JP2000316574A - Ｍｒｓａが産生する毒素タンパクの検出方法およびモノクローナル抗体とその断片およびｍｒｓａが産生する毒素タンパク検出用キットおよびモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ - Google Patents
Ｍｒｓａが産生する毒素タンパクの検出方法およびモノクローナル抗体とその断片およびｍｒｓａが産生する毒素タンパク検出用キットおよびモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマInfo
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- JP2000316574A JP2000316574A JP2000059946A JP2000059946A JP2000316574A JP 2000316574 A JP2000316574 A JP 2000316574A JP 2000059946 A JP2000059946 A JP 2000059946A JP 2000059946 A JP2000059946 A JP 2000059946A JP 2000316574 A JP2000316574 A JP 2000316574A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 従来困難であった院内感染起因菌ＭＲＳＡが
産生する毒素タンパクの迅速・確実な検出を可能とする
方法を開発すること。 【解決手段】 ＭＲＳＡが産生する毒素タンパク、ロイ
コシジンＦに対するモノクローナル抗体および酵素、蛍
光色素、ビオチン等で標識化した該モノクローナル抗体
を提供する。また、該モノクローナル抗体を産生するハ
イブリドーマを提供する。さらに該モノクローナル抗
体、該標識化モノクローナル抗体を使用するＭＲＳＡの
産生する毒素タンパクの簡易迅速な検出法を提供すると
ともに該検出法に使用するキットを提供する。
産生する毒素タンパクの迅速・確実な検出を可能とする
方法を開発すること。 【解決手段】 ＭＲＳＡが産生する毒素タンパク、ロイ
コシジンＦに対するモノクローナル抗体および酵素、蛍
光色素、ビオチン等で標識化した該モノクローナル抗体
を提供する。また、該モノクローナル抗体を産生するハ
イブリドーマを提供する。さらに該モノクローナル抗
体、該標識化モノクローナル抗体を使用するＭＲＳＡの
産生する毒素タンパクの簡易迅速な検出法を提供すると
ともに該検出法に使用するキットを提供する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、細菌が産生する抗
原性物質、特にタンパクまたはペプチドあるいはタンパ
ク性毒素などに特異的な抗体およびこれを使用する該細
菌の検出方法に関する。より具体的には、メチシリン耐
性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）が産生する抗原性物質、
タンパクまたはペプチド、タンパク性毒素に対する抗体
に関する。さらに具体的には本発明はＭＲＳＡが産生す
る毒素タンパクであるロイコシジンＦに特異的なモノク
ローナル抗体とその断片、およびそれを産生するハイブ
リドーマに関する。さらに該モノクローナル抗体を使用
するＭＲＳＡが産生する毒素タンパクの検出方法並びに
ＭＲＳＡが産生する毒素タンパク検出用キットに関す
る。
原性物質、特にタンパクまたはペプチドあるいはタンパ
ク性毒素などに特異的な抗体およびこれを使用する該細
菌の検出方法に関する。より具体的には、メチシリン耐
性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）が産生する抗原性物質、
タンパクまたはペプチド、タンパク性毒素に対する抗体
に関する。さらに具体的には本発明はＭＲＳＡが産生す
る毒素タンパクであるロイコシジンＦに特異的なモノク
ローナル抗体とその断片、およびそれを産生するハイブ
リドーマに関する。さらに該モノクローナル抗体を使用
するＭＲＳＡが産生する毒素タンパクの検出方法並びに
ＭＲＳＡが産生する毒素タンパク検出用キットに関す
る。
【０００２】
【従来の技術】一般に細菌、特に病原性細菌の検出は困
難であり、しかも時間がかかる厄介な課題である。従
来、多くの方法が提案されているが、迅速かつ簡便に細
菌、特に病原性細菌を検出する方法は確立されていると
は言い難い。
難であり、しかも時間がかかる厄介な課題である。従
来、多くの方法が提案されているが、迅速かつ簡便に細
菌、特に病原性細菌を検出する方法は確立されていると
は言い難い。
【０００３】中でも、ＭＲＳＡ、すなわち、メチシリン
耐性黄色ブドウ球菌は、院内感染の起因菌として１９８
０年代から注目されだし、今日に至るも全世界的にその
対策に苦慮している最重要な病原菌である。１９４０年
代にペニシリンが開発されて以来、病原菌と抗生物質の
開発との間には熾烈な闘いが繰り広げられてきたことは
周知のことである。すなわち、抗生物質が頻用されるに
つれ、その抗生物質に対する耐性菌が現れるようにな
り、ついには多種類の抗生物質、例えば、ペニシリン系
抗生物質のみでなく、クロラムフェニコール、テトラサ
イクリン、アミノ糖抗生物質、サルファ剤などに対して
種々の組み合わせで多剤耐性の病原菌が現れるに至った
のである。その代表的な病原菌がＭＲＳＡである。これ
らの多剤耐性病原菌のほとんどは抗生物質が多用される
病院内で発生し他の患者や医師・看護婦にも感染し、し
かもその治療が困難であるため、世界的に大きな問題と
なっている。
耐性黄色ブドウ球菌は、院内感染の起因菌として１９８
０年代から注目されだし、今日に至るも全世界的にその
対策に苦慮している最重要な病原菌である。１９４０年
代にペニシリンが開発されて以来、病原菌と抗生物質の
開発との間には熾烈な闘いが繰り広げられてきたことは
周知のことである。すなわち、抗生物質が頻用されるに
つれ、その抗生物質に対する耐性菌が現れるようにな
り、ついには多種類の抗生物質、例えば、ペニシリン系
抗生物質のみでなく、クロラムフェニコール、テトラサ
イクリン、アミノ糖抗生物質、サルファ剤などに対して
種々の組み合わせで多剤耐性の病原菌が現れるに至った
のである。その代表的な病原菌がＭＲＳＡである。これ
らの多剤耐性病原菌のほとんどは抗生物質が多用される
病院内で発生し他の患者や医師・看護婦にも感染し、し
かもその治療が困難であるため、世界的に大きな問題と
なっている。
【０００４】現在行われている対策としては、ＭＲＳＡ
の発生をいちはやく発見してその感染を防ぐことに主眼
が置かれており、そのためには、ＭＲＳＡの信頼できか
つ迅速な検出法が不可欠である。しかしながら、信頼で
きかつ迅速に結果を出せるＭＲＳＡ検出法はこれまで開
発に成功していないといわなければならない。
の発生をいちはやく発見してその感染を防ぐことに主眼
が置かれており、そのためには、ＭＲＳＡの信頼できか
つ迅速な検出法が不可欠である。しかしながら、信頼で
きかつ迅速に結果を出せるＭＲＳＡ検出法はこれまで開
発に成功していないといわなければならない。
【０００５】例えば、ＭＲＳＡの検出法として最も信頼
性の高いＰＣＲ法、すなわち、メチシリン感受性の黄色
ブドウ球菌（ＭＳＳＡ）には存在せず、ＭＲＳＡに存在
してβ−ラクタム系抗生物質に対する耐性化に関与して
いる、ｍｅｃＡ遺伝子を増幅して検出する方法は、設備
と熟練した技術者を必要とするうえ、結果がでるまで時
間がかかり迅速性に欠けるという問題点を含んでいる。
性の高いＰＣＲ法、すなわち、メチシリン感受性の黄色
ブドウ球菌（ＭＳＳＡ）には存在せず、ＭＲＳＡに存在
してβ−ラクタム系抗生物質に対する耐性化に関与して
いる、ｍｅｃＡ遺伝子を増幅して検出する方法は、設備
と熟練した技術者を必要とするうえ、結果がでるまで時
間がかかり迅速性に欠けるという問題点を含んでいる。
【０００６】また、現在一般に使用されているＷＨＯや
米国ＮＣＣＬＳ推奨の「ディスク拡散法」、日本化学療
法学会抗菌薬感受性測定検討委員会設定の「ＭＩＣ測定
法」、ＮＣＣＬＳ推奨の「ＭＲＳＡスクリーン寒天培地
法」はいずれもＰＣＲ法に比べ信頼性に乏しく、しかも
通常の黄色ブドウ球菌同定プロセスとＭＲＳＡの検出プ
ロセスという２段階のプロセスを経るため、結果がでる
まで２日以上を要し迅速性に欠けるという問題点を含ん
でいる。
米国ＮＣＣＬＳ推奨の「ディスク拡散法」、日本化学療
法学会抗菌薬感受性測定検討委員会設定の「ＭＩＣ測定
法」、ＮＣＣＬＳ推奨の「ＭＲＳＡスクリーン寒天培地
法」はいずれもＰＣＲ法に比べ信頼性に乏しく、しかも
通常の黄色ブドウ球菌同定プロセスとＭＲＳＡの検出プ
ロセスという２段階のプロセスを経るため、結果がでる
まで２日以上を要し迅速性に欠けるという問題点を含ん
でいる。
【０００７】従って、患者検体等からＭＲＳＡを検出す
るための信頼できる迅速なＭＲＳＡ検出法の開発が強く
望まれている。
るための信頼できる迅速なＭＲＳＡ検出法の開発が強く
望まれている。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】本発明の第１の目的
は、ＭＲＳＡの検出に使用できるモノクローナル抗体、
すなわち、ＭＲＳＡまたはその産生物に特異的なモノク
ローナル抗体および抗体活性を有するそのＦａｂフラグ
メントを提供することにある。本発明の第２の目的は、
上記モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを提
供することにある。本発明の第３の目的は上記モノクロ
ーナル抗体を用いる迅速かつ簡易でしかも信頼性の高い
ＭＲＳＡが産生する毒素タンパクの検出法を提供するこ
とにある。本発明の第４の目的は上記ＭＲＳＡが産生す
る毒素タンパクの検出法に使用するための患者検体に直
接適用できるＭＲＳＡが産生する毒素タンパク検出キッ
トを提供することにある。
は、ＭＲＳＡの検出に使用できるモノクローナル抗体、
すなわち、ＭＲＳＡまたはその産生物に特異的なモノク
ローナル抗体および抗体活性を有するそのＦａｂフラグ
メントを提供することにある。本発明の第２の目的は、
上記モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを提
供することにある。本発明の第３の目的は上記モノクロ
ーナル抗体を用いる迅速かつ簡易でしかも信頼性の高い
ＭＲＳＡが産生する毒素タンパクの検出法を提供するこ
とにある。本発明の第４の目的は上記ＭＲＳＡが産生す
る毒素タンパクの検出法に使用するための患者検体に直
接適用できるＭＲＳＡが産生する毒素タンパク検出キッ
トを提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明者らはＭＲＳＡを
迅速に検出するため、ＭＲＳＡが産生するタンパクを標
的とするモノクローナル抗体の作成を試みた。このよう
なＭＲＳＡが産生するタンパクとしては、例えば、ｍｅ
ｃＡ遺伝子の発現タンパクであるＰＢＰ−２’やＭＲＳ
Ａに起因する病態を誘発する直接の原因物質であるタン
パク性毒素、ロイコシジンＦを挙げることができる。
迅速に検出するため、ＭＲＳＡが産生するタンパクを標
的とするモノクローナル抗体の作成を試みた。このよう
なＭＲＳＡが産生するタンパクとしては、例えば、ｍｅ
ｃＡ遺伝子の発現タンパクであるＰＢＰ−２’やＭＲＳ
Ａに起因する病態を誘発する直接の原因物質であるタン
