JP2003265192A

JP2003265192A - ＩＫＫ−αタンパク質、核酸及び方法

Info

Publication number: JP2003265192A
Application number: JP2003013573A
Authority: JP
Inventors: Mike Rothe; ロス，マイク; Zhaodan Cao; カオ，ジャオダン; Catherine Regnier; レニエ，キャサリン
Original assignee: Tularik Inc
Current assignee: Tularik Inc
Priority date: 1997-07-01
Filing date: 2003-01-22
Publication date: 2003-09-24
Also published as: AU8283698A; JP3549899B2; US20060019365A1; DE69826493T2; EP1005539A1; AU726294B2; EP1005539A4; US6235513B1; CA2294566C; DE69826493D1; US7045613B2; US6235512B1; ES2224414T3; EP1005539B1; US6235492B1; JP2001510346A; WO1999001541A1; ATE277171T1; US6479266B1; CA2294566A1

Abstract

(57)【要約】【課題】ＩκＢキナーゼであるＩＫＫ-α、及び関連
した核酸に関する方法と組成物を提供する。【解決手段】本ポリペプチドは開示されたＩＫＫ-α
コード核酸からの形質転換宿主細胞から組換え的に産生
されてもヒト細胞から精製してもよい。本発明は開示さ
れたＩＫＫ-α遺伝子と特異的にハイブリダイズ可能な
単離されたＩＫＫ-αハイブリダイゼーションプローブ
及びプライマー、特異的抗体のようなＩＫＫ-α特異的
結合薬剤、及び主題組成物を製造し、診断法、治療法及
び生物製剤工業において使用する方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（発明の分野）この発明の分野は転写因子
の活性化に関与するタンパク質である。

【０００２】（背景）サイトカイン類は、潜伏転写因子
の活性等を改変することにより遺伝子発現における変化
をトリガーする(HillとTreisman,1995)。核因子κＢ(Ｎ
Ｆ-κＢ)は、そのような外部刺激が活性な転写因子に如
何に転換されるかの顕著な例である(Vermaら,1995)。Ｎ
Ｆ-κＢ系は、数多くの免疫及び炎症性応答遺伝子並び
に重要なウィルス遺伝子の発現を制御する関連転写因子
のＲｅｌファミリーのメンバーのホモ及びヘテロダイマ
ーからなる(LenardoとBaltimore, 1989; BaeuerleとHen
kel, 1994)。ＮＦ-κＢ転写因子の活性はその細胞下局
在化により調節される(Vermaら,1995)。大抵の細胞型に
おいて、ＮＦ-κＢは５０ｋＤａと６５ｋＤａのサブユ
ニットからなるヘテロダイマーとして存在する。このヘ
テロダイマーは抑制タンパク質のＩκＢファミリーのメ
ンバーであるＩκＢαと結合して細胞質に隔絶される(F
incoとBaldwin,1995； ThanosとManiatis, 1995; Verma
ら, 1995)。IκＢαはＮＦ-κＢの核局在化シグナルを
マスクし、それによってＮＦ-κＢの核トランスロケー
ションを防ぐ。核中に転位置し同族ＤＮＡ配列に結合す
る活性な転写因子へのＮＦ-κＢの転換には、２６ｓプ
ロテアソームでのＩκＢαのリン酸化と続くユビキチン
依存性分解が必要となる。ＩκＢαのシグナル誘導リン
酸化はセリン３２と３６で起こる。これらのセリンの一
方又は両方の突然変異により、ＩκＢαはユビキチン結
合とタンパク分解性分解に対して耐性にする(Chenら, 1
995)。

【０００３】多面的サイトカインである腫瘍壊死因子
(ＴＮＦ)及びインターロイキン-１(ＩＬ-１)はＩκＢリ
ン酸化と続くＮＦ-κＢ活性化の生理的誘導物質である
(Osbornら,1989；Begら,1993)。ＴＮＦ及びＩＬ-１は細
胞表面レセプターの異なるファミリーを介してＮＦ-κ
Ｂ活性化を導くシグナル伝達カスケードを開始させるが
(Smithら,1994；Dinarello,1996)、両方の経路は、シグ
ナルトランスデューサーとしてアダプタータンパク質の
ＴＮＦレセプター関連因子(ＴＲＡＦ)ファミリーのメン
バーを利用する(Rotheら,1995；Hsuら,1996；Caoら,199
6b)。ＴＲＡＦタンパク質は元来は、７５ｋＤａのＴＮ
Ｆレセプター(ＴＮＦＲ２)、ＣＤ４０、ＣＤ３０、及び
リンホトキシン-βレセプターを含むＴＮＦレセプター
ファミリーの幾つかのメンバーの細胞質ドメインに直接
随伴することが見出された(Rotheら,1994; Huら,1994；
Chengら, 1995; Mosialosら, 1995; SongとDonner, 19
95;Satoら,1995; Leeら, 1996; Gedrichら, 1996; Ansi
eauら, 1996)。また、ＴＲＡＦタンパク質はアダプター
タンパク質ＴＲＡＤＤにより５５ｋＤａのＴＮＦレセプ
ター(ＴＮＦＲ１)に間接的に補充される(Hsuら,1996)。
ＴＮＦよるＮＦ-κＢの活性化にはＴＲＡＦ２が必要と
なる(Rotheら,1995；Hsuら,1996)。ＴＲＡＦ５もまたＴ
ＮＦレセプターファミリーのメンバーによるＮＦ-κＢ
活性化に関係していた(Nakanoら,1996)。これに対し
て、ＴＲＡＦ６はＩＬ-１によりＮＦ-κＢ活性化に関与
する(Caoら,1996b)。ＩＬ-１処理の際、ＴＲＡＦ６は、
ＩＬ-１レセプター複合体に結合するセリン-スレオニン
キナーゼであるＩＲＡＫに付随する(Caoら,1996a)。

【０００４】ＮＦ-κＢ-誘導キナーゼ(ＮＩＫ)はＴＲＡ
Ｆ２-相互作用タンパク質として同定されたＭＡＰキナ
ーゼキナーゼキナーゼ(ＭＡＰ３Ｋ)ファミリーのメンバ
ーである(Malininら,1997)。ＮＩＫは過剰発現されたと
きＮＦ-κＢを活性化し、そのＴＲＡＦ２-相互作用Ｃ末
端ドメインを含む(ＮＩＫ_{(６２４-９４７)})又はそのキ
ナーゼドメインに２つの重要なリシン残基を欠く(ＮＩ
Ｋ_{(ＫＫ４２９-４３０} _ＡＡ))ＮＩＫのキナーゼ不活性突
然変異体が、ＴＮＦ-、ＩＬ-１-、及びＴＲＡＦ２-誘導
ＮＦ-κＢ活性化を抑制するドミナントネガティブ阻害
剤として挙動する(Malininら,1997)。最近、ＮＩＫは、
ＴＲＡＦ５及びＴＲＡＦ６を含むＴＲＡＦファミリーの
更なるメンバーと結合することが見出された。ＮＩＫの
触媒的に不活性な突然変異体もまたＴＲＡＦ５-及びＴ
ＲＡＦ６-誘発ＮＦ-κＢ活性化を抑制し、よってＴＲＡ
Ｆの下流のＴＮＦ及びＩＬ-１によりトリガーされるＮ
Ｆ-κＢシグナル伝達カスケードにおける共通のメディ
エータとしての統一概念をＮＩＫに提供する。

【０００５】ここで、我々は、ＮＩＫ-相互作用タンパ
ク質として新規なヒトキナーゼＩκＢキナーゼであるＩ
ＫＫ-αを開示する。ＩＫＫ-αは未知の機能のセリン-
スレオニンキナーゼをコードすると推論された過去に同
定されたオープンリーディングフレームの概念的翻訳物
(配列番号：５)と配列類似性を有する(「保存されたへ
リックス・ループ・へリックス遍在性キナーゼ(Conserv
ed Helix-loop-helixUbiquitous Kinase)」又はＣＨＵ
Ｋ, ConnellyとMarcu 1995; Mockら, 1995)。ＩＫＫ-α
の触媒的に不活性な突然変異体は、ＴＮＦ及びＩＬ-１
刺激により並びにＴＲＡＦ及びＮＩＫ過剰発現により誘
発されるＮＦ-κＢ活性化を抑制することが示され；一
過性に発現したＩＫＫ-αは内在性ＩκＢα複合体に随
伴することが示され；そしてＩＫＫ-αがＩκＢαをセ
リン３２及び３６上でリン酸化することが示される。

