JP2000505559A - プリオン病の検出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明はヒツジのスクラピー、ウシ海綿状脳症、ヒトのクロイツフェルト−ヤコブ病などのプリオン病を検出する方法を提供し、これによって生存動物から標本調製可能な組織中に異常タンパクまたはプリオンタンパクを検出する。

Description

【発明の詳細な説明】 プリオン病の検出方法 発明の分野 本発明は海綿状脳症（ＳＥｓ）とも呼ばれるプリオン病の分野に関し、たとえ ば、ヒツジのスクラピー、ウシ海綿状脳症(ＢＳＥ，狂牛病)、ヒトのクロイツフ ェルト−ヤコブ病（ＣＪＤ）およびクールーなどに関する。プリオン病は取分け プリオンタンパクの摂取あるいは接種を経て伝染し得るものであり、医原性に発 生するが、伝染の証拠のない何らかの理由であるいは遺伝的根拠によっても起こ る。 序章 プリオン病は世の関心の的となっているものであり、最近、英国でティーンエ イジャーおよび農夫に予期せざるＣＪＤの例が検出されたことにより一層の関心 を呼んでいる。そこではプリオンタンパクが肉の消費を経てウシからヒトに伝染 するとの仮説が出されたが、それはＢＳＥがヒトに伝染してＣＪＤを惹起こすこ とを意味している。 いくつかの要因が世間の関心を高めている。 ａ）ＳＥｓの原因因子、いわゆるプリオンタンパクの性質が未知であり、少な くとも論争の的になっていること。 ｂ）その性質が何であれ、その因子は他の感染性因子を除去する手法（たとえ ば、加熱）に非常に抵抗性であること。 ｃ）一旦発症すると治療の介入は明らかに不可能であること。 ｄ）ＳＥｓには極端に長い潜伏期間があること。 ｅ）前臨床段階に用い得る実用的な感度のよい特異的診断法が存在しないこと である。 これらの全てが一般に「爆弾を抱えて生きている」という感覚を与えている。 プリオンタンパクが肉および肉製品に存在する可能性が健康上の脅威となるのみ ならず、輸血に使用する血液および血液製剤に存在する可能性、動物起源の医薬 品、動物起源の化粧品、細胞培養に使用する血清、要するに、動物起源の広範な 一連の製品に存在する可能性がヒトおよび動物の健康に脅威となる可能性を与え ている。 今日まで、スクラピーおよび他の伝染性海綿状脳症の確定診断は、この病気の 臨床徴候のある動物またはヒトから死後試験期間中に採取した脳の組織学的試験 に依存していた。異常もしくは変性タンパク（ＰｒＰ^Sc，プリオンタンパク）の 沈殿物が疾患動物の脳に検出される。このタンパクはプロティナーゼＫによる消 化、その他正常タンパクの変性、溶解または除去などの種々の方法にまるで非感 受性である。異常タンパクは、プリオン病の病因の中心と考えられる。特定の核 酸が存在しない故に古典的な微生物学法では感染ではないに拘わらず、異常タン パクそれ自身が原因因子とみなされ、感受性動物がそのような異常タンパクを体 内に取り込んだ場合(すなわち、摂取、接種、またはＰｒＰタンパク、ＰｒＰ^cの 正常品遺伝子の突然変異を経ることにより)、連鎖反応が起こり、最終的にプリ オン病の臨床的徴候に至ることになる。連鎖反応は、動物の体内に存在する正常 タンパクから形成されたさらに異常なタンパクの形成を必然的に伴う。正常形と 異常形は、さらに異常形を産生させる方法で相互に作用する。異常形はタンパク 分解作用に強く抵抗するので、変化したプリオンタンパクの沈殿物が、特に脳と 中枢神経系（ＣＮＳ）に形成され、海綿状脳症を起こし、さらに脳疾患の臨床徴 候を惹起する。 ＳＥ−感染もしくは罹患動物およびヒトは疾患特異免疫応答を欠いているので 、（数年を要する）臨床徴候が表出する前に個体を確認するのはこれまで実際不 可能であった。ＳＥｓと矛盾なく関連する生物学的、血液学的または全体的な病 理学的異常はない。それ故、ＳＥｓの診断は、臨床徴候の認知、電子脳撮影法も しくは磁気共鳴影像技術(両者ともヒト患者のみに用いる)、あるいは脳の生検に よるより侵襲的な方法に依存している。最終診断は剖検に際し、脳の組織学的試 験により実施する。神経膠症およびニューロン欠失と関連する灰白質の空胞形成 （海綿状変化）から成る神経組織学的病巣は、一般に十分に特徴的である。さら なる確認は脳抽出物のスクラピー関連原線維を証明するか、その構成タンパクＰ ｒＰ^Scの存在を証明することにより可能である。ＰｒＰ^Scはこの疾患と関係があ り、宿主コード化プリオンタンパク（ＰｒＰ）の異常形であり、異常形は立体配 坐の変化により誘発される。ＰｒＰ^Scはウエスタン・ブロッティングあるいは免 疫組織化学などの免疫学的手法により検出可能である。