JP2003010647A - 蛋白質を操作する方法及び装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】非特異ペプチド吸着表面を備え、物理的収集、
移動及び放出を目的として電気機械手段により容易に操
作可能な小型ビーズを提供する。 【解決手段】溶液から蛋白質あるいはペプチドを抽出、
同定および操作する方法および装置であって、標的成分
に対して親和力を備えるコーティングを施した常磁性ビ
ーズを利用する。一実施態様において、Ｃ１８をコーテ
ィングした常磁性ビーズを用いて蛋白質およびペプチド
を吸着する。このビーズを用いて、抗体の精製、固定化
およびアッセイを行うことができる。ビーズを循環させ
ることにより、溶液からモル量が何倍も多い結合パート
ナーを分離できる可能性がある。磁気プローブを用いて
ビーズを捕捉し、このビーズを選択した処理段階に移動
させる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、天然蛋白質及びペ
プチドを結合可能なコーティングを施したビーズに蛋白
質及びペプチドを可逆的に結合することにより、蛋白質
及びペプチドを操作する方法及び装置に関する。本発明
は特に、磁気ビーズ上に天然蛋白質及びペプチドを捕捉
する方法及び装置の提供を目的とする。

【０００２】

【従来の技術】寸法の小さな磁気ビーズあるいは粒子は
周知であり、数多くの分離及び識別を目的に利用されて
きた。小型磁気ビーズは、細胞や他の粒子を結合してこ
れを処理及び分離するために用いられている。例えば米
国特許第４，２３０，６８５号、同第３，９７０，５１
８号、同第５，５０８，１６４号、同第５，５６７，３
２６号及び同第４，０１８，８８６号を参照されたい。

【０００３】磁気ビーズは、ゼラチン、コロイド金属及
び他の物質で調製されるような様々なポリマーに金属粒
子を含有させて調製されている。この種のビーズの例が
米国特許第４，５８２，６２２号に開示されている。磁
気ビーズの反応部分への蛋白質の化学結合は、米国特許
第４，６２８，０３７号に開示されているように様々な
架橋基を用いて提案されてきた。蛋白質結合に開裂可能
な結合がある可能性もあるが、蛋白質結合は可逆的なも
のとして開示されてはいない。

【０００４】これまでストレプトアビジンをコーティン
グした磁気ビーズがビオチン化物質の固定化に用いられ
てきた。米国特許第４，４５２，７７３号には、抗体を
固定化し、蛋白質を結合するための、蛋白質Ａに対する
開裂性リンカーを含む多糖類(デキストラン)の磁気ビー
ズが提案されている。米国特許第５，１５８，８７１号
では蛋白質Ａをコーティングした磁気ビーズが提案され
ている。米国特許第４，２９７，３３７号には多孔質ガ
ラスで製造した磁器ビーズが開示されている。

【０００５】Ｌｏｕｇｈらに付与された米国特許第５，
９００，４８１号には、コーティングを施したビーズを
用いてＤＮＡを結合することによりそのＤＮＡを操作す
ることが開示されている。ビーズに結合される様々な分
子の操作に関する開示文献として他に、Ｇｉｒａｕｌｔ
ら著、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ６８
（１３）：２１２２〜６頁（１９９６年）及びＴａｎｇ
ら著、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ
２３（１６）：３１２６〜３１頁（１９９５年）が挙
げられる。

【０００６】小型ビーズ用に数多くの磁選機が市販され
ている。これに比較的安価な永久磁石を用いると、ミク
ロン寸法の強磁性粒子を溶液から容易に取出すことがで
きる。こうした磁選機の例として、マサチューセッツ州
ＷａｍｐｏｌｅのＣｉｂａｃｏｒｎｉｎｇ Ｍｅｄｉｃ
ａｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ製磁選機、米国マサチュ
ーセッツ州ＮｏｒｗｅｌｌのＳｅｒｏｎｏ Ｄｉａｇｎ
ｏｓｔｉｃｓ製ＭＡＩＡ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｓｅｐａ
ｒａｔｏｒ、米国ニューヨーク州ＧｒｅａｔＮｅｃｋの
ＤＹＮＡＬ，Ｉｎｃ．製ＤＹＮＡＬ ＭＰＣ−１及び米
国マサチューセッツ州ＣａｍｂｒｉｄｇｅのＡｄｖａｎ
ｃｅｄ Ｍａｇｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．製ＢｉｏＭａｇ
Ｓｅｐａｒａｔｏｒが挙げられる。

【０００７】Ｐａｒｔｏｎに付与された米国特許第５，
８３４，１９７号には、コーティングを施したビーズを
用いて液体から一定種を捕捉する方法が開示されてい
る。このビーズには抗原に対する選択的親和力が備わっ
ている。標識抗体を添加してその抗原を挟持させ、その
抗原を容易に検出及び回収できるように磁気ビーズに検
知可能な標識を結合させる。

【０００８】試料内に含まれる多種類の蛋白質を分離及
び精製する１つの方法は、二次元ゲル電気泳動法を用い
ることである。電気泳動分離処理を規定通りに蛋白質の
錯体混合物に適用して各分子種を分解する。二次元電気
泳動では２段階の垂直分離を利用して蛋白質スポットの
高精度分解パターンを形成し、その多くが有効な同種蛋
白質試料となり得る。参照文献例として、Ｏ’Ｆａｒｒ
ｅｌ著、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５０：４００７〜
４０２１頁（１９７５年）、Ａｎｄｅｒｓｏｎら著、Ａ
ｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．８５：３３１〜３４０頁（１
９７８年）、Ａｎｄｅｒｓｏｎら著、Ａｎａｌ．Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ．８５：３４１〜３５４頁（１９７８）、Ａｎ
ｄｅｒｓｏｎら著、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９３：
３１２〜３２０頁（１９７９年）及びＧｉｏｍｅｔｔｉ
ら著、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０２：４７〜５８
頁（１９８０年）が挙げられる。

【０００９】主に、微量化学エドマン分解による特徴づ
け、アミノ酸分析あるいは質量分光分析を目的に、ある
いは抗血清の生成を目的とする動物免疫用抗体の調製の
ために、こうしたスポットから単離した蛋白質を回収す
る方法が記載されてきている。実際のところ、現在では
対象となる蛋白質を含むスポットを切取ることにより、
このゲル内で発見された単離蛋白質を同定している。ト
リプシンを添加して蛋白質を切断し、ペプチドを生成さ
せた後、これを質量分析法（ＭＳ）により同定する。Ｒ
ｏｓｅｎｆｅｌｄら著、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏ
ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０３：１７３〜１７９頁（１９
９２年）に一例が開示されている。ペプチド分子量のパ
ターンあるいはその断片から、該当する配列データベー
スとの比較から推定により元の蛋白質を同定することが
できる。

【００１０】この実施に伴う難点の１つは、こうしたペ
プチドの量が少ないにもかかわらず、ゲルから周囲の液
体内に自由に拡散して容器壁と相互作用してしまうこと
である。ＭＳ解析での利用を目的とする濃度希薄溶液内
のペプチドは、少量の周囲液体の遠心型真空濃縮（Ｓｐ
ｅｅｄｖａｃ系）あるいは凍結乾燥により回収されてい
る。この回収ステップには、希釈ペプチドがプラスチッ
クや他の表面に曝露されており、これにペプチドが捕捉
されて研究者の目に見えなくなる可能性があることか
ら、数多くの難点がある。

【００１１】同様に、ゲル上のスポットから完全な蛋白
質を単離した場合に回収方法を用いる。電気溶離がその
１方法であり、この場合、蛋白質が電場の影響を受け
て、切取ったゲルスポットから移動する。大半の処理に
おいて、溶離した蛋白質は、予想される分子質量の蛋白
質に対して非透過性である膜に対する電気泳動により少
量の流体として回収される。この処理を実行するように
設計された装置は、ＢｉｏＲａｄ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ
Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅその他から販売
されている。こうした手法では、おそらくその遮断膜か
ら蛋白質を完全に回収できないために回収量が少ないと
いう欠点がある。

【００１２】その他周知である処理の例として、ＨＰ
Ｇ１０００Ａアミノ酸配列自動分析装置用Ｃ１８小型逆
相クロマトグラフィ用カラム内に蛋白質を吸収すること
が挙げられる。Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ製アミ
ノ酸配列分析装置では、上半分のＣ１８クロマトグラフ
ィ支持体と下半分のイオン交換支持体とを含む２部構成
小型使い捨てカラムである試料カートリッジを使用する
ことができる。異なる水溶液と有機溶剤とがこのカート
リッジ内を流動する際、その流れを、適用した蛋白質あ
るいはペプチドを損失しないようにこれらを常に「下
流」支持体上に固定化する方向に向けることができる。
これまで、ゲルスポット蛋白質をカラムにより電気溶離
することにより、Ｃ１８カラムの半分に蛋白質を適用す
る試みがなされてきた。しかしながら、カラム内に気泡
が形成されてこれが電流の流れを遮断する場合が多い。
うまく固定化された蛋白質は、化学的に変性され、直接
エドマン配列決定用に分解される。

【００１３】もう１つの手法は電気ブロットであり、こ
の手法ではゲルを蛋白質結合膜に対して挟持し、適した
電極及び緩衝剤により電場を印加することにより、その
蛋白質をゲルから膜を介して移動させ、そこで蛋白質を
固定化する。ニトロセルロース製ブロットシートを用い
るこのような一例は、Ｔｏｗｂｉｎら著、Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、米国、１９７９年、７６、
４３５０〜４３５４頁に開示されている。ゲルから分離
した蛋白質は間隔をあけた関係を保ちながら膜に侵入す
るため、分離されて膜に結合する蛋白質のパターンは、
ゲル内にて分解される蛋白質のパターンとほぼ同じであ
る。蛋白質と併用する場合のこの処理を一般に「ウェス
タンブロッティング法」と呼ぶ。このブロッティング手
法の欠点は、異なる形式で引き続き操作するために、ブ
ロットした蛋白質を膜から除去することが難しいことで
ある。

【００１４】ポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）
は疎水性に富み、蛋白質をよく結合する。二次元ゲルか
ら蛋白質を回収する、また二次元ゲルからペプチドの分
解あるいは転写をその場で利用するためにポリビニリデ
ンジフルオリド膜（Ｍｉｌｉｐｏｒｅ製Ｉｍｍｏｂｉｌ
ｏｎ（登録商標)）が用いられてきた。Ｋｅｎｎｅｄｙ
ら著、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．米国、
８５（１８）：７００８〜１２頁（１９８８年）及びＫ
ａｍｐｓら著、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，１７６
（１）：２２〜７頁（１９８９年）を参照されたい。帯
電基を含む膜もこれまで使用されてきている（Ｍｉｌｉ
ｐｏｒｅ製陽イオン膜）。分解された蛋白質の寸法が小
さい、あるいはゲル媒体の孔が非常に大きい場合（アガ
ロースゲルと同様）、蛋白質によっては外的作用による
溶離でゲルから回収できるものもある。

【００１５】溶離方法に共通する問題は、蛋白質溶液が
非常に希薄であるため回収が容易ではなく、少量かつ、
機械的方法での操作が難しい形態でしか回収できないこ
とである。ヒト血清に対する分解が高精度である二次元
電気泳動ゲルも周知である。Ａｎｄｅｒｓｏｎら著、Ｉ
ｎ：Ｔｈｅ Ｐｌａｓｍａ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ｆ．Ｐ
ｕｔｎａｍ編集、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、第２
版、Ｖｏｌ．４、２２１〜２７０頁（１９８４年）を参
照されたい。

【００１６】固定化した抗原を利用して抗体を繰り返し
吸着及び溶離することによりその特異的抗体の何倍もの
量を結果的に精製することが提案されている。Ａｎｄｅ
ｒｓｏｎら著、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６６
（１）：１５９〜７４頁（１９７５年）及びＡｎｄｅｒ
ｓｏｎら著、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６８（２）：
３７１〜９３頁（１９７５年）を参照されたい。

【００１７】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、非特
異ペプチド吸着表面を備え、物理的収集、移動及び放出
を目的として電気機械手段により容易に操作可能な小型
ビーズを提供することである。本発明のもう１つの目的
は、蛋白質あるいはペプチドを可逆的あるいは不可逆的
に付着させる小型磁気ビーズを製造及び利用することで
ある。ビーズに付着した蛋白質あるいはペプチドは、抗
体あるいは他の受容体に可逆的に結合され得るものであ
り、ビーズに対する蛋白質あるいはペプチドの場合と異
なる条件下になるとその可逆的結合はそれぞれ溶離性と
なる。

【００１８】本発明の別の目的は、蛋白質吸着ビーズ床
を貫通して切出したゲルスポットから蛋白質を電気溶離
することにより２Ｄ電気泳動ゲル上のスポットとして分
離した蛋白質など、精製前の蛋白質を回収及び処理する
方法及び装置を提供することである。本発明のもう１つ
の目的は、蛋白質あるいはペプチドを含む透過性支持体
材料全体を試薬と反応させて親和性標識をその蛋白質あ
るいはペプチドに結合させることにより、精製あるいは
透過性支持体材料からの分離前に蛋白質あるいはペプチ
ドに親和性標識を行うことである。

【００１９】さらに別の実施形態において、蛋白質ある
いはペプチドに結合した親和性標識は、蛋白質あるいは
ペプチドにおける分子の実効電荷及び等電点を変更する
ことはない。本発明の１つの目的は、マトリックス支援
レーザ脱離イオン化法−飛行時間型質量分析法（ＭＡＬ
ＤＩ−ＴＯＦ）質量分析あるいはエレクトロスプレー
（ＥＳ）質量分析用、特にＬＣ／ＭＳ／ＭＳ用に、磁気
ビーズから溶離することによりマトリクス内で蛋白質及
びペプチドを調製することである。

【００２０】多くの特異蛋白質に親和性である少量の抗
体を提供し、アフィニティクロマトグラフィにビーズに
固定化した蛋白質を用いることも本発明のもう１つの目
的である。さらに、１回の操作で２Ｄ電気泳動あるいは
親和力による捕捉などの分析方法により調製可能な量よ
りも抗体及び蛋白質の低濃度試料から大量の抗体及び蛋
白質を調製することが本発明のもう１つの目的である。

【００２１】磁気ビーズを操作するための機械的アセン
ブリの提供と、多種蛋白質及び抗体の処理、蛋白質ある
いは抗体の同時回収、錯体内における蛋白質あるいはそ
れに結合された付随成分の同定の自動化とが本発明のも
う１つの目的である。磁気ビーズの吸引及び解放を目的
とする永久磁石型プローブを提供することが本発明の別
の目的である。この場合、磁石は、複数の反応ステーシ
ョンにおける結合物質操作手段として、プローブ内を移
動することによりビーズを選択的に吸引及び解放する

【００２２】

【課題を解決するための手段】本発明では、蛋白質を二
次元電気泳動により分離した後、対象蛋白質を含むゲル
を切出し、特殊装置内にて対象蛋白質を電気溶離し、そ
の蛋白質を磁気ビーズ上に捕捉し、そのビーズを磁気プ
ローブで操作して洗浄し、その後好ましくは、同定を目
的として液浸、任意の復元、抗体との接触、抗体の溶
離、蛋白質の溶離あるいは蛋白質の分析を行う。別の方
法として、対象蛋白質をまず切断し、ペプチドを溶離及
び捕捉した後、洗浄して、質量分光分析計上に直接溶離
する。

【００２３】本発明では、分離、精製、洗浄及び溶離を
大量の溶液内で行うが、操作対象である蛋白質あるいは
ペプチドは量的に少量の溶体として回収可能である方法
で蛋白質及びペプチドの操作を実現する。この操作を、
プローブの位置を移動させ後、このプローブを交互に磁
気化及び消磁化することにより行う。本発明による目的
及び利点は基本的に、親和性結合要素あるいは疎水性コ
ーティングを表面に施した磁気ビーズを提供することに
より得られる。このコーティングは蛋白質あるいはペプ
チドを可逆的に結合することができるものである。

【００２４】本発明の目的から、増加したモル量の結合
パートナーを精製し、これが循環利用されて元の結合パ
ートナーに対してさらに大きなモル量を精製することの
できる共役系が得られる。本発明による上述の目的及び
利点を、第１の蛋白質を固定化するための結合親和力を
備えた第１のコーティングを施した第１の磁気ビーズ
と、第２の蛋白質を固定化するための結合親和力を備え
た第２のコーティングを施した第２の磁気ビーズとを含
むビーズ組成物を提供することによりさらに達成する。

【００２５】本発明による上述の目的及び利点を、試料
から蛋白質あるいはペプチドを回収する方法を提供する
ことによりまたさらに達成する。この方法は、試料の溶
液あるいは分散液を提供するステップと、その溶液を一
定量の磁気マイクロビーズに接触させるステップと、そ
のビーズを溶液から回収するステップとを含む。このマ
イクロビーズの外面には、蛋白質あるいはペプチドに対
して結合親和力を備えた疎水性コーティングが施されて
いる。このマイクロビーズを溶液に十分な時間をかけて
接触させ、蛋白質あるいはペプチドをそのビーズに結合
させる。

【００２６】本発明による上述の目的及び利点を、標的
化合物に対して結合親和力を備えたコーティングを施し
た一定量の磁気ビーズを提供するステップと、そのビー
ズを上記溶液に十分な時間をかけて接触させ、標的化合
物をビーズに付着させるステップと、そのビーズを溶液
から分離するステップと、標的成分をビーズから溶離す
るステップとを含む、溶液から標的成分を回収する方法
を提供することによりまたさらに達成する。

【００２７】本発明による上述の目的及び利点を、標的
成分の溶液あるいは分散液を、標的成分に結合親和力を
備えたコーティングを施した磁気マイクロビーズに十分
な時間をかけて接触させることにより、標的成分をビー
ズに結合させるステップと、プローブを作動させること
により分散液に電磁場を誘導してプローブ上にビーズを
捕捉するステップと、そのプローブ及び捕捉したビーズ
を第１の洗浄液に移動するステップと、そのプローブを
非作動状態にすることによりビーズを洗浄液内に解放し
て不純物を除去し、標的成分を単離するステップとを含
む、試料から標的成分を単離する方法を提供することに
よりまたさらに達成する。

【００２８】本発明による上述の目的及び利点を、標的
成分の溶液あるいは分散液を、その標的成分に対して結
合親和力を備えたコーティングを施した一定量の磁気マ
イクロビーズに接触させるステップと、濾過装置を備え
たチューブを介してその溶液あるいは分散液を吸引し
て、その濾過装置にビーズを収集するステップと、チュ
ーブの一端を分析装置入口内に位置付けるステップと、
そのビーズから標的成分を直接分析装置内に溶離して標
的成分を分析するステップとを含む、標的成分の分析方
法を提供することによりまたさらに達成する。この接触
ステップを十分な時間をかけて行うことにより、標的成
分をビーズに結合させる。

【００２９】本発明による上述の目的及び利点を、液体
から一定量の磁気ビーズを回収する装置を提供すること
によりまたさらに達成する。この装置は、一定量の磁気
ビーズを含む液体を入れる容器と、その容器を出入りし
て往復移動ができるように取付けられたプローブとを含
む。このプローブは、電磁場を選択的に形成することが
できるものであり、頂端部、底端部、及びその頂端部に
結合されたカラーを具備する。

【００３０】本発明による上述の目的及び利点を、溶液
あるいは分散液から標的化合物を分離する装置を提供す
ることによりまたさらに達成する。この装置は、第１の
導電性液体を入れる第１容器と、標的化合物を含む第２
の導電性液体を入れる第２容器と、第１液体に電流を流
すために第１容器内に配置された第１電極と、第２液体
に電流を流すために第２容器内に配置された第２電極
と、２つの電極の間に電流を流しつつ、第１液体を第２
液体から分離するために第２容器に接続された多孔質部
材と、多孔質部材上に配置され、標的化合物に対して親
和力を備えた材料のコーティングを施した一定量の磁気
ビーズと、２つの電極の間に電流を発生させることによ
り、標的化合物をビーズ方向に移動させてそのコーティ
ング材料に結合させる電気出力源とを具備する。

