ITTO20080614A1 - Procedimento per la rivelazione di un analita, con l'impiego di cristalli fotonici risonanti e relativo dispositivo. - Google Patents

Procedimento per la rivelazione di un analita, con l'impiego di cristalli fotonici risonanti e relativo dispositivo.

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ITTO20080614A1
ITTO20080614A1 IT000614A ITTO20080614A ITTO20080614A1 IT TO20080614 A1 ITTO20080614 A1 IT TO20080614A1 IT 000614 A IT000614 A IT 000614A IT TO20080614 A ITTO20080614 A IT TO20080614A IT TO20080614 A1 ITTO20080614 A1 IT TO20080614A1
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photonic crystal
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Kanna Aoki
Yasuhiko Arakawa
Roberto Cingolani
Vittorio Massimo De
Luigi Martiradonna
Alessandro Massaro
Ferruccio Pisanello
Pier Paolo Pompa
Ross Rinaldi
Stefania Sabella
Tiziana Stomeo
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Description

DESCRIZIONE dell’invenzione industriale dal titolo: "Procedimento per la rivelazione di un analita, con l'impiego di cristalli fotonici risonanti e relativo dispositivo"
DESCRIZIONE
La presente invenzione si riferisce ad un procedimento e a un dispositivo per l'identificazione di un analita, in particolare una biomolecola presente in un campione biologico, e trova applicazione particolarmente in genomica, proteomica e nella fabbricazione di bio-chip.
Lo sviluppo di tecnologie di micro- e nanofabbricazione, associate alla modellistica biomolecolare e a sistemi micro-elettromeccanici (MEMS), ha notevolmente contribuito alla realizzazione di laboratori miniaturizzati applicati all’analisi genomica e proteomica. I campi di applicazione di questi laboratori miniaturizzati sono estremamente ampi e ad essi si fa riferimento con il termine generale di bio-chip e altresì con termini quali gene-chip, gene-array, DNA microarray, protein chip e lab-on-chip. Essenzialmente questi chip, sviluppati sia in configurazione semplice a se stante sia in architetture/dispositivi integrati, consistono di strutture planari, realizzate su diversi substrati quali vetro o materiali plastici sui quali vengono immobilizzate (bio)molecole sonda (quali DNA, proteine o cellule, che selettivamente riconoscono molecole bersaglio), mediante modifica chimica della superficie o mediante sintesi in situ [Fan 2006]. Questi chip possono essere costituiti da idonei micro-reattori e/o sistemi capillari e apparati per la rivelazione della reazione di (bio)riconoscimento tra le specie biomolecolari in soluzione.
La tecnologia dei bio-chip ha rivoluzionato il campo della biologia molecolare, particolarmente in genomica e proteomica, nella diagnostica sperimentale e clinica e nella farmaco-genomica, trovando applicazioni come saggi enzimatici, saggi di immunochimica, rivelazione di polimorfismi genetici, sequenziamento dì acidi nucleici, e amplificazione di DNA su scala micro-volumetrica.
In particolare, grazie all’elevata specificità della reazione di ibridazione tra sequenze oligonucleotidiche, chip basati su interazioni biomolecolari tra filamenti di DNA sono stati sviluppati più rapidamente rispetto a chip basati su proteine. In quest'ultimo caso, nonostante il forte interesse della comunità scientifica, lo sviluppo è stato rallentato a causa del complesso meccanismo di bioriconoscimento di specie molecolari proteiche.