後者の手法は次第にヒト および畜産ＳＥ分野の双方において、臨床場面での信頼できる診断手技として益 々受け入れられるようになっている。 実用的前臨床診断試験の探求は研究の主たるトピックであったし、現在もそう である。この研究は一般にバイオアッセイによる感染性の検出、あるいはＰｒＰ^Sc に関連する疾患の検出に集中している。バイオアッセイは最も高感度の検出法 でありながら、これまで実用的診断法となるには余りに煩雑で時間が掛りすぎる 。試験結果は、患者が死亡してから暫くして入手できる程のものであった。 それ故、ほとんどの研究者がＰｒＰ^Scを検出する手法に焦点を絞った。全ての 研究者が、ＰｒＰ^Scが原因因子であるという声明に同意するわけではないが、全 員ではないにしてもほとんどがＰｒＰ^Scの存在と疾患の関係が確かに立証されて いることに同意している。ＣＮＳ外の組織にＰｒＰ^Scが検出されることは、脳の 剖検よりも侵襲度の低い方法を通して試料採取することを可能とし、それによっ て実用的前臨床診断技術の展望が実質的に開けてくるだろう。種々の組織が早期 検出技術の開発試行に用いられている。それは血液、尿、組織線維芽細胞、そし て特に動物分野では、リンパ系組織である。最も将来性のある衝撃的手法の要約 をここに示す(広範な総説はシュロイダー、１９９４ａ、１９９４ｂを参照)。 血液−ヒトＳＥｓについては、ヒトＣＪＤ患者のバフィコート試料からげっ歯 類へＣＪＤが伝染するというしばしば論争となった実験があるが(ムラモトら、 １９９３)、スクラピーに自然罹患した動物の血液および特にバフィコートが、 臨床または前臨床段階で何らかの感染能を有しているという証拠はほとんどある いは全くない(フレイザーおよびディッキンソン、１９７８；ハドローら、１９ ８２)。興味深い結果を最近マイナーら（１９９２）が報告したが、彼らは、コ ドン２００に変異をもち、臨床上罹患している８名を一群とするＣＪＤ患者の末 梢組織、培養線維芽細胞および単球の双方にＰｒＰ^Scを検出した。著者らはウエ スタンブロッティングおよび免疫細胞化学の手法を用いた。しかし、彼らの報文 は徹底追求したものとは思われず、たとえそれらの結果が確認できたとしても、 少なくとも動物のＳＥｓの場合には信頼できる血液テストの機会も遠のいている ように思われ、文献からはネガティブとする報告の数まで出されている(ブラウ ンの総説、１９９５)。 尿−ＣＤＪの例で、ＣＤＪをマウスに感染させることにより尿中に感染性が証 明されたとする主張が一度だけなされたことがある。しかし、その同じ著者はそ の実験を再現することができなかった(ブラウン、１９９５)。全く異なるアプロ ーチが最近報告された(ブルジェールら、１９９１)。スクラピー罹患動物と対照 動物の尿を、これら２群の識別を可能とする反復キャピラリー・ミクロ電気泳動 法によるボルタメトリー法でテストした。このアプローチは期待できるように思 えたが、特定のＢＳＥの前臨床段階検出ではその値が確認できなかった。 リンパ系組織−リンパ系組織はヒトＳＥｓの診断分野では明らかに使用されて いないが、畜産の分野では使われている。すでに古典的となったハドローの研究 が示しているように、自然感染スクラピーのヒツジでは、１０〜１４月齢という 早期にバイオアッセイにより感染性が検出できていた。これはＣＮＳでの感染性 が見出される以前のことであった(ハドローら、１９８０)。ウエスタンブロッテ ィングがスクラピーに感染したマウスの脾臓にＰｒＰ^Scの存在を明らかにしたが (ディリンジャーら、１９８３；ドイら、１９８８)、ある例ではＰｒＰ^Scが実験 感染後４週目という早い時期に検出された。これらのマウスからプールしたリン パ節もＰｒＰ^Scを含有していた。同様に、ウエスタンブロッティングを用いて、 スクラピーの徴候を示す一群の自然感染ヒツジのＣＮＳ，脾臓およびリンパ節試 料にもＰｒＰ^Scを全く矛盾なく検出した(イケガミら、１９９１)。このウエスタ ンブロッティングでの値は、少なくとも臨床例では、他のグループも確認してい る。しかし、この結果は実験的に感染させた一群のヒツジを接種後１６、１８お よび２１ヵ月目に殺したものからの結果であるが、臨床徴候が現れる以前のもの であり、矛盾が多く、評価の難しいものであった。ＰｒＰ^Scは恐ら く陽性であった動物１２頭のうち３頭の脾臓試料に検出されたが、リンパ節試料 ではほんの僅かか疑わしい結果であり、陽性の結果は見出されず、この技術の非 感受性を証明しているだけであった。それ故、ＴＳＥの前臨床診断にウエスタン ブロッティングを使用すると、誤解を生じ、信頼できない結果を与える。 