JP2001520004A

JP2001520004A - ミント（Ｍｅｎｔｈａｐｉｐｅｒｉｔａ）由来ゲラニル二リン酸シンターゼ

Info

Publication number: JP2001520004A
Application number: JP2000516013A
Authority: JP
Inventors: ロドニービー．クロティーウ，; マークアール．ワイルダング，; チャールズシー．バーク，; ジョナサンガーシェンゾン，
Original assignee: ワシントンステイトユニバーシティリサーチファウンデイション
Priority date: 1997-10-16
Filing date: 1998-10-15
Publication date: 2001-10-30
Also published as: EP1023436A1; WO2001029188A1; WO1999019460A1; EP1023436A4; US6303330B1; NZ503964A; CA2306207A1; AU1089099A; AU741393B2; US5876964A

Abstract

(57)【要約】ペパーミント由来のゲラニル二リン酸シンターゼをコードするｃＤＮＡが、単離および配列決定され、そして対応するアミノ酸配列が決定された。従って、ペパーミント（Ｍｅｎｔｈａｐｉｐｅｒｉｔａ）由来のゲラニル二リン酸シンターゼ（配列番号２）の発現をコードする単離されたＤＮＡ配列（配列番号１）が提供される。他の局面において、ゲラニル二リン酸シンターゼまたはそれとのハイブリダイゼーションが可能なゲラニル二リン酸シンターゼＤＮＡまたはＲＮＡの少なくとも一部に十分に相補的な塩基配列（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応プライマーとして、またはゲラニル二リン酸シンターゼもしくは関連遺伝子についてのプローブとして有用な、アンチセンスゲラニル二リン酸シンターゼＲＮＡもしくは相補的ゲラニル二リン酸シンターゼＤＮＡのフラグメント）をコードする複製可能組換えクローニングビヒクルが提供される。さらに別の局面において、ゲラニル二リン酸シンターゼをコードする組換えクローニングビヒクルおよび／またはＤＮＡ配列で、形質転換され、トランスフェクトされ、感染され、ならびに／あるいは注入された、改変宿主細胞が提供される。従って、後の使用のための組換えゲラニル二リン酸シンターゼの有意な量の産生、単離および精製を容易にするため、モノテルペノイドの産生を増強するために、植物においてゲラニル二リン酸シンターゼの発現または増強された発現を得るため、抗癌特性を有するモノテルペノイドの前駆体として癌性細胞においてゲラニル二リン酸を産生するために使用され得るか、あるいは、さもなければ、ゲラニル二リン酸シンターゼの調節もしくは発現またはゲラニル二リン酸の産生のために使用され得る、ゲラニル二リン酸シンターゼの組換え発現のための系および方法が提供される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（発明の分野）本発明は、ゲラニル二リン酸シンターゼ（例えば、Ｍｅｎｔｈａｐｉｐｅｒ
ｉｔａ由来のゲラニル二リン酸シンターゼ）をコードする核酸配列、ならびにそ
の配列を含むベクター、その配列を含む宿主細胞、および組換えゲラニル二リン
酸シンターゼおよびそれらの変異体を産生する方法に関する。

【０００２】（発明の背景）ゲラニル二リン酸シンターゼ（ＧＰＰシンターゼ）は、Ｃ₅伸長反応を触媒して種々のテルペノイドファミリーの線状（非環式）前駆体を形成する、プレニル
トランスフェラーゼと呼ばれる酵素のファミリーの１つである。ＧＰＰシンター
ゼは、ジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）およびイソペンテニル二リン酸（
ＩＰＰ）の縮合を触媒して、モノテルペンの中間体Ｃ₁₀非環式前駆体であるゲラ
ニル二リン酸（ＧＰＰ）を形成する（Ｗｉｓｅ，Ｍ．Ｌ．およびＣｒｏｔｅａｕ
，Ｒ、Ｃａｎｅ，Ｄ．Ｅ．編、「ＣｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅＮａｔｕｒａ
ｌＰｒｏｄｕｓｔｓＣｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｉｓｏｐｒｅｎｏｉｄｓ，第２巻
」、ＥｌｓｅｖｉｅｒＳｃｉｅｎｃｅ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９９７（印刷中
））（図１）。ファルネシル二リン酸シンターゼ（ＦＰＰシンターゼ）（関連プ
レニルトランスフェラーゼ）は、ＧＰＰおよびＩＰＰを基質として利用して、フ
ァルネシル二リン酸（ＦＰＰ）（これは、セスキテルペンテンの中間体Ｃ₁₅前駆
体である）を形成する（図１）。別のプレニルトランスフェラーゼであるゲラニ
ルゲラニル二リン酸シンターゼ（ＧＧＰＰシンターゼ）は、ファルネシル二リン
酸およびＩＰＰの縮合を触媒して、ゲラニルゲラニル二リン酸（ＧＧＰＰ）（こ
れは、ジテルペンファミリーの中間体Ｃ₂₀前駆体である）を形成する（図１）。
プレニルトランスフェラーゼのほかのタイプは、ＧＧＰＰおよびＩＰＰを基質と
して利用して、非常に長鎖の分子（例えば、天然ゴム）を形成し得る。Ｐｏｕｌ
ｔｅｒＣ．Ｄ．およびＲｉｌｌｉｎｇ，Ｈ．Ｃ．，Ａｃｃｔｓ．Ｃｈｅｍ．
Ｒｅｓ．１１：３０７−３１３（１９７８）；Ｓｃｏｌｉｎｋ，Ｐ．Ａ．およ
びＢａｒｔｌｅｙ，Ｇ．，ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．１４：
３０５，３０７（１９９６）。

【０００３】これらのプレニルトランスフェラーゼの全てについての基本的な反応機構は同
じであり、そして３つの工程から構成される（図２を参照のこと。ここで、ゲラ
ニル二リン酸シンターゼによって触媒される反応は、一般的な反応機構の例示と
して示される）。図２を参照して、第１工程では、アリル二リン酸エステル（２
ａ）は、安定なカルボニウムイオンに（２ｂ）にイオン化される。次いで、この
カルボニウムイオンは、イソペンテニル二リン酸（２ｃ）の二重結合を攻撃して
、別のカルボニウムイオン（２ｄ）を生成する。このサイクルの最終工程では、
プロトンが、新たに形成されたカルボニウムイオン（２ｄ）から排除されて、新
たなアリルの二重結合を含むテルペノイド（２ｅ）を形成する。ＧＰＰシンター
ゼによって触媒される反応では、アリル二リン酸エステルは、ジメチルアリル二
リン酸である（図１および図２）。ＦＰＰシンターゼおよびＧＧＰＰシンターゼ
によって触媒される反応では、アリル二リン酸エステルは、それぞれ、ゲラニル
二リン酸およびファルネシル二リン酸である（図１）。

【０００４】ＦＰＰシンターゼおよびＧＧＰＰシンターゼ（これらは、中間体としてＧＰＰ
そ産生し、そしてほぼ編在性である（Ｑｇｕｒａ，Ｋ．およびＫｏｙａｍａ，Ｔ
．，Ｏｇｕｒａ，Ｋ．およびＳａｎｋａｗａ，Ｕ．編、「ＤｙｎａｍｉｃＡ
ｓｐｅｃｔｓｏｆＮａｔｕｒａｌＰｒｏｄｕｃｔｓＣｈｅｍｉｓｔｒｙ
」Ｋｏｄａｎｓｈａ／ＨａｒｗｏｏｄＡｃａｄｅｍｉｃＰｕｂｌｉｓｈｅ
ｒｓ，Ｔｏｋｙｏ，１−２３頁、１９９７）とは異なり、ゲラニル二リン酸シ
ンターゼは、豊富な量のモノテルペンを産生する植物種に大きく制限される。Ｆ
ＰＰシンターゼおよびＧＧＰＰシンターゼは両方とも、ＦＰＰおよびＧＧＰＰへ
の経路上での遊離中間体として無視できるレベルのＧＰＰのみを産生する（Ｏｇ
ｕｒａ，Ｋ．およびＫｏｙａｍａ，Ｔ．（前出））ので、一次代謝とモノテルペ
ン生合成との間の重大な関係を提供し、そしてモノテルペン生合成の本質的な駆
動者として働くのは、ゲラニル二リン酸シンターゼである（Ｗｉｓｅ，Ｍ．Ｌ．
およびＣｒｏｔｅａｕ，Ｒ．（前出））。

【０００５】それゆえ、モノテルペン産生（精油）種の収率を増加するか、またはモノテル
ペン生合成経路とを任意の非産生種（例えば、農作物、果実を有する植物種、お
よび動物）に遺伝子操作する組換え方法を開発する任意の試みは、ゲラニル二リ
ン酸シンターゼ遺伝子またはｃＤＮＡクローンへの接近を必要とする。選択され
たモノテルペンシンターゼ（例えば、（−）−リモネンシンターゼ（Ｃｏｌｂｙ
ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．ＣＨｅｍ．２６８：２３０１６−２３０２４，１９９３）
および任意の続く経路の酵素とのゲラニル二リン酸シンターゼの同時発現は、任
意の生存生物における、単純な炭素基質（たとえば、グルコース）からの対応す
るモノテルペン産物の生成を可能にして当然である。

【０００６】モノテルペンは、食品における香味剤として、および香水における香りとして
利用される（Ａｒｃｔａｎｄｅｒ，Ｓ．，ＰｅｒｆｕｍｅａｎｄＦｌａｖ
ｏｒＭａｔｅｒｉａｌｓｏｆＮａｔｕｒａｌＯｒｉｇｉｎ，Ａｒｃｔ
ａｎｄｅｒＰｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｅｌｉｚａｂｅｔｈ，ＮｅｗＪ
ｅｒｓｅｙ；Ｂｅｄｏｕｋｉａｎ，Ｐ．Ｚ．ＰｅｒｆｕｍｅｒｙａｎｄＦ
ｌａｖｏｒｉｎｇＭａｔｅｒｉａｌｓ，第４版、ＡｌｌｕｒｅｄＰｕｂｌｉ
ｃａｔｉｏｎｓ，Ｗｈｅａｔｏｎ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ，１９９５；Ａｌｌｕｒｅ
ｄ，Ｓ．ＦｌａｖｏｒａｎｄＦｒａｇｒａｎｃｅＭａｔｅｒｉａｌｓ，
ＡｌｌｕｒｅｄＰｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｗｈｅａｔｏｎ，Ｉｌｌｉｎｏ
ｉｓ，１９９７）。モノテルペンはまた、種々の工業プロセスにおいて中間体と
して使用される。Ｄａｗｓｏｎ，Ｆ．Ａ．、ＴｈｅＡｍａｚｉｎｇＴｅｒｐ
ｅｎｅｓ，ＮａｖａｌＳｔｏｒｅｓＲｅｖ．，Ｍａｒｃｈ／Ａｐｒｉｌ
，６−１２，１９９４。モノテルペンはまた。ペストおよび病原体に対する植物
の天然の防御系に関係する。Ｆｒａｎｃｋｅ，Ｗ．、Ｍｕｌｌｅｒ，Ｐ．Ｍ．お
よびＬａｍｐａｒｓｋｙ、Ｄ．編、Ｐｅｒｆｕｍｅｓ：Ａｒｔ，Ｓｃｉｅｎｃｅ
ａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＥｌｓｅｖｉｅｒＡｐｐｌｉｅｄＳｃ
ｉｅｎｃｅ，ＮＹ，ＮＹ，６１−９９，１９９１；Ｈａｒｂｏｒｎｅ，Ｊ．Ｂ
．、Ｈａｒｂｏｒｎｅ，Ｊ．Ｂ．およびＴｏｍａｓ−Ｂａｒｂｅｒａｎ，Ｆ．Ａ
．編、ＥｃｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＢｉｏｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙｏｆＰｌａｎｔＴｅｒｐｅｎｏｉｄｓ，Ｃｌａｒｅｎｄｏｎ
Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，３９９−４２６，１９９１；Ｇｅｒｓｈｅｎｚｏｎ
，Ｊ．およびＣｒｏｔｅａｕ，Ｒ．、Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ，Ｇ．Ａ．およびＢｅ
ｒｅｎｂａｕｍ，Ｍ．Ｒ．編、Ｈｅｒｂｉｖｏｒｅｓ：ＴｈｅｉｒＩｎｔｅｒ
ａｃｔｉｏｎｓｗｉｔｈＳｅｃｏｎｄａｒｙＰｌａｎｔＭｅｔａｂｏｌ
ｉｅｓ，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，１６８−２
２０，１９９１。

【０００７】モノテルペンが癌の予防および処置に有効であるという実質的な証拠もまた存
在する（Ｅｌｓｏｎ，Ｃ．Ｅ．およびＹｕ，Ｓ．Ｇ．，Ｊ．Ｎｕｔｒ．１２４
：６０７−６１４，１９９４）。従って、例えば、リモネン、ペリリルアルコー
ル（ｐｅｒｒｉｌｙｌａｌｃｏｈｏｌ）およびゲラニオールは、各々、非常に
広範な範囲の哺乳動物癌に対する化学治療活性を有することが示されている（例
えば、（１）リモネン、Ｅｌｅｇｂｅｄｅら、Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ
５：６６１−６６５、１９８４；Ｅｌｓｏｎら、Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ
９：３３１−３３２，１９８８；Ｍａｌｔｚｍａｎら、Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎ
ｅｓｉｓ１０：７８１−７８５，１９８９；Ｗａｔｔｅｎｂｅｒｇ，Ｌ．Ｗ．
およびＣｏｃｃｉａ，Ｊ．Ｂ．，Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ１２：１１
５−１１７，１９９１；Ｗａｔｔｅｎｂｅｒｇ，Ｌ．Ｗ．およびＣｏｃｃｉａ，
Ｊ．Ｂ．，Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ１２：１１５−１１７，１９９１
；Ｈａａｇら、ＣａｎｃｅｒＲｅｓ５２：４０２１−４０２６，１９９２；
Ｃｒｏｗｅｌｌ，Ｐ．Ｌ．およびＧｏｕｌｄ，Ｍ．Ｎ．，ＣＲＣＣｒｉｔ．
Ｒｅｖ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅｓｉｓ５：１−２２，１９９４；（２）ペリリルア
ルコール、Ｍｉｌｌｓら、ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．５５：９７９−９８３，１
９９５；Ｈａａｇ，Ｊ．Ｄ．およびＧｏｕｌｄ，Ｍ．Ｎ．，ＣａｎｃｅｒＣ
ｈｅｍｏｔｈｅｒ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．３４：４７７−４８３，１９９４；
Ｓｔａｒｋら、ＣａｎｃｅｒＬｅｔｔ．９６：１５−２１，１９９５、なら
びに（３）ゲラニオール、Ｓｈｏｆｆら、ＣｅｎｃｅｒＲｅｓ．５１：３７
−４２，１９９１；Ｙｕら、Ｊ．Ｎｕｔｒ．１２５：２７６３−２７６７，１
９９５；Ｂｕｒｋｅら、Ｌｉｐｉｄｓ３２：１５１−１５６，１９９７を参照
のこと）。

【０００８】癌細胞は、同源のモノテルペンシンターゼタンパク質を癌細胞に標的すること
によって、またはモノテルペンシンターゼ遺伝子を癌細胞に導入することによっ
て、抗癌特性を有するモノテルペンの治療的な量を産生するように改変され得る
。しかし、癌治療に対するこのアプローチは、ゲラニル二リン酸シンターゼの自
然分布が、モノテルペンの豊富な量を産生する植物種に非常に制限されるという
事実によって複雑化する。従って、動物細胞は、モノテルペン前駆体ゲラニル二
リン酸を天然には産生しない。結果的に、癌細胞が抗癌特性を有する内在性モノ
テルペンを産生するように遺伝子操作することは、ゲラニル二リン酸シンターゼ
をコードする遺伝子を、抗癌特性を有するモノテルペンを産生するモノテルペン
シンターゼをコードする遺伝子とともに導入する必要がある。同様に、タンパク
質ターゲッティングアプローチが利用される場合、ゲラニル二リン酸シンターゼ
タンパク質およびモノテルペンシンターゼタンパク質の両方が、癌細胞に標的化
されなければならない。

【０００９】標準的なタンパク質ターゲッティング技術は、ゲラニル二リン酸シンターゼを
、モノテルペンシンターゼ（例えば、リモネンシンターゼ）とともに、腫瘍に対
する特異的ターゲッティングを伴って動物細胞に導入するために使用され得る（
Ｃｏｌｂｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２３０１６−２３０２４，
１９９３）。例えば、Ｗｅａｒｌｅｙ、Ｌ．Ｌ．，ＣｒｉｔｉｃａｌＲｅｖ
ｉｅｗｓｉｎＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃＤｒｕｇＣａｒｒｉｅｒＳｙｓ
ｔｅｍｓ，８（４）：３３１−３９４，１９９１；Ｓｈｅｌｄｏｎ，Ｋら、Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９２（６）：２０５６−２０６
０，１９９５を参照のこと。さらに、標準的な遺伝子治療技術は、ＧＰＰシンタ
ーゼ遺伝子およびモノテルペンシンターゼ遺伝子を、抗癌特性を有するモノテル
ペンの内因性合成のために癌性細胞にターゲッティングするために使用され得る
。遺伝子ターゲッティング技術の概説については、以下を参照のこと；Ｍａｈａ
ｔｏＲ．Ｉら、ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈ１４（７
）：８５３−８５９，１９９７；Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ，Ｆ．Ｍ．およびＭｅｒｔ
ｅｌｓｍａｎｎ、Ｒ．，Ｏｎｋｏｌｏｇｉｅ２０（１）：２６−３４，１９９
７；Ｂｕｃｋｅｌ，Ｐ．，ＴｒｅｎｄｓｉｎＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａ
ｌＳｃｉｅｎｃｅ１７（１２）：４５０−４５６，１９９６；Ｒｏｔｈ，Ｊ
．Ａ．およびＣｒｉｓｔｉａｎｏ，Ｒ．Ｊ．，Ｊ．Ｎａｔ’ｌＣａｎｃｅｒ
Ｉｎｓｔ．８９（１）：２１−３９，１９９７；Ｌｅｄｌｅｙ，Ｆ．Ｄ．，
ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈ１３（１１）：１５９５
−１６１４，１９９６。

【００１０】今日までに、ゲラニル二リン酸シンターゼ活性を含む抽出物は、以下を含むい
くつかの植物供給源から単離されている：ブドウ（Ｃｌａｓｔｒｅら、Ｐｌａｎ
ｔＰｈｙｓｉｏｌ．１０２：２０５−２１１，１９９３）；ゼラニウム（Ｓｕ
ｇａ，Ｔ．およびＥｎｄｏ，Ｔ．，Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３０：１７
５７−１７６１，１９９１）；セージ（Ｃｒｏｔｅａｕ，Ｒ．およびＰｕｒｋｅ
ｔｔ，Ｐ．Ｔ．，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ，２７１：５２４
−５３５，１９８９）およびＬｉｔｈｏｓｐｅｒｍｕｍ（Ｈｅｉｄｅ，Ｌ．およ
びＢｅｒｇｅｒ，Ｕ．，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２７３：
３３１−３３８，１９８９）。ブドウからの酵素のみが、均一に精製されている
（Ｃｌａｓｔｒｅら（前出））。

