JP2000508163A

JP2000508163A - モノオキシゲナーゼシトクロムＰ４５０ｃａｍ変異体

Info

Publication number: JP2000508163A
Application number: JP9517168A
Authority: JP
Inventors: ルートロクウォン; サービンラージアフリッチ; ダーレンポールニッカーソン; アルウィンジェームズハート
Original assignee: ビージーピーエルシー
Priority date: 1995-11-01
Filing date: 1996-11-01
Publication date: 2000-07-04
Also published as: SK55598A3; CA2236381A1; GB2306485B; CN1212015A; GB9622819D0; GB2306485A8; GB2306485A; WO1997016553A1

Abstract

(57)【要約】３３４番目の部位のシステイン残基が除去されている、モノオキシゲナーゼシトクロムＰ４５０ｃａｍ変異体。

Description

【発明の詳細な説明】モノオキシゲナーゼシトクロムＰ４５０ｃａｍ変異体本発明は、モノオキシゲナーゼシトクロムＰ４５０ｃａｍ変異体に関する。モノオキシゲナーゼは、活性化された又は活性化されていない炭素−水素結合の酸素を用いての選択的酸化を触媒し¹、それゆえ有機合成における潜在的な使用について大きな興味が持たれている。しかしながら、この領域における進歩は、モノオキシゲナーゼ酵素及び／又は関連電子伝達タンパク質の十分な量を単離することの困難性により妨げられてきた。１５０以上の異なるシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼのアミノ酸配列が入手可能であるにもかかわらず、現在まで、入手できる構造のデータはわずか３種類のみであり^2,3,4、細菌系において首尾よく過剰発現しているものはほとんどない⁵。可溶性かつ十分な量を発現することができる、あるシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼは、ピー・プチダ（P.putida）由来の高度特異的Ｐ−４５０ｃａｍであり、この酵素はショウノウの５−エキソ−ヒドロキシショウノウへの位置選択的かつ立体選択的ヒドロキシル化を触媒する⁶。Ｐ−４５０ｃａｍの高分解能の結晶構造が測定され²、この細菌酵素の作用機序は哺乳類における対応物の作用機序と非常に類似していると信じられているので、Ｐ−４５０ｃａｍは、哺乳類酵素の構造モデルが基本とする枠組み（framework）として利用されている。Ｐ−４５０ｃａｍのヌクレオチド配列及び対応するアミノ酸配列は文献に記載されている^5,7。この酵素の活性部位の位置は知られており、構造と機能との関係が研究されてきている^8,9。Ｐ−４５０ｃａｍの変異体は、１０１、１８５、２４７及び２９５番目の部位におけるもの^9,10,11、並びに８７番目の部位におけるもの¹²が文献に記載されている。９６番目の部位のチロシン（Ｙ９６）が９６番目の部位のフェニルアラニンに変化した変異体（Ｙ９６Ｆ変異体）が文献に記載されている^11,13,14,15。しかし、全ての場合において論文は、変異体の、野生型酵素に対する基質としてあらかじめ示されている分子の酸化反応に対する作用について報告している。どのように変異体を使用して、異なる新規な基質の酸化に対する生体触媒を提供するかということについての教示は全くない。新規な生体触媒を開発する試みにおいて、本発明者等はＰ−４５０ｃａｍをリデザイン（redesign）し、野生型タンパク質に対する基質であろうとなかろうと有機分子の特異的酸化を効率的に行うことができるようにすることを目的とする計画を開始した。