JP2014122165A

JP2014122165A - 免疫賦活剤

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Publication number: JP2014122165A
Application number: JP2012277661A
Authority: JP
Inventors: Tomoko Tatsuno; 智子辰野; Hiromichi Yamashiro; 宏道山城
Original assignee: Lintec Corp
Current assignee: Lintec Corp
Priority date: 2012-12-20
Filing date: 2012-12-20
Publication date: 2014-07-03

Abstract

【課題】新たな免疫賦活剤及び免疫療法剤の提供。
【解決手段】（Ａ）イミキモド又はその塩と、（Ｂ）下記一般式（１）で表されるピロリドン類とを組み合わせてなる免疫賦活剤。

（式中、Ｒは、水素原子又は炭素数１〜１２のアルキル基を示す。）
【選択図】なし

Description

本発明は、免疫賦活剤及び免疫療法剤に関する。

免疫療法は、元来生体が有している外来抗原排除という免疫応答を利用する療法であり、免疫系を賦活させることで治療するものである。免疫療法には、皮下、皮内、経皮投与法などがあり、免疫賦活剤と抗原とを順次に或いは同時に投与することで自然免疫系を活性化し、投与抗原に対する高い免疫応答を期待している。自然免疫系に関わる分子群としてトールライクレセプター（ＴＬＲｓ）が挙げられる。ＴＬＲｓはショウジョウバエにおいて同定された自然免疫に関与する分子群であるが、マウス及びヒトにおいてもそのホモログが同定されている。これまでに同定されているＴＬＲｓはＴＬＲ１からＴＬＲ１１まであるが、細胞表面に発現するものと細胞内エンドソームに発現するものに大別される。細胞内エンドソームに発現するＴＬＲｓはＴＬＲ３、７、８、９であり、そのリガンドは核酸物質である（ＴＬＲ３：ｄｓＲＮＡ，ＴＬＲ７／８：ｓｓＲＮＡ，ＴＬＲ９：ｓｓＤＮＡ）。ウイルス感染などによってこれらのＴＬＲｓからシグナルが入ると、細胞内でＩＬ−１α、ＩＦＮに関わる遺伝子群が転写され、免疫系が活性化される（非特許文献１）。

イミダゾキノリン誘導体であるイミキモド（ＣＡＳ登録番号：９９０１１−０２−６）はＴＬＲ７に選択的に結合する化合物であり（非特許文献２）、クリーム剤が尖圭コンジローマの治療薬として１９９７年にＦＤＡの承認を得ている（非特許文献３）。その作用機序はイミキモドそのものがコンジローマに作用するのではなく、免疫担当細胞中に発現するＴＬＲ７を介したサイトカイン産生促進による、生体が有する免疫応答惹起によって引き起こされると考えられる(非特許文献４)。また、表皮ランゲルハンス細胞（ＬＣ）にイミキモドが作用することで活性化が誘導され、抗腫瘍免疫が促進されることが報告されている（特許文献１、非特許文献５、６）。イミキモドによるアジュバント効果は上記抗腫瘍効果だけでなく、ＨＩＶワクチン投与時の免疫賦活剤としても使用されている（特許文献２）。その一方で、腫瘍細胞には種々ＴＬＲｓが発現していることが報告されており、ＴＬＲｓリガンドによる腫瘍の直接的殺傷効果を期待した臨床試験が行われている（非特許文献７）。

特表２０１１−５２４３９０号公報特開２０１０−１８９３９７号公報

Ｋｒｉｓｈｎａｎら、ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＭｅｄｉｃｉｎｅ、３９、４２１−４３８（２００７）Ｌｅｅら、ＰＮＡＳ、１００、６６４６−６６５１（２００３）ベセルナクリーム５％インタビューフォーム（持田製薬株式会社、２００７）Ｒａｊａｇｏｐａｌら、Ｂｌｏｏｄ、１１５、１９４９−１９５７（２０１０）Ｓｕｚｕｋｉら、ＪＩｎｖｅｓｔＤｅｒｍａｔｏｌ、１１４、１３５−１４１（２０００）Ｒｅｃｈｔｓｔｅｉｎｅｒら、ＪＩｍｍｕｎｏｌ、１７４、２４７６−２４８０（２００５）ｉｍｇｅｎｅｘ社資料（２００９）