【００１１】表１は、いくつかの種から単離されたゲラニル二リン酸シンターゼの限定され
た利用可能な物理的および化学的特徴を要約する。

【００１２】

【表１】これらのデータは、ゲラニル二リン酸シンターゼの物理的および化学的特性が
、種間で相当変化することを示す。例えば、分子量は、６６ｋＤａ（ブドウ）か
ら１００ｋＤａ（セージ）まで変化する。同様に、Ｌｉｔｈｏｓｐｅｒｍｕｍか
ら単離されたゲラニル二リン酸シンターゼの等電点は、４．９５であるのに対し
て、ミントゲラニル二リン酸シンターゼの「偽成熟（ｐｓｅｕｄｏｍａｔｕｒｅ
）」形態（すなわち、アミノ末端から最初の４８アミノ酸が欠失されているクロ
ーンＭ１３．１８のｃＤＮＡインサートによってコードされるタンパク質）は、
５．４２の等電点を有する。異なる種から単離されたゲラニル二リン酸シンター
ゼの物理的および化学的特性におけるこの変動は、公開された精製プロトコルが
、各々、互いに有意に異なるという事実に反映される。

【００１３】ゲラニル二リン酸シンターゼについてのアミノ酸配列データは、当該分野では
報告されていない。植物由来のＦＰＰシンターゼおよびＧＧＰＰシンターゼをコ
ードするいくつかのＤＮＡ配列が利用可能である（Ｓｃｏｌｎｉｋ，Ｐ．Ａ．お
よびＢａｒｔｌｅｙ，Ｇ．Ｅ．，ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｏｒｔ
１４：３０５−３１９，１９９６）が、ゲラニル二リン酸シンターゼについて
の遺伝子は、これまでに報告されていない。

【００１４】（発明の要旨）前述に従って、ペパーミント由来のゲラニル二リン酸シンターゼをコードする
ｃＤＮＡは、単離および配列決定されており、そして対応するアミノ酸配列が推
定されている。従って、本発明は、単離された組換えゲラニル二リン酸シンター
ゼタンパク質、およびその部分、ゲラニル二リン酸シンターゼの発現をコードす
る単離されたＤＮＡ配列、およびその部分（例えば、ペパーミント（Ｍｅｎｔｈ
ａｐｉｐｅｒｉｔａ）由来のゲラニル二リン酸シンターゼ（配列番号２）をコ
ードする配列番号１に示される配列）に関する。他の局面において、本発明は、
核酸配列、例えば、ゲラニル二リン酸シンターゼまたはそれとのハイブリダイゼ
ーションが可能なゲラニル二リン酸シンターゼＤＮＡまたはＲＮＡの少なくとも
一部に有意に相補的な塩基配列（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応プライマーとし
て、またはゲラニル二リン酸シンターゼもしくは関連遺伝子についてのプローブ
として有用な、アンチセンスゲラニル二リン酸シンターゼＲＮＡもしくは相補的
ゲラニル二リン酸シンターゼＤＮＡのフラグメント）をコードするＤＮＡ配列を
含む、複製可能組換えクローニングビヒクルに関する。本発明のさらに他の局面
において、本発明の組換えクローニングビヒクルおよび／もしくはＤＮＡ配列で
、形質転換された、トランスフェクトされた、感染された、ならびに／または注
入された、改変宿主細胞が提供される。従って、本発明は、ゲラニル二リン酸シ
ンターゼの組換え発現を提供する。本明細書中に記載される発明性概念（ｉｎｖ
ｅｎｔｉｖｅｃｏｎｃｅｐｔ）は、後の使用のための組換えゲラニル二リン酸
シンターゼの産生、単離、および有意な量の精製を容易にするため、植物、微生
物または動物におけるゲラニル二リン酸シンターゼの発現または増強された発現
を得るために使用され得るか、あるいははさもなければ、ゲラニル二リン酸シン
ターゼの調節または発現が、ゲラニル二リン酸シンターゼの産生または酵素産物
であるゲラニル二リン酸もしくはその誘導体について所望される環境において使
用され得る。

【００１５】本発明のさらに別の局面において、癌を処置するための方法が提供される。こ
の方法は、ゲラニル二リン酸シンターゼタンパク質を、ゲラニル二リン酸を抗癌
特性を有するモノテルペンに転換し得るモノテルペンシンターゼタンパク質とと
もに、癌細胞に導入する工程を包含する。あるいは、ゲラニル二リン酸シンター
ゼタンパク質およびモノテルペンシンターゼタンパク質をコードする（すなわち
、ゲラニル二リン酸を抗癌特性を有するモノテルペンに変換し得る）核酸配列が
、癌細胞に導入される。

【００１６】本発明の前述の局面および多くの付帯する利点は、添付の図面と組み合わせた
場合に、以下の詳細な説明を参照することによって、より理解される。

【００１７】（好ましい実施態様の詳細な説明）本明細書中で使用される用語「アミノ酸」とは、全ての天然に存在するＬ−α
−アミノ酸またはその残基をいう。このアミノ酸は、一文字表記または三文字表
記のいずれかによって同定される：

【００１８】

【数１】本明細書中で使用される用語「ヌクレオチド」とは、糖部分（ペントース）、
ホスフェートおよび窒素複素環式塩基を含むＤＮＡまたはＲＮＡのモノマー単位
を意味する。この塩基は、グリコシド炭素（ペントースの１’炭素）を介して糖
部分に結合し、そして塩基と糖の組み合わせは、ヌクレオシドと称される。この
塩基は、アデニン（「Ａ］）、グアニン（「Ｇ」）、シトシン（「Ｃ」）および
チミン（「Ｔ」）であるＤＮＡの４つの塩基を用いてヌクレオチドを特徴付ける
。イノシン（「Ｉ」）は、４つの天然に存在する塩基（Ａ、Ｃ、ＧまたはＴ）の
いずれかを置換するために使用され得る合成の塩基である。この４つのＲＮＡ塩
基は、Ａ、Ｇ、Ｃおよびウラシル（「Ｕ」）である。本明細書中に記載されるヌ
クレオチド配列は、隣接するペントースの３’炭素と５’炭素との間のホスホジ
エステル結合によって接続されるヌクレオチドの線状アレイを含む。

【００１９】用語「パーセント同一性」（％Ｉ）とは、２つのアミノ酸配列または２つの核
酸配列が並行して整列される場合に、同じ相対位置を占有するアミノ酸またはヌ
クレオチドの割合を意味する。

【００２０】用語「パーセント類似性」（％Ｓ）とは、２つの比較されたタンパク質配列の
関連性の程度の統計学的測定である。パーセント類似性は、化学的類似性（例え
ば、比較されたアミノ酸が、酸性、塩基性、疎水性、芳香族などであるかどうか
）および／または一対の比較されるアミノ酸の１つのメンバーをコードするコド
ンをその対のほかのメンバーをコードするコドンに変換するに必要な塩基対変化
の最小数によって測定される進化的距離に基づいてアミノ酸の各比較される対に
対する数値を割り当てる、コンピュータープログラムによって計算される。計算
は、２つの配列のベストフィットアラインメントが、すべての可能なアラインメ
ントの反復性比較によって経験的になされた後になされる（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，
Ｓ．およびＨｅｉｎｋｏｆｆ，Ｊ．Ｇ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：１０９１５−１０９１９，１９９２）。

【００２１】本明細書中で示されるように、パーセント同一性およびパーセント類似性の値
は、本明細書中に開示されるＭｅｎｔｈａＧＰＰシンターゼ（配列番号２）と
ＧＧＰＰシンターゼとの間のアミノ酸レベルで、本明細書中に開示されるＭｅｎ
ｔｈａＧＰＰシンターゼの推定アミノ酸配列（配列番号２）と表２に示される
ＧＧＰＰシンターゼとの間でなされた個々の対になった比較から得られる値の平
均である。同様に、本明細書中に示されるように、パーセント同一性およびパー
セント類似性の値は、本明細書中に開示されるＭｅｎｔｈａＧＰＰシンターゼ
（配列番号２）とＦＰＰシンターゼとの間のアミノ酸レベルで、本明細書中に開
示されるＭｅｎｔｈａＧＰＰシンターゼの推定アミノ酸配列（配列番号２）と
表２に示されるＦＰＰシンターゼとの間でなされた個々の対になった比較から得
られる値の平均である。表２に示される％Ｉおよび％Ｓ値は、ＭｅｎｔｈａＧ
ＰＰシンターゼタンパク質配列（配列番号２）および表２に列挙される配列の各
々の個々の対になった比較から得られた値である。

【００２２】

【表２】「オリゴヌクレオチド」は、リン酸ジエステル結合で連結されたデオキシリボ
ヌクレオチドの短い長さの一本鎖または二本鎖の配列をいう。このオリゴヌクレ
オチドは、既知の方法によって化学合成され、そして例えばポリアクリルアミド
ゲル上で精製される。

【００２３】用語「ゲラニル二リン酸シンターゼ」は、本明細書中では、ジメチルアリル二
リン酸（ＤＭＡＰＰ）およびイソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）を縮合させ、ゲ
ラニル二リン酸（これは、本明細書中で記載のようなモノテルペンの中間体非環
式前駆体である）を形成することを触媒し得る酵素を意味するために使用される
。

【００２４】用語「精油植物（単数または複数）」は、高レベルのモノテルペノイドおよび
／またはセスキテルペノイドおよび／またはジテルペノイド油、ならびに／ある
いは高レベルのモノテルペノイドおよび／またはセスキテルペノイドおよび／ま
たはジテルペノイド樹脂を生産する植物種の群をいう。前出の油および／または
樹脂は、それらを生産する精油植物の新鮮重量の約０．００５％より多くを占め
る。精油および／樹脂は、例えば、Ｅ．Ｇｕｅｎｔｈｅｒ、ＴｈｅＥｓｓｅｎ
ｔｉａｌＯｉｌｓ，第Ｉ−ＶＩ巻、Ｒ．Ｅ．ＫｒｉｅｇｅｒＰｕｂｌｉｓｈ
ｉｎｇＣｏ．、ＨｕｎｔｉｎｇｔｏｎＮ．Ｙ．、１９７５（本明細書中に参
考として援用される）において、より十分に記載されている。精油植物は、以下
を包含するが、これらに限定されない：Ｌａｍｉａｃｅａｅ、以下の種を包含するが、これらに限定されない：Ｏｃｉ
ｍｕｍ（バジル）、Ｌａｖａｎｄｕｌａ（ラベンダー）、Ｏｒｉｇａｎｕｍ（オ
レガノ）、Ｍｅｎｔｈａ（ミント）、Ｓａｌｖｉａ（セージ）、Ｒｏｓｍｅｃｉ
ｎｕｓ（ローズマリー）、Ｔｈｙｍｕｓ（タイム）、ＳａｔｕｒｅｊａおよびＭ
ｏｎａｒｄａ、Ｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒａｅ、以下の種を包含するが、これらに限定されない：
Ｃａｒｕｍ（キャラウェー）、Ａｎｅｔｈｕｍ（デイル）、ｆｅｎｉｃｕｌｕｍ
（ウイキョウ）、およびＤａｕｃｕｓ（ニンジン）、Ａｓｔｅｒａｃｅａｅ（Ｃｏｍｐｏｓｉｔａｅ）、以下の種を包含するが、こ
れらに限定されない：Ａｒｔｅｍｉｓｉａ（タラゴン、ヤマヨモギ）、Ｔａｎａ
ｃｅｔｕｍ（ヨモギギク）、Ｒｕｔａｃｅａｅ（例えば、カンキツ植物）；Ｒｏｓａｃｅａｅ（例えば、バ
ラ）、Ｍｙｒｔａｃｅａｅ（例えば、ユーカリ、ブラシノキ）；Ｇｒａｍｉｎｅ
ａｅ（例えば、Ｃｙｍｂｏｐｏｇｏｎ（コウスイガヤ））；Ｇｅｒａｎａｃｅａ
ｅ（ゼラニウム）；および特定の球果植物（Ａｂｉｅｓ（例えば、カナダバルサ
ム）、Ｃｅｄｒｕｓ（ヒマラヤスギ）、およびＴｈｕｊａおよびＪｕｎｉｐｅｒ
ｕｓを含む）。

【００２５】精油植物の範囲は、Ｅ．Ｇｕｅｎｔｈｅｒ、ＴｈｅＥｓｓｅｎｔｉａｌＯ
ｉｌｓ，第Ｉ−ＶＩ巻、Ｒ．Ｅ．ＫｒｉｅｇｅｒＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏ
．、ＨｕｎｔｉｎｇｔｏｎＮ．Ｙ．、１９７５（本明細書中に参考として援用
される）においてより十分に記載される。

【００２６】用語「被子植物」は、子房内に覆われている種子を生産する植物のクラスをい
う。

【００２７】用語「裸子植物」は、子房に覆われていない種子を生産する植物のクラスをい
う。

【００２８】用語「変化」、「アミノ酸配列変化」、「改変体」、および「アミノ酸配列改
変体」は、ネイティブなゲラニル二リン酸シンターゼに比較してアミノ酸配列に
おいていくらかの差異を有するゲラニル二リン酸シンターゼ分子をいう。通常、
改変体は、ネイティブなゲラニル二リン酸シンターゼと少なくとも約７０％の相
同性を有し、好ましくは、改変体は、ネイティブなゲラニル二リン酸シンターゼ
と少なくとも約８０％相同である。本発明の範囲内にあるゲラニル二リン酸シン
ターゼのアミノ酸配列改変体は、特定の位置での置換、欠失、および／または挿
入を有する。ゲラニル二リン酸シンターゼの配列改変体は、所望の酵素活性増強
または減少、放射化学または立体化学の改変、あるいは基質資化または産物分配
の変化を達成させるために使用され得る。

【００２９】置換ゲラニル二リン酸シンターゼ改変体は、ネイティブなゲラニル二リン酸シ
ンターゼ配列において少なくとも１つのアミノ酸残基が除去され、そして同じ位
置にその代わりに異なるアミノ酸が挿入されている改変体である。置換は、単一
であり得る（ここでは、分子中のたった１つのアミノ酸が置換されている）か、
またはそれらは、複数であり得る（ここでは、２つ以上のアミノ酸が、同じ分子
中で置換されている）。ゲラニル二リン酸シンターゼ分子の活性における実質的
な変化は、ネイティブなアミノ酸の電荷および／または構造において有意に異な
る側鎖を有するアミノ酸と置換することにより、得られ得る。このタイプの置換
は、ポリペプチド骨格の構造および／または置換の領域中の分子の電荷もしくは
疎水性に影響することが予期される。

【００３０】ゲラニル二リン酸シンターゼ分子の活性における中程度の変化は、ネイティブ
な分子の電荷および／または構造に類似である側鎖を有するアミノ酸と置換する
ことにより、予期される。このタイプの置換は、保存的置換と呼ばれ、ポリペプ
チド骨格の構造または置換の領域中の分子の電荷もしくは疎水性のいずれも実質
的に変化しないと予期される。

【００３１】挿入ゲラニル二リン酸シンターゼ改変体は、ネイティブなゲラニル二リン酸シ
ンターゼ分子における特定の位置のアミノ酸に隣接して、１つ以上のアミノ酸が
挿入された改変体である。アミノ酸に隣接するとは、アミノ酸のα−カルボキシ
官能基またはα−アミノ官能基のいずれかに接続されることを意味する。挿入は
、１つ以上のアミノ酸であり得る。通常、挿入は、１つまたは２つの保存的アミ
ノ酸からなる。挿入部位に近接したアミノ酸に電荷および／または構造が類似す
るアミノ酸は、保存的であると定義される。あるいは、本発明は、挿入部位に近
接したアミノ酸とは実質的に異なる電荷および／または構造を有するアミノ酸の
挿入を包含する。

【００３２】欠失改変体は、ネイティブなゲラニル二リン酸シンターゼ分子中の１つ以上の
アミノ酸が除去されている改変体である。通常、欠失改変体は、ゲラニル二リン
酸シンターゼ分子の特定の領域において１つまたは２つのアミノ酸の欠失を有す
る。

【００３３】用語「生物学的活性」、「生物学的に活性である」、「活性」、および「活性
である」は、ゲラニル二リン酸シンターゼに関して使用される場合、酵素活性ア
ッセイ（例えば、以下の実施例１に記載のアッセイ）において測定されるように
、ゲラニル二リン酸シンターゼ分子がジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）お
よびイソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）を縮合し、ゲラニル二リン酸を形成させ
る能力をいう。ゲラニル二リン酸シンターゼのアミノ酸配列改変体は、望ましい
生物学的活性の変化（例えば、反応速度論、基質資化、産物分配、または他の特
徴（例えば、放射化学および立体化学）の変化を包含する）を有し得る。

【００３４】用語「コードするＤＮＡ配列」、「コードするＤＮＡ」、および「コードする
核酸」は、デオキシリボ核酸の鎖に沿ったデオキシリボヌクレオチドの順序また
は配列をいう。これらのデオキシリボヌクレオチドの順序は、翻訳されたポリペ
プチド鎖に沿ったアミノ酸の順序を決定する。従って、ＤＮＡ配列は、アミノ酸
配列をコードする。

【００３５】用語「複製可能発現ベクター」および「発現ベクター」は、外来ＤＮＡの一片
をその中に挿入し得るＤＮＡの一片（通常、二本鎖である）をいう。外来ＤＮＡ
は、異種ＤＮＡとして定義され、これは、宿主において天然には見出されないＤ
ＮＡである。ベクターは、外来または異種ＤＮＡを適切な宿主細胞に輸送するた
めに使用される。いったん宿主細胞内に入ると、ベクターは、宿主染色体ＤＮＡ
とは独立して、または同時に複製し得、そして数コピーのベクターおよびその挿
入された（外来の）ＤＮＡが生成され得る。さらに、ベクターは、外来ＤＮＡの
ポリペプチドへの翻訳を可能にする必要なエレメントを含有する。従って、外来
ＤＮＡによりコードされたポリペプチドの多くの分子は、迅速に合成され得る。

【００３６】用語「形質転換された宿主細胞」、「形質転換された」、および「形質転換」
は、細胞へのＤＮＡの導入をいう。この細胞は、「宿主細胞」と称され、そして
これは、原核生物細胞または真核生物細胞であり得る。代表的な原核生物宿主細
胞は、Ｅ．ｃｏｌｉの種々の株を包含する。代表的な真核生物宿主細胞は、植物
細胞（例えば、トウモロコシ細胞）、酵母細胞、昆虫細胞、または動物細胞であ
る。導入されたＤＮＡは、通常、挿入されたＤＮＡ片を含有するベクターの形態
である。導入されたＤＮＡ配列は、宿主細胞と同じ種由来であり得るか、または
宿主細胞とは異なる種由来であり得、あるいはこれは、ハイブリッドＤＮＡ配列
（いくつかの外来ＤＮＡおよび宿主種由来のいくつかのＤＮＡを含有する）であ
り得る。

【００３７】本発明によれば、ゲラニル二リン酸シンターゼをコードするｃＤＮＡが、以下
のようにして単離され、そして配列決定された。ゲラニル二リン酸シンターゼは
、腺毛分泌細胞にもっぱら位置し、そしてこれらの精油種においてゲラニル二リ
ン酸の形成を触媒する。これらの分泌細胞クラスターは、公知の方法によってＭ
ｅｎｔｈａｓｐｉｃａｔａから単離され、そしてゲラニル二リン酸シンターゼ
は、新規な精製プロトコル（ダイ−リガンドクロマトグラフィー工程、およびア
ニオン交換クロマトグラフィー、続く分取ＳＤＳ−ＰＡＧＥからなる）を利用し
てそれから精製された。限定量の精製ゲラニル二リン酸シンターゼは、９アミノ
酸ペプチドの配列（配列番号３）を生じた。この配列情報は、ゲラニル二リン酸
シンターゼｃＤＮＡのクローン化のために逆遺伝学アプローチを可能にするには
不充分であった。すなわち、プローブとして有効であるのに十分に特異的である
縮重オリゴヌクレオチドプローブの構築を可能にするには十分でないアミノ酸し
かなかった。

