ITPD20100388A1 - Metodo di rilevamento di un enzima proteolitico mediante amplificazione di un segnale catalizzata da nanoparticelle di oro. - Google Patents

Metodo di rilevamento di un enzima proteolitico mediante amplificazione di un segnale catalizzata da nanoparticelle di oro. Download PDF

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ITPD20100388A1
ITPD20100388A1 IT000388A ITPD20100388A ITPD20100388A1 IT PD20100388 A1 ITPD20100388 A1 IT PD20100388A1 IT 000388 A IT000388 A IT 000388A IT PD20100388 A ITPD20100388 A IT PD20100388A IT PD20100388 A1 ITPD20100388 A1 IT PD20100388A1
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Leonard Jan Prins
Paolo Scrimin
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Univ Padova
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Description

Descrizione
“Metodo di rilevamento di un enzima proteolitico mediante amplificazione di un segnale catalizzata da nanoparticelle di oro “
Campo dell’invenzione
L’invenzione concerne un metodo di rilevamento di un enzima proteolitico basato su una reazione di conversione, catalizzata da nanoparticelle di Au (oro) con composti leganti aventi cariche positive auto-assemblantesi in mono-strato sulla superficie del metallo, con produzione di una molecola “reporter†consistente in un composto che genera un segnale misurabile strumentalmente, in particolare cromogenico o fluorogenico. Il metodo può essere applicato per il rilevamento di proteasi e può essere reso selettivo operando una opportuna scelta del peptide substrato.
Stato della tecnica
La determinazione di un’attività enzimatica à ̈ essenziale in enzimologia, poiché permette di studiare i meccanismi alla base di una patologia e di sviluppare di conseguenza nuovi agenti terapeutici per la stessa. Tra tutti gli enzimi, le proteasi sono particolarmente importanti, essendo i processi proteolitici il risultato finale dell’attività di molte proteine [L. Hedstrom, Chem. Rev. 102, 4501 (2002); L. Tong, Chem. Rev. 102, 4609 (2002); H. Neurath, J. Celi. Biochem. 32, 35 (1986)].
Metodi convenzionali per il rilevamento delle proteasi sono basati sull’uso di radioisotopi o substrati fluoro- o cromogenici. Pertanto, sono stati sviluppati vari approcci basati sulle diverse interazioni del substrato dell’enzima e dei suoi prodotti con un chemosensore in grado di determinare la produzione di un segnale fluorimetrico o colorimetrico, come ad esempio saggi di spiazzamento [B. T. Nguyen, et al. Coord. Chem. Rev. 250, 3118 (2006)] e strategie sintetiche di pori su membrane [N. Sakai, et al. Acc. Chem. Res. 41 , 1354 (2008)].
Una seconda strategia nello sviluppo di sensori sensibili prevede l’uso di nanoparticelle di vario tipo, di cui si sfruttano le intrinseche proprietà chimicofisiche in combinazione con la possibilità di modificarne la superficie con piccoli leganti organici [N.L. Rosi, C.A. Mirkin, Chem. Rev. 105, 1547 (2005); S.S Agasti et al. Adv. Drug. Del. Rev. 62, 316 (2010); M. De et al. Adv. Mater. 20, 4225 (2008)]. Ciò che rende particolarmente interessanti queste nanoparticelle funzionalizzate à ̈ la loro natura multivalente, che permette l’interazione con il target in più punti e quindi con alta affinità [A. Mulder et al. Org. Biomol. Chem. 2, 3409 (2004)]. A tal riguardo sono stati studiati estesamente in particolare colloidi protetti mono-strato di oro (in breve Au MPC), avendo questi colloidi una alta stabilità ed essendo facili da preparare e funzionalizzare [M.C. Daniel et al., Chem. Rev. 104, 293-346 (2004)]. Principalmente, l’uso di Au MPC à ̈ basato o sull’induzione di un cluster che causa un cambiamento di colore (dal rosso al blu) [K.H. Su et al. Nano Leti. 3, 1087-1090 (2003); C. Guarise et al. Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 103, 3978-3982 (2006)] o uno spiazzamento guidato dall’analita del fluoroforo legato ai Au MPC [Sapsford, K.E. et al. Angew. Chem. Int. Ed. 45, 4562-4588 (2006); C.C. You et al. Nat. Nanotechnol. 2, 318-323 (2007)]. Recentemente, à ̈ stata inoltre descritta una strategia alternativa, in cui gli analiti prevengono l’estinzione fluorescente di una molecola “reporter†, bloccandone l’accesso alle unità reattive localizzate su un mono-strato [E. Climent et al. Chem. Commun., 6531-6533 (2008)]. E' stato ancora più recentemente riportato in letteratura un sensore basato su Au MPC, che prevede la formazione di un segnale di amplificazione mediante lo spiazzamento di un enzima per mezzo di un analita [O R. Miranda, et al. J. Am. Chem. Soc. 132, 5285-5289 (2010)].
La caratteristica comune di questi metodi à ̈ che la quantità del segnale generato à ̈ proporzionale alla quantità di substrato convertito dall’enzima. La sensibilità di questi saggi potrebbe essere, invece, significativamente incrementata nel caso in cui la conversione enzimatica di un singolo substrato portasse alla formazione di un gran numero di molecole reporter.
Pertanto, il principale limite dei metodi di determinazioni noti attualmente à ̈ che la quantità del segnale prodotto rilevabile, mediante un isotopo o un fluoroforo o un cromoforo, à ̈ linearmente correlata alla quantità del prodotto derivante dall’azione dell’enzima sul suo substrato. Questo pone limiti alla sensibilità e alla velocità della misura, poiché la determinazione di basse concentrazioni di enzima richiede tempi lunghi per generare un segnale apprezzabile. Un secondo svantaggio à ̈ che devono essere impiegati substrati enzimatici speciali (isotopi, fluorofori o cromofori) per generare un segnale rilevabile dopo l’idrolisi di un legame peptidico e la presenza di questi reagenti interferisce con l’affinità enzima/substrato portando a determinazioni non affidabili.
Sommario dell’invenzione
Lo scopo dell’invenzione à ̈ quindi di superare il problema del rapporto stechiometrico tra la quantità di substrato idrolizzato dall'enzima e la quantità di segnale (i.e. molecola “reporter†) prodotta.
Per ovviare a questa limitazione à ̈ stato trovato un metodo quali- e quantitativo che prevede essenzialmente un processo che determina l’amplificazione del segnale da misurare catalizzato da nanoparticelle di Au funzionalizzate con cariche positive, ovvero colloidi di oro protetti con un mono-strato (Au MPC).