従来の免疫賦活剤の効果は十分ではなく、さらに優れた免疫賦活剤及びそれを用いた免疫療法剤が望まれていた。
よって、本発明の課題は、新たな免疫賦活剤及び免疫療法剤を提供することにある。

そこで本発明者は、種々の成分を用いて脾臓細胞から産生される液性因子の産生誘導能を指標として免疫賦活作用を検討してきたところ、イミキモドと特定のピロリドン類の組み合わせが強い免疫賦活能を有し、免疫賦活剤として有用であることを見出し、本発明を完成した。

すなわち、本発明は、（Ａ）イミキモド又はその塩と、（Ｂ）下記一般式（１）で表されるピロリドン類とを組み合わせてなる免疫賦活剤を提供するものである。

（式中、Ｒは水素原子又は炭素数１〜１２のアルキル基を示す）

また、本発明は、上記免疫賦活剤を含有する免疫療法剤を提供するものである。

本発明によれば、脾臓細胞の細胞増殖の増大、及び腫瘍細胞の表面分子であるＭＨＣクラスＩ・IIの発現を亢進するため、優れた免疫賦活剤が提供できるとともに、その免疫賦活剤を含む免疫療法剤が提供できる。

脾臓細胞の増殖に対するイミキモド単独（比較用製剤１）及びイミキモドとピロリドン類との組み合わせ（免疫賦活剤１、２）の効果を示す図である。ＭＨＣクラスＩ分子の発現に対するイミキモド単独（比較用製剤２）及びイミキモドとピロリドン類との組み合わせ（免疫賦活剤３）の効果を示す図である。ＭＨＣクラスII分子の発現に対するイミキモド単独（比較用製剤２）及びイミキモドとピロリドン類との組み合わせ（免疫賦活剤３）の効果を示す図である。

本発明の免疫賦活剤は、（Ａ）イミキモド又はその塩と、（Ｂ）上記一般式（１）で表されるピロリドン類とを組み合わせてなる。

イミキモドは、化学名１−（２−メチルプロピル）−１Ｈ−イミダゾ〔４，５−ｃ〕キノリン−４−アミン（Ｒ８３７とも呼ばれる）であり、尖圭コンジローマ治療薬として用いられている化合物である。イミキモドの塩としては、塩酸塩、硫酸塩等の無機酸塩、酢酸塩、クエン酸塩等の有機酸塩が挙げられる。

ピロリドン類（１）を示す一般式（１）中、Ｒとしては炭素数１〜１２のアルキル基が好ましく、炭素数１〜６のアルキル基がより好ましく、炭素数１〜３のアルキル基がさらに好ましい。Ｒの具体例としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基が挙げられるが、メチル基、エチル基が特に好ましい。すなわち、ピロリドン類（１）としては、Ｎ−メチルピロリドン、Ｎ−エチルピロリドンが特に好ましい。

イミキモド又はその塩とピロリドン類（１）とを組み合わせて用いれば、後記実施例に示すように、イミキモド単独投与の場合に比べて、脾臓細胞の増殖を亢進し、また腫瘍細胞ＭＨＣクラスＩ及びII分子発現を上昇させる作用を有する。従って、この組み合わせは、ヒトを含む哺乳動物の免疫賦活剤として有用であり、免疫療法剤、特に癌免疫療法剤として有用である。

本発明の免疫賦活剤は、イミキモド又はその塩と、ピロリドン類（１）とを組み合わせて投与できればよく、同時投与であっても、互いに逐次投与であってもよい。また、イミキモド又はその塩と、ピロリドン類（１）とは、投与経路が同一でも、互いに異なっていてもよい。

本発明の免疫療法剤は、上記の免疫賦活剤を含むものであり、好ましくはさらに抗原を含むものである。本発明の免疫療法剤は、免疫賦活剤および抗原を含む１つの製剤としてもよいし、免疫賦活剤および抗原を別体の製剤として含むキットであってもよい。また、他の免疫賦活剤、免疫調節剤、不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）、ＴＬＲ賦活剤（クレスチン、リポポリサッカロイド、フラジェリン、ＣｐＧヌクレオチド）等と併用してもよい。