【００３８】結果、全ＲＮＡが、Ｍｅｎｔｈａｐｉｐｅｒｉｔａ由来の単離された毛状分
泌細胞から抽出され、そしてｍＲＮＡがそこから精製された。この分泌細胞ｍＲ
ＮＡは、標準的な手段によるｃＤＮＡライブラリーの合成のための基質として作
用した。１００の無作為に選択したｃＤＮＡクローンが配列決定され、そして１
つのクローンが、植物由来ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼに対して低い相
同性を示した（約２８％同一性；約５４％類似性）。この「プレニルトランスフ
ェラーゼ様」ｃＤＮＡ由来の配列情報が、ＰＣＲプライマー（配列番号４および
５）を構築するために使用された。続いて、このＰＣＲプライマーは、「プレニ
ルトランスフェラーゼ様」ｃＤＮＡの１１３ｂｐフラグメント（配列番号６）を
増幅するために使用された。このフラグメントを、腺毛状分泌細胞ライブラリー
から２７のさらなる相同性クローンを単離するためにプローブとして使用された
。配列決定は、２７のクローンが３つの対立遺伝子を呈することを明示した。３
つの対立遺伝子群の各々からの１つのクローンの生物学的活性は、３つの代表的
なｃＤＮＡの各々を個々に発現するＥ．ｃｏｌｉ由来の上清中のゲラニル二リン
酸活性を測定することにより試験された。ゲラニル二リン酸シンターゼ活性の最
高レベルを示すクローン（Ｍｐ１３．１８と称する）が完全に配列決定され（配
列番号１）、そしてそれがゲラニル二リン酸シンターゼクローンであることが、
推定のゲラニル二リン酸シンターゼタンパク質配列をＭｅｎｔｈａｓｐｉｃａ
ｔａから精製されたゲラニル二リン酸シンターゼタンパク質由来の９アミノ酸ペ
プチド（配列番号３）の配列と比較することによって確認された。

【００３９】さらに、８アミノ酸ペプチド（配列番号７）の配列（Ｍｅｎｔｈａｓｐｉｃ
ａｔａから精製されたゲラニル二リン酸シンターゼタンパク質由来）が、ゲラニ
ル二リン酸シンターゼのクローニングに続いて得られた。９アミノ酸ペプチド（
配列番号３）および８アミノ酸ペプチド（配列番号７）の両方の配列は、クロー
ン化されたゲラニル二リン酸シンターゼｃＤＮＡから推定されたタンパク質配列
の対応する領域（それぞれ、配列番号２のアミノ酸２５４〜２６２、およびアミ
ノ酸１８４〜１９１）に正確に適合した。精製されたＭｅｎｔｈａｓｐｉｃａ
ｔａゲラニル二リン酸シンターゼ由来のペプチド配列が、クローン化されたＭｅ
ｎｔｈａｐｉｐｅｒｉｔａゲラニル二リン酸シンターゼの対応する領域に完全
に適合したという所見は、この２種の間の遺伝的関係と一致する：ペパーミント
（Ｍｅｎｔｈａｐｉｐｅｒｉｔａ）は、Ｍｅｎｔｈａａｑｕａｔｉｃａを４
倍体Ｍｅｎｔｈａｓｐｉｃａｔａと交雑することにより生産された６倍体種で
ある（ＨａｒｌｅｙおよびＢｒｉｇｈｔｏｎ、Ｂｏｔ．Ｊ．Ｌｉｎｎ．Ｓｏｃ．
７４：７１−９６［１９７７］）。要するに、６倍体ペパーミントは、４倍体ス
ペアミントの完全ゲノムを含有する。

【００４０】ゲラニル二リン酸シンターゼｃＤＮＡの単離は、この機能的な酵素の効率的な
発現系の開発を可能にし；モノテルペン生合成の発達的調節を試験するための有
用なツールを提供し、そして他のゲラニル二リン酸シンターゼの単離を可能にす
る。ゲラニル二リン酸シンターゼｃＤＮＡの単離はまた、新規にモノテルペン生
合成を導入するため、または内因性モノテルペン生合成を改変するために、広範
囲の生物の形質転換を可能にする。

【００４１】配列番号２に記載のゲラニル二リン酸シンターゼタンパク質は酵素をプラスチ
ドに指向させるが、推定標的化配列（配列番号２、アミノ酸１〜４８）の当該分
野で周知の他の輸送配列（例えば、ｖｏｎＨｅｉｊｎｅＧら、Ｅｕｒ．Ｊ．
Ｂｉｏｃｈｅｍ１８０：５３５−５４５、１９８９；Ｓｔｒｙｅｒ、Ｂｉｏｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙＷ．Ｈ．ＦｒｅｅｍａｎａｎｄＣｏｍｐａｎｙ、Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ、ＮＹ、７６９頁［１９８８］）との置換は、他の細胞位置または細
胞外位置にゲラニル二リン酸シンターゼを指向させるために用いられ得る。

【００４２】プラスミドＭｐ１３．１８のｃＤＮＡ挿入片（配列番号１）によりコードされ
た配列番号２のネイティブなゲラニル二リン酸シンターゼアミノ酸配列に加えて
、欠失、置換、変異および／または挿入により生産された配列改変体が、先行技
術により制限される範囲を除いて、本発明の範囲内であると意図される。ゲラニ
ル二リン酸シンターゼアミノ酸配列改変体は、野生型ゲラニル二リン酸シンター
ゼをコードするＤＮＡ配列を変異させる（例えば、部位特異的変異誘発と通常呼
ばれる技術を用いることによる）ことにより、構築され得る。現在当該分野で周
知の種々のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法（例えば、Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅ
ｒＳｉｔｅ−ＤｉｒｅｃｔｅｄＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓキット（Ｃｌｏｎｔ
ｅｃｈから）のような２プライマー系）が、この目的のために使用され得る。

【００４３】この系における標的プラスミドの変性後、２つのプライマーがこのプラスミド
に同時にアニールされる；これらのプライマーの一方は、所望の部位特異的変異
を含み、他方は、プラスミドにおける別の部位に変異を含み、制限部位の除去を
生じる。次いで、第二の鎖合成が行われ、これらの２つの変異を強く連結し、そ
して得られたプラスミドは、Ｅ．ｃｏｌｉのｍｕｔＳ株に形質転換される。プラ
スミドＤＮＡは、形質転換細菌から単離され、関連の制限酵素で制限され（それ
により非変異プラスミドを線状化する）、次いでＥ．ｃｏｌｉに再形質転換され
る。この系は、一本鎖ファージミドのサブクローン化または生成の必要性なく、
発現プラスミドにおいて直接的に変異の生成を可能にする。２つの変異の強い連
結および非変異プラスミドの続く線状化は、高変異効率を生じ、そして最少のス
クリーニングを可能にする。出発制限部位プライマーの合成後、この方法は、変
異部位あたりたった１つの新規なプライマータイプの使用を必要とする。各位置
変異を別個に調製するよりむしろ、一セットの「設計された縮重」オリゴヌクレ
オチドプライマーが、所定の部位で所望の変異の全てを同時に導入するために合
成され得る。形質転換体は、変異クローンを同定および選別するために、プラス
ミドＤＮＡを変異誘発領域にわたって配列決定することによりスクリーニングさ
れ得る。次いで、各変異体ＤＮＡは、制限され、そしてＭｕｔａｔｉｏｎＤｅ
ｔｅｃｔｉｏｎＥｎｈａｎｃｅｍｅｎｔゲル（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ）上の電気
泳動によって分析され、配列において他の変化が生じていないことを確認し得る
（非変異誘発コントロールとのバンドシフト比較による）。

【００４４】確証された変異体二重鎖は、（このタイプのベクターにまだクローン化されて
いなければ）複製可能発現ベクターにクローン化され得、そして得られた発現構
築物は、変異体タンパク質の高レベルでの生産および続くそれらの精製のために
、Ｅ．ｃｏｌｉ（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ株）を
形質転換するために使用され得る。ＦＡＢ−ＭＳマッピングの方法は、変異体発
現の忠実度を迅速に調べるために使用され得る。この技術は、全タンパク質にわ
たってセグメントを配列決定することを提供し、そして配列割り当てにおいて必
要な信頼性を提供する。このタイプのマッピング実験において、タンパク質は、
プロテアーゼで消化される（選択は、改変されるべき特定の領域に依存する。な
ぜなら、このセグメントが主な関心の的であり、残りのマップは、非変異誘発タ
ンパク質のマップに同一であるべきであるため）。切断フラグメントのセットは
、微小孔ＨＰＬＣ（逆相またはイオン交換、これもまた、改変されるべき特定の
領域に依存する）によって分画されて、各画分中にいくつかのペプチドを提供し
、そしてペプチドの分子量はＦＡＢ−ＭＳによって決定される。次いで、質量が
、推定配列の消化から予期されるペプチドの分子量と比較され、そして配列の正
しさが即座に確かめられる。タンパク質改変に対してこの変異誘発アプローチは
指向されるので、変化されたペプチドの配列決定は、ＭＳが推定と一致すれば、
必要とされるべきではない。変更残基を確認することが必要であれば、ＣＡＤ−
タンデムＭＳ／ＭＳが、問題の混合物のペプチド、あるいは改変の位置に依存し
てサブトラクティブＥｄｍａｎ分解またはカルボキシペプチダーゼＹ消化のため
に精製された標的ペプチドを配列決定するために使用され得る。

【００４５】特定の部位特異的変異体の設計において、一般に、まず非保存的置換（例えば
、Ｃｙｓ、ＨｉｓまたはＧｌｕの代わりにＡｌａ）を行い、結果として活性が大
いに損なわれるかどうかを決定することが、望ましい。次いで、変異誘発タンパ
ク質の特性が、機能変化の感度指標としてＫ_mおよびｋ_catの反応速度論パラメー
ターに対して特に注意して試験される。そこから、結合および／または触媒自体
の変化が、ネイティブな酵素に対する比較によって推定され得る。残基が、この
手段によって、活性を損なうこと、またはノックアウトに重要であることが示さ
れれば、側鎖長を変えるためのＧｌｕからＡｓｐへ、ＣｙｓからＳｅｒへ、また
はＨｉｓからＡｒｇへのような保存的置換がなされ得る。疎水性セグメントにつ
いて、主として、変化されるのはサイズであるが、芳香族もまたアルキル側鎖に
ついて置換され得る。通常産物分布における変化は、反応順序のどの段階が変異
によって変化されているかを示し得る。

【００４６】他の部位特異的変異誘発技術はまた、本発明のヌクレオチド配列と共に用いら
れ得る。例えば、ＤＮＡの制限エンドヌクレアーゼ消化、続く連結が、Ｓａｍｂ
ｒｏｏｋら（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ第２版、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒ
ａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ、ＮｅｗＹｏｒｋ、ＮＹ［１９８９］）のセクション
１５．３に記載されるように、ゲラニル二リン酸シンターゼ欠失改変体を生成す
るために使用され得る。類似のストラテジーが、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出）の
セクション１５．３において記載されるように挿入改変体を構築するために使用
され得る。

【００４７】オリゴヌクレオチド指向性変異誘発もまた、本発明の置換改変体を調製するた
めに使用され得る。それはまた、本発明の欠失改変体および挿入改変体を便宜的
に調製するために使用され得る。この技術は、Ａｄｅｌｍａｎら（ＤＮＡ２：
１８３［１９８３］）により記載されるように、当該分野において周知である。
一般に、少なくとも２５ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドが、ゲラニル二リ
ン酸シンターゼ分子において２つ以上のヌクレオチドを挿入、欠失または置換す
るために使用される。至適なオリゴヌクレオチドは、変異をコードするヌクレオ
チドのいずれかの側に１２〜１５の完全に適合したヌクレオチドを有する。野生
型ゲラニル二リン酸シンターゼを変異誘発するために、オリゴヌクレオチドは、
適切なハイブリダイゼーション条件下で一本鎖ＤＮＡテンプレート分子にアニー
ルされる。次いで、ＤＮＡ重合酵素（通常、Ｅ．ｃｏｌｉＤＮＡポリメラーゼ
Ｉのクレノウフラグメント）が添加される。この酵素は、ＤＮＡの変異を有する
鎖の合成を完了するためのプライマーとして、オリゴヌクレオチドを使用する。
従って、ヘテロ二重鎖分子は、ＤＮＡの一方の鎖が、ベクターに挿入された野生
型ゲラニル二リン酸シンターゼをコードし、ＤＮＡの第二の鎖が、同じベクター
に挿入されたゲラニル二リン酸シンターゼの変異型をコードするように形成され
る。次いで、このヘテロ二重鎖分子は、適切な宿主細胞に形質転換される。

【００４８】１つより多くのアミノ酸が置換されている変異体は、いくつかの方法の１つに
おいて生成され得る。アミノ酸がポリペプチド鎖において共に近接して位置すれ
ば、それらは、所望のアミノ酸置換の全てをコードする１つのオリゴヌクレオチ
ドを用いて同時に変異され得る。しかしながら、アミノ酸が互いからある程度の
距離に位置する場合（例えば、１０アミノ酸より大きく離れている）、所望の変
更のすべてをコードする単一のオリゴヌクレオチドを生成することはより困難で
ある。代わりに、２つの代替的な方法のうち一方が用いられ得る。第一の方法で
は、別個のオリゴヌクレオチドが、置換されるべき各アミノ酸について生成され
る。次いで、これらのオリゴヌクレオチドは、同時に一本鎖テンプレートＤＮＡ
にアニールされ、そしてテンプレートから合成されたＤＮＡの第二の鎖は、所望
のアミノ酸置換の全てをコードする。代替法は、所望の変異体を生産するために
、２ラウンド以上の変異誘発を包含する。第一のラウンドは、単一変異体につい
て記載のとおりである：野生型ゲラニル二リン酸シンターゼＤＮＡがテンプレー
トとして使用され、第一の所望のアミノ酸置換をコードするオリゴヌクレオチド
がこのテンプレートにアニールされ、そして次いで、ヘテロ二重鎖ＤＮＡ分子が
生成される。第二のラウンドの変異誘発は、テンプレートとして第一のラウンド
の変異誘発において生産された変異ＤＮＡを利用する。従って、このテンプレー
トは、すでに１以上の変異を含有する。次いで、さらなる所望のアミノ酸置換を
コードするオリゴヌクレオチドがこのテンプレートにアニールされ、そして得ら
れたＤＮＡの鎖は、いまや第一および第二の両方のラウンドの変異誘発からの変
異をコードする。この得られたＤＮＡは、第三のラウンドなどの変異誘発におい
てテンプレートとして使用され得る。

【００４９】ゲラニル二リン酸シンターゼをコードする遺伝子は、任意の生物（無傷植物、
動物、微生物）、またはそれに由来する細胞培養物に組み込まれ得、これは、ジ
メチルアリル二リン酸およびイソペンテニル二リン酸を生産し、生物に依存して
、これらの主要基質のゲラニル二リン酸およびその続く代謝産物への変換を行う
。ゲラニル二リン酸シンターゼ遺伝子は、種々の目的のために任意の生物に組み
込まれ得る。この目的は、以下を包含するが、これらに限定されない：風味特性
および芳香特性の生産または改変；防御能の改善；ゲラニル二リン酸およびその
誘導体により媒介される他の生態学的相互作用の変化；ガン細胞の増殖、分化ま
たは分裂の選択的破壊または阻害；あるいはゲラニル二リン酸およびその誘導体
の生産。

【００５０】真核生物発現系は、ゲラニル二リン酸シンターゼ生産のために利用され得る。
なぜなら、これらは、必要とされる翻訳後修飾を実施し得、そしてこの酵素を適
切な膜位置に指向させ得るからである。この目的のために代表的な真核生物発現
系は、本発明のゲラニル二リン酸シンターゼの発現のために、組換えバキュロウ
イルス、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウイルス（
ＡｃＮＰＶ；Ｍ．Ｄ．ＳｕｍｍｅｒｓおよびＧ．Ｅ．Ｓｍｉｔｈ、ＡＭａｎｕ
ａｌｏｆＭｅｔｈｏｄｓｆｏｒＢａｃｕｌｏｖｉｒｕｓＶｅｃｔｏｒ
ｓａｎｄＩｎｓｅｃｔＣｅｌｌＣｕｌｔｕｒｅＰｒｏｃｅｄｕｒｅｓ
［１９８６］；Ｌｕｃｋｏｗら、Ｂｉｏ−ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ６：４７−５
５［１９８７］）を使用する。組換えバキュロウイルスでの昆虫細胞（例えば、
Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ種の細胞）の感染は、大量のゲラ
ニル二リン酸シンターゼタンパク質の生産を可能にする。さらに、バキュロウイ
ルス系は、組換えゲラニル二リン酸シンターゼの生産についての他の重要な利点
を有する。例えば、バキュロウイルスは、ヒトに感染せず、従って、大量でも安
全に扱われ得る。バキュロウイルス系において、ゲラニル二リン酸シンターゼを
コードするＤＮＡセグメントおよびベクターを含むＤＮＡ構築物が調製される。
このベクターは、バキュロウイルスのポリヘドロン遺伝子プロモーター領域、組
換えの間の適切な交叉に必要なバキュロウイルスフランキング配列（フランキン
グ配列は、プロモーター配列に近接した約２００〜３００塩基対を含み得る）お
よび細菌複製起点（構築物の細菌での複製を可能にする）を含み得る。このベク
ターは、（ｉ）ＤＮＡセグメントが、ポリヘドロン遺伝子プロモーターに近接し
て（または作動可能に連結されて、または「下流に」、または「制御下に」）配
置され、そして（ｉｉ）プロモーター／ゲラニル二リン酸シンターゼ組み合わせ
がバキュロウイルスＤＮＡの２００から３００塩基対（フランキング配列）まで
両側に配置されるように、構築される。

【００５１】ゲラニル二リン酸シンターゼＤＮＡ構築物を生産するために、全長ゲラニル二
リン酸シンターゼをコードするｃＤＮＡクローンは、本明細書中に記載のような
方法を用いて得られる。ＤＮＡ構築物は、宿主細胞において、組換えが行われる
ような条件下で、適切なバキュロウイルスの（すなわち、構築物においてコード
されたプロモーターと同じ種のバキュロウイルスの）バキュロウイルスＤＮＡと
接触させられる。得られる組換えバキュロウイルスは、全長ゲラニル二リン酸シ
ンターゼをコードする。例えば、昆虫宿主細胞は、ＤＮＡ構築物および機能的バ
キュロウイルスと同時トランスフェクトされ得るか、または別個にトランスフェ
クトされ得る。次いで、得られた組換えバキュロウイルスは、単離され得、そし
てゲラニル二リン酸シンターゼの生産を行うように細胞に感染するために使用さ
れ得る。宿主昆虫細胞は、例えば、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄ
ａ細胞を包含する。これは、バキュロウイルス発現ゲラニル二リン酸シンターゼ
を生産し得る。本発明の組換えバキュロウイルスで感染された昆虫宿主細胞は、
次いで、バキュロウイルスコード化ゲラニル二リン酸シンターゼの発現を可能に
する条件下で培養される。このように生産されたゲラニル二リン酸シンターゼは
、次いで、当該分野で公知の方法を用いて細胞から抽出される。

【００５２】他の真核生物微生物（例えば、酵母）もまた、本発明を実施するために使用さ
れ得る。パン酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅが一般に
用いられる酵母であるが、いくつかの他の株もまた利用可能である。プラスミド
ＹＲｐ７（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂら、Ｎａｔｕｒｅ２８２：３９［１９７９］
；Ｋｉｎｇｓｍａｎら、Ｇｅｎｅ７：１４１［１９７９］；Ｔｓｃｈｅｍｐｅ
ｒら、Ｇｅｎｅ１０：１５７［１９８０］）は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
における発現ベクターとして一般に用いられる。このプラスミドは、トリプトフ
ァン中で増殖する能力を欠損する酵母の変異株（例えば、ＡＴＣＣ第４４，０７
６号およびＰＥＰ４−１株（Ｊｏｎｅｓ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ８５：１２［１９
７７］））についての選択マーカーを提供するｔｒｐ１遺伝子を含む。酵母宿主
細胞ゲノムの特徴としてのｔｒｐ１病巣の存在は、次いで、トリプトファン不在
下での増殖により形質転換を検出するための有効な環境を提供する。酵母宿主細
胞は、一般に、Ｈｉｎｎｅｎ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
７５：１９２９［１９７８］）に記載のように、ポリエチレングリコール法を
用いて形質転換される。さらなる酵母形質転換プロトコルは、Ｇｉｅｔｚら、Ｎ
．Ａ．Ｒ２０（１７）：１４２５、１９９２；Ｒｅｅｖｅｓら、ＦＥＭＳ９
９：１９３−１９７、１９９２に記載される。

