JP3875366B2 - 還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ｎａｄｈ）または還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドフォスフェート（ｎａｄｐｈ）の測定方法 - Google Patents
還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ｎａｄｈ）または還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドフォスフェート（ｎａｄｐｈ）の測定方法 Download PDFInfo
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- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、多くの酵素の補酵素として働く還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以下「ＮＡＤＨ」という）または還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドフォスフェート（以下「ＮＡＤＰＨ」という）の測定方法およびＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを補酵素とする酵素の活性の測定方法並びに酵素基質濃度の測定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨは、各種酵素反応において補酵素として働くことが知られている。例えば、ＮＡＤＨ等は、ある種の脱水素酵素が触媒するαヒドロキシ酸から対応するケトン酸への酸化の際に、補酵素として働く。この具体例の一つとして、下記の反応式（化１）で表される乳酸のピルビン酸への酸化をあげることができる。
【０００３】
（化１）
ＣＨ3−ＣＨＯＨ−ＣＯＯＨ＋ＮＡＤ+ → ＣＨ3ＣＯ−ＣＯＯＨ＋ＮＡＤＨ
【０００４】
また、ＮＡＤＨは、ＧＬＤＨ（グルタメート・デヒドロゲナーゼ）の存在下におけるアンモニウム塩による２−オキソグルタレートのＬ−グルタメートへの変換において補酵素として作用する。
【０００５】
このようなＮＡＤＨ等の補酵素としての性質を利用し、酵素活性や酵素基質濃度を調べるために、ＮＡＤＨ等の濃度測定が臨床検査の分野において広く行われている。たとえば、前記ＧＬＤＨの場合では、残留ＮＡＤＨを測定すれば、反応媒体中のアンモニアを定量することができる。すなわち、基質がＮＡＤ+ （またはＮＡＤＰ+ ）の存在下酵素反応によって酸化される場合は、ＮＡＤＨ（またはＮＡＤＰＨ）が生成する。また、基質がＮＡＤＨ（またはＮＡＤＰＨ）の存在下酵素反応によって還元される場合は、ＮＡＤ+ （またはＮＡＤＰ+ ）が生成する。したがって、前者の場合であればＮＡＤＨ（またはＮＡＤＰＨ）の増加量を、後者の場合であればＮＡＤＨ（またはＮＡＤＰＨ）の減少量を測定することにより、酵素基質濃度の変動やＮＡＤＨ等を補酵素とする酵素の活性を測定することができる。
【０００６】
ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの測定方法は、光学的手法と電気化学的手法の２種類に大別できる。
【０００７】
光学的手法としては、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨ自体の紫外部の光吸収（極大吸収波長：３４０ｎｍ）を直接測定する方法、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨ自体の蛍光を直接測定する方法、触媒の存在下でＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨとレサズリンの反応によって生成するレゾルフィンの蛍光を測定する方法などが知られている。
【０００８】
電気化学的手法としては、作用極と対極の２つの電極を用い、前記作用極に印加してＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを電解酸化し、その際に前記作用極と該対極との間に通ずる電流を測定する方法が知られている。この電気化学的手法は、光学的手法に対して比較的簡易で安価な測定装置を用いて迅速に測定が可能であるという長所を備えているが、光学的手法に比べて感度が低いという欠点を有する。したがって、従来から、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの電気化学的な測定方法において、感度の向上を目的とした様々な試みが行われている。
【０００９】
