JP2000300263A

JP2000300263A - 血管新生に関連するタンパク質「４１０」および「ｎｅｗ」、ならびに該タンパク質をコードする遺伝子

Info

Publication number: JP2000300263A
Application number: JP11107234A
Authority: JP
Inventors: Shunichiro Matsumoto; 俊一郎松本; Yoko Saito; 洋子齋藤; Yasuhiko Masuyasu; 安彦増保; Norio Ota; 紀夫太田
Original assignee: Helix Research Institute
Current assignee: Helix Research Institute
Priority date: 1999-04-14
Filing date: 1999-04-14
Publication date: 2000-10-31

Abstract

(57)【要約】【課題】新規なアンギオポエチン様タンパク質および
それらの遺伝子、並びにそれらの製造方法及び用途を提
供することを課題とする。【解決手段】ヒト胎児由来のcDNAから、既知のアンギ
オポエチンと相同性を有する新規なタンパク質（410お
よびNEW）を同定した。これらのタンパク質は血管新生
の制御への関与が示唆され、血管新生が関与する疾患に
対する新しい予防薬や治療薬の開発に有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、血管新生に関与す
るタンパク質と相同性を有する新規なタンパク質および
それらの遺伝子、並びにそれらの製造および用途に関す
る。

【０００２】

【従来の技術】血管の形成過程は、胎生初期での"脈管
形成(vasculogenesis)"と、同後期での"血管新生(angio
genesis)"の二段階に分類される [W. Risau, Nature, 3
86: 671-674 (1997); D. Hanahan, Science, 277: 48-5
0 (1997)]。両過程ではレセプター型チロシン・キナー
ゼ（RTK）の関与が示唆されており、脈管形成では血管
内皮増殖因子(vascular endothelial growth factor; V
EGF）とそれに対する特異的な細胞膜上受容体（VEGF-R
1, VEGF-R2）が重要な役割を果たしている事がノックア
ウトマウスの実験より証明されている [F. Shalaby et
al., Nature, 376:62-66 (1995)]。一方、血管新生の過
程でもRTKタイプの細胞膜上受容体、"Tie"の関与が想定
されている。TieにはTie-1とTie-2が存在するが、マウ
スを用いたノックアウト実験で脈管形成不全による致死
を誘発することから、両分子共に血管造成における必須
の因子であるとされている [T. N. Sato et al., Natur
e, 376: 70-74 (1995); M. C. Puri et al., EMBO J.,
14: 5884-5891 (1995)]。

【０００３】Tie-2の特異的なリガンドは、アメリカの
研究グループにより遺伝子クローニングがなされ、アン
ギオポエチン-1(Angiopoietin-1) [S. Davis et. al.,
Cell, 87: 1161-1169 (1996)]およびアンギオポエチン-
2(Angiopoietin-2) [P. C. Maisonpierre et al., Scie
nce, 277: 55-60 (1997)]と名付けられた。アンギオポ
エチン-1（Ang-1）はTie-2結合を介して血管内皮細胞に
働きかけ、VEGFにより構築された幼若血管をより成熟な
血管へと分化誘導する。アンギオポエチン-1の過剰発現
動物を用いた実験では、血管が巨大化し、数が増え、ま
た分岐が多くなる事が観察されている [C. Suri et a
l., Science, 282: 468-471 (1998)]。アンギオポエチ
ン-2（Ang-2）はアンギオポエチン-1/Tie-2系での生理
的な阻害物質であると考えられており、アンギオポエチ
ン-1と競合的に働き、脈管形成、形態維持を制御してい
ると考えられている [P. C. Maisonpierre et al., Sci
ence, 277: 55-60 (1997)]。他方、Tie-1に対する特異
的なリガンドは未同定である。血管新生に関与する未知
の因子のクローニングが望まれていた。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、新規なアン
ギオポエチン様タンパク質およびそれらの遺伝子、並び
にそれらの製造方法及び用途を提供することを課題とす
る。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決すべく鋭意研究を行った結果、ヒト胎児由来のポ
リA^＋ RNAを用いた逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PC
R）により、2つの新規なcDNAを単離することに成功した
（この2つのクローンをそれぞれ「410」および「NEW」
と命名した）。

【０００６】単離したcDNAによりコードされる「410」
タンパク質および「NEW」タンパク質のアミノ酸配列
は、血管新生に関与するタンパク質であるアンギオポエ
チン-1およびアンギオポエチン-2 と相同性を有してい
た（図１〜４）。特に、ヒトアンギオポエチン-1および
-2において生物活性を有していると考えられているＣ
末端領域のフィブリノーゲンドメインは、「410」タン
パク質および「NEW」タンパク質のＣ末端領域でも保存
されていた（図５〜８）。「410」タンパク質および「N
EW」タンパク質のフィブリノーゲンドメインのアミノ酸
配列は、ヒトアンギオポエチン-1および -2と40％以上
の同一性を有しており、Ｎ末端領域よりも高度に保存さ
れていた。また、「410」タンパク質および「NEW」タン
パク質のアミノ酸配列には、アンギオポエチン-1および
-2で保存されているシステイン残基6部位のうち、5部
位が保存されていた。これらのことから、「410」タン
パク質および「NEW」タンパク質は、血管新生に関与す
るアンギオポエチンファミリーに属する新規なタンパク
質と考えられる。

【０００７】本発明者らは、「410」タンパク質および
「NEW」タンパク質とアンギオポエチンとの密接な関係
から、これらタンパク質やそれらの遺伝子、さらにはこ
れらタンパク質の活性を調節する化合物が、血管新生が
関与する各種疾患の治療などへ応用しうることを見出し
た。

【０００８】すなわち、本発明は、新規なアンギオポエ
チン様タンパク質およびそれらの遺伝子、並びにそれら
の製造および用途に関し、より具体的には、（１）配
列番号：４または８に記載のアミノ酸配列からなるタン
パク質、または該タンパク質中のアミノ酸配列において
１若しくは複数のアミノ酸が欠失、付加、挿入および／
または他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ
酸配列からなり、配列番号：４または８に記載のアミノ
酸配列からなるタンパク質と機能的に同等なタンパク
質、（２）配列番号：３または７に記載の塩基配列か
らなるDNAとハイブリダイズするDNAがコードするタンパ
ク質であって、配列番号：４または８に記載のアミノ酸
配列からなるタンパク質と機能的に同等なタンパク質、
（３）（１）または（２）に記載のタンパク質をコー
ドするDNA、（４）（３）に記載のDNAを含むベクタ
ー、（５）（４）に記載のベクターを保持する形質転
換体、（６）（５）に記載の形質転換体を培養する工
程を含む、（１）または（２）に記載のタンパク質の製
造方法、（７）（１）または（２）に記載のタンパク
質の部分ペプチド、（８）（１）または（２）に記載
のタンパク質に対する抗体、（９）配列番号：３また
は７に記載の塩基配列からなるDNAと特異的にハイブリ
ダイズし、少なくとも１５塩基の鎖長を有するDNA、
（１０）（１）または（２）に記載のタンパク質に結
合する化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）（１）または（２）に記載のタンパク質またはそ
の部分ペプチドに被検試料を接触させる工程、および
（ｂ）該タンパク質またはその部分ペプチドに結合する
化合物を選択する工程、を含む方法、（１１）（１
０）に記載の方法により単離されうる、（１）または
（２）に記載のタンパク質に結合する化合物、（１２）
受容体タンパク質である、（１１）に記載の化合物、
（１３）（１）または（２）に記載のタンパク質の受
容体を発現する細胞をスクリーニングする方法であっ
て、（ａ）（１）または（２）に記載のタンパク質また
はその部分ペプチドに被検細胞試料を接触させる工程、
および（ｂ）該タンパク質またはその部分ペプチドに結
合する細胞を選択する工程、を含む方法、（１４）
（１）または（２）に記載のタンパク質とその受容体と
の結合を阻害する化合物をスクリーニングする方法であ
って、（ａ）被検試料の存在下で、（１）または（２）
に記載のタンパク質を該タンパク質の受容体または該受
容体を発現する細胞に接触させる工程、（ｂ）該タンパ
ク質とその受容体または該受容体を発現する細胞との結
合活性を検出する工程、および（ｃ）被検試料非存在下
において検出した場合と比較して、該結合活性を低下さ
せる化合物を選択する工程、を含む方法、（１５）
（１４）に記載の方法により単離されうる、（１）また
は（２）に記載のタンパク質とその受容体との結合を阻
害する化合物、に関する。

【０００９】

【発明の実施の形態】本発明は、新規なアンギオポエチ
ン様タンパク質「410」および「NEW」に関する。本発明
のタンパク質に含まれる「410」タンパク質（配列番
号：４）および「NEW」タンパク質（配列番号：８）
は、ヒト胎児由来のpoly A⁺ RNAを鋳型としてRT-PCRに
よりcDNAをスクリーニングすることにより単離された遺
伝子がコードする分泌性タンパク質である。「410」タ
ンパク質および「NEW」タンパク質のアミノ酸配列は、
血管新生の制御に関与するアンギオポエチン-1およびア
ンギオポエチン-2と相同性を有していた。この事実はこ
れらタンパク質が、特に血管新生の制御に関与している
タンパク質であることを示唆している。従って、本発明
のタンパク質やそれらの遺伝子、また、本発明のタンパ
ク質の活性を調節する化合物は、血管新生が関与する疾
患の予防や治療への応用が考えられる。