図１に示されるように、Ｐ−４５０ｃａｍの三次元構造は、活性部位が、ショウノウの疎水基とのファン・デル・ワールス力による密接な接触（close van de r Waals contact）を提供することを示している。ショウノウと２４４番目の部位のロイシン、２４７番目のバリン及び２９５番目のバリンの側鎖との接触は特に重要である。３つの芳香族残基（Ｙ９６、Ｆ８７及びＦ９８）は共にグループ化（group）して、基質結合ポケット（substrate binding pocket）に並び、９６番目のチロシンとショウノウのカルボニル炭素との間に水素結合を有する。これは正しい配向で基質を維持し、反応の位置特異性かつ立体特異性を保証する。 Lipscomb等¹⁶は、１９７８年に、野生型のＰ−４５０ｃａｍが二量体化する傾向があることを実証したが、ショウノウ酸化に対するモノマー及びダイマーの触媒活性は識別することができなかったことも報告している。二量体化反応はチオール還元剤により逆転することができるので、二量体化反応は分子間システインジスルフィド（Ｓ−Ｓ）結合形成により起こると結論づけた。彼らは、二量体化が、Ｐ−４５０ｃａｍ分子あたり１以上のシステインと関係するかどうかを決定することができなかった。また、この反応に関与する鍵となるシステイン残基を同定することもできなかった。なぜならば、Ｐ−４５０ｃａｍのアミノ酸配列及び結晶構造がこの時点では未知であったからである。本発明者等は、分子モデリング化（molecular modelling）を使用して、活性部位ポケット（active site pocket）における３つの芳香族残基（Ｙ９６、Ｆ８７、Ｆ９８）に対する点変異の起こりうる作用を研究した。本発明者等は、小さい疎水性非芳香族側鎖でこれらの芳香族残基のいずれかを置換すると、より疎水性の基質と結合するために使用することができる「芳香族ポケット（aromatic pocket）」を提供することができることに注目した。プログラムＧＲＩＤ¹⁷を使用して、芳香族プローブと前記の残基をアラニンに変えたシトクロムＰ−４５０ｃａｍの可能性のある変異体（Ｆ８７Ａ、Ｙ９６Ａ及びＦ９８Ａ）との間の相互作用エネルギーを計算した。次いで結果を、分子モデリングパッケージクォンタ（Quanta）¹⁸を使用して図解的に調べた。変異体Ｆ９８Ａは、芳香族プローブに接近しやすい活性部位空洞（cavity）内で強い結合相互作用を有し、Ｙ９６Ａではわずかに小さく、Ｆ８７Ａでは実質的に欠いている（less）ことが明らかになった。第一の例においては、９６番目の部位のチロシンをアラニンに変異させることに決定した。なぜならば、結合ポケットに対してより中心的（central）であるからである。一方、９８番目の部位のフェニルアラニンはある面に対する溝の中に存在する。また、９６番目の部位のチロシンの除去は、ショウノウに対する基質特異性を減少させるだろう。なぜならば、基質に対する水素結合が喪失するからである。本発明の一面に従い、３３４番目のシステイン残基が除去されたモノオキシゲナーゼシトクロムＰ４５０ｃａｍの変異体が提供される。好ましくは、除去は、システイン残基を、システイン残基以外の別のアミノ酸で置換することにより行われる。別に、除去は、３３４番目のシステイン残基全体を酵素から削除することにより行われる。適宜、変異体中の９６番目の部位のチロシン残基を、チロシン以外の別の残基により置換する。都合のよいことに、アミノ酸は、以下に示すアミノ酸：アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン及びバリンからなる群より選択される。ただし、３３４番目の部位がシステイン残基である場合には、アミノ酸はシステインではなく、９６番目の部位がチロシン残基である場合には、アミノ酸はチロシンでない。好ましくは、８７、９８、１０１、１８５、１９３、２４４、２４７、２９５、２９７、３９５及び３９６番目の部位の１以上の部位におけるアミノ酸は、別のアミノ酸残基により置換されている。