JP2013155180A - ＡｃｔＲＩＩＢから誘導されたバリアントおよびその使用 - Google Patents

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Abstract

【課題】ＴＧＦ−βシグナル伝達の強力なレギュレーターとして機能する作用薬を提供する。
【解決手段】ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド、特にＡｃｔＲＩＩＢバリアント。ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを、種々の傷害または容態、特に筋肉および神経筋の障害、脂肪組織障害、代謝障害、神経変性障害、ならびに高齢に関連する筋肉の消耗、前立腺癌療法、ならびに癌悪液質の治療のために使用することができる。かかるＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを含む、薬学的調製物。ＡｃｔＲＩＩＢタンパク質および／またはＡｃｔＲＩＩＢリガンドの活性を調整する化合物をスクリーニングする方法。
【選択図】図１

Description

関連出願への相互参照
この出願は、２００７年２月２日に出願された米国仮出願第６０／８９９，３０４号、２００７年５月１日に出願された米国仮出願第６０／９２７，０８８号および２００７年５月２５日に出願された米国仮出願第６０／９３１，８８０号の利益を主張する。上記で言及された出願の全ての教示は、参考として本明細書に援用される。
発明の背景
トランスフォーミング成長因子−β（ＴＧＦ−β）スーパーファミリーは、共通の配列要素および構造モチーフを有する種々の成長因子を含む。これらのタンパク質は、脊椎動物および無脊椎動物において多種多様な細胞型に生物学的影響を及ぼすことが公知である。スーパーファミリーのメンバーは、パターン形成および組織特異化における胚発生中で重要な機能を果たし、種々の分化過程（脂質生成、筋形成、軟骨形成、心臓発生、血液生成、神経発生、および上皮細胞分化が含まれる）に影響を及ぼし得る。このファミリーは２つの一般的な種類（ＢＭＰ／ＧＤＦ類およびＴＧＦ−β／アクチビン／ＢＭＰ１０類）に分類され、このメンバーは、多様で、しばしば、補完性の効果がある。ＴＧＦ−βファミリーメンバーの活性の操作により、しばしば、生物において有意に生理学的変化を起こすことが可能である。例えば、ピエモンテ牛およびビルギアンブルー牛は、筋肉量が顕著に増加するＧＤＦ８（ミオスタチンとも呼ばれる）遺伝子の機能喪失型変異を有する。非特許文献１。さらに、ヒトでは、ＧＤＦ８の不活性対立遺伝子は、筋肉量の増加、報告によれば、異常な強さに関連する。非特許文献２。
Ｇｒｏｂｅｔら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１９９７、１７（１）：７１−４ Ｓｃｈｕｅｌｋｅら、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ２００４、３５０：２６８２−８
筋肉、骨、軟骨、および他の組織を、適切なＴＧＦ−βファミリーメンバーによって媒介されるシグナル伝達の刺激または拮抗によって変化させることができる。したがって、ＴＧＦ−βシグナル伝達の強力なレギュレーターとして機能する作用薬が必要である。
発明の要旨
ある態様では、本開示は、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド、特に、ＡｃｔＲＩＩＢバリアント（アミノ末端およびカルボキシ末端の短縮および配列の変化を含む）を提供する。かかるＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを、種々の傷害または容態、特に筋肉および神経筋の障害（例えば、筋ジストロフィ、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、および筋萎縮）、脂肪組織障害（例えば、肥満）、代謝障害（例えば、２型糖尿病）、神経変性障害、ならびに高齢に関連する筋肉の消耗（サルコペニア）、前立腺癌療法、ならびに癌悪液質の治療のために使用することができる。特定の実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド（例えば、可溶性ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド）は、ＡｃｔＲＩＩＢ活性に関連する任意の過程でＡｃｔＲＩＩＢ受容体を拮抗することができる。任意選択的に、本発明のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを、ＡｃｔＲＩＩＢ受容体の１つまたは複数のリガンド（ＧＤＦ８（ミオスタチンとも呼ばれる）、ＧＤＦ１１、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢ、Ｎｏｄａｌ、およびＢＭＰ７（ＯＰ−１とも呼ばれる）など）を優先的に拮抗するようにデザインすることができる。したがって、さらなる障害の治療で有用であり得る。ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの例には、天然に存在するＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドおよびその機能的バリアントが含まれる。開示はまた、ＧＤＦ１１への結合を保持しながらアクチビン親和性を著しく減少させたＡｃｔＲＩＩＢ由来のバリアント組を提供する。これらのバリアントは、他の組織に及ぼす影響を減少させながら筋肉に望ましい影響を及ぼす。
ある態様では、本開示は、ＧＤＦ８、ＧＤＦ１１、アクチビン、ＢＭＰ７、またはＮｏｄａｌなどのＡｃｔＲＩＩＢリガンドに結合する可溶性ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドおよび薬学的に許容可能なキャリアを含む薬学的調製物を提供する。任意選択的に、可溶性ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、１０マイクロモル未満または１マイクロモル未満、１００ナノモル、１０ナノモル、または１ナノモルのＫｄでＡｃｔＲＩＩＢリガンドに結合する。任意選択的に、可溶性ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、ＡｃｔＲＩＩＢシグナル伝達（ＡｃｔＲＩＩＢリガンドによって誘発される細胞内シグナル伝達事象など）を阻害する。かかる調製物で用いる可溶性ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、本明細暑中に開示のいずれか（配列番号１、２、５、６、および１２から選択されるアミノ酸配列または配列番号１、２、５、６、および１２から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、または９９％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドなど）であり得る。可溶性ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドには、天然のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの機能的フラグメント（配列番号１、２、５、６、および１２から選択される配列の少なくとも１０、２０、または３０個のアミノ酸またはＣ末端の１、２、３、４、５、もしくは１０〜１５個のアミノ酸を欠き、且つＮ末端の１、２、３、４、もしくは５個のアミノ酸を欠く配列番号１の配列を含むものなど）が含まれ得る。好ましいポリペプチドは、配列番号１と比較して、Ｎ末端に２個と５個との間のアミノ酸およびＣ末端に３個以下のアミノ酸が短縮しているであろう。別の好ましいポリペプチドは、配列番号１２として示すポリペプチドである。可溶性ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、天然に存在するＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドと比較して、アミノ酸配列中（例えば、リガンド結合ドメイン中）に１つまたは複数の変化を含むことができる。アミノ酸配列の変化により、例えば、哺乳動物細胞、昆虫細胞、または他の真核生物細胞中で産生した場合にポリペプチドのグリコシル化を変化することができるか、天然に存在するＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドと比較してポリペプチドのタンパク質切断を変えることができる。可溶性ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、１つのドメインとしてＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド（例えば、ＡｃｔＲＩＩＢのリガンド結合ドメインまたはそのバリアント）および望ましい性質（改善された薬物動態学、より容易な精製、特定組織へのターゲティングなど）をもたらす１つまたは複数のさらなるドメインを有する融合タンパク質であり得る。例えば、融合タンパク質のドメインは、１つまたは複数のｉｎ ｖｉｖｏ安定性、ｉｎ ｖｉｖｏ半減期、取り込み／投与、組織の局在化または分布、タンパク質複合体の形成、融合タンパク質の多量体化、および／または精製を増強することができる。可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ融合タンパク質は、免疫グロブリンＦｃドメイン（野生型または変異体）または血清アルブミンを含むことができる。ある実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合物は、Ｆｃドメインと細胞外ＡｃｔＲＩＩＢドメインとの間に存在する相対的に構造化されていないリンカーを含む。この非構造化リンカーは、ＡｃｔＲＩＩＢの細胞外ドメインのＣ末端（「テール」）のおよそ１５個のアミノ酸非構造化領域に応答することができるか、相対的に二次構造を含まない５と１５、２０、３０、５０、またはそれを超えるアミノ酸との間の人工的配列であり得る。リンカーは、グリシン残基およびプロリン残基が豊富であり得、例えば、トレオニン／セリンおよびグリシンの反復配列（例えば、ＴＧ４またはＳＧ４反復）を含むことができる。融合タンパク質は、精製サブシーケンス（エピトープタグ、ＦＬＡＧタグ、ポリヒスチジン配列、およびＧＳＴ融合物など）を含むことができる。任意選択的に、可溶性ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、グリコシル化アミノ酸、ＰＥＧ化アミノ酸、ファルネシル化アミノ酸、アセチル化アミノ酸、ビオチン化アミノ酸、脂質部分に抱合したアミノ酸、および有機誘導体化剤に抱合したアミノ酸から選択される１つまたは複数の修飾アミノ酸残基を含む。薬学的調製物はまた、ＡｃｔＲＩＩＢ関連障害を治療するために使用される化合物などの１つまたは複数のさらなる化合物を含むことができる。好ましくは、薬学的調製物は、実質的に発熱物質を含まない。一般に、ＡｃｔＲＩＩＢタンパク質を、ＡｃｔＲＩＩＢタンパク質の適切に天然のグリコシル化を媒介する哺乳動物細胞株中で発現させて、患者の好ましくない免疫応答の可能性を減少させることが好ましい。ヒト細胞株およびＣＨＯ細胞株が首尾よく使用されており、他の一般的な哺乳動物発現ベクターが有用であると予想される。
ある態様では、ヒト組織の成長の促進またはヒト組織喪失の減少もしくは防止で用いる本明細書中に記載され、ラベリングされた薬学的調製物を含むパッケージ化された医薬品を提供する。組織の例には、骨、軟骨、筋肉、脂肪、および神経組織が含まれる。
ある態様では、本開示は、変化したリガンド結合（例えば、ＧＤＦ８結合）ドメインを含む可溶性ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを提供する。かかるＡｃｔＲＩＩＢ受容体の変化したリガンド結合ドメインは、アミノ酸残基に１つまたは複数の変異（ヒトＡｃｔＲＩＩＢのＥ３７、Ｅ３９、Ｒ４０、Ｋ５５、Ｒ５６、Ｙ６０、Ａ６４、Ｋ７４、Ｗ７８、Ｌ７９、Ｄ８０、Ｆ８２、およびＦ１０１など）（ナンバリングは配列番号２に対する）を含む。任意選択的に、変化したリガンド結合ドメインは、ＡｃｔＲＩＩＢ受容体の野生型リガンド結合ドメインと比較してＧＤＦ８／ＧＤＦ１１などのリガンドに対する選択性を増加させることができた。例証するために、これらの変異によって、アクチビンを超えるＧＤＦ１１（したがって、おそらくＧＤＦ８）の変化したリガンド結合ドメインの選択性を増加させることを本明細書中に証明する（ＡｃｔＲＩＩＢに関して示す）：Ｋ７４Ｙ、Ｋ７４Ｆ、Ｋ７４Ｉ、およびＤ８０Ｉ。以下の変異は逆効果であり、ＧＤＦ１１に対するアクチビンの結合比が増加する：Ｄ５４Ａ、Ｋ５５Ａ、Ｌ７９Ａ、およびＦ８２Ａ。全ての（ＧＤＦ１１およびアクチビン）結合活性を、「テール」領域（おそらく、非構造化リンカー領域）の包含によって増加させることができ、Ｋ７４Ａ変異の使用によっても増加させることができる。リガンド結合親和性を全体的に減少させる他の変異には、以下が含まれる：Ｒ４０Ａ、Ｅ３７Ａ、Ｒ５６Ａ、Ｗ７８Ａ、Ｄ８０Ｋ、Ｄ８０Ｒ、Ｄ８０Ａ、Ｄ８０Ｇ、Ｄ８０Ｆ、Ｄ８０Ｍ、およびＤ８０Ｎ。変異を組み合わせて、所望の効果を達成することができる。例えば、ＧＤＦ１１：アクチビン結合比に影響を及ぼす多数の変異は、リガンド結合に全体として負の影響を及ぼし、したがって、これらを、一般にリガンド結合を増加させる変異と組み合わせてリガンド選択性を有する改良された結合タンパク質を産生することができる。
任意選択的に、変化したリガンド結合ドメインは、野生型リガンド結合ドメインの比と比較して少なくとも２、５、１０、またはさらに１００倍のアクチビン結合のＫｄのＧＤＦ８結合のＫｄに対する比を有する。任意選択的に、変化したリガンド結合ドメインは、野生型リガンド結合ドメインと比較して少なくとも２、５、１０、またはさらに１００倍のアクチビン阻害についてのＩＣ５０のＧＤＦ８／ＧＤＦ１１阻害についてのＩＣ５０に対する比を有する。任意選択的に、変化したリガンド結合ドメインは、アクチビン阻害についてのＩＣ５０の少なくとも１／２、１／５、１／１０、またはさらに１／１００のＩＣ５０でＧＤＦ８／ＧＤＦ１１を阻害する。これらの可溶性ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、免疫グロブリンＦｃドメイン（野生型または変異体のいずれか）を含む融合タンパク質であり得る。ある場合において、本可溶性ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、ＧＤＦ８／ＧＤＦ１１のアンタゴニスト（インヒビター）である。
ＡｃｔＲＩＩＢの他のバリアント（以下など）を意図する。ＡｃｔＲＩＩＢ由来の部分が配列番号２のアミノ酸２１〜２９のいずれかから始まり（任意選択的に、配列番号２の２２〜２５から始まり）、配列番号２のアミノ酸１０９〜１３４のいずれかで終了する配列に対応し、ＡｃｔＲＩＩＢ融合タンパク質が細胞ベースのアッセイにおいてアクチビン、ミオスタチン、および／またはＧＤＦ１１によるシグナル伝達を阻害する、配列番号２のＡｃｔＲＩＩＢ配列由来の部分および第２のポリペプチド部分を含むバリアントＡｃｔＲＩＩＢ融合タンパク質。ＡｃｔＲＩＩＢ由来の部分が、配列番号２のアミノ酸２０〜２９のいずれかから始まり（任意選択的に、配列番号２の２２〜２５から始まり）、配列番号２のアミノ酸１０９〜１３３のいずれかで終了する配列に対応する、上記のバリアントＡｃｔＲＩＩＢ融合タンパク質。ＡｃｔＲＩＩＢ由来の部分が、配列番号２のアミノ酸２０〜２４のいずれかから始まり（任意選択的に、配列番号２の２２〜２５から始まり）、配列番号２のアミノ酸１０９〜１３３のいずれかで終了する配列に対応する、上記バリアントＡｃｔＲＩＩＢ融合タンパク質。ＡｃｔＲＩＩＢ由来の部分が、配列番号２のアミノ酸２１〜２４のいずれかから始まり、配列番号２のアミノ酸１０９〜１３４のいずれかで終了する配列に対応する、上記バリアントＡｃｔＲＩＩＢ融合タンパク質。ＡｃｔＲＩＩＢ由来の部分が、配列番号２のアミノ酸２０〜２４のいずれかから始まり、配列番号２のアミノ酸１１８〜１３３のいずれかで終了する配列に対応する、上記バリアントＡｃｔＲＩＩＢ融合タンパク質。ＡｃｔＲＩＩＢ由来の部分が、配列番号２のアミノ酸２１〜２４のいずれかから始まり、配列番号２のアミノ酸１１８〜１３４のいずれかで終了する配列に対応する、上記バリアントＡｃｔＲＩＩＢ融合タンパク質。ＡｃｔＲＩＩＢ由来の部分が、配列番号２のアミノ酸２０〜２４のいずれかから始まり、配列番号２のアミノ酸１２８〜１３３のいずれかで終了する配列に対応する、上記バリアントＡｃｔＲＩＩＢ融合タンパク質。ＡｃｔＲＩＩＢ由来の部分が、配列番号２のアミノ酸２０〜２４のいずれかから始まり、配列番号２のアミノ酸１２８〜１３３のいずれかで終了する配列に対応する、上記バリアントＡｃｔＲＩＩＢ融合タンパク質。ＡｃｔＲＩＩＢ由来の部分が、配列番号２のアミノ酸２１〜２９のいずれかから始まり、配列番号２のアミノ酸１１８〜１３４のいずれかで終了する配列に対応する、上記バリアントＡｃｔＲＩＩＢ融合タンパク質。ＡｃｔＲＩＩＢ由来の部分が、配列番号２のアミノ酸２０〜２９のいずれかから始まり、配列番号４のアミノ酸１１８〜１３３のいずれかで終了する配列に対応する、上記バリアントＡｃｔＲＩＩＢ融合タンパク質。ＡｃｔＲＩＩＢ由来の部分が、配列番号２のアミノ酸２１〜２９のいずれかから始まり、配列番号２のアミノ酸１２８〜１３４のいずれかで終了する配列に対応する、上記バリアントＡｃｔＲＩＩＢ融合タンパク質。ＡｃｔＲＩＩＢ由来の部分が、配列番号２のアミノ酸２０〜２９のいずれかから始まり、配列番号２のアミノ酸１２８〜１３３のいずれかで終了する配列に対応する、上記バリアントＡｃｔＲＩＩＢ融合タンパク質。驚いたことに、配列番号２の２２〜２５から始まる構築物の活性レベルが、ヒトＡｃｔＲＩＩＢの全細胞外ドメインを有するタンパク質より高い。上記バリアントＡｃｔＲＩＩＢ融合タンパク質のいずれかを、ホモ二量体として産生することができる。上記ＡｃｔＲＩＩＢ融合タンパク質のいずれかは、ＩｇＧ重鎖由来の定常領域（Ｆｃドメインなど）を含む異種部分を有することができる。
他のバリアントＡｃｔＲＩＩＢタンパク質（以下など）を意図する。配列番号２のアミノ酸２９〜１０９の配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含むバリアントＡｃｔＲＩＩＢタンパク質であって、配列番号２の６４に対応する位置がＲまたはＫであり、バリアントＡｃｔＲＩＩＢタンパク質が細胞ベースのアッセイにおいてアクチビン、ミオスタチン、および／またはＧＤＦ１１によるシグナル伝達を阻害する、バリアントＡｃｔＲＩＩＢタンパク質。配列番号２に関する少なくとも１つの変化がリガンド結合ポケットの外側に位置する、上記バリアントＡｃｔＲＩＩＢタンパク質。配列番号２に関する少なくとも１つの変化がリガンド結合ポケット内に位置する保存的変化である、上記バリアントＡｃｔＲＩＩＢタンパク質。上記配列番号２に関する少なくとも１つの変化がＫ７４、Ｒ４０、Ｑ５３、Ｋ５５、Ｆ８２、およびＬ７９からなる群から選択される１つまたは複数の位置での変化である、上記バリアントＡｃｔＲＩＩＢタンパク質。タンパク質がＡｃｔＲＩＩＢの内因性Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔ配列以外の位置およびリガンド結合ポケットの外側の位置に少なくとも１つのＮ−Ｘ−Ｓ／Ｔ配列を含む、上記バリアントＡｃｔＲＩＩＢタンパク質。
他のバリアントＡｃｔＲＩＩＢタンパク質（以下など）を意図する。タンパク質が、ＡｃｔＲＩＩＢの内因性Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔ配列以外の位置およびリガンド結合ポケットの外側の位置に少なくとも１つのＮ−Ｘ−Ｓ／Ｔ配列を含む、配列番号２のアミノ酸２９〜１０９の配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含むＡｃｔＲＩＩＢタンパク質。タンパク質が、配列番号２の２４位に対応する位置にＮを含み、配列番号２の２６位に対応する位置にＳまたはＴを含み、バリアントＡｃｔＲＩＩＢタンパク質が細胞ベースのアッセイにおいてアクチビン、ミオスタチン、および／またはＧＤＦ１１によるシグナル伝達を阻害する、上記バリアントＡｃｔＲＩＩＢタンパク質。タンパク質が、配列番号２の６４位に対応する位置にＲまたはＫを含む、上記バリアントＡｃｔＲＩＩＢタンパク質。配列番号２に関する少なくとも１つの変化がリガンド結合ポケット内に位置する保存的変化である、上記バリアントＡｃｔＲＩＩＢタンパク質。配列番号２に関する少なくとも１つの変化がＫ７４、Ｒ４０、Ｑ５３、Ｋ５５、Ｆ８２、およびＬ７９からなる群から選択される１つまたは複数の位置での変化である、上記バリアントＡｃｔＲＩＩＢタンパク質。タンパク質が異種部分をさらに含む融合タンパク質である、上記バリアントＡｃｔＲＩＩＢタンパク質。上記バリアントＡｃｔＲＩＩＢ融合タンパク質のいずれかを、ホモ二量体として産生することができる。上記ＡｃｔＲＩＩＢ融合タンパク質のいずれかは、ＩｇＧ重鎖由来の定常領域（Ｆｃドメインなど）を含む異種部分を有することができる。
ある態様では、本開示は、完全なＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドをコードしない可溶性ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドをコードする核酸を提供する。単離ポリヌクレオチドは、可溶性ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドのコード配列（上記のものなど）を含むことができる。例えば、単離核酸は、膜貫通ドメインまたは細胞質ドメイン内に存在するか、細胞外ドメインと膜貫通ドメインまたは細胞質ドメインとの間に存在する終止コドンを別にすれば、ＡｃｔＲＩＩＢの細胞外ドメイン（例えば、リガンド結合ドメイン）をコードする配列およびＡｃｔＲＩＩＢの膜貫通ドメインの一部もしくは全部および／またはＡｃｔＲＩＩＢ の細胞質ドメインをコードするであろう配列を含むことができる。例えば、単離ポリヌクレオチドは、全長ＡｃｔＲＩＩＢポリヌクレオチド配列（配列番号４など）または部分短縮バージョンを含むことができ、この単離ポリヌクレオチドは、３’末端から少なくとも６００ヌクレオチド前に転写終結コドンをさらに含むか、そうでなければ、任意選択的に全長ＡｃｔＲＩＩＢの短縮部分に融合した細胞外ドメインに対してポリヌクレオチドの翻訳が起こるように存在する。本明細書中に開示の核酸を、発現用プロモーターに作動可能に連結することができ、本開示は、かかる組換えポリヌクレオチドで形質転換した細胞を提供する。好ましくは、細胞は、ＣＨＯ細胞などの哺乳動物細胞である。
ある態様では、本開示は、可溶性ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの作製方法を提供する。かかる方法は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞などの適切な細胞中での本明細書中に開示の任意の核酸（例えば、配列番号３）の発現を含むことができる。かかる方法は、ａ）可溶性ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド発現に適切な条件下で細胞を培養する工程であって、細胞が可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ発現構築物で形質転換される、工程；およびｂ）このようにして発現した可溶性ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを回収する工程を含むことができる。可溶性ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを、細胞培養物からタンパク質を得るための任意の周知の方法を使用して、粗画分、部分精製画分、または高度に精製された画分として回収することができる。
ある態様では、本明細書中に開示の可溶性ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを、筋肉の喪失または不十分な筋肉成長に関連する障害を有する被験体の治療方法で使用することができる。かかる障害には、筋萎縮、筋ジストロフィ、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、および筋消耗障害（例えば、悪液質、食欲不振、ＤＭＤ症候群、ＢＭＤ症候群、ＡＩＤＳ消耗症候群、筋ジストロフィ、神経筋疾患、運動ニューロン疾患、神経筋接合部疾患、および炎症性筋障害）が含まれる。本方法は、有効量の可溶性ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを必要とする被験体に投与する工程を含むことができる。
ある態様では、本明細書中に開示の可溶性ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを、体脂肪含有量を減少するか体脂肪含有量の増加速度を低下する方法、ならびに望ましくない体重増加に関連する障害（肥満、非インスリン依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）、心血管疾患、癌、高血圧症、変形性関節症、卒中、呼吸困難、および胆嚢疾患など）を治療するための方法で使用することができる。これらの方法は、有効量の可溶性ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを必要とする被験体に投与する工程を含むことができる。
ある種の特定の態様では、本明細書中に開示の可溶性ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを、ＧＤＦ８の異常な活性に関連する障害の治療方法で使用することができる。かかる障害には、代謝障害（２型糖尿病、耐糖能異常、代謝症候群（例えば、Ｘ症候群）、および（例えば、熱傷または窒素不均衡）によって誘導されるインスリン抵抗性など）；脂肪組織障害（例えば、肥満）；筋ジストロフィ（ディシュンヌ型筋ジストロフィが含まれる）；筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）；筋萎縮；臓器萎縮症；脆弱；手根管症候群；鬱血性閉塞性肺疾患；サルコペニア、悪液質、および他の筋消耗症候群；骨粗鬆症；糖質コルチコイド誘導性骨粗鬆症；骨減少症；変形性関節症；骨粗鬆症関連骨折；慢性糖質コルチコイド療法に起因する骨量低下、早発性性腺機能不全、アンドロゲン抑制、ビタミンＤ欠乏症、続発性副甲状腺機能亢進症、栄養失調、ならびに神経性食欲不振が含まれる。本方法は、有効量の可溶性ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを必要とする被験体に投与する工程を含むことができる。
ある態様では、本開示は、骨、軟骨、筋肉、および脂肪などの組織の成長を刺激する薬剤の同定方法を提供する。本方法は、ａ）可溶性ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドと競合してＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドのリガンド結合ドメインに結合する試験薬を同定する工程、およびｂ）組織成長に及ぼす薬剤の影響を評価する工程を含む。
ある態様では、開示は、細胞中のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドまたはＡｃｔＲＩＩＢリガンド（例えば、ＧＤＦ８、ＧＤＦ１１、アクチビン、ＢＭＰ７、およびＮｏｄａｌ）の活性を拮抗する方法を提供する。本方法は、細胞を可溶性ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドと接触させる工程を含む。任意選択的に、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドまたはＡｃｔＲＩＩＢリガンドの活性を、ＡｃｔＲＩＩＢ／ＡｃｔＲＩＩＢリガンド複合体によって媒介されるシグナル伝達によってモニタリングする（例えば、細胞増殖のモニタリングによる）。本方法の細胞には、骨芽細胞、軟骨細胞、筋細胞、脂肪細胞、および筋肉細胞が含まれる。
ある態様では、本開示は、本明細書中に記載の障害または容態の治療薬の作製のための可溶性ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの使用を提供する。
本発明はまた、以下に記載の項目を提供する。
（項目１）
配列番号２のアミノ酸２９〜１０９の配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含むバリアントＡｃｔＲＩＩＢタンパク質であって、該タンパク質が、ＡｃｔＲＩＩＢの内因性Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔ配列以外の位置およびリガンド結合ポケットの外側の位置に少なくとも１つのＮ−Ｘ−Ｓ／Ｔ配列を含む、バリアントＡｃｔＲＩＩＢタンパク質。
（項目２）
上記タンパク質が、配列番号２の２４位に対応する位置にＮを含み、配列番号２の２６位に対応する位置にＳまたはＴを含み、上記バリアントＡｃｔＲＩＩＢタンパク質が、細胞ベースのアッセイにおいてアクチビン、ミオスタチン、および／またはＧＤＦ１１によるシグナル伝達を阻害する、項目１に記載のバリアントＡｃｔＲＩＩＢタンパク質。
（項目３）
上記タンパク質が、配列番号２の６４位に対応する位置にＲまたはＫを含む、項目２に記載のバリアントＡｃｔＲＩＩＢタンパク質。
（項目４）
上記配列番号２の配列に関する少なくとも１つの変化が、リガンド結合ポケット内に位置する保存的変化である、項目２に記載のバリアントＡｃｔＲＩＩＢタンパク質。
（項目５）
上記配列番号２の配列に関する少なくとも１つの変化が、Ｋ７４、Ｒ４０、Ｑ５３、Ｋ５５、Ｆ８２、およびＬ７９からなる群から選択される１つまたは複数の位置での変化である、項目２に記載のバリアントＡｃｔＲＩＩＢタンパク質。
（項目６）
上記タンパク質が、配列番号２のアミノ酸２２〜２４のいずれかに対応するアミノ酸から始まり、配列番号２のアミノ酸１３３または１３４のいずれかに対応するアミノ酸で終了するアミノ酸配列を含む、項目２に記載のバリアントＡｃｔＲＩＩＢタンパク質。
（項目７）
上記タンパク質が異種部分をさらに含む融合タンパク質である、項目１〜項目６のいずれか１項に記載のバリアントＡｃｔＲＩＩＢタンパク質。
（項目８）
上記タンパク質がホモ二量体である、項目７に記載のバリアントＡｃｔＲＩＩＢ融合タンパク質。
（項目９）
上記異種部分がＩｇＧ重鎖由来の定常領域を含む、項目７に記載のＡｃｔＲＩＩＢ融合タンパク質のバリアント。
（項目１０）
配列番号２のアミノ酸２９〜１０９の配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含むバリアントＡｃｔＲＩＩＢタンパク質であって、上記タンパク質が配列番号２の７９位に対応する位置に酸性アミノ酸を含み、上記バリアントＡｃｔＲＩＩＢタンパク質が細胞ベースのアッセイにおいてミオスタチンおよび／またはＧＤＦ１１によるシグナル伝達を阻害する、バリアントＡｃｔＲＩＩＢタンパク質。
（項目１１）