【００１０】血管新生とは、既存血管より新たな血管が
構築される過程であると考えられており、生理的には排
卵、胎盤形成、炎症、創傷治癒などで起きる。しかし、
これら以外にも、血管新生はさまざまな疾患において重
要な役割を果すと考えられる。例えば、狭心症、心筋梗
塞、脳梗塞、下肢の閉塞性動脈硬化症などの虚血性疾患
において、血管新生を誘導し血流を創生することができ
れば、これらの疾患の治療を行うことができると考えら
れる。また、逆に血管新生を抑制することで治療を行う
ことも考えられる。このような対象となる疾患は、癌、
糖尿病性網膜症、リュウマチ性関節炎、アテローム性動
脈硬化症などで、いずれも新生血管の発生と病態の悪性
度には相関性がある。特に癌では、例え生体内で細胞が
悪性化しても血管新生が起こらなければ、癌細胞の増殖
は起こらないと考えられており（こうした癌をdormant
tumorと呼ぶ）、血管新生の抑制は、新たな癌治療法と
して注目されている。

【００１１】本発明のアンギオポエチン様タンパク質
は、その受容体(群)を介して、それら受容体(群)を活性
化または不活化することにより、血管新生の制御に関与
していると考えられるため、上記の疾患に対する治療や
予防に利用することができると考えられる。さらに、後
述するように、本発明のアンギオポエチン様タンパク質
を利用してその受容体(群)を単離したり、本発明のタン
パク質に応答性を有する細胞を用いて、バイオアッセイ
により本発明のタンパク質やその受容体(群)のアゴニス
トやアンタゴニストをスクリーニングすることが可能と
なる。本発明のタンパク質の活性を制御するこれら化合
物も、また、血管新生が重要な役割を果たす上記疾患の
治療や予防のために利用できる。すなわち、血管新生を
促進する化合物は、例えば、狭心症、心筋梗塞、脳梗
塞、下肢の閉塞性動脈硬化症などの虚血性疾患に対する
医薬品候補化合物となり、血管新生を抑制する化合物
は、例えば、癌、糖尿病性網膜症、リュウマチ性関節
炎、アテローム性動脈硬化症などに対する医薬品候補化
合物となる。

【００１２】本発明のタンパク質は、組み換えタンパク
質として、また天然のタンパク質として調製することが
可能である。組み換えタンパク質は、例えば、後述する
ように本発明のタンパク質をコードするDNAを挿入した
ベクターを適当な宿主細胞に導入し、形質転換体内で発
現したタンパク質を精製することにより調製することが
可能である。一方、天然のタンパク質は、例えば、後述
する本発明のタンパク質に対する抗体を結合したアフィ
ニティーカラムを利用して調製することができる (Curr
ent Protocols in Molecular Biology edit. Ausubel e
t al. (1987) Publish. Jhon Wily & Sons Section 16.
1-16.19)。アフィニティー精製に用いる抗体は、ポリク
ローナル抗体であってもモノクローナル抗体であっても
よい。また、インビトロトランスレーション（例えば、
「On the fidelity of mRNA translation in the nucle
ase-treated rabbit reticulocyte lysate system. Das
so,M.C.,Jackson,R.J.(1989) NAR 17:3129-3144」参
照）などにより本発明のタンパク質を調製することも可
能である。

【００１３】また、本発明には、「410」タンパク質ま
たは「NEW」タンパク質と機能的に同等なタンパク質が
含まれる。ここで「機能的に同等」とは、対象となるタ
ンパク質が「410」タンパク質または「NEW」タンパク質
と同等の生物学的特性を有していることを意味する。
「410」タンパク質または「NEW」タンパク質が持つ生物
学的特性としては、アンギオポエチンのアミノ酸配列と
有意な相同性を有し（実施例参照）、分泌性タンパク質
として機能するという特性が挙げられる。また、受容体
に結合し、受容体を活性化または不活化するという特性
が挙げられる。さらに、脈管形成および／または血管新
生を制御する特性も考えられる。具体的には血管の形
成、形態維持、新生、および／または消失(regression)
を調節する活性が考えられる。このような活性には、血
管内皮細胞（管腔を形成していないangioblastも含む）
や造血細胞の分化、増殖、遊走および／または生存維持
を調節する活性などが含まれる。さらに発生時における
血管内皮細胞の脱落阻止、出血阻止、および／または心
臓の発育を調節する活性なども考えられる。また、プラ
スミノーゲンアクチベーターやコラゲナーゼを含むプロ
テアーゼ活性の調節、コラーゲンゲル中などにおける血
管様構造の形成の調節、Milesアッセイ等による血管透
過性の調節などの活性も考えられる。

【００１４】「410」タンパク質または「NEW」タンパク
質と機能的に同等なタンパク質は、当業者であれば、例
えば、タンパク質中のアミノ酸配列に変異を導入する方
法（例えば、部位特異的変異誘発法(Current Protocols
in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987)
Publish. Jhon Wily & Sons Section 8.1-8.5)）を利用
して調製することができる。また、このようなタンパク
質は、自然界におけるアミノ酸の変異により生じること
もある。本発明には、このように「410」タンパク質
（配列番号：４）または「NEW」タンパク質（配列番
号：８）のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミ
ノ酸が置換、欠失、挿入および／もしくは付加などによ
り変異したタンパク質であって、これらタンパク質と機
能的に同等なタンパク質も含まれる。

【００１５】タンパク質におけるアミノ酸の変異数や変
異部位は、その機能が保持される限り制限はない。変異
数は、典型的には、全アミノ酸の10％以内であり、好ま
しくは全アミノ酸の5％以内であり、さらに好ましくは
全アミノ酸の1％以内である。

【００１６】また、「410」タンパク質または「NEW」タ
ンパク質と機能的に同等なタンパク質は、当業者に周知
のハイブリダイゼーション技術あるいは遺伝子増幅技術
を利用して単離することも可能である。即ち、当業者で
あれば、ハイブリダイゼーション技術 (Current Protoc
ols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (198
7) Publish. Jhon Wily & Sons Section 6.3-6.4)を用
いて「410」または「NEW」をコードするDNA配列（それ
ぞれ配列番号：３または７）またはその一部をもとにこ
れと相同性の高いDNAを単離して、該DNAからこれらタン
パク質と機能的に同等なタンパク質を得ることは、通常
行いうることである。このように「410」タンパク質ま
たは「NEW」タンパク質をコードするDNAとハイブリダイ
ズするDNAにコードされるタンパク質であって、これら
タンパク質と機能的に同等なタンパク質もまた本発明の
タンパク質に含まれる。

【００１７】機能的に同等なタンパク質を単離する生物
としては、ヒト以外に、例えばラット、マウス、ウサ
ギ、ニワトリ、ブタ、ウシ等が挙げられるが、これらに
制限されない。

【００１８】機能的に同等なタンパク質をコードするDN
Aを単離するためのハイブリダイゼーションのストリン
ジェンシーは、通常「1xSSC、0.1% SDS、37℃」程度で
あり、より厳しい条件としては「0.5xSSC、0.1% SDS、4
2℃」程度であり、さらに厳しい条件としては「0.2xSS
C、0.1% SDS、65℃」程度であり、ハイブリダイゼーシ
ョンの条件が厳しくなるほどプローブ配列と高い相同性
を有するDNAの単離を期待しうる。但し、上記SSC、SDS
および温度の条件の組み合わせは例示であり、当業者で
あれば、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシー
を決定する上記若しくは他の要素（例えば、プローブ濃
度、プローブの長さ、ハイブリダイゼーション反応時間
など）を適宜組み合わせることにより、上記と同様のス
トリンジェンシーを実現することが可能である。

【００１９】このようなハイブリダイゼーション技術を
利用して単離されるタンパク質は、通常、「410」タン
パク質または「NEW」タンパク質とアミノ酸配列におい
て高い相同性を有する。高い相同性とは、少なくとも40
％以上、好ましくは60％以上、さらに好ましくは90％以
上の配列の相同性を指す。相同性の特定は、BLAST検索
アルゴリズムを用いて決定することができる。

【００２０】また、遺伝子増幅技術（PCR）（Current p
rotocols in Molecular Biology edit. Ausubel et a
l. (1987) Publish. John Wiley & Sons Section 6.1-
6.4）を用いて「410」タンパク質または「NEW」タンパ
ク質をコードするDNA配列（それぞれ配列番号：３また
は７）の一部をもとにプライマーを設計し、これらタン
パク質をコードするDNA配列またはその一部と相同性の
高いDNA断片を単離して、これを基にこれらタンパク質
と機能的に同等なタンパク質を得ることも可能である。