例えば、特公昭５８−１６６９４号公報には、ＮＡＤＨが電極表面に直接化学結合で固定化された酵素電極が開示されている。この技術は、電極表面上で直接酸化されるべきＮＡＤＨを、化学結合で電極表面上に固定することにより、ＮＡＤＨと電極表面とを常に近接させて酸化効率を向上させることで、感度の向上をが図るものである。
【００１０】
また、特開昭５６−３５０５０号公報には、ＮＡＤＨを直接電解酸化するのではなく、メルドラブルーをメディエータとして用い、前記メディエータの還元型を電解酸化する際の電流値から間接的にＮＡＤＨを測定する技術が開示されている。この技術では、メディエータの酸化還元サイクルを利用することで感度の向上を図っている。
【００１１】
そして、特表平１−５０３４０９号公報には、活性化炭素粒子または活性化グラファイト粒子を天然樹脂または合成樹脂等の結合剤で結合した多孔質かつ不均質の樹脂結合層からなる活性化炭素電極を使用したＮＡＤＨの電気化学的測定方法が開示されている。この技術における感度の向上の原因は明瞭ではないが、活性化炭素または活性化グラファイトの多孔質で不均質な構造が、電極の実効面積を増大させていることが原因と推察される。さらに、活性化炭素素または活性化グラファイトがＮＡＤＨとの適合性に優れ、他の材質の電極に比べて速やかにＮＡＤＨを酸化できることも感度向上の一因と推察される。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
これらのＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの測定方法のなかで、光学的手法は、電気化学的手法に比べ、複雑で高価な測定装置を必要とする。また、前記光学的手法のなかで、ＮＡＤＨ等の紫外部の光吸収を測定する方法では、光の波長領域が紫外部であるために、光源および検出器ともに、安価で耐久性に優れたものを得難いという問題がある。また、前記ＮＡＤＨ等自体の蛍光を測定する方法若しくはＮＡＤＨ等との反応で生成したレゾルフィンの蛍光を測定する方法では、例えば尿を測定対象とする場合、共存物質として含まれるタンパク質やビリルビン等の蛍光物質の影響を避け難いという問題がある。
【００１３】
前記電気化学的手法は、先に述べたように、簡易で安価な測定装置を使用して、簡便に測定を行うことができるという利点がある。しかし、前記各種の試みによって感度の向上が図られてはいるものの、依然、検出下限濃度は、０．１〜１ｍｍｏｌ／Ｌ程度と充分でなく、感度の面で光学的手法には及ばない。酵素活性測定のためのＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの検出下限濃度としては１０μｍｏｌ／Ｌ程度が望まれるが、感度が低い従来の電気化学的な測定方法では、酵素活性や酵素基質濃度の測定を行うことは、実質的に困難である。
【００１４】
そこで、本発明の目的は、高い感度でＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの濃度を測定することが可能なＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの電気化学的測定方法を提供することである。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
前記目的を達成するために、本発明のＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの測定方法は、少なくとも作用極および対極の２つの電極を用いてＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの濃度を電気化学的に測定する方法であって、前記作用極に対しＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの電解が起こらない電位範囲で一定電位を印加し、その後、前記作用極にＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの電解が起こる電位範囲でパルス電位を印加し、このパルス電位を印加してから１０〜１０００ミリ秒後に前記作用極と前記対極との間に通ずる電流を測定する方法である。
【００１６】
本発明の測定方法において、前記測定方法における一連の操作を１サイクルとし、この操作を２サイクル以上繰り返し、各サイクルで測定した電流の平均値を算出することが好ましい。
【００１７】
この際、２サイクル以上の操作の繰り返しを時間的に連続して行うことが好ましい。これにより、一つのサイクルの終点とつぎのサイクル始点において、ＮＡＤＨ等の電解が起こる電位範囲のパルス電位からＮＡＤＨ等の電解が起こらない電位範囲の一定電位へ実質的に瞬間に電位が変動して前記一定電位に保持されることとなり、これによって電極が安定化されるからである。
【００１８】