本発明者等は、公開されている結晶学的原子配位（crystallographic atomic co-ordinate）から作成するＰ−４５０ｃａｍの構造を、モデリングプログラムクォンタを使用して調べた。本発明者等は、Ｐ−４５０ｃａｍ表面近くに存在し、タンパク質の二量体化を導く分子間ジスルフィド結合形成に関係しているかもしれない５つのシステイン（５８、８５、１３６、１４８及び３３４番目のシステイン）の存在を決定した。本発明者等は、部位特異的変異誘発を行い、これらのシステインをアラニンに置換し、５種のＣｙｓ−Ａｌａ表面変異体（surfac emutant）を生成した。野生型Ｐ−４５０ｃａｍ及び５種のＣｙｓ−Ａｌａ表面変異体におけるタンパク質二量体化の程度について研究した。野生型Ｐ−４５０ｃａｍ並びにＣ５８Ａ、Ｃ８５Ａ，Ｃ１３６Ａ及びＣ１４８Ａ変異体において、二量体の存在を、リソース（Resource）Ｑカラム（ファルマシア）中のアニオン交換高速タンパク質液体クロマトグラフィー（anion exchange fast protein liquid chromatography ）及びスーペローズ（Superose）１２カラム（ファルマシア）中のゲル濾過サイズ排除クロマトグラフィーの両者により検出した。一方、Ｃ３３４Ａ変異体については、高濃度下に（０．１ｍＭの範囲）においてさえも、二量体は検出されなかった。本発明者等は、野生型Ｐ−４５０ｃａｍは、２つのタンパク質分子中の３３４番目の表面システインの間の分子間Ｓ−Ｓジスルフィド結合形成により二量体化を受けると結論づけた。Ｃ３３４Ａ変異体は、望ましくないタンパク質の二量体化を除去するという明白な利益を有し、したがって、溶液中における単量体種（single species）の存在を常に保証する。更に、本発明者等は、この変異体の全く予期しない利益に注目した。全てのタンパク質と同様に、野生型Ｐ−４５０ｃａｍは静置状態において凝集を示す。なぜタンパク質が凝集するのかは明確ではないが、Ｐ−４５０ｃａｍ凝集体は不溶性であり、かつ触媒作用的に不活性である。野生型並びにＣ５８Ａ、Ｃ８５Ａ、Ｃ１３６Ａ及びＣ１４８Ａ変異体は、すべて、４℃における保存及び−２０℃の５０％グリセロール溶液中においてさえも、凝集及び二量体化を示した。凝集は、ターンオーバーの間、特にあらゆる商業的に実行可能な産業利用、特に有機分子合成において要求される高濃度のＰ−４５０ｃａｍにおいても起こるだろう。Ｃ３３４Ａ変異体は、たとえｍＭの濃度で、室温下で３日間以上経過しても、凝集のあらゆる証拠を示さなかった。したがって、Ｃ３３４Ａ変異体は、タンパク質の取扱い、保存及び増加した触媒の有効期間において有利な作用を有する。本発明者等は、９６番目の部位における変異は、変異した酵素がかなり広範囲の有機基質を触媒することを可能にする鍵であると信じている。酵素の活性部位に隣接するその他のアミノ酸を、活性部位の形状及び特異性を変化させるために変異させてもよい。これらその他のアミノ酸には、８７、９８、１０１、１８５、１９３、２４４、２４７、２９５、２９７、３９５及び３９６番目の部位のアミノ酸が含まれる。これらの部位のうちの１以上の部位におけるアミノ酸を、活性部位を拡張するために小さい疎水性アミノ酸により置換、又は活性部位を縮小するために大きい疎水性アミノ酸により置換、又は基質の芳香族環と相互作用するために対応する芳香族環を有するアミノ酸により置換できることが予見されている。酸化反応に関して、条件は、添付した参考文献リストの文献に記載されている。酵素系は、典型的に、変異した酵素に加えて、プチダレドキシン（putidaredo xin）及び補因子としてのＮＡＤＨと共のプチダレドキシンレダクターゼを含んでいる。シクロヘキシルベンゼン酸化の例は、以下の実験に関するセクションに記載されている。有機化合物の種々のクラスは以下に予見及び記載されている。本発明者等は、野生型Ｐ−４５０ｃａｍは、以下に示すセクションに含まれる多数の分子の酸化に対して活性であることに注目している。