In particolare, il metodo per il rilevamento di un enzima proteoiitico messo a punto allo scopo predetto prevede una cascata di due processi catalizzati per la generazione di un segnale misurabile, in cui un ruolo cruciale à ̈ svolto da un composto peptidico, avente natura di polianione ed avente, contemporaneamente la funzione di substrato dell’enzima e di inibitore di nanoparticelle colloidali di Au funzionalizzate con leganti aventi cariche positive auto-assemblantesi in monostrato, la cui l’attività catalitica porta alla formazione di un segnale consistente in un agente misurabile strumentalmente, ad esempio per via spettrofotometrica o fiuorimetrica.
È quindi oggetto della presente invenzione un metodo per il rilevamento di un enzima proteoiitico caratterizzato dal fatto di impiegare per tale rilevamento un composto peptidico avente natura di polianione ed avente funzione sia di substrato dell’enzima da rilevare sia di inibitore dell’attività catalitica di nanoparticelle di Au funzionalizzate catalizzanti una reazione di conversione di un reagente in un prodotto in grado di produrre una molecola “reporter†come segnale misurabile strumentalmente. Tali nanoparticelle di Au sono funzionalizzate con leganti aventi cariche positive che si auto-assemblano in mono-strato sulla superficie del metallo.
Il metodo oggetto dell’invenzione si à ̈ dimostrato in grado di adempiere allo scopo in quanto, come sarà più chiaro dalla descrizione dettagliata dell’invenzione che segue, si à ̈ potuto verificare che la presenza dell’enzima da determinare portava all’idrolisi di un composto peptidico da parte dello stesso e da questa ne derivava una amplificazione catalizzata nella generazione del segnale, in particolare determinava la produzione di 70 molecole “reporter†invece che 1 , incrementando significativamente la sensibilità del saggio. Tale sensibilità à ̈ ulteriormente migliorata dal fatto che il metodo à ̈ selettivamente indirizzato alla determinazione di uno specifico enzima, essendo tale selettività operata mediante la scelta di un appropriato substrato a seconda del tipo di enzima che si intende rilevare. Inoltre diversamente dai metodi convenzionali non à ̈ necessario modificare il substrato deH’enzima introducendo sullo stesso gruppi fuoro- o cromogenici in grado di generare un segnale misurabile.
Le proteasi di interesse per il metodo sono la subtilisina, le caspasi, la glutammato carbossipeptidasi II, la granzima, e la termolisina.
L’invenzione si estende inoltre ai composti peptidici, avente natura di polianione ed avente contemporaneamente la funzione di substrato deH’enzima e di inibitore di nanoparticelle colloidali di Au funzionalizzate, e loro derivati impiegabili per il metodo oggetto dell'invenzione.
Questi ed altri vantaggi come pure altri oggetti dell’invenzione saranno più chiari dalla descrizione dettagliata dell’invenzione che segue con l’ausilio delle figure allegate alla stessa.
Breve descrizione delle figure
Figura 1. La figura mostra una rappresentazione schematica del principio di funzionamento del metodo di rilevamento di un enzima oggetto dell’invenzione secondo una realizzazione delio stesso, in cui il segnale misurabile à ̈ la molecola “reporter†p-nitrofenolo (in breve PNP), a partire da un composto peptidico indicato in figura come “substrato†sia in assenza (A) che in presenza (B) dell’enzima da rilevare, mediante nanoparticelle di Au funzionalizzate con cariche positive (identificate in figura come Au MPC 1) che catalizzano la reazione di transfosforilazione dell’agente cromogenico 2-idrossipropil-4-nitrofenil fosfato (in breve HPNPP) e la liberazione della molecola “reporter†. (A) la reazione di transfosforilazione di HPNPP à ̈ inibita in assenza di proteasi in quanto il composto peptidico, essendo un polianione, forma con le nanoparticelle di Au funzionalizzate un complesso stabile che inibisce l’idrolisi catalizzata del HPNPP. (B) La presenza di una proteasi in grado di idrolizzare il substrato peptidico polianione, invece, previene la formazione del complesso Au MPC 1 /substrato e permette la reazione catalizzata di trans-fosforilazione di HPNPP. Contestualmente si ha la produzione della molecola “reporter " p-nitro-fenolo. che viene quantificata misurando l’assorbanza a 405nm.
Figura .2. La figura mostra il numero di equivalenti di p-nitro-fenolo (PNP) prodotti per unità catalitica di TACNâ— Zn(ll) in funzione del tempo. Condizioni sperimentali: [TACNâ— Zn(ll)] = 5.0- 10<-6>M, [HPNPP]0= 10*10<-3>M, [HEPES] = 1.0-10<-2>M, pH = 7.0, 40°C. Il numero di equivalenti di PNP per TACNâ— Zn(ll) à ̈ stato calcolato dividendo l’assorbanza per il coefficiente di estinzione molare del PNP a pH 7.0 (8503 l.mol<- 1>.cm<-1>) e alla concentrazione di TACN-Zn(ll) 5.0 Î1⁄4Îœ. La concentrazione finale del PNP era 0.35 mM corrispondente alla conversione del 35 % di HPNPP (1.0 mM).
Figura 3. La figura mostra una rappresentazione schematica del protocollo utilizzato per il metodo di rilevamento di un enzima proteolitico secondo l'invenzione.
Figura 4. La figura mostra i risultati ottenuti con il saggio di rilevamento della Subtilisina A descritto all’esempio 1 : a) l’assorbanza a 405 nm misurata 30 minuti dopo l'aggiunta di Au MPC 1 e di HPNPP ad una soluzione del peptide substrato AcNH-Asp-Asp-Asp-OH (SEQ IDNO. B) incubato con la Subtilisina A a differenti concentrazioni per 1 ora in assenza (â– ) e in presenza (â–¡) di un inibitore dell'enzima fenil-metilsulfonil fluoruro (PMFS) (H20 tamponata a pH 7.5 ([HEPES]=10 mM), T = 25°C); b) la differenza in assorbenza a 405 nm tra il AcNH-Asp-Asp-Asp-OH incubato per 1 ora con differenti concentrazioni di Subtilisina A ed il campione di riferimento contenente AcNH-Asp-Asp-Asp-OH in funzione del tempo di saggio; c) la linearità della risposta rispetto alle concentrazioni dell’enzima in un regime nanomolare e l’effetto positivo a tempi di saggio più lunghi (â–  : 20 minuti, â–¡ : 20 ore) sulla intensità del segnale in uscita (= misura del PNP).
