JP2573797C - - Google Patents

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【発明の詳細な説明】 【０００１】 【産業上の利用分野】 本発明は植物細胞の遺伝学的方法に関する。 【０００２】 【従来の技術】シャトルベクター RuvkunとAusubel（1981）Nature 298：85ー88、により開発されたシャトルベ
クターは、外来遺伝物質を、大プラスミド、ウイルスまたはゲノムの選ばれた位
置に挿入する方法を可能とする。大プラスミド又はゲノムを扱う場合、２つの主
要な問題がある。１つは大プラスミドが、各制限酵素に対して多くの部位を有す
ることである。特定の部位特異的切断反応は再現性がなく、多部位切断反応とそ
れに続く連結は、変化させたくない多くのフラグメントの順序および方向を混乱
させる大きな難点を生ずる。第２に大ＤＮＡプラスミドを用いた形質転換効率は
非常に低い。シャトルベクターは、しばしばインビトロで、外来遺伝物質を小プ
ラスミドに容易に挿入し、次に通常インビボ技術により、大プラスミドに移すこ
とにより、これらの困難を打開することが可能である。 【０００３】 シャトルベクターは、究極の受容細菌へ導入され得る通常プラスミドである、
ＤＮＡ分子より成る。それはまた、外来遺伝物質が挿入され得る受容ゲノムのフ
ラグメントのコピーと、これもまた受容ゲノムフラグメントに挿入される選択形
質をコードするＤＮＡセグメントを含む。選択形質（"マーカー"）は、トランス
ポソン突然変異誘発または制限酵素とリガーゼにより容易に挿入される。 【０００４】 該シャトルベクターは究極受容細胞、典型的にはアグロバクテリウム属の細菌
、へ三親交雑（RuvkunとAusubel、前出）、二親交雑での自己可動性ベクターの
直接移送、アグロバクテリウム細胞による外部ＤＮＡの直接取込み（M.Holsters
et al.（1978）Molec．Gen．Genet．163：181-187 の条件を用いる"形質転換"
）、他の細菌細胞とアグロバクテリウムのスフェロプラスト融合、リポソーム包
括Ｄ ＮＡの取込み、またはインビトロでパッケージ可能なウイルス上にあるシャトル
ベクターの感染、により導入される。三親交雑はプラスミド可動と接合移送に関
する遺伝子を有する可動性プラスミドを有する菌株とシャトルベクターを有する
菌株との交雑を含む。もしシャトルベクターがプラスミド遺伝子により移動可能
ならば、そのシャトルベクターは大ゲノム、例えばアグロバクテリウム菌株のTi
またはRiプラスミドを有する受容細胞へ移される。 【０００５】 シャトルベクターが受容細胞へ導入された後、マーカーのいずれか一方の側で
の１回の組換えを伴う二重乗換えが期待される。この現象はマーカーを含むＤＮ
Ａセグメントを受容ゲノムへ移し、挿入物を欠く相同セグメントと置換し得る。
元のシャトルベクターを欠失した細胞を選択する為に、そのシャトルベクターは
究極受容細胞中で複製が不可能であるか、受容細胞に既存の独立に選択可能なプ
ラスミドと不和合性でなければならない。この為の１つの共通的な手段は、シャ
トルベクターと不和合性でかつ他の薬剤耐性マーカーを有する他のプラスミドを
第３の親に備えることである。 【０００６】 従って両薬剤耐性で選択すると、生存細胞はその中でシャトルベクターのマー
カーが受容ゲノムと組換えを起こしたもののみである。もしシャトルベクターが
余分のマーカーを持っていれば、シャトルベクターと受容プラスミド間での１回
の乗換えの結果生じる完全なシャトルベクターが受容プラスミドに組み込まれた
ものを有する細胞を選択し、排除できる。もし外来遺伝物質が選択しようとする
マーカー内か、近接した位置に挿入されていれば、同じ二重組換の結果、それは
受容プラスミドに組み込まれ得る。相同フラグメントのマーカー内または近接し
た位置でなく、外来遺伝物質がマーカーから遠く離れて挿入されている場合、外
来遺伝物質とマーカーの間で組換えが起こり、外来遺伝物質を移せないことも起
こるだろう。 【０００７】 シャトルベクターはアグロバクテリウムのプラスミドの操作に有用であること
が証明されている：D.J.Garfinkel et al.（1981）Cell 27：143-153，A.J.M.Ma tzke and M.D.Chilton（1981）J.Molec.Appl.Genet．1：39-49、およびJ.Leeman
s et al.（1981）J.Malec．Appl．Genet．1：149-164を参照のこと、そこではシ
ャトルベクターを"中間ベクター（intermedeate vectors）"と呼んでいる。 【０００８】アグロバクテリウム−概説 グラム陰性細菌、リゾビウム科のアグロバクテリウム属には、アグロバクテリ
ウム・チューメファシエンス（A.tumefaciens）種とアグロバクテリウム・リゾ
ゲネス（A.rhizogenes）種がある。これらの種は夫々植物のクラウンゴール病、
毛状根病（hairly root disease）の原因となる。クラウンゴールは未分化組織
の瘤（gall）化に特徴付けられる。毛根は感染組織での異常な根（ルート）の誘
導により特徴付けられる奇形腫である。両病において、異状な増殖植物組織は、
植物により正常には生産されない通常オピンとして知られている、１つまたはそ
れ以上のアミノ酸誘導体を生産し、これは感染細菌により異化される。既知のオ
ピンは３族に分類され、その典型的なメンバーはオクトピン、ノパリン、アグロ
ピンである。異常増殖組織の細胞は培養により増殖可能であり、また適当な条件
下で形質転換した表現型を保ちつつ完全な植物に再生される。 【０００９】 アグロバクテリウムのヴィルレント株はアグロバクテリウム・チューメファシ
エンスではTi（腫瘍誘導；Tumor-inducing）プラスミド、アグロバクテリウム・
リゾゲネスではRi（ルート誘導；root- inducing）プラスミドと呼ばれる大プラ
スミドを有する。これらのプラスミドを菌から消去すると病原性を失う。Tiプラ
スミドはＴ−ＤＮＡ（転移ＤＮＡ）と呼ばれる、腫瘍では宿主植物のゲノム中に
組み込まれている領域を含む。Ｔ−ＤＮＡは数種の転写物をコードしている。突
然変異の研究からこれらのうちのいくつかは腫瘍の増殖の誘導に関与しているこ
とが示された。tml、tmrおよびtms遺伝子の変異は夫々巨大腫瘍（タバコで）、
ルート出現傾向、シュート誘発傾向を示す。Ｔ−ＤＮＡはまた少なくとも１つの
オピンシンセターゼ遺伝子をコードし、Tiプラスミドは、しばしば、それが合成
し得るオピンにより分類される。各Ｔ−ＤＮＡ遺伝子はＴ−ＤＮＡプロモーター
の支配下にある。このＴ−ＤＮＡプロモーターは真核生物のプロモーターに構造 が類似しており、形質転換植物細胞でのみ機能するらしい。Tiプラスミドはまた
Ｔ−ＤＮＡ領域外にも遺伝子を担っている。これらの遺伝子はオピン異化、発癌
性、アグロシン感受性、複製、細菌細胞への自己輸送の機能に関与している。Ri
プラスミドはTiプラスミドと類似の構造をとっている。植物細胞の形質転換に関
与する一連の遺伝子とＤＮＡ配列は、以下では形質転換誘導因子（ＴＩＰ）とし
て総合的に呼ぶ。従ってＴＩＰの名称はTiおよびRiプラスミド両者を包含する。
ＴＩＰの取り込まれたセグメントを、ここではＴ−ＤＮＡと称し、Tiプラスミド
あるいはRiプラスミドに由来している。最近のアグロバクテリウム起因病の一般
的総説はD.J.Marlo(1982)、Adv．Plant Pathol．1：139-178、L.W.Ream and M.P
.Gordon（1982）、Science 218：854-859,および M.W.Bevan and M.D.Chilton（
1982）、Ann.Reb.Genet．16：357-384; G.Kahl and J.Schell（1982）Molecular
Biology of Plant Tumorsに述べられている。 【００１０】アグロバクテリウム−植物組織の感染 植物細胞は既知の多くの方法によりアグロバクテリウムにより形質転換され得
る；例えば植物細胞とアグロバクテリウムとの共存培養；植物の直接感染；植物
プロトプラストとアグロバクテリウムスフェロプラストの融合；植物細胞プロト
プラストによる遊離ＤＮＡの取込みによる直接形質転換；部分的に細胞壁を再生
しているプロトプラストの完全な細菌による形質転換；プロトプラストのＴ−Ｄ
ＮＡ含有リポソームによる形質転換；Ｔ−ＤＮＡを保持するウイルスの利用；ミ
クロインジェクション等。どの方法も遺伝子が確実に発現される限り充分であり
、有糸分裂および減数分裂を通じて安定に伝達される。 【００１１】 植物組織のアグロバクテリウムによる感染は当業者には公知の単純な技術であ
る（例えばD.N.Butcher et al.（1980）in Tissue Culture Methods for Plant
Pathologists，eds.：D.S.Ingrams and J.P.Helgeson、pp.203-208 参照）。植
物は種々のどの方法によっても傷つけられる、例えば刃で切る、針で穴をあける
、あるいは研磨剤で摺るなど。次いで傷口を腫瘍誘導細菌を含む溶液で感染させ
る。完全な植物を感染させる他の方法はジャガイモの塊茎小片（D.K.Anand and
G.T. Herberlein（1977）Amer.J.Bot．64：153-158）またはタバコ茎の断片（Binns e
t al.）などの組織の小片を植えつけることである。誘導後、腫瘍は植物ホルモ
ンを含まない培地で組織培養され得る。ホルモン非依存性増殖は形質転換植物組
織の典型であり、培養組織の増殖の通常の条件とは大いに対照的である（A.C.Br
aun（1956）Cancer Res.16：53-56）。 【００１２】 アグロバクテリウムはまた単離細胞および培養細胞（Marton et al.（1979）
Nature 277：129-131）、および単離したタバコ葉肉プロトプラストを感染し
得る。後者の技術では、新しい細胞壁を一部再生させる時間をおいた後、一定時
間の間アグロバクテリウム細胞を培養に加え、次いで抗生物質を添加し殺した。
Tiプラスミドを保持するアグロバクテリウム・テューメファシエンス細胞に接触
した細胞のみが、ホルモンを含まない培地にプレートしたときカルスを形成した
。大部分のカルスはオピン同化に関する酵素活性を有していた。他の研究者（R.
B.Horsch and R.T.Fraley（18 January 1983 15th Miami Winter Symposium）
は共存培養により、形質転換しホルモン非依存性増殖するカルスを高頻度（10％
以上）で得、カルスの95％がオピンを作った。M.R.Davey et al.（1980）in Ing
ram and Helgeson、前出、pp.209-219、は、プロトプラスから再生した老細胞の
感染について述べている。 【００１３】 植物プロトプラストはＴＩＰプラスミドの直接取込みにより形質転換され得る
。M.R.Davey et al.（1980）Plant Sci.Lett.18：307-313,およびM.R.Davey et
al.（1980）in Ingram and Helgeson、前出、は、ペチュニアのプロトプラスト
をポリ-Ｌ-α-オルニチン存在下でTiプラスミドで形質転換し、培養によりオピ
ン合成とホルモン非依存性増殖の表現型を示した。その後、ポリエチレングリコ
ールがTi取込みを促進し、特定のＴ−ＤＮＡ配列がゲノムに取り込まれることが
示された。（J.Draper et al.（1982）Plant and Cell Physiol．23：451-458、
M.R.Davey et al.（1982）in Plant Tissue Culture 1982、ed：A.Fujiwara、pp
.515-516）。F.A.Krens et al.（1982）Nature 296：72-74、は同様の結果をポ
リエチレングリコール次いでカルシウムショックによる方法で報告したが、彼ら の結果では取り込まれたＴ−ＤＮＡはTiプラスミド配列の近接部分を含んでいた
。 【００１４】 ＤＮＡを取り込ませる他の方法にリポソームの使用がある。ＤＮＡ含有リポソ
ームの調製は、Papahadjopoulosの米国特許第4,078,052号と第4,235,871号にあ
る。Ti−ＤＮＡをリポソームによる導入する方法が報告されている（T.Nagata e
t al.（1982）in Fujiwara、前出、pp.509-510、および T.Nagata（1981）Mol.G
en.Genet.184：161-165）。類似の系に細胞壁を除去した植物と細菌の細胞の融
合がある。この技術の例は S.Hasezawa et al.（1981）Mol．Gen．Genet.182：2
06-210により報告されているアグロバクテリウムのスフェロプラストによるツル
ニチニチソウ（Vinca）の形質転換である。植物プロトプラストは細胞壁が不完
全なアグロバクテリウム細胞を取り込むことができる（S.Hasezawa et al.（198
2）in Fujiwara、前出、pp.517-518）。 【００１５】 Ｔ−ＤＮＡは２つのプロトプラストの融合による再生した組織に移り、一方の
みが形質転換される（G.J.Wullems et al.（1980）Theor．Appl.Genet.56：203-
208）。植物の再生の項で詳しく述べるように、Ｔ−ＤＮＡは減数分裂でも伝わ
り、単純なメンデル法則に従って子孫に伝達される。 【００１６】アグロバクテリウム−植物の再生 正常な形態を有する分化植物組織がクラウンゴール腫瘍から得られた。A.C.Br
aun and H.N.Wood（1976）Proc.Natl.Acad.Sci．USA 73：496-500、はタバコ奇
形腫（teratomas）を正常な植物につぎ木し、正常に見える開花し得るシュート
を得た。このシュートは培地におくと、オピン生成能と、植物ホルモン非依存増
殖能を保持した。選択された植物では、これら腫瘍表現型は子孫に伝達されない
ようで、多分減数分裂の間に消失した（R.Turgeon et al.（1976）Proc.Natl.Ac
ad.Sci．USA 73：3562-3564）。自然に腫瘍の性質を失った、あるいは奇形腫の
種から生じた植物は、当初すべてのＴ−ＤＮＡを失ったように思われていた（F.
