JP3856471B2 - 安定なタンパク質：リン脂質の組成物および方法 - Google Patents
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Description
発明の背景
本発明は、溶融小球状（molten globular state）に変化することのできるタンパク質の二次および三次構造を安定化させるのに有用なタンパク質：リン脂質構造に関する。特に、本発明は、より高い安定性およびより長いシェルフライフを示し、高温での製剤において、また新規の供給送達賦形剤として使用することができるＧ-ＣＳＦ：リン脂質およびＭＧＤＦ：リン脂質組成物に関する。
いくつかのタンパク質が溶融小球状（ＭＧＳ）に変化することが示されている。Ｖａｎ ｄｅｒ Ｇｏｏｔ， Ｆ．Ｇ．， Ｎａｔｕｒｅ ３５４， ４０８−４１０（１９９１）。溶融小球状のタンパク質は天然タンパク質と同等の二次構造を示すが、堅固な三次構造を欠く。Ｐｉｔｓｙｎら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２６２：１， ２０−２４（１９９０）。一部の場合には、この状態への遷移はそれまで隠されていたタンパク質の疎水性領域の露出を伴う。臨界疎水性残基を露出することにより、ＭＧＳはタンパク質の凝集および沈降における中間体となりうる。ＭＧＳの立体配座は、遠紫外領域における円偏光二色性を芳香族側鎖のスペクトル（近紫外円偏光二色性および蛍光）と比較することによって検出することができる。溶融小球状状態は、遠紫外円偏光二色性変化の不在下で芳香族スペクトルの変化を示し、Ｂｙｃｈｋｏｖａら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２３８：２３１−２３４（１９８８）、一部のタンパク質による膜透過に関与すると考えられる、Ｂｙｃｈｋｏｖａら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２３８：２３１−２３４（１９８８）；Ｖａｎ ｄｅｒ Ｇｏｏｔ， Ｆ．Ｇ．， Ｎａｔｕｒｅ ３５４， ４０８−４１０（１９９１）。
顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ-ＣＳＦ）は、凝集の前にＭＧＳに遷移することが知られているタンパク質のひとつである。ヒト組換えＧ-ＣＳＦは、感染に対抗するために使用される白血球の一種である好中球を選択的に刺激する。現在、組換えＧ−ＣＳＦであるフィルグラスチム（Ｆｉｌｇｒａｓｔｉｍ）が治療に使用されている。種々の条件下でのＧ-ＣＳＦの構造が広汎に検討されてきた；Ｌｕら、Ｊ． Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． Ｖｏｌ． ２６７， ８７７０−８７７７（１９９２）。その疎水特性のゆえに、Ｇ-ＣＳＦは長期的なシェルフライフの製剤することが困難である。一部の疎水性タンパク質の製剤は、長期保存中にダイマーおよびより高次の凝集物（マクロ領域）の形成によって活性を失う。保存中にはアミド分解や酸化のような他の化学的変化も起こりうる。さらに、Ｇ-ＣＳＦを製剤するには変性に対しても保護しなければならず、特にタンパク質の二次および三次構造の安定性を保持するように注意しなければならない。
ヒトＧＭ-ＣＳＦは、マクロファージおよび顆粒球性始原細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏでの増殖のために継続的に必要とされる２２-ｋＤａの糖タンパク質である。この物質はまた、これらの始原細胞が顆粒球およびマクロファージを形成する不可逆的作用を制御する。その他の生物学的作用には、成熟細胞型の機能的作用の調節；Ｇｏｕｇｈら、Ｎａｔｕｒｅ， ３０９， ７６３−７６７（１９８４）、ならびに認識された化学的誘因物質への走化性の上昇；Ｗｉｌｌｉａｍｓら、Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ， ４ｔｈ ｅｄ．（１９９０）が含まれると考えられる。ＧＭ-ＣＳＦは同時に単球の産生を刺激し、従って単球減少症のような単球性障害の治療において有用であると考えられる。
ヒトＧＭ-ＣＳＦは多くのソースから入手し、精製することができる。組換えヒトＧＭ-ＣＳＦの生産のための方法は、以前にＢｕｒｇｅｓｓら、Ｂｌｏｏｄ， ６９：１， ４３−５１（１９８７）によって記述されている。本文中に参考文献として包含される米国特許５，０４７，５０４号（Ｂｏｏｎｅ）は、原核宿主細胞発現の産物としてグリコシル化されていない形態のＧＭ-ＣＳＦの商業規模量の生産を可能にした。
ＭＧＤＦあるいは巨核球増殖分化因子は、循環血小板レベルの主要な調節因子であると思われる、最近クローン化されたサイトカインである。次の文献参照：Ｂａｒｔｌｅｙ， Ｔ．Ｄ．ら、Ｃｅｌｌ ７７：１１１７−１１２４（１９９４）；Ｌｏｋ， Ｓ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３６９：５６５−５６８（１９９４）；ｄｅ Ｓａｕｖａｇｅ， Ｆ．Ｊ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３６９：５３３−５３８（１９９４）；Ｍｉａｙａｚａｋｉ， Ｈ．ら、Ｅｘｐ． Ｈｅｍａｔｏｌ． ２２：８３８（１９９４）；Ｋｕｔｅｒ， Ｄ．Ｊ．ら、ＰＮＡＳ ＵＳＡ， ９１：１１１０４−１１１０８（１９９４）。ＭＧＤＦはまたトロンボポイエチン（ＴＰＯ）、ｍｐｌ-リガンド、メガトポイエチンとも称される。成熟ヒトＭＧＤＦは全体で３３２個のアミノ酸を持つタンパク質である。このタンパク質および対応するｃＤＮＡの配列を本文中の図２９に示す。
チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）および大腸菌細胞において生産した組換えＭＧＤＦは、ｉｎ ｖｉｖｏでマウス、ラットおよびサルにおいて巨核球および／あるいは血小板を特異的に刺激あるいは増加させる生物学的活性を持つことが明らかにされている。Ｈｕｎｔ， Ｐ．ら、Ｂｌｏｏｄ ８４（１０）：３９０Ａ（１９９４）参照。図２９の１位のアミノ酸から始まって少なくとも１５１個のアミノ酸に及ぶように切断したヒトＭＧＤＦ分子はin vivoでの生物学的活性を保持している。また、ヒト配列のＭＧＤＦタンパク質のＮ末端で最初の６個のアミノ酸までを取り除いて、生物学的活性を保持することが可能である。それ故、生物学的活性は図２９に示すヒトＭＧＤＦの成熟アミノ酸配列の７位から１５１位（両端を含む）までのアミノ酸内に保持されていると思われる。
天然に生じるＭＧＤＦはグリコシル化された分子である。天然ＭＧＤＦのグリコシル化パターンは、ＭＧＤＦにおいて認められた２つのキー領域に関連する。この分子の活性部分に相当する、ヒトＭＧＤＦの最初の約１５１個のアミノ酸配列は、赤血球の産生を刺激することができるサイトカイン、エリスロポイエチン（ＥＰＯ）と顕著な相同性を持ち、ヒトＭＧＤＦの「ＥＰＯ様」領域と称される。成熟タンパク質の残りのアミノ酸は、いわゆる「Ｎ結合炭水化物」領域を構成する。これらはＮ結合グリコシル化のための部位の全部ではないにしても大部分を含むからである。ヒトＭＧＤＦには、６個のＮ結合グリコシル化部位が存在し、そのすべてがＮ結合グリコシル化領域に含まれる。いずれの領域もＯ結合グリコシル化部位を含む。分子中には推定上１２-１４のＯ結合グリコシル鎖が存在する。ＣＨＯ細胞において組換えによって発現されたヒトＭＧＤＦ ＤＮＡに関する実験的証拠は、ＥＰＯ様領域では少なくとも２つのＯ結合部位が１位（Ｓｅｒ）と３７位（Ｔｈｒ）でグリコシル化されていることを示している。
Ｇ-ＣＳＦやＭＧＤＦのようなタンパク質はある種の特定条件下で安定化されうるが、さらにこれらやその他のタンパク質の二次および三次構造を安定化させることにより、シェルフライフを延長させる必要がある。そのようなタンパク質を処理するためにこれまでに試みられたひとつの方法がリポソームの使用である。リポソームは水不溶性の極性脂質、特にリン脂質によって形成される完全に閉鎖された脂質二重層の膜である。リポソーム小胞は単一の膜二重層を持つこともあり（単層性）、あるいは複数の膜二重層を持つこともある（多層性）。二重層は、親水性（極性）の「頭部」領域と疎水性（無極性）の「尾部」領域を持つ２つの脂質単層から成り、親水性の頭部が水相の方に向うのに対し、疎水性の尾部は二重層の中心の方向に向う。リポソームの安定性、硬さおよび透過性は、リン脂質組成の変化、温度変化、ステロールの包含あるいは電荷した両親媒分子の取り込みによって変わりうる。リポソームの基礎構造は当業者に周知の様々な技術によって作製できる。
リポソームはその形成過程において、水性チャネルに水溶質を捕獲し、種々の速度でそれらを放出することができる。リポソームは細胞内に酵素を導入し、その代謝を変化させうることが発見されて（Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ， Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． ２９５， ７０４−７１０， ７６５−７７０（１９７６））、リポソームは標的薬剤送達の探求に対する回答であると伝えられた。その結果、リポソームの疎水層あるいは疎水核内に隠された薬剤、ビタミンおよびタンパク質の緩徐放出デポ剤としてのリポソームの使用に関して、製薬業界において数多くの開発研究が行われている。
薬物担体としてのリポソームの使用の成功は限られている。そのような使用を試みた研究者達がいくつかの問題に遭遇したためである。たとえば、リポソームは封入された抗原に対する強力な免疫学的付加物として作用することが知られており、外因性由来の酵素あるいは他のタンパク質がリポソーム内に封入されたときには警戒が必要である。また、薬剤の拡散速度を制御することは困難である。これはリポソームに固有の不安定性と一部の薬剤の拡散を促進するある種の血液成分の存在によるものである。さらに、一部の物質は、その性質上リポソーム内にほとんど封入されず、従って循環中に速やかに拡散する。最後に、肝臓あるいは脾臓以外の細胞あるいは器官を標的するという問題があった。リポソーム、リポソーム内に取り込まれた物質、および薬物担体としてのリポソームの使用に関連した問題についての卓越した総説は、「生物学および医学における薬物担体」１４章、２８７−３４１（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎ．Ｙ．， １９７９）に掲載されているＧｒｅｇｏｒｙ Ｇｒｅｇｏｒｉａｉｄｉｓによる「リポソーム」である。
薬物担体としてリポソームを利用する試みに関しては多くの報告があるが、ペプチドおよび／あるいはタンパク質の構造を安定化させることにより治療用ペプチドあるいはタンパク質のシェルフライフを向上させる目的でのリポソームの使用についてはほとんど開示されていない。「治療用ペプチドおよびタンパク質」と題するＰＣＴ／ＵＳ９０／０５１６３において、Ｈｏｓｔｅｔｌｅｒらは、空気／水界面におけるポリペプチドおよび／あるいはタンパク質の蓄積を防ぐため、ならびに容器表面へのポリペプチドおよび／あるいはタンパク質の吸着を防ぐために、ポリペプチドおよび／あるいはタンパク質を可溶化するための医薬上許容されうる希釈薬としての空（ｅｍｐｔｙ）のリポソームの使用を開示している。Ｈｏｓｔｅｔｌｅｒらは、負に電荷したリン脂質を約５０モル％まで付加しうること、また中性リン脂質であるホスファチジルコリンが好ましいリポソームであることを開示している。Ｈｏｓｔｅｔｌｅｒらはポリペプチドおよび／あるいはタンパク質の構造を安定化させることが示された希釈薬については開示していない。
「腫瘍壊死因子のリポソーム製剤の調製と特性」と題するＰＣＴ／ＵＳ９１／０７６９４、Ｈｕｎｇら、では、表面に結合したあるいはリポソーム内に被包された、脂質親和性に変化させた腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）分子が記述されている。リポソーム性脂質親和性ＴＮＦ分子はｉｎ ｖｉｖｏでの安定性が高いことが報告されている。安定性とは、ＴＮＦ−リポソームが、ｉｎ ｖｉｖｏで系内へのＴＮＦの漏出が低いあるいは低下傾向にあることを指す。好ましいリポソームは中性脂質であった。Ｈｕｎｇらは、賦形剤がタンパク質構造への安定化作用を持つＴＮＦ組成については開示していない。
タンパク質、たとえばＧ-ＣＳＦあるいはＭＧＤＦを負に電荷した脂質小胞と接触させ、それによって直接、熱誘発の凝集、変性、活性喪失、および二次構造の展開（unfolding）に対してタンパク質を安定化させることに関しては、文献からは何も引き出せない。高温を必要とする製剤工程（たとえばＧ-ＣＳＦおよび／あるいはＭＧＤＦのポリマー内への取り込み）において有用である、ならびに新規の送達賦形剤として使用される（たとえばＰＥＧ化（ｐｅｇｙｌａｔｅｄ）Ｇ−ＣＳＦの経口投与）という恩恵をもたらす組成物への需要が存在する。本発明はそのような組成を提供するものである。
発明の概要
本発明は、溶融小球状態条件下でタンパク質に疎水性賦形剤、例えば、リソ−リン脂質もしくは他のリポソーム、を添加することがそのタンパク質の二次及び三次構造を直接安定化し、それにより熱誘発凝集、変性、及び失活からタンパク質が保護されることに向けられている。特には、本発明は、安定なＧ−ＣＳＦ：リン脂質及びＭＧＤＦ：リン脂質組成物に向けられている。驚くべきことに、好ましいＧ−ＣＳＦ：リン脂質及びＭＤＧＦ：リン脂質組成物は、冷却によるタンパク質二次構造の完全な回復を伴いつつ、１０−９５℃の間で数回循環させることが可能である。これらの組成物は、新規輸送担体としての使用の他に、高温を要する処方手順に有用である。加えて、これらの組成物は、タンパク質単体と比較して長期の貯蔵有効期間を示し、かつタンパク質とリン脂質との相互作用がガラスバイアルへのタンパク質の吸着を防ぐ。
好ましい態様において、タンパク質：リン脂質複合体は、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、エッグホスファチジルグリセロール、ジオレオイルホルファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、エッグホスファチジルエタノールアミン、ジオレオイルホスファチジン酸（ＤＯＰＡ）、ジミリストイルホスファチジン酸（ＤＭＰＡ）、ジパルミトイルホスファチジン酸（ＤＰＰＡ）、ジオレオイルホスファチジルセリン（ＤＯＰＳ）、ジミリストイルホスファチジルセリン（ＤＭＰＳ）、ジパルミトイルホスファチジルセリン（ＤＰＰＳ）、エッグホスファチジルセリン、リソホスファチジルグリセロール、リソホスファチジルエタノールアミン、リソホスファチジルセリンから選択される負に荷電したリポソームを含む。ＤＯＰＧ、負荷電不飽和リン脂質が特に好ましい。本発明は、さらに、３．０−７．５の範囲に維持されるｐＨ、及び少なくとも１０：１の脂質：タンパク質比を包含する。
本発明の好ましい態様を提供するさらなる要素には、等張性調整剤；緩衝剤；及びｐＨ調整剤の１以上の使用の他に、タンパク質：リン脂質複合体における化学修飾タンパク質の使用が含まれる。当該技術の知識を有する者に理解されるであろうように、本発明はこれらのさらなる要素の様々な組み合わせを有する安定なタンパク質：リン脂質組成物を包含する。
【図面の簡単な説明】
図１は、ＤＯＰＧ小胞の存在下（曲線１）及び非存在下（曲線２）におけるｒｈＧ−ＣＳＦの蛍光放射スペクトルを表す。ｒｈＧ−ＣＳＦの濃度は０．２ｍｇ／ｍｌであった。ＤＯＰＧ：ｒｈＧ−ＣＳＦ比（曲線１）は１００：１（モル：モル）であった。
図２は、増加する脂質：タンパク質比のｒｈＧ−ＣＳＦ蛍光に対する効果を示す。Ｆ0は初期蛍光（脂質なし）であり、Ｆは、脂質を添加して脂質：ｒｈＧ−ＣＳＦの指示されたモル比を達成した後の蛍光を指す。図２（ａ）は、ＤＯＰＧ：ｒｈＧ−ＣＳＦの混合物についてのＦ／Ｆ0（■）及び最大放射波長（△）を示す。図２（ｂ）はＤＯＰＣ：ｒｈＧ−ＣＳＦの混合物についてのＦ／Ｆ0（■）及び最大放射波長（△）を示す。
図３は、ＤＯＰＧ小胞の非存在下（●）及び存在下（○）における、ＫＩによるｒｈＧ−ＣＳＦ蛍光の消光のスターン−ボルマー（Ｓｔｅｒｎ−Ｖｏｌｍｅｒ）プロットを示す。消光実験は、ｒｈＧ−ＣＳＦ（０．２ｍｇ／ｍｌ）及びＤＯＰＧ：ｒｈＧ−ＣＳＦ（１００：１モル比）にＫＩのアリコートを添加することにより行った。
図４は、ピレンデカン酸添加の際のｒｈＧ−ＣＳＦトリプトファン蛍光の消光を表す。放射波長は３２７ｎｍであった。ＤＯＰＧ：ｒｈＧ−ＣＳＦ比は１００：１（モル比）であった。
図５は、様々な脂質の非存在下及び存在下における、ｒｈＧ−ＣＳＦについてのＦ強度変化を示すグラフである。各事例において、脂質：タンパク質比は１００：１（モル比）であった。
図６は、様々な脂質の非存在下及び存在下における、ｒｈＧ−ＣＳＦについての最大放射のシフトの比較を示すグラフである。各事例において、脂質：タンパク質比は１００：１（モル比）であった。
図７は、ｒｈＧ−ＣＳＦ（曲線１）のＣＤに対するＤＭＰＣ（曲線２）、ＤＭＰＧ（曲線３）、及びＤＭＰＡ（曲線４）の効果を示す。各事例において、脂質：タンパク質比は、水中、ｐＨ６．０で、５０：１（モル比）であった。
図８は、ｒｈＧ−ＣＳＦ（曲線１）又はＤＯＰＧ：ｒｈＧ−ＣＳＦ（１４０：１モル比）（曲線２）のＣＤに対する昇温の効果を示す。ｒｈＧ−ＣＳＦ濃度は、水中、ｐＨ６．０で、８０μｇ／ｍｌであった。温度は、１０−９０℃から、１００℃／時の速度で走査した。
図９は、ｒｈＧ−ＣＳＦ（曲線１）及びＤＯＰＧ：ｒｈＧ−ＣＳＦ（４５：１モル比）（曲線２）についての示差走査熱量サーモグラムを示す。試料中のｒｈＧ−ＣＳＦの濃度は１ｍｇ／ｍｌ（水中でｐＨ７．０）であった。走査速度は９０℃／時であった。
図１０は、ｒｈＧ−ＣＳＦ（曲線１）及びＤＯＰＧ：ｒｈＧ−ＣＳＦ（１４０：１モル比）（曲線２）のＣＤに対する温度サイクルの影響を示す。試料を、矢印で示されるように、急速に９５℃に加熱し、かつ１０℃に冷却した。試料中のｒｈＧ−ＣＳＦ濃度は８０μｇ／ｍｌ、ｐＨ６．０であった。
図１１は、ｒｈＧ−ＣＳＦ（曲線１）及びＤＭＰＧ：ｒｈＧ−ＣＳＦ（１５０：１モル比）（曲線２）のＣＤに対する温度サイクルの影響を示す。試料を９５℃に加熱し、１０℃に冷却した。試料中のｒｈＧ−ＣＳＦ濃度は８０μｇ／ｍｌ、ｐＨ６．０であった。
図１２は、ｒｈＧ−ＣＳＦ（曲線１）及びＤＰＰＧ：ｒｈＧ−ＣＳＦ（１５０：１モル比）（曲線２）のＣＤに対する温度サイクルの影響を示す。試料を９５℃に加熱し、１０℃に冷却した。試料中のｒｈＧ−ＣＳＦ濃度は８０μｇ／ｍｌ、ｐＨ６．０であった。
図１３は、様々な脂質の、凍結乾燥過程でのｒｈＧ−ＣＳＦを安定化する能力を示すグラフである。各事例における脂質：タンパク質比は１００：１であった。安定性は、骨髄検定における生体外活性の保持に基づいた。ｒｈＧ−ＣＳＦ単独では凍結乾燥プロセスに耐えることができないので、用いられる対照は脂質が存在しない未処理ｒｈＧ−ＣＳＦである。
図１４は、ｒｈＧ−ＣＳＦの生体内活性に対する様々な脂質の効果を示す。活性（ＷＢＣカウント）はハムスターの皮下注射の後に測定した。ｒｈＧ−ＣＳＦ用量は、１００：１の脂質：タンパク質比で、１００μｇ／ｋｇであった。
図１５は、ｒｈＧ−ＣＳＦの生体内活性に対する様々な脂質の効果を示す。活性（ＷＢＣカウント）は、ハムスターの皮下注射の後に測定した。ｒｈＧ−ＣＳＦ用量は、５０：１の脂質：タンパク質比で、１００μｇ／ｋｇであった。
図１６は、ＤＯＰＧの非存在下及び存在下における、様々なｐＨでの、ＣＨＯ−Ｇ−ＣＳＦについてのＦ強度変化の比較を示すグラフである。各事例において、脂質：タンパク質比は１００：１（モル比）であった。
図１７は、ＤＯＰＧの非存在下及び存在下における、様々なｐＨでの、ＣＨＯ−Ｇ−ＣＳＦについての最大放射のシフトの比較を示すグラフである。各事例において、脂質：タンパク質比は１００：１（モル比）であった。
図１８は、ＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦ（−）及びＤＭＰＧ：ＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦ（１７：１モル比）（----）のＣＤに対する温度サイクルの影響を示す。試料を９０℃に加熱し、１０℃に冷却した。図１９は：（ａ）ＰＢＳ、ｐＨ７．０中でのＧＭ-ＣＳＦのＣＤに対する温度サイクルの影響を示す。１０℃でのＧＭ−ＣＳＦ（−）を、９０℃に加熱した後１０℃に冷却したＧＭ−ＣＳＦ（----）と比較する；（ｂ）ＤＰＰＧ：ＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦ（１７：１モル比）のＣＤに対する温度サイクルの影響を示す。１０℃でのＤＰＰＧ：ＧＭ−ＣＳＦ（−）を、９０℃に加熱した後１０℃に冷却したＤＰＰＧ：ＧＭ−ＣＳＦ（----）と比較する。
図２０は：（ａ）ＤＯＰＧの非存在下及び存在下における、ｒｈＧ−ＣＳＦの十二指腸内注入に対する全ＷＢＣ応答の結果を示す。ｒｈＧ−ＣＳＦ用量は７５０μｇ／ｋｇであり、脂質：タンパク質比は１００：１であった；（ｂ）ＤＯＰＧの非存在下及び存在下における、ＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦの＋二指腸内注入に対する全ＷＢＣ応答の結果を示す。ＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦ用量は７５０μｇ／ｋｇであり、脂質：タンパク質比は１００：１であった。
図２１は、十二指腸内ポンプ注入の後のＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦの血清レベルに対するＤＯＰＧの効果を示す。ＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦ用量は７５０μｇ／ｋｇであり、脂質：タンパク質比は１００：１であった。
図２２は、ＤＭＰＧ小胞の存在下及び非存在下におけるＭＧＤＦの蛍光放射スペクトルを表す。ＭＧＤＦの濃度は０．１ｍｇ／ｍｌであった。このＭＧＤＦは大腸菌由来ＭＧＤＦ１−１６３であった。ＤＭＰＧ：ＭＧＤＦ比は１００：１（モル：モル）であった。
図２３は、ＭＧＤＦ蛍光に対する、増大する脂質：タンパク質比の効果を示す。このＭＧＤＦは大腸菌由来ＭＧＤＦ１−１６３であった。ｐＨ５．０（−○−）及びＰＨ７．０（−●−）でのＤＭＰＧ：ＭＧＤＦ混合物の最大放射波長が示されている。