【００３１】本発明による上述の目的及び利点を、標的
化合物を溶液あるいは分散液から分離する装置を提供す
ることによりまたさらに達成する。この装置は、第１の
開口端部と第２の開口端部とを備え、第１の端部と第２
の端部との間に軸方向通路を設けた中空チューブと、そ
の軸方向通路内に配置された多孔質濾過部材と、チュー
ブの第２の端部に接続された吸引装置と、磁気ビーズを
捕捉するために軸方向通路内に電磁場を形成する磁石と
を具備する。

【００３２】本発明による上述の目的及び利点を、磁気
ビーズを移動させる装置を提供することによりまたさら
に達成する。この装置は、閉じた底端部及び開口した頂
端部を備えて一定量の磁気ビーズを含む液体を入れられ
る寸法である第１容器と、閉じた底端部及び、第１容器
の開口頂端部と連通する開口頂端部を含む第２容器と、
第1の容器からビーズを捕捉してそのビーズを第２容器
に移動させるための第１磁石とを具備する。

【００３３】他の態様において、本発明は、 １．疎水性コーティングを表面に施した磁気ビーズ。 ２．蛋白質あるいはペプチドを可逆的に結合可能なコー
ティングを表面に施した磁気ビーズ。 ３．蛋白質あるいはペプチドを可逆的に結合可能な磁気
ビーズ。 ４．リガンドを固定化する結合親和力を備えたコーティ
ングを施した磁気ビーズを含むビーズ組成物。 ５．第２のリガンドを固定化する第２の結合親和力を備
えた第２のコーティングを施した第２の磁気ビーズをさ
らに含む、請求項４に記載のビーズ組成物。 ６．試料から標的成分を回収する方法であって、前記標
的成分に対する結合親和力を備えたポリマーコーティン
グを外面に施したビーズの懸濁液を使用することを特徴
とする方法。 ７．ビーズ溶液を使用することを特徴とする、試料から
蛋白質あるいはペプチドを回収する方法。 ８．一定量の磁気ビーズを含む標的成分の溶液あるいは
分散液を使用することと、前記溶液あるいは分散液を、
濾過装置を具備するチューブを介して吸引し、前記ビー
ズを前記濾過装置に回収することと、を特徴とする標的
成分の分析方法。 ９．試料容器内にあって標的成分を含む溶液を使用し、
前記溶液を、前記標的化合物に対して結合親和力を備え
たコーティングを備えた有孔量の磁気ビーズと接触させ
ることを特徴とする、液体試料から標的成分を連続的に
回収する方法。 １０．液体から一定量の磁気ビーズを回収する装置であ
って、頂端部と底端部と前記頂端部に接続されたカラー
とを具備する往復移動型プローブにより、電磁場を選択
的に形成することのできる装置。 １１．複数の電極間に電流を流すことができるように第
１液体と第２液体との間に通路を設けたことを特徴とす
る、標的成分を溶液あるいは分散液から分離する装置。 １２．軸方向通路を含む中空部と、前記軸方向通路内に
電磁場を形成するための磁石とを備えたことを特徴とす
る、磁気ビーズを操作する装置。 １３．第１容器と、第２容器と、前記第１容器からビー
ズを捕捉して前記ビーズを前記第２容器へ移動させる磁
化性部材とを具備することを特徴とする、磁気反応性ビ
ーズを操作及び移動する装置。 であってもよい。

【００３４】本発明は特に、 １０１．蛋白質あるいはペプチドを可逆的に結合可能な
疎水性コーティングを施した表面を備えた磁気ビーズ。 １０２．前記ビーズが磁化性コア部を含み、前記コーテ
ィングが、少なくとも４炭素原子を含む鎖状炭化水素で
ある疎水性ペンダント基を含むポリマーである、請求項
１〜３及び請求項１０１のいずれかに記載のビーズ。 １０３．前記ペンダント基がＣ₁₂〜Ｃ₂₀アルキルであ
る、請求項１〜３、請求項１０１及び請求項１０２のい
ずれかに記載のビーズ。 １０４．前記疎水性コーティングに結合された蛋白質あ
るいはペプチドをさらに含む、請求項１〜３及び請求項
１０１〜請求項１０３のいずれかに記載のビーズ。 １０５．前記蛋白質が変性している、請求項１〜３及び
請求項１０１〜請求項１０４のいずれかに記載のビー
ズ。 １０６．前記ビーズの直径が約０．１〜約５ｍｍであ
る、請求項１〜３及び請求項１０１〜請求項１０５のい
ずれかに記載のビーズ。 １０７．前記コーティングが、Ｃ₁₈アルキル基をペンダ
ントさせたポリマー材料を含む、請求項１〜３及び請求
項１０１〜請求項１０６のいずれかに記載のビーズ。 １０８．第１のリガンドを固定化する結合親和力を備え
た第１のコーティングを施した第１の磁気ビーズと、第
１のリガンドとは異なる第２のリガンドを固定化する結
合親和力を備えた第２のコーティングを施した第２の磁
気ビーズと、を含むビーズ組成物。 １０９．前記第１のコーティングが第１のリガンドを結
合させて含み、前記第２のコーティングが第２のリガン
ドを結合させて含む、請求項４、請求項５及び請求項１
０８のいずれかに記載のビーズ組成物。 １１０．前記第１のリガンドに結合された第１の受容体
と、前記第２のリガンドに結合された第２の受容体とを
含む、請求項４、請求項５、請求項１０８及び請求項１
０９のいずれかに記載のビーズ組成物。 １１１．試料から標的成分を回収する方法であって、前
記試料を含む溶液を提供するステップと、前記標的成分
に対して結合親和力を備えたポリマーコーティングを外
面に施した一定量の磁気ビーズに前記溶液を十分な時間
をかけて接触させることにより、前記標的成分を前記ビ
ーズに結合させるステップと、前記溶液から前記ビーズ
を回収するステップと、を含む方法。 １１２．前記標的成分が蛋白質あるいはペプチドであ
り、前記ビーズ上の前記コーティングが蛋白質あるいは
ペプチドに対して結合親和力を備えている、請求項６、
請求項７及び請求項１１１のいずれかに記載の方法。 １１３．前記回収されたビーズを、洗浄液で洗浄するこ
とにより、前記ビーズから非結合材料を除去するステッ
プをさらに含む、請求項６、請求項７、請求項１１１及
び請求項１１２のいずれかに記載の方法。 １１４．前記ビーズから前記結合した蛋白質あるいはペ
プチドを溶離するステップをさらに含む、請求項６、請
求項７、請求項１１１〜１１３のいずれかに記載の方
法。 １１５．前記磁気ビーズが磁化性コア部を含む、請求項
６、請求項７、請求項１１１〜１１４のいずれかに記載
の方法。 １１６．前記ポリマーコーティング材料が、前記蛋白質
あるいはペプチドに対する結合親和力を備えた疎水性基
をペンダントさせて含む、請求項６、請求項７、請求項
１１１〜１１５のいずれかに記載の方法。 １１７．前記結合親和力が可逆性であるため、前記蛋白
質あるいはペプチドを放出可能である、請求項６、請求
項７、請求項１１１〜１１６のいずれかに記載の方法。 １１８．前記ビーズ上の前記コーティングが、前記蛋白
質あるいはペプチドと化学結合を形成することができ、
前記溶液を前記ビーズに十分な時間をかけて接触させる
ことにより、前記蛋白質あるいはペプチドを前記ビーズ
に結合させるステップと、前記溶液から前記ビーズを分
離するステップと、前記ビーズから前記蛋白質あるいは
ペプチドを切断するステップと、を含む、請求項６、請
求項７、請求項１１１〜１１７のいずれかに記載の方
法。 １１９．一定量のビーズが、第１の蛋白質あるいはペプ
チドに対する結合親和力を備えたコーティングを施した
第１のビーズと、第２の蛋白質あるいはペプチドに対す
る結合親和力を備えたコーティングを施した第２のビー
ズとを含む、請求項６、請求項７、請求項１１１〜１１
８のいずれかに記載の方法。 １２０．前記回収ステップが、前記溶液を濾過して、前
記ビーズを前記溶液から分離することを含む、請求項
６、請求項７、請求項１１１〜１１９のいずれかに記載
の方法。 １２１．前記回収ステップが、濾過部材を介して前記溶
液を吸収し、前記濾過部材上に前記ビーズを収集するこ
とを含む、請求項６、請求項７、請求項１１１〜１２０
のいずれかに記載の方法。 １２２．前記濾過部材が多孔質ガラスフリットである、
請求項６、請求項７、請求項１１１〜１２１のいずれか
に記載の方法。 １２３．前記濾過部材を中に取付けたチューブの第１端
部を前記溶液内に挿入するステップと、前記チューブの
第２端部から前記溶液を吸引して、前記ビーズを前記濾
過部材上に収集するステップと、を含む、請求項６、請
求項７、請求項１１１〜１２２のいずれかに記載の方
法。 １２４．前記ビーズに電磁場を当てて前記ビーズを前記
チューブ内に保持するステップと、前記電磁場を消滅さ
せて前記ビーズを前記フリットから分離するステップと
をさらに含む、請求項６、請求項７、請求項１１１〜１
２３のいずれかに記載の方法。 １２５．磁石を前記溶液内に挿入することにより、前記
ビーズを前記磁石に装着させるステップと、前記磁石を
前記溶液から除去するステップとを含む、請求項６、請
求項７、請求項１１１〜１２４のいずれかに記載の方
法。 １２６．前記磁石が電磁石であり、前記方法が、前記電
磁石を作動状態にして前記ビーズを付着させるステップ
と、前記電磁石を非作動状態として前記電磁石から前記
ビーズを取り外すステップとを含む、請求項６、請求項
７、請求項１１１〜１２５のいずれかに記載の方法。 １２７．前記溶液内にプローブを挿入するステップと、
前記プローブ周囲に磁場を形成して前記ビーズを前記プ
ローブに付着させるステップと、前記溶液から前記プロ
ーブを取出すステップとを含む、請求項６、請求項７、
請求項１１１〜１２６のいずれかに記載の方法。 １２８．前記プローブが電磁石である、請求項６、請求
項７、請求項１１１〜１２７のいずれかに記載の方法。 １２９．前記プローブが、中空スリーブと、前記中空ス
リーブ内に配置された磁石とを含む、請求項６、請求項
７、請求項１１１〜１２８のいずれかに記載の方法。 １３０．前記磁石が前記スリーブ内に着脱自在に取付け
られている、請求項６、請求項７、請求項１１１〜１２
９のいずれかに記載の方法。 １３１．前記磁石を前記スリーブ内に位置付けることに
より、前記ビーズを前記スリーブに付着させるステップ
を含む、請求項６、請求項７、請求項１１１〜１３０の
いずれかに記載の方法。 １３２．前記磁石を前記スリーブ内に位置付けることに
より、前記ビーズを解放するステップをさらに含む、請
求項６、請求項７、請求項１１１〜１３１のいずれかに
記載の方法。 １３３．前記蛋白質あるいはペプチドを含む支持媒体を
提供するステップと、前記支持媒体を溶液内に投入する
ステップと、前記蛋白質あるいはペプチドを前記溶液内
に分散させるステップとをさらに含む、請求項６、請求
項７、請求項１１１〜１３２のいずれかに記載の方法。 １３４．前記支持媒体が電気泳動ゲルである、請求項
６、請求項７、請求項１１１〜１３３のいずれかに記載
の方法。 １３５．前記溶液に電流を印加して、前記蛋白質あるい
はペプチドを前記ゲルから前記溶液内に拡散させるステ
ップをさらに含む、請求項６、請求項７、請求項１１１
〜１３４のいずれかに記載の方法。 １３６．前記溶液内に第１電極及び第２電極を適用する
ステップと、前記ビーズ及び前記ゲルを前記電極と前記
電極との間に位置付けるステップと、前記電流を印加す
ることにより、前記蛋白質あるいはペプチドを前記ビー
ズに向けて拡散させ、かつ前記ビーズに付着させるステ
ップを含む、請求項６、請求項７、請求項１１１〜１３
５のいずれかに記載の方法。 １３７．前記ビーズが床の形態をとり、前記方法が、前
記ビーズ床を前記ゲルと前記電極の少なくとも１つとの
間に位置付けるステップを含む、請求項６、請求項７、
請求項１１１〜１３６のいずれかに記載の方法。 １３８．前記電極と電極との間に透過膜を設け、前記ビ
ーズ床を前記透過膜上で支持するステップを含む、請求
項６、請求項７、請求項１１１〜１３７のいずれかに記
載の方法。 １３９．前記プローブを洗浄液内に挿入して、前記ビー
ズを洗浄するステップを含む、請求項６、請求項７、請
求項１１１〜１３８のいずれかに記載の方法。 １４０．前記プローブを洗浄液内に挿入するステップ
と、前記電磁場を不活性化することにより前記ビーズを
前記プローブから引き離して前記洗浄液内に分散させる
ステップと、前記プローブを作動させて前記電磁場を形
成することにより前記ビーズを前記プローブに再付着さ
せるステップと、前記ビーズ及び前記標的成分を前記洗
浄液から取出すステップとを含む、請求項６、請求項
７、請求項１１１〜１３９のいずれかに記載の方法。 １４１．前記溶離ステップが、前記ビーズを前記プロー
ブに付着させた状態で前記標的成分を前記ビーズから溶
離することを含む、請求項６、請求項７、請求項１１１
〜１４０のいずれかに記載の方法。 １４２．前記溶離ステップが、前記プローブを溶離液内
に挿入することと、前記プローブを非作動状態にするこ
とにより前記電磁場を消滅させて前記ビーズを前記溶離
液内に分散させ、前記標的成分を溶離することと、前記
プローブを作動させて前記電磁場を形成することにより
前記ビーズを前記プローブに付着させることと、前記プ
ローブ及びビーズを前記溶離液及び溶離された標的成分
から取出すこととを含む、請求項６、請求項７、請求項
１１１〜１４１のいずれかに記載の方法。 １４３．前記標的成分が変性蛋白質である、請求項６、
請求項７、請求項１１１〜１４２のいずれかに記載の方
法。 １４４．標的成分の溶液あるいは分散液を、前記標的成
分に対して結合親和力を備えたコーティングを施した一
定量の磁気ビーズに十分な時間をかけて接触させること
により、前記標的成分を前記ビーズに結合させるステッ
プと、前記溶液あるいは分散液を、濾過装置を取付けた
チューブを介して吸引し、前記ビーズを前記濾過装置上
に収集するステップと、前記チューブの一端を分析装置
の入口内に位置付けるステップと、前記ビーズから前記
標的成分を直接前記分析装置内に溶離して前記標的成分
を分析するステップと、を含む標的成分の分析方法。 １４５．前記チューブ周囲に電磁場を設けて、前記溶離
ステップ時に前記ビーズを前記チューブ内に保持する、
請求項８または請求項１４４に記載の方法。 １４６．前記チューブの周囲に、前記電磁場を設けるた
めの磁石を具備する、請求項８及び請求項１４４〜１４
５のいずれかに記載の方法。 １４７．前記磁石が前記チューブ上で摺動自在であり、
前記方法が、前記溶離ステップ時に前記磁石を前記濾過
部材に隣接するまで摺動させるステップを含む、請求項
８及び請求項１４４〜１４６のいずれかに記載の方法。 １４８．前記溶離ステップの後、前記チューブを標的成
分の第２溶液あるいは分散液に移すステップと、前記電
磁場を消滅させて前記ビーズを解放するステップとをさ
らに含む、請求項８及び請求項１４４〜１４７のいずれ
かに記載の方法。 １４９．前記チューブを介して液体を供給することによ
り、前記ビーズを前記第２溶液あるいは分散液内に運搬
するステップをさらに含む、請求項８及び請求項１４４
〜１４８のいずれかに記載の方法。 １５０．前記分析装置が質量分析計である、請求項８及
び請求項１４４〜１４８のいずれかに記載の方法。 １５１．液体試料から標的成分を連続的に回収する方法
であって、前記標的成分を含む液体を試料容器内に提供
し、前記液体を、前記標的化合物に対して結合親和力を
備えたコーティングを施した一定量の磁気ビーズに十分
な時間をかけて接触させることにより、前記標的成分を
前記ビーズ上の前記コーティングに結合させるステップ
と、前記ビーズを溶離液の入った溶離容器に移して前記
ビーズから前記標的化合物を溶離するステップと、前記
ビーズを前記試料容器に移すステップと、を含む方法。 １５２．前記ビーズに施す前記コーティングが、抗体、
抗原、疎水性コーティング材料、リガンド及び受容体か
らなる群から選択される、請求項９または請求項１５１
に記載の方法。 １５３．前記ビーズを前記試料容器から洗浄容器に移
し、前記溶離容器に移す前に前記ビーズから不純物を洗
い流すステップを含む、請求項９、請求項１５１及び請
求項１５２のいずれかに記載の方法。 １５４．前記溶離容器から前記標的成分を回収するステ
ップをさらに含む、請求項９及び請求項１５１〜１５３
のいずれかに記載の方法。 １５５．磁化性プローブを前記試料容器内に挿入し、前
記プローブを磁化して前記ビーズを捕捉させた後、前記
プローブを前記試料容器から引抜くステップをさらに含
む、請求項９及び請求項１５１〜１５４のいずれかに記
載の方法。 １５６．前記プローブを前記溶離容器に移して、前記ビ
ーズから前記標的成分を溶離するステップをさらに含
む、請求項９及び請求項１５１〜１５５のいずれかに記
載の方法。 １５７．前記プローブを消磁して、前記ビーズを前記溶
離剤内に解放するステップをさらに含む、請求項９及び
請求項１５１〜１５６のいずれかに記載の方法。 １５８．前記溶離ステップ後、前記プローブを磁化して
前記ビーズを前記溶離剤から捕捉させるステップをさら
に含む、請求項９及び請求項１５１〜１５７のいずれか
に記載の方法。 １５９．第１磁化性プローブと第２磁化性プローブと
を、軸を中心に回転自在な支持体部材に結合して設ける
ステップを含み、前記試料が第１の量の前記ビーズを含
み、前記溶離容器が第２の量の前記ビーズを含み、前記
方法が、前記支持体部材を、前記第１プローブが前記試
料容器内に挿入され、かつ第２プローブが前記溶離容器
内に挿入される第１位置まで移動するステップと、前記
第１と第２プローブとを磁化することにより、前記試料
容器が含む前記第１の量のビーズと前記溶離容器が含む
第２の量のビーズとをそれぞれ捕捉させるステップと、
前記支持体部材を上昇させて、前記第１及び第２プロー
ブを前記試料容器及び前記溶離容器からそれぞれ取出す
ステップと、前記支持体部材を回転させ、前記支持体部
材を、前記第１プローブが前記溶離容器内に挿入され、
かつ前記第２プローブが前記試料容器内に挿入される第
２位置まで下降させるステップと、前記複数のプローブ
を消磁することにより、前記第１の量のビーズを前記溶
離容器内に解放し、前記第２の量のビーズを前記試料容
器内に解放するステップと、を含む、請求項９及び請求
項１５１〜１５８のいずれかに記載の方法。 １６０．一定量の磁気ビーズを含む液体を入れる容器
と、電磁場を選択的に形成可能であり、頂端部、底端
部、及び前記頂端部に接合されたカラーを備え、前記容
器を出入りする往復運動ができるように取付けられたプ
ローブと、を含む、液体から一定量の磁気ビーズを回収
する装置。 １６１．前記カラーの外径が前記プローブの直径を上回
り、前記カラーに軸方向通路が設けられており、前記プ
ローブが、前記軸方向通路内の延出位置から後退位置ま
で往復運動できるように前記カラーに接続されている、
請求項１０または請求項１６０に記載の装置。 １６２．前記カラーが、前記プローブの前記底端部の方
向に向いた先細り状底面を含む、請求項１０、請求項１
６０及び請求項１６１のいずれかに記載の装置。 １６３．前記先細り状底面が前記プローブ方向に収束し
ている、請求項１０及び請求項１６０〜１６２のいずれ
かに記載の装置。 １６４．前記先細り状底面が実質的に凹状である表面を
含む、請求項１０及び請求項１６０〜１６３のいずれか
に記載の装置。 １６５．前記プローブが電磁石である、請求項１０及び
請求項１６０〜１６４のいずれかに記載の装置。 １６６．前記プローブが、頂端部及び閉じた底端部を含
む中空スリーブと、前記スリーブ内に摺動自在に収容さ
れ、前記頂端部から前記底端部まで可動である磁石とを
含む、請求項１０及び請求項１６０〜１６５のいずれか
に記載の装置。 １６７．前記プローブの前記頂端部が開口である、請求
項１０及び請求項１６０〜１６６のいずれかに記載の装
置。 １６８．前記プローブが、前記プローブを支持し、かつ
前記容器に対して前記プローブを上昇及び下降させる支
持アームを具備する、請求項１０及び請求項１６０〜１
６７のいずれかに記載の装置。 １６９．前記磁石が、前記支持アームに摺動自在に接続
されている、請求項１０及び請求項１６０〜１６８のい
ずれかに記載の装置。 １７０．前記磁石に接続された下方端部と、前記プロー
ブに対して往復移動ができるように前記プローブの前記
支持アームに接続された上方端部とを含む往復運動型ア
ームをさらに含む、請求項１０及び請求項１６０〜１６
９のいずれかに記載の装置。 １７１．前記磁石が前記スリーブの前記閉じた底端部に
ある第１位置から前記スリーブの前記底端部から距離を
おいた第２位置まで前記スリーブ内で前記磁石を往復運
動させる空気式アクチュエータを前記磁石に接続してさ
らに含む、請求項１０及び請求項１６０〜１７０のいず
れかに記載の装置。 １７２．標的成分を溶液あるいは分散液から分離する装
置であって、第１の導電性液体を入れる第１容器と、前
記標的化合物を含む第２の導電性液体を入れる第２容器
と、前記第１液体に電流を流すために前記第１容器内に
位置付けられた第１電極と、前記第２液体に電流を流す
ために前記第２容器内に位置付けられた第２電極と、前
記２つの電極の間に電流を通すための、前記第１液体と
前記第２液体との間に設けられた通路と、前記通路内に
配置され、前記標的化合物に対して親和力を備えた材料
でコーティングを施した一定量の磁気ビーズと、前記２
つの電極の間に電流を発生させることにより、前記標的
化合物を前記ビーズ方向に移動させて前記コーティング
材料に結合させる電気出力源と、を含む装置。 １７３．前記通路が多孔質部材を含む、請求項１１また
は請求項１７２に記載の装置。 １７４．前記第２容器の底端部に開口部があり、前記多
孔質部材が前記開口部をカバーするように前記第２容器
に結合されている、請求項１１、請求項１７２及び請求
項１７３のいずれかに記載の装置。 １７５．前記第２容器が前記第１容器内に配置されてい
る、請求項１１及び請求項１７２〜１７４のいずれかに
記載の装置。 １７６．前記ビーズが、前記多孔質部材上に床を形成し
ている、請求項１１及び請求項１７２〜１７５のいずれ
かに記載の装置。 １７７．前記標的化合物が、前記第２の導電性液体内に
沈水された多孔質固形支持体内に分散されている、請求
項１１及び請求項１７２〜１７６のいずれかに記載の装
置。 １７８．前記ビーズ上の前記コーティングが、蛋白質あ
るいはハプテンの誘導部分に親和性である、請求項１１
及び請求項１７２〜１７７のいずれかに記載の装置。 １７９．前記ビーズ上の前記コーティングが、ビオチン
化蛋白質に親和性であるアビジンあるいはストレプトア
ビジンである、請求項１１及び請求項１７２〜１７８の
いずれかに記載の装置。 １８０．前記ビーズが、前記標的化合物の特異部分に親
和性であるコーティングを具備している、請求項１１及
び請求項１７２〜１７９のいずれかに記載の装置。 １８１．前記通路が、前記第１容器と前記第２容器との
間に延在するチューブを含む、請求項１１及び請求項１
７２〜１８０のいずれかに記載の装置。 １８２．前記チューブが実質的にＵ字型である部分を含
み、前記ビーズが前記Ｕ字型部分内に位置付けられてい
る、請求項１１及び請求項１７２〜１８１のいずれかに
記載の装置。 １８３．第１の開口端部及び第２の開口端部を含み、前
記第１端部と前記第２端部との間に軸方向通路を設けた
中空チューブと、前記チューブの前記第２端部に接続さ
れた吸引装置と、磁気ビーズを捕捉するために前記軸方
向通路内に電磁場を形成する磁石と、を具備する磁気ビ
ーズ操作装置。 １８４．多孔質濾過部材を前記中空チューブの前記軸方
向通路内に配置してさらに含む、請求項１２または請求
項１８３に記載の装置。 １８５．前記磁石に軸方向通路が設けられており、前記
チューブが前記軸方向通路内に配置されている、請求項
１２、請求項１８３及び請求項１８４のいずれかに記載
の装置。 １８６．前記磁石が前記チューブの周囲を、前記濾過部
材に隣接する第１位置から前記濾過部材と距離をおいた
第２位置まで摺動可能である、請求項１２、請求項１８
３〜１８５のいずれかに記載の装置。 １８７．閉じた底端部と開口頂端部とがあり、第１の量
の磁気ビーズを含む第１液体を投入可能な寸法である第
１容器と、閉じた底端部と第２液体を投入する開口頂端
部とがある第２容器と、前記第１容器から前記ビーズを
捕捉して、前記ビーズを前記第２容器に移す第１の磁化
性部材と、を含む、磁気ビーズの操作及び移動装置。 １８８．前記磁化性部材が、第１の磁化性プローブと、
支持部材に接続された第２の磁化性プローブと、後退位
置と前記第１プローブが前記第１容器内に挿入されかつ
前記第２プローブが前記第２容器内に挿入される挿入位
置との間で前記支持部材を軸方向に移動させる操作装置
とを含む、請求項１３または請求項１８７に記載の装
置。 １８９．前記支持部材が前記軸方向に平行な軸を中心に
回転自在であり、前記第１の磁化性プローブが前記第２
容器内に挿入されることができ、前記第２の磁化性プロ
ーブが前記第１容器内に挿入されることができる、請求
項１３、請求項１８７及び請求項１８８のいずれかに記
載の装置。 １９０．前記第１容器の前記開口端部に接続された第１
端部と、前記第２容器の前記開口端部に接続された第２
端部とを含む導管をさらに具備する、請求項１３及び請
求項１８７〜１８９のいずれかに記載の装置。 １９１．前記導管が、前記第１容器の前記開口端部に接
続された第１端部と第２端部とを含む第１脚、及び、前
記第１脚が含む前記第２端部に接続された第１端部と前
記第２容器の前記開口端部に接続された第２端部とを含
む第２脚を具備する、請求項１３及び請求項１８７〜１
９０のいずれかに記載の装置。 １９２．前記第１脚が、前記第１容器に対して実質的に
上向き方向に延在し、前記第２脚が、前記第２容器に対
して実質的に上向き方向に延在する、請求項１３及び請
求項１８７〜１９１のいずれかに記載の装置。 １９３．前記磁石が、前記第１脚が含む前記第２端部に
配置されている、請求項１３及び請求項１８７〜１９２
のいずれかに記載の装置。 １９４．前記磁石が、前記第１脚を介して前記第１容器
から前記ビーズを引き寄せて前記ビーズを捕捉するよう
に、選択的に活性化される、請求項１３及び請求項１８
７〜１９３のいずれかに記載の装置。 １９５．前記磁石が、前記第２脚を介して前記第２容器
内に前記捕捉したビーズを落下させられるように、選択
的に非活性化される、請求項１３及び請求項１８７〜１
９４のいずれかに記載の装置。 １９６．第２磁石を、前記第２脚を介して前記第２容器
内に前記ビーズを吸引するように位置付けてさらに含
む、請求項１３及び請求項１８７〜１９５のいずれかに
記載の装置。 １９７．前記第１及び第２磁石が電磁石である、請求項
１３及び請求項１８７〜１９６のいずれかに記載の装
置。 １９８．チューブを前記第１容器と前記第２容器との間
に延在させてさらに含み、前記チューブが、前記第１及
び第２容器内の液体レベルより下に方向付けられてい
る、請求項１３及び請求項１８７〜１９７のいずれかに
記載の装置。 １９９．前記第１及び第２容器がそれぞれ、前記第１容
器と前記第２容器との間のチューブを充填する液体レベ
ルを維持するように位置付けられた液体入口を具備す
る、請求項１３及び請求項１８７〜１９８のいずれかに
記載の装置。 であってもよい。