【００２１】本発明は、また、本発明のタンパク質の部
分ペプチドを含む。この部分ペプチドには、例えば、シ
グナルペプチドが除去されたタンパク質が含まれる。ま
た、本発明のタンパク質の競合阻害剤として機能する、
受容体との結合能を有するが受容体を活性化する能力の
ない部分ペプチドが含まれる。また、抗体調製のための
抗原ペプチドが含まれる。部分ペプチドが本発明のタン
パク質に特異的であるためには、少なくとも７アミノ
酸、好ましくは８アミノ酸以上、より好ましくは９アミ
ノ酸以上のアミノ酸配列からなる。該部分ペプチドは、
本発明のタンパク質に対する抗体や本発明のタンパク質
の競合阻害剤の調製以外に、例えば、本発明のタンパク
質に結合する受容体のスクリーニングなどに利用し得
る。本発明の部分ペプチドは、例えば、遺伝子工学的手
法、公知のペプチド合成法、あるいは本発明のタンパク
質を適当なペプチダーゼで切断することによって製造す
る。

【００２２】また、本発明は、上記本発明のタンパク質
をコードするDNAに関する。本発明のDNAとしては、本発
明のタンパク質をコードしうるものであれば、その形態
に特に制限はなく、cDNAの他、ゲノムDNA、化学合成DNA
なども含まれる。また、本発明のタンパク質をコードし
うる限り、遺伝暗号の縮重に基づく任意の塩基配列を有
するDNAが含まれる。本発明のDNAは、上記のように、
「410」タンパク質または「NEW」タンパク質をコードす
るDNA配列（それぞれ配列番号：３または７）あるいは
その一部をプローブとしたハイブリダイゼーション法や
これらDNA配列をもとに合成したプライマーを用いたPCR
法等の常法により単離することが可能である。

【００２３】また、本発明は、本発明のDNAが挿入され
たベクターに関する。本発明のベクターとしては、挿入
したDNAを安定に保持するものであれば特に制限され
ず、例えば宿主に大腸菌を用いるのであれば、クロー
ニング用ベクターとしてはpBluescriptベクター(Strata
gene社製）などが好ましい。本発明のタンパク質を生産
する目的においてベクターを用いる場合には、特に発現
ベクターが有用である。発現ベクターとしては、試験管
内、大腸菌内、培養細胞内、生物個体内でタンパク質を
発現するベクターであれば特に制限されないが、例え
ば、試験管内発現であればpBESTベクター（プロメガ社
製）、大腸菌であればpETベクター（Invitrogen社
製）、培養細胞であればpME18S-FL3ベクター（GenBank
Accession No. AB009864）、生物個体であればpME18Sベ
クター（Mol Cell Biol. 8:466〜472(1988)）などが好
ましい。ベクターへの本発明のDNAの挿入は常法によ
り、例えば制限酵素サイトを用いたリガーゼ反応により
行うことができる（Current protocolsin Molecular Bi
ology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John W
iley &Sons．Section 11.4〜11.11）。

【００２４】また、本発明は、本発明のベクターを保持
する形質転換体に関する。本発明のベクターが導入され
る宿主細胞としては特に制限はなく、目的に応じて種々
の宿主細胞が用いられる。タンパク質を高発現させるた
めの真核細胞としては、例えば、COS細胞、CHO細胞など
を例示することができる。

【００２５】宿主細胞へのベクター導入は、例えば、リ
ン酸カルシウム沈殿法、電気パルス穿孔法（Current pr
otocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al.
(1987) Publish. John Wiley & Sons．Section 9.1-9.
9）、リポフェクタミン法（GIBCO-BRL社製）、マイクロ
インジェクション法などの方法で行うことが可能であ
る。

【００２６】また、本発明は、本発明のタンパク質をコ
ードする配列番号：３または７に記載の塩基配列からな
るDNAと特異的にハイブリダイズし、少なくとも15ヌク
レオチドの鎖長を有するDNAに関する。ここで「特異的
にハイブリダイズする」とは、通常のハイブリダイゼー
ション条件下、好ましくは厳格な条件下で、本発明のタ
ンパク質をコードする配列番号：３または７に記載の塩
基配列からなるDNAとハイブリダイズし、他のタンパク
質をコードするDNAとはハイブリダイズしないことを意
味する。このようなDNAは、本発明のDNAを検出、単離す
るためのプローブとして、また、本発明のDNAを増幅す
るためのプライマーとして利用することが可能である。
プライマーとして用いる場合には、通常、15bp〜100b
p、好ましくは15bp〜35bpの鎖長を有する。また、プロ
ーブとして用いる場合には、本発明のDNAの少なくとも
一部若しくは全部の配列を有し、少なくとも15bpの鎖長
のDNAが用いられる。

【００２７】本発明のDNAは、本発明のタンパク質の異
常を検査・診断するために利用できる。例えば、本発明
のDNAをプローブやプライマーとして用いたノーザンハ
イブリダイゼーションやRT-PCRにより、発現異常を検査
したり、本発明のDNAをプライマーとして用いたポリメ
ラーゼ連鎖反応(PCR)によりゲノムDNA-PCRやRT-PCRによ
り本発明のタンパク質をコードするDNAやその発現制御
領域を増幅し、RFLP解析、SSCP、シークエンシング等の
方法により、配列の異常を検査・診断することができ
る。

【００２８】また、「配列番号：３または７に記載のDN
Aと特異的にハイブリダイズし、少なくとも15ヌクレオ
チドの鎖長を有するDNA」には、本発明のタンパク質の
発現を抑制するためのアンチセンスDNAが含まれる。ア
ンチセンスDNAは、アンチセンス効果を引き起こすため
に、少なくとも15bp以上、好ましくは100bp、さらに好
ましくは500bp以上の鎖長を有し、通常、3000bp以内、
好ましくは2000bp以内の鎖長を有する。このようなアン
チセンスDNAには、本発明のタンパク質の異常（機能異
常や発現異常）などに起因した疾患（特に、血管新生に
関連した疾患）の遺伝子治療への応用も考えられる。該
アンチセンスDNAは、例えば、本発明のタンパク質をコ
ードするDNA（例えば、配列番号：３または７に記載のD
NA）の配列情報を基にホスホロチオネート法（Stein, 1
988 Physicochemical properties of phosphorothioate
oligodeoxynucleotides. Nucleic Acids Res 16, 3209
-21(1988)）などにより調製することが可能である。

【００２９】本発明のDNAは、遺伝子治療に用いる場合
には、例えば、レトロウイルスベクター、アデノウイル
スベクター、アデノ随伴ウイルスベクターなどのウイル
スベクターやリポソームなどの非ウイルスベクターなど
を利用して、ex vivo法やinvivo法などにより患者へ投
与を行うことができる。

【００３０】また、本発明は、本発明のタンパク質に結
合する抗体に関する。本発明の抗体の形態には特に制限
はなく、ポリクローナル抗体やモノクローナル抗体また
は抗原結合性を有するそれらの一部も含まれる。また、
全てのクラスの抗体が含まれる。さらに、本発明の抗体
には、ヒト化抗体などの特殊抗体も含まれる。

【００３１】本発明の抗体は、ポリクローナル抗体の場
合には、常法に従いアミノ酸配列に相当するオリゴペプ
チドを合成して家兎に免疫することにより得ることが可
能であり（Current protocols in Molecular Biology e
dit. Ausubel et al. (1987)Publish. John Wiley & So
ns. Section 11.12〜11.13）、一方、モノクローナル抗
体の場合には、常法に従い大腸菌で発現し精製したタン
パク質を用いてマウスを免疫し、脾臓細胞と骨髄腫細胞
を細胞融合させたハイブリドーマ細胞の中から得ること
ができる（Current protocols in Molecular Biology e
dit. Ausubelet al. (1987) Publish. John Wiley & So
ns．Section 11.4〜11.11）。

【００３２】本発明のタンパク質に結合する抗体は、本
発明のタンパク質の精製に加え、例えば、本発明のタン
パク質の発現異常や構造異常の検査・診断に利用するこ
とも考えられる。具体的には、例えば組織、血液、また
は細胞などからタンパク質を抽出し、ウェスタンブロッ
ティング、免疫沈降、ELISA等の方法による本発明のタ
ンパク質の検出を通して、発現や構造の異常の有無を検
査・診断することができる。

【００３３】また、本発明のタンパク質に結合する抗体
を、本発明のタンパク質に関連した疾患の治療などの目
的に利用することも考えられる。抗体を患者の治療目的
で用いる場合には、ヒト抗体またはヒト化抗体が免疫原
性の少ない点で好ましい。ヒト抗体は、免疫系をヒトの
ものと入れ換えたマウス（例えば、「Functional trans
plant of megabase human immunoglobulin loci recapi
tulates human antibody response in mice, Mendez,
M.J. et al.(1997) Nat.Genet.15:146-156」参照）に免
疫することにより調製することができる。また、ヒト化
抗体は、モノクローナル抗体の超可変領域を用いた遺伝
子組み換えによって調製することができる(Methods in
Enzymology 203, 99-121(1991))。