【０００６】（本発明の概要）本発明は、ＩＫＫ-αポ
リペプチド、関連する核酸、及びＩＫＫ-α-特異的構造
及び活性及びＩＫＫ-α機能、特にＩκＢキナーゼ活性
を有するそのポリペプチドドメインに関する方法及び組
成物を提供する。ＩＫＫ-αポリペプチドは、ＮＦκＢ
活性化を調節することができ、よって細胞機能の重要な
調節因子を提供する。該ポリペプチドは、主題のＩＫＫ
-αポリペプチドコード核酸由来の形質転換宿主細胞か
ら組換え的に産生されても哺乳動物細胞から精製されて
もよい。本発明は、開示されたＩＫＫ-α遺伝子と特異
的にハイブリダイズ可能な単離ＩＫＫ-αハイブリダイ
ゼーションプローブとプライマー、特異的抗体のような
ＩＫＫ-α-特異的結合薬剤、及び主題組成物を製造し、
診断法（例えば、ＩＫＫ-α転写物に対する遺伝子ハイ
ブリダイゼーションスクリーン）、治療法（例えばＴＮ
Ｆシグナル伝達を阻害するＩＫＫ-αキナーゼ阻害剤）
及び生物薬剤工業（例えば免疫原、他の転写調節因子を
単離するための試薬、薬理学的リード薬剤のために化学
ライブラリをスクリーニングするための試薬等々）に使
用する方法を提供する。

【０００７】（本発明の詳細な説明）ヒトＩＫＫ-αポ
リペプチドをコードしている天然ｃＤＮＡの核酸配列は
配列番号：３として示され、概念的全長翻訳物は配列番
号：４として示される。本発明のＩＫＫ-αポリペプチ
ドは配列番号：３の不完全翻訳物、特に配列番号：３の
残基１〜６３８を含み、その翻訳物及び配列番号：４の
欠失変異体はヒトＩＫＫ-α-特異的アミノ酸配列、結合
特異性又は機能を有し、Ｃｙｓ３０、Ｇｌｕ５４３、Ｌ
ｅｕ６０４、Ｔｈｒ６７９、Ｓｅｒ６８０、Ｐｒｏ６８
４、Ｔｈｒ６８６及びＳｅｒ６８７の少なくとも一つを
含む。好ましい翻訳物／欠失変異体は、配列番号：４の
６つの残基Ｃｙｓ３０、Ｇｌｕ５４３、Ｌｅｕ６０４、
Ｔｈｒ６７９、Ｓｅｒ６８０、Ｐｒｏ６８４、Ｔｈｒ６
８６又はＳｅｒ６８７含有ドメインを含み、該残基に直
ぐ隣り合う少なくとも８、より好ましくは少なくとも約
１２、最も好ましくは少なくとも２０の連続残基の配列
を含んでなるもので、該残基は、上記連続残基内に好ま
しくはあり(例えば表Ｉを参照されたい)；この変異体が
ｈＩＫＫ-α特異的エピトープ及び免疫原を提供する。

【０００８】

【表１】

【０００９】主題ドメインは、ＩＫＫ-αドメイン特異
的活性又は機能、例えばＩＫＫ-α-特異的キナーゼ又は
キナーゼ抑制活性、ＮＩＫ-結合又は結合抑制活性、Ｉ
κＢ-結合又は抑制活性、ＮＦκＢ活性化又は抑制活性
又は抗体結合性を提供する。好ましいドメインはＩκＢ
のセリン３２と３６の少なくとも一方、好ましくは両方
をリン酸化させる(Verma,I.M.ら(1995))。本明細書にお
いて、IκＢのセリン３２とセリン３６とは、コンセン
サス配列ＤＳＧＬ／ＩＸＳＭ／Ｌの一部である２つのセ
リン残基(例えばＩκＢαのｓｅｒ３２と３６、ＩκＢ
βのｓｅｒ１９と２３、及びメチオニンの使用に応じて
IκＢεのｓｅｒ１５７と１６１あるいは１８と２２)を
集合的に指す。

【００１０】ＩＫＫ-α-特異的活性又は機能は、簡便な
インビトロ、細胞ベース、又はインビボアッセイ：例え
ば動物でのインビトロ結合アッセイ、細胞培養アッセイ
（例えば遺伝子療法、遺伝子組換え等々）等々により決
定することができる。結合アッセイは、結合標的とのＩ
ＫＫ-αポリペプチドの分子相互作用が評価されるあら
ゆるアッセイを包含する。結合標的は、例えばＩＫＫ-
α基質のような天然の細胞内結合標的、ＩＫＫ-α調節
タンパク質あるいはＩＫＫ-α活性又はその局在化を直
接変調するその他の制御因子；あるいは抗体のような特
異的免疫タンパク質、又は以下に記載するようなスクリ
ーニングアッセイにおいて同定されるもののようなＩＫ
Ｋ-α特異的薬剤のような非天然結合標的でもよい。Ｉ
ＫＫ-α-結合特異性は、キナーゼ活性又は結合平衡定数
（通常少なくとも約１０^７Ｍ^−１、好ましくは少なくと
も約１０^８Ｍ^−１、より好ましくは少なくとも約１０^９
Ｍ⁻ ^１）により、ＩＫＫ-α-発現細胞におけるネガティ
ブ変異体として機能し、異種性宿主（例えばげっ歯類又
はウサギ）中でＩＫＫ-α特異的抗体を誘発する等々の
主題タンパク質の能力により、検定することができる。
とにかく、主題ＩＫＫ-αポリペプチドのＩＫＫ-α結合
特異性はCornellyとMarcu(1995)のマウス及びヒトＣＨ
ＵＫ配列並びにＩＫＫ-β(配列番号：２）を必ず区別す
る。

【００１１】本発明に係るＩＫＫ-αポリペプチドは単
離されるか純粋である：「単離」ポリペプチドは、天然
の状態では付随している物質の少なくとも幾らかを伴っ
ておらず、この量は、与えられた試料中の全ポリペプチ
ドの好ましくは少なくとも約０．５％，より好ましくは
少なくとも約５％を構成し、純粋なポリペプチドは与え
られた試料中の全ポリペプチドの少なくとも約９０％、
好ましくは少なくとも約９９％を構成する。特定の実施
態様では、ＩＫＫ-αポリペプチドは、ＩＫＫ-βから単
離され、及び／又はＩＫＫ複合体から単離されたＭＫＰ
-１沈降性複合体から単離される。ＩＫＫ-αポリペプチ
ドとポリペプチドドメインは合成されても、組換え技術
により産生されても、あるいは哺乳動物細胞、好ましく
はヒト細胞から精製されてもよい。非常に広範な分子及
び生化学的方法が主題組成物の生化学合成、分子発現及
び精製に利用でき、例えば、Molecular Cloning, A Lab
oratory Manual (分子クローニング、実験室マニュア
ル)（Sambrookら、コールド・スプリング・ハーバー・
ラボラトリー）、Current Protocols in MolecularBiol
ogy (分子生物学における現在のプロトコール)（Ausube
lら編、Greene Publ.Assoc., Wiley-Interscience, N
Y）あるいは当該分野でその他知られているものを参照
されたい。

【００１２】本発明は、ＩＫＫポリペプチド、好ましく
はＩＫＫ-αポリペプチドに特異的な結合薬剤で、基
質、アゴニスト、アンタゴニスト、天然細胞内結合標的
等々を含むもの、かかる薬剤を同定し調製する方法、及
び診断法、治療法及び製薬開発におけるその用途を提供
する。例えば、特異的結合薬剤は、様々な診断及び治療
用途、特に疾病又は疾病予後に例えばＮＦ-κＢ活性化
のような主題タンパク質を含む経路の不適切な利用に関
与する場合に有用である。新規なＩＫＫ特異的結合薬剤
には、ＩＫＫ特異的レセプター、例えば特異的抗体のよ
うな体細胞性組換えポリペプチドレセプター又はＴ細胞
抗原レセプター（例えばHarlowとLane（1988）Antibodi
es, A Laboratory Manual (抗体、実験室マニュアル)、
コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー）及び
例えば一重、二重及び三重ハイブリッドスクリーニング
のようなアッセイで同定されるその他の天然の結合薬
剤、以下に記載するような化学ライブラリのスクリーニ
ングで同定される非天然細胞内結合薬剤等々が包含され
る。特に興味深い薬剤はＩＫＫ機能、例えばＩＫＫ依存
性転写活性化を変調する。例えばＩＫＫＩκＢキナー
ゼ活性の広範な阻害剤を、ＩκＢを含むシグナル伝達を
調節するために使用しても良い。ＩＫＫＩκＢキナー
ゼ阻害剤の例には、セリン／スレオニンキナーゼ(例え
ばＰＫＣ)阻害剤の既知のクラス、例えばＡＴＰと基質
結合の競合阻害剤、抗生物質、ＩＫＫ誘導ペプチド阻害
剤等々が含まれる。表IIおよびIIIを参照されたい。Ｉ
ＫＫ特異性と活性は、プロテインキナーゼのパネルを使
用する高収量キナーゼアッセイにおいて即座に定量され
る(引用文献と実施例を参照されたい)。

