ITMI960264A1 - Sequenza oligonocleotidica da fegato di capra - Google Patents

Sequenza oligonocleotidica da fegato di capra Download PDF

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Abstract

Una macchina confezionatrice di prodotti diversi (16) in film plastico termoretraibile (13) comprende mezzi (12) di taglio e sigillatura del film (13) ed un tunnel (14) di termoretrazione dell'involucro sigillato contenente il prodotto (16) da confezionare. Detti mezzi (12) di taglio e sigillatura sono disposti fra un primo trasportatore (15) di entrata del prodotto (16) ed un secondo trasportatore (17) di ricezione del prodotto (16) stesso. Detto tunnel di termoretrazione (14) è disposto al di sotto di detto primo trasportatore (15) ed è attraversato da un terzo trasportatore (19) di uscita del prodotto (16) confezionato. Detto secondo trasportatore (17) è mobile fra una prima posizione sollevata complanare al primo trasportatore (15) ed una seconda posizione abbassata complanare al terzo trasportatore (19), e viceversa.

Description

"SEQUENZA OLIGONUCLEOTIDICA DA FEGATO DI CAPRA"
La presente invenzione riguarda la sequenza nucleotidica di un frammento di DNA che codifica per una sequenza di amminoacidi contenuta in almeno una proteina isolata da fegato di capra.
WO 92/10197 descrive estratti di organi di mammiferi con acido perclorico, in particolare di fegato di capra, che consistono di almeno tre diverse proteine e che sono caratterizzati da insolite proprietà farmacologiche e immunologiche.
Più recentemente, in WO 96/02567, è stata descritta la sequenza amminoacida parziale di una proteina di 14 Kda purificata da detto estratto, dotata di attività antineoplastica. I sieri di animali immunizzati con detta proteina presentano una sorprendente attività citotossica nei confronti di linee cellulari tumorali umane.
Nel 1993, Levi-Favatier et al. hanno riportato in Eur. J. Biochem, 212(3),665-673, la sequenza di un cDNA che codifica per una proteina di 10 kDa estratta da fegato di ratto la cui sequenza amminoacidica mostra elevato grado di identità con la sequenza descritta in WO 96/02567.
Similarità di sequenza amminoacidica è riscontrata anche con almeno due altre "ipotetiche” proteine, una di fegato di ratto di 14 kDa e una umana.Le corrispondenti sequenze nucleotidiche, recentemente depositate in banca dati EMBL, rispondono rispettivamente ai numeri di accesso L’elevato grado di omologia con quella oggetto dell' invenzione, suggerisce l’esistenza di una famiglia di geni e di proteine altamente conservate nelle diverse specie.
La disponibilità della sequenza nucleotidica codificante per la proteina di 14 Kda da fegato di capra (UK 114) descritta in WO 96/02567 e che è attualmente l'unica ad essere studiata per le sue proprietà inminofarmacologiche, permette lo studio e lo sviluppo di sistemi di espressione per la produzione del DNA ricorabinante, di metodi diagnostici basati sull'uso di sonde nucleotidiche, di proteine che presentino migliorate caratteristiche,etc.
Il DNA secondo la presente invenzione consta di 296 paia di basi e ha la seguente sequenza. ATG QAX GGG XXX 1S
GGA CAG CTT GTG CCA GGA GGG GTG GTA GAA GAG GCT AAA 94
GAG GCT CTT ACA AAC ATA GGT GAA ATT CTG AAA GCA GCA «3
QGC TOT GAC TTC ACG AAT GTG GTA AAA GCA ACG GTT TTG 132
CTG GCT GAC ATA AAT GAC TTC AGT GCT GTC AAT GAT GTC 171
TAC AAA CAA TAT TTC CAG AGT AGT TTT CCG GCG AGA GCT 210
GCT TAC CAG GTT GCT GCT TTG CCC AAA GGA GGC CGT GTT 249
GAG ATC GAA GCA ATA GCT GTG CAA GGA CCX CTC ACX ACC 298
GGX AGT GT 296 L'invenzione comprende inoltre sequenze di DNA che contengono la sequenza sopra riportata e che codificano la proteina di 14 kDa da fegato di capra avente la sequenza di 137 amminoacidi riportata di seguito.