Generalmente, il legame tra una (bio)molecola e una specie bersaglio deve essere espresso come segnale rivelabile e misurabile. La rivelazione può sfruttare vari fenomeni fisici come l'emissione di luce, la risposta elettro-chimica, e variazioni nel potenziale elettrico, massa, corrente o frequenza. Tra questi la rivelazione ottica è il metodo di analisi più ampiamente diffuso. Il metodo di rivelazione ottica è essenzialmente basato sulla misura di luminescenza originata da un marcatore luminescente associato ad una coppia di molecole complementari (ad esempio oligonucleotidi complementari), formata dall'analita bersaglio e dalla (bio)molecola sonda. Tipicamente, il marcatore luminescente viene coniugato all'analita bersaglio in esame e il segnale emesso viene rilevato successivamente all'interazione (biorìconoscimento) tra le molecole sonda e bersaglio (ad esempio a seguito di una reazione di ibridazione). Durante il processo di rivelazione del segnale, la regione di lettura è appropriatamente illuminata mediante una luce di eccitazione e un rivelatore raccoglie il segnale ottico emesso dal marcatore. Questi approcci, nonostante forniscano soltanto informazioni qualitative su di un analita in un campione, tuttavia sono estremamente efficaci, in quanto permettono di selezionare un ampio numero di biomolecole diverse con un sìngolo chip. Le specie sonda, o elementi di bio-riconoscimento, con sequenze di basi (nucìeotidiche) note, sono immobilizzate in posizioni predesignate del chip, ad esempio, con una tipica configurazione a matrice. Alla emissione di luce proveniente da una determinata coordinata della matrice, viene rapidamente associata una specifica sequenza nucleotidica dell<1>analita catturato. Recentemente, sono state proposte diverse soluzioni che sfruttano i cristalli fotonici per l'area di lettura ottica di bio-chip. I cristalli fotonici, grazie alla variazione periodica dell'indice di rifrazione in una, due o tre direzioni (1D, 2D o 3D), permettono di ingegnerizzare ì modi fotonici e di ottenere specchi altamente riflettenti [Happ,2001], guide d’onda [Mekìs, 1996; Johnson, 2000] e micro-nanorisonatori ottici [Foresi, 1997; Akahane, 2003; Song, 2005].
Tali soluzioni possono essere classificate in funzione dell'impiego o meno di marcatori luminescenti.
Nei metodi di rivelazione "label-free" ("senza marcatore"), agli analitì bersaglio non sono associati marcatori luminescenti. Si rivela invece la variazione di lunghezza d'onda risonante di risonatori a cristalli fotonici causata dalla presenza di analiti bersaglio catturati sulla superfìcie (ad esempio, DNA ibridato). Gli analiti modificano localmente l’indice di rifrazione dello strato di rivestimento superiore sul cristallo fotonico, spostando la sua frequenza di risonanza. La rivelazione di questi spostamenti spettrali è attuata mediante misure di riflettanza o trasmittanza su di un singolo risonatore [Petter, 2004; Cunningham, 2006; Altug, 2007], L’analisi della regione di lettura è pertanto attuata mediante scansione sequenziale multipla dell'intera area di lettura, singolo risonatore per singolo risonatore.
US 6 990 259 illustra la fabbricazione di celle a cristalli fotonici, organizzate in matrici, nelle quali vengono introdotti "difetti" nella struttura periodica. Tali difetti inducono un aumento localizzato dell'intensità del campo elettromagnetico che determina:
a) l’incremento del fattore Q (indice della larghezza spettrale del modo ottico risonante nel difetto) ,
b) l'aumento della sensibilità del sensore grazie all'interazione del campione con una frazione di energia elettromagnetica più elevata, localizzata esattamente nel punto in cui è situato il campione stesso .
Tale dispositivo funziona in modalità "labelfree" e permette inoltre una misura quantitativa dell' analita; l’interazione con il campione deter-mina lo spostamento del picco di lunghezza d’onda risonante della luce riflessa da o trasmessa attraverso il cristallo fotonico e l'entità di tale spo-stamento è funzione della concentrazione dell’ analita .