【００３５】

【発明の実施の形態】蛋白質の説明としての用語「単
離」とは、他の細胞成分、特に他の蛋白質を本質的に含
まない化学組成物を意味する。用語「精製された」と
は、蛋白質の相対濃度が、蛋白質を精製していない組成
物の場合より大幅に高い状態をいう。純度及び同質性は
通常、ポリアクリルアミドゲルによる電気泳動あるいは
高性能液体クロマトグラフィなどの分析技術を用いて特
定される。一般に、蛋白質を精製あるいは単離すると、
これがその試料に含まれる高分子種全ての８０％以上を
占める。含有高分子種全ての９０％を上回るまで蛋白質
を精製すると好ましい。含有高分子種全ての９５％を上
回るまで蛋白質を精製するとより好ましく、本質的に同
質な状態、あるいは従来の手法では他の高分子種が顕著
に検出されない程度にまで生成すれば最も好ましい。

【００３６】用語「蛋白質」は、糖タンパク質、リポタ
ンパク質及び標識蛋白質ならびに低分子重量ペプチドな
どの天然及び人工的に誘導された異形分子を包括する。
「ペプチド」は主に、本発明においてその寸法とは無関
係に蛋白質の断片を指す。「小型分子」は、受容体に認
知可能である低分子重量の好ましくは有機分子である。
通常、小型分子は蛋白質に対する特異結合化合物であ
る。

【００３７】用語「結合成分」、「リガンド」あるいは
「受容体」は、様々な異種分子のいずれでもよく、これ
らの用語は同意として交換して使用可能である。用語
「リガンド」は主に、試料内で受容体に特異的に結合す
る化学成分をさす。リガンドは通常、蛋白質あるいはペ
プチドであるが、ハプテンとして作用する例などの小型
分子を含む場合もある。例えば、イムノアッセイにより
試料内の蛋白質を検出する場合、検出された蛋白質がリ
ガンドである。

【００３８】用語「受容体」は、試料内の化学成分をさ
し、リガンドに対して親和性であり、リガンドに結合可
能である。受容体は通常蛋白質あるいはペプチドである
が、小型分子を含む場合もある。例えば、抗体分子が受
容体として作用することも多い。本明細書でいう用語
「結合要素」は、結合対の要素、すなわち、化学的ある
いは物理的手段により一方の分子が第２の分子に特異的
に結合する２つの異なる分子をさす。周知の抗原及び抗
体の結合対要素のみならず、他の結合対の例として、ビ
オチンとアビジン、炭水化物とレクチン、ヌクレオチド
の相補配列、作動体と受容体分子、酵素補助因子と酵
素、酵素抑制剤と酵素、ペプチド配列とその配列あるい
は蛋白質全体に特異な抗体、ポリマーの酸と塩基、色素
と蛋白質バインダ、ペプチドと特異蛋白質バインダ(リ
ボヌクレアーゼ、Ｓ−ペプチド及びリボヌクレアーゼＳ
−蛋白質)、糖とホウ酸、及び結合アッセイにおける分
子会合を可能とする親和力を備えた同様の分子が挙げら
れるがこれに限定するものではない。さらに、結合対と
して、組換え技術あるいは分子工学により製造される分
析物類似体あるいは結合要素など、元の結合要素の類似
体である要素を挙げることができる。結合要素が免疫反
応体であれば、例えば抗体、抗原、ハプテンあるいはこ
れらの錯体が可能であり、「抗体」を用いる場合、単ク
ローンあるいはポリクローナル抗体、組換え蛋白質ある
いは抗体、キメラ抗体、混合物（単数あるいは複数）、
単鎖抗体提示ファージ抗体（ファージ全体を含む）、そ
の断片（単数あるいは複数）、ならびに抗体及び蛋白質
の結合要素の混合物でよい。

【００３９】用語「結合」には、永久的あるいは一次的
を問わず、あらゆる物理的あるいは化学的付着あるいは
密接な会合を含む。一般に、イオン結合の相互作用、水
素結合、疎水力、ファンデルワールス力などにより、対
象のリガンド分子と受容体との間を物理的に付着させる
ことができる。「結合」相互作用は、結合により化学変
化が起こる場合のように短い可能性がある。これは、結
合成分が酵素であり、その分析物が酵素用基質である場
合に一般的である。さらに、化学的連結が永久的あるい
は可逆的結合である可能性もある。結合成分と分析物と
が接触して生じる反応も本発明でいう結合の定義内であ
る。結合は、特に異なる条件下において、特異的となる
可能性がある。

【００４０】用語「結合した」あるいは「会合した」と
は、上述した２つの成分の密着した連結をさす。結合の
性質として、リンカー部分による化学的連結、物理的結
合、あるいは高分子錯体における場合などのパッケージ
ングである可能性がある。同様に細胞の成分全てがその
細胞に「会合」あるいは「結合」している。「親和性標
識」は、親和性標識への結合により操作したい対象蛋白
質に結合した化学的部分である。通常、親和性標識は、
リンカー基と親和性標識用に蛋白質を受容体から一定の
距離に保持する任意のスペーサ基とにより蛋白質に付着
する。通常の親和性標識として、リガンド及び受容体の
あらゆる種類が挙げられ、特にビオチン及びハプテンが
代表例である。

【００４１】用語「生物学的試料」には、組織、流体、
固体（好ましくは懸濁性）、生体全般、蛋白質を含む抽
出物及び断片が含まれる。こうした蛋白質試料は、１種
類あるいは複数種類の植物、微生物あるいは動物からの
細胞、組織あるいは流体から得られるものである。本発
明においては主に哺乳類からの試料を用いる。用語「ビ
ーズ」は、本発明で使用する収集反応容器内に嵌合する
小型粒子である。このビーズは、自らまたは添加部分あ
るいはコーティングを介して１種類あるいは複数種類の
蛋白質と相互作用する。

【００４２】用語「磁気(magnetically responsive)」
は、本来磁石である、一次的に磁気を帯びることができ
る、あるいは磁場に反応する材料をさす。その例とし
て、常磁性、反磁性、強磁性、超磁性などの材料が挙げ
られる。磁性を帯びてほしくない状況で強磁性粒子が磁
性を保持してしまう場合にも常磁性粒子であればそれを
表出できるため、常磁性粒子が特に好ましい。「磁気」
が、永久磁石ロッドや鉄含有小型ビーズなど、異なる性
能を備えた材料を指す場合もある。電場内を容易に移動
可能である高帯電ビーズもこの「磁気」に含まれるた
め、磁気ビーズもこの範囲である。

【００４３】用語「透過性支持体材料」は、蛋白質ある
いはペプチドが貫通でき、蛋白質あるいはペプチドの混
合物を分離可能な固体材料である。ゲル、その中でも電
気泳動ゲルが特に好ましい。本発明の目的は、二次元
（２−ＤＥ）電気泳動式ゲルで分離された蛋白質の回収
と、それに引き続くその利用及び同定とにある。ゲル内
の蛋白質量は通常非常に少ないことから、２−ＤＥで分
離された蛋白質を、蛋白質を有効に捕捉する形態で回収
する。ゲル内で単離される蛋白質の種類は非常に多いた
め、本発明は、自動制御方式を併用できるように設計さ
れている。必要であれば、本発明は、蛋白質あるいは抗
体を検出する双方のイムノアッセイ用に蛋白質に結合し
た抗体に特に関して電気泳動法による分離時に変性した
再生後の蛋白質分子を復元する処理、抗体に結合してい
る抗体の単クローン、単鎖、ポリクローナルあるいは断
片を選別する処理、あるいは抗体混合物（プール抗原を
用いた免疫により生成された例など）から蛋白質特異抗
体を反復捕捉する処理にも適合可能である。こうした処
理を循環的に行って、固定化抗原の何倍ものモル量の抗
体をゲルスポットから生成することができる。

【００４４】抗体に関して、これを固定化してアフィニ
ティクロマトグラフィカラムを製造し、この抗体を用い
てゲルあるいは天然源からより多くの抗原を精製し、こ
の処理を継続することにより、さらに多くの抗体及びそ
れによるさらに多くの抗原を得る方法を、抗体及び抗原
のほぼ全量が得られるまでブートストラップすることが
できる。

【００４５】蛋白質結合部分をコーティングした磁気ビ
ーズを使用することにより、固定化された蛋白質を、抗
体や他の蛋白質試料などの一連の異なる液体試薬に曝露
するために、高処理能力を備えた機械的試料処理と同じ
ように容易に運搬する手段が得られる。ゲルスポット内
の蛋白質量が少ないため、この蛋白質を表面に吸着させ
てしまうとこれを簡単に損失してしまう。これがプラス
チック表面で起こると特に問題である。本発明による装
置全体について、蛋白質を損失しないようにその表面を
「ブロッキング剤」でコーティングすると好ましい。適
したブロッキング剤として、コラーゲン、ゼラチン（特
に冷水魚皮ゼラチン）、スキムミルク、血清蛋白及び、
蛋白質と反応しない疎水性部分及びも親水性部分を含む
数多くの化合物が挙げられる。

【００４６】二次元ゲル上に分離された蛋白質を単離
し、次の処理に利用できるようにする選択肢は限られて
いる。従来技術における１つの方法は、その蛋白質を膜
に結合することであり、これは２−ＤＥ分離（すなわち
ウェスタンブロッティング）での位置と同じように間隔
を開けた状態で数多くの蛋白質をシート上に固定化した
大型シートの形態をとることができる。あるいはこのブ
ロットを、複数の小片として、あるいはアレイ（例えば
９６ウェルプレートの底部に）に搭載する複数片として
製造あるいは切断することもできる。膜上に固定化する
（ウェスタンブロッティングのように）と、引き続く検
出（コロイド金染色によるなど）用に蛋白質をうまく回
収することができるが、各蛋白質が結合する膜領域を次
のステップにおける処理ごとに切り離すことは難しい。
膜から蛋白質を完全に回収することが難しいため、回収
量が少なくなる。ブロッティングを各スポットについて
行うと（フィルタがニトロセルロースあるいはＰＶＤＦ
などの蛋白質結合膜である９６ウェルフィルタ底部プレ
ートなど）、フィルタ領域がスポットより大幅に広くな
りがちであるため（少なくとも現在のプレートでは）、
フィルタの他の領域における結合が非特異性となる問題
がおこる。固定化されたスポット蛋白質に抗体混合物及
び洗浄液を適用すると、多くのウェルフィルタ上に流動
が繰返される。

【００４７】もう１つの方法は、蛋白質が陽極に向かう
移動方向においてその通路にイオンに対して透過性であ
るが蛋白質には非透過性である膜を配置することにより
蛋白質を「捕獲」するように設計された装置において、
単離して切出したゲル領域（理想としては１種類の蛋白
質を含有）から蛋白質を電気溶離することである。蛋白
質を膜表面近くで少量の液体として収集し、後に構造的
特徴づけに用いる、あるいは次の作業用の表面に固定す
ることができると理想的である。少ない容量での作業を
可能とするため、９６ウェルプレートなどの表面に固定
すると好ましい。蛋白質を、その密度や固定化された他
の蛋白質との関係から固着する。

【００４８】溶離方法に伴う共通の問題は、蛋白質を、
少量で、ほぼ損失することなく高効率で（十分な量を確
保するため）、しかも機械的方法による次の操作が容易
な形態で回収することが容易ではないことである。次の
操作を可能にする形態でゲル内の蛋白質を全て回収でき
れば、分離した蛋白質の定量測定及び幾つかの用途に向
けた有効利用が可能となる。二次元ゲルスポット内の蛋
白質量が微量であることから、多くの用途で蛋白質を高
効率で回収する必要がある。本発明では、蛋白質に接着
する材料によるコーティングを施した、あるいは親和性
部分を装着して含むビーズを用いることにより、この難
点を克服する。磁気ビーズが小型であれば、操作、洗
浄、少量の試薬内への投与が容易であり、蛋白質を少量
ずつ回収できるため、小型磁気ビーズが特に好ましい。

