutatható mértékben nem bomlott. E példa igazolja, hogy ·· «

·· « I • · • « ·· · • <

* «

- 28 a TGF-β 1 implantátumból végbemenő felszabadulását nem a DBM lebomlása szabályozza.

A fenti leírás, valamint a példák illusztráló jellegűek, tehát korlátozóknak nem tekinthetők. Számos további változtatás lehetséges a találmány szellemén és oltalmi körén belül, amelyek a jártas szakember számára nyilvánvalók.

Claims

1. TGF-β hatóanyag hordozására alkalmas, biológiai körülmények között lebomló készítmény, azzal jellemezve, hogy demineralizált (ásványmentesitett) csontmatrix és lebomló homopolimer vagy kopolimer keverékét tartalmazza, amelyben a TGF-^ hatóanyag oldott vagy diszpergált állapotban van, és amely a TGF-f) hatóanyagot az idő előrehaladása szerint (az idő függvényében) előre meghatározható, szabályzott ütemben képes felszabadítani.

2. Az 1. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy abból a TGF-β hatóanyag biológiailag aktív (bioaktiv) alakban szabadul fel.

3. Az 1. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy lebomló homopolimerként vagy kopolimerként politejsavat, poli(tejsav-glikolsav) kopolimert, poliglikolsavat, polikaprolaktont, poli(hidroxi-vajsav)-at, polianhidrideket, poliortoésztereket, polikarbonátokat, poliamidokat, poliacetálokat, poliaminosavakat vagy poli(ciano-akrilát)-okát tartalmaz.

4. Az 1 . igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy TGF~p hatóanyagként TGF-p^ hatóanyagot tartalmaz. 5. Az 1. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy TGF-β hatóanyagként TGF-5^> hatóanyagot tartalmaz. 6. Az 1. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy TGF~P hatóanyagként mórfogenetikus csont-

·· ·· • · · ·· ·· · • · · · ·· ·· ··

- 30 fehérjét tartalmaz.

7. Az 1. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy a keverék olyan adalékanyagot is tartalmaz, amely lágyitószerként hat, vagy a TGF-p hatóanyagnak a készítményből végbemenő felszabadulási kinetikáját módosítja8. A 7. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy adalékanyagként valamely oligo-L-laktidot tartalmaz.

A 7. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy adalékanyagként kollagént tartalmaz.

10. A 7. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy adalékanyagként glicerint tartalmaz.

11 .

TGF-p hatóanyagot hordozó rendszer, azzal jellemezve, hogy biológiai körülmények között lebomló készítménnyel bevont, implantálható hordozót tartalmaz, ahol a készítmény demineralizált csontmatrix és poli(tejsav-glikolsav) kopolimer keveréke, amelyben a TGF-hatóanyag oldott vagy diszpergált állapotban van, és amely képes a TGF-^> hatóanyag előre meghatározható, ellenőrzött (szabályzott) ütemü felszabadítására az idő függvényében.

12. A 11. igénypont szerinti hordozórendszer, azzal jellemezve, hogy hordozóként biológiai körülmények között lebomló hordozót tartalmaz.

13. A 11. igénypont szerinti hordozórendszer, azzal jellemezve, hogy a hordozóként szilárd, nem bomló hordozót tartalmaz.

• ·

14. A 11. igénypont szerinti hordozórendszer, azzal jellemezve, hogy oldószeres öntéssel vagy kompressziós formálással implantálható hordozóvá alakított, biológiai körülmények között lebomló készítményt tartalmaz.

15.

TGFhatóanyag stabilizálására alkalmas készítmény, azzal jellemezve, hogy körülbelül

10 mM-tól körülbelül 50 mM-ig terjedő koncentrációban szerves sav puffért tartalmaz, és pH-értéke körülbelül 2,5.

16.

A 15.

igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy pu fférként citromsavas pufferoldatot tartalmaz.

17.

15.

igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy pufferként ecetsavas pufferoldatot tartalmáz .

18.

15. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy legalább egy, további komponensként mannitot, emberi szérumalbumint, zselatint vagy nemionos nedvési tőszert tartalmaz.

19. A 15. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy rekonstitucióra (ismételt vizes oldásra) alkalmas, liofilizált formában van.

20. Eljárás hatóanyagként transzformáló növekedési faktort (TGF-p hatóanyagot) tartalmazó gyógyászati készítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy az ismert módon előállított hatóanyagot fiziológiailag elfogadható vivő-

anyaggal összekeverve gyógyászati készítménnyé alakítjuk. í) - ADVOPATFNT szab ad almi iroda KARÁCSObDQ BÉLA Π· . Postacím: 1251 Bp· PL H·