L'altro approccio è basato sulla rivelazione dell'analita tramite la luminescenza di marcatori coniugati all'analita stesso. In particolare, l'utilizzo di risonatori a cristalli fotonici induce un significativo incremento nell'emissione dei fluorofori. In questo caso, il campo elettromagnetico corrispondente alle lunghezze d'onda di eccitazione è aumentato localmente ingegnerizzando in modo appropriato modi risonanti o evanescenti ("leaky modes") [Ganesh, 2007; Matìas, 2007]. Questo approccio si basa sull'incremento dell'intero spettro di fluorescenza, senza che si attui alcun potenziamento selettivo a frequenze specifiche. Il rapporto tra il segnale utile e il rumore che deriva dalla diffusione o riflessione della luce di eccitazione viene significativamente incrementato, tuttavia è sempre necessario attuare una scansione sequenziale dell'intero chip (matrice di risonatori di cristalli fotonici).
Nonostante questi approcci migliorativi, sussiste ancora la necessità di sviluppare nuovi metodi di rivelazione ad elevata precisione e a maggiore velocità di analisi.
In particolare, scopo dell'invenzione è fornire un nuovo procedimento e un nuovo dispositivo ottico basato sulla combinazione della tecnologia dei cristalli fotonici con le nano-biotecnologie utile a migliorare le attuali soluzioni in termini di sensibilità di rivelazione, rapporto segnale-rumore e velocità del procedimento di lettura ottica.
In vista di tale scopo, costituiscono oggetto dell'invenzione un procedimento ed un dispositivo come definiti nelle rivendicazioni che seguono.
Nei disegni annessi:
la figura 1 è uno schema di un dispositivo ottico per l'analisi biomolecolare, secondo l'invenzione;
le figure 2a e 2b sono rappresentazioni schematiche che illustrano una fase del procedimento di utilizzo del dispositivo ottico (bio-chip) secondo l'invenzione relative rispettivamente all’evento di legame tra:
a) un elemento di bio-riconoscimento (sonda) per uno specifico analita (bersaglio) in esame (oligonucleotidi, proteine, ligandi) e
b) una sequenza di DNA (bersaglio) in esame che si lega ad una specifica sonda costituita da una molecola complementare (sequenza) di ssDNA;
la figura 3a è uno schema di una matrice di risonatori di cristalli fotonici utilizzata nel dispositivo ottico secondo l'invenzione;
la figura 3b illustra un tipico esempio di spettro di emissione raccolto da un'area di lettura non assistita da risonatori di cristalli fotonici; e
la figura 3c illustra un esempio dello spettro del segnale di emissione rivelato sull'intera area di lettura di un dispositivo ottico secondo l'invenzione.
Secondo l'invenzione, la tecnologia dei cristalli fotonici è applicata alla regione di lettura ottica del bio-chip (regione di bioriconoscimento), in cui ha luogo l'eccitazione e l'emissione dei marcatori luminescenti coniugati con 1'analita o gli analiti in esame. Questi analiti, come già indicato, interagiscono specificatamente e selettivamente con gli elementi di bioriconoscimento, immobilizzati sulla superficie del risonatore.
Il dispositivo di rivelazione del segnale ottico comprende un substrato, sul quale è realizzata una matrice di cristalli fotonici risonanti. Per la fabbricazione di micro- o nano-risonatori ottici (regioni ove la luce, intrappolata, viene poi emessa nella direzione verticale solo a specifiche frequenze o modi ottici) si possono utilizzare geometrie 1D, 2D e 3D con materiali lineari o non lineari. I cristalli fotonici sono in grado di controllare la propagazione della luce, introducendo una periodicità 1D, 2D o 3D in materiali che presentano un'elevata trasparenza ottica nell'intervallo di frequenza di interesse.
Si utilizzano micro- o nano-cavità di cristalli fotonici che risuonano nella banda spettrale di emissìone di un marcatore luminescente.
In particolare, utilizzando cristalli fotonici 2D (che possono facilmente essere integrati in strutture planari), questi risonatori possono essere fabbricati in una guida d'onda realizzata su un substrato avente un diverso indice di rifrazione o in una guida sospesa in una configurazione a membrana.
