JP2000514422A

JP2000514422A - 肥満のための遺伝子治療

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Publication number: JP2000514422A
Application number: JP10503629A
Authority: JP
Inventors: モージイ，マナル・エイ; クー，ミン・チヨン; チヤオ，チン; カースキー，シー・トーマス
Original assignee: メルクエンドカンパニーインコーポレーテッド
Priority date: 1996-06-20
Filing date: 1997-06-20
Publication date: 2000-10-31
Also published as: CA2258504A1; EP0921820A4; WO1997048419A1; EP0921820A1

Abstract

(57)【要約】遺伝子治療は哺乳類における肥満を治療することができる。肥満調節遺伝子を哺乳類に供給送達する。好ましくは、該遺伝子はレプチンあるいはレプチン受容体をコードする。供給送達され、ｉｎｖｉｖｏで発現される蛋白は、動物に注入した蛋白よりも有効である。

Description

【発明の詳細な説明】肥満のための遺伝子治療発明の分野本発明は肥満のための遺伝子治療の方法に関する。本発明はまた、この遺伝子治療において有用なベクターに関する。発明の背景レプチンはｏｂ遺伝子によって発現される蛋白である。レプチンは脂肪組織によって分泌され、満腹因子であると同時に代謝の調節因子であると思われる（Ｌｅｖｉｎら、１９９６Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９３：１７２６−１７３０）。マウス遺伝子とそのヒト相同体の両方が最近同定され、塩基配列決定された（Ｚｈａｎｇら、１９９４Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）３７２：４２５−４３１）。ｏｂ遺伝子に関して同型接合であるマウス（ｏｂ／ｏｂ）は、おそらくレプチンの過小発現のゆえに肥満である。ｏｂ／ｏｂマウスに毎日組換え型蛋白の注射を行うと、食物摂取が著明に抑制され、体重と脂肪の減少が生じた。やせ型（すなわち野生型）マウスでは、レプチンの毎日の注射は食物摂取と体重の適度な減少を導く。体脂肪に関する結果は一貫していない（Ｐｅｌｌｅｙｍｏｕｎｔｅｒら、１９９５，Ｓｃｉｅｎｃｅ２６９：５４０−５４３；Ｈａｌａａｓら、１９９５Ｓｃｉｅｎｃｅ２６９：５４３−５４６；およびＣａｍｐｆｉｅｌｄら、１９９５Ｓｃｉｅｎｃｅ２６９：５４６−５４９）。ヒトにおける肥満は死亡率に関連する重要な障害であり、多くの原因から生じうるが、少なくとも一部には産生されるレプチンの量の不足によると考えられる。レプチンは蛋白であり、消化器系による分解や不活性化を受けやすいので、経口的に供給送達することはできない。肥満が一部にはレプチンの欠乏によるものである肥満患者に対してのレプチンの供給送達のための治療を開発することは望ましいであろう。ある種の形態の肥満はレプチンの投与によっては治療できないと思われる。これらの症例では、問題は細胞表面のレプチン受容体の量の不足によるものである可能性が高い。そうでなければ、細胞表面に存在する受容体が、有効にレプチンと結合することができないかまたはレプチン結合によって生じるシグナルを有効に処理することができない突然変異を含むと考えられる。現在のところ、これらの受容体を増加させるあるいはそれらを代替することができる治療法は存在しない。発明の概要適用なし発明の詳細な説明本発明は肥満のための遺伝子治療に関する。