【００４９】蛋白質は、共有化学結合、強力で特異な非
共有リガンド−受容体結合、あるいはそれより弱い非共
有結合によりビーズに固定化することができる。リガン
ド−受容体結合の例として、ビオチン−ストレプトアビ
ジン／アビジンあるいは抗体−抗原の相互作用が挙げら
れる。ビオチン−ストレプトアビジンは非共有型である
が、親和力が非常に高く（解離定数が約１０¹⁵）、抗原
（ｐＨ２、４Ｍグアニジン、２Ｍチオシアン酸アンモニ
ウム、あるいは１％ＳＤＳなど）から抗体を解離するた
めに利用可能な室温溶解条件の範囲内で保存することが
できる。ストレプトアビジン自体は非常に安定で、磁気
ビーズに必要な操作時にビーズから剥離することはあま
りない。これより弱い非共有結合の例として、ＰＶＤＦ
とこの材料の膜上に吸着された蛋白質との間の結合を例
とする、水素結合、疎水力などが挙げられる。

【００５０】上記の他にも、ビーズに結合したハプテン
あるいはエピトープ誘導蛋白質及び、抗ハプテンあるい
は抗エピトープ抗体などの化学的親和性部分も利用可能
である。親和力による結合が起こった後、化学的架橋に
より共有結合が形成されて、その付着状態は永久的とな
る可能性がある。有機化学部分も結合要素として利用可
能であり、この場合、蛋白質及びビーズ表面は、レクチ
ンと糖あるいは多糖、蛋白質ＡあるいはＧと抗体Ｆｃ、
ホルモンとホルモン受容体、Ｔ細胞受容体と抗原、補酵
素/補助因子と酵素、フェニルボロン酸とサリチルヒド
ロキサム酸、及び互いに反応するが一般に蛋白質とは反
応しない他の化学部分対などの結合要素に誘導される。

【００５１】共有結合あるいは非常に強力な非共有結合
は、固定化された蛋白質の反復利用に好ましい。ビオチ
ン標識手法では、長いエキステンダアーム（ビオチン化
試薬の一部）により蛋白質をビーズから分離することが
できるという利点がある。これにより蛋白質の復元が容
易になるはずである。大半の直接的蛋白質：ビーズ共有
固定化化学及び非特異的吸着では、蛋白質がビーズに密
着して結合され、また、蛋白質が１ヶ所以上で結合され
るために蛋白質の再生が難しくなる傾向にある。一方、
ビオチンなどの親和性標識を用いるには、蛋白質アビジ
ン、ストレプトアビジンあるいは類似体でコーティング
したビーズを利用する必要があり、これには、こうした
蛋白質と相互作用する抗体あるいは他の分子が不要な
「非特異」結合を生じる可能性がある。抗体／抗原結合
として、直接的で密着したもの、あるいは親和性標識を
利用した、十分な剥離により蛋白質を復元化できるもの
が可能である。

【００５２】二次元ゲルにおいて、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ
Ｂｌｕｅ染色試薬により検出可能な通常の蛋白質スポ
ットには１００ｎｇの蛋白質が含有されており、この蛋
白質のＭＷが５０ｋｄであれば約２ｐｍｏｌ（２×１０
^-12ｍｏｌ）に匹敵する。蛋白質が表面に結合した際、
その蛋白質の面積がおよそ５ｎｍ×４ｎｍ（２５×１０
^-18ｍ²）であると推定すれば、その表面に密着して配列
した場合に２ｐｍｏｌの占める合計面積は０．３ｃｍ²
となり、１μｌでは３ｃｍ²が必要である。したがっ
て、２−Ｄゲルスポット内の蛋白質量（通常１００ｎｇ
以下）であれば、量的に９６ウェルプレート内あるい
は、高密度で表面に蛋白質を収容できれば容積の小さな
ビーズにもうまく結合する。アビジンをコーティングし
たＰｏｒｏｓ（登録商標）支持体ビーズ（ＢＡ Ｐｏｒ
ｏｓ）の場合、Ｐｏｒｏｓ（登録商標）支持体ビーズ１
００μｌにつき１２．５μｍｏｌのビオチンを結合する
ことができる。６０ｋｄのビオチン化蛋白質を得るに
は、１μｌの蛋白質が０．１３μｌのＰｏｒｏｓ（登録
商標）支持体ビーズにより取り込まれなければならな
い。このビーズは多孔性で内面積が広くなっていること
から、容積の非常に小さなビーズでも利用可能である。
Ｄｙｎａｌ製ストレプトアビジンビーズの場合、ビーズ
の１ｍｇあたり約５〜１０μｌビオチン標識蛋白質を結
合する。

【００５３】したがって、本発明の１つの目的は、磁気
ビーズ上に吸着することによりゲルスポット蛋白質分画
の多くを回収する方法を提供することである。蛋白質を
変性条件下にて二次元ゲル操作から取り込むと、蛋白質
は変性する。直接あるいは親和性リガンドにより蛋白質
がビーズに吸着すると、その組成はビーズに結合した変
性蛋白質の１つとなる。このビーズを、プロテアーゼに
よる分解、蛋白質に特異的に結合する抗体の選択を目的
とする抗体混合物への曝露及び、もとの蛋白質に結合す
る可能性のある他の蛋白質への暴露などの処理の実行に
適した磁場を利用してさらに操作することができる。

【００５４】磁気ビーズは、磁気材料の粒子を中に含む
ポリマー、ガラスあるいは他の不活性材料の小型ビーズ
であると好ましい。超軟鉄粒子であればその磁気性能が
鉄の超常磁性によるものであることから、それによるビ
ーズは永久磁石あるいは電磁石には結合するが外部に磁
場が形成されなければ互いに結合しないため、超軟鉄粒
子が特に好ましい。好ましい例として、Ｄｙｎａｌ（ノ
ルウェー）により製造されるプラスチック製磁気ビー
ズ、Ｂａｎｇｓ Ｌａｂｓ、ＡｄｖａｎｃｅｄＭａｇｎ
ｅｔｉｃｓ、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ製造の常磁性粒子
及び超常磁性ビーズ、Ｓｐｈｅｒｏｔｅｃｈ（イリノイ
州Ｌｉｂｅｒｔｙｖｉｌｌｅ）及びＢａｎｇｓ Ｌａｂ
ｓ製造の鮮明な色の磁性粒子、多孔質あるいは連続表面
ビーズ、強磁性ニッケルビーズ（Ｃｌｅｍｅｎｔｅ Ａ
ｓｓｏｃｉａｔｅｓ）、多糖類(デキストラン)をコーテ
ィングした磁気ビーズ、シリカ及び多孔性球状ガラス製
磁気ビーズ（米国特許第６，０２７，９４５号）が挙げ
られる。こうしたビーズを少量のスラリとして、綿栓付
き緩衝液充填ピペットチップなどの溶離チャンバに添加
し、重力あるいはピペットチップの鋭利な（底）端部に
配置した磁石を利用して下降させ、綿栓上に稠密な領域
を形成する。試験対象であるビーズは電気溶離中にこの
位置から移動することはない。

【００５５】ビーズ自体の直径は約１０ｎｍ〜約１ｍｍ
であり、その比重が約０．５を超えて約８未満であると
好ましい。数分間にわたり懸濁された状態を保つために
はビーズの量を０．１〜０．５μｌとするとより好まし
い。このビーズではその磁気粒子上に不活性ポリマーコ
ーティングを具備しても、あるいはこうした複数の粒子
を不活性ポリマー内に埋設してもよい。ペプチドをこの
ビーズに結合する場合（蛋白質スポット消化物からのペ
プチド回収を目的とする実施形態と同様に）、疎水性コ
ーティングを含むように、あるいは、Ｃ₁₈炭化水素側鎖
を含むモノマーなどの疎水性モノマーと共重合するよう
にポリマーを誘導すると好ましい。ビーズの磁気部分
は、粒子、ワイヤ、ストリップの形態であっても、電気
メッキ、蒸着あるいは石版印刷術により形成された部分
であってもよい。この磁気部分に鉄を含有させるが、ニ
ッケル、コバルト、これらの合金、磁性希土類元素ある
いは他の常磁性材料の合金を含有させる場合もある別の
実施形態において、「磁気」ビーズを高帯電にして、電
流内において可動な状態にする。この実施形態では、１
対の電極を容器内に挿入し、高電圧電流を印加してビー
ズを一方の電極に吸着させた後、ビーズを付着させたま
まこの電極を容器から引抜く。電流を止めるとビーズは
解放される。

【００５６】磁気ビーズは一般にその固有形態のままで
は使用されず、所望の結合特性を備えた特定材料でコー
ティングされる。一実施形態において、磁気ビーズは、
磁気粒子を埋設させたポリマー材料で製造される。本明
細書ではこの外側層を「コーティング」と見なす。この
コーティングを、対象となる蛋白質及び／またはペプチ
ドの本質的に全てを結合するペンダント部分を含むポリ
マー材料とすると好ましい。このペンダント部分を一般
に疎水性としてコーティングの性質を疎水性にする。こ
のペンダント基は通常、少なくとも４炭素原子を含む鎖
状炭化水素である。好ましい実施形態におけるこのペン
ダント基は４〜３０炭素原子を含むアルキル基である。
別の実施形態におけるペンダント基はＣ₈〜Ｃ₂₅アルキ
ル基であり、Ｃ₁₈アルキル基であれば好ましい。アルケ
ン部分の有無にかかわらず、環状、芳香族系、複素環式
及び枝分かれ炭化水素も使用可能である。このペンダン
ト基に、酸素、窒素、硫黄、ハロゲン及びリン含有基を
含むことができる。こうしたコーティングにより、水溶
液から本質的に全ての蛋白質あるいはペプチドを吸着
し、洗い流されないように密着結合させられることが重
要である。

【００５７】コーティングを化学的に磁気ビーズに付着
させることにより、あるいは市販のＣ₁₈粒子を変性して
磁気を持たせることにより、コーティングビーズを合成
することができる。後者の場合、市販のオクタデシルシ
リルシリカビーズ、ｍｉｃｒｏＢｏｎｄａｐａｋ（登録
商標）Ｃ１８パッキング、あるいはＳｅｐ−Ｐａｋ（登
録商標）Ｃ１８カートリッジパッキングを用いて、光リ
ソグラフィ、接着あるいは鉄を含む粒子に対する共有結
合を利用して鉄を含浸させることにより、合成すること
ができる。本明細書でいう「Ｃ１８」コーティングビー
ズとは、Ｃ₁₈アルキルペンダント基を含むポリマー材料
であるコーティングを具備したビーズをさす。

【００５８】従来技術ではポリスチレンを用いてビーズ
を形成してきたが、この種のビーズによるペプチドある
いは蛋白質の吸着はある程度に留まり、全てを良好に吸
着するまでには至らない。ポリスチレン製ビーズからの
溶離にもむらがある。帯電ペプチドの場合にこれは特に
顕著になるようである。一方、本願によるＣ１８コーテ
ィング磁気ビーズでは良好な結果が得られている。

【００５９】ビーズに所望の蛋白質（１種類あるいは複
数種類）あるいはペプチドを吸着させた後、ブロッキン
グ剤を添加してビーズが他の蛋白質あるいはペプチドを
吸着しないようにしてもよい。蛋白質は環境のいたる所
に存在し、蛋白質あるいはペプチドを結合したビーズと
の接触に使用され得る多くの溶液内に見られることか
ら、望ましくない結合の発生を最小限にとどめることが
重要である。ＭＳ分析においてなど、純蛋白質あるいは
ペプチドを必要とする目的のために蛋白質あるいはペプ
チドを後に溶離したい場合は、こうした一般処理の例外
である。

【００６０】蛋白質あるいはペプチドとコーティングと
の間の結合の性質は、後に添加する他の材料に対して蛋
白質あるいはペプチド結合を解離するために用いる条件
とは異なる条件下において結合反応が可逆性となり得る
ものである。例えば、抗原に結合した抗体がアセトニト
リルではなく酸性緩衝液により溶離性となるため、Ｃ１
８コーティング磁気ビーズに結合している蛋白質抗原は
約５０％アセトニトリル水溶液には溶離するが、ｐＨ
２．５である緩衝液単独の場合には溶離しない。ビーズ
と蛋白質／ペプチドとの間に、結合された蛋白質／ペプ
チドと添加する結合要素との間の反応とは異なる結合反
応を発生させることにより、それぞれを任意に選択的に
溶離性とすることができる。

【００６１】通常抗体結合エピトープを表わす分子の親
水性部分を支障なく利用できることから、蛋白質によっ
ては疎水性コーティングに接着させることが望ましい。
しかしながら、他の蛋白質では疎水性コーティングに接
着すると変性する場合もある。変性が、蛋白質が結合要
素として作用しなくなる可能性のある種類である場合、
磁気ビーズに疎水性材料をコーティングしてはならな
い。そのかわりビーズには、天然型、化学的に添加した
エピトープ、あるいは蛋白質の結合部分に対する親和性
結合試薬をコーティングしなくてはならない。例えば、
蛋白質をビオチン化し、アビジンコーティングビーズに
接触させることができる。

【００６２】図１〜図３に示す本発明による第１実施形
態において、溶離装置１０には、第１緩衝液１６を入れ
る第１容器１２と第２緩衝液１８を入れる第２容器１４
とが具備されている。これらの緩衝液は、電気溶離処理
の従来技術における当業者には周知の標準緩衝液であ
る。第２容器１４を絶縁材料で製造すると好ましい。例
示した実施形態において、第２容器１４は円錐状である
が、どのような形状でもよい。本発明による一実施形態
において、第２容器１４は使い捨てピペットチップで作
製されており、第１容器１２内に吊り下げられている。
第２容器１４の底端部２２には開口部２０があり、この
容器１４の開口端部２０でゲル２μｌを重合させること
により形成した一定量のアクリルアミドゲル２４が充填
されている。アクリルアミドゲル２４ではなくガラスウ
ールなどのスクリーンあるいは他の多孔質構造体を用い
てもよい。アクリルアミドゲル充填物２４には緩衝液を
含有して電流を伝導させるが、第１容器１２内の空間と
第２容器１４との間で液体が大量に流動することはな
い。コーティングを施した常磁性ビーズ２６の層を、こ
のアクリルアミドゲル充填物２４の上に搭載する。蛋白
質スポットを含む２Ｄゲル板から切出したゲルスポット
２８をビーズ２６の上部に配置し、緩衝液１８内に含浸
する。白金電極３０及び３２を第１容器１２及び第２容
器１４内にそれぞれ配置して、ゲルスポット２８、ビー
ズ２６及びゲル充填物２４を通る電流路を設けてこれら
を電気的に接続する。通常電極３２を陰極（負）とし、
電極３０を陽極（正）として、これらを適した電源３４
に接続する。

【００６３】ゲルスポット２８からビーズ２６に移動さ
せる材料の性質及び量に依存して、予め定められた時
間、電極３０と電極３２との間に電流を印加する。この
電流のレベルも、ゲルスポット２８に含まれる材料の性
質及び量に依存して変化する。例えば、約１０ボルト〜
５００ボルトの電圧が印加可能であるが、約５０ボルト
の電圧を印加できれば理想的である。電流を印加する
と、ゲルスポット２８内の所望の材料がスポット２８か
ら電極３０に向けて移動する。しかしながら、その所望
材料はビーズ２６に捕捉され、電極３０と電極３２との
間で異常に高い電圧で不当に長い時間にわたり電圧が印
加されない限り、ビーズ２６に付着された状態が続く。

【００６４】電気溶離が完了し、ゲルスポット蛋白質
（任意にビオチンなどで誘導）がビーズ２６（任意にス
トレプトアビジンなどで誘導）に捕捉された時点で、電
極３２とゲルスポット２８とを取出し、以下に説明する
ように、常磁性ビーズ２６を磁気プローブ上に回収して
別の容器に移す。他の複数の容器に、洗浄液、復元液、
溶離液、抗体あるいは他の受容体溶液などを入れてお
く。

【００６５】図１〜図３に示した容器を用いたこの実施
形態では、このような手順でゲルスポット２４から常磁
性ビーズ２６上に蛋白質を捕捉する。ビオチン化する、
あるいはその他の方法で化学的に変性して親和性結合剤
が得られる蛋白質試料を用いて、二次元電気泳動法によ
る分離を行う。ある好ましい親和性標識あるいはハプテ
ンは、蛋白質分子の実効帯電及び等電点を維持できる非
常に分子量の低い少量部分を添加して形成した。蛋白質
に対する試薬ＮＨＳ−ｉｍｉｎｏｂｉｏｔｉｎ（Ｐｉｅ
ｒｃｅ製）によるビオチン化がこの１例である。親和性
結合対の例として他に、レクチンと糖、ハプテンと抗
体、蛋白質ＡあるいはＧと抗体Ｆｃ、他の特異結合蛋白
質対、フェニルボロン酸とサリチルヒドロキサム酸、及
び互いに反応するが一般に蛋白質とは反応しない他の化
学的部分対が挙げられる。

【００６６】二次元電気泳動ゲルを任意に染色して、所
望の蛋白質スポットを同定する。第２容器１４を、その
開口部をゲル板内に切り込む、切り込まないにかかわら
ず、ゲル板のゲルスポット位置上にかぶせるなどして、
所望の蛋白質スポットを含むゲル部分を切断し、物理的
に取出す、あるいはゲルの他の部分と分離してゲルスポ
ット２８を得る。このゲルスポット２８を図１に示す第
２容器１４内に配置し、電流を印加することにより、蛋
白質（ＳＤＳとの錯体ではない）を移動させ、ゲルスポ
ット２４から緩衝液１８を通過してコーティングビーズ
２６の床上に到達させる。ビーズ床２６は、沈降によ
り、あるいは磁石を容器に隣接して配置することにより
形成することができる。蛋白質を、電気泳動させる前あ
るいはゲル内にある間にビオチン化した場合、アビジン
あるいはストレプトアビジンをコーティングした常磁性
ビーズを用いると、ビオチンとアビジンあるいはストレ
プトアビジンとの相互作用によりビオチン化したゲルス
ポット蛋白質がビーズに結合される。他の親和性標識
も、蛋白質に付着する可能性があり、親和性リガンドに
対する対応受容体と併用することができる。この受容体
は磁気ビーズに付着される。電気泳動分離後に蛋白質ス
ポットをゲル内にてビオチン化した場合、その時点では
電荷を変更する必要がないため、ビオチン単独（ＮＨＳ
−ビオチン）での使用が可能である。ＳＤＳ変性剤の存
在下であればビオチン及びビオチン化蛋白質はストレプ
トアビジンに結合することがわかっている。

【００６７】Ｃ１８コーティングビーズが非特異的に本
質的に全ての蛋白質及びペプチドを吸着するかぎり、本
発明によるビーズは蛋白質混合物の吸着に使用可能であ
り、免疫学的検定時おけるプラスチックチューブの側部
などこれまで使用されてきた他の蛋白質付着材料と同じ
方法で全ての蛋白質の精製及び濃縮技術として使用可能
である。さらに、Ｃ１８コーティングビーズは従来のカ
ラムクロマトグラフィにおいて蛋白質の吸着に用いられ
ており、本発明においても、特にビーズ上に蛋白質を吸
着した後に、これを常磁性に製造すれば、このＣ１８コ
ーティング磁気ビーズを同じ目的で利用可能である。Ｈ
ＰＬＣなどように予め充填したカラムを使用することに
比べて、分散しているため吸着結果が良好になる可能性
がある。磁気ビーズであればカラム充填時の操作も容易
である。

【００６８】別の実施形態において、この磁気ビーズ
に、接触により蛋白質を共有結合できる反応基を含むコ
ーティングを施す。結合された蛋白質を用いて抗体を単
離することができる。あるいは、抗体をビーズに結合し
て、このビーズにより蛋白質を単離することも可能であ
る。別の実施形態において、初期ＳＤＳ電気泳動前、電
気泳動時、あるいはその後に親和性標識を蛋白質（１種
類あるいは複数種類）に付着する。この実施形態では、
ゲル支持体内あるいは支持体と支持体との間を移動する
蛋白質を親和性標識の反応形態に曝露し、蛋白質に共有
結合させる。親和性標識を添加する試薬が小型分子であ
るため、これを溶液内の蛋白質に直接添加して反応させ
ても、予め分離することなくゲル自体の蛋白質に直接添
加して反応させてもよい。所望に応じて、親和性標識と
の反応前に、切断スポットなどのゲルの一部をまずゲル
全体から取出してもよい。