Figura 5. La figura mostra i risultati ottenuti con il saggio di rilevamento della Caspasi 1 descritto all’esempio 2: l’incremento in assorbenza a 400 nm in funzione del tempo a seguito dell’addizione di Au MPC 1 e HPNPP ad una soluzione del peptide substrato AcNH-YVADD-OH (SEQ IDNO. 1) e Caspasi 1 incubati per 4 giorni a 37°C in assenza (I) e presenza (II) dell’inibitore dell ’enzima AcNH-YVAD-CMK. Condizioni sperimentali: [AcNH-YVADD-OH] = 5.0- 10<-6>M, caspase 1 = 0.1 AU, [TACN-Zn(ll)] = 5.0-10-<6>Îœ, [HPNPP] = 1.0-10<-3>M, [HEPES] = 1.0-10<-2>M, pH = 7.2, 40 °C.
Descrizione dettagliata dell'invenzione
Definizioni e abbreviazioni
A meno che non siano diversamente definiti, tutti i termini scientifici e tecnici usati in tutte le parti della descrizione dell’invenzione hanno i significati che comunemente un tecnico del settore in cui l’invenzione ricade comunemente comprende. In particolare à ̈ noto ad un tecnico del settore che i termini “nanoparticelle†e “colloidi†sono da considerarsi equivalenti.
Au MPC à ̈ qui usata come abbreviazione per le “nanoparticelle di Au funzionalizzate con cariche positive auto-assemblantesi in mono-strato†e “colloidi di Au protetti mono-strato di molecole organiche†ed espressioni equivalenti. Tali espressioni qui impiegate sono da considerarsi ai fini della descrizione della presente invenzione equivalenti e nel loro significato esteso.
Molecola “reporter†o “segnale misurabile†sono termini -equivalenti, con cui si intende indicare il prodotto derivante dalla reazione di conversione, catalizzata da nanoparticelle di Au, funzionalizzate con cariche positive auto-assemblantesi in mono-strato, di un reagente cromogenico o fluorogenico, substrato delle stesse Au MPC. dalla conversione si genera un composto cromoforo o fluoroforo, la c.d. “molecola reporter†, misurabile per via strumentale con metodi noti ad un esperto del settore. A titolo di esempio, ma non limitatamente a questa, in una realizzazione preferita dell’invenzione tale reazione di conversione à ̈ la transfosforilazione dell’agente cromogenico 2-idrossipropil-4-nitrofenil fosfato (il quale à ̈ quindi il substrato delle Au MPC) con produzione dell’agente cromoforo pnitrofenolo (che à ̈ la “molecola. reporter†) misurabile con l’assorbanza a 405 nm. Le abbreviazioni sotto riportate sono riferite alla reazione di conversione catalizzata o all’affinità delle Au MPC rispetto al peptide polianionico substrato/inbitore:
Kcat= costante di velocità della conversione catalizzata da Au MPC di un agente cromogenico/fluorogenico.
Kuncat= costante di velocità della conversione di un agente cromogenico/fluorogenico in assenza di Au MPC.
KM = costante di dissociazione tra Au MPC e l'agente cromogenico/fluorogenico o il peptide anionico.
Descrizione
La caratteristica essenziale e chiave del metodo di rilevamento di una proteasi secondo l’invenzione à ̈ l'impiego di un peptide polianionico che possa contemporaneamente agire come substrato dell’enzima, e quindi possa essere idrolizzato dallo stesso in modo specifico, e come inibitore dell’attività catalitica di nanoparticelle di Au funzionalizzate con leganti aventi cariche positive autoassemblantesi in mono-strato sulla superficie del metallo. L’impiego di un peptide con queste caratteristiche determina un processo a cascata di due eventi catalitici per la generazione di un segnale misurabile a due vie a seconda che l’enzima sia presente o assente nel campione da analizzare:
A. in assenza dell’enzima il peptide substrato non viene idrolizzato e quindi, avendo natura polianionica, forma con le nanoparticelle di Au cariche positivamente un complesso che inibisce l’attività delle stesse nella catalisi della conversione di un reagente con produzione di un segnale misurabile, consistente in particolare in un agente cromoforo o fluoroforo;
B. in presenza di una proteasi in grado di idrolizzare il substrato peptidico polianionico, invece, non si ha la formazione del complesso Au MPC /peptide substrato, con ciò permettendo che si abbia la conversione catalizzata del reagente con produzione del segnale misurabile in termini di concentrazione di un composto cromoforo o fiuoroforo.
Questo processo à ̈ in dettaglio schematizzato in figura 1 con riferimento ad uno specifico esempio di reazione di conversione catalizzata, preferita per gli scopi della presente invenzione, di un agente cromogenico, quale la reazione di transfosforilazione del 2-idrossipropil-4-nitrofenil fosfato (HPNPP) e sua conversione in p-nitro-fenolo (PNP).
Benché questa sia in una realizzazione preferita dell’invenzione la reazione di conversione che viene sfruttata per la produzione di un segnale misurabile, tale reazione di conversione catalizzata dalle Au MPC può utilizzare anche altri substrati e generare altre “molecole reporter†, modificando opportunamente il gruppo uscente che genera la “molecola reporter†su una struttura di base in grado di funzionare come substrato delle Au MPC.
Pertanto, il reagente cromogenico o fluorogenico, substrato della reazione di conversione catalizzata dalie nanoparticelle di Au, può essere un composto 2-idrossipropil-(R-) fosfato, dove R à ̈ un gruppo che diventa un composto cromo- o fluoroforo quando viene tagliato dal substrato. Alternative al reagente cromogenico HPNPP possono essere per esempio il 2-idrossipropil-(2,4-dinitrofenile) fosfato, il 2-idrossipropil-(2,4-dinitro-7-sulfonato-naftile) fosfato, il 2-idrossipropil-(3,6,8-trisulfonato pirene) fosfato, reagenti che generano rispettivamente le molecole “reporter†di cui à ̈ sotto-riportata la formula di struttura
Le nanoparticelle di Au impiegabili per l’implementazione del metodo oggetto dell'invenzione sono note e descritte in Manea F. et al. Angew.Chem.Int.Ed. 43, 6165 (2004).
In breve, le caratteristiche che devono avere queste nanoparticelle Au MPC per gli scopi della presente invenzione sono:
- una dimensione preferibilmente compresa tra 1.5 - 20 nm;
- cariche positive derivanti dal complesso tra 1 ,4,7-triazaciclononano (TACN) e lo ione Zn", di cui à ̈ sotto riportata la formula di struttura, autoassemblantesi in mono-strato sulla superficie del metallo
- una densità di carica di almeno 1 carica positiva per tiolo e preferibilmente compresa tra 2 e 3 cariche positive per tiolo.