-M.Yang et al.（1980）In Vitro 16：87-92，F.Yang et al.（1980）Molec.Gen
.Genet.177：707-714、M.Lemmers et al.（1980）J.Mol.Biol.144：353-376）。 しかし、ホルモン（１mg/l カイネチン）処理後復帰した植物を用いた後の研究
で、減数分裂を経た植物は形質転換表現型に関するＴ−ＤＮＡ遺伝子は失ってい
るが、Ｔ−ＤＮＡの両端に相同性のある配列を維持していた（F.Yang and R.B.S
impson（1981）Proc.Natl.Acad.Sci．USA 78：4151-4155）。 【００１７】 G.J.Wullems et al.（1981）Cell 24：719-724、はさらに、オピン同化に関す
る遺伝子が、その植物は雄性不稔であるが、減数分裂を通して伝わること、そし
ておそらくＴ−ＤＮＡはそのままメンデル法則に従って遺伝し得ることを示した
（G.Wullems et al.（1982）in A.Fujiwara、前出）。L.Otten et al.（1981）M
olec.Gen.Genet.183：209-213、は、シュートを生じる腫瘍生成に tms（シュー
ト誘導）遺伝子座でのTn７トランスポソン起因のTiプラスミド変異を用いた。こ
れらのシュートが植物中で再生すると自己稔性花を生じた。着生した種が発芽し
た植物はＴ−ＤＮＡを有しオピンを生成した。tmr（ルート誘導）変異を用いた
同様の実験で、全Ｔ−ＤＮＡが減数分裂を通して子孫に伝わり、これら子孫で、
程度にバラツキがあるが、ノパリン遺伝子が発現すること、また同時に伝達され
た酵母のアルコール脱水素酵素Ｉ遺伝子は発現しないことが示された（K.A.Bart
on et al.（1983）Cell 32：1033-1043）。Ｔ−ＤＮＡ配列を欠く再生組織はお
そらく腫瘍に混在していた非形質転換細胞の子孫であるらしい（G.Ooms et al.
（1982）Cell 30：589-597）。アグロバクテリウム・リゾゲネスによる形質転換
の結果生じたルートは比較的容易に苗に再生することが示された。（M.-D.Chilt
on et al.（1982）Nature 295：432-434）。 【００１８】アグロバクテリウム−TIP プラスミド上の遺伝子 ＴＩＰプラスミドのＴ−ＤＮＡ内に多数の遺伝子が同定された。約半ダースの
オクトピンプラスミドＴ−ＤＮＡ転写物がマッピングされ（S.B.Gelvin et al.
（1982）Proc.Natl.Acad.Sci．USA 79：76-80、L.Willmitzer et al.（1982）EM
BO J．1：139-146）、またいくつかの機能が明確にされた（J.Leemans et al.（
1982）EMBO J．1：147-152）。オクトピン型プラスミドの４つの遺伝子が tms、
tmr およびtmlを含むトランスポソン変異誘発により充分明確になった（D.J. Garfinkel et al.（1981）Cell 27：143-153）。これらの遺伝子に変異をもつTi
プラスミドは、ニコチニア・タバカムの腫瘍カルスを刺激し、シュートを生じ、
ルートを生じ、そして正常より大きくなる。他の宿主では、これら遺伝子の変異
は、異なった表現型を誘導し得る（Chilton，M.D．Ann.Rev.Genet.（1982）参照
）。tmsとtmrの表現型は、腫瘍に存在する植物ホルモンレベルの差異と相関して
いる。サイトカイニン：オーキシン比の相違は、非形質転換カルス組織でシュー
トまたはルート形成を誘導する培養中のサイトカイン：オーキシン比の相違と類
似している(D.E．Akiyoshi et al.（1983）Proc.Natl.Acad.Sci．USA 80：407-4
11)。tmsまたはtmrどちらか一方のみの機能遺伝子を持つＴ−ＤＮＡ（機能するt
mlのみの場合ではないが）は、明白な腫瘍増殖を刺激し得る。シュートとルート
の刺激は機能tmlにより夫々促進と阻害を受ける（L.W.Ream et al.（1983）Proc
.Natl.Acad.Sci．USA 80：1660-1664）。Ｔ−ＤＮＡ遺伝子の変異が植物ゲノム
へのＴ−ＤＮＡの挿入に影響することはないようである（J.Leemans et al.（19
82）同上；L.W.Ream et al.（1983）同上）。オクトピンシンセターゼをコード
するocs遺伝子はH.De Greve et al.（1982）J.Mol.Appl．Genet.1：499-511、に
より塩基配列が決定された。これはイントロン（真核遺伝子に共通して見られる
介在配列で転写後ｍＲＮＡのプロセッシングの間にメッセンジャー前駆体から除
かれる）を有していない。また真核の転写シグナル（ＴＡＴＡボックス）とポリ
アデニル化部位がある。オクトピンシンセターゼを有する植物細胞はホモアルギ
ニンを無毒化するので、ocs遺伝子は、外来ＤＮＡによる形質転換された植物細
胞の有効な選択マーカーとなり得る（G.M.S.Van Slogteren et al.（1982）Plan
t Mol.Biol．1：133-142）。 【００１９】 ノパリンTiプラスミドはノパリンシンセターゼ遺伝子（nos）をコードしてお
り、nosは A．Depicker et al.（1982）J.Mol.Appl.Genet.1：561-573、により
配列決定された。ocs遺伝子と同様nosもイントロンがない。２つのポリアデニン
化部位の候補とＴＡＴＡボックスとなり得る配列がある。ocsと対照的にnosの上
流にはＣＡＴボックスとして知られる転写シグナルらしい配列がある。J.C.McPh
ersson et al.（1980）Proc.Natl.Acad．Sci.USA 77：2666-2670、は、クラウン ゴール組織のＴ−ＤＮＡがコードするｍＲＮＡのインビトロ翻訳を報告した。 【００２０】 毛根Ｔ−ＤＮＡの転写もまた検出された（L．Willmitzer et al.（1982）Mol.
Gen.Genet.186：16-22）。機能的には毛根症候群はtmrの変異したTiプラスミド
によりもたらされるクラウンゴール腫瘍と同等のようである（F.F.White and E.
W.Nester（1980）J.Bacteriol.144：710-720）。 【００２１】 真核生物において、ＤＮＡのメチル化（特にシトシン残基の）は転写不活性化
と相関している。比較的メチル化が少ない遺伝子はｍＲＮＡに転写される。Gelv
in et al.（1983）Nucleic Acids Res.1：159-174、はクラウンゴール腫瘍のＴ
−ＤＮＡは常に少なくともメチル化されていない１コピーが存在することを見出
した。同じゲノムがメチル化されている多くの他のＴ−ＤＮＡコピーを含むとい
うことは１つ以上の過剰のＴ−ＤＮＡのコピーは生物学的に不活性であることを
示唆する（G．Ooms et al.（1982）Cell 30：589-597 も参照）。 【００２２】 TiプラスミドはＴ−ＤＮＡ領域の外側にあり、感染過程に必要な他の遺伝子を
コードしている（ノパリンプラスミドについては M.Holsters et al.（1980）Pl
asmid 3：212-230,オクトピンプラスミドについては H.De Greve et al.（1981
）Plasmid 6：235-248、D.J.Garfinkeland E.W.Nester（1980）J.Bacteriol 144
：732-743、および G.Ooms（1980）J.Bacteriol 144：82-91参照）。最も重要な
のは onc遺伝子で、これが変異するとTiプラスミドの発癌性を失わせる（これら
の遺伝子座はビルレンスに関する言葉virとして知られている）。onc遺伝子はト
ランスに作用し、異なったプラスミド型で物理的に他のプラスミドに局在してい
るＴ−ＤＮＡでの植物細胞の形質転換を引き起こし得る（J.Hille et al.（1982
）Plasmid 7：107-118、H.J．Klee et al.（1982）J.Bacteriol 150：327-331、
M.-D.Chilton（18 January 1983）15th Miami Winter Symp.）。ノパリンTiＤＮ
ＡはTiプラスミドからの切出し、または宿主ゲノムへの取込みに関与するらしく
、Ｔ−ＤＮＡの左または右側の境界に極めて隣接している約25塩基対の順方向繰
り返し配列（direct repeat）を有し（N.S.Yadav et al.（1982）Proc.Natl.Aca
d. Sci.USA 79：6322-6326）、そして類似配列がオクトピンＴ−ＤＮＡ境界に隣接
した場所に見つかっている（R.B.Simpson et al.（1982）Cell 29：1005-1014）
。オピン同化はオクトピンおよびノパリン型プラスミドの夫々ocsおよびnos遺伝
子により特徴付けられる。Tiプラスミドはまた複製開始点を含むそれ自身の増殖
に必要な機能をもコードしている。Tiプラスミド転写物は S.B.Gelvin et al.（
1981）Plasmid 6：17-29、により、アグロバクテリウム・チューメファシエンス
細胞中に見出されており、彼らはＴ−ＤＮＡ領域が非Ｔ−ＤＮＡ配列に沿って弱
く転写されることを見い出した。Tiプラスミドにより支配される性質は Merlo、
前出（特に、第２表参照）およびReam and Gordon、前出、によりまとめられて
いる。 【００２３】アグロバクテリウム−ＴＩＰプラスミドＤＮＡ 種々のオクトピン型Tiプラスミドは、互いにほぼ100％相同性があることがＤ
ＮＡハイブリダイゼーション（T.C.Currier and E.W.Nester（1976）J.Bacterio
l.126：157-165）または制限酵素解析（D.Sciaky et al.（1978）Plasmid 1：23
8-253）により調べられた。ノパリン型Tiプラスミドは互いに少なくとも67％相
同性がある（Currier and Nester、前出）。種々のRiプラスミドは互いに非常に
相同性があることが明らかとなった（P.Costantino et al.（1981）Plasmid 5：
170-182）。N.H.Drummond and M.-D.Chilton（1978）J.Bacteriol.136：1178-11
83、は、オクトピンおよびノパリン型Tiプラスミドは比較的狭い部分に互いに相
同性があることを示した。これらの相同性は、G.Engler et al.（1981）J.Mol B
iol.152：183-208、により詳しくマップされた。それらは、４つの類似領域の３
つが、更に３（Ｔ−ＤＮＡにまたがる）、４（特定のonc遺伝子を含む）、およ
び９（onc遺伝子を有する）の類似領域に細分化されることを見出した。連結し
ている相同領域は、少なくともtra遺伝子（Tiプラスミドの他の細菌細胞への接
合伝達に関与する）と、複製および不和合性に関する遺伝子とを含む。この領域
はリゾビアッシー科の別の属であるリゾビウムの一種から分離されたSymプラス
ミド（共生窒素固定に関与する）と相同性がある（R.K.Prakash et al.（1982）
Plasmid 7：271-280）。４つの領域の順序は保存されていないが、いずれも同一 方向に配置している。Ｔ−ＤＮＡ配列の一部はノパリンおよびオクトピンプラス
ミド間で極めて良く保存されている（M.-D．Chilton et al.（1978）Nature 275
：147-149、A.Depicker et al.（1978）Nature 275：150-153）。Riプラスミド
はそれらの間、およびオクトピン（F.F.White and E.W.Nester（1980）J.Bacter
iol.144：710-720）とノパリン（G.Risuleo et al.(1982)Plasmid 7：45-51）の
両Tiプラスミドにはかなり相同性がある。その領域はおもにonc遺伝子をコード
している領域である。RiＴ−ＤＮＡはTiプラスミドの両型のＴ−ＤＮＡに弱いな
がらも、かなり相同性がある（L.Willmitzer et al.（1982）Mol.Gen.Genet.186
：3193-3197）。未感染のニコチニア・グラウカの植物ＤＮＡは、ｃＴ−ＤＮＡ
（細胞のＴ−ＤＮＡ）と呼ばれる配列を含んでおり、RiＴ−ＤＮＡの一部と相同
性がある（F.F.White et al.（1983）Nature 301：348-350）。 【００２４】 Ti（M.-D.Chilton et al.（1977）Cell 11：263-271）またはRi（M.-D.Chilto
n（1982）Nature 295：432-434、F.F.White et al.（1982）Proc．Natl.Acad.Sc
i．USA 79：3193-3197、L.Willmitzer（1982）Mol.Gen.Genet．186：16-22）プ
ラスミドの一部分は、腫瘍植物細胞のＤＮＡに見出される。転移したＤＮＡはＴ
−ＤＮＡとして知られている。Ｔ−ＤＮＡは核内（M.P.Nuti et al.（1980）Pla
nt Sci.Lett．18：1-6、L.Willmitzer et al.（1980）Nature 287：359-361、M.
