JP2000511060A - 組み合せたリガーゼ検出およびポリメラーゼ連鎖反応を用いる核酸配列相違の検出 - Google Patents

組み合せたリガーゼ検出およびポリメラーゼ連鎖反応を用いる核酸配列相違の検出

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、組み合せたリガーゼ検出反応（ＬＤＲ）およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて検出配列の相違を検出することに関する。本発明の１つの実施態様は、ポリメラーゼ連鎖反応に組み合せたリガーゼ検出反応の使用である。本発明の他の実施態様は、１次ポリメラーゼ連鎖反応と組み合わせた２次ポリメラーゼ連鎖反応と組み合せたリガーゼ検出反応である。本発明の第３の実施態様は、１次ポリメラーゼ連鎖反応と組み合わせた２次ポリメラーゼ連鎖反応である。リガーゼ検出反応およびポリメラーゼ連鎖反応のこのような組み合せは、核酸配列相違の多重検出を可能とする。

Description

【発明の詳細な説明】 組み合せたリガーゼ検出およびポリメラーゼ 連鎖反応を用いる核酸配列相違の検出 本出願は１９９６年５月２９日付の米国仮出願６０／０１８,５３２の利益を 享受する。 本発明は、米国保健研究所認可番号ＧＭ４１３３７−０６による政府資金でも ってなされた。米国政府が一定の権利を有し得る。 発明の分野 本発明は、組み合せたリガーゼ検出反応（ＬＤＲ）およびポリメラーゼ連鎖反 応（ＰＣＲ）を用いて検出配列の相違を検出することに関する。本発明の１つの 実施態様は、ポリメラーゼ連鎖反応に組み合せたリガーゼ検出反応の使用である 。本発明の他の実施態様は、１次ポリメラーゼ連鎖反応と組み合わせた２次ポリ メラーゼ連鎖反応と組み合せたリガーゼ検出反応である。本発明の第３の実施態 様は、１次ポリメラーゼ連鎖反応と組み合わせた２次ポリメラーゼ連鎖反応であ る。 発明の背景 多重検出 高度に多形的な座の大規模多重解析が、父親検定および法医学（Reynolds et al.，Anal．Chem.，63:2-15(1991)）、臓器移稙のドナーとレシピエントの組み 合わせ（Buyse et al.，Tissue Antigens，41:1-14(1993)and Gyllensten et al .，PCR Meth．Appl，1:91-98(1991)）、遺伝疾患の診断、予後および出産前の相 談（Chamberlain et al.，Nucleic Acids Res.，16:11141-11156(1988)and L.C ．Tsui，Human Mutat.，1:197-203(1992)）および発ガン変異（Hollstein et al .，Science，253:49-53(1991)）などについて個体の実際的な同定に必要である 。さらに、核酸解析による感染疾患診断の費用効率はパネル試験における多重規 模で直接的に変動する。これらの適用の多くは、時に密接なスペース座の多重性 において単一塩基の相違の識別力に依存している。 多数の配列領域を含むサンプル中に１以上の選択ポリヌクレオチド配列の存在 を検出するのに、様々なＤＮＡハイブリダイゼーション技法が利用される。フラ グメント捕捉と標識による簡単な方法において、選択された配列含有のフラグメ ントが固定化プローブにハイブリダイゼーションされる。捕捉フラグメントは検 出可能なレポーター部分を含有する第２プローブへのハイブリダイゼーションに よって標識される。 広く用いられている他の方法はサザンブロット法である。この方法において、 サンプル中のＤＮＡフラグメントの混合物はゲル電気泳動により分別されて、ニ トロセルローズ・フィルター上に固定される。フィルターをハイブリダイゼーシ ョン条件で１以上の標識プローブと反応さすことにより、プローブ配列含有のバ ンドが同定される。この方法は、与えられたプローブ配列含有の制限酵素ＤＮＡ 消化においてフラグメントを同定するのに、および制限フラグメント長・多形性 （“ＲＦＬＰ”）を解析するのに、特に有用である。 ポリヌクレオチドサンプル中の、与えられた単数または複数の配列の存在を検 出する他の方法に、ポリメラーゼ連鎖反応による配列の選択的増幅がある。Mull is et alの米国特許第４,６８３,２０２号およびR．K．Saiki，et al.，Science 230:1350(1985)。この方法において、選択した配列の反対側の末端部分に相補 的なプライマーがプライマー開始複製の連続ラウンドを熱サイクリングと共に推 進するのに用いられる。増幅配列は種々の技術により容易に同定することができ る。この方法は、ポリヌクレオチド含有サンプル中の低コピー配列の存在を検出 するのに、例えば体液サンプル中の病原菌配列を検出するのに特に有用である。 さらに最近、既知の標的配列をプローブ連結方法によって同定する方法が報告 されている。N．M．Whiteley et al.の米国特許第４,８８３,７５０号、D．Y．W u et al.，Genomics 4:560(1989)、U．Landegren et al.，Science 241:1077(19 88)およびE．Winn-Deen et al.，Clin．Chem．37:1522(1991)。オリゴヌクレオ チド連結アッセイ（“ＯＬＡ”）として知られる一つの方法において、所望の標 的領域にまたがる２つのプローブまたはプローブエレメントが標的領域にハイブ リダイズされる。プローブエレメントが隣接の標的塩基と塩基対になると、プロ ーブエレメントの向かい合う末端は、連結反応により、例えばリガーゼ 処理により結ばれる。連結プローブエレメントは検定されて、標的配列の存在が 明らかにされる。 この方法の修飾として、連結プローブエレメントは相補的プローブエレメント 対について鋳型として働く。対のプローブエレメントの存在における変性、ハイ ブリダイゼーションおよび連結反応の継続的サイクルでもって、標的配列は直線 的に増幅され、非常に少量の標的配列が検出および／または増幅されるのを可能 とする。この方法をリガーゼ検出反応と呼ぶ。プローブエレメントの２つの相補 対が使用されるとき、そのプロセスはリガーゼ連鎖反応と呼ばれ、標的配列の指 数的増幅を達成する。F．Barany，“Genetic Disease Detection and DNA Ampli fication Using Cloned Thermostable Ligase,”Proc．Natl．Acad．Sci．USA， 88:189-93(1991)およびF．Barany，“The Ligase Chain Reaction（LCR）in a P CR World,”PCR Methods and Applications，1:5-16(1991)。 核酸配列相違の多重検出についての他の方式はGrossman et al.の米国特許第 ５,４７０,７０５号に開示されている。そこでは、検出可能標識と電荷／翻訳摩 擦ドラッグの顕著な比率とを有する配列特異的プローブが標的にハイブリダイズ され、そして一緒に連結される。この技法は、嚢胞性線維症・透過膜レギュレー ター遺伝子の大規模多重解析についてGrossman，et al.，“High-density Multi plex Detection of Nucleic Acid SequencesおよびOligonucleotide Ligation A ssay and Sequence-coded Separation,”Nucl．Acids．Res．22(21):4527-34(19 94)で用いられた。 Jou,et al.，“Deletion Detection in Dystrophin Gene by Multiplex Gap L igase Chain Reaction and Immunochromatographic Strip Technology，”Human Mutation 5:86-93(1995)は、いわゆる“ギャップリガーゼ連鎖反応”の利用に 関し、各エクソンについてのプローブ上の相違するハプテンに特異的な抗体を有 する免疫クロマトグラフィー上で読まれる増幅産物でもって、多重エクソンの同 時に選択された領域を増幅する。 標的ポリヌクレオチドにおける多数の配列の各々の存在・不存在を検出するの に有用な方法に関して、（例えば、遺伝子スクリーニング分野において）必要性 が増大している。例えば４００種もの変異が嚢胞性線維症に関連している。この 疾患に対する遺伝子的前処置のためのスクリーニングにおいて、“嚢胞性線維症 ”の積極的な同定を行うために、対象者のゲノムＤＮＡにおける可能性のある相 違する遺伝子配列変異のすべてを検査することが最適である。１回のアッセイで 可能性ある変異部位のすべての存在・不存在を検査するのが理想的である。しか し、上記した先行技術は、便利な自動的な単一アッセイとして多数の選択配列を 検出するのに容易に用いることができない。 固相ハイブリダイゼーションアッセイにおいては、多数の液体処理工程を必要 とし、単一ヌクレオチド・ミスマッチ識別に要するストリジェンシィを保持する ために、いくつかのインキュベーションおよび洗浄温度を注意深くコントロール しなければならない。最適ハイブリダイゼーション条件がプローブ配列によって 大きく変わるので、この方法の多重化は困難である。 等量の各ＰＣＲ産物を得る多重ＰＣＲプロセスの開発は、困難であり、労力を 要する。これは、反応におけるプライマーのアニール比率の変動と与えられたＭ ｇ2+濃度での各配列のポリメラーゼ伸長比率の変動によるものである。典型的に は、アニール温度に加え、プライマー、Ｍｇ2+および塩濃度は、反応におけるプ ライマーアニール比率とポリメラーゼ伸長比率のバランスを保つように調整され る。残念ながら、各々新しいプライマーセットを反応に加えると、形成すること のできる可能なアンプリコンとプライマー二量体の数が指数的に増加する。従っ て、各追加プライマーセットで、各々比較的等量の正確な産物を得る条件をつく りだすのがますます困難になり、時間を要することになる。 対立遺伝子特異的ＰＣＲ産物は一般に同じ大きさを有し、アッセイ結果は、各 反応チューブに関連するゲル・レーンでの産物バンドの存在・不存在によって計 られる。Gibbs et al.，Nucleic Acids Res.，17:2437-2448(1989)。この方法は 、異なるプライマーの組み合わせを有する多数の反応チューブに試験サンプルを 分割することを要し、アッセイ費用が増大する。ＰＣＲも、１つの反応チューブ 中で対立遺伝子プライマーを競合せしめるように相違する蛍光染料を付着せしめ ることにより、対立遺伝子を識別するが（F．F．Chehab et al.，Proc．Natl．A cad．Sci．USA，86:9178-9182(1989)）、多重解析へのこの経路は、現在の機器 および染料化学でもっては経済的にスペクトル的に分解できる染色が比較的少な いので、規模が限られている。粗大側鎖による修飾塩基の取り込みが、その電気 泳動運動性によって対立遺伝子ＰＣＲ産物を識別するのに用いられるが、この方 法は、ポリメラーゼによるこれら修飾塩基の取り込みの成功性からして、および これらの基の唯一つによって大きさが相違する比較的大きいＰＣＲ産物を分解す るための電気泳動性からして、限定されたものである。Livak et al.，Nucleic Acids Res.，20:4831-4837(1989)。各ＰＣＲ産物は単一変異のみを探すのに用い られ、多重化を難しくする。 対立遺伝子特異的プローブの連結反応は一般的に、対立遺伝子シグナルを分解 するのに、固相捕捉反応（U．Landegren et al.，Science，241:1077-1080(1988 )；Nickerson et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，87:8923-8927(1990)）ま たはサイズ依存分離法（D．Y．Wu，et al.，Genomics，4:560-569(1989)and F． Barany，Proc．Natl．Acad．Sci.，88:189-193(1991)）を用い、後者の方法は連 結プローブのサイズ幅が狭いので多重規模では限定されている。さらに、多重フ ォーマットにおいて、リガーゼ検出反応だけでは少量の標的配列を検出および計 測するのに充分な産物をつくることができない。ギャップリガーゼ連鎖反応は追 加の工程、すなわちポリメラーゼ伸長を必要とする。より複雑な多重化のために 電荷／翻訳摩擦ドラッグ（translational frictional drag）の明白な比率を有 するプローブを用いることは、長い電気泳動時間かあるいは検出の他の形態の使 用を必要とする。 ポリヌクレオチドサンプルにおける多重選択配列の存在・不存在を検出するた めの迅速な単一アッセイ方式が必要である。 ミクロサテライト解析 ミクロサテライトとして知られる縦列反復ＤＮＡ配列は、ヒトゲノム中の遺伝 子要素の非常に一般的で高度に多型性類を表す。小さい反復配列を含むこれらの ミクロサテライトマーカーは、初期の遺伝子マッピングや連鎖解析に使用されて いる。Weber，J．L．et al.，Am．J．Hum．Genet．44:388-396(1989)；Weissenb ach，J．et al.，Nature（London）359:794-800(1992)。これらの反復体のＰＣ Ｒ増幅によって、ヘテロ結合喪失を迅速に測定し、腫瘍抑制遺伝子マッピング方 法を著しく簡素化することができる。Ruppert，J．M.，et al.，Cancer Res．53:5093-94(1993);van der Riet，et al.，Cancer Res．54:1156-58(1994) ;Nawroz，H.，et al.，Cancer Res．54:1152-55(1994);Cairns，P.，et al.，Ca ncer Res．54:1422-24(1994)。さらに最近、ハンチントン舞踏病、脆弱Ｘ症候群 、筋緊張性ジストロフィー、脊髄小脳性運動失調Ｉ型、脊髄延髄性筋萎縮および 遺伝性歯状赤色淡蒼球性萎縮（dentatorubral-pallidoluysian atrophy）を含む 特定の遺伝性疾患における特異的変異を同定するために使用されている。The Hu ntington's Disease Collaborative Research Group Cell 72:971-83(1993);Kre mer，E．J.，et al.，Science 252:1711-14(1991);Imbert，G.，et al.，Nat．G enet．4:72-76(1993); 0rr，H.T.，et al.，Nat．Genet．4:221-226(1993);Bian calana，V.，et al.，Hum．Mol．Genet．1:255-258(1992);Chung，M.-Y.，et al .，Nat．Genet．5:254-258(1993); Koide，R.，et al.，Nat．Genet．6:9-13(19 94)。これらの遺伝性疾患は、感受性遺伝子中のトリヌクレオチド反復ユニット の伸長が原因のようである。さらに広範なミクロサテライト不安定性は、腫瘍組 織の反復要素の伸長および欠失から証明され、最初、結腸直腸腫瘍についてPein ado，M．A.，et al．Proc．Natl．Acad．Sci．USA 89:10065-69(1992);Ionov，Y .，Nature（London）363:558-61(1993);Thibodeau，S．N.，et al.，Science 26 0:816-819(1993)また後にいくつかの他の腫瘍型について（Risinger，J.I.，Can cer Res．53:5100-03(1993); Han，H.-J.，et al.，Cancer Res．53:5087-89(19 93);Peltomaki，P.，Cancer Res．53:5853-55(1993);Gonzalez-Zulueta，M.，et al.，Cancer Res．53:5620-23(1993);Merlo，A.，et al.，Cancer Res．54:209 8-2101(1994)報告された。遺伝性非ポリポーシス結腸直腸癌患者において、この 遺伝子不安定性はミスマッチ修復遺伝子における遺伝性および体細胞性変異によ るようである。Leach，F.，et al.，Cell 75:1215-1225(1993); Fishel，R.，et al.，Cell 75:1027-38(1993);Papadopoulos，N.，et al.，Science 263:1625-2 9(1994);Bronner，C．E.，et al.，Nature（London）368:258-61(1994)。 ＰＣＲは、癌検知において新しい多型性の出現とヘテロ接合性喪失の両方を同 定する際のミクロサテライト解析に一般に使用される。L．Mao，et al.，“Micr osatellite Alterations as Clonal Markers for the Detection of Human Cancer,”Proc．Natl．Acad．Sci USA 91(21):9871-75(1994);L．Mao，et ．al.，“Molecular Detection of Primary Bladder Cancer by Microsatellite Analysis,”Science 271:659-62(1996);D．Radford，et.al.，“Allelotyping of Ductal Carcinoma in situ of the Breast:Detection of Loci on 8p，13q， 161，17p and 17q,”Cancer Res．55(15):3399-05(1995)。このような目的のた めにＰＣＲを使用するとき、各ＰＣＲ反応は個別に行われ、配列ゲル上で分離さ れる。 これらの参考文献はＰＣＲが特定の癌の診断および予後に利用性があることを 示しているにもかかわらず、このタイプの解析は高度な情報処理能力がなく、サ イズ分割を要するので、欠点がある。さらに、ＰＣＲ滑りに問題があり、研究者 をトリー、テトラーおよび高ヌクレオチド反復ユニットにシフトさせ、癌検知を さらに困難にする。 ミクロサテライトマーカーはまた、結腸癌検知（L．Cawkwell，et．al.，“Fr equency of Allele Loss of DCC，p53，RB1，WT1，NF1，NM23，and APC/MCC in Colorectal Cancer Assayed by Fluorescent Multiplex Polymerase Chain Reac tion,”Br．J．Cancer 70(5):813-18(1994)）およびゲノムマッピング（P.Reed, et．al.，“Chromosome-specific Microsatellite Sets for Fluorescent-Based ,Semi-Automated Genome Mapping,”Nat．Genet．7(3):390-95(1994)）にも使用 されている。しかしながら、このような多重プロセスのカギは、それを単一反応 チューブで行う能力である。従来の多重ミクロサテライトマーカー技法はプライ マー濃度および増幅条件に注意深い対応を要する。ＰＣＲ産物をセット中にため ておくことができるが、混合物が各バンド中にほぼ等しい量のＤＮＡを有するこ とを保証するために、アガロースゲル上で試用することを要する。 ヒト同定 ＰＣＲはまたヒト同定、例えば父親検定、犯罪捜査および軍部の人員同定に使 用されている。A．Syvanen et．al.，“Identification of Individuals by Ana lysis of Biallelic DNA Markers，Using PCR and Solid-Phase Mini-Sequencin g”Am．J．Hum．Genet．52(1):46-59(1993)にヒト同定についてのミ ニ配列決定技法が記載されている。この技法は、単一ＰＣＲチューブで多くても ４ＰＣＲ反応が一度に行われ、個体マーカーのＰＣＲ増幅を要する。ミニ配列決 定は個体の多型性を測定するのに行われる。 組み合せたプロセス G．Deng，et．al.，“An Improved Method of Competitive PCR for Quantita tion of Gene Copy Number,”Nucl．Acids．Res．21:4848-49(1993)は競合ＰＣ Ｒプロセスを記述している。各遺伝子およびその等価標準について用いるプライ マーの異なるセットを２ＰＣＲ工程に利用する。 T．Msuih，et．al.，“Novel，Ligation-Dependent PCR Assay for Detection of Hepatitis C．Virus in Serum,”J．Clin．Microbio．34:501-07(1996)およ びY．Park，et．al.，“Detection of HCV RNA Using Ligation-Dependent Poly merase CHain Reaction in Formalin-Fixed Paraffin-Embedded Liver Tissue” （提出）は、ＬＤＲ／ＰＣＲプロセスのＲＮＡとの併用について記述している。 発明の概要 本発明は、組み合せたＬＤＲおよびＰＣＲプロセスを用いて核酸配列の相違を 検出することに関する。本発明は次の３実施態様の１つによって行われる。 （１）ＬＤＰと組み合せたＰＣＲ、（２）１次ＰＣＲと組み合せた２次ＰＣＲと 組み合せたＬＤＲ、および（３）１次ＰＣＲと組み合せた２次ＰＣＲ。これらの 実施態様の各々がある種の性質を検出するのに特定の適用性を有する。しかし、 各々において核酸配列の相違を多重的に検出するのに組み合せた反応を利用する ものであり、そこでは各プロセスの初期段階由来のオリゴヌクレオチドがプロセ スの後期段階由来のオリゴヌクレオチドで使用され得る配列を含有している。 Ｉ．１次ＰＣＲ／２次ＰＣＲ／ＬＤＲプロセス 本発明の一つの実施態様は、複数の標的ヌクレオチド配列における１以上の単 一塩基の変更、挿入、欠失または転座により相違している複数の配列の２以上を 同定するための方法に関する。この方法は、第１ポリメラーゼ相、第２ポリメラ ーゼ相およびリガーゼ検出相を含む。このプロセスは、複数の配列相違がある１ 以上の標的ヌクレオチド配列を含有するかも知れないサンプルを分析することを 含む。 第１ポリメラーゼ連鎖反応相において、１以上の１次オリゴヌクレオチドプラ イマー群が準備される。各群は１以上の１次オリゴヌクレオチドプライマー・セ ットを含有し、各セットは、標的特異的部分と５’上流２次プライマー特異的部 分を有する第１ヌクレオチドプライマー、および標的特異的部分と５’上流２次 プライマー特異的部分を有する第２オリゴヌクレオチドプライマーを含む。同じ 群の各セットの第１オリゴヌクレオチドプライマーは同じ５’上流２次プライマ ー特異的部分を有し、同じ群の各セットの第２オリゴヌクレオチドプライマーは 同じ５’上流２次プライマー特異的部分を有している。特定のセットのオリゴヌ クレオチドプライマーは、対応する標的ヌクレオチド配列の相補的鎖でのハイブ リダイゼーションに適しており、ポリメラーゼ連鎖反応産物の形成をもたらす。 しかし、１次オリゴヌクレオチドプライマーがサンプル中に他のヌクレオチド配 列にハイブリダイズするときに、該ポリメラーゼ連鎖反応産物の形成に妨害する ミスマッチがある。特定のセットにおけるポリメラーゼ連鎖反応産物は、同じ群 での他のポリメラーゼ連鎖反応産物と識別され得る。１次オリゴヌクレオチドプ ライマー、サンプルおよびポリメラーゼは混合されて、１次ポリメラーゼ連鎖反 応混合物を形成する。 １次ポリメラーゼ連鎖反応混合物は、実質的に上記したように、変性処理、ハ イブリダイゼーション処理および伸長処理を含む２以上のポリメラーゼ連鎖反応 サイクルにかけられる。ハイブリダイゼーションの際に、１次オリゴヌクレオチ ドプライマーの標的特異的部分が標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズする。 伸長処理によってハイブリダイズした１次オリゴヌクレオチドプライマーが伸長 されて、１次オリゴヌクレオチドプライマーがハイブリダイズする標的ヌクレオ チド配列に相補的な１次伸長産物を形成する。 １次オリゴヌクレオチドプライマーの上流２次プライマー特異的部分は標的Ｄ ＮＡに存在しないが、その配列は１次ポリメラーゼ連鎖反応相の第２以後のサイ クルで複写される。結果として、第２サイクル後に産生された１次伸長産物は、 その５’末端に２次プライマー特異的部分、およびその３’末端にプライマー特 異的部分の補体を有する。 次は、第２ポリメラーゼ連鎖反応相である。この相では１つまたは複数の２次 オリゴヌクレオチドプライマーセットが準備される。各セットは、第１の１次オ リゴヌクレオチドプライマーの５’上流部分と同じ配列を含有する第１の２次オ リゴヌクレオチドプライマー、および第１の２次プライマーに相補的な第１の１ 次オリゴヌクレオチドと同じ１次オリゴヌクレオチドプライマーセットに由来す る第２の１次オリゴヌクレオチドプライマーの５’上流部分と同じ配列を含有す る第２の２次オリゴヌクレオチドプライマーを有する。２次オリゴヌクレオチド プライマーのセットは、特定の群において１次伸長産物のすべてを増幅するのに 使用され得る。２次オリゴヌクレオチドプライマーを１次伸長産物およびポリメ ラーゼと混合して、２次ポリメラーゼ連鎖反応混合物とする。 ２次ポリメラーゼ連鎖反応混合物は、実質的に上記したように、変性処理、ハ イブリダイゼーション処理および伸長処理を含む２以上のポリメラーゼ連鎖反応 サイクルにかけられる。ハイブリダイゼーションの際に、２次オリゴヌクレオチ ドプライマーの標的特異部分が１次伸長産物上に存在する相補的配列にハイブリ ダイズし、元の標的配列にハイブリダイズしない。伸長処理によってハイブリダ イズ２次オリゴヌクレオチドプライマーが伸長されて、１次伸長産物に相補的な ２次伸長産物を形成する。 本発明の態様における最後の相はリガーゼ検出反応相である。ここでは、複数 のオリゴヌクレオチドプローブセットが準備され、各セットは、２次伸長産物特 異的部分と検出可能レポーター標識を保持する第１オリゴヌクレオチドプローブ 、および２次伸長産物特異的部分を保持する第２オリゴヌクレオチドプローブを 有する。特定セットのオリゴヌクレオチドプローブは、相補的２次伸長産物特異 的部分に互いに隣接してハイブリダイズしたときに一緒に連結反応するのに適し ている。しかし、オリゴヌクレオチドプローブがサンプル中の他のヌクレオチド 配列にハイブリダイズするときに該連結反応を妨害するミスマッチがある。特定 セットにおけるオリゴヌクレオチドプローブの連結反応産物は、プローブまたは 他の連結反応産物のいずれかと識別され得る。複数のオリゴヌクレオチドプロー ブセットを２次伸長産物およびリガーゼと混合して、リガーゼ検出反応混合物と する。 リガーゼ検出反応混合物は、実質的に上記したように、変性処理およびハイブ リダイゼーション処理を有する１以上のリガーゼ検出反応サイクルにかけられる 。ハイブリダイゼーション処理において、オリゴヌクレオチドプローブセットは 、隣接部位で塩基特異的に、もし存在すれば夫々の２次伸長産物にハイブリダイ ズする。結果として、隣接プローブは互いに連結して、一緒に結合している検出 可能レポーター標識および２次伸長産物特異的部分を含有する連結産物配列を形 成する。オリゴヌクレオチドプローブセットは、その夫々の相補的２次伸長産物 以外のヌクレオチド配列にハイブリダイズし得るが、１以上のミスマッチの存在 のために一緒に連結しないで、変性処理の際に個々に分離している。リガーゼ検 出反応サイクルに続いて、連結反応産物配列のレポーター標識が検出されて、サ ンプル中の１以上の標的ヌクレオチド配列の存在が示される。 本発明の１次ＰＣＲ／２次ＰＣＲ/ＬＤＲプロセスは、単一ヌクレオチドおよ び縦列反復多形性の多重的検出においてＰＣＲのみの使用よりも顕著な利点をも たらす。 上記したように、ＰＣＲのみの使用では、多重検出を行うための操作条件にお いて厳しい最適化をなすことを要する。さらに、多数の標的ヌクレオチド配列を 検出するためには、オリゴヌクレオチドプライマーの量を増加しなければならな い。