L’uso di queste nanoparticelle di Au nella catalisi dell'idrolisi di HPNPP in PNP à ̈ facilmente misurabile ed à ̈ noto [F. Manea, et al ref. cit. ] e consolidato e questo lo rende particolarmente vantaggioso per la sua affidabilità e facilità di implementazione. La catalisi à ̈ ottenuta dall’azione cooperativa di due complessi TACN*Zn" localizzati sulla superficie del mono-strato. Come noto queste nanoparticelle di Au hanno un comportamento di saturazione simile a quello di un enzima con valori per Kcat= 6.7 x 10<-3>s<-1>e KM = 0.31 mM a pH = 7.5 in H2O. Inoltre, ai fini analitici l’uso di queste nanoparticelle di Au e la reazione di transfosforilazione di HPNPP per la produzione di un segnale misurabile presentano l’ulteriore vantaggio che alle condizioni sperimentali di esecuzione del saggio non c’à ̈ praticamente nessuna reazione competitiva, poiché kuncatper la reazione non catalizzata di HPNPP à ̈ nell’ordine di 10<-7>s<-1>nelle stesse condizioni sperimentali, e che la reazione può essere monitorata facilmente visivamente, misurando l’assorbanza del p-nitrofenolo prodotto a 405 nm.
Per un altro aspetto, invece, l’uso di queste Au MPC à ̈ particolarmente vantaggioso, poiché le stesse possono avere un elevato numero di cariche positive dovute al complesso TACN-Zn" posizionato sulla superficie del metallo e in conseguenza hanno una grande affinità per molecole cariche negativamente. Esperimenti di turn-over, descritti nella parte sperimentale che segue, condotti per la messa a punta del metodo oggetto dell’invenzione hanno evidenziato che queste nanoparticelle di Au giocano effettivamente un ruolo non secondario nell’amplificazione del segnale, avendo questi esperimenti mostrato che il sistema à ̈ capace di generare almeno 70 molecole di PNP per complesso di TACNâ— Zn" (fig- 2).
Considerando il fatto che il metodo secondo l’invenzione si basa su una cascata di due processi catalizzati regolati dalle interazioni enzima/peptide substrato e peptide substrato o prodotto dello stesso derivante dall’idrolisi enzimatica con Au MPC, vanno tenuti in debita considerazioni, inoltre, alcuni requisiti relativi ai peptidi impiegabili. È, infatti, il peptide substrato che ha un ruolo chiave nell’indurre o inibire i due processi catalizzati, il primo di idrolisi catalizzata dall'enzima ed il secondo catalizzato dalle nanoparticelle di Au.
In particolare, avendo tale peptide una funzione sia di substrato dell’enzima che di inibitore delle nanoparticelle di Au, deve avere un adeguata sequenza amminoacidica e nel contempo avere un adeguato numero di cariche negative. Pertanto, peptidi utili a questi scopi possono essere peptidi rappresentabili dalla formula generale (I)
RNH-[AA - AA]n[AA - AA]rCOOH
(I)
in cui:
R Ã ̈ un gruppo acetile;
[AA- AA ],· (/<'>= un numero intero compreso tra 1 e 4) definisce un dominio di affinità per le nanoparticelle di Au funzionalizzate positivamente consistente in un amminoacido o in una sequenza di amminoacidi, dove l'amminoacido o gli amminoacidi, uguali o diversi tra di loro, sono scelti tra acido aspartico o acido glutammico;
[AA- AA]„ (n — un numero intero compreso tra 1 e 8) definisce il dominio di selettività per l’enzima da rilevare consistente in un amminoacido o in una sequenza di amminoacidi, dove l'amminoacido o gli amminoacidi, uguali o diversi tra di loro, sono scelti indifferentemente tra gli amminoacidi proteinogenici sia della serie L che della D,
e loro derivati.
In questi peptidi gioca un ruolo sostanziale la porzione [AA - AA]„ che definisce il dominio di selettività in quanto questa à ̈ disegnata specificamente al fine che tali peptidi possano essere i substrati specifici deH’enzima che si vuole rilevare, mentre la porzione [AA - AA] definendo l’affinità per la nanoparticelle di Au à ̈ 10785PTIT Notarbartolo & Gervasi S.p.A.
significativa per ottenere un’adeguata differenza di carica tra il peptide substrato ed il prodotto derivate dalla sua idrolisi enzimatica.
Infatti, affinché tale processo si determini in modo efficiente devono essere soddisfatti i seguenti requisiti relativamente al peptide substrato/inibitore . di Au MPC:
- il peptide substrato ed il prodotto derivante dalla sua idrolisi catalizzata dalla presenza dell’enzima da rilevare devono avere tra di loro differente affinità per le nanoparticelle di Au usate nella seconda catalisi ed in particolare, essendo l’interazione di tipo elettrostatico, ciò implica che l’enzima deve modificare la carica del substrato diminuendola; e
- la concentrazione del substrato da usare nel saggio deve essere tale per cui il substrato ed il prodotto derivante dall’idrolisi enzimatica abbiano la più grande differenza in potere di inibizione. In ogni caso, il regime della concentrazione à ̈ indicativamente determinato dal numero di cariche negativo e presente sul substrato secondo il criterio:
cariche negative sul substrato regime di concentrazione utile
1 > 1x10<'3>M
2 5x10<'3>M — 1x10<"3>M
3 5x1 0<"6>M — IxlO<"4>M
4 5x1 0<"7>M - 1x10<"5>M.
Per il metodo secondo l’invenzione peptidi substrati putativi di enzimi proteolitici ed inibitori di Au MPC sono i seguenti:
Enzima_ peptidi substrato/inibitori (SEQ. ΙΡΠΟ.Ί Glutammato carbossi peptidasi II AcNH-DE-OH (SEQ. IDNO. A) Subtilisina AcNH-DDD-OH (SEQ. IDNO. B) Caspasi 1 AcNH-YVADD-OH (SEQ. IDNO. 1) Caspasi 2 AcNH-VDVADDD-OH (SEQ. IDNO. 2) Caspasi 3 AcNH-DEVDDD-OH (SEQ. IDNO. 3) Caspasi 4 AcNH-LEVDDD-OH (SEQ. IDNO. 4) Caspasi 5 AcNH-WEHDDD-OH (SEQ. IDNO. 5) Caspasi 6 AcNH-VEIDDD-OH (SEQ. IDNO. 6) Caspasi 8 AcNH-IETDDD-OH (SEQ. IDNO. 7) Caspasi 9 AcNH-LEHDDD-OH (SEQ. IDNO. 8) Caspasi 10 AcNH-AEVDDD-OH (SEQ. IDNO. 9) Caspasi 12 AcNH-ATADDD-OH (SEQ. IDNO. 10) Caspasi 13 AcNH-LEEDDD-OH (SEQ. IDNO. 11) Termoiisina AcNH-XXXDDD-OH (X = qualsiasi AA) (SEQ. IDNO. 12)
Granzyme AcNH-IEPDDD-OH (SEQ. IDNO. 13). Tenendo conto di quanto in precedenza menzionato a titolo di esempio sono riportati in tabella 1 le condizioni in cui i requisiti precedentemente indicati sono soddisfatti nel caso in cui l’enzima da determinare sia la subtilisina A, la glutammato carbossi peptdidasi II o la caspasi 1 .