【００５３】酵母ベクターにおける適切な促進配列は、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（
Ｈｉｔｚｅｍａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５：２０７３［１９８０］
）または他の糖分解酵素（Ｈｅｓｓら、Ｊ．Ａｄｖ．ＥｎｚｙｍｅＲｅｇ．７
：１４９［１９６８］；Ｈｏｌｌａｎｄら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１７：
４９００［１９７８］）（例えば、エノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン
酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホ
フルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセリ
ン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオース−リン酸イソメラーゼ、ホスホ
グルコースイソメラーゼ、およびグルコキナーゼ）に対するプロモーターを包含
する。適切な発現プラスミドの構築において、これらの遺伝子と関連した終結配
列もまた、発現されることが所望される配列の３’側で発現ベクターに連結され
て、ｍＲＮＡのポリアデニル化および終結を提供する。増殖条件により制御され
る転写のさらなる利点を有する他のプロモーターは、アルコールデヒドロゲナー
ゼ２、イソシトクロームＣ、酸性ホスファターゼ、窒素代謝に関連した分解酵素
、および上述のグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、およびマル
トースおよびガラクトース資化を担う酵素のプロモーター領域である。酵母適合
性プロモーター、複製起点、および終結配列を含む任意のプラスミドベクターが
適切である。

【００５４】多細胞生物（例えば、植物）由来の細胞培養物が、本発明を実施するために宿
主として使用され得る。トランスジェニック植物は、例えば、Ｈｏｅｃｋｅｍａ
ら、Ｎａｔｕｒｅ３０３：１７９−１８１［１９８３］）に記載のように、ゲ
ラニル二リン酸シンターゼおよび選択可能マーカー遺伝子（例えば、カナマイシ
ンに対する耐性をコードするｋａｎ遺伝子）をコードするプラスミドを、ヘルパ
ーＴｉプラスミドを含有するＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｉｆａｃｉｅ
ｎｓに移入し、そしてＡｎら、ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌｏｓｙ８１：３０
１−３０５［１９８６］により記載のように、形質転換されるべき植物の葉片を
とともにＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ細胞を培養することにより得られ得る。培
養植物宿主細胞の形質転換は、通常、上述のような、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍｔｕｍｉｆａｃｉｅｎｓによって達成される。哺乳動物宿主細胞、および堅
い細胞膜障壁を有さない他の宿主細胞の培養物は、通常、ＧｒａｈａｍおよびＶ
ａｎｄｅｒＥｂ（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ５２：５４６［１９７８］）にもとも
と記載されるリン酸カルシウム法を用いて形質転換され、そしてＳａｍｂｒｏｏ
ｋら、前出のセクション１６．３２−１６．３７に記載のように改変される。し
かし、ＤＮＡを細胞に導入するための他の方法（例えば、ポリブレン（Ｋａｗａ
ｉおよびＮｉｓｈｉｚａｗａ、Ｍｏｌ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．４：１１７２［１
９８４］）、プロトプラスト融合（Ｓｃｈａｆｆｎｅｒ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７７：２１６３［１９８０］）、エレクトロポレー
ション（Ｎｅｕｍａｎｎら、ＥＭＢＯＪ．１：８４１［１９８２］）、および
核への直接微量注入（Ｃａｐｅｃｃｈｉ、Ｃｅｌｌ２２：４７９［１９８０］
））もまた、用いられ得る。さらに、動物形質転換ストラテジーは、Ｍｏｎａｓ
ｔｅｒｓｋｙＧ．Ｍ．およびＲｏｂｌ、Ｊ．Ｍ．Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓｉ
ｎＴｒａｎｓｇｅｎｉｃＡｎｉｍａｌＳｃｉｅｎｃｅ、ＡＳＭＰｒｅｓ
ｓ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、Ｄ．Ｃ．、１９９５において概説されている。形質
転換植物カルスは、例えば、カナマイシン、および適量の植物ホルモン（例えば
、ナフタレン酢酸およびベンジルアデニン、カルスおよびシュート誘導のため）
を含有する培地上で細胞を増殖させることによって、選択可能マーカーによって
選択され得る。植物細胞は、次いで、再生され得、そして得られた植物は、当業
者に周知の技術を用いて鉢上げされ得る。

【００５５】さらに、ゲラニル二リン酸シンターゼ生産を調節する遺伝子が、誘導可能であ
る必要なプロモーターと共に植物に組み込まれ得る。本発明の本実施態様の実施
において、特定の外部刺激または内部刺激にのみ応答するプロモーターが、標的
ｃＤＮＡに融合される。従って、遺伝子は、特定の刺激に応じることを除いては
転写されない。この遺伝子が転写されない限り、その遺伝子産物は生産されない
。

【００５６】本発明の実施において用いられ得る応答性プロモーター系の例示的な例は、ト
ウモロコシにおけるグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）系である
。ＧＳＴは、出芽前除草剤としてしばしば使用される、多数の疎水性求電子性化
合物を解毒し得る酵素ファミリーである（Ｗｅｉｇａｎｄら、ＰｌａｎｔＭｏ
ｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ７：２３５−２４３［１９８６］）。研究は
、ＧＳＴが、この増強された除草剤耐性を引き起こすことに直接関与することを
示している。この作用は、特定の１．１ｋｂｍＲＮＡ転写産物によって主に媒
介される。手短には、トウモロコシは、外部刺激に応答し得、そして遺伝子産物
を生産するように誘導され得る、既存の天然に存在する静止遺伝子を有する。こ
の遺伝子は、以前に同定され、クローン化されている。従って、本発明の１つの
実施態様において、プロモーターは、ＧＳＴ応答性遺伝子から除去され、そして
すでにそのネイティブプロモーターが除去されたゲラニル二リン酸シンターゼ遺
伝子に付着される。この遺伝子操作された遺伝子は、外部化学刺激に応答するプ
ロモーターおよびゲラニル二リン酸シンターゼの首尾よい生産を担う遺伝子の組
み合わせである。

【００５７】上述の方法に加えて、クローン化ＤＮＡを広範な種々の植物種（裸子植物、被
子植物、単子葉植物、および双子葉植物を含む）に移入する幾つかの方法は当該
分野において公知である（例えば、ＧｌｉｃｋおよびＴｈｏｍｐｓｏｎ，編，Ｍ
ｅｔｈｏｄｓｉｎＰｌａｎｔＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，Ｃ
ＲＣＰｒｅｓｓ，ＢｏｃａＲａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ［１９９３］、本
明細書中に参考として援用される）。代表的な例には、電気パルスが細胞膜を一
過性に浸透化処理し、組換えＤＮＡを含む種々の生物学的分子の取り込みを可能
にする、プロトプラストによる電気穿孔促進性ＤＮＡ取り込み（Ｒｈｏｄｅｓら
，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４０：２０４−２０７［１９８８］）：ポリエチレングリ
コールでのプロトプラストの処理（Ｌｙｚｎｉｋら，ＰｌａｎｔＭｏｌｅｃｕ
ｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，１３：１５１−１６１［１９８９］）；ならびに細胞
壁を貫通するための爆発力または圧縮ガスにより推進されるＤＮＡを積んだ微粒
子銃を用いた細胞のボンバードメント（Ｋｌｅｉｎら，ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉ
ｏｌ．９１：４４０−４４４［１９８９］およびＢｏｙｎｔｏｎら，Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ，２４０：１５３４−１５３８［１９８８］）がある。Ｔａｘｕｓ種の形質
転換は、例えば本明細書中に参考として援用される、Ｈａｎら，ＰｌａｎｔＳ
ｃｉｅｎｃｅ，９５：１８７−１９６（１９９４）中に示される方法を使用する
ことにより達成され得る。Ｒｙｅ植物（Ｓｅｃａｌｅｃｅｒｅａｌｅ）に適用
されている方法は選択マーカー遺伝子を含有するプラスミドＤＮＡを発生中の花
の分げつに直接注入することである（ｄｅｌａＰｅｎａら，Ｎａｔｕｒｅ
３２５：２７４−２７６（１９８７））。さらに植物ウイルスが、遺伝子を植物
細胞に移入するためにベクターとして使用され得る。植物を形質転換するための
ベクターとして使用され得る植物ウイルスの例としては、カリフラワーモザイク
ウイルス（Ｂｒｉｓｓｏｎら，Ｎａｔｕｒｅ３１０：５１１−５１４（１９８
４））が挙げられる。さらに、植物形質転換ストラテジーおよび技術は、Ｂｉｒ
ｃｈ，Ｒ．Ｇ．，ＡｎｎＲｅｖＰｌａｎｔＰｈｙｓＰｌａｎｔＭｏｌ
Ｂｉｏｌ，４８：２９７（１９９７）；Ｆｏｒｅｓｔｅｒら，Ｅｘｐ．Ａｇｒ
ｉｃ．，３３：１５−３３（１９９７）に概説される。植物形質転換技術を開示
する上述の刊行物は本明細書中に参考として援用され、かつ少しの変更でこれら
の技術を広範囲の植物種に適用可能にする。

【００５８】これらの技術の各々は利点および不利な点を有する。この技術の各々において
、プラスミド由来のＤＮＡは、目的の遺伝子のみならず、選択マーカーおよびス
クリーニングマーカー遺伝子をも含むように遺伝的に操作される。選択マーカー
遺伝子は、このプラスミドのコピーを組込んだ細胞のみを選択するために使用さ
れる（この構築は、目的の遺伝子ならびに選択およびスクリーニング遺伝子が１
ユニットとして移入されるような構築である）。スクリーニング遺伝子は、目的
の遺伝子を有する細胞のみの首尾良い培養に関する別の検査基準を提供する。通
常使用される選択マーカー遺伝子は、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩ
Ｉ（ＮＰＴＩＩ）である。この遺伝子は、カナマイシン（細胞が増殖する増殖培
地に直接添加され得る化合物）に対する耐性を伝達する。植物細胞は、通常カナ
マイシンに感受性で、結果として死に至る。ＮＰＴＩＩ遺伝子の存在はカナマイ
シンの作用を克服し、そしてこの遺伝子を有する各細胞は生存可能なままである
。本発明の実施において使用され得る別の選択マーカー遺伝子は、除草剤グルフ
ォシネート（Ｂａｓｔａ）に耐性を付与する遺伝子である。通常使用されるスク
リーニング遺伝子は、βグルクロニダーゼ遺伝子（ＧＵＳ）である。この遺伝子
の存在は、推定の形質転換細胞のサンプルがＧＵＳアッセイ溶液で処理される組
織化学的反応を使用して特徴付けられる。適切なインキュベーション後、ＧＵＳ
遺伝子を含有する細胞はブルーに変わる。好ましくは、このプラスミドは選択マ
ーカー遺伝子およびスクリーニングマーカー遺伝子を共に含む。

【００５９】１つ以上のこれらの遺伝子を含有するプラスミドは、上述の技術のいずれかに
より、植物プロトプラストまたはカルス細胞に導入される。マーカー遺伝子が選
択遺伝子である場合、ＤＮＡパッケージを組込んだ細胞のみが、適切な植物毒性
薬剤を用いた選択下で生存する。一旦、この適切な細胞が同定および増殖される
と、植物は再生される。この形質転換植物由来の子孫が、ＤＮＡパッケージが植
物ゲノムに首尾良く組込まれたことを確実にするために試験されねばならない。

【００６０】哺乳動物宿主細胞もまた本発明の実施において使用され得る。適切な哺乳動物
細胞株の例としては以下が挙げられる：ＳＶ４０（ＣＯＳ−７，ＡＴＣＣＣＲ
Ｌ１６５１）により形質転換したサル腎臓ＣＶＩ株；ヒト胎児腎臓株２９３Ｓ
（Ｇｒａｈａｍら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．３６：５９［１９７７］）；ベビ
ーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ，ＡＴＣＣＣＣＬ１０）；チャイニーズハム
スター卵巣細胞（ＵｒｌａｂおよびＣｈａｓｉｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．ＳｃｉＵＳＡ７７：４２１６［１９８０］）；マウスセルトーリ細胞（
ＴＭ４，Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３［１９８０］）
；サル腎臓細胞（ＣＶＩ−７６，ＡＴＣＣＣＣＬ７０）；アフリカミドリザ
ル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６，ＡＴＣＣＣＲＬ−１５８７）；ヒト頚部癌腫細
胞（ＨＥＬＡ，ＡＴＣＣＣＣＬ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ，ＡＴＣＣ
ＣＣＬ３４）；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ３Ａ，ＡＴＣＣＣＲ
Ｌ１４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８，ＡＴＣＣＣＣＬ７５）；ヒト肝臓
細胞（ＨｅｐＧ２，ＨＢ８０６５）；マウス乳ガン細胞（ＭＭＴ０６０５６２
，ＡＴＣＣＣＣＬ５１）；ラット肝細胞ガン細胞（ＨＴＣ，ＭＩ．５４，Ｂ
ａｕｍａｎｎら，Ｊ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．８５：１［１９８０］）；ならびに
ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒら，ＡｎｎａｌｓＮ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
３８３：４４［１９８２］）。これらの細胞に関する発現ベクターには通常、
（必要であれば）複製起点のＤＮＡ配列、発現される遺伝子の前に位置するプロ
モーター、リボソーム結合部位、ＲＮＡスプライシング部位、ポリアデニル化部
位、および転写終結部位が含まれる。

【００６１】哺乳動物発現ベクターにおいて使用されたプロモーターはしばしばウイルス起
源のプロモーターである。これらのウイルスプロモーターは通常ポリオーマウイ
ルス、アデノウイルス２、および最も頻繁にはシミアンウイルス４０（ＳＶ４０
）由来である。ＳＶ４０ウイルスは、初期および後期プロモーターと呼ばれる２
つのプロモーターを含む。これらのプロモーターは特に有用であるが、これらは
共に、ウイルスの複製起点をまた含む１つのＤＮＡフラグメントとして、このウ
イルスから容易に得られるからである（Ｆｉｅｒｓら，Ｎａｔｕｒｅ２７３：
１１３［１９７８］）。より小さいまたはより大きいＳＶ４０ＤＮＡフラグメ
ントもまた、これらがウイルス複製起点に位置するＨｉｎｄＩＩＩ部位からＢｇ
ｌＩ部位に伸長する約２５０ｂｐ配列を含むことを条件に、使用され得る。

【００６２】あるいは、外来遺伝子（相同性プロモーター）と自然に結合するプロモーター
は、それらが形質転換のために選択された宿主細胞株と適合性であることを条件
に、使用され得る。

【００６３】複製起点は、ＳＶ４０または他のウイルス（例えば、ポリオーマ、アデノ、Ｖ
ＳＶ、ＢＰＶ）のような外因性供給源から得られ得、そしてクローニングベクタ
ーに挿入され得る。あるいは、この複製起点は、宿主細胞染色体複製機構により
提供され得る。外来遺伝子を含有するベクターが宿主細胞染色体に組込まれた場
合、しばしば後者で十分である。

【００６４】二次的なＤＮＡコード配列の使用は、形質転換細胞株中のゲラニル二リン酸シ
ンターゼの産生レベルを増強し得る。二次コード配列は代表的に、酵素ジヒドロ
葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）を含む。ＤＨＦＲの野生型形態は、化学メトトレ
キセート（ＭＴＸ）により通常阻害される。細胞中のＤＨＦＲ発現のレベルは、
培養宿主細胞に添加したＭＴＸの量に依存して変化する。二次配列として特に有
用にするＤＨＦＲのさらなる特徴は、形質転換細胞を同定するために選択マーカ
ーとして使用され得ることである。ＤＨＦＲの２つの形態は、二次配列、野生型
ＤＨＦＲ、およびＭＴＸ耐性ＤＨＦＲとしての使用に利用可能である。特定の宿
主細胞で使用されるＤＨＦＲのタイプは、この宿主細胞がＤＨＦＲ欠損である（
内因的に非常に低いレベルのＤＨＦＲを産生するか、または機能的なＤＨＦＲを
全く産生しないかということ）か否かによる。ＵｒｌａｕｂおよびＣｈａｓｉｎ
、前出により記載されるＣＨＯ細胞株のようなＤＨＦＲ欠損細胞株は、野生型Ｄ
ＨＦＲコード配列で形質転換される。形質転換後、これらのＤＨＦＲ欠損細胞株
は、機能的なＤＨＦＲを発現し、かつ栄養素ヒポキサンチン、グリシン、および
チミジンを欠く培養培地中で増殖し得る。非形質転換細胞は、この培地中で生存
しない。

【００６５】ＤＨＦＲのＭＴＸ耐性形態は、ＭＴＸ感受性である通常量の機能的なＤＨＦＲ
を内因的に産生する宿主細胞において、形質転換宿主細胞について選択する手段
として使用され得る。ＣＨＯ−Ｋｌ細胞株（ＡＴＣＣＮｏ．ＣＬ６１）はこれ
らの特徴を所有し、従って、この目的のために有用な細胞株である。ＭＴＸの細
胞培養培地への添加は、ＭＴＸ耐性ＤＨＦＲをコードするＤＮＡで形質転換した
これらの細胞のみを増殖可能にする。非形質転換細胞はこの培地中で生存し得な
い。

【００６６】原核生物もまた、本発明の最初のクローニング工程のための宿主細胞として使
用され得る。それらは、大量のＤＮＡの迅速な産生について、部位特異的変異誘
発について使用される一本鎖ＤＮＡ鋳型の産生について、多くの変異体の同時の
スクリーニングについて、および生成された変異体のＤＮＡ配列決定について特
に有用である。適切な原核生物宿主細胞には、Ｅ．ｃｏｌｉＫ１２株２９４
（ＡＴＣＣ受託番号３１，４４６）、Ｅ．ｃｏｌｉ株Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ受
託番号２７，３２５）、Ｅ．ｃｏｌｉＸ１７７６（ＡＴＣＣ受託番号３１，５
３７）、およびＥ．ｃｏｌｉＢが含まれる；しかし多くの他のＥ．ｃｏｌｉ株
（例えば、ＨＢ１０１、ＪＭ１０１、ＮＭ５２２、ＮＭ５３８、ＮＭ５３９）、
ならびに原核生物の多くの他の種および属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉ
ｓのような桿菌、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍまたはＳｅｒ
ｒａｔｉａｍａｒｃｅｓａｎｓのような他の腸内細菌、および種々のＰｓｅｕ
ｄｏｍｏｎａｓ種を含む）は全て宿主として使用され得る。原核生物宿主細胞ま
たは強固な細胞壁を有する他の宿主細胞は、好ましくは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら前
出、の１．８２章、中に記載されるとおりの塩化カルシウム法を使用して形質転
換される。あるいは電気穿孔が、これらの細胞の形質転換に使用され得る。原核
生物形質転換技術は、Ｄｏｗｅｒ，Ｗ．Ｊ．，ＧｅｎｅｔｉｃＥｎｇｉｎｅｅ
ｒｉｎｇ，ＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓａｎｄＭｅｔｈｏｄｓ，１２：２７５−２
９６，ＰｌｅｎｕｍＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏｒｐ．，１９９０；Ｈａｎａ
ｈａｎら，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｘｙｍｏｌ．２０４：６３，１９９１に示される。