【００３４】また、本発明は、本発明のタンパク質を利
用した、本発明のタンパク質に結合する化合物のスクリ
ーニング方法に関する。このスクリーニング方法は、
（ａ）本発明のタンパク質またはその部分ペプチドに被
検試料を接触させる工程、（ｂ）該タンパク質またはそ
の部分ペプチドに結合する化合物を選択する工程を含
む。

【００３５】具体的な方法としては、例えば、本発明の
タンパク質のアフィニティーカラムに被検試料を接触さ
せ精製する方法、twoハイブリッドシステムを利用する
方法、ウエストウエスタンブロッティング法、コンビナ
トリアルケミストリー技術におけるハイスループットス
クリーニングによる方法など多くの公知の方法を利用す
ることができる。

【００３６】スクリーニングに用いる被検試料として
は、これらに制限されないが、例えば、細胞抽出液、遺
伝子ライブラリーの発現産物、合成低分子化合物、合成
ペプチド、天然化合物などが挙げられる。

【００３７】このスクリーニング方法によれば、本発明
のタンパク質の受容体を単離することが可能である。本
発明のタンパク質の受容体を単離するためのスクリーニ
ングを行う場合、被検試料としては、例えば受容体が発
現していることが予想される細胞（例えば血管内皮細胞
など）の細胞抽出物や、該細胞から調製したRNAを基に
作製したcDNA発現ライブラリーを用いることが可能であ
る。アンギオポエチン-1やアンギオポエチン-2は、それ
らの受容体として受容体型チロシンキナーゼであるTie-
2に結合することが知られている。本発明のタンパク質
もまた、受容体型チロシンキナーゼに結合し、細胞内へ
シグナル伝達を行っている可能性が高い。また、このス
クリーニング方法によれば、本発明のタンパク質の受容
体のアゴニストやアンタゴニストの候補となる化合物を
単離することも可能である。

【００３８】また、本発明は、本発明のタンパク質の受
容体を発現する細胞をスクリーニングする方法に関す
る。このスクリーニング方法は、（ａ）本発明のタンパ
ク質またはその部分ペプチドに被検細胞試料を接触させ
る工程、および（ｂ）該タンパク質またはその部分ペプ
チドに結合する細胞を選択する工程、を含む。

【００３９】このスクリーニングは、例えば、以下のよ
うに行うことが可能である。まず、本発明のタンパク質
の精製品を取得する。次いで、その精製タンパク質を標
識し、各種細胞株または初代培養細胞に対して結合アッ
セイを行い、これにより受容体を発現している細胞を選
定する（本庶・新井・谷口・村松編新生化学実験講座
７増殖分化因子とその受容体p203-236 (1991) 東京化
学同人）。標識としては、¹²⁵IなどのRI標識のほか、酵
素（アルカリホスファターゼ等）標識も可能である。ま
た、本発明のタンパク質を標識せずに用いて、本発明の
タンパク質に対する抗体を標識して用いて検出すること
も考えられる。

【００４０】Ang-1の受容体であるTie-2を発現する細胞
は、正常ヒト静脈内皮細胞（HUVEC,human umbilical ve
in endothelial cell、宝酒造販売）等が知られている
ので、「410」タンパク質または「NEW」タンパク質の受
容体を発現する細胞も血管内皮細胞である可能性が高
い。それらの細胞を用いれば、Ang-1やAng-2と受容体と
の結合活性等の比較を行うことができる。また、HUVEC
で「410」または「NEW」タンパク質とAng-1やAng-2との
結合活性等の比較を行うことは当然可能である。

【００４１】上記スクリーニングにより得られた本発明
のタンパク質の受容体を発現する細胞は、後述するよう
に該受容体のアゴニストやアンタゴニストのスクリーニ
ングに用いることが可能である。

【００４２】上記のスクリーニングにより本発明のタン
パク質の受容体や該受容体を発現する細胞が得られれ
ば、本発明のタンパク質とその受容体または該受容体を
発現する細胞との結合活性を指標に、該結合を阻害する
化合物（例えば、受容体アゴニストやアンタゴニスト）
のスクリーニングが可能となる。

【００４３】このスクリーニング方法は、（ａ）被検試
料の存在下で、本発明のタンパク質を該タンパク質の受
容体または該受容体を発現する細胞に接触させる工程、
（ｂ）該タンパク質とその受容体または該受容体を発現
する細胞との結合活性を検出する工程、および（ｃ）被
検試料非存在下において検出した場合と比較して、該結
合活性を低下させる化合物を選択する工程、を含む。

【００４４】スクリーニングに用いる被検試料として
は、例えば、細胞抽出液、遺伝子ライブラリーの発現産
物、合成低分子化合物、合成ペプチド、天然化合物など
が挙げられるが、これらに制限されない。また、本発明
のタンパク質との結合活性を指標とした上記のスクリー
ニングにより単離された化合物を被検試料として用いる
ことも可能である。

【００４５】例えば、アイソトープラベルした「410」
タンパク質または「NEW」タンパク質と被検試料を、こ
れらタンパク質の受容体を発現する細胞に接触させ、こ
れらタンパク質のその受容体への結合活性を検出する。
そして、アイソトープラベルしたこれらタンパク質の細
胞当たりの結合活性を低下させる化合物を選択する。

【００４６】このスクリーニングにより単離される化合
物は、本発明のタンパク質の受容体のアゴニストやアン
タゴニストの候補となる。本発明のタンパク質とその受
容体との結合活性の低下によるリン酸化などの細胞内シ
グナルの変化をもとに、得られた化合物が本発明のタン
パク質の受容体のアゴニストであるかアンタゴニストで
あるかを判定することができる。また、得られる化合物
は、生体内において、本発明のタンパク質とこれと相互
作用する分子(受容体も含む）との該相互作用を阻害す
る化合物の候補ともなる。これら化合物は、本発明のタ
ンパク質が関連する疾患（例えば、血管新生に関連する
疾患）の予防薬や治療薬への応用が考えられる。

【００４７】本発明のスクリーニング方法により単離さ
れた化合物を医薬品として用いる場合には、単離された
化合物自体を直接患者に投与する以外に、公知の製剤学
的方法により製剤化して投与を行うことも可能である。
例えば、薬理学上許容される担体もしくは媒体、具体的
には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤な
どと適宜組み合わせて製剤化して投与することが考えら
れる。患者への投与は、例えば、動脈内注射、静脈内注
射、皮下注射など当業者に公知の方法により行いうる。
投与量は、患者の体重や年齢、投与方法などにより変動
するが、当業者であれば適当な投与量を適宜選択するこ
とが可能である。また、該化合物がDNAによりコードさ
れうるものであれば、該DNAを遺伝子治療用ベクターに
組込み、遺伝子治療を行うことも考えられる。投与量、
投与方法は、患者の体重や年齢、症状などにより変動す
るが、当業者であれば適宜選択することが可能である。

【００４８】

【実施例】次に、本発明を実施例によりさらに具体的に
説明するが、本発明は下記実施例に限定されるものでは
ない。なお、特に断りがない場合は、公知の方法（Mani
atis, T. at al. (1982) : "Molecular Cloning - A La
boratory Manual" Cold Spring Harbor Laboratory, N
Y）に従って実施可能である。

【００４９】［実施例１］新規アンギオポエチン様タン
パク質をコードする遺伝子の単離本発明のアンギオポエチン様タンパク質（410、NEW）を
コードする全長cDNAは、ヒト胎児由来のpoly A⁺ RNA（C
lontech）を鋳型としてRT-PCRにより取得した。

【００５０】新規アンギオポエチン様タンパク質「41
0」の増幅にはforwardプライマーとして5'-ATGAGGCCACT
GTGCGTGAC-3'（配列番号：１）、reverseプライマーと
して5'-TTAGTGGAAGGTGTTGGGGTTCG-3'（配列番号：２）
を用いた。RT-PCRはPyrobest DNApolymerase（宝酒造）
を用い94°C（30秒）／60°C（30秒）／72°C（2分）の
サイクルを35回繰り返した。その結果、約1.5 kbpのDNA
断片が増幅された。この断片をpCR2.1 プラスミド（Inv
itrogen）を用いてクローニングした。得られたクロー
ンの塩基配列はダイデオキシターミネーション法により
ABI377 DNA Sequencer（Applied Biosystems）を用いて
解析した。明らかになった配列を配列番号：３に示す。

【００５１】同配列は1482 baseのオープンリーディン
グフレーム（配列番号：３の第1番目から第1482番目）
を持っている。オープンリーディングフレームから予測
されるアミノ酸配列（493アミノ酸）を配列番号：４に
示す。