Tabella 1 : Substrati e prodotti per diversi enzimi. Per ogni enzima à ̈ data la concentrazione del substrato a cui la differenza nel potere inibitorio del substrato e dei prodotti à ̈ massima
enzima Substrato Prodotto/i(carica Concentrazione (carica netta) netta) ottimale di saggio K inibizione (M) K inibizione (M)
Subtilisina AS AcNH-DDD-OH (- AcNH-DD-OH (-3) 5.0 x 10<'e>(45)
4) (SEQ. ID NO. (SEQ. IDNO. C)
B)1.8x1 0<"6>5.0x1 0<'6>
Glutammato A/-acetyl-L- /V-acetyl-L- 5.0 x 10-<6>(65) carbossi aspartyl-L- aspartate (-2) e
peptidasi II glutamate (-3) gl utamate (-1)
(SEQ. IDNO. A)
4.0x1 0<'5>
9.0x1 0<'7>
Caspasi 1 AcNH-YVADD (-3) AcNH-YVAD (-2) 5.0 x 10<"e>(42)
(SEQ. IDNO. 1) (SEQ. IDNO. 14)
4.0x1 0<'6>IxlO<"4>
Il dettaglio degli esperimenti di inibizione eseguiti per la messa a punto e verifica del metodo sono riportati nella parte sperimentale che segue.
Il rilevamento di un enzima proteolitico secondo il metodo oggetto dell’invenzione prevede che lo stesso comprenda almeno le seguenti fasi:
- aggiunta ad un campione, contenente in soluzione o sospensione acquosa tamponata a pH 7.0-8.0 l’enzima proteolitico da determinare un . composto peptidico di formula generale (I) avente la funzione di agire come substrato dell’enzima e come inibitore di nanoparticelle di Au funzionalizzate con leganti aventi cariche positive autoassemblantesi in mono-strato;
- aggiunta alla miscela così ottenuta dopo incubazione della stessa per almeno un tempo di 20 minuti nanoparticelle funzionalizzate di Au ed un reagente composto substrato delle stesse per la reazione di conversione;
- determinazione per via strumentale della generazione della molecola
“reporter†dal momento dell’aggiunta delle nanoparticelle funzionalizzate di Au e del suo substrato;
- misura della concentrazione dell’enzima sulla base della concentrazione della molecola “reporter†sulla base di una curva di taratura ottenuta con una serie di campioni a titolo noto di enzima.
Il protocollo per l’esecuzione del metodo à ̈ schematizzato in fig. 3. Di seguito esso à ̈ riportato in dettaglio.
Il saggio secondo il metodo di rilevamento di un enzima proteolitico secondo l’invenzione prevede le seguenti condizioni sperimentali.
Una soluzione acquosa di un peptide di formula generale (I) à ̈ aggiunto in una quantità compresa tra 0.25 mg e 5 mg e preferibilmente di 2.5 mg ad una concentrazione compresa tra 5.0 x 10<'7>M e 1.0 x 10<"5>M, e preferibilmente di 5.0 x 10<"6>M, ad una soluzione acquosa di enzima tamponata con HEPES (10x10<'3>M) ad un pH compreso tra 7.0 e 8.0 (preferibilmente 7.5) con una concentrazione di enzima ignota. La miscela viene incubata ad una temperatura tra 25 e 40°C per un periodo tra 20 minuti e 24 ore (preferibilmente 30 minuti). Dopo questo tempo di incubazione vengono aggiunte le nanoparticelle Au MPC per arrivare ad una concentrazione finale di TACN'Zn" di 5.0 x 10<"6>M ed HPNPP per arrivare ad una concentrazione finale di 1.0 x 10<"3>M. Viene misurata l’assorbanza ad una lunghezza d’onda di 405 nm dopo un tempo di incubazione che varia tra .20 minuti e 24 ore. Dal valore di assorbenza misurata si calcola la concentrazione di PNP tramite l’equazione (1 a<0>o 1b):
[PNP] = A405 nm /13135 (a pH 7.5) (1 a)
[PNP] = A405 nm /8503 (a pH 7.0) (1 b)
in cui il valore di 13135 corrisponde alla coefficiente di estinzione molare del PNP ad un pH di 7.5 e il valore di 8503 corrisponde alla coefficiente di estinzione molare del PNP ad un pH di 7.0.
La concentrazione di enzima può essere quindi quantificata secondo l’equazione (2)
[enzima] = (A405nm, 64800 s-3.75x10<'2>)/4.74x10<"2>(Î1⁄4Îœ) (2) ottenuta da una retta di taratura usando una serie di campioni a titolo noto di enzima.
PARTE SPERIMENTALE
Esperimenti di tum-over
Ad una soluzione acquosa ([HEPES] = 10 mM, pH =7.0, T=40 °C) di Au MPC (5.0 Î1⁄4Îœ con riferimento alla concentrazione di TACN e ZnN03(5.0 Î1⁄4Îœ) à ̈ stata aggiunto HPNPP cosicché la concentrazione finale sìa di 1.0 mM. L’assorbanza a 405 nm à ̈ stata misurata per un periodo di 7 giorni. La concentrazione finale di PNP à ̈ stata calcolata con la seguente equazione
[PNP] = Α405ηη/8503 (M)
in cui il valore di 8503 corresponde alia coefficiente di estinzione molare del PNP a pH 7.0. Il numero di molecole di PNP prodotte per complesso TACN'Zn" (70) Ã ̈ stata calcolata dividendo la concentrazione finale di PNP (0.35 mM) per la concentrazione di TACN'Zn".
I risultati ottenuti sono riportati nella figura 2 precedentemente menzionata. La figura mostra il numero di molecole di PNP prodotti per complesso TACN'Zn" in funzione del tempo.