図２４は、ＤＭＰＧ小胞の非存在下（○）及び存在下（●）における、ＫＩによるＭＧＤＦ蛍光の消光のスターン−ボルマープロットを示す。このＭＧＤＦは大腸菌由来ＭＧＤＦ１−１６３であった。消光実験は、ＭＤＧＦ（０．１ｍｇ／ｍｌ）及びＤＭＰＧ：ＭＧＤＦ（１００：１モル比）にＫＩのアリコートを添加することにより行った。
図２５は、ＭＧＤＦ（○）及びＤＭＰＧ：ＭＧＤＦ（１００：１モル比）（●）のＣＤに対する温度サイクルの影響を示す。このＭＧＤＦは大腸菌由来ＭＧＤＦ１−１６３であった。残存ヘリシティ％は、各サイクル後に１０℃で検出されるＣＤの量を指す（１サイクル＝試料を急速に９５℃に加熱し、１０℃に冷却した）。
図２６は、様々な濃度の尿素の存在下におけるＭＧＤＦ（±ＤＭＰＧ）変性の程度を示す。ＭＧＤＦ（−□−）及びＤＭＰＧ：ＭＧＤＦ（−■−）蛍光放射最大の他に、ＭＧＤＦ（−○−）及びＤＭＰＧ：ＭＧＤＦ（−●−）についての円偏光二色性ＭＲＥが示されている。このＭＧＤＦは大腸菌由来ＭＧＤＦ１−１６３であった。ＤＭＰＧ：ＭＧＤＦ比は１００：１（モル：モル）であった。
図２７は、ＭＧＤＦ（±ＤＭＰＧ）及びＰＥＧ−ＭＧＤＦ（±ＤＭＰＧ）についての最大蛍光放射のグラフ表示である。このＭＧＤＦは大腸菌由来ＭＧＤＦ１−１６３であり、ＰＥＧ−ＭＧＤＦはモノ−ＰＥＧ化（ｍｏｎｏ−ｐｅｇｙｌａｔｅｄ）大腸菌由来ＭＧＤＦ１−１６３であった。ＤＭＰＧ：ＭＧＤＦ及びＤＭＰＧ：ＰＥＧ−ＭＧＤＦ比は、１００：１（モル：モル）であった。
図２８は、様々なＰＥＧ−ＭＧＤＦ濃度での、ガラスバイアルに対するＰＥＧ−ＭＧＤＦ（±ＤＭＰＧ）吸着の程度を示す。このＭＧＤＦは大腸菌由来ＭＧＤＦ１−１６３であり、ＰＥＧ−ＭＧＤＦはモノ−ＰＥＧ化（ポリエチレングリコール化）大腸菌由来ＭＧＤＦ１−１６３であった。室温で１８時間のインキュベーションの後にガラスバイアルから回収可能な放射標識ＭＧＤＦの量をカウントすることにより、ＰＥＧ−ＭＧＤＦ（−□−）及びＤＭＰＧ：ＰＥＧ−ＭＧＤＦ（−○−）の回収％を検定した。図２９は、シグナルペプチド（アミノ酸−２１ないし−１）及び成熟アミノ酸配列（１−３３２）を含む、ヒトＭＧＤＦのＤＮＡ及びアミノ酸配列（配列番号１及び２）を示す。
図３０は、結果として実質的なモノ−ポリエチレングリコール化生成物を生じる、モノ−メトキシ−ポリエチレングリコールアルデヒドを用いる、Ｎ−末端残基のα−アミノ基での部位特異的ＭＧＤＦ還元アルキル化の例を示す。
図３１は、正常マウスにおける、血小板総数の観点からのＤＭＰＧ：ＭＧＤＦ及びＤＭＰＧ：ＰＥＧ−ＭＧＤＦの生体内活性を示す。このＭＧＤＦは大腸菌由来ＭＧＤＦ１−１６３であり、ＰＥＧ−ＭＧＤＦはモノ−ポリエチレングリコール化大腸菌由来ＭＧＤＦ１−１６３であった。ＤＭＰＧ：ＭＧＤＦ及びＤＭＰＧ：ＰＥＧ−ＭＧＤＦ用量は１００μｇ／ｋｇ及び３００μｇ／ｋｇであり、脂質：タンパク質比は１００：１であった。
発明の詳細な説明
本発明の組成物は、以下に続く検討でより詳細に記述され、以下に示される実施例により例示される。実施例には、本発明の種々の態様が示され、種々のタンパク質・リン脂質組成物の安定性および生物活性の試験結果が包含される。驚くべきことに、脂質小胞を有するタンパク質の相互反応はタンパク質のタンパク構造を直接的に安定化し、それにより脂質の不存在下でタンパク質を変性させる条件下でさえ、タンパク質に安定化効果を及ぼす。
ポリエチレングリコール分子を付着（接着）させたＧ−ＣＳＦ（上述のとおり）を使用して、化学的に修飾されたＧ−ＣＳＦ：リン脂質組成物の経口投与もここに記載されている。
本発明の実施に使用することが考えられるのは、溶融した小球状状態に移行する能力のある種々のタンパク質である。考えられる具体的なタンパク質は、前述のＧ−ＣＳＦ，ＧＭ−ＣＳＦ，ＭＧＤＦ，Ｍ−ＣＳＦ，インターフェロン（アルファ、ベータおよびガンマ）、インターロイキン（１−１１）、エリスロポイエチン（ＥＰＯ）、線維芽細胞成長因子、幹細胞因子、神経成長因子、ＢＤＮＦ，ＮＴ３，血小板由来成長因子、および腫瘍成長因子（アルファ、ベータ）のような種々の造血性因子を含むサイトカインが挙げられる。他のタンパク質は、ＭＧＳに移行する能力について評価されうる。問題のタンパク質がＭＧＳに移行する能力があれば、問題のタンパク質は負に荷電されたリポソーム小胞と接触し得、安定化効果が評価される。
一般に、本発明の実施に有用なＧ−ＣＳＦは、哺乳類生物から純粋に単離された野性型、または代替的に化学的合成手段の、またはゲノムあるいはｃＤＮＡクローニングによりまたは遺伝子合成により得られる外因性ＤＮＡ配列の原核または真核宿主発現の産生物でありうる。適切な原核宿主としては、種々の細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞が挙げられる。適切な真核宿主としては、酵母（例えば、エス．セレビジアエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））および哺乳類（例えば、チャイニーズハムスター卵巣、サル）細胞が挙げられる。使用される宿主によって、Ｇ−ＣＳＦ発現産生物は、哺乳類または他の真核生物の糖（炭水化物）でグリコシル化されてもよく、またはグリコシル化されていなくてもよい。本発明は、Ｇ−ＣＳＦ、組換え体Ｇ−ＣＳＦのような任意のそして全ての形態を使用することを意図し、特にＥ．ｃｏｌｉ由来のものが、最も商業的に実施しやすい点で好ましい。
本発明に使用される化学的に修飾されるべきＧ−ＣＳＦは、天然のヒトＧ−ＣＳＦ（ｎｈＧ−ＣＳＦ）または、原核または真核宿主細胞発現のような組換え体核酸法の産生物のいずれでもよい。一般に、考えられる化学的修飾は、Ｇ−ＣＳＦ分子自身に化学的部分を付着させることである。タンパク質修飾および融合タンパク質を記載する概論文献は、フランシスのフォーカス・オン・グロース・ファクターズ（Ｆｏｃｕｓ ｏｎ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ）、３巻、４−１０（１９９２年５月）（イギリス、ロンドン エヌ２オー オーエルディー、フリエルン バーネット レーン、マウントビュー コートのメディスクリプトにより出版）である。例えば、「ケミカリー モディファイド グラヌロサイト コロニー スティミュレイティング ファクター」という表題で、ポリエチレングリコール分子が付着したＧ−ＣＳＦを製造するための材料および方法を記載したＥＰ０４０１３８４を参照されたい。付着は、タンパク質に直接、または活性剤に対して架橋として作用する部分に結合させることよりなる。共有結合は付着の最も安定なものとして好ましい。化学的修飾は、Ｇ−ＣＳＦの効果を制御、支持または拡張するのに寄与しうる。これは、例えば、化学的に修飾されたＧ−ＣＳＦが循環に達する時間の量を制御する効果を示す。化学的修飾剤の例は、その誘導体を含めたポリエチレングリコール組成物である。
投与を有効にする任意の化学的に修飾されたＧ−ＣＳＦ標品は、本発明を実施するのに使用することが考えられる。当業者の技術者が認識する公知方法により効力が測定されうる。ペギル化（ｐｅｇｙｌａｔｅｄ，ＰＥＧ化）Ｇ−ＣＳＦ、特にペギル化Ｅ．ｃｏｌｉ由来Ｇ−ＣＳＦ、そして詳細にはトリ−テトラ ペギル化Ｅ．ｃｏｌｉ由来Ｇ−ＣＳＦが好ましい。
Ｇ−ＣＳＦは、２．５〜５．０のｐＨ範囲で、３次構造を失うことおよびアルファ螺旋含量が増加することに関与する立体配座の変化が起こるという事実にもかかわらず、酸性条件下で最も安定であると報告されてきた。ナルヒらのジェイ．プロテイン ケム（Ｊ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｅｍ．）、１０巻、３５９−３６７（１９９１年）。この立体配座の変化は、溶融した小球状状態（ＭＧＳ）の特徴である。したがって、ＭＧＳに移行する能力のある他のタンパク質に働く処方剤（フォーミュレーター）の場合には、Ｇ−ＣＳＦに働く処方剤は、凝集および変性を防ぐために、２次および３次構造を加熱誘導で折畳みを解くことから保護しなければならない。
本発明に有用なＧＭ−ＣＳＦは、哺乳類生物から純粋に単離された野性型、あるいはゲノムまたはｃＤＮＡクローニングによるかまたは遺伝子合成により得られた外因性ＤＮＡ配列の原核または真核宿主発現の産生物であってよい。適切な原核宿主としては、種々の細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞が挙げられる。適切な真核宿主としては、酵母（例えば、エス．セレビジアエ）および哺乳類（例えば、チャイニーズハムスター卵巣、サル）細胞が挙げられる。使用される宿主によって、ＧＭ−ＣＳＦ発現産生物は、哺乳類または他の真核生物の糖でグリコシル化されてもよく、またはグリコシル化されていなくてもよい。本発明は、ＧＭ−ＣＳＦ、組換え体ＧＭ−ＣＳＦのような任意のそして全ての形態を使用することが考えられ、特にＥ．ｃｏｌｉ由来のものが、最も商業的に実施しやすい点で好ましい。
ここで使用される「ＭＧＤＦ」の語は、天然に発生するＭＧＤＦ、天然に発生するＭＧＤＦの断片並びに巨核球および／または血小板の成長、発達および／または生成を特異的に刺激する生物活性を持たせるように天然に発生するＭＧＤＦのものを十分に複製するようなアミノ酸配列及びグリコシル化を有する人為的に発生するポリペプチドを包含する。
好ましい具体例として、ＭＧＤＦは、真核または原核宿主細胞に形質移入された外因性ＤＮＡ配列の発現の産生物である。すなわち、好ましい具体例として、ＭＧＤＦは「組換え体ＭＧＤＦ」である。好ましい真核宿主は哺乳類であり、特にＣＨＯ細胞であるのが好ましく、そして好ましい原核宿主は細菌であり、特にＥ．ｃｏｌｉであるのが好ましい。組換え体ＭＧＤＦは、ここにおよびＭＧＤＦのクローニングおよび発現に関してここで引用した出版物に記載した手段により有利に生成される。
いくつかのさらに好ましいＭＧＤＦ分子は、ここで図２９に基づき、以下に示すアミノ酸配列を示す。
ＭＧＤＦ１−３３２ 図２９のアミノ酸１−３３２
ＭＧＤＦ１−１９１ 図２９のアミノ酸１−１９１
ＭＧＤＦ１−１８３ 図２９のアミノ酸１−１８３
ＭＧＤＦ１−１７４ 図２９のアミノ酸１−１７４
ＭＧＤＦ１−１６３ 図２９のアミノ酸１−１６３
ＭＧＤＦ１−１５３ 図２９のアミノ酸１−１５３
ＭＧＤＦ１−１５２ 図２９のアミノ酸１−１５２
ＭＧＤＦ１−１５１ 図２９のアミノ酸１−１５１
ＭＧＤＦ７−３３２ 図２９のアミノ酸７−３３２
ＭＧＤＦ７−１９１ 図２９のアミノ酸７−１９１
ＭＧＤＦ７−１８３ 図２９のアミノ酸７−１８３
ＭＧＤＦ７−１７４ 図２９のアミノ酸７−１７４
ＭＧＤＦ７−１６３ 図２９のアミノ酸７−１６３
ＭＧＤＦ７−１５３ 図２９のアミノ酸７−１５３
ＭＧＤＦ７−１５２ 図２９のアミノ酸７−１５２
ＭＧＤＦ７−１５１ 図２９のアミノ酸７−１５１
上述の各々の場合に、Ｍｅｔ−ＬｙｓはさらにそのＮ−末端に含まれる。
ＭＧＤＦの種々の類似体も本発明に使用することが考えられる。ここで使用する場合、「ＭＧＤＦの類似体」は、ＭＧＤＦのアミノ酸配列に１つまたはそれ以上の変化を伴い、その結果糖付着の部位のタイプ（Ｎ−またはＯ−結合）、数または位置に変化を生じたＭＧＤＦを意味する。ＭＧＤＦ類似体（類）は、天然の配列のＭＧＤＦ（例えば、ヒトＭＧＤＦ）と比較して少なくとも同等の生物活性を残しており、生物活性についての分析で測定する場合、実質的により高い活性を持ちうる。得られる類似体は天然のヒト／組換え体ＭＧＤＦより少ないかまたは多い（好ましくは多い）糖鎖を有しうる。
カルボキシ末端伸長が少なくとも１つの別の糖部位を提供するＭＧＤＦのカルボキシ末端から伸長する１つまたはそれ以上のアミノ酸を有する類似体も、本発明の類似体の範囲内に含まれる。ＭＧＤＦのカルボキシ末端は、使用されるＭＧＤＦの特定の形態（例えば、ＭＧＤＦ １−３３２アミノ酸、またはＭＧＤＦ １−１６３アミノ酸）によって変化する。１つまたはそれ以上のＮ−またはＯ−結合グリコシル化部位を含むようなアミノ酸をカルボキシ末端に加えることにより、別の糖部位を、ＭＧＤＦ種のカルボキシ末端に付加しうる。
本発明は、化学的に修飾されたＭＧＤＦ組成物も広範に包含する。一般に、予測される化学的修飾は、ＭＧＤＦタンパク質が少なくとも１つのポリエチレングリコール分子（すなわち、ペギル化（ＰＥＧ化）ＭＧＤＦ）に結合するＭＧＤＦ産生物である。ＭＧＤＦのペギル化は、当業界で公知の任意のペギル化反応により行われうる。例えば、フォーカス・オン・グロース・ファクターズ（Ｆｏｃｕｓ ｏｎ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ）、３（２）、４−１０（１９９２年）；ＥＰ ０１５４３１６号；ＥＰ ０４０１３８４号；およびペギル化に関してここで引用した他の出版物参照。ペギル化は、反応性ポリエチレングリコール分子（または類似の反応性水溶性ポリマー）とのアシル化反応またはアルキル化反応を介して行われるのが好ましい。
一般にアシル化によるペギル化は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の反応性エステル誘導体をＭＧＤＦタンパク質と反応させることを包含する。任意の公知または実質的に発見された反応性ＰＥＧ分子を使用してＭＧＤＦのペギル化を行いうる。好ましい活性化ＰＥＧエステルは、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（「ＮＨＳ」）にエステル化されたＰＥＧである。ここで使用する場合、「アシル化」は、以下のタイプのＭＧＤＦとＰＥＧのような水溶性ポリマーとの間の結合：アミド、カルバメート、ウレタン等を制限なしに包含することが考えられる。バイオコンジュゲート ケム．（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．）、５巻、１３３−１４０（１９９４）参照。反応条件は、ペギル化の分野で公知の任意のものまたはそれらの実質的に発展したものから選択しうるが、修飾されるべきＭＧＤＦ種を不活性化するであろう温度、溶媒、およびｐＨのような条件は避けるべきである。
アシル化によるペギル化をすると、一般的にポリペギル化ＭＧＤＦ産生物を生じ、ここでリシンε−アミノ基はアシル結合基を介してペギル化される。連結結合はアミドであるのが好ましい。得られる産生物は、実質的にモノ、ジまたはトリペギル化のみ（例えば≧９５％）であるのも好ましい。しかし、より高い程度のペギル化（ＭＧＤＦのリシンε−アミノ酸基と、ＭＧＤＦのアミノ末端でのα−アミノ基を加えた最大数まで）を示す数種は、結局使用される特定の反応条件により形成されるのが通常である。所望であれば、とりわけ透析、塩析、超遠心、イオン交換クロマトグラフィ、ゲル濾過クロマトグラフィおよび電気泳動を含む標準精製技術により、より精製されたペギル化種を混合物、特に未反応の種から分離しうる。
アルキル化によるべギル化は、一般に還元剤の存在下で、ＰＥＧの末端アルデヒド誘導体をＭＧＤＦのようなタンパク質と反応させることを包含する。アルキル化によるペギル化を行うと、ポリペギル化ＭＧＤＦも生じ得る。さらに、ここに記載されたとおりの反応条件を操作して、実質的にＭＧＤＦ種のＮ末端のα−アミノ基のみでペギル化（すなわち、モノペギル化種）し得る。モノペギル化産生物を得るためのＭＧＤＦとの具体的な還元性アルキル化反応を図３０に示す。モノペギル化またはポリペギル化のいずれの場合にも、ＰＥＧ基は、−ＣＨ2−ＮＨ−基を介してタンパク質に付着しているのが好ましい。特に−ＣＨ2−基に関して、このタイプの結合は、ここでは「アルキル」結合を意味する。
還元的アルキル化を介してモノペギル化産生物を生成するための誘導体化は、ＭＧＤＦでの誘導体化を可能にする１級アミノ基のタイプの違い（リシン対Ｎ−末端）による反応性の違いを利用する。反応は、タンパク質のリシン残渣のε−アミノ基とＮ−末端残渣のα−アミノ基のものとのｐＫａの差異を利用させるｐＨ（以下参照）で行われる。このような選択的誘導体により、アルデヒドのような反応性基を含む水溶性ポリマーをタンパク質に付着することが制御される。ポリマーとの接合は、タンパク質のＮ−末端で優勢に起こり、そしてリシン側鎖アミノ基のような他の反応性基の修飾は顕著には起こらない。
したがって、好ましい態様として、本発明はペギル化ＭＧＤＦに関し、ここでＰＥＧ基（類）は、アシルまたはアルキル基を介して付着している。上で検討したとおり、このような産生物はモノペギル化またはポリペギル化（例えば、２−６、好ましくは２−５のＰＥＧ基を含有する）であってもよい。ＰＥＧ基は一般にアミノ酸のαまたはεアミノ基でタンパク質に付着しているが、ＰＥＧ基は、適切な反応条件下でＰＥＧ基に付着しはじめるのに十分に反応性を有するタンパク質に付着した任意のアミノ基に付着することも考えられる。
アシル化及びアルキル化アプローチの両方で使用されるポリマー分子は、水溶性ポリマー又はそれらの混合物の中から選択される。選択されたポリマーは、それが結合しているタンパク質が生理学的環境のような水性環境中で沈殿しないように水溶性でなくてはならない。選択されたポリマーは、好ましくは、重合度を本発明の方法で与えられるように調節することができるように、アシル化のための活性エステル又はアルキル化のためのアルデヒドのような１個の反応性基を有するように変性しなくてはならない。好ましい反応性ＰＥＧアルデヒドは、水安定性であるポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド又はそのモノＣ1〜Ｃ10アルコキシ若しくはアリールオキシ誘導体である。このポリマーは、分枝型又は非分枝型であってよい。好ましくは、最終製品製剤の治療使用のために、このポリマーは医薬上許容できるであろう。この水溶性ポリマーは、例えば、ポリエチレングリコール、モノメトキシ−ポリエチレングリコール、デキストラン、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセリン）及びポリビニルアルコールからなる群から選択することができる。アシル化反応のために、選択されたポリマー（群）は１個の反応性エステル基を有していなくてはならない。本発明の還元性アルキル化のために、選択されたポリマー（群）は１個の反応性アルデヒド基を有していなくてはならない。一般的に、水溶性ポリマーは、天然に生じるグリコシル残基からは選択されないであろう。それは、これらが普通、哺乳類組み換え発現システムによって一層便利に製造されるためである。このポリマーはどのような分子量のものであってもよく、分枝型又は非分枝型であってよい。
本発明で使用するための特に好ましい水溶性ポリマーは、ポリエチレングリコール、略称ＰＥＧである。本明細書で使用するとき、ポリエチレングリコールは、モノ−（Ｃ1〜Ｃ10）アルコキシ若しくはアリールオキシ−ポリエチレングリコールのような、他のタンパク質を誘導するために使用されたＰＥＧの全ての形を包含することを意味する。ペギル化ＭＧＤＦの製造方法は一般的に、（ａ）ＭＧＤＦペプチドを（ＰＥＧの反応性エステル又はアルデヒド誘導体のような）ポリエチレングリコールと、ＭＧＤＦが１個又は２個以上のＰＥＧ基と結合するようになる条件下で反応させる工程及び（ｂ）反応生成物（群）を得る工程からなっている。一般に、アシル化反応のための最適反応条件は、公知のパラメーター及び所望の結果に基づいてケース・バイ・ケースで決定されるであろ。例えば、ＰＥＧ：タンパク質の比が大きくなると、ポリ−ペギル化生成物のパーセントが大きくなる。
他の重要な考慮はポリマーの分子量である。一般に、ポリマーの分子量が高くなると、タンパク質に結合することができるポリマー分子の数は少なくなる。同様に、これらのパラメーターを最適化するとき、ポリマーの枝分かれを考慮に入れなくてはならない。一般的に、分子量が高くなると（又は、枝分かれが多くなると）ポリマー：タンパク質比が高くなる。一般に、本発明で意図されるペギル化反応について、好ましい分子量は約２ｋＤａ〜約１００ｋＤａ（用語「約」は±１ｋＤａを示す）である。好ましい平均分子量は約５ｋＤａ〜約５０ｋＤａであり、特に好ましくは約１２ｋＤａ〜約２５ｋＤａであり、最も好ましくは２０ｋＤａである。水溶性ポリマーのＭＧＤＦタンパク質に対する比は、一般に１：１〜１００：１の範囲であり、好ましくは（ポリペギル化のために）１：１〜２０：１及び（モノペギル化のために）１：１〜５：１であろう。
上記の条件を使用して、還元性アルキル化によって、アミノ末端でα−アミノ基を有する全てのＭＧＤＦタンパク質へのポリマーの選択的結合が与えられ、モノポリマー／ＭＧＤＦタンパク質共役体の実質的に均一な製剤が与えられる。本明細書に於いて用語「モノポリマー／ＭＧＤＦタンパク質結合体」は、ＭＧＤＦタンパク質分子に結合した１個のポリマー分子からなる組成物を意味するために使用される。モノポリマー／ＭＧＤＦタンパク質結合体は好ましくは、リシンアミノ側基以外のＮ−末端に位置しているポリマー分子を有する。この製剤は好ましくは、９０％より多いモノポリマー／ＭＧＤＦタンパク質結合体、更に好ましくは９５％より多いモノポリマー／ＭＧＤＦタンパク質結合体であり、観察できる分子の残りは未反応物（即ち、ポリマー単位のないタンパク質）である。下記の実施例に、少なくとも約９０％のモノポリマー／タンパク質結合体及び約１０％の未反応タンパク質である製剤を与える。このモノポリマー／タンパク質結合体は生物学的活性を有する。
本発明の組成物で有用な脂質小胞体は、問題にしているタンパク質と相互作用し得る負に帯電したリポソームである。使用が意図されている特別のリポソームには、ジオレオイルホスファチジルグリセリン（ＤＯＰＧ）、ジミリストイルホスファチジルグリセリン（ＤＭＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセリン（ＤＰＰＧ）、卵ホスファチジルグリセリン、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、卵ホスファチジルエタノールアミン、ジオレオイルホスファチジン酸（ＤＯＰＡ）、ジミリストイルホスファチジン酸（ＤＭＰＡ）、ジパルミトイルホスファチジン酸（ＤＰＰＡ）、ジオレオイルホスファチジルセリン（ＤＯＰＳ）、ジミリストイルホスファチジルセリン（ＤＭＰＳ）、ジパルミトイルホスファチジルセリン（ＤＰＰＳ）、卵ホスファチジルセリン、リゾホスファチジルグリセリン、リゾホスファチジルエタノールアミン、リゾホスファチジルセリンが含まれる。使用する特別のリポソームに依存して、リポソームの量を変化させることができる。