本発明のひとつの局面は、肥満を治療する、血清グルコースレベルを低下させる、あるいは血清インシュリンレベルを低下させる治療法を必要とする哺乳類において、肥満調節遺伝子をコードする遺伝子を該哺乳類に供給送達し、肥満調節遺伝子の転写と翻訳のための十分な時間を与えることを含む、肥満を治療する、血清グルコースレベルを低下させる、あるいは血清インシュリンレベルを低下させる方法を含む。一部の種類の肥満は、レプチンの量の不足あるいは細胞表面上に存在する機能的レプチン受容体の量の不足によって生じる。従って、本発明のもうひとつの局面は、レプチンあるいはレプチン受容体をコードする遺伝子を哺乳類に供給送達し、レプチンあるいはレプチン受容体遺伝子の転写と翻訳のための十分な時間を与えることを含む肥満の治療方法である。本発明の特定実施形態は、その肥満、高い血清グルコースレベル、あるいは高いインシュリンレベルが、少なくとも一部には産生されるレプチンの量の不足によるものである哺乳類のための遺伝子治療である。「産生されるレプチンの量の不足」とは、動物が機能的レプチンを産生するが必要とされるよりも低いレベルであること；全くレプチンを産生することができないこと；あるいは、天然レプチンほど有効に機能しないかまたは全く機能しない突然変異形態のレプチンを産生することが想定されている。従って、本発明は、レプチンをコードする遺伝子を哺乳類に供給送達し、レプチン遺伝子の転写と翻訳のための十分な時間を与えることを含む、少なくとも一部には哺乳類によって産生されるレプチンの量の不足を原因とする肥満、血清グルコースレベルの上昇あるいはインシュリン上昇を治療する方法を対象とする。肥満は、正常な量のレプチンを産生するが、そのレプチン受容体が適切にレプチンと結合することができないかまたは適切にレプチンを処理することができない、あるいはレプチン受容体が十分な量で産生されない動物において起こりうる。これらの状況は、レプチン受容体を用いた遺伝子治療によって矯正されうる。従って本発明のもうひとつの局面は、そのいずれかが、少なくとも一部には、哺乳類による機能的レプチン受容体産生の量の不足の結果である肥満、過度の血漿インシュリンレベルあるいは過度の血漿グルコースレベルのための治療である。従って、本発明のひとつの局面は、哺乳類にレプチン受容体をコードする遺伝子を供給送達し、レプチン受容体遺伝子の転写と翻訳のための十分な時間を与えることを含む、哺乳類においてレプチン受容体の量を増加させる方法である。図の簡単な説明図１は２匹のｏｂ／ｏｂマウスの写真である。右側のマウスは対照群からのものである。左側のマウスは本発明に従った遺伝子治療を受けた。図２は、組換え型ヒトレプチン蛋白で処置したマウスの体重変化を示すグラフである。ヒト組換え型レプチンを１μｇ／ｇｍ体重で毎日腹腔内注射した。矢印は採血時点を示す。図３は、対照として使用した、レポーター遺伝子（β−ガラクトシダーゼ）を持つアデノウイルスで処置したマウスの体重変化を示すグラフである。図４は、ヒトレプチン遺伝子を持つアデノウイルスで処置したマウスの体重変化を示すグラフである。図５は、すべての群のマウスについての体重変化のパーセントを示すグラフである。図６Ａ（左のグラフ）は、レプチン遺伝子を含むアデノウイルスで処置したマウスの血漿中で認められたヒトレプチンの量を示すグラフである。図６Ｂ（右のグラフ）は、組換え型ヒトレプチンの毎日の注射で５日間処置したマウスについての結果を示す。図７Ａ（左のグラフ）は、レプチン遺伝子を含むアデノウイルスで処置したマウスの血漿中のインシュリンとレプチンの量を示す。図７Ｂ（右のグラフ）は、組換え型ヒトレプチン注射で処置したマウスの血漿中のインシュリンとレプチンの量を示す。図８は、組換え型レプチン、レポーター遺伝子あるいはレプチン遺伝子を含むアデノウイルスのいずれかで処置したマウスのグルコースレベルを示す。本明細書および請求の範囲全体を通じて使用する時、次の定義が適用される：「天然」：ある遺伝子あるいは蛋白が、特定の生物において自然に発生すれば天然である。