Il dispositivo di rivelazione potrà avere una configurazione finale analoga a quella dei dispositivi di tipo bio-chip precedentemente citati in uso corrente, con una camera destinata a ricevere il fluido contenente il campione da analizzare e con una parete costituita dal substrato su cui è realizzata la matrice di risonatori a cristalli fotonici. Il dispositivo finale può essere realizzato con elevata robustezza meccanica, utilizzando ad esempio risonatori a cristalli fotonici realizzati su uno strato di silicio sospeso nell'aria (membrana) o cresciuto su biossido di silicio, o uno stra-to di biossido dì titanio su biossido di silicio, oppure una membrana di nitruro di silicio (SixNy) o SixNysu biossido di silicio, oppuré arseniuro di gallio (GaAs) su arseniuro di gallio alluminio (Al-xGai-xAs); un’elevata flessibilità può essere conseguita usando una struttura a membrana di polìmetilmetacrìlato (PMMA), o PMMA su polidimetilsilossano (PDMS).
Preferibilmente, almeno due risonatori a cristalli fotonici della matrice di cristalli fotonici presentano lunghezze d'onda di risonanza diverse tra loro e più preferibilmente ciascun risonatore a cristallo fotonico presenta una propria distinta lunghezza d'onda di risonanza.
Sulla superficie di ciascun risonatore sono fissate sonde specifiche per gli analiti da rivelare, ad esempio sequenze di DNA a singolo filamento (ssDNA), anticorpi, recettori, aptameri e simili. Nello schema della figura 1 sono illustrate, a titolo dì esempio, matrici di cristalli fotonici 1 e biomolecole sonda 2 della stessa tipologia. Naturalmente, è possìbile considerare nella stessa matrice associata al chip diverse strutture di cristalli fotonici con differenti lunghezze d'onda di risonanza ed analogamente ciascun elemento di bioriconoscimento, legato univocamente ad una singola struttura di risonatore, può essere diverso dagli altri e specifico per ciascun analita.
Le sonde 2 sono legate con elevata precisione spaziale mediante tecniche chimiche, fisiche o elettrostatiche .
Lo schema di base per la rivelazione dì biomolecole 4 (proteine, ligandì, e simili) e di acidi nucleici 6 è illustrato nelle figure 2a e 2b, rispettivamente. Anche con riferimento allo schema delle figure 2a e 2b, i risonatori possono essere diversi l'uno dall'altro e così pure gli elementi di bioriconoscimento 2 legati a ciascun risonatore.
Gli analiti bersaglio 4,6 sono marcati direttamente (ad esempio tramite sintesi) o indirettamente mediante coniugazione con uno o più marcatori luminescenti 8, tipicamente fluorofori.
Il dispositivo oggetto dell'invenzione sì fonda su uno schema unico ed originale di rivelazione. La rivelazione è effettuata raccogliendo lo spettro di emissione che proviene dall’intera area di bioriconoscimento del chip. Utilizzando un'idonea matrice composta da risonatori a cristalli fotonici che posseggono lunghezze d’onda risonanti diverse, ciascun elemento di bioriconoscimento del dispositivo è univocamente associato ad un diverso picco di risonanza. Mediante analisi dello spettro di emissione è possibile individuare tali picchi di risonanza e quindi risalire alle specifiche (bio)molecole analiti bersaglio 4,6 contenute nel campione sottoposto ad analisi.
E' così possibile raccogliere contemporaneamente i segnali provenienti da diversi risonatori in una singola analisi, incrementando la velocità di raccolta e di elaborazione del segnale. Inoltre, i cristalli fotonici inibiscono fortemente la radiazione dì eccitazione diffusa o riflessa verso la direzione di rivelazione. L'eliminazione di tale radiazione diffusa o riflessa, unitamente all’incremento dell'intensità del segnale di emissione proveniente dai risonatori, aumenta significativamente il rapporto segnale-rumore complessivo. Questa caratteristica permette di ridurre gli errori di lettura, consentendo agli operatori di evitare la fase successiva e complessa di trattamento e correzione dei dati raccolti. Per abbattere ulteriormente il rumore dì background, causato dallo scattering della luce di eccitazione, tale luce di eccitazione può essere selettivamente indirizzata verso la regione di lettura tramite guide d’onda.