タンパク質：リン脂質組成物には好ましくは、溶液のｐＨを所望の範囲内に維持するために緩衝剤が含まれる。好ましい緩衝剤には、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウム及びクエン酸ナトリウムが含まれる。これらの緩衝剤の混合物も使用することができる。組成物で有用な緩衝剤の量は、使用する特別の緩衝剤及び溶液のｐＨに大きく依存している。例えば、酢酸塩はｐＨ６よりもｐＨ５で一層有効な緩衝剤であり、それでｐＨ６よりもｐＨ５で溶液中でより少ない酢酸塩を使用することができる。本発明の組成物についての好ましいｐＨ範囲はｐＨ３．０〜７．５である。
本発明の組成物は更に、溶液を等張にし、溶液を注射のためにより適合なものとする等張性調整剤を含有しうる。最適の調整剤は、濃度０−１５０ｍＭの塩化ナトリウムである。
有効量の本発明のポリペプチド産物と、医薬として許容できる希釈剤、保存剤、可溶化剤、乳化剤、アジュバント及び／又は担体を含有する医薬組成物も本発明に含まれる。このような組成物は、上記タンパク質の物理的状態、安定性及び生体利用性に影響を与える。例えば、Remingtons Pharmaceutical Sciences, 18版, 1435-1712（Mack Publishing Co., Easton,PA.,1990）（引用により本明細書に含まれるものとする）を参照。ある特定の場合に、上記タンパク質の有効量を規定するものは、所望の治療結果、治療する状態又は疾患の程度、患者の肉体的状態などの、知識のある臨床医が考慮する種々の因子による。
E.coli由来ｒｈＧ−ＣＳＦを含む好適実施態様では、使用するリポソーム小胞（ベシクル）は、１０ｍＭ酢酸ナトリウムを含む、ＤＯＰＧ：Ｇ−ＣＳＦの比が５０：１で、ｐＨ４．５のＤＯＰＧである。
E.coli由来ｒｈＧＭ−ＣＳＦを含む好適実施態様では、使用するリポソームベシクルは、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）を含む、ＤＭＰＧ：ＧＭ−ＣＳＦの比が１７：１で、ｐＨ７．０のＤＭＰＧである。
化学修飾された（ポリエチレングリコール化された（pegylated））E.coli由来ｒｈＧ−ＣＳＦを含む好適実施態様では、ｒｈＧ−ＣＳＦは、３個−４個ポリエチレングリコール化されたものであり、使用するリポソームベシクルは、ＤＭＰＧ：ＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦの比が１７：１で、ｐＨ４．５のＤＭＰＧである。
E.coli由来ＭＧＤＦ１−１６３を含む好適実施態様では、使用するリポソームベシクルは、１０ｍＭ酢酸ナトリウム、５％ソルビトール中の、ＤＭＰＧ：ＭＧＤＦの比が１００：１で、ｐＨ５．０のＤＭＰＧである。
化学修飾された（ポリエチレングリコール化された）E.coli由来ＭＧＤＦ１−１６３を含む好適実施態様では、ＭＧＤＦは、還元的アルキル化を介して１個のポリエチレングリコール化されたもの（２０ｋＤａ）であり、使用するリポソームベシクルは、１０ｍＭ酢酸ナトリウム、５％ソルビトール中の、ＤＭＰＧ：ＭＧＤＦの比が１００：１で、ｐＨ５．０のＤＭＰＧである。
ＣＨＯ由来ＭＧＤＦ１−３３２を含む好適実施態様では、使用するリポソームベシクルは、１０ｍＭ酢酸ナトリウム、５％ソルビトール中の、ＤＭＰＧ：ＭＧＤＦの比が１００：１で、ｐＨ５．０のＤＭＰＧである。
特定のタンパク質：脂質組成物に関し、本発明を記載し説明したが、種々の関連組成物及び治療方法が本発明の範囲内に存在しうることは、当業者に明らかであろう。
以下の実施例で、本発明の種々の面をより詳細に説明する。
実施例１
組換えヒトＧ−ＣＳＦ（ｒｈＧ−ＣＳＦ）を脂質ベシクルに導入することの可能性を試験するために、最初の実験を行った。米国特許第4,810,643号（Souza）に記載されているように、ヒトＧ−ＣＳＦをコードするＤＮＡ配列でE.coli細胞をトランスフェクトする組換えＤＮＡ技術を用いて、ｒｈＧ−ＣＳＦを産生させた。希塩酸（ｐＨ４．０）中で４ｍｇ／ｍＬ溶液としてｒｈＧ−ＣＳＦを調製した。全ての脂質をAvanti Polar Lipids（Alabaster, Ala）から得、クロロホルム中最終濃度１００ｍｇ／ｍＬで、窒素下−２０℃で保存した。
Ｇ−ＣＳＦ：リン脂質複合体の調製
Ｇ−ＣＳＦとの組合せ用の脂質ベシクルを調製するために、適切な脂質３０μｍｏｌをガラス管に分配し、窒素ガス流を用いて乾燥し薄フィルムを形成させた。脂質フィルムを少なくとも２時間真空乾燥し、微量のクロロホルムも除去した。蒸留脱イオン水（ｄｄＨ2Ｏ）、リン酸緩衝化生理食塩水ｐＨ７．２（Gibco/BRL“Ｄ−ＰＢＳ”）、又は１５０ｍＭ ＮａＣｌ１ｍＬ中で脂質フィルムを水和させた。次に、浴型音波処理器（Laboratory supplies, Hicksville,N.Y.）でサンプルの音波処理を行った。サンプルが視覚的に透明になるまで（通常１０−１５分間）、音波処理を続けた。使用するまで、サンプルを窒素下４℃で保存した。最終脂質濃度は３０ｍＭであった。あるいは、脂質ベシクルは、上記のように脂質３００μｍｏｌを採り、窒素下乾燥、脱水することにより、調製できた。上記のように、乾燥脂質フィルムを、適切な水溶液１０ｍＬ中で水和させた。次いで、卓上型乳化器（Microfluidics Model 110S, Microfluidics, Inc. Cambridge, MA）を１０，０００ｐｓｉで操作して、サンプルを微流動化した。サンプルを装置にかけることを１０回繰返した。次に、上記のように、微流動化サンプルを４℃で保存した。
Ｇ−ＣＳＦ：リン脂質複合体は、Ｇ−ＣＳＦ（上記）とある特定の脂質（上記）を混合して調製した。混合は、渦まき回転、攪拌、又は穏やかな振蕩によって行った。種々のモル比の脂質：Ｇ−ＣＳＦを調製し、タンパク質の膜挿入及び安定化を評価した。例えば、脂質：Ｇ−ＣＳＦが４０：１モル比であり、Ｇ−ＣＳＦが０．２ｍｇ／ｍＬであるサンプル３ｍＬ（水中）を調製するために、Ｇ−ＣＳＦ保存溶液１５０μＬを脂質４４μＬ（３０ｍＭ保存溶液、音波処理により水中で調製）と混合し、水を加え、最終サンプル容量３ｍＬにする。５分インキュベーションを勧める（必須ではないが）が、ここではサンプルを使用する前、又はアッセイする前に５分インキュベーションを行った。
Ｇ−ＣＳＦはまた、微流動化前の水和脂質と混合できる。上記のように、次なる混合物の微流動化により、脂質膜内へのＧ−ＣＳＦの導入が起る。
Ｇ−ＣＳＦ：リン脂質複合体の解析
１．トリプトファン発光スペクトル
ｒｈＧ−ＣＳＦには２個のトリプトファン残基があり、それらは局所環境状態に非常に感受性が高い。それ故、ｒｈＧ−ＣＳＦがリポソームと接触しているときのｒｈＧ−ＣＳＦトリプトファン蛍光を測定するために、解析を行った。蛍光発光極大の青へのシフトは、トリプトファンがより疎水性環境にあり、それ故ｒｈＧ−ＣＳＦは脂質膜に埋め込まれたということを示唆する。トリプトファン蛍光解析の優れた総説はPrinciples of Fluorescence Microscopy, J.Lakowicz, １１章（Plenum Press,New York, 1983）である。
Ｇ−ＣＳＦ：脂質複合体（上記）のトリプトファン蛍光は、サンプルを２８０ｎｍで励起し、速度１ｎｍ／秒、１ｎｍの変化量で２８５〜４２０ｎｍの発光を走査してアッセイした。サンプル容量は３ｍＬであり、Ｇ−ＣＳＦの最終濃度は、全てのサンプルで０．２ｍｇ／ｍＬであった。脂質：Ｇ−ＣＳＦ比は変化させた。全ての蛍光測定は、PTI Alphascan fluorometer（South Brunswick, NJ）を用いて行った。全ての測定を２５℃で行い、循環水浴に連結している水ジャケットキュベットホルダーの使用中、この温度を維持した。発光スペクトルを集め、ＰＴＩによって提供されたデータソフトウエアを用いて解析した。
ＤＯＰＧからなる小単ラメラベシクルの存在下及び不存在下のｒｈＧ−ＣＳＦの蛍光スペクトルを図１に示す。ｒｈＧ−ＣＳＦは、ＤＯＰＧベシクル不存在下３３４ｎｍに極大発光を有する。脂質：タンパク質比１００：１でのＤＯＰＧ存在下、ｒｈＧ−ＣＳＦトリプトファン蛍光は３２７ｎｍへの蛍光極大発光の青方シフト及び蛍光強度の劇的増加を示す。ＤＯＰＧ存在下での蛍光発光の低波長化は、トリプトファンが天然タンパク質よりより疎水性の環境に存在することを示唆する。図２に示すように、蛍光シフトはＤＯＰＧ：Ｇ−ＣＳＦのモル比に依存し、ＤＯＰＧ：Ｇ−ＣＳＦ比が１０：１になると、膜挿入が検出できる。
２．ヨウ素イオン消光実験
ヨウ素イオンはトリプトファン蛍光の有効な衝突性消光剤であり、脂質膜には侵入できない。それ故、ヨウ素イオンによるトリプトファン蛍光の有効な消光は、バルクの水性溶媒へ該残基が曝されていることを示し、タンパク質のトリプトファンが水性溶媒から隔離されているときには、ヨウ素イオン消光が起らない。これらの実験で、Ｇ−ＣＳＦ及びＤＯＰＧ：Ｇ−ＣＳＦ組成物（脂質：タンパク質比１００：１）を用いた。サンプルの最初の読み（Ｆ0）をとり、記録した後、ヨウ化カリウム（ＫＩ）（５Ｍ保存液）の添加量を増大させた後、蛍光強度を測定した。サンプルとＫＩ溶液の両方が、Leeら、Biochem.Biophys.Acta, 984：174-182(1989)及びLe Doanら、Biochem. Biophys. Acta, 858：1-5(1986)に記載されているように、１ｍＭ Ｎａ2ＳＯ3（最終濃度）を含むように調製した。Ｎａ2ＳＯ3の添加は、タンパク質及び膜の非極性領域に分配しうるＩ2の生成を防止する。データをStern-Volmer式（Ｆ0／Ｆ＝１＋ＫKI［ＫＩ］）（Ｆ0及びＦは、それぞれ濃度［ＫＩ］でのＫＩの不存在下及び存在下のサンプルの蛍光強度である）によって解析した。ＫKIは、Ｇ−ＣＳＦトリプトファン残基のＫＩ消光のStern-Volmer消光定数である；Lehrer,S.,Biochemistry 10：3254-3263(1979)。
データのStern-Volmerプロットを図３に示す。ＤＯＰＧベシクルの不存在下、ｒｈＧ−ＣＳＦ蛍光はＫＩによって有効に消光される。ＤＯＰＧの存在下、データのStern-Volmerプロットは線形であり、ヨウ素イオンは両方のトリプトファンによく接近できないことを示す。データによると、ＤＯＰＧ不存在下でヨウ素イオンが接近できるトリプトファン残基に、ＤＯＰＧ存在下でヨウ素イオンが接近できなくなる。それ故、このトリプトファンを含むｒｈＧ−ＣＳＦの一部分はＤＯＰＧ二重層に埋もれているにちがいない。
３．エネルギートランスファー測定
以前に示されたように、トリプトファン供給体とピレンデカン酸などの脂質可溶性蛍光受容体の間でエネルギートランスファーが起ることができる。何故ならば、このプローブの励起スペクトルはトリプトファンの発光スペクトルとかなり重なり合うからである。Friereら、Biochemistry 22：1675-1680(1983)。該タンパク質が脂質膜に挿入するならば、トリプトファンからピレンへのエネルギートランスファーによりトリプトファン蛍光の消光が起るであろう。この実験では、種々の脂質：Ｇ−ＣＳＦ複合体のトリプトファン発光強度を、ピレンデカン酸（テトラヒドロフラン中の３０μｇ／ｍＬ保存液）の種々の量の添加前（Ｆ0）及び後（Ｆ）で記録した。ピレンデカン酸とサンプルの混合を促進するために、ピレンデカン酸添加の間サンプルを絶えず攪拌した。Ｆ／Ｆ0の比は、Ｇ−ＣＳＦトリプトファンと疎水性であるエネルギー受容体ピレンデカン酸の間で起るエネルギートランスファーの量に比例する。
図４は、ＤＯＰＧの存在下（脂質：タンパク質比１００：１）のｒｈＧ−ＣＳＦの消光特性を、添加したピレンデカン酸の関数として示す。非常に低い濃度（１モル％未満）のピレンデカン酸で消光が起り、膜の構造及び挙動に対するこの蛍光プローブの影響は最小である。ピレンデカン酸は急速に脂質二重層に分配することを予想することができるので、本データは、ｒｈＧ−ＣＳＦが、トリプトファンからピレン受容体への有効なエネルギートランスファーが起るために十分に深くＤＯＰＧ膜に埋め込まれていることを示す。ｒｈＧ−ＣＳＦの存在下及び不存在下、ピレンデカン酸−標識ＤＯＰＧベシクルの励起スペクトルを調べることによって、エネルギートランスファーを確認した。
上記解析により、ｒｈＧ−ＣＳＦはＤＯＰＧのような不飽和リン脂質と密接に相互作用できることが分る。ＤＯＰＧベシクルの存在下、ｒｈＧ−ＣＳＦトリプトファンは、水可溶性蛍光消光剤から保護されるが、疎水性蛍光プローブへのエネルギートランスファーを介する消光に感受性がある。共に考慮すると、データにより、ｒｈＧ−ＣＳＦはＤＯＰＧからなる膜に挿入できることが分る。１０：１比（脂質：Ｇ−ＣＳＦ）に達すると、膜挿入は検出できる。この比の数は、該タンパク質の挿入部分の廻りの脂質数を表している可能性がある。
実施例２
この実施例では、ｒｈＧ−ＣＳＦの他のリン脂質と相互作用する能力を、上記のようにＦ／Ｆ0強度と極大発光の比較を用いて測定した。各場合で、脂質：ｒｈＧ−ＣＳＦのモル比は１００：１であった。
図５は、種々の脂質の不存在下と存在下のｒｈＧ−ＣＳＦのＦ／Ｆ0データを示す。図６は同一組成物の発光極大データを示す。図５と図６のデータは、ｒｈＧ−ＣＳＦは、ＤＯＰＧの他に、ＤＭＰＧ、ＤＰＰＧ、及び有効性は小さいがホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）とホスファチジルセリン（ＰＳ）に挿入できることを示す。更に、ＮＧ−ＤＯＰＥ（ＰＥ頭部をより陰性にしたＤＯＰＥサンプル）は、ＤＯＰＥよりもｒｈＧ−ＣＳＦの挿入が向上していることが知見された。
ＤＯＰＣ、ＤＭＰＣ及びＤＰＰＣは中性脂質であり、これらのベシクルは、ｒｈＧ−ＣＳＦの極大発光又は蛍光強度に殆ど又は全く効果を有しない。このことは、これらのリン脂質と相互作用が起らなかったことを示す（図５、図６、及び図７の曲線２を参照）。
上記データは、モルテングロビュール状態への遷移ができるタンパク質は種々の脂質ベシクルに挿入できることを示す。しかし、このｒｈＧ−ＣＳＦ：脂質相互作用は、陰性荷電の脂質ベシクルを用いるときのみ起る。陰性荷電脂質ベシクルの中で、より大きい陰性荷電をもったベシクルがより強いｒｈＧ−ＣＳＦ：脂質相互作用をもたらすように考えられる。
実施例３
この実施例では、ＤＯＰＧとｒｈＧ−ＣＳＦとの相互作用をタンパク質の安定性に関連するものとして測定した。Ｐｅｌｔｉｅｒ型サーモスタット制御細胞保持器及び磁力式攪拌器を具備したＪａｓｃｏ Ｊ−７２０装置において円二色性測定を行なった。２２２ｎｍにおける円二色性を、８０μｇ／ｍｌの最終ｒｈＧ−ＣＳＦ濃度及び６．０のｐＨ値を用いて測定した。Ｍｉｃｒｏｃａｌ ＭＣ−２熱量計を用いて示差走査熱量測定を行なった。ｒｈＧ−ＣＳＦ（１ｍｇ／ｍｌ；水中）またはＤＯＰＧ：ｒｈＧ−ＣＳＦ（４５：１ モル／モル；水中）の試料を９０℃／時の速度で走査した。データを蓄積し、Ｍｉｃｒｏｃａｌソフトウェアを用いて分析した。
円二色性（２２２ｎｍ）を上昇する温度の関数として測定することにより、Ｇ−ＣＳＦのα−ヘリシティーの温度誘導型変化を追跡することができる。ｐＨ６．０において熱により誘導されるｒｈＧ−ＣＳＦの変性（ｕｎｆｏｌｄｉｎｇ）を図８に示す。曲線は、温度６０℃から７０℃にかけてかなり急激な転移が起こり、その結果α−ヘリシティーが失われることを示している。上記転移後、ｒｈＧ−ＣＳＦは溶液から不可逆的に沈澱する。変性の温度範囲は図９に示した、示差走査熱量測定により得られたｐＨ７．０におけるｒｈＧ−ＣＳＦの融点に類似する。
これに対して、ＤＯＰＧ：ｒｈＧ−ＣＳＦ試料ではα−ヘリシティーは温度が上昇するにつれて徐々に失われ、ｒｈＧ−ＣＳＦ単独の場合と異なり、ＤＯＰＧ：ｒｈＧ−ＣＳＦの温度誘導型変性が協調的（ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ）なものであるとは考えられない（図８）。この結論は、示差走査熱量測定が示す融解転移の欠如によっても証明される（図９）。注目に値するが、ＤＯＰＧ：ｒｈＧ−ＣＳＦ試料は９５℃まで加熱された後にα−ヘリシティーを回復し得、冷却すればヘリシティーを完全に回復することから９５℃と１０℃との間での周期的温度変化を行なわせることが可能である（図１０参照）。単独のｒｈＧ−ＣＳＦは、上記のような条件下では不可逆的に変性し、溶液から沈澱する。
ＤＭＰＧ及びＤＰＰＧがＧ−ＣＳＦの円二色性に及ぼす作用も調べた。１５０：１の脂質対ｒｈＧ−ＣＳＦ比を用いた。ＤＯＰＧの場合同様、ＤＭＰＧ及びＤＰＰＧもｒｈＴ−ＣＳＦの二次構造を安定化する（図１１〜１３）。
これらのデータは、ｒｈＧ−ＣＳＦとＤＯＰＧ、ＤＭＰＧ及びＤＰＰＧとの相互作用によって、ｒｈＧ−ＣＳＦが単独では不安定となる条件下に前記タンパク質の安定性が向上することを証明している。上記相互作用はｒｈＧ−ＣＳＦの二次及び三次構造を直接安定化する。
実施例４
この実施例では、ｒｈＧ−ＣＳＦとＤＯＰＧとの相互作用をｒｈＧ−ＣＳＦの生物活性に関連するものとして測定した。ｒｈＧ−ＣＳＦのｉｎ ｖｉｔｒｏ活性を、Ｚｓｅｂｏ等，Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ １７２， ｐｐ．１７５−１８４， １９８６に記載されているネズミ骨髄細胞によるＧ−ＣＳＦ依存性［3Ｈ］−チミジン摂取を用いてアッセイした。活性アッセイは総て三重に行なった。ｉｎ ｖｉｖｏ活性は、ハムスターへの皮下注射（ｒｈＧ−ＣＳＦ用量１００μｇ／ｋｇ）及び白血球（ＷＢＣ）計数によって測定した。
１． ｉｎ ｖｉｔｒｏ活性
Ａ．
ＤＯＰＧ不在下及び存在下でのｒｈＧ−ＣＳＦの比活性を測定した。熱処理したｒｈＧ−ＣＳＦ及びＤＯＰＧ：ｒｈＧ−ＣＳＦ試料も試験した。結果を表１にまとめる。
表１に示したように、ＤＯＰＧ二重層内への挿入はｒｈＧ−ＣＳＦの生物活性に悪影響を及ぼさない。１０分間８５℃に加熱した後のｒｈＧ−ＣＳＦは検出可能な活性を有せず、該タンパク質は沈澱する。同様に処理した後のＤＯＰＧ：ｒｈＧ−ＣＳＦは加熱しないｒｈＧ−ＣＳＦの活性の〜８５％を保持し、冷却すると二次構造を完全に回復する。
Ｂ．
様々な脂質の、ｒｈＧ−ＣＳＦを凍結乾燥の間安定化する能力も調べた。ｒｈＧ−ＣＳＦを様々な脂質と組み合わせた試料を凍結乾燥し、活性について（先に述べたように）アッセイした。ｒｈＧ−ＣＳＦと混合したＤＯＰＧ、ＤＭＰＧ及びＤＰＰＧは凍結乾燥後、ｒｈＧ−ＣＳＦ生物活性の〜１００％保持を可能にする（図１４）。ｒｈＧ−ＣＳＦ単独では凍結乾燥後に生存できなかった。
２． ｉｎ ｖｉｖｏ活性
脂質不在下及び存在下でのｒｈＧ−ＣＳＦの活性（ＷＢＣ数）を測定した。第０日に、皮下注射（ｒｈＧ−ＣＳＦ用量１００μｇ／ｋｇ）後の活性を測定した。五つの異なる脂質：ｒｈＧ−ＣＳＦ複合体をアッセイしたが、いずれの脂質：ｒｈＧ−ＣＳＦ複合体もｉｎ ｖｉｖｏ活性を保持した（図１５及び１６）。
上述の試験は、負荷電脂質二重層内への挿入がｒｈＧ−ＣＳＦの生物活性に悪影響を及ぼさないことを証明している。加えて、脂質の保護作用によってｒｈＧ−ＣＳＦは凍結乾燥過程の間保護されると考えられる。
実施例５
この実施例では、化学的に改質したＧ−ＣＳＦ（ペグ化Ｇ−ＣＳＦ；ＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦ）及び真核宿主細胞の発現産物として得られたＧ−ＣＳＦ（ＣＨＯ−Ｇ−ＣＳＦ）をその負荷電脂質小胞と相互作用する能力について試験した。ＣＨＯ−Ｇ−ＣＳＦの場合、測定は（先の実施例１に述べた）強度Ｆ／Ｆ0及び発光極大の比較を用いて行なった。脂質対タンパク質のモル比は常に１００：１とした。ＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦの場合は円二色性分析に基づいて測定を行なった。
用いたＣＨＯ−Ｇ−ＣＳＦは、Ｓｏｕｚａの米国特許第４，８１０，６４３号に開示されている、ヒトＧ−ＣＳＦをコードするＤＮＡ配列でチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞をトランスフェクトする組み換えＤＮＡ技術を用いて製造した。ＣＨＯ−Ｇ−ＣＳＦはＰＢＳを媒質としてｐＨ７の０．６ｍｇ／ｍｌ溶液に調製した。ＣＨＯ−Ｇ−ＣＳＦはｒｈＧ−ＣＳＦと同様にしてＤＯＰＧと相互作用することが判明し、その際各試料はＤＯＰＧの存在下により高い螢光強度を示し、かつ発光極大のブルーシフトも示した（図１７及び１８）。従って、ＤＯＰＧとの相互作用は、Ｇ−ＣＳＦの組み換え形態の何らかの特殊性に起因するものではない。
この実験で用いたＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦは、（ＰＥＧ ６０００を用いて）トリ−テトラペグ化した大腸菌由来Ｇ−ＣＳＦであった。先に述べた操作を用いてＤＭＰＧ：ＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦ（１７：１ モル／モル）試料を調製した。ＤＭＰＧ：ＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦ試料は加熱後に二次構造を完全に回復することが判明した（図１９）。ＰＥＧ分子の存在にもかかわらず、この誘導体タンパク質は天然タンパク質と同様にして脂質と相互作用し得た。
上記データは、Ｇ−ＣＳＦと負荷電脂質小胞との相互作用に関連する安定化作用が原核宿主細胞の発現産物として得られるｒｈＧ−ＣＳＦに特有のものではないことを示している。ＭＧＳへと転移（ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎｉｎｇ）可能な化学的に改質されリポソーム小胞と接触したタンパク質、即ちこの実験で用いたＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦ：ＤＭＰＧも安定化作用を示した。
実施例６
この実施例では、ＤＭＰＧ及びＤＰＰＧがＧＭ−ＣＳＦに及ぼす作用を調べた。ＧＭ−ＣＳＦはＢｏｏｎｅの米国特許第５，０４７，５０４号に開示された組み換えヒトＧＭ−ＣＳＦとし、これを、リン酸緩衝食塩液（ＰＢＳ）を媒質としてｐＨ７．０の１ｍｇ／ｍｌ溶液に調製した。１７：１の脂質対ＧＭ−ＣＳＦ比を用い、先に述べた円二色性分析を用いて熱安定性を測定した。ＤＭＰＧ及びＤＰＰＧはＧＭ−ＣＳＦの熱安定性、即ち加熱後の二次構造回復を改善し得る（図２０ａ及び２０ｂ）。
このようなデータは、溶融球状へと転移可能なタンパク質であって、該タンパク質に改善された熱安定性を付与する負荷電脂質小胞と相互作用するものの別の例を示している。
実施例７