「レプチン遺伝子」：天然レプチンあるいはその誘導体をコードするあらゆる哺乳類からの遺伝子。「誘導体」は、天然レプチンの生物活性の少なくとも８０％を保持する、修飾されたレプチン分子である。「レプチン受容体」：天然レプチン受容体あるいはその誘導体をコードする哺乳類からの遺伝子。「誘導体」は、天然受容体分子の少なくとも８０％有効に天然レプチンと結合する、修飾された受容体分子である。「肥満調節遺伝子」：レプチン、レプチン受容体、神経ペプチドＹ等をコードする遺伝子を含めて、その遺伝子産物が哺乳類における肥満の調節に関与する遺伝子。これまで、組換え型レプチンは肥満の表現型を呈する動物に投与され、毎日の注射は体重を減少させることが示されてきた。しかし、肥満を治療するこの方法には数多くの不都合な点がある。まず第一に、この方法は、少なくとも一部には産生されるレプチンの量の不足によって肥満が生じる動物に関してのみ有用である。必ずしもすべての肥満がこの欠損によるわけではない。さらに、注射は、特に長期的治療に関して、あまり都合のよい治療方法ではない。その上、レプチンの半減期は短く、そのため治療の有効期間はわずかに約２４時間であることが認められており、その後動物は体重を回復することが観察された。本発明は、ｉｎｖｉｖｏでレプチンあるいはレプチン受容体を発現することができるベクターを提供することにより、組換え型蛋白の毎日の投与に関連する問題を解決する。意外にも、ｉｎｖｉｖｏで発現されるレプチンは組換え型レプチンの投与よりも有益であることが認められた；その作用はより長く持続し、最も驚くべき点として、注射によって投与される組換え型レプチンよりも２０倍以上強力である。ｉｎｖｉｖｏでのレプチン受容体あるいは神経ペプチドＹの発現はこれまで治療不能であったタイプの肥満の治療を可能にする。遺伝子様々な種からのレプチンおよびレプチン遺伝子の配列が知られている（Ｚｈａｎｇら、１９９４Ｎａｔｕｒｅ３７２：４２５；Ｏｇａｗａら、１９９５Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９６：１６４７−１６５２；Ｍｕｒａｋａｍｉら、１９９５Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２０９：９４４；およびＣｏｎｓｉｄｉｎｅら、１９９５Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９５：２９８６；これらは各々参照してここに組み込まれる）。所望する場合は、レプチン誘導体をコードする遺伝子も使用できる。レプチンのアミノ酸およびヌクレオチド配列は既知であるので、所望する突然変異形態のレプチンをコードするヌクレオチド配列を構築することは十分に当業者の技術範囲内である。これらを使用して、トランスジェニック動物モデルにおいてレプチンの結合およびシグナル伝達に関わる構造と機能の関係を検討することができる。レプチン受容体のアミノ酸配列およびレプチン受容体をコードする遺伝子の核酸配列も既知である；たとえば、参照してここに組み込まれるＴｏｒｉａｇｌｌａら、１９９５，Ｃｅｌｌ８３：１−２０参照。レプチン受容体は、オールターナティブスプライシングのため、様々なアイソフォームが存在しうる。これら多くのアイソフォームが存在することの生物学的影響は明確には理解されていない。しかし、長い形態のマウスレプチン受容体の成熟前終了をもたらす突然変異は、明らかにｄｂ／ｄｂマウスの肥満表現型の原因である（Ｌｅｅら、１９９６、Ｎａｔｕｒｅ３７９：６３２−６３５；Ｃｈｕａら、１９９６、Ｓｃｉｅｎｃｅ２７１：９９４−９９６；およびＣｈｅｎら、１９９６、Ｃｅｌｌ８４：４９１−４９５）。本発明のさらなる局面では、誘導体レプチン受容体を哺乳類に導入し、生じた哺乳類を用いてレプチン結合とレプチン受容体の間の構造と機能的関係を検討することができる。