Esperimenti di inibizione
Ad una soluzione acquosa ([HEPES] = 10 mM, pH =7.0, T=40 °C) di Au MPC (5.0 Î1⁄4Îœ con riferimento alla concentrazione di TACN) e ZnN03(5.0 Î1⁄4Îœ) à ̈ stata aggiunta una quantità di inibitore coprendo l’intervallo di concentrazioni come indicate nella Tabella 2 per i vari inibitori. Dopo 5 minuti à ̈ stato aggiunto HPNPP (1.0 mM) e l’assorbanza a 405 nm à ̈ stata misurata per un periodo di 30 min. La velocità iniziale à ̈ data dalla pendenza della curva dell’assorbanza contro il tempo. La costante di inibizione come indicata in tabella 1 à ̈ definita come la concentrazione di inibitore che serve per dimezzare la velocità iniziale in assenza di inibitore.
Tabella 2. Intervallo delle concentrazioni per i vari inibitori
Inibitore Concentrazione Concentrazione
(SEQ. IDNO.) inferiore (M) superiore (M)
AcNH-DDD-OH
1.0x10<"7>5.0x1 0<'5>
(B)
AcNH-DD-OH
1.0x10<'7>1.0x10<"3>
(C)
AcNH-YVADD-OH
1.0x10<"8>5.0x1 0-<4>
(1)
AcNH-YVAD-OH
1.0x10<'7>1.0x10<'3>
(14)
AcNH-DE-OH
1.0x10<"8>5.0x1 0<'5>
(A)
AcNH-D-OH
5.0x1 0<'7>1.0x10<'3>
I risultati ottenuti sono riportati nella tabella 1 precedentemente riportata. La concentrazione ottimale per l’assay à ̈ stato definito come la concentrazione a quale il potere inibitoria tra il substrato e prodotto à ̈ il massimo. Per tutte le coppie AcNH-DDD-OH/AcNH-DD-OH, AcNH-YVADD-OH/AcNH-YVAD-OH e AcNH-DE-OH/AcNH-D-OH questa concentrazione risulta essere 5.0x1 0<'6>M.
Per gli scopi illustrativi, ma non limitativi, della presente invenzione di seguito sono riportati esempi di determinazioni di proteasi, una proteasi aspecifica quale la Subtilisina A e la caspasi 1 , da cui possono essere desunti sia la facilità e versatilità di applicazione del metodo secondo l’invenzione che i vantaggi ottenibili con lo stesso.
ESEMPI
Esempio 1: saggio di rilevamento della Subtilisina
Metodo
Tutti i prodotti commerciali (incluso l’enzima) sono stati acquistati dalla Sigma Aldrich. Il peptide AcNH-DDD-OH di SEQ ID NO. B à ̈ stato sintetizzato secondo il metodo di sintesi peptidica su fase solida (resina Wang) usando la chimica Fmoc. Il saggio di rilevamento dell’enzima à ̈ stato eseguito a pH 7.5 ([HEPES]=10 mM). Una soluzione acquosa del peptide substrato AcNH-DDD-OH (925 pL, 10.7 pM) à ̈ stata incubata con 10 pL di una soluzione acquosa di Subtilisina A tamponata a pH 7.5 con HEPES (10 mM) ad una concentrazione di 42 pM. La soluzione à ̈ stata mantenuta a 25°C per 20 minuti, dopo di che si sono aggiunti Au MPC, Zn(N03)2e HPNPP per avere, rispettivamente, le concentrazioni di 5x1 0<"6>pM (in riferimento al TACN), 5x10<'6>pM e 1.0 mM. La provetta à ̈ stata mantenuta termostata a 40°C per 30 minuti, durante i quali la formazione del prodotto p-nitro-fenolo à ̈ seguita misurando l’assorbanza a 405 nm.
L’esperimento di inibizione con fenil-metilsulfonil fluoruro (PMFS) di controllo à ̈ stato eseguito in modo analogo a quanto descritto in precedenza, aggiungendo 175 ng di inibitore fenil-metilsulfonil fluoruro (PMFS) (1 pM) alla soluzione dell’enzima 30 minuti prima dell’aggiunta del tripeptide substrato.
Risultati
Il peptide AcNH-Asp-Asp-Asp-OH viene incubato con la Subtilisina A in concentrazioni da 66 nM - 42 Î1⁄4Îœ. Dopo 60 minuti sono stati aggiunti Au MPC (TACN'Zn<11>= 5 Î1⁄4Îœ) e HPNPP (1 mM) alla miscela e quindi si inizia la misurazione dell’assorbanza a 405 nm per 30 minuti. La dipendenza dell’assorbanza a 405 nm misurata alla concentrazione iniziale dell’enzima dimostra che il metodo à ̈ in grado di rilevare l’attività enzimatica (fig. 4a). Infatti, non si osservava nessuna attività enzimatica nel caso in cui la Subtilisina A sia stata pre-trattata con l’inibitore PMFS (fenil-metilsulfonil fluoruro). Il fatto che l’assorbanza giunga a plateau a concentrazioni di Subtilisina maggiori di 20 pM indica che il substrato AcNH-Asp-Asp-Asp-OH à ̈ stato idrolizzato al suo massimo grado.
Il vantaggio dell’amplificazione catalizzata del segnale à ̈ evidente quando il tempo di incubazione per la prodizione di p-nitrofenolo mediante Au MPC à ̈ aumentato (fig. 4b). Come conseguenza della produzione catalitica di p-mitrofenolo, la differenza assoluta in assorbanza con e senza l’enzima presenta aumenti in funzione del tempo. Come risultato, anche piccole quantità di substrato idrolizzato da una soluzione di enzima 66 nM in 60 minuti à ̈ sufficiente per generare una apprezzabile differenza di circa 0.04 unità di assorbanza dopo .20 ore di incubazione con HPNPP. La linearità della curva di assorbanza contro le basse concentrazioni di enzima (fig. 4c) indicata che il protocollo à ̈ utilizzabile ed affidabile anche per una determinazione quantitativa della concentrazione dell’enzima in un intervallo nanomolare. La massima differenza in assorbenza osservata (0.12 AU; fig. 4b) corrisponde ad una differenza di 15 Î1⁄4Îœ in concentrazione di p-nitrofenolo.
Esempio 2: saggio di rilevamento della Caspasi 1
Metodo
Tutti i prodotti commerciali (incluso l’enzima) sono stati acquistati dalla Sigma Aldrich. Il peptide AcNH-YVADD-OH di SEQ IDNO. 1 à ̈ stato sintetizzato secondo il metodo di sintesi peptidica su fase solida (resina Wang) usando la chimica Fmoc.