パク性毒素、ロイコシジンＦを挙げることができる。
【００１０】ロイコシジンＦはヒトの多核および単核白
血球を崩壊させる白血球溶解毒であって、メチシリン耐
性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）が産生するアミノ酸約３
００個からなるタンパクである。ＭＲＳＡ培養液からロ
イコシジンＦを精製する方法は神尾らにより確立されて
いる（Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．５７，２１９８−２１９９（１９９３））。
血球を崩壊させる白血球溶解毒であって、メチシリン耐
性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）が産生するアミノ酸約３
００個からなるタンパクである。ＭＲＳＡ培養液からロ
イコシジンＦを精製する方法は神尾らにより確立されて
いる（Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．５７，２１９８−２１９９（１９９３））。
【００１１】本発明者らはロイコシジンＦを標的タンパ
クとして選び、この毒素タンパクに対する抗体を産生す
る細胞とミエローマ細胞からこの毒素タンパクに対する
モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを作成
し、選別し、培養することにより、ロイコシジンＦに特
異的なモノクローナル抗体を取得することに成功した。
さらに、上記モノクローナル抗体を標識化し、標識イム
ノアッセイによりロイコシジンＦの検出を行ったところ
簡易かつ迅速にロイコシジンＦを検出することが可能で
あること、すなわち、ＭＲＳＡが産生する毒素の検出が
可能であることを発見した。本発明は以上の事実に基づ
いて完成するに至ったものである。
クとして選び、この毒素タンパクに対する抗体を産生す
る細胞とミエローマ細胞からこの毒素タンパクに対する
モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを作成
し、選別し、培養することにより、ロイコシジンＦに特
異的なモノクローナル抗体を取得することに成功した。
さらに、上記モノクローナル抗体を標識化し、標識イム
ノアッセイによりロイコシジンＦの検出を行ったところ
簡易かつ迅速にロイコシジンＦを検出することが可能で
あること、すなわち、ＭＲＳＡが産生する毒素の検出が
可能であることを発見した。本発明は以上の事実に基づ
いて完成するに至ったものである。
【００１２】即ち、本発明の要旨は、（１） ＭＲＳＡ
が産生する毒素に特異的に結合する能力を有する抗体を
使用するＭＲＳＡが産生する毒素タンパクの検出方法、
（２） ＭＲＳＡが産生する毒素タンパクに特異的なモ
ノクローナル抗体、（３） ＭＲＳＡが産生する毒素タ
ンパク、ロイコシジンＦに特異的なモノクローナル抗
体、（４） ＭＲＳＡが産生する毒素タンパク、ロイコ
シジンＦで免疫した動物細胞と該動物のミエローマ細胞
との細胞融合により作成されたハイブリドーマによって
産生され、ロイコシジンＦに特異的に結合する能力を有
するモノクローナル抗体、（５） 上記ハイブリドーマ
が受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−６６６９として工業技術院
生命工学工業技術研究所に寄託されたハイブリドーマで
ある前記（４）記載のモノクローナル抗体、（６） 前
記（２）〜（５）いずれかに記載のモノクローナル抗体
から得られる断片であって、ロイコシジンＦと結合する
活性を有する断片、（７） 標識化された、前記（２）
〜（５）いずれかに記載のモノクローナル抗体、（８）
酵素、放射性同位元素、蛍光色素、ビオチン、染料ゾ
ル、金コロイドおよび着色ラテックスからなる群より選
択される少なくとも一つにより標識化された、前記
（２）〜（５）いずれかに記載のモノクローナル抗体、
（９） 酵素、放射性同位元素、蛍光色素、ビオチン、
染料ゾル、金コロイドおよび着色ラテックスからなる群
より選択される少なくとも一つにより標識化された、前
記（６）記載のモノクローナル抗体の断片、（１０）
酵素により標識化された、前記（２）〜（５）いずれか
に記載のモノクローナル抗体、（１１） 蛍光色素によ
り標識化された、前記（２）〜（５）いずれかに記載の
モノクローナル抗体、（１２） ビオチンにより標識化
された、前記（２）〜（５）いずれかに記載のモノクロ
ーナル抗体、（１３） 前記（２）〜（５）いずれかに
記載のモノクローナル抗体および／または前記（７）、
（８）、（１０）〜（１２）いずれかに記載の標識化モ
ノクローナル抗体を使用するＭＲＳＡが産生する毒素の
検出方法、（１４） 前記（３）〜（５）いずれかに記
載のモノクローナル抗体および／または前記（１０）〜
（１２）いずれかに記載の標識化モノクローナル抗体を
使用するＭＲＳＡが産生する毒素の検出方法、（１５）
前記（６）記載のモノクローナル抗体断片および／ま
たは前記（９）記載の標識化モノクローナル抗体断片を
使用するＭＲＳＡが産生する毒素の検出方法、（１６）
前記（２）〜（５）いずれかに記載のモノクローナル
抗体および／または前記（７）、（８）、（１０）〜
（１２）いずれかに記載の標識化モノクローナル抗体を
含むＭＲＳＡが産生する毒素の検出用キット、（１７）
前記（３）〜（５）いずれかに記載のモノクローナル
抗体および／または前記（１０）〜（１２）いずれかに
記載の標識化モノクローナル抗体を含むＭＲＳＡが産生
する毒素の検出用キット、（１８） 前記（２）〜
（５）いずれかに記載のモノクローナル抗体、前記
（７）、（８）、（１０）〜（１２）いずれかに記載の
標識化モノクローナル抗体、ニトロセルローズ膜片およ
び緩衝液を含むＭＲＳＡが産生する毒素の検出用キッ
ト、（１９） 前記（３）〜（５）いずれかに記載のモ
ノクローナル抗体、前記（１０）〜（１２）いずれかに
記載の標識化モノクローナル抗体、ニトロセルローズ膜
片および緩衝液を含むＭＲＳＡが産生する毒素の検出用
キット、並びに（２０） ＭＲＳＡが産生する毒素タン
パク、ロイコシジンＦに特異的なモノクローナル抗体を
産生するハイブリドーマ、に関する。
が産生する毒素に特異的に結合する能力を有する抗体を
使用するＭＲＳＡが産生する毒素タンパクの検出方法、
（２） ＭＲＳＡが産生する毒素タンパクに特異的なモ
ノクローナル抗体、（３） ＭＲＳＡが産生する毒素タ
ンパク、ロイコシジンＦに特異的なモノクローナル抗
体、（４） ＭＲＳＡが産生する毒素タンパク、ロイコ
シジンＦで免疫した動物細胞と該動物のミエローマ細胞
との細胞融合により作成されたハイブリドーマによって
産生され、ロイコシジンＦに特異的に結合する能力を有
するモノクローナル抗体、（５） 上記ハイブリドーマ
が受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−６６６９として工業技術院
生命工学工業技術研究所に寄託されたハイブリドーマで
ある前記（４）記載のモノクローナル抗体、（６） 前
記（２）〜（５）いずれかに記載のモノクローナル抗体
から得られる断片であって、ロイコシジンＦと結合する
活性を有する断片、（７） 標識化された、前記（２）
〜（５）いずれかに記載のモノクローナル抗体、（８）
酵素、放射性同位元素、蛍光色素、ビオチン、染料ゾ
ル、金コロイドおよび着色ラテックスからなる群より選
択される少なくとも一つにより標識化された、前記
（２）〜（５）いずれかに記載のモノクローナル抗体、
（９） 酵素、放射性同位元素、蛍光色素、ビオチン、
染料ゾル、金コロイドおよび着色ラテックスからなる群
より選択される少なくとも一つにより標識化された、前
記（６）記載のモノクローナル抗体の断片、（１０）
酵素により標識化された、前記（２）〜（５）いずれか
に記載のモノクローナル抗体、（１１） 蛍光色素によ
り標識化された、前記（２）〜（５）いずれかに記載の
モノクローナル抗体、（１２） ビオチンにより標識化
された、前記（２）〜（５）いずれかに記載のモノクロ
ーナル抗体、（１３） 前記（２）〜（５）いずれかに
記載のモノクローナル抗体および／または前記（７）、
（８）、（１０）〜（１２）いずれかに記載の標識化モ
ノクローナル抗体を使用するＭＲＳＡが産生する毒素の
検出方法、（１４） 前記（３）〜（５）いずれかに記
載のモノクローナル抗体および／または前記（１０）〜
（１２）いずれかに記載の標識化モノクローナル抗体を
使用するＭＲＳＡが産生する毒素の検出方法、（１５）
前記（６）記載のモノクローナル抗体断片および／ま
たは前記（９）記載の標識化モノクローナル抗体断片を
使用するＭＲＳＡが産生する毒素の検出方法、（１６）
前記（２）〜（５）いずれかに記載のモノクローナル
抗体および／または前記（７）、（８）、（１０）〜
（１２）いずれかに記載の標識化モノクローナル抗体を
含むＭＲＳＡが産生する毒素の検出用キット、（１７）
前記（３）〜（５）いずれかに記載のモノクローナル
抗体および／または前記（１０）〜（１２）いずれかに
記載の標識化モノクローナル抗体を含むＭＲＳＡが産生
する毒素の検出用キット、（１８） 前記（２）〜
（５）いずれかに記載のモノクローナル抗体、前記
（７）、（８）、（１０）〜（１２）いずれかに記載の
標識化モノクローナル抗体、ニトロセルローズ膜片およ
び緩衝液を含むＭＲＳＡが産生する毒素の検出用キッ
ト、（１９） 前記（３）〜（５）いずれかに記載のモ
ノクローナル抗体、前記（１０）〜（１２）いずれかに
記載の標識化モノクローナル抗体、ニトロセルローズ膜
片および緩衝液を含むＭＲＳＡが産生する毒素の検出用
キット、並びに（２０） ＭＲＳＡが産生する毒素タン
パク、ロイコシジンＦに特異的なモノクローナル抗体を
産生するハイブリドーマ、に関する。
【００１３】
【発明の実施の形態】以下に本発明についてＭＲＳＡを
具体的に取り上げ、詳細に説明する。
具体的に取り上げ、詳細に説明する。
【００１４】本発明の第１の目的であるＭＲＳＡまたは
その生産物に特異的なモノクローナル抗体は、ＭＲＳＡ
が産生する毒素タンパク、ロイコシジンＦに対して特異
的な抗体を産生するハイブリドーマを適当な条件の下で
培養し、得られる培養液から分離・精製して得ることが
できる。また、ハイブリドーマをマウス腹腔内に移植し
て得られる腹水からも分離・精製することができる。
その生産物に特異的なモノクローナル抗体は、ＭＲＳＡ
が産生する毒素タンパク、ロイコシジンＦに対して特異
的な抗体を産生するハイブリドーマを適当な条件の下で
培養し、得られる培養液から分離・精製して得ることが
できる。また、ハイブリドーマをマウス腹腔内に移植し
て得られる腹水からも分離・精製することができる。
【００１５】上記のハイブリドーマは、ロイコシジンＦ
に対する抗体を産生する細胞とミエローマ細胞とを融合
させることにより得ることができる。
に対する抗体を産生する細胞とミエローマ細胞とを融合
させることにより得ることができる。
【００１６】ロイコシジンＦに対する抗体を産生する細
胞の取得は、例えば、ロイコシジンＦの精製標品または
部分精製標品を適当なアジュバント、例えばＲＩＢＩア
ジュバントと共に適当なマウス、例えば、ＢＡＬＢ／ｃ
マウスに適当な間隔で複数回腹腔内注射し、好ましく
は、さらにミエローマ細胞との融合の３日前に、ロイコ
シジンＦのみを静脈内に注射し、ついで常法に従って、
脾臓を摘出し、そこから脾臓細胞を単離し、ロイコシジ