上記タンパク質が、ＡｃｔＲＩＩＢの内因性Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔ配列以外の位置およびリガンド結合ポケットの外側の位置に少なくとも１つのＮ−Ｘ−Ｓ／Ｔ配列を含む、項目１０に記載のバリアント。
（項目１２）
上記タンパク質が、配列番号２の２４位に対応する位置にＮを含み、配列番号２の２６位に対応する位置にＳまたはＴを含む、項目１１に記載のバリアントＡｃｔＲＩＩＢタンパク質。
（項目１３）
上記タンパク質が配列番号２の６４位に対応する位置にＲまたはＫを含む、項目１０に記載のバリアントＡｃｔＲＩＩＢタンパク質。
（項目１４）
上記配列番号２の配列に関する少なくとも１つの変化が、リガンド結合ポケット内に位置する保存的変化である、項目１０に記載のバリアントＡｃｔＲＩＩＢタンパク質。
（項目１５）
上記配列番号２の配列に関する少なくとも１つの変化が、Ｋ７４、Ｒ４０、Ｑ５３、Ｋ５５、Ｆ８２、およびＬ７９からなる群から選択される１つまたは複数の位置での変化である、項目１０に記載のバリアントＡｃｔＲＩＩＢタンパク質。
（項目１６）
上記タンパク質が、配列番号２のアミノ酸２２〜２４のいずれかに対応するアミノ酸から始まり、配列番号２のアミノ酸１３３または１３４のいずれかに対応するアミノ酸で終了するアミノ酸配列を含む、項目１０に記載のバリアントＡｃｔＲＩＩＢタンパク質。
（項目１７）
上記タンパク質が異種部分をさらに含む融合タンパク質である、項目１０〜項目１６のいずれか１項に記載のバリアントＡｃｔＲＩＩＢタンパク質。
（項目１８）
上記タンパク質がホモ二量体である、項目１７に記載のバリアントＡｃｔＲＩＩＢ融合タンパク質。
（項目１９）
上記異種部分がＩｇＧ重鎖由来の定常領域を含む、項目１７に記載のＡｃｔＲＩＩＢ融合タンパク質のバリアント。
（項目２０）
配列番号２のアミノ酸２９〜１０９の配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含むバリアントＡｃｔＲＩＩＢタンパク質であって、上記タンパク質が、ＡｃｔＲＩＩＢの内因性Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔ配列以外の位置およびリガンド結合ポケットの外側の位置に少なくとも１つのＮ−Ｘ−Ｓ／Ｔ配列を含む、バリアントＡｃｔＲＩＩＢタンパク質。
（項目２１）
上記タンパク質が、配列番号２の２４位に対応する位置にＮを含み、配列番号２の２６位に対応する位置にＳまたはＴを含み、上記バリアントＡｃｔＲＩＩＢタンパク質が、細胞ベースのアッセイにおいてアクチビン、ミオスタチン、および／またはＧＤＦ１１によるシグナル伝達を阻害する、項目２０に記載のバリアントＡｃｔＲＩＩＢタンパク質。
（項目２２）
上記タンパク質が、配列番号２の６４位に対応する位置にＲまたはＫを含む、項目２１に記載のバリアントＡｃｔＲＩＩＢタンパク質。
（項目２３）
上記配列番号２の配列に関する少なくとも１つの変化が、リガンド結合ポケット内に位置する保存的変化である、項目２１に記載のバリアントＡｃｔＲＩＩＢタンパク質。
（項目２４）
上記配列番号２の配列に関する少なくとも１つの変化が、Ｋ７４、Ｒ４０、Ｑ５３、Ｋ５５、Ｆ８２、およびＬ７９からなる群から選択される１つまたは複数の位置での変化である、項目２１に記載のバリアントＡｃｔＲＩＩＢタンパク質。
（項目２５）
上記タンパク質が、配列番号２のアミノ酸２２〜２４のいずれかに対応するアミノ酸から始まり、配列番号２のアミノ酸１３３または１３４のいずれかに対応するアミノ酸で終了するアミノ酸配列を含む、項目２１に記載のバリアントＡｃｔＲＩＩＢタンパク質。
（項目２６）
上記タンパク質が異種部分をさらに含む融合タンパク質である、項目２０〜項目２５のいずれか１項に記載のバリアントＡｃｔＲＩＩＢタンパク質。
（項目２７）
上記タンパク質がホモ二量体である、項目２６に記載のバリアントＡｃｔＲＩＩＢ融合タンパク質。
（項目２８）
上記異種部分がＩｇＧ重鎖由来の定常領域を含む、項目２７に記載のＡｃｔＲＩＩＢ融合タンパク質のバリアント。
（項目２９）
配列番号２のＡｃｔＲＩＩＢ配列由来の部分および第２のポリペプチド部分を含むＡｃｔＲＩＩＢ融合タンパク質であって、該配列番号２に由来する部分が、配列番号２のアミノ酸２２〜２４のいずれかから始まり、配列番号２のアミノ酸１３３または１３４のいずれかで終了する配列に対応し、該ＡｃｔＲＩＩＢ融合タンパク質が配列番号２の配列とは５個以下のさらなるアミノ酸位置で異なり、該ＡｃｔＲＩＩＢタンパク質が細胞ベースのアッセイにおいてミオスタチンおよび／またはＧＤＦ１１によるシグナル伝達を阻害する、ＡｃｔＲＩＩＢ融合タンパク質。
（項目３０）
上記タンパク質が、ＡｃｔＲＩＩＢの内因性Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔ配列以外の位置およびリガンド結合ポケットの外側の位置に少なくとも１つのＮ−Ｘ−Ｓ／Ｔ配列を含む、項目２９に記載のバリアント。
（項目３１）
上記タンパク質が配列番号２の２４位に対応する位置にＮを含み、配列番号２の２６位に対応する位置にＳまたはＴを含む、項目３０に記載のバリアントＡｃｔＲＩＩＢタンパク質。
（項目３２）
上記タンパク質が配列番号２の６４位に対応する位置にＲまたはＫを含む、項目２９に記載のバリアントＡｃｔＲＩＩＢタンパク質。
（項目３３）
上記配列番号２の配列に関する少なくとも１つの変化が、リガンド結合ポケット内に位置する保存的変化である、項目２９に記載のバリアントＡｃｔＲＩＩＢタンパク質。
（項目３４）
上記配列番号２の配列に関する少なくとも１つの変化が、Ｋ７４、Ｒ４０、Ｑ５３、Ｋ５５、Ｆ８２、およびＬ７９からなる群から選択される１つまたは複数の位置での変化である、項目２９に記載のバリアントＡｃｔＲＩＩＢタンパク質。
（項目３５）
上記タンパク質が異種部分をさらに含む融合タンパク質である、項目２９〜項目３４のいずれか１項に記載のバリアントＡｃｔＲＩＩＢタンパク質。
（項目３６）
上記タンパク質がホモ二量体である、項目３５に記載のバリアントＡｃｔＲＩＩＢ融合タンパク質。
（項目３７）
上記異種部分がＩｇＧ重鎖由来の定常領域を含む、項目３５に記載のＡｃｔＲＩＩＢ融合タンパク質のバリアント。
（項目３８）
配列番号２のＡｃｔＲＩＩＢ配列由来の部分および第２のポリペプチド部分を含むバリアントＡｃｔＲＩＩＢ融合タンパク質であって、該配列番号２に由来する部分が、配列番号２のアミノ酸２０〜２９のいずれかから始まり、配列番号２のアミノ酸１０９〜１３４のいずれかで終了する配列に対応し、該ＡｃｔＲＩＩＢ融合タンパク質が、配列番号２の６４位にアルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）、またはヒスチジン（Ｈ）を有し、細胞ベースのアッセイにおいてアクチビン、ミオスタチン、および／またはＧＤＦ１１によるシグナル伝達を阻害する、バリアントＡｃｔＲＩＩＢ融合タンパク質。
（項目３９）
上記配列番号２に由来する部分が、配列番号２のアミノ酸２１〜２９のいずれかから始まり、配列番号４のアミノ酸１１８〜１３４のいずれかで終了する配列に対応する、項目３８に記載のバリアントＡｃｔＲＩＩＢ融合タンパク質。
（項目４０）
上記配列番号２に由来する部分が、配列番号２のアミノ酸２１〜２９のいずれかから始まり、配列番号２のアミノ酸１２８〜１３４のいずれかで終了する配列に対応する、項目３８に記載のバリアントＡｃｔＲＩＩＢ融合タンパク質。
（項目４１）
上記配列番号２に由来する部分が、配列番号２のアミノ酸２１〜２４のいずれかから始まり、配列番号２のアミノ酸１０９〜１３４のいずれかで終了する配列に対応する、項目３８に記載のバリアントＡｃｔＲＩＩＢ融合タンパク質。
（項目４２）
上記配列番号２に由来する部分が、配列番号２のアミノ酸２１〜２４のいずれかから始まり、配列番号２のアミノ酸１１８〜１３４のいずれかで終了する配列に対応する、項目３８に記載のバリアントＡｃｔＲＩＩＢ融合タンパク質。
（項目４３）
上記配列番号２に由来する部分が、配列番号２のアミノ酸２１〜２４のいずれかから始まり、配列番号２のアミノ酸１２８〜１３４のいずれかで終了する配列に対応する、項目３８に記載のバリアントＡｃｔＲＩＩＢ融合タンパク質。
（項目４４）
（ａ）アクチビンシグナル伝達の阻害と比較してより高いＧＤＦ１１またはＧＤＦ８シグナル伝達の阻害；（ｂ）血清半減期の増加；および（ｃ）（ａ）と（ｂ）の両方からなる群から選択される性質を付与する配列番号２の配列に対する１つまたは複数の修飾をさらに含む、項目３８に記載のバリアントＡｃｔＲＩＩＢ融合タンパク質。
（項目４５）
配列番号２のＡｃｔＲＩＩＢ配列由来の部分および第２のポリペプチド部分を含むバリアントＡｃｔＲＩＩＢ融合タンパク質であって、該配列番号２に由来する部分が、配列番号２のアミノ酸２０〜２９のいずれかから始まり、配列番号２のアミノ酸１０９〜１３３のいずれかで終了する配列に対応し、該ＡｃｔＲＩＩＢ融合タンパク質が、配列番号２の６４位にアルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）、またはヒスチジン（Ｈ）を有し、細胞ベースのアッセイにおいてアクチビン、ミオスタチン、および／またはＧＤＦ１１によるシグナル伝達を阻害する、バリアントＡｃｔＲＩＩＢ融合タンパク質。
（項目４６）
上記配列番号２に由来する部分が、配列番号２のアミノ酸２０〜２９のいずれかから始まり、配列番号２のアミノ酸１１８〜１３３のいずれかで終了する配列に対応する、項目４５に記載のバリアントＡｃｔＲＩＩＢ融合タンパク質。
（項目４７）
上記配列番号２に由来する部分が、配列番号２のアミノ酸２０〜２９のいずれかから始まり、配列番号２のアミノ酸１２８〜１３３のいずれかで終了する配列に対応する、項目４５に記載のバリアントＡｃｔＲＩＩＢ融合タンパク質。
（項目４８）
上記配列番号２に由来する部分が、配列番号２のアミノ酸２０〜２４のいずれかから始まり、配列番号２のアミノ酸１０９〜１３３のいずれかで終了する配列に対応する、項目４５に記載のバリアントＡｃｔＲＩＩＢ融合タンパク質。
（項目４９）
上記配列番号２に由来する部分が、配列番号２のアミノ酸２０〜２４のいずれかから始まり、配列番号２のアミノ酸１１８〜１３３のいずれかで終了する配列に対応する、項目４５に記載のバリアントＡｃｔＲＩＩＢ融合タンパク質。
（項目５０）
上記配列番号２に由来する部分が、配列番号２のアミノ酸２０〜２４のいずれかから始まり、配列番号２のアミノ酸１２８〜１３３のいずれかで終了する配列に対応する、項目４５に記載のバリアントＡｃｔＲＩＩＢ融合タンパク質。
（項目５１）
（ａ）アクチビンシグナル伝達の阻害と比較してより高いＧＤＦ１１またはＧＤＦ８シグナル伝達の阻害；（ｂ）血清半減期の増加；および（ｃ）（ａ）と（ｂ）の両方からなる群から選択される性質を付与する配列番号２の配列に対する１つまたは複数の修飾をさらに含む、項目４５に記載のバリアントＡｃｔＲＩＩＢ融合タンパク質。
（項目５２）
上記タンパク質がホモ二量体である、項目３８〜５１のいずれか１項に記載のバリアントＡｃｔＲＩＩＢ融合タンパク質。
（項目５３）
上記異種部分がＩｇＧ重鎖由来の定常領域を含む、項目３８〜５１のいずれか１項に記載のＡｃｔＲＩＩＢ融合タンパク質のバリアント 。
（項目５４）
上記異種部分がＦｃドメインである、項目５３に記載のバリアントＡｃｔＲＩＩＢ融合タンパク質。
（項目５５）
配列番号２のアミノ酸２９〜１０９の配列と少なくとも８０％同一であるが、１００％同一ではないアミノ酸配列を含むバリアントＡｃｔＲＩＩＢタンパク質であって、配列番号４の６４位に対応する位置がＫであり、上記バリアントＡｃｔＲＩＩＢタンパク質が、細胞ベースのアッセイにおいてアクチビン、ミオスタチン、および／またはＧＤＦ１１によるシグナル伝達を阻害する、バリアントＡｃｔＲＩＩＢタンパク質。
（項目５６）
上記配列番号２の配列に関する少なくとも１つの変化がリガンド結合ポケットの外側に位置する、項目５５に記載のバリアントＡｃｔＲＩＩＢタンパク質。
（項目５７）
上記配列番号２の配列に関する少なくとも１つの変化が、リガンド結合ポケット内に位置する保存的変化である、項目５５に記載のバリアントＡｃｔＲＩＩＢタンパク質。
（項目５８）
上記配列番号２の配列に関する少なくとも１つの変化が、Ｋ７４、Ｒ４０、Ｑ５３、Ｋ５５、Ｆ８２、およびＬ７９からなる群から選択される１つまたは複数の位置での変化である、項目５５に記載のバリアントＡｃｔＲＩＩＢタンパク質。
（項目５９）
上記タンパク質が、配列番号２の内因性Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔ配列以外の位置およびリガンド結合ポケットの外側の位置に少なくとも１つのＮ−Ｘ−Ｓ／Ｔ配列を含む、項目５５に記載のバリアントＡｃｔＲＩＩＢタンパク質。
（項目６０）
上記タンパク質が、（ａ）アクチビンシグナル伝達の阻害と比較してより高いＧＤＦ１１またはＧＤＦ８シグナル伝達の阻害；（ｂ）血清半減期の増加；および（ｃ）（ａ）と（ｂ）の両方からなる群から選択される性質を付与する配列番号２の配列に対する１つまたは複数の修飾を含む、項目５５に記載のバリアントＡｃｔＲＩＩＢタンパク質。
（項目６１）
項目１〜項目６０のいずれか１項に記載のタンパク質を含む薬学的調製物。
（項目６２）
有効量の項目６１に記載の薬学的調製物を被験体に投与する工程を含む、筋肉の喪失または不十分な筋肉成長に関連する障害を有する被験体を治療するための方法。
（項目６３）
上記被験体が筋萎縮を有する、項目６２に記載の方法。
（項目６４）
上記被験体が筋ジストロフィを有する、項目６２に記載の方法。
（項目６５）
上記筋ジストロフィがディシュンヌ型筋ジストロフィである、項目６４に記載の方法。
（項目６６）
上記被験体が若年者であり、治療をディシュンヌ型筋ジストロフィの診断日から１〜５年以内に開始する、項目６４に記載の方法。
（項目６７）
上記筋ジストロフィがＦＳＨ筋ジストロフィである、項目６２に記載の方法。
（項目６８）
上記被験体がＡＬＳを有する、項目６２に記載の方法。
（項目６９）
上記被験体がＡＬＳの診断後に治療を受ける、項目６８に記載の方法。
（項目７０）
上記障害が癌または癌療法に関連する悪液質である、項目６２に記載の方法。
（項目７１）
上記障害が前立腺癌療法に関連する筋肉喪失である、項目７０に記載の方法。
（項目７２）
上記障害が腫瘍に関連する筋肉喪失である、項目７０に記載の方法。
（項目７３）
上記腫瘍が結腸癌の腫瘍（ｃｏｌｏｎ ｃａｎｃｅｒ ｔｕｍｏｒ）である、項目７２に記載の方法。
（項目７４）
有効量の項目６１に記載の薬学的調製物を被験体に投与する工程を含む、神経変性に関連する障害を有する被験体を治療するための方法。
（項目７５）
上記障害が筋萎縮性側索硬化症である、項目７４に記載の方法。
（項目７６）
有効量の項目６１に記載の薬学的調製物を被験体に投与する工程を含む、被験体の体脂肪含有量を減少させるか、体脂肪含有量の増加速度を低下させるための方法。
（項目７７）
有効量の項目６１に記載の薬学的調製物を被験体に投与する工程を含む、被験体の望ましくない体重増加に関連する障害を治療するための方法。
（項目７８）
上記障害が、肥満、重篤または病的な肥満、非インスリン依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）、心血管疾患、癌、高血圧症、変形性関節症、卒中、呼吸困難、および胆嚢疾患からなる群から選択される、項目７７に記載の方法。
（項目７９）
有効量の項目６１に記載の薬学的調製物を被験体に投与する工程を含む、コレステロールおよび／またはトリグリセリドを低下させるための方法。
（項目８０）
有効量の項目６１に記載の薬学的調製物を被験体に投与する工程を含む、サルコペニアを治療するための方法。
（項目８１）
配列番号５のアミノ酸配列を含むＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃタンパク質。
（項目８２）
上記タンパク質が配列番号５の５位に対応する位置にＮを有する、項目８１に記載のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃタンパク質。
（項目８３）
上記タンパク質が配列番号５の６０位に対応する位置にＤまたはＥを有する、項目８１に記載のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃタンパク質。
（項目８４）
上記タンパク質が配列番号５の６０位に対応する位置にＤまたはＥを有する、項目８２に記載のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃタンパク質。
（項目８５）
上記タンパク質が二量体である、項目８１に記載のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃタンパク質。
（項目８６）
上記タンパク質が二量体である、項目８２に記載のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃタンパク質。
（項目８７）
上記タンパク質が二量体である、項目８３に記載のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃタンパク質。
（項目８８）
上記タンパク質が二量体である、項目８４に記載のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃタンパク質。
（項目８９）
項目８１〜項目８８のいずれか１項に記載のタンパク質を含む薬学的調製物。
（項目９０）
有効量の項目８９に記載の薬学的調製物を被験体に投与する工程を含む、筋肉の喪失または不十分な筋肉成長に関連する障害を有する被験体を治療するための方法。
（項目９１）
上記被験体が筋萎縮を有する、項目９０に記載の方法。
（項目９２）
上記被験体が筋ジストロフィを有する、項目９０に記載の方法。
（項目９３）
上記筋ジストロフィがディシュンヌ型筋ジストロフィである、項目９２に記載の方法。
（項目９４）
上記被験体が若年者であり、治療をディシュンヌ型筋ジストロフィの診断日から１〜５年以内に開始する、項目９３に記載の方法。
（項目９５）
上記筋ジストロフィがＦＳＨ筋ジストロフィである、項目９２に記載の方法。
（項目９６）
上記被験体がＡＬＳを有する、項目９０に記載の方法。
（項目９７）
上記被験体がＡＬＳの診断後に治療を受ける、項目９６に記載の方法。
（項目９８）
上記障害が癌または癌療法に関連する悪液質である、項目９０に記載の方法。
（項目９９）
上記障害が前立腺癌療法に関連する筋肉喪失である、項目９８に記載の方法。
（項目１００）
上記障害が腫瘍に関連する筋肉喪失である、項目９８に記載の方法。
（項目１０１）
上記腫瘍が結腸癌の腫瘍である、項目１００に記載の方法。
（項目１０２）
有効量の項目８９に記載の薬学的調製物を被験体に投与する工程を含む、神経変性に関連する障害を有する被験体を治療するための方法。
（項目１０３）
上記障害が筋萎縮性側索硬化症である、項目１０２に記載の方法。
（項目１０４）
有効量の項目８９に記載の薬学的調製物を被験体に投与する工程を含む、被験体の体脂肪含有量を減少させるか、体脂肪含有量の増加速度を低下させるための方法。
（項目１０５）
有効量の項目１０４に記載の薬学的調製物を被験体に投与する工程を含む、被験体の望ましくない体重増加に関連する障害を治療するための方法。
（項目１０６）
上記障害が、肥満、重篤または病的な肥満、非インスリン依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）、心血管疾患、癌、高血圧症、変形性関節症、卒中、呼吸困難、および胆嚢疾患からなる群から選択される、項目１０５に記載の方法。
（項目１０７）
有効量の項目８９に記載の薬学的調製物を被験体に投与する工程を含む、コレステロールおよび／またはトリグリセリドを低下させるための方法。
（項目１０８）
有効量の項目１０７に記載の薬学的調製物を被験体に投与する工程を含む、サルコペニアを治療するための方法。
（項目１０９）
筋肉の喪失または不十分な筋肉成長に関連する障害の治療薬の製造のための項目６１または項目８９に記載の薬学的調製物の使用。
（項目１１０）
筋肉の喪失または不十分な筋肉成長に関連する障害の治療に使用するための項目６１または項目８９に記載の薬学的調製物。
（項目１１１）
神経変性に関連する障害の治療薬の製造のための項目６１または項目８９に記載の薬学的調製物の使用。
（項目１１２）
神経変性に関連する障害の治療に使用するための項目６１または項目８９に記載の薬学的調製物。
（項目１１３）
被験体の体脂肪含有量を減少させるか、体脂肪含有量の増加速度を低下させるための薬物の製造のための項目６１または項目８９に記載の薬学的調製物の使用。
（項目１１４）
被験体の体脂肪含有量を減少させるか、または体脂肪含有量の増加速度を低下させることに使用するための項目６１または項目８９に記載の薬学的調製物。
（項目１１５）
被験体の望ましくない体重増加に関連する障害の治療薬の製造のための項目６１または項目８９に記載の薬学的調製物の使用。
（項目１１６）
被験体の望ましくない体重増加に関連する障害の治療に使用するための項目６１または項目８９に記載の薬学的調製物。
（項目１１７）
コレステロールおよび／またはトリグリセリドを低下させる医薬の製造のための項目６１または項目８９に記載の薬学的調製物の使用。
（項目１１８）
コレステロールおよび／またはトリグリセリドを低下させることに使用するための項目６１または項目８９に記載の薬学的調製物。
（項目１１９）
サルコペニアの治療薬の製造のための項目６１または項目８９に記載の薬学的調製物の使用。
（項目１２０）
サルコペニアの治療に使用するための項目６１または項目８９に記載の薬学的調製物。
図１は、ヒトＡｃｔＲＩＩＢ可溶性（細胞外）ポリペプチド配列（配列番号１）を示す。Ｃ末端「テール」に下線を引いている。 図２は、ヒトＡｃｔＲＩＩＢ前駆体タンパク質配列（配列番号２）を示す。シグナルペプチドに下線を引いている。細胞外ドメインを太字で示している（配列番号１ともいう）。潜在的Ｎ結合グリコシル化部位を囲んでいる。 図３は、配列番号３と示したヒトＡｃｔＲＩＩＢ可溶性（細胞外）ポリペプチドをコードする核酸配列を示す。 図４は、配列番号４と示したヒトＡｃｔＲＩＩＢ前駆体タンパク質をコードする核酸配列を示す。 図５は、ビヒクル（菱形）、ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｒ６４ ２０−１３４）−ｍＦｃ（四角）、または長半減期形態のＡｃｔＲＩＩＢ（Ｒ６４Ａ２４Ｎ ２０−１３４）（三角）で処置したマウスの体重増加を示す。 図６は、研究終了時の切開した筋肉の重量を示す。ビヒクル：各群の左のカラム（薄い陰影）；ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｒ６４ ２０−１３４）−ｍＦｃ：各群の中央のカラム（中間の陰影）；ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｒ６４Ａ２４Ｎ ２０−１３４）：各群の右側のカラム（濃い陰影）。 図７は、ＰＢＳおよびマウスＡｃｔＲＩＩＢ（Ｒ６４Ｋ７４Ａ ２０−１３４）−ｍＦｃ（または「Ｋ７４Ａ＋１５テール」）で処置したＳＯＤマウスの握力測定（それぞれ白色および黒色のバー）を示す。図は、疾患の初期段階（１１７日目）および後期段階（１４９日目）におけるＰＢＳ群と比較したマウスＡｃｔＲＩＩＢ（Ｒ６４Ｋ７４Ａ ２０−１３４）−ｍＦｃ群の強度の増加を示す。＊Ｐ＜０．０５、両側スチューデントｔ検定。 図８は、ＰＢＳおよびＡｃｔＲＩＩＢ（Ｒ６４ Ｋ７４Ａ ２０−１３４）−ｍＦｃで処置したＳＯＤマウスのカプラン・マイヤー生存比較（それぞれ、白色線および黒色線）を示す。ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｒ６４Ｋ７４Ａ ２０−１３４）−ｍＦｃ処置コホートは、ＰＢＳ群と比較して、平均生存日数が増加した。 図９は、ＰＢＳおよびＡｃｔＲＩＩＢ（Ｒ６４ ２０−１３４）−ｍＦｃ ＨＦＤを与えたマウスの体組成の比率（それぞれ、白色および黒色のバー）を示す。マウスＡｃｔＲＩＩＢ（Ｒ６４ ２０−１３４）−Ｆｃタンパク質での処置により、脂肪量が有意に低下し、除脂肪組織が増加する。 図１０は、高齢マウス（Ａ）またはＡｃｔＲＩＩＢ（Ｒ６４ ２０−１３４）−ｍＦｃで処置した高齢マウス（Ｂ）由来の大腿筋の断面（４倍）を示す。 図１１は、ＣＴ２６結腸癌細胞を使用した癌悪液質実験におけるマウスの平均体重を示す。菱形：非腫瘍化生理食塩水処置マウス；四角：非腫瘍化ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｒ６４ ２０−１３４）−ｍＦｃ処置マウス；三角：腫瘍化生理食塩水処置マウス；「ｘ」：腫瘍化ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｒ６４ ２０−１３４）−ｍＦｃ処置マウス（１０ｍｇ／ｋｇ）；「＊」：腫瘍化ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｒ６４ ２０−１３４）−ｍＦｃ処置マウス（３０ｍｇ／ｋｇ）；円：腫瘍化ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｒ６４ ２０−１３４）−ｍＦｃ処置マウス（１０ｍｇ／ｋｇ）（予防方法のために腫瘍移植時に開始した処置）。 図１２は、ボックスで示したリガンドに直接接触するための複数のＡｃｔＲＩＩＢおよびＡｃｔＲＩＩＡ結晶構造（リガンド結合ポケット）の合成解析に基づいた本明細書中で予想される残基とのヒトＡｃｔＲＩＩＡおよびＡｃｔＲＩＩＢのアラインメントを示す。 図１３は、種々の脊椎動物ＡｃｔＲＩＩＢタンパク質およびヒトＡｃｔＲＩＩＡのマルチプル配列アラインメントを示す。
詳細な説明
１．概説
ある態様では、本発明は、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドに関する。本明細書中で使用される場合、用語「ＡｃｔＲＩＩＢ」は、任意の種由来のアクチビン受容体ＩＩＢ型（ＡｃｔＲＩＩＢ）タンパク質およびＡｃｔＲＩＩＢ関連タンパク質のファミリーに関する。ＡｃｔＲＩＩＢファミリーのメンバーは、一般に、全てがシステインリッチ領域を有するリガンド結合細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および推定セリン／トレオニンキナーゼ特異性を有する細胞質ドメインから構成される膜貫通タンパク質である。ヒトＡｃｔＲＩＩＡ前駆体タンパク質（比較のために提供する）およびＡｃｔＲＩＩＢ前駆体タンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ図１（配列番号１）および図２（配列番号２）に示す。
用語「ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド」を、ＡｃｔＲＩＩＢファミリーメンバーの任意の天然に存在するポリペプチドおよび有用な活性を保持するその任意のバリアント（変異体、フラグメント、融合物、およびペプチド模倣物の形態が含まれる）を含むポリペプチドをいうために使用する。例えば、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドには、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド配列と少なくとも約８０％同一、好ましくは、少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、またはそれを超えて同一の配列を有する任意の公知のＡｃｔＲＩＩＢの配列に由来するポリペプチドが含まれる。
特定の実施形態では、本発明は、可溶性ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドに関する。本明細書中で使用される場合、用語「可溶性ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド」は、一般に、ＡｃｔＲＩＩＢタンパク質の細胞外ドメインを含むポリペプチドをいう。本明細書中で使用される場合、用語「可溶性ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド」には、任意の天然に存在するＡｃｔＲＩＩＢタンパク質の細胞外ドメインおよび有用な活性を保持するその任意のバリアント（変異体、フラグメント、およびペプチド模倣物の形態が含まれる）が含まれる。例えば、ＡｃｔＲＩＩＢタンパク質の細胞外ドメインは、リガンドに結合し、一般に可溶性である。可溶性ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの例には、図１（配列番号１）に示したＡｃｔＲＩＩＢ可溶性ポリペプチドが含まれる。可溶性ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの他の例は、ＡｃｔＲＩＩＢタンパク質の細胞外ドメインに加えてシグナル配列を含む（実施例１を参照のこと）。シグナル配列は、ＡｃｔＲＩＩＢの未変性のシグナル配列または別のタンパク質由来のシグナル配列（組織プラスミノゲンアクチベーター（ＴＰＡ）シグナル配列またはミツバチメラチン（ＨＢＭ）シグナル配列など）であり得る。
ＴＧＦ−βシグナルは、Ｉ型およびＩＩ型セリン／トレオニンキナーゼ受容体のヘテロマー複合体によって媒介されるシグナルである。このシグナルは、リガンド刺激の際に下流Ｓｍａｄタンパク質をリン酸化および活性化する（Ｍａｓｓａｇｕe、２０００、Ｎａ
ｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１：１６９−１７８）。これらのＩ型およびＩＩ型受容体は、全てがシステインリッチ領域を有するリガンド結合細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および推定セリン／トレオニンキナーゼ特異性を有する細胞質ドメインから構成される膜貫通タンパク質である。Ｉ型受容体は、シグナル伝達に不可欠であり、ＩＩ型受容体は、リガンド結合およびＩ型受容体発現に必要である。Ｉ型およびＩＩ型アクチビン受容体は、リガンド結合後に安定な複合体を形成し、ＩＩ型受容体によってＩ型受容体がリン酸化される。
２つの関連するＩＩ型受容体であるＡｃｔＲＩＩＡおよびＡｃｔＲＩＩＢは、アクチビンのＩＩ型受容体と同定されている（ＭａｔｈｅｗｓおよびＶａｌｅ、１９９１、Ｃｅｌｌ ６５：９７３−９８２；Ａｔｔｉｓａｎｏら、１９９２、Ｃｅｌｌ ６８：９７−１０８）。アクチビンに加えて、ＡｃｔＲＩＩＡおよびＡｃｔＲＩＩＢは、いくつかの他のＴＧＦ−βファミリータンパク質（ＢＭＰ７、Ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ８、およびＧＤＦ１１が含まれる）と生化学的に相互作用することができる（Ｙａｍａｓｈｉｔａら、１９９５、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１３０：２１７−２２６；ＬｅｅおよびＭｃＰｈｅｒｒｏｎ、２００１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９８：９３０６−９３１１；ＹｅｏおよびＷｈｉｔｍａｎ、２００１、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．７：９４９−９５７；Ｏｈら、２００２、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１６：２７４９−５４）。出願人は、可溶性ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃ融合タンパク質およびＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質は、ｉｎ ｖｉｖｏで実質的に異なる効果を有し、ＡｃｔＲＩＩＡ−Ｆｃは主に骨に影響を及ぼし、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃは主に骨格筋に影響を及ぼすことを見出した。