すなわち、図２において、Ｔが１サイクルの時間、τがパルス電位印加時間、(Ｔ−τ)が前記一定電位印加時間となる。上記のように、パルス電位から一定電位へ実質的に瞬間に電位を変動させることで電極が安定化されることがあるので、時間的に連続してサイクルを繰り返し、測定した電流の平均値を算出して濃度に換算する場合では、(Ｔ−τ)は電極が安定化するのに必要な時間とするのが望ましい。なお、図２において、Ｅｉは前記一定電位を示し、△Ｅはパルス電位と一定電位の差を示し、Ｉは作用極と対極との間に流れる電流を示す。
【００１９】
前記一定電位は、−５００〜２００ｍＶ（ｖｓ．Ａｇ／ＡｇＣｌ）であるのが望ましく、前記一定電位の印加時間は、電極が安定する時間が好ましく、具体的には１〜１２０秒の範囲が好ましく、特に好ましくは２〜１０秒である。また、前記パルス電位は、１００〜１０００ｍＶ（ｖｓ．Ａｇ／ＡｇＣｌ）であるのが望ましい。前記一定電位、前記一定電位印加時間および前記パルス電位は、測定試料の温度、ｐＨ、使用する電極の材質と種類などによって好適な値が変動するから、必要な感度、Ｓ／Ｎ比などから最適な組み合わせを選ぶことが好ましい。パルス電位を印加してから作用極と対極の間を通ずる電流を測定するまでの時間は、前記所定の範囲の時間であるが、この時間も、測定試料の温度、ｐＨ、使用する電極の材質と種類などによって好適な値が変動するから、必要な感度、Ｓ／Ｎ比などから最適な値を選ぶことが好ましい。また、前記作用極の材質は特に限定されるものではなく、必要に応じて、プラスティックフォームドカーボン、グラッシーカーボン、金、白金、銀など従来公知の材質の電極を使用することができる。このなかで、プラスティックフォームドカーボンが好ましい。前記作用極の形態についても同様であって、プローブ型の固体電極であっても良いし、印刷技術を用いた電極であってもよく、カーボンペースト電極のようなペースト電極であっても良い。一方、対極についても、特に制限するものではなく、従来公知のものを使用することができ、例えば、白金電極、グラッシーカーボン、金、銀、印刷カーボン、カーボンペースト等が使用できる。また、本発明において、参照電極を使用することが好ましく、例えば、銀／塩化銀（Ａｇ／ＡｇＣｌ）電極などを使用できる。
【００２０】
また、様々な妨害物質の影響を回避したい場合には、前記作用極を妨害除去膜によって被覆することが好ましい。前記妨害除去膜とは、電極の汚染、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨ以外の電気化学活性種などの影響を低減させるための膜であって、例えば、血液、尿、随液などの体液を測定試料として使用する場合に電極表面へタンパク質が吸着するのを妨ぐための透析膜、セルロースアセテート膜、ナフィオン膜等があげられる。
【００２１】
本発明の測定方法のＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの電気化学的な濃度測定では、検出下限１０μｍｏｌ／Ｌの実現が可能である。したがって、本発明の測定方法によりＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを測定することにより、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを補酵素とする酵素の活性測定や酵素基質濃度測定が可能となる。
【００２２】
【発明の実施の形態】
本発明の実施形態を実施例により比較例と併せて説明する。
【００２３】
なお、以下の実施例および比較例における測定条件は、以下のとおりである。まず、電極は、通常の３電極系（プローブ型固体電極）を用いた。作用極としては、プラスティックフォームドカーボン（ＰＦＣ）電極（φ３ｍｍ：ビー・エー・エス株式会社製）を用い、対極としては、白金電極（φ１ｍｍ：市村金属株式会社製）を、参照電極としては、銀／塩化銀（Ａｇ／ＡｇＣｌ）電極（ビー・エー・エス社製）をそれぞれ用いた。作用極表面は、タンパクなどの妨害除去のため、透析膜（Ｓｅａｍｌｅｓｓ Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ Ｔｕｂｉｎｇ、輸入販売元：三光純薬社）で被覆した。測定溶液は、０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液をベース溶液として、ＮＡＤＨ濃度が５〜２００μｍｏｌ／Ｌとなるように調整したものを用いた。測定溶液の温度は、測定中２５℃で一定となるように調整した。
【００２４】
（実施例１）
上記の条件の下、パルス電位を用いたＮＡＤＨの測定を行った。パルス電位印加前に作用極へ印加しておく初期電位は、−２５０ｍＶ（ｖｓ．Ａｇ／ＡｇＣｌ）とした。パルス電位は、初期電位からＮＡＤＨを酸化し得る電位へと印加電位をパルス的に（実質的に瞬間に）引き上げる際の電位であるが、本実施例においては５００ｍＶ（ｖｓ．Ａｇ／ＡｇＣｌ）とした。そして、パルス電位印加後４０ミリ秒後の電流値を測定した。パルス電位を印加する時間幅は40ミリ秒とした。そして、これらの操作を１サイクルとし、この１サイクルの時間を３秒として（すなわち前記一定電位印加時間を３０００−４０＝２９６０ミリ秒として）１０サイクルの操作を時間的に連続して行い、１０回の測定の電流の平均値を算出した。この電流の平均値とＮＡＤＨ濃度との関係を、図１のグラフに示す。