しかしながら、全ての場合において、変異体Ｐ−４５０ｃａｍタンパク質は、非常に高いターンオーバー活性を示す。ｉ）有機化合物は、芳香族化合物、炭化水素又は酵素を失活又は変性させない条件下において使用される化合物のいずれかである。変異は、酵素の活性部位中の芳香族−結合ポケットを作成する目的で行われるので、変異した酵素は広範囲の芳香族化合物の酸化を触媒することができる。例示としての芳香族及びポリ芳香族（polyaromatic）化合物の酸化については、以下に示す実験セクションにおいて実証されており、更に非常に驚くべきことに、野生型酵素はショウノウファミリーのメンバーのみの酸化を触媒することが報告されていたが、その他幾つかの分子、例えばスチレン¹⁹、エチルベンゼン^9,10、テトラロン誘導体²⁰及びニコチン²¹等に対して低い活性を示した。ｉｉ）有機化合物は炭化水素、例えば官能基を有する脂肪族又は脂環式化合物であってもよい（スキーム１参照）。芳香族保護基を、酸化反応の前に官能基に付加し、酸化反応後に官能基から除去する。適当な芳香族基はベンジル基である。保護基は２つの目的に対して役立つ。１つは、基質をより疎水性にし、それゆえ疎水性酵素ポケットへの結合を増加させること。２つめは、基質を活性部位に保持することを補助するかもしれないということである。したがって、正しい芳香族保護基を使用することにより、基質の位置選択的かつ立体選択的なヒドロキシル化が達成されるだろう。１官能基化（monofunctionalised）炭化水素の例としては、シクロヘキシル、シクロペンチル及びアルキル誘導体があげられる（スキーム１）。これらの化合物の酸化生成物は、有機合成、特にホモキラル形態において生成するときの有益な出発物質である。芳香族保護基の範囲が予見されている、例えばベンジル又はナフチルエーテル及びベンゾイルエーテル並びにアミドである（スキーム１）。カルボキシル保護基としてのベンゾオキサゾール基及びアルデヒド保護基としてのベンジルオキサゾリジン基は興味の対象になる。両者とも酵素による酸化の後容易に切断することができ、アルデヒド及び酸の微生物酸化についての文献に記載されている²²。ｉｉｉ）有機化合物は、Ｃ４〜Ｃ１２の脂肪族又は脂環式炭化水素である。シクロヘキサン並びに直鎖及び分岐炭化水素の酸化は、以下に示す実験セクションにおいて実証されている。本発明者等は、野生型Ｐ−４５０ｃａｍもこれらの分子を酸化することができるが、その活性は低く、変異体では全ての場合において実質的に高い活性を示すことを見出した。ｉｖ）有機化合物はハロゲン化脂肪族又は脂環式炭化水素である。リンデン（ヘキサクロロシクロヘキサン）の酸化についても以下に記載されている。活性部位の置換と３３４番目の部位のシステインのアラニンへの表面変異（surface mutation）とが組み合わされ、かつ９６番目の部位のチロシン（Ｙ９６）の代わりにアラニン、ロイシン、バリン又はフェニルアラニンを含んでいる変異体を構築した。最終的に、幾つかの活性部位変異（active site mutation）と表面変異とを組合わせて、複数の変異を有する変異体酵素を構築した。シトクロムＰ−４５０ｃａｍ、その天然の電子伝達パートナーであるプチダレドキシン及びプチダレドキシンレダクターゼをコードする遺伝子を、ピー・プチダ（P．Putida）の全細胞ＤＮＡから、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて増幅した。使用した発現ベクター／大腸菌（E．coli）宿主の組み合わせは、Ｐ−４５０ｃａｍについてはＪＭ１０９株中のｐＲＨ１０９１であり²³、プチダレドキシンについてはＪＭ１０９株中のｐＵＣ１１８であり、プチダレドキシンレダクターゼについてはＤＨ５株中のｐＧＬＷ１１であった。オリゴヌクレオチドに向けられた、部位特異的変異（oligonucleotide-directed site-specif ic mutagenesis）を、Zoller及びSmithの方法²⁴に従い、Ｍ１３ｍｐ１９サブクローンを使用して行い、変異体の選択はKunkelの方法²⁵により行った。