ンＦに対して抗体を産生する細胞を取得することにより
行うことができる。
胞の取得は、例えば、ロイコシジンＦの精製標品または
部分精製標品を適当なアジュバント、例えばＲＩＢＩア
ジュバントと共に適当なマウス、例えば、ＢＡＬＢ／ｃ
マウスに適当な間隔で複数回腹腔内注射し、好ましく
は、さらにミエローマ細胞との融合の３日前に、ロイコ
シジンＦのみを静脈内に注射し、ついで常法に従って、
脾臓を摘出し、そこから脾臓細胞を単離し、ロイコシジ
ンＦに対して抗体を産生する細胞を取得することにより
行うことができる。
【００１７】ミエローマ細胞は、８−アザグアニン耐性
の株を大阪大学微生物病研究所、杉本 央博士より分与
を受けた。
の株を大阪大学微生物病研究所、杉本 央博士より分与
を受けた。
【００１８】細胞融合はポリエチレングリコール（ＰＥ
Ｇ）法やセンダイウイルス法などが普通に用いられる。
ポリエチレングリコール法の場合は、常法に従って、例
えば、ミエローマ細胞と脾臓細胞を適当な割合で混合し
た後、ポリエチレングリコール（例えば、メルク社製、
重合度４０００）で処理することにより行うことができ
る。
Ｇ）法やセンダイウイルス法などが普通に用いられる。
ポリエチレングリコール法の場合は、常法に従って、例
えば、ミエローマ細胞と脾臓細胞を適当な割合で混合し
た後、ポリエチレングリコール（例えば、メルク社製、
重合度４０００）で処理することにより行うことができ
る。
【００１９】また、常法に従って、電気的処理により細
胞融合を行わせることもできる。
胞融合を行わせることもできる。
【００２０】上記のようにして細胞融合処理により得ら
れた細胞群からハイブリドーマを選別するには、常法に
従って、ＨＡＴ培地を使用し生育する細胞を選択する。
れた細胞群からハイブリドーマを選別するには、常法に
従って、ＨＡＴ培地を使用し生育する細胞を選択する。
【００２１】ＨＡＴ培地とは、一般に、ヒポキサンチン
（Ｈ）、アミノプテリン（Ａ）およびチミジン（Ｔ）を
含む細胞培養培地をいうが、市販品（例えば、ベーリン
ガー・マンハイム社製）を使用することもできる。例え
ば、市販のＨＡＴ培地と牛胎児血清を添加したダルベッ
コ変法イーグル培地を混合してＨＡＴ培地として使用す
ることができる。ＰＥＧ処理後の細胞をＨＡＴ培地に懸
濁し、９６穴プレートを用いて培養し、３〜４日毎に半
量の培地を交換し、生育する細胞を取得する。
（Ｈ）、アミノプテリン（Ａ）およびチミジン（Ｔ）を
含む細胞培養培地をいうが、市販品（例えば、ベーリン
ガー・マンハイム社製）を使用することもできる。例え
ば、市販のＨＡＴ培地と牛胎児血清を添加したダルベッ
コ変法イーグル培地を混合してＨＡＴ培地として使用す
ることができる。ＰＥＧ処理後の細胞をＨＡＴ培地に懸
濁し、９６穴プレートを用いて培養し、３〜４日毎に半
量の培地を交換し、生育する細胞を取得する。
【００２２】ＨＡＴ培地に生育しうる細胞の中から目的
のロイコシジンＦに特異的なモノクローナル抗体を産生
するハイブリドーマを選別するには、常法に従って、標
識免疫検定法、例えば、ＥＬＩＳＡ（酵素免疫検定法）
やＲＩＡ（ラジオイムノアッセイ法）を利用することが
できる。例えば、ＥＬＩＳＡプレートにロイコシジンＦ
を吸着させ、ブロックして非特異的吸着を防止した後、
ハイブリドーマ培養上清を添加し、排液・洗浄した後、
標識化抗マウス抗体を含む溶液を添加し、排液・洗浄し
た後、標識の検出を行い、陽性のハイブリドーマを選別
する。
のロイコシジンＦに特異的なモノクローナル抗体を産生
するハイブリドーマを選別するには、常法に従って、標
識免疫検定法、例えば、ＥＬＩＳＡ（酵素免疫検定法）
やＲＩＡ（ラジオイムノアッセイ法）を利用することが
できる。例えば、ＥＬＩＳＡプレートにロイコシジンＦ
を吸着させ、ブロックして非特異的吸着を防止した後、
ハイブリドーマ培養上清を添加し、排液・洗浄した後、
標識化抗マウス抗体を含む溶液を添加し、排液・洗浄し
た後、標識の検出を行い、陽性のハイブリドーマを選別
する。
【００２３】このようにして選別されたハイブリドーマ
の中から、例えば限界希釈法によってクローニングする
ことにより、ＭＲＳＡの産生する毒素タンパクに特異的
なモノクローナル抗体を産生する単一のハイブリドーマ
を取得することができる。
の中から、例えば限界希釈法によってクローニングする
ことにより、ＭＲＳＡの産生する毒素タンパクに特異的
なモノクローナル抗体を産生する単一のハイブリドーマ
を取得することができる。
【００２４】上記のようにして得られた本発明のＭＲＳ
Ａの産生する毒素タンパクに特異的なモノクローナル抗
体産生ハイブリドーマ株としては、具体的には、ＡＬｕ
ｋＦ３−１、ＡＬｕｋＦ４−２、ＡＬｕｋＦ５−１およ
びＡＬｕｋＦ６−１が挙げられ、そのうちＡＬｕｋＦ３
−１については、通商産業省工業技術院生命工学工業技
術研究所に受託番号、ＦＥＲＭ ＢＰ−６６６９として
寄託されている。
Ａの産生する毒素タンパクに特異的なモノクローナル抗
体産生ハイブリドーマ株としては、具体的には、ＡＬｕ
ｋＦ３−１、ＡＬｕｋＦ４−２、ＡＬｕｋＦ５−１およ
びＡＬｕｋＦ６−１が挙げられ、そのうちＡＬｕｋＦ３
−１については、通商産業省工業技術院生命工学工業技
術研究所に受託番号、ＦＥＲＭ ＢＰ−６６６９として
寄託されている。
【００２５】上記のようにして得られたハイブリドーマ
は次のようにしてイン・ビトロまたはイン・ビボで培養
して目的のモノクローナル抗体を産生させることができ
る。
は次のようにしてイン・ビトロまたはイン・ビボで培養
して目的のモノクローナル抗体を産生させることができ
る。
【００２６】イン・ビトロでの培養法。例えば、約５％
の二酸化炭素を含む空気中で、適当な動物細胞用培地に
牛胎児血清を約１０〜１５容量％の濃度となるように添
加して調製した培地中で約３７℃で培養することによ
り、そのハイブリドーマの増殖に伴い目的のモノクロー
ナル抗体が産生される。
の二酸化炭素を含む空気中で、適当な動物細胞用培地に
牛胎児血清を約１０〜１５容量％の濃度となるように添
加して調製した培地中で約３７℃で培養することによ
り、そのハイブリドーマの増殖に伴い目的のモノクロー
ナル抗体が産生される。
【００２７】イン・ビボでの培養法。ハイブリドーマ株
をマウスの体内、例えば腹腔内に移植し、そのマウスを
飼育することにより、そのハイブリドーマの増殖に伴い
そのマウスの体内に目的のモノクローナル抗体が産生さ
れる。
をマウスの体内、例えば腹腔内に移植し、そのマウスを
飼育することにより、そのハイブリドーマの増殖に伴い
そのマウスの体内に目的のモノクローナル抗体が産生さ
れる。
【００２８】上記のイン・ビトロ培養で得られた培養上
清またはイン・ビボ培養で得られたマウスの腹水、血清
などの体液から目的のモノクローナル抗体を分離・精製
するには通常のタンパクの分離精製法に従って次のよう
な処理を行う。
清またはイン・ビボ培養で得られたマウスの腹水、血清
などの体液から目的のモノクローナル抗体を分離・精製
するには通常のタンパクの分離精製法に従って次のよう
な処理を行う。
【００２９】例えば、硫酸アンモニウムなどの塩を用い
る塩析、限外濾過、セファクリルＳ−３００ＨＲなどに
よるゲル濾過、ゲル浸透クロマトグラフィー、アフィニ
ティクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィ
ーなどを適宜組み合わせて精製を行う。ただし、抗体の
精製には、抗体に特異的に結合するプロテインＡによる
アフィニティクロマトグラフィーが特に有用である。
る塩析、限外濾過、セファクリルＳ−３００ＨＲなどに
よるゲル濾過、ゲル浸透クロマトグラフィー、アフィニ
ティクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィ
ーなどを適宜組み合わせて精製を行う。ただし、抗体の
精製には、抗体に特異的に結合するプロテインＡによる
アフィニティクロマトグラフィーが特に有用である。
【００３０】上記の方法で得られたモノクローナル抗体
は、常法に従って、パパイン等で消化して、Ｆａｂフラ
グメントとＦｃフラグメントに分離し、ロイコシジンＦ
結合活性を有するＦａｂフラグメントを単離することが
できる。Ｆａｂフラグメントの精製には未反応のモノク
ローナルおよびＦｃとは強く結合するが、Ｆａｂには結
合しないプロテインＡによるアフィニティクロマトグラ
フィーを用いるのが便利である。
は、常法に従って、パパイン等で消化して、Ｆａｂフラ
グメントとＦｃフラグメントに分離し、ロイコシジンＦ
結合活性を有するＦａｂフラグメントを単離することが
できる。Ｆａｂフラグメントの精製には未反応のモノク
ローナルおよびＦｃとは強く結合するが、Ｆａｂには結
合しないプロテインＡによるアフィニティクロマトグラ
フィーを用いるのが便利である。
【００３１】上記の方法で得られたモノクローナル抗体
およびそのＦａｂフラグメントは、抗体の標識化に通常
使用される種々の方法で標識化することができる。例え
ば、酵素、放射性同位元素、蛍光物質、ビオチン等で標
識化することができ、あるいは染料ゾル、金コロイド、
着色ラテックスなどで可視的に標識することも可能であ
る。
およびそのＦａｂフラグメントは、抗体の標識化に通常
使用される種々の方法で標識化することができる。例え
ば、酵素、放射性同位元素、蛍光物質、ビオチン等で標
識化することができ、あるいは染料ゾル、金コロイド、
着色ラテックスなどで可視的に標識することも可能であ
る。
【００３２】酵素標識に使用し得る酵素の例としては、
ペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、チロシナ
ーゼ、酸性ホスファターゼ、アルカリ性ホスファターゼ
などを挙げることができる。これらの酵素はいずれも酵
素標識検定法によく使用されており、常法に従ってモノ
クローナル抗体の酵素標識を行うことができる。
ペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、チロシナ
ーゼ、酸性ホスファターゼ、アルカリ性ホスファターゼ
などを挙げることができる。これらの酵素はいずれも酵
素標識検定法によく使用されており、常法に従ってモノ
クローナル抗体の酵素標識を行うことができる。
【００３３】また、放射標識に使用する放射性同位元素
としては、１２５Ｉ、１４Ｃ、３Ｈなどを挙げることが
できる。
としては、１２５Ｉ、１４Ｃ、３Ｈなどを挙げることが
できる。
【００３４】蛍光標識に使用する蛍光色素としては、フ
ルオレシン・イソ・チオシアネート（ＦＩＴＣ）、テト
ラメチルローダミン・イソ・チオシアネート（ＲＩＴ
Ｃ）などを挙げることができる。
ルオレシン・イソ・チオシアネート（ＦＩＴＣ）、テト
ラメチルローダミン・イソ・チオシアネート（ＲＩＴ
Ｃ）などを挙げることができる。
【００３５】上記のようにして得られた本発明のモノク
ローナル抗体は患者検体中のロイコシジンＦの存在の迅
速検出に極めて便利に使用することが可能となる。
ローナル抗体は患者検体中のロイコシジンＦの存在の迅
速検出に極めて便利に使用することが可能となる。
【００３６】例えば、適当な固体に結合させた本発明の
モノクローナル抗体を患者検体に接触させ、ついで本発
明の標識化モノクローナル抗体と接触させた後、適当な
方法でその標識を検出することにより、陽性の患者検体
はＭＲＳＡが産生する毒素タンパクを含む検体であると
判定することができる。