【００２５】
前記結果から、この実施例では、ＮＡＤＨ濃度１．０ｍｍｏｌ／Ｌまでの良好な直線性（相関係数：ｒ＝０．９９９）が得られた。そして、計算によってＮＡＤＨの検出下限濃度を求めたところ、１０μｍｏｌ／Ｌであった。なお、検出下限濃度の計算は、検量線（電流―濃度プロットの回帰直線）上で、下記の式（数１）を与えるＸの値（ＮＡＤＨ濃度）とした。
【００２６】
（数１）
Ｙ ＝ ｂ ＋ ３Ｓｙ／ｘ
Ｘ：ＮＡＤＨ濃度
Ｙ：電流値
ｂ：検量線の切片
Ｓｙ／ｘ：統計量 Ｓｙ／ｘ＝｛Σ（ｙｉ−ｙａ）2／ｎ−２｝2
ｙｉ：i番目の測定値（電流値）
ｙａ：ｙｉの平均値
ｎ：測定ポイント数（ｙｉの数）
【００２７】
（比較例１）
以下に示すように、パルス電位を用いずに一定電位を用いて定常電流を測定する方法でＮＡＤＨ濃度を測定した。
【００２８】
作用極に６５０ｍＶ（ｖｓ．Ａｇ／ＡｇＣｌ）の一定電位を印加して、ＮＡＤＨ濃度を測定し、ＮＡＤＨ濃度と電流の関係を調べた。印加電位以外の条件は、パルス電位を用いた実施例１と同一とした。この結果を図３のグラフに示す。同図に示すように、１．０ｍｍｏｌ／Ｌまでの良好な直線性（相関係数：ｒ＝０．９９９）を得られたものの、実施例１と同様の方法で算出したＮＡＤＨの検出下限濃度は、３７．７μｍｏｌ／Ｌであった。
【００２９】
これら実施例１および比較例１の結果から、パルス電位を用いた本発明の測定法によれば、検出下限濃度で比較して、一定電位を用いた定常電流測定に対して、約４倍の感度向上が得られたといえる。
【００３０】
（実施例２）
Ｄ−３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素（ＨＢＤＨ）を用いたＤ−３−ヒドロキシ酪酸の測定を行った。この酵素反応は、下記の式（化２）で表される。この式から分かるとおり、ＮＡＤＨの生成量を測定することにより、Ｄ−３−ヒドロキシ酪酸濃度（基質濃度）を定量することができる。
【００３１】
【００３２】
実施例１と同様の条件の下、パルス電位印加後の電流値の測定し、測定した電流値とＤ−３−ヒドロキシ酪酸（基質）濃度との関係を調べた。その結果を図４のグラフに示す。同図のグラフから分かるように、７０μｍｏｌ／Ｌまでの良好な直線性（相関係数：ｒ＝０．９９０）が得られた。また、実施例１と同様の方法で算出された基質濃度の検出下限は、９．２３μｍｏｌ／Ｌであった。
【００３３】
【発明の効果】
以上のように、本発明の測定方法は、迅速かつ簡便な電気化学的な測定方法であり、かつＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを検出限界下限濃度１０μｍｏｌ／Ｌ以下の高い感度で測定できる方法である。すなわち、本発明の測定方法の適用により、微量のＮＡＤＨ等を迅速かつ簡便に測定できるとともに、ＮＡＤＨ等を補酵素とする酵素の活性やその基質濃度の迅速かつ簡便な測定も可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の一実施例における電流とＮＡＤＨ濃度との関係を示すグラフである。
【図２】本発明の測定方法の一例の説明図である。
【図３】比較例における電流とＮＡＤＨ濃度との関係を示すグラフである。
【図４】本発明のその他の実施例における電流と基質濃度との関係を示すグラフである。
【発明の属する技術分野】
本発明は、多くの酵素の補酵素として働く還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以下「ＮＡＤＨ」という）または還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドフォスフェート（以下「ＮＡＤＰＨ」という）の測定方法およびＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを補酵素とする酵素の活性の測定方法並びに酵素基質濃度の測定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨは、各種酵素反応において補酵素として働くことが知られている。例えば、ＮＡＤＨ等は、ある種の脱水素酵素が触媒するαヒドロキシ酸から対応するケトン酸への酸化の際に、補酵素として働く。この具体例の一つとして、下記の反応式（化１）で表される乳酸のピルビン酸への酸化をあげることができる。
【０００３】
（化１）
ＣＨ3−ＣＨＯＨ−ＣＯＯＨ＋ＮＡＤ+ → ＣＨ3ＣＯ−ＣＯＯＨ＋ＮＡＤＨ
【０００４】
また、ＮＡＤＨは、ＧＬＤＨ（グルタメート・デヒドロゲナーゼ）の存在下におけるアンモニウム塩による２−オキソグルタレートのＬ−グルタメートへの変換において補酵素として作用する。