しかし、これが起きると、標的独立反応（例えばプライマー二量体作用）の 可能性が増加する。加うるに、変異を知らねばならず、偽の正反応が正常なタン プレットのポリメラーゼ伸長によって生じることがあり、重複しているプライマ ーの干渉による近接クラスター部位では多重検出はできず、小さい反復配列にお ける単一塩基または小さい挿入や欠失は検出できず、そして正常ＤＮＡの高バッ クグランドにおける変異DＮＡの定量が難しい。結果として、単一の多重ＰＣＲ プロセスにおいて検出される標的ヌクレオチド配列の数は限られてくる。 直接的配列決定は、配列を正しく得るには豊富な変異サンプルを必要とし、多 くのエクソン含有の大きい遺伝子について多重反応を必要とし、産物の電気泳動 分離を必要とし、時間がかかり、正常ＤＮＡのバックグランド５％以下での変異 ＤＮＡ検出には用いることができない。ミニ配列決定においては、変異を知らね ばならず、重複しているプライマーの干渉による近接クラスター部位では多重検 出はできず、小さい反復配列における単一塩基または小さい挿入や欠失は検出で きず、そして４種の分離反応を必要とする。対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチ ドハイブリダイゼーション（ＡＳＯ）においては、変異を知らねばならず、ハイ ブリダイゼーションおよび洗浄条件を知らねばならず、交叉反応を防ぐのは難し く、重複するプライマーの干渉による近接クラスター部位では多重検出はできず 、正常ＤＮＡのバックグランドの５％以下では変異ＤＮＡは検出できない。プラ イマー調節ＲＥＬＰは、正常ＤＮＡから変異体を識別するのに電気泳動分離を必 要とし、制限部位に移行し得る部位に適用するには限界があり、変異の性質を調 べるのに追加の解析を必要とし、変異ＤＮＡが正常のＤＮＡの高バックグランド にあるときは用いるのが難しい。単鎖立体配座多形性解析（ＳＳＣＰ）は、変異 配座体を正常配座体と区別するのに電気泳動分離を必要とし、可能性のある変異 の３０％を誤り、変異の性質を調べるために追加の解析を要し、サイレント多形 性と変異を識別できない。ジデオキシヌクレオチドフィンガー・プリント（ｄｄ Ｆ）の場合、正常ＤＮＡの高いバックグランドにおいては変異を検出するのは困 難であり、変異配座体を正常配座体と区別するのに電気泳動を必要とし、変異の 性質を調べるために追加の解析を要し、サイレント多形性と変異を識別できない 。変性勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）は、変異配座体を正常配座体から電気泳動 的に分離しなければならず、可能性のある変異の３０％を誤り、変異の性質を調 べるために追加の解析を要し、サイレント多形性と変異を識別できない。そして 前に得た結果を再現するのに技術的に熟練を要する。ＲＮａｓｅミスマッチ開裂 法は、変異の性質を調べるのに追加の解析を要し、ＲＮａｓｅ抵抗性ミスマッチ を排除するために両鎖の解析を必要とし、正常ＤＮＡの高いバックグランドにお いては変異を検出するのに困難がある。化学的ミスマッチ分裂法は、正常ＤＮＡ のバックグランドが５％以下では変異ＤＮＡを検出することができず、すべての 変異を検出するのに両鎖の解析を必要とする。Ｔ４ Ｅｎｄｏ VIIミスマッチ分 裂法では、変異の性質を調べるのに追加の解析を要し、変異とサイレント多形性 を区別できず、エンドヌクレアーゼが結果の注意深い解釈に必要なコントロール ＤＮＡを分裂し、そして正常ＤＮＡの高いバックグランドでは変異の検出が困難 である。 ＰＣＲの感受性とＬＤＲの特異性を組み合せた本発明の１次ＰＣＲ／２次ＰＣ Ｒ／ＬＤＲプロセスにおいては、上記のような問題がない。１次ＰＣＲ相は２次 プライマー特異的部分を有する１次伸長産物を産生する。この最初の相は、１次 伸長産物の産生を最大にするのに効果的で、ＰＣＲのみのプロセスにおいて時々 起きる有害反応を生じることのない条件で実施される。特に、本発明の１次ＰＣ Ｒ相は、１５−２０ＰＣＲサイクルで実施され、ＰＣＲのみのプロセスで用いら れるであろうよりも少ないプライマーが使用される。本発明の１次ＰＣＲ相は、 いくつかの標的ヌクレオチド配列がよく増幅し、一方あるものは増幅しないので 、非常に多様で、予想外に伸長産物を生み出す。しかし、２次ＰＣＲ相において は、すべての１次伸長産物が同じ２次プライマー特異的部分を有するので、ほぼ 等しく増幅される。サンプル中に元から存在している標的ヌクレオチド配列は、 これらの配列が２次プライマー特異的部分を含有しないので、２次ＰＣＲ相によ っては増幅されない。結果として、本発明の１次ＰＣＲ／２次ＰＣＲ／ＬＤＲプ ロセスは、単一のチューブにおける数百のヌクレオチド配列相違の多重検出を、 分析に供せられる各特定サンプルについての操作条件をその都度つくることなし に、達成することができる。変異配列の選択がＰＣＲよりもむしろＬＤＲで調節 されるので、１次ＰＣＲ／２次ＰＣＲ／ＬＤＲプロセスは偽の正標的生成には感 受性が低い。さらに、１次ＰＣＲ／２次ＰＣＲ／ＬＤＲプロセスは、近接クラス ター変異の検出、小さい反復配列における単一塩基または小さい挿入や欠失の検 出、正常ＤＮＡの高いバックグランドにおける１％以下の変異の定性的検出、お よびアドレス可能アレイを用いる連結反応産物配列の検出を可能とする。唯一の 主要な必要事項は、変異を知り、多数のオリゴヌクレオチドを合成することであ る。 単一ヌクレオチドおよび縦列反復多形性の検出ができることは、法医学的ＤＮ Ａ同定および遺伝子疾患の診断に特に重要である。 II．ＬＤＲ／ＰＣＲプロセス 本発明の第２態様は、複数の標的ヌクレオチド配列における１以上の単一塩基 の変更、挿入、欠失および転座によって相違している１以上の複数配列を同定す る方法に関する。この方法はリガーゼ検出反応相に続いてポリメラーゼ連鎖反応 相を有する。この方法は、複数の配列相違を有する１以上の標的ヌクレオチド配 列を含有する可能性のあるサンプルを準備することを含む。 リガーゼ検出反応相において１以上のオリゴヌクレオチドプローブが準備され る。各セットは、標的特異的部分と５’上流プライマー特異的部分を保持する第 １オリゴヌクレオチドプローブ、および標的特異的部分と３’下流プライマー特 異的部分を保持する第２オリゴヌクレオチドプローブを有する。特定セットにお ける標的ヌクレオチドプローブは、対応する標的ヌクレオチド配列に互いに隣接 してハイブリダイズするときに一緒に連結反応するのに適している。しかし、サ ンプル中に存在する他のヌクレオチド配列とハイブリダイズするときに、この連 結反応を妨害するミスマッチがある。サンプル、複数のオリゴヌクレオチドプロ ーブセットおよびリガーゼを混合して、リガーゼ検出反応混合物とする。 リガーゼ検出反応混合物は１以上のリガーゼ検出反応サイクルにかけられる。 これらのサイクルには変性処理とハイブリダイゼーション処理が含まれる。変性 処理において、ハイブリダイズされたオリゴヌクレオチドは標的ヌクレオチド配 列から分離される。ハイブリダイゼーション処理によって、オリゴヌクレオチド プローブセットは隣接部位で塩基特異的に、もしサンプル中に存在しておればそ の夫々の標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズする。ハイブリダイズされると 、オリゴヌクレオチドプローブセットは互いに連結して、連結反応産物配列を形 成する。この産物は、５’上流プライマー特異的部分、一緒に結合した標的特異 的部分および３’下流プライマー特異的部分を含む。各セットの連結反応産物配 列は連結検出反応混合物中の他の核酸と識別可能である。オリゴヌクレオチドプ ローブセットはその夫々の標的ヌクレオチド配列以外のサンプル中のヌクレオチ ド配列とハイブリダイズするが、１以上のミスマッチの存在によって連結せず、 そして、次の変性処理の際に個々に分離している。 ポリメラーゼ連鎖反応において、１または複数のオリゴヌクレオチドプローブ が準備される。各セットは、連結反応産物配列の５’上流プライマー特異的部分 に同じ配列を含有する上流プライマー、および連結反応産物配列の３’下流プラ イマー特異的部分に相補的な下流プライマーを有している。うち、１つのプライ マーは検出可能レポーター標識を有する。リガーゼ検出反応混合物を１または複 数のオリゴヌクレオチドプローブセットおよびポリメラーゼと混合すると、ポリ メラーゼ連鎖反応混合物が形成する。 ポリメラーゼ連鎖反応混合物は、変性処理、ハイブリダイゼーション処理およ び伸長処理を含む１以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルにかけられる。変性処 理においてハイブリダイズ核酸配列が分離される。ハイブリダイゼーション処理 によって、プライマーが連結反応産物配列の相補的プライマー特異的部分とハイ ブリダイズする。伸長処理において、ハイブリダイズプライマーが伸長されて、 プライマーがハイブリダイズしている配列に相補的な伸長産物を形成する。ポリ メラーゼ連鎖反応相の第１サイクルにおいて、下流プライマーが連結反応産物配 列の３’下流プライマー特異的部分にハイブリダイズし、伸長されて連結反応産 物配列に相補的な伸長産物を形成する。次のサイクルにおいて、上流プライマー が連結反応産物に相補的な伸長産物の５’上流プライマー特異的部分にハイブリ ダイズし、下流プライマーが連結反応産物配列の３’下流部分にハイブリダイズ する。 このプロセスのポリメラーゼ連鎖反応相に続いて、レポーター標識が検出され 、伸長産物が識別されて、サンプル中の１以上の標的ヌクレオチド配列の存在が 表される。 本発明のＬＤＲ／ＰＣＲプロセスの一つの実施態様は、細胞中の遺伝子コピー の数（すなわち遺伝子量）の測定においてＬＤＲのみの使用に比べて改良された 成果をもたらす。ＬＤＲのみを使用すると、複数の遺伝子を定量するの必要とす る十分な標的コピーを産生するのが難しい。 本発明のＬＤＲ／ＰＣＲプロセスの他の実施態様において、ＬＤＲ連結反応産 物配列がサンプル中に誘導された遺伝子の比率に応じた比率で産生される。同じ プライマー特異的部分をＬＤＲ相のためのオリゴヌクレオチドプローブに合体す ることにより、ＰＣＲ相が連結反応産物配列をその比率の保持と同じ程度に増幅 する。解析しようとするサンプル中に元から存在する標的配列は、この標的配列 がＰＣＲプライマー特異的部分を含有しないので、ＰＣＲ相で増幅されない。さ らに、ＰＣＲ相のためのオリゴヌクレオチドプライマーのみがレポーター標識を 有し、この標識のある伸長産物のみが検出される。 遺伝子量の変化の測定は多くの生物医学での利用において重要である。 Ｘ染色体上の遺伝子が男性と女性では相違しており、女性は２コピーに対し男 性は１コピーである。女性はＸ染色体について欠失の保持者となることがある。 もしＸ染色体の欠失領域が１以上の遺伝子を含むとすると、女性は他のＸ−染色 体の対応する非欠失域にこれらの遺伝子１コピーのみを有する。この結果（Ｘ− 連結遺伝子の１コピーを有すること）は、男性細胞における状況に類似しており 、遺伝された障害を発揮することなく、常に寛容されている。しかし、もしその 女性の息子が彼女の欠失Ｘ染色体を受け継ぐと、彼は欠失領域に遺伝子コピーを 所有しないので、遺伝子不存在によるＸ−関連障害にかかる。このように、染色 体欠失の検出は、本発明のＬＤＲ／ＰＣＲプロセスの適用例である。 受精卵が染色体の異常補体を有すると、先天性の染色体障害が起きる。最も多 い先天性染色体障害はダウン症候群であって、各細胞に追加の染色体（４７、Ｘ Ｘ＋２１または４７、ＸＹ＋２１と表される）が存在するときに、これは生じる 。本発明のＬＤＲ／ＰＣＲプロセスは先天性染色体障害を同定できるように設計 され得る。 本発明のＬＤＲ／ＰＣＲプロセスは、モノヌクレオチドおよびジヌクレオチド 反復配列における多形性を識別するのに有用でもある。クローン性の検出のため にユニーク多形性を含有すの少数の細胞を識別するのにも有用である。 ＬＤＲ／ＰＣＲプロセスはゲルおよび非ゲル（すなわちＤＮＡアレイ）の両方 の技法で用いられる。多くの遺伝子の増幅および欠失の同時の多重分析、定量分 析を可能にし、外部標準を必要としない。ＬＤＲ／ＰＣＲプロセスにおける唯一 の比較的小さい問題点は、染色体における大きい欠失の境界を測定するのが難し いことである。 一方、ミクロサテライト・マーカー分析は、欠失または増幅した小さい領域を 検出するのに用いることはできず、増幅領域の同時検出に適合せず、情報マーカ ーの利用性に依存している。競合的ＰＣＲ（すなわち分別的ＰＣＲ）は、いくつ もの欠失および増幅を同時に検出するために多重的に使用できないし、特に精密 でない。サザン・ハイブリダイゼーションは、時間と労力がかかり、試験する各 プローブについて多工程を要して多重化には適しておらず、そして大量のＤＮＡ を必要とする。蛍光インシトゥハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）は、特別の 技術を要し、時間がかかり、調べようとする欠失または増幅領域を解析する大き いプローブを必要とする。このように本発明のＬＤＲ／ＰＣＲプロセスは先行プ ロセスに優れる顕著な進歩がある。 III．１次ＰＣＲ／２次ＰＣＲプロセス 本発明の第三の実施態様は、１以上の標的ヌクレオチド配列における１以上の 単一塩基の変更、挿入、欠失または転座により相違している複数の配列の２以上 を同定するための方法に関する。この方法は、複数の配列相違がある１以上の標 的ヌクレオチド配列を含有するかも知れないサンプルを２つの連続するポリメラ ーゼ連鎖反応相にかけることを含む。 第１ポリメラーゼ連鎖反応相において、１以上の１次オリゴヌクレオチドプラ イマー群が準備される。各群は２以上の１次オリゴヌクレオチドプライマー・セ ットを含有する。各セットは、標的特異的部分と５’上流第２プライマー特異的 部分を保持する第１オリゴヌクレオチドプライマー、および標的特異的部分と５ ’上流第２プライマー特異的部分を保持する第２オリゴヌクレオチドプライマー を有する。同じ群の各セットの第１オリゴヌクレオチドプライマーは同じ５’上 流第２プライマー特異的部分を有し、同じ群の各セットの第２オリゴヌクレオチ ドプライマーは同じ５’上流第２プライマー特異的部分を有している。特定のセ ットのオリゴヌクレオチドプライマーは、対応する標的ヌクレオチド配列の相補 鎖でのハイブリダイゼーションに適しており、ポリメラーゼ連鎖反応産物の形成 をもたらす。しかし、１次オリゴヌクレオチドプライマーがサンプル中に存在す る他のヌクレオチド配列にハイブリダイズするときに、該ポリメラーゼ連鎖反応 産物の形成を妨害するミスマッチがある。特定のセットにおけるポリメラーゼ連 鎖反応産物は、同じ群または他の群を有する他のポリメラーゼ連鎖反応産物と識 別され得る。１次オリゴヌクレオチドプライマーをサンプルおよびポリメラーゼ と混合して、第１ポリメラーゼ連鎖反応混合物とする。 １次ポリメラーゼ連鎖反応混合物は、実質的に上記したように、変性処理、ハ イブリダイゼーション処理および伸長処理を含む２以上のポリメラーゼ連鎖反応 サイクルにかけられる。ハイブリダイゼーションの際に、１次オリゴヌクレオチ ドプライマーの標的特異部分が標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズする。伸 長処理によってハイブリダイズ１次オリゴヌクレオチドプライマーが伸長されて 、１次オリゴヌクレオチドプライマーがハイブリダイズする標的ヌクレオチド配 列に相補的な１次伸長産物を形成する。 １次オリゴヌクレオチドプライマーの上流２次プライマー特異的部分は標的Ｄ ＮＡに存在しないが、その配列は１次ポリメラーゼ連鎖反応相の第２以後のサイ クルで複写される。結果として、第２サイクル後の１次伸長産物は、その５’末 端に２次プライマー特異的部分、そしてその３’末端にプライマー特異的部分の 補体を有する。 本発明のこの実施態様での第２ポリメラーゼ連鎖反応相において１つまたは複 数の２次オリゴヌクレオチドプライマーセットが準備される。各セットは、検出 可能レポーター標識を保持し、かつ第１の１次オリゴヌクレオチドプライマーの ５’上流部分と同じ配列を含有する第１の２次プライマー、および第１の２次プ ライマーに相補的な第１の１次オリゴヌクレオチドと同じ１次オリゴヌクレオチ ドプライマーセットに由来する第２の１次オリゴヌクレオチドプライマーの５’ 上流部分と同じ配列を含有する第２の２次プライマーを有する。２次オリゴヌク レオチドプライマーのセットは、各群において１次伸長産物を増幅する。２次オ リゴヌクレオチドプライマーを１次伸長産物およびポリメラーゼと混合して、２ 次ポリメラーゼ連鎖反応混合物とする。 ２次ポリメラーゼ連鎖反応混合物は、実質的に上記したように、変性処理、ハ イブリダイゼーション処理および伸長処理を含む１以上のポリメラーゼ連鎖反応 サイクルにかけられる。ハイブリダイゼーションの際に、２次オリゴヌクレオチ ドプライマーが１次伸長産物にハイブリダイズする。伸長処理によって、ハイブ リダイズした２次オリゴヌクレオチドプライマーが伸長されて、１次伸長産物に 相補的な２次伸長産物を形成する。２次ポリメラーゼ連鎖反応混合物を２以上の ポリメラーゼ連鎖反応サイクルに掛けた後に、標識２次伸長産物が検出される。 これはサンプル中おける１以上の標的ヌクレオチド配列の存在を表す。 本発明の１次ＰＣＲ／２次ＰＣＲプロセスは、サザンハイブリダイゼーション 、競合的ＰＣＲ、および異型接合の損失を起こすヌクレオチド欠失の検出におけ るミクロサテライト・マーカー解析法を上回る顕著な利点を有する。サザンハイ ブ リダイゼーションは、競合的ＰＣＲより精密であるが、非常に労力を要し、多量 のＤＮＡを必要とし、いかなる技法でも多重化されていない。現在の多重ミクロ サテライト・マーカー法はプライマー濃度と増幅条件に非常な注意を要する。 本発明の１次ＰＣＲ／２次ＰＣＲプロセスは、これら先行技術における困難性 を解決する。１次ＰＣＲ相において、１次オリゴヌクレオチドプライマーがジヌ クレオチドまたは他の反復配列の両側に置かれ、２次プライマー特異的部分を含 む。１次ＰＣＲ相は、これらのプライマーの低濃度で実施されて、同時にいくつ かの部座の増幅を可能とする。２次ＰＣＲ相によって、選択される標的特異的２ 次プライマーと同じ速度で増幅が続けられて、隣接のセットからミクロサテライ ト・マーカーの１セットが並べられる。１次ＰＣＲ／２次ＰＣＲプロセスは、単 −ＰＣＲチューブで、単一ゲルレーン解析で多重検出を実施するのに用いられる 。 本発明のこの実施態様は、ミクロサテライト・マーカー分析を実施して遺伝子 中のヌクレオチド欠失を同定するのに有用である。このような多重検出は単一の 反応チューブで実施され得る。しかし、１次ＰＣＲ／２次ＰＣＲプロセスは、増 幅と欠失を識別できないので、かかる識別をなそうとするときは、上記のＬＤＲ ／ＰＣＲプロセスすなわち分別ＰＣＲプロセスを併用しなければならない。 図面の簡単な説明 図１は、電気泳動またはアドレス可能アレイ上の捕捉による点変異などの生殖 細胞系変異の検出のための１次ＰＣＲ／２次ＰＣＲ／ＬＤＲプロセスを表す流れ 図である。なお、図１および他の図における用語“ジップコード”は、後に用い られるプライマーまたはプローブの特異的な配列を意味するが、標的配列または 他のゲノム配列を意味しない。 図２は、電気泳動またはアドレス可能アレイ上の捕捉によるバイ対立遺伝子多 形性の検出のための１次ＰＣＲ／２次ＰＣＲ／ＬＤＲプロセスを表す流れ図であ る。 図３は、電気泳動またはアドレス可能アレイ上の捕捉による癌関連変異の検出 のための１次ＰＣＲ／２次ＰＣＲ／ＬＤＲプロセスを表す流れ図である。 図４は、バイ対立遺伝子多形性の検出のための１次ＰＣＲ／２次ＰＣＲ／ＬＤ Ｒプロセスを表す模式図である。 図５は、与えられた部位ですべての可能性ある塩基を識別するＬＤＲオリゴヌ クレオチドプローブを用いて、対立遺伝子の相違の検出のための１次ＰＣＲ／２ 次ＰＣＲ／ＬＤＲプロセスを表す模式図である。 図６は、与えられた部位ですべての可能性ある塩基を識別するＬＤＲオリゴヌ クレオチドプローブを用いて、２つの近接する部位の可能性ある塩基の存在を検 出のための１次ＰＣＲ／２次ＰＣＲ／ＬＤＲプロセスを表す模式図である。 図７は、隣接する対立遺伝子での癌関連変異の検出のための１次ＰＣＲ／２次 ＰＣＲ／ＬＤＲプロセスを表す模式図である。 図８は、電気泳動検出を用いて制限エンドヌクレアーゼ消化の有無でのＬＤＲ ／ＰＣＲプロセスを表す流れ図である。 図９は、遺伝子特異的アドレスを用いるアドレス可能アレイでの検出のための ＬＤＲ／ＰＣＲプロセスを表す流れ図である。 図１０は、遺伝子増幅および欠失の多重検出のためのＬＤＲ／ＰＣＲプロセス を表す模式図である。 図１１は、ＬＤＲ／ＰＣＲプロセスのための対立遺伝子特異的問題を表す模式 図である。 図１２は、図１１に表されたＬＤＲ／ＰＣＲプロセスのための対立遺伝子特異 的問題の解決を表す模式図である。 図１３は、電気泳動またはアドレス可能アレイ上の捕捉による２対立遺伝子多 形性の検出のための中間的エクソヌクレアーゼ消化相を有するＬＤＲ／ＰＣＲプ ロセスを表す流れ図である。 図１４は、電気泳動またはアドレス可能アレイ上の捕捉による癌関連変異の検 出のための中間的エクソヌクレアーゼ消化相を有するＬＤＲ／ＰＣＲプロセスを 表す流れ図である。 図１５は、対立遺伝子特異的変異および多形性の検出のための中間的エクソヌ クレアーゼ消化相を有するＬＤＲ／ＰＣＲプロセスを表す模式図である。 図１６は、モノヌクレオチド反復多形性検出のための中間的エクソヌクレアー ゼ消化相を有するＬＤＲ／ＰＣＲプロセスを表す模式図である。 図１７は、低存在量のモノヌクレオチド反復多形性検出のための中間的エクソ ヌクレアーゼ消化相を有するＬＤＲ／ＰＣＲプロセスを表す模式図である。 図１８は、中間的配列伸長相、およびＬＤＲ相の後でＰＣＲ相の前でのウラシ ルＮ−グリコシラーゼ消化相を有し、および電気泳動またはアドレス可能アレイ による検出を有するＬＤＲ／ＰＣＲプロセスを用いての多形性検出を表す流れ図 である。 図１９は、中間的配列伸長相、およびＬＤＲ相の後でＰＣＲ相の前でのウラシ ルＮ−グリコシラーゼ消化相を有し、および電気泳動またはアドレス可能アレイ による検出を有するＬＤＲ／ＰＣＲプロセスを用いての癌検出を表す流れ図であ る。 図２０は、中間的配列伸長相、およびＬＤＲ相の後でＰＣＲ相の前でのウラシ ルＮ−グリコシラーゼ消化相を有するＬＤＲ／ＰＣＲプロセスを用いてのモノヌ クレオチド反復体の検出を表す模式図である。 図２１は、中間的配列伸長相、およびＬＤＲ相の後でＰＣＲ相の前でのウラシ ルＮ−グリコシラーゼ消化相を有するＬＤＲ／ＰＣＲプロセスを用いての低豊富 であるモノヌクレオチド反復多形性の検出を表す模式図である。 図２２は、ミクロサテライト反復体の検出のための１次ＰＣＲ／２次ＰＣＲプ ロセスを表す流れ図である。 図２３は、ミクロサテライト反復体における挿入および欠失の多重検出のため の１次ＰＣＲ／２次ＰＣＲプロセスを表す模式図である。 図２４は、ＬＤＲ／ＰＣＲプロセスにおける遺伝子増幅および欠失の定量のた めのＬＤＲオリゴヌクレオチドプローブの設計を示す。 図２５Ａ−Ｄは、ＬＤＲ／ＰＣＲプロセスについての電気泳動濃度を示す。 図２６Ａ−Ｃは、正常女性ＤＮＡ、肺癌細胞系ＺＲ−７５−３０ ＤＮＡおよ び消化器癌細胞系ＳＫＧＴ−２に由来するＥｒｂＢ、Ｇ６ＰＤ、Ｉｎｔ２、ｐ５ ３およびＳＯＤ遺伝子セグメントについてのＬＤＲ／ＰＣＲプロセスの電気泳動 濃度を示す。ＥｒｂB遺伝子は癌細胞系で増幅することが知られている。１０４ ｂｐの標的特異的連結反応産物配列は、各連結反応プライマー５００フェムトモ ル、ゲノムＤＮＡ５０ng、Thermus thermophillus（“Tth”）リガーゼ１２４単 位、１０×緩衝液２μｇ（０.２Ｍ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８.５および０.１Ｍ ＭｇＣ ｌ2）、１０ｍＭ ＮＡＤ２μｇおよび２００ｍＭ ＤＴＴ １μｌを容量２０μｌ で用いて、ＬＤＲの１０サイクル（９４℃で３０秒、６５℃で４分）において生 成せしめる。連結反応産物は、１０×ストフェル緩衝液（Perkin Elmer）５μｌ 、各オリゴヌクレオチドプライマー２５ピコモル、Ｔａｑポリメラーゼ・ストフ ェル・フラグメント２５単位および各ｄＮＴＰ中の５ｍＭ溶液８μｌを含有する 溶液３０μｌを加えて、ＰＣＲの２６サイクル（９４℃で１５秒、６５℃で５０ 秒）において比較的に増幅される。増幅後、産物をＨａｅIIIおよびＨｉｎ Ｐ１ Ｉで消化し、５８ｂｐ（ＥｒｂＢ（すなわちＨＥＲ−２／ｎｅｕ／ｅｒｂＢオン コジーン）、６１ｂｐ（Ｇ６ＰＤ）、６７ｂｐ（Ｉｎｔ２（すなわちｉｎｔ−２ オンコジーン））、７０ｂｐ（ｐ５３）および７６ｂｐ（ＳＯＤ））のＦＡＭ標 識産物を産生する。これらの産物を分離し、ジーンスキャン６７２ソフトウェア ・パッケージ（Applied Biosystems,Inc.，Foster City,Calif.）を用いて３７ ３ＡＤＮＡシクエンサー上で解析する。結果が電気泳動濃度図に表され、ピーク の高さと面積がＰＣＲ産物の量を示している。図２６Ａは、正常女性ＤＮＡにお ける５部位について遺伝子量測定を示す。Ｇ６ＰＤ、Ｉｎｔ２、ｐ５３およびＳ ＯＤについてのピークの高さおよび面積は非常に類似している。ＦｒｂＢについ てのピークの高さおよび面積は正常ゲノムＤＮＡにおいて明らかに小さい。図２ ６Ｂは、既知のＥｒｂＢ増幅での細胞系、ＺＲ−７５−３０において遺伝子量を 検査したので、ＥｒｂＢでのピークが高く、面積が大きいことを示している。図 ２６Ｃは、消化器細胞系であるＳＫＧＴ−２においてＥｒｂＢ遺伝子の劇的な増 幅およびIｎｔ２の中程度の増幅があることを示している。Ｇ６ＰＤ遺伝子ピー クは、大きいＥｒｂＢピークにのみこまれたかも知れない。 図２７Ａ−Ｃは、Ｇ６ＰＤ、Ｉｎｔ２、ｐ５３およびＳＯＤについて他のＬＤ ＲオリゴヌクレオチドプローブおよびＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーの相 対的ピークの高さにＥｒｂＢ増幅が影響するかどうかを測定するためのＬＤＲ／ ＰＣＲプロセスについての電気泳動濃度図を示す。図２７Ａは、正常女性ＤＮＡ における４部位についての遺伝子量測定を示す。全５ＬＤＲプライマーを用いた 実験でのようにＧ６ＰＤ、Ｉｎｔ２、ｐ５３およびＳＯＤについてのピークの高 さおよび面積は類似している。図２７Ｂは、ＺＲ−７５−３０乳癌細胞系のＧ６ ＰＤ、Ｉｎｔ２、ｐ５３およびＳＯＤが正常女性ＤＮＡに比較して類似の相対ピ ークの高さであることを示している。ｐ５３についてのピークは低下し、この細 胞系における細胞部分でのこの遺伝子の欠失を示唆している。図２７Ｃは、消化 器癌細胞系のＳＫＧＴ−２において、Ｇ６ＰＤおよびｐ５３が同等のピークを有 することを示している。全５ＬＤＲオリゴヌクレオチドプローブを用いた実験で のように、Ｉｎｔ２のピークは比較的高い。このように、各産物のＬＤＲおよび ＰＣＲ増幅は、実験中において他の産物と独立的とみられる。 図２８Ａ−Ｃは、１次ＰＣＲ／２次ＰＣＲ／ＬＤＲプロセスのＰＣＲ相につい ての電気泳動濃度図を示す。１次ＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを用いて の１２部位の多重ＰＣＲ増幅は大略等量の産物をつくる。単一塩基多形性を有す る８０以上の遺伝子領域がヒトゲノム・データベースから同定された。そのうち １２（表１０および図２９Ａ−Ｈ参照）は、１次ＰＣＲ相において次のように増 幅された。２次ＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーの２セットの１つに相補的 な遺伝子特異的３’末端および５’末端を有するように、長い１次ＰＣＲオリゴ ヌクレオチドプライマーを設計した。上流１次ＰＣＲオリゴヌクレオチドプライ マーはＦＡＭ（すなわち、６−カルボキシフルオレセイン：配列決定および変異 検定に用いられる蛍光染料）またはＴＥＴ（すなわち、テトラクロリネート−６ −カルボキシフルオレセイン：配列決定／変異検定に用いられる蛍光染料）のい ずれかでの蛍光標識を持つように合成した。全２４塩基の長い１次ＰＣＲオリゴ ヌクレオチドプライマーを低濃度（２０μｌ中各プライマー２ピコモル）で１５ サイクルの１次ＰＣＲ相に用いた。