【００６９】電気泳動処理を行う際、変性条件を用いて
もよい。立体構造が重要となる具体的な目的を追加して
蛋白質を用いるには、蛋白質を復元すると好ましい。蛋
白質の復元には、ジスルフィドによる再編成剤の有無に
かかわらず尿素あるいはグアニジンなどのカオトロピッ
ク試薬の濃度を下げて使用することができ、通常、ジス
ルフィドイソメラーゼなどの酵素を使用してジスルフィ
ド架橋に適した改質を補助する。他の復元技術も本質的
に周知であり、これらを用いて、変性後、電気泳動時に
天然構造を回復することができる。こうした技術の例と
して、温度、ｐＨ、界面活性剤、溶剤、尿素、グアニジ
ン、チオシアン酸グアニジン、チオシアン酸アンモニウ
ム、ジスルフィド活性試薬などを勾配変化させることが
挙げられる。ジスルフィド活性試薬の例として、メルカ
プトエタノール、ジチオスレイトールジチオエリスリト
ール、グルタチオン、トリブチルスズなどが挙げられ、
濃度を低下させたジスルフィド活性試薬を後の復元段階
で用いる。関連する蛋白質、補助因子、抗体及び他の受
容体、マトリクス、鋳型／ポリマー及びマイクロフィル
タなどの構成要素をさらに追加して、この復元処理を補
助してもよい。封入体及び他の蛋白質の復元に関する文
献は大量にあり、その例としてＳｈｉｍｉｚｕら著、Ｂ
ｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．１６（２）：２４８〜
５３頁（２０００年）が挙げられる。

【００７０】天然蛋白質を元々変性した変性剤と同種の
変性剤、あるいは異種の変性剤の温度及び濃度勾配を徐
々に低下させることにより、蛋白質の再生をより的確に
行なうことができる。蛋白質を部分的あるいは完全に復
元できれば、その蛋白質をビーズから溶離してもよい、
あるいはそのビーズを固定化リガンドとして直接用いる
こともできる。その蛋白質には復元処理がさらに必要な
場合があるため、同じ復元方法あるいは異なる勾配の復
元処理が必要となり得る。蛋白質が異なれば異なる復元
条件が必要であれば、ビーズに結合することにより回収
される各蛋白質についてその処理を最適化してよい。

【００７１】蛋白質に依存して、２Ｍを上回る尿素を含
む溶液にはメルカプトエタノール（あるいは別のジスル
フィド還元剤）を含有し、約２Ｍを下回る尿素を含む溶
液にはこのような還元剤ではなく、いくらかの酸素（空
気からあるいは添加による）を含有してジスルフィドに
再形成を開始させることができる。天然状態にある蛋白
質をもとに回収を行うと、変性蛋白質の回収に問題が生
じる可能性がある。抗体エピトープ、補助因子への結
合、関連する蛋白質及び基質が、蛋白質が復元されるま
でに破損される可能性がある。本発明の１つの利点は、
天然蛋白質構造に特異でない相互作用（ビオチン化ある
いは疎水力による）によりビーズ上に蛋白質を回収でき
ることであり、これは蛋白質が変性していてもいなくと
も実行可能である。その上、このビーズが、変性蛋白質
が溶解性であるなしに影響されることなく復元を開始で
きる足場構造となり、固定化された蛋白質は、復元され
た後まで他の蛋白質分子と相互作用を起こすことができ
ない。溶解ステップを削除することにより、変性蛋白質
に固有の少なくとも１つの問題を回避することができ
る。このように、本発明による復元態様は、ソースとは
無関係に、蛋白質の復元に、特に処理及び精製時に変性
した封入体及び蛋白質に広く適用可能である。各復元終
了後、酵素活性あるいは受容体結合について試験し、そ
の結果を復元効果の尺度として天然形態の場合と比較す
ることができる。

【００７２】電気溶離系の別の実施形態において、トリ
プシンあるいは蛋白質のペプチド処理剤で予備処理を行
うことのできる２ＤＥゲル全体を、コーティング磁気ビ
ーズの薄層上に配置する。コーティング磁気ビーズの薄
層を２ＤＥゲルの頂部に配置できればより好ましい。こ
の系全体に電気泳動処理を行い、蛋白質をゲルから電気
溶離して層に吸着させる。対象として所望する各蛋白質
を含むビーズ領域を、好ましくはポンチ、へら、あるい
は、ビーズのわずかな領域を取出せるそれに類似したも
のでビーズ／ゲル構造体から取出す。所望のビーズを非
磁気リング、メッシュを用いて、あるいは磁気によりゲ
ルの反対側に引き寄せることにより、所望のビーズを周
囲のビーズから磁気的に分離できれば、磁気プローブを
直接用いてもよい。ビーズを取出す位置は、ゲルを走査
し、ビーズ除去装置を制御するコーティングへの走査シ
グナルによる座標を用いて特定する。ゲルに対する走査
は、ビーズ層とは反対側から行っても、あるいはビーズ
を添加する前に行ってもよい。各スポットの位置を正確
に合わせ、同時にゲルの変形あるいはビーズの転位を防
止するために、ゲルを多孔質固体相上に保持することが
望ましい。

【００７３】ビーズとゲルとの間の接触を、ビーズをゲ
ル上あるいはゲル内に機械的に圧搾する、磁気的に駆動
する、あるいは遠心力により沈降させることにより強化
することができる。スポット内の蛋白質濃度が十分に高
ければ、コーティングビーズをゲル内に駆動してこれを
拡散させ、蛋白質結合を行うことにより十分に定性測定
が可能である。メッシュをゲル表面上に配置して、電気
溶離時及び選択的ビーズ回収時にビーズの横方向移動を
防止することができる。蛋白質を含まない領域を残しつ
つビーズがゲル中に拡散するため、スポット内の蛋白質
は、多くの蛋白質を吸着するはずのコーティングビーズ
付近を通過する際、互いに拡散することができない。ゲ
ルとの接触状態から切断あるいは駆逐されて取出された
ものであれば、本発明による他の蛋白質コーティングビ
ーズのように操作することができる。

【００７４】［図３Ａに示す実施形態］図３Ａに示す本
発明の別の実施形態において、電気溶離装置１１には、
第１緩衝液１５を入れる容器１３が具備されている。導
管１７が容器１３の側壁から延出しており、これには実
質的にＵ字型であるトラップ１８と開口頂端部２１とが
ある。親和性コーティングを施した磁気ビーズ２３床が
トラップ１９内に配置されている。Ｕ字型トラップ１９
は、容器１３と連通した第１脚部２５を画成しており、
これを第１緩衝液１５で充填する。Ｕ字型トラップ１９
の第２脚部には第２緩衝液を充填する。蛋白質スポット
を含むゲルコア３１及び第１電極３３を、容器１３の第
１緩衝液内に入れる。第２電極を第２緩衝液内にいれ、
電流を電源３７から電極３３及び３５に印加して、蛋白
質をゲルコア３１から第２電極に向けて電気溶離する。
ここで蛋白質あるいはペプチドをビーズ２３上に捕捉す
る。ビーズ２３はＵ字型トラップ１９内で床を形成し
て、図１〜図３の実施形態に示したようにゲルを充填す
ることなく第１緩衝液１５と第２緩衝液２９とを隔離し
ている。

【００７５】別の実施形態において、蛋白質スポットを
ゲル板上で同定し、そのゲル板の両側を緩衝液で取り囲
む。この実施形態の好ましい形態では、開口端部のある
第１容器を、ゲル板に対して蛋白質スポットを取り囲む
ように配置して第１緩衝液を入れる。開口端部のある第
２容器を蛋白質スポットの反対側に配置して第２緩衝液
を入れる。親和性コーティングを施した一定量の磁気ビ
ーズを、一方の容器が含む一方の緩衝液内に入れる。各
緩衝液内に電極を配置し、電流を電極に印加して、蛋白
質を直接ゲル板から溶液内に溶離させ、これをビーズで
捕捉する。ゲル板の方向は垂直あるいは水平のいずれで
もよく、容器の形状は、緩衝液をゲルと接触した状態に
保持できるものとする。

【００７６】別の実施形態において、２つの隣接する容
器にそれぞれ緩衝液を入れ、各容器の側壁からチューブ
あるいは他の導管を延出させて、この２つの容器を接続
する。親和性コーティングを施した磁気ビーズ床をこの
チューブ内に配置して容器内の２種類の緩衝液を隔離す
る。各緩衝液内に電極を入れ、蛋白質スポットを含むゲ
ルコアを一方の容器内に配置する。２つの電極に電流を
印加して蛋白質をビーズ上に溶離する。

【００７７】［図４〜図６に示す実施形態］本発明によ
るこの実施形態の目的は、容器３９の液体３８内にある
磁気ビーズ３６を回収するためにプローブ３４を使用す
ることである。上記実施形態と同様にビーズ３６は、標
的成分に対して親和力を備えたコーティングビーズであ
る。ビーズ３６を、標的化合物を含む電気溶離液３８内
に分散させて、標的化合物をビーズ３６のコーティング
に結合させる。以下に説明するように、プローブ３４
は、ビーズ３６を捕捉してこれを様々な洗浄及び処理段
階に移動させることに特に適している。

【００７８】図４を参照すると、プローブ３４は、軟鉄
製コア４０と電線コイル４２とを含む電磁石である。コ
イル４２には、適した電源４６に接続されたリード線４
４が具備されている。電源４６には、適した切換及び制
御装置を備えて、コイル４２に電流を選択的に印加する
ことにより、コア４０の磁気を活性化及び不活性化す
る。カラー４８をコア４０に接続し、これにコア４０の
先端部５２に向けて収束する裁頭円錐形状の底部５０を
設ける。カラー４８にはコア４０を収容する軸方向通路
を設けて、カラー４８をコア４０周囲で軸方向に摺動で
きるようにする。

【００７９】図４に示すように、ビーズ３６が所望の標
的成分を捕捉した後、プローブ３４をまず容器３９上に
配置する。電源４６のスイッチを入れてコア４０に磁気
を与えてから、プローブ３４を容器３９内に挿入する。
図５に示すようにコア４０の磁気によりビーズ３６を捕
捉する。ビーズ３６に次の処理を施すためにプローブ３
４を容器３９から引き上げる。図６に示す実施形態で
は、ビーズ３６を容器５６の第２液体５４内に移す。液
体５４を例えば洗浄液として、余分な反応物などの不純
物を除去することができる。適した反応物の例として、
従来技術において周知であるように標識あるいは復元反
応物が挙げられる。

【００８０】プローブ３４を液体５４内に含浸させてビ
ーズ３６を容器５６に移す。電源４６を切り、ビーズ３
６を液体５４内に解放する。カラー４８を静止させた状
態で、コア４０を液体５４から引き抜く。コア４０を、
カラー４８の軸方向通路内で摺動させることにより、コ
ア４０に付着しているビーズを全て円錐形先端部５２で
擦り取る。ビーズ３６を液体５４内で処理し、液体５４
内にプローブ５４を挿入し、電源４６を入れることによ
りこれを回収する。

【００８１】別の実施形態において、プローブ３４を用
いて容器内でビーズを捕捉した後、液体を容器から除去
する。第２の処理液をその容器内に投入して、プローブ
上にまだ捕捉されているビーズを洗浄あるいは処理す
る。別の方法として、磁石を容器側部の外側に配置し
て、液体の交換時にビーズを側部に付着させておくこと
もできる。この外部磁石を取り除くとビーズ３６は液体
を混ざり合う。

【００８２】［図７〜図１５に示す実施形態］図７〜図
１５に示す本発明による別の実施形態において、プロー
ブ６０を水平レール６２に取付けて、捕捉した標的化合
物の移動及び処理に選択したステーションまでの線状路
を移動できるようにする。プローブ６０には、レール６
２に接続されてアクチュエータ６６により水平及び鉛直
方向移動の可能な鉛直アーム６４が具備されている。ア
クチュエータ６６として空気圧シリンダあるいは歯車駆
動装置が利用可能である。アクチュエータ６６をマイク
ロプロセッサなどの制御装置６８に接続して、アームを
選択的に動作させる。

【００８３】プローブ６０に、閉じた底端部７２と開口
頂端部７４とを含む中空スリーブ７０を具備する。通
常、スリーブ７０は略円柱状であり、ガラス、プラスチ
ックあるいはこれ以外の非磁性体で製造されている。軸
方向通路を設けたカラー７６をスリーブ７０の頂端部７
４に結合して、スリーブ７０をその軸方向通路内に延在
させる。上述の実施形態と同様に、カラー７６には、先
端部８０に向けて収束する裁頭円錐形状の底面７８を設
ける。通常、カラー７６をスリーブ７０に固定し、カラ
ー７６下にスリーブ７０の作業部分を設けるように底端
部７２から一定距離を設ける。

【００８４】図８を参照すると、永久磁石８２が摺動自
在にスリーブ７０内に搭載されている。往復運動型アー
ム８４には、磁石８２に接続した下方端部８６とアーム
６４に接続した上方端部８８とがある。アーム６４には
アーム８４に接続したアクチュエータ９０を備えて、磁
石８２をスリーブ７０内で往復運動させる。アクチュエ
ータ９０として、例えば適した復帰バネを含む空気圧シ
リンダが使用可能である。アクチュエータ９０を、アク
チュエータ９０を選択的に作動させる制御装置６８にも
接続する。アクチュエータ９０によりアーム６４の動作
を制御して、容器９４内の液体９２を出入りするように
スリーブ７０を上下させる。アクチュエータ９０によ
り、延出した下降位置と引き抜いた上昇位置との間にお
ける磁石８２の往復運動も制御する。磁石８２が下方位
置にあると、磁石８２が磁気ビーズを捕捉してスリーブ
６０の外面に付着させる。磁石８２が上昇するにつれ
て、ビーズは磁石８２とともに上昇して円錐状先端部８
０に到達する。ここでビーズは７０から振り落とされ
る。

【００８５】プローブ６０を自動化された機械的作業と
併用して、大量の試料を連続的に処理できるようにする
と好ましい。本発明による一方法におけるプローブ６０
が、表面に標的成分を捕捉している磁気ビーズを捕捉
し、これを様々な容器間に移動させる。図９を参照する
と、容器９６には液体９８が入っており、その中に磁気
ビーズ１００が分散されている。容器９６を、従来技術
で周知であるようにマルチウェルプレートの１つのウェ
ルとしてもよい。図１０に示すように、プローブ６０を
液体９８内に下降させ、磁石８２をスリーブ７０の閉じ
た底端部７２に隣接するまで下方位置に移動させる。磁
石８２を図１０の下方位置に位置付けることにより、ビ
ーズ１００を吸引し、これをスリーブ７０の側壁に付着
させる。付着させた後、プローブ６０を図１１に示す位
置まで上昇させてビーズ１００を液体９８から取出す。

【００８６】図１２を参照すると、プローブ６０は続い
て、洗浄液、復元液あるいは標識反応物などの第２液体
１０４を入れた第２容器１０２上の位置に移動してい
る。ビーズ１００をスリーブ７０の表面上に捕捉した状
態であるプローブ６０を下降させて液体１０４内に入れ
る。次に、図１３に示すように、磁石８２をスリーブの
頂端部７４に向けて後退位置まで上昇させてスリーブ７
０の磁場を消滅させて、ビーズ１００を開放する。磁石
８２が上昇するにつれ、ビーズ１００はスリーブ７０の
側壁に沿って引き上げられて円錐状先端部８０に到達す
る。ビーズはそれ以上磁石８２を追従することができ
ず、スリーブ７０から落下して液体１０２内に分散す
る。さらにプローブ６０を上昇させて、液体１０２から
図１４に示す位置まで引抜く。この捕捉及び移動ステッ
プは何度でも反復して、ビーズを分散させた後、磁石８
２をスリーブ７０内に下降させることによりこれを再度
捕捉できることを理解されたい。

【００８７】プローブ６０は、親和性コーティングを施
し、そのコーティングに標的成分を吸着させたビーズを
洗浄する別の自動化方法での使用に特に適している。統
合した方法には基本的に、図１５のブロック１０６に示
すようにこの方法を開始するステップが含まれる。ブロ
ック１０８に示すように蛋白質などの標的成分を含むゲ
ルスポットを電気溶離容器内に配置し、ブロック１１０
に示すように電流を印加して標的成分を溶液中に溶離す
る。ブロック１１２に示すように親和性コーティングを
施した一定量のマイクロビーズを、ビーズ層を設けてい
ない別の電気溶離容器に添加して、標的成分をマイクロ
ビーズ表面上に捕捉する。ブロック１１４に示すように
図９〜図１４に示した例などの磁気プローブを電気溶離
容器の液体内に挿入する。ブロック１１６に示すように
プローブに磁気を与えてマイクロビーズを捕捉する。次
いでこのプローブを洗浄あるいは蛋白質の処理容器に移
動し、消磁してマイクロビーズをその洗浄あるいは蛋白
質の処理液内に解放した後、ブロック１２０に示すよう
にマイクロビーズを捕捉する。

【００８８】蛋白質あるいはペプチドが親和性標識ある
いは反応部分を担持する実施形態の場合、磁気ビーズへ
の固定化は、そのビーズの受容体との可逆的相互作用、
あるいはビーズ上の反応基を介して行い、これを引き続
き切断してそのペプチドをビーズから剥離することがで
きる。ゲル（２ＤＥゲルなど）から切断されて、そのま
まペプチドに分解（例えばトリプシン、ｌｙｓ、ｇｌｕ
などにより）された蛋白質スポットを同定する場合、ペ
プチド結合表面（Ｃ１８など）でコーティングしたビー
ズを、ゲル試料から溶離したペプチドを含む抽出物に添
加する。ビーズ表面の疎水性が非常に高いことから、ペ
プチドは物理的にその上に吸着される。ビーズを含有す
るゲルあるいは液体に超音波処理を施すことにより、こ
の吸着方法を促進してもよい。

【００８９】［図１６（Ａ）〜図１６（Ｏ）に示す実施
形態］図１６（Ａ）〜図１６（Ｏ）には、（ＭＡＬＤ
Ｉ）マトリックス支援レーザ脱離イオン化法あるいはＥ
Ｓエレクトロスプレー質量分析に向けて蛋白質をペプチ
ドに消化する別の実施形態における方法を例示する。図
１６（Ａ）に示すように蛋白質スポット１２４を含有さ
せて切出したゲル試料を図１６（Ａ）に示すように脱色
液１２８の入った容器１２６内に投入して蛋白質検出染
料を除去し、図１６（Ｂ）に示す脱色されたゲルスポッ
トを得る。

【００９０】このゲルスポット１２４を図１６（Ｃ）に
示すように乾燥させて吸着性摂取力を上昇させた後、図
１６（Ｄ）に示すように消化媒体１２９を添加して蛋白
質をペプチドに切断し、図１６（Ｅ）に示すようにゲル
スポット１２４を再水和させる。適した蛋白質切断試薬
の例として、臭化シアン、至適ｐＨあるいは、トリプシ
ンなどの蛋白質分解酵素が挙げられる。切断後、図１６
（Ｆ）に示すように溶離液光記録媒体１３０を容器１２
６に添加した後、図１６（Ｇ）に示すように磁気ビーズ
１３２を添加してゲルスポット１２４から溶離されてく
るペプチドを捕捉させる。

【００９１】図１６（Ｈ）に示すように、ピンあるいは
電気コイルなどの磁化性プローブ１３４を液体１３０内
に挿入してマイクロビーズ１３２を捕捉させる。図１６
（Ｉ）及び図１６（Ｊ）に示すように、ビーズ１３２を
捕捉して付着させたプローブ１３４を容器１２６から取
出して、洗浄液１３８の入った容器１３６内に挿入す
る。図１６（Ｋ）に示すようにプローブ１３４を消磁す
ることにより、ビーズ１３２を解放して液体１３８内に
分散させ、ビーズ１３２から不純物を除去する。図１６
（Ｌ）に示すようにプローブに再度磁気を与えてビーズ
１３２を捕捉させる。プローブ１３４を容器１３６から
取出してＭＡＬＤＩプレート１４０上に配置する。図１
６（Ｍ）及び図１６（Ｎ）に示すように、ＭＡＬＤＩマ
トリクスを含むアセトニトリル４０％水溶液などの溶離
液１４２をプローブ１３４及びビーズ１３２に向けて滴
下することにより、ビーズ１３２からペプチドをＭＡＬ
ＤＩプレート１４０上に溶離する。こうして溶離したペ
プチドを図１６（Ｏ）に示すようにプレート１４０上で
乾燥させて結晶を形成させる。