La figura 3b illustra un tipico esempio del segnale di emissione raccolto da un'area di lettura non assistita da risonatori di cristalli fotonicì. La forma della curva è tipica del marcatore originale, con la presenza di un significativo rumore dovuto alla luce di eccitazione diffusa.
La figura 3c costituisce un esempio di uno spettro rivelato sull’intera area di lettura, ove λ:, λ2e λι sono le lunghezze d'onda delle radiazioni emesse dei marcatori luminescenti a seguito dell'accoppiamento degli analiti bersaglio 4,6 con le sonde 2 associate a detti risonatori. La presenza di ciascun picco nello spettro totale rivela dunque la presenza del corrispondente analita bersaglio 4,6 nel saggio di analisi.
Secondo 1’invenzione, la tecnologia dei cristalli fotonici può pertanto essere applicata alla tecnologia dei bio-chip allo scopo di fornire i seguenti vantaggi:
a) controllabilità della lunghezza d'onda risonante di ciascun risonatore nella matrice tramite una accurata scelta dei materiali e della geometria; specificatamente, diviene possibile incrementare l'intensità dello spettro di emissione del fluoroforo coniugato ad un analita: ciò permette di attuare una rivelazione ottica non soltanto sulla base di una discriminazione spaziale per i diversi contributi, ma anche sulla base di una discriminazione spettrale, poiché ciascun pixel corrisponde ad uno specifico risonatore operante ad una determinata frequenza (figura 3a);
b) incremento dell'intensità di emissione del fluoroforo in specifiche bande spettrali, incrementando così il rapporto segnale-rumore;
c) possibilità di eccitare selettivamente il marcatore luminescente tramite guide d'onda o una risonanza di un certo modo ottico nel cristallo fotonico per sopprimere la luce diffusa, riflessa o diffratta dal substrato: ciò può essere ottenuto controllando l'angolo di emissione o dì eccitazione mediante appropriata progettazione del cristallo fotonico; questa proprietà può essere sfruttata per separare spazialmente la radiazione di eccitazione da quella di emissione.
In relazione al punto a), una luce dì eccitazione esterna inviata verso la matrice ad un angolo appropriato ecciterà il marcatore legato all'analita catturato, che emetterà il suo tipico segnale a banda larga. Quindi, il segnale a banda larga viene amplificato in specifiche bande spettrali dal risonatore a cristallo fotonico (figura 3a). In tale figura sono illustrati quattro esempi di realizzazione di risonatori a cristalli fotonìci la-ld. La variazione da pixel a pixel (cioè da analita ad analita) delle frequenze contemporaneamente emesse dalla matrice permette un elevato grado di parallelismo su un elevato numero di diversi analiti, rendendo cosi veloce il riconoscimento dei campioni esaminati.
In relazione ai punti b) e c), l'appropriata scelta dei materiali e della geometria dei cristalli fotonici può portare alla realizzazione di un band-gap spettrale di energia che sopprime l'intensità del segnale elettromagnetico propagato in specifiche direzioni. Creando dei difetti nel cristallo fotonico, e' possibile localizzare specifici modi ottici all'interno di tale band-gap spettrale, la cui intensità viene selettivamente amplificata in specifiche direzioni.
Ulteriori vantaggi dell'invenzione comprendono:
la possibilità di realizzare il sistema di rivelazione proposto, basato su discriminazione spettrale (multiplexing spettrale), anche in un sistema fondato su una distinzione spaziale;
incremento della velocità di acquisizione dei dati tramite l'analisi spettrale del segnale proveniente dall'intera area di lettura;
associazione univoca di un certo spettro di emissìone a ciascun analita contenuto in un saggio non noto, utilizzando un singolo marcatore comune o due o più marcatori allo scopo di incrementare ulteriormente i processi di analisi in parallelo;
elevata risoluzione spettrale nella rivelazione, utilizzando risonatori a cristalli fotonici con elevato fattore di qualità;
possibilità di sviluppare strutture di cristalli fotonici più complessi per accoppiare i segnali di picco di risonanza con modi guidati o evanescente nel pattern del cristallo fotonico, per trasportare efficacemente la luce dì eccitazione e/o i segnali di emissione tra l'area di lettura ed un rivelatore.