【００１３】好適な阻害剤には、海生生物により生産さ
れたスタウロスポリン(Omura Sら,J Antibiot (Tokyo)
1995 Jul; 48(7):535-48)のような天然化合物、及びＥ
ＧＦレセプタープロテインキナーゼをまた強力に阻害す
るＰＤ１５３０３５のような合成化合物(Fry DWら Scie
nce 1994 Aug 19; 265(5157):1093-5)が含まれる。合成
プロテインキナーゼ阻害剤のチロホスチンファミリーの
メンバーもまた有用である；これらには純粋なＡＴＰコ
ンピティターである化合物、純粋な基質コンピティター
である化合物、及びＡＴＰと基質の両方と競合する混合
コンピティターである化合物が含まれる(Levitzki AとG
azit A, Science 1995 Mar 24; 267 (5205): 1782-8)。
更なるＩＫＫ阻害剤には、哺乳動物細胞により内在的に
生産されるペプチド系基質コンピティター、例えばＰＫ
Ｉ(プロテインキナーゼ阻害剤, Seasholtz AFら, Proc
Natl Acad Sci USA 1995 Feb 28;92(5):1734-8)、又は
ｃｄｃキナーゼを阻害するタンパク質(Correa-Bordes J
及びNurse P, Cell 1995 Dec 15; 83(6):1001-9)が含ま
れる。更なる小ペプチドベース基質競合性キナーゼ阻害
剤とアロステリック阻害剤(ＡＴＰ又は基質競合と独立
の抑制機構)は確立された方法(Hvalby Oら Proc Natl A
cad Sci USA 1994 May 24; 91(11):4761-5; Barja Pら,
Cell Immunol 1994 Jan; 153(1):28-38; Villar-Palas
i C, BiochimBiophys Acta 1994 Dec 30; 1224(3):384-
8; Liu WZら, Biochemistry 1994 Aug23; 33(33):10120
-6)により直ぐに産生される。

【００１４】

【表２】

【００１５】引用文献１．Hagiwara, M.ら Mol. Pharmacol. 32: 7 (1987) ２．Herbert, J.M.ら Biochem Biophys Res Com 172:99
3 (1990) ３．Schachtele,C.ら Biochem Biophys Res Com 151:55
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0)

【００１６】

【表３】

【００１７】従って、本発明は、例えばセリン／スレオ
ニンキナーゼ阻害剤に細胞を接触させることにより、Ｉ
ＫＫキナーゼ活性を変調する工程を含む細胞中にIκＢ
を含むシグナル伝達を変調する方法を提供する。細胞は
培養中かインサイツ、すなわち天然宿主内に常在してい
てもよい。好適な阻害剤は哺乳動物宿主において経口的
に活性である。診断用途に対しては、阻害剤又は他のＩ
ＫＫ結合剤は、例えば蛍光、放射性、化学発光、又は、
結合薬剤に直接抱合されるか結合薬剤に特異的なプロー
ブに抱合される他の容易に検出可能な分子でしばしば標
識される。

【００１８】開示したＩＫＫ-αポリペプチドのアミノ
酸配列は、選択された発現系に対して最適化されたＩＫ
Ｋ-αポリペプチドコード核酸を逆翻訳するために使用
されるか（Hollerら (1993) Gene 136,323-328; Martin
ら (1995) Gene 154,150-166）、天然のＩＫＫ-αコー
ド核酸配列の単離に使用される変性オリゴヌクレオチド
プライマー及びプローブを産生するために使用される
(「ＧＣＧ」ソフトウェア、ジェネティクス・コンピュ
ータ・グループ・インク、マディソンＷＩ)。ＩＫＫ-α
コード核酸配列は、ＩＫＫ-α発現ベクターに使用さ
れ、例えば発現及びスクリーニングのために組換え宿主
細胞に、例えばＩＫＫ-α変調細胞機能に関与する疾患
に対する候補薬の効能等の機能性研究等々のための遺伝
子組換え動物に導入される。

【００１９】本発明はまた、配列番号：３のストランド
の少なくとも１２、好ましくは少なくとも２４、より好
ましくは少なくとも３６、最も好ましくは少なくとも９
６の近接塩基、特に配列番号：２のヌクレオチド１−１
９１３のもの、好ましくは塩基１−９２、１８１１、１
８１２、１９９２、１９９５、２０３４、２０３５、２
０３９、２０４０、２０５５及び２０６０を含むＩＫＫ
-α ｃＤＮＡ特異的配列を有し、(配列番号：５)を含む
第３核酸の存在下で配列番号：３の相補ストランドを含
む第２核酸と特異的にハイブリダイズするのに充分な核
酸ハイブリダイゼーションプローブ及び複製／増幅プラ
イマーを提供する。特異的ハイブリダイゼーションを実
証するには一般にストリンジェントな条件、例えば４２
℃の温度で５ｘＳＳＰＥ（０．１８ＭＮａＣｌ、０．
０１ＭＮａＰＯ_４、ｐＨ７．７、０．００１ＭＥＤＴ
Ａ）バッファー中に３０％のホルムアミドを含むバッフ
ァー中でハイブリダイズし４２℃において０．２ｘＳＳ
ＰＥで洗浄を行ったとき結合したまま残る条件、好まし
くは４２℃の温度で５ｘＳＳＰＥ中に５０％のホルムア
ミドを含むバッファー中でハイブリダイズし４２℃にお
いて０．２ｘＳＳＰＥバッファーで洗浄を行ったとき結
合したまま残る条件が必要となる。ＩＫＫ-α核酸はま
た例えばＢＬＡＳＴＸ（Altschulら(1990) Basic Local
Alignment Search Tool, J Mol Biol 215, 403-410）
のような整合化アルゴリズムを使用して区別することも
できる。

【００２０】主題の核酸は、合成／非天然配列のもので
あり、及び／又は単離される、すなわちその天然の状態
で付随している物質の少なくとも幾らかを伴っておら
ず、この量は、好ましくは与えられた画分中に存在する
全核酸の少なくとも約０．５％，より好ましくは少なく
とも約５％を構成し、通常は、天然染色体上に結合して
いるもの以外のヌクレオチド（群）に結合した天然配列
又は非天然配列を含んでなることを意味する組換え体で
ある。配列番号３の核酸配列又はそのフラグメントを含
んでなる組換え核酸は、そのような配列又はフラグメン
トを、天然染色体上に結合しているもの以外の配列が直
ぐ隣に(すなわち、近接して)位置している末端か、天然
染色体上に結合しているもの以外の配列が直ぐに隣に位
置しているか末端にある１０ｋｂ、好ましくは２ｋｂよ
りも小さい負のフランキング領域が隣に位置している末
端に含んでいる。核酸は通常はＲＮＡもしくはＤＮＡで
あるが、他の塩基又はヌクレオチド類似体を含んでなる
核酸を使用して安定性を修正する等々もしばしば好適で
ある。

【００２１】主題の核酸には、翻訳可能な転写物、ハイ
ブリダイゼーションプローブ、ＰＣＲプライマー、診断
用核酸等々としての使用；ＩＫＫ-α遺伝子及び遺伝子
転写物の存在を検出し、更なるＩＫＫ-α相同体及び構
造類似体をコードする核酸を検出又は増幅するための使
用を含む広範な応用範囲が見出される。診断法では、Ｉ
ＫＫ-αハイブリダイゼーションプローブが、臨床及び
実験室試料中の野生型及び変異体IKK-α対立遺伝子を同
定する際に使用される。変異体対立遺伝子は、高処理臨
床診断に対する対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド
(ＡＳＯ)プローブを産生するために使用される。治療法
では、治療用ＩＫＫ-α核酸が活性なＩＫＫ-αの細胞発
現もしくは細胞内濃度又は利用能を変調するために使用
される。

【００２２】本発明はＩＫＫ変調性細胞機能のレベルで
活性な薬剤、化合物又は薬剤用のリード化合物を同定す
る効率的な方法を提供する。一般に、これらのスクリー
ニング法は、天然のＩＫＫ結合標的との相互作用を変調
する化合物、特にＩκＢ誘導基質、特にＩκＢ及びＮＩ
Ｋ基質とのＩＫＫリン酸化を変調する化合物に対するア
ッセイを含む。標識インビトロタンパク−タンパク結合
アッセイ、イムノアッセイ、細胞ベースアッセイ等々を
含む結合薬剤に対する広範なアッセイが提供される。該
方法は、リード化合物に対しての化学ライブラリの自動
でコスト性能の良い高処理スクリーニングに受け入れら
れる。同定された薬剤は動物及びヒト治験用に製薬工業
で使用される；例えば薬剤を誘導体化し、インビトロ及
びインビボアッセイで再スクリーニングして製薬開発の
ための活性を最適化し毒性を最小化することができる。

【００２３】インビトロ結合アッセイでは、他のペプチ
ド又はポリペプチド、例えば検出もしくは係留用のタグ
等との融合産物の一部であってもよいＩＫＫポリペプチ
ドを含む成分の混合物を使用する。アッセイ混合物は、
天然の細胞内ＩＫＫ結合標的を含む。特定の実施態様で
は、結合標的はＩκＢセリン３２及び／又は３６を含ん
でなる基質である。このような基質は、セリン３２及び
／又は３６残基と、少なくとも５、好ましくは少なくと
も１０、より好ましくは少なくとも２０の天然に生じる
直ぐ隣りに位置する残基（例えば、セリン３６ペプチド
に対して、ＩκＢα、βもしくはε由来基質に対してそ
れぞれ残基２６−４６、２２−４２、又は１２−３２も
しくは１５１−１７１の残基）を各側に含むＩκＢα、
βもしくはεペプチドを含んでなる。天然の全長結合標
的を使用することもできるが、その部分がアッセイにお
いて簡便に測定可能な主題ＩＫＫポリペプチドに対して
結合親和性とアビディティをもたらす限り、かかる部分
(例えばペプチド)を使用することがしばしば好ましい。
アッセイ混合物はまた候補薬理剤を含有する。候補薬剤
には、典型的には有機化合物であるが、数多くの化学ク
ラスが包含され、好ましくは小さな有機化合物が含ま
れ、合成又は天然化合物のライブラリを含む広範な供給
源から得られる。様々な他の試薬もまた混合物に含めて
も良い。これらには、(キナーゼアッセイに対する)ＡＴ
Ｐ又はＡＴＰ類似体、塩、バッファー、中性タンパク
質、例えばアルブミン、洗浄剤、プロテアーゼ阻害剤、
ヌクレアーゼ阻害剤、抗菌剤等々のような様々なその他
の試薬を含有する。