Il saggio di rilevamento dell’enzima à ̈ stato eseguito a pH 7.2 ([HEPES]=10 mM). Una soluzione del pentapeptide substrato AcNH-YVADD-OH (5.0 Î1⁄4L, 1.0 mM) à ̈ stata incubata con 1.0 pL di una soluzione ad una concentrazione di 0.1 AU/pL di enzima Caspasi 1 (enzima ricombinante umano espresso in E. coli; 100 AU sono state rigenerate con 100 pL di soluzione tampone 0.5M HEPES). La soluzione à ̈ stata mantenuta a 37°C per 4 giorni, e quindi sono stati aggiunti Au MPC , Zn(N03)2e HPNPP per avere le concentrazioni finali di, rispettivamente, 5x1 0<"6>pM (in riferimento al TACN), 5x1 0<'6>pM e 1.0 mM. La provetta à ̈ stata mantenuta termostata a 40°C per 48 ore, durante le quali la formazione del prodotto p-nitrofenolo viene seguita misurando l’assorbanza a 405 nm.
L’esperimento di inibizione di controllo con Ac-Tyr-Val-Ala-Asp-clorometilchetone à ̈ stata eseguita in modo analogo a quanto descritto in precedenza, aggiungendo 151 pg di inibitore Ac-Tyr-Val-Ala-Asp-clorometilchetone (0.28 mM) alla soluzione dell’enzima 40 minuti prima di aggiungere il peptide substrato AcNH-YVADD-OH. Risultati
Lo scopo dell’esempio à ̈ quello di illustrare come il metodo oggetto dell’Invenzione possa essere reso selettivo scegliendo un opportuno substrato peptidico a seconda del tipo di enzima che si intende rilevare e/o determinare quantitativamente. La caspasi 1 à ̈ paradigmatica in tal senso in quanto correntemente à ̈ misurata con un saggio colorimetrico basato sul substrato AcNH-YVAD-pNA (p-NA= p-nitroanilina), poiché questo enzima idrolizza il legame dopo l’acido aspartico, rilasciando p-nitroanilina. Per gli scopi di questa determinazione à ̈ stato sintetizzato il substrato AcNH-YVADD-OH contenente in ulteriore acido aspartico dopo il sito di taglio, che aumenta l’affinità di tale substrato per Au MPC. Caspasi 1 (0.1 di unità attive) à ̈ stata incubate con il substrato AcNH-YVADD-OH (5 Î1⁄4Îœ) per 3 giorni a 40°C e a pH 7.0 dopo di che sono stati aggiunti Au MPC (TACN*Zn" = 5 Î1⁄4Îœ) e HPNPP (1 mM). Lo stesso esperimento à ̈ stato anche eseguito in presenza dell’inibitore AcNH-YVAD-CMK (CMK: clorometilchetone). La velocità iniziale di formazione del p-nitrofenolo era significativamente più alta nel caso in cui l’enzima fosse presente (Δvinit,meas= 0.30, ΔÎ1⁄2,init,exp= 0.42, basato sugli esperimenti di inibizione) ed era coerente con le velocità aspettate in base alle curve di inibizione.
Analogamente a quanto visto per l’esempio della Subtilisina prima riportato, l’incremento in assorbenza à ̈ stato misurato in un esteso intervallo di tempo determinando tra i due campioni una differenza in assorbenza di 0.76 unità dopo 24 ore (fig. 5). Questo corrisponde ad una differenza in concentrazione di pnitrofenolo di 90 Î1⁄4Îœ. Nelle stesse condizioni operative il saggio colorimetrico convenzionale, che usa 5 Î1⁄4Îœ di AcNH-YVAD-pNA, permette una differenza di concentrazione massima di 5 Î1⁄4Îœ p-nitroanilina. La differenza corrisponde ad un fattore di amplificazione del segnale di 18 ed illustra i vantaggi del metodo secondo l’invenzione.

Claims (20)

  1. Rivendicazioni 1. Un metodo per il rilevamento di un enzima proteolitico caratterizzato dal fatto di impiegare per tale rilevamento un composto peptidico avente natura di polianione ed avente funzione sia di substrato deH’enzima da rilevare sia di inibitore di nanoparticelle di Au, funzionalizzate con leganti aventi cariche positive auto-assemblantesi in monostrato sulla superficie del metallo, che catalizzano una reazione di conversione di un reagente capace di generare una molecola “reporter" come segnale misurabile strumentalmente. .
  2. 2. Il metodo secondo la rivendicazione 1 , in cui il composto peptidico à ̈ rappresentabile dalla formula generale (I) RNH-[AA— AA]„[AA - AA]rCOOH (') in cui: R à ̈ un gruppo acetile; [AA- AA ],· (/ = un numero intero compreso tra 1 e 4) definisce un dominio di affinità per le nanoparticelle di Au funzionalizzate positivamente consistente in un amminoacido o in una sequenza di amminoacidi dove ramminoacido o gli amminoacidi, uguali o diversi tra di loro, sono scelti tra acido aspartico o acido glutammico; [AA — AA]n( n = un numero à ̈ un numero intero compreso tra 1 e 8) definisce il dominio di selettività per l’enzima da rilevare consistente in un amminoacido o una sequenza di amminoacidi dove ramminoacido o gli amminoacidi, uguali o diversi tra di loro, sono scelti indifferentemente tra gli amminoacidi proteinogenici sia della serie L che della D, e derivati degli stessi.
  3. 3. Il metodo secondo la rivendicazione 1 , in cui le nanoparticelle funzionalizzate di Au hanno: una dimensione compresa tra 1 .5 - 20 nm; cariche positive derivanti dal complesso tra 1 ,4,7-triazaciclononano (TACN) e lo ione Zn“; una densità di carica di almeno 1 carica positiva per tiolo e sino a 3 cariche positive per tiolo.
  4. 4. Il metodo secondo la rivendicazione 1 , in cui la reazione di conversione à ̈ una reazione di conversione del 2-idrossipropil-(R-) fosfato dove R rappresenta in gruppo uscente che genera una “molecola reporter†.
  5. 5. Il metodo secondo la rivendicazione 4, in cui R Ã ̈ scelto tra 2-idrossipropil-4-nitrofenil fosfato, 2-idrossipropil-(2,4-dinitrofenile) fosfato, 2-idrossipropi!-(2,4-dinitro-7-sulfonato-naftile) fosfato, 2-idrossipropil-(3,6,8-trisulfonato pirene) fosfato.
  6. 6. Il metodo secondo la rivendicazione 4, in cui la reazione di conversione à ̈ la reazione di trans-fosforilazione del 2-idrossipropil-4-nitrofenil fosfato con generazione di p-nitrofenolo come “molecola reporter†.