【００６７】代表的な例として、ゲラニル二リン酸シンターゼをコードするｃＤＮＡ配列は
、異種宿主としてＥ．ｃｏｌｉにおける過剰発現用に（Ｎｏｖａｇｅｎから）市
販されている（Ｈｉｓ）₆・ＴａｇｐＥＴベクターに移入され得る。このｐＥＴ発現プラスミドは高レベルの異種発現系において幾つかの利点を有する。所望
のｃＤＮＡ挿入片は、インフレームで、６ヒスチジンをコードするプラスミドベ
クター配列に連結後、標的タンパク質のアミノ末端コドンに結合される高度に特
異的なプロテアーゼ認識部位（トロンビン）に連結する。この発現した融合タン
パク質のヒスチジン「ブロック」は、固定化した金属イオンへの非常にタイトな
結合を促進し、そして固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィーによ
る組換えタンパク質の迅速な精製を可能にする。次にヒスチジンリーダー配列は
、トロンビン、および固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィーによ
り再度精製したゲラニル二リン酸シンターゼを用いた精製タンパク質の処理によ
り、特異的なタンパク質分解部位で切断されるが、このときより浅いイミダゾー
ル勾配を使用して組換えシンターゼを溶出する一方で、ヒスチジンブロックをな
お吸着させておく。この過剰発現−精製系は高処理能で、優れた分解能を有し、
かつ速く、類似の結合挙動を示す夾雑Ｅ．ｃｏｌｉタンパク質の量（トロンビン
タンパク質分解前後）は極めて低い。

【００６８】当業者に明らかであるように、宿主細胞に適合性である種に由来するレプリコ
ンおよび制御配列を含有する任意のプラスミドベクターもまた、本発明の実施に
おいて使用され得る。通常このベクターは、複製部位、形質転換細胞における表
現型選択を提供するマーカー遺伝子、１つ以上のプロモーター、ならびに外来Ｄ
ＮＡ挿入用の幾つかの制限酵素部位を含むポリリンカー領域を有する。Ｅ．ｃｏ
ｌｉの形質転換に代表的に使用されるプラスミドには、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１
８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、およびＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＭ
１３が含まれ、その全てはＳａｍｂｒｏｏｋら、前出の１．１２−１．２０章に
記載される。しかし他の多くの適切なベクターは、同様に利用可能である。これ
らのベクターは、アンピシリンおよび／またはテトラサイクリン耐性をコードす
る遺伝子を含有し、これらのベクターで形質転換した細胞が、これらの抗生物質
の存在下で増殖することを可能にする。

【００６９】原核生物細胞ベクターにおいて最も通常に使用されるプロモーターには、βラ
クタマーゼ（ペニシリナーゼ）およびラクトースプロモーター系（Ｃｈａｎｇら
、Ｎａｔｕｒｅ３７５：６１５［１９７８］；Ｉｔａｋｕｒａら，Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ１９８：１０５６［１９７７］；Ｇｏｅｄｄｅｌら，Ｎａｔｕｒｅ２８
１：５４４［１９７９］）およびトリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系（Ｇ
ｏｅｄｄｅｌら，Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．８：４０５７［１９８０］
；ＥＰＯ特許出願公開第３６，７７６号）、ならびにアルカリフォスファターゼ
系が含まれる。これらが最も通常に使用される一方で、他の微生物プロモーター
は利用されてきた。そしてそれらのヌクレオチド配列に関する詳細は公開されて
おり、当業者がそれらをプラスミドベクターに機能的に連結することを可能にし
ている（Ｓｉｅｂｅｎｌｉｓｔら、Ｃｅｌｌ２０：２６９［１９８０］を参照
のこと）。

【００７０】細胞から通常分泌される多くの真核生物タンパク質は、アミノ酸配列の一部と
して内因性分泌シグナル配列を含む。従って、細胞質中に通常見出されるタンパ
ク質は、シグナル配列をタンパク質に連結することにより、分泌について標的化
され得る。これは、シグナル配列をコードするＤＮＡをこのタンパク質をコード
するＤＮＡの５’末端に連結し、次にこの融合タンパク質を適切な宿主細胞中に
発現することにより容易に達成される。このシグナル配列をコードするＤＮＡは
、シグナル配列を有するタンパク質をコードする任意の遺伝子から制限フラグメ
ントとして得られ得る。従って、原核生物、酵母、および真核生物シグナル配列
は、本発明の実施に利用した宿主細胞のタイプに依存して、本明細書中で使用さ
れ得る。例えばヒト成長ホルモン、プロインスリン、およびプロアルブミンを含
む幾つかの真核生物遺伝子のシグナル配列部分をコードするＤＮＡおよびアミノ
酸配列は公知であり（Ｓｔｒｙｅｒ，ＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙＷ．Ｈ．Ｆｒ
ｅｅｍａｎａｎｄＣｏｍｐａｎｙ，ＮｅｗＹｏｒｋ，ＮＹ，ｐ．７６９［
１９８８］）、適切な真核生物宿主細胞中にシグナル配列として使用され得る。
例えば酸性ホスファターゼ（Ａｒｉｍａら、Ｎｕｃ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．１１
：１６５７［１９８３］）、α因子、アルカリホスファターゼ、およびインベル
ターゼのような酵母シグナル配列は、酵母宿主細胞からの分泌を方向付けるため
に使用され得る。例えば、ＬａｍＢまたはＯｍｐＦ（Ｗｏｎｇら、Ｇｅｎｅ６
８：１９３［１９８８］）、ＭａｌＥ、ＰｈｏＡ、あるいはβラクタマーゼをコ
ードする遺伝子、ならびに他の遺伝子由来の原核生物シグナル配列は、原核生物
細胞由来のタンパク質を培養培地に標的化するために使用され得る。

【００７１】配列番号２に示される配列を有するゲラニル二リン酸シンターゼタンパク質は
、残基１〜４８のアミノ末端膜挿入配列を含み、配列番号２に示される実施態様
において、酵素をプラスチドに方向付ける。植物、動物、および微生物由来の代
替的な輸送配列は、本発明の実施に使用され、遺伝子産物を、細胞質、小胞体、
ミトコンドリア、または他の細胞成分に方向付け得るか、またはタンパク質を培
地への排出について標的化する。これらの考慮は、ゲラニル二リン酸シンターゼ
の過剰発現に適し、かつ任意の所望の位置において遺伝子産物機能を可能にする
細胞または無傷生物内の発現の方向付けに適する。

【００７２】複製配列、調節配列、表現型選択遺伝子、および目的のゲラニル二リン酸シン
ターゼＤＮＡをコードするＤＮＡを含む適切なベクターの構築は、標準の組換え
ＤＮＡ手順を使用して調製される。単離したプラスミドおよびＤＮＡフラグメン
トは、当該分野において周知のように、切断され、調整され、そして特定の順で
互いに連結されて、所望のベクターを生成する（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、
前出を参照のこと）。

【００７３】上述のとおり、ゲラニル二リン酸シンターゼ改変体は、好ましくは、部位特異
的変異誘発の方法を使用して生成される変異により産生される。この方法は、所
望の変異の配列およびオリゴヌクレオチドをＤＮＡ鋳型に安定にハイブリダイズ
させるために充分な数の近接するヌクレオチドの両方をコードする、特定のオリ
ゴヌクレオチドの合成および使用を必要とする。

【００７４】本発明の別の局面において、ゲラニル二リン酸シンターゼをコードする遺伝子
は、抗癌特性を有するモノテルペンを産生するモノテルペンシンターゼをコード
する遺伝子と組み合せて癌腫細胞中に導入され得る。抗癌特性を有するモノテル
ペンを産生するモノテルペンシンターゼをコードする遺伝子に加えて、ゲラニル
二リン酸シンターゼ遺伝子は、ガン細胞中に導入されるに違いない。なぜなら動
物細胞は、このモノテルペンの化学的な前駆体であるゲラニル二リン酸を天然で
は産生しないからである。抗癌特性を有するモノテルペンの例は、前出４頁に述
べられたとおり、リモネン、ペリリルアルコールおよびゲラニオールである。モ
ノテルペンシンターゼをコードする核酸配列の例は、以下同時係属特許出願に開
示されるが、この各々は本明細書中に参考として援用される：米国特許出願番号
０８／８４６，５２６「ＤＮＡＥｎｃｏｄｉｎｇＬｉｍｏｎｅｎｅＳｙｎ
ｔｈａｓｅｆｒｏｍＭｅｎｔｈａｓｐｉｃａｔａ」；米国特許出願番号０
８／９３７，５４０「ＭｏｎｏｔｅｒｐｅｎｅＳｙｎｔｈａｓｅｓｆｒｏｍ
ＣｏｍｍｏｎＳａｇｅ（Ｓａｌｖｉａｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）」および
ＰＣＴ特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９８／１４５２８「Ｍｏｎｏｔｅｒｐｅｎｅ
ＳｙｎｔｈａｓｅｓｆｒｏｍＧｒａｎｄｆｉｒ（Ａｂｉｅｓｇｒａｎｄ
ｉｓ）」。

【００７５】遺伝子のヒト細胞への導入に関する幾つかの方法は、当該分野において公知で
ある。例えば、細胞が体外にある場合、細胞ベースの療法を使用し、遺伝子を細
胞内に導入し得る。細胞ベースのアプローチは、患者由来の細胞を除去する工程
、治療的タンパク質をコードする遺伝子をこの除去した細胞中に導入する工程、
ならびに細胞移植または輸血によりこの細胞を患者に戻す工程を包含する。この
細胞ベースのアプローチが、重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）を処置するために使
用されているが、これは酵素アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）における遺伝的
欠損に起因する。ＳＣＩＤの遺伝子治療処置は、罹患した個体から抹消血リンパ
球またはの骨髄前駆細胞の取り出し、レトロウイルスベクターを使用する正常Ａ
ＤＡ遺伝子のこれらの細胞の染色体への導入、およびこの遺伝的に操作した細胞
のこの患者への再導入を包含した（Ｃ．Ｂｏｒｄｉｇｎｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ
２７０：４７０、４７４（１９９５）、Ｒ．Ｍ．Ｂｌａｅｓｅら、Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ２７０：４７５−４７９（１９９５）；Ｄ．Ｂ．Ｋｏｈｎら、Ｎａｔｕｒ
ｅＭｅｄ．１：１０１７−１０２３（１９９５））。初期の結果は、この遺伝
的に操作した細胞は長い期間持続し、ＡＤＡの低いレベルの発現が確立され得る
ことを実証した。

【００７６】アナログ細胞ベースのアプローチは、家族性高コレステロール血（ＬＤＬ−レ
セプター欠損）（Ｍ．Ｇｒｏｓｓｍａｎら、ＮａｔｕｒｅＧｅｎｅｔｉｃｓ
６：３３５４１（１９９４）；Ｍ．Ｇｒｏｓｓｍａｎら，ＮａｔｕｒｅＭｅ
ｄ．１：１１４８−１１５４（１９９５））およびゴシュ病（Ｊ．Ａ．Ｎｏｌｔ
ａら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９０：３４２−３４８（１９９２）；Ｌ．
Ｘｕら，Ｅｘｐｔｌ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２２：２２３−２３０（１９９４）；Ｔ
．Ｏｈａｓｈｉら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８９：１
１３３２−１１３３６（１９９２））を処置するために使用されている。

【００７７】遺伝子は、インサイチュで、または細胞を身体から取り出した後、ウイルスベ
クターにより導入され得る。例えば、レトロウイスは感染後、それらの遺伝子を
宿主細胞染色体中に挿入する能力を有するＲＮＡウイルスである。ウイルスタン
パク質をコードする遺伝子を欠くが、細胞に感染する能力を保持し、それらの遺
伝子を標的細胞の染色体中に挿入するレトロウイルスベクターが開発されてきた
（Ａ．Ｄ．Ｍｉｌｌｅｒ，Ｈｕｍ．Ｇｅｎ．Ｔｈｅｒ．１：５−１４（１９９０
））。レトロウイルスは分裂細胞のみに効率的に感染し、従って、レトロウイル
スが、身体から取り出された細胞に遺伝子を導入するために使用される場合、細
胞分裂は、増殖促進培地または特定の因子で刺激される。レトロウイルスのイン
ビボでの適用は、ウイルス産生細胞の腫瘍への直接の投与により達成されている
。感染した細胞により放出されるウイルス粒子が、近接する腫瘍細胞に感染する
。それ故腫瘍中、相対的に低いパーセントの細胞のみが、この標的化した遺伝子
を、ほとんどのまたは全ての腫瘍細胞中に最終的に導入するために、最初に感染
される必要がある（Ｋ．Ｗ．Ｃｕｌｖｅｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ２５６：１５５
０−１５５２（１９９２）。

【００７８】アデノウイルスベクターは、直接患者に投与されるように設計される。異なる
レトロウイルスベクターとは異なり、アデノウイルスベクターは、この宿主細胞
の染色体に統合しない。代わりに、アデノウイルスベクターを使用して細胞に導
入された遺伝子は、限られた期間の間持続する染色体外エレメント（エピソーム
）として核に維持される。アデノウイルスベクターは、気道上皮細胞、内皮細胞
、肝細胞および種々の腫瘍を含む多くの異なる組織において、分裂および非分裂
細胞にインビボで感染する（Ｂ．Ｃ．Ｔｒａｐｎｅｌｌ，ＡｄｖＤｒｕｇＤ
ｅｌＲｅｖ．１２：１８５−１９９（１９９３））。

【００７９】別のウイルスベクターは、単純ヘルペスウイルスである。このウイルスは、ニ
ューロンに治療遺伝子を送達するために、幾つかの最初の適用において使用され
ており、そして幾つかの形態の脳ガンに治療遺伝子を送達するために、おそらく
使用され得た、大きい二本鎖ＤＮＡウイルスである（Ｄ．Ｓ．Ｌａｔｃｈｍａｎ
，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２：１７９−９５（１９９４））。ワクシニ
アウイルスの組換え形態は、大きな挿入物に適合し得、そして相同的組み換え体
により生成される。今日まで、このベクターは、インターロイキン（ＩＬ）（例
えば、ヒトＩＬ−１β）ならびに補助的刺激分子Ｂ７−１およびＢ７−２を送達
するために使用されている（Ｇ．Ｒ．Ｐｅｐｌｉｎｓｋｉら，Ａｎｎ．Ｓｕｒｇ
．Ｏｎｃｏｌ．２：１５１−９（１９９５）；Ｊ．Ｗ．Ｈｏｄｇｅら，Ｃａｎｃ
ｅｒＲｅｓ．５４：５５５２−５５（１９９４））。

【００８０】遺伝子治療に対する別のアプローチは、ＤＮＡプラスミドの患者への直接導入
を包含する（Ｆ．Ｄ．Ｌｅｄｌｅｙ，Ｈｕｍ．ＧｅｎｅＴｈｅｒ．６：１１２
９−１１４４（１９９５））。このプラスミドＤＮＡは、身体内の細胞により取
り込まれ、組換えタンパク質の発現を方向付け得る。代表的なプラスミドＤＮＡ
は、このＤＮＡがＤＯＴＭＡ（１，２−ジオレイルオキシプロピル−３−トリメ
チルアンモニウムブロマイド）およびＤＯＰＥ（ジオレイルホスファチジルエタ
ノールアミン）のような１つ以上の脂質と結合するリポソームの形態で、細胞に
送達される。ＤＯＴＭＡを用いた処方は、動物モデルにおいて肺上皮細胞におけ
る発現を提供することが示されてきた（Ｋ．Ｌ．Ｂｒｉｇｈａｍら，Ａｍ．Ｊ．
Ｍｅｄ．Ｓｃｉ，２９８：２７８−２８１（１９８９）；Ａ．Ｂ．Ｃａｎｏｎｉ
ｃｏら，Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１０：２４−
２９（１９９４））。さらに、研究は、５％ＰＶＰ（５０，０００ｋＤａ）で処
方したプラスミドＤＮＡの筋肉注射は、生理食塩水単独中のＤＮＡの注射に見ら
れるレベルのほぼ２００倍に、筋肉中のレポーター遺伝子発現のレベルを増加す
る（Ｒ．Ｊ．Ｍｕｍｐｅｒら，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１３：７０１−７０９（１
９９６）；Ｒ．Ｊ．Ｍｕｍｐｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｓｙｍｐ．Ｃｏ
ｎｔ．Ｒｏｌ．Ｂｉｏａｃ．Ｍａｔｅｒ．２２：３２５−３２６（１９９５））
。プラスミドＤＮＡの筋肉内投与は、多くの月数を持ちこたえる遺伝子発現をも
たらす（Ｊ．Ａ．Ｗｏｌｆｆら，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１：３６３−３
６９（１９９２）；Ｍ．Ｍａｎｔｈｏｒｐｅら，Ｈｕｍ．ＧｅｎｅＴｈｅｒ．
４：４１９−４３１（１９９３）；Ｇ．Ａｓｃａｄｉら，ＮｅｗＢｉｏｌ．３
：７１−８１（１９９１），Ｄ．Ｇａｌら，Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．６８：１８
−２５（１９９３））。

【００８１】さらに、ＤＮＡの取り込みおよび発現はまた、プラスミドの甲状腺（Ｍ．Ｓｉ
ｋｅｓら，Ｈｕｍ．ＧｅｎｅＴｈｅｒ．５：８３７−８４４（１９９４））お
よび滑膜（Ｊ．Ｙｏｖａｎｄｉｃｈら，Ｈｕｍ．ＧｅｎｅＴｈｅｒ．６：６０
３−６１０（１９９５））への直接注射後、観察された。より低いレベルの遺伝
子発現が、肝臓（Ｍ．Ａ．Ｈｉｃｋｍａｎら，Ｈｕｍ．ＧｅｎｅＴｈｅｒ．５
：１４７７−１４８３（１９９４））、皮膚（Ｅ．Ｒａｚら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９１：９５１９−９５２３（１９９４））への間隙の注
射，気道への点滴注入（Ｋ．Ｂ．Ｍｅｙｅｒら，ＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ２
：４５０−４６０（１９９５））、内皮への適用（Ｇ．Ｄ．Ｃｈａｐｍａｎら，
ＣｉｒｃｕｌａｔｉｏｎＲｅｓ．７１：２７−３３（１９９２）；Ｒ．Ｒｉｅ
ｓｓｅｎら，ＨｕｍａｎＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ，４：７４９−７５８（１
９９３））後、ならびに静脈内投与後（Ｒ．Ｍ．Ｃｏｎｒｙら，Ｃａｎｃｅｒ
Ｒｅｓ．５４：１１６４−１１６８（１９９４））観察されている。

【００８２】種々のデバイスが、ＤＮＡの標的細胞に対する利用性を増強するように開発さ
れてきた。１つの単純なアプローチは、標的細胞を物理的に、ＤＮＡを含むカテ
ーテルまたは移植可能な材料と接触させることである（Ｇ．Ｄ．Ｃｈａｐｍａｎ
ら，ＣｉｒｃｕｌａｔｉｏｎＲｅｓ．７１：２７−３３（１９９２））。別の
アプローチは、高圧化で液体カラムを直接標的組織に投射するニードルフリーの
ジェット式噴射デバイスを利用することである（Ｐ．Ａ．Ｆｕｒｔｈら，Ａｎａ
ｌＢｉｏｃｈｅｍ．２０：３６５−３６８（１９９２））；（Ｈ．Ｌ．Ｖａｈ
ｌｓｉｎｇら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１７５：１１−２２（１９９４
））；（Ｆ．Ｄ．Ｌｅｄｌｅｙら，ＣｅｌｌＢｉｏｃｈｅｍ．１８Ａ：２２６
（１９９４））。