レプチンあるいはレプチン受容体をコードする遺伝子はまた、宿主細胞環境に導入された時に遺伝子の発現を可能にする少なくとも１個の因子を含まねばならない。これらの配列は、プロモータ、応答因子、およびエンハンサー因子を含むがこれらに限定されない。本発明の好ましい局面では、プロモータは、構成的であるよりはむしろ調節可能、すなわち誘導性であるものが選択される。そのようなプロモータの特定例は次のものを含む：Ｓｒ−アルファ、ＣＭＶ、調節可能なｔｅｔ、Ｐ−４５０、アルブミン等。ベクターベクターあるいは他の供給送達媒体を用いて異種レプチンあるいはレプチン受容体遺伝子を生物に供給送達することができる。ＤＮＡ供給送達媒体は、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、およびレトロウイルスベクターのようなウイルスベクターを含みうる。たとえば：Ｃｈｕら、１９９４ＧｅｎｅＴｈｅｒ１：２９２−２９９；Ｃｏｕｔｕｒｅら、１９９４ＨｕｍＧｅｎｅＴｈｅｒ５：６６７−６７７；およびＥｉｖｅｒｈａｎｄら、１９９５ＧｅｎｅＴｈｅｒ２：３３６−３４３参照。同様に適切な非ウイルスベクターは、ＤＮＡ−脂質複合体、たとえばリポソーム媒介の供給送達系あるいはアシアロ糖蛋白媒介の供給送達系のようなリガンド／ポリ−Ｌ−リシン複合体を含む。たとえば：Ｆｅｌｇｎｅｒら、１９９４Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，２６９：２５５０−２５６１；Ｄｅｒｏｓｓｉら、１９９５，Ｒｅｓｔｏｒ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｎｅｕｒｏｓ．８：７−１０；およびＡｂｃａｌｌａｈら、１９９５Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ８５：１−７。ベクターを肥満調節遺伝子のための供給送達媒体として選択する場合、宿主細胞における遺伝子の発現を可能にするいかなるベクターでもよい。ベクターが、同時に宿主ゲノムに組み込まれることができるものであることが望ましく、そうすれば該遺伝子は永続的に発現されうるが、これは必ずしも必要ではない。ベクターが宿主のゲノムに組み込まれない場合は、遺伝子の発現は永続的ではなく一過性であると考えられる。ｏｂ遺伝子の一過性発現に適するひとつのベクターは、Ｅ１遺伝子に欠失を有するアデノウイルスである。前述した第ＷＯ９５／００６５５号およびＭｉｔａｎｉら、１９９５の出版物が教示するように、そのようなベクターは既知である。これらのウイルスは肝細胞に選択的に感染し、初期感染後約３−４週間そこに残存する。肝細胞中に存在する間、これらのウイルスは異種遺伝子を発現することができる。ベクターは一般に静脈注射によって宿主に投与される。適当な力価は、選択される個々のベクター、宿主、使用されるプロモータの力価、および治療される疾患の重症度のような多くの因子に依存する。マウスに関しては、アデノウイルスベクターは好ましくは、体重のグラム当り約５．０×１０⁶から約１０×１０⁶プラーク形成単位（ＰＦＵ）の範囲の用量で注射として投与される。好ましい用量は、少なくとも約６−９×１０⁶ＰＦＵ／ｇｍ体重の範囲であり、より好ましくは少なくとも約６．７−８．６×１０⁶ＰＦＵ／ｇｍ体重（マウスに関してはおよそ少なくとも１−５×１０⁸ＰＦＵに相当する）である。従って本発明は特に、次の事柄を含む、少なくとも一部には哺乳類によるレプチンあるいはレプチン受容体の量の不足によるものである肥満、高い血清グルコースレベルあるいは高いインシュリンレベルを治療する方法を対象とする：ａ）レプチンあるいはレプチン受容体をコードする遺伝子を含むウイルスベクターで該哺乳類をトランスフェクションする；該ベクターはさらに、哺乳類組織におけるその発現を調節する少なくとも１個の因子を含む；およびｂ）レプチン遺伝子の転写と翻訳のために十分な時間を経過させる。