【００５２】新規アンギオポエチン様タンパク質「NE
W」の増幅にはforwardプライマーとして5'-ATGGGGAAGCC
CTGGCTGCGTGCGCTACAG-3'（配列番号：５）、reverseプ
ライマーとして5'-TCACAGCTTCAGGGGCCGAATGAGCATGGC-3'
（配列番号：６）を用いた。 RT-PCRはPyrobest DNA po
lymerase（宝酒造）を用い5% ホルムアミド存在下で98
°C（20秒）／64°C（30秒）／74°C（3分）のサイクル
を35回繰り返した。その結果、約1.5 kbpのDNA断片が増
幅された。この断片をpCR2.1 プラスミド（Invitroge
n）を用いてクローニングした。得られたクローンの塩
基配列はダイデオキシターミネーション法によりABI377
DNA Sequencer（Applied Biosystems）を用いて解析し
た。明らかになった配列を配列番号：７に示す。

【００５３】同配列は1413 baseのオープンリーディン
グフレーム（配列番号：７の第1番目から第1413番目）
を持っている。オープンリーディングフレームから予測
されるアミノ酸配列（470アミノ酸）を配列番号：８に
示す。

【００５４】［実施例２］「410」、「NEW」のアミノ酸
配列よりの機能予測（１）「410」のアミノ酸配列とヒトアンギオポエチン-
1（Ang1） mRNA complete cds.(U83508, 2149塩基, 498
アミノ酸)およびヒトアンギオポエチン-2（Ang2） mRNA
complete cds.(AF004327, 2269塩基, 496アミノ酸) の
アミノ酸配列に対するALIGN（calculates a global ali
gnment of two sequences）[Myers andMiller, CABIOS
(1989); FASTA2（ftp://ftp.virginia.edu/pub/fasta
/）と共にプログラムをダウンロード可能] による検索
を行った。その結果を図１および２に示した。「410」
のアミノ酸配列（上段）が、Human angiopoietin-1（図
１下段）およびHuman angiopoietin-2（図２下段)のア
ミノ酸配列と、28.7%および28.2%の相同性を示した。こ
れらのことから「410」が血管新生に関与するアンギオ
ポエチン（Angiopoietin）のファミリーである可能性が
高い遺伝子であることが示唆された。

【００５５】（２）「NEW」のアミノ酸配列とヒトアン
ギオポエチン-1（Ang1）およびヒトアンギオポエチン-2
（Ang2）のアミノ酸配列に対するALIGNによる検索を行
った結果を図３および４に示した。「NEW」のアミノ酸
配列（上段）が、Human angiopoietin-1（図３下段）お
よびHuman angiopoietin-2（図４下段)のアミノ酸配列
と、28.8%および27.2%の相同性を示した。これらのこと
から「410」が血管新生に関与するアンギオポエチン（A
ngiopoietin）のファミリーである可能性が高い遺伝子
であることが示唆された。

【００５６】（３）「410」、「NEW」のアミノ酸配列よ
りの機能予測ヒトアンギオポエチン-1およびヒトアンギオポエチン-2
の生物活性は分子内C末端領域に存在するフィブリノー
ゲンドメインに存在すると考えられている[D.M. Valenz
uela et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96: 1904-
1909 (1999)]。「410」、「NEW」にも同様のフィブリノ
ーゲンドメイン（それぞれアミノ酸番号275−460および
257−441）が分子内C末端領域に存在している。この領
域について、ヒトアンギオポエチン-1およびヒトアンギ
オポエチン-2のフィブリノーゲンドメイン（それぞれア
ミノ酸番号282−468および281−467）のALIGNによる検
索を行った。その結果を図５から８に示した。「41
0」、「NEW」のフィブリノーゲンドメインのアミノ酸配
列は、Human angiopoietin-1およびHuman angiopoietin
-2と、いずれも40%以上保存されており、分子内N末領域
よりも特に良く保存されていたことから、アンギオポエ
チン同様の生物活性を有する可能性が考えられた。

【００５７】さらに、Ang1のアミノ酸番号で 41, 286,
315, 439, および452であり、Ang2のアミノ酸番号で 4
1, 284, 313, 437, および450であるシステイン残基
が、「410」でもアミノ酸番号で54, 278, 307, 430, お
よび443、「NEW」ではアミノ酸番号で37, 260, 287, 41
0, および423で存在していた。この結果は、ヒトAng1お
よびAng2、並びにマウスAng1およびAng2で共通に保存さ
れているシステイン残基8個 [P. C. Maisonpierre et a
l., Science, 277: 55-60 (1997)]のうち5個が「41
0」、「NEW」でも存在していることを示している。残り
のAng1およびAng2で保存されているシステイン残基３個
のうち2個はCys-X−Cys−X-Cysの2個であった。このこ
とより、Ang1およびAng2で保存されているシステイン残
基6部位のうち、「410」、「NEW」では5部位に存在して
いることが分かった。

【００５８】これらのことから「410」、「NEW」が血管
新生に関与するアンギオポエチン（Angiopoietin）のフ
ァミリーである可能性が高いタンパク質であることが示
唆された。

【００５９】

【発明の効果】本発明のタンパク質は、血管新生の制御
に関与していることが示唆されるため、本発明のタンパ
ク質やそれらの遺伝子、または本発明のタンパク質や受
容体の活性を制御する化合物は、血管新生が関与する疾
患の新しい予防薬や治療薬の開発への利用が期待され
る。