【００２４】得られた混合物は、候補の薬理剤が存在し
なかったらＩＫＫポリペプチドが細胞結合標的、部分又
は類似体に基準結合親和性をもって特異的に結合するよ
うな条件下でインキュベートされる。混合物成分を、要
求された結合をもたらす任意の順序で添加することがで
き、最適な結合を容易にする任意の温度でインキュベー
ションを実施することができる。インキュベート期間は
同様に最適結合となるように選択されるが、迅速な高処
理スクリーニングを容易にするように最小化される。

【００２５】インキュベート後、ＩＫＫポリペプチドと
一又は複数の結合標的の間の薬剤偏向結合が任意の簡便
な方法で検出される。ＩＫＫキナーゼ活性に対しては、
「結合」はＩＫＫ-α基質のリン酸化の変化により一般
に検出される。この実施態様では、キナーゼ活性は標識
リン酸塩の基質への移動により定量することができ、こ
こで、標識は、放射能、発光、光学もしくは電子密度等
々のような直接的検出をもたらすものでも、あるいはエ
ピトープタグ等々のような間接的検出をもたらすもので
もよい。標識と他のアッセイ成分、例えば光学又は電子
密度、放射線、非放射性エネルギー移動等々の性質に応
じて、様々な方法を使用して標識を検出することがで
き、あるいは抗体抱合体等々で間接的に検出される。

【００２６】薬剤の存在下での結合アフィニティーと比
較して薬剤の非存在下における標的に対するＩＫＫポリ
ペプチドの結合アフィニティーの差は、薬剤がＩＫＫ結
合標的に対するＩＫＫポリペプチドの結合を変調するこ
とを示している。同様に、以下に記載される細胞ベース
アッセイにおいても、薬剤の存在及び不存在下における
ＩＫＫ-α依存性転写活性化の差は、薬剤がＩＫＫ機能
を変調することを示している。本明細書において使用さ
れる差は、統計的に有意であり、好ましくは少なくとも
５０％、より好ましくは少なくとも９０％の差を表す。

【００２７】次の実験部分と実施例は例証のために提供
するもので限定をなすものではない。実験ＩＫＫ-αの同定ＮＩＫ媒介ＮＦ-κＢ活性化のメカニズムを調べるため
に、我々は、酵母二重ハイブリッドタンパク質相互作用
クローニングによりＮＩＫに直接結合するタンパク質を
同定した(FieldとSong, 1989)。酵母転写因子ＧＡＬ４
のＤＮＡ結合ドメインに融合したＮＩＫをコードする発
現ベクターを産生した。このベクターはヒトＢ細胞ｃＤ
ＮＡライブラリの二重ハイブリッドスクリーニングにお
いて餌として使用した。およそ６００万の形質転換体か
ら、ｈｉｓ及びｌａｃＺレポーター遺伝子の活性化によ
り測定して８つの陽性のクローンを得た。これらのクロ
ーンから、３つがＴＲＡＦファミリーのメンバーである
ＴＲＡＦ３をコード化し(Huら,1994； Chengら, 1995;
Mosialosら, 1995; Satoら, 1995)、一つがＩＫＫ-αと
我々が呼ぶ新規なタンパク質をコード化した。酵母細胞
への再形質転換によりＮＩＫとＩＫＫ-αの間の相互作
用が証明された。全長ヒトＩＫＫ-αクローンは、ＩＫ
Ｋ-αの二重ハイブリッドクローンの５’末端から産生
したプローブでジャーカットｃＤＮＡライブラリをスク
リーニングすることにより単離した。ＩＫＫ-αは、Ｎ
末端セリン-スレオニンキナーゼ触媒作用ドメイン、Ｃ
末端ヘリックス・ループ・ヘリックスドメイン及びヘリ
ックス・ループ・ヘリックスとキナーゼドメインの間に
並列したロイシンジッパー様両親媒性αヘリックスを含
む。

【００２８】ヒト細胞におけるＩＫＫ-αとＮＩＫの相
互作用ＩＫＫ-αのＮＩＫとの相互作用は、哺乳動物細胞免疫
共沈降アッセイにおいて確認された。Ｎ末端フラッグエ
ピトープタグを含むヒトＩＫＫ-αをＭｙｃエピトープ
タグＮＩＫ又はＨＡエピトープタグＴＲＡＦタンパク質
での２９３ヒト胚性腎臓細胞において一過性に同時発現
させた。細胞溶解物をフラッグエピトープに対するモノ
クローナル抗体を使用して免疫沈降させ、共沈するＮＩ
Ｋ又はＴＲＡＦタンパク質を抗Ｍｙｃ又は抗ＨＡモノク
ローナル抗体での免疫ブロット分析により検出した。こ
のアッセイにおいて、ＩＫＫ-αはＮＩＫを共沈させる
ことができ、酵母二重ハイブリッド分析によるＩＫＫ-
αについて検出した両タンパク質間の相互作用を確認す
る。また、殆どのＮ末端キナーゼドメイン(ＩＫＫ-α
_{(３０７-７４５)})を欠く欠失変異体ＩＫＫ-αタンパク
質はＮＩＫと結合することができ、ＩＫＫ-αのα-ヘリ
ックスＣ末端の半分がＮＩＫとの相互作用を媒介するこ
とを示している。ＮＩＫに対して、ＩＫＫ-αはＴＲＡ
Ｆ２又はＴＲＡＦ３の何れにも結合しなかった。しかし
ながら、ＮＩＫをＩＫＫ-αとＴＲＡＦ２と共に同時発
現させたとき、ＩＫＫ−αでのＴＲＡＦ２の強い共沈が
検出され、ＩＫＫ-α、ＮＩＫ及びＴＲＡＦ２の間の三
元複合体の形成を示している。

【００２９】ＮＦ-κＢ活性化に対するＩＫＫ-α及びＩ
ＫＫ-α変異体の影響ＮＦ-κＢ活性化におけるＩＫＫ-αの可能な役割を調べ
るために、我々は、ＩＫＫ-αの一過性過剰発現がＮＦ-
κＢ依存性レポーター遺伝子を活性化させるかどうかを
調べた。Ｅ-セレクチン-ルシフェラーゼレポーター作成
物(SchindlerとBaichwal, 1994)及びＩＫＫ-α発現ベク
ターをＨｅＬａ細胞中に同時形質移入した。ＩＫＫ-α
発現はレポーター遺伝子を用量依存的に活性化させ、ル
シフェラーゼ活性の最大の誘導はベクター対照と比較し
て約６ないし７倍であった。同様な結果は２９３細胞に
おいて得られ、そこではＩＫＫ-αの過剰発現がおよそ
４倍のレポーター遺伝子活性を誘導した。ＴＮＦ処理は
レポーター遺伝子アッセイにおいて過剰発現されたＩＫ
Ｋ-αの弱いＮＦ-κＢ誘導活性を刺激しなかった。従っ
て、ＩＫＫ-αは過剰発現したときＮＦ-κＢの活性化を
誘発する。

【００３０】我々は次に２９３細胞中のレポーター遺伝
子アッセイにおけるシグナル誘導ＮＦ-κＢ活性化の際
にＮＩＫになお随伴するキナーゼ不活性ＩＫＫ-α
_{(３０７-７} _４５)の過剰発現の影響を決定した。ＩＫＫ-
α_{(３０７-７４５)}の過剰発現はＮＩＫ_{(６２４-９４７)}
の過剰発現と同様なＴＮＦ-及びＩＬ-１-誘導レポータ
ー遺伝子活性化を阻止した。ＩＫＫ-α_{(３０７-７４５)}
はＴＲＡＦ２、ＴＲＡＦ６及びＮＩＫの過剰発現により
誘発されるＮＦ-κＢ依存性レポーター遺伝子活性を阻
害したことがまた見出された。これらの結果を併せる
と、触媒的に不活性なＩＫＫ-α突然変異体はＴＮＦ-、
ＩＬ-１、ＴＲＡＦ-及びＮＩＫ-誘発ＮＦ-κＢ活性化の
ドミナントネガティブな阻害剤である。これは、ＩＫＫ
-αがＮＩＫの下流のＴＮＦ及びＩＬ-１によるＮＦ-κ
Ｂ活性化の共通のメディエータとして機能することを示
している。