ある実施形態では、本発明は、本ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド（例えば、可溶性ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド）でのＡｃｔＲＩＩＢ受容体のリガンド（ＡｃｔＲＩＩＢリガンドとも呼ばれる）の拮抗に関する。したがって、本発明の組成物および方法は、ＡｃｔＲＩＩＢ受容体の１つまたは複数のリガンドの異常な活性に関連する障害の治療に有用である。ＡｃｔＲＩＩＢ受容体の例示的リガンドには、いくつかのＴＧＦ−βファミリーメンバー（アクチビン、Ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ８、ＧＤＦ１１、およびＢＭＰ７など）が含まれる。
アクチビンは、二量体ポリペプチド成長因子であり、ＴＧＦ−βスーパーファミリーに属する。２つの密接に関連するβサブユニットのホモ／ヘテロ二量体（βＡβＡ、βＢβＢ、およびβＡβＢ）である３つのアクチビン（Ａ、Ｂ、およびＡＢ）が存在する。ＴＧＦ−βスーパーファミリーでは、アクチビンは、卵巣細胞および胎盤細胞中でのホルモン産生を刺激し、神経細胞生存を支持し、細胞型に正および負に依存する細胞周期の進行に影響を及ぼし、少なくとも両生類胚中で中葉胚分化を誘導することができる固有且つ多機能の因子である（ＤｅＰａｏｌｏら、１９９１、Ｐｒｏｃ ＳｏｃＥｐ Ｂｉｏｌ Ｍｅｄ．１９８：５００−５１２；Ｄｙｓｏｎら、１９９７、Ｃｕｒｒ Ｂｉｏｌ．７：８１−８４；Ｗｏｏｄｒｕｆｆ、１９９８、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５５：９５３−９６３）。さらに、刺激された単球性白血病細胞から単離した赤芽球分化誘導因子（ＥＤＦ）は、アクチビンＡと同一であることが見い出された（Ｍｕｒａｔａら、１９８８、ＰＮＡＳ、８５：２４３４）。アクチビンＡが骨髄中で赤血球生成の天然のレギュレーターとして作用することが示唆された。いくつかの組織では、アクチビンシグナル伝達は、その関連するヘテロ二量体であるインヒビンによって拮抗される。例えば、下垂体からの濾胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）の放出中、アクチビンはＦＳＨの分泌および合成を促進する一方で、インヒビンはＦＳＨの分泌および合成を阻害する。アクチビンの生物活性を調節し、そして／またはアクチビンに結合することができる他のタンパク質には、下記のフォリスタチン（ＦＳ）、フォリスタチン関連タンパク質（ＦＳＲＰ）、α２−マクログロブリン、サーベラス、およびエンドグリンが含まれる。
Ｎｏｄａｌタンパク質は、中胚葉および内胚葉の誘導および形成ならびに初期胚形成におけるその後の軸構造（心臓および胃など）の組織化で機能する。発生中の脊椎動物胚中の背側組織が脊索および脊索前板の軸構造に主に寄与する一方で、周辺細胞を動員して非軸胚構造を形成することが証明された。Ｎｏｄａｌは、Ｉ型とＩＩ型受容体との両方およびＳｍａｄタンパク質として公知の細胞内エフェクターを介してシグナル伝達するようである。最近の研究は、ＡｃｔＲＩＩＡおよびＡｃｔＲＩＩＢがＮｏｄａｌのＩＩ型受容体としての機能を果たすという概念を支持する（Ｓａｋｕｍａら、Ｇｅｎｅｓ Ｃｅｌｌｓ．２００２、７：４０１−１２）。Ｎｏｄａｌリガンドはその補因子（例えば、ｃｒｉｐｔｏ）と相互作用して、アクチビンＩ型およびＩＩ型を活性化し、Ｓｍａｄ２をリン酸化することが示唆される。Ｎｏｄａｌタンパク質は、初期脊椎動物胚形成に極めて重要な多数の事象（中胚葉形成、前部パターン形成、および左右軸の特定化が含まれる）に関与する。実験的証拠により、Ｎｏｄａｌシグナル伝達がｐＡＲ３−Ｌｕｘ（アクチビンおよびＴＧＦ−βに特異的に応答することが以前に示されているルシフェラーゼレポーター）を活性化することが証明されている。しかし、Ｎｏｄａｌは、ｐＴｌｘ２−Ｌｕｘ（骨形成タンパク質に特異的に応答するレポーター）を誘導することができない。最近の結果は、Ｎｏｄａｌシグナル伝達がアクチビン−ＴＧＦ−β経路のＳｍａｄであるＳｍａｄ２およびＳｍａｄ３の両方によって媒介されるという直接的な生化学的証拠が得られている。さらなる証拠により、細胞外Ｃｒｉｐｔｏタンパク質がＮｏｄａｌシグナル伝達に必要であり、そのことがアクチビンまたはＴＧＦ−βのシグナル伝達と異ならせていることが示されている。
成長分化因子８（ＧＤＦ８）はまた、ミオスタチンとしても公知である。ＧＤＦ８は、骨格筋量の負のレギュレーターである。ＧＤＦ８は、発生中および成体の骨格筋で高度に発現される。トランスジェニックマウスにおけるＧＤＦ８ヌル変異は、骨格筋の顕著な肥大および過形成によって特徴づけられる（ＭｃＰｈｅｒｒｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ、１９９７、３８７：８３−９０）。骨格筋量の類似の増加は、ウシ（Ａｓｈｍｏｒｅら、１９７４、Ｇｒｏｗｔｈ、３８：５０１−５０７；ＳｗａｔｌａｎｄおよびＫｉｅｆｆｅｒ、Ｊ．Ａｎｉｍ．Ｓｃｉ．、１９９４、３８：７５２−７５７；ＭｃＰｈｅｒｒｏｎおよびＬｅｅ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９７、９４：１２４５７−１２４６１；およびＫａｍｂａｄｕｒら、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．、１９９７、７：９１０−９１５）および、特にヒト（Ｓｃｈｕｅｌｋｅら、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ２００４；３５０：２６８２−８）でのＧＤＦ８の天然に存在する変異で明らかである。研究により、ヒトにおけるＨＩＶ感染に関連する筋肉消耗がＧＤＦ８タンパク質発現の増加を伴うことも示されている（Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ｃａｄａｖｉｄら、ＰＮＡＳ、１９９８、９５：１４９３８−４３）。さらに、ＧＤＦ８は、筋肉特異的酵素の産生を調整し（例えば、クレアチンキナーゼ）、筋芽細胞増殖を調整することができる（ＷＯ００／４３７８１号）。ＧＤＦ８プロペプチドは、成熟したＧＤＦ８ドメイン二量体に非共有結合して、その生物活性を不活化することができる（Ｍｉｙａｚｏｎｏら（１９８８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６３：６４０７−６４１５；Ｗａｋｅｆｉｅｌｄら（１９８８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６３；７６４６−７６５４；およびＢｒｏｗｎら（１９９０）Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ、３：３５−４３）。ＧＤＦ８または構造的に関連するタンパク質に結合し、その生物活性を阻害する他のタンパク質には、フォリスタチン、および潜在的には、フォリスタチン関連タンパク質が含まれる（Ｇａｍｅｒら（１９９９）Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．、２０８：２２２−２３２）。
ＢＭＰ１１としても公知の成長分化因子１１（ＧＤＦ１１）は、分泌タンパク質である（ＭｃＰｈｅｒｒｏｎら、１９９９、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２２：２６０−２６４）。ＧＤＦ１１は、マウス成長において尾芽、肢芽、上顎弓および下顎弓、ならびに脊髄後根神経節中に発現する（Ｎａｋａｓｈｉｍａら、１９９９、Ｍｅｃｈ．Ｄｅｖ．８０：１８５−１８９）。ＧＤＦ１１は、中胚葉および神経組織の両方のパターン形成において固有の役割を果たす（Ｇａｍｅｒら、１９９９、Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ．、２０８：２２２−３２）。ＧＤＦ１１は、ニワトリ肢の発生における軟骨形成および筋形成の負のレギュレーターであることが示された（Ｇａｍｅｒら、２００１、Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ．２２９：４０７−２０）。筋肉中でのＧＤＦ１１の発現はまた、ＧＤＦ８と類似の方法での筋肉成長調節でのその役割も示唆される。さらに、脳内でのＧＤＦ１１の発現により、ＧＤＦ１１が神経系の機能に関連する活性も保有することが示唆される。興味深いことに、ＧＤＦ１１は、嗅上皮中の神経発生を阻害することが見出された（Ｗｕら、２００３、Ｎｅｕｒｏｎ．３７：１９７−２０７）。したがって、ＧＤＦ１１は、筋肉疾患および神経変性疾患（例えば、筋萎縮性側索硬化症）などの疾患の治療においてｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏで適用することができる。
骨形成タンパク質−１（ＯＰ−１）とも呼ばれる骨形成タンパク質（ＢＭＰ７）は、軟骨および骨の形成を誘導することが周知である。さらに、ＢＭＰ７は、広範な一連の生理学的過程を調節する。例えば、ＢＭＰ７は、上皮骨形成現象を担う骨誘導因子であり得る。ＢＭＰ７がカルシウム調節および骨ホメオスタシスで役割を果たすことも見出されている。アクチビンと同様に、ＢＭＰ７はＩＩ型受容体ＡｃｔＲＩＩＡおよびＩＩＢに結合する。しかし、ＢＭＰ７およびアクチビンは、異なるＩ型受容体をヘテロマー受容体複合体に動員する。認められている主なＢＭＰ７Ｉ型受容体はＡＬＫ２である一方で、アクチビンはＡＬＫ４（ＡｃｔＲＩＩＢ）に排他的に結合した。ＢＭＰ７およびアクチビンは、異なる生物学的応答を誘発し、異なるＳｍａｄ経路を活性化した（Ｍａｃｉａｓ−Ｓｉｌｖａら、１９９８、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２７３：２５６２８−３６）。
ある態様では、本発明は、一般に、ＡｃｔＲＩＩＢ活性に関連する任意の過程においてＡｃｔＲＩＩＢリガンドのシグナル伝達を拮抗するためのある種のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド（例えば、可溶性ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド）の使用に関する。任意選択的に、本発明のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、ＡｃｔＲＩＩＢ受容体の１つまたは複数のリガンド（アクチビン、Ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ８、ＧＤＦ１１、およびＢＭＰ７など）を拮抗することができる。したがって、さらなる障害の治療で有用であり得る。
したがって、本発明は、ＡｃｔＲＩＩＢまたはＡｃｔＲＩＩＢリガンドの異常な活性に関連する疾患または容態の治療または防止におけるＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの使用を意図する。ＡｃｔＲＩＩＢまたはＡｃｔＲＩＩＢリガンドは、多数の極めて重要な生物学的過程の調節に関与する。これらの過程における重要な機能により、これらは、治療介入の望ましい標的であり得る。例えば、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド（例えば、可溶性ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド）を使用して、ヒトまたは動物の障害または容態を治療することができる。かかる障害または容態の例には、代謝障害（２型糖尿病、耐糖能異常、代謝症候群（例えば、Ｘ症候群）、および外傷（例えば、熱傷または窒素不均衡）によって誘導されるインスリン抵抗性など）；脂肪組織障害（例えば、肥満）；筋ジストロフィ（ディシュンヌ型筋ジストロフィが含まれる）などの筋肉および神経筋障害；筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）；筋萎縮；臓器萎縮症；脆弱；手根管症候群；鬱血性閉塞性肺疾患；ならびにサルコペニア、悪液質、および他の筋消耗症候群が含まれるが、これらに限定されない。他の例には、特に高齢女性および／または閉経後女性における骨粗鬆症；糖質コルチコイド誘導性骨粗鬆症；骨減少症；変形性関節症；および骨粗鬆症関連骨折が含まれる。なおさらなる例には、慢性糖質コルチコイド療法に起因する骨量低下、早発性性腺機能不全、アンドロゲン抑制、ビタミンＤ欠乏症、続発性副甲状腺機能亢進症、栄養失調、および神経性食欲不振が含まれる。これらの障害および容態は、以下の「治療への使用例」で考察している。
本明細書中で使用される用語は、一般に、本発明の文脈内および各用語が使用される特定の文脈において、当該分野におけるその通常の意味を有する。ある種の用語を以下または本明細書中のほかの場所で考察しており、それにより、本発明の組成物および方法の説明およびこれらの作製および使用方法で実施者にさらなる助言が与えられる。用語の任意の使用範囲または意味は、用語が使用される特定の文脈から明らかであろう。
「約」および「およそ」は、一般に、測定の性質または精度を考慮して、測定された量の許容可能な誤差の程度を意味するものとする。典型的には、誤差の程度の例は、所与の値または値の範囲の２０パーセント（％）以内、好ましくは１０％以内、より好ましくは５％以内である。
あるいは、特に生体系では、用語「約」および「およそ」は、所与の値の一桁以内、好ましくは５倍以内、より好ましくは２倍以内である値を意味し得る。本明細書中に記載の数量は、他で記載しない限り近似値であり、明示しない場合、用語「約」または「およそ」を推測することができることを意味する。
本発明の方法は、配列を相互に比較する工程（野生型配列と１つまたは複数の変異体（配列バリアント）との比較が含まれる）を含むことができる。かかる比較は、典型的には、例えば、配列アラインメントプログラムおよび／または当該分野で周知のアルゴリズム（例えば、２〜３例を挙げると、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＭＥＧＡＬＩＧＮ）を使用したポリマー配列のアラインメントを含む。当業者は、かかるアラインメントにおいて、変異が残基の挿入または欠失を含む場合、配列アラインメントは、挿入または欠失した残基を含まないポリマー配列中に「ギャップ」（典型的には、ダッシュ、または「Ａ」で示す）を導入することを容易に認識することができる。
「相同な」は、全てのその文法的形態および綴りの異形において、「共通の進化的起源」を保有する２つのタンパク質（同種の生物におけるスーパーファミリー由来のタンパク質および異種の生物由来の相同タンパク質が含まれる）の間の関係をいう。かかるタンパク質（およびそのコード核酸）は、配列相同性を有し、これは、その配列類似性（同一率の観点から）または特定の残基もしくはモチーフの存在および保存された位置を反映する。
用語「配列類似性」は、全てのその文法的形態において、核酸配列間またはアミノ酸配列間の同一または対応の程度をいい、共通の進化的起源を含んでも含んでいなくても良い。
しかし、一般的な用法および本願では、用語「相同な」は、「高度に」などの副詞で修飾した場合、配列類似性をいうことができ、共通の進化的起源に関連しても関連しなくても良い。
２．ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド
ある態様では、本発明は、ＡｃｔＲＩＩＢバリアントポリペプチド（例えば、可溶性ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド）に関する。任意選択的に、フラグメント、機能的バリアント、および修飾形態は、その対応する野生型ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドと類似または同一の生物活性を有する。例えば、本発明のＡｃｔＲＩＩＢバリアントは、ＡｃｔＲＩＩＢリガンド（例えば、アクチビンＡ、アクチビンＡＢ、アクチビンＢ、Ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ８、ＧＤＦ１１、またはＢＭＰ７）に結合してその機能を阻害することができる。任意選択的に、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、骨、軟骨、筋肉、または脂肪などの組織の成長を調整する。ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの例には、ヒトＡｃｔＲＩＩＢ前駆体ポリペプチド（配列番号２）、および可溶性ヒトＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド（例えば、配列番号１、５、６、および１２）が含まれる。
本開示は、ＡｃｔＲＩＩＢの機能的に活性な部分およびバリアントを同定する。出願人は、Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号２のアミノ酸６４（Ａ６４）に対応する部分にアラニンを有し、アクチビンおよびＧＤＦ−１１に対する親和性が比較的低い、Ｈｉｌｄｅｎら（Ｂｌｏｏｄ．１９９４ Ａｐｒ．１５；８３（８）：２１６３−７０）によって開示された配列を有することを確認した。それに反して、６４位にアルギニンを有する（Ｒ６４）同一のＦｃ融合タンパク質は、低ナノモルから高ピコモルの範囲でアクチビンおよびＧＤＦ−１１に対して親和性を有する。したがって、Ｒ６４を有する配列を、本開示においてヒトＡｃｔＲＩＩＢの野生型基準配列として使用する。
Ａｔｔｉｓａｎｏら（Ｃｅｌｌ．１９９２ Ｊａｎ．１０；６８（１）：９７−１０８）は、ＡｃｔＲＩＩＢの細胞外ドメインのＣ末端のプロリンノットの欠失がアクチビンに対する受容体の親和性を減少させることを示した。ここに示したデータは、配列番号２のアミノ酸２０〜１１９を含むＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質（「ＡｃｔＲＩＩＢ（２０−１１９）−Ｆｃ」）が、プロリンノット領域および完全な膜近傍ドメインを含むＡｃｔＲＩＩＢ（２０−１３４）−Ｆｃと比較してＧＤＦ−１１およびアクチビンへの結合が減少したことを示す。しかし、ＡｃｔＲＩＩＢ（２０−１２９）−Ｆｃタンパク質は、プロリンノット領域が破壊された場合でさえ、野生型と比較して、類似しているがいくらか減少した活性を保持する。したがって、アミノ酸１３４、１３３、１３２、１３１、１３０、および１２９で終結するＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメインは全て活性であると予想されるが、１３４または１３３で終結する構築物がもっとも活性であり得る。同様に、残基１２９〜１３４のいずれかの変異は、大きなマージンによってリガンド結合親和性を変化させないと予想される。これの裏付けとして、Ｐ１２９およびＰ１３０は、リガンド結合を実質的に減少させない。したがって、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質は、アミノ酸１０９（最終システイン）ほどの早期に終結し得るが、１０９および１１９またはその間で終結する形態はリガンド結合が減少したと予想される。アミノ酸１１９は不十分に保存されており、したがって、容易に変化または短縮される。１２８以後で終結する形態は、リガンド結合活性を保持する。１１９および１２７またはその間で終結する形態は、中程度の結合能力を有するであろう。任意のこれらの形態は、臨床的設定または実験的設定に応じて使用することが望ましいかもしれない。
ＡｃｔＲＩＩＢのＮ末端では、アミノ酸２９以前から始まるタンパク質がリガンド結合活性を保持すると予想される。アミノ酸２９は、最初のシステインを示す。２４位でのアラニンからアスパラギンへの変異により、リガンド結合に実質的に影響を及ぼすことなくＮ結合グリコシル化配列が導入される。これにより、シグナル切断ペプチドとシステイン架橋領域（アミノ酸２０〜２９に対応する）との間の領域の変異が十分に許容されることが確認される。特に、２０、２１、２２、２３、および２４位から始まる構築物は活性を保持し、２５、２６、２７、２８、および２９位から始まる構築物も活性を保持することが予想される。実施例に示すデータは、驚いたことに、２２、２３、２４、または２５位から始まる構築物が最も活性が高いことを証明する。
まとめると、ＡｃｔＲＩＩＢの活性部分は配列番号２のアミノ酸２９〜１０９を含み、構築物は、例えば、アミノ酸２０〜２９に対応する残基から始まり、アミノ酸１０９〜１３４に対応する位置で終了し得る。他の例には、２０〜２９または２１〜２９由来の位置から始まり、１１９〜１３４、１１９〜１３３、または１２９〜１３４、１２９〜１３３由来の位置で終了する構築物が含まれる。他の例には、２０〜２４（または２１〜２４または２２〜２５）由来の位置から始まり、１０９〜１３４（または１０９〜１３３）、１１９〜１３４（または１１９〜１３３）、または１２９〜１３４（または１２９〜１３３）由来の位置で終了する構築物が含まれる。これらの範囲内のバリアント、特に配列番号４の対応する部分と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％同一のバリアントも意図する。
本開示は、図２２に示す複合ＡｃｔＲＩＩＢ構造の分析結果を含む。この結果は、リガンド結合ポケットが、残基Ｙ３１、Ｎ３３、Ｎ３５、Ｌ３８〜Ｔ４１、Ｅ４７、Ｅ５０、Ｑ５３〜Ｋ５５、Ｌ５７、Ｈ５８、Ｙ６０、Ｓ６２、Ｋ７４、Ｗ７８〜Ｎ８３、Ｙ８５、Ｒ８７、Ａ９２、およびＥ９４〜Ｆ１０１によって定義されることを証明している。これらの位置では、Ｋ７４Ａ変異が十分に許容されるにも関わらず、保存的変異が許容され、Ｒ４０Ａ、Ｋ５５Ａ、Ｆ８２Ａ、およびＬ７９位の変異も同様であると予想される。Ｒ４０は、ツメガエルのＫであり、この位置の塩基性アミノ酸が許容されることを示す。Ｑ５３は、ウシＡｃｔＲＩＩＢ中のＲおよびツメガエルＡｃｔＲＩＩＢ中のＫであり、したがって、アミノ酸（Ｒ、Ｋ、Ｑ、Ｎ、およびＨが含まれる）がこの位置で許容されるであろう。したがって、活性なＡｃｔＲＩＩＢバリアントタンパク質の一般的形態は、アミノ酸２９〜１０９を含むが、任意選択的に、２０〜２４または２２〜２５の範囲の位置から始まり、１２９〜１３４の範囲の位置で終了し、リガンド結合ポケット中にたった１、２、５、１０、または１５個の保存的アミノ酸変化を含み、リガンド結合ポケット中の４０、５３、５５、７４、７９および／または８２位に０、１つまたは複数の非保存的変化を含む、形態である。かかるタンパク質は、配列番号４のアミノ酸２９〜１０９の配列と８０％、９０％、９５％、または９９％を超える配列同一性を保持することができる。特に、変化を十分に許容することができる結合ポケットの外側の部位には、細胞外ドメインのアミノ末端およびカルボキシ末端（上記）ならびに４２〜４６位および６５〜７３位が含まれる。６５位でのアスパラギンからアラニンへの変化（Ｎ６５Ａ）は、Ａ６４バックグラウンド中でリガンド結合を実際に改善する。したがって、Ｒ６４バックグラウンド中のリガンド結合に悪影響を及ぼさないと予想される。この変化は、おそらく、Ａ６４バックグランド中でＮ６５のグリコシル化を排除する。したがって、この領域中の有意な変化が許容される可能性が高いことが証明される。Ｒ６４Ａの変化はあまり許容されない一方で、Ｒ６４Ｋは十分に許容される。したがって、別の塩基性残基（Ｈなど）は、６４位で許容され得る。
ＡｃｔＲＩＩＢは、ほぼ全ての脊椎動物で十分に保存されており、巨大な細胞外ドメインが完全に保存されている。ＡｃｔＲＩＩＢに結合する多数のリガンドも高度に保存されている。したがって、種々の脊椎動物由来のＡｃｔＲＩＩＢ配列の比較により、変化することができる残基が洞察される。したがって、活性なヒトＡｃｔＲＩＩＢバリアントは、別の脊椎動物ＡｃｔＲＩＩＢ配列由来の対応する位置に１つまたは複数のアミノ酸を含むことができるか、ヒトまたは他の脊椎動物中の残基に類似する残基を含むことができる。以下の例は、活性なＡｃｔＲＩＩＢバリアントの定義のためのこのアプローチを示す。Ｌ４６はツメガエルＡｃｔＲＩＩＢ中のバリンであるため、この位置を変化させることができ、任意選択的に別の疎水性残基（Ｖ、Ｉ、またはＦなど）または非極性残基（Ａなど）に変化させることができる。Ｅ５２はツメガエル中でＫであり、この部位は、広範な種々の変化（Ｅ、Ｄ、Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｓ、Ｔ、Ｐ、Ｇ、Ｙなどの極性残基、おそらくＡが含まれる）を許容することができることを示す。Ｔ９３は、ツメガエル中でＫであり、好ましい極性残基（Ｓ、Ｋ、Ｒ、Ｅ、Ｄ、Ｈ、Ｇ、Ｐ、Ｇ、およびＹなど）を用いた広範な構造の異形がこの位置で許容されることを示す。Ｆ１０８はツメガエル中でＹである。したがって、Ｙまたは他の疎水性基（Ｉ、Ｖ、またはＬ）が許容されるはずである。Ｅ１１１はツメガエル中でＫであり、残基の変化（Ｄ、Ｒ、Ｋ、およびＨ、ならびにＱおよびＮが含まれる）がこの位置で許容されることを示す。Ｒ１１２はツメガエル中でＫであり、塩基性残基（ＲおよびＨが含まれる）がこの位置で許容されることを示す。１１９位のＡは相対的にあまり保存されず、げっ歯類中でＰおよびツメガエル中でＶとして出現しする。したがって、本質的に任意のアミノ酸がこの位置で許容されるはずである。
開示は、さらなるＮ結合グリコシル化部位（Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔ）の付加が、ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｒ６４）−Ｆｃ形態と比較してＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質の血清半減期を増加させることを証明する。２４位でのアスパラギンの導入により（Ａ２４Ｎ構築物）、より長い半減期を付与するＮＸＴ配列が作製される。他のＮＸ（Ｔ／Ｓ）配列が４２〜４４（ＮＱＳ）および６５〜６７（ＮＳＳ）で見出されるが、後者は、６４位でＲと有効にグリコシル化できない。Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔ配列を、一般に、図１２に定義したリガンド結合ポケットの外側の位置に導入することができる。非内因性Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔ配列の特に適切な導入部位には、アミノ酸２０〜２９、２０〜２４、２２〜２５、１０９〜１３４、１２０〜１３４、または１２９〜１３４が含まれる。Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔ配列を、ＡｃｔＲＩＩＢ配列とＦｃまたは他の融合成分との間のリンカーに導入することもできる。かかる部位を、既存のＳもしくはＴに関して正確な位置にＮを導入すること、または既存のＮに対応する位置にＳもしくはＴを導入することによって最小の労力で導入することができる。したがって、Ｎ結合グリコシル化部位を作製するであろう望ましい変化は以下である：Ａ２４Ｎ、Ｒ６４Ｎ、Ｓ６７Ｎ（おそらくＮ６５Ａ変化と組み合わせた）、Ｅ１０６Ｎ、Ｒ１１２Ｎ、Ｇ１２０Ｎ、Ｅ１２３Ｎ、Ｐ１２９Ｎ、Ａ１３２Ｎ、Ｒ１１２Ｓ、およびＲ１１２Ｔ。グリコシル化されると予想される任意のＳを、免疫原性部位を作製することなくＴに変化することができると予想される。これは、グリコシル化によって保護されるためである。同様にグリコシル化されると予想される任意のＴを、Ｓに変化することができる。したがって、変化Ｓ６７ＴおよびＳ４４Ｔが示唆される。同様に、Ａ２４Ｎバリアントでは、Ｓ２６Ｔ変化を使用することができる。したがって、ＡｃｔＲＩＩＢバリアントは、１つまたは複数のさらなる非内因性Ｎ結合グリコシル化コンセンサス配列を含むことができる。
Ｌ７９位を、変化したアクチビン−ミオスタチン（ＧＤＦ−１１）結合特性が付与されるように変化することができる。Ｌ７９ＡまたはＬ７９Ｐは、アクチビン結合よりも広範にＧＤＦ−１１結合を減少させる。Ｌ７９ＥまたはＬ７９Ｄは、ＧＤＦ−１１結合を保持する。際立って、Ｌ７９ＥおよびＬ７９Ｄバリアントは、アクチビン結合を大きく減少させた。ｉｎ ｖｉｖｏ実験により、これらの非アクチビン受容体は有意に筋肉量を増加させる能力を保持するが、他の組織に及ぼす影響が減少することが示されている。これらのデータは、アクチビンに及ぼす影響が減少したポリペプチドを得るための望ましさおよび実現可能性を示す。
記載の異形を、種々の方法で組み合わせることができる。さらに、本明細書中に記載の変異誘発プログラムの結果は、ＡｃｔＲＩＩｂ中にしばしば保存に有利なアミノ酸位置が存在することを示す。これらの位置には、６４位（塩基性アミノ酸）、８０位（酸性または疎水性アミノ酸）、７８位（疎水性、特にトリプトファン）、３７位（酸性、特に、アスパラギン酸またはグルタミン酸）、５６位（塩基性アミノ酸）、６０位（疎水性アミノ酸、特に、フェニルアラニンまたはチロシン）が含まれる。したがって、本明細書中に開示の各バリアントでは、本開示は、保存することができるアミノ酸のフレームワークを提供する。保存することが望ましいかも知れない他の位置は以下である：５２位（酸性アミノ酸）、５５位（塩基性アミノ酸）、８１位（酸性）、９８（極性または荷電、特に、Ｅ、Ｄ、Ｒ、またはＫ）。
ある実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの単離フラグメントを、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドをコードする核酸（例えば、配列番号３および４）の対応するフラグメントから組換え的に産生したポリペプチドのスクリーニングによって得ることができる。さらに、フラグメントを、従来のＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ固相ｆ−Ｍｏｃまたはｔ−Ｂｏｃ化学などの当該分野で公知の技術を使用して化学合成することができる。（組換えまたは化学合成によって）フラグメントを産生し、これを試験して、例えば、ＡｃｔＲＩＩＢタンパク質またはＡｃｔＲＩＩＢリガンドのアンタゴニスト（インヒビター）またはアゴニスト（アクチベーター）として機能することができるペプチジルフラグメントを同定することができる。
ある実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの機能的バリアントは、配列番号３、４、および１０から選択されるアミノ酸配列と少なくとも７５％同一のアミノ酸配列を有する。ある場合において、機能的バリアントは、配列番号３、４、および１０から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のアミノ酸配列を有する。