【００６０】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Helix Reseach Institute <120> "410" and "NEW", proteins related to angiogenesis and genes encording them. <130> H1-104 <140> <141> <160> 8 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 1 atgaggccac tgtgcgtgac 20 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 2 ttagtggaag gtgttggggt tcg 23 <210> 3 <211> 1482 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(1482) <400> 3 atg agg cca ctg tgc gtg aca tgc tgg tgg ctc gga ctg ctg gct gcc 48 Met Arg Pro Leu Cys Val Thr Cys Trp Trp Leu Gly Leu Leu Ala Ala 1 5 10 15 atg gga gct gtt gca ggc cag gag gac ggt ttt gag ggc act gag gag 96 Met Gly Ala Val Ala Gly Gln Glu Asp Gly Phe Glu Gly Thr Glu Glu 20 25 30 ggc tcg cca aga gag ttc att tac cta aac agg tac aag cgg gcg ggc 144 Gly Ser Pro Arg Glu Phe Ile Tyr Leu Asn Arg Tyr Lys Arg Ala Gly 35 40 45 gag tcc cag gac aag tgc acc tac acc ttc att gtg ccc cag cag cgg 192 Glu Ser Gln Asp Lys Cys Thr Tyr Thr Phe Ile Val Pro Gln Gln Arg 50 55 60 gtc acg ggt gcc atc tgc gtc aac tcc aag gag cct gag gtg ctt ctg 240 Val Thr Gly Ala Ile Cys Val Asn Ser Lys Glu Pro Glu Val Leu Leu 65 70 75 80 gag aac cga gtg cat aag cag gag cta gag ctg ctc aac aat gag ctg 288 Glu Asn Arg Val His Lys Gln Glu Leu Glu Leu Leu Asn Asn Glu Leu 85 90 95 ctc aag cag aag cgg cag atc gag acg ctg cag cag ctg gtg gag gtg 336 Leu Lys Gln Lys Arg Gln Ile Glu Thr Leu Gln Gln Leu Val Glu Val 100 105 110 gac ggc ggc att gtg agc gag gtg aag ctg ctg cgc aag gag agc cgc 384 Asp Gly Gly Ile Val Ser Glu Val Lys Leu Leu Arg Lys Glu Ser Arg 115 120 125 aac atg aac tcg cgg gtc acg cag ctc tac atg cag ctc ctg cac gag 432 Asn Met Asn Ser Arg Val Thr Gln Leu Tyr Met Gln Leu Leu His Glu 130 135 140 atc atc cgc aag cgg gac aac gcg ttg gag ctc tcc cag ctg gag aac 480 Ile Ile Arg Lys Arg Asp Asn Ala Leu Glu Leu Ser Gln Leu Glu Asn 145 150 155 160 agg atc ctg aac cag aca gcc gac atg ctg cag ctg gcc agc aag tac 528 Arg Ile Leu Asn Gln Thr Ala Asp Met Leu Gln Leu Ala Ser Lys Tyr 165 170 175 aag gac ctg gag cac aag tac cag cac ctg gcc aca ctg gcc cac aac 576 Lys Asp Leu Glu His Lys Tyr Gln His Leu Ala Thr Leu Ala His Asn 180 185 190 caa tca gag atc atc gcg cag ctt gag gag cac tgc cag agg gtg ccc 624 Gln Ser Glu Ile Ile Ala Gln Leu Glu Glu His Cys Gln Arg Val Pro 195 200 205 tcg gcc agg ccc gtc ccc cag cca ccc ccc gct gcc ccg ccc cgg gtc 672 Ser Ala Arg Pro Val Pro Gln Pro Pro Pro Ala Ala Pro Pro Arg Val 210 215 220 tac caa cca ccc acc tac aac cgc atc atc aac cag atc tct acc aac 720 Tyr Gln Pro Pro Thr Tyr Asn Arg Ile Ile Asn Gln Ile Ser Thr Asn 225 230 235 240 gag atc cag agt gac cag aac ctg aag gtg ctg cca ccc cct ctg ccc 768 Glu Ile Gln Ser Asp Gln Asn Leu Lys Val Leu Pro Pro Pro Leu Pro 245 250 255 act atg ccc act ctc acc agc ctc cca tct tcc acc gac aag ccg tcg 816 Thr Met Pro Thr Leu Thr Ser Leu Pro Ser Ser Thr Asp Lys Pro Ser 260 265 270 ggc cca tgg aga gac tgc ctg cag gcc ctg gag gat ggc cac gac acc 864 Gly Pro Trp Arg Asp Cys Leu Gln Ala Leu Glu Asp Gly His Asp Thr 275 280 285 agc tcc atc tac ctg gtg aag ccg gag aac acc aac cgc ctc atg cag 912 Ser Ser Ile Tyr Leu Val Lys Pro Glu Asn Thr Asn Arg Leu Met Gln 290 295 300 gtg tgg tgc gac cag aga cac gac ccc ggg ggc tgg acc gtc atc cag 960 Val Trp Cys Asp Gln Arg His Asp Pro Gly Gly Trp Thr Val Ile Gln 305 310 315 320 aga cgc ctg gat ggc tct gtt aac ttc ttc agg aac tgg gag acg tac 1008 Arg Arg Leu Asp Gly Ser Val Asn Phe Phe Arg Asn Trp Glu Thr Tyr 325 330 335 aag caa ggg ttt ggg aac att gat ggc gaa tac tgg ctg ggc ctg gag 1056 Lys Gln Gly Phe Gly Asn Ile Asp Gly Glu Tyr Trp Leu Gly Leu Glu 340 345 350 aac att tac tgg ctg acg aac caa ggc aac tac aaa ctc ctg gtg acc 1104 Asn Ile Tyr Trp Leu Thr Asn Gln Gly Asn Tyr Lys Leu Leu Val Thr 355 360 365 atg gag gac tgg tcc ggc cgc aaa gtc ttt gca gaa tac gcc agt ttc 1152 Met Glu Asp Trp Ser Gly Arg Lys Val Phe Ala Glu Tyr Ala Ser Phe 370 375 380 cgc ctg gaa cct gag agc gag tat tat aag ctg cgg ctg ggg cgc tac 1200 Arg Leu Glu Pro Glu Ser Glu Tyr Tyr Lys Leu Arg Leu Gly Arg Tyr 385 390 395 400 cat ggc aat gcg ggt gac tcc ttt aca tgg cac aac ggc aag cag ttc 1248 His Gly Asn Ala Gly Asp Ser Phe Thr Trp His Asn Gly Lys Gln Phe 405 410 415 acc acc ctg gac aga gat cat gat gtc tac aca gga aac tgt gcc cac 1296 Thr Thr Leu Asp Arg Asp His Asp Val Tyr Thr Gly Asn Cys Ala His 420 425 430 tac cag aag gga ggc tgg tgg tat aac gcc tgt gcc cac tcc aac ctc 1344 Tyr Gln Lys Gly Gly Trp Trp Tyr Asn Ala Cys Ala His Ser Asn Leu 435 440 445 aac ggg gtc tgg tac cgc ggg ggc cat tac cgg agc cgc tac cag gac 1392 Asn Gly Val Trp Tyr Arg Gly Gly His Tyr Arg Ser Arg Tyr Gln Asp 450 455 460 gga gtc tac tgg gct gag ttc cga gga ggc tct tac tca ctc aag aaa 1440 Gly Val Tyr Trp Ala Glu Phe Arg Gly Gly Ser Tyr Ser Leu Lys Lys 465 470 475 480 gtg gtg atg atg atc cga ccg aac ccc aac acc ttc cac taa 1482 Val Val Met Met Ile Arg Pro Asn Pro Asn Thr Phe His 485 490 <210> 4 <211> 493 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Met Arg Pro Leu Cys Val Thr Cys Trp Trp Leu Gly Leu Leu Ala Ala 1 5 10 15 Met Gly Ala Val Ala Gly Gln Glu Asp Gly Phe Glu Gly Thr Glu Glu 20 25 30 Gly Ser Pro Arg Glu Phe Ile Tyr Leu Asn Arg Tyr Lys Arg Ala Gly 35 40 45 Glu Ser Gln Asp Lys Cys Thr Tyr Thr Phe Ile Val Pro Gln Gln Arg 50 55 60 Val Thr Gly Ala Ile Cys Val Asn Ser Lys Glu Pro Glu Val Leu Leu 65 70 75 80 Glu Asn Arg Val His Lys Gln Glu Leu Glu Leu Leu Asn Asn Glu Leu 85 90 95 Leu Lys Gln Lys Arg Gln Ile Glu Thr Leu Gln Gln Leu Val Glu Val 100 105 110 Asp Gly Gly Ile Val Ser Glu Val Lys Leu Leu Arg Lys Glu Ser Arg 115 120 125 Asn Met Asn Ser Arg Val Thr Gln Leu Tyr Met Gln Leu Leu His Glu 130 135 140 Ile Ile Arg Lys Arg Asp Asn Ala Leu Glu Leu Ser Gln Leu Glu Asn 145 150 155 160 Arg Ile Leu Asn Gln Thr Ala Asp Met Leu Gln Leu Ala Ser Lys Tyr 165 170 175 Lys Asp Leu Glu His Lys Tyr Gln His Leu Ala Thr Leu Ala His Asn 180 185 190 Gln Ser Glu Ile Ile Ala Gln Leu Glu Glu His Cys Gln Arg Val Pro 195 200 205 Ser Ala Arg Pro Val Pro Gln Pro Pro Pro Ala Ala Pro Pro Arg Val 210 215 220 Tyr Gln Pro Pro Thr Tyr Asn Arg Ile Ile Asn Gln Ile Ser Thr Asn 225 230 235 240 Glu Ile Gln Ser Asp Gln Asn Leu Lys Val Leu Pro Pro Pro Leu Pro 245 250 255 Thr Met Pro Thr Leu Thr Ser Leu Pro Ser Ser Thr Asp Lys Pro Ser 260 265 270 Gly Pro Trp Arg Asp Cys Leu Gln Ala Leu Glu Asp Gly His Asp Thr 275 280 285 Ser Ser Ile Tyr Leu Val Lys Pro Glu Asn Thr Asn Arg Leu Met Gln 290 295 300 Val Trp Cys Asp Gln Arg His Asp Pro Gly Gly Trp Thr Val Ile Gln 305 310 315 320 Arg Arg Leu Asp Gly Ser Val Asn Phe Phe Arg Asn Trp Glu Thr Tyr 325 330 335 Lys Gln Gly Phe Gly Asn Ile Asp Gly Glu Tyr Trp Leu Gly Leu Glu 340 345 350 Asn Ile Tyr Trp Leu Thr Asn Gln Gly Asn Tyr Lys Leu Leu Val Thr 355 360 365 Met Glu Asp Trp Ser Gly Arg Lys Val Phe Ala Glu Tyr Ala Ser Phe 370 375 380 Arg Leu Glu Pro Glu Ser Glu Tyr Tyr Lys Leu Arg Leu Gly Arg Tyr 385 390 395 400 His Gly Asn Ala Gly Asp Ser Phe Thr Trp His Asn Gly Lys Gln Phe 405 410 415 Thr Thr Leu Asp Arg Asp His Asp Val Tyr Thr Gly Asn Cys Ala His 420 425 430 Tyr Gln Lys Gly Gly Trp Trp Tyr Asn Ala Cys