その後、２次ＰＣＲオリゴヌクレオチドプラ イマーの２セットを高濃度（各２５ピコモル）で加え、２次ＰＣＲ相をさらに２ ５サイクル行った。産物を３７３ＤＮＡシークエンサー（Applied Biosystems） で分離した。パネルＡは、ＦＡＭ−およびＴＥＴ−標識産物について合わせた電 気泳動濃度図を示す。パネルＢは、ＦＡＭ標識産物のみを示す。パネルＣは、Ｔ ＥＴ標識産物のみを示す。このプロセスは、プライマー濃度またはＰＣＲ条件を 注意深く調節する必要なしに、多重的産物について同様の量を産生する。 図２９Ａ−Ｈは、法医学的同定のための１２バイ対立遺伝子の検出における１ 次ＰＣＲ／２次ＰＣＲ／ＬＤＲプロセスのＬＤＲ相についての電気泳動濃度図を 表す。１２多形性遺伝子についての１次および２次ＰＣＲ相は、図２８Ａ−Ｃ記 載のように行った。しかし、２次ＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを蛍光標 識しなかった。２次ＰＣＲプロセス伸長産物を３６ＬＤＲ・オリゴヌクレオチド プローブ（各部座につき１通常および２識別プライマー）含有のリガーゼ緩衝液 中に希釈した。ＬＤＲオリゴヌクレオチドプローブセットを次の２方法で設計し た。（ｉ）対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブは同じ長さであるが、 ＦＡＭかＴＥＴ標識のいずれかを含有する、（ii）対立遺伝子特異的オリゴヌク レオチドプローブ両者をＨＥＸ（すなわち、ヘキサクロリネート−６−カルボキ シフルオレセイン：配列決定および変異検出に用いられる蛍光染料）で標識する が、長さに２塩基対の相違がある。ＬＤＲ相の２０サイクル後、連結反応産物配 列を３７３ＤＮＡシークエンサー（Applied Biosystems）で１０％ポリアクリル アミド・シークエンシング・ゲルにより溶解した。パネルＡおよびＥは、２個体 の１２座ＰＣＲ／ＬＤＲを示す。パネルＢ、ＣおよびＤは夫々、パネルＡにおけ る個体についてのＦＡＭ、ＴＥＴおよびＨＥＸを示す。パネルＡの個体は、座６ （ＡＬＤＯＢ（すなわちアルドラーゼＢ））および座８（ＩＧＦ（すなわちイン スリン生長因子））でのみ同型接合である。パネルＥの個体は、座３（Ｃ６（す なわち、補体成分Ｃ６））、座５（ＮＦ１（すなわち、神経線維腫症））、座６ （ＡＬＤＯＢ）および座８（ＩＧＦ）でのみ異型接合であった。このことから、 １次ＰＣＲ／２次ＰＣＲ／ＬＤＲプロセスが多数の位置における同型接合および 異型接合の両方の遺伝子型を同時に識別し得ることが分かる。 発明の詳細な記述 Ｉ．１次ＰＣＲ／２次ＰＣＲ／ＬＤＲプロセス 本発明の一つの実施態様は、複数の標的ヌクレオチド配列における１以上の単 一塩基の変更、挿入、欠失または転座により相違している複数の配列の２以上を 同定するための方法に関する。この方法は、第１ポリメラーゼ相、第２ポリメラ ーゼ相およびリガーゼ検出相を含む。このプロセスは、複数の配列相違がある１ 以上の標的ヌクレオチド配列を含有するかも知れないサンプルを分析することを 含む。 第１ポリメラーゼ連鎖反応相において、１以上の1次オリゴヌクレオチドプラ イマー群が準備される。各群は１以上の１次オリゴヌクレオチドプライマー・セ ットを含有し、各セットは、標的特異的部分と５’上流２次プライマー特異的部 分を有する第１ヌクレオチドプライマー、および標的特異的部分と５’上流２次 プライマー特異的部分を有する第２オリゴヌクレオチドプライマーを含む。同じ 群の各セットの第１オリゴヌクレオチドプライマーは同じ５’上流２次プライマ ー特異的部分を有し、同じ群の各セットの第２オリゴヌクレオチドプライマーは 同じ５’上流２次プライマー特異的部分を有している。特定のセットのオリゴヌ クレオチドプライマーは、対応する標的ヌクレオチド配列の相補的鎖でのハイブ リダイゼーションに適しており、ポリメラーゼ連鎖反応産物の形成をもたらす。 しかし、１次オリゴヌクレオチドプライマーがサンプル中に他のヌクレオチド配 列にハイブリダイズするときに、該ポリメラーゼ連鎖反応産物の形成に妨害する ミスマッチがある。特定のセットにおけるポリメラーゼ連鎖反応産物は、同じ群 での他のポリメラーゼ連鎖反応産物と識別され得る。１次オリゴヌクレオチドプ ライマー、サンプルおよびポリメラーゼは混合されて、１次ポリメラーゼ連鎖反 応混合物を形成する。 １次ポリメラーゼ連鎖反応混合物は、実質的に上記したように、変性処理、ハ イブリダイゼーション処理および伸長処理を含む２以上のポリメラーゼ連鎖反応 サイクルにかけられる。ハイブリダイゼーションの際に、１次オリゴヌクレオチ ドプライマーの標的特異的部分が標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズする。 伸長処理によってハイブリダイズした１次オリゴヌクレオチドプライマーが伸長 されて、１次オリゴヌクレオチドプライマーがハイブリダイズする標的ヌクレオ チド配列に相補的な１次伸長産物を形成する。 １次オリゴヌクレオチドプライマーの上流２次プライマー特異的部分は標的Ｄ ＮＡに存在しないが、その配列は１次ポリメラーゼ連鎖反応相の第２以後のサイ クルで複写される。結果として、第２サイクル後に産生された１次伸長産物は、 その５’末端に２次プライマー特異的部分、およびその３’末端にプライマー特 異的部分の補体を有する。 次は、第２ポリメラーゼ連鎖反応相である。この相では１つまたは複数の２次 オリゴヌクレオチドプライマーセットが準備される。各セットは、第１の１次オ リゴヌクレオチドプライマーの５’上流部分と同じ配列を含有する第１の２次オ リゴヌクレオチドプライマー、および第１の２次プライマーに相補的な第１の１ 次オリゴヌクレオチドと同じ１次オリゴヌクレオチドプライマーセットに由来す る第２の１次オリゴヌクレオチドプライマーの５’上流部分と同じ配列を含有す る第２の２次オリゴヌクレオチドプライマーを有する。２次オリゴヌクレオチド プライマーのセットは、特定の群において１次伸長産物のすべてを増幅するのに 使用され得る。２次オリゴヌクレオチドプライマーを１次伸長産物およびポリメ ラーゼと混合して、２次ポリメラーゼ連鎖反応混合物とする。 ２次ポリメラーゼ連鎖反応混合物は、実質的に上記したように、変性処理、ハ イブリダイゼーション処理および伸長処理を含む２以上のポリメラーゼ連鎖反応 サイクルにかけられる。ハイブリダイゼーションの際に、２次オリゴヌクレオチ ドプライマーの標的特異部分が１次伸長産物上に存在する相補的配列にハイブリ ダイズし、元の標的配列にハイブリダイズしない。伸長処理によってハイブリダ イズ２次オリゴヌクレオチドプライマーが伸長されて、１次伸長産物に相補的な ２次伸長産物を形成する。 本発明の態様における最後の相はリガーゼ検出反応相である。ここでは、複数 のオリゴヌクレオチドプローブセットが準備され、各セットは、２次伸長産物特 異的部分と検出可能レポーター標識を保持する第１オリゴヌクレオチドプローブ 、および２次伸長産物特異的部分を保持する第２オリゴヌクレオチドプローブを 有する。特定セットのオリゴヌクレオチドプローブは、相補的２次伸長産物特異 的部分に互いに隣接してハイブリダイズしたときに一緒に連結反応するのに適し ている。しかし、オリゴヌクレオチドプローブがサンプル中の他のヌクレオチド 配列にハイブリダイズするときに該連結反応を妨害するミスマッチがある。特定 セットにおけるオリゴヌクレオチドプローブの連結反応産物は、プローブまたは 他の連結反応産物のいずれかと識別され得る。複数のオリゴヌクレオチドプロー ブセットを２次伸長産物およびリガーゼと混合して、リガーゼ検出反応混合物と する。 リガーゼ検出反応混合物は、実質的に上記したように、変性処理およびハイブ リダイゼーション処理を有する１以上のリガーゼ検出反応サイクルにかけられる 。 ハイブリダイゼーション処理において、オリゴヌクレオチドプローブセットは、 隣接部位で塩基特異的に、もし存在すれば夫々の２次伸長産物にハイブリダイズ する。結果として、隣接プローブは互いに連結して、一緒に結合している検出可 能レポーター標識および２次伸長産物特異的部分を含有する連結産物配列を形成 する。オリゴヌクレオチドプローブセットは、その夫々の相補的２次伸長産物以 外のヌクレオチド配列にハイブリダイズし得るが、１以上のミスマッチの存在の ために一緒に連結しないで、変性処理の際に個々に分離している。リガーゼ検出 反応サイクルに続いて、連結反応産物配列のレポーター標識が検出されて、サン プル中の１以上の標的ヌクレオチド配列の存在が示される。 図１、２および３は２種の検出手法のいずれかを用いた本発明の１次ＰＣＲ／ ２次ＰＣＲ／ＬＤＲプロセスを表す流れ図である。１つの方法として、毛管電気 泳動またはゲル電気泳動と蛍光定量の使用がある。他方、捕捉オリゴヌクレオチ ドアドレスのアレイ上の捕捉と蛍光定量によって検出が実施される。図１は生殖 細胞系変異（例えば、点変異）の検出に関し、図２はバイ対立遺伝子多形性の検 出であり、図３は癌関連変異の検出を示す。 図１は生殖系点変異の検出を表す。第１工程において、ＤＮＡサンプル作成後 、Ｔａｑ（すなわちThermus aquaticus）ポリメラーゼを用いた１次ＰＣＲ増幅 に、ホットスタート条件で、標的特異的部分と２次プライマー特異的部分とを有 するオリゴヌクレオチドプライマーと共に、多重エクソンをかける。１次ＰＣＲ 相の終了点で、Ｔａｑポリメラーゼは、１００℃で１０分間加熱するか、または 凍結／解凍工程により不活性化される。１次ＰＣＲ増幅相の産物は、第２工程で Ｔａｑポリメラーゼを用いホットスタート条件で２次オリゴヌクレオチドプライ マーと共に、２次ＰＣＲ増幅にかける。２次ＰＣＲ相の終了点で、Ｔａｑポリメ ラーゼは、１００℃で１０分間加熱するか、または凍結／解凍工程により不活性 化される。第３工程において、２次ＰＣＲ相の産物は、対立遺伝子特異的部分と 共通部分を有するＬＤＲオリゴヌクレオチドプローブを含有する新鮮なＬＤＲ緩 衝液に２０倍に希釈する。第４工程は、ＬＤＲ相であって、ホットスタート条件 でＴａｑリガーゼを加えることにより始まる。ＬＤＲの際にオリゴヌクレオチド プローブはその隣接のオリゴヌクレオチドプローブに、接合部で完全な相補性を 与え る標的配列の存在においてのみ、連結する。 産物は２種の相違するホーマットにおいて検出される。第１ホーマット５ａで は、蛍光標識ＬＤＲプローブが相違する長さのポリＡまたはヘキサエチレンオキ シド・テイルを含有する。このように各連結反応産物配列（正常ＤＮＡ上でハイ ブリダイズされた２プローブの連結反応の結果である）は、いくつかの連結反応 産物配列がピークの段差を与えるように、少し相違する長さと運動性を有する。 生殖細胞系変異は電気泳動濃度図上に新しいピークをつくることがある。他方、 生殖細胞系変異連結反応産物配列が正常ＤＮＡ連結反応産物配列と同じ運動性を 有して泳動するが、相違する蛍光レポーターで識別されるようにＬＤＲプローブ は設計され得る。新しいピークのサイズはほぼ元のサンプルに存在する変異の量 である。すなわち、ホモ接合正常は０％、ヘテロ接合保持は５０％、そしてホモ 接合変異は１００％である。第２ホーマット５ｂにおいて、各対立遺伝子特異的 プローブは、例えばその５’末に２４追加ヌクレオチド塩基を含有する。これら の配列はユニーク・アドレス可能配列であって、アドレス可能アレイ上でその相 補的アドレス配列に特異的にハイブリダイズする。ＬＤＲ反応において、各対立 遺伝子特異的プローブは、対応する標的配列の存在において隣接の蛍光標識共通 プローブに連結できる。野生型および変異の対立遺伝子に対応する連結反応産物 配列は、アレイ上の隣接アドレスに捕捉される。未反応のプローブは洗浄して除 く。黒点は野生型対立遺伝子についての１００％シグナルを表す。白点は変異対 立遺伝子についての０％シグナルを表す。灰色点は生殖細胞系変異の１つの位置 、各対立遺伝子についての５０％シグナルを表す。 図２は、バイ対立遺伝子多形性の検出を表す。第１工程において、Ｔａｑポリ メラーゼを用いた１次ＰＣＲ増幅に、ホットスタート条件で、標的特異的部分と ２次プライマー特異的部分とを有するオリゴヌクレオチドプライマーと共に、多 重エクソンをかける。１次ＰＣＲ増幅相の産物は、第２工程でＴａｑポリメラー ゼを用いホットスタート条件で２次オリゴヌクレオチドプライマーと共に、２次 ＰＣＲ増幅にかける。２次ＰＣＲ相の終了点で、Ｔａｑポリメラーゼは、１００ ℃で１０分間加熱するか、または凍結／解凍工程により不活性化される。第３工 程において２次ＰＣＲ相の産物は対立遺伝子特異的部分と共通部分を有するＬ ＤＲオリゴヌクレオチドプローブを含有する新鮮なＬＤＲ緩衝液に２０倍に希釈 する。第４工程は、ＬＤＲ相であって、ホットスタート条件でＴａｑリガーゼを 加えることにより始まる。ＬＤＲの際にオリゴヌクレオチドプローブはその隣接 のオリゴヌクレオチドプローブに、接合部で完全な相補性を与える標的配列の存 在においてのみ、連結する。第１ホーマット５ａでは、蛍光標識ＬＤＲプローブ が相違する長さのポリＡまたはヘキサエチレンオキシド・テイルを含有する。各 連結反応産物は、いくつかの連結反応産物配列がピークの段差を与えるように、 少し相違する長さと運動性を有する。他方、多形性対立遺伝子の連結反応産物配 列が同じ位置で移動するが、相違する蛍光レポーターで識別されるようにＬＤＲ プローブは設計され得る。ピークのサイズはほぼ各対立遺伝子の量である。第２ ホーマット５ｂにおいて、各対立遺伝子特異的プローブは、例えばその５’末に ２４の追加ヌクレオチド塩基を有するユニーク・アドレス可能配列を含有する。 これらの配列は、捕捉オリゴヌクレオチドアレイ上でその相補的アドレス配列に 特異的にハイブリダイズする。ＬＤＲ反応において、各対立遺伝子特異的プロー ブは、対応する標的配列の存在において隣接の蛍光標識共通プローブに連結でき る。各対立遺伝子に対応する連結反応産物配列は、アレイ上の隣接アドレスに捕 捉される。未反応のプローブは洗浄して除く。黒点は両染色体が与えられた対立 遺伝子を有すことを表す。白点はいずれの染色体もこの対立遺伝子を有さないこ とを表す。灰色点は１つの染色体が与えられた対立遺伝子を有することを表す。 図３は、癌関連変異を表す。第１工程において、ＤＮＡサンプル作成後、Ｔａ ｑポリメラーゼを用いた１次ＰＣＲ増幅に、ホットスタート条件で、標的特異的 部分と２次プライマー特異的部分とを有するオリゴヌクレオチドプライマーと共 に、多重エクソンをかける。１次ＰＣＲ増幅相の産物は、第２工程でＴａｑポリ メラーゼを用いホットスタート条件で２次オリゴヌクレオチドプライマーと共に 、２次ＰＣＲ増幅にかける。２次ＰＣＲ相の終了点で、Ｔａｑポリメラーゼは、 １００℃で１０分間加熱するか、または凍結／解凍工程により不活性化される。 ＰＣＲ産物の蛍光定量は第３工程において毛管またはゲル電気泳動により行うこ とができる。第４工程において、産物はマーカーＤＮＡの１／１００希釈（フラ グメントの各々につき）でスパイクされる。このＤＮＡは、癌サンプルにみられ な いが、適当なＬＤＲプローブで容易に検出される変異を有することを除けば、野 生型ＤＮＡに相同的である。第５工程において、２次ＰＣＲ相産物中の混合ＤＮ Ａ産物は、対立遺伝子特異的部分と共通部分を含有するＬＤＲオリゴヌクレオチ ドプローブを含む新鮮なＬＤＲ緩衝液に２０倍に希釈される。第６工程は、ＬＤ Ｒ相であって、ホットスタート条件でＴａｑリガーゼを加えることにより始まる 。ＬＤＲの際に、接合部に完全な相補性を与える標的配列の存在においてのみ、 オリゴヌクレオチドプローブがその隣接のオリゴヌクレオチドプローブに連結す る。 産物は上記と同じホーマットで検出される。第７ａ工程のホーマットにおいて 、毛管またはゲル電気泳動により産物が分離され、そして蛍光シグナルが定量さ れる。変異ピークのマーカーピークに対する割合は、元のサンプル中に存在する 癌変異の概量を１００で除して算出される。第７ｂ工程のホーマットにおいて、 アドレス可能アレイ上の相補的配列についての特異的ハイブリダイゼーションに よって産物が検出される。マーカー点に対する変異点中の蛍光シグナルの割合は 、元のサンプル中に存在する癌変異の概量を１００で除して算出される。 図４に示すように、興味ある２種のＤＮＡフラグメントを本発明の１次ＰＣＲ ／２次ＰＣＲ／ＬＤＲプロセスで処理する。最初に２重鎖ＤＮＡ分子を変性して 、鎖をほどく。これは８０−１０５℃に加熱することによりなされる。３−標的 特異的部分（影の部分）と５’２次プライマー特異的部分（黒い部分）を有する １次ＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを低濃度で加えて、典型的に５０−８ ５℃で鎖にハイブリダイズせしめる。熱安定性ポリメラーゼ（例えば、Taq aqua nticusポリメラーゼ）も加え、温度を５０−８５℃に調節して、プライマーがハ イブリダイズする核酸の長さに沿ってプライマーを伸長する。ポリメラーゼ連鎖 反応の伸長相の後に、得た２重鎖分子を８０−１０５℃に加熱して、分子を変性 し、鎖を分離する。これらのハイブリダイゼーション、伸長、変性工程は数回繰 り返して、標的を適当なレベルにまで増幅する。 ２次ＰＣＲ相において、１次ＰＣＲ相産物を２次ＰＣＲオリゴヌクレオチドプ ライマーと混合して、典型的には５０−８５℃で互いにハイブリダイズせしめる 。２次オリゴヌクレオチドプライマーは１次オリゴヌクレオチドプライマーより も常に高い濃度で使用する熱安定性ポリメラーゼも加え、温度を５０−８５℃に 調 節して、プライマーがハイブリダイズする核酸の長さに沿ってプライマーを伸長 する。ポリメラーゼ連鎖反応の伸長相の後に、得た２重鎖分子を８０−１０５℃ に加熱して、分子を変性し、鎖を分離する。これらのハイブリダイゼーション、 伸長、変性工程は数回繰り返して、標的を適当なレベルにまで増幅する。 ２次ＰＣＲ相が完了すると、図４に示すように、連結検出反応相が始まる。標 的核酸変性後、もし存在すれば二重鎖ＤＮＡ分子として、温度８０−１０５℃、 好ましくは９４℃で、標的ヌクレオチド配列の１本鎖のための連結検出反応オリ ゴヌクレオチドプローブがリガーゼと共に加えられる（例えば、図４に示すよう に、Taq aquanticusポリガーゼのような熱安定性リガーゼ）。オリゴヌクレオチ ドプローブは標的核酸分子とハイブリダイズし得て、典型的には４５−８５℃、 好ましくは６５℃で連結する。連結部に完全な相補性があるとオリゴヌクレオチ ドは一緒に連結する。変わり得るヌクレオチドがＴまたはＡであると、標的ヌク レオチド配列におけるＴの存在は、Ｆ１レポーター標識を有するオリゴヌクレオ チドプローブを５’ポリＡテイルＡnを有する共通オリゴヌクレオチドプローブ と連結せしめ、標的ヌクレオチド配列中のＡの存在は、Ｆ２レポーター標識を有 するオリゴヌクレオチドプローブをＡnを有する共通のオリゴヌクレオチドプロ ーブと連結せしめる。同様に、変わり得るヌクレオチドがＡまたはＧであると、 標的ヌクレオチド配列におけるＴの存在は、Ｆ３ＡＡレポーター標識（すなわち 、５’ポリＡスペーサーを形成する２追加塩基にカップルしたＦ３レポーター標 識）を有するオリゴヌクレオチドプローブを５’ポリＡテイルＡn+4を有する共 通オリゴヌクレオチドプローブと連結せしめ、標的ヌクレオチド配列中のＣの存 在は、Ｆ３レポーター標識を有するオリゴヌクレオチドプローブをＡn+4を有す る共通のオリゴヌクレオチドプローブと連結せしめる。連結反応後に材料を変性 にかけてハイブリダイズ鎖を分離する。ハイブリダイゼーション／連結反応およ び変性工程は１以上のサイクル（例えば１−５０サイクル）で実施されて、標的 シグナルが増幅される。両Ｆ３−標識オリゴヌクレオチドの等モル連結反応は個 体がその座についてヘテロ接合型であることを示し、一方、Ｆ２標識オリゴヌク レオチドの連結反応は個体が他の座についてホモ接合型であることを示す。 図４において、定量が毛管またはゲル電気泳動で実施されるとき、ポリＡnお よびポリＡn+4テイルが用いられる。異なった長さのテイルによって、対応する 相違の連結反応産物配列がゲルまたは毛管における異なる位置でバンドを形成す る。異なる位置でのバンドの存在は、解析されるＤＮＡにおける対応ヌクレオチ ド相違の同定を可能にする。連結反応産物配列が異なるレポーター標識の使用に 基づいて識別できるけれども、異なるレポーター標識と異なる長さのテイルの組 み合せは、より多数のヌクレオチド相違の識別を可能とする。これは多重検出プ ロセスに重要である。 図１−３について述べたように、ゲルまたは毛管電気泳動に代わって、アドレ ス可能アレイ上での検出を実施できる。かかるアドレス可能アレイの使用には、 レポーター標識（すなわちテイルＡnおよびＡn+4）を含有しないＬＤＲオリゴヌ クレオチドプローブ上のポリＡが相違するアドレス可能アレイ特異的オリゴヌク レオチド部分で置き換えられることを要する。上記でより完全に説明したように 、固体支持物は捕捉オリゴヌクレオチドのアレイと共に準備され、そのいくつか は相違するアドレス可能アレイ特異的オリゴヌクレオチド部分に相補的である。 相補的捕捉オリゴヌクレオチドプローブのこれらの部分のハイブリダイゼーショ ンは対応するヌクレオチド相違の存在を示す。 図５は、本発明のよる１次ＰＣＲ／２次ＰＣＲ／ＬＤＲプロセスについての模 式図であり、興味ある２ＤＮＡ分子における可能性ある塩基が識別される。１次 および２次ＰＣＲプロセスは、図４で述べたのと実質的に同じように実施される 。左手のＤＮＡ分子と併せた蛍光レポーター標識Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３およびF３の 出現は、夫々ＤＮＡ分子におけるＡ、Ｇ、ＣおよびＴ対立遺伝子の存在を表す。 図５に示すように、等量のＦ１およびＦ３レポーター標識は問題の個体がＡおよ びＣ対立遺伝子についてヘテロ接合型であることを表す。図５における右手のＤ ＮＡ分子の分析について、同じレポーター標識が異なる対立遺伝子の存在を表す のに用いられる。しかし、識別塩基を有する各オリゴヌクレオチドプローブ上で 、異なる５’ポリＡテイルが存在する。より特異的に２単位ポリＡテイル、４単 位ポリＡテイル、６単位ポリＡテイルおよび８単位ポリＡテイルが、夫々ＤＮＡ 分子におけるＴ、Ｃ、ＧおよびＡ対立遺伝子に対応する。図５に示すように、Ａ6 およびＡ4テイルを有する等量のＦ１レポーター標識は、問題の個体がＧおよび Ｃ対立遺伝子についてヘテロ接合型であることを表す。 図６は、図５は、本発明のよる１次ＰＣＲ／２次ＰＣＲ／ＬＤＲプロセスにつ いての模式図であり、興味ある２ＤＮＡ分子における２近接部位で可能性ある塩 基が識別される。１次および２次ＰＣＲプロセスは、図４で述べたのと実質的に 同じように実施される。ここではＬＤＲプローブは重複可能であり、接合部で完 全な相補性が存在すると連結がなお可能である。これがＬＤＲを他の方法と区別 することであって、対立遺伝子特異的ＰＣＲなどでは、重複プライマーが互いに 妨害し合う。図６において、識別オリゴヌクレオチドプローブは、そのプローブ の３末に識別塩基を有するレポーター標識を含有する。ポリＡテイルは共通オリ ゴヌクレオチドプローブの３’末上にある。左手のＤＮＡ分子において、レポー ター標識Ｆ１およびＦ３を有する連結反応産物配列の等量の存在は、問題の個体 が第１位置でＡおよびＣ対立遺伝子についてヘテロ接合であることを示す。同様 に、左手のＤＮＡ分子の第２位置において、レポーター標識Ｆ２、Ｆ３およびＦ ４を有する連結反応産物配列の存在は、問題の個体がＧ、ＣおよびＴ対立遺伝子 についてヘテロ接合であることを示す。 右手のＤＮＡ分子にもどって、Ａ6およびＡ4テイルを持つレポーター標識Ｆ１ を有する連結反応産物配列の等量の存在は、問題の個体が第１位置でＧおよびＣ 対立遺伝子についてヘテロ接合であることを示す。右手のＤＮＡ分子の第２位置 において、Ａ8およびＡ2テイルを持つレポーター標識Ｆ１を有する連結反応産物 配列の等量の存在は、問題の個体がＡおよびＴ対立遺伝子についてヘテロ接合で あることを示す。 図７は、正常配列の過剰存在で低存在量の変異を検出するための本発明の１次 ＰＣＲ／２次ＰＣＲ／ＬＤＲプロセスを表す模式図である。左手のＤＮＡ分子は Ｋ−ｒａｓ遺伝子のコドン１２、配列ＧＧＴでグリシン（“Gly”）をコードす る。小さい比率の細胞がＧＡＴにおけるＧからＡへの変異を含有し、アスパラギ ン酸（“Asp”）をコードする。野生型（すなわち正常）配列についてのＬＤＲ プローブが反応から抜けている。正常ＬＤＲプローブ（Ｇである識別塩基と共） が挿入されると、このプローブは共通プローブに連結し、変異標的由来のいかな るシグナルにも打ち勝つ。代わりに、図７に示されるように、蛍光標識Ｆ１およ びＡn+2テイルを有する連結反応産物配列の存在は変異をコードするアスパルギ ン酸の存在を表している。右手のＤＮＡ分子において、Ｋ−ｒａｓ遺伝子のコド ン６１配列ＣＡＧがあり、グルタミン（“Gln”）をコードする。小さい比率の 細胞がＧＡＧにおけるＣからＧへの変異を含有し、グルタミン酸（“Glu”）を コードする。さらに、ＬＤＲオリゴヌクレオチドプローブが野生型に見られるＣ およびＡ塩基を含まず、変異シグナルに打ち勝つことはない。このＤＮＡ分子に ついて、蛍光標識Ｆ２Ａn+4テイルを有する連結反応産物配列の存在は変異をコ ードするグルタミン酸の存在を表す。 II．ＬＤＲ／ＰＣＲプロセス 本発明の第２態様は、複数の標的ヌクレオチド配列における１以上の単一塩基 の変更、挿入、欠失および転座によって相違している１以上の複数配列を同定す る方法に関する。この方法はリガーゼ検出反応相に続いてポリメラーゼ連鎖反応 相を有する。この方法は、複数の配列相違を有する１以上の標的ヌクレオチド配 列を含有する可能性のあるサンプルを準備することを含む。 リガーゼ検出反応相において１以上のオリゴヌクレオチドプローブが準備され る。各セットは、標的特異的部分と５’上流プライマー特異的部分を保持する第 １オリゴヌクレオチドプローブ、および標的特異的部分と３’下流プライマー特 異的部分を保持する第２オリゴヌクレオチドプローブを有する。特定セットにお ける折後ヌクレオチドプローブは、対応する標的ヌクレオチド配列に互いに隣接 してハイブリダイズするときに一緒に連結反応するのに適している。しかし、サ ンプル中に存在する他のヌクレオチド配列とハイブリダイズするときに、この連 結反応を妨害するミスマッチがある。サンプル、複数のオリゴヌクレオチドプロ ーブセットおよびリガーゼを混合して、リガーゼ検出反応混合物とする。 リガーゼ検出反応混合物は１以上のリガーゼ検出反応サイクルにかけられる。 これらのサイクルには変性処理とハイブリダイゼーション処理が含まれる。変性 処理において、ハイブリダイズされたオリゴヌクレオチドは標的ヌクレオチド配 列から分離される。ハイブリダイゼーション処理によって、オリゴヌクレオチド プローブセットは隣接部位で塩基特異的に、もしサンプル中に存在しておればそ の夫々の標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズする。ハイブリダイズされると 、 オリゴヌクレオチドプローブセットは互いに連結して、連結反応産物配列を形成 する。この産物は、５’上流プライマー特異的部分、一緒に結合した標的特異的 部分および３’下流プライマー特異的部分を含む。各セットの連結反応産物配列 は連結検出反応混合物中のたの核酸と識別可能である。オリゴヌクレオチドプロ ーブセットはその夫々の標的ヌクレオチド配列以外のサンプル中のヌクレオチド 配列とハイブリダイズするが、１以上のミスマッチの存在によって連結せず、そ して、次の変性処理の際に個々に分離している。 ポリメラーゼ連鎖反応において、１または複数のオリゴヌクレオチドプローブ が準備される。各セットは、連結反応産物配列の５’上流プライマー特異的部分 に同じ配列を含有する上流プライマー、および連結反応産物配列の３’下流プラ イマー特異的部分に相補的な下流プライマーを有している。うち、１つのプライ マーは検出可能レポーター標識を有する。リガーゼ検出反応混合物を１または複 数のオリゴヌクレオチドプローブセットおよびポリメラーゼと混合すると、ポリ メラーゼ連鎖反応混合物が形成する。 ポリメラーゼ連鎖反応混合物は、変性処理、ハイブリダイゼーション処理およ び伸長処理を含む１以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルにかけられる。変性処 理においてハイブリダイズ核酸配列が分離される。ハイブリダイゼーション処理 によって、プライマーが連結反応産物配列の相補的プライマー特異的部分とハイ ブリダイズする。伸長処理において、ハイブリダイズプライマーが伸長されて、 プライマーがハイブリダイズしている配列に相補的な伸長産物を形成する。ポリ メラーゼ連鎖反応相の第１サイクルにおいて、下流プライマーが連結反応産物配 列の３’下流プライマー特異的部分にハイブリダイズし、伸長されて連結反応産 物配列に相補的な伸長産物を形成する。次のサイクルにおいて、上流プライマー が連結反応産物に相補的な伸長産物の５’上流プライマー特異的部分にハイブリ ダイズし、下流プライマーが連結反応産物配列の３’下流部分にハイブリダイズ する。 このプロセスのポリメラーゼ連鎖反応相に続いて、レポーター標識が検出され 、伸長産物が識別されて、サンプル中の１以上の標的ヌクレオチド配列の存在が 表される。 図８は、制限エンドヌクレアーゼ消化の有無および毛管電気泳動検出を用いた 本発明のＬＤＲ／ＰＣＲプロセスを表す流れ図である。第１工程において、ＤＮ Ａサンプルは、Ｔａｑリガーゼ、および標的特異的部分およびプライマー特異的 部分を含有するオリゴヌクレオチドプローブと混合する。混合物はＬＤＲプロセ スにかけられて、連結標的特異的部分およびプライマー特異的部分を含有する連 結反応産物配列を産生する。第２工程で、連結反応産物配列をポリメラーゼおよ びプライマーと混合し、この混合物をＰＣＲプロセスにかける。次の工程で連結 反応産物配列が同じかまたは相違するサイズであるかの機能について測定する。 連結反応産物配列が相違するサイズであると、第３ａ工程が選ばれてＰＣＲから の伸長細胞が毛管電気泳動またはゲル電気泳動にかけられる。いずれも続いて蛍 光定量がなされる。連結反応産物配列が同じサイズのときは第３ｂ工程が用いら れ、ＰＣＲ相からの伸長産物は制限エンドヌクレアーゼ消化にかけられる。毛管 電気泳動またはゲル電気泳動にかけられるユニーク・サイズの消化フラグメント が産生され、第４ｂ工程による蛍光定量が行われる。第３ａ工程が選択されたと きは、電気泳動の結果のカーブは、１０４、１０７および１１０に移行する３種 の連結反応産物配列があり、ピーク域はそれぞれＨｅｒ２遺伝子増幅、ｐ５３遺 伝子のヘテロ接合の喪失およびコントロールＳＯＤ遺伝子を表す。第３ｂおよび ４ｂ工程による電気泳動曲線は、３種の連結反応産物配列制限フラグメントを５ ８、７０および７６に有し、ピーク域はそれぞれＨｅｒ２遺伝子増幅、ｐ５３遺 伝子のヘテロ接合の喪失およびコントロールＳＯＤ遺伝子を表す。 図８の別法として、図９は本発明のＬＤＲ／ＰＣＲプロセスを表し、第３工程 で伸長産物が捕捉オリゴヌクレオチドアドレスのアレイ上に捕捉される。捕捉オ リゴヌクレオチドプローブは連結反応接合部を通じてヌクレオチド配列に相補的 であり得る。捕捉オリゴヌクレオチドのアレイ上に捕捉された遺伝子コピー数は 既知のコントロールと比較して蛍光定量で測定される。図８において、アレイの このような分析は遺伝子特異的アドレスにハイブリダイズしている連結反応産物 配列を表し、蛍光の強度がＨｅｒ−２遺伝子増幅、ｐ５３遺伝子ヘテロ接合の喪 失およびコントロールＳＯＤ遺伝子をそれぞれ示す。 図１０は、遺伝子増幅および欠失の多重検出のためのＬＤＲ／ＰＣＲプロセス を表す模式図である。染色体１７ｑ由来のＨｅｒ−２／ｎｅｕ、染色体１７ｐ由 来のｐ５３遺伝子および染色体２１ｑ由来のＳＯＤ遺伝子の比率が検出される。 ９４℃でのＤＮＡの変性に続いて、標的特異的部分とプライマー特異的部分とを 有するオリゴヌクレオチドプローブの対が標的核酸上で互いに隣接してアニール し、互いに連結する（ミスマッチの不存在で）。このリガーゼ検出反応はＴｔｈ リガーゼでもってハイブリダイゼーション／連結反応温度６５℃で実施され、こ の温度はオリゴヌクレオチドプローブについてのＴｍ値７５℃より十分低い。次 いで、連結反応産物配列は、Ｔａｑポリメラーゼとプライマー特異的部分に相補 的な２つの共通プライマー（うち１つは蛍光標識されている）とを用いるＰＣＲ によって増幅される。サンプル中に最初に存在していた標的配列の比率は保持さ れる。伸長産物は、サンプル中に存在の各標的配列についてのユニーク・サイズ 蛍光標識フラグメントを放出するＨａｅIIIおよびＨｉｎｐ １Ｉで消化される 。消化産物を分離し、３７３Ａ ＤＮＡシークエンサー（Applied Biosystems， Inc.，Foster City，Calif.）で分析する。ピークの高さおよび面積は最初の標 的サンプルに存在する遺伝子の相対コピーに関する。 図１１は、対立遺伝子特異的ＬＤＲ／ＰＣＲプロセスにおいて生じ得る問題を 表す模式図である。ＰＣＲ／ＬＤＲプロセスは非常に強力であるが、本発明の多 重対立遺伝子特異的ＬＤＲ／ＰＣＲプロセスが好ましくなる状況が存在する。Ｌ ＤＲオリゴヌクレオチドプローブの１以上のセットを用い、各セットは、（ａ） 標的特異的部分と５’上流プライマー特異的部分とを有する第１オリゴヌクレオ チドプライマー、および（ｂ）標的特異的部分と３’下流プライマー特異的部分 とを有する第２オリゴヌクレオチドプライマーを特徴とする。図１１の第１工程 に示すように、ＬＤＲオリゴヌクレオチドプローブは標的配列上で互いに隣接し てアニールする。熱安定性リガーゼを用いるＬＤＲ反応（黒点）は、連結反応接 合部に完全な相補性があれば、連結反応産物配列を形成する。第２工程において 、連結反応産物配列はプライマーセットでＰＣＲ増幅される。この各セットは、 （ａ）連結反応産物配列の５’上流プライマー特異的部分と同じ配列を含有する 上流プライマー、および（ｂ）この連結反応産物配列の３’下流プライマー特異 的部分に相補的な下流プライマーを特徴とする。プライマーは第２工程に黒線と して示される。１つのプライマーが蛍光標識されていると、様々な検出方法にお いて検出され得る蛍光細胞を産生する。特異的であるべきＬＤＲ／ＰＣＲプロセ スについて、ＰＣＲ伸長産物は連結反応の不存在では形成されるべきでない。不 都合にも、ポリメラーゼが第ＩＬＤＲオリゴヌクレオチドプローブ（正常標的か ら離れて）を伸長して、標的配列の長さと５’末のプライマー特異的部分を含有 する産物を形成する可能性がある。一方、ポリメラーゼは、下流プライマーを用 いる下流ＬＤＲプローブのいくつかの相補的コピーをつくり得る。第２増幅サイ クルにおいて、この下流ＬＤＲプローブ伸長産物は標的配列から離れた上流ＬＤ Ｒプローブ伸長産物にアニールし、２つのプライマー特異的配列で両側から挟ま れた標的領域を含有する配列を生み出す。この産物はＬＤＲ産物として増幅され 、偽の正シグナルをもたらす。 図１２は、中間エクソヌクレアーゼ消化工程を用いて対立遺伝子特異的ＬＤＲ ／ＰＣＲ問題の解決を表す模式図である。対立遺伝子特異的ＬＤＲ／ＰＣＲは、 バックグランド連結反応独立（正しくない）標的増幅を顕著に低下して、達成す ることができる。そのために、連結反応産物配列の情報内容を除去しないで、連 結反応独立ＰＣＲ増幅に要する１以上の成分をなくすことが必要である。１つの 解決法は、第２工程においてエクソヌクレアーゼを用い、第１工程からの未反応 ＬＤＲオリゴヌクレオチドプローブを消化することである。連結していない末端 、例えば下流オリゴヌクレオチドプローブの３’末をブロックすることにより、 １つのプローブが実質的に消化に対し抵抗性となり、他は感受性となる。全長連 結反応産物配列の存在のみが上流プライマーの消化を防止する。ブロック群には 、骨格としてチオホスフェート類および／または２.０−メチルリボース糖類が ある。エクソヌクレアーゼにはExoＩ(３'−５')、ExoIII(３'−５')およびExoIV (５'−３'と３'−５'の両方)があり、後者は両側のブロックを必要とする。両プ ローブをブロックする便利な方法は、１つの長い“パドロック（padlock）”プ ローブ（参照、M．Nilsson et．al.,“Padlock Probes：Circularizing Oligonu cleotides for Localized DNA Detection,”Science 265:2085-88(1994)（出典 明示により本明細書の一部とする））を用いることであるが、必ずしも必要とし ない。エクソヌクレアーゼを用いる利点は、例えばExoＩ（単鎖特異的） とExoIII（二重鎖特異的）との併用は、両標的および１つのプローブを破壊し得 ることであり、連結反応産物配列は実質的に未消化で止まっていることである。 ＰＣＲに先立つエクソヌクレアーゼ処理により、第３および４工程において、各 セットの１つまたは両オリゴヌクレオチドプローブは実質的に減少し、残存のオ リゴヌクレオチドプローブと元の標的ＤＮＡ（これもエクソヌクレオチド処理に より実質的に減少）とのハイブリダイゼーション、およびオリゴヌクレオチドプ ローブセットによるＰＣＲ増幅のための適当な基質である連結反応産物配列の形 成が実質的に低下させられる。換言すれば連結反応独立標識伸長産物の形成は実 質的に減少し、またはなくなる。 図１３は、サイズまたはＤＮＡアレイのいずれかによる検出でエクソヌクレア ーゼ消化を用いる対立遺伝子特異的ＬＤＲ／ＰＣＲプロセスを表す流れ図である 。この流れ図は、多重対立遺伝子特異的ＬＤＲ／ＰＣＲプロセスに要する３反応 を示す。第１工程において、ＬＤＲオリゴヌクレオチドプローブ（下流プローブ がその３’末でブロックされている）が、ＴａｑＤＮＡリガーゼを用いて、正し い対立遺伝子標的の存在で連結される。第２工程で、未反応の上流プローブはエ クソヌクレアーゼで消化され、同時に標的も消化される。最後に第３工程で、プ ライマーセットが用いられて、連結反応産物配列のプライマー特異的部分にハイ ブリダイズすることにより連結反応産物配列を増幅する。第４ａ工程において、 与えられた特定のセットのＬＤＲオリゴヌクレオチドプローブがユニーク長産物 を産生し、オリゴヌクレオチドプローブまたは他の連結反応産物と識別される。 ＬＤＲ反応の後に産物は産物はサイズまたは電気泳動運動性により分別される。 ＰＣＲプライマー上の標識が検出され、サイズで産物が識別される。第４ｂ工程 において、特定セットのＬＤＲオリゴヌクレオチドプローブが、ＰＣＲプライマ ー配列での相違によってオリゴヌクレオチドプローブまたは他の連結反応産物配 列と識別される。複数のオリゴヌクレオチドプローブセットを使用することによ りすべての産物が識別される。各セットは、（ａ）連結反応産物配列の５’上流 プライマー特異的部分に同じ配列を含有する上流プライマーおよび（ｂ）連結反 応産物配列の３’下流プライマー特異的部分に相補的な下流プライマーを特徴と し、１つのプライマーは検出可能レポーター標識を有し、他のプライマーはその ５’ 末に連結したアドレス可能ヌクレオチド配列（アドレス可能ヌクレオチド配列が ＰＣＲ反応後単鎖を残すように）を含有する。後者は、ポリメラーゼが伸長し得 ないＰＣＲプライマー内の非天然塩基を用いて達成され、単鎖テイルを有するＰ ＣＲ産物を産生する。参照、Newton，et．al.，“The Production of PCR Produ cts with 5’Single-stranded Tails Using Primers that Incorporate Novel P hosphoramiditeI ntermediates”Nucl.Acids Res．21(3):1155-62(1993)（出典 明示により本明細書の一部とする）。相違する特定の部位に固定された相違捕捉 オリゴヌクレオチドを有するＤＮＡアレイを準備して（捕捉オリゴヌクレオチド はプライマー上のアドレス可能ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を 有する）、ＰＣＲ伸長産物がＤＮＡアレイにハイブリダイズできる。最後に、特 定部位でＤＮＡアレイに固定されたアドレス可能アレイ特異的部分を用いて捕捉 された伸長産物配列の標識が検出される。これはサンプル中の1以上の標的ヌク レオチド配列の存在を表す。 図１４は、サイズを基とする、またはＤＮＡアレイを基とする検出によるエク ソヌクレアーゼ消化を用いる対立遺伝子特異的ＬＤＲ／ＰＣＲプロセスを表す流 れ図である。この流れ図は、ＬＤＲ反応の開始点で（第２工程）マーカー配列を 加えること（第１工程）により相違する標的量（特に低存在癌変異）をいかに定 量するかを示す。生化学的反応（すなわちＰＣＲ（第４工程））に続いて、図１ ３に示すように、マーカー産物に対する変異産物の相対量が毛管またはゲル電気 泳動（第５ａ工程）またはアドレス可能アレイ上の捕捉（第５ｂ工程）を用いて 定量される。元のサンプル中の変異標的の量が決定される。 図１５は、変異または多形性の検出のためのエクソヌクレアーゼ消化（第２工 程）を有する対立遺伝子特異的ＬＤＲ／ＰＣＲプロセスを表す模式図である。変 異および多形性は図１２に記載のように識別される。本例において、第１工程で 、標的特異的部分の３’末に識別対立遺伝子特異的塩基を有する上流ＬＤＲオリ ゴヌクレオチドプローブは、相違する５’上流プライマー特異的部分を有する。 このように、相違するプライマー（ＰＣＲ増幅工程（すなわち第３工程における ））が相違する蛍光群（ＦａｍおよびＴｅｔ）で標識されて、産物の識別が可能 となる（第４工程）。アレイに基づく検出法も用いられ、上流（対立遺伝子特 異的）プローブが相違する５’上流プライマー特異的部分を有し、および相違す るＰＣＲプライマーがＰＣＲ反応後に単鎖を残す相違するアドレス可能ヌクレオ チド配列を含有する。 図１６は、モノヌクレオチドまたはジヌクレオチド反復多形性検出のためにエ クソヌクレアーゼ消化を用いる（第２工程）対立遺伝子特異的ＬＤＲ（第１工程 ）／ＰＣＲ（第３工程）を表す模式図である。ＬＤＲ／ＰＣＲの最も強力な使用 の１つは、ヌクレオチド反復多形性の検出であって、対立遺伝子特異的ＰＣＲで は達成できず（３'ヌクレオチドが常に同じであるから）、またＰＣＲ産物サイ ズ変化の観察でも容易に達成できない（増幅中にＴａｑポリメラーゼが滑ること による）ものである。図１６において、ＬＤＲオリゴヌクレオチドプローブはＡ9 とＡ10モノヌクレオチド反復配列を熱安定性ＤＮＡリガーゼの特異性によって 識別する。ＬＤＲ産物のみが正しい長さの標的配列上で形成し、そしてこの標的 の存在が識別される（第４工程）。 図１７は、低存在量のモノヌクレオチドまたはジヌクレオチド反復変異の検出 のためにエクソヌクレアーゼ消化（第２工程）を用いる対立遺伝子特異的ＬＤＲ ／ＰＣＲプロセスを表す模式図である。モノヌクレオチド反復長変異は図１２に 記載のように識別される。図１７において、ＬＤＲオリゴヌクレオチドプローブ （第１工程）はＡ8、Ａ9（変異）およびＡ10（正常）モノヌクレオチド反復配列 を熱安定性ＤＮＡリガーゼの特異性によって識別する。２つの上流ＬＤＲオリゴ ヌクレオチドプローブは、その標的特異的部分の３’末でモノヌクレオチド配列 の長さが異なり、相違する５’上流プライマー特異的部分を有する。このように 、相違するプライマー（ＰＣＲ増幅工程（第３工程）における）は異なる蛍光群 （ＦａｍおよびＴｅｔ）で標識されて、産物の識別が可能となる（第４工程）。 これには、サイズに代わり蛍光標識を基にしてモノヌクレオチド反復多形性が識 別できるという顕著な利点がある。サイズによる識別はポリメラーゼ滑りのため に偽の正反応をもたらしやすい。アレイに基づく検出法においては、上流（対立 遺伝子特異的）プローブは相違する５’上流プライマー特異的部分を有し、相違 するＰＣＲプライマーはＰＣＲ反応後に単鎖を残す相違のアドレス可能ヌクレオ チド配列を含有する。 図１８は、サイズを基とする、またはＤＮＡアレイを基とする検出においてウ ラシルＮ−グリコシラーゼ選択を用いる対立遺伝子特異的ＬＤＲ／ＰＣＲプロセ スを表す流れ図である。流れ図は、多重対立遺伝子特異的ＬＤＲ／ＰＣＲに要す る４反応を示す。ＬＤＲオリゴヌクレオチドプローブセット（うち、１または両 方のプローブがデオキシチミジンの代わりにデオキシウラシルを含有する）は、 第１工程においてＴａｑＤＮＡリガーゼを用いて正しい対立遺伝子標的の存在下 に連結される。連結反応産物配列の相補的コピーが第２工程においてシクエナー ゼでつくられる。シクエナーゼは修飾Ｔ７ポリメラーゼであって有用な容易に不 活性化されるポリメラーゼ（すなわちE.coliポリメラーゼなどの中温性ポリメラ ーゼ）を有する。連結反応産物配列および未反応プローブの両方が第３工程にお いてウラシルＮ−グリコシラーゼで破壊される。ウラシルＮ−グリコシラーゼを 用いる利点は、ＰＣＲの持ち越し防止についてその証明された能力である。最後 にＰＣＲプライマーセットが利用されて、第４工程においてシクエノーゼ伸長産 物が増幅される。第５ａ工程において、特定セットのＬＤＲオリゴヌクレオチド プローブがユニーク長産物を産生し、プローブまたは他の連結反応産物と識別さ れる。ＰＣＲ反応後、産物はサイズまたは電気泳動運動性により分離される。Ｐ ＣＲプライマー上の標識が検出され、産物はサイズにより識別される。第５ｂ工 程において、特定セットのＬＤＲオリゴヌクレオチドプローブがユニーク長産物 を産生し、プローブまたは他の連結反応産物と識別される。複数のオリゴヌクレ オチドプローブセットを使用することにより、すべての産物が識別される。各セ ットは、（ａ）連結反応産物配列の５’上流プライマー特異的部分に同じ配列を 含有する上流プライマーおよび（ｂ）連結反応産物配列の３’下流プライマー特 異的部分に相補的な下流プライマーを特徴とする。１つのプライマーは検出可能 レポーター標識を有し、他のプライマーはその５’末に連結したアドレス可能ヌ クレオチド配列（アドレス可能ヌクレオチド配列がＰＣＲ反応後単鎖を残すよう に）を含有する。相違する特定の部位に固定された相違捕捉オリゴヌクレオチド を有するＤＮＡアレイを準備して（捕捉オリゴヌクレオチドはプライマー上のア ドレス可能ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を有する）、ＰＣＲ伸 長産物がＤＮＡアレイにハイブリダイズできる。最後に、特定部位でＤＮＡア レイに固定されたアドレス可能アレイ特異的部分を用いて、捕捉された伸長産物 配列の標識が検出される。これはサンプル中の１以上の標的ヌクレオチド配列の 存在を表す。 図１９は、サイズを基とする、またはＤＮＡアレイを基とする検出によるウラ シルＮ−グルコシラーゼ選択を用いる定量的対立遺伝子特異的ＬＤＲ／ＰＣＲプ ロセスを表す流れ図である。この流れ図は、第２工程のＬＤＲ相開始点で第１工 程におけるマーカー配列を加えることにより相違する標的（特に低存在量の癌変 異）をいかに定量するかを示す。図１８で記載したように、生化学反応（すなわ ちシクエナーゼ処理(第３工程)、ウラシルＮ−グリコシラーゼ選択（第４工程） およびＰＣＲ（第５工程）が進められ、マーカー産物に対する変異産物の相対量 が毛管またはゲル電気泳動（第６ａ工程）あるいはアドレス可能アレイ上の捕捉 （第６ｂ工程）によって定量される。この情報から元のサンプル中の変異標的量 が測定される。 図２０は、モノヌクレオチドまたはジヌクレオチド反復多形性検出のためにウ ラシルＮ−グルコシラーゼ選択を用いる（第２工程）対立遺伝子特異的ＬＤＲ（ 第１工程）／ＰＣＲ（第３工程）を表す模式図である。ＬＤＲ／ＰＣＲプロセス の最も強力な使用の１つは、ヌクレオチド反復多形性の検出であって、対立遺伝 子特異的ＰＣＲでは達成できず（３’ヌクレオチドが常に同じであるから）、ま たＰＣＲ産物サイズ変化の観察でも容易に達成できない（増幅中にＴａｑポリメ ラーゼが滑ることによる）ものである。図２０において、ＬＤＲ（第１工程）リ ゴヌクレオチドプローブはＡ9とＡ10モノヌクレオチド反復配列を熱安定性ＤＮ Ａリガーゼの特異性によって識別する。ＬＤＲ産物のみが正しい長さの標的配列 上で形成し、そしてこの標的の存在が第５工程で識別される。 図２１は、低存在量のモノヌクレオチドまたはジヌクレオチド反復配列の検出 のためのウラシルＮ−グリコシラーゼ選択を用いる対立遺伝子特異的ＬＤＲ／Ｐ ＣＲプロセスを表す流れ図である。モノヌクレオチド反復長変異は図１８記載の ように識別される。図２１において、ＬＤＲオリゴヌクレオチドプローブは、Ａ8 、Ａ9（変異）およびＡ10（正常）モノヌクレオチド反復配列間を熱安定性ＤＮ Ａリガーゼの特異性によって識別する（第１工程）。シクエナーゼ処理（第２ 工程）次いでウラシルＮ−グリコシラーゼ選択（第３工程）が実施される。２つ の上流ＬＤＲオリゴヌクレオチドプローブはその標的特異的部分の３’末でモノ ヌクレオチド配列の長さが異なり、相違する５’上流プライマー特異的部分を有 する。このように、相違するプライマー（ＰＣＲ増幅（第４工程）における）は 異なる蛍光群（ＦａｍおよびＴｅｔ）により標識されて、産物の検出が可能とな る。これには、サイズの代わりに蛍光標識に基づいてモノヌクレオチド反復多形 性を識別し得るという顕著な利点がある。サイズに基づくと、ポリメラーゼ滑り のために偽の正反応が起きやすい。アレイに基づく検出法では、上流（対立遺伝 子特異的）プローブは異なる５’上流プライマー特異的部分を有し、異なるＰＣ ＲプライマーがＰＣＲ反応後に単鎖を残す相違アドレス可能アレイ特異的部分を 含有する。 図１１−１７に関して記載されたＬＤＲ／エクソヌクレアーゼ／ＰＣＲプロセ スおよび図１８−２１のＬＤＲ／シクナーゼ／ウラシルＮ−グリコシラーゼ／Ｐ ＣＲプロセスのセットは、多重検出の利用をもたらし、そしてＰＣＲが多くの相 違する標的配列を増幅して、すべて単一の反応チューブにおいて多重単一塩基ま たは配列変化を識別する。これはＰＣＲの感受性とＬＤＲの選択性を組み合すこ とにより達成される。変異配列の選択がＰＣＲよりもむしろＬＤＲで調節される ので、１次ＰＣＲ／２次ＰＣＲ／ＬＤＲプロセスは偽の正反応シグナル産生が起 こりにくい。さらに、１次ＰＣＲ／２次ＰＣＲ／ＬＤＲプロセスは、密接クラス ター変異の検出、単一塩基または小さい反復配列における小さい挿入および欠失 の検出、正常ＤＮＡの高バックグランドにおける１％以下の変異の定量的検出、 および連結反応産物配列の検出をアドレス可能アレイを用いて可能とする。小さ い反復配列における小さい挿入および欠失の検出は、１次増幅がＰＣＲであると き、“どもり”を起こすことがある。現在の技術ではこの問題を適当に解決する ことができない。特に、モノヌクレオチド反復多形性を含有する標的配列が正常 ＤＮＡよりも低い存在量で存在するときは、解決できない。実際、反復配列活性 化を含むゲノム変異の解析はＰＣＲ“どもり”問題に深刻に悩んでいる。本発明 のＬＤＲ／ＰＣＲプロセスを用いることにより、正常ＤＮＡの高バックグランド における１％を下まわる変異を検出することが可能である。このプロセスにおい て当面している唯一の比較的軽い問題は、変異を知らねばならないことおよび３ 種の相違する酵素／反応条件を用いなければならないことである。 III．１次ＰＣＲ／２次ＰＣＲプロセス 本発明の第三の実施態様は、１以上の標的ヌクレオチド配列における１以上の 単一塩基の変更、挿入、欠失または転座により相違している複数の配列の２以上 を同定するための方法に関する。この方法は、複数の配列相違がある１以上の標 的ヌクレオチド配列を含有するかも知れないサンプルを２つの連続するポリメラ ーゼ連鎖反応相にかけることを含む。 第１ポリメラーゼ連鎖反応相において、１以上の１次オリゴヌクレオチドプラ イマー群が準備される。各群は２以上の１次オリゴヌクレオチドプライマー・セ ットを含有する。各セットは、標的特異的部分と５’上流第２プライマー特異的 部分を保持する第１オリゴヌクレオチドプライマー、および標的特異的部分と５ ’上流第２プライマー特異的部分を保持する第２オリゴヌクレオチドプライマー を有する。同じ群の各セットの第１オリゴヌクレオチドプライマーは同じ５’上 流第２プライマー特異的部分を有し、同じ群の各セットの第２オリゴヌクレオチ ドプライマーは同じ５’上流第２プライマー特異的部分を有している。特定のセ ットのオリゴヌクレオチドプライマーは、対応する標的ヌクレオチド配列の相補 鎖でのハイブリダイゼーションに適しており、ポリメラーゼ連鎖反応産物の形成 をもたらす。しかし、１次オリゴヌクレオチドプライマーがサンプル中に存在す る他のヌクレオチド配列にハイブリダイズするときに、該ポリメラーゼ連鎖反応 産物の形成を妨害するミスマッチがある。特定のセットにおけるポリメラーゼ連 鎖反応産物は、同じ群または他の群を有する他のポリメラーゼ連鎖反応産物と識 別され得る。１次オリゴヌクレオチドプライマーをサンプルおよびポリメラーゼ と混合して、第１ポリメラーゼ連鎖反応混合物とする。 １次ポリメラーゼ連鎖反応混合物は、実質的に上記したように、変性処理、ハ イブリダイゼーション処理および伸長処理を含む２以上のポリメラーゼ連鎖反応 サイクルにかけられる。ハイブリダイゼーションの際に、１次オリゴヌクレオチ ドプライマーの標的特異部分が標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズする。伸 長処理によってハイブリダイズ１次オリゴヌクレオチドプライマーが伸長されて 、 １次オリゴヌクレオチドプライマーがハイブリダイズする標的ヌクレオチド配列 に相補的な１次伸長産物を形成する。 １次オリゴヌクレオチドプライマーの上流２次プライマー特異的部分は標的Ｄ ＮＡに存在しないが、その配列は１次ポリメラーゼ連鎖反応相の第２以後のサイ クルで複写される。結果として、第２サイクル後の１次伸長産物は、その５’末 端に２次プライマー特異的部分、そしてその３’末端にプライマー特異的部分の 補体を有する。 本発明のこの実施態様での第２ポリメラーゼ連鎖反応相において１つまたは複 数の２次オリゴヌクレオチドプライマーセットが準備される。各セットは、検出 可能レポーター標識を保持し、かつ第１の１次オリゴヌクレオチドプライマーの ５’上流部分と同じ配列を含有する第１の２次プライマー、および第１の２次プ ライマーに相補的な第１の１次オリゴヌクレオチドと同じ１次オリゴヌクレオチ ドプライマーセットに由来する第２の１次オリゴヌクレオチドプライマーの５’ 上流部分と同じ配列を含有する第２の２次プライマーを有する。２次オリゴヌク レオチドプライマーのセットは、各群において１次伸長産物を増幅する。２次オ リゴヌクレオチドプライマーを１次伸長産物およびポリメラーゼと混合して、２ 次ポリメラーゼ連鎖反応混合物とする。 ２次ポリメラーゼ連鎖反応混合物は、実質的に上記したように、変性処理、ハ イブリダイゼーション処理および伸長処理を含む１以上のポリメラーゼ連鎖反応 サイクルにかけられる。ハイブリダイゼーションの際に、２次オリゴヌクレオチ ドプライマーが１次伸長産物にハイブリダイズする。伸長処理によって、ハイブ リダイズした２次オリゴヌクレオチドプライマーが伸長されて、１次伸長産物に 相補的な２次伸長産物を形成する。２次ポリメラーゼ連鎖反応混合物を２以上の ポリメラーゼ連鎖反応サイクルに掛けた後に、標識２次伸長産物が検出される。 これはサンプル中おける１以上の標的ヌクレオチド配列の存在を表す。 図２２は、ミクロサテライト反復体の検出のための本発明による１次ＰＣＲ／ ２次ＰＣＲプロセスを表す流れ図である。第１工程において（すなわち１次ＰＣ Ｒ相）、ＤＮＡサンプル作成後、Ｔａｑポリメラーゼをホットスタート条件で用 いて、標的特異的部分と２次プライマー特異的部分とを有するオリゴヌクレオチ ドプライマーと共に多重エクソンを増幅する。第２工程は２次ＰＣＲでありＴａ ｑポリメラーゼを用いて、１次ＰＣＲプライマーの２次プライマー特異的部分と 同じ配列を含有するオリゴヌクレオチドプライマーと共に１次ＰＣＲ伸長産物を 増幅する。２次ＰＣＲ相で得た伸長産物を第３工程において毛管電気泳動または ゲル電気泳動にかけ、次いで蛍光定量を行う。図の電気泳動の結果は、ＲＢＩお よびＮＭ２３を含有する両対立遺伝子（すなわち染色体）およびｐ５３について のヘテロ接合の喪失（すなわち、１つの染色体上の対立遺伝子の喪失の存在を示 す。） 図２３は、ミクロサテライト反復体における挿入および欠失によるヘテロ接合 性の喪失を検出するために、本発明による１次ＰＣＲ／２次ＰＣＲプロセスを表 す模式図である。第１工程の１次ＰＣＲ相は、９４℃でのサンプルＤＮＡの変性 から始められる。