【００８３】遺伝子送達の別のデバイスは、「遺伝子銃」またはＢｉｏｌｉｓｔｉｃ^TMであ
り、これは、ＤＮＡコート微粒子を直接インビボで細胞の核に投射する弾道デバ
イスである。一旦核内に入ると、ＤＮＡは、金またはタングステン微粒子から溶
出し、標的細胞により発現され得る。この方法は、遺伝子を直接、皮膚、肝臓、
および筋肉に移入させるために、効果的に使用される（Ｎ．Ｓ．Ｙａｎｇら，Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８７：９５６８−９５７２（１９９０）
；Ｌ．Ｃｈｅｎｇら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９０：
４４５５−４４５９（１９９３）；Ｒ．Ｓ．Ｗｉｌｌｉａｍｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８８：２７２６−２７３０（１９９１））。

【００８４】標的化した遺伝子送達に対する別のアプローチは、分子結合体の使用であり、
これは、核酸またはＤＮＡ結合剤が、核酸の細胞への特異的標的化に対して結合
されたタンパク質または合成リガンドからなる（Ｒ．Ｊ．Ｃｒｉｓｔｉａｎｏら
，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：１１５４８−５２（
１９９３）；Ｂ．Ａ．Ｂｕｎｎｅｌｌら，Ｓｏｍａｔ．ＣａｌｌＭｏｌ．Ｇｅ
ｎｅｔ．１８：５５９−６９（１９９２）；Ｍ．Ｃｏｔｔｅｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：６０９４−９８（１９９２））。一
旦ＤＮＡがこの分子結合体に結合されると、タンパク質−ＤＮＡ複合体が生じる
。この遺伝子送達系は、異なるリガンドの使用によって多くの細胞型に標的化送
達し得ることが示されている（Ｒ．Ｊ．Ｃｒｉｓｔｉａｎｏら，Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：１１５４８−５２（１９９３））。例
えば、葉酸ビタミンは、葉酸レセプターを過剰発現する細胞（例えば、卵巣癌腫
細胞）へのプラスミドＤＮＡの送達を促進するために、リガンドとして使用され
る（Ｓ．Ｇｏｔｔｓｃｈａｌｋら，ＧｅｎｅＴｈｅｒ．１：１８５−９１（１
９９４））。マラリア円形スポロゾイトタンパク質は、肝細胞上のＡＳＯＲレセ
プター発現が低い条件下で（例えば、肝硬変、糖尿病、および肝細胞癌腫におい
て）、遺伝子の肝臓特異的送達のために使用されている（Ｚ．Ｄｉｎｇら，Ｊ．
Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：３６６７−７６（１９９５））。癌細胞における
上皮増殖因子（ＥＧＦ）のレセプターの過剰発現は、肺ガン細胞によるＥＧＦ／
ＤＮＡ複合体の特異的な取り込みを可能にしている（Ｒ．Ｃｒｉｓｔｉａｎｏら
，ＣａｎｃｅｒＧｅｎｅＴｈｅｒ．３：４−１０（１９９６））。

【００８５】抗癌活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の標的化した発現は、誘導可
能プロモーターの制御下にトランスジーンを配置することにより達成され得る。
例えば、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）遺伝子についてのプロモーターがベクター中に
取りこまれ、これは、膵臓癌腫の細胞特異的発現のような、腫瘍細胞中の得られ
るＣＥＡ発現ベクター構築物の細胞特異的発現を方向付けた（Ｊ．Ｍ．ＤｉＭａ
ｉｏら，Ｓｕｒｇｅｒｙ１１６：２０５−１３（１９９４））。ヒト界面活性
剤タンパク質Ａ遺伝子の調節配列が、このタンパク質を発現する非小細胞肺癌に
おいて細胞特異的発現を生成するために使用されている（Ｍ．Ｊ．Ｓｍｉｔｈら
，Ｈｕｍ．ＧｅｎｅＴｈｅｒ．５：２９−３５（１９９４））。

【００８６】ゲラニル二リン酸シンターゼタンパク質およびモノテルペンシンターゼタンパ
ク質を癌細胞中に導入するための別のアプローチは、この精製したタンパク質を
身体に直接導入することである。代表的には、このタンパク質は、脂質のような
別の分子と結合して導入され、このタンパク質を酵素的分解から保護する。例え
ば、ポリマー、特にポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の共有結合が、身体内で
特定のタンパク質を酵素的加水分解から保護し、従って半減期を延長するために
使用されている（Ｆ．Ｆｕｅｒｔｇｅｓら，Ｊ．ＣｏｎｔｒｏｌｌｅｄＲｅｌ
ｅａｓｅ，１１：１３９（１９９０））。多くのポリマー系がタンパク質送達系
について報告されている（Ｙ．Ｈ．Ｂａｅら，Ｊ．ＣｏｎｔｒｏｌｌｅｄＲｅ
ｌｅａｓｅ，９：２７１（１９８９）；Ｒ．Ｈｏｒｉら，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．
，６：８１３（１９８９）；Ｉ．Ｙａｍａｋａｗａら，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ
．７９：５０５（１９９０）；Ｉ．Ｙｏｓｈｉｈｉｒｏら，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ
ｌｅｄＲｅｌｅａｓｅ，１０：１９５（１９８９）；Ｍ．Ａｓａｎｏら，Ｊ．
ＣｏｎｔｒｏｌｌｅｄＲｅｌｅａｓｅ，９：１１１（１９８９）；Ｊ．Ｒｏｓ
ｅｎｂｌａｔｔら，Ｊ．ＣｏｎｔｒｏｌｌｅｄＲｅｌｅａｓｅ，９：１９５（
１９８９）；Ｋ．Ｍａｋｉｎｏ，Ｊ．ＣｏｎｔｒｏｌｌｅｄＲｅｌｅａｓｅ，
１２：２３５（１９９０）；Ｙ．Ｔａｋａｋｕｒａら，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ
．，７８：１１７（１９８９）；Ｙ．Ｔａｋａｋｕｒａら，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓ
ｃｉ．，７８：２１９（１９８９））。

【００８７】治療的タンパク質は、このタンパク質を吸収し得る身体膜への適用（例えば、
鼻の、胃腸の、および直腸の膜）により身体に導入され得る。このタンパク質は
、代表的には、浸管エンハンサーと併用して吸収性膜に適用される（Ｖ．Ｈ．Ｌ
．Ｌｅｅ，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒ．ＤｒｕｇＣａｒｒｉｅｒＳｙｓｔ
．，５：６９（１９８８）；Ｖ．Ｈ．Ｌ．Ｌｅｅ，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ
Ｒｅｌｅａｓｅ，１３：２１３（１９９０）；Ｖ．Ｈ．Ｌ．Ｌｅｅ編，Ｐｅｐｔ
ｉｄｅａｎｄＰｒｏｔｅｉｎＤｒｕｇＤｅｌｉｖｅｒｙ，Ｍａｒｃｅｌ
Ｄｅｋｋｅｒ，ＮｅｗＹｏｒｋ（１９９１）；Ａ．Ｇ．ＤｅＢｏｅｒら，Ｊ
．ＣｏｎｔｒｏｌｌｅｄＲｅｌｅａｓｅ，１３：２４１（１９９０））。例え
ば、ＳＴＤＨＦは、フシジン酸の合成誘導体（構造上胆汁酸塩に類似であるステ
ロイド界面活性剤）であり、経鼻送達のための浸管エンハンサーとして使用され
ている（Ｗ．Ａ．Ｌｅｅ，Ｂｉｏｐｈａｒｍ．Ｎｏｖ．／Ｄｅｃ．，２２，１９
９０）。

【００８８】さらに、治療タンパク質を持つミクロスフェアは身体に送達され得る。１つの
適用において、生物接着剤が、経鼻の経路に代わりに、タンパク質を有するミク
ロスフェアを保持するために使用された。吸収エンハンサーがこのタンパク質と
共にミクロスフェアー中に取り込まれた場合、バイオアべイラビリティーが増加
した（Ｌ．Ｉｌｌｕｍら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．，６３：２０７（１９９０
）；Ｎ．Ｆ．Ｆａｒｒａｊら，Ｊ．ＣｏｎｔｒｏｌｌｅｄＲｅｌｅａｓｅ，１
３：２５３（１９９０））。

【００８９】前述は、以下の代表的な例と関連してより完全に理解され得るが、この例にお
いて「プラスミド」は小文字ｐの後英数字で示される。本発明で使用される開始
プラスミドは、市販されているか、制限なく公に入手可能であるか、あるいは公
開された手順を使用してこのような利用可能なプラスミドから構築され得るかの
いずれかである。さらに、他の等価なプラスミドは当該分野において公知であり
、当業者に明らかである。

【００９０】ＤＮＡの「消化」、「切断」、または「開裂」は、ＤＮＡ中の特定の位置での
み作用する酵素でのＤＮＡの触媒的開裂を言う。これらの酵素は制限エンドヌク
レアーゼ呼ばれ、そして各酵素が開裂するＤＮＡ配列に沿った部位は制限部位と
呼ばれる。本発明において使用される制限酵素は市販されており、製造者により
提供された使用説明書に従って使用される（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出の１．６
０−１．６１章および３．３８−３．３９章もまた参照のこと）。

【００９１】制限消化物からの所与のＤＮＡフラグメントの「回収」または「単離」は、電
気泳動法、既知の分子量のマーカーＤＮＡフラグメントの移動度に対する目的の
フラグメントの移動度との比較による目的のフラグメントの同定、所望のフラグ
メントを含むゲル切片の切り出し、およびＤＮＡからのこのゲルの分離による、
ポリアクリルアミドゲルまたはアガロースゲル上の得られるＤＮＡフラグメント
の分離を意味する。この手順は一般的に公知である。例えば、Ｌａｗｎら（Ｎｕ
ｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．９：６１０３−６１１４（１９８２））、お
よびＧｏｅｄｄｅｌら（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，前出）を参照
のこと。

【００９２】以下の実施例は、本発明を実施するために現在意図されている最良の態様を単
に例示するが、本発明を限定すると解釈されるべきでない。本明細書中の全ての
文献引用は、表現上、参考として援用される。

【００９３】（実施例）（実施例１）（ゲラニル二リン酸シンターゼの単離）Ｍｅｎｔｈａゲラニル二リン酸シンターゼの精製ストラテジーを、経験的に開
発した。先行技術の教示は矛盾しており、そしてＭｅｎｔｈａからのゲラニル二
リン酸シンターゼの単離における使用のために適用し得なかった。例えば、Ｃｌ
ａｓｔｒｅら、前出は、完全精製されたゲラニル二リン酸シンターゼ（ブドウ由
来）の当該分野における唯一の例を提供する。Ｃｌａｓｔｒｅらの精製プロトコ
ールは、以下の工程からなる：硫酸アンモニウム沈殿、陰イオン交換クロマトグ
ラフィー（ＤＥＡＥおよびＭｏｎｏＱ）、ヒドロキシアパタイトクロマトグラ
フィー、疎水性（フェニル置換）クロマトグラフィー、ゲル浸透クロマトグラフ
ィー、および未変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動。Ｃｌａｓｔｒｅらは、硫
酸アンモニウム沈殿が、最も効果的な精製工程であると報告した。対照的に、本
明細書で報告されるようなＭｅｎｔｈａゲラニル二リン酸シンターゼの精製にお
いては、硫酸アンモニウム沈殿、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、疎
水性（フェニル置換）クロマトグラフィー、およびゲル浸透クロマトグラフィー
の技術は、すべて失敗した。特に、硫酸アンモニウム沈殿は、Ｍｅｎｔｈａゲラ
ニル二リン酸シンターゼの単離に適用した場合に非効率的であった。結果として
、以下の精製プロトコールが経験的に開発された。

【００９４】植物材料、基質、および試薬。ミント植物（Ｍｅｎｔｈａｓｐｉｃａｔａ）
を、以前に記載のように繁殖および成長させた（Ａｌｏｎｓｏら、Ｊ．Ｂｉｏｌ
．Ｃｈｅｍ．２６７：７５８２−７５８７、１９９２）。植物の茎（３〜７週齢
）から新たに出現した、急速に伸長する葉（５〜１０ｍｍ長）を、酵素精製のた
めの腺毛細胞の調製のために使用した（Ｇｅｒｓｈｅｎｚｏｎら、Ａｎａｌ．Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ．２００：１３０−１３８、１９９２）。[４−¹⁴Ｃ]イソペンテニ
ル二リン酸（５４Ｃｉ／ｍｏｌ）を、ＤｕＰｏｎｔ／ＮＥＮから購入した。ジメ
チルアリル二リン酸を、記載されるように合成した（Ｄａｖｉｓｓｏｎら、Ｍｅ
ｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．１１０：１３０−１４４、１９８５）。

【００９５】プレニルトランスフェラーゼ活性のアッセイ。１０μｌの酵素溶液に、１０％
グリセロール、１０ｍＭＭｇＣｌ₂、および１ｍＭＤＴＴを含む、９０μ ｌＭＯＰＳＯ緩衝液（２５ｍＭ、ｐＨ７．０）を添加した。ＤＭＡＰＰ（１
０μＭ）および[４−¹⁴Ｃ]ＩＰＰ（７μＭ）を、反応を開始するために添加し、
そして内容物に１ｍｌヘキサンを重層した。混合液を手短にボルテックスし、次
いで３１℃で１時間インキュベートした。インキュベート後、１０μｌの３Ｎ
ＨＣｌを添加し、内容物をボルテックスおよび遠心分離し、そして生成物の加水
分解を３１℃で２０分間継続した。加水分解が完了した後、再度反応混合液をボ
ルテックスおよび遠心分離して、その結果、酸に不安定なアリル二リン酸（また
は内在性のホスファターゼによる加水分解に由来するこれらのアルコール）由来
のこの生成物は、ヘキサン層に分配された。このヘキサン層を取り除き、そして
それに含まれる放射性生成物を、液体シンチレーションカウンターによって測定
した。

【００９６】生成物の同定。反応生成物の同定のために、このアッセイを１０倍にスケール
アップし、そして回収を改善するために、ペンタンをヘキサン重層の代わりに置
き換えた。上記のような酸加水分解およびペンタン層の除去の後に、反応混合液
を２×１ｍｌジエチルエーテルで抽出して、生成物の完全な回収を確実にした
。次いで、組み合わせた有機抽出物を無水Ｎａ₂ＳＯ₄で脱水し、そして１００μ
ｌにまで濃縮し、次いで放射性ＧＬＣ分析のための内部標準の添加およびさらな
る濃縮を行った。探索された生成物は：ファルネシル二リン酸由来の、内在性ホ
スファターゼによって触媒される加水分解からのすべてのｔｒａｎｓ−ファルネ
ソール、ならびに酸触媒再構成由来のｃｉｓ，ｔｒａｎｓ−ファルネソールおよ
びネロリゾール（計Ｃ₁₅アルコール）；ゲラニル二リン酸由来の、内在性ホスフ
ァターゼによって触媒される加水分解からのゲラニオール、ならびに酸触媒再構
成由来のネロールおよびリナロール（計Ｃ₁₀アルコール）；ならびに、計Ｃ₅アルコール（ジメチルアリルアルコール、イソペンテノール、およびジメチルビニ
ルカルビノール）である。

【００９７】ゲラニル二リン酸シンターゼを含有するミント腺毛抽出物の最初の調製。下記
の以前に記載された手順（Ｇｅｒｓｈｅｎｚｏｎら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ
．２００：１３０−１３８、１９９２）に従って、腺毛細胞クラスター（約２×
１０⁷）を４０ｇの葉組織から単離した。単離されたその細胞クラスターを、Ｋｐｉ緩衝液（５０ｍｌ、１００ｍＭ、ｐＨ７．４、５ｇＸＡＤ、０．５ｇ
ＰＶＰＰ、２５０ｍＭショ糖、１ｍＭＤＴＴ、１ｍＭＰＭＳＦおよび１ｍ
ＭＮａ₄ＥＤＴＡを含有する）に懸濁し、そして超音波処理（Ｂｒａｕｎ−ｓｏｎｉｃ２０００、全出力、４５秒間の氷中での冷却により分けた、５回の１
５秒間のバースト（ｂｕｒｓｔ））によって破壊した。超音波処理物を２０μｍ
のナイロンメッシュを通してろ過し、そしてろ過物に、ＸＡＤまたはＰＶＰＰを
含まない５０ｍｌのＫＰｉ緩衝液を添加して１００ｍｌにした。次いで、超音波
処理物を１８，０００ｇ（３０分間）で、次いで１９５，０００ｇ（９０分間）
で遠心分離し、そして上清を酵素の供給源として利用した。

【００９８】色素−リガンド相互作用クロマトグラフィー。２つの腺調製物（２００ｍｌ）
から合わせた上清を、１０％グリセロール、１ｍＭＤＴＴ、および１０ｍＭ
ＭｇＣｌ₂を含むＭｅｓ緩衝液（４ｌ、２５ｍＭ、ｐＨ６．２）中で透析した（２×、４℃、計１８時間）。透析した上清を、それぞれのチューブ中で透析
緩衝液で平衡化した５ｍｌのＤｙｅＭａｔｒｅｘＲｅｄＡゲル（Ａｍｉｃ
ｏｎ）を含む８本のポリプロピレンチューブ（５０ｍｌ）に等量に分けた。１時
間の穏やかな混合（Ｌａｂｑｕａｋｅ）後、内容物を８本の１．５×１２ｃｍの
ポリプロピレンカラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に注ぎ、重力によって流し、そして透
析緩衝液の４×容量で洗浄した。次いで、ゲラニル二リン酸シンターゼを、１０
％グリセロール、５ｍＭＫＰｉ、１ｍＭＤＴＴ、および１ｍＭＥＤＴＡ
を含むＢｉｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液（２４０ｍｌ、２５ｍＭ、ｐＨ７．０）で溶出
させた。全体の手順を０〜４℃で行った。

【００９９】陰イオン交換クロマトグラフィー。色素−リガンド相互作用クロマトグラフィ
ー工程からの溶出物を、１０％グリセロールおよび１ｍＭＤＴＴを含むＢｉ
ｓ−Ｔｒｉｓ緩衝液Ａ（２５ｍＭ、ｐＨ７．０）で平衡化したＳｏｕｒｃｅ１
５Ｑ分離メディア（ＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ）を含むＨＲ１０／１
０カラムにロードした。ゲラニル二リン酸シンターゼを、グラジエント（緩衝液
Ａ中で０〜４００ｍＭＫＣｌ；総量４００ｍｌ）を用いて溶出した。最も活性
の高い画分を収集し（６ｍｌ）、そして−８０℃で保存した。ファルネシル二リ
ン酸シンターゼは、４〜１０ｍＭＫＣｌで溶出した；ゲラニル二リン酸シンタ
ーゼを、１４０〜１８０ｍＭＫＣｌで溶出した；ゲラニルゲラニル二リン酸シ
ンターゼ活性は検出されなかった。陰イオン交換クロマトグラフィーは、ゲラニ
ル二リン酸シンターゼについて最も有意な精製工程を提供した。

【０１００】陰イオン交換クロマトグラフィー画分においてゲラニル二リン酸シンターゼタ
ンパク質を同定するために、ゲラニル二リン酸活性を含むそれぞれの画分からの
等容量をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにロードし、そしてそこに含まれるタンパク質を
分離および銀染色した。各々の画分におけるタンパク質染色強度とゲラニル二リ
ン酸シンターゼ活性レベルとの相関は、標的酵素として十分に分離された２９ｋ
Ｄａバンドの同定を可能にした。さらなる証拠を、較正されたゲル浸透クロマト
グラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５）によって提供した。これは、ゲラニル二
リン酸シンターゼが、約７０ｋＤａ（主ピーク）および約３０ｋＤａに一致する
容量で溶出されることを示し、少なくともいくらかの触媒活性を保持する３０ｋ
Ｄａサブユニットを生じる７０ｋＤａホモダイマーのネイティブ酵素に一致した
。