モノクローナル抗体を患者検体に接触させ、ついで本発
明の標識化モノクローナル抗体と接触させた後、適当な
方法でその標識を検出することにより、陽性の患者検体
はＭＲＳＡが産生する毒素タンパクを含む検体であると
判定することができる。
【００３７】上記の適当な固体とは、通常、患者検体ま
たは患者検体を含む液体または懸濁液に浸漬したときに
溶解せず、そして容易にこれらの液体または懸濁液から
分離し、洗浄することができる固形物を指し、紙片、布
片、合成樹脂片、またはこれらの粒子などであって、適
当な方法でモノクローナル抗体を結合させることができ
るものであれば本発明に使用することができる。
たは患者検体を含む液体または懸濁液に浸漬したときに
溶解せず、そして容易にこれらの液体または懸濁液から
分離し、洗浄することができる固形物を指し、紙片、布
片、合成樹脂片、またはこれらの粒子などであって、適
当な方法でモノクローナル抗体を結合させることができ
るものであれば本発明に使用することができる。
【００３８】本発明のモノクローナル抗体を固体に結合
させる方法としては、水溶液中で容易に脱離しない程度
に結合させうる方法であれば特に制限なく使用でき、抗
体と担体とを結合させるために通常使用される方法、例
えば、モノクローナル抗体含有液をニトロセルローズ膜
片に滴下し乾燥させたる方法、モノクローナル抗体と固
体を構成する化合物とを直接または二官能性のスペーサ
ー（例えば、グルタルアルデヒドなど）などを介して共
有結合させる方法などが好ましい。
させる方法としては、水溶液中で容易に脱離しない程度
に結合させうる方法であれば特に制限なく使用でき、抗
体と担体とを結合させるために通常使用される方法、例
えば、モノクローナル抗体含有液をニトロセルローズ膜
片に滴下し乾燥させたる方法、モノクローナル抗体と固
体を構成する化合物とを直接または二官能性のスペーサ
ー（例えば、グルタルアルデヒドなど）などを介して共
有結合させる方法などが好ましい。
【００３９】上記の標識を検出する適当な方法とは、標
識が酵素標識の場合はその酵素の適当な発色性基質を含
む溶液と接触させる方法、放射標識の場合は放射能をカ
ウントする方法、蛍光標識の場合は蛍光を測定する方
法、ビオチンの場合は標識化アビジン誘導体と結合させ
た後標識を検出する方法など、通常標識免疫検定法にお
いて常用されている方法を指している。
識が酵素標識の場合はその酵素の適当な発色性基質を含
む溶液と接触させる方法、放射標識の場合は放射能をカ
ウントする方法、蛍光標識の場合は蛍光を測定する方
法、ビオチンの場合は標識化アビジン誘導体と結合させ
た後標識を検出する方法など、通常標識免疫検定法にお
いて常用されている方法を指している。
【００４０】さらに、本発明は上記のロイコシジンＦに
特異的な標識化モノクローナル抗体および／またはその
未標識モノクローナル抗体を用いる本発明のＭＲＳＡが
産生する毒素タンパクの検出法に使用できる簡便なキッ
トを提供することができる。
特異的な標識化モノクローナル抗体および／またはその
未標識モノクローナル抗体を用いる本発明のＭＲＳＡが
産生する毒素タンパクの検出法に使用できる簡便なキッ
トを提供することができる。
【００４１】このキットは、上記の本発明のＭＲＳＡが
産生する毒素タンパクの検出法に使用される試薬類およ
び反応溶液をすべて含み、ＭＲＳＡが産生する毒素タン
パクを含むと思われる検体さえあれば、直ちにＭＲＳＡ
が産生する毒素タンパクの検出を行うことができるキッ
トである。
産生する毒素タンパクの検出法に使用される試薬類およ
び反応溶液をすべて含み、ＭＲＳＡが産生する毒素タン
パクを含むと思われる検体さえあれば、直ちにＭＲＳＡ
が産生する毒素タンパクの検出を行うことができるキッ
トである。
【００４２】例えば、本発明のロイコシジンＦに特異的
な標識化モノクローナル抗体および例えば紙片、布片、
合成樹脂片または粒子などの固体片に結合させて固定化
した本発明のモノクローナル抗体、またはニトロセルロ
ーズ膜片と標識化モノクローナル抗体との組み合わせの
ように容易に固定化モノクローナル抗体を調製できる組
み合わせ並びに反応用緩衝液からなるキットがその１例
である。
な標識化モノクローナル抗体および例えば紙片、布片、
合成樹脂片または粒子などの固体片に結合させて固定化
した本発明のモノクローナル抗体、またはニトロセルロ
ーズ膜片と標識化モノクローナル抗体との組み合わせの
ように容易に固定化モノクローナル抗体を調製できる組
み合わせ並びに反応用緩衝液からなるキットがその１例
である。
【００４３】このキットを使用するには、まず、患者検
体を反応用緩衝液と適当に混ぜ、この溶液中に、本発明
のモノクローナル抗体を結合させた固体片、例えば予め
ＣＮＢｒで活性化されたセルローズに常法に従って本発
明のモノクローナル抗体を結合させて調製した固定化モ
ノクローナル抗体またはニトロセルローズ膜片に本発明
のモノクローナル抗体を固定化したもの、を浸漬して検
体中のロイコシジンＦとモノクローナル抗体との複合体
を形成させた後、この固体片（固定化モノクローナル抗
体）を溶液から分離し、ついで緩衝液中で洗浄した後、
標識化モノクローナル抗体を含む反応用緩衝液中に浸漬
して標識化モノクローナル抗体−ロイコシジンＦ−固定
化モノクローナル抗体複合体を形成させる。得られた固
体片を適当な標識検出法を用いて固体片にロイコシジン
Ｆを介して結合している標識化モノクローナル抗体の標
識を検出する。
体を反応用緩衝液と適当に混ぜ、この溶液中に、本発明
のモノクローナル抗体を結合させた固体片、例えば予め
ＣＮＢｒで活性化されたセルローズに常法に従って本発
明のモノクローナル抗体を結合させて調製した固定化モ
ノクローナル抗体またはニトロセルローズ膜片に本発明
のモノクローナル抗体を固定化したもの、を浸漬して検
体中のロイコシジンＦとモノクローナル抗体との複合体
を形成させた後、この固体片（固定化モノクローナル抗
体）を溶液から分離し、ついで緩衝液中で洗浄した後、
標識化モノクローナル抗体を含む反応用緩衝液中に浸漬
して標識化モノクローナル抗体−ロイコシジンＦ−固定
化モノクローナル抗体複合体を形成させる。得られた固
体片を適当な標識検出法を用いて固体片にロイコシジン
Ｆを介して結合している標識化モノクローナル抗体の標
識を検出する。
【００４４】また、実施例４に示すＭＲＳＡの産生する
毒素タンパクの検出法に使用するＭＲＳＡの産生する毒
素タンパク検出用キットの場合、キットは未標識モノク
ローナル抗体、ペルオキシダーゼ標識モノクローナル抗
体、１５％希釈牛胎児血清、ＰＢＳ、０．０５％トゥイ
ーン２０添加ＰＢＳ、過酸化水素とｏ−フェニレンジア
ミンを含む溶液、１Ｎ−硫酸から構成される。この検出
法では、キットの他に、ＥＬＩＳＡプレートと比色計が
必要となる。
毒素タンパクの検出法に使用するＭＲＳＡの産生する毒
素タンパク検出用キットの場合、キットは未標識モノク
ローナル抗体、ペルオキシダーゼ標識モノクローナル抗
体、１５％希釈牛胎児血清、ＰＢＳ、０．０５％トゥイ
ーン２０添加ＰＢＳ、過酸化水素とｏ−フェニレンジア
ミンを含む溶液、１Ｎ−硫酸から構成される。この検出
法では、キットの他に、ＥＬＩＳＡプレートと比色計が
必要となる。
【００４５】本発明のＭＲＳＡの産生する毒素タンパク
の検出法または本発明のＭＲＳＡの毒素タンパクの検出
キットを使用することにより、今日まで困難であった院
内感染の起因菌であるＭＲＳＡの毒素タンパクの迅速な
検出が極めて容易になる。本発明の方法の信頼性は実施
例に示すように、極めて高いものである。
の検出法または本発明のＭＲＳＡの毒素タンパクの検出
キットを使用することにより、今日まで困難であった院
内感染の起因菌であるＭＲＳＡの毒素タンパクの迅速な
検出が極めて容易になる。本発明の方法の信頼性は実施
例に示すように、極めて高いものである。
【００４６】
【実施例】以下、実施例、参考例により本発明をさらに
詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例等によりな
んら限定されるものではない。
詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例等によりな
んら限定されるものではない。
【００４７】（参考例１） ロイコシジンＦの採取 ＭＲＳＡ（メチシリン耐性黄色ブドウ球菌）ＲＩＭＤ３
１０９２５株をハートインフュージョン培地（１０００
ｍｌ）中、酸素：二酸化炭素（８０：２０）の気流で曝
気しつつ、３７℃で２０時間培養した。培養液の遠心上
清に、ヒドロキシアパタイトを加えてタンパク質を吸着
させ、洗浄した後、０．８Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．
０）で溶出した。溶出画分について、ＴＳＫゲルＳＰ−
５ＰＷ（トーソー社製）を用いてクロマトグラフィーを
行い、精製ロイコシジンＦ（３．６ｍｇ）を得た。
１０９２５株をハートインフュージョン培地（１０００
ｍｌ）中、酸素：二酸化炭素（８０：２０）の気流で曝
気しつつ、３７℃で２０時間培養した。培養液の遠心上
清に、ヒドロキシアパタイトを加えてタンパク質を吸着
させ、洗浄した後、０．８Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．
０）で溶出した。溶出画分について、ＴＳＫゲルＳＰ−
５ＰＷ（トーソー社製）を用いてクロマトグラフィーを
行い、精製ロイコシジンＦ（３．６ｍｇ）を得た。
【００４８】（実施例１） 本発明のハイブリドーマの取得 （１） 抗体を産生する細胞の取得 ロイコシジンＦによるマウスの免疫化。 ＢＡＬＢ／ｃ雄マウスに精製ロイコシジンＦ１０μｇを
ＲＩＢＩアジュバント０．２ｍｌと共に腹腔内に１４日
間隔で２回注射した。１４日後（ミエローマ細胞との融
合実験の３日前）にロイコシジンＦのみを１０μｇ尾静
脈内に注射してマウスをロイコシジンＦで免疫した。
ＲＩＢＩアジュバント０．２ｍｌと共に腹腔内に１４日
間隔で２回注射した。１４日後（ミエローマ細胞との融
合実験の３日前）にロイコシジンＦのみを１０μｇ尾静
脈内に注射してマウスをロイコシジンＦで免疫した。
【００４９】ついで、エーテルで死亡させた免疫マウス
から脾臓を摘出した。２１Ｇの注射針で１０ヵ所程度脾
臓を刺し、注射針をセットした注射器でダルベッコ変法
イーグル培地４０ｍｌを脾臓に注入し、脾臓細胞を遊出
させ、回収して、ロイコシジンＦに対する抗体を産生す
る細胞を取得した。
から脾臓を摘出した。２１Ｇの注射針で１０ヵ所程度脾
臓を刺し、注射針をセットした注射器でダルベッコ変法
イーグル培地４０ｍｌを脾臓に注入し、脾臓細胞を遊出
させ、回収して、ロイコシジンＦに対する抗体を産生す
る細胞を取得した。
【００５０】（２） ロイコシジンＦに特異的なモノク
ローナルを産生するハイブリドーマの取得 使用したミエローマ細胞（Ｘ６３−Ａｇ８−６．５．
３）は大阪大学微生物病研究所、杉本 央博士より分与
を受けた８−アザグアニン耐性の株であった。
ローナルを産生するハイブリドーマの取得 使用したミエローマ細胞（Ｘ６３−Ａｇ８−６．５．
３）は大阪大学微生物病研究所、杉本 央博士より分与
を受けた８−アザグアニン耐性の株であった。
【００５１】ミエローマ細胞を１、免疫マウスの脾臓細
胞を５の割合で混合した後、ペレットにし、これに４０
％のＰＥＧ（メルク社製、重合度４０００）および１０
％のＤＭＳＯを含む血清なしのダルベッコ変法イーグル