これら誤解を生じる結果の理由はＰｒＰ^Scタンパク（罹患組織に存在）を調製 し、それを正常細胞中のイソ型ＰｒＰタンパクから分離もしくは分割する方法に 見出すことができる。なお、イソ型ＰｒＰタンパクはウエスタンブロッティング に使用する同じ抗血清とも免疫反応する。 イケガミら（１９９１）およびムラマツら（１９９３）は種々の段階でウエス タンブロッティングを実施するための試料を調製する必要があった。彼らは先ず 、ＰｒＰ^ScおよびＰｒＰの両方に比較的富む分画を含む組織抽出物を調製するこ とによって試料を濃厚化し、その後プロティナーゼＫ処理によりＰｒＰタンパク を除去する必要があった。この手技は、少なくとも１０回の畔化・分離工程を必 要とし、各工程では試料中の検出すべきタンパク絶対量を減少させてしまう。こ のプロトコールは、多量のＰｒＰ^SCが正常細胞のイソ型ＰｒＰに関連して存在す る場合にはＳＥ'ｓの臨床段階の診断にとって非常に有効であるが、ＴＳＥの前 臨床段階ではＰｒＰ^Scの絶対量が非常に少ないので、通常は調製中に行方知れず になってしまう。 ＢＳＥでは状況がスクラピーとは異なる。一方では、ＢＳＥ罹患ウシの異なる 組織を用いたマウス伝染実験の結果によると、ＣＮＳ以外の組織中ＢＳＥ因子の 分布は、ヒツジのスクラピー例における程広範ではないことを示しているが、他 方、バイオアッセイに用いたマウスではスクラピーに対してより、ＢＳＥに対し て遥かに感度が低いと言える。ＢＳＥをマウスに実験的に伝染させることは脳材 料を用いた時のみに成功した(フレイザーら、１９８８；フレイザーら、１９９ ０)。他の材料、すなわち、脾臓、精液、バフィコート、筋肉、骨髄および胎盤 を接種したマウスは健常のままであった。 しかし、バイオアッセイ以外の上記全ての技術は、ＳＥｓの診断がこの疾患の 臨床段階においてのみ、時には剖検時のみに確定し得ることを共通に示している 。 バイオアッセイにそのまま用いる実験動物では病気の進行が非常に遅いため、バ イオアッセイが非常に遅くなるという事実を考慮しても、本疾患の前臨床段階で ＳＥｓを直ちに診断する方法は現在利用できない。このように、診断テスト法開 発における平均的熟練者は、生物試料中の全種のタンパクを検出するために利用 可能な診断技術を現在豊富にもっており、その技術とは研究中のタンパクを濃縮 する方法を経由もしくは経由せずに、酵素−もしくは標識−結合イムノアッセイ においてモノクローナル抗体またはポリクローナル抗血清を用いるものであるが 、プリオン病の前臨床例に適用可能な診断技術の開発に手引きとなるような黄金 の基準は入手できない。換言すると、高性能の診断テストを確立する方法はこの 分野の一般熟練者が現在よく知るところである。しかし、当該熟練者は黄金の基 準がないために、これら高性能診断テストの感度と特異性を確立する方法を有し ていない。 我々は、今やプリオン病またはＳＥ'ｓの信頼性の高い迅速前臨床診断法を見 出した。本発明は、ヒツジのスクラピー前臨床診断法ならびにＢＳＥおよびCＪ Ｄなどの他のＳＥｓ診断法を提供する。我々はSＥｓを研究するためのモデルと してヒツジのスクラピーを用いた。一群のＳＥｓに関する知識は、ＣＪＤやクー ルーなどのヒト型も含めてスクラピーの研究から膨大に得られている。スクラピ ーはヒツジおよびヤギの進行性・致死性神経疾患であり、ＳＥｓ群の「原型」で あって、多分英国でのＢＳＥ流行の原因であろうと考えられている。英国でＢＳ Ｅが爆発的に流行した期間に採られた制御・衛生上の手段は、ほとんどがスクラ ピーについて判明していた事実に基づいていた。種々の末梢組織の感染性存在に 関する上記バドローのデータを考慮して我々が結論したことは、中でも特にリン パ系組織がＰｒＰ^Scの検出に基づく前臨床テスト開発のための候補であって、他 の組織、たとえば、ＰｒＰの感染性が見出されている網膜、肺胞マクロファージ あるいは単球など、それらに限定するものではないにしても、それらも候補とな ろうということであった。 我々が手中にしているのは、イムノ−ペルオキシダーゼ染色法を用いる免疫組 織化学（ＩＨＣ）であるが、それを臨床上のスクラピーおよびＢＳＥ診断のため に脳の組織切片に用いると、ＰｒＰ^Scの検出法（バン・クーレンら、１９９５） として信頼性が高く、実用的であり、且つ、ウエスタンブロッティングよりも扱 い難くないことが証明された。この同じＩＨＣ技術と同じ抗血清を用いて、一群 の自然罹患した臨床上陽性のスクラピーヒツジ（ｎ＝５５）について数多くのリ ンパ系組織を試験した(バン・クーレンら、投稿中、実験の部も参照)。我々は一 頭を除く全ての動物について(９８％)、その脾臓、咽頭後方のリンパ節、腸間膜 リンパ節および口蓋扁桃中にＰｒＰ^Scが存在することを証明した。