  7. 7. Il metodo secondo una delle rivendicazioni da 1 a 6, in cui i composti peptidici sono scelti tra i peptidi aventi SEQ. IDNO. A, B e da 1 a 13.
  8. 8. Un metodo per il rilevamento di un enzima proteolitico comprendente almeno le fasi di: - aggiungere ad un campione contenente in soluzione o sospensione acquosa tamponata a pH tra 7.0 e 8.0 l’enzima proteolitico da determinare un composto peptidico avente natura di polianione ed avente -funzione sia di substrato deH’enzima da rilevare sia di inibitore di nanoparticelle di Au, funzionalizzate con leganti aventi cariche positive auto-assemblantesi in monostrato sulla superficie del metallo, catalizzanti una reazione di conversione di un reagente capace di generare una molecola “reporter†come segnale misurabile strumentalmente; - aggiungere alla miscela cosi ottenuta dopo incubazione della stessa per almeno un tempo di 20 minuti le nanoparticelle funzionalizzate di Au ed un reagente composto substrato delle stesse per la reazione di conversione; - determinare per via strumentale la generazione della molecola “reporter" dal momento dell’aggiunta delle nanoparticelle funzionalizzate di Au e del suo substrato; - calcolare la concentrazione dell’enzima sulla base della concentrazione della molecola “reporter†.
  9. 9. Il metodo secondo la rivendicazione 8, in cui il composto peptidico à ̈ rappresentabile dalla formula generale (I) RNH-[AA - AA]n[AA - AA]rCOOH (I) in cui: R à ̈ un gruppo acetile; [AA - AA],· (/ = un numero intero compreso tra 1 e 4) definisce un dominio di affinità per le nanoparticelle di Au funzionalizzate positivamente consistente in un amminoacido o in una sequenza di amminoacidi dove lamminoacido o gli amminoacidi, uguali o diversi tra di loro, sono scelti tra acido aspartico o acido glutammico; [AA - AA]n( n = un numero à ̈ un numero intero compreso tra 1 e 8) definisce il dominio di selettività per l’enzima da rilevare consistente in un amminoacido o una sequenza di amminoacidi dove Pamminoacido o gli amminoacidi, uguali o diversi tra di loro, sono scelti indifferentemente tra gli amminoacidi proteinogenici sia della serie L che della D, e derivati degli stessi.
  10. 10. Il metodo secondo la rivendicazione 8, in cui le nanoparticelle<■>funzionalizzate di Au hanno: una dimensione compresa tra 1 .5 — 20 nm; cariche positive derivanti dal complesso tra 1 ,4,7-triazaciclononano (TACISI) e lo ione Zn"; una densità di carica di almeno 1 carica positiva peritolo e sino a 3 cariche positive per tiolo.
  11. 11. Il metodo secondo la rivendicazione 8, in cui la reazione di conversione à ̈ una reazione di conversione del 2-idrossipropil-(R-) fosfato dove R rappresenta in gruppo uscente che genera una “molecola reporter".
  12. 12. Il metodo secondo la rivendicazione 11 , in cui R Ã ̈ scelto tra 2-idrossipropil-4-nitrofenil fosfato, 2-idrossipropil-(2,4-dinitrofenile) fosfato, 2-idrossipropil-(2,4-dinitro-7-sulfonato-naftile) fosfato, 2-idrossipropil-(3,6,8-trisulfonato pirene) fosfato.
  13. 13. Il metodo secondo la rivendicazione 11 , in cui la reazione di conversione à ̈ la reazione di trans-fosforilazione del 2-idrossipropil-4-nitrofenil fosfato con generazione della molecola “reporter†p-nitrofenolo.
  14. 14. Il metodo secondo la rivendicazione 8, in cui il composto peptidico à ̈ aggiunto secondo la sua carica alle concentrazioni di: 1 carica negativa > 1x10<'3>M; 2 cariche negative tra 5x1 CT<3>M e 1x10<'3>M; 3 cariche negative tra 5x1 0<"6>M e 1x1ο<-4>M; 4 cariche negative tra 5x10<"7>M e 1x10<'5>M.
  15. 15. Il metodo secondo la rivendicazione 8, in cui le nanoparticelle funzionalizzate di Au sono aggiunte sino alla concentrazione finale di 5x1 0<"6>M ed il suo substrato sino alla concentrazione finale di 1x10<"3>M.
  16. 16. Il metodo secondo la rivendicazione 13, in cui la concentrazione della molecola “reporter à ̈ calcolata sulla base dell’equazione: [PNP] = A405 nm /13135 (pH 7.5) [PNP]<=>A405 nm /8503 (a pH 7.0) in cui il valore di 13135 corrisponde alla coefficiente di estinzione molare del PNP ad un pH di 7.5 e il valore di 8503 corrisponde alla coefficiente di estinzione molare del PNP ad un pH di 7.0.
  17. 17. Il metodo secondo la rivendicazione 13, in cui la concentrazione dell’enzima à ̈ calcolato sull’equazione: [enzima] — (A405nm,64βοο s-3.75x10<"2>)/4.74x10<"2>(Î1⁄4Îœ) ottenuta da una retta di taratura usando una serie di campioni a titolo noto di enzima.
  18. 18. Il metodo secondo una delle da 8 a 17, in cui i composti peptidici sono scelti tra i peptidi aventi SEQ. IDNO. A, B e da 1 a 13.
  19. 19. Composti peptidici rappresentabili dalla formula generale (I) RNH-[AA — AA]n[AA— AA]rCOOH (I) in cui: R à ̈ un gruppo acetile; [AA - AA ],· (/ = un numero intero compreso tra 1 e 4) definisce un dominio di affinità per le nanoparticelle di Au funzionalizzate positivamente consistente in un amminoacido o in una sequenza di amminoacidi dove l’amminoacido 0 gli amminoacidi, uguali 0 diversi tra di loro, sono scelti tra acido aspartico 0 acido glutammico; [AA - AA]„ ( n = un numero à ̈ un numero intero compreso tra 1 e 8) definisce il dominio di selettività per l’enzima da rilevare consistente in un amminoacido o una sequenza di amminoacidi dove l'amminoacido o gli amminoacidi, uguali o diversi tra di loro, sono scelti indifferentemente tra gii amminoacidi proteinogenici sia della serie L che della D, e derivati degli stessi, per uso nel metodo di rilevamento di un enzima proteolitico.
  20. 20. Composti peptidici secondo la rivendicazione 19 scelti tra i peptidi aventi SEQ. IDNO. A, B e da 1 a 13.
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