【００３１】括弧内の文献 Ansieau, S.ら (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 9
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t. 358,113-118。 Schindler, U.,とBaichwal, V.R. (1994) Mol. Cell. B
iol. 14,5820-5831。 Smith, C.A., Farrah, T., 及びGoodwin, R.G. (1994)
Cell 76,959-962。 Song, H.Y. とDonner, D.B. (1995) Biochem. J. 809,8
25-829。 Thanos, D., とManiatis, T. (1995) Cell 80, 529-53
2。 Verma, I.M.ら (1995) Genes Dev. 9, 2723-2735。

【００３２】実施例１．ＩＫＫ-α-ＩκＢαリン酸化アッセイに対するプ
ロトコールＡ．試薬： −ニュートラライトアビジン：ＰＢＳ中に２０μｇ／ｍ
ｌ。 −キナーゼ：ＰＢＳに２０μｇ／ｍｌで入れた１０^−８
−１０^−５ＭのＩＫＫ-α（配列番号：４）。 −基質：ＰＢＳに４０μｇ／ｍｌで入れた１０^−７−１
０^−４Ｍのビオチン化基質（ヒトＩκＢαの残基２６−
４６からなる２１残基ペプチド）。 −阻害バッファー：ＰＢＳ中に５％ＢＳＡ、０．５％ト
ウィーン２０；室温で１時間。 −アッセイバッファー：１００ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭ
のＭｇＣｌ_２、１ｍＭのＭｎＣｌ_２、２０ｍＭのＨＥＰ
ＥＳ、ｐＨ７．４、０．２５ｍＭのＥＤＴＡ、１％のグ
リセロール、０．５％のＮＰ-４０、５０ｍＭのＢＭ
Ｅ、１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ、プロテアーゼ阻害剤カクテ
ル。 −[^３２Ｐ]γ-ＡＴＰの１０ｘ保存液：１００μＣｉ[
^３２Ｐ]γ−ＡＴＰを伴う２ｘ１０^−５Ｍの非放射性Ａ
ＴＰ。スクリーニングの間、４℃のマイクロ冷蔵庫に配
置。 −プロテアーゼ阻害剤カクテル（１０００Ｘ）：１０ｍ
ｌのＰＢＳ中に１０ｍｇのトリプシン阻害剤（ＢＭＢ＃
１０９８９４）、１０ｍｇのアプロチニン（ＢＭＢ＃２
３６６２４）、２５ｍｇのベンズアミジン（シグマ＃Ｂ
−６５０６）、２５ｍｇのロイペプチン（ＢＭＢ＃１０
１７１２８）、１０ｍｇのＡＰＭＳＦ（ＢＭＢ＃９１７
５７５）、及び２ｍＭのＮａＶｏ_３（シグマ＃Ｓ-６５
０８）。

【００３３】Ｂ．アッセイプレートの調製： −４℃で一晩かけてウェル当り１２０μｌの保存Ｎアビ
ジンでコーティング。 −２００μｌのＰＢＳで２回洗浄。 −１５０μｌの阻害バッファーで阻害。 −２００μｌのＰＢＳで２回洗浄。

【００３４】Ｃ．アッセイ： −４０μｌのアッセイバッファー／ウェルを添加。 −４０μｌのビオチン化基質（アッセイバッファー中に
２−２００ｐｍｏｌ／４０ｕｌ）を添加。 −４０μｌのキナーゼ（アッセイバッファー中に０．１
−１０ｐｍｏｌ／４０ｕｌ）を添加。 −１０μｌの化合物又は抽出物を添加。 −１０μｌの[^３２Ｐ]γ−ＡＴＰの１０ｘ保存液を添
加。 −２５℃で１５分間振とう。 −２５℃で更に４５分間インキュベート。 −２００μｌのＰＢＳで４回洗浄することにより反応を
停止。 −１５０μｌのシンチレーションカクテルを添加。 −トップカウントをカウント。

【００３５】Ｄ．（各プレート上にある）全アッセイ
用の対照：ａ．非特異的結合ｂ．８０％阻害の非放射性ＡＴＰ。

【００３６】２．高収量ＩＫＫ-α-ＮＩＫ結合アッセ
イに対するプロトコールＡ．試薬： −ニュートラライトアビジン：ＰＢＳ中に２０μｇ／ｍ
ｌ。 −阻害バッファー：ＰＢＳ中に５％のＢＳＡ、０．５％
のトウィーン２０；室温で１時間。 −アッセイバッファー：１００ｍＭのＫＣｌ、２０ｍＭ
のＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．６、１ｍＭのＭｇＣｌ_２、１％
のグリセロール、０．５％のＮＰ-４０、５０ｍＭのβ-
メルカプトエタノール、１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ、プロテ
アーゼ阻害剤のカクテル。 −^３２ＰＩＫＫ-αポリペプチドの１０ｘストック：２
００,０００−２５０,０００ｃｐｍの標識ＩＫＫ-α
（ベックマンカウンター）が補填された１０ ^−８−１０
^−６Ｍの「非放射性」ＩＫＫ-α。スクリーニングの
間、４℃のマイクロ冷蔵庫に配置。 −プロテアーゼ阻害剤カクテル（１０００Ｘ）：１０ｍ
ｌのＰＢＳ中に１０ｍｇのトリプシン阻害剤（ＢＭＢ＃
１０９８９４）、１０ｍｇのアプロチニン（ＢＭＢ＃２
３６６２４）、２５ｍｇのベンズアミジン（シグマ＃Ｂ
−６５０６）、２５ｍｇのロイペプチン（ＢＭＢ＃１０
１７１２８）、１０ｍｇのＡＰＭＳＦ（ＢＭＢ＃９１７
５７５）、及び２ｍＭのＮａＶｏ_３（シグマ＃Ｓ−６５
０８）。 −ＮＩＫ：ＰＢＳ中の１０^−７−１０^−５Ｍのビオチン
化ＮＩＫ

【００３７】Ｂ．アッセイプレートの調製： −４℃で一晩かけてウェル当り１２０μｌの保存Ｎ-ア
ビジンでコーティング。 −２００μｌのＰＢＳで２回洗浄。 −１５０μｌの阻害バッファーで阻害。 −２００μｌのＰＢＳで２回洗浄。

【００３８】Ｃ．アッセイ： −４０μｌのアッセイバッファー／ウェルを添加。 −１０μｌの化合物又は抽出物を添加。 −１０μｌの^３３Ｐ−ＩＫＫ-α（２０−２５,０００ｃ
ｐｍ／０．１−１０ｐｍｏｌ／ウェル＝１０^−９−１０
^−７Ｍ最終濃度）を添加。 −２５℃で１５分間振とう。 −２５℃で更に４５分間インキュベート。 −４０μＭのビオチン化ＮＩＫ（アッセイバッファー中
に０．１−１０ｐｍｏｌ／４０ｕｌ）を添加。 −室温で１時間インキュベート。 −２００μＭのＰＢＳで４回洗浄することにより反応を
停止。 −１５０μＭのシンチレーションカクテルを添加。 −トップカウントをカウント。

【００３９】Ｄ．（各プレート上にある）全アッセイ
用の対照：ａ．非特異的結合ｂ．８０％阻害の可溶性（非ビオチン化ＮＩＫ）。

【００４０】本明細書において引用した刊行物と特許出
願の全てを、あたかもそれぞれ個々の刊行物又は特許出
願が出典明示により特に個々に取り込まれることが示さ
れているように、出典明示によりここに取り込む。前記
の発明を理解を容易にするために例証と実施例によりあ
る程度詳細に記載したが、この発明の教示に照らせば、
添付の請求の範囲の精神又は範囲から逸脱しないで、あ
る変更と修正を行ってもよいことは当業者であれば容易
に分かるであろう。