試験したリン パ節のうち、扁桃は扁桃一個ごとに検出可能な程、高いＰｒＰ^Scの沈降比を有す ることが判明した。陽性例全ての中で、６０％以上の扁桃小胞が染色陽性であり 、これらの例の９５％で、その比が８０％以上であった。この方法がスクラピー の前臨床段階で適用可能かどうかを評価するために、我々はヒツジの扁桃を摘出 して連続生検を必要とする研究に乗り出した。他の組織を用いることも前臨床診 断のために同様に考慮しうるが、連続的研究のために実験的利用可能性が保証さ れる限り扁桃を選択した。我々は１０ヵ月齢のヒツジ扁桃にスクラピー関連のＰ ｒＰ^Scを検出したが、その月齢は潜伏期の半分以下であって、研究中のヒツジで は略２５月齢のときにスクラピーが発達してくると期待される。もっと後の段階 でスクラピーが発達してくると期待されるヒツジ、あるいは全生涯を健康のまま で終わると期待されるヒツジでは、我々はＰｒＰ^Scのタンパクを検出しなかった 。 スクラピーに関しては、将来の制御プログラムはこれらの知見から利益を得る ことになるだろう。数種の品種での制御プログラムは、ＰｒＰ遺伝子型と増大し たスクラピー感受性または抵抗性との間の確立した連環を使用する養育プログラ ムと、上記の方法、すなわち、当該疾患の前臨床段階で感受性動物の扁桃中Ｐｒ Ｐ^Scの特徴的な存在を検出する方法とを組み合せることから成る。 ＢＳＥ、および一般にはＳＥｓに関しては、今や用いる技術の変更と調整を、 ＢＳＥおよびＳＥ診断の特別の状況および条件に合わせて実施することができる 。これらの変更は、異なる種からのプリオンタンパクのアミノ酸配列における相 同性および異型性についての特別の知識から導くことができる(既知配列の選択 に ついては図１参照)。また、特異抗血清を選択する際に、これらプリオンタンパ クの選択した連続もしくは非連続ペプチド配列の反応性にに対して選択すること により方針を見出し得る。先ず、ＩＨＣ技術はＢＳＥおよび特に末梢リンパ節に 使用するためにさらに改良してもよい。これを成すには脳切片の免疫染色に使用 するプロトコールの改変が必要である。リンパ系組織中のＰｒＰ^Scの検出には、 免疫ブロッティングを使用することのみが臨床例で試みられている(モーリら、 １９９２)。その結果は陰性であり、検出が感度に関して問題のあることを示し ている。ＢＳＥの前臨床段階でＰｒＰ^Scを検出するために容易ならぬ努力はなさ れていない。生きているウシの扁桃生検を採取する技術は実行可能であり、ウシ は軽い鎮静状態（キシラジン（Xylazine）(ロンパン)）とすることができるので 、ヒツジの場合よりも容易でさえある。ＢＳＥの場合に早期診断の可能性があれ ば、英国でウシ集団に関して今日提案されているある厳しい対策の必要性を緩和 することになる。 到達点はまだ遠いとしても、我々の発明の意味するところはヒトのＳＥｓの分 野にある。また、ここで前臨床段階にＩＨＣ技術を適用する可能性は今や確立し たものとなっている。文献では、我々はこの関係におけるリンパ系組織の実験に っいて如何なる参考文献も見出さなかった。より容易に入手できる扁桃があり、 また、常時病理解剖学の実験室に出入りできるのであれば、ヒトＳＥｓに適用し た上記の技術がＳＥｓの疑いのある場合の早期診断に寄与するものとなる。この ことは、潜伏期の早期時点でこの疾患を抱え込んでいる個々人を検出することを も可能とする。少なくとも臨床上の徴候が現れるまでには非常に長い期間がある が、翻ってそれが特定の危険群に適用するための確実な治療手段をも可能とする ことになろう(少なくとも、アンホテリシン−Ｂの使用など、この疾患の進行を 遅らせる介入)。 本発明はこのようにプリオン病の検出方法を提供するものであり、該方法によ って種々組織中の異常タンパクが検出される。該組織はリンパ系または扁桃組織 に限定されるものではないが、生きている動物、特に農耕動物またはヒトまたは 他の動物類から試料化し得るものである。本発明はまた異常タンパクおよび正常 タンパク間の識別をする方法を提供するが、その方法では正常タンパクをタンパ ク分解、水解または変性する方法で正常タンパクを除去するか、あるいは異常タ ンパクを免疫学的に検出することにより識別する。免疫学的検出法では診断テス ト法開発の熟練者が周知の方法を必然的に伴うが、酵素または標識結合もしくは 非結合抗体での免疫学的検出を採用する全ての方法、それはウエスタンブロッテ ィングの技術も包含するが、プリオン病前臨床診断のための黄金の基準が利用可 能になったという事実によりそれらの方法が今や感度のよい特異性の高い技術に 発展する可能性がある。これらの方法はまた、上記方法の必要要素から成る診断 試験あるいはテストキットに発展する可能性がある。