Mal 8ar OLU AON 4
8ER GLU OLU PRO VAL GLY GLU ALA Lya Ala Pro Ala Ala 17
II· Oly PRO Tyr 8«r Gin Aia Val Lau vai Asp Mg Thr so
Ite Tyr U 8ar Oly βΐη LEU Gty Met Asp Pro ALA Bar 43
ATG GAX CCX OCO XXX
Oly Gin Lau Val Pro Gly Gly Val VAL Gki Giu Aia Lya 5· GGA GAG CTT GTG CCA GGA GGG GTG GTA GAA GAG GCT AAA
Otn Ala Lau TUR Asn ILE Gly Giu Ha Lau Lya Ala Ala 66 CAO GCT CTT ACA AAC ATA GGT GAA ATT CTG AAA OCA OCA
Oly Cya Aap Pha Thr Asn Va? Val Lya ALA Thr Vai Lau 82 GGC TOT GAC TTC ACG AAT GTG GTA AAA GCA ACG GTT TTG
Lau Ala Asp Ila Ain Atp Pha 8ER ALA Val Αιη A8P VAL 66 CTG GCT GAC ATA AAT OAC TTC AGT OCT QTC AAT GAT GTC
Tyr Lya OLN Tyr Pha Gin 8ER BER PIE Pro Ala Mg Ala 108 TAC AAA CAA TAT TTC CAO AOT AGT TTT CCG OCG AGA GCT
Ala Tyr Gin Val Ala Ma Lau Pro Lya Gly GLY Mg VAL 121 GCT TAC CAG GTT GCT GCT TTQ CCC AAA GGA GGC CGT GTT
Giù Ha «u Ala Ile Ala Val Gin Gly Pro LEU Thr Thr 124 GAG ATC GAA OCA ATA GCT GTG CAA GGA CCX CTC ACX ACC
Ala 8ER Val 127 OCX AGT GT
La sequenza di DNA oggetto dell'invenzione è stata ottenuta mediante la tecnica nota come Polymerase Chain Reaction (PCR) applicata a cDNA ottenuto per retrotrascrizione dell'RNA totale purificato, secondo metodiche convenzionali, da fegato di capra. Come primers sono stati utilizzati due gruppi di oligonucleotidi degenerati disegnati e sintetizzati sulla base della sequenza amminoacidica della proteina UK 114. In particolare,un primo gruppo di primers (PGOAT-1)corrispondente agli amminoacidi 39-45, consiste di una miscela di 20meri che comprendono tutte le possibilità di sequenza dovute alla degenerazione del codice genetico (5'-ATGGAT(oC)CCT(oCoAoG)GCT(oCoAoG)A(oT)-G(oC)T(oCoAoG)GGT(oCoAoG)CA-3'). Il secondo (PGOAT-9), corrispondente agli amminoacidi 131-137, consiste di una miscela di 20meri antisenso che, anche in questo caso, comprende tutte le possibilità di sequenza dovute alla degenerazione del codice genetico (5'-ACA(oGoToC)G(oC)A(oT)A(oGoCoT)GCA(oGoCoT)GTA(oGoToC)GTT(oGoCoA)AA(oG)A-(oGoCot)GG-3').
La retrotrascrizione è stata effettuata a 42*C per 60 min. utilizzando oligo(dT)come primer d'innesco.
La PCR ha fornito, dopo 35 cicli di amplificazione (95*C per 2 min.; 55eC per 2 min.; 72*C per 1 min.)un frammento di 296 paia di basi che è stato inserito nel plasmide pCR II e clonato. La digestione del DNA plasmidico, purificato da 10 diversi cloni, con l'enzima di restrizione Eco RI indica che in tutti è presente un inserto di 296 paia di beisi. Le sequenze nucleotidiche degli inserti, determinate utilizzando i promoters T7 e Sp6, presenti in 3 di questi diversi cloni plasmidici, risulta codificare la sequenza amminoacidi ca sopra riportata.
Tuttavia le sequenze nucleotidiche degli inserti contenuti nei 3 diversi cloni plasmidici risultano essere perfettamente identiche solo dal nucleotide 16 al nucleotide 278. Diversità di basi (indicate con x) vengono riscontrate nei primi e negli ultimi 20 nucleotidi, ma questo avviene perchè i primers utilizzati nella reazione di amplificazione sono miscele di oligonucleotidi degenerati

Claims (1)

  1. RIVENDICAZIONI 1. Frammento di DNA avente la seguente sequenza ATG QAX CCX GCO XXX 1S GGA CAG CTT GTG OCA GGA GGG GTG GTA GAA GAG GCT AAA 94 GAG GCT CTT ACA AAC ATA QGT GAA ATT CTG AAA GCA GCA 93 GGC TOT GAC TTC ACO AAT GTG GTA AAA GCA ACG GTT TTG 122 CTG GCT GAC ATA AAT GAC TTC AGT GCT GTC AAT GAT GTC 171 TAC AAA CAA TAT TTC CAG AGT AGT TTT CCG GCG AGA GCT 210 GCT TAC CAG GTT GCT GCT TTG CCC AAA GGA GGC CGT GTT 249 GAG ATC GAA GCA ATA GCT GTG CAA GGA CCX CTC ACX ACC 2S8 GCX AGT GT 298 2. Sequenze di DNA che contengono la sequenza della rivendicazione 1 e che codifica la proteina UK 114 da 14 Kda da fegato di capra.
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