【００４１】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> TURALIC INC. <120> IKK-a Proteins, Nucleic Acids and Methods <130> JP3804SCI <150> US 08/887,115 US 08/890,854 <151> 1997-07-01 1997-07-10 <160> 5 <210> SEQ ID NO: 1 <211> 2268 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> atgagctggt caccttccct gacaacgcag acatgtgggg cctgggaaat gaaagagcgc 60 cttgggacag ggggatttgg aaatgtcatc cgatggcaca atcaggaaac aggtgagcag 120 attgccatca agcagtgccg gcaggagctc agcccccgga accgagagcg gtggtgcctg 180 gagatccaga tcatgagaag gctgacccac cccaatgtgg tggctgcccg agatgtccct 240 gaggggatgc agaacttggc gcccaatgac ctgcccctgc tggccatgga gtactgccaa 300 ggaggagatc tccggaagta cctgaaccag tttgagaact gctgtggtct gcgggaaggt 360 gccatcctca ccttgctgag tgacattgcc tctgcgctta gataccttca tgaaaacaga 420 atcatccatc gggatctaaa gccagaaaac atcgtcctgc agcaaggaga acagaggtta 480 atacacaaaa ttattgacct aggatatgcc aaggagctgg atcagggcag tctttgcaca 540 tcattcgtgg ggaccctgca gtacctggcc ccagagctac tggagcagca gaagtacaca 600 gtgaccgtcg actactggag cttcggcacc ctggcctttg agtgcatcac gggcttccgg 660 cccttcctcc ccaactggca gcccgtgcag tggcattcaa aagtgcggca gaagagtgag 720 gtggacattg ttgttagcga agacttgaat ggaacggtga agttttcaag ctctttaccc 780 taccccaata atcttaacag tgtcctggct gagcgactgg agaagtggct gcaactgatg 840 ctgatgtggc acccccgaca gaggggcacg gatcccacgt atgggcccaa tggctgcttc 900 aaggccctgg atgacatctt aaacttaaag ctggttcata tcttgaacat ggtcacgggc 960 accatccaca cctaccctgt gacagaggat gagagtctgc agagcttgaa ggccagaatc 1020 caacaggaca cgggcatccc agaggaggac caggagctgc tgcaggaagc gggcctggcg 1080 ttgatccccg ataagcctgc cactcagtgt atttcagacg gcaagttaaa tgagggccac 1140 acattggaca tggatcttgt ttttctcttt gacaacagta aaatcaccta tgagactcag 1200 atctccccac ggccccaacc tgaaagtgtc agctgtatcc ttcaagagcc caagaggaat 1260 ctcgccttct tccagctgag gaaggtgtgg ggccaggtct ggcacagcat ccagaccctg 1320 aaggaagatt gcaaccggct gcagcaggga cagcgagccg ccatgatgaa tctcctccga 1380 aacaacagct gcctctccaa aatgaagaat tccatggctt ccatgtctca gcagctcaag 1440 gccaagttgg atttcttcaa aaccagcatc cagattgacc tggagaagta cagcgagcaa 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Ser Leu Thr Thr Gln Thr Cys Gly Ala Trp Glu 1 5 10 15 Met Lys Glu Arg Leu Gly Thr Gly Gly Phe Gly Asn Val Ile Arg Trp 20 25 30 His Asn Gln Glu Thr Gly Glu Gln Ile Ala Ile Lys Gln Cys Arg Gln 35 40 45 Glu Leu Ser Pro Arg Asn Arg Glu Arg Trp Cys Leu Glu Ile Gln Ile 50 55 60 Met Arg Arg Leu Thr His Pro Asn Val Val Ala Ala Arg Asp Val Pro 65 70 75 80 Glu Gly Met Gln Asn Leu Ala Pro Asn Asp Leu Pro Leu Leu Ala Met 85 90 95 Glu Tyr Cys Gln Gly Gly Asp Leu Arg Lys Tyr Leu Asn Gln Phe Glu 100 105 110 Asn Cys Cys Gly Leu Arg Glu Gly Ala Ile Leu Thr Leu Leu Ser Asp 115 120 125 Ile Ala Ser Ala Leu Arg Tyr Leu His Glu Asn Arg Ile Ile His Arg 130 135 140 Asp Leu Lys Pro Glu Asn Ile Val Leu Gln Gln Gly Glu Gln Arg Leu 145 150 155 160 Ile His Lys Ile Ile Asp Leu Gly Tyr Ala Lys Glu Leu Asp Gln Gly 165 170 175 Ser Leu Cys Thr Ser Phe Val Gly Thr Leu Gln Tyr Leu Ala Pro Glu 180 185 190 Leu Leu Glu Gln Gln Lys Tyr Thr Val Thr Val Asp Tyr Trp Ser Phe 195 200 205 Gly Thr Leu Ala Phe Glu Cys Ile Thr Gly Phe Arg Pro Phe Leu Pro 210 215 220 Asn Trp Gln Pro Val Gln Trp His Ser Lys Val Arg Gln Lys Ser Glu 225 230 235 240 Val Asp Ile Val Val Ser Glu Asp Leu Asn Gly Thr Val Lys Phe Ser 245 250 255 Ser Ser Leu Pro Tyr Pro Asn Asn Leu Asn Ser Val Leu Ala Glu Arg 260 265 270 Leu Glu Lys Trp Leu Gln Leu Met Leu Met Trp His Pro Arg Gln Arg 275 280 285 Gly Thr Asp Pro Thr Tyr Gly Pro Asn Gly Cys Phe Lys Ala Leu Asp 290 295 300 Asp Ile Leu Asn Leu Lys Leu Val His Ile Leu Asn Met Val Thr Gly 305 310 315 320 Thr Ile His Thr Tyr Pro Val Thr Glu Asp Glu Ser Leu Gln Ser Leu 325 330 335 Lys Ala Arg Ile Gln Gln Asp Thr Gly Ile Pro Glu Glu Asp Gln Glu 340 345 350 Leu Leu Gln Glu Ala Gly Leu Ala Leu Ile Pro Asp Lys Pro Ala Thr 355 360 365 Gln Cys Ile Ser Asp Gly Lys Leu Asn Glu Gly His Thr Leu Asp Met 370 375 380 Asp Leu Val Phe Leu Phe Asp Asn Ser Lys Ile Thr Tyr Glu Thr Gln 385 390 395 400 Ile Ser Pro Arg Pro Gln Pro Glu Ser Val Ser Cys Ile Leu Gln Glu 405 410 415 Pro Lys Arg Asn Leu Ala Phe Phe Gln Leu Arg Lys Val Trp Gly Gln 420 425 430 Val Trp His Ser Ile Gln Thr Leu Lys Glu Asp Cys Asn Arg Leu Gln 435 440 445 Gln Gly Gln Arg Ala Ala Met Met Asn Leu Leu Arg Asn Asn Ser Cys 450 455 460 Leu Ser Lys Met Lys Asn Ser Met Ala Ser Met Ser Gln Gln Leu Lys 465 470 475 480 Ala Lys Leu Asp Phe Phe Lys Thr Ser Ile Gln Ile Asp Leu Glu Lys 485 490 495 Tyr Ser Glu Gln Thr Glu Phe Gly Ile Thr Ser Asp Lys Leu Leu Leu 500 505 510 Ala Trp Arg Glu Met Glu Gln Ala Val Glu Leu Cys Gly Arg Glu Asn 515 520 525 Glu Val Lys Leu Leu Val Glu Arg Met Met Ala Leu Gln Thr Asp Ile 530 535 540 Val Asp Leu Gln Arg Ser Pro Met Gly Arg Lys Gln Gly Gly Thr Leu 545 550 555 560 Asp Asp Leu Glu Glu Gln Ala Arg Glu Leu Tyr Arg Arg Leu Arg Glu 565 570 575 Lys Pro Arg Asp Gln Arg Thr Glu Gly Asp Ser Gln Glu Met Val Arg 580 585 590 Leu Leu Leu Gln Ala Ile Gln Ser Phe Glu Lys Lys Val Arg Val Ile 595 600 605 Tyr Thr Gln Leu Ser Lys Thr Val Val Cys Lys Gln Lys Ala Leu Glu 610 615 620 Leu Leu Pro Lys Val Glu Glu Val Val Ser Leu Met Asn Glu Asp Glu 625 630 635 640 Lys Thr Val Val Arg Leu Gln Glu Lys Arg Gln Lys Glu Leu Trp Asn 645 650 655 Leu Leu Lys Ile Ala Cys Ser Lys Val Arg Gly Pro Val Ser Gly Ser 660 665 670 Pro Asp Ser Met Asn Ala Ser Arg Leu Ser Gln Pro Gly Gln Leu Met 675 680 685 Ser Gln Pro Ser Thr Ala Ser Asn Ser Leu Pro Glu Pro Ala Lys Lys 690 695 700 Ser Glu Glu Leu Val Ala Glu Ala His Asn Leu Cys Thr Leu Leu Glu 705 710 715 720 Asn Ala Ile Gln Asp Thr Val Arg Glu Gln Asp Gln Ser Phe Thr Ala 725 730 735 Leu Asp Trp Ser Trp Leu Gln Thr Glu Glu Glu Glu His Ser Cys Leu 740 745 750 Glu Gln Ala Ser 755 <210> SEQ ID NO: 3 <211> 2238 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> atggagcggc ccccggggct gcggccgggc gcgggcgggc cctgggagat gcgggagcgg 60 ctgggcaccg gcggcttcgg gaacgtctgt ctgtaccagc atcgggaact tgatctcaaa 120 atagcaatta agtcttgtcg cctagagcta agtaccaaaa acagagaacg atggtgccat 180 gaaatccaga ttatgaagaa gttgaaccat gccaatgttg taaaggcctg tgatgttcct 240 gaagaattga atattttgat tcatgatgtg cctcttctag caatggaata ctgttctgga 300 ggagatctcc gaaagctgct caacaaacca gaaaattgtt gtggacttaa agaaagccag 360 atactttctt tactaagtga tatagggtct gggattcgat atttgcatga aaacaaaatt 420 atacatcgag atctaaaacc tgaaaacata gttcttcagg atgttggtgg aaagataata 480 cataaaataa ttgatctggg atatgccaaa gatgttgatc aaggaagtct gtgtacatct 540 tttgtgggaa cactgcagta tctggcccca gagctctttg agaataagcc ttacacagcc 600 actgttgatt attggagctt tgggaccatg gtatttgaat gtattgctgg atataggcct 660 tttttgcatc atctgcagcc atttacctgg catgagaaga ttaagaagaa ggatccaaag 720 tgtatatttg catgtgaaga gatgtcagga gaagttcggt ttagtagcca tttacctcaa 780 ccaaatagcc tttgtagttt aatagtagaa cccatggaaa actggctaca gttgatgttg 840 aattgggacc ctcagcagag aggaggacct gttgacctta ctttgaagca gccaagatgt 900 tttgtattaa tggatcacat tttgaatttg aagatagtac acatcctaaa tatgacttct 960 gcaaagataa tttcttttct gttaccacct gatgaaagtc ttcattcact acagtctcgt 1020 attgagcgtg aaactggaat aaatactggt tctcaagaac ttctttcaga gacaggaatt 1080 tctctggatc ctcggaaacc agcctctcaa tgtgttctag atggagttag aggctgtgat 1140 agctatatgg tttatttgtt tgataaaagt aaaactgtat atgaagggcc atttgcttcc 1200 agaagtttat ctgattgtgt aaattatatt gtacaggaca gcaaaataca gcttccaatt 1260 atacagctgc gtaaagtgtg ggctgaagca gtgcactatg tgtctggact aaaagaagac 1320 tatagcaggc tctttcaggg acaaagggca gcaatgttaa gtcttcttag atataatgct 1380 aacttaacaa aaatgaagaa cactttgatc tcagcatcac aacaactgaa agctaaattg 1440 gagttttttc acaaaagcat tcagcttgac ttggagagat acagcgagca gatgacgtat 1500 gggatatctt cagaaaaaat gctaaaagca tggaaagaaa tggaagaaaa ggccatccac 1560 tatgctgagg ttggtgtcat tggatacctg gaggatcaga ttatgtcttt gcatgctgaa 1620 atcatggagc tacagaagag cccctatgga agacgtcagg gagacttgat ggaatctctg 1680 gaacagcgtg ccattgatct atataagcag ttaaaacaca gaccttcaga tcactcctac 1740 agtgacagca cagagatggt gaaaatcatt gtgcacactg tgcagagtca ggaccgtgtg 1800 ctcaaggagc tgtttggtca tttgagcaag ttgttgggct gtaagcagaa gattattgat 1860 ctactcccta aggtggaagt ggccctcagt aatatcaaag aagctgacaa tactgtcatg 1920 ttcatgcagg gaaaaaggca gaaagaaata tggcatctcc ttaaaattgc ctgtacacag 1980 agttctgccc ggtcccttgt aggatccagt ctagaaggtg cagtaacccc tcagacatca 2040 gcatggctgc ccccgacttc agcagaacat gatcattctc tgtcatgtgt ggtaactcct 2100 caagatgggg agacttcagc acaaatgata gaagaaaatt tgaactgcct tggccattta 2160 agcactatta ttcatgaggc aaatgaggaa cagggcaata gtatgatgaa tcttgattgg 2220 agttggttaa cagaatga 2238 <210> SEQ ID NO: 4 <211> 745 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> Met Glu Arg Pro Pro Gly Leu Arg Pro Gly Ala Gly Gly Pro Trp Glu 1 5 10 15 Met Arg Glu Arg Leu Gly Thr Gly Gly Phe Gly Asn Val Cys Leu Tyr 20 25 30 Gln His Arg Glu Leu Asp Leu Lys Ile Ala Ile Lys Ser Cys Arg Leu 35 40 45 Glu Leu Ser Thr Lys Asn Arg Glu Arg Trp Cys His Glu Ile Gln Ile 50 55 60 Met Lys Lys Leu Asn His Ala Asn Val Val Lys Ala Cys Asp Val Pro 65 70 75 80 Glu Glu Leu Asn Ile Leu Ile His Asp Val Pro Leu Leu Ala Met Glu 85 90 95 Tyr Cys Ser Gly Gly Asp Leu Arg Lys Leu Leu Asn Lys Pro Glu Asn 100 105 110 Cys Cys Gly Leu Lys Glu Ser Gln Ile Leu Ser Leu Leu Ser Asp Ile 115 120 125 Gly Ser Gly Ile Arg Tyr Leu His Glu Asn Lys Ile Ile His Arg Asp 130 135 140 Leu Lys Pro Glu Asn Ile Val Leu Gln Asp Val Gly Gly Lys Ile Ile 145 150 155 160 His Lys Ile Ile Asp Leu Gly Tyr Ala Lys Asp Val Asp Gln Gly Ser 165 170 175 Leu Cys Thr Ser Phe Val Gly Thr Leu Gln Tyr Leu Ala Pro Glu Leu 180 185 190 Phe Glu Asn Lys Pro Tyr Thr Ala Thr Val Asp Tyr Trp Ser Phe Gly 195 200 205 Thr Met Val Phe Glu Cys Ile Ala Gly Tyr Arg Pro Phe Leu His His 210 215 220 Leu Gln Pro Phe Thr Trp His Glu Lys Ile Lys Lys Lys Asp Pro Lys 225 230 235 240 Cys Ile Phe Ala Cys Glu Glu Met Ser Gly Glu Val Arg Phe Ser Ser 245 250 255 His Leu Pro Gln Pro Asn Ser Leu Cys Ser Leu Ile Val Glu Pro Met 260 265 270 Glu Asn Trp Leu Gln Leu Met Leu Asn Trp Asp Pro Gln Gln Arg Gly 275 280 285 Gly Pro Val Asp Leu Thr Leu Lys Gln Pro Arg Cys Phe Val Leu Met 290 295 300 Asp His Ile Leu Asn Leu Lys Ile Val His Ile Leu Asn Met Thr Ser 305 310 315 320 Ala Lys Ile Ile Ser Phe Leu Leu Pro Pro Asp Glu Ser Leu His Ser 325 330 335 Leu Gln Ser Arg Ile Glu Arg Glu Thr Gly Ile Asn Thr Gly Ser Gln 340 345 350 Glu Leu Leu Ser Glu Thr Gly Ile Ser Leu Asp Pro Arg Lys Pro Ala 355 360 365 Ser Gln Cys Val Leu Asp Gly Val Arg Gly Cys Asp Ser Tyr Met Val 370 375 380 Tyr Leu Phe Asp Lys Ser Lys Thr Val Tyr Glu Gly Pro Phe Ala Ser 385 390 395 400 Arg Ser Leu Ser Asp Cys Val Asn Tyr Ile Val Gln Asp Ser Lys Ile 405 410 415 Gln Leu Pro Ile Ile Gln Leu Arg Lys Val Trp Ala Glu Ala Val His 420 425 430 Tyr Val Ser Gly Leu Lys Glu Asp Tyr Ser Arg Leu Phe Gln Gly Gln 435 440 445 Arg Ala Ala Met Leu Ser Leu Leu Arg Tyr Asn Ala Asn Leu Thr Lys 450 455 460 Met Lys Asn Thr Leu Ile Ser Ala Ser Gln Gln Leu Lys Ala Lys Leu 465 470 475 480 Glu Phe Phe His Lys Ser Ile Gln Leu Asp Leu Glu Arg Tyr Ser Glu 485 490 495 Gln Met Thr Tyr Gly Ile Ser Ser Glu Lys Met Leu Lys Ala Trp Lys 500 505 510 Glu Met Glu Glu Lys Ala Ile His Tyr Ala Glu Val Gly Val Ile Gly 515 520 525 Tyr Leu Glu Asp Gln Ile Met Ser Leu His Ala Glu Ile Met Glu Leu 530 535 540 Gln Lys Ser Pro Tyr Gly Arg Arg Gln Gly Asp Leu Met Glu Ser Leu 545 550 555 560 Glu Gln Arg Ala Ile Asp Leu Tyr Lys Gln Leu Lys His Arg Pro Ser 565 570 575 Asp His Ser Tyr Ser Asp Ser Thr Glu Met Val Lys Ile Ile Val His 580 585 590 Thr Val Gln Ser Gln Asp Arg Val Leu Lys Glu Leu Phe Gly His Leu 595 600 605 Ser Lys Leu Leu Gly Cys Lys Gln Lys Ile Ile Asp Leu Leu Pro Lys 610 615 620 Val Glu Val Ala Leu Ser Asn Ile Lys Glu Ala Asp Asn Thr Val Met 625 630 635 640 Phe Met Gln Gly Lys Arg Gln Lys Glu Ile Trp His Leu Leu Lys Ile 645 650 655 Ala Cys Thr Gln Ser Ser Ala Arg Ser Leu Val Gly Ser Ser Leu Glu 660 665 670 Gly Ala Val Thr Pro Gln Thr Ser Ala Trp Leu Pro Pro Thr Ser Ala 675 680 685 Glu His Asp His Ser Leu Ser Cys Val Val Thr Pro Gln Asp Gly Glu 690 695 700 Thr Ser Ala Gln Met Ile Glu Glu Asn Leu Asn Cys Leu Gly His Leu 705 710 715 720 Ser Thr Ile Ile His Glu Ala Asn Glu Glu Gln Gly Asn Ser Met Met 725 730 735 Asn Leu Asp Trp Ser Trp Leu Thr Glu 740 745 <210> SEQ ID NO: 5 <211> 2146 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> gtaccagcat cgggaacttg atctcaaaat agcaattaag tcttgtcgcc tagagctaag 60 taccaaaaac agagaacgat ggtgccatga aatccagatt atgaagaagt tgaaccatgc 120 caatgttgta aaggcctgtg atgttcctga agaattgaat attttgattc atgatgtgcc 180 tcttctagca atggaatact gttctggagg agatctccga aagctgctca acaaaccaga 240 aaattgttgt ggacttaaag aaagccagat actttcttta ctaagtgata tagggtctgg 300 gattcgatat ttgcatgaaa acaaaattat acatcgagat ctaaaacctg aaaacatagt 360 tcttcaggat gttggtggaa agataataca taaaataatt gatctgggat atgccaaaga 420 tgttgatcaa ggaagtctgt gtacatcttt tgtgggaaca ctgcagtatc tggccccaga 480 gctctttgag aataagcctt acacagccac tgttgattat tggagctttg ggaccatggt 540 atttgaatgt attgctggat ataggccttt tttgcatcat ctgcagccat ttacctggca 600 tgagaagatt aagaagaagg atccaaagtg tatatttgca tgtgaagaga tgtcaggaga 660 agttcggttt agtagccatt tacctcaacc aaatagcctt tgtagtttaa tagtagaacc 720 catggaaaac tggctacagt tgatgttgaa ttgggaccct cagcagagag gaggacctgt 780 tgaccttact ttgaagcagc caagatgttt tgtattaatg gatcacattt tgaatttgaa 840 gatagtacac atcctaaata tgacttctgc aaagataatt tcttttctgt taccacctga 900 tgaaagtctt cattcactac agtctcgtat tgagcgtgaa actggaataa atactggttc 960 tcaagaactt ctttcagaga caggaatttc tctggatcct cggaaaccag cctctcaatg 1020 tgttctagat ggagttagag gctgtgatag ctatatggtt tatttgtttg ataaaagtaa 1080 aactgtatat gaagggccat ttgcttccag aagtttatct gattgtgtaa attatattgt 1140 acaggacagc aaaatacagc ttccaattat acagctgcgt aaagtgtggg ctgaagcagt 1200 gcactatgtg tctggactaa aagaagacta tagcaggctc tttcagggac aaagggcagc 1260 aatgttaagt cttcttagat ataatgctaa cttaacaaaa atgaagaaca ctttgatctc 1320 agcatcacaa caactgaaag ctaaattgga gttttttcac aaaagcattc agcttgactt 1380 ggagagatac agcgagcaga tgacgtatgg gatatcttca gaaaaaatgc taaaagcatg 1440 gaaagaaatg gaagaaaagg ccatccacta tgctgaggtt ggtgtcattg gatacctgga 1500 ggatcagatt atgtctttgc atgctgaaat catggagcta cagaagagcc cctatggaag 1560 acgtcaggga gacttgatgg aatctctgga acagcgtgcc attgatctat ataagcagtt 1620 aaaacacaga ccttcagatc actcctacag tgacagcaca gagatggtga aaatcattgt 1680 gcacactgtg cagagtcagg accgtgtgct caaggagcgt tttggtcatt tgagcaagtt 1740 gttgggctgt aagcagaaga ttattgatct actccctaag gtggaagtgg ccctcagtaa 1800 tatcaaagaa gctgacaata ctgtcatgtt catgcaggga aaaaggcaga aagaaatatg 1860 gcatctcctt aaaattgcct gtacacagag ttctgcccgc tctcttgtag gatccagtct 1920 agaaggtgca gtaacccctc aagcatacgc atggctggcc cccgacttag cagaacatga 1980 tcattctctg tcatgtgtgg taactcctca agatggggag acttcagcac aaatgataga 2040 agaaaatttg aactgccttg gccatttaag cactattatt catgaggcaa atgaggaaca 2100 gggcaatagt atgatgaatc ttgattggag ttggttaaca gaatga 2146