本発明はさらにプリオン病 の診断、疾患制御プログラム、消費用肉の選択、および血液あるいは血液製品の 選択に際して、上記の方法、テストまたはテストキットのいずれかの使用を提供 するものである。 実験の部 自然スクラピーの臨床例におけるヒツジリンパ系組織中のプリオンタンパクの 免疫組織化学的検出 材料と方法 ヒツジースクラピー感染に似た神経障害をもつ６７頭のヒツジを購入した。５ ５頭のヒツジは、その脳についての組織病理学的および免疫組織化学的実験によ りスクラピーと診断された(バン・クーレンら、１９９５)。１頭は、スクラピー 感染症と多分単球症リステリアを原因とする同時発症髄膜脳炎に罹患していた。 スクラピー陽性ヒツジは、３０の異なる群れから来ていた。この群は５４頭のメ スと１頭のオスからなり、年齢構成は２〜５才、８ツの異なる品種と雑種から成 っていた。１２頭のヒツジはスクラピー感染症の組織病理学的徴候を示さなかっ たし、その脳もＰｒＰ^Sc免疫染色を示さなかった。これらヒツジのうち５頭は髄 膜脳炎と診断され、１頭は既知原因によるミエリン内浮腫があり、６頭は組織病 理学的異常を示さなかった。スクラピー陰性ヒツジは全て１０の異なる群れと、 ２ツの異なる品種および雑種からのメスであった。年齢は１〜５才である。 剖検−剖検は、自然死後３６時間以内あるいはペントバルビタール・ナトリウ ムの静脈注射および瀉血による致死直後に実施した。脳は以前に記載したとおり 、スクラピー診断のために各ヒツジから摘出した(バン・クーレンら、１９９５) 。試料を数種のリンパ系組織、すなわち、脾臓、口蓋扁桃、表在性頚部リンパ節 (肩甲骨前リンパ節)、腸骨下部リンパ節(大腿前リンパ節)、内側咽頭後リンパ節 、気管気管支リンパ節、腸間膜リンパ節、および回腸から採取した。 組織学的および免疫組織化学的手法 組織試料を２％パラホルムアルデヒドを含む過ヨウ素酸−リジン−パラホルム アルデヒド固定液（ＰＬＰ）（メルク、ダルムシュタット、ドイツ）に直ちに浸 漬し、２４時間放置した。試料を最大２ｍｍの厚さに切り取り、新たに作製した ＰＬＰにさらに２４時間固定した。固定後、組織試料を水洗し、定法どおり脱水 し、パラフィン中に埋め込んだ。５μｍの３つの切片に切断し、３−アミノアル キルトリエトキシシラン−被覆のスライドガラス（シグマ、セントルイス、ミズ ーリ州，米国）に載せ、少なくとも４８時間６０℃で乾燥し、脱パラフィン化し た。最初の切片をヘマトキシリン−エオジン（ＨＥ）で染色した。第二および第 三の切片を、以下の処方に従い、ヒツジのプリオンタンパクに対する抗ペプチド 血清および免疫前血清でそれぞれ免疫染色した。９８％ぎ酸（メルク）に３０分 浸漬した後、切片を洗浄し、水に浸漬して加圧オーブン中１２１℃で３０分間オ ートクレーブ処理した。内因性のペルオキシダーゼをメタノール（メルク）中０ ．３％過酸化水素でブロックした。室温で１時間、抗ペプチド抗血清または免疫 前血清とインキュベートし、１％ウシ血清アルブミン（シグマ）含有リン酸バッ ファー塩液（ｐＨ７．２）で１：１５００に希釈し、次いで、先ずビオチン−結 合ヤギ抗ウサギＩｇＧと、次いでストレプトアビジン−ペルオキシダーゼと１０ 分間および５分間それぞれインキュベートした(ダコパット、グロストラップ、 デンマーク)。基質としてアミノエチルカルバゾール（ザイメッド・ラボラトリ ー・インク、サンフランシスコ、カリフォルニア州、米国）を用いた。その理由 はその赤い色が、リンパ系組織にしばしば存在する黄褐色のカロイド／リポフシ ンおよびへモシデリン色素から容易に識別し得るからである。種々の工程の間に 切片を０．０５％トウイーン−２０（メルク）含有リン酸バッファー塩液で完全 にす すいだ。切片をメイヤーのヘマトキシリンで３０秒間対比染色し、グリセルゲル （ダコパット）に載せた。免疫組織化学染色ごとに、スクラピー罹患が確認され ているヒツジの延髄切片を同時にＰｒＰ染色し、免疫染色手法が正しいか否かを チェックした。 ペプチド合成および抗ペプチド抗血清 ヒツジのプリオンタンパクから誘導した配列をもつ５種のペプチド（ＰｒＰ９ ４−１０５、１００−１１１、１２６−１４３、１４５−１７７、２２３−２３ ４）を合成し、既に公表された手法（バン・クーレンら、１９９５）に従い、抗 ペプチド抗血清をウサギに上昇させるのに用いた。確立した手法に従いスクラピ ー罹患ヒッジの脳から分離し、部分的に精製したプリオンタンパクのウエスタン ブロットに基づき、抗血清がＰｒＰ（未消化でプロティナーゼＫ処理後）に特異 的であることを確認した(ヒルマートおよびディリンジャー、１９８４)。