可能性のある基質の結合を、分光学的方法により研究した。基質の非存在下における野生型酵素は、６−共配位（6-co-ordinated）低スピン形態であり、弱い結合水は６番目の共配位部位を占有し、４１８ｎｍに特徴的な最大ソーレー帯（Soret maximum）を示す。ショウノウ及び基質類似体であるアダマンタノン、アダマンタン及びノルボルナンの結合は、ヘムを、３９２ｎｍに特徴的なソーレー帯を有する５−配位高スピン形態に完全に転換した。このヘムのスピン状態のシフト（haem spin-state shift）は、ヘムの還元ポテンシャルの増加により達成され、このことは生理学上の電子伝達パートナーであるプチダレドキシンにＰ −４５０ｃａｍを還元させ、触媒作用的ヒドロキシル化サイクルを開始させることを可能にする²⁶。したがって、ヘムのスピン状態シフトは、表１及び表２に示されるように、野生型及びＰ−４５０ｃａｍ酵素変異体により酸化される分子の見込みの定性的な徴候になる。緩衝液（５０ｍＭ、トリス塩酸、ｐＨ７．４）であって、１０μＭプチダレドキシン、２μＭプチダレドキシンレダクターゼ、１μＭシトクロムＰ−４５０ｃａｍモノオキシゲナーゼ（野生型又は変異体）、２００ｍＭＫＣｌ、５０μｇ／ｍｌウシ肝臓カタラーゼ（シグマ）及び１ｍＭの標的有機化合物、例えばシクロヘキシルベンゼン（エタノール中の０．１Ｍストックとして添加）を含む緩衝液、典型的には３ｍ１を３０℃で５分間プレインキュベートした。ＮＡＤＨを全濃度が２ｍＭになるよう添加することにより酵素反応を開始させた。追加の４つのＮＡＤＨのアリコート（各回１ｍＭずつＮＡＤＨ濃度を上昇させるため）を、１０分間隔で添加し、３０分間インキュベートし、１つの基質のアリコート（１ｍＭずつ濃度を上昇させるため）も添加した。６０分間経過後、クロロホルム０．５ｍｌを添加し、混合物をボルテックスすることにより、反応を終了させた。層を、４℃における遠心分離（４０００ｇ）により分離した。クロロホルム層をガスクロマトグラフィーにより分析した。Ｐ−４５０ｃａｍが介在する酸化生成物を商業的に入手することができるとは限らない、多数の基質化合物、例えばシクロヘキシルベンゼンについては、クロロホルム抽出物を窒素を流しながら乾燥するまで蒸発させた。残渣をヘキサンを用いて抽出し、酸化生成物を高速液体クロマトグラフィーにより分離し、ヘキサン／イソプロパノール勾配を用いて溶離した。精製した生成物を、質量分析装置及び特に核磁気共鳴分光器により同定した。水性緩衝液に対して異なる溶解度を有する異なる基質については、インキュベート混合物に添加する基質量を、終濃度０．２〜０．４ｍＭの間で変化させた。ＮＡＤＨ濃度を３４０ｎｍでモニターし、全ての場合において、インキュベーションの間に追加の基質及びＮＡＤＨを添加した。前記の実験技術を使用して、本発明者等は、野生型Ｐ−４５０ｃａｍ及び変異体Ｙ９６Ａの両者に対する基質としてのかなりの数の有機化合物を研究した。研究には、変異体：Ｙ９６Ｖ；Ｙ９６Ｌ：Ｙ９６ｆ：Ｃ３３４Ａ：複合（combined ）変異体：Ｆ８７Ａ−Ｙ９６Ｇ−Ｆ１９３Ａ及び活性部位及び表面の複合変異体：Ｙ９６Ａ−Ｃ３３４Ａ、Ｙ９６Ｌ−Ｃ３３４Ａ、Ｙ９６Ｆ−Ｃ３３４Ａ、Ｆ８７Ａ−Ｙ９６Ｇ−Ｆ１９３Ａ−Ｃ３３４Ａを含んでいた。Ｃ３３４Ａ及びＣ３３４Ａ−Ｙ９６Ａについての結果を、表１及び２に示す。ここでは、構造的に関連している分子を共にグループ化した。表１は、変異体Ｙ９６Ａ−Ｃ３３４Ａによる、小さい直鎖、分岐及び環状炭化水素の酸化に対するＮＡＤＨの消費を列挙している。表２（ａ）〜２（ｈ）は、現在までに明らかになった変異体と基質の組み合わせについての生成物の分布を列挙している。３４４番目の部位におけるシステイン残基は、周知かつ自由に利用することができる標準的な制限技術により削除することができ、それゆえ本明細書には詳細には説明しない。