宿主一時的にｏｂあるいはｏｂ受容体遺伝子産物を発現する動物は有益な研究ツールである。たとえば、それらを使用して、レプチンの量の減少の影響、あるいはレプチンのアベイラビリティーが低下している環境での様々な外因的に供給される物質（ホルモンあるいは推定上のレプチン受容体作用物質および拮抗物質など）の影響をモニターすることができる。肥満の様々な局面を検討する上で有用な動物モデルを作製することのほかに、本発明は特にヒトのための遺伝子治療を対象とする。本発明に従って、肥満の（ｏｂ／ｏｂ）マウスにヒトレプチン遺伝子を含むアデノウイルスを注射した。所望するいかなる種からのレプチン遺伝子も使用できるが、好ましい実施形態では、宿主として同じ種からの遺伝子を使用する。これらを、マーカ遺伝子（β− ガラクトシダーゼ）だけを含むアデノウイルスを注射したｏｂ／ｏｂマウス、組換え型レプチンの注射を受けたｏｂ／ｏｂマウス、および未処置対照と比較した。一部の実験ではさらにｄｂ／ｄｂマウス（肥満であるが、レプチン注射に対して不応答性）を対照として使用する。体重：図２は、毎日１μｇ／ｇｍ体重のヒト組換え型レプチン蛋白の注射を受けたマウスについての体重変化を未処置対照と比較して示している。レプチン摂取動物は連続５日間注射を受け、グラフでは黒塗りの記号で示されている。レプチンを摂取した動物全部が、注射後２４時間以内に体重減少した。すべての動物が最後の腹腔内注射後４８時間以内に体重増加した。図３は、レポーター遺伝子を持つ様々な力価のアデノウイルスを摂取したマウスについて測定した体重を示す。すべての動物が注射後体重増加し続けた。図４は、レプチン遺伝子を持つアデノウイルスを摂取したマウスについての結果を示す。グラフからわかるように、すべての動物が注射後２４時間以内に体重減少した。全動物が処置後１−２週間体重減少し続けた。注射は比較的広い力価範囲にわたって有効であり、用量反応性が認められた。体重の絶対変化と共に、すべての群について体重変化のパーセンテージを計算した。組換え型レプチン注射で処置した動物では、体重減少は３日目にプラトーになり、処置後１−５日で４．７％の体重減少を認めた。レプチン遺伝子を持つベクターで処置したマウスでは、１０−１２日間にわたって体重減少が持続し、１８．６１％の体重減少を生じた。さらに、処置後１−５日で、組換え型レプチン処置マウスでは４．７％だけの減少であったのに比べ、９．１７％の体重減少を認めた。これは図５に示されている。レプチン：ヒト組換え型レプチンの注射を受けた動物と、レプチン遺伝子を持つベクターを摂取した動物において、血漿中のヒトレプチンの量を測定した。組換え型蛋白を摂取した動物は、対照（やせた野生型）動物で認められたレプチンの量よりも約２０倍高いレプチンレベルを持つことが認められた；ピーク量は３９９．８±４０．９１ｎｇ／ｍｌであった。レプチン遺伝子を摂取した動物は、血漿中に野生型マウスで認められた正常範囲内のレプチンレベル（１７．５２± ４．６６ｎｇ／ｍｌ）を有していた。両群の動物において、体重増加は血漿中で検出されるヒトレプチンの減少と時間的に一致していた。これは図６に示されている。インシュリン：組換え型蛋白を摂取した動物と遺伝子治療を受けた動物において、血漿中のインシュリンの量を測定した。これは図７に示されている。両群で、インシュリンレベルはやせ型（野生型）動物で認められるレベルまで低下したことが観察され、レプチンレベルと逆相関していた。遺伝子治療を受けたマウスでは少なくとも１週間低いインシュリンレベルが持続したのに対し、組換え型レプチン処置マウスでは、インシュリンレベルは注射後２４時間以内に処置前のレベルまで上昇した。グルコース：組換え型レプチンを摂取したマウスと遺伝子治療の処置を受けたマウスにおいて、血漿中のグルコースレベルも測定した。