【０１０１】調製ＳＤＳ−ＰＡＧＥ。陰イオン交換クロマトグラフィー工程からの部分精製
されたゲラニル二リン酸シンターゼ（６０ｍｌ）を９５℃で１５分間加熱し、冷
却し、そして蒸留水中で透析した（２×、４ｌ、１８時間、４℃）。次いで、タ
ンパク質溶液を凍結乾燥して粉末にし、そして１００μｌのＳＤＳ緩衝液および
５０μｌの３×ローディング緩衝液中に懸濁し、そして標準的なプロトコール（
Ｌａｅｍｍｌｉ，Ｕ．Ｋ．，Ｎａｔｕｒｅ２２７：６８０−６８５，１９７０
）によって、１２．５％のアクリルアミドのＳＤＳ−ＰＡＧＥ[１５ｃｍ×１８ｃｍ×１．５ｍｍゲル]により３５ｍＡで６時間分離した。クマシーブルー染色は、１０個のタンパク質バンドを示し、最も顕著なバンドは２９ｋＤａに相当し
、そして参照としてのカルボニックアンヒドラーゼを用いて較正された染色強度
に基づいて、１０μｇタンパク質と見積もられた。２９ｋＤａタンパク質バンド
（これはイオン交換クロマトグラフィーにおけるゲラニル二リン酸シンターゼ活
性と一致したものである）を、ゲルから切り出し、そして微量遠心チューブ内で
合わせた。

【０１０２】アミノ酸分析およびタンパク質配列決定。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル切片に含まれ
る推定のゲラニル二リン酸シンターゼタンパク質（約１０μｇ）を、公表された
プロトコール（Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｊ．Ｅ．，Ｃｏｌｉｇａｎら編、「Ｃｕｒｒｅ
ｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＰｒｏｔｅｉｎＳｃｉｅｎｃｅ、第１巻」
、ＪｏｈｎＷｉｌｅｙａｎｄＳｏｎｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，１１．３．１
−１１．３．１３、１９９６）に従って、トリプシン（ＰｒｏｍｅｇａＶ５１
１／１，２）で消化した。次いで、ペプチド混合液を、蒸留水／１％トリフルオ
ロ酢酸（ＴＦＡ）（緩衝液Ａ）で平衡化したＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅ
ｍｓＣ１８カラム（ＡｑｕａｐｕｒｅＯＤＳ−３００）にロードし、そして
７０％ＣＨ₃ＣＮ、２９％蒸留水、および１％ＴＦＡからなる緩衝液Ｂを用いるグラジエント溶出（０〜６０分間、０％〜３７％緩衝液Ｂ／６０〜９０分
間、３７％〜７５％緩衝液Ｂ／９０〜１０５分間、７５％〜１００％緩衝液Ｂ）
によって分離した。５つの分離可能なペプチドを、ＷａｓｈｉｎｇｔｏｎＳｔ
ａｔｅＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｆｏｒＢｉｏｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｙａｎｄＢｉｏａｎａｌｙｓｉｓでのＥｄｍａｎ分解によるア
ミノ末端配列分析に供した。５つの消化生成物のうち２つが明白なペプチド配列
を生じた；ＦＧＬＹＱＧＴＬＲ（配列番号３）およびＲＶＩＩＥＩＳＲ（配列番
号７）。他の収集したペプチドは、低収率または混在物の存在のいずれかによっ
て、有用な配列情報を生じなかった。

【０１０３】（実施例２）（ゲラニル二リン酸シンターゼｃＤＮＡのクローニング）ショットガンクローニングおよび配列決定。ゲラニル二リン酸シンターゼ精製
プロトコルのさらなるスケールアップが実用的でないので、限られたゲラニル二
リン酸シンターゼペプチド配列情報は、配列に基づくクローニングストラテジー
を全く不可能にした。結果として、高度に濃縮された供給源、すなわち、Ｍｅｎ
ｔｈａにおけるモノテルペン生合成の独占的な供給源を構成する、ペパーミント
油腺細胞から単離されたｍＲＮＡから構築されたｃＤＮＡライブラリーから、ラ
ンダム配列決定の試みを開始した。

【０１０４】ミント植物（Ｍｅｎｔｈａｐｉｐｅｒｉｔａ）を、以前に記載されたように
（Ａｌｏｎｓｏら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：７５８２−７５８７、１
９９２）繁殖させ、そして生育させた。分泌細胞を５日齢のペパーミント葉から
単離し（Ｇｅｒｓｈｅｎｚｏｎら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００：１３０
−１３８、１９９２）、そして全ＲＮＡを、単離した分泌細胞から抽出した（Ｌ
ｏｇｅｍａｎｎら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６３：１６−２０、１９８７
）。Ｐｏｌｙ（Ａ）⁺−ＲＮＡをオリゴ（ｄＴ）セルロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上のクロマトグラフィーによって精製し、そして得られたｍＲＮＡの５μｇ
を使用して製造者（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）の説明書に従ってλＺＡＰｃＤＮ
Ａライブラリーを構築した。プラスミドを、ミント腺λＺＡＰＩＩファージミド
（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）の大量の切断物から精製した。プラスミドを、Ｔ３プ
ロモータープライマーおよびＡＢＩ配列決定装置で引き続き得られるデータを使
用して配列決定した（ＤｙｅＤｅｏｘｙＴｅｒｍｉｎａｔｏｒＣｙｃｌｅ
Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）。ＮＣＢＩ
ＢＬＡＳＴサーバーを、ＧＣＧＷｉｓｃｏｎｓｉｎＰａｃｋａｇｅ（Ｇｅｎ
ｅｔｉｃｓＣｏｍｐｕｔｅｒＧｒｏｕｐ，１９９４ＰｒｏｇｒａｍＭａ
ｎｕａｌｆｏｒｔｈｅＷｉｓｃｏｎｓｉｎＰａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉ
ｏｎ８，ＧｅｎｅｔｉｃｓＣｏｍｐｕｔｅｒＧｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ
、ＷＩ）のプログラムを用いて、データベース検索のために使用した。

【０１０５】最初に配列決定された１００クローンの内、１つの見込みのあるクローン（Ｍ
ｐ１０：１３）は、それが植物由来のゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼに対
して低い相同性（約２８％の同一性；約５０％の類似性）を示すが、植物由来の
ファルネシル二リン酸シンターゼにはほとんど相同性を示さない（約１６％の同
一性；約４０％の類似性）という点において、配列において「プレニルトランス
フェラーゼ様」であることが見出された。クローンＭｐ１０：１３の配列に由来
するＰＣＲプライマーｐＭｐ１３Ｆ（配列番号４）およびｐＭｐ１３Ｒ（配列番
号５）を使用して、１１３ｂｐの５’−フラグメント（配列番号６）を増幅した
。これは同じプライマーおよびα³²Ｐ−ｄＡＴＰを使用して標識された。得られ
るプローブを使用して、高いストリンジェンシーにおいて３０００のミント腺ラ
イブラリーλＺＡＰＩＩｃＤＮＡクローンをスクリーニングした。３０００の
λＺＡＰＩＩｃＤＮＡクローンを有するフィルターを、放射性標識した、１１
３ｂｐプローブで一晩、４２℃で、３０％ホルムアルデヒド、５×ＳＳＰＥ（０
．７５ＭＮａＣｌ、０．０５ＭＮａＨ₂ＰＯ₄、０．００５ＭＥＤＴＡ、ｐ
Ｈ７．４）、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ試薬（０．１％フィコール４００、０
．１％ポリビニルピロリドン、０．１％ウシ血清アルブミン）、０．１％
ＳＤＳおよび２０μｇ／ｍｌ変性剪断ニシン精子ＤＮＡ中でハイブリダイズさ
せた。次いでフィルターを、１×ＳＳＣ（０．１５ＭＮａＣｌおよび０．０１
６５Ｍクエン酸ナトリウム）および０．１％ＳＤＳ中で６５℃で、洗浄１回
当たり３０分間、３回洗浄した。２７個の陽性クローンを２回目のスクリーニン
グによって精製し、そしてＴ３およびＴ７プロモータープライマーを用いて配列
決定した。配列決定は、クローニングされた遺伝子が３つの対立遺伝子を意味す
ることを示した。

【０１０６】推定ゲラニル二リン酸シンターゼｃＤＮＡによってコードされるタンパク質の
生物学的活性のアッセイ。各々の推定ゲラニル二リン酸シンターゼ対立遺伝子か
らの１つの全長のインフレームのクローンを、Ｅ．ｃｏｌｉＸＬ１−Ｂｌｕｅ
に形質転換し、そしてＯＤ₆₀₀＝０．７にまで増殖させ、１ｍＭＩＰＴＧで誘導し、そして６時間２０℃で発現させた。細菌を遠心分離によって収集し、アッ
セイ緩衝液に再懸濁し、そして短い超音波処理によって破壊した。遠心分離によ
って破砕物からその抽出物を清澄化し、そして１ｍＭＰＭＳＦ、１ｍＭＥＤ
ＴＡおよび０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００がインキュベーション混合液に
含まれる以外は実施例１に記載のように、得られる上清を同時基質として¹⁴Ｃ−
ＩＰＰおよびＤＭＡＰＰを使用してアッセイした。クローンのうちの１つ、Ｍｐ
１３．１８と称されるものを、最も高いレベルの発現された活性を有することを
示し、そしてｃＤＮＡ挿入物は両方の鎖で完全に配列決定された（配列番号１）
。

【０１０７】Ｅ．ｃｏｌｉとは異なるコドン使用頻度を利用する植物およびアルギニンコド
ンＡＧＡおよびＡＧＧの存在は、Ｅ．ｃｏｌｉ中で異種発現された場合、真核生
物タンパク質の誤った翻訳または切断に導き得る。クローンＭｐ１３．１８配列
中の１４のアルギニンのうち９個がこれらのまれなＥ．ｃｏｌｉｔＲＮＡによ
ってコードされているので、ｐＥＴ３ａ由来のベクター、ｐＳＢＥＴａを発現の
ために選択した。このベクターは、強力なＴ７ｌａｃプロモーター由来のＴ７
ＤＮＡポリメラーゼを有する駆動発現に加えて、まれなアルギニンコドン使用頻
度についてのｔＲＮＡをコードする配列を有する（Ｓｃｈｅｎｋら、ＢｉｏＴｅ
ｃｈｎｉｑｕｅｓ１９：１９６−２００、１９９５）。

【０１０８】Ｍｐ１３．１８のオープンリーディングフレームをｐＳＢＥＴａに方向付けて
クローニングするために、部位特異的変異誘発によってＮｄｅＩ部位（ＣＡＴ
ＡＴＧ）を開始メチオニンに添加し（ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ、Ｓｔｒａｔａｇ
ｅｎｅ）、そして都合のよいＢａｍＨＩ部位（停止コドンの８ｂｐ下流）を利用
した。ベクターおよびＭｐ１３．１８の操作した誘導体（Ｍｐ１３．１８Ｎと称
す）を、ＢａｍＨＩおよびＮｄｅＩで二重消化し、そのフラグメントをゲル精製
し、そして一晩連結し、次いでＥ．ｃｏｌｉＸＬ１−Ｂｌｕｅコンピテント細
胞に形質転換した。得られるプラスミド（ｐＳＢ１３．１８と称す）を、精製し
、配列決定して所望でない変化が変異誘発の間に生じていないことを確認し、そ
してＴ７発現株、Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳに形質転換した
。クローンｐＳＢ１３．１８を、Ｅ．ｃｏｌｉでのゲラニル二リン酸シンターゼ
発現のすべての続く研究において使用した。Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現を上記の
ように行った。

【０１０９】ＧＰＰシンターゼペプチドアミノ酸配列情報を使用する、プラスミドＭｐ１３
．１８によってコードされる推定ＧＰＰシンターゼの同定の確認。推定ゲラニル
二リン酸シンターゼ遺伝子のＥ．ｃｏｌｉにおける機能的発現は、クローン化し
たｃＤＮＡがゲラニル二リン酸シンターゼをコードすることを絶対的には証明し
ない。ＧＰＰシンターゼの機能的発現は、すべての発現系（植物、微生物、およ
び動物）において使用される宿主細胞が、基質（ジメチルアリル二リン酸および
イソペンテニル二リン酸）およびＧＰＰシンターゼによって触媒される反応の生
成物（ゲラニル二リン酸）の両方を加水分解し得る、競合するホスファターゼを
含むという事実によって複雑化される。結果として、組換え酵素の無細胞抽出物
中に生じる偽陰性の可能性が存在する。

【０１１０】さらに、機能的発現は、すべての宿主細胞（植物、微生物、および動物）が内
在性のＦＰＰシンターゼを含むという事実によって複雑化される。この酵素は、
Ｃ₁₅ホモログファルネシル二リン酸への経路上でＧＰＰ（Ｃ₁₀）を合成し（図１
を参照のこと）、そしてＦＰＰシンターゼの変異型、改変型、またはさもなくば
分解型（例えば、組換え酵素の無細胞アッセイのプロセスにおいて細胞破損によ
って生成される）が、ゲラニル二リン酸中間体を放出し、従ってＧＰＰシンター
ゼの存在の偽陽性の指示を導くことが、当該分野で公知である（Ｗｉｓｅ，Ｍ．
Ｌ．およびＣｒｏｔｅａｕ，Ｒ．，Ｃａｎｅ，Ｄ．Ｅ．編、「Ｃｏｍｐｒｅｈｅ
ｎｓｉｖｅＮａｔｕｒａｌＰｒｏｄｕｃｔｓＣｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｉｓｏ
ｐｒｅｎｏｉｄｓ、第２巻」ＥｌｓｅｖｉｅｒＳｃｉｅｎｃｅ、Ｏｘｆｏｒｄ
、１９９７（印刷中）；Ｏｇｕｒａ，Ｋ．およびＫｏｙａｍａ，Ｔ．，Ｏｇｕｒ
ａ，Ｋ．およびＳａｎｋａｗａ，Ｕ．編、「ＤｙｎａｍｉｃＡｓｐｅｃｔｓ
ｏｆＮａｔｕｒａｌＰｒｏｄｕｃｔｓＣｈｅｍｉｓｔｒｙ」Ｋｏｄａｎｓ
ｈａ／ＨａｒｗｏｏｄＡｃａｄａｍｉｃＰｕｂｌｉｓｈｅｒｓＴｏｋｙｏ
、１〜２３頁、１９９７）。このようなアーチファクト的なＧＰＰの形成は、Ｅ
．ｃｏｌｉ抽出物中で観察され、そして各々の場合における極度な注意および再
現性、およびコントロールの使用が組換え酵素活性のモニタリングにおいて必要
とされる。

【０１１１】最後に、反応の基質の１つ（ジメチルアリル二リン酸）は、ＦＰＰシンターゼ
酵素の、結合したゲラニル二リン酸中間体を置換し得、そしてアッセイまたは反
応媒体におけるそのようなマイナーな変化でさえ、ＧＰＰシンターゼの存在につ
いての偽陽性の指示を生じ得る。本明細書中に記載されるアッセイは、この複雑
化を最小化するように設計されるが、この反応速度論的効果は、高度に可変性で
ありそして媒体の条件に依存する。従って、ＧＰＰシンターゼの機能的異種発現
を伴う厳しい複雑化が存在する。これは主に偽陽性に導き、クローンの同一性を
確認する手段として機能的発現における信頼性を妨害する。この理由のために、
機能的発現による陽性の指示に関わらず、ＧＰＰシンターゼクローンは、推定ゲ
ラニル二リン酸シンターゼｃＤＮＡ由来のアミノ酸配列データに、精製されたタ
ンパク質からの限定されて利用可能なＧＰＰシンターゼアミノ酸配列データを一
致させることによってのみ明白に確認され得る。

【０１１２】精製されたＧＰＰシンターゼ由来の２つのペプチド配列（配列番号３および配
列番号７）と、推定ＧＰＰシンターゼクローンＭｐ１３．１８（配列番号２）の
推定アミノ酸配列とのアラインメントは、９個のアミノ酸ペプチド（配列番号３
）が、推定ＧＰＰシンターゼ配列（配列番号２）のアミノ酸残基２５４〜２６２
に正確に一致し、一方８個のアミノ酸ペプチド（配列番号７）は、推定ＧＰＰシ
ンターゼ配列（配列番号２）のアミノ酸残基１８４〜１９１に正確に一致するこ
とを示した。

【０１１３】（実施例３）（プラスミドＭｐ１３．１８のゲラニル二リン酸シンターゼｃＤＮＡインサー
トの配列分析）Ｍｐ１３．１８（１１３１ｎｔ）のｃＤＮＡインサートによってコードされる
ゲラニル二リン酸シンターゼクローン（最も高い発現レベルのシンターゼ活性を
産生する）は、９３９ヌクレオチドのオープンリーディングフレームを含み、こ
れは計算された分子量３３，４６５を有する３１３アミノ酸のタンパク質に相当
する。最初の４８の推定アミノ酸残基は、色素体の標的配列の予想される特性、
すなわちセリン残基および小さくて疎水的な側鎖を有するアミノ酸残基に富み、
そして酸性残基が少ないことを示す（ｖｏｎＨｅｉｊｎｅら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ．１８０：５３５−５４５．１９８９）。推定の、アミノ末端標的
配列の存在は、植物細胞におけるモノテルペン生合成の色素体起源と一致する（
Ｗｉｓｅ，Ｍ．Ｌ．およびＣｒｏｔｅａｕ，Ｒ．，Ｃａｎｅ，Ｄ．Ｅ．編、「Ｃ
ｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅＮａｔｕｒａｌＰｒｏｄｕｃｔｓＣｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ：Ｉｓｏｐｒｅｎｏｉｄｓ、第２巻」ＥｌｓｅｖｉｅｒＳｃｉｅｎｃｅ
，Ｏｘｆｏｒｄ，１９９７（印刷中））。推定の移行ペプチド残基を除外するこ
とによって、分子量２８，４８５の成熟型のプロセシングされたタンパク質に一
致するアミノ酸配列は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってネイティブな酵素について決
定された約２９，０００（単量体サブユニットサイズ）の分子量と完全に一致す
る。

【０１１４】翻訳され、植物に由来するプレニルトランスフェラーゼ配列のアラインメント
は、Ｍｅｎｔｈａゲラニル二リン酸シンターゼと植物ファルネシル二リン酸シン
ターゼとの間の関係（約１６％同一性、約４０％類似性）よりも、Ｍｅｎｔｈａ
ゲラニル二リン酸シンターゼと植物ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼとの間
のより密接な関係（約２８％同一性、約５４％類似性）を示す。Ｍｅｎｔｈａゲ
ラニル二リン酸シンターゼが、ファルネシル二リン酸シンターゼよりもより密接
にゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼに関連しているという観察は、細胞質に
局在するファルネシル二リン酸シンターゼと異なる、ゲラニル二リン酸シンター
ゼおよびゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼの色素体局在化と一致する。Ｍｅ
ｎｔｈａゲラニル二リン酸シンターゼは、ファルネシル二リン酸シンターゼより
もゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼにより密接に関連するが、それにもかか
わらず、Ｍｅｎｔｈａゲラニル二リン酸シンターゼおよびゲラニルゲラニル二リ
ン酸シンターゼまたはファルネシル二リン酸シンターゼのいずれかのとの間の、
低い全体の同一性および類似性が存在することは明らかである。