本発明の免疫賦活剤及び免疫療法剤の投与方法としては、経皮投与、経粘膜投与、経口投与、皮下注射、皮内注射等が挙げられるが、経皮投与がより好ましい。本発明の免疫賦活剤と抗原を併用して投与する場合には、その抗原特異的免疫応答を誘導することができる。抗原の投与は、本発明の免疫賦活剤と抗原とを同時に投与してもよく、また本発明の免疫賦活剤を投与した後に抗原を投与してもよい。

上記抗原としては、免疫応答を引き起こすことができる分子であれば、特に制限はないが、例えばペプチド又はタンパク質が挙げられる。ペプチドとしては、天然由来のペプチド又は合成ペプチドのいずれでもよく、３〜２５のアミノ酸残基からなるペプチドが好ましい。タンパク質としては、天然由来のタンパク質又は合成タンパク質のいずれでもよい。具体的には、癌抗原（腫瘍抗原）、種々のウイルス由来抗原、感染原因菌由来抗原、種々のアレルギー原因抗原等が挙げられる。上記腫瘍抗原としては、自己の腫瘍細胞を無毒化して得られる自己腫瘍抗原であってもよい。

本発明の免疫賦活剤又は免疫療法剤中の成分（Ａ）の含有量は、０．００００１質量％以上が好ましく、０．００１質量％以上がより好ましく、０．１質量％以上がさらに好ましい。なお、本発明の免疫賦活剤又は免疫療法剤の剤形が、後述する貼付剤である場合には、貼付剤の粘着層中に粘着剤を含むことが必要であるため、貼付剤の粘着層中の成分（Ａ）の含有量は、０．００００１〜２５質量％が好ましく、０．００１〜２０質量％がより好ましく、０．１〜１５質量％がさらに好ましい。

また、本発明の免疫賦活剤又は免疫療法剤中の成分（Ｂ）の含有量は、０．００００１質量％以上が好ましく、０．００１質量％以上がより好ましく、０．１質量％以上がさらに好ましい。なお、本発明の免疫賦活剤又は免疫療法剤の剤形が、後述する貼付剤である場合には、貼付剤の粘着層中の成分（Ｂ）の含有量は、０．００００１〜２５質量％が好ましく、０．００１〜２０質量％がより好ましく、０．１〜１５質量％がさらに好ましい。

また、成分（Ａ）と成分（Ｂ）との含有質量比（成分（Ａ）：成分（Ｂ））は、１：１００〜１００：１が好ましく、１：５０〜５０：１がより好ましい。

また、本発明の免疫賦活剤及び免疫療法剤には、希釈剤、溶解助剤、吸収促進剤等として、常温で液状又はペースト状の成分が含まれていてもよく、例えば、流動パラフィン、スクワラン、イソパラフィン等の炭化水素類；パラフィン系プロセスオイル、ナフテン系プロセスオイル等の石油系オイル；ホホバ油、ヒマシ油、ヒマワリ油、オリーブ油、ごま油、サフラワー油、スクワレン等の天然動植物油脂類；ステアリルアルコール、ラウリルアルコール、セトステアリルアルコール、オレイルアルコール、ヘキシルデカノール、オクチルドデカノール等の高級アルコール類；メチルフェニルポリシロキサン、メチルポリシロキサン等のシリコーン類；ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、ベヘニン酸、イソステアリン酸、オレイン酸等の高級脂肪酸類；アルキルグリセリルエーテル等の界面活性剤；水等が挙げられ、これらのうち１種又は２種以上を組み合わせて用いることができる。

本発明の免疫賦活剤又は免疫療法剤の剤形は、注射用剤又は経皮投与剤であることが好ましく、経皮投与剤であることがより好ましい。経皮投与剤は、注射用剤と比較して、非侵襲的であること、また操作が塗る、貼るなどの単純な作業になるため、医療従事者である必要がなく、患者自身によっても作業可能である点で優れている。このような経皮投与剤の具体的な剤形としては、液剤、軟膏剤、ローション剤、クリーム剤、スプレー剤等の他、パップ剤、テープ剤等の貼付剤などが挙げられる。これらの中でも貼付剤であることがより好ましく、角質剥離機能を有する貼付剤であることが特に好ましい。