ある実施形態では、本発明は、治療効率または安定性（例えば、ｅｘ ｖｉｖｏ有効期間およびｉｎ ｖｉｖｏでのタンパク質分解耐性）の増強などの目的のためのＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの構造の修飾による機能的バリアントの作製を意図する。修飾ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを、例えば、アミノ酸の置換、欠失、または付加によって産生することもできる。例えば、ロイシンのイソロイシンまたはバリンとの単独の置換、アスパラギン酸のグルタミン酸との単独の置換、トレオニンのセリンとの単独の置換、またはアミノ酸の構造的に関連するアミノ酸との類似の置換（例えば、保存的変異）は得られた分子の生物活性に大きな影響を及ぼさないと予想することが妥当である。保存的置換は、その側鎖中の関連するアミノ酸ファミリー内に起こるものである。ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドのアミノ酸配列の変化によって機能的ホモログが得られるかどうかを、バリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドが野生型ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドに類似の様式で細胞中で応答するか、野生型に類似の様式でアクチビン、ＧＤＦ−１１、またはミオスタチンなどの１つまたは複数のリガンドに結合する能力の評価によって容易に決定することができる。
ある種の特定の実施形態では、本発明は、バリアント（または変異）ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドのリガンド結合活性（例えば、結合親和性または結合特異性）が変化するような、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの細胞外ドメイン（リガンド結合ドメインともいわれる）の変異の作製を意図する。ある場合において、かかるバリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、特異的リガンドに対する結合親和性が変化（上昇または低下）した。他の場合、バリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、そのリガンドに対する結合親和性が変化した。
例えば、本開示は、アクチビンと比較してＧＤＦ８／ＧＤＦ１１に優先的に結合するバリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを提供する。本開示は、さらに、的外れの影響を減少させるためのかかるポリペプチドの望ましさを確立するが、かかる選択的バリアントは、治療効果を得るために非常に大きな筋肉量の増加を必要とし得、いくらかのレベルの的外れの影響が許容可能な重症疾患の治療にはあまり望ましくないかもしれない。例えば、ＡｃｔＲＩＩＢタンパク質のアミノ酸残基（Ｅ３９、Ｋ５５、Ｙ６０、Ｋ７４、Ｗ７８、Ｄ８０、およびＦ１０１など）は、リガンド結合ポケット中に存在し、アクチビンおよびＧＤＦ８などのそのリガンドへの結合を媒介する。したがって、本発明は、アミノ酸残基に１つまたは複数の変異を含むＡｃｔＲＩＩＢ受容体の変化したリガンド結合ドメイン（例えば、ＧＤＦ８結合ドメイン）を提供する。任意選択的に、変化したリガンド結合ドメインは、ＡｃｔＲＩＩＢ受容体の野生型リガンド結合ドメインと比較してＧＤＦ８などのリガンドに対する選択性を増加させることができる。例えば、これらの変異により、アクチビンよりもＧＤＦ８の変化したリガンド結合ドメインの選択性が増加する。任意選択的に、変化したリガンド結合ドメインについてのアクチビン結合のＫｄのＧＤＦ８結合のＫｄに対する比は、野生型リガンド結合ドメインについての比と比較して少なくとも２、５、１０、またはさらに１００倍である。任意選択的に、変化したリガンド結合ドメインについてのアクチビン阻害のＩＣ５０のＧＤＦ８阻害のＩＣ５０の比は、野生型リガンド結合ドメインと比較して少なくとも２、５、１０、またはさらに１００倍である。任意選択的に、変化したリガンド結合ドメインは、アクチビン阻害についてのＩＣ５０の少なくとも１／２、１／５、１／１０、またはさらに１／１００のＩＣ５０でＧＤＦ８を阻害する。
特定の例として、ＡｃｔＲＩＩＢのリガンド結合ドメインの正電荷のアミノ酸残基Ａｓｐ（Ｄ８０）を、バリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドがＧＤＦ８に優先的に結合するが、アクチビンには結合しないように、異なるアミノ酸残基に変異することができる。好ましくは、Ｄ８０残基を、無電荷アミノ酸残基、負のアミノ酸残基、および疎水性アミノ酸残基からなる群から選択されるアミノ酸残基に変化させる。さらなる特定の例として、疎水性残基Ｌ７９を、酸性アミノ酸であるアスパラギン酸またはグルタミン酸に変化させて、ＧＤＦ１１結合を保持しながらアクチビン結合を非常に減少させることができる。当業者に認識されるように、ほとんどの記載の変異体、バリアント、または修飾物を核酸レベルで作製することができるか、いくつかの場合、翻訳後修飾または化学合成によって作製することができる。かかる技術は、当該分野で周知である。
ある実施形態では、本発明は、ポリペプチドのグリコシル化を変化させるためのＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの特異的変異を意図する。ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド中のグリコシル化部位の例を、図２に示す。かかる変異を、１つまたは複数のグリコシル化部位（Ｏ結合またはＮ結合グリコシル化部位など）を導入または排除するために選択することができる。アスパラギン結合グリコシル化認識部位は、一般に、適切な細胞グリコシル化酵素によって特異的に認識されるトリペプチド配列（アスパラギン−Ｘ−トレオニン（式中、「Ｘ」は任意のアミノ酸である））を含む。野生型ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド配列（Ｏ結合グリコシル化部位のため）に対する１つまたは複数のセリン残基またはトレオニン残基の付加または置換によって変化させることもできる。グリコシル化認識部位の第１または第３のアミノ酸位置の一方または両方の種々のアミノ酸の置換または欠失（および／または第２の位置でのアミノ酸欠失）により、修飾トリペプチド配列でグリコシル化されない。ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド上の炭水化物部分数の別の増加手段は、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドへのグリコシドの化学的または酵素的カップリングによる手段である。使用したカプリング様式に応じて、糖を、（ａ）アルギニンおよびヒスチジン；（ｂ）遊離カルボキシル基；（ｃ）遊離スルフヒドリル基（システインの遊離スルフヒドリル基など）；（ｄ）遊離ヒドロキシル基（セリン、トレオニン、またはヒドロキシプロリンの遊離ヒドロキシル基など）；（ｅ）芳香族残基（フェニルアラニン、チロシン、またはトリプトファンの芳香族残基など）；または（ｆ）グルタミンのアミド基に結合することができる。これらの方法は、１９８７年９月１１日公開のＷＯ８７／０５３３０号およびＡｐｌｉｎおよびＷｒｉｓｔｏｎ（１９８１）ＣＲＣ Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、ｐｐ．２５９−３０６（本明細書中で参考として援用される）に記載されている。ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド上に存在する１つまたは複数の炭水化物部分の除去を、化学的および／または酵素的に行うことができる。化学的脱グリコシル化は、例えば、化合物トリフルオロメタンスルホン酸または等価な化合物へのＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの暴露を含むことができる。この処理により、結合糖（Ｎ−アセチルグルコサミンまたはＮ−アセチルガラクトサミン）以外のほとんどまたは全ての糖が切断される一方で、アミノ酸配列はインタクトなままである。化学的脱グリコシル化は、Ｈａｋｉｍｕｄｄｉｎら（１９８７）Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２５９：５２およびＥｄｇｅら（１９８１）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１８：１３１によってさらに説明されている。ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド上の炭水化物部分の酵素的切断を、Ｔｈｏｔａｋｕｒａら（１９８７）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１３８：３５０に記載のように、種々のエンドグリコシダーゼまたはエクソグリコシダーゼの使用によって行うことができる。哺乳動物細胞、酵母細胞、昆虫細胞、および植物細胞の全てがペプチドのアミノ酸配列に影響を受け得る異なるグリコシル化パターンを導入することができるので、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド配列を、必要に応じて、使用した発現系の型に依存して調整することができる。一般に、ヒトで用いるＡｃｔＲＩＩＢタンパク質を、適切なグリコシル化が得られる哺乳動物細胞株（ＨＥＫ２９３細胞株またはＣＨＯ細胞株など）中で発現するが、他の哺乳動物発現細胞株も同様に有用であると予想される。
この開示は、さらに、バリアント、特に、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの組み合わせバリアント組（任意選択的に、短縮バリアントが含まれる）を生成する方法を意図する。組み合わせ変異体のプールは、機能的バリアント配列の同定に特に有用である。かかる組み合わせライブラリーのスクリーニングの目的は、例えば、変化した薬物動態学または変化したリガンド結合などの変化した性質を有するＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドバリアントを生成することであり得る。種々のスクリーニングアッセイを以下に提供し、かかるアッセイを使用して、バリアントを評価することができる。例えば、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドバリアントを、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドに結合する能力（ＡｃｔＲＩＩＢリガンドのＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドへの結合を防止する能力）についてスクリーニングすることができる。
ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドまたはそのバリアントの活性を、細胞ベースの活性またはｉｎ ｖｉｖｏアッセイで試験することもできる。例えば、骨芽細胞または前駆体中の骨産生に関与する遺伝子発現に及ぼすＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドバリアントの影響を評価することができる。これを、必要に応じて、１つまたは複数の組換えＡｃｔＲＩＩＢリガンドタンパク質（例えば、ＢＭＰ７）の存在下で行うことができ、細胞をトランスフェクトしてＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドおよび／またはそのバリアント、任意選択的にＡｃｔＲＩＩＢリガンドを産生することができる。同様に、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを、マウスまたは他の動物に投与し、密度または体積などの１つまたは複数の骨の性質を評価することができる。骨折の治癒率も評価することができる。同様に、筋肉細胞、脂肪細胞、および神経細胞中のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドまたはそのバリアントの活性を、これらの細胞の成長に及ぼす任意の影響について、例えば、下記のアッセイによって試験することができる。かかるアッセイは当該分野で周知であり、日常的アッセイである。ＳＭＡＤ反応性レポーター遺伝子を、かかる細胞株で使用して、下流シグナル伝達に及ぼう影響をモニタリングすることができる。
天然に存在するＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドと比較して選択能力を有する組み合わせ由来のバリアントを生成することができる。かかるバリアントタンパク質を、組換えＤＮＡ構築物から発現する場合、遺伝子療法プロトコルで使用することができる。同様に、変異誘発により、対応する野生型ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドと劇的に異なる細胞内半減期を有するバリアントが生じ得る。例えば、変化したタンパク質により、未変性のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを破壊するか、そうでなければ、不活化するタンパク質分解または他の過程に対してより安定にするか、不安定にすることができる。かかるバリアントおよびバリアントをコードする遺伝子を使用して、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの半減期の調整によって、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドレベルを変化させることができる。例えば、短い半減期により、より一過性の生物学的影響を得ることができ、誘導性発現系の一部である場合、細胞内の組換えＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドレベルの調節を強化することができる。
ある実施形態では、本発明のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド中に天然に存在する任意のものに加えて、翻訳後修飾をさらに含むことができる。かかる修飾には、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化、およびアシル化が含まれるが、これらに限定されない。結果として、修飾ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、非アミノ酸成分（ポリエチレングリコール、脂質、ポリサッカリドまたはモノサッカリド、およびリン酸塩など）を含むことができる。ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの機能性に及ぼすかかる非アミノ酸成分の影響を、他のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドバリアントについて本明細書中に記載のように試験することができる。ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドをＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの初期の形態の切断によって細胞中に産生する場合、翻訳後プロセシングはまた、本発明のタンパク質の正確な折り畳みおよび／または機能に重要であり得る。異なる細胞（ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、２９３、Ｗ１３８、ＮＩＨ−３Ｔ３、またはＨＥＫ２９３など）は、かかる翻訳後活性の特異的細胞機構および特徴的機構を有し、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの正確な修飾およびプロセシングを確実にするように選択することができる。
ある態様では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの機能的バリアントまたは修飾形態には、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの少なくとも一部および１つまたは複数の融合ドメインを有する融合タンパク質が含まれる。かかる融合ドメインの周知の例には、ポリヒスチジン、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、チオレドキシン、プロテインＡ、プロテインＧ、免疫グロブリン重鎖定常領域（例えば、Ｆｃ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、またはヒト血清アルブミンが含まれるが、これらに限定されない。融合ドメインを、所望の性質が付与されるように選択することができる。例えば、いくつかの融合ドメインは、アフィニティクロマトグラフィによる融合タンパク質の単離に特に有用である。アフィニティ精製のために、アフィニティクロマトグラフィのための関連マトリックス（グルタチオン、アミラーゼ、およびニッケルまたはコバルトに抱合した樹脂など）を使用する。多数のかかるマトリックスは、「キット」形態（（ＨＩＳ６）融合パートナーとともに使用するＰｈａｒｍａｃｉａ ＧＳＴ精製システムおよびＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓ（商標）システム（Ｑｉａｇｅｎ）など）で利用可能である。別の例として、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの検出を容易にするために融合ドメインを選択することができる。かかる検出ドメインの例には、種々の蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ）ならびに特異的抗体が利用可能な通常は短いペプチド配列である「エピトープタグ」が含まれる。特異的モノクローナル抗体が容易に利用可能な周知のエピトープタグには、ＦＬＡＧ、インフルエンザウイルス赤血球凝集素（ＨＡ）、およびｃ−ｍｙｃタグが含まれる。場合によっては、融合ドメインは、第Ｘａ因子またはトロンビンなどのプロテアーゼ切断部位を有する。この部位により、関連プロテアーゼが融合タンパク質を部分的に消化し、それにより、融合タンパク質から組換えタンパク質が遊離する。次いで、その後のクロマトグラフィ分離によって、遊離タンパク質を融合ドメインから単離することができる。ある好ましい実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを、ｉｎ ｖｉｖｏでＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを安定にするドメイン（「安定剤」ドメイン）と融合する。「安定化」は、破壊の減少、腎臓によるクリアランスの減少、または他の薬物動態作用に起因するかどうかと無関係に血清半減期を増加させる全てのものを意味する。免疫グロブリンのＦｃ部分内の融合は、広範なタンパク質に望ましい薬物動態学的性質を付与することが公知である。同様に、ヒト血清アルブミンへの融合により、望ましい性質を付与することができる。選択することができる他の融合ドメイン型には、多量体化（例えば、二量体化、四量体化）ドメインおよび機能的ドメイン（筋肉成長のさらなる刺激などのさらなる生物学的機能を付与する）が含まれる。
特定の例として、本発明は、Ｆｃドメインに融合した細胞外（例えば、ＧＤＦ８結合）ドメイン（例えば、配列番号１３）を含むＧＤＦ８アンタゴニストとしての融合タンパク質を提供する。
好ましくは、Ｆｃドメインは、Ａｓｐ−２６５、リジン３２２、およびＡｓｎ−４３４などの残基に１つまたは複数の変異を有する。ある場合において、１つまたは複数のこれらの変異（例えば、Ａｓｐ−２６５変異）を有する変異Ｆｃドメインにより、野生型Ｆｃドメインと比較してＦｃγ受容体への結合能力が減少した。他の場合、１つまたは複数のこれらの変異（例えば、Ａｓｎ−４３４変異）を有する変異Ｆｃドメインにより、野生型Ｆｃドメインと比較してＭＨＣクラスＩ関連Ｆｃ受容体（ＦｃＲＮ）への結合能力が増加した。
融合タンパク質の異なる要素を所望の機能性と一致する任意の様式で配置することができると理解される。例えば、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを、異種ドメインに対してＣ末端に配置することができるか、異種ドメインをＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドに対してＣ末端に配置することができる。ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドドメインおよび異種ドメインは、融合タンパク質中で隣接する必要はなく、さらなるドメインまたはアミノ酸配列をいずれかのドメインに対してＣ末端またはＮ末端またはドメイン間に含めることができる。
ある実施形態では、本発明のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを安定化することができる１つまたは複数の修飾を含む。例えば、かかる修飾は、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドのｉｎ ｖｉｔｒｏ半減期を増強するか、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの循環半減期を増強するか、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドのタンパク質分解を減少させる。かかる安定化修飾には、融合タンパク質（例えば、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドおよび安定剤ドメインを含む融合タンパク質が含まれる）、グリコシル化部位の修飾（例えば、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドのグリコシル化部位の付加が含まれる）、および炭水化物部分の修飾（例えば、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド由来の炭水化物部分の除去が含まれる）が含まれるが、これらに限定されない。融合タンパク質の場合、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを、ＩｇＧ分子などの安定剤ドメイン（例えば、Ｆｃドメイン）に融合する。本明細書中で使用する場合、用語「安定剤ドメイン」は、融合タンパク質の場合のように融合ドメイン（例えば、Ｆｃ）をいうだけでなく、炭水化物部分などの非タンパク質性修飾またはポリエチレングリコールなどの非タンパク質性ポリマーも含まれる。
ある実施形態では、本発明は、他のタンパク質から単離されているか、他のタンパク質を実質的に含まない単離および／または精製形態のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを利用可能である。
ある実施形態では、本発明のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド（非修飾または修飾）を、種々の当該分野で公知の技術によって産生することができる。例えば、かかるＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを、標準的なタンパク質化学技術（Ｂｏｄａｎｓｋｙ、Ｍ．Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ、Ｂｅｒｌｉｎ（１９９３）およびＧｒａｎｔ Ｇ．Ａ．（編）、Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ
Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａ Ｕｓｅｒ’ｓ Ｇｕｉｄｅ、Ｗ．Ｈ．ＦｒｅｅｍａｎおよいＣｏｍｐａｎｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９２）に記載の技術など）を使用して合成することができる。さらに、自動化ペプチド合成機は市販されている（例えば、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＣｈｅｍＴｅｃｈ Ｍｏｄｅｌ ３９６；Ｍｉｌｌｉｇｅｎ／Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ ９６００）。あるいは、当該分野で周知のとおり、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド、そのフラグメントまたはバリアントを、種々の発現系（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ＣＯＳ細胞、バキュロウイルス）を使用して組換え的に産生することができる（下記も参照のこと）。さらなる実施形態では、修飾または非修飾ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを、例えば、プロテアーゼ（例えば、トリプシン、サーモリシン、キモトリプシン、ペプシン、または対の塩基性アミノ酸変換酵素（ＰＡＣＥ））の使用による天然に存在するか組換え的に産生された全長ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの消化によって産生することができる。コンピュータ分析（市販のソフトウェア（例えば、ＭａｃＶｅｃｔｏｒ、Ｏｍｅｇａ、ＰＣＧｅｎｅ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎ、Ｉｎｃ．））を使用して、タンパク質分解部位を同定することができる。あるいは、かかるＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを、当該分野で公知の標準的技術（化学的切断（例えば、臭化シアン、ヒドロキシルアミン）など）などによって天然に存在するか組換え的に産生された全長ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドから産生することができる。
３．ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドをコードする核酸
ある態様では、本発明は、任意のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド（例えば、可溶性ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド）（本明細書中に開示の任意のバリアントが含まれる）をコードする単離および／または組換え核酸を提供する。例えば、配列番号４は天然に存在するＡｃｔＲＩＩＢ前駆体ポリペプチドをコードし、配列番号３は可溶性ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドをコードする。本核酸は、一本鎖または二本鎖であり得る。かかる核酸は、ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子であり得る。これらの核酸を、例えば、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの作製方法で使用するか、治療薬（例えば、遺伝子療法アプローチで）として直接使用することができる。
ある態様では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドをコードする本核酸は、配列番号３のバリアントである核酸を含むとさらに理解される。バリアントヌクレオチド配列には、１つまたは複数のヌクレオチドの置換、付加、または欠失によって異なる配列（対立遺伝子バリアントなど）が含まれる。したがって、配列番号４中で指定されたコード配列のヌクレオチド配列と異なるコード配列が含まれるであろう。
ある実施形態では、本発明は、配列番号３と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である単離または組換え核酸配列を提供する。当業者は、配列番号３および配列番号３のバリアントに相補的な核酸も本発明の範囲内であると認識するであろう。さらなる実施形態では、本発明の核酸配列は、単離核酸、組換え核酸、および／または異種ヌクレオチド配列と融合された核酸、またはＤＮＡライブラリー中の核酸であり得る。
他の実施形態では、本発明の核酸には、配列番号３中の指定されたヌクレオチド配列、配列番号３の相補配列、またはそのフラグメントに対して高度にストリンジェントな条件下でハイブリッド形成するヌクレオチド配列も含まれる。上記で考察される通り、当業者は、ＤＮＡハイブリッド形成を促進する適切なストリンジェンシー条件を変化させることができると容易に理解するであろう。当業者は、ＤＮＡハイブリッド形成を促進する適切なストリンジェンシー条件を変化させることができると容易に理解するであろう。例えば、約４５℃で６．０×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）でのハイブリッド形成を行い、その後に５０℃の２．０×ＳＳＣで洗浄することができる。例えば、洗浄工程における塩濃度を、５０℃で約２．０×ＳＳＣの低ストリンジェンシーから５０℃で約０．２×ＳＳＣの高ストリンジェンシーまでから選択することができる。さらに、洗浄工程における温度を、室温（約２２℃）での低ストリンジェンシー条件から約６５℃の高ストリンジェンシー条件までに増加させることができる。温度および塩の両方を変化させることができるか、温度または塩濃度を一定に保持しながら、他の変数を変化させることができる。１つの実施形態では、本発明は、室温で６×ＳＳＣの低ストリンジェンシー条件下でハイブリッド形成させ、その後に室温の２×ＳＳＣで洗浄する核酸を提供する。
遺伝コードの縮重によって配列番号３に記載の核酸と異なる単離核酸も本発明の範囲内である。例えば、多数のアミノ酸は、１つを超えるトリプレットによって指定される。同一のアミノ酸または同義語（例えば、ＣＡＵおよびＣＡＣはヒスチジンの同義語である）を特定するコドンにより、タンパク質のアミノ酸配列に影響を及ぼさない「サイレント」変異を得ることができる。しかし、本タンパク質のアミノ酸配列を変化させるＤＮＡ配列多型が哺乳動物細胞間で存在すると予想される。当業者は、天然の対立遺伝子異形に起因する特定のタンパク質をコードする核酸の１つまたは複数のヌクレオチド（ヌクレオチドの約３〜５％まで）のこれらの異形が所与の種の個体間に存在し得ることが認識されるであろう。任意および全てのかかるヌクレオチド異形および得られたアミノ酸多型は、本発明の範囲内である。
ある実施形態では、本発明の組換え核酸を、発現構築物中の１つまたは複数の調節ヌクレオチド配列に作動可能に連結することができる。調節ヌクレオチド配列は、一般に、発現のために使用される宿主細胞に適切であろう。種々の宿主細胞のための多数の適切な発現ベクター型および適切な調節配列型は、当該分野で公知である。典型的には、この１つまたは複数の調節ヌクレオチド配列には、プロモーター配列、リーダー配列またはシグナル配列、リボゾーム結合部位、転写開始配列および転写終結配列、翻訳開始配列および翻訳終結配列、およびエンハンサー配列またはアクチベーター配列が含まれ得るが、これらに限定されない。当該分野で公知の構成性プロモーターまたは誘導性プロモーターは、本発明で意図される。プロモーターは、天然に存在するプロモーターまたは１つを超えるプロモーターの要素を組み合わせたハイブリッドプロモーターのいずれかであり得る。発現構築物は、プラスミドなどのエピソーム上の細胞中に存在することができるか、発現構築物を染色体中に挿入することができる。好ましい実施形態では、発現ベクターは、形質転換された宿主細胞を選択するための選択マーカー遺伝子を含む。選択マーカー遺伝子は当該分野で周知であり、使用される宿主細胞内で変化するであろう。