【０００５】
このようなＮＡＤＨ等の補酵素としての性質を利用し、酵素活性や酵素基質濃度を調べるために、ＮＡＤＨ等の濃度測定が臨床検査の分野において広く行われている。たとえば、前記ＧＬＤＨの場合では、残留ＮＡＤＨを測定すれば、反応媒体中のアンモニアを定量することができる。すなわち、基質がＮＡＤ+ （またはＮＡＤＰ+ ）の存在下酵素反応によって酸化される場合は、ＮＡＤＨ（またはＮＡＤＰＨ）が生成する。また、基質がＮＡＤＨ（またはＮＡＤＰＨ）の存在下酵素反応によって還元される場合は、ＮＡＤ+ （またはＮＡＤＰ+ ）が生成する。したがって、前者の場合であればＮＡＤＨ（またはＮＡＤＰＨ）の増加量を、後者の場合であればＮＡＤＨ（またはＮＡＤＰＨ）の減少量を測定することにより、酵素基質濃度の変動やＮＡＤＨ等を補酵素とする酵素の活性を測定することができる。
【０００６】
ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの測定方法は、光学的手法と電気化学的手法の２種類に大別できる。
【０００７】
光学的手法としては、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨ自体の紫外部の光吸収（極大吸収波長：３４０ｎｍ）を直接測定する方法、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨ自体の蛍光を直接測定する方法、触媒の存在下でＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨとレサズリンの反応によって生成するレゾルフィンの蛍光を測定する方法などが知られている。
【０００８】
電気化学的手法としては、作用極と対極の２つの電極を用い、前記作用極に印加してＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを電解酸化し、その際に前記作用極と該対極との間に通ずる電流を測定する方法が知られている。この電気化学的手法は、光学的手法に対して比較的簡易で安価な測定装置を用いて迅速に測定が可能であるという長所を備えているが、光学的手法に比べて感度が低いという欠点を有する。したがって、従来から、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの電気化学的な測定方法において、感度の向上を目的とした様々な試みが行われている。
【０００９】
例えば、特公昭５８−１６６９４号公報には、ＮＡＤＨが電極表面に直接化学結合で固定化された酵素電極が開示されている。この技術は、電極表面上で直接酸化されるべきＮＡＤＨを、化学結合で電極表面上に固定することにより、ＮＡＤＨと電極表面とを常に近接させて酸化効率を向上させることで、感度の向上をが図るものである。
【００１０】
また、特開昭５６−３５０５０号公報には、ＮＡＤＨを直接電解酸化するのではなく、メルドラブルーをメディエータとして用い、前記メディエータの還元型を電解酸化する際の電流値から間接的にＮＡＤＨを測定する技術が開示されている。この技術では、メディエータの酸化還元サイクルを利用することで感度の向上を図っている。
【００１１】
そして、特表平１−５０３４０９号公報には、活性化炭素粒子または活性化グラファイト粒子を天然樹脂または合成樹脂等の結合剤で結合した多孔質かつ不均質の樹脂結合層からなる活性化炭素電極を使用したＮＡＤＨの電気化学的測定方法が開示されている。この技術における感度の向上の原因は明瞭ではないが、活性化炭素または活性化グラファイトの多孔質で不均質な構造が、電極の実効面積を増大させていることが原因と推察される。さらに、活性化炭素素または活性化グラファイトがＮＡＤＨとの適合性に優れ、他の材質の電極に比べて速やかにＮＡＤＨを酸化できることも感度向上の一因と推察される。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
これらのＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの測定方法のなかで、光学的手法は、電気化学的手法に比べ、複雑で高価な測定装置を必要とする。また、前記光学的手法のなかで、ＮＡＤＨ等の紫外部の光吸収を測定する方法では、光の波長領域が紫外部であるために、光源および検出器ともに、安価で耐久性に優れたものを得難いという問題がある。また、前記ＮＡＤＨ等自体の蛍光を測定する方法若しくはＮＡＤＨ等との反応で生成したレゾルフィンの蛍光を測定する方法では、例えば尿を測定対象とする場合、共存物質として含まれるタンパク質やビリルビン等の蛍光物質の影響を避け難いという問題がある。
【００１３】