免疫前 血清を免疫処理の前に収集し、陰性対照血清として用いた。 用いた血清は経験的、理論的および分析的価値のどの面でも利点を有するが、 その価値の組み合せは診断への適用においてさらに価値の高いものとなる。血清 の調製についてはバン・クーレンらの報文（１９９５）に記載されている。これ ら血清の免疫化学的性質は一部公表されている。この例に用いる特異血清はスク ラピーの診断用に計画されているが、その手引きは以下に掲げる他のＳＥｓの診 断に適用可能な血清開発のための処方に見出される。ただし、その配列はプリオ ンタンパクの種特異的配列に対応するものとして選択する。もし必要なら、特異 的血清を産生させるためにウサギ以外の他の動物を選択してもよい。 １．該血清はＰｒＰタンパクの配列に基づく配列を有する合成ペプチドで誘導 する。 ２．該血清はウサギで誘導する。 ３．該ペプチドの配列は、これらのペプチドを認識する抗体のみならず標準の ＰｒＰタンパクをも誘導する程度にウサギＰｒＰ配列と差異を有する。 ４．免疫に使用するペプチドは短いものとする(１２マー)。この短さがＰｒＰ のスクラピー型に対し高い特異性を示し、その結果過酷な変性および分解処理 後においてさえ組織切片に結合する上で重要な役割をもつと思われる。 ５．免疫処置に使用し、特異的にスクラピーＰｒＰ染色を生じる配列をＰｒＰ^Sc のプロテアーゼＫ抵抗性ドメインから選択する。 ６．診断用ＩＨＣに使用する血清もまた以下のような他の免疫化学的試験にお いて十分な反応性を有する−ＰｒＰ^CおよびＰｒＰ^Sc双方のウエスタンブロッテ ィング、ＰｒＰタンパクとのＥＬＩＳＡ、ヒツジＰｒＰの重なり配列をもつ１２ マーのＰＥＰＳＣＡＮ。 ７．選択したペプチドは以下の性質（親水性、可変性、表面発現）を有する− 免疫処置に使用したとき−該配列を基本とする抗原に結合する抗体を誘導する利 点を有する。 ８．誘導された抗血清は１２マーのペプチドを有するＰＥＰＳＣＡＮで分析し たとき、適正な特異性を示す。これらペプチドのＮ−端またはＣ−端のいずれか に外来二量化グリシンを付加しても該ペプチドの特異性は低下せず、むしろ多分 さらに免疫化をより効果的にする。その理由は恐らく該ペプチドをさらに担体タ ンパクから際立たせて、抗原性の重要な決定因子である担体タンパクの性質の上 で該ペプチドをより柔軟なものとするからと思われる。 ９．ペプチド合成および免疫処置のために選択した配列は、二次構造（α−ヘ リックスまたはβ−シート）を形成する傾向の低いドメインを表出し、合成ペプ チドとしてβ−シートを形成することのできる文献ａに記載されたような４領域 の部分ではない。 結果 抗ペプチド抗血清の免疫組織化学的検定 同一および別個の免疫標識パターンをスクラピー罹患ヒツジのリンパ系組織に ついて、全抗ペプチド抗血清により検出した。５種の抗血清はＰｒＰタンパクの 異なるエピトープに対するものであったので、該抗ペプチド抗血清と他のタンパ クとの交差反応性は除外することができた。それ故、我々は免疫標識タンパクを ＰｒＰとして分類した。さらに我々はスクラピー陰性ヒツジのいずれのリンパ系 組織にもＰｒＰ免疫反応性が見られないという理由で、このＰｒＰをスクラピー 関連ＰｒＰ（ＰｒＰ^Sc）と定義した。該抗ペプチド抗血清を免疫前血清と置き換 えると、如何なる免疫標識も生じなかった。 リンパ系組織におけるＰｒＰ^Scの定位 ＰｒＰ^SCは脾臓、口蓋扁桃、リンパ節、および孤立リンパ小節もしくは回腸の パイエル集腺の一次および二次リンパ系小胞内に位置していた(図１Ａ−Ｃ)。Ｐ ｒＰ^Scの免疫標識パターンはリンパ系小胞中心の網状ネットワークから成り、染 色強度は多様であった。このネットワークから離れると、大小のＰｒＰ^Sc粒子が 小胞内の非リンパ系細胞の細胞質中に見られた。これら細胞の幾つかは、その細 胞質中にセロイド／リポフシン色素が同時に存在することから、マクロファージ であると同定した(図１Ｄ)。リンパ系小胞のＢリンパ球の免疫標識は認めなかっ た。 さらなる免疫標識を特定の細胞とリンパ系組織の領域にしばしば認めた。脾臓 では、動脈周囲リンパ鞘（ＰＡＬＳ）の個々の細胞と脾臓小体周縁の辺縁帯が、 時には細胞質内のセロイド／リポフシン色素と組み合わさってＰｒＰ^Sc粒子を含 んでいた。脾臓の赤色髄にはＰｒＰ^Scを認めなかった。口蓋扁桃と回腸には、Ｐ ｒＰ^Scの枝別れまたは粒子が小胞と陰窩上皮の間の円蓋リンパ球間に散在してい るのを見出した。リンパ節ではＰｒＰ^Sc粒子を傍皮質のリンパ球間に認めた。 リンパ系組織中のＰｒＰ^Scの分布 ＰｒＰ^Scは５５頭のスクラピー罹患ヒツジのうち、５４頭（９８％）の脾臓、 扁桃、咽頭後リンパ節および腸間膜リンパ節に検出した。