両群で、処置後６−９日以内にグルコースレベルが低下した。組換え型蛋白処置マウスは、やせた野生型マウスで認められるのと同等のレベルまでは達せず、また１週間未満しか低いレベルを維持しなかった。これに対し、遺伝子治療を受けたマウスは、グルコースレベルが野生型のやせたマウスのレベルまで低下し、少なくとも２週間この低いレベルを維持した。これは図８に示されている。本発明をよりよく例示するため、以下の非制限的実施例を示す。実施例１レプチンのクローニングと発現ＪｅｆｆｅｒｓｏｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙから２つのＰＣＲｃＤＮＡ増幅断片を入手した（どちらもＣｌｏｎｔｅｃｈファージヒト視床下部ライブラリーからの変異体をクローニングして作製された）：ヒトレプチンをコードするものと、グルタミンを含むヒトレプチン変異体をコードするもの（Ｚｈａｎｇら、１９９４，Ｎａｔｕｒｅ３７２：４２５；Ｃｏｎｓｉｄｉｎｅら、１９９５Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９５：２９８６）。クローニングを目的として２つのＰＣＲ断片を増幅した。２つのプライマーをデザインし、ＧＩＢＣＯＢＲＬＣｕｓｔｏｍＰｒｉｍｅｒｓから入手した：正プライマー：ＡＴＧＣＡＴＴＧＧＧＧＡＡＣＣＣＴＧＴＧ逆プライマー：ＴＣＡＧＣＡＣＣＣＡＧＧＧＣＴＧＡＧＧＴ該プライマーを用いて次のようにｃＤＮＡを再増幅した：各プライマー２μｌ（０．３μｇ／μｌ原液）、ｄＮＴＰ２μｌ（１０μＭ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、１０ＸＰＣＲ緩衝液１０μｌ（ＥｘｐａｎｄＬｏｎｇＴｅｍｐｌａｔｅＰＣＲＳｙｓｔｅｍＫｉｔ，ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍからの緩衝液２）、Ｔａｑポリメラーゼ２μｌ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）、テンプレートＤＮＡ３μｌおよび水１８μｌ。ＰＣＲサイクリングの条件は次の通りであった：最初に（Ｔａｑ酵素を加えずに）９４℃で１−２分間混合物をインキュベートし、次に各試験管にＴａｑを加えて、９４℃で３０秒間、４５℃で４５秒間および７２℃で１分間の２０サイクルで、サイクリングプログラムを開始した。２０回の増幅の終了時に、サンプルを７２℃で７分間インキュベートした。各々の場合に（ヒトレプチン−ｈＯｂ、グルタミンを含むヒトレプチン−ｈＯｂＧＬＮ）予想される断片の大きさはそれぞれ５０１と５０４であった。ＰＣＲ増幅した断片をｐＣＲ−ＳｃｒｉｐｔＳＫ（＋）プラスミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にクローン化し、選択したいくつかの細菌コロニーを増殖させ、プラスミドを抽出して配列決定し、クローン化された２つの正しい配列を確認した。次に挿入部分を使用して組換え型アデノウイルスシャトルベクターを作製した。この試験で用いたアデノウイルスベクターは、レプチン遺伝子挿入部分を除いて基本的に、参照してここに組み込まれる、Ｍｏｒｓｅｙら、１９９３Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９２：１５８０−８６に述べられているものと同じである。ＢａｙｌｏｒＣｏｌｌｅｇｅｏｆＭｅｄｉｃｉｎｅから入手したｐｄｅｌＥ１ｓｐ１ＣＭＶ−ＢＧＨｐＡアデノウイルスシャトルベクターを２つの挿入部分（ｈＯｂとｈＯｂＧＬＮ）のクローニングに使用した。同様にｍＯｂｃＤＮＡ（Ｚｈａｎｇら、１９９４Ｎａｔｕｒｅ３７２：４２５）をｐｄｅｌＥ１ｓｐ１ＣＭＶ−ＢＧＨｐＡに挿入した。