培地を加えて１分間混和した。ついで、血清なしのダル
ベッコ変法イーグル培地で細胞を洗浄した後、ＨＡＴ培
地（牛胎児血清を１５％添加したダルベッコ変法イーグ
ル培地に５０倍濃縮ＨＡＴ溶液（ベーリンガー・マンハ
イム社製）を１／５０量加えたもの）に細胞を懸濁し
た。９６穴プレートに１穴当たり４×１０4個／２００
μｌの細胞を加え、５％ＣＯ2下で培養した。３〜４日
毎に半量のＨＡＴ培地を交換し、この条件下で生育する
細胞を取得した。
胞を５の割合で混合した後、ペレットにし、これに４０
％のＰＥＧ（メルク社製、重合度４０００）および１０
％のＤＭＳＯを含む血清なしのダルベッコ変法イーグル
培地を加えて１分間混和した。ついで、血清なしのダル
ベッコ変法イーグル培地で細胞を洗浄した後、ＨＡＴ培
地（牛胎児血清を１５％添加したダルベッコ変法イーグ
ル培地に５０倍濃縮ＨＡＴ溶液（ベーリンガー・マンハ
イム社製）を１／５０量加えたもの）に細胞を懸濁し
た。９６穴プレートに１穴当たり４×１０4個／２００
μｌの細胞を加え、５％ＣＯ2下で培養した。３〜４日
毎に半量のＨＡＴ培地を交換し、この条件下で生育する
細胞を取得した。
【００５２】（３） ロイコシジンＦに特異的なモノク
ローナル抗体を産生するハイブリドーマの選別 ９６穴ＥＬＩＳＡプレート（イワキ社製）に１μｇ／ｍ
ｌのロイコシジンＦのＰＢＳ（０．１５ＭのＮａＣｌ添
加０．１５Ｍリン酸バッファー、ｐＨ７．４）溶液をそ
れぞれの穴に０．１ｍｌずつ入れ、４℃、１晩の処理を
行ってロイコシジンＦを穴に吸着させた。ＰＢＳで１５
％に希釈した牛胎児血清を穴に添加してプレートへの非
特異的結合を防止した後、各穴にハイブリドーマ培養上
清１００μｌを加え、３７℃で１２０分間インキュベー
トし、排液し、０．０５％トゥイーン２０を含むＰＢＳ
で洗浄した後、ペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ抗
体（Ｈ＋Ｌ）（バイオラド社製）を加えて３７℃で６０
分間インキュベートし、排液した。０．０５％トゥイー
ン２０を含むＰＢＳで洗浄した後、過酸化水素（０．０
０６％）とｏ−フェニレンジアミン（０．４ｍｇ／ｍ
ｌ）を含む５０ｍＭクエン酸・リン酸バッファーを１穴
当たり０．１５ｍｌ加えてインキュベートし、発色反応
をさせた。１Ｎ硫酸を添加して反応を止め、４９０ｎｍ
の吸光度を読み取り、抗体産生が陽性のハイブリドーマ
を選別した。
ローナル抗体を産生するハイブリドーマの選別 ９６穴ＥＬＩＳＡプレート（イワキ社製）に１μｇ／ｍ
ｌのロイコシジンＦのＰＢＳ（０．１５ＭのＮａＣｌ添
加０．１５Ｍリン酸バッファー、ｐＨ７．４）溶液をそ
れぞれの穴に０．１ｍｌずつ入れ、４℃、１晩の処理を
行ってロイコシジンＦを穴に吸着させた。ＰＢＳで１５
％に希釈した牛胎児血清を穴に添加してプレートへの非
特異的結合を防止した後、各穴にハイブリドーマ培養上
清１００μｌを加え、３７℃で１２０分間インキュベー
トし、排液し、０．０５％トゥイーン２０を含むＰＢＳ
で洗浄した後、ペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ抗
体（Ｈ＋Ｌ）（バイオラド社製）を加えて３７℃で６０
分間インキュベートし、排液した。０．０５％トゥイー
ン２０を含むＰＢＳで洗浄した後、過酸化水素（０．０
０６％）とｏ−フェニレンジアミン（０．４ｍｇ／ｍ
ｌ）を含む５０ｍＭクエン酸・リン酸バッファーを１穴
当たり０．１５ｍｌ加えてインキュベートし、発色反応
をさせた。１Ｎ硫酸を添加して反応を止め、４９０ｎｍ
の吸光度を読み取り、抗体産生が陽性のハイブリドーマ
を選別した。
【００５３】（４） 限界希釈法による上記ハイブリド
ーマのクローニング ５％Ｂｒｉｃｌｏｎｅ 、１５％牛胎児血清添加ダルベ
ッコ変法イーグル培地を用いて上記のようにして得られ
たロイコシジンＦに対する抗体を産生するハイブリドー
マを希釈し、９６穴プレートに１穴当たり１個以下にな
るように分注した。５％ＣＯ2下、３７℃で約１０日間
培養し、顕微鏡下でシングルクローンとして増殖するこ
とが確認されたコロニーを選別した。
ーマのクローニング ５％Ｂｒｉｃｌｏｎｅ 、１５％牛胎児血清添加ダルベ
ッコ変法イーグル培地を用いて上記のようにして得られ
たロイコシジンＦに対する抗体を産生するハイブリドー
マを希釈し、９６穴プレートに１穴当たり１個以下にな
るように分注した。５％ＣＯ2下、３７℃で約１０日間
培養し、顕微鏡下でシングルクローンとして増殖するこ
とが確認されたコロニーを選別した。
【００５４】このようにして得られた本発明の、ロイコ
シジンＦに特異的なモノクローナル抗体産生ハイブリド
ーマ株は、ＡＬｕｋＦ３−１、ＡＬｕｋＦ４−２、ＡＬ
ｕｋＦ５−１およびＡＬｕｋＦ６−１と命名され、その
中の一株ＡＬｕｋＦ３−１については、通商産業省工業
技術院生命工学工業技術研究所に受託番号、ＦＥＲＭＢ
Ｐ−６６６９として寄託されている。
シジンＦに特異的なモノクローナル抗体産生ハイブリド
ーマ株は、ＡＬｕｋＦ３−１、ＡＬｕｋＦ４−２、ＡＬ
ｕｋＦ５−１およびＡＬｕｋＦ６−１と命名され、その
中の一株ＡＬｕｋＦ３−１については、通商産業省工業
技術院生命工学工業技術研究所に受託番号、ＦＥＲＭＢ
Ｐ−６６６９として寄託されている。
【００５５】（実施例２） 本発明のロイコシジンＦに特異的なモノクローナル抗体
の取得 （１） 上記のハイブリドーマ株は、１５％牛胎児血清
添加ダルベッコ変法イーグル培地中で、５％ＣＯ2下、
３７℃の条件下で培養した。プリステイン０．５ｍｌを
２回腹腔内注射したＢＡＬＢ／ｃマウスに１×１０7個
の抗体産生ハイブリドーマを腹腔内移植した。約１０日
後、抗体を含む腹水を回収した。
の取得 （１） 上記のハイブリドーマ株は、１５％牛胎児血清
添加ダルベッコ変法イーグル培地中で、５％ＣＯ2下、
３７℃の条件下で培養した。プリステイン０．５ｍｌを
２回腹腔内注射したＢＡＬＢ／ｃマウスに１×１０7個
の抗体産生ハイブリドーマを腹腔内移植した。約１０日
後、抗体を含む腹水を回収した。
【００５６】（２） バイオラド社製ＭＡＰIIキットを
用いてモノクローナル抗体を精製した。キット中の結合
バッファーで腹水を３倍に希釈した後、キット中のプロ
テインＡカラムにかけ、溶出バッファーで抗体を溶出さ
せて精製モノクローナル抗体を得た。１ｍｌの腹水から
本発明のモノクローナル抗体が約５ｍｇ得られた。
用いてモノクローナル抗体を精製した。キット中の結合
バッファーで腹水を３倍に希釈した後、キット中のプロ
テインＡカラムにかけ、溶出バッファーで抗体を溶出さ
せて精製モノクローナル抗体を得た。１ｍｌの腹水から
本発明のモノクローナル抗体が約５ｍｇ得られた。
【００５７】（実施例３） 本発明の標識化モノクローナル抗体の調製 （１） ペルオキシダーゼ標識化モノクローナル抗体の
調製 ペルオキシダーゼ５０ｍｇを蒸留水７ｍｌに溶解した
後、０．１ＭのＮａＩＯ4 水溶液３ｍｌに溶解して添加
し、室温で２０分間反応させた。ゲル濾過によりＮａＩ
Ｏ4の除去と１ｍＭ酢酸バッファー２ｍｌへの置換を行
った。ついで、本発明のモノクローナル抗体（ＡＬｕｋ
Ｆ３−１）６ｍｇを１０ｍＭ炭酸バッファーに溶解し、
直ちにＮａＩＯ4処理ペルオキシダーゼと反応させた。
室温に２時間放置した後、４ｍｇ／ｍｌのＮａＢＨ4 水
溶液０．２ｍｌを添加して標識化反応を停止させた。
調製 ペルオキシダーゼ５０ｍｇを蒸留水７ｍｌに溶解した
後、０．１ＭのＮａＩＯ4 水溶液３ｍｌに溶解して添加
し、室温で２０分間反応させた。ゲル濾過によりＮａＩ
Ｏ4の除去と１ｍＭ酢酸バッファー２ｍｌへの置換を行
った。ついで、本発明のモノクローナル抗体（ＡＬｕｋ
Ｆ３−１）６ｍｇを１０ｍＭ炭酸バッファーに溶解し、
直ちにＮａＩＯ4処理ペルオキシダーゼと反応させた。
室温に２時間放置した後、４ｍｇ／ｍｌのＮａＢＨ4 水
溶液０．２ｍｌを添加して標識化反応を停止させた。
【００５８】（２） 蛍光標識化モノクローナル抗体の
調製 蛍光色素としてフルオレッセイン・イソチオシアネート
（ＦＩＴＣ）を使用した。テトラメチルローダミン・イ
ソ・チオシアネート（ＲＩＴＣ）を使用しても同様に蛍
光標識が可能である。
調製 蛍光色素としてフルオレッセイン・イソチオシアネート
（ＦＩＴＣ）を使用した。テトラメチルローダミン・イ
ソ・チオシアネート（ＲＩＴＣ）を使用しても同様に蛍
光標識が可能である。
【００５９】本発明のモノクローナル抗体（ＡＬｕｋＦ
３−１）を０．１Ｍ炭酸バッファーｐＨ８．０に２ｍｇ
／ｍｌの濃度で溶解した。ついで、ＦＩＴＣを１ｍｇ／
ｍｌになるようにＤＭＳＯに溶解し、その０．０５ｍｌ
を抗体溶液に加え、４℃で８時間、遮光して反応させ
た。セファデックスＧ−５０によるゲル濾過を行い、結
合しなかったＦＩＴＣを除去した後、抗体溶液に安定剤
として牛血清アルブミンを最終濃度１％になるように添
加してＦＩＴＣ標識化モノクローナル抗体（ＡＬｕｋＦ
３−１）とした。
３−１）を０．１Ｍ炭酸バッファーｐＨ８．０に２ｍｇ
／ｍｌの濃度で溶解した。ついで、ＦＩＴＣを１ｍｇ／
ｍｌになるようにＤＭＳＯに溶解し、その０．０５ｍｌ
を抗体溶液に加え、４℃で８時間、遮光して反応させ
た。セファデックスＧ−５０によるゲル濾過を行い、結
合しなかったＦＩＴＣを除去した後、抗体溶液に安定剤
として牛血清アルブミンを最終濃度１％になるように添
加してＦＩＴＣ標識化モノクローナル抗体（ＡＬｕｋＦ
３−１）とした。
【００６０】（３） ビオチン標識化モノクローナル抗
体の調製 ５ｍｇのモノクローナル抗体（ＡＬｕｋＦ３−１）を
０．５ｍｌの０．１Ｍ炭酸バッファー（ｐＨ９．０）に
溶解し、１ｍｇ／ｍｌ濃度のビオチン−Ｎ−ヒドロキシ
スクシンイミド（アメリカン・クワレクス社製）水溶液
を０．５ｍｌ添加し、室温で１時間穏和に撹拌して標識
化反応を行った。反応物をＰＢＳに対して一晩透析して
未反応のビオチン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドを除
去し、安定剤として牛血清アルブミンを最終濃度１％に
なるように加えてビオチン標識化モノクローナル抗体
（ＡＬｕｋＦ３−１）とした。
体の調製 ５ｍｇのモノクローナル抗体（ＡＬｕｋＦ３−１）を
０．５ｍｌの０．１Ｍ炭酸バッファー（ｐＨ９．０）に
溶解し、１ｍｇ／ｍｌ濃度のビオチン−Ｎ−ヒドロキシ
スクシンイミド（アメリカン・クワレクス社製）水溶液
を０．５ｍｌ添加し、室温で１時間穏和に撹拌して標識
化反応を行った。反応物をＰＢＳに対して一晩透析して
未反応のビオチン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドを除
去し、安定剤として牛血清アルブミンを最終濃度１％に
なるように加えてビオチン標識化モノクローナル抗体
（ＡＬｕｋＦ３−１）とした。
【００６１】（実施例４） 本発明のペルオキシダーゼ標識化モノクローナル抗体を
使用するロイコシジンＦの検出 ＰＢＳ（０．１５ＭのＮａＣｌ添加０．１５Ｍリン酸バ
ッファー、ｐＨ７．４）で１、２、５または１０μｇ／
ｍｌに希釈したロイコシジンＦ溶液をＥＬＩＳＡプレー
ト（イワキ社製）に１穴当たり０．１ｍｌずつ加え、４
℃で一晩吸着させた。ついで、０．０５％トゥイーン２
０を添加したＰＢＳで洗浄した後、１５％に希釈した牛
胎児血清で処理してプレート表面の非特異的吸着を防止
した。バイオラド社のイムノウォッシュ・モデル１５７
５を用いてプレートを洗浄した後、抗体換算で２μｇ／
ｍｌの本発明のペルオキシダーゼ標識化モノクローナル