この実施例では、ＤＯＰＧ：ＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦ複合体を用いて、腸管内投与後にＧ−ＣＳＦに対する治療応答を高める可能性を評価した。この実験用のＤＯＰＧは実施例１に述べたように調製し、またＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦは実施例５に述べたように調製した。１００μｍｏｌの脂質（７９７μｌ）を真空乾燥し、これに１ｍｌのミリＱ水を添加して脂質の１００ｍＭ溶液を製造した。この溶液を音波処理水浴（Ｌａｂ． Ｓｕｐｐｌｙ Ｉｎｃ．， Ｈｉｃｋｓｖｉｌｌｅ， ＮＹから入手可能なモデルＧ １１２ＳＰ１Ｔ）中で５分間、または該脂質溶液が透明となるまで音波処理した。１ｍＭ ＨＣｌ中の９０ｎｍｏｌの天然ｒｈＧ−ＣＳＦまたはＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦに９μｍｏｌのＤＯＰＧの溶液（９０μｌ）を添加した。溶液を攪拌し、１ｍＭ ＨＣｌで最終体積２ｍｌとした。ラットへの十二指腸内投与では物質を、動物に移植した浸透圧ポンプ内に設置した。この方法では物質が２４時間にわたって放出される。
ｒｈＧ−ＣＳＦとＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦとの両方を脂質と共にかまたは脂質無しで投与した動物の全ＷＢＣ分析の結果を図２１に示す。図２１ａは、天然Ｇ−ＣＳＦの注入では賦形剤対照に比較してＷＢＣ応答が刺激されないことを示している。この添加はｒｈＧ−ＣＳＦに対する動物の治療応答に対してさほどの衝撃とならない。
ペグ化Ｇ−ＣＳＦに対するラットの応答を図２１ｂに示す。この図からは、単独のＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦがＷＢＣ応答を刺激したことが知見され得る。ＷＢＣの上昇は基線量に戻るまでの４８時間維持される。ＤＯＰＧと配合したＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦもＷＢＣ応答を刺激し、その応答はＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦ単独の場合のほぼ２倍である。これらの結果は、注入後に測定したＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦの血清中レベルによって確認できる（図２１）。
上記データは、経口用ＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦ製剤にＤＯＰＧなどのアニオン性脂質を含有させると誘導化タンパク質によって誘起される治療応答が増大すると考えられることを証明するものである。関与する機序は目下のところ判明していない。
実施例８
この実施例では、ＤＭＰＧがＭＧＤＦに及ぼす作用を調べた。ＭＧＤＦは組み換えヒト大腸菌由来ＭＧＤＦ １−１６３とし、これを、１０ｍＭ酢酸ナトリウム、５％ソルビトールを媒質として用いてｐＨ５．０の１．０ｍｇ／ｍｌ溶液に調製した。ＤＭＰＧ：ＭＧＤＦ複合体は実施例１に述べたようにして調製した。
ＤＭＰＧ：ＭＧＤＦ複合体の分析
１． トリプトファン発光スペクトル
ＭＧＤＦ中には１個のトリプトファン残基が有り（５１位）、これを用いてＭＧＤＦとＤＭＰＧ小胞との相互作用を監視した。ＤＭＰＧ：ＭＧＤＦ複合体のトリプトファン螢光を、０．１ｍｇ／ｍｌのＭＧＤＦ濃度を用いて実施例１に述べたようにしてアッセイした。ＤＭＰＧから成る小さな単ラメラ小胞の存在下及び不在下でのＭＧＤＦの螢光スペクトルを図２２に示す。ＭＧＤＦは、ＤＭＰＧ小胞不在下では３３６ｎｍのところに発光極大を有する。ＤＭＰＧが脂質対タンパク質比１００：１で存在すると、ＭＧＤＦトリプトファン螢光は螢光発光極大の３２８ｎｍへのブルーシフトを示す。ＤＭＰＧの存在下に発せられる螢光が短波長であることにより、トリプトファンが天然タンパク質に比べてより疎水性の環境に有ることが示唆される。また、図２３に示したように、螢光シフトはＤＭＰＧ対ＭＧＤＦのモル比に左右され、その際ＤＭＰＧ対ＭＧＤＦ比が８〜３０：１に達すると膜内への挿入が検出可能となる。螢光の変化はモル比１００：１以上において最大となり、またｐＨ値を７．０から５．０に下げると、ＭＧＤＦはＤＭＰＧ小胞に対して明らかにより高い親和性を示す。このことは、或る種のアミノ酸（例えばヒスチジン）の滴定を用いて相互作用を促進または抑制し得ることを示唆している。
２． ヨウ化物消光実験
この実験では、ＭＧＤＦ及びＤＭＰＧ：ＭＧＤＦ組成物（ＤＭＰＧ対ＭＧＤＦ比１００：１）を用いて、実施例１に述べたヨウ化物消光実験を行なった。データのＳｔｅｒｎ−Ｖｏｌｍｅｒプロットを図２４に示す。ＤＭＰＧ小胞不在下では、ＭＧＤＦ螢光はＫＩによって有効に消光される。これに対して、ＤＭＰＧ存在下ではヨウ化物はトリプトファンに作用できず、このことから、ＭＧＤＦのトリプトファン保有部分はＤＭＰＧ二重層内に埋没しているであろうと考えられる。
上述の分析から、Ｇ−ＣＳＦ及びＧＭ−ＣＳＦの場合同様、ＭＧＤＦもＤＭＰＧのような不飽和リン脂質と密接に相互作用し得ることは明らかである。ＤＭＰＧ小胞の存在下に、ＭＧＤＦトリプトファンは水溶性螢光消光剤から保護される。総合的にみて、データはＭＧＤＦがＤＭＰＧから成る膜内へ挿入され得ることを示している。膜内への挿入は（ＤＭＰＧ対ＭＧＤＦの）比が８：１に到達すると検出可能となり、前記比の数字はタンパク質の挿入部分を囲繞する脂質の数を表わし得る。
実施例９
この実施例では、ＤＭＰＧ：ＭＧＤＦの相互作用がタンパク質の安定性に及ぼす作用を調べた。熱安定性、尿素の存在下での安定性、及びＭＧＤＦ（±ＤＭＰＧ）の貯蔵寿命安定性を評価した。各検査では、１００：１のＤＭＰＧ：ＭＧＤＦモル比を使用した。
１．熱安定性
ＭＧＤＦ単独の又はＤＭＰＧ小胞内に挿入したＭＧＤＦの円二色性（２２２ｎｍでのＣＤ）を、実施例３，図１０に記載したように９５℃〜１０℃の熱サイクルの関数として監視した。残留ＣＤ％とは、各サイクル（１サイクルは１０℃−＞９５℃−＞１０℃）の後に（１０℃で）検出されたＣＤの量を指定の組成物の非加熱試料のＣＤと比較した値を指す。ＭＧＤＦは３サイクル加熱するとヘリシティーの７０％以上を喪失するが、ＤＭＰＧ：ＭＧＤＦでは同一条件下で元のαヘリシティーが完全に保持される（図２５を参照されたい）。
２．尿素の存在下での安定性
尿素は、タンパク質を変性させ得るカオトロピック試薬である。ＭＧＤＦ（±ＤＭＰＧ）の平衡変性を、蛍光（即ち三次構造の測定）及び円二色性（即ち二次構造の測定）により監視した。図２６に示すように、タンパク質の三次構造が喪失すると、トリプトファン残基が水相により露出されてＭＧＤＦの発光波長がより長い波長にシフトし、二次構造が喪失すると、αヘリシティーが喪失するために平均残分楕円率（ｍｅａｎ ｒｅｓｉｄｕｅ ｅｌｉｐｉｃｉｔｙ）（ＭＲＥ）の負値がちいさくなる。ＤＭＰＧの不在下では、三次構造を５０％喪失させるのに約３Ｍ尿素が必要であるが、ＤＭＰＧの存在下では５０％の構造を喪失させるのに８Ｍの尿素が必要である。同様に、ＤＭＰＧの不在下でＭＧＤＦ ＭＲＥの５０％を喪失させるには、ＤＭＰＧの存在下での９Ｍ尿素に対し７Ｍ尿素が必要である。
３．貯蔵寿命安定性
以下の表２に示す条件下で大腸菌ＭＧＤＦ １−１６３（±ＤＭＰＧ）を貯蔵し、次いで１００ｍＭリン酸緩衝液、１０％エタノール、０．２％Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ６．９を移動相とするＴｏｓｏ−ＨａａｓＧ３０００ＳＷＸＬカラムをもちいるサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）で試験した。試料をエタノール及びＴｗｅｅｎ−２０で希釈して、移動相で使用したのと同一濃度とし、試験毎に１０−２０μｇの試料を注入した。カラム温度は４０℃に維持した。生成する凝集ＭＧＤＦは非凝集タンパク質よりも早く溶離し、凝集体ピーク及びモノマーピークの曲線下の面積を測定することによりこのＭＧＤＦを定量する。データでは凝集体ピークにおける総ＭＧＤＦ％を示す。
表２に示すように、ＤＭＰＧにより、貯蔵時における凝集体の生成は大幅に減少する。従って、ＤＭＰＧを使用してＭＧＤＦの貯蔵寿命を延ばすことができる。
上記データは、ＭＧＤＦがＤＭＰＧ小胞と相互作用すると、ＭＧＤＦだけでは不安定な条件下でのタンパク質の安定性が高まる。この相互作用により、尿素のような変性剤の存在下でＭＧＤＦの二次構造及び三次構造を直接安定化し、様々な温度でのＭＧＤＦの貯蔵寿命はかなり改善される。
実施例１０
この実施例では、化学的に改質させたＭＧＤＦ １−１６３（モノＰＥＧ化（２０ｋＤａ）ＭＧＤＦ １−１６３（ＰＥＧ−ＭＧＤＦ））と負電荷脂質小胞との相互作用能力を試験した。ＰＥＧ−ＭＧＤＦについては、（上述の実施例１及び８に記載したように）Ｆ／Ｆ0強さ及び発光最大値の比較を用いて測定を行った。いずれの場合も、脂質：タンパク質のモルは１００：１であった。
上記実験で使用したＰＥＧ−ＭＧＤＦは、モノメトキシ−ポリエチレングリコールアルデヒド（ＭｅＰＥＧ）（平均分子量：２０ｋＤａ）を還元的アルキル化において用いたモノＰＥＧ化（２０ｋＤａ）大腸菌由来ＭＧＤＦ １−１６３である。４−２０％２プレキャスト勾配ゲル（ＮＯＶＥＸ）を用いるドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動により、ＰＥＧ−ＭＧＤＦ接合体の相同性を調べた。４６．９ｋＤａタンパク質の位置に対応する主要バンド一つが判明した。
次いで、上述の手順を用いて、ＤＭＰＧ：ＰＥＧ−ＭＧＤＦ（１００：１モル／モル）試料を調製した。ＤＭＰＧ：ＰＥＧ−ＭＧＤＦ試料は加熱後に二次構造を完全に回復することが判明した（図２７）。この誘導体化タンパク質は、ＰＥＧ分子が存在するにもかかわらず、天然タンパク質と同様に脂質と相互作用し得た。
このデータは、ＭＧＤＦと負電荷脂質小胞との相互作用に関連する発光最大シフトが、原核生物宿主細胞の発現産物として得られたＭＧＤＦのみに特有のものではないことを示している。科学的に改質させたｒｈＧ−ＣＳＦで実証されたように、ＤＭＰＧ：ＰＥＧ−ＭＧＤＦも発光シフトを示した。データは、科学的に改質させたＭＧＤＦがＤＭＰＧからなる膜内に進入し得ることを示している。
実施例１１
この実施例では、ＤＭＰＧ：ＰＥＧ−ＭＧＤＦの相互作用がガラスバイアルへのＭＧＤＦ吸着の問題に及ぼす作用を評価した。約１１ｐｇ／ｍｌの［125Ｉ］−ＰＥＧ−ＭＧＤＦを濃度の異なる非標識ＰＥＧ−ＭＧＤＦと合わせて、指定のＰＥＧ−ＭＧＤＦ最終濃度にした（図２８を参照されたい）。示されている場合にはＤＭＰＧを希釈液に含めた（図２７も参照されたい）。３ｃｃのガラスバイアル（Ｋｉｍｂｌｅ）内に１ｍＬの調製物を入れた。室温で１８時間インキュベートした後にガラスバイアルから回収できる放射性標識ＭＧＤＦの量をカウントして、ＰＥＧ−ＭＧＤＦの回収％を調べた。図２８に示すように、ＰＥＧ−ＭＧＤＦはタンパク質濃度が下がると容易にガラス容器に吸着し、吸着は０．１−５０μｇ／ｍｌの範囲で特に高い。対照的に、ＤＭＰＧ：ＰＥＧ−ＭＧＤＦ試料は、０．１−５０μｇ／ｍｌのＰＥＧ−ＭＧＤＦの範囲では、ガラスに殆ど吸着しない。
実施例１２
この実施例では、ＤＭＰＧ：ＭＧＤＦ １−１６３及びＤＭＰＧ：ＰＥＧ−ＭＧＤＦ １−１６３の相互作用がＭＧＤＦ １−１６３及びＰＥＧ−ＭＧＤＦ １−１６３の生物活性に及ぼす作用を調べた。ＭＧＤＦ １−１６３は大腸菌に由来し、脂質：タンパク質の比率は１００：１であった。１００μｇ／ｋｇ及び３００μｇ／ｋｇのＭＧＤＦ、ＰＥＧ−ＭＧＤＦ、ＤＭＰＧ：ＭＧＤＦ又はＤＭＰＧ：ＰＥＧ−ＭＧＤＦで処理したマウスの血小板数を測定し、結果を図３１に示す。正常雌Ｂａｌｂ／ｃマウスの皮下に１日１回で８日間、各形態を指定濃度で投与した。最後の注射から２４時間後に、尾静脈で切除した小側面（ｌａｔｅｒａｌ）由来の試験血液を採取した。Ｓｙｓｍｅｘ電子血液細胞分析機（Ｂａｘｔｅｒ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ， Ｉｎｃ． Ｉｒｖｉｎｅ， ＣＡ）を用いて血液細胞を分析した。データは、４匹の動物の測定値の平均±この平均の標準誤差として示す。全白血球細胞数又は赤血球細胞数のような他の血液細胞パラメーターは上記処置の鋭気要を受けなかった（データは示さず）。結果は、大腸菌ＭＧＤＦ １−１６３をＰＥＧ化すると分子のｉｎ ｖｉｖｏ活性が増したことを示している。更に重要であるが、上記検査は、負電荷脂質の二層内への挿入が様々なＭＧＤＦ形態の生物活性に悪影響を及ぼさないことを示している。
配列表
配列番号：１
配列の長さ：１３４２
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｃＤＮＡ
配列の特徴
特徴を表す記号：ＣＤＳ
存在位置：９９．．．６２１
配列
配列番号：２
配列の長さ：１７４
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
配列
本発明は、溶融小球状（molten globular state）に変化することのできるタンパク質の二次および三次構造を安定化させるのに有用なタンパク質：リン脂質構造に関する。特に、本発明は、より高い安定性およびより長いシェルフライフを示し、高温での製剤において、また新規の供給送達賦形剤として使用することができるＧ-ＣＳＦ：リン脂質およびＭＧＤＦ：リン脂質組成物に関する。
いくつかのタンパク質が溶融小球状（ＭＧＳ）に変化することが示されている。Ｖａｎ ｄｅｒ Ｇｏｏｔ， Ｆ．Ｇ．， Ｎａｔｕｒｅ ３５４， ４０８−４１０（１９９１）。溶融小球状のタンパク質は天然タンパク質と同等の二次構造を示すが、堅固な三次構造を欠く。Ｐｉｔｓｙｎら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２６２：１， ２０−２４（１９９０）。一部の場合には、この状態への遷移はそれまで隠されていたタンパク質の疎水性領域の露出を伴う。臨界疎水性残基を露出することにより、ＭＧＳはタンパク質の凝集および沈降における中間体となりうる。ＭＧＳの立体配座は、遠紫外領域における円偏光二色性を芳香族側鎖のスペクトル（近紫外円偏光二色性および蛍光）と比較することによって検出することができる。溶融小球状状態は、遠紫外円偏光二色性変化の不在下で芳香族スペクトルの変化を示し、Ｂｙｃｈｋｏｖａら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２３８：２３１−２３４（１９８８）、一部のタンパク質による膜透過に関与すると考えられる、Ｂｙｃｈｋｏｖａら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２３８：２３１−２３４（１９８８）；Ｖａｎ ｄｅｒ Ｇｏｏｔ， Ｆ．Ｇ．， Ｎａｔｕｒｅ ３５４， ４０８−４１０（１９９１）。
顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ-ＣＳＦ）は、凝集の前にＭＧＳに遷移することが知られているタンパク質のひとつである。ヒト組換えＧ-ＣＳＦは、感染に対抗するために使用される白血球の一種である好中球を選択的に刺激する。現在、組換えＧ−ＣＳＦであるフィルグラスチム（Ｆｉｌｇｒａｓｔｉｍ）が治療に使用されている。種々の条件下でのＧ-ＣＳＦの構造が広汎に検討されてきた；Ｌｕら、Ｊ． Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． Ｖｏｌ． ２６７， ８７７０−８７７７（１９９２）。その疎水特性のゆえに、Ｇ-ＣＳＦは長期的なシェルフライフの製剤することが困難である。一部の疎水性タンパク質の製剤は、長期保存中にダイマーおよびより高次の凝集物（マクロ領域）の形成によって活性を失う。保存中にはアミド分解や酸化のような他の化学的変化も起こりうる。さらに、Ｇ-ＣＳＦを製剤するには変性に対しても保護しなければならず、特にタンパク質の二次および三次構造の安定性を保持するように注意しなければならない。
ヒトＧＭ-ＣＳＦは、マクロファージおよび顆粒球性始原細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏでの増殖のために継続的に必要とされる２２-ｋＤａの糖タンパク質である。この物質はまた、これらの始原細胞が顆粒球およびマクロファージを形成する不可逆的作用を制御する。その他の生物学的作用には、成熟細胞型の機能的作用の調節；Ｇｏｕｇｈら、Ｎａｔｕｒｅ， ３０９， ７６３−７６７（１９８４）、ならびに認識された化学的誘因物質への走化性の上昇；Ｗｉｌｌｉａｍｓら、Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ， ４ｔｈ ｅｄ．（１９９０）が含まれると考えられる。ＧＭ-ＣＳＦは同時に単球の産生を刺激し、従って単球減少症のような単球性障害の治療において有用であると考えられる。
ヒトＧＭ-ＣＳＦは多くのソースから入手し、精製することができる。組換えヒトＧＭ-ＣＳＦの生産のための方法は、以前にＢｕｒｇｅｓｓら、Ｂｌｏｏｄ， ６９：１， ４３−５１（１９８７）によって記述されている。本文中に参考文献として包含される米国特許５，０４７，５０４号（Ｂｏｏｎｅ）は、原核宿主細胞発現の産物としてグリコシル化されていない形態のＧＭ-ＣＳＦの商業規模量の生産を可能にした。
ＭＧＤＦあるいは巨核球増殖分化因子は、循環血小板レベルの主要な調節因子であると思われる、最近クローン化されたサイトカインである。次の文献参照：Ｂａｒｔｌｅｙ， Ｔ．Ｄ．ら、Ｃｅｌｌ ７７：１１１７−１１２４（１９９４）；Ｌｏｋ， Ｓ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３６９：５６５−５６８（１９９４）；ｄｅ Ｓａｕｖａｇｅ， Ｆ．Ｊ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３６９：５３３−５３８（１９９４）；Ｍｉａｙａｚａｋｉ， Ｈ．ら、Ｅｘｐ． Ｈｅｍａｔｏｌ． ２２：８３８（１９９４）；Ｋｕｔｅｒ， Ｄ．Ｊ．ら、ＰＮＡＳ ＵＳＡ， ９１：１１１０４−１１１０８（１９９４）。ＭＧＤＦはまたトロンボポイエチン（ＴＰＯ）、ｍｐｌ-リガンド、メガトポイエチンとも称される。成熟ヒトＭＧＤＦは全体で３３２個のアミノ酸を持つタンパク質である。このタンパク質および対応するｃＤＮＡの配列を本文中の図２９に示す。
チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）および大腸菌細胞において生産した組換えＭＧＤＦは、ｉｎ ｖｉｖｏでマウス、ラットおよびサルにおいて巨核球および／あるいは血小板を特異的に刺激あるいは増加させる生物学的活性を持つことが明らかにされている。Ｈｕｎｔ， Ｐ．ら、Ｂｌｏｏｄ ８４（１０）：３９０Ａ（１９９４）参照。図２９の１位のアミノ酸から始まって少なくとも１５１個のアミノ酸に及ぶように切断したヒトＭＧＤＦ分子はin vivoでの生物学的活性を保持している。また、ヒト配列のＭＧＤＦタンパク質のＮ末端で最初の６個のアミノ酸までを取り除いて、生物学的活性を保持することが可能である。それ故、生物学的活性は図２９に示すヒトＭＧＤＦの成熟アミノ酸配列の７位から１５１位（両端を含む）までのアミノ酸内に保持されていると思われる。
天然に生じるＭＧＤＦはグリコシル化された分子である。天然ＭＧＤＦのグリコシル化パターンは、ＭＧＤＦにおいて認められた２つのキー領域に関連する。この分子の活性部分に相当する、ヒトＭＧＤＦの最初の約１５１個のアミノ酸配列は、赤血球の産生を刺激することができるサイトカイン、エリスロポイエチン（ＥＰＯ）と顕著な相同性を持ち、ヒトＭＧＤＦの「ＥＰＯ様」領域と称される。成熟タンパク質の残りのアミノ酸は、いわゆる「Ｎ結合炭水化物」領域を構成する。これらはＮ結合グリコシル化のための部位の全部ではないにしても大部分を含むからである。ヒトＭＧＤＦには、６個のＮ結合グリコシル化部位が存在し、そのすべてがＮ結合グリコシル化領域に含まれる。いずれの領域もＯ結合グリコシル化部位を含む。分子中には推定上１２-１４のＯ結合グリコシル鎖が存在する。ＣＨＯ細胞において組換えによって発現されたヒトＭＧＤＦ ＤＮＡに関する実験的証拠は、ＥＰＯ様領域では少なくとも２つのＯ結合部位が１位（Ｓｅｒ）と３７位（Ｔｈｒ）でグリコシル化されていることを示している。
Ｇ-ＣＳＦやＭＧＤＦのようなタンパク質はある種の特定条件下で安定化されうるが、さらにこれらやその他のタンパク質の二次および三次構造を安定化させることにより、シェルフライフを延長させる必要がある。そのようなタンパク質を処理するためにこれまでに試みられたひとつの方法がリポソームの使用である。リポソームは水不溶性の極性脂質、特にリン脂質によって形成される完全に閉鎖された脂質二重層の膜である。リポソーム小胞は単一の膜二重層を持つこともあり（単層性）、あるいは複数の膜二重層を持つこともある（多層性）。二重層は、親水性（極性）の「頭部」領域と疎水性（無極性）の「尾部」領域を持つ２つの脂質単層から成り、親水性の頭部が水相の方に向うのに対し、疎水性の尾部は二重層の中心の方向に向う。リポソームの安定性、硬さおよび透過性は、リン脂質組成の変化、温度変化、ステロールの包含あるいは電荷した両親媒分子の取り込みによって変わりうる。リポソームの基礎構造は当業者に周知の様々な技術によって作製できる。
リポソームはその形成過程において、水性チャネルに水溶質を捕獲し、種々の速度でそれらを放出することができる。リポソームは細胞内に酵素を導入し、その代謝を変化させうることが発見されて（Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ， Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． ２９５， ７０４−７１０， ７６５−７７０（１９７６））、リポソームは標的薬剤送達の探求に対する回答であると伝えられた。その結果、リポソームの疎水層あるいは疎水核内に隠された薬剤、ビタミンおよびタンパク質の緩徐放出デポ剤としてのリポソームの使用に関して、製薬業界において数多くの開発研究が行われている。
薬物担体としてのリポソームの使用の成功は限られている。そのような使用を試みた研究者達がいくつかの問題に遭遇したためである。たとえば、リポソームは封入された抗原に対する強力な免疫学的付加物として作用することが知られており、外因性由来の酵素あるいは他のタンパク質がリポソーム内に封入されたときには警戒が必要である。また、薬剤の拡散速度を制御することは困難である。これはリポソームに固有の不安定性と一部の薬剤の拡散を促進するある種の血液成分の存在によるものである。さらに、一部の物質は、その性質上リポソーム内にほとんど封入されず、従って循環中に速やかに拡散する。最後に、肝臓あるいは脾臓以外の細胞あるいは器官を標的するという問題があった。リポソーム、リポソーム内に取り込まれた物質、および薬物担体としてのリポソームの使用に関連した問題についての卓越した総説は、「生物学および医学における薬物担体」１４章、２８７−３４１（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎ．Ｙ．， １９７９）に掲載されているＧｒｅｇｏｒｙ Ｇｒｅｇｏｒｉａｉｄｉｓによる「リポソーム」である。