ユニークＤＮＡ周ミクロサテライト反復変異に相補的な３’末 および２次ＰＣＲ相で使用される２プライマーの１つに同じ配列を含有する５’ 末を有する長いＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーは、６５℃で標的ＤＮＡに アニールする。１次ＰＣＲ相を１０−１５サイクル実施する。１次ＰＣＲ相で使 用された長いプライマーは、重複長の範囲を有する対立遺伝子を増幅しない限り 、多重化され得る。これらの反応は腫瘍または対応正常ＤＮＡ上で実施されて、 情報的（すなわち、ヘテロ接合）部座が同定されねばならない。第２工程（すな わち２次ＰＣＲ増幅）において、１次ＰＣＲプライマー（１つは蛍光標識されて いる）の５’末に相補的なプライマーが用いられて、ほぼ等しい効率で１次ＰＣ Ｒ伸長産物を増幅する。２次ＰＣＲ伸長産物は分離され、ゲル電気泳動およびジ ーンスキャン６７２ソフトウェア−パッケージを用いた３７３Ａ ＤＮＡ（Appli ed Biosystems，Inc.）で解析される。情報部位でのヘテロ接合の喪失領域が同 定される。図２３の解析は、ＲＢＩおよびＮＭ２３を含有する両対立遺伝子（す なわち、染色体）およびｐ５３についてのヘテロ接合の喪失（すなわち、１つの 染色体上の対立遺伝子の喪失）を示す。 IV．一般的プロセス情報 リガーゼ検出反応は、Barany et al.によるWO90/17239、F．Barany et al.， “Cloning,Overexpression and Nucleotide Sequence of aThermostable DNA Ligase-encoding Gene,”Gene，109:1-11(1991),およびF.Barany，“Genetic Di sease Detection and DNA Amqlification Using Cloned Thermostable Ligase ,”Proc．Natl．Acad．Sci．USA，88:189-193(1991)（出典明示により本明細書 の一部とする）に一般的に記載されている。本発明において、リガーゼ検出反応 で2セットの相補的オリゴヌクレオチドが用いられる。これはリガーゼ鎖反応と して知られるもので上記３引用に記載されている。他方、リガーゼ検出反応には 、オリゴヌクレオチド連結反応検出法として知られる単一サイクル法もある。参 照、Landegren，et al.，“A Ligase-Mediated Gene Detection Technique,”Sc ience 241:1077-80(1988);Landegren，et al.，“DNADiagnostics--Molecular T echniques and Automation,”Science 242:229-37(1988);およびLandegren et a l．による米国特許第4,988,617号（出典明示により本発明の一部とする）。 リガーゼ検出反応相において、変性処理は温度８０−１０５℃でなされ、ハイ ブリダイゼーションは５０−８０℃で行われる。各サイクルは変性処理と熱ハイ ブリダイゼーションを含み、合計で約１−５分間の長さである。典型的には、連 結検出反応は変性およびハイブリダイゼーションが２−５０サイクル反復される 。リガーゼ検出反応相の全時間は１−２５０分である。 オリゴヌクレオチドプローブセットまたはプライマーは、リボヌクレオチド、 デオキシヌクレオチド、修飾リボヌクレオチド、修飾デオキシヌクレオチド、修 飾ホスフェート−糖−骨格オリゴヌクレオチド、ヌクレオチドアナログおよびこ れらの混合物であり得る。 一つの変法において、オリゴヌクレオチドプローブセットのオリゴヌクレオチ ド各々、ハイブリダイゼーションすなわち溶融温度（すなわち、Ｔｍ）６６−７ ０℃を有する。これらのオリゴヌクレオチドは長さが２０−２８ヌクレオチドで ある。 上記したように、オリゴヌクレオチドプローブセットまたはプライマーは検出 に適したレポーター標識を有する。有用な標識には、発色団、蛍光分子、酵素、 抗原、重金属、磁気プローブ、色素、燐光性基、放射活性物質、化学ルミネセン ト分子および電気化学的検出分子がある。 ポリメラーゼ連鎖反応法はH．Erlich，et．al.，“Recent Advances in the P olymerase Chain Reaction,”Science 252:1643-50(1991);M．Innis，et．al.， PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications，Academic Press:New Yo rk(1990);およびR．Saiki，et．al.，“Primer-directed Enzymatic Amplificat ion of DNA with a Thermostable DNA Polymerase,”Science 239:487-91（出典 明示により本明細書の一部とする）に完全に記載されている。 本発明の特に重要な態様は、サンプル中の標的ヌクレオチド配列を定量できる 能力である。これは、内部（すなわち、標準確立物質をサンプルと共に増幅およ び検出するとき）または外部（すなわち、標準確立物質を増幅せずに、サンプル と共に検出するとき）的であり得る基準を確立して、多くの方法で達成される。 一つの定量法に従い、レポーター標識により発生したシグナルを検出する。こ のシグナルは、分析するサンプルから製造された連結反応産物を捕捉して得られ る。このシグナルの強度は、サンプル中の連結反応産物配列の捕捉で生じるシグ ナルを既知量の標的ヌクレオチド配列とを比較して目盛曲線から得られる。結果 として、分析サンプル中の標的ヌクレオチド配列の量が測定できる。この技法は 外部標準を用いる。 本発明に関する別の定量法は内部標準を用いるものである。この方法では、サ ンプルに１以上のマーカー標的ヌクレオチド配列の既知量を加える。さらに、複 数のマーカー特異的オリゴヌクレオチドプローブセットを加えて、リガーゼ、前 記のオリゴヌクレオチドプローブセットおよびサンプルと共に混合物とする。マ ーカー特異的オリゴヌクレオチドプローブセットは、（１）マーカー標的ヌクレ オチド配列に相補的な標的特異的部分を有する第１オリゴヌクレオチドプローブ 、および（２）マーカー標的ヌクレオチド配列に相補的な標的特異的部分を有す る第２オリゴヌクレオチドプローブおよび検出可能レポーター標識を含有する。 特定のマーカー特異的オリゴヌクレオチドセット中のオリゴヌクレオチドプロー ブは、対応するマーカー標的ヌクレオチド配列が互いに隣接してハイブリダイズ するときに、連結反応するのに適している。しかし、サンプル中に存在する他の ヌクレオチド配列または添加したマーカー配列がハイブリダイズするときに、こ のような連結反応を妨害するミスマッチがある。連結反応産物配列の存在は、レ ポ ーター標識の検出によって同定される。サンプル中の標的ヌクレオチド配列の量 は、マーカー標的ヌクレオチド配列の既知量から生じた連結反応産物配列の量と 他の連結反応産物配列の量を比較することにより測定される。 本発明の別の定量法は、複数の配列相違を有する２以上の複数の標的ヌクレオ チド配列を含有するサンプルの分析である。標的ヌクレオチド配列に対応する連 結反応産物配列は、前記の方法により検出および識別される。サンプル中の標的 ヌクレオチド配列の相対量は、発生した捕捉連結反応産物配列の相対量と比較す ることにより定量される。これはサンプル中の標的ヌクレオチド配列の相対レベ ルの定量測定を提供する。 好ましい熱安定性リガーゼはThermus aquaticusから誘導される。この酵素は 生体から単離される。M．Takahashi，et al.，“Thermophillic DNA Ligase,”J ．Biol．Chem．259:10041-47(1984)（出典明示により本明細書の一部とする）。 他方、これは組換え法でもつくられる。この単離方法およびThermus aquaticus リガーゼ（Thermus themopilusリガーゼも同様）の産生は、Barany，et al.によ るWO90/17239およひT.Barany，et al.，“Cloning Overexpression and Nucleot ide Sequence of a Thermostable DNA-Ligase Encoding Gene”Gene 109:1-11(1 991)（出典明示により本明細書の一部とする）に開示されている。 これらの引用には、このリガーゼおよびコードＤＮＡについての完全な配列情 報が含まれている。他の適当なリガーゼにはE.coliリガーゼ、Ｔ４リガーゼおよ びPycoccusリガーゼがある。 連結検出反応混合物は担体ＤＮＡやサケ精子ＤＮＡを含み得る。 連結検出反応でのハイブリダイゼーション段階は、好ましくは熱ハイブリダイ ゼーション処理であり、連結反応の接合部において識別されるヌクレオチドを基 にしたヌクレオチド配列の間を識別する。標的ヌクレオチド配列間の相違は、例 えば、単一核酸塩基の相違、核酸欠失、核酸挿入または再配置である。１以上の 塩基を含むこのような配列相違もまた検出できる。好ましくは、オリゴヌクレオ チドプローブセットは、実質的に同じハイブリダイゼーション条件下で標的ヌク レオチド配列にハイブリダイズするように、実質的に同じ長さである。結果とし て、本発明のプロセスは、感染性疾患、遺伝的疾患および癌の検出を可能とする 。 環境監視、法医学および食物科学においても有用である。 広範囲の感染性疾患が本発明プロセスで検出できる。典型的には、細菌、ウイ ルス、寄生虫、真菌感染作用因子によって起きる。種々の感染作用因子の薬剤に 対する耐性も本発明を用いて測定できる。 本発明により検出できる細菌感染作用因子は、大腸菌、サルモネラ菌、赤痢菌 、クレブシエラ、シュードモナス、リステリア・モノサイトゲネス、マイコバク テリウム・ツベルクローシス、マイコバクテリウム・アビウム−イントラセルラ レ、エルシニア、フランシセラ、パスツレラ、ブルセラ、クロストリディア、ボ ルデテラ・ペルツシス、バクテリア状物、スタフィロコッカス・アウレウス、ス タフィロコッカス・ニューモニア、Ｂ−溶血性連鎖球菌、コリネバクテリア・レ ジオネラ、ミコプラズマ、ウレアプラズマ、クラミジア、ナイセリア・ゴノレア 、ナイセリア・メニンギティデス、ヘモフィラス・インフルエンザ、エンテロコ ッカス・ファエカリス、プロテウス・ブルガリス、プロテウス・ミラビリス、ヘ リコバクター・ピロリ、トレポネマ・パラジウム、ボレリア・ブルグドルフェリ 、ボレリア・レクレンティス、リケッチア病原菌、ノカルディアおよびアクチノ マイセテスを含む。 本発明で検出できる真菌感染作用因子は、クリプトコッカス・ネオフォルマン ス、ブラストミセス・デルマティティディス、ヒストプラスマ・カプスラタム、 コシディオイデス・イミティス、パラコシシオイデス・ブラシリエンシス、カン ジダ・アルビカンス、アスペルギルス・フミガウトゥス、フィマイセテス(リゾ プス)、スポロスリックス・シェンキー、クロモマイコシスおよびマドゥロマイ コシスを含む。 本発明により検出できるウイルス感染作用因子は、ヒト免疫不全ウイルス、ヒ トＴリンパ球好性ウイルス、肝炎ウイルス(例えば、Ｂ型肝炎ウイルスおよびＣ 型肝炎ウイルス)、エプスタイン−バールウイルス、サイトメガロウイルス、ヒ ト乳頭腫ウイルス、オルソミクソウイルス、パラミクソウイルス、アデノウイル ス、コロナウイルス、ラブドウイルス、ポリオウイルス、トガウイルス、ブニャ ウイルス、アレナウイルス、ルベラウイルスおよびレオウイルスを含む。 本発明により検出できる寄生虫作用因子は、プラスモジウム・ファルシパルム 、 プラスモジウム・マラリア、プラスモジウム・ビバックス、プラスモジウム・オ バレ、オンコベルバ・ボルブルス、レイシュマニア、トリパノソーマ種、シスト ソーマ種、エンタモエバ・ヒストリティカ、クリプトスポリジウム、ギアルディ ア種、トリコモナス種、バラチジウム・コリ、ウシェレリア・バンクロフティ、 トキソプラスマ種、エンテロビウス・バーミクラリス、アスカリス・ルンブリコ イデス、トリシュリス・トリシウラ、ドラクンクルス・メディネシス、吸虫類、 ジフィロボスリウム・ラトゥム、タエニア種、ニューモシスティス・カリニおよ びネカター・アメリカニスを含む。 本発明はまた感染作用因子による医薬耐性の検出にも有用である。例えば、バ ンコマイシン耐性エンテロコッカス・ファエシウム、メチシリン耐性スタフィロ コッカス・アウレウス、ペニシリン耐性ストレプトコッカス・ニューモニアエ、 多剤耐性マイコバクテリウム・ツベルクローシスおよびＡＺＴ耐性ヒト免疫不全 ウイルスを本発明によりまた同定できる。 遺伝的疾患もまた本発明の方法により検出できる。これは染色体および遺伝的 異常のための出生前スクリーニングまたは遺伝的疾患のための出生後スクリーニ ングにより行い得る。検出可能な遺伝的疾患の例は：２１ヒドロキシラーゼ欠損 症、嚢胞線維症、フラジレＸ症候群、ターナー症候群、デュシェンヌ型筋ジスト ロフィー、ダウン症候群または他のトリソミー、心臓疾患、単一遺伝子疾患、Ｈ ＬＡタイピング、フェニルケトン尿症、鎌状赤血球性貧血、テイ・サックス病、 サラセミア、クラインフェルター症候群、ハンチントン病、自己免疫疾患、リピ ドーシス、肥満欠損、血友病、代謝の先天性異常および糖尿病を含む。 本発明の方法により検出できる癌は、一般的にオンコジーン、腫瘍抑制遺伝子 またはＤＮＡ増幅、複製、組換えまたは修復に関与する遺伝子を含む、これらの 例は：ＢＲＣＡ１遺伝子、ｐ５３遺伝子、ＡＰＣ遺伝子、Her2/Neu増幅、Bcr/Ab l、Ｋ−ｒａｓ遺伝子、ヒト乳頭腫ウイルスタイプ１６および１８を含む。下記 の一般的なヒト癌における上記遺伝子の増幅、大きい欠失、点変異および小さい 欠失／挿入を同定するために、本発明の様々な態様が用いられる。白血病、大腸 癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、脳腫瘍、中枢神経系腫瘍、膀胱癌、黒色腫、肝臓癌 、骨肉腫および他の骨癌、精巣および卵巣癌、頭部・頚部腫瘍および脳新生 物を含む。 環境監視の領域で、本発明は、天然および工学的生態系ならびに都市廃棄水浄 化システムおよび貯水槽中または生物改善を行っている汚染領域のような微小生 態系における病原性および常在性微生物の検出、同定および追跡に使用できる。 新陳代謝生体異物であり得る遺伝子を含むプラスミドの検出もまた可能であり、 集団機能的研究における特異的標的微生物の追跡、または環境的および工学的植 物における遺伝的に修飾された微生物の検出、同定または追跡をする。 本発明は、また、軍務上の人的あるいは犯罪上の検査、父親検定および家族関 係解析のためのヒト同定、ＨＬＡ適合性タイプ分類、および汚染に関する血液、 精液または移植臓器のスクリーニングを含む種々の領域または法医学領域で使用 できる。 食物および飼料産業において、本発明は広範囲の適用を有する。例えば、ビー ル、ワイン、チーズ、ヨーグルト、パン等の製造のための酵母のような製造生物 の同定および特徴付けのために使用できる。使用の他の領域は汚染に対する産物 および処理(例えば、家畜、滅菌および肉処理)の品質コントロールおよび保証に 関する。他の使用は、育種目的の植物、球根および種子の特徴付け、植物特異的 病原体の同定および種々の家畜感染の検出および同定を含む。 望ましくは、オリゴヌクレオチドプローブは、連結反応の接合部における完全 相補性のため、対応する標的ヌクレオチド配列と互いに隣接してハイブリダイズ するとき、連結反応の接合部で互いに連結するのに適している。しかしながら、 セット中のオリゴヌクレオチドプローブがサンプル内に存在する他のヌクレオチ ド配列とハイブリダイズするとき、連結を妨害する連結反応の接合部の塩基ミス マッチがある。最も好ましくは、ミスマッチは連結反応の接合部の３'塩基に隣 接した塩基である。あるいは、ミスマッチは連結反応の接合部に隣接した塩基で あり得る。 上述のように、検出および定量は、毛管またはゲル電気泳動あるいはアレイ捕 捉オリゴヌクレオチドを有する固体支持物で実施され得る。 この目的のための毛管またはゲル電気泳動の使用は既知である。参照、例えば 、Grossman，et al.，“High-density Multiplex Detection of Nucleic Acid Sequences:Oligonucleotide Ligation Assay and Sequence-coded separation, ”Nucl．Acids Res．22(21):4527-34(1994)（出典明示により本明細書の一部と する）。 捕捉オリゴヌクレオチドアレイを有する固体支持物の使用は、米国特許出願第 60/011,359（出典明示により本明細書の一部とする）に完全に開示されている。 このようなアレイを使用するときには、上記のＰＣＲ相およびＬＤＲ相において 用いられるオリゴヌクレオチドプライマーまたはプローブはアドレス可能アレイ 特異的部分を有する。ＬＤＲ相またはＰＣＲ相が完了した後、その産物について のアドレス可能アレイ特異的部分は、単鎖を残し、捕捉相の際に捕捉オリゴヌク レオチドにハイブリダイズする。C．Newton，et al.，“The Production of PCR Products With 5’Single-Stranded Tails Using Primers That Incorporate N ovel Phosphoramidite Intermediates,”Nucl．Acids Res．21(5):1155-62(1993 )（出典明示により本明細書の一部とする）。 本方法の捕捉相において、混合物は固体支持物と温度４５−９０℃および６０ 分間までの時間で接触する。ハイブリダイゼーションはカチオン、量排除または カオトロピック剤を加えることにより促進される。アレイが何１０から１００ア ドレスよりなるとき、正しい連結反応産物配列が適切なアドレスにハイブリダイ ズする機会を持つことが重要である。これは、用いた高温でのオリゴヌクレオチ ドの熱運動、アレイ表面に接触する液体の機械的運動または電場でのアレイを通 るオリゴヌクレオチドの運動により達成される。ハイブリダイゼーション後、ア レイを低ストリジェンシー緩衝液および高ストリジェンシー緩衝液で順次洗う。 安定な状態でハイブリダイズする捕捉オリゴヌクレオチドおよびアドレス可能 ヌクレオチド配列を選択することが重要である。それには、捕捉オリゴヌクレオ チドがアドレス可能アレイ特異的部分にハイブリダイズする温度よりも低い温度 で、オリゴヌクレオチドセットが標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズするよ うに、オリゴヌクレオチドセットと捕捉オリゴヌクレオチドが立体配座すること が必要である。このようにオリゴヌクレオチドが設計されていないと、標的にハ イブリダイズする同じオリゴヌクレオチドセットからの隣接未反応オリゴヌクレ オチドの捕捉によって、偽の正シグナルが起きる。 捕捉オリゴヌクレオチドには、リボヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、修 飾リボヌクレオチド、修飾デオキシヌクレオチド、ペプチドヌクレオチドアナロ グ、修飾ペプチドヌクレオチドアナログ、修飾ホスフェート−糖−骨格オリゴヌ クレオチド、ヌクレオチドアナログおよびこれらの混合物がある。 アレイを使用するとき、本方法の検出相は、ＬＤＲまたはＰＣＲ産物が生じて いるかを走査および同定し、かかる産物の存在を試験サンプル中の標的ヌクレオ チド配列の存在・不存在と相関せしめることを含む。走査は、走査電子顕微鏡、 共焦顕微鏡、電子結合装置、走査透過電子顕微鏡、赤外線顕微鏡、原子力顕微鏡 、電気的コンダクタンスおよび蛍光および燐光造影により行うことができる。相 関処理はコンピューターで行う。 実施例 LDR/PCRプロセス実施例１ −ゲノムDNAの調製 ゲノムDNAを男女２人の健常者ボランティアの血液から標準技術に従って調製 した。簡単に説明すると、EDTAを含有する集血管で約12mlの血液を採取した。そ のサンプル血を４容量の溶解緩衝液(10ｍＭ Tris ｐＨ8.0、10ｍＭ EDTA)に混合 して赤血球を溶解した。10分間氷上でときどき攪拌した後、懸濁物を遠心分離し 上澄み液をデカントした。白血球ペレットを20mlの溶解緩衝液に再懸濁させ、上 記のプロセスを繰り返した。その後、各ペレットを15mlの消化緩衝液(50mM Tris pH8.0、5mM EDTA、100mM NaCl、1% SDS)に懸濁し、それに３mg(0.2mg/ml)のプ ロテイナーゼKを加えた。細胞を37℃で5時間消化した。消化産物を等量のフェノ ールで２度抽出し、それから等量の１：１フェノール：クロロホルム混合液で１ 度抽出し、最後に等量のクロロホルムで抽出した。抽出をするごとに混合液を遠 心分離し、次の抽出に使用するために水相を除去した。最後の抽出の後に、水相 を除去してから1/10量の３Ｍ酢酸ナトリウム、pH6.5を加えた。次いで2倍量の氷 温100% EtOHをそれぞれの溶液に加えてゲノムDNAを沈澱させ、溶液からガラスピ ペットにスプールした。そのDNA沈澱物を0.75ml量の70% EtOH中で２度洗った。 つまり、２度とも手短かに遠心分離して上澄み液を除去できるようにした。２度 目に上澄み液を除去した後、残存するEtOHを蒸発させてDNAを0.5mlの TE(10mM Tri-HCl pH8.0、1ｍＭ EDT含有)溶液中に懸濁した。各DNA溶液の１／５ 希釈物もまたTE中で調製した。 第５DNA溶液の濃度を測定するために、それぞれの溶液の1μｌ、2μｌ、4μｌ アリコートを1%アガロース・ゲル上に対照としての既知の量のHindIII消化lambd aDNAと共に装填した。そのゲルを１５０ボルトで２時間電気泳動緩衝液中の臭化 エチジウムで試運転した。ゲルを写真撮影した後に、DNAバンドの明暗度を比較 して、1/5希釈物が約100ng/mlの濃度を示すのを判定した。さまざまな腫瘍細胞 ラインから抽出したDNA溶液は、他の研究所の好意で入手したものである。それ らの溶液の濃度を同様の手法でチェックし、100ng/mlのTE溶液を調製した。 ゲノムDNAをTagIで消化するために、25μｌの100ng/μｌ溶液を5μｌの10X中 程度塩緩衝液(0.5M NaCl、0.1M MgCl Tris、pH8.0)、20μｌの水性ME(すなわち 、6mM ME(すなわち、メルカプトエタノール)を含む水)、および400UのTagI制限 エンドヌクレアーゼと混合した。消化物を鉱油で覆い、65℃で１時間インキュベ ートした。1.2μｌの500mM EDTAを加え、標本を85℃で10分間加熱して、反応を 停止した。DNAの完全な消化を１％アガロース・ゲル上の電気泳動アリコートで チェックした。実施例２ −ＬＤＲプローブおよびＰＣＲプライマーのためのオリゴヌクレオチド 調製 すべてのオリゴヌクレオチドは394A DNAシンセサイザー(Applied Biosystems Division of Perkin-Elmer Corp,Forter City,Ca.)で合成した。6−FAM標識のオ リゴヌクレオチドは、合成サイクルに製造業者の指示する修飾（Applied Biosys tems Inc.,1994）を使用して、合成し、55℃で４時間経過して脱保護した。LDR オリゴヌクレオチドは、55℃で一晩脱保護した後、エタノール沈澱で精製した。 PCR増幅に使用するオリゴヌクレオチドのプライマー特異的部分は10%Aアクリル アミド/7M尿素ゲル上のポリアクリルアミドゲル電気泳動によって精製した。オ リゴヌクレオチドは電気泳動の後に照明スクリーン上で紫外線遮蔽法で視覚化し 、ゲル（Applied Biosystems Inc.,1192）から削除した。次いでそれらオリゴヌ クレオチドはTNE(すなわち、TrisナトリウムEDTA)緩衝液(100mM Tris/HCl、pH8. 0、500mM NaClおよび５mM EDTA含有)の中で６４℃で一晩溶離し、業者の指 示に従ってSep Pakカートリッジ（Millipore Corp.,Milford,MA.）を使用して溶 解液から回収した。 オリゴヌクレオチドを100μｌ TE(すなわち、.10mM Tri-HCl pH8.0、1mM EDTA 含有)中で再懸濁した。それらの元からのLDRプローブ溶液の典型的な濃度は、下 記の公式で定義されるように、およそ1μｇ/μｌすなわち約74pm/μｌである。 ［濃度(μｇ/μｌ)X106/長さ(nt)X325]=pm/μｌ LDRプローブの濃度を表１に示す。リガーゼ検出反応のオリゴヌクレオチドプ ローブに相補的なオリゴヌクレオチドの濃度は他と比較して高かった。上記の公 式で算出すると、ZipALg1Fは3.75μｇ/μｌ、ZipBLg2Rは2.01μｇ/μｌ、すなわ ち、それぞれ524pm/μｌおよび281pm/μｌであった。 表１ LDR相のために前もって必要な下流LDRオリゴヌクレオチドプローブをT4ポリヌ クレオチドキナーゼでリン酸化した。200pmに等しい5下流オリゴヌクレオチドの アリコート（表１参照）を10μｌの10Xキナーゼ緩衝液（500ｍＭ Tris/HCl、pH8 .0、100ｍＭ MgCl）、10μｌの10ｍＭ ＡＴＰ、20U T4キナーゼ、および十分な 水-MEと混合して、最終容量を100μｌとした。リン酸化を37℃で30分間実施し、 次いで10分間85℃のインキュベーションによってT4酵素を不活性化した。その結 果のキナーゼ化LDRプローブ溶液濃度はプローブごとに2pm/μｌすなわち2000fm/ μｌであった。 キナーゼの反応は次のように要約される。 4.8μｌ G6PDEx6-4R 2.2μｌ ErbBEx1-5R 2.3μｌ Int2Ex3-8R 2.5μｌ p53Ex8-10R 2.5μｌ SODEx3-12R 10 μｌ 10xキナーゼ緩衝液 10 μｌ 10mMATP 65.7μｌ HOH+ME 100 μｌ 合計 ＋２μｌ＝２０単位T4キナーゼ ３７℃で30分間 ヒート・キル・キナーゼ、８５℃で10分間 最終濃度＝2pm/μl=2000fm/μｌ ＬＤＲおよびＰＣＲオリゴヌクレオチド溶液を実験に適した濃度に調節した。 キナーゼＬＤＲプローブ溶液を水で4倍に希釈して、500fm/μｌの濃度を得た。2 00pmに等しい容量のプローブを十分な水と合わせて上流LDRプローブ溶液をつく り、最終濃度400μｌとなるようにした。これによって上流ＬＤＲプローブの各 溶液は500fm/μｌとなった。キナーゼおよび非キナーゼＬＤＲのアリコート(20 μｌ)を次に行う実験に使用するために冷却した。9.5μｌのZipALg1Fおよび17.8 μｌのZipBLg2Rと十分な水とを混合して、元の溶液からＰＣＲプライマーの標準 溶液(10pm/μｌ)をつくり、総容量500μｌとした。これらの溶液をLDR/PCRプロ セスにおいて使用するために冷却した。 非キナーゼプローブを次の方法で製造した。 200 pm eaプライマー 3.62μｌ G6PDEx6-3L 3.28μｌ ErbBEx1-5L 2.04μｌ Int2E3-7L 3.26μｌ p53Ex8-9L 2.48μｌ SODEx3-11L 385.32μｌ HOH 400 μｌ 総容量 最終濃度=0.5pm/μｌ=500fm/μｌ 表２配列 図24は、LDR/PCRプロセスにおける遺伝子増幅および欠失を定量するためのＬ ＤＲオリゴヌクレオチドプローブの設計図である。これらのオリゴヌクレオチド プローブは、p53腫瘍抑制遺伝子の中のエクソン8(染色体17p上)、int-2のエクソ ン3(染色体11q上)、HER-2/neu(すなわち、.HER-2/neu/erbBオンコジーン)中の内 在エクソン(染色体17q上)、SOD(すなわち、スーパーオキシドディムスターゼ)中 のエクソン3(染色体21q上)、G6PD(すなわち、グルコース6-リン酸塩脱水素酵素) 中のエクソン6(染色体Xq上)などを確認できるように設計されている。それぞれ の対をなすLDRオリゴヌクレオチドプローブは次のような特徴をもっている：(i) 左手のヌクレオチドプローブは5'から3'までの18塩基配列を含み、これは蛍光標 識の2次オリゴヌクレオチドプライマー(黒棒)、「アジャストメント配列」(白棒 )および75℃のTmを有する22から28までの塩基の標識特異的配列（模様棒）と同 一である。