角質剥離機能を有する貼付剤は、その粘着力をＪＩＳＺ０２３７に準拠した測定方法（対ベークライト板）で、好ましくは３〜２０Ｎ／２５ｍｍ程度に調整することにより得ることができる。

角質剥離機能を有する貼付剤の剥離により、皮膚表皮角質層を物理的に破壊させることができ、通常免疫賦活剤の適用後に適用される抗原の経皮吸収性を向上させることが出来るうえ、角質剥離機能を有する貼付剤の剥離による皮膚表皮角質層の破壊により皮膚下層に存在する抗原提示細胞（特に表皮ランゲルハンス細胞）の活性化が引き起こされる。すなわち、免疫賦活成分による皮膚下層に存在する抗原提示細胞（例えば表皮ランゲルハンス細胞や真皮樹状細胞など）の活性化と、皮膚表皮角質層の破壊による皮膚下層に存在する抗原提示細胞（特に表皮ランゲルハンス細胞）の活性化の両方を一つの貼付剤で行うことができる。

免疫療法剤として、免疫賦活剤と併用して抗原を投与する場合には、その抗原特異的免疫応答を誘導することができる。

抗原を投与する場合には、上記免疫賦活剤の投与と同時又は約９６時間以内に、好ましくは約７２時間以内に、特に好ましくは約４８時間以内に、抗原を投与する。

抗原は、そのまま投与してもよいが、抗原投与剤の形態にするのが好ましく、抗原投与剤の剤形は、注射用剤又は経皮投与剤であることが好ましく、経皮投与剤であることがより好ましい。この理由は、皮下注射された抗原は投与された局所から拡散するのに時間がかかり、皮膚下層中に点在する抗原提示細胞（例えば表皮ランゲルハンス細胞や真皮内樹状細胞等）に捕獲される効率が低くなるためである。これに対して、経皮投与の場合には、表皮角質層が皮膚透過のバリアとなってしまい、抗原の経皮吸収性が低いことが問題となるが、上記のように、皮膚表皮角質層を破壊することで劇的に抗原の経皮吸収性が高まるうえ、皮下注射に比べて皮膚表皮の比較的広い範囲に抗原が投与されるため、皮膚下層中に点在する抗原提示細胞に捕獲される効率が高くなるという利点を有する。

次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明する。

実施例１
イミキモド類似体（イミキモド塩酸、Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ製、別名：Ｒ８３７）とＮ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）をリン酸緩衝液（ＧＩＢＣＯ社製、商品名「ＰＢＳ（−）」）に溶解し、Ｒ８３７濃度１μｇ/ｍｌ、ＮＭＰ濃度１ｍＭである免疫賦活剤１を調製した。

実施例２
Ｒ８３７とＮＭＰをリン酸緩衝液（ＧＩＢＣＯ社製、商品名「ＰＢＳ（−）」）に溶解し、Ｒ８３７濃度１μｇ/ｍｌ、ＮＭＰ濃度：１０ｍＭである免疫賦活剤２を調製した。

実施例３
Ｒ８３７とＮＭＰをリン酸緩衝液（ＧＩＢＣＯ社製、商品名「ＰＢＳ（−）」）に溶解し、Ｒ８３７濃度１０μｇ/ｍｌ、ＮＭＰ濃度：１ｍＭである免疫賦活剤３を調製した。

比較例１
Ｒ８３７をリン酸緩衝液（ＧＩＢＣＯ社製、商品名「ＰＢＳ（−）」）に溶解し、Ｒ８３７濃度１μｇ/ｍｌである比較用製剤１を調製した。

比較例２
Ｒ８３７をリン酸緩衝液（ＧＩＢＣＯ社製、商品名「ＰＢＳ（−）」）に溶解し、Ｒ８３７濃度１０μｇ/ｍｌである比較用製剤２を調製した。

試験例
８〜１０週齢Ｂａｌｂ／ｃマウス（Ｈ−２^dハプロタイプ）から脾臓を取り出し、ピンセットで単一細胞化した。これらの細胞を０．９％塩化アンモニウム溶液で処理１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有するＲＰＭＩ１６４０培地（ＧＩＢＣＯ製）に懸濁した。これらの脾臓細胞を使用して、以下の評価を行った。