薬物担体としてリポソームを利用する試みに関しては多くの報告があるが、ペプチドおよび／あるいはタンパク質の構造を安定化させることにより治療用ペプチドあるいはタンパク質のシェルフライフを向上させる目的でのリポソームの使用についてはほとんど開示されていない。「治療用ペプチドおよびタンパク質」と題するＰＣＴ／ＵＳ９０／０５１６３において、Ｈｏｓｔｅｔｌｅｒらは、空気／水界面におけるポリペプチドおよび／あるいはタンパク質の蓄積を防ぐため、ならびに容器表面へのポリペプチドおよび／あるいはタンパク質の吸着を防ぐために、ポリペプチドおよび／あるいはタンパク質を可溶化するための医薬上許容されうる希釈薬としての空（ｅｍｐｔｙ）のリポソームの使用を開示している。Ｈｏｓｔｅｔｌｅｒらは、負に電荷したリン脂質を約５０モル％まで付加しうること、また中性リン脂質であるホスファチジルコリンが好ましいリポソームであることを開示している。Ｈｏｓｔｅｔｌｅｒらはポリペプチドおよび／あるいはタンパク質の構造を安定化させることが示された希釈薬については開示していない。
「腫瘍壊死因子のリポソーム製剤の調製と特性」と題するＰＣＴ／ＵＳ９１／０７６９４、Ｈｕｎｇら、では、表面に結合したあるいはリポソーム内に被包された、脂質親和性に変化させた腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）分子が記述されている。リポソーム性脂質親和性ＴＮＦ分子はｉｎ ｖｉｖｏでの安定性が高いことが報告されている。安定性とは、ＴＮＦ−リポソームが、ｉｎ ｖｉｖｏで系内へのＴＮＦの漏出が低いあるいは低下傾向にあることを指す。好ましいリポソームは中性脂質であった。Ｈｕｎｇらは、賦形剤がタンパク質構造への安定化作用を持つＴＮＦ組成については開示していない。
タンパク質、たとえばＧ-ＣＳＦあるいはＭＧＤＦを負に電荷した脂質小胞と接触させ、それによって直接、熱誘発の凝集、変性、活性喪失、および二次構造の展開（unfolding）に対してタンパク質を安定化させることに関しては、文献からは何も引き出せない。高温を必要とする製剤工程（たとえばＧ-ＣＳＦおよび／あるいはＭＧＤＦのポリマー内への取り込み）において有用である、ならびに新規の送達賦形剤として使用される（たとえばＰＥＧ化（ｐｅｇｙｌａｔｅｄ）Ｇ−ＣＳＦの経口投与）という恩恵をもたらす組成物への需要が存在する。本発明はそのような組成を提供するものである。
発明の概要
本発明は、溶融小球状態条件下でタンパク質に疎水性賦形剤、例えば、リソ−リン脂質もしくは他のリポソーム、を添加することがそのタンパク質の二次及び三次構造を直接安定化し、それにより熱誘発凝集、変性、及び失活からタンパク質が保護されることに向けられている。特には、本発明は、安定なＧ−ＣＳＦ：リン脂質及びＭＧＤＦ：リン脂質組成物に向けられている。驚くべきことに、好ましいＧ−ＣＳＦ：リン脂質及びＭＤＧＦ：リン脂質組成物は、冷却によるタンパク質二次構造の完全な回復を伴いつつ、１０−９５℃の間で数回循環させることが可能である。これらの組成物は、新規輸送担体としての使用の他に、高温を要する処方手順に有用である。加えて、これらの組成物は、タンパク質単体と比較して長期の貯蔵有効期間を示し、かつタンパク質とリン脂質との相互作用がガラスバイアルへのタンパク質の吸着を防ぐ。
好ましい態様において、タンパク質：リン脂質複合体は、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、エッグホスファチジルグリセロール、ジオレオイルホルファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、エッグホスファチジルエタノールアミン、ジオレオイルホスファチジン酸（ＤＯＰＡ）、ジミリストイルホスファチジン酸（ＤＭＰＡ）、ジパルミトイルホスファチジン酸（ＤＰＰＡ）、ジオレオイルホスファチジルセリン（ＤＯＰＳ）、ジミリストイルホスファチジルセリン（ＤＭＰＳ）、ジパルミトイルホスファチジルセリン（ＤＰＰＳ）、エッグホスファチジルセリン、リソホスファチジルグリセロール、リソホスファチジルエタノールアミン、リソホスファチジルセリンから選択される負に荷電したリポソームを含む。ＤＯＰＧ、負荷電不飽和リン脂質が特に好ましい。本発明は、さらに、３．０−７．５の範囲に維持されるｐＨ、及び少なくとも１０：１の脂質：タンパク質比を包含する。
本発明の好ましい態様を提供するさらなる要素には、等張性調整剤；緩衝剤；及びｐＨ調整剤の１以上の使用の他に、タンパク質：リン脂質複合体における化学修飾タンパク質の使用が含まれる。当該技術の知識を有する者に理解されるであろうように、本発明はこれらのさらなる要素の様々な組み合わせを有する安定なタンパク質：リン脂質組成物を包含する。
【図面の簡単な説明】
図１は、ＤＯＰＧ小胞の存在下（曲線１）及び非存在下（曲線２）におけるｒｈＧ−ＣＳＦの蛍光放射スペクトルを表す。ｒｈＧ−ＣＳＦの濃度は０．２ｍｇ／ｍｌであった。ＤＯＰＧ：ｒｈＧ−ＣＳＦ比（曲線１）は１００：１（モル：モル）であった。
図２は、増加する脂質：タンパク質比のｒｈＧ−ＣＳＦ蛍光に対する効果を示す。Ｆ0は初期蛍光（脂質なし）であり、Ｆは、脂質を添加して脂質：ｒｈＧ−ＣＳＦの指示されたモル比を達成した後の蛍光を指す。図２（ａ）は、ＤＯＰＧ：ｒｈＧ−ＣＳＦの混合物についてのＦ／Ｆ0（■）及び最大放射波長（△）を示す。図２（ｂ）はＤＯＰＣ：ｒｈＧ−ＣＳＦの混合物についてのＦ／Ｆ0（■）及び最大放射波長（△）を示す。
図３は、ＤＯＰＧ小胞の非存在下（●）及び存在下（○）における、ＫＩによるｒｈＧ−ＣＳＦ蛍光の消光のスターン−ボルマー（Ｓｔｅｒｎ−Ｖｏｌｍｅｒ）プロットを示す。消光実験は、ｒｈＧ−ＣＳＦ（０．２ｍｇ／ｍｌ）及びＤＯＰＧ：ｒｈＧ−ＣＳＦ（１００：１モル比）にＫＩのアリコートを添加することにより行った。
図４は、ピレンデカン酸添加の際のｒｈＧ−ＣＳＦトリプトファン蛍光の消光を表す。放射波長は３２７ｎｍであった。ＤＯＰＧ：ｒｈＧ−ＣＳＦ比は１００：１（モル比）であった。
図５は、様々な脂質の非存在下及び存在下における、ｒｈＧ−ＣＳＦについてのＦ強度変化を示すグラフである。各事例において、脂質：タンパク質比は１００：１（モル比）であった。
図６は、様々な脂質の非存在下及び存在下における、ｒｈＧ−ＣＳＦについての最大放射のシフトの比較を示すグラフである。各事例において、脂質：タンパク質比は１００：１（モル比）であった。
図７は、ｒｈＧ−ＣＳＦ（曲線１）のＣＤに対するＤＭＰＣ（曲線２）、ＤＭＰＧ（曲線３）、及びＤＭＰＡ（曲線４）の効果を示す。各事例において、脂質：タンパク質比は、水中、ｐＨ６．０で、５０：１（モル比）であった。
図８は、ｒｈＧ−ＣＳＦ（曲線１）又はＤＯＰＧ：ｒｈＧ−ＣＳＦ（１４０：１モル比）（曲線２）のＣＤに対する昇温の効果を示す。ｒｈＧ−ＣＳＦ濃度は、水中、ｐＨ６．０で、８０μｇ／ｍｌであった。温度は、１０−９０℃から、１００℃／時の速度で走査した。
図９は、ｒｈＧ−ＣＳＦ（曲線１）及びＤＯＰＧ：ｒｈＧ−ＣＳＦ（４５：１モル比）（曲線２）についての示差走査熱量サーモグラムを示す。試料中のｒｈＧ−ＣＳＦの濃度は１ｍｇ／ｍｌ（水中でｐＨ７．０）であった。走査速度は９０℃／時であった。
図１０は、ｒｈＧ−ＣＳＦ（曲線１）及びＤＯＰＧ：ｒｈＧ−ＣＳＦ（１４０：１モル比）（曲線２）のＣＤに対する温度サイクルの影響を示す。試料を、矢印で示されるように、急速に９５℃に加熱し、かつ１０℃に冷却した。試料中のｒｈＧ−ＣＳＦ濃度は８０μｇ／ｍｌ、ｐＨ６．０であった。
図１１は、ｒｈＧ−ＣＳＦ（曲線１）及びＤＭＰＧ：ｒｈＧ−ＣＳＦ（１５０：１モル比）（曲線２）のＣＤに対する温度サイクルの影響を示す。試料を９５℃に加熱し、１０℃に冷却した。試料中のｒｈＧ−ＣＳＦ濃度は８０μｇ／ｍｌ、ｐＨ６．０であった。
図１２は、ｒｈＧ−ＣＳＦ（曲線１）及びＤＰＰＧ：ｒｈＧ−ＣＳＦ（１５０：１モル比）（曲線２）のＣＤに対する温度サイクルの影響を示す。試料を９５℃に加熱し、１０℃に冷却した。試料中のｒｈＧ−ＣＳＦ濃度は８０μｇ／ｍｌ、ｐＨ６．０であった。
図１３は、様々な脂質の、凍結乾燥過程でのｒｈＧ−ＣＳＦを安定化する能力を示すグラフである。各事例における脂質：タンパク質比は１００：１であった。安定性は、骨髄検定における生体外活性の保持に基づいた。ｒｈＧ−ＣＳＦ単独では凍結乾燥プロセスに耐えることができないので、用いられる対照は脂質が存在しない未処理ｒｈＧ−ＣＳＦである。
図１４は、ｒｈＧ−ＣＳＦの生体内活性に対する様々な脂質の効果を示す。活性（ＷＢＣカウント）はハムスターの皮下注射の後に測定した。ｒｈＧ−ＣＳＦ用量は、１００：１の脂質：タンパク質比で、１００μｇ／ｋｇであった。
図１５は、ｒｈＧ−ＣＳＦの生体内活性に対する様々な脂質の効果を示す。活性（ＷＢＣカウント）は、ハムスターの皮下注射の後に測定した。ｒｈＧ−ＣＳＦ用量は、５０：１の脂質：タンパク質比で、１００μｇ／ｋｇであった。
図１６は、ＤＯＰＧの非存在下及び存在下における、様々なｐＨでの、ＣＨＯ−Ｇ−ＣＳＦについてのＦ強度変化の比較を示すグラフである。各事例において、脂質：タンパク質比は１００：１（モル比）であった。
図１７は、ＤＯＰＧの非存在下及び存在下における、様々なｐＨでの、ＣＨＯ−Ｇ−ＣＳＦについての最大放射のシフトの比較を示すグラフである。各事例において、脂質：タンパク質比は１００：１（モル比）であった。
図１８は、ＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦ（−）及びＤＭＰＧ：ＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦ（１７：１モル比）（----）のＣＤに対する温度サイクルの影響を示す。試料を９０℃に加熱し、１０℃に冷却した。図１９は：（ａ）ＰＢＳ、ｐＨ７．０中でのＧＭ-ＣＳＦのＣＤに対する温度サイクルの影響を示す。１０℃でのＧＭ−ＣＳＦ（−）を、９０℃に加熱した後１０℃に冷却したＧＭ−ＣＳＦ（----）と比較する；（ｂ）ＤＰＰＧ：ＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦ（１７：１モル比）のＣＤに対する温度サイクルの影響を示す。１０℃でのＤＰＰＧ：ＧＭ−ＣＳＦ（−）を、９０℃に加熱した後１０℃に冷却したＤＰＰＧ：ＧＭ−ＣＳＦ（----）と比較する。
図２０は：（ａ）ＤＯＰＧの非存在下及び存在下における、ｒｈＧ−ＣＳＦの十二指腸内注入に対する全ＷＢＣ応答の結果を示す。ｒｈＧ−ＣＳＦ用量は７５０μｇ／ｋｇであり、脂質：タンパク質比は１００：１であった；（ｂ）ＤＯＰＧの非存在下及び存在下における、ＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦの＋二指腸内注入に対する全ＷＢＣ応答の結果を示す。ＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦ用量は７５０μｇ／ｋｇであり、脂質：タンパク質比は１００：１であった。
図２１は、十二指腸内ポンプ注入の後のＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦの血清レベルに対するＤＯＰＧの効果を示す。ＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦ用量は７５０μｇ／ｋｇであり、脂質：タンパク質比は１００：１であった。
図２２は、ＤＭＰＧ小胞の存在下及び非存在下におけるＭＧＤＦの蛍光放射スペクトルを表す。ＭＧＤＦの濃度は０．１ｍｇ／ｍｌであった。このＭＧＤＦは大腸菌由来ＭＧＤＦ１−１６３であった。ＤＭＰＧ：ＭＧＤＦ比は１００：１（モル：モル）であった。
図２３は、ＭＧＤＦ蛍光に対する、増大する脂質：タンパク質比の効果を示す。このＭＧＤＦは大腸菌由来ＭＧＤＦ１−１６３であった。ｐＨ５．０（−○−）及びＰＨ７．０（−●−）でのＤＭＰＧ：ＭＧＤＦ混合物の最大放射波長が示されている。
図２４は、ＤＭＰＧ小胞の非存在下（○）及び存在下（●）における、ＫＩによるＭＧＤＦ蛍光の消光のスターン−ボルマープロットを示す。このＭＧＤＦは大腸菌由来ＭＧＤＦ１−１６３であった。消光実験は、ＭＤＧＦ（０．１ｍｇ／ｍｌ）及びＤＭＰＧ：ＭＧＤＦ（１００：１モル比）にＫＩのアリコートを添加することにより行った。
図２５は、ＭＧＤＦ（○）及びＤＭＰＧ：ＭＧＤＦ（１００：１モル比）（●）のＣＤに対する温度サイクルの影響を示す。このＭＧＤＦは大腸菌由来ＭＧＤＦ１−１６３であった。残存ヘリシティ％は、各サイクル後に１０℃で検出されるＣＤの量を指す（１サイクル＝試料を急速に９５℃に加熱し、１０℃に冷却した）。
図２６は、様々な濃度の尿素の存在下におけるＭＧＤＦ（±ＤＭＰＧ）変性の程度を示す。ＭＧＤＦ（−□−）及びＤＭＰＧ：ＭＧＤＦ（−■−）蛍光放射最大の他に、ＭＧＤＦ（−○−）及びＤＭＰＧ：ＭＧＤＦ（−●−）についての円偏光二色性ＭＲＥが示されている。このＭＧＤＦは大腸菌由来ＭＧＤＦ１−１６３であった。ＤＭＰＧ：ＭＧＤＦ比は１００：１（モル：モル）であった。
図２７は、ＭＧＤＦ（±ＤＭＰＧ）及びＰＥＧ−ＭＧＤＦ（±ＤＭＰＧ）についての最大蛍光放射のグラフ表示である。このＭＧＤＦは大腸菌由来ＭＧＤＦ１−１６３であり、ＰＥＧ−ＭＧＤＦはモノ−ＰＥＧ化（ｍｏｎｏ−ｐｅｇｙｌａｔｅｄ）大腸菌由来ＭＧＤＦ１−１６３であった。ＤＭＰＧ：ＭＧＤＦ及びＤＭＰＧ：ＰＥＧ−ＭＧＤＦ比は、１００：１（モル：モル）であった。
図２８は、様々なＰＥＧ−ＭＧＤＦ濃度での、ガラスバイアルに対するＰＥＧ−ＭＧＤＦ（±ＤＭＰＧ）吸着の程度を示す。このＭＧＤＦは大腸菌由来ＭＧＤＦ１−１６３であり、ＰＥＧ−ＭＧＤＦはモノ−ＰＥＧ化（ポリエチレングリコール化）大腸菌由来ＭＧＤＦ１−１６３であった。室温で１８時間のインキュベーションの後にガラスバイアルから回収可能な放射標識ＭＧＤＦの量をカウントすることにより、ＰＥＧ−ＭＧＤＦ（−□−）及びＤＭＰＧ：ＰＥＧ−ＭＧＤＦ（−○−）の回収％を検定した。図２９は、シグナルペプチド（アミノ酸−２１ないし−１）及び成熟アミノ酸配列（１−３３２）を含む、ヒトＭＧＤＦのＤＮＡ及びアミノ酸配列（配列番号１及び２）を示す。
図３０は、結果として実質的なモノ−ポリエチレングリコール化生成物を生じる、モノ−メトキシ−ポリエチレングリコールアルデヒドを用いる、Ｎ−末端残基のα−アミノ基での部位特異的ＭＧＤＦ還元アルキル化の例を示す。
図３１は、正常マウスにおける、血小板総数の観点からのＤＭＰＧ：ＭＧＤＦ及びＤＭＰＧ：ＰＥＧ−ＭＧＤＦの生体内活性を示す。このＭＧＤＦは大腸菌由来ＭＧＤＦ１−１６３であり、ＰＥＧ−ＭＧＤＦはモノ−ポリエチレングリコール化大腸菌由来ＭＧＤＦ１−１６３であった。ＤＭＰＧ：ＭＧＤＦ及びＤＭＰＧ：ＰＥＧ−ＭＧＤＦ用量は１００μｇ／ｋｇ及び３００μｇ／ｋｇであり、脂質：タンパク質比は１００：１であった。
発明の詳細な説明
本発明の組成物は、以下に続く検討でより詳細に記述され、以下に示される実施例により例示される。実施例には、本発明の種々の態様が示され、種々のタンパク質・リン脂質組成物の安定性および生物活性の試験結果が包含される。驚くべきことに、脂質小胞を有するタンパク質の相互反応はタンパク質のタンパク構造を直接的に安定化し、それにより脂質の不存在下でタンパク質を変性させる条件下でさえ、タンパク質に安定化効果を及ぼす。
ポリエチレングリコール分子を付着（接着）させたＧ−ＣＳＦ（上述のとおり）を使用して、化学的に修飾されたＧ−ＣＳＦ：リン脂質組成物の経口投与もここに記載されている。
本発明の実施に使用することが考えられるのは、溶融した小球状状態に移行する能力のある種々のタンパク質である。考えられる具体的なタンパク質は、前述のＧ−ＣＳＦ，ＧＭ−ＣＳＦ，ＭＧＤＦ，Ｍ−ＣＳＦ，インターフェロン（アルファ、ベータおよびガンマ）、インターロイキン（１−１１）、エリスロポイエチン（ＥＰＯ）、線維芽細胞成長因子、幹細胞因子、神経成長因子、ＢＤＮＦ，ＮＴ３，血小板由来成長因子、および腫瘍成長因子（アルファ、ベータ）のような種々の造血性因子を含むサイトカインが挙げられる。他のタンパク質は、ＭＧＳに移行する能力について評価されうる。問題のタンパク質がＭＧＳに移行する能力があれば、問題のタンパク質は負に荷電されたリポソーム小胞と接触し得、安定化効果が評価される。
一般に、本発明の実施に有用なＧ−ＣＳＦは、哺乳類生物から純粋に単離された野性型、または代替的に化学的合成手段の、またはゲノムあるいはｃＤＮＡクローニングによりまたは遺伝子合成により得られる外因性ＤＮＡ配列の原核または真核宿主発現の産生物でありうる。適切な原核宿主としては、種々の細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞が挙げられる。適切な真核宿主としては、酵母（例えば、エス．セレビジアエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））および哺乳類（例えば、チャイニーズハムスター卵巣、サル）細胞が挙げられる。使用される宿主によって、Ｇ−ＣＳＦ発現産生物は、哺乳類または他の真核生物の糖（炭水化物）でグリコシル化されてもよく、またはグリコシル化されていなくてもよい。本発明は、Ｇ−ＣＳＦ、組換え体Ｇ−ＣＳＦのような任意のそして全ての形態を使用することを意図し、特にＥ．ｃｏｌｉ由来のものが、最も商業的に実施しやすい点で好ましい。
本発明に使用される化学的に修飾されるべきＧ−ＣＳＦは、天然のヒトＧ−ＣＳＦ（ｎｈＧ−ＣＳＦ）または、原核または真核宿主細胞発現のような組換え体核酸法の産生物のいずれでもよい。一般に、考えられる化学的修飾は、Ｇ−ＣＳＦ分子自身に化学的部分を付着させることである。タンパク質修飾および融合タンパク質を記載する概論文献は、フランシスのフォーカス・オン・グロース・ファクターズ（Ｆｏｃｕｓ ｏｎ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ）、３巻、４−１０（１９９２年５月）（イギリス、ロンドン エヌ２オー オーエルディー、フリエルン バーネット レーン、マウントビュー コートのメディスクリプトにより出版）である。例えば、「ケミカリー モディファイド グラヌロサイト コロニー スティミュレイティング ファクター」という表題で、ポリエチレングリコール分子が付着したＧ−ＣＳＦを製造するための材料および方法を記載したＥＰ０４０１３８４を参照されたい。付着は、タンパク質に直接、または活性剤に対して架橋として作用する部分に結合させることよりなる。共有結合は付着の最も安定なものとして好ましい。化学的修飾は、Ｇ−ＣＳＦの効果を制御、支持または拡張するのに寄与しうる。これは、例えば、化学的に修飾されたＧ−ＣＳＦが循環に達する時間の量を制御する効果を示す。化学的修飾剤の例は、その誘導体を含めたポリエチレングリコール組成物である。
投与を有効にする任意の化学的に修飾されたＧ−ＣＳＦ標品は、本発明を実施するのに使用することが考えられる。当業者の技術者が認識する公知方法により効力が測定されうる。ペギル化（ｐｅｇｙｌａｔｅｄ，ＰＥＧ化）Ｇ−ＣＳＦ、特にペギル化Ｅ．ｃｏｌｉ由来Ｇ−ＣＳＦ、そして詳細にはトリ−テトラ ペギル化Ｅ．ｃｏｌｉ由来Ｇ−ＣＳＦが好ましい。
Ｇ−ＣＳＦは、２．５〜５．０のｐＨ範囲で、３次構造を失うことおよびアルファ螺旋含量が増加することに関与する立体配座の変化が起こるという事実にもかかわらず、酸性条件下で最も安定であると報告されてきた。ナルヒらのジェイ．プロテイン ケム（Ｊ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｅｍ．）、１０巻、３５９−３６７（１９９１年）。この立体配座の変化は、溶融した小球状状態（ＭＧＳ）の特徴である。したがって、ＭＧＳに移行する能力のある他のタンパク質に働く処方剤（フォーミュレーター）の場合には、Ｇ−ＣＳＦに働く処方剤は、凝集および変性を防ぐために、２次および３次構造を加熱誘導で折畳みを解くことから保護しなければならない。
本発明に有用なＧＭ−ＣＳＦは、哺乳類生物から純粋に単離された野性型、あるいはゲノムまたはｃＤＮＡクローニングによるかまたは遺伝子合成により得られた外因性ＤＮＡ配列の原核または真核宿主発現の産生物であってよい。適切な原核宿主としては、種々の細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞が挙げられる。適切な真核宿主としては、酵母（例えば、エス．セレビジアエ）および哺乳類（例えば、チャイニーズハムスター卵巣、サル）細胞が挙げられる。使用される宿主によって、ＧＭ−ＣＳＦ発現産生物は、哺乳類または他の真核生物の糖でグリコシル化されてもよく、またはグリコシル化されていなくてもよい。本発明は、ＧＭ−ＣＳＦ、組換え体ＧＭ−ＣＳＦのような任意のそして全ての形態を使用することが考えられ、特にＥ．ｃｏｌｉ由来のものが、最も商業的に実施しやすい点で好ましい。
ここで使用される「ＭＧＤＦ」の語は、天然に発生するＭＧＤＦ、天然に発生するＭＧＤＦの断片並びに巨核球および／または血小板の成長、発達および／または生成を特異的に刺激する生物活性を持たせるように天然に発生するＭＧＤＦのものを十分に複製するようなアミノ酸配列及びグリコシル化を有する人為的に発生するポリペプチドを包含する。
好ましい具体例として、ＭＧＤＦは、真核または原核宿主細胞に形質移入された外因性ＤＮＡ配列の発現の産生物である。すなわち、好ましい具体例として、ＭＧＤＦは「組換え体ＭＧＤＦ」である。好ましい真核宿主は哺乳類であり、特にＣＨＯ細胞であるのが好ましく、そして好ましい原核宿主は細菌であり、特にＥ．ｃｏｌｉであるのが好ましい。組換え体ＭＧＤＦは、ここにおよびＭＧＤＦのクローニングおよび発現に関してここで引用した出版物に記載した手段により有利に生成される。
いくつかのさらに好ましいＭＧＤＦ分子は、ここで図２９に基づき、以下に示すアミノ酸配列を示す。
ＭＧＤＦ１−３３２ 図２９のアミノ酸１−３３２
ＭＧＤＦ１−１９１ 図２９のアミノ酸１−１９１
ＭＧＤＦ１−１８３ 図２９のアミノ酸１−１８３
ＭＧＤＦ１−１７４ 図２９のアミノ酸１−１７４
ＭＧＤＦ１−１６３ 図２９のアミノ酸１−１６３
ＭＧＤＦ１−１５３ 図２９のアミノ酸１−１５３