気管気管支、大腿前お よび肩甲骨前リンパ節では、僅かに低いパーセントでＰｒＰ^Scを認めた(表１)。 孤立リンパ小節もしくは回腸のパイエル集腺については、リンパ系組織が回腸の 切片に存在する２７頭のヒツジのうち、２４頭（８９％）にＰｒＰ^Scが見出され た。５５頭のスクラピー罹患ヒツジのうち、唯１頭だけ、いずれのリンパ系組織 にもＰｒＰ^Scを検出できなかった。 ＰｒＰ^Scを含むリンパ小節の割合は脾臓、扁桃およびリンパ節の切片について 見積もった。９８％のスクラピー罹患ヒツジの口蓋扁桃では、６０％を超える リンパ小節がＰｒＰ^Scを含んでいた。スクラピーをもつヒツジ９３％の扁桃では 、ＰｒＰ^Sc陽性のリンパ小節の割合が８０％を超えていた。脾臓またはリンパ節 において、リンパ小節に６０％を超えるＰｒＰ^Scの蓄積をみたのは３０％を下回 るヒツジにおいてのみであった。 前臨床例で自然スクラピーをもつヒツジのリンパ系組織におけるプリオンタン パクの免疫組織化学的検出 材料と方法 ヒツジ 我々は、１０頭の雑種子ヒツジを意図的に一群として選んだ。そのうちの６頭 はＰｒＰ対立遺伝子に対してホモ接合であり、該遺伝子は１３６位にバリン（Ｖ ）を有し、１７１位にグルタミン（Ｑ）を有するものであった。幾つかの品種に おいて、このＰｒＰ^VQ対立遺伝子はスクラピーに対して感受性が高まることと有 意に関係していた(ベルトら、１９９５)。残り４頭の子ヒツジはヘテロ接合であ って、１ヶのＰｒＰ^VQ対立遺伝子と１ヶのＰｒＰ^AR対立遺伝子を有していた(１ ３６位がアラニンおよび１７１位がアルギニン)。ＰｒＰ^AR対立遺伝子は、スク ラピーに対して抵抗性を増大させることと有意に関係していた。自然スクラピー をもつ群れの中で我々が観察したことは、ＰｒＰ^VQ/VQ遺伝子型をもつヒツジは 約２５月齢でスクラピーのために死亡したこと、また、ＰｒＰ^VQ/AR遺伝子型を もつヒツジの大多数は７０月齢でもなお健康であったことである。我々はＰｒＰ^VQ/VQ のヒツジが誕生後約２５ヵ月以内にほとんど確実にスクラピーの徴候を現 し始めるだろうこと、また、ＰｒＰ^VQ/ARのヒツジは健康のままであろうことを 予測していたので、我々はこれら２ツのヒツジの群を、潜伏期間中既知段階での 変化を研究するのに適切なモデルであると見なした。１０頭のヒツジ全てが同じ 農場で生まれ育ち、その環境では数年来スクラピーが発生していた。これらのヒ ツジが我々の研究所に移され、種々のスクラピー陽性動物が最後の日を過ごした 小牧場に移されるまでの６月齢まで、かれらはその農場で飼育された。 生存動物扁桃の試料採取と検定 扁桃生検を全身麻酔下に採取した。全身麻酔はケタラー（塩酸ケタミン）４ｍ ｇ／ｋｇ、キシラジン（ロンパン）０．０５ｍｇ／ｋｇおよびアトロピン０．１ ｍｇ／ｋｇを組み合せて静脈投与することにより行った。我々は開口器、喉頭鏡 、および直径約４ｍｍの先端をもつ生検用ピンセットを用いた。ヒツジの扁桃は 、ヒトのような他種動物でのように容易に接近し得るものではない。他種動物で は多くの場合咽頭管腔に扁桃がとび出ている。ヒツジではそれが小さな空隙を取 巻いて隠れている。しかし、この空隙（扁桃窩）に続く入り口の縁を生検採取す れば充分であることが証明され、これによって一般に実験を可能とする十分量の 試料（小胞）を採取することができる。動物を安楽死させる直前に、１１頭のヒ ツジ、特に臨床的に罹患したスクラピーヒツジから扁桃生検を採取することによ り、この技術においてある経験が得られた。組織学的手法とは、上記およびバン ・クーレンら（１９９５）に記載のように、特異（抗−ＰｒＰ^Sc）抗ペプチド血 清で免疫染色することを包含する。ヒツジ１１頭のうちの８頭はスクラピー陽性 であることが証明され、一方、３頭は陰性となっていた。この事実は組織学的に 、また死後実験に際しての脳組織のＩＨＣにより確認した。８頭の陽性動物全て の扁桃生検がＩＨＣで陽性の免疫染色を示しが、３頭の陰性例では免疫染色が検 出できなかった。 実際の実験で我々は扁桃生検を連続的に、一定間隔で採取し、６月齢で開始す ることを計画した。論理的理由でこれは遅延した。我々は誕生後約１０ヵ月目で 初めて両群から生検を採取した。その時点ではどのヒツジもスクラピーの臨床的 徴候を示していなかった。最も若いヒツジで９ヵ月半、最年長が１０ヵ月と１週 であった。 結果 ＩＨＣ染色により、我々が明らかにしたことは、６頭の感受性PｒＰ^VQ/VQヒツ ジ全ての扁桃生検においてＰｒＰ^Sc染色が明確ですでに広範であることを知った 。一方、抵抗性ＰｒＰ^VQ/Arヒツジの扁桃生検では免疫染色が検出できなかった 。