３つのシャトル全部（ｐｄｅｌＥ１ｓｐ１ＣＭＶ−ｍＯｂ−ＢＧＨｐＡ、ｐｄｅｌＥ１ｓｐ１ＣＭＶ −ｈＯｂ−ＢＧＨｐＡおよびｐｄｅｌＥ１ｓｐ１ＣＭＶ−ｈＯｂＧＬＮ−ＢＧＨｐＡ）を、ウエスタンブロット分析によりレプチン発現に関して試験した。実施例２上記の実施例からの３つのシャトルベクターを、欠損Ｅ１欠失アデノウイルスベクターのレスキュー複製において使用する。Ｍｉｃｒｏｂｉｘから市販されている２９３細胞、継代２７−３０を、トランスフェクションの１日前に６０ｍｍディッシュで調製（ｓｅｔｕｐ）し、使用時には約７０−８０％の集密性であった。シャトルプラスミドのひとつを含む平板を作製し、ｐＪＭ１７；ｐＦＧ１４０（ＭｉｃｒｏｂｉｘＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓＩｎｃ．から購入した）をトランスフェクションの効率に関する陽性対照として使用した。プラークを同定し、滅菌ガラスパスツールピペットを用いてアガロースオーバーレイから充填した。充填した各々のプラークを１０％グリセロール中のＰＢＳ（カルシウムとマグネシウムを含む）１００−５００μｌに懸濁し、−８０℃で凍結して解凍した（１− ３回）。次に解凍したプラークを用いて２９３細胞の９０％集密６ｃｍ平板に感染させ、分離したウイルスを増殖させた。感染後５−８日で、該細胞に関して細胞障害作用（ｃｐｅ）が明らかになった（細胞は円形化し、培地中で分離して浮遊し始めた）。擦過して細胞を採集し、ウエスタン分析によりレプチン発現に関して試験し、さらに抽出したＤＮＡのＨｉｎｄＩＩＩ消化と臭化エチジウム染色したゲルの分析によりＤＮＡ制限パターンに関して試験した。レプチン分泌と正しいＤＮＡ制限パターンに基づいて同定した陽性プラークのひとつを選択し、２回目のプラーク精製とその後の同様の増殖と分析工程に使用した。２回目のプラーク精製後、ウイルスを大規模増殖させた。セシウムバンド法と力価測定を用いて精製し、定量した。得られた力価測定ウイルス株（Ａｄ−ＨＣＭＶ−ｍＯｂ−ＢＧＨ^PA、Ａｄ−ＨＣＭＶ−ｈＯｂ−ＢＧＨ^PAおよびＡｄ−ＨＣＭＶ−ｈＯｂＧＬＮ−ＢＧＨ^PA）を使用時まで−８０℃で保存した。実施例３トランスジェニックマウス基線測定３つの群のマウスを使用した：ｏｂ／ｏｂ、ｄｂ／ｄｂ、やせ型（野生型、対照）。すべての群のマウスを、到着日あるいは到着の翌日から粉砕げっ歯類飼料（５００８）で飼育した。摂食量も測定した。粉砕飼料での飼育の約４日後に、マウスの体重を測定し、グルコースとインシュリンの血漿レベルを定量するため採血した。基線測定の開始から８日後に注射を開始したが、注射に先立ってマウスの体重を測定し、血漿グルコースおよびインシュリンの定量のためすべての被検マウスから血液サンプルを採取した。血漿中のレプチンレベルも定量した。マウスを各々のケージに５匹ずつ収容し、粉砕ＰｕｒｉｎａＣｈｏｗ５００８を蓋のついた給餌コップに入れて与えた。２４時間の摂食量を毎日同じ時間に測定した。摂食量がかなり一定なレベル、通常２０−２５グラム飼料／５匹のマウス−日に安定した後、ウイルスを注射した。注射の当日、注射に先立って午前中に摂食量、体重を測定し、尾の切断した末端から基線血液サンプルを採取した。血液をヘパリン加毛細管に採集した（総容量約７０−１００μｌ）。ヘマトクリットを測定し、血漿を採集した。マウスに次のように注射した：Ａ．ｏｂ／ｏｂマウス群：ｉｖ注射、５匹のマウス／群１群は、尾静脈に２．７５×１０⁸／ｇｍ体重のＡｄＨＣＭＶ−ｈｏｂ−ＢＧＨｐＡ（透析緩衝液５００μｌ中）を摂取した。２群は、尾静脈に２．７５×１０⁸／ｇｍ体重のＡｄＨＣＭＶ−βｇａｌレポーター（透析緩衝液５００μｌ中）を摂取した。３群は、尾静脈に透析緩衝液５００μｌを摂取した。４群は、１ｍｇ／ｋｇ体重の活性レプチンのＩＰ注射を５日間毎日受けた。Ｂ．ｄｂ／ｄｂマウス群：ｉｖ注射、５匹のマウス／群１群は、尾静脈に２．