抗体（ＡＬｕｋＦ３−１）を１穴当たり０．１ｍｌ添加
した。３７℃で２時間インキュベートした後、０．０５
％トゥイーン２０を添加したＰＢＳで洗浄し、過酸化水
素（０．００６％）とｏ−フェニレンジアミン（０．４
ｍｇ／ｍｌ）を含む５０ｍＭクエン酸・リン酸バッファ
ーを１穴当たり０．１５ｍｌ添加し、３７℃で３０分間
インキュベートして発色反応させた。１Ｎ硫酸を１穴当
たり０．０５ｍｌ添加して反応を停止させた後バイオラ
ド社のマイクロプレート・リーダー・モデル５５０を用
いて４９０ｎｍの吸光度を測定した。ブランクとしては
ロイコシジンＦを加えていない穴の吸光度を使用した。
使用するロイコシジンＦの検出 ＰＢＳ（０．１５ＭのＮａＣｌ添加０．１５Ｍリン酸バ
ッファー、ｐＨ７．４）で１、２、５または１０μｇ／
ｍｌに希釈したロイコシジンＦ溶液をＥＬＩＳＡプレー
ト（イワキ社製）に１穴当たり０．１ｍｌずつ加え、４
℃で一晩吸着させた。ついで、０．０５％トゥイーン２
０を添加したＰＢＳで洗浄した後、１５％に希釈した牛
胎児血清で処理してプレート表面の非特異的吸着を防止
した。バイオラド社のイムノウォッシュ・モデル１５７
５を用いてプレートを洗浄した後、抗体換算で２μｇ／
ｍｌの本発明のペルオキシダーゼ標識化モノクローナル
抗体（ＡＬｕｋＦ３−１）を１穴当たり０．１ｍｌ添加
した。３７℃で２時間インキュベートした後、０．０５
％トゥイーン２０を添加したＰＢＳで洗浄し、過酸化水
素（０．００６％）とｏ−フェニレンジアミン（０．４
ｍｇ／ｍｌ）を含む５０ｍＭクエン酸・リン酸バッファ
ーを１穴当たり０．１５ｍｌ添加し、３７℃で３０分間
インキュベートして発色反応させた。１Ｎ硫酸を１穴当
たり０．０５ｍｌ添加して反応を停止させた後バイオラ
ド社のマイクロプレート・リーダー・モデル５５０を用
いて４９０ｎｍの吸光度を測定した。ブランクとしては
ロイコシジンＦを加えていない穴の吸光度を使用した。
【００６２】得られた結果を図１に示す。４９０ｎｍの
吸光度はロイコシジンＦの濃度に比例して増加し、吸着
時のロイコシジンＦの濃度が１μｇ／ｍｌ以上であれ
ば、本発明のペルオキシダーゼ標識化モノクローナル抗
体（ＡＬｕｋＦ３−１）を用いてロイコシジンＦの、ほ
ぼ定量的な検出が可能であることが明らかとなった。
吸光度はロイコシジンＦの濃度に比例して増加し、吸着
時のロイコシジンＦの濃度が１μｇ／ｍｌ以上であれ
ば、本発明のペルオキシダーゼ標識化モノクローナル抗
体（ＡＬｕｋＦ３−１）を用いてロイコシジンＦの、ほ
ぼ定量的な検出が可能であることが明らかとなった。
【００６３】（実施例５） 未標識モノクローナル抗体（ＡＬｕｋＦ５−１）とペル
オキシダーゼ標識化モノクローナル抗体（ＡＬｕｋＦ３
−１）を用いるサンドイッチ法によるロイコシジンＦの
検出 １０μｇ／ｍｌになるようにＰＢＳで希釈した未標識モ
ノクローナル抗体（ＡＬｕｋＦ５−１）の０．１ｍｌを
ＥＬＩＳＡプレート（イワキ社製）の各穴に加え、４℃
で一晩吸着させた。ついで、０．０５％トゥイーン２０
を添加したＰＢＳで洗浄した後、１５％に希釈した牛胎
児血清で処理してプレート表面の非特異的吸着を防止し
た。次に、バイオラド社のイムノウォッシュ・モデル１
５７５を用いてプレートを洗浄した後、０．０１、０．
１、１および１０μｇ／ｍｌの精製ロイコシジンＦの１
％牛胎児血清添加ＰＢＳ溶液をプレートの各穴に０．１
ｍｌずつ添加し、３７℃で２時間インキュベートした。
ついで、排液し、０．０５％トゥイーン２０を添加した
ＰＢＳで洗浄した後、抗体換算で２μｇ／ｍｌのペルオ
キシダーゼ標識化ＡＬｕｋＦ３−１を１穴当たり０．１
ｍｌ添加し、３７℃で２時間インキュベートし、排液し
た。ついで、０．０５％トゥイーン２０を添加したＰＢ
Ｓで洗浄した後、過酸化水素（０．００６％）とｏ−フ
ェニレンジアミン（０．４ｍｇ／ｍｌ）を含む５０ｍＭ
クエン酸・リン酸バッファーを１穴当たり０．１５ｍｌ
添加し、３７℃で３０分間インキュベートして発色反応
させた。１Ｎ硫酸を１穴当たり０．０５ｍｌ添加して反
応を停止させた後バイオラド社のマイクロプレート・リ
ーダー・モデル５５０を用いて４９０ｎｍの吸光度を測
定した。ブランクとしてはロイコシジンＦを加えていな
い穴の吸光度を使用した。
オキシダーゼ標識化モノクローナル抗体（ＡＬｕｋＦ３
−１）を用いるサンドイッチ法によるロイコシジンＦの
検出 １０μｇ／ｍｌになるようにＰＢＳで希釈した未標識モ
ノクローナル抗体（ＡＬｕｋＦ５−１）の０．１ｍｌを
ＥＬＩＳＡプレート（イワキ社製）の各穴に加え、４℃
で一晩吸着させた。ついで、０．０５％トゥイーン２０
を添加したＰＢＳで洗浄した後、１５％に希釈した牛胎
児血清で処理してプレート表面の非特異的吸着を防止し
た。次に、バイオラド社のイムノウォッシュ・モデル１
５７５を用いてプレートを洗浄した後、０．０１、０．
１、１および１０μｇ／ｍｌの精製ロイコシジンＦの１
％牛胎児血清添加ＰＢＳ溶液をプレートの各穴に０．１
ｍｌずつ添加し、３７℃で２時間インキュベートした。
ついで、排液し、０．０５％トゥイーン２０を添加した
ＰＢＳで洗浄した後、抗体換算で２μｇ／ｍｌのペルオ
キシダーゼ標識化ＡＬｕｋＦ３−１を１穴当たり０．１
ｍｌ添加し、３７℃で２時間インキュベートし、排液し
た。ついで、０．０５％トゥイーン２０を添加したＰＢ
Ｓで洗浄した後、過酸化水素（０．００６％）とｏ−フ
ェニレンジアミン（０．４ｍｇ／ｍｌ）を含む５０ｍＭ
クエン酸・リン酸バッファーを１穴当たり０．１５ｍｌ
添加し、３７℃で３０分間インキュベートして発色反応
させた。１Ｎ硫酸を１穴当たり０．０５ｍｌ添加して反
応を停止させた後バイオラド社のマイクロプレート・リ
ーダー・モデル５５０を用いて４９０ｎｍの吸光度を測
定した。ブランクとしてはロイコシジンＦを加えていな
い穴の吸光度を使用した。
【００６４】得られた結果を図２に示す。ロイコシジン
Ｆは本発明の未標識モノクローナル抗体と本発明のペル
オキシダーゼ標識化モノクローナル抗体を用いるサンド
イッチＥＬＩＳＡ法により検出可能であることが明らか
となった。図２から明らかなように、ロイコシジンＦの
濃度が高くなるにつれ吸光度が高くなり、０．１μｇ／
ｍｌ以上のロイコシジンＦの検出が可能であることがわ
かる。従って、本発明の方法により、ＭＲＳＡの産生す
る毒素タンパク、ロイコシジンＦを検出することが可能
であることが明らかである。
Ｆは本発明の未標識モノクローナル抗体と本発明のペル
オキシダーゼ標識化モノクローナル抗体を用いるサンド
イッチＥＬＩＳＡ法により検出可能であることが明らか
となった。図２から明らかなように、ロイコシジンＦの
濃度が高くなるにつれ吸光度が高くなり、０．１μｇ／
ｍｌ以上のロイコシジンＦの検出が可能であることがわ
かる。従って、本発明の方法により、ＭＲＳＡの産生す
る毒素タンパク、ロイコシジンＦを検出することが可能
であることが明らかである。
【００６５】（実施例６） 本発明の蛍光標識化モノクローナル抗体を用いるロイコ
シジンＦの検出 実施例４または実施例５で使用したペルオキシダーゼ標
識化モノクローナル抗体の代わりに本発明の蛍光標識化
モノクローナル抗体を用いて実施例４および実施例５と
同様な実験を行った。標識の検出には９６穴プレート用
フルオロメーター（テカン社、フロースター）を使用
し、吸収波長４９２ｎｍ、蛍光波長５２０ｎｍで測定し
た。
シジンＦの検出 実施例４または実施例５で使用したペルオキシダーゼ標
識化モノクローナル抗体の代わりに本発明の蛍光標識化
モノクローナル抗体を用いて実施例４および実施例５と
同様な実験を行った。標識の検出には９６穴プレート用
フルオロメーター（テカン社、フロースター）を使用
し、吸収波長４９２ｎｍ、蛍光波長５２０ｎｍで測定し
た。
【００６６】その結果、ペルオキシダーゼ標識化モノク
ローナル抗体の場合の約１０倍の検出感度でロイコシジ
ンＦの検出が可能であることが明らかとなった。
ローナル抗体の場合の約１０倍の検出感度でロイコシジ
ンＦの検出が可能であることが明らかとなった。
【００６７】（実施例７） 本発明のビオチン標識化モノクローナル抗体を用いるロ
イコシジンＦの検出 実施例４または実施例５において使用したペルオキシダ
ーゼ標識化モノクローナル抗体の代わりに本発明のビオ
チン標識化モノクローナル抗体を用いて実施例４および
実施例５と同様な実験を行った。
イコシジンＦの検出 実施例４または実施例５において使用したペルオキシダ
ーゼ標識化モノクローナル抗体の代わりに本発明のビオ
チン標識化モノクローナル抗体を用いて実施例４および
実施例５と同様な実験を行った。
【００６８】ペルオキシダーゼ標識化モノクローナル抗
体の代わりに本発明のビオチン標識化モノクローナル抗
体を添加して３７℃で２時間インキュベートした後、ト
ゥイーン２０を添加したＰＢＳで洗浄した。ついでペル
オキシダーゼ標識化ストレプトアビジン（シグマ社製）
を添加し、３７℃で１時間インキュベートした。標識の
検出は実施例４および実施例５と全く同様に行った。本
発明に使用するペルオキシダーゼ標識化ストレプトアビ
ジンのペルオキシダーゼ活性が高いためか、複数のビオ
チンがモノクローナル抗体に結合しているためペルオキ
シダーゼの数の増幅があるためか、本方法の検出感度は
ペルオキシダーゼ標識化モノクローナル抗体を用いた場
合に比べて約１０倍増加した。
体の代わりに本発明のビオチン標識化モノクローナル抗
体を添加して３７℃で２時間インキュベートした後、ト
ゥイーン２０を添加したＰＢＳで洗浄した。ついでペル
オキシダーゼ標識化ストレプトアビジン（シグマ社製）
を添加し、３７℃で１時間インキュベートした。標識の
検出は実施例４および実施例５と全く同様に行った。本
発明に使用するペルオキシダーゼ標識化ストレプトアビ
ジンのペルオキシダーゼ活性が高いためか、複数のビオ
チンがモノクローナル抗体に結合しているためペルオキ
シダーゼの数の増幅があるためか、本方法の検出感度は
ペルオキシダーゼ標識化モノクローナル抗体を用いた場
合に比べて約１０倍増加した。
【００６９】（実施例８） ニトロセルロース膜固定化モノクローナル抗体を用いる
ロイコシジンＦの検出 １００ｎｇの未標識の抗ロイコシジンＦモノクローナル
抗体（ＡＬｕｋＦ５−１）（１０μｇ／ｍｌ濃度のＰＢ
Ｓ溶液の１０μｌ）をニトロセルロース膜片に滴下し、
風乾して固定化した。非特異的吸着を抑制するため、Ｐ
ＢＳに溶解した３％牛血清アルブミンで上記ニトロセル
ロース膜片を４℃で一晩処理した。ついで、０．０５％
トゥイーン２０を添加したＰＢＳで膜片を洗浄した後、
膜片を短冊状に切り、０．３％牛血清アルブミンで希釈
した各種濃度のロイコシジンＦ溶液に浸漬し、室温で２
時間インキュベートした。０．０５％トゥイーン２０を
添加したＰＢＳで膜を洗浄した後、抗体換算で２μｇ／
ｍｌのペルオキシダーゼ標識化モノクローナル抗体（Ａ
ＬｕｋＦ３−１）ＰＢＳ溶液に浸漬し、室温で１時間イ
ンキュベートした。０．０５％トゥイーン２０を添加し
たＰＢＳで膜片を洗浄した後、０．０００３％の過酸化
水素を含んだ０．５ｍｇ／ｍｌの３，３’−ジアミノベ
ンジチン（同仁社製）ＰＢＳ溶液に膜片を浸漬して発色
反応をさせた。
ロイコシジンＦの検出 １００ｎｇの未標識の抗ロイコシジンＦモノクローナル
抗体（ＡＬｕｋＦ５−１）（１０μｇ／ｍｌ濃度のＰＢ
Ｓ溶液の１０μｌ）をニトロセルロース膜片に滴下し、
風乾して固定化した。非特異的吸着を抑制するため、Ｐ
ＢＳに溶解した３％牛血清アルブミンで上記ニトロセル