-D.Chilton et al.（1980）Proc.Natl.Acad.Sci．USA 77：4060-4064）の宿主Ｄ
ＮＡ（M.F.Thomashow et al.（1980）Proc.Natl.Acad.Sci．USA 77：6448-6452
、N.S.Yadav et al.（1980）Nature 287：458-461）に取り込まれる。 【００２５】 M.F.Thomashow et al.（1980）Proc.Natl.Acad.Sci．USA 77：6448-6452、お
よび M.F.Thomashow et al.（1980）Cell 19：729-739、は、オクトピン型Tiプ
ラスミドのＴ−ＤＮＡが、Ｔ−ＤＮＡの左と右の夫々ＴＬ−ＤＮＡおよびＴＲ−
ＤＮＡの２つの別の場所に取り込まれることを見出した。ＴＲおよびＴＬのコピ
ー数は変動し得る（D.J.Merlo et al.（1980）Molec.Gen.Genet.177：637-643）
。Ｔ−ＤＮＡの中芯（core）は、ノパリンＴ−ＤＮＡと相同性が高く（Chilton
et al.（1978）前出、およびDepicker et al.（1978）前出）、腫瘍維持に必要
で、 ＴＬに見られ、一般的に細胞当り１コピー存在し、そしてtms、tmr および tml
遺伝子をコードする。他方、ＴＲはコピー数は多い（D.J.Merlo et al.(1980)前
出）が、まったく不要である（M.De Beuckeleer et al.（1981）Molec.Gen.Gene
t.183：283-288、G.Ooms et al.（1982）Cell 30：589-597）。G.Ooms et al.（
1982）Plasmid 7：15-29 によれば、ＴＲがTiプラスミドから欠失してもアグロ
バクテリウム・チューメファシエンスはヴィルレンスを保っているが、ＴＲがＴ
−ＤＮＡ取込みに関与すると想定されている。G.Ooms et al.（1982）Cell 30：
589-597により、Ｔ−ＤＮＡは植物ゲノムに取り込まれた後、時として欠失する
が、一般に安定であること、またＴ−ＤＮＡ構成が異なる混成細胞を含む腫瘍は
、複数の形質転換現象の結果であることが示された。ocsはＴＬに存在する。し
かし、腫瘍増殖に関連する表現型を失うことなく植物ゲノムから欠失させ得る。
組み込まれたＴＬの左端は順または逆向きの繰り返しＴ−ＤＮＡ配列から成る（
R.B.Simpson et al.（1982）Cell 29：1005-1014）。 【００２６】 オクトピン型腫瘍の状況とは対照的にノパリンＴ−ＤＮＡは一連のフラグメン
トで宿主ゲノムに組み込まれる（M.Lemmers et al.（1980）J.Mol.Biol.144：35
3-376、P.Zambryski et al.（1980）Science 209：1385-1391）。順方向繰り返
し配列が観察された。奇形腫から生じた植物のＴ−ＤＮＡは、挿入ＤＮＡの端の
フラグメントにわずかな修飾がある（Lemmers et al.、前出）。右端と左端の間
の結合部の配列の解析から多くの順繰り返し配列と１つ逆繰り返し配列が明らか
になった。後者は結合部にまたがっている（Zambryski et al.（1980）前出）。
左側の結合部は少なくとも70塩基対（bp）が変動すること、一方、右結合部は１
bpのみの変動である（P.Zambryski et al.（1982）J.Molec.Appl.Genet.1：361-
370）ことが示された。繰り返し配列の結合部の左および右端は、130bp以上のス
ペーサーにより分断されている。このスペーサーの由来は不明であり、特定のＴ
−ＤＮＡ配列を含んでいる。Ｔ−ＤＮＡは繰り返し配列と低コピー数宿主配列の
両者に組み込まれている。 【００２７】 N.S.Yadav et al.（1982）Proc.Natl.Acad.Sci．USA 79：6322-6326、は、Ｔ −ＤＮＡの左端のすぐ外側のノパリンTiプラスミド内にchi部位を見出し、これ
はバクテリオファージλで10Kbp離れているまわりのＤＮＡで一般組み換えを増
大させる。R.B.Simpson et al.（1982）Cell 29：1005-1014、は、オクトピンTi
プラスミド内にchi配列を見出さなかったが、配列を決定した領域の外側に存在
する可能性を排除できない。Tiプラスミドでのchiの意義は不明である。もしchi
が機能を有しているとすれば、chiがＴ−ＤＮＡ内にないので、恐らく植物では
なくアグロバクテリウム細胞内で用いられているだろう。 【００２８】アグロバクテリウム−ＴＩＰプラスミドの操作 シャトルベクターの項で詳しく述べるように、変化させたＤＮＡ配列をＴＩＰ
プラスミドの望みの場所に導入する技術が開発された。トランスポソンはこの技
術で容易に挿入される（D.J.Garfinkel et al.（1981）Cell 27：143-153）。J.
-P.Hernalsteen et al.（1980）Nature 287：654-656、は、TiプラスミドのＴ−
ＤＮＡに挿入されたＤＮＡ配列（ここでは細菌のトランスポソン）が、受容植物
ゲノムへ移され取り込まれることを示した。種々の起源の多くの外来ＤＮＡが挿
入されたが、これまで、その遺伝子は自身のプロモーターの支配下で発現しなか
った。これらの遺伝子には酵母のアルコール脱水素酵素（Adh）（K.A.Barton et
al.（1983））、トウモロコシのAdhI（J.Bennetzen、未発表）とゼイン、哺乳
類のインターフェロンとグロビン、哺乳類のウイルスSV40（J.Schell、未発表）
などがある。M.Holsters et al.（1982）Mol.Gen.Genet.185：283-289、によれ
ば、Ｔ−ＤＮＡに挿入された細菌のトランスポソン（Tn７）が植物ゲノムに取り
込まれた後、完全な機能を有し、多分変化していない形で回収された。 【００２９】 ＴＩＰプラスミド内で欠失を種々の方法で生成し得る。シャトルベクターを標
準の組み換えＤＮＡ技術でつくられた欠失の導入に用いることができる（Cohen
and Boyer US Pat．4,237,224）。前もって決められた一方の端の欠失はトラン
スポソンの誤った切出しにより作成し得る（B.P.Koekman et al.（1979）Plasmi
d 2：347-357、G.Ooms et al.（1982）Plasmid 7：15-29）。J.Hille and R.Sch
ilperoot（1981）Plasmid 6：151-154は、前もって決められた位置での両端を有 する欠失が、２つのトランスポソンを用いて作成し得ることを示した。この技術
はまたイソビボで"組み換えＤＮＡ分子"の構築に用いられる。 【００３０】 ノパリンシンセターゼ遺伝子が、形質転換された植物細胞を選択するのに用い
られる薬剤耐性をコードするＤＮＡセグメントの挿入に用いられた。M.Bevan（M
.D.Chilton et al.（18 January 1983）15th Miami Winter Symp.、により報告
された；およびJ.L.Marx（1983）Science 219：830 参照）とR.Horsch et al.（
（18 January 1983）15th Miami Winter Symp.、およびMarx、前出、参照）は、
Tn5のカナマイシン耐性遺伝子（ネオマイシンフォスフォトランスフェラーゼ）
をノパリンプロモーターの後に（その制御下に）挿入した。その作成には、培養
でカナマイシンおよびG418 のようなアナグロ耐性になるよう植物細胞を形質転
換する方法がとられた。J.Schell et al.(18January 1983)15th Miami Winter S
ymp.（Marx、前出、も参照）は同様の作成法を報告し、そこではTn7のメトトレ
キセート耐性遺伝子（ジハイドロフォレートレダクターゼ）が、ノパリンシンセ
ターゼプロモーターの後につながれた。形質転換細胞はメトトレキセート耐性で
あった。オクトピンシンセターゼを有する植物細胞は毒性化学物質、ホモアルギ
ニンに耐性であり、G.M.S.Van Slogteren et al.（1982）Plant Mol.Biol.1：13
3-142、は、この酵素を洗濯マーカーに用いることを提案した。 【００３１】 M.-D.Chilton et al.（1983）、前出、は、A.Defremeuが"小Ti（mini-Ti）プ
ラスミド"を作成したと報告した。ノパリンＴ−ＤＮＡには、通常１ケ所の制限
酵素KpnIの切断部位がある。この部位を欠く変異がつくられ、完全なノパリンＴ
−ＤＮＡを含むKpnIフラグメントが単離された。このフラグメントはカナマイシ
ン耐性遺伝子と共にpRK290に挿入され、アグロバクテリウム・チューメファシエ
ンス内で維持され、すべての非Ｔ−ＤＮＡ配列を欠くプラスミドが得られた。そ
れ自身では、このプラスミドは植物細胞を形質転換できなかった。しかし、オク
トピンTiプラスミドを持つアグロバクテリウム・チューメファシエンス株に入れ
ると、オクトピンとノパリン両方を合成する腫瘍が誘導された。これはノパリン
Tiプラスミド機能の消失がオクトピンTiプラスミドにより相補されたこと、およ びノパリン"小Ti"は植物細胞を形質転換する能力があったことを示す。Chilton
et al.（1983）、前出、はまた、小TiをSmaIで切り、ノパリンシンセターゼ遺伝
子とその左および右端以外はすべてのＴ−ＤＮＡを欠失した"微Ti"（micro-Ti）
を作成した。この微TiはSmaI部位を欠くpRK290プラスミド誘導対に挿入され、小
Tiと同様にして用いられ、匹敵する結果を得た。 【００３２】 H.Lorz et al.（1982）in Plant Tissue Culture 1982、ed：A.Fujiwara、pp.
511-512、は、ＤＮＡ取込みと維持にＴＩＰ系が見掛け上無関係なプラスミドベ
クターを作り、マーカーとしてノパリンシンセターゼ遺伝子を用いた。 【００３３】ファセオリンと遺伝子調節 一般に高等真核生物の遺伝子は高度に調節されている。植物のような多細胞生
物は多くの分化した組織を有し、夫々は特有の遺伝子産物を要求する特有の機能
を持つ。そのような組織の１つに子葉（cotyledon）がある。豆果（legumes）で
は子葉は、発芽の間に必要となるまで、脂質、炭水化物、無機物および蛋白質な
どを保存する種の貯蔵器官である。フォセオラス・ブルガリスＬ．（フレンチビ
ーン、インゲン豆（kidny bean）、乾燥白豆（navy bean）、緑豆（green bean
）などの名でも知られる）では、主要貯蔵蛋白質はファセオリンである。この蛋
白は極めて類似しかつ互いに等量の小数の分子種から成る。ファセオリンは乾燥
豆の主要な栄養価を担っており、しばしば乾燥重量の10％以上を占める。 【００３４】 ファセオリンはファセオラス・ブルガリスの生活環の間で高度に調節されてい
る。この蛋白は種がさやの中で生ずる間でのみつくられ、そのレベルは遺伝的に
決まった合成のスケジュールに従い、検出限界の低い値から種の蛋白の半分を占
めるまで上昇する。そのピークではファセオリン合成は子葉細胞の蛋白合成の80
％以上にも達する。他の時期には、また他の組織では、ファセオリン合成は検知
できない。世界的な栄養源の重要性に伴い、ファセオリンの調節の仕組みは、フ
ァセオリンの研究、その性質およびその調節に大いに興味をそそる。 【００３５】 【発明の要旨】 ここに開示の発明は、植物遺伝子を導入し、そこで発現する遺伝的に修飾され
た植物細胞を有する植物を提供する。さらに、この発明は、そのゲノムが植物遺
伝子を含むＴ−ＤＮＡを有する植物細胞を備えた植物組織を提供する。この植物
遺伝子は植物細胞内で発現する。またＴ−ＤＮＡ（ここでは植物細胞内で発現可
能な挿入植物遺伝子を含むように修飾されたＴ−ＤＮＡと定義される）を含み、
複製し得るアグロバクテリウム属細菌の新規な細菌株を提供する。さらに、本発
明はエセリシア・コリー（大腸菌）内で複製能を有し、Ｔ−ＤＮＡを含み、さら
にプラスミド内に含まれるＴ−ＤＮＡ内に挿入された植物遺伝子を含むような新
規のプラスミドを提供する。 【００３６】 ここに開示された実験的研究は、Ｔ−ＤＮＡを介して導入後植物細胞内で植物
遺伝子が発現する、即ち既知の方法によりＴ−ＤＮＡに植物遺伝子を挿入し、そ
の挿入物を含むＴ−ＤＮＡを植物細胞に導入することにより行った最初の例であ
ると信ずる。ここに開示された実験は、また、イントロンを含む植物遺伝子がＴ
−ＤＮＡを介して導入された植物細胞内で発現した最初の例を提供するものと信
ずる。これらの結果はＴ−ＤＮＡ内で発現する既知のすべての遺伝子（Ｔ−ＤＮ
Ａ内生遺伝子であれ、挿入外来遺伝子であれ）が現在知られる限りイントロンを
含まないという事実から見れば、驚くべきことである。この結果は、また、当業
者がこれまで、Ｔ−ＤＮＡ遺伝子外のプロモーターがＴ−ＤＮＡ内へ挿入された
場合、植物内で発現を制御する機能を果たすという例を示し得なかったという事
実から見ても、容易に想到されない。 【００３７】 本発明は、他の植物種または株から有用な植物遺伝子を導入することにより、
植物組織または全植物体を遺伝的に修飾するのに有用である。このような有用植
物遺伝子は貯蔵蛋白質、レクチン、病気、昆虫および除草剤に対する耐性因子、
環境ストレスに対し耐性を与える因子などの遺伝子、さらに特異的芳香剤の遺伝
子などがあるがこれらに限らない。本発明は、豆類の主たる種子の貯蔵蛋白質で
あるファセオリン遺伝子のヒマワリやタバコの植物組織への導入と発現により例 示される。Ｔ−ＤＮＡを介して導入された植物遺伝子が発現する植物細胞が一度
得られれば、植物組織および全植物体を当該分野において既知の方法で、そこか
ら再生させ得る。再生した植物は次いで通常の方法で増殖し、導入された遺伝子