Ala His Ser Asn Leu 435 440 445 Asn Gly Val Trp Tyr Arg Gly Gly His Tyr Arg Ser Arg Tyr Gln Asp 450 455 460 Gly Val Tyr Trp Ala Glu Phe Arg Gly Gly Ser Tyr Ser Leu Lys Lys 465 470 475 480 Val Val Met Met Ile Arg Pro Asn Pro Asn Thr Phe His 485 490 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 5 atggggaagc cctggctgcg tgcgctacag 30 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 6 tcacagcttc aggggccgaa tgagcatggc 30 <210> 7 <211> 1413 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(1413) <400> 7 atg ggg aag ccc tgg ctg cgt gcg cta cag ctg ctg ctc ctg ctg ggc 48 Met Gly Lys Pro Trp Leu Arg Ala Leu Gln Leu Leu Leu Leu Leu Gly 1 5 10 15 gcg tcg tgg gcg cgg gcg ggc gcc ccg cgc tgc acc tac acc ttc gtg 96 Ala Ser Trp Ala Arg Ala Gly Ala Pro Arg Cys Thr Tyr Thr Phe Val 20 25 30 ctg ccc ccg cag aag ttc acg ggc gct gtg tgc tgg agc ggc ccc gca 144 Leu Pro Pro Gln Lys Phe Thr Gly Ala Val Cys Trp Ser Gly Pro Ala 35 40 45 tcc acg cgg gcg acg ccc gag gcc gcc aac gcc agc gag ctg gcg gcg 192 Ser Thr Arg Ala Thr Pro Glu Ala Ala Asn Ala Ser Glu Leu Ala Ala 50 55 60 ctg cgc atg cgc gtc ggc cgc cac gag gag ctg tta cgc gag ctg cag 240 Leu Arg Met Arg Val Gly Arg His Glu Glu Leu Leu Arg Glu Leu Gln 65 70 75 80 agg ctg gcg gcg gcc gac ggc gcc gtg gcc ggc gag gtg cgc gcg ctg 288 Arg Leu Ala Ala Ala Asp Gly Ala Val Ala Gly Glu Val Arg Ala Leu 85 90 95 cgc aag gag agc cgc ggc ctg agc gcg cgc ctg ggc cag ttg cgc gcg 336 Arg Lys Glu Ser Arg Gly Leu Ser Ala Arg Leu Gly Gln Leu Arg Ala 100 105 110 cag ctg cag cac gag gcg ggg ccc ggg gcg ggc ccg ggg gcg gat ctg 384 Gln Leu Gln His Glu Ala Gly Pro Gly Ala Gly Pro Gly Ala Asp Leu 115 120 125 ggg gcg gag cct gcc gcg gcg ctg gcg ctg ctc ggg gag cgc gtg ctc 432 Gly Ala Glu Pro Ala Ala Ala Leu Ala Leu Leu Gly Glu Arg Val Leu 130 135 140 aac gcg tcc gcc gag gct cag cgc gca gcc gcc cgg ttc cac cag ctg 480 Asn Ala Ser Ala Glu Ala Gln Arg Ala Ala Ala Arg Phe His Gln Leu 145 150 155 160 gac gtc aag ttc cgc gag ctg gcg cag ctc gtc acc cag cag agc agt 528 Asp Val Lys Phe Arg Glu Leu Ala Gln Leu Val Thr Gln Gln Ser Ser 165 170 175 ctc atc gcc cgc ctg gag cgc ctg tgc ccg gga ggc gcg ggc ggg cag 576 Leu Ile Ala Arg Leu Glu Arg Leu Cys Pro Gly Gly Ala Gly Gly Gln 180 185 190 cag cag gtc ctg ccg cca ccc cca ctg gtg cct gtg gtt ccg gtc cgt 624 Gln Gln Val Leu Pro Pro Pro Pro Leu Val Pro Val Val Pro Val Arg 195 200 205 ctt gtg ggt agc acc agt gac acc agt agg atg ctg gac cca gcc cca 672 Leu Val Gly Ser Thr Ser Asp Thr Ser Arg Met Leu Asp Pro Ala Pro 210 215 220 gag ccc cag aga gac cag acc cag aga cag cag gag ccc atg gct tct 720 Glu Pro Gln Arg Asp Gln Thr Gln Arg Gln Gln Glu Pro Met Ala Ser 225 230 235 240 ccc atg cct gca ggt cac cct gcg gtc ccc acc aag cct gtg ggc ccg 768 Pro Met Pro Ala Gly His Pro Ala Val Pro Thr Lys Pro Val Gly Pro 245 250 255 tgg cag gat tgt gca gag gcc cgc cag gca ggc cat gaa cag agt gga 816 Trp Gln Asp Cys Ala Glu Ala Arg Gln Ala Gly His Glu Gln Ser Gly 260 265 270 gtg tat gaa ctg cga gtg ggc cgt cac gta gtg tca gta tgg tgt gag 864 Val Tyr Glu Leu Arg Val Gly Arg His Val Val Ser Val Trp Cys Glu 275 280 285 cag caa ctg gag ggt gga ggc tgg act gtg atc cag cgg agg caa gat 912 Gln Gln Leu Glu Gly Gly Gly Trp Thr Val Ile Gln Arg Arg Gln Asp 290 295 300 ggt tca gtc aac ttc ttc act acc tgg cag cac tat aag gcg ggc ttt 960 Gly Ser Val Asn Phe Phe Thr Thr Trp Gln His Tyr Lys Ala Gly Phe 305 310 315 320 ggg cgg cca gac gga gaa tac tgg ctg ggc ctt gaa ccc gtg tat cag 1008 Gly Arg Pro Asp Gly Glu Tyr Trp Leu Gly Leu Glu Pro Val Tyr Gln 325 330 335 ctg acc agc cgt ggg gac cat gag ctg ctg gtt ctc ctg gag gac tgg 1056 Leu Thr Ser Arg Gly Asp His Glu Leu Leu Val Leu Leu Glu Asp Trp 340 345 350 ggg ggc cgt gga gca cgt gcc cac tat gat ggc ttc tcc ctg gaa ccc 1104 Gly Gly Arg Gly Ala Arg Ala His Tyr Asp Gly Phe Ser Leu Glu Pro 355 360 365 gag agc gac cac tac cgc ctg cgg ctt ggc cag tac cat ggt gat gct 1152 Glu Ser Asp His Tyr Arg Leu Arg Leu Gly Gln Tyr His Gly Asp Ala 370 375 380 gga gac tct ctt tcc tgg cac aat gac aag ccc ttc agc acc gtg gat 1200 Gly Asp Ser Leu Ser Trp His Asn Asp Lys Pro Phe Ser Thr Val Asp 385 390 395 400 agg gac cga gac tcc tat tct ggt aac tgt gcc ctg tac cag cgg gga 1248 Arg Asp Arg Asp Ser Tyr Ser Gly Asn Cys Ala Leu Tyr Gln Arg Gly 405 410 415 ggc tgg tgg tac cat gcc tgt gcc cac tcc aac ctc aac ggt gtg tgg 1296 Gly Trp Trp Tyr His Ala Cys Ala His Ser Asn Leu Asn Gly Val Trp 420 425 430 cac cac ggc ggc cac tac cga agc cgc tac cag gat ggt gtc tac tgg 1344 His His Gly Gly His Tyr Arg Ser Arg Tyr Gln Asp Gly Val Tyr Trp 435 440 445 gct gag ttt cgt ggt ggg gca tat tct ctc agg aag gcc gcc atg ctc 1392 Ala Glu Phe Arg Gly Gly Ala Tyr Ser Leu Arg Lys Ala Ala Met Leu 450 455 460 att cgg ccc ctg aag ctg tga 1413 Ile Arg Pro Leu Lys Leu 465 470 <210> 8 <211> 470 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Met Gly Lys Pro Trp Leu Arg Ala Leu Gln Leu Leu Leu Leu Leu Gly 1 5 10 15 Ala Ser Trp Ala Arg Ala Gly Ala Pro Arg Cys Thr Tyr Thr Phe Val 20 25 30 Leu Pro Pro Gln Lys Phe Thr Gly Ala Val Cys Trp Ser Gly Pro Ala 35 40 45 Ser Thr Arg Ala Thr Pro Glu Ala Ala Asn Ala Ser Glu Leu Ala Ala 50 55 60 Leu Arg Met Arg Val Gly Arg His Glu Glu Leu Leu Arg Glu Leu Gln 65 70 75 80 Arg Leu Ala Ala Ala Asp Gly Ala Val Ala Gly Glu Val Arg Ala Leu 85 90 95 Arg Lys Glu Ser Arg Gly Leu Ser Ala Arg Leu Gly Gln Leu Arg Ala 100 105 110 Gln Leu Gln His Glu Ala Gly Pro Gly Ala Gly Pro Gly Ala Asp Leu 115 120 125 Gly Ala Glu Pro Ala Ala Ala Leu Ala Leu Leu Gly Glu Arg Val Leu 130 135 140 Asn Ala Ser Ala Glu Ala Gln Arg Ala Ala Ala Arg Phe His Gln Leu 145 150 155 160 Asp Val Lys Phe Arg Glu Leu Ala Gln Leu Val Thr Gln Gln Ser Ser 165 170 175 Leu Ile Ala Arg Leu Glu Arg Leu Cys Pro Gly Gly Ala Gly Gly Gln 180 185 190 Gln Gln Val Leu Pro Pro Pro Pro Leu Val Pro Val Val Pro Val Arg 195 200 205 Leu Val Gly Ser Thr Ser Asp Thr Ser Arg Met Leu Asp Pro Ala Pro 210 215 220 Glu Pro Gln Arg Asp Gln Thr Gln Arg Gln Gln Glu Pro Met Ala Ser 225 230 235 240 Pro Met Pro Ala Gly His Pro Ala Val Pro Thr Lys Pro Val Gly Pro 245 250 255 Trp Gln Asp Cys Ala Glu Ala Arg Gln Ala Gly His Glu Gln Ser Gly 260 265 270 Val Tyr Glu Leu Arg Val Gly Arg His Val Val Ser Val Trp Cys Glu 275 280 285 Gln Gln Leu Glu Gly Gly Gly Trp Thr Val Ile Gln Arg Arg Gln Asp 290 295 300 Gly Ser Val Asn Phe Phe Thr Thr Trp Gln His Tyr Lys Ala Gly Phe 305 310 315 320 Gly Arg Pro Asp Gly Glu Tyr Trp Leu Gly Leu Glu Pro Val Tyr Gln 325 330 335 Leu Thr Ser Arg Gly Asp His Glu Leu Leu Val Leu Leu Glu Asp Trp 340 345 350 Gly Gly Arg Gly Ala Arg Ala His Tyr Asp Gly Phe Ser Leu Glu Pro 355 360 365 Glu Ser Asp His Tyr Arg Leu Arg Leu Gly Gln Tyr His Gly Asp Ala 370 375 380 Gly Asp Ser Leu Ser Trp His Asn Asp Lys Pro Phe Ser Thr Val Asp 385 390 395 400 Arg Asp Arg Asp Ser Tyr Ser Gly Asn Cys Ala Leu Tyr Gln Arg Gly 405 410 415 Gly Trp Trp Tyr His Ala Cys Ala His Ser Asn Leu Asn Gly Val Trp 420 425 430 His His Gly Gly His Tyr Arg Ser Arg Tyr Gln Asp Gly Val Tyr Trp 435 440 445 Ala Glu Phe Arg Gly Gly Ala Tyr Ser Leu Arg Lys Ala Ala Met Leu 450 455 460 Ile Arg Pro Leu Lys Leu 465 470

