JP4166520B2 - 血清学的検査容器およびその製造方法 - Google Patents
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Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、血清学的検査容器、特に不規則性抗体の同定に用いる検査容器、およびその製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
輸血、妊娠等のアロ免疫刺激を受けるとしばしば抗赤血球抗体を産生する。この抗赤血球抗体は不規則性抗体と呼ばれ、次回の輸血時に抗体に対して抗原陽性血が体内に入った場合、輸血効果が得られないばかりか重篤な副作用を呈することがある。輸血を行う場合、この副作用を防止する意味合いから、輸血を受ける患者は数種類のＯ型血球（スクリーニング血球）に対して不規則性抗体の有無を調べるいわゆる抗体スクリーニングを実施する。患者がこれらのスクリーニング血球に反応する抗体を持っていた場合は陽性となる。次に、患者が保有する抗体の種類を決定し、その抗体とは反応しない血液を輸血する。この抗体の種類の決定を抗体同定という。抗体同定には、スクリーニングより更に多く（通常１０種類以上）のＯ型血球（パネル血球）を使用して、抗体の特異性を決定する。パネル血球は様々な異なる抗原性の血球からなる。通常は、パネル血球のみで抗体の同定が可能であるが、複数の抗体を保有している場合はパネル血球のみでは判定できない場合があり、さらに異なる抗原性の血球の必要性が生じている。
【０００３】
一方、赤血球上の抗原は、ある種の酵素（血清学でよく使用されるものはパパイン、フィシン、ブロメリン、プロナーゼ、キモトリプシンなど）やスルフヒドリル試薬（ジチオスレイトールや２−メルカプトエタノール）で処理を行うと特定の抗原性が消失するか、または抗体との反応が増強されることは良く知られている（American Red Cross (1993) Immunohematology Methods and Procedures, American Red Cross National Reference Laboratory, Rockville, MD）。たとえば、Ｆｙａ抗原はパパイン処理を行った血球で反応性が消失してしまうが、Ｄ抗原はむしろ反応性が強まる。このように同一血球であっても酵素処理によって特定の抗原が陰性となった血球を調製できる。
【０００４】
さらに、酵素の種類によって血球上の抗原に対して及ぼす効果が違うという特徴もある。たとえばＦｙａ抗原はパパインでは失活するがトリプシンでは失活しない。血清学においてはこのように異なる種類の酵素や化学物質で処理した血球に対して反応性の変化を見て抗体同定を行うことは良く行われている（JR Storry. Immunohematology 2000; 16:101-104）。
【０００５】
このような技術を用いて、酵素や化学物質の種類を変えて処理をすれば、元の血球に対して何種類かの異なる特異性を持つ血球を作ることが出来る。しかしながら、それぞれの処理方法が極めて厳密であり、過剰の処理を行うと偽陽性反応が発生し、また処理が足りないと失活するはずの抗原性が残ることになる。従って、それぞれ最適条件を設定し、正しく処理を行う必要がある。しかも、酵素や化学物質によって最適条件が異なるので数種類の血球を処理することは容易ではない。また、処理した血球を保管するには液体窒素等で凍結する必要があり、その維持管理と血球の凍結、解凍処理が非常に煩雑である。
【０００６】
一方、特開２０００−３２１２６９、特許第３０３０７１０号で述べられているように、赤血球を乾燥固定することで長期にわたり保存が可能であることが知られている。しかしながら、酵素や化学物質で処理した血球をそのまま乾燥固定してもうまくいかない場合が多い。その原因は、酵素処理することで赤血球のペプチド鎖が分解を受けるので、溶血＋乾燥操作により、固相面から血球がはがれてしまったり、血球そのものの構造が破壊されてしまうからだと考えられる。今まで、血球の酵素処理条件については AABB Technical Mannual 13ed p.673-679. に述べられているように、主にパパイン処理による血球上のＤｕｆｆｙ抗原の失活についてのみ調べられていた。また、血球上の抗原に対して酵素の作用は一様でなく、抗原によっても感受性が異なるということは詳細に検討されていなかった。さらに、乾燥固定に適した酵素処理の条件は検討されていなかった。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