ＭＧＤＦ１−１５２ 図２９のアミノ酸１−１５２
ＭＧＤＦ１−１５１ 図２９のアミノ酸１−１５１
ＭＧＤＦ７−３３２ 図２９のアミノ酸７−３３２
ＭＧＤＦ７−１９１ 図２９のアミノ酸７−１９１
ＭＧＤＦ７−１８３ 図２９のアミノ酸７−１８３
ＭＧＤＦ７−１７４ 図２９のアミノ酸７−１７４
ＭＧＤＦ７−１６３ 図２９のアミノ酸７−１６３
ＭＧＤＦ７−１５３ 図２９のアミノ酸７−１５３
ＭＧＤＦ７−１５２ 図２９のアミノ酸７−１５２
ＭＧＤＦ７−１５１ 図２９のアミノ酸７−１５１
上述の各々の場合に、Ｍｅｔ−ＬｙｓはさらにそのＮ−末端に含まれる。
ＭＧＤＦの種々の類似体も本発明に使用することが考えられる。ここで使用する場合、「ＭＧＤＦの類似体」は、ＭＧＤＦのアミノ酸配列に１つまたはそれ以上の変化を伴い、その結果糖付着の部位のタイプ（Ｎ−またはＯ−結合）、数または位置に変化を生じたＭＧＤＦを意味する。ＭＧＤＦ類似体（類）は、天然の配列のＭＧＤＦ（例えば、ヒトＭＧＤＦ）と比較して少なくとも同等の生物活性を残しており、生物活性についての分析で測定する場合、実質的により高い活性を持ちうる。得られる類似体は天然のヒト／組換え体ＭＧＤＦより少ないかまたは多い（好ましくは多い）糖鎖を有しうる。
カルボキシ末端伸長が少なくとも１つの別の糖部位を提供するＭＧＤＦのカルボキシ末端から伸長する１つまたはそれ以上のアミノ酸を有する類似体も、本発明の類似体の範囲内に含まれる。ＭＧＤＦのカルボキシ末端は、使用されるＭＧＤＦの特定の形態（例えば、ＭＧＤＦ １−３３２アミノ酸、またはＭＧＤＦ １−１６３アミノ酸）によって変化する。１つまたはそれ以上のＮ−またはＯ−結合グリコシル化部位を含むようなアミノ酸をカルボキシ末端に加えることにより、別の糖部位を、ＭＧＤＦ種のカルボキシ末端に付加しうる。
本発明は、化学的に修飾されたＭＧＤＦ組成物も広範に包含する。一般に、予測される化学的修飾は、ＭＧＤＦタンパク質が少なくとも１つのポリエチレングリコール分子（すなわち、ペギル化（ＰＥＧ化）ＭＧＤＦ）に結合するＭＧＤＦ産生物である。ＭＧＤＦのペギル化は、当業界で公知の任意のペギル化反応により行われうる。例えば、フォーカス・オン・グロース・ファクターズ（Ｆｏｃｕｓ ｏｎ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ）、３（２）、４−１０（１９９２年）；ＥＰ ０１５４３１６号；ＥＰ ０４０１３８４号；およびペギル化に関してここで引用した他の出版物参照。ペギル化は、反応性ポリエチレングリコール分子（または類似の反応性水溶性ポリマー）とのアシル化反応またはアルキル化反応を介して行われるのが好ましい。
一般にアシル化によるペギル化は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の反応性エステル誘導体をＭＧＤＦタンパク質と反応させることを包含する。任意の公知または実質的に発見された反応性ＰＥＧ分子を使用してＭＧＤＦのペギル化を行いうる。好ましい活性化ＰＥＧエステルは、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（「ＮＨＳ」）にエステル化されたＰＥＧである。ここで使用する場合、「アシル化」は、以下のタイプのＭＧＤＦとＰＥＧのような水溶性ポリマーとの間の結合：アミド、カルバメート、ウレタン等を制限なしに包含することが考えられる。バイオコンジュゲート ケム．（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．）、５巻、１３３−１４０（１９９４）参照。反応条件は、ペギル化の分野で公知の任意のものまたはそれらの実質的に発展したものから選択しうるが、修飾されるべきＭＧＤＦ種を不活性化するであろう温度、溶媒、およびｐＨのような条件は避けるべきである。
アシル化によるペギル化をすると、一般的にポリペギル化ＭＧＤＦ産生物を生じ、ここでリシンε−アミノ基はアシル結合基を介してペギル化される。連結結合はアミドであるのが好ましい。得られる産生物は、実質的にモノ、ジまたはトリペギル化のみ（例えば≧９５％）であるのも好ましい。しかし、より高い程度のペギル化（ＭＧＤＦのリシンε−アミノ酸基と、ＭＧＤＦのアミノ末端でのα−アミノ基を加えた最大数まで）を示す数種は、結局使用される特定の反応条件により形成されるのが通常である。所望であれば、とりわけ透析、塩析、超遠心、イオン交換クロマトグラフィ、ゲル濾過クロマトグラフィおよび電気泳動を含む標準精製技術により、より精製されたペギル化種を混合物、特に未反応の種から分離しうる。
アルキル化によるべギル化は、一般に還元剤の存在下で、ＰＥＧの末端アルデヒド誘導体をＭＧＤＦのようなタンパク質と反応させることを包含する。アルキル化によるペギル化を行うと、ポリペギル化ＭＧＤＦも生じ得る。さらに、ここに記載されたとおりの反応条件を操作して、実質的にＭＧＤＦ種のＮ末端のα−アミノ基のみでペギル化（すなわち、モノペギル化種）し得る。モノペギル化産生物を得るためのＭＧＤＦとの具体的な還元性アルキル化反応を図３０に示す。モノペギル化またはポリペギル化のいずれの場合にも、ＰＥＧ基は、−ＣＨ2−ＮＨ−基を介してタンパク質に付着しているのが好ましい。特に−ＣＨ2−基に関して、このタイプの結合は、ここでは「アルキル」結合を意味する。
還元的アルキル化を介してモノペギル化産生物を生成するための誘導体化は、ＭＧＤＦでの誘導体化を可能にする１級アミノ基のタイプの違い（リシン対Ｎ−末端）による反応性の違いを利用する。反応は、タンパク質のリシン残渣のε−アミノ基とＮ−末端残渣のα−アミノ基のものとのｐＫａの差異を利用させるｐＨ（以下参照）で行われる。このような選択的誘導体により、アルデヒドのような反応性基を含む水溶性ポリマーをタンパク質に付着することが制御される。ポリマーとの接合は、タンパク質のＮ−末端で優勢に起こり、そしてリシン側鎖アミノ基のような他の反応性基の修飾は顕著には起こらない。
したがって、好ましい態様として、本発明はペギル化ＭＧＤＦに関し、ここでＰＥＧ基（類）は、アシルまたはアルキル基を介して付着している。上で検討したとおり、このような産生物はモノペギル化またはポリペギル化（例えば、２−６、好ましくは２−５のＰＥＧ基を含有する）であってもよい。ＰＥＧ基は一般にアミノ酸のαまたはεアミノ基でタンパク質に付着しているが、ＰＥＧ基は、適切な反応条件下でＰＥＧ基に付着しはじめるのに十分に反応性を有するタンパク質に付着した任意のアミノ基に付着することも考えられる。
アシル化及びアルキル化アプローチの両方で使用されるポリマー分子は、水溶性ポリマー又はそれらの混合物の中から選択される。選択されたポリマーは、それが結合しているタンパク質が生理学的環境のような水性環境中で沈殿しないように水溶性でなくてはならない。選択されたポリマーは、好ましくは、重合度を本発明の方法で与えられるように調節することができるように、アシル化のための活性エステル又はアルキル化のためのアルデヒドのような１個の反応性基を有するように変性しなくてはならない。好ましい反応性ＰＥＧアルデヒドは、水安定性であるポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド又はそのモノＣ1〜Ｃ10アルコキシ若しくはアリールオキシ誘導体である。このポリマーは、分枝型又は非分枝型であってよい。好ましくは、最終製品製剤の治療使用のために、このポリマーは医薬上許容できるであろう。この水溶性ポリマーは、例えば、ポリエチレングリコール、モノメトキシ−ポリエチレングリコール、デキストラン、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセリン）及びポリビニルアルコールからなる群から選択することができる。アシル化反応のために、選択されたポリマー（群）は１個の反応性エステル基を有していなくてはならない。本発明の還元性アルキル化のために、選択されたポリマー（群）は１個の反応性アルデヒド基を有していなくてはならない。一般的に、水溶性ポリマーは、天然に生じるグリコシル残基からは選択されないであろう。それは、これらが普通、哺乳類組み換え発現システムによって一層便利に製造されるためである。このポリマーはどのような分子量のものであってもよく、分枝型又は非分枝型であってよい。
本発明で使用するための特に好ましい水溶性ポリマーは、ポリエチレングリコール、略称ＰＥＧである。本明細書で使用するとき、ポリエチレングリコールは、モノ−（Ｃ1〜Ｃ10）アルコキシ若しくはアリールオキシ−ポリエチレングリコールのような、他のタンパク質を誘導するために使用されたＰＥＧの全ての形を包含することを意味する。ペギル化ＭＧＤＦの製造方法は一般的に、（ａ）ＭＧＤＦペプチドを（ＰＥＧの反応性エステル又はアルデヒド誘導体のような）ポリエチレングリコールと、ＭＧＤＦが１個又は２個以上のＰＥＧ基と結合するようになる条件下で反応させる工程及び（ｂ）反応生成物（群）を得る工程からなっている。一般に、アシル化反応のための最適反応条件は、公知のパラメーター及び所望の結果に基づいてケース・バイ・ケースで決定されるであろ。例えば、ＰＥＧ：タンパク質の比が大きくなると、ポリ−ペギル化生成物のパーセントが大きくなる。
他の重要な考慮はポリマーの分子量である。一般に、ポリマーの分子量が高くなると、タンパク質に結合することができるポリマー分子の数は少なくなる。同様に、これらのパラメーターを最適化するとき、ポリマーの枝分かれを考慮に入れなくてはならない。一般的に、分子量が高くなると（又は、枝分かれが多くなると）ポリマー：タンパク質比が高くなる。一般に、本発明で意図されるペギル化反応について、好ましい分子量は約２ｋＤａ〜約１００ｋＤａ（用語「約」は±１ｋＤａを示す）である。好ましい平均分子量は約５ｋＤａ〜約５０ｋＤａであり、特に好ましくは約１２ｋＤａ〜約２５ｋＤａであり、最も好ましくは２０ｋＤａである。水溶性ポリマーのＭＧＤＦタンパク質に対する比は、一般に１：１〜１００：１の範囲であり、好ましくは（ポリペギル化のために）１：１〜２０：１及び（モノペギル化のために）１：１〜５：１であろう。
上記の条件を使用して、還元性アルキル化によって、アミノ末端でα−アミノ基を有する全てのＭＧＤＦタンパク質へのポリマーの選択的結合が与えられ、モノポリマー／ＭＧＤＦタンパク質共役体の実質的に均一な製剤が与えられる。本明細書に於いて用語「モノポリマー／ＭＧＤＦタンパク質結合体」は、ＭＧＤＦタンパク質分子に結合した１個のポリマー分子からなる組成物を意味するために使用される。モノポリマー／ＭＧＤＦタンパク質結合体は好ましくは、リシンアミノ側基以外のＮ−末端に位置しているポリマー分子を有する。この製剤は好ましくは、９０％より多いモノポリマー／ＭＧＤＦタンパク質結合体、更に好ましくは９５％より多いモノポリマー／ＭＧＤＦタンパク質結合体であり、観察できる分子の残りは未反応物（即ち、ポリマー単位のないタンパク質）である。下記の実施例に、少なくとも約９０％のモノポリマー／タンパク質結合体及び約１０％の未反応タンパク質である製剤を与える。このモノポリマー／タンパク質結合体は生物学的活性を有する。
本発明の組成物で有用な脂質小胞体は、問題にしているタンパク質と相互作用し得る負に帯電したリポソームである。使用が意図されている特別のリポソームには、ジオレオイルホスファチジルグリセリン（ＤＯＰＧ）、ジミリストイルホスファチジルグリセリン（ＤＭＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセリン（ＤＰＰＧ）、卵ホスファチジルグリセリン、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、卵ホスファチジルエタノールアミン、ジオレオイルホスファチジン酸（ＤＯＰＡ）、ジミリストイルホスファチジン酸（ＤＭＰＡ）、ジパルミトイルホスファチジン酸（ＤＰＰＡ）、ジオレオイルホスファチジルセリン（ＤＯＰＳ）、ジミリストイルホスファチジルセリン（ＤＭＰＳ）、ジパルミトイルホスファチジルセリン（ＤＰＰＳ）、卵ホスファチジルセリン、リゾホスファチジルグリセリン、リゾホスファチジルエタノールアミン、リゾホスファチジルセリンが含まれる。使用する特別のリポソームに依存して、リポソームの量を変化させることができる。
タンパク質：リン脂質組成物には好ましくは、溶液のｐＨを所望の範囲内に維持するために緩衝剤が含まれる。好ましい緩衝剤には、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウム及びクエン酸ナトリウムが含まれる。これらの緩衝剤の混合物も使用することができる。組成物で有用な緩衝剤の量は、使用する特別の緩衝剤及び溶液のｐＨに大きく依存している。例えば、酢酸塩はｐＨ６よりもｐＨ５で一層有効な緩衝剤であり、それでｐＨ６よりもｐＨ５で溶液中でより少ない酢酸塩を使用することができる。本発明の組成物についての好ましいｐＨ範囲はｐＨ３．０〜７．５である。
本発明の組成物は更に、溶液を等張にし、溶液を注射のためにより適合なものとする等張性調整剤を含有しうる。最適の調整剤は、濃度０−１５０ｍＭの塩化ナトリウムである。
有効量の本発明のポリペプチド産物と、医薬として許容できる希釈剤、保存剤、可溶化剤、乳化剤、アジュバント及び／又は担体を含有する医薬組成物も本発明に含まれる。このような組成物は、上記タンパク質の物理的状態、安定性及び生体利用性に影響を与える。例えば、Remingtons Pharmaceutical Sciences, 18版, 1435-1712（Mack Publishing Co., Easton,PA.,1990）（引用により本明細書に含まれるものとする）を参照。ある特定の場合に、上記タンパク質の有効量を規定するものは、所望の治療結果、治療する状態又は疾患の程度、患者の肉体的状態などの、知識のある臨床医が考慮する種々の因子による。
E.coli由来ｒｈＧ−ＣＳＦを含む好適実施態様では、使用するリポソーム小胞（ベシクル）は、１０ｍＭ酢酸ナトリウムを含む、ＤＯＰＧ：Ｇ−ＣＳＦの比が５０：１で、ｐＨ４．５のＤＯＰＧである。
E.coli由来ｒｈＧＭ−ＣＳＦを含む好適実施態様では、使用するリポソームベシクルは、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）を含む、ＤＭＰＧ：ＧＭ−ＣＳＦの比が１７：１で、ｐＨ７．０のＤＭＰＧである。
化学修飾された（ポリエチレングリコール化された（pegylated））E.coli由来ｒｈＧ−ＣＳＦを含む好適実施態様では、ｒｈＧ−ＣＳＦは、３個−４個ポリエチレングリコール化されたものであり、使用するリポソームベシクルは、ＤＭＰＧ：ＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦの比が１７：１で、ｐＨ４．５のＤＭＰＧである。
E.coli由来ＭＧＤＦ１−１６３を含む好適実施態様では、使用するリポソームベシクルは、１０ｍＭ酢酸ナトリウム、５％ソルビトール中の、ＤＭＰＧ：ＭＧＤＦの比が１００：１で、ｐＨ５．０のＤＭＰＧである。
化学修飾された（ポリエチレングリコール化された）E.coli由来ＭＧＤＦ１−１６３を含む好適実施態様では、ＭＧＤＦは、還元的アルキル化を介して１個のポリエチレングリコール化されたもの（２０ｋＤａ）であり、使用するリポソームベシクルは、１０ｍＭ酢酸ナトリウム、５％ソルビトール中の、ＤＭＰＧ：ＭＧＤＦの比が１００：１で、ｐＨ５．０のＤＭＰＧである。
ＣＨＯ由来ＭＧＤＦ１−３３２を含む好適実施態様では、使用するリポソームベシクルは、１０ｍＭ酢酸ナトリウム、５％ソルビトール中の、ＤＭＰＧ：ＭＧＤＦの比が１００：１で、ｐＨ５．０のＤＭＰＧである。
特定のタンパク質：脂質組成物に関し、本発明を記載し説明したが、種々の関連組成物及び治療方法が本発明の範囲内に存在しうることは、当業者に明らかであろう。
以下の実施例で、本発明の種々の面をより詳細に説明する。
実施例１
組換えヒトＧ−ＣＳＦ（ｒｈＧ−ＣＳＦ）を脂質ベシクルに導入することの可能性を試験するために、最初の実験を行った。米国特許第4,810,643号（Souza）に記載されているように、ヒトＧ−ＣＳＦをコードするＤＮＡ配列でE.coli細胞をトランスフェクトする組換えＤＮＡ技術を用いて、ｒｈＧ−ＣＳＦを産生させた。希塩酸（ｐＨ４．０）中で４ｍｇ／ｍＬ溶液としてｒｈＧ−ＣＳＦを調製した。全ての脂質をAvanti Polar Lipids（Alabaster, Ala）から得、クロロホルム中最終濃度１００ｍｇ／ｍＬで、窒素下−２０℃で保存した。
Ｇ−ＣＳＦ：リン脂質複合体の調製
Ｇ−ＣＳＦとの組合せ用の脂質ベシクルを調製するために、適切な脂質３０μｍｏｌをガラス管に分配し、窒素ガス流を用いて乾燥し薄フィルムを形成させた。脂質フィルムを少なくとも２時間真空乾燥し、微量のクロロホルムも除去した。蒸留脱イオン水（ｄｄＨ2Ｏ）、リン酸緩衝化生理食塩水ｐＨ７．２（Gibco/BRL“Ｄ−ＰＢＳ”）、又は１５０ｍＭ ＮａＣｌ１ｍＬ中で脂質フィルムを水和させた。次に、浴型音波処理器（Laboratory supplies, Hicksville,N.Y.）でサンプルの音波処理を行った。サンプルが視覚的に透明になるまで（通常１０−１５分間）、音波処理を続けた。使用するまで、サンプルを窒素下４℃で保存した。最終脂質濃度は３０ｍＭであった。あるいは、脂質ベシクルは、上記のように脂質３００μｍｏｌを採り、窒素下乾燥、脱水することにより、調製できた。上記のように、乾燥脂質フィルムを、適切な水溶液１０ｍＬ中で水和させた。次いで、卓上型乳化器（Microfluidics Model 110S, Microfluidics, Inc. Cambridge, MA）を１０，０００ｐｓｉで操作して、サンプルを微流動化した。サンプルを装置にかけることを１０回繰返した。次に、上記のように、微流動化サンプルを４℃で保存した。
Ｇ−ＣＳＦ：リン脂質複合体は、Ｇ−ＣＳＦ（上記）とある特定の脂質（上記）を混合して調製した。混合は、渦まき回転、攪拌、又は穏やかな振蕩によって行った。種々のモル比の脂質：Ｇ−ＣＳＦを調製し、タンパク質の膜挿入及び安定化を評価した。例えば、脂質：Ｇ−ＣＳＦが４０：１モル比であり、Ｇ−ＣＳＦが０．２ｍｇ／ｍＬであるサンプル３ｍＬ（水中）を調製するために、Ｇ−ＣＳＦ保存溶液１５０μＬを脂質４４μＬ（３０ｍＭ保存溶液、音波処理により水中で調製）と混合し、水を加え、最終サンプル容量３ｍＬにする。５分インキュベーションを勧める（必須ではないが）が、ここではサンプルを使用する前、又はアッセイする前に５分インキュベーションを行った。
Ｇ−ＣＳＦはまた、微流動化前の水和脂質と混合できる。上記のように、次なる混合物の微流動化により、脂質膜内へのＧ−ＣＳＦの導入が起る。
Ｇ−ＣＳＦ：リン脂質複合体の解析
１．トリプトファン発光スペクトル
ｒｈＧ−ＣＳＦには２個のトリプトファン残基があり、それらは局所環境状態に非常に感受性が高い。それ故、ｒｈＧ−ＣＳＦがリポソームと接触しているときのｒｈＧ−ＣＳＦトリプトファン蛍光を測定するために、解析を行った。蛍光発光極大の青へのシフトは、トリプトファンがより疎水性環境にあり、それ故ｒｈＧ−ＣＳＦは脂質膜に埋め込まれたということを示唆する。トリプトファン蛍光解析の優れた総説はPrinciples of Fluorescence Microscopy, J.Lakowicz, １１章（Plenum Press,New York, 1983）である。
Ｇ−ＣＳＦ：脂質複合体（上記）のトリプトファン蛍光は、サンプルを２８０ｎｍで励起し、速度１ｎｍ／秒、１ｎｍの変化量で２８５〜４２０ｎｍの発光を走査してアッセイした。サンプル容量は３ｍＬであり、Ｇ−ＣＳＦの最終濃度は、全てのサンプルで０．２ｍｇ／ｍＬであった。脂質：Ｇ−ＣＳＦ比は変化させた。全ての蛍光測定は、PTI Alphascan fluorometer（South Brunswick, NJ）を用いて行った。全ての測定を２５℃で行い、循環水浴に連結している水ジャケットキュベットホルダーの使用中、この温度を維持した。発光スペクトルを集め、ＰＴＩによって提供されたデータソフトウエアを用いて解析した。
ＤＯＰＧからなる小単ラメラベシクルの存在下及び不存在下のｒｈＧ−ＣＳＦの蛍光スペクトルを図１に示す。ｒｈＧ−ＣＳＦは、ＤＯＰＧベシクル不存在下３３４ｎｍに極大発光を有する。脂質：タンパク質比１００：１でのＤＯＰＧ存在下、ｒｈＧ−ＣＳＦトリプトファン蛍光は３２７ｎｍへの蛍光極大発光の青方シフト及び蛍光強度の劇的増加を示す。ＤＯＰＧ存在下での蛍光発光の低波長化は、トリプトファンが天然タンパク質よりより疎水性の環境に存在することを示唆する。図２に示すように、蛍光シフトはＤＯＰＧ：Ｇ−ＣＳＦのモル比に依存し、ＤＯＰＧ：Ｇ−ＣＳＦ比が１０：１になると、膜挿入が検出できる。
２．ヨウ素イオン消光実験
ヨウ素イオンはトリプトファン蛍光の有効な衝突性消光剤であり、脂質膜には侵入できない。それ故、ヨウ素イオンによるトリプトファン蛍光の有効な消光は、バルクの水性溶媒へ該残基が曝されていることを示し、タンパク質のトリプトファンが水性溶媒から隔離されているときには、ヨウ素イオン消光が起らない。これらの実験で、Ｇ−ＣＳＦ及びＤＯＰＧ：Ｇ−ＣＳＦ組成物（脂質：タンパク質比１００：１）を用いた。サンプルの最初の読み（Ｆ0）をとり、記録した後、ヨウ化カリウム（ＫＩ）（５Ｍ保存液）の添加量を増大させた後、蛍光強度を測定した。サンプルとＫＩ溶液の両方が、Leeら、Biochem.Biophys.Acta, 984：174-182(1989)及びLe Doanら、Biochem. Biophys. Acta, 858：1-5(1986)に記載されているように、１ｍＭ Ｎａ2ＳＯ3（最終濃度）を含むように調製した。Ｎａ2ＳＯ3の添加は、タンパク質及び膜の非極性領域に分配しうるＩ2の生成を防止する。データをStern-Volmer式（Ｆ0／Ｆ＝１＋ＫKI［ＫＩ］）（Ｆ0及びＦは、それぞれ濃度［ＫＩ］でのＫＩの不存在下及び存在下のサンプルの蛍光強度である）によって解析した。ＫKIは、Ｇ−ＣＳＦトリプトファン残基のＫＩ消光のStern-Volmer消光定数である；Lehrer,S.,Biochemistry 10：3254-3263(1979)。
データのStern-Volmerプロットを図３に示す。ＤＯＰＧベシクルの不存在下、ｒｈＧ−ＣＳＦ蛍光はＫＩによって有効に消光される。ＤＯＰＧの存在下、データのStern-Volmerプロットは線形であり、ヨウ素イオンは両方のトリプトファンによく接近できないことを示す。データによると、ＤＯＰＧ不存在下でヨウ素イオンが接近できるトリプトファン残基に、ＤＯＰＧ存在下でヨウ素イオンが接近できなくなる。それ故、このトリプトファンを含むｒｈＧ−ＣＳＦの一部分はＤＯＰＧ二重層に埋もれているにちがいない。