は通常の植物改良技術により他の植物へ移される。例えばファセオリン遺伝子の
導入、発現はアルファルファのような馬糧作物（forage crop）の蛋白含量、栄
養価の向上に用いることができる。本発明の他の用途、即ち、他の植物種へ導入
された他の遺伝子の性質の開拓などは当業者にとっては容易なことである。本発
明は、本質的には、いかなる植物遺伝子をも、Ｔ−ＤＮＡの導入が可能で安定に
複製維持できるいかなる植物種へ導入することに応用できる。一般にこれらの種
に以下のものがあるが、それに限定されない。即ち、ヒマワリ（コンポシテ com
positeae科）、タバコ（ソラナシ solanaceae 科）、アルファルファ、大豆およ
び他のマメ類（レグミノシ leguminoseae科）および大部分の野菜類のような（
ディコチレドナウス dicotyledonous）双子葉植物である。 【００３８】 【発明の構成】 本発明は、(a)植物由来のプロモーターと植物の構造遺伝子とを有する植物の
遺伝子をＴ−ＤＮＡに挿入する工程であって、それによってＴ−ＤＮＡ／植物の
遺伝子結合物を形成し、該植物由来のプロモーターは該植物の構造遺伝子の５’
末端に隣接し、該植物の構造遺伝子は該植物由来のプロモーターから転写方向に
下流にあり、そして(b)該Ｔ−ＤＮＡ／植物の遺伝子結合物を植物細胞に移入す
る工程を包含する、植物細胞を遺伝学的に修飾する方法に関する。 【００３９】 本発明の別の局面では、前記工程(b)の実行後に、さらに(c)前記Ｔ−ＤＮＡ／
植物の遺伝子結合物を含んだ植物細胞中で、前記植物の構造遺伝子の発現を検知
する工程を包含する、植物細胞を遺伝学的に修飾する方法に関する。 【００４０】 本明細書および特許請求の範囲での使用の意図と権利範囲に関する不明瞭さを
除くために以下の定義を行う。 【００４１】 Ｔ−ＤＮＡ：植物ゲノムに組み込まれる形質転換誘導因子（ＴＩＰ）由来のＤ
ＮＡセグメント。本明細書で用いるこの用語はアグロバクテリウム・チューメフ
ァシエンスおよびアグロバクテリウム・リゾゲネスを含むアグロバクテリウムの
あらゆる腫瘍誘導株に本質的に由来するＤＮＡを含む。 【００４２】 後者の菌株の場合、以前の研究者は時々Ｒ−ＤＮＡと呼んでいた。さらに本明
細書で用いるＴ−ＤＮＡという用語は、自然発生または実験室内操作によるいか
なる変化、修飾、変異、挿入および脱落をも含む。唯一の構造上の要件は、自然
に発生するＴ−ＤＮＡの右端および左端が、すべてのＴ−ＤＮＡの特徴である安
定な組み込みという期待される機能を確実にするために充分量存在するというこ
とである。 【００４３】 植物遺伝子：本明細書での使用は、植物遺伝子の構造および調節要素、つまり
Ｔ−ＤＮＡ自身の遺伝子に対して外来である要素を含む。ここで使用する植物遺
伝子は、Ｔ−ＤＮＡへ植物起源のプロモーター（転写の開始と翻訳の開始を提供
し、調節しうる遺伝子の領域）と構造遺伝子（蛋白質をコードする、１つまたは
複数のイントロンを含むあるいは含まない領域）との両者である。この植物遺伝
子は、転写の終了および転写後のＲＮＡプロセッシングを制御する機能を有しう
る３’-非翻訳領域をも含み得る。プロモーターと構造遺伝子要素は同一または
異なる既存の遺伝子に由来するであろうし、また同一または異なる植物源に由来
し得る。例えば、植物遺伝子はそれ自身のプロモーターをある植物遺伝子、ある
いは１つの遺伝子のコード領域（イントロン存在または不在）と同一または他の
植物種由来の他のプロモーターから成るインビトロ構成物でも良い。本明細書で
定義する植物遺伝子のコード領域は、植物遺伝子の構造遺伝子のｃＤＮＡコピー
を含む。プロモーターとコード領域はまた、自然にあるいは人為的に誘発された
修飾をも含み得、化学的に合成されたセグメントを含み得る。コードするセグメ
ントはそれ自身、自然発生または合成の、混成蛋白質をコードする複数の起源に
由来する混成物であってもよい。 【００４４】 植物組織：クラウンゴールのような根、芽、花粉、種、腫瘍組織、および胚、
カルスのような培養植物細胞の種々の形の集合物を含む高等植物の、あるいはそ
れに由来する分化、未分化の組織を含む。 【００４５】 植物細胞：栽培植物細胞、培養植物細胞およびプロトプラストを含む。 【００４６】 Ｔ−ＤＮＡを介して導入された植物遺伝子を発現する遺伝的修飾植物の生産は
、種々の技術を伴う現在知られている、特定の知識と技術者に既知の手段を合併
したものである。多くの例において、別の手段が全過程の各段階に存在する。手
段の選択は、基本的ＴＩＰの選択、修飾される植物種および所望の再生方法のよ
うな要素に依存し、それらはいずれも当業者が望む結果を達成するために選択し
用い得る別のプロセス段階を提供する。本発明の基本的な特徴は植物遺伝子の性
質と構造であり、そのＴ−ＤＮＡへの挿入方法である。遺伝的修飾植物を得るた
めに残っているステップは、植物細胞へ修飾Ｔ−ＤＮＡを移送すること（そこで
は、植物細胞の中で修飾Ｔ−ＤＮＡが植物細胞ゲノムの一部として安定に組み込
まれる）を含み、それにはインビトロ培養および完全植物体への実際の再生に関
する技術がある。この技術は、形質転換植物細胞の選択と検出に関するステップ
および最初の形質転換株から商業的に認められうる培養体へ導入遺伝子を移すス
テップを包含し得る。 【００４７】 本発明の主要な特色は先に定義した挿入植物遺伝子を有するＴ−ＤＮＡの構築
である。植物遺伝子挿入部位の場所はＴ−ＤＮＡ境界のすぐ近くにある配列の移
送機能が破壊されない限り、これらの領域が従来の研究によれば、修飾Ｔ−ＤＮ
Ａの植物ゲノムへの挿入に必須であるので、どこでも良い。好ましい挿入部位を
最も活発に転写されている領域に位置するものであり、特にtml遺伝子、および
、図２に示すように地図区分13にまたがるHindIII-f断片にある"1.6"と呼ばれる
領域である。後者の転写物に相関する表現形はない。"1.6"という用語は、ここ
ではこの活発に転写されるＴ−ＤＮＡの領域を意味する。Ｔ−ＤＮＡはいかなる
ＴＩＰプラスミドからも得られる。植物遺伝子は当業者によく知られている標準
技 術で挿入される。内生Ｔ−ＤＮＡ遺伝子の転写と翻訳の方向に関して挿入植物遺
伝子の方向はどちらでも良く２つの可能な方向の一方は機能を果たす。ある遺伝
子がＴ−ＤＮＡの異なった位置に挿入されるとクロマチン構造のような因子のた
め、発現度の差が生じるであろう。ファセオリン遺伝子はアグロバクテリウム・
チューメファシエンスのオクトピン型プラスミドであるpTi15955のtml遺伝子内
のSmaI部位に挿入されると、容易に検出可能な発現レベルに達する。 【００４８】 植物遺伝子をＴ−ＤＮＡに挿入する簡便法に、既述のシャトルベクターがあり
、これはエシェリヒア・コリー内で複製可能なプラスミドへ取り込まれたＴ−Ｄ
ＮＡセグメント（ここへ挿入を期待するセグメント）を有する。このＴ−ＤＮＡ
セグメントは、好ましくはシャトルベクターに特異な１つの制限部位を有する。
植物遺伝子はＴ−ＤＮＡセグメント内の特異的部位に挿入され得る。そしてこの
シャトルベクターは適当なアグロバクテリウム株、好ましくはそれの有するＴ−
ＤＮＡがシャトルベクターのＴ−ＤＮＡセグメントと相同性がある株の細胞へ移
される。形質転換されたアグロバクテリウム株を、Tiプラスミドの既存のセグメ
ントをシャトルベクターのＴ−ＤＮＡセグメントで置換する２重相同組み換え現
象を選択する条件下で増殖させる。 【００４９】 ここで述べた方針に従い、修飾Ｔ−ＤＮＡを当該分野で既知のどれかの技術に
より植物細胞に移すことができる。例えば、この移送はＴ−ＤＮＡ内に取り込ま
れた植物遺伝子を含む新規のアグロバクテリウム株の持つプラスミドの直接感染
、あるいはアグロバクテリウム株と植物細胞の共存培養により最も容易に達成さ
れる。前者の技術である直接感染は、やがて感染部位に腫瘍体またはクラウンゴ
ールの出現をもたらす。クラウンゴール細胞を次いで培養で増殖させ、そして当
業者に既知の適当な環境下で、挿入Ｔ−ＤＮＡセグメントを有する完全植物体に
再生させる。共存培養の方法により、植物細胞のある部分が形質転換される。即
ち細胞内にＴ−ＤＮＡが移り、植物細胞ゲノムに挿入される。いずれにしても、
形質転換細胞を選択あるいは検索して未形質転換細胞と区別しなければならない
。選択はＴ−ＤＮＡの中に植物遺伝子と共に、取り込まれる選択マーカーを用い
る ことにより容易に達成される。例として、ノパリンシンセターゼプロモーター支
配下で発現するジハイドロフォレートレダクターゼあるいはネオマイシンファス
フォトランスフェラーゼがある。これらのマーカーは、夫々メトトレキセートま
たはカナマイシンあるいはそれらの類似物を含む培地での増殖により選択される
。さらにＴ−ＤＮＡは、内生マーカー、例えばTiー誘導腫瘍の培養でホルモン非
依存増殖を制御する遺伝子または遺伝子群、Ri−誘導腫瘍ルートの異常形態を制
御する遺伝子または遺伝子群、およびアミノ酸類似物のような毒性化合物に対す
る耐性（その耐性はオピンシンセターゼによりもたらされる）を制御する遺伝子
群を有する。当業者によく知られている検索法には、オピン生産の測定、特徴的
ＲＮＡまたはＴ−ＤＮＡ配列に対する特異的ハイブリダイゼーション、あるいは
ＥＬＩＳＡ（酵素連関免疫吸着分析の略）、ラジオイムノアッセイ、および"ウ
エスタン"ブロットなどの特異的蛋白質の免疫学的分析がある。 【００５０】 シャトルベクター作戦の別の方法に、Ｔ−ＤＮＡまたはそこに植物遺伝子を挿
入した修飾Ｔ−ＤＮＡを含むプラスミド、即ちアグロバクテリウム株内で独立に
複製し得るプラスミドの使用がある。最近の資料により、アグロバクテリウム株
が、Ｔ−ＤＮＡの植物細胞への移動を促進する機能をもつあるトランスに作用す
る遺伝子を有するならば、そのようなプラスミドのＴ−ＤＮＡがアグロバクテリ
ウム株から植物細胞へ移され得るということが示されている。Ｔ−ＤＮＡを含み
、アグロバクテリウム株内で独立に複製できるプラスミドを、ここでは"サブ−
ＴＩＰ"（sub-TIP）プラスミドと呼ぶ。変動範囲があり、そこでは、"サブ−Ｔ
ＩＰ"プラスミドはそれらが含有するＴ−ＤＮＡの量に差がある。その範囲の端
はＴＩＰプラスミドからのＴ−ＤＮＡがすべて残っているもので、特に"小ＴＩ
Ｐ"（mini-TIP）プラスミドと呼ばれる。その範囲のもう一端はＴ−ＤＮＡ境界
のまわりのＤＮＡの最小量を残してすべてが欠失している。その残存部分は宿主
細胞内で転移と組み込みができる必要最小量である。このようなプラスミドは"
微ＴＩＰ"（micro-TIP）と呼ばれる。サブ−ＴＩＰプラスミドは小さく、直接操
作するのが比較的容易であるという利点がある。希望する遺伝子を挿入した後、
Ｔ−ＤＮＡ転移を促進するトランスに作用する遺伝子を含む植物細胞へ直接容易 に導入できる。アグロバクテリウム株への導入はアグロバクテリウム株の形質転
換か、供与細菌細胞から接合伝達という当業者によく知られている技術により簡
便に達成される。 【００５１】 再生は、既知の技術で達成される。再生ステップの目的は正常に、しかし組み
込まれたＴ−ＤＮＡを保持して、増殖および再生産する全植物体を得ることであ
る。再生の技術は、当該分野で既知の原理によれば、Ｔ−ＤＮＡの起源、そこで
の修飾の性質、および形質転換された植物の種によりいくらか変動する。Ri−型
Ｔ−ＤＮＡで形質転換された植物細胞は、公知の技術により何ら余分な実験なし
に、容易に再生される。Ti-型Ｔ−ＤＮＡで形質転換された植物細胞は、ある例
では、培養のホルモンレベルを適当に操作することにより再生され得る。しかし
、好ましくは、Ti−形質転換組織は、もしＴ−ＤＮＡが TmrとTms遺伝子の一方
または双方に変異を受けておれば、最も簡単に再生される。これらの遺伝子の不
活性化は形質転換組織のホルモンバランスを正常に戻し、培養での組織のホルモ
ンレベルを極めて容易に操作できるようになる結果、簡単に再生するような、よ
り正常なホルモン生理を有する植物をもたらす。数例においては、腫瘍細胞は、
ノパリンシンセターゼのような組み込まれたＴ−ＤＮＡを持ちかつＴ−ＤＮＡ遺
伝子を発現するシート、そしてまた挿入植物遺伝子を発現するシュートを再生さ
せることができる。このシュートは根を有する植物につぎ木する事により栄養細
胞で維持でき、稔性花を着生できる。シュートはこのようにしてＴ−ＤＮＡを有
し、そこへ挿入された植物遺伝子を発現する正常な子孫植物の親植物体となる。 【００５２】 形質転換した植物組織の遺伝型は、しばしばその細胞がインビトロの培地で生
育可で、再生可であることによって簡単に選択される。農学上関心のある栽培変
種植物(cultivar)が、これらの操作に不適応であるならば、もっと余地のある変
化が最初になされる。再生後、新しく導入された外来植物遺伝子は、植物の育て
方や植物遺伝学の当業者に既知の技術により、所望の農学上の栽培変種植物にた
やすく移入される。形質転換された植物の、これら農学上の栽培変種植物との交
配により最初の雑種が得られる。これらの雑種は、次いで、所望の遺伝学的背景 の植物と戻り交雑されうる。子孫は、そして組み込まれたＴ−ＤＮＡの連結した
存在か、挿入された植物遺伝子の発現の結果としての新しい表現型に対して、継
続的に検索されそして選択される。この方法では、何回もの戻し交雑と選択の後
、挿入された植物遺伝子と共に、農学上望ましい親株に本質的に同一な遺伝型を
もって植物が生産され得る。 【００５３】 【実施例】 以下の例はＴＩＰおよびアグロバクテリウムの分子生物学や操作の当業者によ
く知られ、かつ受け入れられうる多くの技術を利用している；そのような方法は
、いつも詳しく述べられているわけではない。酵素は市販のものから得られ、ベ
ンダーの助言もしくは当該分野で既知の他の変法に従って使われる。試薬、緩衝
液や培地の条件はまた当該分野で知られている。そのような標準的技術について
の参考研究には次のものがある：R．Wu，ed．（1979）Meth．Enzymol．68；J.H.