前記電気化学的手法は、先に述べたように、簡易で安価な測定装置を使用して、簡便に測定を行うことができるという利点がある。しかし、前記各種の試みによって感度の向上が図られてはいるものの、依然、検出下限濃度は、０．１〜１ｍｍｏｌ／Ｌ程度と充分でなく、感度の面で光学的手法には及ばない。酵素活性測定のためのＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの検出下限濃度としては１０μｍｏｌ／Ｌ程度が望まれるが、感度が低い従来の電気化学的な測定方法では、酵素活性や酵素基質濃度の測定を行うことは、実質的に困難である。
【００１４】
そこで、本発明の目的は、高い感度でＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの濃度を測定することが可能なＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの電気化学的測定方法を提供することである。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
前記目的を達成するために、本発明のＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの測定方法は、少なくとも作用極および対極の２つの電極を用いてＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの濃度を電気化学的に測定する方法であって、前記作用極に対しＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの電解が起こらない電位範囲で一定電位を印加し、その後、前記作用極にＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの電解が起こる電位範囲でパルス電位を印加し、このパルス電位を印加してから１０〜１０００ミリ秒後に前記作用極と前記対極との間に通ずる電流を測定する方法である。
【００１６】
本発明の測定方法において、前記測定方法における一連の操作を１サイクルとし、この操作を２サイクル以上繰り返し、各サイクルで測定した電流の平均値を算出することが好ましい。
【００１７】
この際、２サイクル以上の操作の繰り返しを時間的に連続して行うことが好ましい。これにより、一つのサイクルの終点とつぎのサイクル始点において、ＮＡＤＨ等の電解が起こる電位範囲のパルス電位からＮＡＤＨ等の電解が起こらない電位範囲の一定電位へ実質的に瞬間に電位が変動して前記一定電位に保持されることとなり、これによって電極が安定化されるからである。
【００１８】
すなわち、図２において、Ｔが１サイクルの時間、τがパルス電位印加時間、(Ｔ−τ)が前記一定電位印加時間となる。上記のように、パルス電位から一定電位へ実質的に瞬間に電位を変動させることで電極が安定化されることがあるので、時間的に連続してサイクルを繰り返し、測定した電流の平均値を算出して濃度に換算する場合では、(Ｔ−τ)は電極が安定化するのに必要な時間とするのが望ましい。なお、図２において、Ｅｉは前記一定電位を示し、△Ｅはパルス電位と一定電位の差を示し、Ｉは作用極と対極との間に流れる電流を示す。
【００１９】
前記一定電位は、−５００〜２００ｍＶ（ｖｓ．Ａｇ／ＡｇＣｌ）であるのが望ましく、前記一定電位の印加時間は、電極が安定する時間が好ましく、具体的には１〜１２０秒の範囲が好ましく、特に好ましくは２〜１０秒である。また、前記パルス電位は、１００〜１０００ｍＶ（ｖｓ．Ａｇ／ＡｇＣｌ）であるのが望ましい。前記一定電位、前記一定電位印加時間および前記パルス電位は、測定試料の温度、ｐＨ、使用する電極の材質と種類などによって好適な値が変動するから、必要な感度、Ｓ／Ｎ比などから最適な組み合わせを選ぶことが好ましい。パルス電位を印加してから作用極と対極の間を通ずる電流を測定するまでの時間は、前記所定の範囲の時間であるが、この時間も、測定試料の温度、ｐＨ、使用する電極の材質と種類などによって好適な値が変動するから、必要な感度、Ｓ／Ｎ比などから最適な値を選ぶことが好ましい。また、前記作用極の材質は特に限定されるものではなく、必要に応じて、プラスティックフォームドカーボン、グラッシーカーボン、金、白金、銀など従来公知の材質の電極を使用することができる。このなかで、プラスティックフォームドカーボンが好ましい。前記作用極の形態についても同様であって、プローブ型の固体電極であっても良いし、印刷技術を用いた電極であってもよく、カーボンペースト電極のようなペースト電極であっても良い。一方、対極についても、特に制限するものではなく、従来公知のものを使用することができ、例えば、白金電極、グラッシーカーボン、金、銀、印刷カーボン、カーボンペースト等が使用できる。また、本発明において、参照電極を使用することが好ましく、例えば、銀／塩化銀（Ａｇ／ＡｇＣｌ）電極などを使用できる。
【００２０】