３．エネルギートランスファー測定
以前に示されたように、トリプトファン供給体とピレンデカン酸などの脂質可溶性蛍光受容体の間でエネルギートランスファーが起ることができる。何故ならば、このプローブの励起スペクトルはトリプトファンの発光スペクトルとかなり重なり合うからである。Friereら、Biochemistry 22：1675-1680(1983)。該タンパク質が脂質膜に挿入するならば、トリプトファンからピレンへのエネルギートランスファーによりトリプトファン蛍光の消光が起るであろう。この実験では、種々の脂質：Ｇ−ＣＳＦ複合体のトリプトファン発光強度を、ピレンデカン酸（テトラヒドロフラン中の３０μｇ／ｍＬ保存液）の種々の量の添加前（Ｆ0）及び後（Ｆ）で記録した。ピレンデカン酸とサンプルの混合を促進するために、ピレンデカン酸添加の間サンプルを絶えず攪拌した。Ｆ／Ｆ0の比は、Ｇ−ＣＳＦトリプトファンと疎水性であるエネルギー受容体ピレンデカン酸の間で起るエネルギートランスファーの量に比例する。
図４は、ＤＯＰＧの存在下（脂質：タンパク質比１００：１）のｒｈＧ−ＣＳＦの消光特性を、添加したピレンデカン酸の関数として示す。非常に低い濃度（１モル％未満）のピレンデカン酸で消光が起り、膜の構造及び挙動に対するこの蛍光プローブの影響は最小である。ピレンデカン酸は急速に脂質二重層に分配することを予想することができるので、本データは、ｒｈＧ−ＣＳＦが、トリプトファンからピレン受容体への有効なエネルギートランスファーが起るために十分に深くＤＯＰＧ膜に埋め込まれていることを示す。ｒｈＧ−ＣＳＦの存在下及び不存在下、ピレンデカン酸−標識ＤＯＰＧベシクルの励起スペクトルを調べることによって、エネルギートランスファーを確認した。
上記解析により、ｒｈＧ−ＣＳＦはＤＯＰＧのような不飽和リン脂質と密接に相互作用できることが分る。ＤＯＰＧベシクルの存在下、ｒｈＧ−ＣＳＦトリプトファンは、水可溶性蛍光消光剤から保護されるが、疎水性蛍光プローブへのエネルギートランスファーを介する消光に感受性がある。共に考慮すると、データにより、ｒｈＧ−ＣＳＦはＤＯＰＧからなる膜に挿入できることが分る。１０：１比（脂質：Ｇ−ＣＳＦ）に達すると、膜挿入は検出できる。この比の数は、該タンパク質の挿入部分の廻りの脂質数を表している可能性がある。
実施例２
この実施例では、ｒｈＧ−ＣＳＦの他のリン脂質と相互作用する能力を、上記のようにＦ／Ｆ0強度と極大発光の比較を用いて測定した。各場合で、脂質：ｒｈＧ−ＣＳＦのモル比は１００：１であった。
図５は、種々の脂質の不存在下と存在下のｒｈＧ−ＣＳＦのＦ／Ｆ0データを示す。図６は同一組成物の発光極大データを示す。図５と図６のデータは、ｒｈＧ−ＣＳＦは、ＤＯＰＧの他に、ＤＭＰＧ、ＤＰＰＧ、及び有効性は小さいがホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）とホスファチジルセリン（ＰＳ）に挿入できることを示す。更に、ＮＧ−ＤＯＰＥ（ＰＥ頭部をより陰性にしたＤＯＰＥサンプル）は、ＤＯＰＥよりもｒｈＧ−ＣＳＦの挿入が向上していることが知見された。
ＤＯＰＣ、ＤＭＰＣ及びＤＰＰＣは中性脂質であり、これらのベシクルは、ｒｈＧ−ＣＳＦの極大発光又は蛍光強度に殆ど又は全く効果を有しない。このことは、これらのリン脂質と相互作用が起らなかったことを示す（図５、図６、及び図７の曲線２を参照）。
上記データは、モルテングロビュール状態への遷移ができるタンパク質は種々の脂質ベシクルに挿入できることを示す。しかし、このｒｈＧ−ＣＳＦ：脂質相互作用は、陰性荷電の脂質ベシクルを用いるときのみ起る。陰性荷電脂質ベシクルの中で、より大きい陰性荷電をもったベシクルがより強いｒｈＧ−ＣＳＦ：脂質相互作用をもたらすように考えられる。
実施例３
この実施例では、ＤＯＰＧとｒｈＧ−ＣＳＦとの相互作用をタンパク質の安定性に関連するものとして測定した。Ｐｅｌｔｉｅｒ型サーモスタット制御細胞保持器及び磁力式攪拌器を具備したＪａｓｃｏ Ｊ−７２０装置において円二色性測定を行なった。２２２ｎｍにおける円二色性を、８０μｇ／ｍｌの最終ｒｈＧ−ＣＳＦ濃度及び６．０のｐＨ値を用いて測定した。Ｍｉｃｒｏｃａｌ ＭＣ−２熱量計を用いて示差走査熱量測定を行なった。ｒｈＧ−ＣＳＦ（１ｍｇ／ｍｌ；水中）またはＤＯＰＧ：ｒｈＧ−ＣＳＦ（４５：１ モル／モル；水中）の試料を９０℃／時の速度で走査した。データを蓄積し、Ｍｉｃｒｏｃａｌソフトウェアを用いて分析した。
円二色性（２２２ｎｍ）を上昇する温度の関数として測定することにより、Ｇ−ＣＳＦのα−ヘリシティーの温度誘導型変化を追跡することができる。ｐＨ６．０において熱により誘導されるｒｈＧ−ＣＳＦの変性（ｕｎｆｏｌｄｉｎｇ）を図８に示す。曲線は、温度６０℃から７０℃にかけてかなり急激な転移が起こり、その結果α−ヘリシティーが失われることを示している。上記転移後、ｒｈＧ−ＣＳＦは溶液から不可逆的に沈澱する。変性の温度範囲は図９に示した、示差走査熱量測定により得られたｐＨ７．０におけるｒｈＧ−ＣＳＦの融点に類似する。
これに対して、ＤＯＰＧ：ｒｈＧ−ＣＳＦ試料ではα−ヘリシティーは温度が上昇するにつれて徐々に失われ、ｒｈＧ−ＣＳＦ単独の場合と異なり、ＤＯＰＧ：ｒｈＧ−ＣＳＦの温度誘導型変性が協調的（ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ）なものであるとは考えられない（図８）。この結論は、示差走査熱量測定が示す融解転移の欠如によっても証明される（図９）。注目に値するが、ＤＯＰＧ：ｒｈＧ−ＣＳＦ試料は９５℃まで加熱された後にα−ヘリシティーを回復し得、冷却すればヘリシティーを完全に回復することから９５℃と１０℃との間での周期的温度変化を行なわせることが可能である（図１０参照）。単独のｒｈＧ−ＣＳＦは、上記のような条件下では不可逆的に変性し、溶液から沈澱する。
ＤＭＰＧ及びＤＰＰＧがＧ−ＣＳＦの円二色性に及ぼす作用も調べた。１５０：１の脂質対ｒｈＧ−ＣＳＦ比を用いた。ＤＯＰＧの場合同様、ＤＭＰＧ及びＤＰＰＧもｒｈＴ−ＣＳＦの二次構造を安定化する（図１１〜１３）。
これらのデータは、ｒｈＧ−ＣＳＦとＤＯＰＧ、ＤＭＰＧ及びＤＰＰＧとの相互作用によって、ｒｈＧ−ＣＳＦが単独では不安定となる条件下に前記タンパク質の安定性が向上することを証明している。上記相互作用はｒｈＧ−ＣＳＦの二次及び三次構造を直接安定化する。
実施例４
この実施例では、ｒｈＧ−ＣＳＦとＤＯＰＧとの相互作用をｒｈＧ−ＣＳＦの生物活性に関連するものとして測定した。ｒｈＧ−ＣＳＦのｉｎ ｖｉｔｒｏ活性を、Ｚｓｅｂｏ等，Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ １７２， ｐｐ．１７５−１８４， １９８６に記載されているネズミ骨髄細胞によるＧ−ＣＳＦ依存性［3Ｈ］−チミジン摂取を用いてアッセイした。活性アッセイは総て三重に行なった。ｉｎ ｖｉｖｏ活性は、ハムスターへの皮下注射（ｒｈＧ−ＣＳＦ用量１００μｇ／ｋｇ）及び白血球（ＷＢＣ）計数によって測定した。
１． ｉｎ ｖｉｔｒｏ活性
Ａ．
ＤＯＰＧ不在下及び存在下でのｒｈＧ−ＣＳＦの比活性を測定した。熱処理したｒｈＧ−ＣＳＦ及びＤＯＰＧ：ｒｈＧ−ＣＳＦ試料も試験した。結果を表１にまとめる。
Ｂ．
様々な脂質の、ｒｈＧ−ＣＳＦを凍結乾燥の間安定化する能力も調べた。ｒｈＧ−ＣＳＦを様々な脂質と組み合わせた試料を凍結乾燥し、活性について（先に述べたように）アッセイした。ｒｈＧ−ＣＳＦと混合したＤＯＰＧ、ＤＭＰＧ及びＤＰＰＧは凍結乾燥後、ｒｈＧ−ＣＳＦ生物活性の〜１００％保持を可能にする（図１４）。ｒｈＧ−ＣＳＦ単独では凍結乾燥後に生存できなかった。
２． ｉｎ ｖｉｖｏ活性
脂質不在下及び存在下でのｒｈＧ−ＣＳＦの活性（ＷＢＣ数）を測定した。第０日に、皮下注射（ｒｈＧ−ＣＳＦ用量１００μｇ／ｋｇ）後の活性を測定した。五つの異なる脂質：ｒｈＧ−ＣＳＦ複合体をアッセイしたが、いずれの脂質：ｒｈＧ−ＣＳＦ複合体もｉｎ ｖｉｖｏ活性を保持した（図１５及び１６）。
上述の試験は、負荷電脂質二重層内への挿入がｒｈＧ−ＣＳＦの生物活性に悪影響を及ぼさないことを証明している。加えて、脂質の保護作用によってｒｈＧ−ＣＳＦは凍結乾燥過程の間保護されると考えられる。
実施例５
この実施例では、化学的に改質したＧ−ＣＳＦ（ペグ化Ｇ−ＣＳＦ；ＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦ）及び真核宿主細胞の発現産物として得られたＧ−ＣＳＦ（ＣＨＯ−Ｇ−ＣＳＦ）をその負荷電脂質小胞と相互作用する能力について試験した。ＣＨＯ−Ｇ−ＣＳＦの場合、測定は（先の実施例１に述べた）強度Ｆ／Ｆ0及び発光極大の比較を用いて行なった。脂質対タンパク質のモル比は常に１００：１とした。ＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦの場合は円二色性分析に基づいて測定を行なった。
用いたＣＨＯ−Ｇ−ＣＳＦは、Ｓｏｕｚａの米国特許第４，８１０，６４３号に開示されている、ヒトＧ−ＣＳＦをコードするＤＮＡ配列でチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞をトランスフェクトする組み換えＤＮＡ技術を用いて製造した。ＣＨＯ−Ｇ−ＣＳＦはＰＢＳを媒質としてｐＨ７の０．６ｍｇ／ｍｌ溶液に調製した。ＣＨＯ−Ｇ−ＣＳＦはｒｈＧ−ＣＳＦと同様にしてＤＯＰＧと相互作用することが判明し、その際各試料はＤＯＰＧの存在下により高い螢光強度を示し、かつ発光極大のブルーシフトも示した（図１７及び１８）。従って、ＤＯＰＧとの相互作用は、Ｇ−ＣＳＦの組み換え形態の何らかの特殊性に起因するものではない。
この実験で用いたＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦは、（ＰＥＧ ６０００を用いて）トリ−テトラペグ化した大腸菌由来Ｇ−ＣＳＦであった。先に述べた操作を用いてＤＭＰＧ：ＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦ（１７：１ モル／モル）試料を調製した。ＤＭＰＧ：ＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦ試料は加熱後に二次構造を完全に回復することが判明した（図１９）。ＰＥＧ分子の存在にもかかわらず、この誘導体タンパク質は天然タンパク質と同様にして脂質と相互作用し得た。
上記データは、Ｇ−ＣＳＦと負荷電脂質小胞との相互作用に関連する安定化作用が原核宿主細胞の発現産物として得られるｒｈＧ−ＣＳＦに特有のものではないことを示している。ＭＧＳへと転移（ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎｉｎｇ）可能な化学的に改質されリポソーム小胞と接触したタンパク質、即ちこの実験で用いたＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦ：ＤＭＰＧも安定化作用を示した。
実施例６
この実施例では、ＤＭＰＧ及びＤＰＰＧがＧＭ−ＣＳＦに及ぼす作用を調べた。ＧＭ−ＣＳＦはＢｏｏｎｅの米国特許第５，０４７，５０４号に開示された組み換えヒトＧＭ−ＣＳＦとし、これを、リン酸緩衝食塩液（ＰＢＳ）を媒質としてｐＨ７．０の１ｍｇ／ｍｌ溶液に調製した。１７：１の脂質対ＧＭ−ＣＳＦ比を用い、先に述べた円二色性分析を用いて熱安定性を測定した。ＤＭＰＧ及びＤＰＰＧはＧＭ−ＣＳＦの熱安定性、即ち加熱後の二次構造回復を改善し得る（図２０ａ及び２０ｂ）。
このようなデータは、溶融球状へと転移可能なタンパク質であって、該タンパク質に改善された熱安定性を付与する負荷電脂質小胞と相互作用するものの別の例を示している。
実施例７
この実施例では、ＤＯＰＧ：ＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦ複合体を用いて、腸管内投与後にＧ−ＣＳＦに対する治療応答を高める可能性を評価した。この実験用のＤＯＰＧは実施例１に述べたように調製し、またＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦは実施例５に述べたように調製した。１００μｍｏｌの脂質（７９７μｌ）を真空乾燥し、これに１ｍｌのミリＱ水を添加して脂質の１００ｍＭ溶液を製造した。この溶液を音波処理水浴（Ｌａｂ． Ｓｕｐｐｌｙ Ｉｎｃ．， Ｈｉｃｋｓｖｉｌｌｅ， ＮＹから入手可能なモデルＧ １１２ＳＰ１Ｔ）中で５分間、または該脂質溶液が透明となるまで音波処理した。１ｍＭ ＨＣｌ中の９０ｎｍｏｌの天然ｒｈＧ−ＣＳＦまたはＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦに９μｍｏｌのＤＯＰＧの溶液（９０μｌ）を添加した。溶液を攪拌し、１ｍＭ ＨＣｌで最終体積２ｍｌとした。ラットへの十二指腸内投与では物質を、動物に移植した浸透圧ポンプ内に設置した。この方法では物質が２４時間にわたって放出される。
ｒｈＧ−ＣＳＦとＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦとの両方を脂質と共にかまたは脂質無しで投与した動物の全ＷＢＣ分析の結果を図２１に示す。図２１ａは、天然Ｇ−ＣＳＦの注入では賦形剤対照に比較してＷＢＣ応答が刺激されないことを示している。この添加はｒｈＧ−ＣＳＦに対する動物の治療応答に対してさほどの衝撃とならない。
ペグ化Ｇ−ＣＳＦに対するラットの応答を図２１ｂに示す。この図からは、単独のＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦがＷＢＣ応答を刺激したことが知見され得る。ＷＢＣの上昇は基線量に戻るまでの４８時間維持される。ＤＯＰＧと配合したＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦもＷＢＣ応答を刺激し、その応答はＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦ単独の場合のほぼ２倍である。これらの結果は、注入後に測定したＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦの血清中レベルによって確認できる（図２１）。
上記データは、経口用ＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦ製剤にＤＯＰＧなどのアニオン性脂質を含有させると誘導化タンパク質によって誘起される治療応答が増大すると考えられることを証明するものである。関与する機序は目下のところ判明していない。
実施例８
この実施例では、ＤＭＰＧがＭＧＤＦに及ぼす作用を調べた。ＭＧＤＦは組み換えヒト大腸菌由来ＭＧＤＦ １−１６３とし、これを、１０ｍＭ酢酸ナトリウム、５％ソルビトールを媒質として用いてｐＨ５．０の１．０ｍｇ／ｍｌ溶液に調製した。ＤＭＰＧ：ＭＧＤＦ複合体は実施例１に述べたようにして調製した。
ＤＭＰＧ：ＭＧＤＦ複合体の分析
１． トリプトファン発光スペクトル
ＭＧＤＦ中には１個のトリプトファン残基が有り（５１位）、これを用いてＭＧＤＦとＤＭＰＧ小胞との相互作用を監視した。ＤＭＰＧ：ＭＧＤＦ複合体のトリプトファン螢光を、０．１ｍｇ／ｍｌのＭＧＤＦ濃度を用いて実施例１に述べたようにしてアッセイした。ＤＭＰＧから成る小さな単ラメラ小胞の存在下及び不在下でのＭＧＤＦの螢光スペクトルを図２２に示す。ＭＧＤＦは、ＤＭＰＧ小胞不在下では３３６ｎｍのところに発光極大を有する。ＤＭＰＧが脂質対タンパク質比１００：１で存在すると、ＭＧＤＦトリプトファン螢光は螢光発光極大の３２８ｎｍへのブルーシフトを示す。ＤＭＰＧの存在下に発せられる螢光が短波長であることにより、トリプトファンが天然タンパク質に比べてより疎水性の環境に有ることが示唆される。また、図２３に示したように、螢光シフトはＤＭＰＧ対ＭＧＤＦのモル比に左右され、その際ＤＭＰＧ対ＭＧＤＦ比が８〜３０：１に達すると膜内への挿入が検出可能となる。螢光の変化はモル比１００：１以上において最大となり、またｐＨ値を７．０から５．０に下げると、ＭＧＤＦはＤＭＰＧ小胞に対して明らかにより高い親和性を示す。このことは、或る種のアミノ酸（例えばヒスチジン）の滴定を用いて相互作用を促進または抑制し得ることを示唆している。
２． ヨウ化物消光実験
この実験では、ＭＧＤＦ及びＤＭＰＧ：ＭＧＤＦ組成物（ＤＭＰＧ対ＭＧＤＦ比１００：１）を用いて、実施例１に述べたヨウ化物消光実験を行なった。データのＳｔｅｒｎ−Ｖｏｌｍｅｒプロットを図２４に示す。ＤＭＰＧ小胞不在下では、ＭＧＤＦ螢光はＫＩによって有効に消光される。これに対して、ＤＭＰＧ存在下ではヨウ化物はトリプトファンに作用できず、このことから、ＭＧＤＦのトリプトファン保有部分はＤＭＰＧ二重層内に埋没しているであろうと考えられる。
上述の分析から、Ｇ−ＣＳＦ及びＧＭ−ＣＳＦの場合同様、ＭＧＤＦもＤＭＰＧのような不飽和リン脂質と密接に相互作用し得ることは明らかである。ＤＭＰＧ小胞の存在下に、ＭＧＤＦトリプトファンは水溶性螢光消光剤から保護される。総合的にみて、データはＭＧＤＦがＤＭＰＧから成る膜内へ挿入され得ることを示している。膜内への挿入は（ＤＭＰＧ対ＭＧＤＦの）比が８：１に到達すると検出可能となり、前記比の数字はタンパク質の挿入部分を囲繞する脂質の数を表わし得る。
実施例９
この実施例では、ＤＭＰＧ：ＭＧＤＦの相互作用がタンパク質の安定性に及ぼす作用を調べた。熱安定性、尿素の存在下での安定性、及びＭＧＤＦ（±ＤＭＰＧ）の貯蔵寿命安定性を評価した。各検査では、１００：１のＤＭＰＧ：ＭＧＤＦモル比を使用した。
１．熱安定性
ＭＧＤＦ単独の又はＤＭＰＧ小胞内に挿入したＭＧＤＦの円二色性（２２２ｎｍでのＣＤ）を、実施例３，図１０に記載したように９５℃〜１０℃の熱サイクルの関数として監視した。残留ＣＤ％とは、各サイクル（１サイクルは１０℃−＞９５℃−＞１０℃）の後に（１０℃で）検出されたＣＤの量を指定の組成物の非加熱試料のＣＤと比較した値を指す。ＭＧＤＦは３サイクル加熱するとヘリシティーの７０％以上を喪失するが、ＤＭＰＧ：ＭＧＤＦでは同一条件下で元のαヘリシティーが完全に保持される（図２５を参照されたい）。
２．尿素の存在下での安定性
尿素は、タンパク質を変性させ得るカオトロピック試薬である。ＭＧＤＦ（±ＤＭＰＧ）の平衡変性を、蛍光（即ち三次構造の測定）及び円二色性（即ち二次構造の測定）により監視した。図２６に示すように、タンパク質の三次構造が喪失すると、トリプトファン残基が水相により露出されてＭＧＤＦの発光波長がより長い波長にシフトし、二次構造が喪失すると、αヘリシティーが喪失するために平均残分楕円率（ｍｅａｎ ｒｅｓｉｄｕｅ ｅｌｉｐｉｃｉｔｙ）（ＭＲＥ）の負値がちいさくなる。ＤＭＰＧの不在下では、三次構造を５０％喪失させるのに約３Ｍ尿素が必要であるが、ＤＭＰＧの存在下では５０％の構造を喪失させるのに８Ｍの尿素が必要である。同様に、ＤＭＰＧの不在下でＭＧＤＦ ＭＲＥの５０％を喪失させるには、ＤＭＰＧの存在下での９Ｍ尿素に対し７Ｍ尿素が必要である。
３．貯蔵寿命安定性
以下の表２に示す条件下で大腸菌ＭＧＤＦ １−１６３（±ＤＭＰＧ）を貯蔵し、次いで１００ｍＭリン酸緩衝液、１０％エタノール、０．２％Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ６．９を移動相とするＴｏｓｏ−ＨａａｓＧ３０００ＳＷＸＬカラムをもちいるサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）で試験した。試料をエタノール及びＴｗｅｅｎ−２０で希釈して、移動相で使用したのと同一濃度とし、試験毎に１０−２０μｇの試料を注入した。カラム温度は４０℃に維持した。生成する凝集ＭＧＤＦは非凝集タンパク質よりも早く溶離し、凝集体ピーク及びモノマーピークの曲線下の面積を測定することによりこのＭＧＤＦを定量する。データでは凝集体ピークにおける総ＭＧＤＦ％を示す。
上記データは、ＭＧＤＦがＤＭＰＧ小胞と相互作用すると、ＭＧＤＦだけでは不安定な条件下でのタンパク質の安定性が高まる。この相互作用により、尿素のような変性剤の存在下でＭＧＤＦの二次構造及び三次構造を直接安定化し、様々な温度でのＭＧＤＦの貯蔵寿命はかなり改善される。
実施例１０
この実施例では、化学的に改質させたＭＧＤＦ １−１６３（モノＰＥＧ化（２０ｋＤａ）ＭＧＤＦ １−１６３（ＰＥＧ−ＭＧＤＦ））と負電荷脂質小胞との相互作用能力を試験した。ＰＥＧ−ＭＧＤＦについては、（上述の実施例１及び８に記載したように）Ｆ／Ｆ0強さ及び発光最大値の比較を用いて測定を行った。いずれの場合も、脂質：タンパク質のモルは１００：１であった。
上記実験で使用したＰＥＧ−ＭＧＤＦは、モノメトキシ−ポリエチレングリコールアルデヒド（ＭｅＰＥＧ）（平均分子量：２０ｋＤａ）を還元的アルキル化において用いたモノＰＥＧ化（２０ｋＤａ）大腸菌由来ＭＧＤＦ １−１６３である。４−２０％２プレキャスト勾配ゲル（ＮＯＶＥＸ）を用いるドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動により、ＰＥＧ−ＭＧＤＦ接合体の相同性を調べた。４６．９ｋＤａタンパク質の位置に対応する主要バンド一つが判明した。
次いで、上述の手順を用いて、ＤＭＰＧ：ＰＥＧ−ＭＧＤＦ（１００：１モル／モル）試料を調製した。ＤＭＰＧ：ＰＥＧ−ＭＧＤＦ試料は加熱後に二次構造を完全に回復することが判明した（図２７）。この誘導体化タンパク質は、ＰＥＧ分子が存在するにもかかわらず、天然タンパク質と同様に脂質と相互作用し得た。
このデータは、ＭＧＤＦと負電荷脂質小胞との相互作用に関連する発光最大シフトが、原核生物宿主細胞の発現産物として得られたＭＧＤＦのみに特有のものではないことを示している。科学的に改質させたｒｈＧ−ＣＳＦで実証されたように、ＤＭＰＧ：ＰＥＧ−ＭＧＤＦも発光シフトを示した。データは、科学的に改質させたＭＧＤＦがＤＭＰＧからなる膜内に進入し得ることを示している。
実施例１１
この実施例では、ＤＭＰＧ：ＰＥＧ−ＭＧＤＦの相互作用がガラスバイアルへのＭＧＤＦ吸着の問題に及ぼす作用を評価した。約１１ｐｇ／ｍｌの［125Ｉ］−ＰＥＧ−ＭＧＤＦを濃度の異なる非標識ＰＥＧ−ＭＧＤＦと合わせて、指定のＰＥＧ−ＭＧＤＦ最終濃度にした（図２８を参照されたい）。示されている場合にはＤＭＰＧを希釈液に含めた（図２７も参照されたい）。３ｃｃのガラスバイアル（Ｋｉｍｂｌｅ）内に１ｍＬの調製物を入れた。室温で１８時間インキュベートした後にガラスバイアルから回収できる放射性標識ＭＧＤＦの量をカウントして、ＰＥＧ−ＭＧＤＦの回収％を調べた。図２８に示すように、ＰＥＧ−ＭＧＤＦはタンパク質濃度が下がると容易にガラス容器に吸着し、吸着は０．１−５０μｇ／ｍｌの範囲で特に高い。対照的に、ＤＭＰＧ：ＰＥＧ−ＭＧＤＦ試料は、０．１−５０μｇ／ｍｌのＰＥＧ−ＭＧＤＦの範囲では、ガラスに殆ど吸着しない。