【図面の簡単な説明】

【図１】「410」のアミノ酸配列（493アミノ酸）（上
段）とヒトアンギオポエチン-1のアミノ酸配列(下段)と
のアラインメントを示す図である。「410」のアミノ酸
配列が、ヒトアンギオポエチン-1のアミノ酸配列と、2
8.7%の相同性を示した。この時のグローバルアラインメ
ントスコア(Global alignment score)は"680"であっ
た。

【図２】「410」のアミノ酸配列（493アミノ酸）（上
段）とヒトアンギオポエチン-２のアミノ酸配列(下段)
とのアラインメントを示す図である。「410」のアミノ
酸配列が、ヒトアンギオポエチン-２のアミノ酸配列
と、28.2%の相同性を示した。この時のグローバルアラ
インメントスコア(Global alignment score)は"662"で
あった。

【図３】「NEW」のアミノ酸配列（470アミノ酸）（上
段）とヒトアンギオポエチン-1のアミノ酸配列(下段)と
のアラインメントを示す図である。「NEW」のアミノ酸
配列が、ヒトアンギオポエチン-1のアミノ酸配列と、2
8.8%の相同性を示した。この時のグローバルアラインメ
ントスコア(Global alignment score)は"580"であっ
た。

【図４】「NEW」のアミノ酸配列（470アミノ酸）（上
段）とヒトアンギオポエチン-２のアミノ酸配列(下段)
とのアラインメントを示す図である。「NEW」のアミノ
酸配列が、ヒトアンギオポエチン-2のアミノ酸配列と、
27.2%の相同性を示した。この時のグローバルアライン
メントスコア(Global alignment score)は"578"であっ
た。

【図５】「410」のフィブリノーゲンドメインのアミノ
酸配列（上段）とヒトアンギオポエチン-1のフィブリノ
ーゲンドメインのアミノ酸配列（下段）とのアラインメ
ントを示す図である。「410」のアミノ酸配列が、ヒト
アンギオポエチン-1のアミノ酸配列と、41.0%の相同性
を示した。この時のグローバルアラインメントスコア(G
lobal alignment score)は"530"であった。

【図６】「410」のフィブリノーゲンドメインのアミノ
酸配列（上段）とヒトアンギオポエチン-２のフィブリ
ノーゲンドメインのアミノ酸配列（下段）とのアライン
メントを示す図である。「410」のアミノ酸配列が、ヒ
トアンギオポエチン-２のアミノ酸配列と、41.2%の相同
性を示した。この時のグローバルアラインメントスコア
(Global alignment score)は"536"であった。

【図７】「NEW」のフィブリノーゲンドメインのアミノ
酸配列（上段）とヒトアンギオポエチン-1のフィブリノ
ーゲンドメインのアミノ酸配列（下段）とのアラインメ
ントを示す図である。「NEW」のアミノ酸配列が、ヒト
アンギオポエチン-1のアミノ酸配列と、42.9%の相同性
を示した。この時のグローバルアラインメントスコア(G
lobal alignment score)は"531"であった。

【図８】「NEW」のフィブリノーゲンドメインのアミノ
酸配列（上段）とヒトアンギオポエチン-２のフィブリ
ノーゲンドメインのアミノ酸配列（下段）とのアライン
メントを示す図である。「NEW」のアミノ酸配列が、ヒ
トアンギオポエチン-２のアミノ酸配列と、41.8%の相同
性を示した。この時のグローバルアラインメントスコア
(Global alignment score)は"507"であった。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/19 ４Ｃ０８５ 1/21 1/21 ４Ｈ０４５ 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/02 ＣＣ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｑ 1/02 1/68 Ａ 1/68 Ａ６１Ｋ 31/00 ６０９Ｆ // Ａ６１Ｐ 9/10 ６２７Ａ 27/02 ６２９Ａ 29/00 ６３５ 35/00 39/395 ＤＡ６１Ｋ 38/00 Ｎ 39/395 48/00 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ 48/00 Ａ６１Ｋ 37/02 (72)発明者太田紀夫神奈川県藤沢市辻堂新町１−２−８−701 Ｆターム(参考） 4B024 BA21 BA80 CA04 CA20 DA01 DA02 DA05 DA11 EA04 GA11 4B063 QA01 QA05 QQ08 QR32 QR35 QR40 QR48 QR55 QR62 QS34 4B064 AG01 AG02 CA01 CA19 CC01 CC24 DA01 DA13 4B065 AA01X AA57X AA88X AA90X AA93Y AB01 AC14 BA02 CA24 CA44 CA46 4C084 AA06 AA07 AA13 AA17 BA01 BA22 BA44 DA39 DB57 ZA262 ZA362 4C085 AA13 AA14 BB07 DD63 DD88 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 CA40 DA01 DA75 EA20 EA50 FA74

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】配列番号：４または８に記載のアミノ酸
配列からなるタンパク質、または該タンパク質中のアミ
ノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が欠失、付
加、挿入および／または他のアミノ酸による置換により
修飾されたアミノ酸配列からなり、配列番号：４または
８に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に
同等なタンパク質。
【請求項２】配列番号：３または７に記載の塩基配列
からなるDNAとハイブリダイズするDNAがコードするタン
パク質であって、配列番号：４または８に記載のアミノ
酸配列からなるタンパク質と機能的に同等なタンパク
質。
【請求項３】請求項１または２に記載のタンパク質を
コードするDNA。
【請求項４】請求項３に記載のDNAを含むベクター。
【請求項５】請求項４に記載のベクターを保持する形
質転換体。
【請求項６】請求項５に記載の形質転換体を培養する
工程を含む、請求項１または２に記載のタンパク質の製
造方法。
【請求項７】請求項１または２に記載のタンパク質の
部分ペプチド。
【請求項８】請求項１または２に記載のタンパク質に
対する抗体。
【請求項９】配列番号：３または７に記載の塩基配列
からなるDNAと特異的にハイブリダイズし、少なくとも
１５塩基の鎖長を有するDNA。
【請求項１０】請求項１または２に記載のタンパク質
に結合する化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）請求項１または２に記載のタンパク質またはその
部分ペプチドに被検試料を接触させる工程、および
（ｂ）該タンパク質またはその部分ペプチドに結合する
化合物を選択する工程、を含む方法。
【請求項１１】請求項１０に記載の方法により単離さ
れうる、請求項１または２に記載のタンパク質に結合す
る化合物。
【請求項１２】受容体タンパク質である、請求項１１
に記載の化合物。
【請求項１３】請求項１または２に記載のタンパク質
の受容体を発現する細胞をスクリーニングする方法であ
って、（ａ）請求項１または２に記載のタンパク質また
はその部分ペプチドに被検細胞試料を接触させる工程、
および（ｂ）該タンパク質またはその部分ペプチドに結
合する細胞を選択する工程、を含む方法。
【請求項１４】請求項１または２に記載のタンパク質
とその受容体との結合を阻害する化合物をスクリーニン
グする方法であって、（ａ）被検試料の存在下で、請求
項１または２に記載のタンパク質を該タンパク質の受容
体または該受容体を発現する細胞に接触させる工程、
（ｂ）該タンパク質とその受容体または該受容体を発現
する細胞との結合活性を検出する工程、および（ｃ）被
検試料非存在下において検出した場合と比較して、該結
合活性を低下させる化合物を選択する工程、を含む方
法。
【請求項１５】請求項１４に記載の方法により単離さ
れうる、請求項１または２に記載のタンパク質とその受
容体との結合を阻害する化合物。