また、様々な妨害物質の影響を回避したい場合には、前記作用極を妨害除去膜によって被覆することが好ましい。前記妨害除去膜とは、電極の汚染、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨ以外の電気化学活性種などの影響を低減させるための膜であって、例えば、血液、尿、随液などの体液を測定試料として使用する場合に電極表面へタンパク質が吸着するのを妨ぐための透析膜、セルロースアセテート膜、ナフィオン膜等があげられる。
【００２１】
本発明の測定方法のＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの電気化学的な濃度測定では、検出下限１０μｍｏｌ／Ｌの実現が可能である。したがって、本発明の測定方法によりＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを測定することにより、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを補酵素とする酵素の活性測定や酵素基質濃度測定が可能となる。
【００２２】
【発明の実施の形態】
本発明の実施形態を実施例により比較例と併せて説明する。
【００２３】
なお、以下の実施例および比較例における測定条件は、以下のとおりである。まず、電極は、通常の３電極系（プローブ型固体電極）を用いた。作用極としては、プラスティックフォームドカーボン（ＰＦＣ）電極（φ３ｍｍ：ビー・エー・エス株式会社製）を用い、対極としては、白金電極（φ１ｍｍ：市村金属株式会社製）を、参照電極としては、銀／塩化銀（Ａｇ／ＡｇＣｌ）電極（ビー・エー・エス社製）をそれぞれ用いた。作用極表面は、タンパクなどの妨害除去のため、透析膜（Ｓｅａｍｌｅｓｓ Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ Ｔｕｂｉｎｇ、輸入販売元：三光純薬社）で被覆した。測定溶液は、０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液をベース溶液として、ＮＡＤＨ濃度が５〜２００μｍｏｌ／Ｌとなるように調整したものを用いた。測定溶液の温度は、測定中２５℃で一定となるように調整した。
【００２４】
（実施例１）
上記の条件の下、パルス電位を用いたＮＡＤＨの測定を行った。パルス電位印加前に作用極へ印加しておく初期電位は、−２５０ｍＶ（ｖｓ．Ａｇ／ＡｇＣｌ）とした。パルス電位は、初期電位からＮＡＤＨを酸化し得る電位へと印加電位をパルス的に（実質的に瞬間に）引き上げる際の電位であるが、本実施例においては５００ｍＶ（ｖｓ．Ａｇ／ＡｇＣｌ）とした。そして、パルス電位印加後４０ミリ秒後の電流値を測定した。パルス電位を印加する時間幅は40ミリ秒とした。そして、これらの操作を１サイクルとし、この１サイクルの時間を３秒として（すなわち前記一定電位印加時間を３０００−４０＝２９６０ミリ秒として）１０サイクルの操作を時間的に連続して行い、１０回の測定の電流の平均値を算出した。この電流の平均値とＮＡＤＨ濃度との関係を、図１のグラフに示す。
【００２５】
前記結果から、この実施例では、ＮＡＤＨ濃度１．０ｍｍｏｌ／Ｌまでの良好な直線性（相関係数：ｒ＝０．９９９）が得られた。そして、計算によってＮＡＤＨの検出下限濃度を求めたところ、１０μｍｏｌ／Ｌであった。なお、検出下限濃度の計算は、検量線（電流―濃度プロットの回帰直線）上で、下記の式（数１）を与えるＸの値（ＮＡＤＨ濃度）とした。
【００２６】
（数１）
Ｙ ＝ ｂ ＋ ３Ｓｙ／ｘ
Ｘ：ＮＡＤＨ濃度
Ｙ：電流値
ｂ：検量線の切片
Ｓｙ／ｘ：統計量 Ｓｙ／ｘ＝｛Σ（ｙｉ−ｙａ）2／ｎ−２｝2
ｙｉ：i番目の測定値（電流値）
ｙａ：ｙｉの平均値
ｎ：測定ポイント数（ｙｉの数）
【００２７】
（比較例１）
以下に示すように、パルス電位を用いずに一定電位を用いて定常電流を測定する方法でＮＡＤＨ濃度を測定した。
【００２８】
作用極に６５０ｍＶ（ｖｓ．Ａｇ／ＡｇＣｌ）の一定電位を印加して、ＮＡＤＨ濃度を測定し、ＮＡＤＨ濃度と電流の関係を調べた。印加電位以外の条件は、パルス電位を用いた実施例１と同一とした。この結果を図３のグラフに示す。同図に示すように、１．０ｍｍｏｌ／Ｌまでの良好な直線性（相関係数：ｒ＝０．９９９）を得られたものの、実施例１と同様の方法で算出したＮＡＤＨの検出下限濃度は、３７．７μｍｏｌ／Ｌであった。
【００２９】
これら実施例１および比較例１の結果から、パルス電位を用いた本発明の測定法によれば、検出下限濃度で比較して、一定電位を用いた定常電流測定に対して、約４倍の感度向上が得られたといえる。
【００３０】
（実施例２）
Ｄ−３−ヒドロキシ酪酸脱水素酵素（ＨＢＤＨ）を用いたＤ−３−ヒドロキシ酪酸の測定を行った。この酵素反応は、下記の式（化２）で表される。この式から分かるとおり、ＮＡＤＨの生成量を測定することにより、Ｄ−３−ヒドロキシ酪酸濃度（基質濃度）を定量することができる。
【００３１】