７５×１０⁸／ｇｍ体重のＡｄＨＣＭＶ−ｈｏｂ−ＢＧＨｐＡ（透析緩衝液５００μｌ中）を摂取した。２群は、尾静脈に２．７５×１０⁸／ｇｍ体重のＡｄＨＣＭＶ−βｇａｌレポーター（透析緩衝液５００μｌ中）を摂取した。３群は、１ｍｇ／ｋｇ体重の活性レプチンのＩＰ注射を５日間毎日受けた。Ｃ．やせ型対照マウス群：やせ型パラメータの測定として５匹のマウスの１ケージ注射なし。実施例４レプチン受容体レプチン遺伝子をレプチン受容体遺伝子に置き換えることを除いて、実施例２ −３で述べたのと同様にしてアデノウイルスベクターを作製する。ｏｂ／ｏｂマウスの代わりにｄｂ／ｄｂマウスを使用する。ｄｂ／ｄｂマウスについての結果は、本文中で報告したｏｂ／ｏｂマウスに関して認められたものと同様である。注射後、グルコースレベルは低下し、インシュリンレベルも低下し、マウスは体重減少する。対照マウスおよびレプチン受容体遺伝子を持つベクターを注射したｏｂ／ｏｂマウスでは作用は全く認められない。発明の詳細な説明適用なし

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＣＡ，ＪＰ，ＵＳ (72)発明者クー，ミン・チヨンアメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカーン・アベニユー・126 (72)発明者チヤオ，チンアメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカーン・アベニユー・126 (72)発明者カースキー，シー・トーマスアメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカーン・アベニユー・126

Claims

【特許請求の範囲】１．肥満を治療する、血清グルコースレベルを低下させる、あるいは血清インシュリンレベルを低下させる治療法を必要とする哺乳類において、肥満調節遺伝子を該哺乳類に供給送達することを含む、肥満を治療する、血清グルコースレベルを低下させる、あるいは血清インシュリンレベルを低下させる方法であって；該遺伝子の転写と翻訳がｉｎｖｉｖｏで起こることを特徴とする方法。２．肥満を治療する、血清グルコースレベルを低下させる、あるいは血清インシュリンレベルを低下させる治療法を必要とする哺乳類において、レプチンをコードする遺伝子を該哺乳類に供給送達することを含む、肥満を治療する、血清グルコースレベルを低下させる、あるいは血清インシュリンレベルを低下させる方法であって；レプチンをコードする遺伝子の転写と翻訳がｉｎｖｉｖｏで起こることを特徴とする方法。３．レプチンをコードする異種遺伝子をベクター中において供給送達する、請求項２に記載の方法。４．ベクターがアデノウイルスである請求項３に記載の方法。５．アデノウイルスが肝において発現される請求項４に記載の方法。６．哺乳類がヒトである請求項１に記載の方法。７．ａ）レプチン受容体をコードする遺伝子を含むウイルスベクターで哺乳類をトランスフェクションする；該ベクターはさらに、哺乳類組織においてその発現を調節する少なくとも１個の因子を含む；およびｂ）レプチン受容体遺伝子の転写と翻訳のために十分な時間を経過させる；からなる少なくとも一部には哺乳類によって産生されるレプチン受容体の量の不足によるものである肥満を治療する方法。８．ベクターがウイルスベクターである請求項７に記載の方法。９．ベクターがアデノウイルスである請求項８に記載の方法。１０．アデノウイルスが肝において発現される請求項９に記載の方法。１１．哺乳類がヒトである請求項１０に記載の方法。１２．レプチン受容体をコードする遺伝子を含むベクターであり、さらに、哺乳類組織においてその発現を調節する少なくとも１個の因子を含む事を特徴とするベクター。１３．ベクターがアデノウイルスである請求項７に記載の方法。