（ii）右手のオリゴヌクレオチドプローブは、75℃のTm(模様棒)を有 する5'から3'までの20-25塩基の標的特異的配列、標的特異的配列内でわずかに ずれた位置を占める一つのHaeIIIまたはHinP1I制限部位および「アジャストメン ト配列」（白棒）を含有する。この２つのオリゴヌクレオチドプローブはこのよ うに設計されているので、それらの合わせた長さは正確に96塩基で50G+C塩基お よび46A+T塩基を有する。ユニーク制限部位の位置は少なくとも2つの塩基の差で 他と異なる産物を生じる。それぞれのオリゴヌクレオチドプローブセットは、選 択されたエクソン特異的領域を有し、(A,T)C↓C(A,T)の接合配列を連結する。こ の接合配列はプロリン残基(CCNコドン)か、トリプトファン残基(TGG)に相補的な 配列かのいずれかに対応する。これらの配列は、連結反応速度 の相違および連結反応接合部における多形性の機会を最少にするように選択され る。 ＬＤＲプローブ配列 ＰＣＲプライマー： （下線をほどこした配列は、ＬＤＲプローブとZipALg1FまたはZipBLg2Rとの補体 の間で共通である。）実施例3 −緩衝液および試薬 Ａ．ＬＤＲ緩衝液および試薬：次のLDR衝液および試薬を選択した。 10X STリガーゼ緩衝液(0.2Ｍ Tris pH8.5、0.1Ｍ MgCl2)［これはまたTris pH7. 6でもって試験した。］ 10X TTリガーゼ緩衝液（0.2Ｍ Tris pH7.6、0.5Ｍ KCL、0.1Ｍ MgCl2、5mMEDTA ） ＮＡＤ(10mM) ＤＴＴ(200mM) 各ＬＤＲプライマー混合液の1/10の濃度を含むＬＤＲプライマー溶液（1μlつき 各ＬＤＲプライマー50fm） Ｔth ＤＮＡリガーゼ（625U/μl） Ｂ.ＰＣＲ緩衝液および試薬：次のＰＣＲ緩衝液および試薬を選択した。 10X Stoffel緩衝液（0,1M KCl、0.1M Tris-HCl pH8.3、Perkin Elemer）dNTP溶 液(総量100Mm、各dNTP 25mM、Perkin Elmer)。この溶液をdHOH中で5倍 に希釈して、各dNTP 5mMの最終濃度にした。 ZipALg1F(10pm/μｌ) ZipBLg2R(10pm/μｌ)実施例4 -ＬＤＲおよびＰＣＲプロセス 各ＤＮＡについて、4つのＬＤＲ／ＰＣＲプロセスを実施して、22、24、26、3 0サイクルに増幅したＰＣＲ増幅反応管で試験し１つの反応が指数増殖期におい て停止するかどうかを確認した。各ＬＤＲ反応（20μｌ）は熱循環であり、次い でＬＤＲプローブのプライマー特異的部分に相補的な部分を有するプライマーを 含むＰＣＲ混合物（30μｌ）を各標本に加えて指数増幅した。反応管のあいだの 差異を最小にするために、ＬＤＲおよびＰＣＲ試薬の原混合液を作成した。 ＬＤＲ試薬の原混合液は、すべての反応管に使用するに充分な量を作成した。 １つの反応に対する混合比率および量は、次のとおりである。 試薬 量 10X STリガーゼ緩衝液 ２μｌ NAD(10mM) ２μｌ DTT(200mM) １μｌ dHOH ５μｌ 合計 10μｌ Tth DNAリガーゼ 0.2μｌ(=125U) 各反応管の標識ＤＮＡおよびＬＤＲプローブの混合度は次の比率で作成した。 試薬 量 DNA(TaqI消化) １μｌ(=50ng) LDRプローブ混合液 ４μｌ(各プライマー200fm) dHOH ５μｌ 合計 10μｌ 各反応に際して、試薬10μｌを薄壁ＰＣＲ管に入れ、急速に10μｌのＬＤＲ試 薬液(リガーゼを含む)と混合し、鉱油で覆い、Perkin Elmer 9600熱循環器に入 れた。ＬＤＲは96℃で2分間保持することから始め、次の10サイクルの94℃30秒 間および65℃4分間でDNAを変性した。 各反応管に使用するPCR試薬混合液はつぎの比率で作成した。 試薬 量 10×Stoffel緩衝液 ５ μｌ dNTP溶液 ８ μｌ(=最終反応で0.8mM各dNTP) ZipALg1F(10pm/μｌ) 2.5μｌ(=反応につき25pm) ZipBLg2R(10pm/μｌ) 2.5μｌ(=反応につき25pm) dHOH 12 μｌ 合計 30 μｌ Stoffelフラグメント 0.25μｌ(=2.5U) ＬＤＲ反応の完結でそれぞれの管を94℃で維持し、一方で30mlのＰＣＲ試混合 液(Stoffelフラグメントを含む)をそれらの管に加えた。ＰＣＲ増幅を94℃で15 秒、次いで60℃で50秒間の熱循環により実施した。それぞれ22、24、26、30サイ クルで、それら４つの各ＤＮＡ標本の同一反応管の１つを取りだしドライアイス およびETOHのスラリー中でクエンチした。実施例5 −アガロースゲルによる検定 26および30サイクル反応標本10マイクロリッターアリコートを2%アガロースゲル 上で検定した。臭化エチジウムによる染色で予想したサイズ（104bp）のバンド が現れた。実施例6 −産物の消化、希釈剤の調製、および遺伝子スキャナーにおける装填 遺伝子特異的ＬＤＲ／ＰＣＲ産物を分離するために、10μｌアリコートの22、24 、26サイクル反応物を各5UのHaeIIIおよびHinP1I制限酵素(共にNew England Bio Labs製)、2μｌの10X制限酵素緩衝液No.2（New England BioLabs製）、および8 μｌのdHOH(すなわち、蒸留水)を含有する10μｌの溶液を加えて消化した。消化 物を37℃で1時間インキュベートし、次いで1μｌの0.5M EDTA(pH8.0)を加えて消 化を停止した。制限消化物は元のＬＤＴ／ＰＣＲ産物の1/2希釈で得た。5μｌの 各制限消化物を20μｌのTE緩衝液に加えて各サンプルの１／１０希釈液調製した 。ABI373A DNAシーケンサー(Applied Biosystem)にサンプルを装填する前に、2% のブルーデキストランおよび非イオン化ホルムアミドを含む50mM EDTA(pH8.0)と 1;5の混合液を作成した。5μｌのEDTAブルーデキストラン溶液に、5μｌの消化 Ｌ ＤＴ／ＰＣＲ産物の希釈液および1μｌのGENESCAN 1000ROXマーカー(Applied Bi osystems)を加えた。これらの溶液を85℃まで10分間加熱し、素早く氷で冷却し た後に5.5μｌを変性ゲルに装填した。 サンプルを可視距離12cm、厚味0.4mmの10%ポリアクリルアミド/7M尿素ゲル上で 、Applied Biosystems 373A DNAシーケンサーの中で分析した。ゲルマトリック スを1.2xTBE(106mM Tris-ホウ酸塩、2.4mM EDTA、pH8.3)および、0.6×TBE(53.4 mM Tris-ホウ酸塩、1.2mM EDTA、pH8.3)を含む電気泳動チェンバー緩衝液とで処 理した。ゲルを電極逆方向性（ゲルの頂上にあるサンプルウエルを有するチェン バーの陽極）でもって、サンプル装填に先立って1600ボルトで30分間試運転した 。装填の後、遺伝子特異的ＬＤＲ／ＰＣＲ産物を1200ボルトで電気泳動し、ABI7 62 DataCollection Software、Ｖ1.1(Applied Biosystems)を使用して第一次の データを得た。 ABI672 Gene Scan Analysis Software、Ｖ1.2.2(Applied Biosystems)を使用 して、結果のデータを電気泳動濃度図で表示し、ピーク値とピーク域を計算した 。 健常女性において、ErbB2ピーク値は低く、p53ピーク値は他の３つのピーク値 よりわずかに低い。図25A-Dを参照されたい。いくつもの実験において、ErbB2ピ ーク値は常に低く、G6PD、Int.2、p53およびSODなどのピーク域はいくぶん異な るが、実験でサンプルを取り替えても、５つのピーク値すべてが同じ相対的なプ ロフィルを示す。男性のDNAを女性のと比較してみると、G6PDピーク値が他のピ ーク値のおよそ半分の範囲であり、男性の1個のX染色体と一致し、一方、その他 のピーク値は基本的に同じであった。NM10乳癌細胞ラインについてのErB2ピーク はわずかに上昇しており、これら細胞ラインにおける既知のErbB-2遺伝子の増幅 を反映して、細胞ラインSKBR3におけるErB2ピークは健常女性のコントロール値 より幾倍か大きい。加えて、NM10細胞ラインはp53のLOH(すなわち、ヘテロ接合 性の喪失)を経たようであり、一方、SKBR3細胞ラインは、G6PDおよびp53のLOHを 経たようである。SKBR3細胞ラインにおける細胞のいくつかは、p53遺伝子の両方 の複製を喪失しているようである。ErbB2プライマーを欠いた状態でこれらの増 幅の繰り返しを行い、これらの追加遺伝子欠失（下記参照）の存在を確認した。 これらの結果は、各ピーク値におけるピーク域を当該実験についての標準値の 各ピーク（SODピーク域）に対する割合と比較することで定量化できる。ピーク 域の生データおよび割合は下記に表示する。 表３−ピーク域の生データ 各割合はそれぞれの遺伝子によって相異するが、（これは各遺伝子に対するLD R/PCRの効率の差異による）G6PD/SODの割合を除けば、それぞれ割合の値は男女 間で概して同じである。女性のG6PD値は男性のおよそ2倍であり、それぞれX染色 体が女性に2つ、男性に1つ存在することを正確に反映している。健常者DNAと癌 細胞ラインとのピーク域の割合を比較することにより、ErbB2増幅を定量できる 。 表５−ピーク域の割合 これらの割合から、健常男女は17q(ErbB)、17p(p53)、11q(Int2)の染色体に同 じ数の遺伝子を持つが、女性は2倍のG6PD遺伝子すなわちX染色体をもつと結論で きる。 さらにこれに加えて、細胞ラインNM10はわずかなErbB-2遺伝子の増幅を示した が、一方で、細胞ラインSKBR3はErbA-2遺伝子、G6PDおよびp53でのLOHの顕著な 増幅を示した。追加的遺伝子増幅および欠失を確認するために、大増幅の原因と なるプライマー対をLDR/PCR反応から除去される（下記参照）。 健常女性において、ErbB2ピーク値は残りの4つのピーク値より低い。いくつか の実験において、G6PD、Int-2、p53、SOD等のピーク値は幾分の差異はあるが、 サンプルを変えても同じ相対的プロフィルを示す。図26A-Cを参照されたい。Erb B2ピーク値は常に低く、理由はわからないがG6PDおよびSODピーク値においてわ ずかな特性曲線の肩が観察される。両方の細胞ラインサンプルにおけるErbB-2の ピーク値は、健常女性コントロール値より幾倍か大きく、それら2つの細胞ライ ンの既知のErbB-2遺伝子増幅を反映している。さらに、ZR-75-30ラインはp53のL OHを示すようであり、一方、SKGT-2細胞ラインはInt-2領域のわずかな増幅を持 つようである。ErbB-2プライマーの不存在でLDR/PCRの実験を繰り返すことによ り、これらの結果が高レベルのErbB-2増幅の産物ではないことが判明した。図27 A−Cを参照されたい。LDR/PCRフォーマットを使用した多重対立遺伝子の増幅お よび欠失について示した。図26A−Cおよび27A−Cを参照されたい。 繰り返すが、これらの結果は、各ピーク値におけるピーク域をその実験につい て標準値の各ピーク（SODピーク域）に対する割合と比較することによって定量 できる。ピーク域の生データおよび割合を次に示す。 表６−ピーク域についての生データ 表７−ピーク域とSODピーク域との比率 ４つのプライマーセットと５つのプライマーセットの実験間で、比率は見事に 一致している。唯一の例外はSKGT2細胞ラインに対するG6PDピーク値で、この場 合は、ErbB-2に対する大きなピーク値がG6PDピーク値に追加されているようであ る。 ErbB2およびInt-2の増幅量をp53の欠失と同様に、正常DNAと癌細胞ラインとの ピーク域割合を表８に示すように比較することで定量できる。 それに加えて、４つのセットのプライマー使用からの割合を5セットのプライ マーと比較して、本技術の内在的一貫性を確かめることができる。 表８−ピーク域率の割合 表８における上半分の数値は、４つまたは５つのプライマーを使用して、LDR/ PCR技術が内在的に一貫しているならば、すべて1.0に近くなるはずである。 すべての数値が1.0に非常に近くなっている。繰り返すが、SKGT2に対するG6PDの 数値は、すでに述べた理由で少し低い。 表８における下半分の数値は、ErbB-2増幅の程度を示す。数字は4プライマー および5プライマー増幅についてかなり一致している。（ただし、上記のとおりS KGT2−G6PDの場合は例外である。）ZR7530細胞ラインはp53に対する明確なLOHを 示し、一方で、SKGT2細胞ラインはInt−2領域および存在する両p53遺伝子の増幅 を示す。 一次PCR/二次PCR/LDRプロセス実施例７ −オリゴヌクレオチド合成法 オリゴヌクレオチドを標準ホスホラミジト化学によってExpedite DNAシンセサ イザー（Perspective Biosystems，Framingham,MA）の上に集めた。6−FAM、TET 、HEXによる5'−末標識のオリゴヌクレオチドを適切なダイ・ホスホルアミジド （Perkin Elmer-Applied Biosystems）を使用して合成し、製造業者のプロトコ ル(Applied Biosystems Division-Perkin Elmer Crop.,「ダイ・ホスホルアミジ ドを使用した蛍光標識オリゴヌクレオチドの合成と精製」”User Bulletin、第78 号、Applied Biosystems Division，Foster City,Ca,(1994)(出典明示により本 明細書の一部とする))に従って、オリゴヌクレオチド精製カートリッジ（Perkin E1mer-Applied Biosystems）で精製した。すべてのオリゴヌクレオチドを、mPA GE-3カラム（Ｊ＆Ｗ Scientific，Folsom,CA)を使用してApplied Biosystems 27 0−HTの毛管電気泳動器で精製度をチェックした。精製度95％以上のオリゴヌク レオチドだけを実験に使用した。オリゴヌクレオチドを250ml TE(10mM Tris/HCl および5mM EDTA、pH8.0)中に再懸濁した。典型的濃度は未精製貯蔵溶液で300〜5 00ｍＭであり、OPC(すなわち、Oligonucleotide Purification Columns，Applie d Biosystems市販)について100−200mMである。PCRおよびLDRについては、オリ ゴヌクレオチドを希釈して、10mM(10pmoles/ml)または5mM(5pmoles/ml)を使用溶 液とした。実施例８ −LDRオリゴヌクレオチドのリン酸化 12LDR共通オリゴヌクレオチドを5'末で蛍光標識オリゴヌクレオチドとに連結 反応できるようにリン酸化した。そのオリゴヌクレオチドを下記の表９に示す。 表９ LDRオリゴヌクレオチドの配列対立遺伝子オリゴヌクレオチドはＦＡＭ、ＴＥＴまたはＨＥＸのいずれかで５’ 末が標識されている。全共通オリゴヌクレオチドは５’末でリン酸化される。下 線は標的配列に相補的でないテイルを表す。ＬＤＲプライマーは２方法により設 計された:（ｉ）対立遺伝子プライマーは同じ長さであるが、ＦＡＭまたはＴＥ Ｔ標識のいずれかを含有する、(ii)対立遺伝子プライマーは両者ともにＨＥＸで 標識されるが、２塩基の長さで相違する。 このリン酸化は、製造業者の指示に従うPhosphate-ON(Clontech Laboeatories ,Palo Alto.Ca)での合成工程の間か、あるいはT4ポリヌクレオチドキナーゼ(Boe hringer Manheim，Indianapolis,IN)を使用して合成後かのいずれかで達成した 。後者の場合には共通オリゴマーを50μｌのキナーゼ緩衝液（50mMTris/HCl、10 mM MgCl2、1mM ATP）で希釈し、最終濃度を1mM(50μｌ中500pmol)とした。10単 位のT4キナーゼを加え、37℃で30分間培養した。T4キナーゼを95℃で10分間加熱 して不活性化した。 キナーゼ反応を次のように実施した。 10μｌ 50ｍＭ共通オリゴ ５μｌ 10Xキナーゼ緩衝液 ５μｌ 10mM ATP 30 μｌ Ｈ2Ｏ 50μｌ 合計 ＋ １μｌ Ｔ4キナーゼ（10単位） 37℃で30分間 95℃で10分間 最終濃度＝10ｍＭ実施例９ −多重PCRの増幅 12の遺伝子領域(2−13)を同時ＰＣＲ増幅のために選んだ。これは下記の表10 に示すHuman Genome Databaseから購入できる資料に基づいている。 表10−多形性部位の分析リスト 部位番号は、それぞれの遺伝子内に位置する特異的単鎖点変異である。すべて の表記した変異はセンス鎖により定義する。遺伝子銀行番号は（）内の番号で示 す。表10の参考文献 ２ M．Armstrong,et al.,”A Polymorphic Cfo I Site In Exon ６ of the Hum an Cytochrome P450 CYPD6 Gene Detected by the Polymerase Chain Reaction ，”Human Genetics 91:616-17(1993)，which is hereby incorporated by refe rence． ３ S.C．Bock，et al.，”Antithrombin III Utah:Proline-407 to LeucineMut ation in a Highly Conserved Region Near the Inhibitor Reactive Site，”B iochemistry 28:3628(1991), which is hereby incorporated by reference． ４ G．Dewald,et al.,“Polymorphism of Human Complement Component C6:An Amino Acid Substitution(glu/ala)Within the Second Thrombospondin Repeat Differentiates Between the Two Common Allotypes C6 A and C6B，”Biochem ，Biophys．Res．Commun .194:458-64(1993),which is hereby incorporated by reference． ５ P.A．Velden，et al.，”Amino Acid Dimorphism in IL1A is Detectable b yPCR Amplification,”Hum ．Mol．Genet．2:1753(1993)，which is hereby inco rporated by reference． ６ R.M．Cawthon，et al.,”Identification and Characterization of Transc ripts From Theneurofibromatosis 1 Region:The Sequence and Genomic Struct ure of EV12 and Mapping of Other Transcripts,”Genomics 7:555-65(1990)， which is hereby incorporated by reference． ７ C.C．Brooks，et al.,”Association of the Widespread Al49P Hereditary Fructose Intolerance Mutation With Newly Identified Sequence Polymprphi sms in the Aldolase B Gene,”Am.J.Human Genetics 52:835-40(1993),which i s hereby incorporated by reference． ８ W，Poller，etal.，”Sequence Polymorphism in the Human Alpha-2-Macro globulin（A2M）Gene，”Nucleic Acid Res ．19:198(1991)，which is hereby i ncorporated by reference． ９ T．Gloudemans，“An Ava II Restriction Fragment Length Polymorphism in the Insulin-Like Growth Factor IIGene and the Occurrence of Smooth Mu scle Tumors，“Cancer Res.53:5754-58(1993)，which is hereby incorporated by reference. 10 C.M Diepstraten，et al.，”A CCA/CCG Neutral Dimorphism in the Codon for Pro 626 of the Human Protein S Gene Pa(PROS1)”,Nucleic AcidsRes ．1 9:5091(1991),which is hereby incorporated by reference． 11 M．Reina，et al.,”SSCP Polymorphism in the Human Hepatic Triglyceri de Lipase(LIPC)Gene,”Hum.Mol.Genet.1:453(1992)，which is hereby incorpo rated by reference． 12 S．Matuura，et al.,“Investigation of the Polymorphic AvaII Site bya PCR-based Assay at the Human CD18 Gene Locus,”Human Genetics 93:721(19 94),which is hereby incorporated by reference． 13 L．Warnich，et al.,”Detection of a Frequent Polymorphism in Exon 10 of the Low-Density Lipoprotein Receptor Gene,”Human Genetics 89:362(19 92), which is hereby incorporated by reference． それぞれの領域はよく特徴が出ており、2つの公知の対立遺伝子だけが単塩基 変異として表れている。ＰＣＲ増幅は全血から製造業者の掲示に従ってパージー ンDNA単離キツト(Gentra Systems，Inc.，Minneapolis，MI)で分離したゲノムDN Aを使用して実施した。 25μｌのPC緩衝液(10mM Tris/HCl、pH8.3、10mM KCl、4mM MgCl2、0.4mM各々d NTP)、10−100ngのゲノム標識DNA、バイブリッドPCRプライマー対1〜12（各プラ イマー2pmol）、1.3単位のAmpliTaq DNAポリメラーゼStoffelフラグメント(Appl ied Biosystems)等を薄肉MicroAmp反応管（Applied Biosystems）に入れた。そ れぞれのハイブリッドプライマーは、遺伝子特異的3'領域(16〜29塩基)および5' 領域(22塩基)から成り、1ないし2セットのユニバーサル（すなわち、プライマー 特異的部分）のプライマー（図4参照。F1=Tet、F2=Fam、F3=Het）と対応する。 これらのプライマーについては表11に示す。 表１１ １次ＰＣＲプライマー配列 遺伝子座1，3，5，7，10，12における順方向および逆方向ハイブリッドプライ マーはユニバーサルプライマ-ALg1およびBLg2のそれぞれと同一の5'末端領域を 含んでいた。座２、4、6、8、９および11についての順・逆プライマーはそれぞ れ、ユニバーサル・プライマーＣＬｇ３およびＤＬｇ4に同じ５’末端領域を含 有していた。PCR相において、低密度のハイブリッドプライマーを使用する根本 理由は、反応過程中にハイブリッドプライマーを空にするためである。これは、 理論的には低増幅効率の産物が高増幅効率の産物に「追いつく」ことが可能であ ることを示す。増幅は、96℃で15秒間の1サイクルで変性させる熱循環と、それ に次いで94℃で15秒間の15サイクルで変性させ、65℃で60秒間アニールして伸張 することで達成した。 高濃度の2対のユニバーサルプライマー（各プライマーが25pmol；表２参照） と、それと同容量のAmplitaq DNAポリメラーゼStoffelフラグメントの1.3単位を Microamp反応管に加え、別の25サイクルに対してアニール温度を55℃に下げて熱 循環を実行した。上流ユニバーサルプライマーALg1およびCLg3をそれぞれ６−FA MおよびTETで蛍光標識した。すべての熱循環をGeneAmp PCR System 9600熱循環 器（Applied Biosystems）で達成した。 一次PCRプロセスを次の條件で実行した。 5.9 μｌ H2O 5 μｌ プライマペアー1−12(各プライマー２pmol) 2.5 μｌ 10xStoffelフラグメント 4 μｌ 25mM MgCl2 5 μｌ 2mM dNTPストック（各ストック） 2.5 μｌ ゲノムDNA(10ng) 0.13 μｌ Stoffelフラグメント（1.3単位） 25 μｌ 合計 一次PCR循環條件は次の通り： 96℃15" 94℃15"、65℃1'x15 65℃Hold（維持） 二次PCRプロセスを次の條件で実行した。 13.37 μｌ H2O 5 μｌ ジッププライマーペアー（各プライマー25pmol） 2.5 μｌ 10×Stoffe1フラグメント 4 μｌ 25nM MgCl2 0.13 μｌ Stoffelフラグメント（1.3単位） 25 μｌ 二次PCR循環條件は次の通り： 94℃15"、55℃1'×25 4℃Hold(維持) PCR産物をApllied Bisystems 373 DNAシーケンサーで分離した。3mlアリコー トのPCRサンプルを蛍光標識Genescan-2500[TAVRA]サイズスタンダード(Apllied Biosystems)を含む3mlのホルムアミドと混合した。50ml Genescan−2500サイズ スタンダード[TAMR]を450mlのホルムアミドに加えることによって、ホルムアミ ドのスタンダード溶液を調製した。サンプルを95℃で2分間加熱し、氷中で急速 に冷却し、Genescanのバージョン1.2ソフトウェアでApplied Biosystems 373 DN Aシーケンサー中の変性化8％ポリアクリルアミドゲルを通して電気泳動させた。 蛍光標識産物のサイズをGenescan分析ソフトウェアによって、局所サザン法を使 って自動的に計算した。電気泳動濃度図で12の産物がはっきりと判明した(図28) 。各産物の均等な量は、アンプリコンのサイズの類似および２次プライマーに対 し相補的な部分を有する１次プライマーの使用に起因する。この２次プライマー は同一の親和力で12のアンプリコンに注意深い反応條件の調整をしなくてもアニ ールする。産物のコンピューターで計算したサイズは135〜1756pの範囲で、正確 にそれらの実際のサイズと一致した（表12参照）。 表12−PCRおよびLDRの産物一覧表 二重標識の方法（表12）によって、産物を電気泳動濃度図で識別するのがいっ そう容易となった。（図28において、パネルAとパネルBおよびCとを比較された い。）実施例10 −多重リガーゼ検出反応 標識PCR産物がリガーゼ産物の配列の検出を妨げるのを避けるために、PCR産物 をLDRの標識として使用する非標識PCRのユニバーサルプライマーを使って、PCR 産物を増幅した。PCR内のポリメラーゼを解凍法によるか、あるいはEDTA/プロテ イナーゼKを加えて、それぞれ5mMおよび100mg/mlの最終濃度にし、37℃で30分間 、さらに95℃10分間加熱することによって不活性化した。 プロテイナーゼK消化を次の條件で行った： 20 μｌ PCR産物 ＋ 2.5μｌ 500mg/mlプロテイナーゼK 25 μｌ 合計 60℃で60分間 95℃で10分間、プロテイナーゼK加熱停止 4μｌのPCR産物を50mM Tris/HCl pH8.5、50mM KCl、10mM MgCl2、1mM NAD+、1 0mM DTT、LDRオリゴヌクレオチドセット1〜2（各ヌクレオチドが200fmol）、10 単位のThermus aquaticus DNAリガーゼ（Barany,F．