本発明のある態様では、本核酸を、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドをコードし、少なくとも１つの調節配列に作動可能に連結されたヌクレオチド配列を含む発現ベクター中に提供する。調節配列は当該分野で認識されており、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド発現を指示するように選択される。したがって、用語「調節配列」には、プロモーター、エンハンサー、および他の発現調節要素が含まれる。例示的調節配列は、Ｇｏｅｄｄｅｌ；Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ（１９９０）に記載されている。例えば、作動可能に連結した場合にＤＮＡ配列の発現を調節する任意の広範な種々の発現調節配列をこれらのベクター中で使用して、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を発現することができる。かかる有用な発現調節配列には、例えば、ＳＶ４０の初期および後期プロモーター、ｔｅｔプロモーター、アデノウイルスまたはサイトメガロウイルス最初期プロモーター、ＲＳＶプロモーター、ｌａｃ系、ｔｒｐ系、ＴＡＣまたはＴＲＣ系、その発現がＴ７ ＲＮＡポリメラーゼによって指示されるＴ７プロモーター、λファージの主なオペレーター領域およびプロモーター領域、ｆｄコートタンパク質の調節領域、３−ホスホグリセリン酸キナーゼまたは他の糖分解酵素のプロモーター、酸性ホスファターゼのプロモーター（例えば、Ｐｈｏ５）、酵母α−接合因子のプロモーター、バキュロウイルス系の多面体プロモーター、および原核細胞または真核細胞またはそのウイルスの遺伝子発現を調節することが公知の他の配列、ならびにその種々の組み合わせが含まれる。発現ベクターのデザインが形質転換すべき宿主細胞および／または発現が望まれるタンパク質の型の選択などの要因に依存し得ると理解すべきである。さらに、ベクターのコピー数、コピー数を調節する能力、およびベクターによってコードされる任意の他のタンパク質（抗生物質マーカーなど）の発現も考慮すべきである。
本発明の組換え核酸を、原核細胞、真核細胞（酵母、トリ、昆虫、または哺乳動物）、またはその両方のいずれかでの発現に適切なベクターへのクローン化した遺伝子またはその一部のライゲーションによって産生することができる。組換えＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド産生用の発現ビヒクルには、プラスミドおよび他のベクターが含まれる。例えば、適切なベクターには、以下の型のプラスミドが含まれる：Ｅ．ｃｏｌｉなどの原核細胞中での発現のためのｐＢＲ３２２由来プラスミド、ｐＥＭＢＬ由来プラスミド、ｐＥＸ由来プラスミド、ｐＢＴａｃ由来プラスミド、およびｐＵＣ由来プラスミド。
いくつかの哺乳動物発現ベクターは、細菌中でのベクターの増殖を容易にするための原核生物配列および真核細胞中で発現される１つまたは複数の真核生物転写単位の両方を含む。ｐｃＤＮＡＩ／ａｍｐ、ｐｃＤＮＡＩ／ｎｅｏ、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＳＶ２ｇｐｔ、ｐＳＶ２ｎｅｏ、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ、ｐＴｋ２、ｐＲＳＶｎｅｏ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＴ７、ｐｋｏ−ｎｅｏ、およびｐＨｙｇ由来のベクターは、真核細胞のトランスフェクションに適切な哺乳動物発現ベクターの例である。いくつかのこれらのベクターを、ｐＢＲ３２２などの細菌プラスミド由来の配列で修飾して、原核細胞および真核細胞の両方における複製および薬物耐性選択を容易にする。あるいは、ウシパピローマウイルス（ＢＰＶ−１）またはエプスタイン・バーウイルス（ｐＨＥＢｏ、ｐＲＥＰ由来の、およびｐ２０５）などのウイルス誘導体を、真核細胞中のタンパク質の一過性発現のために使用することができる。他のウイルス（レトロウイルスが含まれる）発現系の例を、以下の遺伝子療法送達系の説明で見出すことができる。プラスミドの調製および宿主生物の形質転換で使用される種々の方法は、当該分野で周知である。原核細胞および真核細胞の両方に適切な他の発現系ならびに一般的な組換え手順いついては、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ
Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ編（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８９）第１６章および第１７章を参照のこと。いくつかの例では、バキュロウイルス発現系の使用によって組換えポリペプチドを発現することが望ましいかも知れない。かかるバキュロウイルス発現系の例には、ｐＶＬ由来ベクター（ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３、およびｐＶＬ９４１など）、ｐＡｃＵＷ由来ベクター（ｐＡｃＵＷ１など）、およびｐＢｌｕｅＢａｃ由来ベクター（β−ｇａｌ含有ｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩなど）が含まれる。
好ましい実施形態では、ＣＨＯ細胞中での本ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの産生のためのベクターをデザインするであろう（Ｐｃｍｖ−Ｓｃｒｉｐｔベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆ．）、ｐｃＤＮＡ４ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．）、およびｐＣＩ−ｎｅｏベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃ．）など）。明らかなように、本遺伝子構築物を使用して培養物中で増殖した細胞中で本ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを発現させて、例えば、タンパク質（精製のための融合タンパク質またはバリアントタンパク質が含まれる）を産生することができる。
本発明はまた、１つまたは複数の本ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドのコード配列（例えば、配列番号４）を含む組換え遺伝子でトランスフェクトした宿主細胞に関する。宿主細胞は、任意の原核細胞または真核細胞であり得る。例えば、本発明のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを、Ｅ．ｃｏｌｉなどの細菌細胞、昆虫細胞（例えば、バキュロウイルス発現系を使用）、酵母、または哺乳動物細胞中で発現することができる。他の適切な宿主細胞は、当業者に公知である。
したがって、本発明は、さらに、本ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの産生方法に関する。例えば、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドをコードする発現ベクターでトランスフェクトした宿主細胞を、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを発現させるのに適切な条件下で培養することができる。ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを分泌させ、細胞とＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを含む培地との混合物から単離することができる。あるいは、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを、細胞質または膜画分中に保持し、細胞を回収し、溶解し、タンパク質を単離することができる。細胞培養物は、宿主細胞、培地、および他の副生成物を含む。細胞培養に適切な培地は、当該分野で周知である。本ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを、タンパク質精製のための当該分野で公知の技術（イオン交換クロマトグラフィ、ゲル濾過クロマトグラフィ、限外濾過、電気泳動、およびＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの特定のエピトープに特異的な抗体を使用した免疫親和性精製が含まれる）を使用して、細胞培養培地、宿主細胞、またはその両方から単離することができる。好ましい実施形態では、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、その精製を容易にするドメインを含む融合タンパク質である。
別の実施形態では、組換えＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの望ましい部分のＮ末端でポリ−（Ｈｉｓ）／エンテロキナーゼ切断部位配列などの精製リーダー配列をコードする融合遺伝子を、Ｎｉ２＋金属樹脂を使用したアフィニティクロマトグラフィによって発現した融合タンパク質を精製することができる。次いで、精製リーダー配列を、エンテロキナーゼでの処理によって除去して、精製ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを得ることができる（例えば、Ｈｏｃｈｕｌｉら、（１９８７）Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ４１１：１７７；およびＪａｎｋｎｅｃｈｔら、ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８８：８９７２を参照のこと）。
融合遺伝子の作製技術は周知である。本質的に、異なるポリペプチド配列をコードする種々のＤＮＡフラグメントの連結を、ライゲーションのための平滑末端またはねじれた末端（ｓｔａｇｇｅｒ−ｅｎｄｅｄ ｔｅｒｍｉｎｉ）、適切な末端を得るための制限酵素消化、必要に応じた付着末端の穴埋め（ｆｉｌｌｉｎｇ−ｉｎ）、望ましくない連結を回避するためのアルカリホスファターゼ処理、および酵素的ライゲーションを使用した従来の技術にしたがって行う。別の実施形態では、融合遺伝子を、従来の技術（自動化ＤＮＡ合成機が含まれる）によって合成することができる。あるいは、遺伝子フラグメントのＰＣＲ増幅をアンカープライマーを使用して実施して２つの連続遺伝子フラグメント間に相補的オーバーハングを得、その後にアニーリングしてキメラ遺伝子配列を生成することができる（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、ｅｄｓ．Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ：１９９２を参照のこと）。
４．抗体
本発明の別の態様は、抗体に関する。ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド（例えば、可溶性ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド）と特異的に反応し、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドと競合的に結合する抗体を、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド活性のアンタゴニストとして使用することができる。例えば、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド由来の免疫原の使用により、抗タンパク質／抗ペプチド抗血清またはモノクローナル抗体を、標準プロトコルによって作製することができる（例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ｅｄ．ｂｙ ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ：１９８８）を参照のこと）。マウス、ハムスター、またはウサギなどの哺乳動物を、免疫原性形態のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド、抗体応答を誘発することができる抗原フラグメント、または融合タンパク質で免疫化することができる。タンパク質またはペプチドに免疫原性を付与する技術には、キャリアへの抱合または当該分野で周知の他の技術が含まれる。アジュバントの存在下でＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの免疫原性部分を投与することができる。免疫化の進行を、血漿または血清中の抗体力価の検出によってモニタリングすることができる。標準ＥＬＩＳＡまたは他の免疫アッセイを抗原としての免疫原と共に使用して、抗体レベルを評価することができる。
ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの免疫原性調製物での動物の免疫化後、抗血清を得ることができ、必要に応じて、ポリクローナル抗体を血清から単離することができる。モノクローナル抗体を産生するために、抗体産生細胞（リンパ球）を免疫化動物から回収し、骨髄腫細胞などの不死化細胞を使用した標準的な体細胞融合手順によって融合して、ハイブリドーマ細胞を得ることができる。かかる技術は当該分野で周知であり、例えば、ハイブリドーマ技術（ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５−４９７によって最初に開発された）、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂａｒら、（１９８３）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ、４：７２）、およびヒトモノクローナル抗体を産生するためのＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら、（１９８５）Ｍｏｎｏｃｌａｏｎａｌ ＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓおよびＣａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ、Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ、Ｉｎｃ．ｐｐ．７７−９６）が含まれる。ハイブリドーマ細胞を、免疫化学的に、かかるハイブリドーマ細胞を含む培養物から単離したＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドおよびモノクローナル抗体と特異的に反応する抗体の産生についてスクリーニングすることができる。
本明細書中で使用される場合、用語「抗体」は、本ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドとも特異的に反応するそのフラグメントが含まれることを意図する。抗体を、従来の技術を使用して断片化し、フラグメントを上記の全抗体と同一の様式で有用性についてスクリーニングすることができる。例えば、Ｆ（ａｂ）２フラグメントを、ペプシンでの抗体の処理によって生成することができる。得られたＦ（ａｂ）２フラグメントを、ジスルフィド架橋を還元するように処理して、Ｆａｂフラグメントを産生することができる。本発明の抗体は、さらに、抗体の少なくとも１つのＣＤＲ領域によって付与されるＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドに対する親和性を有する二重特異性分子、単鎖分子、キメラ分子、およびヒト化分子が含まれることを意図する。好ましい実施形態では、抗体は、さらに、抗体に結合し、検出することができる標識（例えば、標識は、放射性同位体、蛍光化合物、酵素、または酵素補因子であり得る）を含む。
ある好ましい実施形態では、本発明の抗体はモノクローナル抗体であり、ある実施形態では、本発明は新規の抗体生成方法を利用可能にする。例えば、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体の生成方法は、検出可能な免疫応答の刺激に有効なＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを含む一定量の免疫原性組成物をマウスに投与する工程、マウスから抗体産生細胞（例えば、脾臓由来の細胞）を得る工程、抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合して、抗体産生ハイブリドーマを得る工程、および抗体産生ハイブリドーマを試験して、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを同定する工程を含むことができる。一旦得られると、ハイブリドーマを、任意選択的に、ハイブリドーマ由来細胞がＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体を産生する培養条件で、細胞培養物中で増殖させることができる。モノクローナル抗体を、細胞培養物から精製することができる。
抗体に関して使用される場合、形容詞「〜と特異的に反応する」を、当該分野で一般に理解されているように、抗体が目的の抗原（例えば、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド）と目的でない他の抗原との間で十分な選択性を示し、それにより、抗体が最低でも特定の生体サンプル型での目的の抗原の存在の検出に有用であることを意味することを意図する。治療的適応などの抗体を使用したある方法で、結合特異性がより高いことが望ましいかも知れない。モノクローナル抗体は、一般に、所望の抗原と交差反応ポリペプチドとを有効に区別する傾向がより高い（ポリクローナル抗体と比較した場合）。抗体：抗原相互作用の特異性に影響を及ぼす１つの特徴は、抗原に対する抗体の親和性である。所望の特異性を異なる親和性範囲で到達することができるにもかかわらず、一般に好ましい抗体は、約１０−６、１０−７、１０−８、１０−９以下の親和性（解離定数）を有するであろう。
さらに、所望の抗体を同定するために抗体をスクリーニングために使用される技術は、得られた抗体の性質に影響を受け得る。例えば、抗体を溶液中での抗原の結合に使用する場合、溶液結合を試験することが望ましいかもしれない。種々の異なる技術は、特に望ましい抗体を同定するための抗体と抗原との間の相互作用の試験に利用可能である。かかる技術には、ＥＬＩＳＡ、表面プラズモン共鳴結合アッセイ（例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ結合アッセイ、Ｂｉａ−ｃｏｒｅ ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）、サンドイッチアッセイ（例えば、ＩＧＥＮ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｉｎｃ．、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、Ｍｄ．の常磁性ビーズシステム）、ウェスタンブロット、免疫沈降アッセイ、および免疫組織化学が含まれる。
ある態様では、本開示は、可溶性ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドに結合する抗体を提供する。かかる抗体を、抗原として可溶性ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドまたはそのフラグメントを使用して上記のように生成することができる。この抗原型を使用して、例えば、生体サンプル中でＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを検出し、そして／または個体中の可溶性ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドレベルをモニタリングすることができる。ある場合において、可溶性ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドに特異的に結合する抗体を使用して、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドおよび／またはＡｃｔＲＩＩＢリガンドの活性を調整し、それにより、組織（骨、軟骨、筋肉、脂肪、およびニューロンなど）の成長を調節（促進または阻害）することができる。
５．スクリーニングアッセイ
ある態様では、本発明は、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストである化合物（薬剤）を同定するための本ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド（例えば、可溶性ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド）の使用に関する。このスクリーニングによって同定された化合物を、骨、軟骨、筋肉、脂肪、および／またはニューロンなどの組織で試験して、ｉｎ ｖｉｔｒｏで組織成長を調整する能力を評価することができる。任意選択的に、これらの化合物を、動物モデルでさらに試験して、ｉｎ ｖｉｖｏでの組織成長を調整する能力を評価することができる。
ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドのターゲティングによって組織成長を調整する治療薬をスクリーニングするためのアプローチが多数存在する。ある実施形態では、化合物の高処理スクリーニングを行って、骨、軟骨、筋肉、脂肪、および／またはニューロンの成長に及ぼすＡｃｔＲＩＩＢ媒介性の影響を混乱させる薬剤を同定することができる。ある実施形態では、アッセイを行って、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの結合パートナー（ＡｃｔＲＩＩＢリガンド（例えば、アクチビン、Ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ８、ＧＤＦ１１、またはＢＭＰ７）など）への結合を特異的に阻害または減少させる化合物をスクリーニングし、同定する。あるいは、アッセイを使用して、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドのその結合タンパク質（ＡｃｔＲＩＩＢリガンドなど）への結合を増強する化合物を同定することができる。さらなる実施形態では、化合物を、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドと相互作用する能力によって同定することができる。
種々のアッセイ形式で十分であるにもかかわらず、本開示に照らして、本明細書中に明確に記載されていない形式を当業者は理解するであろう。本明細書中に記載されるように、本発明の試験化合物（薬剤）を、任意の組み合わせ化学法によって作製することができる。あるいは、本化合物は、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで合成された天然に存在する生体分子であり得る。組織成長のモジュレーターとして作用する能力について試験すべき化合物（薬剤）を、例えば、細菌、酵母、植物、または他の生物（例えば、天然物）によって産生することができるか、化学的に産生することができるか（例えば、小分子（ペプチド模倣物が含まれる））、組換え的に産生することができる。本発明によって意図される試験化合物には、非ペプチド有機分子、ペプチド、ポリペプチド、ペプチド模倣物、糖、ホルモン、および核酸分子が含まれる。特定の実施形態では、試験薬は、分子量が２，０００ダルトン未満の有機小分子である。
本発明の試験化合物を、単一の個別の実体として提供することができるか、組み合わせ化学などによって作製されたより複雑な物質のライブラリー中に提供することができる。これらのライブラリーは、例えば、アルコール、アルキルハライド、アミン、アミド、エステル、アルデヒド、エーテル、および他のクラスの有機化合物を含むことができる。試験系に対して試験化合物は、特に初期スクリーニング工程で化合物の単離形態または混合物のいずれかとして存在し得る。任意選択的に、化合物を、他の化合物を使用して誘導体化することができ、化合物の単離を容易にする誘導体化基を有する。誘導体化基の非限定的な例には、ビオチン、フルオレセイン、ジゴキシゲニン、緑色蛍光タンパク質、同位体、ポリヒスチジン、磁性ビーズ、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、光活性架橋剤、またはその任意の組み合わせが含まれる。
化合物および天然抽出物のライブラリーを試験する多数の薬物スクリーニングプログラムでは、所与の期間で調査した化合物数を最大にするための高処理アッセイが望ましい。精製または半精製タンパク質などを使用して誘導することができる無細胞系で行うアッセイは、開発が迅速で、試験化合物によって媒介される分子標的の変化を比較的容易に検出することができるという点で、しばしば、「一次」スクリーニングとして好ましい。さらに、試験化合物の細胞毒性または生物学的利用能の影響を、一般に、ｉｎ ｖｉｔｒｏ系では無視することができる。本アッセイは、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドとその結合タンパク質（例えば、ＡｃｔＲＩＩＢリガンド）との間の結合親和性の変化として出現し得るので、その代わりに分子標的に及ぼす薬物の影響について主に注目する。
例示のみのために、本発明の例示的スクリーニングアッセイでは、目的の化合物を、必要に応じてアッセイのために通常はＡｃｔＲＩＩＢリガンドに結合することができる単離および精製されたＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドと接触する。次いで、化合物とＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドとの混合物に、ＡｃｔＲＩＩＢリガンドを含む組成物を添加する。ＡｃｔＲＩＩＢ／ＡｃｔＲＩＩＢリガンド複合体の検出および定量により、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドとその結合タンパク質との間の阻害（または強化）複合体形成での化合物の有効性を決定するための手段が得られる。化合物の有効性を、種々の濃度の試験化合物を使用して得たデータからの用量応答曲線の作成によって評価することができる。さらに、比較のためのベースラインを得るためのコントロールアッセイも行うことができる。例えば、コントロールアッセイでは、単離および精製ＡｃｔＲＩＩＢリガンドをＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを含む組成物に添加し、ＡｃｔＲＩＩＢ／ＡｃｔＲＩＩＢリガンド複合体の形成を試験化合物の非存在下で定量する。一般に、反応物を混合することができる順番を変化させることができ、同時に混合物ことができると理解されるであろう。さらに、精製タンパク質の代わりに、細胞抽出物および溶解物を使用して、無細胞アッセイ系を適切にすることができる。
ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドとその結合タンパク質との間の複合体形成を、種々の技術によって検出することができる。例えば、複合体形成の調整を、例えば、検出可能に標識されたタンパク質（放射性標識（例えば、３２Ｐ、３５Ｓ、１４Ｃ、または３Ｈ）、蛍光標識（例えば、ＦＩＴＣ）、または酵素的に標識したＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドまたはその結合タンパク質など）を使用するか、免疫アッセイ、またはクロマトグラフィ検出によって定量することができる。
ある実施形態では、本発明は、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドとその結合タンパク質との間の相互作用の程度の直接または間接的な測定における蛍光偏光アッセイおよび蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）アッセイの使用を意図する。さらに、他の検出様式（光導波路（ＰＣＴ公開ＷＯ９６／２６４３２号および米国特許第５，６７７，１９６号）、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、表面電荷センサー、および表面力センサーに基づいた検出様式など）は、本発明の多数の実施形態と適合可能である。
さらに、本発明は、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドとその結合タンパク質との間の相互作用を破壊または強化する薬剤の同定のための「２ハイブリッドアッセイ」としても公知の相互作用捕捉アッセイの使用を意図する。例えば、米国特許第５，２８３，３１７号；Ｚｅｒｖｏｓら（１９９３）Ｃｅｌｌ ７２：２２３−２３２；Ｍａｄｕｒａら（１９９３）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６８：１２０４６−１２０５４；Ｂａｒｔｅｌら（１９９３）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １４：９２０−９２４；およびＩｗａｂｕｃｈｉら（１９９３）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ８：１６９３−１６９６を参照のこと）。特定の実施形態では、本発明は、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドとその結合タンパク質との間の相互作用を絶つ化合物（例えば、小分子またはペプチド）を同定するための逆２ハイブリッド系の使用を意図する。例えば、ＶｉｄａｌおよびＬｅｇｒａｉｎ、（１９９９）Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２７：９１９−２９；ＶｉｄａｌおよびＬｅｇｒａｉｎ、（１９９９）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １７：３７４−８１；および米国特許第５，５２５，４９０号；同第５，９５５，２８０号；および同第５，９６５，３６８号を参照のこと。