【００９２】別の実施形態において、スポットをゲルか
ら電気溶離した後、これをビーズに吸着させ、そこで引
き続きペプチドに分解する。切断試薬がトリプシンある
いは他の蛋白質を主成分とする試薬である場合、蛋白質
を吸着した後にブロッキング剤をそのビーズに添加する
と、切断試薬が非特異に吸着性となる、あるいは切断性
能を持たなくなることの防止に有効である。この実施形
態には、開裂を干渉する可能性のあるゲル材料や他の試
薬を用いない、あるいは本発明による別の処理と同じ場
所でペプチドを切断及び使用しないという利点がある。

【００９３】吸着を本質的に完了した後に、磁気（ある
いは可逆的に磁化性）プローブを、切断液内に挿入し、
ビーズをそれに引き寄せて、プローブを引き上げるまで
付着させる。ここでプローブを一定量の洗浄液内に挿入
して、ビーズ及びプローブから不純溶質を除去すること
ができる。この液体の中で、プローブを一次的に消磁し
てビーズをプローブから解放し、さらに自由な状態で洗
浄してもよい。別の方法として、あるいは組合わせとし
て、洗浄液をプローブからプローブに吸着されているビ
ーズ上にゆっくりと滴下して洗浄することもできる。洗
浄した後、必要に応じてプローブに再度磁気を与え、洗
浄液から取出す。

【００９４】最後に、プローブをＭＡＬＤＩ ＭＳ標的
プレートに隣接させた後、プローブを消磁してビーズを
プレート上に付着させる。別の方法として、５０％アセ
トニトリル（ＡＣＮ）などの溶離液滴をプローブに滴下
して、その流動にしたがってビーズからペプチドを溶離
させてＭＡＬＤＩ標的プレートに付着させる。この溶離
液にＭＡＬＤＩに用いるマトリクスの他成分を含有す
る、あるいは、ペプチドの添加前あるいは添加後にマト
リクスを別々に標的プレートに添加することができる。

【００９５】あるいは、少量の溶離液（５０％アセトニ
トリル水溶液など）を入れた容器内にペプチドを溶離す
る、または溶離液をプローブからビーズに滴下し、それ
を容器内に回収することもできる。この実施形態は、ペ
プチドをエレクトロスプレーＭＳにより特徴付ける場合
に特に適している。米国特許第４，９１０，１４８号に
記載の常磁性ビーズ操作など、粒子の磁気制御に関して
他にも数多くの手段が知られている。図に示したプロー
ブの代わりに、磁気ビーズを磁気により制御する他の分
離技術を用いることもできる。

【００９６】［図１７〜図２２に示す実施形態］磁気ビ
ーズを回収するさらに別の方法を図１７〜図２２に示
す。図１７において、磁気コーティングビーズ１４８
は、ゲルスポット１５４からの抽出液など、蛋白質ある
いはペプチド溶液１５２を入れた容器１５０内に分散さ
れている。ビーズ１４８が蛋白質あるいはペプチドを吸
着した後、ビーズ１４８をプローブ１４６により捕捉す
る。

【００９７】図１７に示すように、プローブ１４６には
中空チューブ１５８が具備されており、このチューブに
は開口底端部１６０と吸引チューブ１６４に接続された
開口頂端部１６２とがある。吸引チューブ１６４は制御
装置１６６に接続されて、その中を通る流体の吸引及び
流体の給送を行う。濾過部材料１６８がチューブ１５８
の軸方向通路１７０内に底端部１６０から距離を置いて
配置されている。好ましい実施形態において、濾過部材
料１６８は多孔質セラミックフリット部材であり、その
孔はマイクロビーズ１４８を収集できる程度に十分小さ
い寸法となっている。軸方向通路を設けた磁石１７２
を、その軸方向通路内にチューブ１５８が貫通して延在
するようにチューブ１５８に接続する。磁石１７２はチ
ューブ１５８の長手方向に沿って軸方向に摺動自在であ
る。一実施形態において、磁石１７２はチューブ１５８
の外面と摩擦係合している。

【００９８】図１８及び図１９に示すように、チューブ
１６４を介して流体を汲み出すことにより溶液１５２を
抜き取る。このときコーティングビーズ１４８は、チュ
ーブ１５８内に濾過部材料１６８に保持されて図１９に
示すコーティングビーズ１４８床を形成している。図２
０は、磁気コーティングビーズ１４８をチューブ１５８
内に保持する位置まで摺動した磁石１７２を示してい
る。別の方法として、液体５１２を吸出する前に磁石１
７２をチューブ１６４上に配置することもできる。磁気
コーティングビーズ１４８をチューブ１５８内に固定化
した後、プローブ１４６を取り出して、図２１に示すよ
うな質量分析計などの分析装置１７４内、あるいは洗浄
容器など他の処理段階に挿入する。

【００９９】一定量の溶離液を、チューブ１５８を介
し、チューブ１５８内に捕捉されたコーティングビーズ
１４８床を介して汲み出すことにより、蛋白質あるいは
ペプチドを溶離して蛋白質あるいはペプチドを抽出し、
分析装置１７４にて分析する。エレクトロスプレー質量
分析計（ＬＣＱあるいはＱｔｏｆなど）は、クロマトグ
ラフィカラムからの溶離勾配を収容できるように設計さ
れているため、チューブ１５８を直接分光計に接続する
ことができる。溶離後、磁石１７２をチューブ１５８上
方に摺動させて、図２２に示すように再利用を目的とし
て液体１７７を入れた別の容器１７６内にビーズ１４８
を解放する。必要に応じて、少量の流体（気体あるいは
液体）をチューブ１５８内に注入し、ビーズ１４８を押
出してもよい。上述のように、ペプチド消化物吸着用Ｃ
１８コーティングビーズが好ましい。この装置の利点
は、消化物内のペプチドを全て捕捉し、これらを全て、
クロマトグラフィ媒体としてＣ１８ビーズを用いること
により高感度ＭＳ（エレクトロスプレー）に運搬できる
ことである。クロマトグラフィ支持体としてのこうした
Ｃ１８磁気ビーズの分解能は、マイクロ微粒子Ｃ１８支
持体を充填した同寸法のカラムと比べて低い可能性があ
るが、ＭＳ前にペプチドを蛋白質消化物と分離する分解
能としては適切である。

【０１００】この実施形態において、溶離液（百分率の
低い溶離液（５％アセトニトリルなど）から高い方（６
０％アセトニトリルなど）への勾配でよい）は直接、エ
レクトロスプレー質量分析計源の入口へと流動する。ペ
プチド及び蛋白質のＥＳ−ＭＳ分析前にはビーズからの
ペプチド勾配溶離法あるいは段階的溶出法ではなく従来
の逆相カラムクロマトグラフィステップを用いてもよ
い。徹底洗浄により残留しているペプチドを全て除去し
た後、ビーズを再利用することができる。

【０１０１】他の構造及び設計を利用してビーズを捕捉
することができる。例えば、電磁石あるいは永久磁石を
チューブの片側に取付けてビーズをチューブに保持して
もよい。電磁石の場合、溶液がチューブから吸引される
際にビーズ１４８を捕捉する磁力が十分であればフリッ
ト１６８を設けなくともよい。電磁石のスイッチ切替え
によりビーズ１４８の捕捉及び解放を行う。さらに、捕
捉装置を分析装置あるいは他の処理ステージまで移動さ
せず、溶離液容器内に配置して、液体チューブ１５８か
ら吸引して分析装置内に直接注入するように設計を変更
してもよい。勾配が必要な場合、異なる溶離液を入れた
複数の容器を用いる、あるいは１つの溶離液容器内の勾
配をゆっくり変化させることができる。

【０１０２】上述した蛋白質の装置と同様、同時に数多
くの試料を処理するためにマルチウェルプレートを用い
ることができる。各捕捉装置を、適切にプログラミング
されたコンピュータにより機械的に操作及び制御して、
異種試料の数及び種類を監視及び調節できるようにする
と好ましい。別の実施形態において、特異抗体を固定化
して含むビーズを用いて、試料内に含まれる適した蛋白
質リガンド及び、そのリガンドと抗体結合部位以外の部
位で相互作用する他の蛋白質を捕捉する。リガンド蛋白
質上の多くのエピトープに反応するポリクローナル抗体
あるいはオリゴクローナルな抗体を用いる場合、そのリ
ガンド蛋白質と相互作用する他の蛋白質を回収すること
ができる。結合蛋白質のセットには、リガンドとそれに
特異に会合する他の蛋白質とが含まれる。この混合物に
は、元の試料（細胞溶解産物でもよい）より量は少ない
が数多くの成分が含有されている場合が多いため、質量
分析（固定したトリプシンに通過させて消化した後）あ
るいは一次元電気泳動（ＳＤＳゲル電気泳動など）、あ
るいは２−ＤＥなどの従来の分析技術により容易に分析
できる可能性がある。得られた情報（蛋白質とリガンド
との相互作用）は非常に有用である可能性があり、特に
この情報が同時に数多くの蛋白質に対して得られた（一
連の特異ビーズ調製物を用いて）場合にこれが当てはま
る。会合成分自体も望ましい性能を備えているため、こ
れを別に回収し、１種類あるいは複数種類の会合成分を
生成、精製及び抽出する方法として利用してもよい。

【０１０３】別の実施形態において、蛋白質を固定化し
て担持するビーズを用いて、その蛋白質と特異的に相互
作用する他の蛋白質を混合物から回収する。好ましい実
施形態において、固定化された蛋白質は延出したリンカ
ーアームによりビーズに結合される。カオトロープ（塩
酸グアニジウムなど）への曝露後、徐々にカオトロープ
を除去するステップ、ジスルフィドによる化学的還元及
び漸進的再酸化ステップ、あるいは天然ジスルフィド結
合の再形成を補助し得る蛋白質ジスルフィドイソメラー
ゼなどの酵素への曝露ステップなどの１つ以上のステッ
プを伴う処理により、この固定化蛋白質を復元して、そ
の天然構造を回復することができる。ＳＤＳ変性蛋白質
を復元する処理は従来技術において周知であり、そのい
ずれを、結合変性蛋白質を担持するビーズに適用しても
よい。蛋白質をうまく復元できると、その蛋白質が捕捉
試薬として作用し、蛋白質錯体内の他の蛋白質を回収す
ることができる。

【０１０４】周知のファージ提示抗体選択法で用いられ
ているように、変性後あるいは復元後のいずれかの固定
化蛋白質を担持するビーズを用いて、適したバクテリオ
ファージの表面の抗体部分を選択的に結合することがで
きる。２ＤＥゲルから回収されて磁気ビーズ上に固定化
された蛋白質「抗原」を用いる大きな利点は、分析ある
いは支持用２ＤＥゲルから回収した微量の蛋白質で複数
回の繰り返し結合及びそ複数回の繰り返し逐次選択を実
行できることである。

【０１０５】本発明のもう１つの実施形態は、２ＤＧで
発見する前に親和性結合により蛋白質を単離することで
ある。この方法では、血清、プール抗体組成物、混合抗
体提示ファージあるいは蛋白質の組合わせライブラリか
ら、生体内免疫あるいは試験管内免疫、または受容体を
吸着するためのビーズ固定化蛋白質の利用により抗体を
生成する。ビーズ自体は担体あるいはアジュバントとし
て作用する、あるいは免疫処理を促進するように改質さ
れている。異なる磁気ビーズ上に抗体あるいは受容体が
固定化される。市販の蛋白質Ａ（あるいは蛋白質Ｇ）固
定化常磁性ビーズが抗体の固定化に好ましい。ペプチド
の結合後にブロッキング剤を添加する場合にはＣ１８
（あるいはこれに類似のもの）をコーティングしたビー
ズを用いてもよい。

【０１０６】この抗体あるいは受容体コーティングビー
ズを、組織や細胞ホモジェネートあるいは血清などの流
体といった天然蛋白質を含む生物学的試料に接触させ
て、その天然蛋白質を特異的に吸着させる。この蛋白質
を、ｐＨ２．５以下の酸性干渉剤あるいは蛋白質の溶離
液（チオシアン酸アンモニウムなど）により溶離し、蛋
白質を回収する。必要に応じて、復元プロトコルを用い
てもよい。吸着、洗浄、溶離及び第２の洗浄容器に磁気
ビーズを繰り返し通す操作により、このリサイクル方式
では、様々な用途に向けて徐々にであるが確実に天然蛋
白質を回収することができる。キャリーオーバが少ない
場合には、１回あるいは複数回の洗浄ステップを省略し
てもよい。この処理はいずれの蛋白質に対しても同様で
あるため、最適化が容易であり、蛋白質の生物学的作用
に対する知識も必要ではない。これにより、蛋白質によ
って全く異なる従来の蛋白質精製及び定量処理の多くを
回避することができる。蛋白質をコーティングした後に
幾つかの結合部位で受容体を結合させたビーズも使用可
能である。あるいは、永久的な吸着が望ましい場合には
受容体及びリガンドを架橋させてもよい。

【０１０７】本発明による親和性処理により、対象とな
る蛋白質、蛋白質のサブユニット、会合蛋白質、蛋白質
錯体、補助因子、基質、及び蛋白質に結合する受容体を
分離する。後に蛋白質を分離することにより多くの情報
が得られる上、この分離処理を、対象となる蛋白質に結
合した物質を分離し、任意に同定する方法として用いる
ことができる。さらに、元々蛋白質の１形態のみを単離
することができたにもかかわらず、受容体をコーティン
グしたビーズは、抗原の他のイソフォームあるいは対立
遺伝子または蛋白質改変体に結合するため、これを分析
及び同定することができる。蛋白質改変体は糖鎖形成、
スプライシング、翻訳後切断、リン酸化などにより互い
に異種となる可能性がある。各「蛋白質改変体」に同様
に複数の使用法があり得る。

【０１０８】蛋白質コーティングビーズには、蛋白質結
合因子、抗体及び蛋白質の受容体を溶液から精製するこ
とを目的とする数多くの遜色のない使用法がある。上述
のように、この蛋白質コーティングビーズ（あるいはブ
ロッキング剤を施したビーズ）を、組織あるいは細胞ホ
モジェネート、または血清、ハイブリドーマ上澄み液、
ファージディスプレイなどの流体など、受容体を含有し
た生物学的試料に接触させて、そこに含まれる受容体を
特異的に吸着させる。受容体を吸着させた後、これをｐ
Ｈ２．５以下の酸性緩衝剤（抗体であれば）あるいは蛋
白質の溶離駅（チオシアン酸アンモニウムなど）で溶離
し、その受容体を回収する。必要に応じて復元プロトコ
ルを用いてもよい。吸着、洗浄、溶離及び第２の洗浄容
器に磁気ビーズを繰り返し通して利用することにより、
このリサイクル方式では、徐々にであるが確実に様々な
使用にできる受容体を回収することができる。キャリー
オーバー量が不充分な場合には、１回あるいは複数回の
洗浄ステップを省略してもよい。この処理はいずれの受
容体に対しても同様であるため、容易に最適化でき、蛋
白質あるいは受容体の生物学的作用に対する知識も必要
ではない。

【０１０９】蛋白質をコーティングしたビーズを、化合
物の組合わせライブラリまたは受容体提示微生物あるい
は細胞から受容体を特定及び／または精製するために用
いることもできる。同様に、このビーズを分離用固相基
質とすることができる。抗体提示ファージライブラリ
を、自然のままの動物あるいは蛋白質や蛋白質混合物に
免疫された動物から入手した免疫グロブリン配列で構成
することが特に重要である。ビーズに結合したファージ
を後に溶離して培養することにより、大量の蛋白質結合
受容体を生成することができる。

【０１１０】受容体をコーティングしたビーズを用い
て、天然化合物を結合し、それを回収することもでき
る。二次元電気泳動処理時に、その蛋白質は変性して、
他のサブユニット、会合蛋白質、補助因子、因子錯体、
基質、膜などから分離する可能性がある。上述したサイ
クル方式の概念を用いて、シグナル蛋白質、シトキン、
膜結合蛋白質などに対する蛋白質受容体を発見すること
ができる。膜結合蛋白質を従来の蛋白質精製技術で単離
することは周知のように難しい。しかしながら、本発明
を用いれば、蛋白質コーティングビーズに結合させるこ
とにより、膜結合蛋白質を捕捉することができる。この
ような方法では、復元した蛋白質を用いる、あるいは任
意の復元処理を施すと好ましい。回収された結合成分を
蛋白質コーティングビーズから溶離して、ＭＳ同定に向
けてペプチドに分解するなどの従来の手段により同定す
ることができる。対象蛋白質に付随する成分の同定は、
その生物学的性能の特定に特に重要である。

【０１１１】［図面２３及び図面２４に示す実施形態］
この実施形態では、制御した電磁石あるいは可動式永久
磁石により磁気ビーズを操作して、このビーズを４つの
容器の間で繰り返し循環させる。図示した実施形態にお
いて、この４つの容器は試料容器、洗浄容器、結合種用
アキュムレータ及び第２の洗浄容器である。ビーズは、
結合種用アキュムレータの条件により、分断されること
のない相互作用（好ましくは共有結合）により蛋白質
（あるいは蛋白質の受容体）を固定化して担持してい
る。このビーズを試料容器内に分散させると、１種類以
上の蛋白質あるいはリガンドが、特異的な相互作用（交
点−抗体相互作用あるいは高分子錯体のサブユニット間
における相互作用）によりビーズに可逆的に結合する。

【０１１２】その後、磁気プローブによりビーズを収集
し、これを洗浄容器に移す。ここでビーズを分散して、
試料からの非特異的キャリーオーバーの全てを希釈剤に
より効率良く除去する。次に、ビーズを収集して、結合
種用アキュムレータに移す。ここの溶液（ｐＨ２．５あ
るいは２Ｍチオシアン酸アンモニウム）は、結合した蛋
白質リガンドを溶液内に開放しやすいように条件が整え
られている。最後に、ビーズを第２の洗浄ステップで洗
浄して、再度リガンドを結合できる状態に戻す。このサ
イクルを所望に応じて何度も繰返すことにより、必要量
のリガンドを結合種用アキュムレータ内に貯蔵する、あ
るいは結合種を試料内から完全に除去するまでこのサイ
クルを繰返す。

【０１１３】こうした動作間において溶液とビーズとを
よく混合するために、攪拌式あるいは超音波式混合機、
可変式磁場あるいは可動式磁場を利用することができ
る。結合種用アキュムレータ容器を、結合種を測量する
量読取キュベットとして用いてもよい。この場合、その
結合種を分析物として処理し、蛍光部分などの検出可能
な標識で標識付けを行うと好ましい。試料からリガンド
が完全になくなるまで、サイクル毎に結合種用アキュム
レータ内で検知される標識量は増加する。

【０１１４】可動式ビーズによる結合要素のサイクル式
抽出及びに蓄積を行うために適した装置を図２３及び図
２４に示す。装置１７８には、４つの容器１８０、１８
２、１８４及び１８６がそれぞれチューブ１８８に接続
された状態で具備されている。チューブ１８８を隣接す
る容器の間に延在させて４つの容器を環状に配置する。

【０１１５】例示した実施形態における容器１８０、１
８２、１８４及び１８６は実質的に同じものである。図
２３及び図２４に示すように、容器１８０及び１８２は
接続チューブ１８８により接続されている。図示のよう
に容器１８０は実質的に円柱状であり、閉じた底壁部１
９０と頂壁部１９２とを具備している。これ以外の形状
の容器も使用可能である。図示の実施形態では、容器１
８０には、閉塞部材を収容する開口部を備えたカラム１
９３が設けられている。容器１８０には混合抗体溶液１
９４が入れられており、容器１８２には洗浄液１９６が
入れられている。この実施形態において、容器１８４に
は溶離液、容器１８６には洗浄液が入れられている。こ
れらの溶液はピペットあるいは供給チューブで各容器の
開口部から供給することができる。

【０１１６】図２３及び図２４の実施形態における接続
チューブ１８８には、容器１８０に接続された第１端部
２００と第１端部２００から離れた第２端部２０２とを
含む第１の部分１９８がある。第２の部分には、第１の
部分１９８が含む第２端部２０２に接続された第１端部
２０６と容器１８２に接続された第２端部２０８とがあ
る。２つの部分１９８及び２０４を一定の角度を設けな
がら接合して、各部分が各容器に対してほぼ上方に延在
させる。部分２０４の第１端部２０６に磁石２１０を取
付ける。磁石２１０を、電源に接続した電磁石にすると
好ましい。この電源には磁石２１０を選択的に作動させ
る制御装置２１４が具備されている。別の実施形態では
磁石２１０を、チューブを取り囲むリング形磁石にして
もよい。各容器の底壁部に磁石２１６を設け、これも電
源２１２及び制御装置２１４に接続する。