ロース膜片を４℃で一晩処理した。ついで、０．０５％
トゥイーン２０を添加したＰＢＳで膜片を洗浄した後、
膜片を短冊状に切り、０．３％牛血清アルブミンで希釈
した各種濃度のロイコシジンＦ溶液に浸漬し、室温で２
時間インキュベートした。０．０５％トゥイーン２０を
添加したＰＢＳで膜を洗浄した後、抗体換算で２μｇ／
ｍｌのペルオキシダーゼ標識化モノクローナル抗体（Ａ
ＬｕｋＦ３−１）ＰＢＳ溶液に浸漬し、室温で１時間イ
ンキュベートした。０．０５％トゥイーン２０を添加し
たＰＢＳで膜片を洗浄した後、０．０００３％の過酸化
水素を含んだ０．５ｍｇ／ｍｌの３，３’−ジアミノベ
ンジチン（同仁社製）ＰＢＳ溶液に膜片を浸漬して発色
反応をさせた。
【００７０】ロイコシジンＦを含まない検体では膜片上
には発色は見られなかったが、０．１μｇ／ｍｌ以上の
濃度のロイコシジンＦを含む検体では発色反応は陽性で
あり、その色調も検体中のロイコシジンＦの濃度が増加
するにつれ濃くなった。
には発色は見られなかったが、０．１μｇ／ｍｌ以上の
濃度のロイコシジンＦを含む検体では発色反応は陽性で
あり、その色調も検体中のロイコシジンＦの濃度が増加
するにつれ濃くなった。
【００７１】また、この方法により、ＭＲＳＡ培養液中
のロイコシジンＦの産生が確認された。
のロイコシジンＦの産生が確認された。
【００７２】以上の結果から、この方法によっても、ロ
イコシジンＦの簡易、迅速な検出が可能であることが明
らかである。
イコシジンＦの簡易、迅速な検出が可能であることが明
らかである。
【００７３】（実施例９） 本発明のモノクローナル抗体のＦａｂフラグメントの単
離 本発明のモノクローナル抗体（ＡＬｕｋＦ３−１）を
０．１Ｍ酢酸バッファー（ｐＨ５．５）に溶解し、タン
パク分解酵素であるパパイン（シグマ社製）を抗体の１
／１００（重量比）加え、３７℃で２時間インキュベー
トした。パパイン処理によりＦａｂフラグメントとＦｃ
フラグメントに分離された反応産物をプロテインＡカラ
ム（バイオラド社製）にかけ、プロテインＡに結合する
未反応のモノクローナル抗体およびＦｃを除去してＦａ
ｂフラグメントを回収した。得られたＦａｂフラグメン
トはＰＢＳに対して透析し、凍結して保存した。１０ｍ
ｇのＡＬｕｋＦ３−１抗体から２ｍｇのＦａｂフラグメ
ントが得られた。
離 本発明のモノクローナル抗体（ＡＬｕｋＦ３−１）を
０．１Ｍ酢酸バッファー（ｐＨ５．５）に溶解し、タン
パク分解酵素であるパパイン（シグマ社製）を抗体の１
／１００（重量比）加え、３７℃で２時間インキュベー
トした。パパイン処理によりＦａｂフラグメントとＦｃ
フラグメントに分離された反応産物をプロテインＡカラ
ム（バイオラド社製）にかけ、プロテインＡに結合する
未反応のモノクローナル抗体およびＦｃを除去してＦａ
ｂフラグメントを回収した。得られたＦａｂフラグメン
トはＰＢＳに対して透析し、凍結して保存した。１０ｍ
ｇのＡＬｕｋＦ３−１抗体から２ｍｇのＦａｂフラグメ
ントが得られた。
【００７４】得られたＦａｂフラグメントの一部は、実
施例２に示した方法と同様の方法により標識化した。
施例２に示した方法と同様の方法により標識化した。
【００７５】（実施例１０） ＭＲＳＡの産生する毒素タンパクの検出用キット （１） 実施例４の方法を実施するためのキット 下記の成分を含むキット（約１０検体分）。 １０ｍｌのＰＢＳ（０．１５ＭのＮａＣｌ添加０．１
５Ｍリン酸バッファー、ｐＨ７．４）溶液、 １０ｍｌの０．０５％トゥイーン２０を添加したＰＢ
Ｓ、 ４ｍｌの１５％牛胎児血清ＰＢＳ溶液、 １．２ｍｌの抗体換算で２μｇ／ｍｌの本発明のペル
オキシダーゼ標識化モノクローナル抗体（ＡＬｕｋＦ３
−１）、 ２ｍｌの過酸化水素（０．００６％）とｏ−フェニレ
ンジアミン（０．４ｍｇ／ｍｌ）を含む５０ｍＭクエン
酸・リン酸バッファー、 １ｍｌの１Ｎ硫酸。
５Ｍリン酸バッファー、ｐＨ７．４）溶液、 １０ｍｌの０．０５％トゥイーン２０を添加したＰＢ
Ｓ、 ４ｍｌの１５％牛胎児血清ＰＢＳ溶液、 １．２ｍｌの抗体換算で２μｇ／ｍｌの本発明のペル
オキシダーゼ標識化モノクローナル抗体（ＡＬｕｋＦ３
−１）、 ２ｍｌの過酸化水素（０．００６％）とｏ−フェニレ
ンジアミン（０．４ｍｇ／ｍｌ）を含む５０ｍＭクエン
酸・リン酸バッファー、 １ｍｌの１Ｎ硫酸。
【００７６】上記のキットを使用する場合は、ＥＬＩＳ
Ａプレートおよび分光光度計が必要である。
Ａプレートおよび分光光度計が必要である。
【００７７】（２） 実施例５の方法を実施するための
キット 下記の成分を含むキット（約１０検体分）。 １０ｍｌのＰＢＳ、 １２μｇの未標識モノクローナル抗体、 １０ｍｌの０．０５％トゥイーン２０を添加したＰＢ
Ｓ、 ４ｍｌの１５％牛胎児血清ＰＢＳ溶液、 １０ｍｌの０．０５％トゥイーン２０を添加したＰＢ
Ｓ、 １．２ｍｌの抗体換算で２μｇ／ｍｌのペルオキシダ
ーゼ標識化モノクローナル抗体、 ２ｍｌの過酸化水素（０．００６％）とｏ−フェニレ
ンジアミン（０．４ｍｇ／ｍｌ）を含む５０ｍＭクエン
酸・リン酸バッファー、 １ｍｌの１Ｎ硫酸。
キット 下記の成分を含むキット（約１０検体分）。 １０ｍｌのＰＢＳ、 １２μｇの未標識モノクローナル抗体、 １０ｍｌの０．０５％トゥイーン２０を添加したＰＢ
Ｓ、 ４ｍｌの１５％牛胎児血清ＰＢＳ溶液、 １０ｍｌの０．０５％トゥイーン２０を添加したＰＢ
Ｓ、 １．２ｍｌの抗体換算で２μｇ／ｍｌのペルオキシダ
ーゼ標識化モノクローナル抗体、 ２ｍｌの過酸化水素（０．００６％）とｏ−フェニレ
ンジアミン（０．４ｍｇ／ｍｌ）を含む５０ｍＭクエン
酸・リン酸バッファー、 １ｍｌの１Ｎ硫酸。
【００７８】（３） 実施例７の方法を実施するための
キット 本発明のビオチン標識化モノクローナル抗体を用いるロ
イコシジンＦの検出下記の成分を含むキット（約１０検
体分）。 １０ｍｌのＰＢＳ、 １２μｇの未標識モノクローナル抗体、 １０ｍｌの０．０５％トゥイーン２０を添加したＰＢ
Ｓ、 ４ｍｌの１５％牛胎児血清ＰＢＳ溶液、 １５ｍｌの０．０５％トゥイーン２０を添加したＰＢ
Ｓ、 １．２ｍｌの抗体換算で２μｇ／ｍｌのビオチン標識
化モノクローナル抗体、 １．２ｍｌのストレプトアビジン換算で１μｇ／ｍｌ
のペルオキシダーゼ標識化ストレプトアビジン、 ２ｍｌの過酸化水素（０．００６％）とｏ−フェニレ
ンジアミン（０．４ｍｇ／ｍｌ）を含む５０ｍＭクエン
酸・リン酸バッファー、 １ｍｌの１Ｎ硫酸。
キット 本発明のビオチン標識化モノクローナル抗体を用いるロ
イコシジンＦの検出下記の成分を含むキット（約１０検
体分）。 １０ｍｌのＰＢＳ、 １２μｇの未標識モノクローナル抗体、 １０ｍｌの０．０５％トゥイーン２０を添加したＰＢ
Ｓ、 ４ｍｌの１５％牛胎児血清ＰＢＳ溶液、 １５ｍｌの０．０５％トゥイーン２０を添加したＰＢ
Ｓ、 １．２ｍｌの抗体換算で２μｇ／ｍｌのビオチン標識
化モノクローナル抗体、 １．２ｍｌのストレプトアビジン換算で１μｇ／ｍｌ
のペルオキシダーゼ標識化ストレプトアビジン、 ２ｍｌの過酸化水素（０．００６％）とｏ−フェニレ
ンジアミン（０．４ｍｇ／ｍｌ）を含む５０ｍＭクエン
酸・リン酸バッファー、 １ｍｌの１Ｎ硫酸。
【００７９】（４） 実施例８の方法を実施するための
キット ニトロセルロース膜固定化モノクローナル抗体を用いる
ロイコシジンＦの検出下記の成分を含むキット（約１０
検体分）。 ニトロセルロース膜の切片、 １２μｇの未標識モノクローナル抗体、 １０ｍｌの０．０５％トゥイーン２０を添加したＰＢ
Ｓ、 ５ｍｌの３％牛胎児血清アルブミンＰＢＳ溶液、 １０ｍｌの０．０５％トゥイーン２０を添加したＰＢ
Ｓ、 １．２ｍｌの抗体換算で２μｇ／ｍｌのペルオキシダ
ーゼ標識化モノクローナル抗体、 ２ｍｌの過酸化水素（０．００３％）と３，３’−ジ
アミノベンジチン（０．５ｍｇ／ｍｌ）を含むＰＢＳ溶
液、 １ｍｌの１Ｎ硫酸。
キット ニトロセルロース膜固定化モノクローナル抗体を用いる
ロイコシジンＦの検出下記の成分を含むキット（約１０
検体分）。 ニトロセルロース膜の切片、 １２μｇの未標識モノクローナル抗体、 １０ｍｌの０．０５％トゥイーン２０を添加したＰＢ
Ｓ、 ５ｍｌの３％牛胎児血清アルブミンＰＢＳ溶液、 １０ｍｌの０．０５％トゥイーン２０を添加したＰＢ
Ｓ、 １．２ｍｌの抗体換算で２μｇ／ｍｌのペルオキシダ
ーゼ標識化モノクローナル抗体、 ２ｍｌの過酸化水素（０．００３％）と３，３’−ジ
アミノベンジチン（０．５ｍｇ／ｍｌ）を含むＰＢＳ溶
液、 １ｍｌの１Ｎ硫酸。
【００８０】
【発明の効果】本発明は、これまで検出が極めて困難で
あり、しかも結果がでるまでかなりの時間を必要とした
院内感染の起因菌であるＭＲＳＡの産生する毒素タンパ
クを、迅速かつ簡便にしかも高い信頼度で検出し得る方
法を提供する。さらに本発明はＭＲＳＡの産生する毒素
タンパクの検出用キットを提供し、特別な設備を必要と
しない簡便で迅速なＭＲＳＡの産生する毒素タンパクの
検出を可能とする。
あり、しかも結果がでるまでかなりの時間を必要とした
院内感染の起因菌であるＭＲＳＡの産生する毒素タンパ
クを、迅速かつ簡便にしかも高い信頼度で検出し得る方
法を提供する。さらに本発明はＭＲＳＡの産生する毒素
タンパクの検出用キットを提供し、特別な設備を必要と
しない簡便で迅速なＭＲＳＡの産生する毒素タンパクの
検出を可能とする。
【００８１】本発明が提供する方法は、他の検出困難な
細菌であって、その菌に特有の抗原性物質、特にタンパ
ク質またはペプチド、あるいはタンパク性の毒素などを
産生する細菌一般の検出にも便利に使用可能である。
細菌であって、その菌に特有の抗原性物質、特にタンパ
ク質またはペプチド、あるいはタンパク性の毒素などを
産生する細菌一般の検出にも便利に使用可能である。
【図１】図１は本発明の方法によるロイコシジンＦの検
出の１例を示すグラフである。実験はロイコシジンＦを
ＥＬＩＳＡプレートに吸着させた後、ペルオキシダーゼ
標識化抗ロイコシジンＦモノクローナル抗体と結合さ
せ、ロイコシジンＦに結合した標識酵素ペルオキシダー
ゼの存在を過酸化水素とｏ−フェニレンジアミンの存在
下に発色反応により検出することにより行った。標識化
モノクローナル抗体の量はロイコシジンＦの吸着量に比
例して増加していることがわかる。従って、本発明の方
法により、ロイコシジンＦをほぼ定量的に検出すること
ができることが明らかである。
出の１例を示すグラフである。実験はロイコシジンＦを
ＥＬＩＳＡプレートに吸着させた後、ペルオキシダーゼ
標識化抗ロイコシジンＦモノクローナル抗体と結合さ
せ、ロイコシジンＦに結合した標識酵素ペルオキシダー
ゼの存在を過酸化水素とｏ−フェニレンジアミンの存在
下に発色反応により検出することにより行った。標識化
モノクローナル抗体の量はロイコシジンＦの吸着量に比
例して増加していることがわかる。従って、本発明の方
法により、ロイコシジンＦをほぼ定量的に検出すること
ができることが明らかである。
【図２】図２は本発明のＥＬＩＳＡサンドイッチ法によ
るロイコシジンＦの検出の１例を示すグラフである。実
験は、未標識ロイコシジンＦモノクローナル抗体をＥＬ
ＩＳＡプレートに吸着させ、ついでロイコシジンＦを含
む検体液を添加し、さらにペルオキシダーゼ標識化モノ
クローナル抗体を添加した後、プレートに残存する標識
化モノクローナル抗体の量を標識酵素ペルオキシダーゼ
の活性を利用して検出することにより行った。この方法
により、０．１μｇ／ｍｌ以上のロイコシジンＦをほぼ
定量的に検出できることがわかる。
るロイコシジンＦの検出の１例を示すグラフである。実