Miller（1972）Experiments in Molecular Genetics；R.Davis et al.（1980）A
dvanced Bacterial Genetics；およびR.F.Schleif and P.C.Wnesink（1982）Pra
ctical Methods in Molecular Biology。 【００５４】 プラスミドIIc を除いて、プラスミドは、プラスミドのみであるが、例えば p
3.8 かpKS4 のように表示には"p"を前に置く。プラスミドを含んだ細胞は同定さ
れた細胞とカッコ内に示したプラスミドによって示されており、例えば、アグロ
バクテリウム・チューメファシエンス（pTi15955）とかK802（pKS4-KB）。下表
１、２、３、４および５は、プラスミドおよびそれらの関係を同定するのに有用
な指標（index）を提供する。下表６は、寄託された菌を示す。図１は、実施例
５、６および８に記載された構築物の有益な比較を提供する。 【００５５】 【表１】 【００５６】 【表２】 【００５７】 【表３】 【００５８】 【表４】 【００５９】 【表５】 【００６０】 【表６】 【００６１】 （実施例１） この実施例の目的はそれ自身のプロモーターの調節下で非Ｔ−ＤＮＡの真核遺
伝子の発現を教示することである。 【００６２】１．１ 特殊なプラスミド誘導体の調製 制限部位は、HindIIIによる消化、ＤＮＡポリメラーゼIによる一本鎖粘着末端
の充填、得られた平滑末端の連結、K802への形質転換、テトラサイクリン耐性で
の選択、その薬剤耐性クローンからのプラスミド単離、そしてその特有の制限部
位の除去を確認するため制限酵素での特性表示によって、プラスミドpBR322から 除去された。このプラスミドをp350（pBR322-HindIII）と呼ぶ。 【００６３】１．２ シャトルベクターの調製 p203は BamHIで消化され、そのＴ−ＤＮＡBam17断片(図２参照)はアガロース
ゲル電気泳動後ゲルから溶出させることによって単離された。この断片はBamHI
で線状化されたp350と混合され、そして連結され、そして反応物はK802に形質転
換された。アンピシリン耐性形質転換株から単離されたプラスミドは制限地図に
よって特徴付け、SmaIで消化し、そして平滑末端は HindIIIリンカーに連結した
。HindIII粘着末端をHindIIIによる切断によって露出させ、その線状プラスミド
は連結によってそれ自身を円形にしたのち、そのプラスミドをK802に形質転換し
た。 【００６４】 アンピンリン耐性形質転換株から分離されたプラスミドは制限地域によって特
徴づけられ、プラスミドの有する図３に示されているような構造はp395と名付け
た。p376は、以下で論議されるが、またこの時点で単離された(図３)。p395はBa
mHIで消化され、そしてそのBam17Ｔ−ＤＮＡ断片は、そのSmaI部位がHindIIIに
変換されたが、アガロースゲル電気泳動に続き溶出された。このBam17断片は、B
glIIで線状化されたpRK290と混合され連結された。その反応液はK802に形質転換
し、選択後、形質転換株は、制限地図によって特徴付けられたプラスミドを調製
するために使われた。この特定のプラスミドを、p490-8/14と名付けた。 【００６５】 p376は、その由来が本実施例中で上述されたが、SmaI、今、HindIIIの特性に
変換されたが、そこから右に約0.8Kbpの欠失のあることが見つけられた。上のp3
95に対してなされたように、そのBam17に相当する BamHIＴ−ＤＮＡ断片が分離
され、BglIIで線状化されたpRK290に連結された。形質転換選択、そしてプラス
ミド単離と特徴付けの後、その特定のプラスミドをp458-1と名付けた。 【００６６】１．３ カナマイシン耐性とファセオリンの遺伝子の挿入 ファセオリン遺伝子を載せた断片を、HindIII消化したpKS-KB3.8から、アガロ
ースゲル電気泳動によって調製した。この断片は、HindIIIで線状化されたp490- 8/14と混合され連結された。K802のカナマイシン耐性形質転換株を、それから制
限地図をつくられたプラスミドを調製するのに使用した。２つの構成体が単離さ
れた：p499/6/7はカナマイシン耐性の右に豆の（塩基）配列を持っていた（図４
）そしてp499/6/8は、反対方向であった（図７）。 【００６７】 精製されたファセオリン遺伝子を載せたpKS-KB3.8のHindIII断片はまた、Hind
IIIで線状化したp458-1と混合され連結された。プラスミドが、再び、K802のカ
ナマイシン耐性形質転換株から調製され制限地図を作成した。再び両方向が単離
された：p496-2（図６）とp496-1（図７）は各々、カナマイシン耐性遺伝子の右
と左にファセオリンを持っていた。 【００６８】１．４ Tiプラスミドの２重相同組み換え ファセオリンとカナマイシン遺伝子は実施例１４に記載するように、アグロバ
クテリウム・チューメファシエンス細胞内に保持されているTiプラスミド内に組
み込まれた。２つのTiプラスミドを受容体（recipients）として用いた：pTi159
55はオクトピン型プラスミドである；そしてpTiA66はアグロバクテリウムIS（挿
入）配列の自然の挿入による機能しないtms遺伝子をもつＡ６オクトピン型プラ
スミドから由来する系統である。p499/6/7，p499/6/8，p496-2とp496-1で定義さ
れた構造を含むpTi15955プラスミドは各々、p529-8，p529-7，p529-11 とp529-2
と名付けられた。pTiA66内の同じ構造は各々、p539-6，p539-5，p539-2とp539-1
と名付けられた。 【００６９】１．５ 植物の感染 p529とp539系列のTiプラスミドを含むアグロバクテリウム・チューメファシエ
ンス細胞は針で刺し、特定の細菌細胞の注入によってヒマワリ植物の幹に感染さ
せるのに使用した。 【００７０】１．６ ファセオリンの検知（detection） ファセオリンの蛋白鎖を、実施例１４に記載したように、ＥＬＩＳＡによって こぶ（gall）に探知された。検査されたすべてのこぶは、ファセオリンを含んで
いることが見い出された；その量は、組織の新鮮な（fresh）重量グラム当り20n
gと0ngの間で多様であり、平均は約10mg/ｇである。蛋白変性ゲル（SDS-ポリア
クリルアミド）のウェスタン・ブロットによる解析は本来のファセオリンよりは
かなり小さいが外見上高分子量の分離したバンドを示した。正確なバンドの数や
大きさは宿主間で多様であり、それは宿主の特異な翻訳後の加工（processing）
の結果である。 【００７１】 ファセオリンのメッセンジャーＲＮＡ鎖は実施例１２で述べられているように
、こぶの中で探知された。検査されたすべてのこぶは、ファセオリン（のＲＮＡ
）鎖を、ポリ（Ａ）５＋４ＲＮＡ画分に含んでいることがわかった；その量は平
均全ポリ（Ａ）ＲＮＡの約0.005％である。変性したＤＮＡゲル（メチル水銀−
アガロース）のノーザン・ブロットによる解析は、本来のファセオリンのメッセ
ンジャーＲＮＡ(1.6Kbp)と同じ大きさの大きい分子量の分離したバンドを示した
。ファセオリンはまた、ＥＬＩＳＡによってpTiA66ベクターによって感染された
細胞に由来するshoot-tissue中に探知された。 【００７２】 ファセオリン蛋白とファセオリンのメッセンジャーＲＮＡの信号の両方の探知
される量は、修飾されていないpTi15955を修飾されていないpTiA66をもつアグロ
バクテリウム・チューメファシエンスにより形質転換されたクラウンゴールを分
析する時にみられるノイズレベル以上に顕著で実質的なものである。 【００７３】 （実施例２） この実施例は、完全なファセオリン遺伝子を、実施例１で教示されたＴ−ＤＮ
Ａに類似のＴ−ＤＮＡに挿入することを教示する。この構成はノパリンのTiプラ
スミドであるpTiC58中に、ノパリン合成遺伝子の領域内に挿入された配列を運ぶ
ように設計されたシャトルベクターを利用する。 【００７４】２．１ シャトルベクターの構成 ノパリン型プラスミドpTiC58（図８ａ）はSmaIで消化され、ノパリン合成遺伝
子をコードした断片はアガロースゲル電気泳動によって単離された。この断片は
BglIIリンカーに平滑末端連結され、それは次いでBglIIによる消化によって露出
させられた。その結果生じたＤＮＡ断片は、BglIIで線状化されたpRK290（図１
０）と混合され連結された。K802への形質転換後テトラサイクリンによって選択
され、プラスミドの単離され、そして制限地図が作成された。その特定のプラス
ミドはpCF44A（図８ｂ）と名付けられた。 【００７５】 ４つのClaI部位は、連続にpCF44Aを２度再切断することによって１つのClaI感
受性の部位に変えられた。そのプラスミドはXhoIで消化され、それ自身で再連結
され、そしてK802に形質転換された。選択後、プラスミドの単離、そして制限地
図の作成後、XhoI断片（２つのClaI部位を有する）の欠失した適当なプラスミド
はClaIで消化され、それ自身で再連結され、そしてK802に形質転換された。選択
、プラスミド単離、そして制限地図作成の後、２度目の欠失したプラスミド（こ
のたびのClaI断片はnos遺伝子の５’末端の他はすべてをもつ）をpKS−nopIV（
図９、図８、図８ｃ）と名付けた。 【００７６】２．２ Kan/bean遺伝子の挿入 pKS-KB3.8（図１１）を、ClaIにより消化されカナマイシン耐性とファセオリ
ンの遺伝子をもつ6.0Kbpの断片がアガロースゲル電気泳動で単離した。この断片
をClaIで線状化したpKS-nopIVと混合し、連結し、そしてK802を形質転換した。
カナマイシンとテトラサイクリンに対して耐性でアンピシリン感受性の形質転換
株から単離されたプラスミドは制限地図を作成され、図８ｂに示された構造をも
つプラスミドをpKS-nopIV-KB3.8 #5と名付けた。ファセオリン遺伝子がカナマイ
シン耐性の左に位置する類似クローンが見い出され、pKS-nopKB3.8 #3と名付け
た。 【００７７】２．３ Tiプラスミドへの転移と植物の感染 三親交雑技術（従来技術と実施例14参照）を、ノパリン型Tiプラスミド、pTiC
58へ、上記の構造物を転移するのに使用した。pKS-nopIV-KB3.8#3および#5のそ れぞれと、pTiC58との交雑の結果できた、TiプラスミドC58-nop-KB#3およびpC58
-nop-KB#5を、制限地図作成とサザンブロット解析によって特徴付けた。その２
つのプラスミドのいずれかを含む細菌（これらプラスミドはnos遺伝子の５’末
端由来の配列とnos遺伝子の３’側面の配列内に存在するカナマイシン／ファセ
オリンの遺伝子の断片のいづれかの方向をもっている）は、その細菌を注入する
ことによって、ヒマワリ植物の幹に感染するのに別々に使用した。 【００７８】２．４ 発現していることの探知 ファセオリン遺伝子の発現は実施例１３．５中のようにＥＬＩＳＡによりヒマ
ワリのこぶの組織中に探知された。 【００７９】 （実施例３） この実施例はファセオリン、これは豆のPhaseolus vulgaris L.の多くの種子
貯蔵蛋白であるが、その遺伝子の操作、いろいろな別の実施例に述べられたベク
ターへファセオリン遺伝子を挿入するための操作を教示する。 【００８０】３．１ ファセオリン遺伝子のサブクローニング Charon 24A AG-PVPh177.4（または177.4;S.M.Sun et al.（1981）Nature 289
：37-41，J.L.Slightom et al.（1983）Proc.Natl.Acad.Sci．USA 80; 図１４）
中のファセオリンの遺伝的クローンをBglIIとBamHIにより消化した。ファセオリ
ン遺伝子をもつ3.8kbpの断片とそれに側面する配列は、アガロースゲル電気泳動
により単離され、それらはBamHIで線状化されたpBR322（図１２）と混合され、
連結された。その混合物は、HB101に形質転換され、そして、アンピシリンに耐 性でテトラサイクリンに感受性のコロニーを選択した。これらのコロニーから単
離したプラスミドの制限地図を作成した。図１３に示された構造をもつプラスミ