【０１１７】図２４に示すように磁気ビーズ２２０をま
ず抗体溶液の入った容器１８０内に投入する。ビーズ２
２０を十分な時間容器１８０内に滞留させ、抗体をビー
ズ２２０に結合させる。好ましい実施形態において、液
体１９４及び１９６を、チューブ１８８をその液体で充
填するレベルまで各容器内に入れる。磁石２１０を作動
させて矢印２２２で示すようにチューブ１８８の第１の
部分を介してビーズ２２０を溶液１９４から引き上げる
ことにより、ビーズを隣の容器に移す。磁石２１０方向
に引き寄せられたビーズ２２０は、符合２２４で表すチ
ューブ１８８の第２の部分に捕捉される。

【０１１８】続いて磁石２１０を消磁してビーズ２２０
を解放すると、ビーズは重力にしたがって第２の部分か
ら隣の容器内に落下する。必要に応じて各容器の底部に
ある磁石２１６を作動させてビーズ２０４を下向きに容
器内に引き寄せることも可能である。各容器には、羽根
車、攪拌棒、超音波源などの攪拌装置を具備してもよ
い。

【０１１９】別の実施形態において、チューブ１８８を
緩やかな曲線形状にして、あるいはチューブ１８８に凹
部を設けてビーズを保持することができる。あるいは、
チューブ１８８を直線状にして隣接容器と容器との間に
直接延在させてもよい。チューブ内に適した弁あるいは
流動抑制装置を設けて隣接する容器と容器との間の液体
及びビーズの流動を調節してもよい。リング形磁石など
の磁石をチューブ周囲に設けてビーズを容器からチュー
ブ内に移動させる。

【０１２０】磁石２１０及び２１６は、電流を変化させ
ることによりその相対磁気を調節することができるもの
である。永久磁石を利用する場合、容器及び／または磁
石を遮蔽する、あるいはこの磁石を移動して近づけるあ
るいは遠ざけることにより容器との距離を調節すること
ができる。ビーズが高帯電状態である場合、液体で充填
したチューブを介して磁気ビーズを移動させるメカニズ
ムとして、溶液に接触する電極を磁石と置き換えてもよ
い。

【０１２１】図示の実施形態において、ビーズ２２０は
常磁性であり、混合抗体源から単一特異性抗体を単離及
び蓄積するための抗原を結合している。各組み合わせの
逆パターンも利用可能であることを理解されたい。ビー
ズ２２０を各容器に連続して移動させる。処理の最後
に、単一特異性抗体を容器１８４から回収する。各容器
内の流体量はチューブ１８８との接続部より下である
が、容器によってそのレベルは異なる可能性がある。別
の方法として、系全体を稠密流体あるいは粘性流体で充
填して、隣接容器と容器との間の流体の移動を実質的に
無くしてもよい。さらに別の実施形態において、接続チ
ューブの直径を極細にする、あるいはチューブに、隣接
する容器と容器との間の流体移動を調節する弁を設ける
ことができる。

【０１２２】ビーズを全ての容器内に投入しなくともよ
いが、通常、処理時には各容器にビーズを含有させる。
各容器における反応が異なるため、各容器の寸法、形状
及び温度は同じでなくともよい。各反応の必要性に応じ
て、その流体を単独で開口部から頻繁に交換しなくては
ならない場合もある（洗浄用流体など）。こうした液体
を外部装置（図示せず）とのラインを介して連続的に交
換することも可能である。ビーズを含みながら流体を交
換する場合、ビーズを濾過する、沈降させる、出口から
遠い方向に引寄せておくなどの処置によりビーズを損失
しないようにしなければならない。

【０１２３】この装置は、抽出、化学的合成（ペプチド
あるいはオリゴヌクレオチド合成、組合せ化学など）、
ＤＮＡ増幅（容器にそれぞれ異なるＰＣＲ法用のプライ
マを投入するなど）及び物品処理などの広範囲の産業用
処理にも有用である。実施する処理や許容できるキャリ
ーオーバー量に依存して、１つ以上の洗浄ステーション
を省くことができる。

【０１２４】［図２５〜図２８に示す実施形態］図２５
〜図２８に図示する本発明による別の実施形態におい
て、容器２３２、２３４、２３６及び２３８の間で磁気
ビーズを移動させる処理装置２３０を示す。上述した実
施形態と同様、容器２３２には標的成分を分散させた試
料液２４０を入れる。容器２３４には洗浄液２４２を入
れ、容器２３６には溶離液２４４、容器２３８には洗浄
液２４６を入れる。図２５に示すように、容器２３２、
２３４、２３６及び２３８を環状に配置する。

【０１２５】装置２３０には、ハブ２５６から放射状に
延在する４本のアーム２４８、２５０、２５２及び２５
４が設けられている。各アームの外端部には磁化性プロ
ーブ２６０が取付けられている。図示の実施形態におけ
るプローブ２６０は電磁石である。ハブ２５６はシャフ
ト２６２により支持されており、このシャフトは操作装
置２６４に接続されている。本発明の一実施形態におい
て、この操作装置は、シャフト２６２及びアームを予め
定められた位置まで回転させることのできるステップモ
ータである。シャフト２６２はその軸方向に往復移動で
きるようにも取付けられている。コンピュータあるいは
マイクロプロセッサなどの制御装置２６６を用いて、操
作装置２６４及び磁化性プローブ２６０の動作を制御す
る。図２６に示すように、ワイヤ２６１をプローブ２６
０から制御装置２６６に延在させる。

【０１２６】本発明によるこの実施形態において、図２
６に示すように容器２３２には試料液体２４０を入れ、
容器２３４には洗浄液２４２を入れる。一定量の磁気ビ
ーズ２６６を容器２３２内に投入し、一定量の磁気ビー
ズ２６８を容器２３４内に投入する。同様量のビーズ
（図示せず）を容器２３６及び２３８に添加することを
理解されたい。上述の実施形態と同様、ビーズ２６６及
び２６８には、標的成分に対して結合親和力を備えた材
料コーティングを施している。

【０１２７】図２６及び図２７を参照すると、ビーズ２
６８を容器２３２の試料液２４０内に十分な時間の間分
散して標的化合物を結合させる。ビーズ２７０は洗浄液
２４２内に分散されている。操作装置２６４を作動させ
てアーム２４８、２５０、２５２及び２５４のプローブ
２６０を各容器２３２、２３４、２３６及び２３８内に
下降させる。図２７に示すようにプローブ２６０に磁気
を与えてビーズ２６８及び２７０を捕捉させる。シャフ
ト２６２を図２８に示す位置まで上昇させてプローブ２
６０を各容器から引き抜く。シャフト２６２を図２６の
矢印２７０の方向に回転させてプローブ２６０を隣の容
器の上に位置付ける。こうしてシャフト２６２を下降さ
せて、ビーズ２６８を付着させたプローブ２６０を洗浄
液２４２内に挿入し、標的成分を捕捉して含むビーズ２
６８を洗浄容器２３４に移す。プローブ２６０を消磁す
ると、ビーズを各液体内に分散させることができる。プ
ローブ２６０に再度磁気を与えてビーズを捕捉し、その
ビーズを隣の容器に移す。

【０１２８】図２５に示すように、装置２３０によりビ
ーズを連続して試料容器２３２から洗浄容器２３４、溶
離容器２３６及び洗浄容器２３８に移動させることがで
きる。装置２３０の連続操作では、ビーズを洗浄容器２
３８から試料容器２３２まで再循環して再度標的化合物
を捕捉させる。容器２３６で溶離された標的化合物は標
準処理にしたがって回収され、分析される。

【０１２９】本発明において、装置１７８を１０００回
操作させることにより、少量の蛋白質抗原から１０００
倍の抗体分子を生成することができる。同様の装置でこ
の抗体を精製、固定化、操作して１０００倍の蛋白質を
生成し、この蛋白質を用いてさらに１０００倍の抗体を
生成することができ、これを繰返す。この手法で最も重
要な点は、純抗体から開始せずとも微量の蛋白質あるい
は抗体（２−Ｄゲルあるいは他のあらゆる分析方法から
の蛋白質など）を用いて大量の純蛋白質をブートストラ
ップ式に生成できる点である。これにより、市販のガン
マグロビン、抗体提示ファージ、組合せ化学などの混合
抗体あるいは他の受容体のプールを利用できることにな
る。別の方法として、少量の抗体及び蛋白質混合物（細
胞溶解産物など）から、リサイクルすることにより、ま
た抗原及び抗体間の「ピンポン」手法により大幅に大量
の純蛋白質及び単一特異性抗体を生成することができ
る。

【０１３０】可動ビーズを利用する重要性は、開始材料
が微量でよいことにある。材料が最小限である初期段階
に少量のアフィニティカラムを生成及び操作することは
非現実的であり恐らく不可能であろう。各ステップで回
収される結合パートナーの量は最小限であり、サイクル
毎にこれが大量の液体に溶解される。これとは対照的
に、ビーズ手法では結合パートナーを最小容量の液体に
濃縮するため、少量の初期リガンドあるいは受容体に対
する可能となる。さらに、ビーズを用いると、一度に多
種類の蛋白質及び／または抗体に対して、並行して蛋白
質を循環させて増幅できるため、多量の抗原に対して迅
速に抗体を生成する、あるいは微量の抗体に対して多量
の抗原を生成することができる。単クローン抗体の従来
の生成方法に比べると格段に速く大量の抗体を生成でき
るため、この系を単クローン抗体の形成に用いることも
できる。一般に、単クローン抗体の生成に向けて抗体及
び抗原を大量生産するには２〜３時間が必要である。こ
うして調製した蛋白質及び単一特異性抗体を、従来通り
調製された蛋白質及び抗体と同じ分析用、医療用及び産
業用用途に使用することができる。

【０１３１】不純物や他の理由で抗体が単一特異性では
ない場合、最終的な生成物は２、３種類の抗原に対して
のみ特異性となる。抗体が単一特異性ではない場合、従
来の免疫サブトラクション(immunosubtraction)法を用
いてもよい。プロトコルの一例は、おそらく二次元電気
泳動ゲルスポットあるいは蛋白質の断片から得るごく微
量の蛋白質あるいはペプチドから開始して、診療あるい
は治療を目的とした大量抗体を作製することである。ま
ず、上述したように磁気ビーズ上に蛋白質を固定化し、
その後任意に復元ステップを施す。次いで、非特異受容
体源プール（１種類あるいは複数種類）である市販のガ
ンマグロブリン、抗体提示ファージ、組合せ化学生成物
などをこのビーズに接触させて、この受容体（１種類あ
るいは複数種類）を吸着させる。この受容体を、例えば
ｐＨ２クエン酸緩衝液などで適切に溶離し、回収された
受容体をビーズ、好ましくは磁気ビーズ上に固定化して
受容体ビーズを形成する。受容体のビオチン化前、ある
いはビオチン化後が、アビジン／ストレプトアビジンビ
ーズあるいはアビジン／ストレプトアビジン非含有ビオ
チン化ビーズとの併用に好ましい。次いで、この受容体
ビーズを用いて、生物学的試料から他の蛋白質との錯体
である可能性もある天然蛋白質を（繰り返し）吸着し、
これを溶離して大量の天然蛋白質を生成することができ
る。この大量天然蛋白質を用いて、動物への免疫、試験
管内免疫、ガンマグロブリンからの抗体の吸着、回復期
血清、プールした生物学的流体、ハイブリドーマ、抗体
提示ファージ、組合せ化学などにより大量の特異的受容
体を作製する。この最後のステップにおいて、所望に応
じて、天然蛋白質を磁気ビーズあるいは他の固相に固定
化してよい。

【０１３２】本発明の一実施形態において、ビオチンを
複合した２ＤＥにより分離された蛋白質（ヒト血清蛋白
質ＳＡＡなど）をストレプトアビジンコーティングビー
ズに固定化し、このビーズをＳＡＡ（及び可能性として
数多くの他の抗原に）に対する抗体を含む試料内を循環
させる。ＳＡＡに特異な抗体を結合種アキュムレータ内
に回収し、他のあらゆる特異な抗体はを試料あるいは第
１の洗浄液内に残留させて分離する。

【０１３３】別の実施形態において、特異抗体を所望の
リガンド(ヒト血清蛋白質ＳＡＡなど)に対して調製し、
この抗体を磁気ビーズに共有結合あるいは他の方法で密
着させる。この抗体を例えば前段落で説明した精製物と
することができる。この系の目的は、１）少量の抗体を
循環させることにより、それを化学量的に大幅に上回る
量の分析物を蓄積し、２）循環時に分析物の蓄積を連続
的に監視することにより広いダイナミックレンジの検出
を行い、３）複数試料に対して再循環したビーズの利用
手段を提供することである。

【０１３４】リガンドを含む試料を、全ての蛋白質が好
ましくは化学量的に色素で標識化されるように、市販の
活性化したＣｙ３（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃ
ｉａＢｉｏｔｅｃｈ）などの蛋白質用汎用蛍光標識試薬
に反応させる。次に、試料及びビーズを適した４チャン
バ式装置内に投入する。制御可能な電磁石を用いてビー
ズを試料内に移動させると蛍光標識リガンドがビーズに
結合する。攪拌機、変動性磁場などの混合手段を補助と
して用い、ビーズを試料に曝露してもよい。次いで、磁
気プローブによりビーズを洗浄液内に移動させて、抗原
−抗体相互作用により密着していない蛋白質の全てを除
去した後、ビーズを結合種アキュムレータチャンバ内に
移す。チャンバ内の酸性ｐＨ（ｐＨ２など）によりリガ
ンドが抗体担持ビーズから解放される。続いて、ビーズ
を洗浄チャンバ（ｐＨ７）に移し、引き続き試料内に戻
してリガンドをさらに捕捉させる。ビーズを清浄な洗浄
液でいつも再生できるのであれば２回の洗浄ステップと
も１つの洗浄ステーションで行ってもよい。こうすると
３つのステーションシステムとなる。

【０１３５】ビーズを他の容器に移す代わりに、ビーズ
を収集して、吸引、洗浄を行い、次のステップの実施に
向けて１つの容器内で溶液を交換してもよい。ビーズが
結合種アキュムレータチャンバ外にある間に、光学系に
よりそのチャンバ内の色素量を測定する。適した例とし
て蛍光色素Ｃｙ３及び対応する蛍光光学系が挙げられる
が、他の非光学系手段で検出されるこれ以外の化学的シ
グナルも利用可能である。一般に、シグナル（あるいは
シグナルを発する成分）はアキュムレータ内の条件下で
安定でなければならない。あるいはまた、アキュムレー
タ内の条件を変化させることで見つけられるものでなけ
ればならない。フルオレセインは例えばｐＨ２．５では
蛍光発光しないため、この標識は、ｐＨ中和試薬をさら
に追加せずに監視するアキュムレータを用いる系での使
用には適していない。サイクル毎に溶離／蓄積チャンバ
に運搬する標識リガンドの量が増加するため、溶離サイ
クル毎にシグナルは特定量ずつ増加する。リガンドが試
料内で激減すると、シグナルの増加量が漸近線まで低下
する。試料内に大量のリガンドが含有されていれば（し
たがってサイクル毎に蛍光発光が一定量増加すれば）、
サイクル時間（さらに具体的に言えば、ビーズが試料内
に滞留する時間）を短縮して、各サイクルにて飽和量よ
り少ない分析物量を運搬させることができる。試料から
溶離／蓄積チャンバに運搬されるリガンド量はビーズ上
の抗体量、リガンドに対するビーズの親和力及び試料内
のリガンド量に依存する。この系が再循環式であること
から、ビーズ上の抗体量を、含有されているリガンドを
全て捕捉するために必要となる量より少なくすることが
できる。定期的あるいは各サイクル後に読み取る循環方
式であることから、サイクルとシグナルとの関係を表す
曲線の不整をならす、あるいはこの曲線を分析してこの
捕捉系のパラメータを特定することができるため、分析
物に対する測量をより正確に行うことができる。ｐＨが
変化するなどの特定の条件下において、抗体の変性など
の望ましくない変化が蛋白質に起こる可能性がある。プ
ローブ上に少量の酸性溶液を流すと良好に溶離できる場
合がある。酸性溶液を結合種アキュムレータ内に滴下す
る場合には、その中ですぐに濃縮中和緩衝剤で希釈す
る。

【０１３６】一実施形態において、４つのチャンバを、
１枚のマルチウェルプレート（９６ウェルプレートな
ど）の特定位置に設けた試料ウェルと、第２のプレート
の洗浄位置と、第３のプレートの同じ位置に設けた結合
種アキュムレータと、第４のプレートに設けた最後の洗
浄位置とにすることができる。９６種類の受容体あるい
は蛋白質を担持する９６種類の磁気ビーズ調製物を用い
ると、９６回のプローブによる磁気ビーズの運搬と４枚
の９６ウェルＭｉｃｒｏｔｉｔｅｒプレートを利用し
て、９６種類の循環式アッセイを同時に行うことができ
る。各サイクルで結合種を解放した後、従来の蛍光プレ
ートリーダーで結合種アキュムレータープレートを読み
取ることができる。別の方法として、４つのチャンバ
を、試料数に依存して、１枚のマルチウェルプレートの
４ウェル、３８６ウェルプレートの４区分９６ウェルず
つ、あるいはこれ以外のウェル数を含むプレートとする
ことができる。

【０１３７】本発明による装置を、補助因子、会合蛋白
質、基質、受容体及び生成物の精製、ＰＣＲによるＤＮ
Ａ増幅、核酸の抽出、固相化学合成、分析系（免疫及び
他の結合アッセイ）など、上記以外の数多くの循環式反
応あるいは多段階処理に同様に適用可能であることを理
解されたい。この装置を、自給式実験室とも、あるいは
大量生産施設とさえも見なすことができる。この装置
が、磁気の印加によるビーズの動作がその瞬間の反応を
特定する、コンピュータ制御及び機械的操作がなされる
自動制御機械内に挿入される「ラボ・オン・チップ」モ
ジュールであると好ましい。

【０１３８】本発明による蛋白質コーティングビーズ及
び受容体コーティングビーズには分析測定において多様
な使用法がある。免疫組織化学において、上述したコー
ティングビーズを単独で、またはより好ましくは標識化
ビーズあるいは予備標識化成分を結合したビーズを用い
てスライド上のリガンドあるいは受容体を検出すること
ができる。米国特許第５，３９５，６８８号は、ビーズ
を蛍光標識化する１つの方法である。この方法得られる
ビーズは顕微鏡の識別が容易である。複数の異種蛋白質
あるいは受容体をコーティングしたビーズを同時に使用
してもよい。同定を容易にするため、ビーズを異なる色
で着色あるいは異種で標識化すると好ましい。受容体あ
るいは蛋白質をビーズから分離し、従来の技術により間
接的に利用する、あるいは標識化して免疫組織化学に直
接利用することができる。

【０１３９】本発明は大量生産用の機械操作に特に適し
ている。通常の二次元ゲルには数百から数千種類もの蛋
白質スポットがあり得る。多数の市販システム、改良型
コロニーピッカーにより並行して行われるステップとし
て、それぞれをゲルから切断することができる。９６ウ
ェルプレートシステムを改良して、磁気プローブを含む
第２のアーム（あるいは送出及び吸引アームの別部分）
を設けた機械的装置を構成してもよい。