実施例１と同様の条件の下、パルス電位印加後の電流値の測定し、測定した電流値とＤ−３−ヒドロキシ酪酸（基質）濃度との関係を調べた。その結果を図４のグラフに示す。同図のグラフから分かるように、７０μｍｏｌ／Ｌまでの良好な直線性（相関係数：ｒ＝０．９９０）が得られた。また、実施例１と同様の方法で算出された基質濃度の検出下限は、９．２３μｍｏｌ／Ｌであった。
【００３３】
【発明の効果】
以上のように、本発明の測定方法は、迅速かつ簡便な電気化学的な測定方法であり、かつＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを検出限界下限濃度１０μｍｏｌ／Ｌ以下の高い感度で測定できる方法である。すなわち、本発明の測定方法の適用により、微量のＮＡＤＨ等を迅速かつ簡便に測定できるとともに、ＮＡＤＨ等を補酵素とする酵素の活性やその基質濃度の迅速かつ簡便な測定も可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の一実施例における電流とＮＡＤＨ濃度との関係を示すグラフである。
【図２】本発明の測定方法の一例の説明図である。
【図３】比較例における電流とＮＡＤＨ濃度との関係を示すグラフである。
【図４】本発明のその他の実施例における電流と基質濃度との関係を示すグラフである。
Claims (12)
- 少なくとも作用極および対極の２つの電極を用いて還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）または還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドフォスフェート（ＮＡＤＰＨ）の濃度を電気化学的に測定する方法であって、前記作用極に対しＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの電解が起こらない電位範囲で一定電位を印加し、その後、前記作用極に対しＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの電解が起こる電位範囲でパルス電位を印加し、このパルス電位を印加してから１０〜１０００ミリ秒後に前記作用極と前記対極との間に通ずる電流を測定するＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの測定方法。
- 請求項１に記載の測定方法における一連の操作を１サイクルとし、この操作を２サイクル以上繰り返し、各サイクルで測定した電流の平均値を算出してＮＡＤＨ濃度またはＮＡＤＰＨ濃度に換算する測定方法。
- ２サイクル以上の一連の操作を時間的に連続して行う請求項２に記載の測定方法。
- ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの電解が起こらない範囲で一定電位を印加する時間が、電極が安定するのに必要な時間である請求項１〜３のいずれか一項に記載の測定方法。
- ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの電解が起こらない範囲での一定電位が−５００〜２００ｍＶ（ｖｓ．Ａｇ／ＡｇＣｌ）である請求項１〜４のいずれか一項に記載の測定方法。
- ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの電解が起こらない範囲で一定電位を印加する時間が、１秒〜１２０秒の範囲である請求項１〜５のいずれか一項に記載の測定方法。
- ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの電解が起こらない範囲で一定電位を印加する時間が、２秒〜１０秒の範囲である請求項１〜５のいずれか一項に記載の測定方法。
- パルス電位が１００〜１０００ｍＶ（ｖｓ．Ａｇ／ＡｇＣｌ）である請求項１〜７のいずれか一項に記載の測定方法。
- 作用極が、プラスティックフォームドカーボン電極である請求項１〜８のいずれか一項に記載の測定方法。
- 作用極が、妨害除去膜により被覆されている請求項１〜９のいずれか一項に記載の測定方法。
- 請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法を用いてＮＡＤＨ濃度またはＮＡＤＰＨ濃度を測定することにより、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを補酵素とする酵素の活性を測定する酵素活性の測定方法。
- 請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法を用いてＮＡＤＨ濃度またはＮＡＤＰＨ濃度を測定することにより、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを補酵素とする酵素の基質濃度を測定する酵素基質濃度の測定方法。
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