ドを選択し、AG-pPVPh3.8（もしくは、p3.8）と名付けた。BglIIとBamHI部位の
相互の連結は両部位を不活化する。 【００８１】 177.4の別のサブクローンは、EcoRIによる消化によって構成され、広範囲にわ
たる３’側面の配列とファセオリン遺伝子の最５’末端を除くすべてを含む7.2k
bpの断片の単離とHB101の形質転換株のアンピシリン選択後、分離されたものは
制限地図を作成された。pBR322のHindIII部位が、ファセオリン遺伝子の５’末
端に隣接し、３’の翻訳されない領域内末端になった方向に挿入されたプラスミ
ドはAG-pPVPh7.2 と名付けられた（またはp7.2;図１５；Sun et al.とSlightom
et al.、同上）。 【００８２】３．２ カナマイシン耐性遺伝子のクローニングと単離 pRZ102（R.A.Jorgenson et al.（1979）Mol.gen.Genet.177；65-72）は、トラ
ンスポゾンTn5の写し(copy)をもっているコリシンＥ１プラスミドであるが、そ
れはBamHIとHindIIIにより消化され、以前に同じ２つの酵素により線状化された
pBR322と混合され、連結され、K802に形質転換された。アンピシリンとカナマイ
シンの両方の耐性で選択された形質転換株から単離されたプラスミドは、制限地
図を作成され、図１６に示される構造をもつプラスミドはpKS-4と名付けられた
。 【００８３】３．３ カナマイシン耐性とファセオリン遺伝子との連結 p3.8はClaIとBamHIにより消化され、そしてファセオリン遺伝子とあるpBR322
の配列を含む4.2kbpの断片は、アガロースゲル電気泳動により単離された。これ
はpKS-4（図１６）をClaIで線状化されたpBR322（図１２）由来のカナマイシン
耐性（ネオマイシンホスホトランスフェラーゼII、NPTII）遺伝子をもつTn5のCl
aI/BamHI断片と混合された。その混合物は連結され、そしてK802に形質転換され
た。アンピシリンとカナマイシンに耐性のコロニーの選択後、プラスミドは単離
され、制限地図を作成した。図１１に見られる構造をもつコロニーはpKS-KB3.8
と名付けられた。 【００８４】 p7.2はEcoRIとBamHIにより消化され、そして、ファセオリン遺伝子の５’末端
を除くすべてをもつ3.0kbpの断片はアガロースゲル電気泳動により単離された。 これはpKS4（図１６）由来のカナマイシン遺伝子とHindIIIにより線状化されたp
BR322（図１２）をもつTn5のHindIII/BamHI断片と混合された。その混合物は連
結され、K802に形質転換された。アンピシリンとカナマイシンに耐性のコロニー
の選択後、プラスミドは単離され制限地図を作成された。図１７に示される構造
をもつコロニーはpKS4-KB3と名付けられた。pKS4-KB内では、ファセオリンは遺
伝子の最５’末端をコードしている配列とすべての５’側面の領域を失っている
（図１４を参照）。 【００８５】 （実施例４） この実施例は遺伝子からイントロンを除去する方法を教示する。これは遺伝子
的環境（genomic environment）にｃＤＮＡを置くのと同じである。非加工（unp
rocessed）の転写の５’と３’末端の両方のエクソン内に制限酵素部位が見つけ
られるか、部位上に特異的変異によってつくられる。これらの部位は遺伝子クロ
ーンとｃＤＮＡの両方に存在する。分在するイントロンを含むＤＮＡは遺伝子ク
ローンから除去でき、２つの部位にわたるそれに相当するイントロンのないｃＤ
ＮＡクローンの断片に置きかえられる。その逆の操作もまた可能である：イント
ロンを含む遺伝子配列をｃＤＮＡ環境中に配置し得る。あるものは遺伝的クロー
ンの内部断片をｃＤＮＡクローンの切断した相当する隙間に挿入する。この後者
の方法は類似しているが、イントロンがその変換される断片を作るために選ばれ
る酵素に感受性な部位を含むよりもしばしば、技術的にはより困難である。この
困難は部分分解の条件の注意深い選択とアガロースゲル電気泳動による所望断片
の精製により克服された。この戦略をさらにねったものは、遺伝子内の個々のイ
ントロンを他のイントロンとエクソンとに影響を及ぼさないで操作すること、お
よび不都合な介在する制限部位が上述するようにイントロン内に存在するときの
配列を段階的に交換することを含む。 【００８６】４．１ ファセオリンのイントロンを含む断片のｃＤＮＡとの交換 ファセオリンとその側面の配列のプラスミドクローンであるp3.8を、EcoRIとS
acIで各々部分的にかつ完全に分解した。そして、pBR322ベクターおよびそのイ ントロンの５’と３’末端の両方を含む6.4kbpの断片をアガロースゲル電気泳動
により単離した。pcDNA31（ファセオリンのｍＲＮＡから作成されたｃＤＮＡのp
BR322プラスミドクローン）は、SacIとEcoRIにより各々部分的にかつ完全に分解
され、そして最５’と３’末端の配列を除く全ファセオリンｃＤＮＡを含む1.33
kbpの断片はアガロースゲル電気泳動により単離された。これらの２つの断片は
一緒に連結され、HB101に形質転換された。コロニーの選択後、菌の増殖、プラ
スミドの単離をし、制限地図作成の結果、欲しい構造をもつプラスミドであるこ
とを確認した。このプラスミドはp3.8-cDNA（図１８）と名付けられた。その全
構造は図１８に示してある。 【００８７】４．２ p3.8−ｃＤＮＡの使用 p3.8-cDNAは遺伝子ＤＮＡ源たとえばすべての他の例で使われるp3.8に代用で
きることに留意。そして、そのようにして使った時のp3.8-cDNAはイントロンを
欠失しているものであるような違った類似構造を生じるだろう。もしくは、この
戦略はすでに作られた構造からイントロンを除去するために使うことができる。 【００８８】 （実施例５） この実施例の目的は、pTi15955と他のオクトピンTiプラスミドのtms（芽"shoo
ting"遺伝子座）からtmr（根"rooting"遺伝子座）を通って欠失したTiプラスミ
ドを生ずることである。この誘導体はこれによって形質転換された細胞が完全な
植物に再生するのに完全なtmsとtmr遺伝子をもつpTi15955によって形質転換され
た細胞よりも簡単であるので有用である。 【００８９】 tms-tmrを欠失したpTi15955は２つの方法で最後に換えられる：tms-tmr不活化
と外来遺伝子の挿入。これらの２つの変換は、Ｔ−ＤＮＡの違った位置で設定さ
れると、各々の変換は違ったシャトルベクターにより独立に挿入される。変換に
よりできた各シャトルベクターは別個に選択され、それはアグロバクテリウム中
で選択できる少なくとも２つのマーカーの使用を必要とする。いつものカナマイ
シン耐性の他にこの実施例は、pBR325由来のクロラムフェニコール耐性を利用し た。 【００９０】５．１ クロラムフェニコール耐性遺伝子クローンの構成 pBR325はHincIIにより消化され、平滑末端はHindIIIリンカーと連結された。
その結果として生じたものはHindIIIにより消化され再連結され、クロラムフェ
ニコール耐性（cam）で選択されpKS-5と名付けられた（図１９）。これは、cam
遺伝子を含むHindIII/BclI断片の起源として機能する。 【００９１】５．２ 欠失とcam遺伝子をもつＴ−ＤＮＡのpBR322クローンの構成 9.2kbpの線状化ＤＮＡ断片は、p203のHindIII完全分解とBamHI部分分解から単
離される（図３１）。cam遺伝子をもつ断片はpKS-5 から単離され、9.2kbpの線
状化断片と混合され、連結され、E.coliに形質転換され、クロラムフェニコール
耐性で選択され、pKS-oct.Cam203と名付けられた（図２０）。 【００９２】 pKS-oct.Cam203は、pTi15955の多くのＴＬ欠失変異体を構成するのに使われう
るプラスミドクローンである。ＴＬの右腕と、その右腕の左に耐性遺伝子を含む
。ＴＬの多種の左腕はcam遺伝子の左（HindIII部位）に付着された。例えば、も
し、p102が付着されたら、欠失は5.2kbpの長さになり、そしてtmsとtmrの全部を
含む。もし、p103が付着されたら、欠失は3.2kbpの長さになり、tmsの一部とtmr
の全部を含む。図２を参照。 【００９３】 pKS-oct.Cam203はHindIIIにより消化された。p102またはp103はHindIIIにより
消化され、そして2.2kbpか2.0kbpのＴ−ＤＮＡの断片は単離され、線状化された
pKS-oct.Cam203と連結され、形質転換され、それぞれ生じたpKS-oct.del II（図
２１）またはpKS-oct.del I（図２２）を単離した。これらの構造は、交雑によ
りアグロバクテリウム・チューメファシエンスに移行し相同的組み換え、そして
、クロラムフェニコール耐性で選択した。あるいは一つは確立した方法を用いて
、プラスミドのもつ構造をBamHIで線状化し、そしてpRK290のBglII部位に連結す
ることによってpRK290にその構造を挿入した。 【００９４】 （実施例６） Tiプラスミドは、この実施例ではtmr中のHpaI部位からtml中のSmaI部位の間の
Ｔ−ＤＮＡを欠失することによって変異される。改変し得るTiプラスミドはpTi1
5955、pTiB6、pTiA66および他のものを含む。この構成は図２３に示される。 【００９５】６．１ cam 遺伝子の単離 pKS-5（図１９）はHindIIIとBclIにより消化された。最も小さい断片が実施例
５で教示したようにアガロースゲルで分離後単離される。 【００９６】６．２ 欠失をもつＴ−ＤＮＡのpBR322クローンの構成 Ｔ−ＤＮＡの欠失の右手腕はp203のSmaI部位にBglII部位を挿入することによ
って構成される（図２３参照）。p203はSmaIによって消化され、BglIIで消化さ
れ、再連結され、K802に形質転換された。別の構成ではBamHIリンカーはBglIIリ
ンカーの代わりをしそして適当なBamHI部分分離物が単離される。その結果とし
て生じるプラスミドはp203-BglIIと名付けられ、そしてBglIIとHindIIIにより消
化される。断片を含むその大きなBglII/HindIIIベクターは、実施例６．１に述
べられているように単離されたクロラムフェニコール耐性断片と連結された。ク
ロラムフェニコール耐性はK802への形質転換後に選択される。その結果生じたプ
ラスミドはp2ｆ（図２３）と名付けられる。 【００９７】６．３ Ｔ−ＤＮＡ欠失クローンの左手腕の構成 HindIII部位はp202のHpaI部位に、HpaIで消化しそしてHindIIIリンカーと連結
することにより挿入される。HindIIIによる消化による粘着末端の露出後、HindI
II末端をもつ2kbp HpaI断片が単離される。HindIII末端のHpaI断片をHindIII分
解し、K802に形質転換する。所望の構成を含むコロニーが分離された後、特徴づ
け、そのプラスミドはp3ｅ（図２４）と名付けられる。 【００９８】６．４ Ｔ−ＤＮＡ欠失クローンの構成 クローンの左手腕は、電気泳動後、アガロースゲルから溶出させることにより
、p3ｅのHindIII分解の2kbp断片を精製することにより得られた。p2fはHindIII
により切断され、アルカリホスファターゼにより処理され、2kbp断片と混合され
、連結され、K802に形質転換され、そしてクロラムフェニコール耐性で選択され
る。プラスミドは個々のコロニーから単離され、制限地図作成によって特徴付け
られる。所望の縦並びの配置方向に２つの腕をもつプラスミドが選ばれ、pKS-oc
t.del IIIと名付けられる（図２５）。 【００９９】 pKS-oct.del IIIは、交雑によりアグロバクテリウム・チューメファシエンス
に移入され、相同的組み換え体は、クロラムフェニコールによる選択によって選
択される。ヒマワリとタバコの根や若枝（shoots）は、他の例に述べられてある
ように植えられ、生じた腫瘍はオーピンに対して試験される。 【０１００】 （実施例７） この例はtmrとtmlを欠失する構成を教示するものであり、実施例６の別法であ