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｎ 9/12 ４Ｃ０８４ 1/21 Ｃ１２Ｑ 1/02 5/10 1/48 Ｚ 9/12 Ｇ０１Ｎ 33/15 ＺＣ１２Ｑ 1/02 33/50 Ｚ 1/48 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡＧ０１Ｎ 33/15 5/00 Ａ 33/50 Ａ６１Ｋ 37/02 (72)発明者カオ，ジャオダンアメリカ合衆国カリフォルニア 94080, サウスサンフランシスコ，コーポレイトドライブ２，トゥラリックインコーポレイテッド内 (72)発明者レニエ，キャサリンアメリカ合衆国カリフォルニア 94080, サウスサンフランシスコ，コーポレイトドライブ２，トゥラリックインコーポレイテッド内Ｆターム(参考） 2G045 AA40 BB03 BB20 CB01 CB21 DA12 DA13 DA14 DA20 DA36 FB01 FB02 FB03 4B024 AA01 AA11 BA10 CA04 4B050 CC01 CC03 DD11 LL01 LL03 4B063 QA18 QQ08 QQ27 QQ95 QR07 QR77 4B065 AB01 BA01 CA29 CA44 CA46 4C084 AA02 AA07 BA01 BA08 BA22 BA23 CA18 NA14 ZB262 ZC202