我々はこのようにして１０月齢のヒツジの扁桃においてスクラピー関連ＰｒＰ^Sc を検出したが、この月齢は約２５月齢でスクラピーが表出すると我々が期待し た潜伏期間の半分以下である。もっと後の段階でスクラピーが発症するか あるいは全生涯健康のままでいると期待されるヒツジでは、我々はこのＰｒＰ^Sc を検出しなかった。我々は、ＩＨＣ−染色と関連の方法がヒツジのスクラピーな らびにＢＳＥおよびＣＪＤなど他のＳＥｓについての前臨床診断を可能とすると 結論する。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】１９９８年６月３０日（１９９８．６．３０） 【補正内容】 請求の範囲 １．異常タンパクのプロテアーゼＫ抵抗性ドメインからのペプチド配列に対し 誘導した少なくとも１種の抗体を使用して、生存動物から標本調製可能な組織中 に異常タンパクを検出することを特徴とするプリオン病の検出方法。 ２．該動物が哺乳類であることを特徴とする請求項１記載の方法。 ３．該組織がリンパ系であることを特徴とする請求項１または２記載の方法。 ４．該組織が扁桃であることを特徴とする請求項１記載の方法。 ５.異常タンパクと正常タンパクとを識別することを特徴とする請求項１，２ ，３または４記載の方法。 ６．該正常タンパクを除去することを特徴とする請求項５記載の方法。 ７．該プリオン病を前臨床段階で検出することを特徴とする請求項１〜６のい ずれかに記載の方法。 ８．請求項１〜７のいずれかに記載の方法を実施するために必要な要素を含む 診断試験法または試験キット。 ９．さらに酵素もしくは標識結合または非結合抗体を含む請求項８記載の診断 試験法または試験キット。 １０．プリオン病の診断または疾患制御プログラムまたは動物起源生成物中の 異常タンパクの検出における請求項１〜７のいずれかに記載の方法または請求項 ８もしくは９に記載の診断試験法または試験キットの使用。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ， ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，Ｇ Ｂ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ， ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，Ｎ Ｏ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ， ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ (72)発明者 ファン キューレン，リュシュス ヨハネ ス マッチェース オランダ国 エヌエル―3981 ゼットエル ビュニック フレットウェイデ 194 (72)発明者 フロマンス，マリア エリザベス ウィル ヘルミナ オランダ国 エヌエル―8244 エーエー レリスタット ウェストカープ ８ (72)発明者 ランヘフェルト，ヨハネス ピーテル マ リア オランダ国 エヌエル―3844 イェーベー ハルデルウェイク ステーデンメーン 12 (72)発明者 スミッツ，マリニュス アドリアニュス オランダ国 エヌエル―3844 カーエー ハルデルウェイク マストメーン 18

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．生存動物から標本調製可能な組織中に異常タンパクを検出することを特徴 とするプリオン病の検出方法。 ２．該動物が哺乳類であることを特徴とする請求項１記載の方法。 ３．該組織がリンパ系であることを特徴とする請求項１または２記載の方法。 ４．該組織が扁桃であることを特徴とする請求項１記載の方法。 ５.異常タンパクと正常タンパクとを識別することを特徴とする請求項１、２ ，３または４記載の方法。 ６．該正常タンパクを除去することを特徴とする請求項５記載の方法。 ７．該異常タンパクを免疫学的に検出することを特徴とする請求項５記載の方 法。 ８．該プリオン病を前臨床段階で検出することを特徴とする請求項１〜７のい ずれかに記載の方法。 ９．請求項１〜８のいずれかに記載の方法を実施するために必要な要素を含む 診断試験法または試験キット。 １０．さらに酵素もしくは標識結合または非結合抗体を含む請求項９記載の診 断試験法または試験キット。 １１．プリオン病の診断または疾患制御プログラムまたは動物起源生成物中の 異常タンパクの検出における請求項１〜８のいずれかに記載の方法または請求項 ９もしくは１０に記載の診断試験法または試験キットの使用。