る。 【０１０１】７．１ BglII部位をもつクロラムフェニコール耐性の構成 pBR325は、HincIIにより消化され、平滑末端はBglIIリンカーと連結され、Bgl
IIにより消化され再連結される（図２６）。クロラムフェニコール耐性は、K802
かGM33の形質転換後、選択される。その結果、生じたプラスミド、pKS-6はcam遺
伝子をもつBglII/BclI断片の供給源として機能する。 【０１０２】７．２ tmr、tml欠失クローンの構成 p203はHpaIとSmaIにより消化される。平滑末端をBglIIリンカーと連結後、Bgl
IIにより消化され、BglII粘着末端を露出し再連結し、K802に形質転換した。所
望の構造が確認され、p2と名付けられる（図２７）。 【０１０３】７．３ Ｔ−ＤＮＡ欠失クローン（pKS-oct.del IIIa）の構成 cam遺伝子をもつBglII断片はpKS-6から単離され、BglIIで切断されたp2に連結
される。クロラムフェニコール耐性はK802の形質転換後、選択される。その結果
生じたプラスミドはpKS-oct.del IIIa（図２８）と名付けられ、実施例６．４に
述べられているように試験される。 【０１０４】 （実施例８） この構成の目的は、クロラムフェニコール遺伝子の挿入によるHpa部位のみのt
mr遺伝子座の変異の例を提供することである。この遺伝子はpKS-6からBglII/Bcl
I断片として単離され、p203のBglII部位に変換されるHpaI部位に連結される。 【０１０５】８．１ Hpa部位のBglII部位への変換 p203は、Hpaにより消化され、BglIIリンカーに連結され、BglIIにより削られ
、再連結される。K802の形質転換後コロニーは選択され、BglII部位の挿入に対
する制限地図作成によって検索される（図２９）。 【０１０６】８．２ cam 遺伝子の単離 pKS-6は、BglIIとBclIにより消化される。もっとも小さい断片は、アガロース
ゲル電気泳動により単離される。 【０１０７】８．３ 変異したＴ−ＤＮＡのクローンの構成 実施例８．１からの修飾したp203はBglIIにより消化され、実施例８．２から
の調製したcam遺伝子と連結され、そしてK802に形質転換される。クロラムフェ
ニコール耐性で選択され、耐性形質転換株から単離し、そして制限酵素地図作成
による特徴付けの後、そのプラスミドはpKS-oct.tmr（図３０）と名付けられる
。 【０１０８】 （実施例９） この例での再生は、Riを基礎にしたＴＩＰプラスミドによって刺激されたニン ジンの腫瘍を包含し、本質的に、M.-D．Chilton et al.（1982）Nature 295:432
〜434 によって記載されるように実行される。 【０１０９】９．１ 毛状の根を感染すること ニンジンの円板状組織は、水0.1ml中の約10⁹の細胞を接種される。得られた根
(root)の末端1〜1.5cmの部分が切りとられ、ホルモンを欠いた固体（1〜1.5 ％
寒天）Monier培地（D.A.Tepfer and J.C.Tempe（1981）C.R.Hebd.Seanc.Acad.Sc
i.,Paris 295:153-156）に置かれ、暗所で25℃〜27℃で生育される。細菌による
汚染のない培養物が、２〜３週間ごとに移され、ホルモンと寒天を欠いたMonier
培地にさらに植えて培養される。 【０１１０】９．２ 根の植物への再生 実施例９．１に述べられているように培養された根組織は、0.36μM 2,4-D と
0.72μM キネチン（kinetin）で補填した固体（0.8％寒天）Monier培地に置かれ
る。４週間後、その結果、生じたカルス組織はホルモンを欠いている液体Monier
培地中に置かれる。１ケ月間、22℃〜25℃でシェイカー（150rpm）で保温の間、
カルスは懸濁培地に分離し幼胚は分化し、ホルモンを欠いたMonier培地を含むペ
トリ皿に置いた時、苗木に育つ。これらの苗木は、培地中で育ち、段階的に減少
した湿度の空気にさらすことにより"強くした（hardening）"後、温室か庭園（
フィールドプロット）中の土壌に移される。 【０１１１】９．３ 非毛状の根のベクターの使用 機能するtmr遺伝子をもたないTiを基礎にしたベクターは、実施例９．１と９
．２に述べられているようにRiを基礎にしたベクターの代わりに使われる。適切
な欠失の構成は実施例６、７と８に述べられている。 【０１１２】 （実施例１０） この実施例での再生は、Tiを基礎にしたＴＩＰプラスミドによって刺激された
タバコの腫瘍を含み、本質的に、K.A.Barton et al.（1983）Cell 32：1033〜10 43によって記載されるように実行される。 【０１１３】１０．１ クラウンゴールの感染 タバコ組織は、初めA.C.Braun（1956）Canc．Res.16:53-56に述べられている
ように、転化した茎断片を利用する方法を使って形質転換される。茎は７％の商
品化されているクロロックスと80％エタノールで表面を殺菌され、殺菌した蒸留
水ですすぎ、１cm切片に切り、ホルモンを欠いた寒天固体ＭＳ培地（T.Murashig
e and F.skoog（1962）Physiol.Plant.15:473-497）を含むペトリ皿中に基底部
におく。植菌は、注射針で茎の切られた基底表面にさし、細菌を注入することに
より遂げられる。茎は25℃で１日当り16時間明所で培養される。育ったカルス（
calli）は茎切片の上部表面から除かれ0.2mg/mlのカルベニシリンを含みホルモ
ンを欠いた固体ＭＳ培地に置かれ、１ケ月のうち、３回、時々、新しいＭＳーカ
ルベニシリン培地に移され、培地に細胞が浮遊しているかどうかを確かめるため
、試験される。無菌組織は上述されているような培地条件(25℃；16hr.：8hr.明
所：暗所)の下で補足のない固体ＭＳ培地で維持される。 【０１１４】１０．２ 形質転換された組織の培地 クローンは、A.Binns and F.Meins（1979）Planta 145:365-369 により述べら
れているように形質転換された無菌組織から得られる。カルス（calli）は、２
または３日間、25℃で0.02mg/l ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）のある液体ＭＳ中で
の培養によって細胞懸濁液に変えられるが、その間135rpmで振とうされ、543と2
13μmのステンレス製の網を通って濾過される。通過した濾過液は濃縮され、0.5
％の溶解された寒天、2.0mg/l ＮＡＡ、0.3mg/lキネチンと 0.4ｇ/l Difco酵母
エキスを含むＭＳ培地の５mlに約８×10³細胞mlの濃度でプレーティングされる
。約１mmの直径に達したコロニーはメス先端で採集され、2.0mg/l ＮＡＡと0.3m
g/lキネチンを含む固体ＭＳ培地に置き、そして生育される。その結果として生
じたカルス（calli）は個々に分裂し、そして形質転換された表現型を検査され
る。 【０１１５】１０．３ 植物の再生 形質転換されたクローンは、0.3mg/lキネチンを含む固体ＭＳ培地に置かれ、
実施例１０．１に述べられたように培養される。形成している芽は1/10強度のＭ
Ｓ培地塩、0.4mg/lのサイアミンを含み、シュークロースとホルモンを欠いてお
り、pH7.0の固体（1.0％寒天）培地にそれらを置くことにより、根づかせる。根
づかせられた苗木（plantlet）は、培地中で生育され、実施例９．２に述べられ
ているように強く（harder）され、温室か庭園（field plot）のどちらかの中で
土壌に移される。 【０１１６】１０．４ 使用されるベクター 実施例１０．１、１０．２および１０．３に述べられている方法は、機能する
tmr遺伝子を欠いたTiに基づいたベクターに適当である。適当な欠失の構成は実
施例６、７と８の中で述べられている。これらの方法も、Riに基づいたベクター
とともに使われた時、有効である。実施例１０．１の中で転化した茎断片の感染
に対して述べられている方法は、しばしばＴＩＰ形質転換植物細胞系列の確立に
役立つ。 【０１１７】 （実施例１１） フォセオリンは、Phaseolis vulgarisの豊富な貯蔵蛋白（全種子蛋白の約50％
）である。機能するフォセオリン遺伝子のアルファルファ植物への移入とフォセ
オリンメッセンジャーＲＮＡの貯蔵されるフォセオリンの翻訳は、それが貯蔵蛋
白合成を葉材に、家畜飼料として使われるべく導入するので重要な経済的価値を
もつ。アルファルファは、フォセオリン遺伝子の移入と発現に対し、価値ある植
物である。というのも、それが家畜飼料としての受容体（acceptance）であり、
それが速く育ち、リゾビウムとの共生をとおして窒素固定が可能であり、クラウ
ンゴール感染に感受性であり、そして一つの細胞かプロトプラストからアルファ
ルファ植物への再生が可能であるからである。 【０１１８】 この例は発現しうるフォセオリン遺伝子の完全なアルファルファ植物への導入
を教示する。 【０１１９】１１．１ シャトルベクターの構成 アルファルファ植物は以後述べられるように、遺伝学的に巧みに処理したアグ
ロバクテリウムのプラスミドを含むクラウンゴール組織から再生される。初段階
で我々は、機能するフォセオリン遺伝子を組み換えたtmr ^-とtms ^-のＴ−ＤＮＡ変
異体を含む"シャトルベクター"を構成する。この構成は順番に下流に機能するネ
オマイシンホスホトランスフェラーゼ（NPT II）の構造遺伝子（カナマイシン耐
性）をもつノパリン合成酵素のプロモーターと組み換えられる（M.-D.Chilton,e
t al.（18 January 1983）15th Miami Winter Symposiumにより報告された;J.L.
Marx（1983）Science 219: 830 and R.Horsch et al.（18 January 1983）15th
Miami Winter Symposium参照）。このタイプの構成は、実施例１に説明されて
いる。 【０１２０】１１．２ アグロバクテリウムと植物細胞への移入 "シャトルベクター"は、次いで、従来技術で（実施例１４）pTi15955のような
Tiプラスミドを含む、アグロバクテリウムのある株に形質転換される。組み換え
プラスミドを含むバクテリアが選択され、そして細胞壁を再生されているアルフ
ァルファとともに一緒に培養される（Marton et al.(1979)Nature 277:129-131;
G.J.Wullems et al.(1981)Proc.Nat.Acad.Sci．USA 78：4344-4348;およびR.B.
Horsch and R.T.Fraley(18 January 1983)15th Miami Winter Symposium）。 【０１２１】 細胞は、培地で生育され、その結果として生じたカルス組織は、ノーザンブロ
ッティング（実施例１２）による特定のｍ−ＲＮＡの存在やＥＬＩＳＡ試験によ
る特定の蛋白の存在を検査される（J.L.Marx(1983)Science 219:830; R.B.Horsc
h andR.T．Fraley(18 January 1983)15th Miami Winter Symposium参照）。 【０１２２】１１．３ 植物の再生 アルファルファ植物は、それから A.V.P．Dos Santos et al.（1980）Z．Pfla
nzenphysiol.99: 261-270;T.J.McCoy and E.T.Bingham（1977）Plant Sci.Lette
rs 10: 59-66;およびK.A.Walker et al.（1979）Plant Sci.Letters 16: 23-30
により以前より使用されている方法に似た方法でカルス組織から再生される。こ
れらの再生された植物は、次いで新規な商業的変種の基礎を形成する従来の植物
生育技術によって繁殖される。 【０１２３】 （実施例１２） すべての実施例において、ＲＮＡが抽出され、分画され、次の処理によって探
知される。 【０１２４】１２．１ ＲＮＡ抽出 この処理は、Silflow et al.(1981)Biochemis-try 13:2725-2731の改変であっ
た。CsCl遠心分離に対するLiCL沈澱の代用は、Murray et al.(1981)J.Mol.Evol.