（細胞増殖評価）
１０％ＦＢＳＲＰＭＩ１６４０に懸濁した２×１０⁵個の脾臓細胞を９６ウェルプレートに播種し、免疫賦活剤１、２又は比較用製剤１で処理した（最終液量２００μｌ）。３７℃、５％ＣＯ₂存在下で７２時間培養後、各ウェルに２０μｌのＷＳＴ−１（タカラバイオ製、テトラゾリウム塩）を添加し、４時間後にマイクロプレートリーダ（サーモフィッシャーサイエンティフィック製）を使用してＯＤ４５０を測定することで細胞増殖活性を判定した。結果を図１に示す。図１はＯＤ４５０の吸光度を示す。
上記ＷＳＴ−１は、ミトコンドリアの呼吸鎖に存在し、生細胞にだけ活性のある「succinate-tetrazolium reductase（コハク酸塩テトラゾリウム還元酵素)」（EC1.3.99.1)によりホルマザン色素に変換される。すなわち、ホルマザン色素と生細胞の数とは直線的な相関を示し、ホルマザン色素の吸光度は生細胞の数に比例する。

（腫瘍細胞ＭＨＣクラスＩ・II発現亢進評価）
ＭＨＣクラスＩ・II分子が通常の体細胞と比較して極めて低発現であるＢ１６Ｆ１０メラノーマ細胞にはＴＬＲ１−７が発現しており、イミキモドを担がんマウスに投与することでＢ１６Ｆ１０を拒絶することが知られている。この作用が抗腫瘍免疫増強によるものであると予想されるが、Ｂ１６Ｆ１０に発現するＴＬＲ７からイミキモドによりシグナルが入り、その結果ＭＨＣクラスＩ・II分子が発現した可能性も考えられる。

マウス腫瘍細胞：Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｈ−２^b拘束性）由来Ｂ１６Ｆ１０メラノーマ（ＡＴＣＣより購入、ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ−１９９２）を１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ製）で維持した。２×１０⁴個のＢ１６Ｆ１０細胞を２４ウェルプレートに播種し、免疫賦活剤３又は比較用製剤２を添加後、３７℃、５％ＣＯ₂存在下で培養した。培養開始から７２時間後に細胞を回収し、ＭＨＣクラスＩ抗体である、ＦＩＴＣ−Ｈ−２^b（バイオレジェンド製、クローン名：Ｍ１/４２）及びＭＨＣクラスII抗体である、ＰＥ−Ｉ−ａ^b（バイオレジェンド製、クローン名：２５−９−１７）を添加して４℃で３０分間反応させた。その後、１％ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液で洗浄後、フローサイトメータによりＭＨＣクラスＩ（図２）、又はＭＨＣクラスII（図３）の発現量をＭＦＩ（平均蛍光強度）を指標として検出した。

図１の結果から、免疫賦活剤１〜２は比較用製剤１と比較して、マウス脾臓細胞の増殖を亢進していることが分る。また、図２、３から、免疫賦活剤３は比較用製剤２と比較して腫瘍細胞ＭＨＣマウスＩ・II分子発現を上昇させていることが分かる。

Claims

（Ａ）イミキモド又はその塩と、（Ｂ）下記一般式（１）で表されるピロリドン類とを組み合わせてなる免疫賦活剤。

（式中、Ｒは、水素原子又は炭素数１〜１２のアルキル基を示す。）
成分（Ａ）と成分（Ｂ）とが一の製剤中に含まれるものである請求項１記載の免疫賦活剤。
成分（Ｂ）がＮ−メチルピロリドン又はＮ−エチルピロリドンである請求項１又は２記載の免疫賦活剤。
請求項１〜３のいずれか１項に記載の免疫賦活剤を含有する免疫療法剤。