実施例１２
この実施例では、ＤＭＰＧ：ＭＧＤＦ １−１６３及びＤＭＰＧ：ＰＥＧ−ＭＧＤＦ １−１６３の相互作用がＭＧＤＦ １−１６３及びＰＥＧ−ＭＧＤＦ １−１６３の生物活性に及ぼす作用を調べた。ＭＧＤＦ １−１６３は大腸菌に由来し、脂質：タンパク質の比率は１００：１であった。１００μｇ／ｋｇ及び３００μｇ／ｋｇのＭＧＤＦ、ＰＥＧ−ＭＧＤＦ、ＤＭＰＧ：ＭＧＤＦ又はＤＭＰＧ：ＰＥＧ−ＭＧＤＦで処理したマウスの血小板数を測定し、結果を図３１に示す。正常雌Ｂａｌｂ／ｃマウスの皮下に１日１回で８日間、各形態を指定濃度で投与した。最後の注射から２４時間後に、尾静脈で切除した小側面（ｌａｔｅｒａｌ）由来の試験血液を採取した。Ｓｙｓｍｅｘ電子血液細胞分析機（Ｂａｘｔｅｒ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ， Ｉｎｃ． Ｉｒｖｉｎｅ， ＣＡ）を用いて血液細胞を分析した。データは、４匹の動物の測定値の平均±この平均の標準誤差として示す。全白血球細胞数又は赤血球細胞数のような他の血液細胞パラメーターは上記処置の鋭気要を受けなかった（データは示さず）。結果は、大腸菌ＭＧＤＦ １−１６３をＰＥＧ化すると分子のｉｎ ｖｉｖｏ活性が増したことを示している。更に重要であるが、上記検査は、負電荷脂質の二層内への挿入が様々なＭＧＤＦ形態の生物活性に悪影響を及ぼさないことを示している。
配列表
配列番号：１
配列の長さ：１３４２
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｃＤＮＡ
配列の特徴
特徴を表す記号：ＣＤＳ
存在位置：９９．．．６２１
配列
配列の長さ：１７４
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
配列
Claims (24)
- 溶融小球状態に変化し得る、明細書に記載の図２９のアミノ酸配列において７〜１５１番目のアミノ酸配列を含むＭＧＤＦと、負に荷電したリン脂質から構成されたインタクトなリン脂質リポソーム小胞との混合によって形成されたリポソーム−ＭＧＤＦ複合体から成り、該ＭＧＤＦの一部分だけが該リポソーム小胞の脂質部分に挿入されていることを特徴とする組成物。
- 前記組成物がｐＨ３．０〜７．５を有し、少なくとも１０：１の脂質対ＭＧＤＦ比を有することを特徴とする請求項１に記載の組成物。
- 前記リポソーム小胞が、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、タマゴホスファチジルグリセロール、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、タマゴホスファチジルエタノールアミン、ジオレオイルホスファチジン酸（ＤＯＰＡ）、ジミリストイルホスファチジン酸（ＤＭＰＡ）、ジパルミトイルホスファチジン酸（ＤＰＰＡ）、ジオレオイルホスファチジルセリン（ＤＯＰＳ）、ジミリストイルホスファチジルセリン（ＤＭＰＳ）、ジパルミトイルホスファチジルセリン（ＤＰＰＳ）、タマゴホスファチジルセリン、リソホスファチジルグリセロール、リソホスファチジルエタノールアミン、及び、リソホスファチジルセリンから成るグループから選択されることを特徴とする請求項１または２に記載の組成物。
- ＭＧＤＦが天然ヒトＭＧＤＦであるかまたは原核性もしくは真核性宿主細胞の発現産物として得られることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
- ＭＧＤＦが、
ＭＧＤＦ１−３３２ 図２９のアミノ酸１−３３２
ＭＧＤＦ１−１９１ 図２９のアミノ酸１−１９１
ＭＧＤＦ１−１８３ 図２９のアミノ酸１−１８３
ＭＧＤＦ１−１７４ 図２９のアミノ酸１−１７４
ＭＧＤＦ１−１６３ 図２９のアミノ酸１−１６３
ＭＧＤＦ１−１５３ 図２９のアミノ酸１−１５３
ＭＧＤＦ１−１５２ 図２９のアミノ酸１−１５２
ＭＧＤＦ１−１５１ 図２９のアミノ酸１−１５１
ＭＧＤＦ７−３３２ 図２９のアミノ酸７−３３２
ＭＧＤＦ７−１９１ 図２９のアミノ酸７−１９１
ＭＧＤＦ７−１８３ 図２９のアミノ酸７−１８３
ＭＧＤＦ７−１７４ 図２９のアミノ酸７−１７４
ＭＧＤＦ７−１６３ 図２９のアミノ酸７−１６３
ＭＧＤＦ７−１５３ 図２９のアミノ酸７−１５３
ＭＧＤＦ７−１５２ 図２９のアミノ酸７−１５２及び
ＭＧＤＦ７−１５１ 図２９のアミノ酸７−１５１
からなる群から選択される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。 - ＭＧＤＦがポリエチレングリコールによってＰＥＧ付加処理されていることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物。
- ＭＧＤＦがモノ−ＰＥＧ化ＭＧＤＦ（ｍＰＥＧ−ＭＧＤＦ）であることを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
- ＰＥＧ基がＮ末端に結合していることを特徴とする請求項６又は７に記載の組成物。
- 更に医薬として許容される担体を含有することを特徴とする請求項１〜８のいずれか１項に記載の組成物。
- 前記ＭＧＤＦが大腸菌由来のＭＧＤＦであり、前記リポソーム小胞がＤＭＰＧであり、前記組成物が１００：１のＤＭＰＧ対ＭＧＤＦ比及びｐＨ５．０を有しかつ１０ｍＭの酢酸ナトリウム及び５％のソルビトールを含有することを特徴とする請求項１〜９のいずれか１項に記載の組成物。
- 前記ＭＧＤＦがモノ−ＰＥＧ化した大腸菌由来のＭＧＤＦ（ｍＰＥＧ−ＭＧＤＦ）であり、前記リポソーム小胞がＤＭＰＧであり、組成物が１００：１のＤＭＰＧ対ｍＰＥＧ−ＭＧＤＦ比及びｐＨ５．０を有しかつ１０ｍＭの酢酸ナトリウム及び５％のソルビトールを含有することを特徴とする請求項１〜１０のいずれか１項に記載の組成物。
- 前記ＭＧＤＦがＣＨＯ由来のＭＧＤＦであり、前記リポソーム小胞がＤＭＰＧであり、前記組成物が１００：１のＤＭＰＧ対ＭＧＤＦ比及びｐＨ５．０を有しかつ１０ｍＭの酢酸ナトリウム及び５％のソルビトールを含有することを特徴とする請求項１〜９のいずれか１項に記載の組成物。
- 溶融小球状態に変化し得る、明細書に記載の図２９のアミノ酸配列において７〜１５１番目のアミノ酸配列を含むＭＧＤＦと負に荷電したインタクトなリン脂質リポソーム小胞とを混合し、前記ＭＧＤＦの一部分だけを前記リポソーム小胞の脂質部分に挿入し、リポソーム−ＭＧＤＦ組成物を得る段階から成るリポソーム−ＭＧＤＦ組成物の調製方法。
- 前記組成物がｐＨ３．０〜７．５を有し、少なくとも１０：１の脂質対ＭＧＤＦ比を有することを特徴とする請求項１３に記載の方法。
- 前記リポソーム小胞が、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、タマゴホスファチジルグリセロール、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、タマゴホスファチジルエタノールアミン、ジオレオイルホスファチジン酸（ＤＯＰＡ）、ジミリストイルホスフアチジン酸（ＤＭＰＡ）、ジパルミトイルホスファチジン酸（ＤＰＰＡ）、ジオレオイルホスファチジルセリン（ＤＯＰＳ）、ジミリストイルホスファチジルセリン（ＤＭＰＳ）、ジパルミトイルホスファチジルセリン（ＤＰＰＳ）、タマゴホスファチジルセリン、リソホスファチジルグリセロール、リソホスファチジルエタノールアミン、及び、リソホスファチジルセリンから成るグループから選択された脂質から調製されることを特徴とする請求項１３または１４に記載の方法。
- ＭＧＤＦが天然ヒトＭＧＤＦであるかまたは原核性もしくは真核性宿主細胞の発現産物として得られることを特徴とする請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の方法。
- ＭＧＤＦが大腸菌又はＣＨＯ由来の発現産物である、請求項１３〜１６のいずれか１項に記載の方法。
- ＭＧＤＦが、
ＭＧＤＦ１−３３２ 図２９のアミノ酸１−３３２
ＭＧＤＦ１−１９１ 図２９のアミノ酸１−１９１
ＭＧＤＦ１−１８３ 図２９のアミノ酸１−１８３
ＭＧＤＦ１−１７４ 図２９のアミノ酸１−１７４
ＭＧＤＦ１−１６３ 図２９のアミノ酸１−１６３
ＭＧＤＦ１−１５３ 図２９のアミノ酸１−１５３
ＭＧＤＦ１−１５２ 図２９のアミノ酸１−１５２
ＭＧＤＦ１−１５１ 図２９のアミノ酸１−１５１
ＭＧＤＦ７−３３２ 図２９のアミノ酸７−３３２
ＭＧＤＦ７−１９１ 図２９のアミノ酸７−１９１
ＭＧＤＦ７−１８３ 図２９のアミノ酸７−１８３
ＭＧＤＦ７−１７４ 図２９のアミノ酸７−１７４
ＭＧＤＦ７−１６３ 図２９のアミノ酸７−１６３
ＭＧＤＦ７−１５３ 図２９のアミノ酸７−１５３
ＭＧＤＦ７−１５２ 図２９のアミノ酸７−１５２及び
ＭＧＤＦ７−１５１ 図２９のアミノ酸７−１５１
からなる群から選択される、請求項１３〜１７のいずれか１項に記載の方法。 - ＭＧＤＦがポリエチレングリコールによってＰＥＧ付加処理されていることを特徴とする請求項１３〜１８のいずれか１項に記載の方法。
- ＭＧＤＦがモノ−ＰＥＧ化ＭＧＤＦ（ｍＰＥＧ−ＭＧＤＦ）であることを特徴とする請求項１３〜１９のいずれか１項に記載の方法。
- ＰＥＧ基をＮ末端に結合させることを特徴とする請求項１９又は２０に記載の方法。
- 前記組成物が医薬として許容される担体を含有することを特徴とする請求項１３〜２１のいずれか１項に記載の方法。
- 前記挿入が前記脂質小胞の脂質二重層内への前記ＭＧＤＦの挿入を包含することを特徴とする請求項１３〜２２のいずれか１項に記載の方法。
- 前記リポソーム−ＭＧＤＦ組成物を前記ＭＧＤＦの二次構造の変性に逆らって直接的に安定化することを特徴とする請求項１３〜２３のいずれか１項に記載の方法。
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| US7338933B2 (en) * | 2004-01-08 | 2008-03-04 | Neose Technologies, Inc. | O-linked glycosylation of peptides |
| US20070081986A1 (en) * | 2005-10-07 | 2007-04-12 | Shunji Tomatsu | Beta-glucuronidase with an attached short peptide of acidic amino acids |
| WO2006010143A2 (en) * | 2004-07-13 | 2006-01-26 | Neose Technologies, Inc. | Branched peg remodeling and glycosylation of glucagon-like peptide-1 [glp-1] |
| WO2006031811A2 (en) * | 2004-09-10 | 2006-03-23 | Neose Technologies, Inc. | Glycopegylated interferon alpha |
| US20080176790A1 (en) | 2004-10-29 | 2008-07-24 | Defrees Shawn | Remodeling and Glycopegylation of Fibroblast Growth Factor (Fgf) |
| US9029331B2 (en) * | 2005-01-10 | 2015-05-12 | Novo Nordisk A/S | Glycopegylated granulocyte colony stimulating factor |
| DE102005012457B3 (de) | 2005-03-18 | 2006-08-31 | Basf Coatings Ag | Epoxid- und Silangruppen enthaltende Oligomere und Polymere, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung |
| US20070154992A1 (en) * | 2005-04-08 | 2007-07-05 | Neose Technologies, Inc. | Compositions and methods for the preparation of protease resistant human growth hormone glycosylation mutants |
| EP1891231A4 (en) * | 2005-05-25 | 2011-06-22 | Novo Nordisk As | GLYCOPEGYLATED FACTOR IX |
| KR100770704B1 (ko) | 2005-08-04 | 2007-10-29 | 삼성전자주식회사 | 픽쳐 스킵 방법 및 장치 |
| US20070105755A1 (en) * | 2005-10-26 | 2007-05-10 | Neose Technologies, Inc. | One pot desialylation and glycopegylation of therapeutic peptides |
| WO2007056191A2 (en) | 2005-11-03 | 2007-05-18 | Neose Technologies, Inc. | Nucleotide sugar purification using membranes |
| ES2516694T3 (es) * | 2006-07-21 | 2014-10-31 | Ratiopharm Gmbh | Glicosilación de péptidos a través de secuencias de glicosilación con unión en O |
| US8969532B2 (en) * | 2006-10-03 | 2015-03-03 | Novo Nordisk A/S | Methods for the purification of polypeptide conjugates comprising polyalkylene oxide using hydrophobic interaction chromatography |
| US20100041872A1 (en) * | 2006-10-04 | 2010-02-18 | Defrees Shawn | Glycerol linked pegylated sugars and glycopeptides |
| KR20100016160A (ko) * | 2007-04-03 | 2010-02-12 | 바이오제너릭스 에이지 | 글리코페길화 ｇ―ｃｓｆ를 이용하는 치료 방법 |
| EP2162535A4 (en) * | 2007-06-04 | 2011-02-23 | Novo Nordisk As | O-linked glycosylation using N-acetylglucosamine transferases |
| WO2008154639A2 (en) * | 2007-06-12 | 2008-12-18 | Neose Technologies, Inc. | Improved process for the production of nucleotide sugars |
| DE202008017456U1 (de) | 2007-08-27 | 2009-08-27 | Biogenerix Ag | Flüssig-Formulierung von G-CSF-Konjugaten |
| US8207112B2 (en) * | 2007-08-29 | 2012-06-26 | Biogenerix Ag | Liquid formulation of G-CSF conjugate |
| US7985727B1 (en) | 2007-09-20 | 2011-07-26 | Abbott Cardiovascular Systems Inc. | Apo A-I mimetic peptides and methods of treatment |
| US7985728B1 (en) | 2007-09-20 | 2011-07-26 | Abbott Cardiovascular Systems Inc. | Sustained release of Apo A-I mimetic peptides and methods of treatment |
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| US8044021B2 (en) * | 2007-09-20 | 2011-10-25 | Abbott Cardiovascular Systems Inc. | Sustained release of apo A-I mimetic peptides and methods of treatment |
| US9173890B2 (en) * | 2007-09-20 | 2015-11-03 | Abbott Cardiovascular Systems Inc. | Sustained release of Apo A-I mimetic peptides and methods of treatment |
| CA2711503A1 (en) * | 2008-01-08 | 2009-07-16 | Biogenerix Ag | Glycoconjugation of polypeptides using oligosaccharyltransferases |
| KR101582841B1 (ko) | 2008-02-27 | 2016-01-11 | 노보 노르디스크 에이/에스 | 콘쥬게이트된 인자 ｖｉｉｉ 분자 |
| EP2673296B1 (en) | 2011-02-07 | 2018-10-24 | Cerenis Therapeutics Holding SA | Lipoprotein complexes and manufacturing and uses thereof |
| AU2012328524B2 (en) | 2011-10-28 | 2017-05-18 | Excelse Bio, Inc. | Protein formulations containing amino acids |
| EP2819652A1 (en) | 2012-02-27 | 2015-01-07 | Epitarget As | Use of a particulate immunomodulator in cancer therapy |
Family Cites Families (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4515736A (en) * | 1983-05-12 | 1985-05-07 | The Regents Of The University Of California | Method for encapsulating materials into liposomes |
| US4744989A (en) * | 1984-02-08 | 1988-05-17 | E. R. Squibb & Sons, Inc. | Method of preparing liposomes and products produced thereby |
| US4766106A (en) * | 1985-06-26 | 1988-08-23 | Cetus Corporation | Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation |
| US4810643A (en) * | 1985-08-23 | 1989-03-07 | Kirin- Amgen Inc. | Production of pluripotent granulocyte colony-stimulating factor |
| JPH03505576A (ja) * | 1988-05-16 | 1991-12-05 | ネクスター・フアーマシユーテイカルズ・インコーポレイテツド | 有機化合物に関する改良 |
| EP0393707B1 (en) * | 1989-04-21 | 1994-10-26 | Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. | Bioactive compounds associated with liposomes and their use in pharmaceutical preparations |
| AU6428890A (en) * | 1989-09-12 | 1991-04-18 | Regents Of The University Of California, The | Therapeutic peptides and proteins |
| JPH03127622A (ja) * | 1989-10-09 | 1991-05-30 | Green Cross Corp:The | ｐＨ感受性リポソーム |
| US5225212A (en) * | 1989-10-20 | 1993-07-06 | Liposome Technology, Inc. | Microreservoir liposome composition and method |
| JPH0482839A (ja) * | 1990-07-20 | 1992-03-16 | Green Cross Corp:The | 蛋白質類・脂質小体複合体 |
| JPH06247842A (ja) * | 1993-02-23 | 1994-09-06 | Green Cross Corp:The | リポソーム組成物の製造方法 |
| WO1995009611A2 (en) * | 1993-10-06 | 1995-04-13 | Amgen Inc. | Stable protein: phospholipid compositions and methods |
-
1995
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