Naturalmente, fermo restando il principio dell’invenzione, le forme di attuazione ed i particolari di realizzazione potranno essere ampiamente variati rispetto a quanto è stato descritto ed illustrato a puro titolo di esempio non limitativo, senza per questo uscire dall'ambito di protezione della presente invenzione definito dalle rivendicazioni allegate.
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Claims (6)

  1. RIVENDICAZIONI 1. Procedimento per l'identificazione di un analita bersaglio (4,6) in un campione, particolarmente un campione biologico, comprendente le operazioni di porre a contatto detto analita bersaglio (4,6) legato ad un marcatore luminescente (8), con una pluralità di molecole sonda (2) immobilizzate su di un supporto, ove almeno una di dette molecole sonda (2) è suscettibile di legame specìfico con detto analita bersaglio (4,6), qualora presente nel campione, fornire a detto supporto una radiazione di eccitazione e prelevare una radiazione di emissione proveniente da detto supporto a seguito dell’evento di legame specifico, caratterizzato dal fatto che: detto supporto comprende una pluralità di risonatori a cristalli fotonici (1), almeno due dì detti risonatori (1) essendo caratterizzati da lunghezza d'onda di risonanza diverse tra loro; ciascuna di dette molecole sonda (2) essendo fissate ad un rispettivo risonatore (1); e dal fatto che l'identificazione dell’analita bersaglio (4,6) è effettuata mediante analisi dello spettro totale di emissione proveniente dall'insieme di detta pluralità di risonatori a cristalli fotonici (1) per l’individuazione di eventuali picchi di lunghezze d'onda di risonanza generati a seguito del legame di detto analita bersaglio (4,6), legato al marcatore luminescente (8), con una o più di dette molecole sonda (2).
  2. 2. Procedimento secondo la rivendicazione 1, in cui la radiazione di eccitazione viene fornita tramite una guida d'onda.
  3. 3. Procedimento secondo la rivendicazione 1 o 2, in cui la radiazione proveniente dal supporto viene prelevata tramite una guida d'onda.
  4. 4. Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti, comprendente inoltre la fase di localizzare un predeterminato modo ottico della radiazione di eccitazione in un difetto del cristallo fotonico e amplificare la radiazione emessa tramite l'accoppiamento con detto modo ottico.
  5. 5. Dispositivo per l'identificazione dì un analita bersaglio (4,6) in un campione, particolarmente un campione biologico, il dispositivo comprendendo una pluralità di molecole sonda (2) immobilizzate su di un supporto, ove almeno una dette molecole sonda (2) è suscettibile di legame specifico con detto analista bersaglio (4,6), qualora presente nel campione, caratterizzato dal fatto che: detto supporto comprende una pluralità di risonatori a cristalli fotonici (1), almeno due di detti risonatori (1) essendo caratterizzati da lunghezza d'onda di risonanza diverse tra loro; ciascuna di dette molecole sonda (2) essendo fissata ad un rispettivo risonatore (1).
  6. 6. Sistema per l'identificazione di un analita bersaglio (4,6) in un campione, particolarmente un campione biologico, comprendente: ~ un dispositivo secondo la rivendicazione 5; - una sorgente atta a fornire a detto dispositivo una radiazione di eccitazione; - mezzi rivelatori atti a prelevare una radiazione di emissione proveniente da detto dispositivo , a seguito dell 'evento di legame specifico; - mezzi dì calcolo associati a detto dispositivo predisposti per analizzare lo spettro totale di emìssione proveniente dall'insieme dì detta pluralità di risonatori a cristalli fotonici (1) per l'individuazione di eventuali picchi di lunghezze d'onda dì risonanza generati a seguito del legame di detto analita bersaglio (4,6), legato ad un marcatore luminescente (8), con una o più di dette mole-cole sonda (2).
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