【０１４０】

【実施例】実施例１：蛋白質コーティングビーズの調製 ＩＳＯ−ＤＡＬＴ（登録商標）Ｓｙｓｔｅｍ Ａｎｄｅ
ｒｓｏｎら著、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．８５：３３
１−３４０頁、（１９７８年）及びＡｎｄｅｒｓｏｎら
著、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．８５：３４１−３５４
頁、（１９７８年）及びＴｗｏ−Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａ
ｌ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：Ｏｐｅｒａｔｉ
ｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＩＳＯ−ＤＡＬＴ（登録商標）Ｓ
ｙｓｔｅｍ Ｌｅｉｇｈ Ａｎｄｅｒｓｏｎ、１９８８
年、Ｌａｒｇｅ Ｓｃａｌｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｐｒｅ
ｓｓ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， ＤＣ、Ｌｉｂｒａｒｙ
ｏｆ Ｃｏｎｇｒｅｓｓ カタログＣａｒｄ Ｎｏ．８
８−８００９７、ＩＳＢＮ ０−９４５５３２−００−
８にしたがって、ヒト血清試料を２−Ｄ電気泳動により
分離した後、クーマシーブルー(Coomassie Blue)により
染色した。ハプトグロビン（軽鎖成分及び重鎖成分の双
方を含む蛋白質）の軽鎖に対応するスポットを２−Ｄか
ら、１〜２ｍｍ直径でゲルの肉厚（１．５ｍｍ）に等し
い長さの円柱状断片を切出して切断した。切断したスポ
ットを５０％アセトニトリル水溶液２００μｌ内で超音
波攪拌により３回洗浄し、クーマシーブルーによる染色
部分を除去した。このゲルスポットは、ヒト血漿タンパ
クの標準地図上の位置に基づいて切出した（（Ａｎｄｅ
ｒｓｏｎ ＆ Ａｎｄｅｒｓｏｎ， Ｐｒｏｃ Ｎａｔ
ｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ７４（１２）：５
４２１〜５頁（１９７７年）及びＡｎｄｅｒｓｏｎ ＆
Ａｎｄｅｒｓｏｎ、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ
１２（１１）：８８３〜９０６頁（１９９１年））。

【０１４１】こうして得た脱色蛋白質スポットをｐＨ８
の０．５Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液２００μｌ内で２回洗
浄し（それぞれ３０分間）、１ｍｇ／ｍｌ ＮＨＳ−Ｌ
Ｃ−ＬＣ−ビオチン標識試薬系（Ｐｉｅｒｃｅ Ｐｒｏ
ｄｕｃｔ Ｎｏ．２１３４３）炭酸ナトリウム５０μｌ
内に投入した。室温にて３０分反応させた後、さらに
０．１Ｍエタノールアミン１００μｌを添加して、未反
応であるビオチン化試薬と組合わせた。さらに３０分
後、スポットを０．１％ＳＤＳトリスグリシン緩衝液で
３回（それぞれ３０分間）洗浄した。

【０１４２】図１に示したような電気溶離装置を、２０
０μｌ用「イエロー」Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ製ピペットチ
ップに、溶離用緩衝液を含む１０％Ｔポリアクリルアミ
ドゲルを充填して組立てた。ストレプトアビジンでコー
ティングしたＤｙｎａｌ製常磁性微小球をこのピペット
チップに添加し（１０％スラリの１０μｌ）、磁石によ
り底部（充填物頂部）でビーズを収集して、１μｌの微
小球凝縮床を得た。スポットをチップ内に投入して、チ
ップの円錐内に嵌り込む位置に沈降させた。最後に、こ
のチップを溶離緩衝液の小型ビーカー内に吊り下げ、白
金電極をチップ内とビーカー内とに配置した。５０Ｖの
電流を３０分間印加して蛋白質を溶離し、その蛋白質を
ビーズ上に捕捉した。溶離後、装置を解体してゲル片を
取出し、常磁性ビーズを磁力により収集し、魚皮ゼラチ
ン０．１％含有リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳＧ）２０
０μｌを含む９６ウェルプレートの１ウェル内に入れ
た。

【０１４３】容器の外面に取付けた外部磁石を用いてビ
ーズを捕捉し、洗浄液２００μｌを含む５ウェルでビー
ズを引き続き洗浄した。ビーズを洗浄液内に入れて開放
し、プレートを振動してビーズを分散させ、１分間イン
キュベートした後にビーズを磁石で再捕捉することによ
り、ビーズの洗浄を行った。このウェルは９６ウェルプ
レートのウェルでよい。洗浄液には魚皮ゼラチン０．１
％含有リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳＧ）２００μｌを
用いる。 実施例２：蛋白質の復元 濃度が約８Ｍである尿素及び１％のメルカプトエタノー
ルを含み、尿素濃度を０．５Ｍずつを増加させた一連の
緩衝液にビーズをくぐらせて、ビーズ上の蛋白質を復元
する。各段階において、３７℃にて１５分間のインキュ
ベートを行った後、プローブでビーズを引き上げて次の
容器に運搬する。 実施例３：抗体及びペプチドの調製 次に、実施例１によるビーズ（「抗原をコーティングし
た」ビーズ。実施例２によるビーズを用いてもよい）を
ヒトハプトグロビンに対するポリクローナル抗血清を含
むウェル内に投入し、これを分散させて１分間結合させ
る。次に、このビーズをプローブにより取出し、２５℃
の２００μｌのＰＢＳＧを入れた別の容器内で１分間に
わたり２回洗浄する。最後に、このビーズを、２５℃で
０．９％ＮａＣｌ及びｐＨ２．５であるＨＣｌの入った
ウェブ内に１分間投入する。この処理により、結合され
ていた抗ハプトグロビン抗体を媒体内に放出する。

【０１４４】抗体の放出後、このビーズをプローブで取
出す。このプローブは、プラスチック製カラーを加えて
改良した「ＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒ」（フィンランド、ヘ
ルシンキのＬａｂｓｙｓｔｅｍｓ ＯＹ）（ｍＲＮＡの
精製に上述にて利用したもの）である。ｐＨ８の緩衝液
濃縮物５０μｌをウェル内に入れて混合し、ｐＨを８ま
で上昇させる。次に、蛋白質Ｇでコーティングした常磁
性ビーズの１０％懸濁液１０μｌをこのウェル内に入れ
て６時間攪拌しながらインキュベートする。抗体をジメ
チルピミリミデートにより蛋白質Ｇに共有結合し（Ｇｅ
ｒｓｔｅｎら著、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏ
ｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ １２７：２１５〜２
２０頁及びＳｃｈｎｅｉｄｅｒら著、Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２
５７：１０，７６６〜１０，７６９頁）、「抗体をコー
ティングした」ビーズの第２のセットを得る。架橋結合
により抗ハプトグロビン抗体をこのビーズに固定化させ
た後、このビーズを、標準ヒト血清２００μｌの入った
ウェルに移し、１０分間攪拌して天然ハプトグロビンを
結合させる。次に、磁気プローブを利用して、抗体コー
ティングビーズを２００μｌのＰＢＳＧの入った３つの
容器を連続して移動させて洗浄する。

【０１４５】最後に、ビーズを少量の５％酢酸内に移し
て、ビーズから天然ハプトグロビンを溶離し、ビーズを
取出す。溶液中のハプトグロビンを２つのアリコットに
わける。この材料の約１０％をＭＡＬＤＩマトリクスの
溶液(シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸を飽和した４０％
ＣＨ₃ＣＮ及び０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）水
溶液)と混合し、ＭＡＬＤＩ質量分析計表面（Ｖｏｙａ
ｇｅｒ ＤＥ−ＳＴＲ、ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）
に付着させ、これを分析したところ、重鎖及び軽鎖の双
方を検出した。溶離した天然ハプトグロビンの残りの９
０％を２−Ｄゲル試料緩衝液と混合し、２−Ｄにより分
析したところ、他の血清蛋白による相当量の不純物を含
まないハプトグロビンの重鎖及び軽鎖の双方を検出し
た。

【０１４６】実施例１及び実施例３では、２−Ｄゲルに
より精製かつ常磁性ビーズに固定化した材料を用いると
ポリクローナル抗血清から特異抗体を単離できることが
わかる。この抗体を引き続き利用して血清から天然抗原
を捕捉し、天然状態において２−ＤＥゲルから単離され
る軽鎖に結合する他のサブユニット（この場合は重鎖）
を特定することができる。 実施例４：抗体の調製及びサイクル式アッセイ ハプトグロビンに対する同じポリクローナル抗血清をＣ
ｙ３（Ａｍｅｒｓｈａｍ製）により蛍光標識化し、反応
しなかったＣｙ３を除去した後、実施例１で調製した抗
原コーティングビーズをこの抗血清のアリコットに曝露
する。この抗血清では、この処理により本質的に全ての
蛋白質（抗体を含む）が同時に蛍光標識化されている。

【０１４７】幾つかの抗体を、ビーズに抗体結合させる
ことによりビーズで単離する。これをＰＢＳＧ内で洗浄
し、上述のように酸で抗体を溶離する。移動した抗体の
蛍光量をＴＥＣＡＮ蛍光プレートリーダーにおいて任意
の単位で測定する。続いてこの操作を同じビーズで反復
し、抗体を同じウェル内に放出し、測定を終えたウェル
内の蛍光量に追加する。新たに測定するたびに蛍光量が
増加した。この操作を合計５回繰返したところ、抗原コ
ーティングビーズによる１回の操作で結合し得る抗体の
およそ５倍を単離（酸性溶離液ウェル内に）した。

【０１４８】この実施例から、ビーズを再循環させる
と、抗原コーティングビーズ上の抗原量あるいは２−Ｄ
ゲルから回収される抗原量に化学的に匹敵する量よりも
多くの抗体を生成できることがわかった。 実施例５：免疫組織化学染色 実施例４で蛍光標識化した抗体を中和し、正常肝臓組織
及び正常腎臓組織の薄片と反応させた。これを徹底的に
洗浄し、Ｃｙ３蛍光の検出に適する励起及び発光用フィ
ルタを具備した蛍光顕微鏡で調べた。Ｃｙ３で標識化し
た抗ハプトグロビン抗体は肝臓柔細胞には結合した（こ
の細胞はハプトグロビンを生成するため予想通り）が、
腎臓細胞（ハプトグロビン非含有）には結合しなかっ
た。

【０１４９】上記方法を実施例３によるポリクローナル
抗ハプトグロビン抗体コーティングビーズで繰返す。肝
臓柔細胞にビーズが固定化され、腎臓細胞にはされなか
ったことから、免疫組織化学染色が正確であったことが
わかる。この実施例から、上述した方法で単離した抗体
を利用することにより、組織部分における蛋白質の位置
を同定することができることがわかる。 実施例６：ファージディスプレイライブラリのスクリー
ニング 実施例１による抗原コーティングビーズを、天然ヒトド
ナーから構成される抗体ファージディスプレイライブラ
リに曝露する。ビーズに結合したファージを溶離して、
単鎖抗体蛋白質を培養する。この抗体を用いてエンザイ
ムイムノアッセイ（ELISA）を構成し、これを用いて一
連のヒト血清内におけるハプトグロビンを測定する。 実施例７：蛋白質スポットの同定 蛋白質ゲルスポットを切出すまで、実施例１の方法を繰
返した。この蛋白質ゲルスポットを２時間水２００μｌ
内で洗浄して脱色した後、４０％アセトン、１０％トリ
エチルアミン及び５％酢酸のｐＨ６．４水溶液内で３０
分間振盪した。次に、このゲル片を１時間２００μｌの
５０％アセトニトリル水溶液中で洗浄した後、これを取
出して２時間空気乾燥させた。このゲル片に、１０％ア
セトニトリルを含む２μｌトリプシンのｐＨ８．２、１
００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ３００μｌ溶液を付着さ
せ、２０時間にわたり３７℃でインキュベートした。ペ
プチドを３０分間それぞれ６０％アセトニトリル、０．
１％トリフルオロ酢酸とで２回抽出した。ｐＨ８．２、
１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液５μｌを添加した
後、Ｃ１８炭化水素をコーティングした約１００μｌの
常磁性ビーズを投入して３０分間振盪した。

【０１５０】図２ａに示した磁気プローブを挿入してビ
ーズを引き上げる。ビーズを新しいチューブ内のｐＨ
８．２、１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液５μｌ内
に分散させて３０分間振盪する。このビーズを磁気プロ
ーブにより再度引き上げ、実施例３の４０％アセトニト
リルを含有するＭＡＬＤＩマトリクス溶液を調製し、そ
の２μｌをビーズより上の磁気プローブ位置に滴下す
る。流体の液滴が磁気プローブの先端部に収集される状
態が見られるまで、さらに２μｌずつをおよそ３０秒間
隔で滴下する。ＭＡＬＤＩ質量分析計表面をその液滴と
接触させて、液滴をＭＡＬＤＩ表面に付着させる。実施
例１で説明したように蛋白質の同定を続ける。 実施例８：ビーズ上に捕捉した蛋白質の分解 ＰＢＳＧ内で洗浄するまで実施例１用に調製したビーズ
を脱イオン水内でさらに洗浄し、１０％アセトニトリル
を含む３μｌトリプシンのｐＨ８．２、１００ｍＭのＴ
ｒｉｓ−ＨＣｌ溶液の入った容器内に投入し、２０時間
にわたり３７℃でインキュベートする。ペプチド生成物
をこの液体内に放出させる。アビジンコーティング磁気
ビーズを磁気プローブで取出す。Ｃ¹⁸コーティング磁気
ビーズをこの液体に添加して、３０分間インキュベート
する。この磁気ビーズを磁気ピンあるいはプローブ上に
捕捉する。ＭＡＬＤＩマトリクス溶液の１μｌアリコッ
トをこの磁気ピン及び捕捉ビーズに滴下して、ペプチド
をＭＡＬＤＩ質量分析用プレート上に溶離する。流体の
流動量が不充分で付着液がプレートに接触しない場合、
液体がプレート上に付着するまでさらに１μｌずつのア
リコットを引き続き添加する。 実施例９：ビーズ上に捕捉されたペプチドのエレクトロ
スプレー質量分析計への導入 実施例７の方法を、図１７の磁気プローブを挿入するま
で繰返す。分解用ウェルのペプチド抽出液内に懸濁して
いる磁気ビーズを毛管（内径１００ミクロン）内に吸引
し、図１７に示す管内部５ｃｍに位置するフリットに付
着させる。ビーズを流入液で一定位置に保持しつつ、ビ
ーズで充填した毛管を取り囲む位置まで磁石を移動させ
る。抽出液を吸引し終わった時点で吸引をやめ、磁石に
より磁気ビーズを毛管の一定位置に保持し続ける。次
に、毛管アセンブリを位置付け装置によりエレクトロス
プレー質量分析計（Ｆｉｎｎｅｇａｎ ＬＣＱ）の入口
内に向けて移動させる。０．５％トリフルオロ酢酸水溶
液内０〜６０％アセトニトリルの勾配をこの毛管内に注
入して磁気ビーズ床上に流出させ、質量分析計内に流入
させた。ペプチドを連続的に溶離し、これを質量分析計
内に導入し、量的及び切断生成物について特徴づけて蛋
白質を同定する。最後に、毛管アセンブリを９６ウェル
プレートの空のウェル上に再度位置付け、磁石を凝集ビ
ーズから離れた位置に再度位置付け、液体を１５秒間迅
速に流出させて、次の分解用ウェブ内に磁気ビーズを収
集する準備としてこのビーズを射出する。

【０１５１】本明細書において開示した実施形態に様々
な修正を加えられることを理解されたい。したがって、
上述は制限的であると解釈されるものではなく、好まし
い実施形態の例示のみを目的としている。当業者であれ
ば、本明細書に添付した請求の範囲及び趣旨を逸脱する
ことなく他の修正案を想定できるであろう。

【０１５２】

【本発明の効果】 【図面の簡単な説明】

以下は本発明の簡単な説明である。

【図１】本発明による第１実施形態の分離装置を示す斜
視図である。

【図２】図１の装置を示す平面図である。

【図３】図１の分離装置を示す側断面図である。

【図３Ａ】本発明による別の実施形態における電気溶離
容器を示す側断面図である。

【図４】本発明による実施形態のプローブを示す側面図
である。

【図５】本発明による実施形態の分離装置用である図４
に示したプローブの側断面図であり、プローブが延在位
置にある状態を示す。

【図６】本発明による実施形態の分離装置用である図４
に示したプローブの側断面図であり、プローブが後退位
置にある状態を示す。

【図７】本発明による別の実施形態における分離装置用
プローブの側面図であり、磁石が延出及び後退位置にあ
る状態を示している。

【図８】プローブの側断面図である。

【図９】図７及び図８の実施形態による分離装置の連続
ステップを示す断面図である。

【図１０】図７及び図８の実施形態による分離装置の連
続ステップを示す断面図である。

【図１１】図７及び図８の実施形態による分離装置の引
き続くステップを示す断面図である。

【図１２】図７及び図８の実施形態による分離装置の引
き続くステップを示す断面図である。

【図１３】図７及び図８の実施形態による分離装置の引
き続くステップを示す断面図である。

【図１４】図７及び図８の実施形態による分離装置の引
き続くステップを示す断面図である。

【図１５】ビーズを捕捉及び解放する処理ステップを示
すフローチャートである。

【図１６】本発明による別の実施形態において質量分析
を目的としてペプチドを分離及び調製する連続ステップ
を示す断面図である。

【図１７】本発明による第４の実施形態における分離装
置の連続ステップを示す断面図である。

【図１８】本発明による第４の実施形態における分離装
置の連続ステップを示す断面図である。

【図１９】本発明による第４の実施形態における分離装
置の連続ステップを示す断面図である。

【図２０】本発明による第４の実施形態における分離装
置の連続ステップを示す断面図である。

【図２１】本発明による第４の実施形態における分離装
置の連続ステップを示す断面図である。

【図２２】本発明による第４の実施形態における分離装
置の連続ステップを示す断面図である。

【図２３】本発明の第５の実施形態における分離装置を
示す斜視図である。

【図２４】図２３の装置を示す部分側断面図である。

【図２５】本発明の別の実施形態におけるビーズ操作装
置の斜視図であり、４本のアームが回転式往復運動型シ
ャフト上に取付けられている状態を示す。

【図２６】図２５の装置の正面側面図であり、磁化性プ
ローブが後退位置にある状態を示す。

【図２７】図２５の装置の正面側面図であり、磁化性プ
ローブが容器に挿入された状態を示す。

【図２８】捕捉したビーズを保持しながらプローブが後
退した状態を示す正面側面図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） // Ｃ０７Ｋ 1/22 Ｃ０７Ｋ 1/22 17/08 17/08 17/14 17/14

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】疎水性コーティングが表面に施された磁気
   ビーズ。
2. 【請求項２】蛋白質またはペプチドを可逆的に結合可能
   なコーティングが表面に施された磁気ビーズ。
3. 【請求項３】蛋白質またはペプチドを可逆的に結合可能
   な磁気ビーズ。
4. 【請求項４】リガンドを固定化する結合親和力を有する
   コーティングが施された磁気ビーズを含むビーズ組成
   物。
5. 【請求項５】第２リガンドを固定化する第２結合親和力
   を有する第２コーティングが施された第２磁気ビーズを
   さらに含む、請求項４に記載のビーズ組成物。
6. 【請求項６】標的成分に対して結合親和力を有するポリ
   マーコーティングを外面に施したビーズの懸濁液を用い
   ることを特徴とする、試料から標的成分を回収する方
   法。
7. 【請求項７】ビーズ溶液を用いることを特徴とする、試
   料から蛋白質あるいはペプチドを回収する方法。
8. 【請求項８】一定量の磁気ビーズを含む標的成分の溶液
   または分散液を利用するステップと、前記溶液または分
   散液を濾過装置を有するチューブを介して吸引し、前記
   ビーズを前記濾過装置に収集するステップと、を含むこ
   とを特徴とする標的成分の分析方法。
9. 【請求項９】標的成分を含む液体を試料容器に入れ、前
   記液体を、標的化合物に対して結合親和力を有するコー
   ティングを施した有効量の磁気ビーズに接触させるステ
   ップを含むことを特徴とする、液体試料から標的成分を
   連続的に回収する方法。
10. 【請求項１０】頂端部と、底端部と、前記頂端部に連結
    されたカラーとを有する往復運動型プローブにより電磁
    場を選択的に形成できることを特徴とする、液体から一
    定量の磁気ビーズを回収する装置。
11. 【請求項１１】電極間で電流を流すことができるよう第
    １液体と第２液体との間に通路を有することを特徴とす
    る、溶液あるいは分散液から標的成分を分離する装置。
12. 【請求項１２】軸方向通路を含む中空部と、前記軸方向
    通路内に電磁場を形成する磁石とを有することを特徴と
    する、磁気ビーズを操作する装置。
13. 【請求項１３】第１容器と、第２容器と、前記第１容器
    から磁気ビーズを捕捉して前記ビーズを前記第２容器に
    移動させる磁化性部材とを有することを特徴とする、磁
    気ビーズを操作して移動させる装置。