スキーム１： ^a値は、Sligarの方法(S.G．Sligar、Biochemistry．1976．15．5399-5406)を使用した２つの独立した測定の平均値である。Ｋ_appの値は、緩衝液中のＫ⁺の濃度に強く依存している。［Ｋ⁺］＞１５０ｍＭにおいて、ショウノウに対するＫ_app は、野生型及びＹ９６Ａ共に０．６μＭである。本表におけるデータは、高いイオン濃度における基質の塩析を避けるために、リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中、［Ｋ⁺］＝７０ｍＭにおいて測定した。^b 飽和には達しなかった。表３Ｐ４５０ｃａｍ変異体による小さいアルカンのターンオーバー以下に列挙するすべての変異体はＣ３３４Ａ変異を含んでいる。ＮＡＤＨ消費速度として測定したターンオーバー速度（ナノモルＮＡＤＨ／ナノモルＰ４５０ｃａｍ／秒）Ｐ４５０ｃａｍ活性部位変異体による基質の酸化にしたがう生成物の構造及び分布「バックグラウンド」−典型的なバックグラウンドのＮＡＤＨ酸化速度は０．０７ナノモルＮＡＤＨ(ナノモルＰ４５０ｃａｍ)^-1秒^-1である。

【手続補正書】【提出日】１９９８年５月１日（１９９８．５．１）【補正内容】請求の範囲 1. ３３４番目の部位のシステイン残基が除去されている、モノオキシゲナーゼシトクロムＰ４５０ｃａｍ変異体。 2. 除去が、システイン残基を、システイン以外のアミノ酸で置換することにより行われる、請求の範囲第１項記載の変異体。 3. 除去が、酵素から、３３４番目の部位のシステイン全体を削除することにより行われる、請求の範囲第１項記載の変異体。 4. 変異体中の９６番目の部位のチロシン残基が、チロシン以外の別のアミノ酸で置換されている、請求の範囲第１項〜第３項のいずれかに記載の変異体。 5. アミノ酸が、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン及びバリンからなる群より選ばれる、請求の範囲第１項、第２項又は第４項のいずれかに記載の変異体。 6. ８７、９８、１０１、１８５、１９３、２４４、２４７、２９５、２９７、３９５及び３９６番目の部位の１以上の部位におけるアミノ酸が、別のアミノ酸残基で置換されている、請求の範囲第１項〜第５項のいずれかに記載の変異体。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ニッカーソンダーレンポールイギリスオックスフォードオーエックス１３ユーエイチマナーロードホリーウェルマナー（番地なし) (72)発明者ハートアルウィンジェームズイギリスレスターシャーエルイー11 ３キュービーラフボローウッドブルックロード 33

Claims

【特許請求の範囲】 1. ３３４番目の部位のシステイン残基が除去されている、モノオキシゲナーゼシトクロムＰ４５０ｃａｍ変異体。 2. 除去が、システイン残基を、システイン以外のアミノ酸で置換することにより行われる、請求の範囲第１項記載の変異体。 3. 除去が、酵素から、３３４番目の部位のシステイン全体を削除することにより行われる、請求の範囲第１項記載の変異体。 4. 変異体中の９６番目の部位のチロシン残基が、チロシン以外の別のアミノ酸で置換されている、請求の範囲第１項〜第３項のいずれかに記載の変異体。 5. アミノ酸が、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン及びバリンからなる群より選ばれる、請求の範囲第１項、第２項又は第４項のいずれかに記載の変異体。 6. ８７、９８、１０ｌ、１８５、１９３、２４４、２４７、２９５、２９７、３９５及び３９６番目の部位の１以上の部位におけるアミノ酸が、別のアミノ酸残基で置換されている、請求の範囲第１項〜第５項のいずれかに記載の変異体。 7. 添付の図面及び／又は実施例に関連して前記に実質的に記載されているモノオキシゲナーゼシトクロムＰ４５０ｃａｍ変異体。