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】配列番号：４のＣｙｓ３０、Ｌｅｕ６０
４、Ｔｈｒ６７９、Ｓｅｒ６８０、Ｐｒｏ６８４、Ｔｈ
ｒ６８６及びＳｅｒ６７８の少なくとも一つを含む１０
残基ドメインを含んでなる単離ＩＫＫ-αポリペプチ
ド。
【請求項２】キナーゼ又はキナーゼ抑制活性、ＮＩＫ
結合又は結合抑制活性、ＩκＢ結合又は結合抑制活性及
びＮＦκＢ活性化又は抑制活性の少なくとも一つから選
択される活性を有する請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】配列番号：３の少なくとも２４の近接塩
基を含み、塩基１−９２、１８１１、１８１２、１９９
２、１９９５、２０３４、２０３５、２０３９、２０４
０、２０５０、２０５５及び２０６０の少なくとも一つ
を含み、配列番号：５の塩基配列を含む第３の核酸の存
在下で配列番号：３の相補的ストランドを含んでなる第
２の核酸に特異的にハイブリダイズする単離された又は
組換え体の核酸。
【請求項４】請求項１に記載のポリペプチドをコード
する組換え核酸。
【請求項５】請求項４に記載の核酸を含んでなる細
胞。
【請求項６】請求項１に記載のＩＫＫ-αポリペプチ
ドの調製方法において、請求項４に記載の核酸を宿主細
胞又は細胞抽出物中に導入し、上記核酸が転写物として
発現し、該転写物が上記ポリペプチドを含んでなる翻訳
産物として発現される条件下で上記宿主細胞又は抽出物
をインキュベートし、上記翻訳産物を単離する工程を含
んでなる方法。
【請求項７】ＩＫＫ-αポリペプチドの結合標的に対
する相互作用を変調する薬剤のスクリーニング方法にお
いて、請求項１に記載の単離ポリペプチド、上記ポリペプチド
の結合標的、及び候補薬剤を含む混合物を、該薬剤が存
在しなかったら上記ポリペプチドが基準親和性をもって
上記結合標的に特異的に結合する条件下でインキュベー
トし、上記結合標的に対する上記ポリペプチドの結合親和性を
検出して薬剤偏向親和性を決定する工程を含んでなり、薬剤偏向親和性と基準親和性の間の差が、上記結合標的
に対する上記ポリペプチドの結合を上記薬剤が変調する
ことを示す方法。
【請求項８】上記結合標的が天然の細胞内基質であ
り、上記基準及び薬剤偏向結合親和性が上記基質のリン
酸化として検出される請求項７に記載の方法。
【請求項９】結合標的に対するＩＫＫ-αポリペプチ
ドの相互作用を変調する薬剤をスクリーニングする方法
において、請求項１に記載の単離ポリペプチド又はＩκＢキナーゼ
活性を保持するその欠失突然変異体、Ｓｅｒ３２とＳｅ
ｒ３６の少なくとも一つを含む天然のＩκＢの６つの残
基を少なくとも含んでなるＩκＢポリペプチド、及び候
補薬剤を含む混合物を、該薬剤が存在しなかったら該ポ
リペプチドが基準親和性をもって上記ＩκＢポリペプチ
ドを上記Ｓｅｒ３２とＳｅｒ３６の少なくとも一つで特
異的にリン酸化する条件下でインキュベートし、上記Ｓｅｒ３２とＳｅｒ３６の少なくとも一つでの上記
ＩκＢポリペプチドのポリペプチド誘発リン酸化を検出
して薬剤偏向活性を決定する工程を含んでなり、薬剤偏向活性と基準活性の間の差が、上記薬剤がＩκＢ
ポリペプチドを特異的にリン酸化する上記ポリペプチド
の能力を変調することを示す方法。
【請求項１０】細胞中においてＩκＢを含むシグナル
伝達を変調する方法において、ＩＫＫ-α(配列番号：
４)キナーゼ活性を変調する工程を含んでなる方法。
【請求項１１】上記変調工程が、細胞をセリン／スレ
オニンキナーゼ阻害剤に接触させることを含んでなる請
求項１０に記載の方法。