験は、未標識ロイコシジンＦモノクローナル抗体をＥＬ
ＩＳＡプレートに吸着させ、ついでロイコシジンＦを含
む検体液を添加し、さらにペルオキシダーゼ標識化モノ
クローナル抗体を添加した後、プレートに残存する標識
化モノクローナル抗体の量を標識酵素ペルオキシダーゼ
の活性を利用して検出することにより行った。この方法
により、０．１μｇ／ｍｌ以上のロイコシジンＦをほぼ
定量的に検出できることがわかる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/577 Ｃ０７Ｋ 14/31 // Ｃ０７Ｋ 14/31 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｇ０１Ｎ 33/543 ５０１Ｄ Ｇ０１Ｎ 33/543 ５０１ Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (72)発明者 神尾 好是 宮城県仙台市泉区住吉東２−１−１ (72)発明者 丹羽 和裕 大阪府大阪市城東区今福西６丁目２番61号 松下精工株式会社内 (72)発明者 小野内 徹 大阪府大阪市城東区今福西６丁目２番61号 松下精工株式会社内 (72)発明者 後藤 裕一 大阪府大阪市城東区今福西６丁目２番61号 松下精工株式会社内 Ｆターム(参考） 4B024 AA13 BA50 DA02 GA05 HA15 4B064 AG27 AG30 CA02 CA10 CA20 CC24 DA15 4B065 AA92X AB05 AC10 BA08 CA24 CA25 CA46 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 CA11 DA76 DA83 EA50 FA72 FA73 GA26
Claims (20)
- 【請求項１】 ＭＲＳＡが産生する毒素タンパクに特異
的に結合する能力を有する抗体を使用するＭＲＳＡが産
生する毒素タンパクの検出方法。 - 【請求項２】 ＭＲＳＡが産生する毒素タンパクに特異
的なモノクローナル抗体。 - 【請求項３】 ＭＲＳＡが産生する毒素タンパク、ロイ
コシジンＦに特異的なモノクローナル抗体。 - 【請求項４】 ＭＲＳＡが産生する毒素タンパク、ロイ
コシジンＦで免疫した動物細胞と該動物のミエローマ細
胞との細胞融合により作成されたハイブリドーマによっ
て産生され、ロイコシジンＦに特異的に結合する能力を
有するモノクローナル抗体。 - 【請求項５】 上記ハイブリドーマが受託番号ＦＥＲＭ
ＢＰ−６６６９として工業技術院生命工学工業技術研
究所に寄託されたハイブリドーマである請求項４記載の
モノクローナル抗体。 - 【請求項６】 請求項２〜請求項５いずれか１項に記載
のモノクローナル抗体から得られる断片であって、ロイ
コシジンＦと結合する活性を有する断片。 - 【請求項７】 標識化された、請求項２〜請求項５いず
れか１項に記載のモノクローナル抗体。 - 【請求項８】 酵素、放射性同位元素、蛍光色素、ビオ
チン、染料ゾル、金コロイドおよび着色ラテックスから
なる群より選択される少なくとも一つにより標識化され
た、請求項２〜請求項５いずれか１項に記載のモノクロ
ーナル抗体。 - 【請求項９】 酵素、放射性同位元素、蛍光色素、ビオ
チン、染料ゾル、金コロイドおよび着色ラテックスから
なる群より選択される少なくとも一つにより標識化され
た、請求項６記載のモノクローナル抗体の断片。 - 【請求項１０】 酵素により標識化された、請求項２〜
請求項５いずれか１項に記載のモノクローナル抗体。 - 【請求項１１】 蛍光色素により標識化された、請求項
２〜請求項５いずれか１項に記載のモノクローナル抗
体。 - 【請求項１２】 ビオチンにより標識化された、請求項
２〜請求項５いずれか１項に記載のモノクローナル抗
体。 - 【請求項１３】 請求項２〜請求項５いずれか１項に記
載のモノクローナル抗体および／または請求項７、請求
項８、請求項１０〜請求項１２いずれか１項に記載の標
識化モノクローナル抗体を使用するＭＲＳＡが産生する
毒素の検出方法。 - 【請求項１４】 請求項３〜請求項５いずれか１項に記
載のモノクローナル抗体および／または請求項１０〜請
求項１２いずれか１項に記載の標識化モノクローナル抗
体を使用するＭＲＳＡが産生する毒素の検出方法。 - 【請求項１５】 請求項６記載のモノクローナル抗体断
片および／または請求項９記載の標識化モノクローナル
抗体断片を使用するＭＲＳＡが産生する毒素の検出方
法。 - 【請求項１６】 請求項２〜請求項５いずれか１項に記
載のモノクローナル抗体および／または請求項７、請求
項８、請求項１０〜請求項１２いずれか１項に記載の標
識化モノクローナル抗体を含むＭＲＳＡが産生する毒素
の検出用キット。 - 【請求項１７】 請求項３〜請求項５いずれか１項に記
載のモノクローナル抗体および／または請求項１０〜請
求項１２いずれか１項に記載の標識化モノクローナル抗
体を含むＭＲＳＡが産生する毒素の検出用キット。 - 【請求項１８】 請求項２〜請求項５いずれか１項に記
載のモノクローナル抗体、請求項７、請求項８、請求項
１０〜請求項１２いずれか１項に記載の標識化モノクロ
ーナル抗体、ニトロセルローズ膜片および緩衝液を含む
ＭＲＳＡが産生する毒素の検出用キット。 - 【請求項１９】 請求項３〜請求項５いずれか１項に記
載のモノクローナル抗体、請求項１０〜請求項１２いず
れか１項に記載の標識化モノクローナル抗体、ニトロセ
ルローズ膜片および緩衝液を含むＭＲＳＡが産生する毒
素の検出用キット。 - 【請求項２０】 ＭＲＳＡが産生する毒素タンパク、ロ
イコシジンＦに特異的なモノクローナル抗体を産生する
ハイブリドーマ。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000059946A JP2000316574A (ja) | 1999-03-10 | 2000-03-06 | Ｍｒｓａが産生する毒素タンパクの検出方法およびモノクローナル抗体とその断片およびｍｒｓａが産生する毒素タンパク検出用キットおよびモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6282099 | 1999-03-10 | ||
| JP11-62820 | 1999-03-10 | ||
| JP2000059946A JP2000316574A (ja) | 1999-03-10 | 2000-03-06 | Ｍｒｓａが産生する毒素タンパクの検出方法およびモノクローナル抗体とその断片およびｍｒｓａが産生する毒素タンパク検出用キットおよびモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000316574A true JP2000316574A (ja) | 2000-11-21 |
Family
ID=26403875
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000059946A Pending JP2000316574A (ja) | 1999-03-10 | 2000-03-06 | Ｍｒｓａが産生する毒素タンパクの検出方法およびモノクローナル抗体とその断片およびｍｒｓａが産生する毒素タンパク検出用キットおよびモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2000316574A (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2006135912A3 (en) * | 2005-06-13 | 2007-05-24 | Nabi Biopharmaceuticals | Use of panton-valentine leukocidin for treating and preventing staphylococcus infections |
| WO2008004536A1 (fr) * | 2006-07-03 | 2008-01-10 | Juntendo University School Of Medicine | Procédé de détection de toxine |
| JP2013053154A (ja) * | 2012-12-04 | 2013-03-21 | Juntendo | 毒素検出方法 |
| US9273360B2 (en) | 2007-12-21 | 2016-03-01 | Biomerieux S. A. | Detection of methicillin-resistant Staphylococcus aureus |
-
2000
- 2000-03-06 JP JP2000059946A patent/JP2000316574A/ja active Pending
Cited By (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2006135912A3 (en) * | 2005-06-13 | 2007-05-24 | Nabi Biopharmaceuticals | Use of panton-valentine leukocidin for treating and preventing staphylococcus infections |
| WO2008004536A1 (fr) * | 2006-07-03 | 2008-01-10 | Juntendo University School Of Medicine | Procédé de détection de toxine |
| JP2008013447A (ja) * | 2006-07-03 | 2008-01-24 | Juntendo | 毒素検出方法 |
| EP2039703A4 (en) * | 2006-07-03 | 2010-08-11 | Univ Jutendo School Medicine | METHOD FOR DETECTING TOXINS |
| US7947808B2 (en) | 2006-07-03 | 2011-05-24 | Juntendo University School Of Medicine | Toxin detection method |
| US20110223614A1 (en) * | 2006-07-03 | 2011-09-15 | Juntendo University School Of Medicine | Toxin detection method |
| US8217150B2 (en) | 2006-07-03 | 2012-07-10 | Juntendo University School Of Medicine | Toxin detection method |
| US9273360B2 (en) | 2007-12-21 | 2016-03-01 | Biomerieux S. A. | Detection of methicillin-resistant Staphylococcus aureus |
| JP2013053154A (ja) * | 2012-12-04 | 2013-03-21 | Juntendo | 毒素検出方法 |
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