ある実施形態では、本化合物を、本発明のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドと相互作用する能力によって同定する。化合物とＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドとの間の相互作用は、共有結合または非共有結合であり得る。例えば、かかる相互作用を、ｉｎ ｖｉｔｒｏ生化学法（光架橋、放射性標識リガンド結合、およびアフィニティクロマトグラフィ（Ｊａｋｏｂｙ Ｗ Ｂら、１９７４、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ４６：１）が含まれる）を使用してタンパク質レベルで同定することができる。ある場合において、化合物を、機構ベースのアッセイ（ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドに結合する化合物を検出するためのアッセイなど）でスクリーニングすることができる。これには、固相または液相の結合事象が含まれ得る。あるいは、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドをコードする遺伝子を、細胞内にレポーター系（例えば、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、または緑色蛍光タンパク質）でトランスフェクトし、好ましくは高処理スクリーニングによってライブラリーに対してスクリーニングするか、ライブラリーの個別のメンバーに対してスクリーニングすることができる。他の機構ベースの結合アッセイを使用することができる（例えば、自由エネルギーの変化を検出する結合アッセイ）。結合アッセイを、ウェル、ビーズ、またはチップに固定しているか、固定抗体によって捕捉されているか、キャピラリー電気泳動によって分離した標的を使用して行うことができる。結合した化合物を、通常、比色分析、蛍光、または表面プラズモン共鳴を使用して検出することができる。
ある態様では、本発明は、例えば、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドおよび／またはＡｃｔＲＩＩＢリガンドの機能の拮抗によって筋肉成長を刺激して筋肉量を増加させる方法および薬剤を提供する。したがって、同定した任意の化合物を、細胞全体または組織中にてｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで試験して、筋肉成長を調整する能力を確認することができる。当該分野で公知の種々の方法を、この目的のために使用することができる。例えば、ＡｃｔＲＩＩＢリガンド（例えば、ＧＤＦ８）への結合によって活性化されたＡｃｔＲＩＩＢタンパク質によるシグナル伝達が減少または阻害されるように本発明の方法を行う。生物中での筋肉組織の成長によってＡｃｔＲＩＩＢタンパク質によるシグナル伝達があまり達成されない対応する生物（または生物集団）の筋肉量と比較して生物中の筋肉量が増加することが認識されるであろう。
例えば、筋肉細胞の成長／増殖に及ぼすＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドまたは試験化合物の影響を、筋原細胞の増殖に関連するＰａｘ−３およびＭｙｆ−５の遺伝子発現ならびに筋肉分化に関連するＭｙｏＤの遺伝子発現の測定によって決定することができる（例えば、Ａｍｔｈｏｒら、Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ．２００２、２５１：２４１−５７）。ＧＤＦ８がＰａｘ−３およびＭｙｆ−５の遺伝子発現を下方制御し、ＭｙｏＤの遺伝子発現を防止することが公知である。ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドまたは試験化合物は、ＧＤＦ８のこの活性を拮抗すると予想される。細胞ベースのアッセイの別の例には、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドまたは試験化合物の存在下での筋芽細胞（Ｃ（２）Ｃ（１２）筋芽細胞など）の増殖の測定が含まれる（例えば、Ｔｈｏｍａｓら、Ｊ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２０００、２７５：４０２３５−４３）。
本発明はまた、筋肉の量および強度を測定するためのｉｎ ｖｉｖｏアッセイを意図する。例えば、Ｗｈｉｔｔｅｍｏｒｅら（Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ．２００３、３００：９６５−７１）は、マウスの骨格筋量の増加および握力の増加の測定方法を開示している。任意選択的に、本方法を使用して、筋肉の疾患または容態（例えば、筋肉量が制限される疾患）に及ぼす試験化合物（例えば、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド）の治療効果を決定することができる。
ある態様では、本発明は、骨形成の調整（刺激または阻害）および骨量の増加のための方法および薬剤を提供する。したがって、同定された任意の化合物を、細胞全体または組織中にてｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで試験して、骨または軟骨の成長を調整する能力を確認することができる。当該分野で公知の種々の方法を、この目的のために使用することができる。
例えば、骨または軟骨の成長に及ぼすＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドまたは試験化合物の影響を、細胞ベースアッセイにおけるＭｓｘ２の誘導または骨前駆細胞の骨芽細胞への分化の測定によって決定することができる（例えば、Ｄａｌｕｉｓｋｉら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２００１、２７（１）：８４−８；Ｈｉｎｏら、Ｆｒｏｎｔ Ｂｉｏｓｃｉ．２００４、９：１５２０−９を参照のこと）。細胞ベースのアッセイの別の例には、間葉系前駆細胞および骨芽細胞中の本ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドおよび試験化合物の骨形成活性の分析が含まれる。例示するために、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２多能性間葉系前駆細胞、Ｃ２Ｃ１２前造骨性細胞、およびＴＥ−８５骨芽細胞に感染させるためのＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを発現する組換えアデノウイルスを構築した。次いで、骨形成活性を、アルカリホスファターゼ、オステオカルシン、基質ミネラル化の誘導の測定によって決定する（例えば、Ｃｈｅｎｇら、Ｊ ｂｏｎｅ Ｊｏｉｎｔ Ｓｕｒｇ Ａｍ．２００３、８５−Ａ（８）：１５４４−５２を参照のこと）。
本発明はまた、骨または軟骨の成長を測定するためのｉｎ ｖｉｖｏアッセイを意図する。例えば、Ｎａｍｋｕｎｇ−Ｍａｔｔｈａｉら、Ｂｏｎｅ、２８：８０−８６（２００１）は、骨折後初期の骨修復を研究するラット骨粗鬆症モデルを開示する。Ｋｕｂｏら、Ｓｔｅｒｏｉｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、６８：１９７−２０２（１９９９）はまた、骨折後後期の骨修復を研究するラット骨粗鬆症モデルを開示する。これらの文献は、骨粗鬆症性骨折研究に関するラットモデルの開示についてその全体が本明細書中で参考として援用される。ある態様では、本発明は、当該分野で公知の骨折治癒アッセイを使用する。これらのアッセイには、骨折技術、組織学的分析、および生化学的分析が含まれ、これらは、例えば、米国特許第６，５２１，７５０号（骨折の原因、骨折範囲の測定、および治癒過程のための実験プロトコルの開示についてその全体が参考として援用される）に記載されている。
ある態様では、本発明は、体重増加および肥満を調節するための方法および薬剤を提供する。細胞レベルで、脂肪細胞の増殖および分化は、肥満発症に極めて重要であり、さらなる脂肪細胞（脂肪細胞）を生成させる。したがって、同定した任意の化合物を、細胞全体または組織中にてｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで試験して、脂肪細胞の増殖または分化の測定によって脂質生成を調整する能力を確認することができる。当該分野で公知の種々の方法を、この目的のために使用することができる。例えば、脂質生成に及ぼすＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド（例えば、可溶性ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド）または試験化合物の影響を、細胞ベースのアッセイにおける３Ｔ３−Ｌ１前脂肪細胞の成熟脂肪細胞の分化の測定（Ｏｉｌ Ｒｅｄ Ｏ染色ビヒクル中のトリアシルグリセロールの蓄積の観察およびＦＡＢＰ（ａＰ２／４２２）およびＰＰＡＲγ２などのある脂肪細胞マーカーの出現など）によって決定することができる。例えば、Ｒｅｕｓｃｈら、２０００、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２０：１００８−２０；Ｄｅｎｇら、２０００、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ．１４１：２３７０−６；Ｂｅｌｌら、２０００、Ｏｂｅｓ Ｒｅｓ．８：２４９−５４を参照のこと。細胞ベースのアッセイの別の例には、ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）陽性細胞のモニタリングなどによる脂肪細胞または脂肪細胞前駆細胞（例えば、３Ｔ３−Ｌ１細胞）の増殖におけるＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドおよび試験化合物の役割の分析が含まれる。例えば、Ｐｉｃｏら、１９９８、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８９：１−７；Ｍａｓｕｎｏら、２００３、Ｔｏｘｉｃｏｌ Ｓｃｉ．７５：３１４−２０を参照のこと。
本発明のスクリーニングアッセイは、本ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドおよびＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドのバリアントだけでなく、任意の試験化合物（ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドのアゴニストおよびアンタゴニストが含まれる）にも適用されると理解される。さらに、これらのスクリーニングアッセイは、薬物標的の検証および品質管理に有用である。
６．治療への使用例
ある実施形態では、本発明の組成物（例えば、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド）を、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドおよび／またはＡｃｔＲＩＩＢリガンド（例えば、ＧＤＦ８）の異常な活性に関連する疾患または容態の治療または防止のために使用することができる。これらの疾患、障害、または容態を、本明細書中で一般に、「ＡｃｔＲＩＩＢ関連容態」という。ある実施形態では、本発明は、治療有効量の上記ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを個体に投与することによって必要とする個体を治療または防止する方法を提供する。これらの方法は、特に、動物、より詳細にはヒトの治療的処置および予防的処置を目的とする。
本明細書中で使用する場合、障害または容態を「防止する」処置は、統計サンプルにおいて、未処置コントロールサンプルと比較して処置サンプルにおける障害または容態の発症を軽減するか、未処置コントロールサンプルと比較して障害または容態の１つまたは複数の症状の発症を遅延させるか重症度を低下させる化合物をいう。本明細書中で使用する場合、用語「治療」には、指定の容態の予防または一旦確立された容態の改善または消失が含まれる。
ＡｃｔＲＩＩＢ／ＡｃｔＲＩＩＢリガンド複合体は、組織成長および初期発生過程（種々の構造正確な形成など）または１つまたは複数の発生後能力（性的発育、下垂体ホルモン産生、ならびに骨および軟骨の作製が含まれる）で不可欠な役割を果たす。したがって、ＡｃｔＲＩＩＢ関連容態には、異常な組織成長および発育障害が含まれる。さらに、ＡｃｔＲＩＩＢ関連容態には、炎症、アレルギー、自己免疫疾患、感染症、および腫瘍などの細胞の成長および分化の障害が含まれるが、これらに限定されない。
例示的ＡｃｔＲＩＩＢ関連容態には、神経筋障害（例えば、筋ジストロフィおよび筋萎縮）、鬱血性閉塞性肺疾患（およびＣＯＰＤに関連する筋肉消耗）、筋肉消耗症候群、サルコペニア、悪液質、脂肪組織障害（例えば、肥満）、２型糖尿病、および骨変性疾患（例えば、骨粗鬆症）が含まれる。他の例示的ＡｃｔＲＩＩＢ関連容態には、筋肉変性障害および神経筋障害、組織修復（例えば、創傷治癒）、神経変性疾患（例えば、筋萎縮性側索硬化症）、免疫学的障害（例えば、リンパ球の異常な増殖または機能に関連する障害）、ならびに肥満、または脂肪細胞の異常な増殖に関連する障害が含まれる。
ある実施形態では、本発明の組成物（例えば、可溶性ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド）を、筋ジストロフィ治療の一部として使用する。用語「筋ジストロフィ」は、骨格筋ならびに時折心筋および呼吸筋の段階的脆弱および悪化によって特徴づけられる変性筋疾患群をいう。筋ジストロフィは、筋肉の微視的変化から開始される進行性の筋肉の消耗および脆弱によって特徴づけられる全身障害である。筋肉が長期にわたって変性するにつれて、ヒトの筋肉の強度が減少する。本ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを含むレジメンを使用して治療することができる例示的筋ジストロフィには、ディシュンヌ型筋ジストロフィ（ＤＭＤ）、ベッカー型筋ジストロフィ（ＢＭＤ）、エメリ・ドレフュシュ型筋ジストロフィ（ＥＤＭＤ）、肢帯型筋ジストロフィ（ＬＧＭＤ）、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィ（ＦＳＨまたはＦＳＨＤ）（ランドゥジー・デジュリン型としても公知）、筋緊張性筋ジストロフィ（ＭＭＤ）（シュタイネルト病としても公知）、眼咽頭型筋ジストロフィ（ＯＰＭＤ）、遠位型筋ジストロフィ（ＤＤ）、先天性筋ジストロフィ（ＣＭＤ）が含まれる。
ディシュンヌ型筋ジストロフィ（ＤＭＤ）は、１８６０年代に、フランス人神経学者Ｇｕｉｌｌａｕｍｅ Ｂｅｎｊａｍｉｎ Ａｍａｎｄ Ｄｕｃｈｅｎｎｅによって最初に記載された。ベッカー型筋ジストロフィ（ＢＭＤ）は、１９５０年代にＤＭＤのこのバリアントを最初に記載したゲルマン人医師Ｐｅｔｅｒ Ｅｍｉｌ Ｂｅｃｋｅｒの名をとって命名されている。ＤＭＤは、少年３５００人に１人が罹患する最も頻繁な遺伝病の１つである。ＤＭＤは、Ｘ染色体の短腕に存在するジストロフィン遺伝子が破壊した場合に発症する。男性のみが１コピーのＸ染色体を保有するので、男性は１コピーのジストロフィン遺伝子のみを有する。ジストロフィンタンパク質がなければ、筋肉は、収縮および弛緩サイクル中に容易に損傷する。疾患初期では筋肉は再生によって補われるが、後期では筋前駆細胞が持続する損傷に対応することができず、健康な筋肉が非機能性線維脂肪組織に置換される。
ＢＭＤは、ジストロフィン遺伝子の異なる変異に起因する。ＢＭＤ患者は、いくつかのジストロフィンを有するが、量または質のいずれかが不十分である。いくつかのジストロフィンを有することにより、ＢＭＤ患者の筋肉がＤＭＤ患者と同様の悪性度または速度での変性から防御される。
例えば、最近の研究により、ｉｎ ｖｉｖｏでのＧＤＦ８（ＡｃｔＲＩＩＢリガンド）機能の遮断または消失がＤＭＤおよびＢＭＤ患者における少なくとも一定の症状を有効に治療することができることが証明されている。したがって、本ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドはＧＤＦ８インヒビター（アンタゴニスト）として作用することができ、ＤＭＤおよびＢＭＤ患者におけるｉｎ ｖｉｖｏでのＧＤＦ８および／またはＡｃｔＲＩＩＢの機能の別の遮断手段を構成する。このアプローチは本明細書中に示すデータによって確認および支持され、それにより、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃタンパク質は、筋ジストロフィのマウスモデルの筋肉量を増加させることを示した。
同様に、本ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、筋肉成長が必要な他の病状で筋肉量を増加させるための有効な手段を提供する。例えば、ルー・ゲーリック病（運動ニューロン疾患）とも呼ばれるＡＬＳは、運動ニューロン（脳を骨格筋に連結するＣＮＳの成分）を攻撃する慢性で不治の抑制できないＣＮＳ障害である。ＡＬＳでは、運動ニューロンが悪化し、最終的に死滅し、患者の脳は通常は完全な機能および警告を保持するにもかかわらず、移動の指令は決して筋肉に到達しない。ほとんどのＡＬＳ患者は、４０歳と７０歳との間である。弱った第１の運動ニューロンは、腕または脚に至るものである。ＡＬＳ患者は、歩行が困難であり得、物を落し得、倒れ、ろれつが回らず、笑いまたは叫び声を制御できない。最終的には、四肢中の筋肉が不使用から萎縮し始める。この筋力低下によって脆弱化するようになり、患者は車いすを必要とするか、ベッドから起き上がることができなくなる。ほとんどのＡＬＳ患者は、呼吸不全または肺炎のような喚起補助の合併症によって疾患発症から３〜５年で死亡する。このアプローチは本明細書中に示すデータによって確認および支持され、それにより、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃタンパク質は、ＡＬＳのマウスモデルの外観、筋肉量、および寿命を改善することが示された。
ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド誘導性の筋肉量の増加は、筋肉消耗疾患を罹患した患者にも有利であり得る。Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ｃａｄａｖｉｄら（前出）は、ＧＤＦ８発現がヒトの除脂肪量と逆に相関し、ＧＤＦ８遺伝子の発現の増加がＡＩＤＳ消耗症候群の男性の体重減少に関連すると報告した。ＡＩＤＳ患者におけるＧＤＦ８機能の阻害により、完全に消失しない場合、ＡＩＤＳの少なくとも一定の症状を緩和することができ、したがって、ＡＩＤＳ患者の生活の質を有意に改善することができる。
ＧＤＦ８（ＡｃｔＲＩＩＢリガンド）機能の喪失も栄養摂取を減少することのない脂肪喪失に関連するので（Ｚｉｍｍｅｒｓら、前出；ＭｃＰｈｅｒｒｏｎおよびＬｅｅ、前出）、本ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを、肥満およびＩＩ型糖尿病の発症を遅延または防止するための治療薬としてさらに使用することができる。このアプローチは本明細書中に示すデータによって確認および支持され、それにより、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃタンパク質は、肥満マウスの代謝状態を改善することを示した。
癌食欲不振−悪液質症候群は、癌の最も衰弱性で致命的な態様である。癌食欲不振−悪液質症候群における進行性体重減少は、多数の癌型の共通の特徴であり、生活の質および化学療法に対する応答が不良なだけでなく、体重減少を伴わない類似の腫瘍患者で見出される生存期間よりも生存期間が短い。食欲不振、脂肪および筋肉組織の消耗、心理的苦痛、およびより低い生活の質に関連して、悪液質は、癌と宿主との間の複雑な相互作用から生じる。悪液質は癌患者の間で最も一般的な死因の１つであり、死因の８０％を占める。悪液質は、タンパク質、炭水化物、および脂肪の代謝をもたらす代謝カオスの複雑な例である。腫瘍は、直接または間接的な異常の両方を生じ、それにより、食欲不振および体重増加が生じる。現在、この過程を調節または逆転するための治療は存在しない。癌食欲不振−悪液質症候群は、サイトカイン産生、脂質流動化因子およびタンパク質分解誘導因子の放出、ならびに中間代謝の変化をもたらす。食欲不振が一般的であるにもかかわらず、食物摂取の減少のみでは癌患者の身体組成の変化を説明することができず、栄養摂取の増加によって消耗症候群を逆転することはできない。発症前の体重の５％を超える無意識の体重減少が６ヶ月以内に起こる場合、癌患者の悪液質を疑うべきである。
成体マウスにおけるＧＤＦ８の全身過剰発現がヒト悪液質症候群で認められるものと類似の最重度の筋肉および脂肪の減少を誘導することが見出されていたので（Ｚｉｍｍｅｒｓら、前出）、筋肉成長が望ましい場合、薬学的組成物としての本ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを有利に使用して、悪液質症候群の症状を防止、治療、または改善することができる。
他の実施形態では、本発明は、骨および／または軟骨形成の誘導、骨減少の防止、骨ミネラル化の増加、または骨脱ミネラル化の防止を行う方法を提供する。例えば、本発明で同定された本ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドおよび化合物を、ヒトおよび他の動物における骨粗鬆症の治療ならびに骨折および軟骨欠損の治癒で適用する。ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、骨粗鬆症発症に対する防御的測定としての無症候性低尾骨密度を用いて診断された患者で有用であり得る。
１つの特定の実施形態では、本発明の方法および組成物は、ヒトおよび他の動物における骨折および軟骨欠損の治癒で医学的に使用することができる。本方法および組成物はまた、本方法および組成物は、閉鎖骨折および開放骨折の軽減で予防的に使用することもでき、人工関節固定の改善で使用することもできる。骨形成薬によって誘導されたｄｅ ｎｏｖｏ骨形成は、先天性、外傷誘導性、または腫瘍切除誘導性頭蓋顔面欠損の修復に寄与し、美容成形手術でも有用である。さらに、本発明の方法および組成物を、歯周疾患の治療および他の歯の修復過程で使用することができる。ある場合において、本ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、骨形成細胞を誘引し、骨形成細胞の成長を刺激し、骨形成細胞前駆体の分化を誘導するための環境を提供することができる。本発明のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドはまた、骨粗鬆症治療で有用であり得る。さらに、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを、軟骨欠損の修復および変形性関節症の防止／逆転で使用することができる。
別の特定の実施形態では、本発明は、軟骨および／または骨欠損または歯周疾患に関連する骨折および他の容態のための治療方法および組成物を提供する。本発明は、さらに、創傷治癒および組織修復のための治療方法および組成物を提供する。創傷型には、熱傷、切創、および潰瘍が含まれるが、これらに限定されない。例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ８４／０１１０６号を参照のこと。かかる組成物は、薬学的に許容可能なビヒクル、キャリア、またはマトリックスと混合した治療有効量の少なくとも１つの本発明のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを含む。
別の特定の実施形態では、本発明の方法および組成物を、骨粗鬆症、副甲状腺機能亢進症、クッシング病、甲状腺中毒症、慢性下痢状態または吸収不良、細尿管性アシドーシス、または神経性食欲不振などの骨減少を生じる容態に適用することができる。女性であること、低体重であること、および座りがちな生活様式を招いていることが骨粗鬆症（骨折の危険につながる骨密度の喪失）の危険因子であることが広く知られている。しかし、骨粗鬆症はまた、一定の薬物の長期使用に起因し得る。薬物または別の病状に起因する骨粗鬆症は、続発性骨粗鬆症として公知である。クッシング病として公知の病状では、体内で産生された過剰量のコルチゾールにより、骨粗鬆症および骨折を引き起こす。続発性骨粗鬆症に関連する最も一般的な薬物は、コルチコステロイド（コルチゾールの用に作用する薬物クラスであって、副腎によって天然に産生されるホルモン）である。適切なレベルの甲状腺ホルモン（甲状腺によって産生される）が骨格の発達に必要であるにもかかわらず、過剰な甲状腺ホルモンは、長期にわたって骨量を減少させ得る。アルミニウムを含む制酸薬は、腎臓に問題のある患者、特に、透析を受けている患者が高用量の薬物を投与されている場合に骨減少を引き起こし得る。続発性骨粗鬆症を引き起こし得る他の薬物には、癲癇を予防するために使用されるフェニトイン（ジランチン）およびバルビツール酸塩；メトトレキサート（Ｒｈｅｕｍａｔｒｅｘ、Ｉｍｍｕｎｅｘ、Ｆｏｌｅｘ ＰＦＳ）、関節炎、癌、および免疫障害のいくつかの型のための薬物；シクロスポリン（Ｓａｎｄｉｍｍｕｎｅ、Ｎｅｏｒａｌ）、臓器移植患者におけるいくつかの自己免疫疾患を治療し、免疫系を抑制するために使用される薬物；前立腺癌および子宮内膜癌を治療するために使用される黄体形成ホルモン放出ホルモンアゴニスト（Ｌｕｐｒｏｎ、Ｚｏｌａｄｅｘ）；ヘパリン（Ｃａｌｃｉｐａｒｉｎｅ、Ｌｉｑｕａｅｍｉｎ）、抗凝固薬；ならびに高コレステロールを治療するために使用されるコレスチラミン（Ｑｕｅｓｔｒａｎ）およびコレスチポール（Ｃｏｌｅｓｔｉｄ）が含まれる。歯周病により、骨減少が引き起こされる。これは、口内のこれらの有害な細菌により、身体が細菌に対する防御を強いられるからである。細菌は、ガムライン下に毒素および酵素を産生し、慢性感染症を引き起こす。
さらなる実施形態では、本発明は、異常なまたは望ましくない骨成長に関連する疾患または障害の治療方法および治療薬を提供する。例えば、進行性骨化性線維異形成（ＦＯＰ）として公知の疾患を有する患者は、任意の運動を妨害する「第２の骨格」を成長させる。さらに、股関節置換手術後に異常な骨成長が起こり得るので、手術結果が台無しになる。これは、本方法および組成物が治療的に有用であり得る病理学的骨成長および状況のより一般的な例である。同一の方法および組成物は、異常な骨成長の他の形態（例えば、外傷、熱傷、または脊髄損傷後の病理学的骨成長）の治療および転移性の前立腺癌または骨肉種に関連して認められる異常な骨成長に関連する望ましくない容態の治療または防止にも有用であり得る。これらの治療薬の例には、ＡｃｔＲＩＩＢリガンド（例えば、ＢＭＰ７）の機能を拮抗するＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド、ＡｃｔＲＩＩＢとそのリガンド（例えば、ＢＭＰ７）との間の相互作用を破壊する化合物、およびＡｃｔＲＩＩＢリガンド（例えば、ＢＭＰ７）がＡｃｔＲＩＩＢ受容体に結合できないようにＡｃｔＲＩＩＢ受容体に特異的に結合する抗体が含まれるが、これらに限定されない。
他の実施形態では、本発明は、動物の体脂肪含有量の調節および体脂肪含有量に関連する容態、特に、体脂肪含有量に関連する健康を脅かす容態の治療または防止のための組成物および方法を提供する。本発明によれば、「体重を制御（調節）する」は、体重の減少または増加、体重増加率の減少または増加、または体重減少率の増加または減少をいうことができ、（例えば、体重を増加または減少させ得る外部または内部の影響に対して）体重の積極的な維持または体重を有意に変化させないことも含まれる。本発明の１つの実施形態は、必要とする動物（例えば、ヒト）へのＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの投与による体重の制御に関する。
１つの特定の実施形態では、本発明は、動物における体重の減少および／または体重増加の減少ならびに、より詳細には、肥満のリスクがあるか罹患している患者の肥満の治療または改善のための方法および化合物に関する。別の特定の実施形態では、本発明は、体重を増加または維持できない動物（例えば、消耗症候群を罹患した動物）の治療のための方法および化合物に関する。かかる方法は、体重および／または質量の増加、体重および／または質量の減少、または望ましくなく（例えば、不健康に）低い体重および／または質量に関連するか起因する容態の改善に有効である。
ＡｃｔＲＩＩＢタンパク質を使用して治療することができる他の障害（高コレステロールが含まれる）を、実施例に記載している。
７．薬学的組成物
ある実施形態では、本発明の化合物（例えば、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド）を、薬学的に許容可能なキャリアを使用して処方する。例えば、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを、単独で投与するか、薬学的処方物（治療組成物）の成分として投与することができる。本化合物を、ヒトまたは脊椎動物の薬物で用いる任意の都合の良い方法での投与のために処方することができる。
ある実施形態では、本発明の治療方法は、組成物を局所、全身、または移植片もしくはデバイスとして局部に投与する工程を含む。投与する場合、本発明で使用する治療組成物は、勿論、発熱物質を含まない生理学的に許容可能な形態である。さらに、組成物を、望ましくは、標的組織部位（例えば、骨、軟骨、筋肉、脂肪、またはニューロン）（例えば、組織損傷を有する部位）への送達のための種々の形態でカプセル化または注射することができる。局所投与は、創傷治癒および組織修復に適切であり得る。任意選択的に上記組成物中に含めることもできるＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド以外の治療に有用な薬剤を、二者択一的または付加的に、本発明の方法において本化合物（例えば、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド）と同時または連続的に投与することができる。
ある実施形態では、本発明の組成物は、１つまたは複数の治療化合物（例えば、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド）を標的組織部位に送達させて発生中の組成物の構造を得ることができ、任意選択的に身体に再吸収することができるマトリックスを含むことができる。例えば、マトリックスにより、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの放出を遅延させることができる。かかるマトリックスを、現在他の医学的に移植で使用される材料から形成することができる。
マトリックス材料の選択は、生体適合性、生分解性、機械的性質、美容的外観、および界面特性に基づく。本組成物の特定の適用により、適切な処方物が明らかになるであろう。組成物の潜在的なマトリックスは、生分解性で化学的に定義された硫酸カルシウム、第三リン酸カルシウム、ヒドロキシアパタイト、ポリ乳酸、およびポリ酸無水物であり得る。他の潜在的な材料は、生分解性であり、且つ生物学的に十分に定義されている骨または皮膚コラーゲンなどである。さらなるマトリックスは、純粋なタンパク質または細胞外基質成分から構成される。他の潜在的なマトリックスは、非生分解性であり、且つ化学的に定義された焼結ヒドロキシアパタイト、バイオガラス、アルミナート、または他のセラミックスなどである。マトリックスは、任意の上記の材料型の組み合わせ（ポリ乳酸およびヒドロキシアパタイトまたはコラーゲンおよび第三リン酸カルシウムなど）から構成され得る。バイオセラミックスを組成物中で変化させ（カルシウム−アルミナート−ホスファートなど）、処理して孔径、粒子サイズ、粒子の形状、および生分解性を変化させることができる。