17:31-42 により記載されていた。沈澱するための２Ｍ尿素を加えた２Ｍ塩化リ
チウムの使用はRhodes(1975)J.Biol.Chem．25:8088-8097から引用された。 【０１２５】 組織はポリトロンかグラウンドガラスホモゲナイザーを使って４％のパラ−ア
ミノサリシル酸、１％トリ−イソプロピルナフタレンスルホン酸、10mMジチオス
レイトール（新鮮に作られたもの）と10mM Na−メタビサルファイト（新鮮に作
られたもの）を含む冷却した50mMトリス−塩酸（pH 8.0）の４-５倍量中で均質
化された。オクタノールは泡立ちを抑制するのに必要とされるものとして使われ
る。１％の８−ヒドロキシキノリンを含む、トリス飽和されたフェノールの等量
が均一化物に加えられ、それから振とうされ、乳状にし、そして20000-30000gで
４℃、15分間、遠心分離された。水の上層はクロロホルム/オクタノール（24:1
）で１度、抽出され、上記のように遠心分離される。濃縮された塩化リチウム−
尿素溶液はそれから各々、２Ｍの最終濃度になるように加えられ、その混合液 は数時間、20℃で放置された。そのＲＮＡ沈澱物は、それから遠心分離で落とさ
れ、２Ｍ塩化リチウムにより、ペレットを分散するため洗われた。その沈澱物は
次いで70％エタノール-0.3Ｍ酢酸ナトリウムにより洗われ、透明な溶液になるよ
うに充分な殺菌水に溶解された。エタノールを1/2倍量加えられ、そしてその混
合液は1/2時間水上に置かれ、その後、雑多な多糖をとり除くため遠心分離され
た。ＲＮＡ沈澱物はそれから再生され、そして水または殺菌した塩を含まないポ
リ（Ｕ）緩衝液に再溶解された。 【０１２６】１２．２ ポリ（Ｕ）／セファデックスクロマトグラフィー ２つのポリ（Ｕ）セファデックス（商標：Pharmacia，Inc.、Uppsala，Sweden
）緩衝液を用いた。一つは無塩で20mM Tris、1mM EDTAおよび0.1％SDSを含んで
いる。もう一つは一つ目の緩衝液に0.1Ｍの塩化ナトリウムを加えたものである
。Ａ426において、良好な会合を起こすために、２X貯蔵緩衝液を作る必要がある
。そして一部分に塩を加えることが必要である。最終濃度に合わせてから、緩衝
液をオートクレーブにかける。 【０１２７】 ポリ（Ｕ）セファデックスは、Bethesda Research Laboratoriesより得た。10
0μgの期待されるポリ（Ａ）ＲＮＡについて1gのポリ（Ｕ）セファデックスを用
いた。ポリ（Ｕ）セファデックスを、無塩のポリ（Ｕ）緩衝液に水和し、ジャケ
ットをつけたカラムに流し込む。温度を60℃に上げ、カラムを無塩緩衝液で 260
mmにおけるベースラインが平滑になるまで洗った。最終的には、カラムを塩を含
むポリ（Ｕ）緩衝液で40℃で平衡化する。 【０１２８】 濃度500μｇ/ml以下のＲＮＡを無塩緩衝液中で65℃、５分間加熱した。その後
、冷却し、塩化ナトリウムを 0.1Ｍの濃度になるように加えた。それから光学濃
度が安定なベースラインまで落ちるまで、流速1ml/min.以下で流したカラムにＲ
ＮＡを移す。それから、カラム温度を60℃まで上げ、ＲＮＡを無塩ポリ（Ｕ）緩
衝液で溶出させた。ＲＮＡは普通３倍のカラム容量で洗い出される。溶出したＲ
ＮＡを用いやすい容量まで２級ブタノールで濃縮し、10mMになるように塩化ナト
リ ウムを加えた後、２倍容量のエタノールを加え沈澱させる。エタノール沈澱物を
水に溶かし、NH₄−酢酸塩を0.1Ｍになるよう加える。そしてエタノールで再び沈
澱させる。最終的にＲＮＡを殺菌水に再溶解し、-70 ℃において保存する。 【０１２９】１２．３ ホルムアルデヒドＲＮＡゲルと"ノーザン"ブロット 用いる方法は Thomas(1980)Proc.Nat.Acad.Sci．USA 77:5201およびHoffman,
et al.(1981)J.Biol.Chem．256:2597 によるものである。 【０１３０】 20mMリン酸ナトリウム（pH 6.8〜7.0）を含む0.75〜1.5％のアガロースゲルを
固めた。もし高分子の集合したバンドが現れたら、6％あるいは2.2Mのホルトア
ルデヒド（36％の貯蔵溶液を用いる）を加えて、実験をやり直した。ホルムアル
デヒドをアガロースに65℃まで冷やしてから加えた。ホルムアルデヒドを加える
と臭化エチジウムにより発見が困難になる。泳動緩衝液は10mMリン酸ナトリウム
（pH 6.8〜7.0）である。 【０１３１】 電気泳動に先だち、ＲＮＡを最終濃度６％ホルムアルデヒド、50％ホルムアル
デヒド、20mMリン酸ナトリウム緩衝液および5mM EDTAの変性緩衝液で処理した。
ＲＮＡを緩衝液中60℃で10〜20分間保温した。保温は、停止緩衝液の添加に停止
した。20μlのサンプルについて、4μl 50％グリセロール、10mM EDTA、5mMリン
酸ナトリウムそしてブロムフェノールブルーを加えた。 【０１３２】 浸水した電気泳動を用いる。ゲルを浸す前に、ＲＮＡをロードした。そして12
5mAで5分間ゲルの中に入れた。 【０１３３】 それからゲルを水に浸し、電流を30mA（夜通し）あるいは50mA（6〜8時間）に
下げる。緩衝液を循環させ、低温室で電気泳動を行った。 【０１３４】１２．４ "ノーザン"ブロット 特異的なＲＮＡを検出するためにブロットされるゲルの場合は、染色しなかっ た。しかし分離したマーカーのレーンは染色に用いた。染色は0.1M酢酸ナトリウ
ム中、5μｇ/ml臭化ブロマイドで行い、脱染色は0.1M酢酸ナトリウム中、数時間
行った。 【０１３５】 染色の前に、5〜10分間、60〜70℃の水で処理すると視認が容易になった。ブ
ロットするゲルを15分間、10x標準サリンクエン酸（SSC）−3％ホルムアルデヒ
ドに浸した。もし、大きなＲＮＡ分予がゲルから溶出しなければ、そのときは処
理の前にＲＮＡに切れ目をいれるために50mM水酸化ナトリウム中、10〜30分間処
理した。もし、基礎処理を用いたのなら、ブロットする前にゲルを中和し、SSC-
ホルムアルデヒドに浸すべきである。ＲＮＡのニトロセルロースへの転移は標準
方法により行った。 【０１３６】 プレハイブリダイゼーションを42℃で最低４時間、50％ホルムアルデヒド、10
％硫酸デキストラン、5XSSC、5Xデンハート、100μｇ/ml変性キャリヤーＤＮＡ
、20μｇ/mlポリ（Ａ）、40mMリン酸ナトリウム（pH 6.8〜7.0）、0.2％SDS中で
行った。ハイブリダイゼーションをプローブを同じ緩衝液に加え、一晩保温して
行った。プローブは、約5×10⁵cpm/ml以上の濃度で用いた。 【０１３７】 ハイブリダイゼーション後、ニトロセルロースを、42℃で2XSSC、25mMリン酸
ナトリウム、5mM EDTA、2mMピロリン酸ナトリウム溶液を用いて何度も洗った。
最後に、64℃で20分間、1XSSCで洗った。 【０１３８】 もし、オートラジオグラフィーに際して、フィルターが乾燥していなくてまた
、プローブが1mM EDTAにより64℃で広範囲に洗ったことで除かれているのなら、
最上の結果が得られた。 【０１３９】 （実施例１３） "ウェスタン"ブロット（SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動後、抗原を発見
するために行う）は、本質的には R.P.Legocki and D.P.S.Verma（1981）Analyt
. Biochem．111:385-392に示されているのと同様に行った。 【０１４０】 マイクロ−ＥＬＩＳＡ(enzyme-linked immuno-sorbant assay)を96個のウェル
(well)をもつImmulon−2型プレートを用いて次に示すステップにより行った。 【０１４１】１３．１ プレートへの抗体の結合 一日目、ウェルをコーティング緩衝液で1:1000に希釈した抗体（ウサギ抗ファ
セオリンIgG）でコートした。200μl/wellで37℃で2〜4時間保温した。プレート
をサランラップでおおった。それから、プレートをリン酸緩衝液−ツイーン（PB
S-Tween）で３回洗った。各々の洗いのステップは5分間あけた。それから、1％
の牛血清アルブミン（BSA）を洗いのために加え、20分間放置してから捨てた。
洗いはPBS-Tweenを用いて５回以上行った。 【０１４２】１３．２ 組織の均質化 組織を小片に切ってからポリトロンにより、１gmの組織/mlリン酸緩衝液−ツ
イーン−2％ポリビニル、ピロリドン−40（PBS-Tween-２％ PVP-40）の条件でホ
モゲナイズした。すべてのサンプルは破砕の前後およびファセオリン標準曲線の
作成の前後は氷中で保存した。組織のホモジェネートで標準曲線を作成した。そ
して、組織に依存するファセオリンの回収をチェックするために緩衝液で標準曲
線を作った。ホモゲナイズしたサンプルを遠心分離した後、各々のサンプルのう
ち100μlをウェルに入れ、4℃で一晩放置した。失敗を避けるために各々のサン
プルについて2個、同じことをした。保温中、プレートはシールした。 【０１４３】１３．３ 酵素の結合 一晩保温後、抗原を捨てウェルを PBS-Tweenで5回洗う、各々の洗いの間に5分
間の間隔を置いた。 【０１４４】 結合物（ウサギ抗ファセオリンIgGアルカリフォスファターゼ結合）をPBS-Twe
en−2％PVP（0.2％ BSAを含む）で1:3000に希釈し、150μlを各ウェルに加えた
。 そして37℃で3〜6時間保温した。保温後、結合物を捨て、ウェルをPBS-Tweenで5
回洗う。各々の洗いの間に５分間の間隔を置く。 【０１４５】１３．４ 分析 分析を始める直前に、ｐ−ニトロフェニルフォスフェイトの5mgの錠剤（Sigma
より得た。そして暗所で凍結保存）を、10mlの基質に加え、錠剤が溶解するまで
攪拌する。200μlの室温溶液をすばやく各ウェルに加える。反応を種々の時間（
たとえばt=0，10，20，40，60，90，120分）において、Dynatech Micro-ELISA r
eaderを用いて測定した。 【０１４６】 ｐ−ニトロフェニルフォスフェイト（無色）がアルカリフォスファターゼによ
り無機リン酸とｐ−ニトロフェノールに加水分解されるとｐ−ニトロフェノール
が溶液に黄色を与えた。それは 410nmにおける分光光度的に測定し得た。検出で
きる最小量は0.1ngより小であった。 【０１４７】 （実施例１４） 三親交雑は、一般的に次に示すように行われた；当業者に公知の他の変法も用
いることができる。E．coli K802（pRK290に基礎をおくシャトルベクター）をE.
coli（pRK2013）およびストレプトマイシンに耐性なアグロバクテリウム・チュ
ーメファシエンス株と交雑した。pRK2013は、シャトルベクターをもつ株に移り
、アグロバクテリウムへ移入するためのシャトルベクターを作った。ストレプト
マイシンおよびシャトルベクターが耐性である薬剤（カナマイシンか、クロラム
フェニコールがしばしば用いられる）の両方を含む培地で成育するものの中から
シャトルベクター配列を有するアグロバクテリウムの細胞を選択した。これらの
細胞とE.coli（pPH 1J1）との交雑によりアグロバクテリウム細胞にpPH1J1が移
った。pPH1J1とpRK290に基礎を置くシャトルベクターは同一細胞内に長時間、共
在することができない。ゲンタマイシン（pPH1J1が耐性遺伝子をもつ）を含む培
地で生育させれば、pRK290配列の欠落した細胞を選択することができた。ストレ
プトマイシンおよびゲンタマイシンおよびカナマイシンあるいはクロラムフェニ
コ ールに耐性な細胞のみがシャトルベクターと二重相同部位組み換えをおこしたTi
プラスミドを持ち、所望の構成を有している。

【図面の簡単な説明】 【図１】 本発明の実施例１１、１２および１４で使用されるプラスミドを比較した説明図
である。 【図２】 ＴｉプラスミドpTi15955のＴ−ＤＮＡ領域を示す説明図である。 【図３】 実施例１で使用されるp395とp376の作成を示す説明図である。 【図４】 実施例１で使用されるp499/6/7の構造を示す説明図である。 【図５】 実施例１で使用されるp499/6/8の構造を示す説明図である。 【図６】 実施例１で使用されるp496-2の構造を示す説明図である。 【図７】 実施例１で使用されるp496-1の構造を示す説明図である。 【図８】 実施例２で使用される各プラスミドの構造を示す説明図である。 【図９】 実施例２で使用されるpKS-nopIVの構造を示す説明図である。 【図１０】 実施例２で使用されるpRK290の構造を示す説明図である。 【図１１】 実施例２で使用されるpKS-KB3.8の構造を示す説明図である。 【図１２】 pBR322の構造を示す説明図である。 【図１３】 実施例３で使用されるp3.8の構造を示す説明図である。 【図１４】 実施例３で使用されるファセオリン遺伝子の構造を示す説明図である。 【図１５】 実施例３で使用されるAG-pPVph7.2(p7.2)の構造を示す説明図である。 【図１６】 実施例３で使用されるpKS-4の構造を示す説明図である。 【図１７】 実施例３のpKS4-KBの構造を示す説明図である。 【図１８】 実施例４のp3.8-cDNAの作成と構造を示す説明図である。 【図１９】 実施例５で使用されるpKS-5の作成を示す説明図である。 【図２０】 実施例５で使用されるpKS-oct.Cam 203の作成を示す説明図である。 【図２１】 実施例５で使用されるpKS-oct.delIIの構造を示す説明図である。 【図２２】 実施例５で使用されるpKS-oct.delIの構造を示す説明図である。 【図２３】 実施例６で使用されるp2fの作成方法を示す説明図である。 【図２４】 実施例６で使用されるp3eの作成方法を示す説明図である。 【図２５】 実施例６で使用されるpKS-oct.delIIIの作成方法を示す説明図である。 【図２６】 実施例７で使用されるpKS-6の作成方法を示す説明図である。 【図２７】 実施例７で使用されるp2の作成方法を示す説明図である。 【図２８】 実施例７で使用されるpKS-oct.delIIIaの作成方法を示す説明図である。 【図２９】 実施例８のp203のHpaI部位のBglII部位への変換方法を示す説明図である。 【図３０】 実施例８のpKS-oct.tmrの構造を示す説明図である。 【図３１】 実施例１でシャトルベクターの作成に用いるp203の構造を示す説明図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 【請求項１】 (a)植物由来のプロモーターと植物の構造遺伝子とを有する植
   物の遺伝子をＴ−ＤＮＡに挿入する工程、それによってＴ−ＤＮＡ／植物の遺伝
   子結合物を形成し、該植物由来のプロモーターは該植物の構造遺伝子の５’末端
   に隣接し、そして該植物の構造遺伝子は該植物由来のプロモーターから転写方向
   に下流にある；そして、 (b)該Ｔ−ＤＮＡ／植物の遺伝子結合物を双子葉植物細胞に移入する工程、 を包含する双子葉植物細胞を遺伝学的に修飾する方法。 【請求項２】 前記工程(b)の実行後に、さらに、(c)前記Ｔ−ＤＮＡ／植物の
   遺伝子結合物を含んだ植物細胞中で前記植物の構造遺伝子の発現を検知する工程
   を包含する、請求項１に記載の方法。 【請求項３】 前記構造遺伝子が１つかそれ以上のイントロンを有する、請求
   項１に記載の方法。 【請求項４】 前記植物の遺伝子が種子貯蔵蛋白をコードする、請求項１に記
   載の方法。 【請求項５】 前記植物の遺伝子がファセオリンをコードする、請求項１に記
   載の方法。 【請求項６】 前記Ｔ−ＤＮＡと植物の遺伝子との結合物が、シャトルベクタ
   ーの部分として前記工程(b)に先立って維持されそして複製される、請求項１に
   記載の方法。 【請求項７】 前記植物の遺伝子が tml あるいは"1.6"領域中のオクトピン型
   Ｔ−ＤＮＡ中に挿入される、請求項１に記載の方法。 【請求項８】 前記双子葉植物がコンポジテかレグミノセの一員である、請求
   項１に記載の方法。