【０１１５】ヌクレオチドレベルにおける同一性パーセントの比較は、ＭｅｎｔｈａＧＰ
ＰシンターゼｃＤＮＡとファルネシル二リン酸シンターゼｃＤＮＡクローンとの
間の最も高いレベルの同一性が、プラスミドＭｐ１３．１８のｃＤＮＡインサー
トとＺｅａｍａｙｓ（受託番号Ｌ３９７８９）からのファルネシル二リン酸シ
ンターゼｃＤＮＡとの間の３８％の同一性パーセントの値であることを示す。同
様に、ＭｅｎｔｈａＧＰＰシンターゼｃＤＮＡとゲラニルゲラニル二リン酸シ
ンターゼｃＤＮＡとの間の最も高いレベルの同一性が、Ｍｐ１３．１８のｃＤＮ
ＡインサートとＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ（受託番号Ｌ２５８
１３）からのゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼｃＤＮＡとの間の４４％の同
一性パーセントである。比較によって、完全に関連していない核酸配列は、約２
５％の同一性パーセントスコアを生じる。従って、Ｍｐ１３．１８のｃＤＮＡイ
ンサートのヌクレオチド配列は、ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼおよびフ
ァルネシル二リン酸シンターゼをコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列にわず
かに関連するのみである。

【０１１６】（実施例４）（ペパーミントＧＰＰシンターゼｃＤＮＡ（配列番号１）の、他の植物種から
のＧＰＰシンターゼメッセンジャーＲＮＡ分子へのハイブリダイゼーションを実
証するノーザン分析）ノーザンブロット分析を利用して、配列番号１に示されるペパーミントＧＰＰ
シンターゼｃＤＮＡと、他の植物種由来のＧＰＰシンターゼをコードするｍＲＮ
Ａ分子との間のハイブリダイゼーションを実証した。Ｍｅｎｔｈａｓｐｉｃａ
ｔａ、Ｍｅｎｔｈａｃａｎｄｉｃａｎｓ、Ｓａｌｖｉａｏｆｆｉｃｉｎａｌ
ｉｓ、およびＰｅｒｉｌｌａｆｒｕｔｅｓｃｅｎｓからＲＮＡを抽出し、そし
てこれらの種の各々からのＲＮＡのアリコートを、変性アガロースゲル上で分離
し、そしてナイロンメンブレン上にブロットした。そのメンブレンを、以下のハ
イブリダイゼーションおよび洗浄条件を利用して、放射標識したペパーミントＧ
ＰＰシンターゼｃＤＮＡ（配列番号１）でプローブした：３×ＳＳＣ中での、６
５℃、１６時間のハイブリダイゼーション、続いて以下の条件下での洗浄：２×
ＳＳＣ中、１８℃〜２５℃での、洗浄１回当たり２０分間、２回の洗浄、続いて
０．５×ＳＳＣ中、５５℃での、洗浄１回あたり３０分間、２回の洗浄。上記の
洗浄条件下で放射標識したペパーミントＧＰＰシンターゼｃＤＮＡ（配列番号１
）は、試験した植物種の各々由来の相同なＧＰＰシンターゼｍＲＮＡにハイブリ
ダイズしたままであった。

【０１１７】（実施例５）（ＰｅｒｉｌｌａｆｒｕｔｅｓｃｅｎｓおよびＳａｌｖｉａｏｆｆｃｉｎ
ａｌｉｓからクローン化された部分長ＧＰＰシンターゼｃＤＮＡ分子）ＧＰＰシンターゼタンパク質の一部をコードする部分長ｃＤＮＡフラグメント
を、ＰｅｒｉｌｌａｆｒｕｔｅｓｃｅｎｓおよびＳａｌｖｉａｏｆｆｃｉｎ
ａｌｉｓから抽出したｍＲＮＡから増幅した。配列番号２に示されるゲラニル二
リン酸シンターゼタンパク質のアミノ酸７６〜８２をコードする、配列番号１に
示される核酸配列の一部に対応する縮重正方向ＰＣＲプライマー（配列番号８）
を合成した。配列番号２に示されるゲラニル二リン酸シンターゼタンパク質のア
ミノ酸１２４〜１２９をコードする、配列番号１に示される核酸配列の一部に対
応する縮重逆方向ＰＣＲプライマー（配列番号９）を合成した。ＰＣＲ増幅を以
下の条件下で行った：２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ８．４）、５０ｍＭ
ＫＣｌ、５ｍＭＭｇＣｌ₂、０．５ｍＭ各ｄＮＴＰ、２．５単位のＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、５０ｐｍｏｌの配列番号８に示したプライマー、５０ｐｍ
ｏｌの配列番号９に示したプライマー、および鋳型としての１×１０⁶λＺＡＰＩＩｃＤＮＡライブラリーファージを含む１×ＰＣＲ緩衝液。以下の温度サイ
クリング条件を利用した：９４℃で２分間、続いて、９４℃で１分間、４５℃で
３０秒間、次いで７２℃で３０秒間の３０サイクル。ＰＣＲ生成物を、製造者（
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の説明書に従って、ＴＯＰＯ−ＴＡを使用してクローニ
ングした。

【０１１８】上記のＰＣＲ増幅条件を利用して、１６１ｂｐｃＤＮＡフラグメントを、Ｐｅ
ｒｉｌｌａｆｒｕｔｅｓｃｅｎｓ（配列番号１０）から増幅および精製した。
このフラグメント（配列番号１０）は、配列番号１に示されるペパーミントゲラ
ニル二リン酸シンターゼｃＤＮＡ配列のヌクレオチド２３１〜３９２に対応する
。部分長ＰｅｒｉｌｌａＧＰＰシンターゼｃＤＮＡ配列（配列番号１０）の、
配列番号１に示されるミントゲラニル二リン酸シンターゼｃＤＮＡ配列の対応す
る領域との比較は、２つの比較された核酸配列の間の８０％の同一性を示す。Ｐ
ｅｒｉｌｌａＧＰＰシンターゼ部分長ｃＤＮＡ配列（配列番号１０）によって
コードされるＧＰＰシンターゼタンパク質フラグメント（配列番号１１）の、ミ
ントＧＰＰシンターゼタンパク質（配列番号２に示されるＧＰＰシンターゼアミ
ノ酸配列のアミノ酸残基７６〜１２９）の対応する領域との比較は、２つの比較
されたアミノ酸配列の間の９０％の類似性を示した。

【０１１９】同様に、上記のＰＣＲ増幅条件を利用して、１６１ｂｐｃＤＮＡフラグメント
を、Ｓａｌｖｉａｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ（配列番号１２）から増幅および精
製した。このフラグメント（配列番号１２）は、配列番号１に示されるミントゲ
ラニル二リン酸シンターゼｃＤＮＡ配列のヌクレオチド２３１〜３９２に対応す
る。部分長ＳａｌｖｉａｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓＧＰＰシンターゼｃＤＮＡ
配列（配列番号１２）の、配列番号１に示されるミントゲラニル二リン酸シンタ
ーゼｃＤＮＡ配列の対応する領域との比較は、２つの比較された核酸配列の間の
７７％の同一性を示す。ＳａｌｖｉａＧＰＰシンターゼ部分長ｃＤＮＡ配列（
配列番号１２）によってコードされるＧＰＰシンターゼタンパク質フラグメント
（配列番号１３）の、ミントＧＰＰシンターゼタンパク質の対応する領域（配列
番号２に示されるＧＰＰシンターゼアミノ酸配列のアミノ酸残基７６〜１２９）
との比較は、２つの比較されたアミノ酸配列の間の８３％の類似性を示した。

【０１２０】（実施例６）（ミントＧＰＰシンターゼをコードするさらなる代表的な核酸配列）前出の実施例２においてより完全に示されるように、配列番号４および配列番
号５に示されるＰＣＲプライマーを使用して、１１３ｂｐｃＤＮＡフラグメン
ト（配列番号６）を増幅した。これは、Ｍｅｎｔｈａｐｉｐｅｒｉｔａ腺毛、
分泌細胞ｃＤＮＡライブラリーからの２７の相同なクローンを単離するためにプ
ローブとして使用される。配列決定は、２７のクローンが３つの対立遺伝子を意
味することを示した。この３つの対立遺伝子の群の各々由来の１つのクローンの
生物学的活性を、その３つの各々の代表的なｃＤＮＡを個々に発現するＥ．ｃｏ
ｌｉ由来の上清中のゲラニル二リン酸活性を測定することによって試験した。最
高レベルのゲラニル二リン酸シンターゼ活性を示すクローンを、Ｍｐ１３．１８
と命名した。Ｍｐ１３．１８のヌクレオチド配列を、配列番号１に示す。

【０１２１】さらに、他の２つのＧＰＰシンターゼ対立遺伝子の群のそれぞれからの代表的
なｃＤＮＡを配列決定した。１つのＧＰＰシンターゼ対立遺伝子の核酸配列（ク
ローン１３．１１と命名）は、配列番号１４に示し、そして配列番号１４に示さ
れる核酸配列によってコードされるＧＰＰシンターゼタンパク質は、配列番号１
５に開示される。他のＧＰＰシンターゼ対立遺伝子の配列（クローン１３．２５
と命名）は、配列番号１６に示され、そして配列番号１６に示される核酸配列に
よってコードされるＧＰＰシンターゼタンパク質は、配列番号１７において開示
される。

【０１２２】配列番号１、配列番号１４、および配列番号１６に示される核酸配列に加えて
、ペパーミントゲラニル二リン酸シンターゼタンパク質をコードする本発明の代
表的な核酸配列の例は、配列番号１８；配列番号１９；配列番号２０；配列番号
２１；および配列番号２２に示される。配列番号１８；配列番号１９；配列番号
２０；配列番号２１；および配列番号２２に示される核酸配列は、コンピュータ
を用いて生成された。遺伝コードの縮重を利用することによって、配列番号１８
；配列番号１９；配列番号２０；配列番号２１；および配列番号２２に示される
核酸配列は各々、異なる配列を有するが、各々が配列番号２に示されるタンパク
質をコードする。従って、配列番号１８；配列番号１９；配列番号２０；配列番
号２１；および配列番号２２に示される核酸分子の各々のオープンリーディング
フレームは、ヌクレオチド１〜ヌクレオチド９３９にわたる。

【０１２３】配列番号２、配列番号１５および配列番号１７に示されるタンパク質配列に加
えて、本発明の代表的なゲラニル二リン酸シンターゼタンパク質の例は、配列番
号２３；配列番号２４；配列番号２５；配列番号２６；配列番号２７に示される
。配列番号２３；配列番号２４；配列番号２５；配列番号２６および配列番号２
７に示されるアミノ酸配列は、配列番号２に示されるペパーミントＧＰＰシンタ
ーゼタンパク質配列における保存性アミノ酸置換を作製することによって、コン
ピュータを使用して生成された。

【０１２４】（実施例７）（ペパーミントゲラニル二リン酸シンターゼｃＤＮＡ（配列番号１）の、本発
明の他の核酸配列へのハイブリダイゼーション）本発明の核酸分子は、以下のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件
下で、配列番号１に示される核酸配列、または配列番号１に示される核酸配列の
相補的配列にハイブリダイズし得る：５×ＳＳＣ中、６５℃での１６時間のイン
キュベーション、続いて以下の条件下での洗浄：２×ＳＳＣ中、１８℃〜２５℃
での、１洗浄あたり２０分間で２回の洗浄；好ましくは、２×ＳＳＣ中、１８℃
〜２５℃での、１洗浄あたり２０分間で２回の洗浄、続いて０．５×ＳＳＣ中、
５５℃での３０分間の１回洗浄；最も好ましくは、２×ＳＳＣ中、１８℃〜２５
℃での１洗浄あたり１５分間で２回の洗浄、続いて０．２×ＳＳＣ中、６５℃で
の１洗浄あたり２０分間の２回洗浄。

【０１２５】本発明の核酸分子の、配列番号１に示される核酸配列、または、配列番号１に
示される核酸配列の相補的配列へのハイブリダイズする能力は、例えば、Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ（第
２版），Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｅ．Ｆ．ＦｒｉｔｓｃｈおよびＴ．Ｍａｎｉａ
ｔｉｓ編、９．５２〜９．５５（引用された頁は本明細書中で参考として援用さ
れる）に示されるように、ニトロセルロースフィルターまたはナイロンメンブレ
ン上に固定化された核酸に、放射性標識された核酸プローブをハイブリダイズす
る技術を利用することによって決定され得る。

【０１２６】（実施例８）（本発明のＧＰＰシンターゼタンパク質の特性）本発明の代表的なゲラニル二リン酸シンターゼタンパク質は、好ましくは表３
に示される特性を有する。

【０１２７】

【表３】

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、（ａ）ゲラニル二リン酸シンターゼ、（ｂ）ファルネシル二リン酸シ
ンターゼ、および（ｃ）ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼによって触媒され
る縮合反応を示す。

【図２】図２は、全てのフェニルトランスフェラーゼに共通する反応機構を示す。ゲラ
ニル二リン酸シンターゼによって触媒される反応を、ゲラニル機構の図示として
示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者ワイルダング，マークアール. アメリカ合衆国ワシントン 99111，コルファックス，ベネディクトロード 2252 (72)発明者バーク，チャールズシー. アメリカ合衆国アイダホ 83843，モスコウ，エヌ．ヘイズストリート 628 (72)発明者ガーシェンゾン，ジョナサンドイツ国ディー−07743 ジェナ，エバストラッセ１Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA10 CA04 DA01 DA02 EA04 GA11 HA01 4B050 CC03 DD13 LL01 4B065 AA88X AA89Y AA90X AA93X CA29 CA44

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ゲラニル二リン酸シンターゼタンパク質をコードする、単離
されたヌクレオチド配列。
【請求項２】被子植物ゲラニル二リン酸シンターゼタンパク質をコードす
る、請求項１に記載の単離されたヌクレオチド配列。
【請求項３】裸子植物ゲラニル二リン酸シンターゼタンパク質をコードす
る、請求項１に記載の単離されたヌクレオチド配列。
【請求項４】精油植物ゲラニル二リン酸シンターゼタンパク質をコードす
る、請求項１に記載の単離されたヌクレオチド配列。
【請求項５】Ｌａｍｉａｃｅａｅファミリーのメンバー中に天然に存在す
るゲラニル二リン酸シンターゼタンパク質をコードする、請求項１に記載の単離
されたヌクレオチド配列。
【請求項６】Ｍｅｎｔｈａゲラニル二リン酸シンターゼタンパク質をコー
ドする、請求項１に記載の単離されたヌクレオチド配列。
【請求項７】Ｍｅｎｔｈａｐｉｐｅｒｉｔａゲラニル二リン酸シンター
ゼタンパク質をコードする、請求項６に記載の単離されたヌクレオチド配列。
【請求項８】配列番号１、配列番号１４および配列番号１６のいずれか１
つに示されるヌクレオチド配列を含む、請求項７に記載の単離されたヌクレオチ
ド配列。
【請求項９】Ｓａｌｖｉａゲラニル二リン酸シンターゼタンパク質をコー
ドする、請求項１に記載の単離されたヌクレオチド配列。
【請求項１０】Ｓａｌｖｉａｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓゲラニル二リン酸
シンターゼタンパク質をコードする、請求項９に記載の単離されたヌクレオチド
配列。
【請求項１１】配列番号１２に示されるヌクレオチド配列からなる、請求
項１０に記載の単離されたヌクレオチド配列。
【請求項１２】Ｐｅｒｉｌｌａゲラニル二リン酸シンターゼタンパク質を
コードする、請求項１に記載の単離されたヌクレオチド配列。
【請求項１３】Ｐｅｒｉｌｌａｆｒｕｔｅｓｃｅｎｓゲラニル二リン酸
シンターゼタンパク質をコードする、請求項１２に記載の単離されたヌクレオチ
ド配列。
【請求項１４】配列番号１０に示されるヌクレオチド配列からなる、請求
項１３に記載の単離されたヌクレオチド配列。
【請求項１５】単離された組換えゲラニル二リン酸シンターゼタンパク質
。
【請求項１６】請求項１５に記載の、単離された組換え被子植物ゲラニル
二リン酸シンターゼタンパク質。
【請求項１７】請求項１５に記載の、単離された組換え裸子植物ゲラニル
二リン酸シンターゼタンパク質。
【請求項１８】請求項１５に記載の、単離された組換え精油植物ゲラニル
二リン酸シンターゼタンパク質。
【請求項１９】請求項１５に記載の、単離された組換えゲラニル二リン酸
シンターゼタンパク質であって、該タンパク質がＬａｍｉａｃｅａｓｅファミリ
ーのメンバー中に天然に存在する、単離された組換えゲラニル二リン酸シンター
ゼタンパク質。
【請求項２０】請求項１５に記載の、単離された組換えＭｅｎｔｈａゲラ
ニル二リン酸シンターゼタンパク質。
【請求項２１】請求項２０に記載の、単離された組換えＭｅｎｔｈａｐ
ｉｐｅｒｉｔａゲラニル二リン酸シンターゼタンパク質。
【請求項２２】配列番号２、配列番号１５および配列番号１７のいずれか
１つに示されるアミノ酸配列からなる、単離された組換えＭｅｎｔｈａｐｉｐ
ｅｒｉｔａゲラニル二リン酸シンターゼタンパク質。
【請求項２３】請求項１〜１４のいずれか１つに記載のヌクレオチド配列
を含む、複製可能発現ベクター。
【請求項２４】請求項１５〜２２のいずれか１つに記載のタンパク質をコ
ードするヌクレオチド配列を含む、複製可能発現ベクター。
【請求項２５】請求項２３または２４に記載のベクターを含む、宿主細胞
。
【請求項２６】宿主細胞においてゲラニル二リン酸シンターゼの産生を伝
えるかまたは増強する方法であって、該方法は、該宿主細胞において該タンパク
質の発現を可能にする条件下で、請求項２３または請求項２４に記載の発現ベク
ターを該宿主細胞に導入する工程を包含する、方法。
【請求項２７】前記宿主細胞が真核生物細胞である、請求項２６に記載の
方法。
【請求項２８】前記宿主細胞が植物細胞である、請求項２７に記載の方法
。
【請求項２９】前記宿主細胞が動物細胞である、請求項２７に記載の方法
。
【請求項３０】宿主細胞においてゲラニル二リン酸シンターゼの産生を伝
えるかまたは増強する方法であって、該方法は、請求項１５、請求項１６、請求
項１７、請求項１８、請求項１９、請求項２０、請求項２１および請求項２２の
いずれか１つに記載の単離された組換えタンパク質を該宿主細胞に導入する工程
を包含する、方法。
【請求項３１】哺乳動物宿主において癌を処置する方法であって、該方法
は、癌性細胞に、ゲラニル二リン酸シンターゼタンパク質およびモノテルペンシ
ンターゼタンパク質を導入する工程であって、該モノテルペンシンターゼタンパ
ク質が、ゲラニル二リン酸を抗癌特性を有するモノテルペンに転換し得る、工程
、を包含する方法。
【請求項３２】前記ゲラニル二リン酸シンターゼタンパク質が精油植物種
由来であり、そして前記モノテルペンシンターゼがリモネンシンターゼである、
請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】前記ゲラニル二リン酸シンターゼタンパク質がＭｅｎｔｈ
ａ種由来であり、そして前記モノテルペンシンターゼがリモネンシンターゼであ
る、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】哺乳動物宿主における癌を処置する方法であって、該方法
は、癌性細胞に、ゲラニル二リン酸シンターゼタンパク質をコードするヌクレオ
チド配列およびモノテルペンシンターゼタンパク質をコードするヌクレオチド配
列の両方を導入する工程であって、該モノテルペンシンターゼタンパク質が、ゲ
ラニル二リン酸を抗癌特性を有するモノテルペンに変換し得る、工程、を包含す
る方法。
【請求項３５】前記ゲラニル二リン酸シンターゼタンパク質が精油植物種
由来であり、そして前記モノテルペンシンターゼがリモネンシンターゼである、
請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】前記ゲラニル二リン酸シンターゼタンパク質がＭｅｎｔｈ
ａ種由来であり、そして前記モノテルペンシンターゼがリモネンシンターゼであ
る、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】配列番号１に示されるヌクレオチド配列、または配列番号
１に示されるヌクレオチド配列のアンチセンス相補体に、ストリンジェントな条
件下でハイブリダイズし得る、単離されたヌクレオチド配列。