and Gelfand,D.,“Cloning ，Overexpression,and Nucleotide Sequence of a Thermostable DNA Ligase-En coding Gene,”Gene,109:1−11(1991)、(出典明示により本明細書の一部とする 。)を含む20μｌのLDR混合液で希釈した。各LDRオリゴヌクレオチドプローブセ ットは、2つの対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドおよび1つの共通ヌクレオチ ドを含む。LDRオリゴヌクレオチドプローブセット1，2，3，4，5，6，7，8，9に おける識別可能な対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブの各一対は、サ イズが等しく一方のオリゴヌクレオチドは6FAM標識であり、他のオリゴヌクレオ チドはTET標識であった。LDRオリゴヌクレオチドプローブセット5，10，11，12 に対して、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドの各一対は、２つの塩基（大き い方のオリゴヌクレオチドは標的配列に相補的でない5'テイルを有する）で相異 し、両方のオリゴヌクレオチドはHEX標識である。熱循環を実施して95℃2分間1 サイクルで変性し、次いで95℃30秒間20サイクルで変性し、65℃4分間で連結反 応した。 LDRプロセスを次のとおり実行した。 4μｌ PCR産物 2μｌ LCRオリゴセット1〜12（各オリゴ200fmol） 2μｌ 10×T.リガーゼ緩衝液 2μｌ 10mM NAD+ 1μｌ 200mM DTT 9μｌ H2O 20μｌ 合計 1μｌ Taq リガーゼ(10単位) リガーゼのストック： 0.5μｌの625u/ml＋3.2μｌ 10X緩衝液＋27.5μｌ H2O LDRサイクリングの條件は次のとおり： 94℃2' 94℃30”，65℃×20 4℃ Hold(維持) 3μｌアリコートのLDRサンプルを3μｌの標準サイズ（Applied Biosystems） 蛍光標識Genescan−2500[TAMRA]と混合せしめた。サンプルを95℃で2分間加熱し 、氷中で急速冷却し、Genescanの1.2バージョンソフトウエアでApplied Biosyst ems 373DNAシーケンサー中の変性化10％ポリアクリルアミドゲルを通して、電気 泳動させた。蛍光標識産物のサイズをGenescan分析ソフトウエアによって、局所 サザン法を使って自動的に計算した。２つの固体のLDRプロフィルを図29に示す 。それぞれの蛍光着色を独立して分析すると（図29、パネルB−D,F−H）、各遺 伝座ごとに存在する対立遺伝子の測定は非常に容易であった。各LDR産物（表12 ）に単純な"A"あるいは"B"コードをつけて、遺伝子型にコードを割り当てるのに 使用した。次の表13を参照されたい。 表13-PCR-LDRで測定した5個体の遺伝子型 最初の個体（図29A〜D；表13の個体1）は、多形体部位においてヘテロ接合体 である。個体部位1〜4および6〜7におけるヘテロ接合体は、電気泳動濃度図上の それぞれの位置における6-FAMおよびTET標識の産物(図29、パネルＢおよびＣ)両 方を検出することによって判明した。個体部位5，11，12におけるヘテロ接合体 はそれらの各遺伝子座（図29、パネルＤ）に対して2つの塩基のサイズが相異す る２つのHEX標識産物の存在によって判明した。それに反して、個体部位8および ９(図２９、パネルＢ、Ｃ)で検出した１つの産物によって、それらの各遺伝子座 がそれぞれホモ接合体であることが立証された。 第２の個体（図29E〜FおよびG〜H、表13の個体2）がヘテロ接合体であったの は、個体部位3，5，6，9だけであり、1，2，4，7，8，10，11，12の個体部位で ホモ接合体であった。2人の試験者の間のこれらの位置における遺伝子型には合 計８つの相異があった。３人の試験者を加えて型を判別した結果、５人のすべて の試験者が１２遺伝子座（表13）に基づいた明確な遺伝子型をもっていた。 本発明は、説明するために詳細に記載したが、説明のためのみに詳述したので あり、以下の請求の範囲で定義している本発明の精神および範囲からそれない限 り、当業者は修飾を施すことができることを理解されたい。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ， ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，Ｇ Ｂ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ， ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，Ｎ Ｚ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ， ＶＮ，ＹＵ (72)発明者 バラニー，フランシス アメリカ合衆国10021ニューヨーク州ニュ ーヨーク、イースト・シックスティサー ド・ストリート450番、アパートメント12 シー (72)発明者 ルビン，マシュー アメリカ合衆国10024ニューヨーク州ニュ ーヨーク、コロンブス・アベニュー600番、 アパートメント・13エム

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １．複数の標的ヌクレオチド配列における１以上の単一塩基の変更、挿入、欠 失または転座により相違している複数の配列の１以上を同定するための方法であ って： 複数の配列相違を有する１以上の標的ヌクレオチド配列を含有する可能性のあ るサンプルを準備し； １以上のオリゴヌクレオチドプローブセットを準備し、各セットは（ａ）標的 特異的部分と５’上流プライマー特異的部分を保持する第１オリゴヌクレオチド プローブ、および（ｂ）標的特異的部分と３’下流プライマー特異的部分を保持 する第２オリゴヌクレオチドプローブを特徴とし（特定セットにおける標的ヌク レオチドプローブは、対応する標的ヌクレオチド配列に互いに隣接してハイブリ ダイズするときに一緒に連結反応するのに適し、しかし、サンプル中に存在する 他のヌクレオチド配列とハイブリダイズするときに、この連結反応を妨害するミ スマッチがある）； リガーゼを準備し； サンプル、複数のオリゴヌクレオチドプローブセットおよびリガーゼを混合し て、リガーゼ検出反応混合物とし； リガーゼ検出反応混合物を変性処理およびハイブリダイゼーション処理を含む １以上のリガーゼ検出反応サイクルにかけ（変性処理において、ハイブリダイズ されたオリゴヌクレオチドは標的ヌクレオチド配列から分離され、ハイブリダイ ゼーション処理により、オリゴヌクレオチドプローブセットは隣接部位で塩基特 異的に、もしサンプル中に存在していればその夫々の標的ヌクレオチド配列にハ イブリダイズし、互いに連結して、連結反応産物配列を形成し、この産物配列は 、（ａ）５’上流プライマー特異的部分、（ｂ）一緒に結合した標的特異的部分 および（ｃ）３’下流プライマー特異的部分を含み、各セットの連結反応産物配 列は連結検出反応混合物中の他の核酸と識別可能であり、オリゴヌクレオチドプ ローブセットはその夫々の標的ヌクレオチド配列以外のサンプル中のヌクレオチ ド配列とハイブリダイズするが、１以上のミスマッチの存在によって連結せず、 そ して、次の変性処理の際に個々に分離している）； １つまたは複数のオリゴヌクレオチドプライマーセットを準備し、各セットは 、（ａ）連結反応産物配列の５’上流プライマー特異的部分と同じ配列を含有す る上流プライマー、および（ｂ）連結反応産物配列の３’下流プライマー特異的 部分に相補的な下流プライマーを特徴とし（プライマーの１つは検出可能レポー ターを有する）； ポリメラーゼを準備し； リガーゼ検出反応混合物を１または複数のオリゴヌクレオチドプライマーセッ トおよびポリメラーゼと混合して、ポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成せしめ； ポリメラーゼ連鎖反応混合物を、変性処理、ハイブリダイゼーション処理およ び伸長処理を含む１以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルにかけ（変性処理にお いて、ハイブリダイズ核酸配列が分離され、ハイブリダイゼーション処理におい て、プライマーが連結反応産物配列の相補的プライマー特異的部分とハイブリダ イズし、伸長処理において、ハイブリダイズプライマーが伸長されて、プライマ ーがハイブリダイズしている配列に相補的な伸長産物を形成し、第１サイクルに おいて、下流プライマーが連結反応産物配列の３’下流プライマー特異的部分に ハイブリダイズし、伸長されて連結反応産物配列に相補的な伸長産物を形成し、 次のサイクルにおいて、上流プライマーが連結反応産物に相補的な伸長産物の５ ’上流プライマー特異的部分にハイブリダイズし、３’下流プライマーが連結反 応産物配列の３’下流部分にハイブリダイズする）； レポーター標識を準備し； 伸長産物を識別して、サンプルの１以上の標的ヌクレオチド配列の存在を表す ； ことを含む方法。 ２．請求項１の方法において、セット中のオリゴヌクレオチドプローブの１つ に制限部位を含有するものであり、該方法がさらに、 制限部位で各伸長産物を制限消化して、標識伸長産物フラグメントを産生し（ 制限部位が各オリゴヌクレオチドプローブセットに位置して、該制限消化後にポ リメラーゼ連鎖反応混合物における他の核酸と識別され得るように、ユニーク 長を有する伸長産物フラグメントを産生し； 伸長産物フラグメントをサイズまたは電気泳動運動性によって分離する（該識別 がサイズの異なる伸長産物フラグメントを区別する）； ことを含む請求項１の方法。 ３．請求項１の方法において、特定セットのオリゴヌクレオチドプローブの連 結反応産物配列が、ポリメラーゼ連鎖反応混合物中の他の核酸と識別され得るよ うに、ユニーク長の伸長産物を産生するものであり、該方法がさらに、 伸長産物フラグメントをサイズまたは電気泳動運動性によって分離する（該識別 がサイズの異なる伸長産物フラグメントを区別する）； ことを含む請求項１の方法。 ４．請求項１の方法において、オリゴヌクレオチドが、各セットの連結反応接 合部を通してのその連結反応産物配列がユニークであり、ポリメラーゼ連鎖反応 混合物中の他の核酸と識別できるように、立体配座されるものであり、該方法が さらに、 相違する特定部位で固定された相違捕捉オリゴヌクレオチドを有する固体支持 物を準備し(捕捉オリゴヌクレオチドが与えられたプローブセットの連結接合部 を通ってユニークヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を有している) ； １以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルにかけた後に該ポリメラーゼ連鎖反応 混合物を、伸長産物が捕捉オリゴヌクレオチドに塩基特異的にハイブリダイズす るのに効果的な条件で固体支持物に接触せしめ、それによって相補的捕捉オリゴ ヌクレオチドを有する部位で固体支持物上で伸長産物を捕捉する（該検出は、連 結反応接合部のまわりのユニークヌクレオチド配列部分を用いて捕捉され、そし て特定部位で固体支持物に固定化された伸長産物の存在を表し、それによってサ ンプル中の１以上の標的ヌクレオチド配列の存在を検出する）； ことを含む請求項１の方法。 ５．請求項１の方法において、各プライマーセットで、１つのプライマーが検 出可能レポーター標識を有し、他のプライマーがポリメラーゼ連鎖反応混合物を １以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルにかけた後にこのプライマー５’末に連 結するアドレス可能アレイ特異的部分を含有するものであり、該方法がさらに、 相違する特定部位で固定化された相違捕捉オリゴヌクレオチドを有する固体支 持物を準備し（捕捉オリゴヌクレオチドは与えられたプライマーセットの連結反 応接合部を通してユニークヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列を 有する）； １以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルにかけた後に該ポリメラーゼ連鎖反応 混合物を、伸長産物が捕捉オリゴヌクレオチドに塩基特異的にハイブリダイズす るのに効果的な条件で固体支持物に接触せしめ、それによって相補的捕捉オリゴ ヌクレオチドを有する部位で固体支持物上で伸長産物を捕捉する（該検出が連結 反応接合部のまわりのユニークヌクレオチド配列を用いて捕捉され、そして特定 部位で固体支持物に固定化された伸長産物の存在を表し、それによってサンプル 中の１以上の標的ヌクレオチド配列の存在を検出する）； ことを含む請求項１の方法。 ６．請求項１の方法において、２以上の複数配列の相対量が、１以上の単一塩 基の変更、挿入、欠失または転座によって相違し、定量しようとする複数の標的 ヌクレオチド配列の未知量でサンプル中に存在し、そしてオリゴヌクレオチドプ ライマーが特定のプローブ群におけるオリゴヌクレオチドプローブセットで形成 される全連結反応産物配列の増幅に有用であり、オリゴヌクレオチドプライマー セットが複数のオリゴヌクレオチドプライマー群を形成し、各群が２以上のオリ ゴヌクレオチドプローブセットを含み、そのうちにおいて、同じ群のオリゴヌク レオチドプローブセットが同じ５’上流プライマー特異的部分と同じ３’下流プ ライマー特異的部分とを含有するものであり、該方法がさらに、 該識別後に伸長産物の相対量を定量し； 産生した伸長産物の相対量を比較して、サンプル中の２以上の標的ヌクレオチ ド配列の相対レベルの定量を行う； ことを含む請求項１の方法。 ７．請求項６の方法において、各セット中のオリゴヌクレオチドプローブの１ つが制限部位を含有するものであり、該方法がさらに、 制限部位で各伸長産物を制限消化して、標識伸長産物フラグメントを産生し（ 制限部位が各オリゴヌクレオチドプローブセットに位置して、該制限消化後に ポリメラーゼ連鎖反応混合物における他の核酸と識別され得るように、ユニーク 長を有する伸長産物フラグメントを産生する）； 伸長産物フラグメントをサイズまたは電気泳動運動性によって分離する（該識 別がサイズの異なる伸長産物フラグメントを区別する）； ことを含む請求項６の方法。 ８．請求項６の方法において、同じ群のオリゴヌクレオチドプローブセットが 同じ５’上流プライマー特異的部分と同じ３’下流プライマー特異的部分とを有 し、そして特定セットにおけるオリゴヌクレオチドプローブの連結反応産物配列 がポリメラーゼ連鎖反応混合物中の他の核酸と識別できるようにユニーク長産物 を有するものであり、該方法がさらに、 伸長産物をサイズまたは電気泳動運動性により分離する（該検出および該識別 が標識が標識伸長産物中のサイズの相違により実施される）； ことを含む請求項６の方法。 ９．請求項６の方法において、特定セットのオリゴヌクレオチドプローブの連 結反応産物配列が、ポリメラーゼ連鎖反応混合物中の他の核酸と識別され得るよ うに、連絡接合部を通ってユニーク配列を含有するものであり、該方法がさらに 、 相違する特定部位で固定された相違捕捉オリゴヌクレオチドを有する固体支持 物を準備し(捕捉オリゴヌクレオチドが与えられたプローブセットの連結接合部 を通ってユニークヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を有している) ； １以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルにかけた後に該ポリメラーゼ連鎖反応 混合物を、伸長産物が捕捉オリゴヌクレオチドに塩基特異的にハイブリダイズす るのに効果的な条件で固体支持物に接触せしめ、それによって相補的捕捉オリゴ ヌクレオチドを有する部位で固体支持物上で伸長産物を捕捉する（該検出は、連 結反応接合部を通ってユニークヌクレオチド配列部分を用いて捕捉され、そして 特定部位で固体支持物に固定化された伸長産物の存在を表す）； ことを含む請求項６の方法。 １０．請求項１の方法において、特定セットの１つまたは両方のオリゴヌクレ オチドプローブがその非連結末端にブロック群を有し、ブロック群がエクソヌク レアーゼ消化に実質的に抵抗性である特定セットにおけるオリゴヌクレオチドプ ローブの連結反応産物を減少するものであり、該方法がさらに、 リガーゼ検出反応混合物を１以上のリガーゼ検出反応サイクルにかけた後に、 リガーゼ検出反応混合物をエクソヌクレアーゼ消化にかけ(エクソヌクレアーゼ がブロックされないオリゴヌクレオチドプローブを実質的に破壊し、連結反応産 物の実質部分を破壊せず、そして元の標的ヌクレオチド配列の存在を減少する) ； エクソヌクレアーゼを不活性化する（該エクソヌクレアーゼ処理が連結反応独 立伸長産物の形成を、ポリメラーゼ連鎖反応混合物の１以上のポリメラーゼ連鎖 反応サイクル処理の際に減少する）； ことを含む請求項１の方法。 １１．請求項１０の方法において、特定セットのオリゴヌクレオチドプローブ の連結反応産物配列がユニーク長産物を産生するものであり、該方法がさらに、 伸長産物をサイズまたは電気泳動運動性により分離し（該識別がサイズの相違 する伸長産物を分別する）； ことを含む請求項１０の方法。 １２．請求項１１の方法において、１以上の単一塩基の変更、挿入、欠失また は転座により相違する１以上の複数の配列が定量する複数の標的ヌクレオチド配 列を有する未知量のサンプル中に存在するものであり、該方法がさらに、 １以上のマーカー標的ヌクレオチド配列の既知量を準備し； １または複数のオリゴヌクレオチドプローブ群を準備し、各群はマーカー標的 ヌクレオチド配列のために特異的に設計されたプローブセットを含む２以上のオ リゴヌクレオチドプローブセットを含有し（特定セットの１または両方のオリゴ ヌクレオチドプローブはその非連結末端でブロックされ、同じ群のオリゴヌクレ オチドプローブセットは同じ５’上流プライマー特異的部分または同じ３’下流 プライマー特異的部分のいずれか、あるいは同じ５’上流プライマー特異的部分 と同じ３’下流プライマー特異的部分の両方を有し、該リガーゼ検出反応混合物 はさらにマーカー標的ヌクレオチド配列を含有し、プローブセットはマーカー標 的ヌクレオチド配列のために特異的に設計されたプローブセットを含む）、該方 法がさらに； １または複数のオリゴヌクレオチドプライマー群を準備し、各群が２以上のオ リゴヌクレオチドプライマーセットを含有し（各群のオリゴヌクレオチドプライ マーセットは同じ５’上流プライマーまたは同じ３’下流プライマーのいずれか 、あるいは５’上流プライマーと同じ３’下流プライマーの両方を含有し、オリ ゴヌクレオチドプライマー群は与えられた群での全連結反応産物配列の増幅に有 用である）； 該識別後に伸長産物量を定量し； 未知のサンプルから産生した伸長産物量をマーカー標的ヌクレオチド配列の既 知量から産生した伸長産物量と比較して、サンプル中の１以上のヌクレオチド配 列レベルを定量する； ことを含む請求項１１の方法。 １３．請求項１０の方法において、各プライマーセットで、１つのプライマー が検出可能レポーター標識を有し、他のプライマーがポリメラーゼ連鎖反応混合 物を１以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルにかけた後にこのプライマー５’末 に連結し、単鎖を残すアドレス可能アレイ特異的部分を含有するものであり、該 方法がさらに、 相違する特定部位で固定化された相違捕捉オリゴヌクレオチドを有する固体支 持物を準備し（捕捉オリゴヌクレオチドがアドレス可能アレイ特異的部分に相補 的であるヌクレオチド配列を有す）； １以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルにかけた後に該ポリメラーゼ連鎖反応 混合物を、伸長産物が捕捉オリゴヌクレオチドに塩基特異的にハイブリダイズす るのに効果的な条件で固体支持物に接触せしめ、それによって相補的捕捉オリゴ ヌクレオチドを有する部位でアドレス可能アレイ特異的部分を固体支持物に捕捉 する（該検出がアドレス可能アレイ特異的部分を用いて捕捉され、そして特定部 位で個体支持物に固定された伸長産物の存在を表す）； ことを含む請求項１０の方法。 １４．請求項１３の方法において、１以上の単一塩基の変更、挿入、欠失また は転座により相違する１以上の複数の配列は、定量する複数の標的ヌクレオチド 配列を有する未知量のサンプル中に存在し、１つのプライマーが検出可能レポー ター標識を有し、他のプライマーがポリメラーゼ連鎖反応混合物を１以上のポリ メラーゼ連鎖反応サイクル処理した後にそのプライマーの５’末に連結し、そし て単鎖を残すアドレス可能アレイ特異的部分を含有し、同じ群のオリゴヌクレオ チドプライマーが５’上流プライマーか、同じ３’下流プライマーのいずれかを 含有し、オリゴヌクレオチドプライマー群が与えられた群の全連結反応産物配列 を増幅するのに用い得るものであり、該方法がさらに、 １以上のマーカー標的ヌクレオチド配列の既知量を準備し； １または複数のオリゴヌクレオチドプローブ群を準備し、各群はマーカー標的 ヌクレオチド配列のために特異的に設計されたプローブセットを含む２以上のオ リゴヌクレオチドプローブセットを含有し（同じ群のオリゴヌクレオチドプロー ブセットの１つまたは両方は、同じ５’上流プライマー特異的部分または同じ３ ’下流プライマー特異的部分のいずれかを含有する）； １または複数のオリゴヌクレオチドプライマー群を準備し、各群が２以上のオ リゴヌクレオチドプライマーセットを含有し（同じ群のオリゴヌクレオチドプラ イマーセットは、同じ５’上流プライマーまたは同じ３’下流プライマーのいず れかを含有し、オリゴヌクレオチドプライマーの１群は群中の全連結反応産物配 列の増幅に使用される）； マーカー標的ヌクレオチド配列とマーカー標的ヌクレオチド配列のために特異 的に設計されたプローブセットとを連結反応検出反応混合物に混合し； 伸長産物量を定量し； 未知のサンプルから産生した伸長産物量をマーカー標的ヌクレオチド配列の既 知量から産生した伸長産物量と比較して、サンプル中の１以上のヌクレオチド配 列レベルを定量する； ことを含む請求項１３の方法。 １５．請求項１において、特定セットの１または２のオリゴヌクレオチドプロ ーブがデオキシチミジンの代わりにデオキシウラシルを含有し、デオキシウラシ ルがオリゴヌクレオチドプローブおよびウラシルＮ−グリコシラーゼに実質的に 感受性である連結反応産物配列を減少するものであり、該方法がさらに、 リガーゼ検出反応混合物の１以上のリガーゼ検出反応サイクル処理の後で、か つポリメラーゼ連鎖反応混合物の１以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクル処理の 前に、リガーゼ検出反応混合物を、連結反応産物配列の３’下流プライマー特異 的部分に相補的な１または複数の下流プライマーおよびポリメラーゼと混合して 、伸長混合物を形成し； 伸長混合物をハイブリダイズ処理にかけ（下流プライマーは連結反応産物配列 の３’下流プライマー特異的部分にハイブリダイズし、伸長して、連結反応産物 配列に相補的な伸長産物を形成する）； ポリメラーゼを不活性化し； 該不活性化後に伸長混合物をウラシルＮ−グリコシラーゼと混合して、ウラシ ルＮ−グリコシラーゼ消化混合物を形成し； 伸長混合物を実質的にウラシルＮ−グリコシラーゼ消化にかけて、オリゴヌク レオチドプローブ、連結反応産物配列、およびプライマーとして５’上流プライ マーを用いる元の標的からの伸長産物を破壊し、連結反応産物配列からの下流プ ライマー伸長産物を破壊せず； ウラシルＮ−グリコシラーゼを不活性化し； 該ウラシルＮ−グリコシラーゼ不活性化後にポリメラーゼをウラシルＮ−グリ コシラーゼ消化混合物と混合して、ポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成し； ポリメラーゼ連鎖反応混合物を１以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルにかけ 、デオキシウラシルの代わりにデオキシチミジンを含むこと以外は実質的に同じ 連結反応産物配列である第１サイクルにおいて伸長産物を形成し、続くサイクル において、５’上流プライマーが連結反応産物配列に相補的な伸長産物の５’上 流プライマー特異的部分にハイブリダイズし、３’下流プライマーが伸長処理、 連結反応産物配列に実質的に同じ伸長産物配列の３’下流部分にハイブリダイズ しそれにより、伸長混合物のウラシルＮ−グリコシラーゼ消化処理が、連結反応 産物配列、１または２のオリゴヌクレオチドプローブおよびポリメラーゼ連鎖反 応混合物の１以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクル処理からの連結反応独立伸長 産物の量を減少する； ことを含む請求項１の方法。 １６．請求項１５の方法において、特定セットのオリゴヌクレオチドプローブ の連結反応産物配列が、プライマーまたは他の連結反応産物配列と識別し得るユ ニーク長産物を産生するものであり、該方法がさらに、 伸長産物をサイズまたは電気泳動運動性により分離する（該識別がサイズの相 違する伸長産物を分別する）； ことを含む請求項１５の方法。 １７．請求項１６の方法において、１以上の単一塩基の変更、挿入、欠失また は転座により相違する１以上の複数の配列は定量する複数の標的ヌクレオチド配 列を有する未知量のサンプル中に存在するものであり、該方法はさらに、 １以上のマーカー標的ヌクレオチド配列の既知量を準備し； １以上のマーカー特異的オリゴヌクレオチドプライマーセットを準備し、各セ ットは、（ａ）標的特異的部分および５’上流プライマー特異的部分を有する第 １オリゴヌクレオチドプローブおよび（ｂ）標的特異的部分および３’下流プラ イマー特異的部分を有する第２オリゴヌクレオチドプローブを特徴とし（特定セ ットの１または２オリゴヌクレオチドプローブはデオキシチミジンの代わりにデ オキシウラシルを含有し、特定セットのオリゴヌクレオチドプローブは対応する マーカー標的ヌクレオチド配列に互いに隣接してハイブリダイズするときに一緒 の連結反応に適しており、しかし、サンプル中または加えられたマーカー配列中 に存在する他のヌクレオチド配列にハイブリダイズするときは、該連結反応を妨 害するミスマッチを有し、該オリゴヌクレオチドプローブセットおよび該マーカ ー特異的オリゴヌクレオチドセットは複数のオリゴヌクレオチドプローブ群を形 成し、特定セットのオリゴヌクレオチドプローブの連結反応産物配列がユニーク 長産物を産生し、そして同じ群または他の群におけるプローブまたは他の連結反 応産物配列と識別され得る）； マーカー標的ヌクレオチド配列およびマーカー標的ヌクレオチド配列のために 特異的に設計されたプローブをリガーゼ検出混合物に混合し； １または複数のオリゴヌクレオチドプライマー群を準備し、各群が２以上のオ リゴヌクレオチドプライマーセットを含有し（同じ群のオリゴヌクレオチドプラ イマーセットは同じ５’上流プライマーまたは同じ３’下流プライマーのいずれ か、あるいは５’上流プライマーと同じ３’下流プライマーの両方を含有し、オ リゴヌクレオチドプライマーの１群は与えられた群での全連結反応産物配列の増 幅に使用される）； 伸長産物をサイズまたは電気泳動運動性により分離し； 該識別後に伸長産物量を定量し； 未知のサンプルから産生した伸長産物量をマーカー標的ヌクレオチド配列の既 知量から産生した伸長産物量と比較して、サンプル中の１以上の標的ヌクレオチ ド配列レベルを定量する； ことを含む請求項１６の方法。 １８．