ある実施形態では、本発明の方法を、例えば、有効成分として所定量の薬剤をそれぞれ含むカプセル、カシェ、丸薬、錠剤、ロゼンジ（風味をつけた基剤、通常、スクロースおよびアカシアまたはトラガカントを使用）、粉末、顆粒、水性または非水性の溶液または懸濁液、水中油滴型または油中水滴型乳濁液、エリキシルまたはシロップ、香剤（ゼラチンおよびグリセリン、またはスクロースおよびアカシアなどの不活性基剤を使用）、および／または含嗽剤などの形態で経口投与することができる。薬剤を、ボーラス、舐剤、またはペーストとして投与することもできる。
経口投与のための固体投薬形態（カプセル、錠剤、丸薬、糖衣錠、粉末、および顆粒など）では、１つまたは複数の本発明の治療化合物を、１つまたは複数の薬学的に許容可能なキャリア（クエン酸ナトリウムまたは第二リン酸カルシウムなど）および／または任意の以下と混合することができる：（１）充填剤または増量剤（デンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール、および／またはケイ酸など）；（２）結合剤（例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロース、および／またはアカシアなど）；（３）保湿剤（グリセロールなど）；（４）崩壊剤（寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモデンプンまたはタピオカデンプン、アルギン酸、一定の径酸塩、および炭酸ナトリウムなど）；（５）溶解遅延剤（パラフィンなど）；（６）吸収促進剤（第四級アンモニウム化合物など）；（７）湿潤剤（例えば、セチルアルコールおよびモノステアリン酸グリセロールなど）；（８）吸収剤（カオリンおよびベントナイトクレイなど）；（９）潤滑剤（タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、およびその混合物など）；および（１０）着色剤。カプセル、錠剤、および丸薬の場合、薬学的組成物は緩衝剤も含むことができる。類似の型の固体組成物を、ラクトースまたは乳糖および高分子量ポリエチレングリコールなどの賦形剤を使用して、軟および硬ゼラチンカプセル中の充填剤として使用することもできる。
経口投与のための液体投薬形態には、薬学的に許容可能な乳濁液、マイクロエマルジョン、溶液、懸濁液、シロップ、およびエリキシルが含まれる。有効成分に加えて、液体投薬形態は、当該分野で一般に使用される不活性希釈剤（水または他の溶剤など）、溶解補助剤および乳化剤（エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコールなど）、オイル（特に、綿実油、ラッカセイ油、トウモロコシ油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油、およびゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフリルアルコール、ポリエチレングリコール、およびソルビタンの脂肪酸エステル、およびその混合物などを含むことができる。不活性希釈剤に加えて、経口組成物はまた、アジュバント（湿潤剤、乳化剤、および懸濁剤など）、甘味料、香味物質、着色料、香料、および防腐剤を含むことができる。
懸濁液は、活性化合物に加えて、懸濁剤（エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトール、およびソルビタンエステルなど）、微結晶性セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、寒天およびトラガカント、ならびにその混合物を含むことができる。
本明細書中に開示の一定の組成物を、皮膚または粘膜に局所投与することができる。局所処方物は、皮膚または角質層への浸透促進剤として有効であることが公知の１つまたは複数の広範な種々の薬剤をさらに含むことができる。これらの例は、２−ピロリドン、Ｎ−メチル−２−ピロリドン、ジメチルアセトアミド、ジメチルホルムアミド、プロピレングリコール、メチルアルコールまたはイソプロピルアルコール、ジメチルスルホキシド、およびアゾンである。さらなる薬剤をさらに含めて、美容的に許容可能な処方物を作製することができる。これらの例は、脂肪、ワックス、油、色素、香料、防腐剤、安定剤、および界面活性剤である。角質溶解薬（当該分野で公知の角質溶解薬など）も含めることができる。例は、サリチル酸および硫黄である。
局所または経費投与のための投薬形態には、粉末、噴霧、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、溶液、パッチ、および吸入剤が含まれる。活性化合物を、滅菌条件下で薬学的に許容可能なキャリアおよび必要であり得る任意の防腐剤、緩衝液、または噴射剤と混合することができる。軟膏、ペースト、クリーム、およびゲルは、本発明の化合物（例えば、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド）に加えて、賦形剤（動物および植物の脂肪、油、ワックス、パラフィン、デンプン、トラガカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコン、ベントナイト、ケイ酸、タルク、および酸化亜鉛、またはその混合物など）を含むことができる。
粉末および噴霧は、本化合物に加えて、賦形剤（ラクトース、タルク、ケイ酸、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウム、およびポリアミド粉末、またはこれらの物質の混合物など）を含むことができる。噴霧は、さらに、慣習的噴射剤（クロロフルオロ炭化水素など）および揮発性非置換炭化水素（ブタンおよびプロパンなど）を含むことができる。
ある実施形態では、非経口投与に適切な薬学的組成物は、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤、処方物を意図するレシピエントの血液と等張にする溶質、懸濁剤、または増粘剤を含むことができる１つまたは複数の薬学的に許容可能な滅菌等張水溶液または非水溶液、分散液、懸濁液、もしくは乳濁液、または使用直前に滅菌注射液または滅菌注射懸濁液に再構成することができる滅菌粉末と組み合わせた１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを含むことができる。本発明の薬学的組成物中で使用することができる適切な水性および非水性のキャリアの例には、水、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、およびポリエチレングリコールなど）、およびその適切な混合物、植物油（オリーブ油など）、および注射用有機エステル（オレイン酸エチルなど）が含まれる。例えば、コーティング物質（レシチンなど）の使用、分散液の場合の必要な粒子サイズの維持、および界面活性剤の使用によって適切な流動性を維持することができる。
本発明の組成物はまた、アジュバント（防腐剤、湿潤剤、乳化剤、および分散剤など）を含むことができる。種々の抗生物質および抗真菌薬（例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、およびソルビン酸など）を含めることによって微生物作用の防止を確実に行うことができる。等張剤（糖および塩化ナトリウムなど）を組成物に含めることも望ましいかもしれない。さらに、吸収を遅延する薬剤（モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなど）を含めることによって注射用薬学的形態の吸収を遅延することができる。
主治医が本発明の化合物（例えば、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド）の作用を改変する種々の要因を考慮することによって投薬レジメンを決定することが理解される。種々の要因は、治療すべき疾患に依存するであろう。筋肉障害では、要因には、形成が望まれる筋肉量、疾患に最も影響を及ぼす筋肉、悪化した筋肉の容態、患者の年齢、性別、および食事、投与期間、および他の臨床的要因が含まれるが、これらに限定されない。最終組成物への他の公知の成長因子の添加も投薬量に影響を及ぼし得る。筋肉の成長および／または修復の定期的評価（例えば、強度試験、筋肉サイズのＭＲＩ評価、および筋肉生検の分析）によって進行をモニタリングすることができる。
本発明のある実施形態では、１つまたは複数のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを、共に（同時に）投与するか、異なる時間に（連続的または重複的に）投与することができる。さらに、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを、別の型の治療薬（例えば、軟骨誘導薬、骨誘導薬、筋肉誘導薬、脂肪減少薬、またはニューロン誘導薬）と共に投与することができる。２つの型の化合物を、同時または異なる時間に投与することができる。本発明のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドが別の治療薬が協力するか相乗的に作用することができると予想される。
特定の例では、種々の骨形成因子、軟骨誘導因子、および骨誘導因子、特に、ビスホスホネートが記載されている。例えば、欧州特許出願番号１４８，１５５号および同第１６９，０１６号を参照のこと。例えば、本ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドと組み合わせることができる他の因子には、種々の成長因子（上皮成長因子（ＥＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−β）、およびインスリン様成長因子（ＩＧＦ）など）が含まれる。
ある実施形態では、本発明はまた、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドのｉｎ ｖｉｖｏ産生のための遺伝子療法を提供する。かかる療法は、上に列挙の障害を有する細胞または組織へのＡｃｔＲＩＩＢポリヌクレオチド配列の導入によってその治療効果を達成するであろう。ＡｃｔＲＩＩＢポリヌクレオチド配列の送達を、キメラウイルスなどの組換え発現ベクターまたはコロイド分散系を使用して行うことができる。ＡｃｔＲＩＩＢポリヌクレオチド配列の治療的送達には、ターゲティングしたリポソームを使用することが好ましい。
本明細書中に教示の遺伝子療法のために使用することができる種々のウイルスベクターには、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニア、または、好ましくは、ＲＮＡウイルス（レトロウイルスなど）が含まれる。好ましくは、レトロウイルスベクターは、マウスまたはトリのレトロウイルスの誘導体である。１つの外来遺伝子を挿入することができるレトロウイルスベクターの例には、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭｕＬＶ）、ハーベイマウス肉腫ウイルス（ＨａＭｕＳＶ）、マウス乳癌ウイルス（ＭｕＭＴＶ）、およびラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）が含まれるが、これらに限定されない。多数のさらなるレトロウイルスベクターを、複数の遺伝子に組み込むことができる。全てのこらのベクターを、形質導入された細胞を同定および生成することができるように、選択マーカー遺伝子を導入または組み込むことができる。レトロウイルスベクターを、例えば、糖、糖脂質、またはタンパク質の結合によって標的特異的にすることができる。抗体の使用によるターゲティングが好ましい。当業者は、特異的ポリヌクレオチド配列をレトロウイルスゲノムに挿入するかウイルスエンベロープに結合させて、ＡｃｔＲＩＩＢポリヌクレオチドを含むレトロウイルスベクターを標的特異的に送達させることができると認識している。１つの好ましい実施形態では、ベクターを、骨、軟骨、筋肉、またはニューロン細胞／組織にターゲティングする。
あるいは、組織培養細胞を、従来のリン酸カルシウムトランスフェクションによってレトロウイルス構造遺伝子であるｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖをコードするプラスミドで直接トランスフェクトすることができる。ついで、これらの細胞を、目的の遺伝子を含むベクタープラスミドでトランスフェクトする。得られた細胞は、培養培地にレトロウイルスベクターを放出する。
ＡｃｔＲＩＩＢポリヌクレオチドのための別のターゲティングされた送達系は、コロイド分散系である。コロイド分散系には、高分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフィア、ビーズ、および脂質ベースの系（水中油滴型乳濁液が含まれる）、ミセル、混合ミセル、およびリポソームが含まれる。本発明の好ましいコロイド系はリポソームである。リポソームは、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでの送達ビヒクルとして有用な人工膜小胞である。ＲＮＡ、ＤＮＡ、およびインタクトなビリオンを、水性内部内にカプセル化し、生物活性形態で細胞に送達させることができる（例えば、Ｆｒａｌｅｙら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．、６：７７、１９８１）。リポソームビヒクルを使用した有効な遺伝子導入方法は当該分野で公知であり、例えば、Ｍａｎｎｉｎｏら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、６：６８２、１９８８を参照のこと。リポソームの組成物は、通常、リン脂質の組み合わせ（通常、ステロイド、特にコレステロールとの組み合わせ）である。他のリン脂質または他の脂質も使用することができる。リポソームの物理的特徴は、ｐＨ、イオン強度、および２価の陽イオンの存在に依存する。
リポソーム産生で有用な脂質の例には、ホスファチジル化合物（ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴ脂質、セレブロシド、およびガングリオシドなど）が含まれる。例示的リン脂質には、卵ホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、およびジステアロイルホスファチジルコリンが含まれる。例えば、臓器特異性、細胞特異性、およびオルガネラ特異性に基づいたリポソームのターゲティングも可能であり、当該分野で公知である。
本発明を、ここに一般的に記載し、以下の実施例を参照して本発明がより容易に理解されるであろう。実施例は、一定の実施形態および本発明の実施形態の例示のみを目的とし、本発明を制限することを意図しない。
（実施例１）
ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質の生成
出願人は、その間に最小のリンカー（３つのグリシンアミノ酸）を有するヒトまたはマウスのＦｃドメインに融合したヒトＡｃｔＲＩＩＢの細胞外ドメインを有する可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ融合タンパク質を構築した。この構築物を、それぞれ、ＡｃｔＲＩＩｂ−ｈＦｃおよびＡｃｔＲＩＩｂ−ｍＦｃという。
ＣＨＯ細胞株から精製したＡｃｔＲＩＩｂ−ｈＦｃを、以下に示す（配列番号５）。
ＡｃｔＲＩＩｂ−ｈＦｃタンパク質およびＡｃｔＲＩＩｂ−ｍＦｃタンパク質を、ＣＨＯ細胞株中に発現させた。以下の３つの異なるリーダー配列を考慮した。
（ｉ）ミツバチメリチン（ＨＢＭＬ）：ＭＫＦＬＶＮＶＡＬＶＦＭＶＶＹＩＳＹＩＹＡ（配列番号７）
（ｉｉ）組織プラスミノゲンアクチベーター（ＴＰＡ）：ＭＤＡＭＫＲＧＬＣＣＶＬＬＬＣＧＡＶＦＶＳＰ（配列番号８）
（ｉｉｉ）未変性：ＭＧＡＡＡＫＬＡＦＡＶＦＬＩＳＣＳＳＧＡ（配列番号９）。
選択形態はＴＰＡリーダーを使用し、以下の非プロセシングアミノ酸配列を有する。
このポリペプチドは、以下の核酸配列によってコード去れる（配列番号１０）。
ＣＨＯ細胞産生物質のＮ末端配列決定により、−ＧＲＧＥＡＥの主な配列（配列番号１１）が明らかになった。特に、文献に報告された他の構築物は、−ＳＧＲ．．．配列から始まる。
一連のカラムクロマトグラフィ工程（例えば、以下の３つを超える工程が任意の順序で含まれる：プロテインＡクロマトグラフィ、Ｑセファロースクロマトグラフィ、フェニルセファロースクロマトグラフィ、サイズ排除クロマトグラフィ、および陽イオン交換クロマトグラフィ）によって精製することができる。ウイルス濾過および緩衝液の交換を使用して精製を完了することができる。
ＡｃｔＲＩＩｂ−Ｆｃ融合タンパク質を、ＨＥＫ２９３細胞およびＣＯＳ細胞中にも発現した。全細胞株由来の材料および妥当な培養条件によってｉｎ ｖｉｖｏで筋肉増強活性を有するタンパク質が得られたが、力価の変動が認められ、この変動は、おそらく細胞株の選択および／または培養条件に関連する。
（実施例２）
ＡｃｔＲＩＩｂ−Ｆｃ変異体の生成
出願人は、ＡｃｔＲＩＩＢの細胞外ドメインの一連の変異を作製し、細胞外ＡｃｔＲＩＩＢとＦｃドメインとの間の可溶性融合タンパク質としてこれらの変異タンパク質を産生した。バックグラウンドＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合物は、以下の配列（Ｆｃ部分に下線）（配列番号１２）を有する。
種々の変異（Ｎ末端およびＣ末端の短縮が含まれる）を、バックグラウンドＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃタンパク質に導入した。実施例１に示したデータに基づいて、これらの構築物は、ＴＰＡリーダーを用いて発現した場合、Ｎ末端セリンを欠くと予想される。ＰＣＲ変異誘発によってＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメインを変異させた。ＰＣＲ後、フラグメントを、Ｑｉａｇｅｎカラムによって精製し、ＳｆｏＩおよびＡｇｅＩで消化し、ゲル精製した。これらのフラグメントを、ライゲーション時にヒトＩｇＧ１を有する融合キメラが作製されるように発現ベクターｐＡＩＤ４（ＷＯ２００６／０１２６２７を参照のこと）にライゲーションした。Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αへの形質転換の際に、コロニーを選別し、ＤＮＡを単離した。マウス構築物（ｍＦｃ）について、ヒトＩｇＧ１をマウスＩｇＧ２ａと置換した。全変異体の配列を検証した。
全変異体を、一過性トランスフェクションによってＨＥＫ２９３Ｔ細胞中に産生した。まとめると、５００ｍｌスピナ中に、６×１０５細胞／ｍｌのＨＥＫ２９３Ｔ細胞を２５０ｍｌのＦｒｅｅｓｔｙｌｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）培地中に準備し、一晩成長させた。翌日、これらの細胞を、最終ＤＮＡ濃度０．５ｕｇ／ｍｌにてＤＮＡ：ＰＥＩ（１：１）複合体で処理した。４時間後、２５０ｍｌの培地を添加し、細胞を７日間成長させた。馴化培地を細胞の遠沈によって回収し、濃縮した。
変異体を、種々の技術（例えば、プロテインＡカラムが含まれる）を使用して精製し、低ｐＨ（３．０）のグリシン緩衝液で溶離した。中和後、これらをＰＢＳに対して透析した。
また、類似の方法によってＣＨＯ細胞中に変異体を産生した。
変異体を、下記の結合アッセイおよび／またはバイオアッセイで試験した。いくつかの例では、アッセイを、精製タンパク質よりもむしろ馴化培地を使用して行った。
（実施例２）
ＧＤＦ−１１およびアクチビン媒介シグナル伝達のバイオアッセイ
Ａ−２０４レポーター遺伝子アッセイを使用して、ＧＤＦ−１１およびアクチビンＡによるシグナル伝達に及ぼすＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃタンパク質の影響を評価した。細胞株：ヒト横紋筋肉腫（筋肉由来）。レポーターベクター：ｐＧＬ３（ＣＡＧＡ）１２（Ｄｅｎｎｌｅｒら、１９９８、ＥＭＢＯ １７：３０９１−３１００に記載）。図５を参照のこと。ＣＡＧＡ１２モチーフは、ＴＧＦ−β応答遺伝子（ＰＡＩ−１遺伝子）中に存在するので、このベクターは、Ｓｍａｄ２および３を介してシグナル伝達する因子に一般に使用される。
１日目：Ａ−２０４細胞を４８ウェルプレートに分割する。
２日目：１０ｕｇのｐＧＬ３（ＣＡＧＡ）１２またはｐＧＬ３（ＣＡＧＡ）１２（１０ ｕｇ）＋ｐＲＬＣＭＶ（１ｕｇ）、およびＦｕｇｅｎｅを使用してＡ−２０４細胞をトランスフェクトする。
３日目：因子（培地＋０．１％ＢＳＡに希釈）を添加する。インヒビターを細胞への添加の１時間前に因子とプレインキュベーションする必要がある。６時間後、細胞をＰＢＳで洗浄し、細胞を溶解する。
これの後に、ルシフェラーゼアッセイを行う。いかなるインヒビターの非存在下でさえも、アクチビンＡは、レポーター遺伝子発現の１０倍の刺激およびＥＤ５０〜２ｎｇ／ｍｌを示した。ＧＤＦ−１１：１６倍刺激、ＥＤ５０：〜１．５ｎｇ／ｍｌ。
ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｒ６４、２０〜１３４）は、本アッセイで、アクチビン、ＧＤＦ−８、およびＧＤＦ−１１活性の強力なインヒビターである。バリアントを、このアッセイで同様に試験した。
（実施例３）
Ｎ末端およびＣ末端短縮のＧＤＦ−１１阻害
ＡｃｔＲＩＩＢ部分であるＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ（Ｒ６４、２０〜１３４）のＮ末端およびＣ末端を短縮し、ＧＤＦ−１１およびアクチビンのインヒビターとしての活性について試験した。活性を以下に示す（馴化培地中で測定）。
Ｃ末端ＡｃｔＲＩＩｂ−ｈＦｃ短縮：
認められるように、Ｃ末端の３つ（．．．ＰＰＴで終わる）、６つ（．．．ＹＥＰで終わる）、またはそれを超えるアミノ酸の短縮により、分子の活性が１／３以下に減少する。ＡｃｔＲＩＩＢ部分の最後の１５アミノ酸の短縮により、より多くの活性が喪失する（ＷＯ２００６／０１２６２７号を参照のこと）。
ＡｃｔＲＩＩＢ−ｈＦｃ（Ｒ６４ ２０〜１３１）タンパク質のバックグラウンド中にアミノ末端短縮を作製した。活性を以下に示す（馴化培地中で測定）。
Ｎ末端ＡｃｔＲＩＩｂ−ｈＦｃ短縮：
したがって、Ｎ末端から２つ、３つ、または４つのアミノ酸の短縮により、全長細胞外ドメインを有するバージョンより活性の高いタンパク質が産生される。さらなる実験は、５つのアミノ酸を短縮したＡｃｔＲＩＩｂ−ｈＦｃ（Ｒ６４、２５〜１３１）は非短縮形態と等価な活性を有し、Ｎ末端のさらなる欠失はタンパク質活性を破壊し続けることを示す。したがって、最適な構築物は、配列番号４のアミノ酸１３３〜１３４で終わるＣ末端と配列番号４のアミノ酸２２〜２４で始まるＮ末端との間を有するであろう。アミノ酸２１または２５に対応するＮ末端により、ＡｃｔＲＩＩｂ−ｈＦｃ（Ｒ６４、２０〜１３４）構築物に類似の活性が得られるであろう。
（実施例４）
ＡｃｔＲＩＩｂ−Ｆｃバリアント、細胞ベースの活性
上記のように、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃタンパク質の活性を、細胞ベースのアッセイで試験した。結果を以下の表１にまとめている。異なるＣ末端短縮構築物中のいくつかのバリアントを試験した。上記で考察するように、５個または１５個のアミノ酸短縮により、活性が減少した。著しいことに、Ｌ７９ＤおよびＬ７９Ｅバリアントはアクチビン結合の実質的な欠失を示す一方で、ＧＤＦ−１１のほとんどの野生型阻害を保持した。
ＧＤＦ１１およびアクチビンＡへの可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ結合：
＋低活性（約１×１０−６ＫＩ）
＋＋中程度の活性（約１×１０−７ＫＩ）
＋＋＋良好な（野生型）活性（約１×１０−８ＫＩ）
＋＋＋＋野生型より高い活性 。
いくつかのバリアントを、ラット中で血清半減期について評価した。ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｒ６４ ２０〜１３４）−Ｆｃの血清半減期は約７０時間である。ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｒ６４ Ａ２４Ｎ ２０〜１３４）−Ｆｃの血清半減期は、約１００〜１５０時間である。Ａ２４Ｎバリアントは、細胞ベースのアッセイ（上記）およびｉｎ ｖｉｖｏアッセイ（下記）で野生型分子と等価の活性を有する。より長い半減期と組み合わせて、これは、長期にわたってＡ２４Ｎバリアントが野生型分子よりもタンパク質単位あたりの影響がより高いことを意味する。
著しいことに、７９位での酸性アミノ酸（アスパラギン酸またはグルタミン酸）の導入により、アクチビン結合が選択的に減少する一方で、ＧＤＦ１１／ＧＤＦ８結合が保持される。下記で考察されるように、野生型ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃタンパク質は、筋肉以外の組織に影響を及ぼすようであり、そのいくつかは望ましくないかもしれない。本明細書中に開示するように、これらの影響は、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃに結合して阻害する種々の異なるリガンド（おそらくアクチビンが含まれる）に関連すると予想される。最初のデータは、マウスでは、Ｌ７９ＥおよびＬ７９Ｄバリアントが筋肉以外の組織に及ぼす影響が減少する一方で、筋肉に及ぼすその影響が保持されることを示す。この型の異形をＡｃｔＲＩＩＢのバリアントと見なすことができるにもかかわらず、これらのタンパク質はもはやアクチビン受容体として真に機能せず、したがって、俗称「ＡｃｔＲＩＩＢ」がこれらのポリペプチドの誘導の指標としてのみ適切であることに留意すべきである。７９位の酸性残基がアクチビン結合を減少させる一方でＧＤＦ１１結合を保持するにもかかわらず、この位置での他の変化ではこのような影響はない。Ｌ７９Ａ変化により、ＧＤＦ１１結合と比較してアクチビン結合が増加する。Ｌ７９Ｐ変化により、アクチビンおよびＧＤＦ１１結合の両方が減少する。
（実施例５）
ＧＤＦ−１１およびアクチビンＡ結合
あるＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃタンパク質のリガンドへの結合を、ＢｉａＣｏｒｅ（商標）アッセイで試験した。
ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃバリアントまたは野生型タンパク質を、抗ｈＦｃ活性を使用したシステムに捕捉した。リガンドを注入し、捕捉した受容体タンパク質に流した。結果を以下の表にまとめている。
リガンド結合特異性ＩＩＢバリアント
これらのデータは細胞ベースのアッセイを確認し、Ａ２４ＮバリアントがＡｃｔＲＩＩｂ−ｈＦｃ（Ｒ６４ ２０〜１３４）分子に類似のリガンド結合活性を保持し、Ｌ７９ＤまたはＬ７９Ｅ分子がミオスタチンおよびＧＤＦ１１結合を保持するが、アクチビンＡへの結合の顕著な減少（定量不可能）を示すことを証明する。
他のバリアントを生成し、ＷＯ２００６／０１２６２７号に報告されているように、デバイスにカップリングしたリガンドを使用して試験し、カップリングしたリガンドに受容体を流した。これらのバリアントに関するデータの表を以下に再度示す。
ＧＤＦ１１およびアクチビンＡへの可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃバリアント結合（Ｂｉａｃｏｒｅアッセイ）
＊結合は認められず
−−＜１／５ ＷＴ結合
−約１／２ ＷＴ結合
＋ＷＴ
＋＋２倍未満の結合増加
＋＋＋約５倍の結合増加
＋＋＋＋約１０倍の結合増加
＋＋＋＋＋約４０倍の結合増加 。
（実施例６）
野生型マウスにおける筋肉量に及ぼすＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃタンパク質の影響
出願人は、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃタンパク質が野生型マウスの筋肉量を増加させる能力を決定した。
Ｃ５７Ｂ１１０マウスに、ヒトＡｃｔＲＩＩＢ（Ｒ６４ ２０〜１３４）タンパク質またはヒトＡｃｔＲＩＩＢ（Ｋ７４Ａ ２０〜１３４）のいずれかを２回／週にて投与した（１０ｍｇ／ｋｇ；腹腔内（ｉ．ｐ．））。マウスを、０日目および２８日目にＮＭＲスキャンして、全身除脂肪組織量の変化率を決定した。ヒトＡｃｔＲＩＩＢ（Ｒ６４ ２０〜１３４）−Ｆｃ処置マウスは、ビヒクルコントロール群と比較した場合、除脂肪組織の有意な３１．１％の増加を示した。ヒトＡｃｔＲＩＩＢ（Ｋ７４Ａ ２０〜１３４）−Ｆｃタンパク質で処置したマウスは、コントロールコホートと比較して除脂肪組織量の有意な増加を示したが、ヒトＡｃｔＲＩＩＢ（Ｒ６４ ２０〜１３４）処置群よりもその範囲は狭い。類似の研究では、マウスをＰＢＳ、１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、または１０ｍｇ／ｋｇのマウスＡｃｔＲＩＩＢ（ＷＴ、２０〜１３４）−Ｆｃにて２回／週で腹腔内処
置した。研究終了時に、大腿筋、腓腹筋、胸筋、および横隔膜筋を切開し、秤量した。結果を以下の表３にまとめている。
図３に示すように、マウスＡｃｔＲＩＩＢ（ＷＴ、２０〜１３４）−Ｆｃ融合タンパク質は、野生型マウスの筋肉量を有意に増加させる。マウスＡｃｔＲＩＩＢ（ＷＴ、２０〜１３４）−Ｆｃ処置マウスでは、腓腹筋は２６．５％増加し、大腿筋は２８．９％増加し、胸筋は４０．０％増加した。本発明者らはまた、ビヒクル処置コントロールマウスと比較して６３％増加した横隔膜筋の変化を認めた。横隔膜筋の減少は、種々の筋ジストロフィでよく見られる合併症である。したがって、マウスＡｃｔＲＩＩＢ（ＷＴ、２０〜１３４）−Ｆｃ処置後に認められる横隔膜重量の増加は、臨床的に重要であり得る。
（実施例７）
野生型マウスにおける筋肉量に及ぼす長期半減期ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃタンパク質の影響
出願人は、半減期が長いＡｃｔＲＩＩＢ−ｍＦｃ（Ｒ６４、Ａ２４Ｎ ２０〜１３４）タンパク質のバリアントが野生型マウスの筋肉量を増加させる能力を決定した。
Ｃ５７Ｂ１１０マウスに、ヒトＡｃｔＲＩＩＢ−ｍＦｃ（Ｒ６４ ２０〜１３４）タンパク質またはヒトＡｃｔＲＩＩＢ−ｍＦｃ（Ｒ６４、Ａ２４Ｎ ２０〜１３４）のいずれかを２回／週にて投与した（１０ｍｇ／ｋｇ；腹腔内（ｉ．ｐ．））。マウスを、２５日目までの種々の時点でＮＭＲスキャンして、全身除脂肪組織量の変化率を決定した。両分子によって総体重および筋肉量が等価に増加し、腓腹筋、大腿筋、および胸筋に及ぼす影響は、４０〜７０％増加の範囲であった。図５および６を参照のこと。
これらのデータは、半減期増加型分子が短期間の研究で野生型分子と等価の効力で筋肉成長を促進することを証明する。
（実施例８）
野生型マウスにおける筋肉量に及ぼすアクチビン結合が減少したＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃタンパク質の影響
出願人は、ＡｃｔＲＩＩＢ−ｍＦｃ（Ｒ６４、Ｌ７９Ｄ ２０〜１３４）タンパク質の長期半減期バリアントが野生型マウスの筋肉量を増加する能力を決定した。
Ｃ５７Ｂ１１０マウスに、ヒトＡｃｔＲＩＩＢ−ｍＦｃ（Ｒ６４ ２０〜１３４）タンパク質またはヒトＡｃｔＲＩＩＢ−ｍＦｃ（Ｒ６４、Ｌ７９Ｄ ２０〜１３４）のいずれかを２回／週にて投与した（１０ｍｇ／ｋｇ；腹腔内（ｉ．ｐ．））。マウスを、２４日目までの種々の時点でＮＭＲスキャンして、全身除脂肪組織量の変化率を決定した。データを、以下の表に示す。
これらのデータは、ＡｃｔＲＩＩＢのＬ７９Ｄバリアント（アクチビンＡ結合の減少）がｉｎ ｖｉｖｏで筋肉成長に活性であるが、筋肉成長量は野生型ＡｃｔＲＩＩＢより低いことを証明する。この影響の減少は、ミオスタチン結合のわずかな減少またはさらなる依然として未知の筋肉成長の負のレギュレーターへの結合の喪失に一部起因し得る。アクチビンＡシグナル伝達に影響を及ぼすことなく筋肉成長を刺激する能力が非常に望ましい。これは、アクチビンが、生殖器系、骨、肝臓、および多数の他の組織に影響を及ぼすことが公知の広範に発現する調節分子であるからである。マウスでは、ＡｃｔＲＩＩＢ−ｍＦｃ（Ｒ６４ ２０〜１３４）が生殖器系に実質的に影響を及ぼし、いくつかの場合、脾臓サイズを増大させる。ＡｃｔＲＩＩＢ−ｍＦｃ（Ｒ６４、Ｌ７９Ｄ ２０〜１３４）分子は、生殖組織および脾臓の両方に及ぼす影響を非常に弱め、この分子が生殖的に活動的であるか、生殖器系に及ぼす影響が最小であることが望ましい患者の筋肉成長の促進に特に適切であることが示された。
（実施例９）
Ｍｄｘマウスにおける筋肉量および強度に及ぼすＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃタンパク質の影響
マウスＡｃｔＲＩＩＢ（ＷＴ、２０〜１３４）−Ｆｃタンパク質が罹患状態で筋肉量を増加させる能力を決定するために、出願人は、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃタンパク質が筋ジストロフィのｍｄｘマウスモデルにおける筋肉量を増加させる能力を決定した。
成体Ｍｄｘマウスを、マウスＡｃｔＲＩＩＢ（ＷＴ、２０〜１３４）−Ｆｃタンパク質（１、３、または１０ｍｇ／ｋｇ；腹腔内）またはＰＢＳビヒクルコントロールで２回／週にて処置した。力変換器を引いた場合に発揮するマウスの力を測定して、前肢の握力を測定する。コホート間の握力を比較するために、５回の平均牽引力を使用した。研究終了時に、大腿筋、腓腹筋、胸筋、および横隔膜筋を解剖し、秤量した。握力測定も有意な増加を示した。筋肉量の結果を、以下の表にまとめている。
ビヒクルおよびマウスＡｃｔＲＩＩＢ（ＷＴ、２０〜１３４）−Ｆｃ処置ｍｄｘマウス由来の組織重量
表に示すように、マウスＡｃｔＲＩＩＢ（ＷＴ、２０〜１３４）−Ｆｃ処置群は、ＰＢＳ処置マウスと比較してｍｄｘマウスで除脂肪組織量が増加した。ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ処置により、ビヒクルコントロール群と比較して、腓腹筋サイズが２５．９％増加し、大腿筋サイズが３１．８％増加し、胸筋サイズが８５．４％増加した。マウスＡｃｔＲＩＩＢ（ＷＴ、２０〜１３４）−Ｆｃ処置マウスの横隔膜筋の重量がコントロールコホートと比較して３４．２％増加することも見出されたことが臨床的に重要かもしれない。これらのデータは、筋ジストロフィ病態におけるＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃタンパク質の有効性を証明する。
さらに、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃタンパク質で処置したｍｄｘマウスは、ビヒクル処置コントロールと比較して握力が増加した。１６週間後、１、３、および１０ｍｇ／ｋｇのＡｃｔＲＩＩＢ群は、それぞれ、ビヒクルコントロール群と比較して握力が３１．４％、３２．３％、および６４．４％増加した。マウスＡｃｔＲＩＩＢ（ＷＴ、２０〜１３４）−Ｆｃ処置群の握力の改善は、処置群で見出された筋肉の増加が生理学的に関連するという概念を支持する。ｍｄｘマウスは、その野生型対応マウスよりも収縮誘導性障害に感受性を示し、有意により多数の分解再生サイクルを受ける。これらの筋肉表現型にもかかわらず、マウスＡｃｔＲＩＩＢ（ＷＴ、２０〜１３４）−Ｆｃ処置により、ｍｄｘマウスの握力が増加する。
デュシェーヌ筋ジストロフィでは、幼少期に発症し、しばしば早ければ５歳で発症する。したがって、成体マウスに関して示した上記データは、必ずしもその影響を反映しておらず、ＡｃｔＲＩＩＢ分子は、ＤＭＤを有する小児が有するであろう。これに取り組むために、幼若ｍｄｘマウスを使用して研究を行った。
ＡｃｔＲＩＩＢ−ｍＦｃ（Ｒ６４、２０〜１３４）処置は、幼若（４週齢）Ｃ５７ＢＬ／１０およびｍｄｘマウスの体重を有意に増加させる。ｉｎ ｖｉｖｏＮＭＲ顕微鏡法を使用した体組成分析により、より高い体重を伴う除脂肪組織量の増加が明らかとなった。各コントロールコホートよりＡｃｔＲＩＩＢ−ｍＦｃ（Ｒ６４、２０〜１３４）処置Ｃ５７ＢＬ／１０マウスは除脂肪組織量が３５．２％増加し、処置ｍｄｘ群は除脂肪組織量が４８．３％増加した。さらに、強度に及ぼすＡｃｔＲＩＩＢ−ｍＦｃ（Ｒ６４、２０〜１３４）処置の影響を評価した。ビヒクル処置ｍｄｘマウスの握力スコアは、ビヒクルＣ５７ＢＬ／１０コホートよりも１５．７％低く、それにより、ジストロフィン欠損に関連する筋力低下を示した。対照的に、ＡｃｔＲＩＩＢ−ｍＦｃ（Ｒ６４、２０〜１３４）処置ｍｄｘマウスは、ｍｄｘビヒクル群と比較してその握力が改善され、Ｃ５７ＢＬ／１０ビヒクルマウスを超え、処置Ｃ５７ＢＬ／１０握力スコアレベルに到達する握力に到達した（ビヒクルｍｄｘ：０．１４０±０．０１ ＫｇＦ；処置ｍｄｘ：０．１９９±０．０２ ＫｇＦ；ビヒクルＣ５７ＢＬ／１０：０．１６６±０．０３；０．２０５±０．０２ ＫｇＦ）。際立って、処置により、幼若ｍｄｘマウスが野生型の握力レベルに回復した。したがって、ＡｃｔＲＩＩＢ−ｍＦｃ（Ｒ６４、２０〜１３４）分子は、特に、発症に近い年齢の若年患者におけるディシュンヌ型筋ジストロフィで臨床的に重要に適用される可能性が高い。
（実施例７）
ＳＯＤ１マウスの強度および生存に及ぼすＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃタンパク質の影響
ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドがＡＬＳマウスモデルの強度および生存を増大させる能力を決定するために、出願人は、ＳＯＤ１マウスにおけるＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃタンパク質を試験した。
Ｂ６．Ｃｇ−Ｔｇ（ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ）１Ｇｕｒ／Ｊ（すなわちＳＯＤ１）マウスは、高コピー数のヒトスーパーオキシドジムスターゼ導入遺伝子の変異対立遺伝子を保有する。高レベルのこのタンパク質は、ヒト疾患ＡＬＳに匹敵する表現型をマウスに伝達する。ＳＯＤ１マウスは、上行性麻痺を発症し、９１日目までに初期の疾患の兆候を示す。この疾患により、１９〜２３週齢で早死にする。
ＳＯＤ１マウスに、ビヒクルコントロールまたはＡｃｔＲＩＩＢ−ｍＦｃ（Ｋ７４Ａ ２０〜１３４）（ｉ．ｐ．、５ｍｇ／ｋｇ、２回／週）を投与した。これを１０週齢から開始した。力変換器を引いた場合に発揮するマウスの力を測定して、前肢の握力を測定する。コホート間の握力を比較するために、５回の平均牽引力を使用した。マウスの出生日とマウスが３０秒以内に横倒しの状態を自ら正すことができない日の間の日数として生存を計算した。図７は握力の測定値を示し、図８は生存データを示す。
疾患末期のマウスは、おそらく麻痺の進行によって毛繕いが困難であり、毛並が乱れている。マウスの大まかな観察により、マウスＡｃｔＲＩＩＢ（Ｋ７４Ａ ２０〜１３４）−Ｆｃ処置群が、ＰＢＳ群と比較して、疾患末期でさえも十分に毛繕いされているようであることが明らかとなった。この所見により、処置マウスがコントロールよりも良好な健康状態であり、高い生活の質を維持することが示唆される。
図７に示すように、マウスＡｃｔＲＩＩＢ（Ｋ７４Ａ ２０〜１３４）−Ｆｃ処置を受けたＳＯＤ１マウスは、ＰＢＳコントロールコホートと比較して有意に高い握力を示す。これは１１７日目（疾患初期）に認められ、１４９日目の疾患進行後にも認められた。図８は、ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｋ７４Ａ ２０〜１３４）−Ｆｃ処置マウスがビヒクルコントロールよりも有意に長期に生存することを示す。この研究は、マウスの強度および生存の改善に関するＡＬＳマウスモデルにおけるマウスＡｃｔＲＩＩＢ（Ｋ７４Ａ ２０〜１３４）−Ｆｃの有用性を示す。
ＳＯＤ１マウスを使用して類似の実験を行ったが、有意な病徴の発生後のヒトＡＬＳ治療をより良好に模倣するために、処置を肉眼で検出可能な発症の開始（１３０日目）まで遅延した。１３０日目に、ＳＯＤ１マウスを、ビヒクル（改変ＴＢＳ）処置群またはＡｃｔＲＩＩＢ（Ｒ６４ ２０〜１３４）−ｍＦｃ（１０ｍｇ／ｋｇ）処置群のいずれかに分類した。マウスに、１週間に１回皮下投与した。マウスを、研究−１日目および２７日目（それぞれ、１２９日齢および１５７日齢）にＮＭＲスキャンした。０日目および２０日目に握力測定を行った。研究終了時に、雄コントロール群は、研究０日目より体重が４．３％減少したのに対して、処置群は研究０日目より体重が７．８％増加した。雌コントロール群は、その研究０日目の体重より１．５％減少し、処置雌コホートは１５％増加した。
ＳＯＤ１握力測定
雄および雌ＳＯＤ１マウスにおける０日目および２０日目の握力測定。上付文字の「ａ」は、各０日目の測定と比較した有意な相違を示す（ｐ＜０．０５）。上付文字の「ｂ」は、測定２０日目のＰＢＳ（群１）およびＡｃｔＲＩＩＢ（Ｒ６４ ２０〜１３４）−ｍＦｃ（群２）との間の有意な相違を示す（ｐ＜０．０５）。
マウスをＮＭＲスキャンして、治療に寄与した体組成の変化を決定した。雄コントロールマウスは、一連の研究にわたってその除脂肪組織量を６．０％喪失し（−１日目：１８．２ｇ±１．２８；２７日目：１７．１ｇ±１．１０）、雄処置マウスは研究０日目のその除脂肪組織量を９．１％増加させた（−１日目：１９．１７ｇ±０．７７；２７日目：２０．９２ｇ±０．７４）。雌コントロールマウスは、研究開始当初から除脂肪組織量が０．８３％減少し（−１日目：１３．１８ｇ±０．８４；２７日目：１３．０８ ｇ±０．７１）、雌処置マウスは研究０日目の体重が１０．７％増加した（−１日目：１３．６６ ｇ±０．８３；２７日目：１５．１２ｇ±１．２１）。雄および雌の処置群の両方は、その各コントロール群と比較して除脂肪組織量が有意に増加した（ｐ＜０．００１）。ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｒ６４ ２０〜１３４）−ｍＦｃのＳＯＤ１マウスの影響
これらのデータは、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ処置が、筋肉機能および生活の質の両方の改善のための能動性ＡＬＳ患者の治療で有利であり得る。
（実施例８）
肥満マウスの脂肪過多症および糖尿病に及ぼすＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃタンパク質の影響
出願人は、高脂肪食（ＨＦＤ）摂取マウスにおいてＡｃｔＲＩＩＢ−ｍＦｃタンパク質を試験して、肥満マウスモデルにおいてＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃが脂肪過多症を軽減する能力を決定した。
ＩＩ型糖尿病は、肥満の主な合併症であり、インスリン抵抗性によって特徴づけられる。空腹時インスリンレベルの上昇は、インスリン抵抗性を示し、動物がインスリン抵抗状態であるかどうかを試験するための手段である。出願人は、肥満マウスモデルにおける正規化空腹時インスリンレベルでのマウスＡｃｔＲＩＩＢ（Ｒ６４ Ｋ７４Ａ ２０〜１３４）−Ｆｃでの処置の影響を決定した。
ＨＦＤ摂取Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、３５％脂肪から構成される飼料で維持し、標準的な固形飼料（４．５％脂肪）を与えた年齢適合マウスより体重が約５０％重い場合に肥満と見なした。肥満マウスに、ビヒクルコントロールまたはヒトＡｃｔＲＩＩＢ（Ｒ６４ Ｋ７４Ａ ２０〜１３４）−Ｆｃ（１０ｍｇ／ｋｇ；ｉ．ｐ．）のいずれかを２回／週で投与した。肥満マウスをＮＭＲスキャンして、投与開始時および投与３週間後の体組成を決定した。ベースラインからの体組成の変化を、図９にまとめている。
マウスにＨＦＤを与え、その体重が標準的な固形飼料を与えた対応マウスよりも５０％重い場合に肥満と見なした。ＨＦＤ摂取マウスに、ビヒクルコントロールまたはマウスＡｃｔＲＩＩＢ（Ｒ６４ Ｋ７４Ａ ２０−１３４）−Ｆｃ（５ｍｇ／ｋｇ ２回／週；ｉ．ｐ．）のいずれかを３５週間投与した。研究終了時に、マウスを一晩絶食させた。絶食終了後、採血し、血清を処理した。次いで、血清を使用して、両コホートについての空腹時インスリンレベルを決定した。肥満マウスの空腹時インスリンレベルに及ぼすマウスＡｃｔＲＩＩＢ（Ｋ７４Ａ ２０〜１３４）−Ｆｃの影響についての結果を、以下の表にまとめている。
ビヒクルおよびマウスＡｃｔＲＩＩＢ（Ｋ７４Ａ ２０〜１３４）−Ｆｃ処置マウス由来の空腹時インスリンレベル
図９は、ビヒクル処置コントロールと比較した場合のマウスＡｃｔＲＩＩＢ（Ｒ６４ Ｋ７４Ａ ２０〜１３４）−Ｆｃコホートの脂肪過多症の減少を示す。処置マウスは、そのベースラインレベルと比較して、２５．９％の脂肪量の減少が見出された。さらに、処置群は、そのベースラインレベルよりその除脂肪量が１０．１％増加した。ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｒ６４ Ｋ７４Ａ ２０〜１３４）−ｍＦｃの脂肪組織および除脂肪組織量の両方の変化率は、ＰＢＳ処置群の変化率よりも有意に高かった。
このモデルでは、マウスは、その固形飼料対応マウスより５０％を超えて重くなるまで高脂肪食を維持した。この体重および脂肪過多症の顕著な増加に基づいて、このモデルが病的肥満として特徴づけられるヒトに対応し得るということは理にかなっている。したがって、ヒトＡｃｔＲＩＩＢ（Ｒ６４ Ｋ７４Ａ ２０〜１３４）−Ｆｃタンパク質での処置が肥満マウスの脂肪過多症を軽減するという所見は、病的肥満のヒトの治療に臨床的に関連し得る。
表５にまとめた結果により、マウスＡｃｔＲＩＩＢ（Ｋ７４Ａ ２０〜１３４）−Ｆｃタンパク質での処置が肥満に関連する上昇した空腹時血清インスリンレベルを有意に低下させることができることが示唆される。この所見は、ＩＩ型糖尿病治療におけるＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの使用の臨床的に関連する可能性があることを支持する。
さらなる実験を、肥満および糖尿病のＨＦＤモデルにおいてＡｃｔＲＩＩＢ−ｍＦｃ（Ｒ６４ ２０〜１３４）を使用して行った。３０週齢のＨＦＤ摂取Ｃ５７ＢＬ／６マウスを２群（ＰＢＳおよび１０ｍｇ／ｋｇ ＡｃｔＲＩＩＢ−ｍＦｃ（Ｒ６４ ２０〜１３４））に分けた。マウスを秤量し、２回／週にて１２週間腹腔内投与した。マウスを、０日目および９４日目にＮＭＲによって評価した。
処置マウスは、その実験０日目に１．９％の体重を喪失し、ＰＢＳ処置マウスは、研究中の開始時体重より６．７％増加した。処置マウスはまた、研究中にＰＢＳ群よりも除脂肪組織が有意に増加した（２１．１％±６．２８対３．７％±４．０８）。処置マウスはまた、ＰＢＳ群（＋１０．２±１０．１８）と比較して、有意に脂肪組織を喪失した（−３４％±１０．９５）。ＡｃｔＲＩＩＢ−ｍＦｃ（Ｒ６４ ２０〜１３４）処置群で各筋肉重量も増加した。
これらのマウスにおけるＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ処置に関連する脂肪および筋肉に及ぼす有利な影響に加えて、血清脂質に及ぼす正の影響が認められた。血清コレステロールレベルおよび血清トリグリセリドレベルの両方が顕著に減少し、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質を使用して患者のこれらの脂質レベルを低下させることができることが示唆された。
（実施例９）
悪液質マウスにおける筋肉量に及ぼすＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃタンパク質の影響
出願人は、ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｒ６４ ２０〜１３４）−ｍＦｃが糖質コルチコイド誘導性筋肉消耗のマウスモデルにおける筋肉喪失を弱める能力を試験した。
マウスにＰＢＳまたはデキサメタゾン（２ｍｇ／ｋｇ）のいずれかを１３日間にわたって毎日皮下投与して、筋肉消耗を誘導した。同様に１３日間にわたって、ＰＢＳおよびデキサメタゾン処置群に、治療の全ての組み合わせが示されるようにビヒクルまたはＡｃｔＲＩＩＢ（Ｒ６４ ２０〜１３４）−ｍＦｃ（１０ｍｇ／ｋｇ；ｉ．ｐ．；２回／週）を投与した。マウスを、０日目および１３日目にＮＭＲスキャンして、群間の除脂肪組織量の変化を決定した。ＮＭＲの結果を、以下の表６に概説する。
ＮＭＲスキャニングは、ＰＢＳ：ＰＢＳコホートと比較したデキサメタゾン：ＰＢＳ群の除脂肪組織量の有意な２．５％減少を示した。対照的に、デキサメタゾン：ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｒ６４ ２０〜１３４）−ｍＦｃ群は、除脂肪組織量が１３．５％増加し、ＰＢＳ：ＰＢＳ群およびデキサメタゾン：ＰＢＳ群の両方と比較した場合に有意な増加であった。悪液質は、種々の治療上の処置（慢性糖質コルチコイド療法が含まれる）の望ましくない副作用である。したがって、ヒトＡｃｔＲＩＩＢ（Ｒ６４ ２０〜１３４）−ｍＦｃタンパク質での処置が悪液質関連筋肉消耗を弱めることができることが臨床的に重要であり得る。
（実施例１０）
高齢マウスまたは卵巣切除マウスにおける筋肉量および肥満に及ぼすＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃの影響
サルコペニアは、他の点では健康な高齢に関連する筋肉喪失型である。本障害は、進行性の骨格筋量の喪失ならびに強度および可動性の障害に関連する。サルコペニアの原因は、あまり理解されていない。女性では、更年期が筋肉喪失を加速させ、骨喪失も加速させる。したがって、ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｒ６４、２０〜１３４）−ｍＦｃを、非常に高齢の（２歳）マウスおよび卵巣切除マウス（閉経後状態のモデル）で試験した。
８週齢のＣ５７ＢＬ／６雌マウスを、卵巣切除するか（ＯＶＸ）、疑似手術を行い、１６週間年をとらせた後に研究を介した。研究開始時に、偽マウスおよびＯＶＸマウスを、処置群およびビヒクル群にそれぞれ分けた。全群を秤量し、ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｒ６４、２０〜１３４）−ｍＦｃまたは緩衝液コントロールのいずれを１１週間にわたって毎週投与した。全マウスを、０日目および８３日目にＮＭＲスキャンによって研究して、体組成を決定した。
研究終了時に、偽ＰＢＳマウスがもとの除脂肪量の４．７％を喪失し、偽処置群は、一連の研究にわたって除脂肪量が２１％増加した。研究終了までに、ＯＶＸコントロールはその除脂肪量の１２．１％を喪失し（偽ビヒクルより有意）、処置ＯＶＸマウスは１２．９％増加した。
これらのデータは、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質を使用して閉経後の女性に一般的な筋肉喪失に反作用することができることを示す。
自然に老化した集団に及ぼすＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃの影響を評価するために、雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、処置開始前に７０週齢に老化させた。マウスを２群に分けた（ＰＢＳおよび１０ｍｇ／ｋｇ ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｒ６４、 ２０〜１３４）−ｍＦｃ）。各群を秤量し、２回／週で１０週間投与した。一連の研究にわたり、処置群はＰＢＳ群より除脂肪組織量が有意に増加した。
処置群はまた、ＰＢＳマウスと比較して各筋肉重量が有意に高かった。
筋肉内脂肪が減少し、細胞構築が改善されたので、処置コホートにおける筋肉の完全性もまた、ＰＢＳ群よりも高いようであった（図１０を参照のこと）。
これらのデータは、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質を使用して、男性および女性の高齢に関連する筋肉消耗を治療することができることを証明する。
（実施例１１）
去勢に関連する筋肉喪失に及ぼすＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃの影響。
前立腺癌は、一般に、抗アンドロゲン療法を使用して治療する。治療の副作用には、筋肉喪失および肥満の増大が含まれる。去勢マウスで類似の変化が起こり、このことにより、去勢マウスがこの臨床背景でＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃが使用される可能性を研究するための良好なモデルとなる。
８週齢の雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスを去勢するか疑似手術を行い、３週間回復させ、その後に研究を開始する。偽群および去勢群を、ＰＢＳ群およびＡｃｔＲＩＩＢ（Ｒ６４、 ２０〜１３４）−ｍＦｃ（１０ｍｇ／ｋｇ）群にさらに分けた。マウスを秤量し、１回／週にて１２週間皮下投与した。マウスを、０日目および８３日目の研究でＮＭＲスキャンした。
一連の研究にわたり、偽ＰＢＳマウスでは、研究０日目の除脂肪組織量より平均９．７２％±３．６７増加し、偽ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｒ６４、 ２０〜１３４）−ｍＦｃマウスでは３５．７９％±３．１増加した。去勢ＰＢＳ処置マウスは、０日目除脂肪組織量の８．１％±４．２２を喪失し、処置去勢マウスは１７．７７％±３．８６増加した。さらに、去勢によって脂肪過多症が増加するが、ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｒ６４、 ２０〜１３４）−ｍＦｃ処置は脂肪量増加の程度の減少に役立った。
去勢ビヒクルマウス由来の腓腹筋および胸筋は、偽ＰＢＳマウスより小さかった（去勢腓腹筋：０．２７５±０．０３ｇ、去勢胸筋：０．１９６±０．０６ｇ；偽腓腹筋：０．３１３±０．０２ｇ、偽胸筋：０．２５４±０．０３ｇ）。ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｒ６４、２０〜１３４）−ｍＦｃ処置は、マウス体重のこの去勢誘導性の減少を有意に小さくする（去勢腓腹筋：０．４２１±０．０３ｇ、去勢胸筋：０．２９６±０．０６ｇ）。
（実施例１２）
癌悪液質に及ぼすＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃの影響
多数の腫瘍は、無食欲および重症筋肉喪失に関連する。悪液質を示す患者は、非悪液質患者よりも予後が不良である。結腸癌細胞株ＣＴ２６は、マウスで重度の悪液質を誘導する。ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｒ６４ ２０〜１３４）を、このモデルで外植片誘導性悪液質に及ぼす影響について試験した。
以下のように、６つのマウス群を実験で使用した。
群３〜６に、５×１０６腫瘍細胞を皮下投与した。群６に１週間に２回のＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃでの処置を直ちに開始した。腫瘍サイズが３００〜５００ｍｍ３に到達した研究２８日目に群１〜５に投与を開始した。図１１に示すように、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃは、腫瘍が確立したマウスおよび腫瘍導入前の予防モデルで使用した場合にＣＴ２６腫瘍に関連する筋肉喪失を顕著に減少させた。
（実施例１３）
野生型マウスにおける筋肉量に及ぼすＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃバリアントの影響
本研究は、６週齢のＣ５７ＢＬ／６雄マウスにおける筋肉量および他の組織に及ぼす以下のＡｃｔＲＩＩＢ関連Ｆｃ構築物の影響を示した。マウスを秤量し、ＰＢＳまたはＡｃｔＲＩＩＢ関連Ｆｃ構築物（１０ｍｇ／ｋｇ）のいずれかを２週間毎に腹腔内注射した。ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｒ６４ ２０〜１３４）−Ｆｃ
ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｄ ２０〜１３４）−Ｆｃ
ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｌ７９Ｅ ２０〜１３４）−Ｆｃ
ＡｃｔＲＩＩＢ（Ａ２４Ｎ ２０〜１３４）−Ｆｃ
ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｒ６４Ｋ ２０−１３４）−Ｆｃ 。
研究開始時、中間、および研究終了時にマウスをＮＭＲスキャンした。大腿筋、胸筋、腓腹筋、肝臓、腎臓、および脾臓を秤量し、ホルマリン中に保持した。
最初のデータ分析は、ＡｃｔＲＩＩＢ（Ｒ６４ ２０〜１３４）−Ｆｃによって筋肉量および除脂肪体重が最も増加する一方で、他の組織にも最も高い影響を及ぼすことを示す。Ｌ７９ＤおよびＬ７９Ｅバリアントは、筋肉量をより低い程度に増加させる一方で、他の組織にほとんど影響を及ぼさない。Ａ２４ＮおよびＲ６４Ｋ構築物は、筋肉および組織に中程度の影響を及ぼす。これらのデータは、アクチビン結合が減少したＡｃｔＲＩＩＢのバリアントが望ましい性質、特に、筋肉組織に及ぼす選択的影響を有することが確認される。
参照による引用
本明細書中に言及したすべての刊行物および特許は、各刊行物または特許が具体的且つ個別に参考として援用されることを示すように、その全体が本明細書中で参考として援用される。
主題の特定の実施形態が考察されているが、上記明細書は例示であり本発明を制限しない。本明細書および以下の特許請求の範囲を再検討した際に多数の変形形態が当業者に明らかである。本発明の全範囲を、特許請求の範囲およびその等価物の全範囲ならびに明細書およびかかる変形形態を参照することによって決定すべきである。

Claims (18)

  1. 配列番号２のアミノ酸２９〜１０９の配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含むバリアントＡｃｔＲＩＩＢタンパク質であって、前記タンパク質が配列番号２の７９位に対応する位置に酸性アミノ酸を含む、バリアントＡｃｔＲＩＩＢタンパク質。
  2. 前記タンパク質が、配列番号２のアミノ酸２９〜１０９に少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のバリアントＡｃｔＲＩＩＢタンパク質。
  3. 前記タンパク質が、配列番号２のアミノ酸２９〜１０９に少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のバリアントＡｃｔＲＩＩＢタンパク質。
  4. 前記タンパク質が、配列番号２の６４位に対応する位置にＲを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載のバリアントＡｃｔＲＩＩＢタンパク質。
  5. 前記タンパク質が、配列番号２の６４位に対応する位置にＫを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載のバリアントＡｃｔＲＩＩＢタンパク質。
  6. 前記タンパク質が、配列番号２の７９位に対応する位置にＤを含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載のバリアントＡｃｔＲＩＩＢタンパク質。
  7. 前記タンパク質が、配列番号２の７９位に対応する位置にＥを含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載のバリアントＡｃｔＲＩＩＢタンパク質。
  8. 前記タンパク質が、配列番号２のアミノ酸２２〜２５のいずれかに対応するアミノ酸残基から始まり、配列番号２のアミノ酸１３１、１３３または１３４のいずれかに対応するアミノ酸で終了するアミノ酸配列を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載のバリアントＡｃｔＲＩＩＢタンパク質。
  9. 前記タンパク質が、配列番号２のアミノ酸２５から始まり、配列番号２のアミノ酸１３１で終了するアミノ酸配列を含む、請求項８に記載のバリアントＡｃｔＲＩＩＢタンパク質。
  10. 前記タンパク質は、異種部分をさらに含む融合タンパク質である、請求項１〜９のいずれか１項に記載のバリアントＡｃｔＲＩＩＢタンパク質。
  11. 前記タンパク質が、ホモ二量体である、請求項１０に記載のバリアントＡｃｔＲＩＩＢタンパク質。
  12. 前記異種部分がＩｇＧ重鎖由来の定常領域を含む、請求項１０に記載のバリアントＡｃｔＲＩＩＢタンパク質。
  13. 前記異種部分がＦｃドメインを含む、請求項１２に記載のバリアントＡｃｔＲＩＩＢタンパク質。
  14. 前記融合タンパク質がさらに、前記ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドと前記異種ポリペプチドとの間に位置するリンカードメインを含む、請求項１０〜１３のいずれか１項に記載のバリアントＡｃｔＲＩＩＢタンパク質。
  15. 前記タンパク質は、グリコシル化アミノ酸、ＰＥＧ化アミノ酸、ファルネシル化アミノ酸、アセチル化アミノ酸、ビオチン化アミノ酸、および脂質部分に結合したアミノ酸から選択される１または複数の修飾アミノ酸残基を含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載のバリアントＡｃｔＲＩＩＢタンパク質。
  16. 前記タンパク質がさらに、エピトープタグ、ＦＬＡＧタグ、ポリヒスチジン配列、およびＧＳＴ融合物から選択される精製配列を含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載のバリアントＡｃｔＲＩＩＢタンパク質。
  17. 前記バリアントＡｃｔＲＩＩＢタンパク質は、細胞ベースのアッセイにおいて、ミオスタチンおよび／またはＧＤＦ１１によるシグナル伝達を阻害する、請求項１〜１６のいずれか１項に記載のバリアントＡｃｔＲＩＩＢタンパク質。
  18. 請求項１〜１７のいずれか１項に記載のバリアントＡｃｔＲＩＩＢタンパク質を含む、薬学的調製物。
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