請求項１５の方法において、各プライマーセットにおいて、１つのプラ イマーが検出可能レポーター標識を有し、他のプライマーがポリメラーゼ連鎖反 応混合物を１以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルにかけた後にこのプライマー ５’末に連結し、単鎖を残すアドレス可能アレイ特異的部分を含有するものであ り、該方法がさらに、 相違する特定部位で固定化された相違捕捉オリゴヌクレオチドを有する固体支 持物を準備し（捕捉オリゴヌクレオチドがアドレス可能アレイ特異的部分に相補 的であるヌクレオチド配列を有する）； １以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルにかけた後に該ポリメラーゼ連鎖反応 混合物を、伸長産物が捕捉オリゴヌクレオチドに塩基特異的にハイブリダイズす るのに効果的な条件で固体支持物に接触せしめ、それによって相補的捕捉オリゴ ヌクレオチドを有する部位でアドレス可能アレイ特異的部分を固体支持物に捕捉 する（該検出がアドレス可能アレイ特異的部分を用いて捕捉され、そして特定部 位で固体支持物に固定された伸長産物の存在を表す）； ことを含む請求項１５の方法。 １９．請求項１８の方法において、１以上の単一塩基の変更、挿入、欠失また は転座により相違する１以上の複数の配列は定量する複数の標的ヌクレオチド配 列を有する未知量のサンプル中に存在するものであり、該方法がさらに、 １以上のマーカー標的ヌクレオチド配列の既知量を準備し； １または複数のオリゴヌクレオチドプローブ群を準備し、各群はマーカー標的 ヌクレオチド配列のために特異的に設計されたプローブセットを含む２以上のオ リゴヌクレオチドプローブセットを含有し（特定セットのオリゴヌクレオチドプ ローブの連結反応産物配列は、同じ群または他の群のプローブまたは他の連結反 応産物配列と識別される）； マーカー標的ヌクレオチド配列およびマーカー標的ヌクレオチド配列のために 特異的に設計されたプローブをリガーゼ検出混合物に混合し； １または複数のオリゴヌクレオチドプライマー群を準備し、各群が２以上のオ リゴヌクレオチドプライマーセットを含有し（同じ群のオリゴヌクレオチドプラ イマーセットは同じ５’上流プライマーまたは同じ３’下流プライマーのいずれ かを含有し、オリゴヌクレオチドプライマーの１群は与えられた群での全連結反 応産物配列の増幅に使用される）； 該識別後に伸長産物量を定量し； 未知のサンプルから産生した伸長産物量をマーカー標的ヌクレオチド配列の既 知量から産生した伸長産物量と比較して、サンプル中の１以上の標的ヌクレオチ ド配列レベルを定量する； ことを含む請求項１８の方法。 ２０．各変性処理が温度約８０−１０５℃である、請求項１の方法。 ２１．変性処理またはハイブリダイゼーション処理を含むリガーゼ検出反応の 各サイクルが約３０秒−約５分間の長さである、請求項１の方法。 ２２．リガーゼ検出反応混合物の１以上のリガーゼ検出反応サイクル処理が２ −５０サイクルで反復される、請求項１の方法。 ２３．リガーゼ検出反応混合物の１以上のリガーゼ検出反応サイクル処理につ いての全時間が１−２５０分である、請求項１の方法。 ２４．リガーゼがThermus aquaticusリガーゼ、Thermus thermophilusリガー ゼ、E.coliリガーゼ、Ｔ４リガーゼおよびPyrococcusリガーゼからなる群より選 ばれる、請求項１の方法。 ２５．検出レポーター標識が発色団、蛍光分子、酵素、抗原、重金属、磁気プ ローブ、色素、燐光性基、放射活性物質、化学ルミネセント分子および電気化学 的検出分子からなる群より選ばれる、請求項１の方法。 ２６．オリゴヌクレオチドプローブの標的特異的部分各々がハイブリダイゼー ション温度５０−８５℃を有する、請求項１の方法。 ２７．オリゴヌクレオチドプローブの標的特異的部分が２０−２８ヌクレオチ ドの長さである、請求項１の方法。 ２８．オリゴヌクレオチドプローブセットがリボヌクレオチド、デオキシヌク レオチド、修飾リボヌクレオチド、修飾デオキシヌクレオチド、修飾ホスフェー ト−糖−骨格オリゴヌクレオチド、ヌクレオチドアナログおよびこれらの混合物 からなる群より選ばれる、請求項１の方法。 ２９．複数の標的ヌクレオチド配列における１以上の単一塩基の変更、挿入、 欠失または転座により相違している複数の配列の２以上を同定するための方法で あって： 複数の配列相違を有する１以上の標的ヌクレオチド配列を含有する可能性のあ るサンプルを準備し； １以上の１次オリゴヌクレオチドプライマー群を準備し、各群は１以上の１次 オリゴヌクレオチドプライマーセットを含み、各セットは（ａ）標的特異的部分 と５’上流２次プライマー特異的部分を保持する第１オリゴヌクレオチドプライ マー、および（ｂ）標的特異的部分と５’上流２次プライマー特異的部分を保持 する第２オリゴヌクレオチドプライマーを特徴とし（同じ群の各セットの第１オ リゴヌクレオチドプライマーが同じ５’上流２次プライマー特異的部分を含有し 、同じ群の各セットの第２オリゴヌクレオチドプライマーが同じ５’上流２次プ ライマー特異的部分を含有し、特定セットのオリゴヌクレオチドプライマーは対 応する標的ヌクレオチド配列の相補的な鎖でハイブリダイズして、ポリメラーゼ 連鎖反応を形成するのに適しており、しかし、サンプル中に存在する他のヌクレ オチド配列にハイブリダイズするときは、該ポリメラーゼ連鎖反応の形成を妨害 するミスマッチを有し、該オリゴヌクレオチドプローブセットおよび該マーカー 特異的オリゴヌクレオチドセットは複数のオリゴヌクレオチドプローブ群を形成 し、特定セットのポリメラーゼ連鎖反応産物が同じ群または他の群における他の ポリメラーゼ連鎖反応産物配列と識別され得る）； ポリメラーゼを準備し； サンプル、１次オリゴヌクレオチドプライマーおよびポリメラーゼを混合して 、１次ポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成し； １次ポリメラーゼ連鎖反応混合物を、変性処理、ハイブリダイゼーション処理 および伸長処理を含む２以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルにかけ（変性処理 において、ハイブリダイズされた核酸配列が分離され、ハイブリダイゼーション 処理において、１次オリゴヌクレオチドプライマーの標的特異的部分が標的ヌク レオチド配列にハイブリダイズし、伸長処理において、ハイブリダイズされた１ 次オリゴヌクレオチドプライマーが伸長されて、１次オリゴヌクレオチドプライ マーのハイブリダイズする標的ヌクレオチド配列に相補的な１次伸長産物を形成 する）； １または複数の２次オリゴヌクレオチドプライマーセットを準備し、各セット は、（ａ）第１の１次オリゴヌクレオチドプライマーの５’上流部分と同じ配列 を含有する第１の２次オリゴヌクレオチドプライマー、および（ｂ）第１の２次 プライマーにより含有される第１の１次オリゴヌクレオチドと同じ１次オリゴヌ クレオチドプライマーセットに由来する第２の１次オリゴヌクレオチドプライマ ーの５’上流部分と同じ配列を含有する第２の２次オリゴヌクレオチドプライマ ーを有し（２次オリゴヌクレオチドプライマーのセットは、与えられた群におい て１次伸長産物のすべてを増幅するのに使用され得る）； １次伸長産物、２次オリゴヌクレオチドプライマーおよびポリメラーゼを混合 して、２次ポリメラーゼ連鎖反応混合物とし； ２次ポリメラーゼ連鎖反応混合物を変性処理、ハイブリダイゼーション処理お よび伸長処理を含む２以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルにかけ（変性処理に おいて、ハイブリダイズされた核酸遺伝子が分離し、ハイブリダイゼーションに おいて、２次オリゴヌクレオチドプライマーが１次伸長産物にハイブリダイズし 、伸長処理において、ハイブリダイズ２次オリゴヌクレオチドプライマーが伸長 されて、１次伸長産物に相補的な２次伸長産物を形成する）； 複数のオリゴヌクレオチドプローブセットが準備され、各セットは、（ａ）２ 次伸長産物特異的部分と検出可能レポーター標識を保持する第１オリゴヌクレオ チドプローブ、および（ｂ）２次伸長産物特異的部分を保持する第２オリゴヌク レオチドプローブを有し（特定セットのオリゴヌクレオチドプローブは、相補的 ２次伸長産物特異的部分に互いに隣接してハイブリダイズしたときに一緒に連結 反応するのに適し、しかし、サンプル中の他のヌクレオチド配列にハイブリダイ ズするときに該連結反応を妨害するミスマッチがある）； リガーゼを準備し； ２次伸長産物、複数のオリゴヌクレオチドプローブセットおよびリガーゼを混 合して、リガーゼ検出反応混合物とし； リガーゼ検出反応混合物を、変性処理およびハイブリダイゼーション処理を含 む１以上のリガーゼ検出反応サイクルにかけ（変性処理において、ハイブリダイ ズされたオリゴヌクレオチドが２次伸長産物から分離され、ハイブリダイゼーシ ョン処理において、オリゴヌクレオチドプローブセットは、隣接部位で塩基特異 的に、もし存在すれば夫々の２次伸長産物にハイブリダイズし、互いに連結して 、一緒に結合している（ａ）検出可能レポーター標識および（ｂ）２次伸長産物 特異的部分を含有する連結産物配列を形成し、オリゴヌクレオチドプローブセッ トは、その夫々の相補的２次伸長産物以外のヌクレオチド配列にハイブリダイズ し得るが、１以上のミスマッチの存在のために一緒に連結しないで、変性処理の 際に個々に分離する）； 連結反応産物配列のレポーター標識が検出されて、それによりサンプル中の２ 以上の標的ヌクレオチド配列の存在が表される； ことを含む方法。 ３０．請求項２９の方法において、特定セットのオリゴヌクレオチドプローブ の連結反応産物配列が、リガーゼ検出反応混合物中の他の核酸と識別できるよう に、ユニーク長を有するものであり、該方法はさらに、 サイズまたは電気泳動運動性により連結反応産物配列を分離し； 該検出後に、サイズの異なる連結反応産物配列を識別する； ことを含む請求項２９の方法。 ３１．請求項２９の方法において、各セットの第２オリゴヌクレオチドプロー ブがアドレス可能アレイ特異的部分を有するものであり、該方法がさらに、 相違する特定部位で固定化された相違の捕捉オリゴヌクレオチドを有する固体 支持物を準備し（捕捉オリゴヌクレオチドはアドレス可能アレイ特異的部分に相 補的であるヌクレオチド配列を有する）； １以上のリガーゼ検出反応サイクルにかけた後に、リガーゼ検出反応混合物を 、リガーゼ配列産物が捕捉オリゴヌクレオチドに塩基特異的にハイブリダイズす るのに効果的な条件で固体支持物に接触せしめ、それによって相補的捕捉オリゴ ヌクレオチドを有する部位で固体支持物にアドレス可能アレイ特異的部分を捕捉 する（該検出がアドレス可能アレイ特異的部分を用いて捕捉され、そして特定部 位で固体支持物に固定化された連結反応産物配列の存在を表し、それによってサ ンプル中の１以上の標的ヌクレオチド配列の存在を表す）； ことを含む請求項２９の方法。 ３２．請求項２９の方法において、１以上の単一塩基の変更、挿入、欠失また は転座により相違し、未知量のサンプル中に存在する１以上の複数の配列の相対 量を１以上の標的ヌクレオチド配列で定量するものであり、該方法がさらに、 ２次ポリメラーゼ連鎖反応混合物を１以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルに かけた後に、２次伸長産物を定量し； １以上のマーカー標的ヌクレオチド配列の既知量を準備し； マーカー標的ヌクレオチド配列のために特異的に設計されたプローブセットを 含む１以上の配列特異的プローブセットを準備し； マーカー標的ヌクレオチド配列、および標的ヌクレオチド配列のために特異的 に設計されたプローブセットをリガーゼ検出反応混合物と混合し； 連結反応産物配列を定量し； 未知のサンプルから産生した伸長産物量をマーカー標的ヌクレオチド配列の既 知量から産生した伸長産物量と比較して、サンプル中の１以上の標的ヌクレオチ ド配列の相対レベルを定量する； ことを含む請求項２９の方法。 ３３．請求項３２の方法において、第２オリゴヌクレオチドプローブがアドレ ス可能特異的部分を有し、該方法がさらに、 相違する特定部位で固定化された相違の捕捉オリゴヌクレオチドを有する固体 支持物を準備し（捕捉オリゴヌクレオチドはアドレス可能特異的部分に相補的で あるヌクレオチド配列を有する）； １以上のリガーゼ検出反応サイクルにかけた後に、リガーゼ検出反応混合物を 、 リガーゼ配列産物が捕捉オリゴヌクレオチドに塩基特異的にハイブリダイズする のに効果的な条件で固体支持物に接触せしめ、それによって相補的捕捉オリゴヌ クレオチドを有する部位で固体支持物にアドレス可能アレイ特異的部分を捕捉す る； アドレス可能アレイ特異的部分を用いて捕捉し、特定部位で固体支持物に固定 した連結反応産物配列を定量し； 未知のサンプルから産生した捕捉連結反応産物量をマーカー標的ヌクレオチド 配列の既知量から産生した捕捉連結反応産物量と比較して、サンプル中の１以上 の標的ヌクレオチド配列の相対レベルを定量する； ことを含む請求項３２の方法。 ３４．１以上のマーカー標的ヌクレオチド配列が１以上の単一ヌクレオチド位 置で標的ヌクレオチド配列と相違する、請求項３２の方法。 ３５．請求項３２の方法において、オリゴヌクレオチドプローブセットが複数 のオリゴヌクレオチドプローブ群を形成し、各群が単一ヌクレオチド位置で多重 対立遺伝子相違を識別するために設計された１以上のオリゴヌクレオチドプロー ブセットを含有し、各群のオリゴヌクレオチドプローブセットにおいて、２次伸 長産物特異的部分と検出可能レポーター標識を有する共通の１次オリゴヌクレオ チドプローブ、および与えられた対立遺伝子またマーカーヌクレオチド配列に塩 基特異的にハイブリダイズする２次伸長産物特異的部分を有する第２オリゴヌク レオチドプローブが存在し、各第２オリゴヌクレオチドプローブは異なる長さを 有し、特定セットのオリゴヌクレオチドプローブの連結反応産物配列はユニーク 長産物を産生するものであり、さらに該方法が、 連結反応産物配列をサイズまたは電気泳動運動性により分離し； サイズの異なる連結反応産物配列を識別する； ことを含む請求項３２の方法。 ３６．請求項３２の方法において、オリゴヌクレオチドプローブセットが複数 のオリゴヌクレオチドプローブ群を形成し、各群が単一ヌクレオチド位置で多重 対立遺伝子相違を識別するために設計された１以上のオリゴヌクレオチドプロー ブセットを含有し、各群のオリゴヌクレオチドプローブセットにおいて、２次伸 長産物特異的部分を有する共通の１次オリゴヌクレオチドプローブ、および与え られた対立遺伝子またマーカーヌクレオチド配列に塩基特異的にハイブリダイズ する２次伸長産物特異的部分を有する第２オリゴヌクレオチドプローブが存在し 、各第２オリゴヌクレオチドプローブは異なる検出可能レポーター標識を有し、 特定セットのオリゴヌクレオチドプローブの連結反応産物配列はユニーク長産物 を産生するものであり、さらに該方法が、 連結反応産物配列をサイズまたは電気泳動運動性により分離し； サイズの異なる連結反応産物配列を識別する； ことを含む請求項３２の方法。 ３７．オリゴヌクレオチドプローブセットが複数のオリゴヌクレオチドプロー ブ群を形成し、各群が単一ヌクレオチド位置で多重対立遺伝子相違を識別するた めに設計された１以上のオリゴヌクレオチドプローブセットを含有し、各群のオ リゴヌクレオチドプローブセットにおいて、２次伸長産物特異的部分と検出可能 レポーター標識を有する共通の１次オリゴヌクレオチドプローブ、および与えら れた対立遺伝子またマーカーヌクレオチド配列に塩基特異的にハイブリダイズす る２次伸長産物特異的部分を有する第２オリゴヌクレオチドプローブが存在し、 各第２オリゴヌクレオチドプローブは異なるアドレス可能アレイ特異的部分を有 する、請求項３３の方法。 ３８．請求項３３の方法において、オリゴヌクレオチドプローブセットが複数 のオリゴヌクレオチドプローブ群を形成し、各群が単一ヌクレオチド位置で多重 対立遺伝子相違を識別するために設計された１以上のオリゴヌクレオチドプロー ブセットを含有し、各群のオリゴヌクレオチドプローブセットにおいて、２次伸 長産物特異的部分とアドレス可能アレイ特異的部分を有する共通の１次オリゴヌ クレオチドプローブ、および与えられた対立遺伝子またマーカーヌクレオチド配 列に塩基特異的にハイブリダイズする２次伸長産物特異的部分を有する第２オリ ゴヌクレオチドプローブが存在し、各第２オリゴヌクレオチドプローブは異なる 検出可能レポーター標識を有する、請求項３３の方法。 ３９．単一標的ヌクレオチド配列における２以上の近接または隣接のヌクレオ チド位置での多重対立遺伝子相違または多重標的ヌクレオチド配列における２以 上の近接または隣接のヌクレオチド位置での多重対立遺伝子相違が、重複し得る ２次伸長特異的部分を有するオリゴヌクレオチドプローブで識別される、請求項 ２９の方法。 ４０．サンプル中の、正常配列の過剰存在下での単一標的ヌクレオチド配列に おける多重の近接または隣接の位置での多重対立遺伝子相違の低存在量、または 正常配列の過剰存在下での多重標的ヌクレオチド配列における多重の近接または 隣接の位置での多重対立遺伝子相違の低存在量が識別され、オリゴヌクレオチド プローブセットが複数のオリゴヌクレオチドプローブ群を形成し、各群が単一ヌ クレオチド位置で多重対立遺伝子相違を識別するために設計された１以上のオリ ゴヌクレオチドプローブセットを含有し、群内での１以上のセットが共通の第１ オリゴヌクレオチドプローブを共有し、第２オリゴヌクレオチドプローブが２次 伸長産物特異的部分を有し、この部分は塩基特異的に正常対立遺伝子以外の与え られた対立遺伝子にハイブリダイズし、該検出において、連結反応産物配列の標 識が検出され、それによって、サンプル中の、１以上の標的ヌクレオチド配列に おける１以上のヌクレオチド位置での１以上の低存在量の対立遺伝子の存在を表 す、請求項２９の方法。 ４１．請求項２９の方法において、サンプル中の未知量の、正常配列の過剰存 在下での単一標的ヌクレオチド配列における多重の近接または隣接の位置で多重 対立遺伝子相違の低存在量、または正常配列の過剰存在下での多重標的ヌクレオ チド配列における多重の近接または隣接のヌクレオチド位置で多重対立遺伝子相 違の低存在量を定量するものであり、さらに該方法が、 １以上のマーカー標的ヌクレオチド配列の既知量を準備し； １以上のマーカー特異的オリゴヌクレオチドプローブセットを準備し、各セッ トが（ａ）マーカー標的ヌクレオチド配列に相補的な標的特異的部分を有する第 １オリゴヌクレオチドプローブ、および（ｂ）マーカー標的ヌクレオチド配列に 相補的な標的特異的部分と検出可能レポーター標識を有する第２オリゴヌクレオ チドプローブを特徴とし（特定マーカー特異的オリゴヌクレオチドセットのオリ ゴヌクレオチドプローブは対応するマーカー標的ヌクレオチド配列に互いに隣接 してハイブリダイズするときに一緒の連結反応に適しており、しかし、サンプル 中または加えられたマーカー配列中に存在する他のヌクレオチド配列にハイブリ ダイズするときは、該連結反応を妨害するミスマッチを有し、該複数のオリゴヌ クレオチドプローブセットおよび複数のマーカー特異的オリゴヌクレオチドプロ ーブセットは、マーカーヌクレオチド配列を含み、単一ヌクレオチド位置で多重 対立遺伝子相違を識別するためのオリゴヌクレオチドプローブ群を形成し、群内 での１以上のセットが共通の第１オリゴヌクレオチドプローブを共有し、第２オ リゴヌクレオチドプローブが２次伸長産物特異的部分を有し、この部分は塩基特 異的に正常対立遺伝子以外の与えられた対立遺伝子にハイブリダイズし、リガー ゼ検出反応混合物を形成するための該混合物は、マーカー標的ヌクレオチド配列 およびマーカー標的ヌクレオチド配列のための特異的に設計されたプローブセッ トをリガーゼ検出反応混合物に混合することを含む）； 連結反応産物配列を定量し； 低存在量の未知のサンプルから産生した連結反応産物量をマーカー標的ヌクレ オチド配列の既知量から産生した連結反応産物量と比較して、サンプル中の１以 上の低存在量の標的ヌクレオチド配列レベルを定量する； ことを含む請求項２９の方法。 ４２．各変性処理が温度約８０−１０５℃である、請求項２９の方法。 ４３．変性処理またはハイブリダイゼーション処理を含むリガーゼ検出反応の 各サイクルが約３０秒−約５分間の長さである、請求項２９の方法。 ４４．リガーゼ検出反応混合物の１以上のリガーゼ検出反応サイクル処理が２ −５０サイクルで反復される、請求項２９の方法。 ４５．リガーゼ検出反応混合物の１以上のリガーゼ検出反応サイクル処理につ いての全時間が１−２５０分である、請求項２９の方法。 ４６．リガーゼがThermus aquaticusリガーゼ、Thermus thermophilusリガー ゼ、E.coliリガーゼ、Ｔ４リガーゼおよびPyrococcusリガーゼからなる群より選 ばれる、請求項２９の方法。 ４７．検出レポーター標識が発色団、蛍光分子、酵素、抗原、重金属、磁気プ ローブ、色素、燐光性基、放射活性物質、化学ルミネセント分子および電気化学 的検出分子からなる群より選ばれる、請求項２９の方法。 ４８．オリゴヌクレオチドプローブの標的特異的部分各々がハイブリダイゼー ション温度５０−８５℃を有する、請求項２９の方法。 ４９．オリゴヌクレオチドプローブの標的特異的部分が２０−２８ヌクレオチ ドの長さである、請求項２９の方法。 ５０．オリゴヌクレオチドプローブセットがリボヌクレオチド、デオキシヌク レオチド、修飾リボヌクレオチド、修飾デオキシヌクレオチド、修飾ホスフェー ト−糖−骨格オリゴヌクレオチド、ヌクレオチドアナログおよびこれらの混合物 からなる群より選ばれる、請求項２９の方法。 ５１．複数の標的ヌクレオチド配列における１以上の単一塩基の変更、挿入、 欠失または転座により相違している複数の配列の２以上を同定するための方法で あって： 複数の配列相違を有する１以上の標的ヌクレオチド配列を含有する可能性のあ るサンプルを準備し； １以上の１次オリゴヌクレオチドプライマー群を準備し、各群は（ａ）標的特 異的部分と５’上流２次プライマー特異的部分を保持する第１オリゴヌクレオチ ドプライマー、および（ｂ）標的特異的部分と５’上流２次プライマー特異的部 分を保持する第２オリゴヌクレオチドプローブを特徴とし（同じ群の各セットの 第１オリゴヌクレオチドプライマーが同じ５’上流２次プライマー特異的部分を 含有し、同じ群の各セットの第２オリゴヌクレオチドプライマーが同じ５’上流 ２次プライマー特異的部分を含有し、 特定セットのオリゴヌクレオチドプライマーは対応する標的ヌクレオチド配列 の相補的な鎖でハイブリダイズして、ポリメラーゼ連鎖反応産物を形成するのに 適しており、しかし、サンプル中または加えられたマーカー配列中に存在する他 のヌクレオチド配列にハイブリダイズするときは、ポリメラーゼ連鎖反応を妨害 するミスマッチを有し、特定セットのポリメラーゼ連鎖反応産物配列が同じ群ま たは他の群における他のポリメラーゼ連鎖反応産物配列と識別され得る）； ポリメラーゼを準備し； サンプル、１次オリゴヌクレオチドプライマーおよびポリメラーゼを混合して 、１次ポリメラーゼ連鎖反応混合物を形成し； １次ポリメラーゼ連鎖反応混合物を、変性処理、ハイブリダイゼーション処理 および伸長処理を含む２以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルにかけ（変性処理 において、ハイブリダイズされた核酸配列は分離され、ハイブリダイゼーション 処理において、１次オリゴヌクレオチドプライマーの標的特異的部分は標的ヌク レオチド配列にハイブリダイズし、伸長処理において、ハイブリダイズされた１ 次オリゴヌクレオチドプライマーは伸長されて、１次オリゴヌクレオチドプライ マーのハイブリダイズする標的ヌクレオチド配列に相補的な１次伸長産物を形成 する）； １または複数の２次オリゴヌクレオチドプライマーセットを準備し、各セット は、（ａ）検出可能レポーター標識を保持し、第１の１次オリゴヌクレオチドプ ライマーの５’上流部分と同じ配列を含有する第１の２次オリゴヌクレオチドプ ライマー、および（ｂ）第１の２次プライマーに相補的な第１の１次オリゴヌク レオチドと同じ１次オリゴヌクレオチドプライマーセットに由来する第２の１次 オリゴヌクレオチドプライマーの５’上流部分と同じ配列を含有する第２の２次 オリゴヌクレオチドプライマーを有し（２次オリゴヌクレオチドプライマーのセ ットが与えられた特定の群における１次伸長産物を増幅する）； １次伸長産物、２次オリゴヌクレオチドプライマーおよびポリメラーゼを混合 して、２次ポリメラーゼ連鎖反応混合物とし； ２次ポリメラーゼ連鎖反応混合物を、変性処理、ハイブリダイゼーション処理 および伸長処理を含む２以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルにかけ（変性処理 において、ハイブリダイズされた核酸配列が分離し、ハイブリダイゼーションに おいて、２次オリゴヌクレオチドプライマーが１次伸長産物にハイブリダイズし 、伸長処理において、ハイブリダイズ２次オリゴヌクレオチドプライマーが伸長 されて、１次伸長産物に相補的な２次伸長産物を形成する）； 標識２次伸長産物を検出し、それによってサンプル中の１以上の標的ヌクレオ チド配列の存在を表すことを含む方法。 ５２．請求項５１の方法において、特定セットのポリメラーゼ連鎖反応２次オ リゴヌクレオチドプライマーが、２次ポリメラーゼ連鎖反応混合物中の他の核酸 と識別できるように、ユニーク長の２次伸長産物を産生するものであり、該方法 はさらに、 サイズまたは電気泳動運動性により伸長産物を分離し； サイズの異なる２次伸長産物を識別する； ことを含む請求項５１の方法。 ５３．請求項５１の方法において、２次伸長産物が他の２次伸長産物と識別で きるようにユニーク配列を含有するものであり、該方法はさらに、 相違する特定部位で固定化された相違捕捉オリゴヌクレオチドを有する固体支 持物を準備し（捕捉オリゴヌクレオチドは２次伸長産物内のユニークヌクレオチ ド配列に相補的であるヌクレオチド配列を有する）； １以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルにかけた後に、２次ポリメラーゼ連鎖 反応混合物を、２次伸長産物が捕捉オリゴヌクレオチドに塩基特異的にハイブリ ダイズするのに効果的な条件で固体支持物に接触せしめ、それによって相補的捕 捉オリゴヌクレオチドを有する部位で固体支持物に２次伸長産物を捕捉する（該 検出が２次伸長産物内でユニークヌクレオチド配列部分を用いて捕捉され、特定 部位で固体支持物に固定された２次伸長産物の存在を表し、それによってサンプ ル中の１以上の標的ヌクレオチドの存在を表す）； ことを含む請求項５１の方法。 ５４．請求項５１の方法において、同じ群の１次オリゴヌクレオチドプライマ ーセットが第１オリゴヌクレオチドプライマー上の同じ５’上流プライマー特異 的部分または第２オリゴヌクレオチドプライマー上の同じ５’上流プライマー特 異的部分のいずれかを含み、２次オリゴヌクレオチドプライマーセットが１また は複数のオリゴヌクレオチドプライマー群を形成し、各群は１以上のオリゴヌク レオチドプライマーセットを含み、１つの２次オリゴヌクレオチドプライマーが 検出可能レポーターレベルを有し、そして他の２次オリゴヌクレオチドプライマ ーが、１以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルに２次ポリメラーゼ連鎖反応混合 物がかけられた後に単鎖を残すプライマーの５’末に連結しているアドレス可能 アレイ特異的部分を含有し、同じ群のオリゴヌクレオチドプライマーが同じ第１ の２次オリゴヌクレオチドプライマーまたは同じ第２の２次オリゴヌクレオチド プライマーのいずれかを有し、２次オリゴヌクレオチドプライマーの１群が与え られた群での全１次伸長産物を増幅するのに用いられるものであり、該方法がさ らに、 相違する特定部位で固定化された相違捕捉オリゴヌクレオチドを有する固体支 持物を準備し（捕捉オリゴヌクレオチドはアドレス可能アレイ特異的部分に相補 的であるヌクレオチド配列を有する）； １以上のポリメラーゼ連鎖反応サイクルにかけた後に、該ポリメラーゼ連鎖反 応混合物を、２次伸長産物が捕捉オリゴヌクレオチドに塩基特異的にハイブリダ イズするのに効果的な条件で固体支持物に接触せしめ、それによって相補的捕捉 オリゴヌクレオチドを有する部位で固体支持物にアドレス可能アレイ特異的部分 を捕捉する（該検出が２次伸長産物内でユニークヌクレオチド配列部分を用いて 捕捉され、特定部位で固体支持物に固定された２次伸長産物の存在を表し、それ によってサンプル中の１以上の標的ヌクレオチドの存在を表す）； ことを含む請求項５１の方法。
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