従って本発明の目的は、予め特定の抗原を選択的に失活させた赤血球を長期間安定して使用することが可能な血清学的検査容器、およびその製造方法を提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明の一態様に係る血清学的検査容器は、同一プレート上に血清検体収容部としての複数のウェルを有し、各々のウェルの壁面に、非処理の赤血球および特定の抗原を選択的に失活させた赤血球からなる群より選ばれる複数の赤血球のうちいずれかを乾燥固定したことを特徴とする。なお、特定の抗原を選択的に失活させた赤血球および非処理の赤血球は、同一の赤血球由来のものが好ましい。
【０００９】
本発明の他の態様に係る血清学的検査容器の製造方法は、（ａ）未処理の赤血球を血清検体収容部の壁面に固相する工程と、（ｂ）固相した赤血球上の特定の抗原を酵素処理または化学処理により選択的に失活させる工程と、（ｃ）処理後の赤血球に界面活性剤を含有する等張以上の液体を接触させて赤血球の内容物を溶出させる工程と、（ｄ）内容物を溶出させた赤血球に乾燥用溶液を添加した後に乾燥操作を行う工程とを含むことを特徴とする。
【００１０】
工程（ｂ）はたとえば、３２０Ｕ以上のトリプシンを含有するアルカリ性の等張バッファーで室温〜３７℃において至適時間反応させることにより、赤血球上のＬｕｔｈｅｒａｎ、Ｍ、およびＸｇａ抗原のうち少なくとも１種を選択的に失活させる工程である。
【００１１】
工程（ｂ）はたとえば、０．０５Ｕ〜３Ｕの濃度のパパインを含有するｐＨ６の等張バッファーで室温〜３７℃において至適時間反応させることにより、赤血球上のＤｕｆｆｙ、Ｍ、Ｓ、Ｘｇａ、およびＧｅ抗原のうち少なくとも１種を選択的に失活させる工程である。
【００１２】
工程（ｂ）はたとえば、０．０５Ｕ〜１Ｕの濃度のブロメリンを含有するｐＨ６〜８の等張バッファーで室温〜３７℃において至適時間反応させることにより、赤血球上のＤｕｆｆｙ、Ｍ、Ｓ、およびＸｇａ抗原のうち少なくとも１種を選択的に失活させる工程である。
【００１３】
工程（ｂ）はたとえば、０．１〜０．００６Ｍのジチオスレイトールを含有するアルカリ性の等張バッファーで室温〜３７℃において至適時間反応させることにより、赤血球上のＫｅｌｌ系抗原のうち少なくとも１種を選択的に失活させる工程である。
【００１４】
本発明の他の態様に係る血清学的検査容器の製造方法は、（ａ）赤血球上の特定の抗原を酵素処理または化学処理により選択的に失活させる工程と、（ｂ）処理した赤血球を血清検体収容部の壁面に固相する工程と、（ｃ）固相した赤血球に界面活性剤を含有する等張以上の液体を接触させて赤血球の内容物を溶出させる工程と、（ｄ）内容物を溶出させた赤血球に乾燥用溶液を添加した後に乾燥操作を行う工程とを含むことを特徴とする。
【００１５】
工程（ａ）はたとえば、血球濃度３％に対して２０Ｕ以上のトリプシンを含有するアルカリ性の等張バッファーで室温〜３７℃において至適時間反応させることにより、赤血球上のＬｕｔｈｅｒａｎ、Ｍ、およびＸｇａ抗原のうち少なくとも１種を選択的に失活させる工程である。
【００１６】
工程（ａ）はたとえば、血球濃度３％に対して０．４Ｕ以下の濃度のパパインを含有するｐＨ６の等張バッファーで室温〜３７℃において至適時間反応させることにより、赤血球上のＤｕｆｆｙ、Ｍ、Ｓ、Ｘｇａ、およびＧｅ抗原のうち少なくとも１種を選択的に失活させる工程である。
【００１７】
工程（ａ）はたとえば、血球濃度３％に対して０．４Ｕ以下のブロメリンを含有するｐＨ６の等張バッファーで室温〜３７℃において至適時間反応させることにより、赤血球上のＤｕｆｆｙ、Ｍ、およびＸｇａ抗原のうち少なくとも１種を選択的に失活させる工程である。
【００１８】
【発明の実施の形態】
以下、本発明をより詳しく説明する。
【００１９】
本発明に係る血清学的検査容器は、赤血球上に存在する特定の抗原を、酵素または化学物質で処理することにより選択的に失活させた赤血球を血清検体収容部の壁面に乾燥固定することにより、所望の抗原性を有する赤血球を長期にわたり安定して使用できるようにしたものである。ここで、本発明において特定の抗原とは、通常赤血球上に存在し得るいかなる抗原であっても良い。たとえば、Ｌｕｔｈｅｒａｎ、Ｍ、およびＸｇａ抗原のうち少なくとも１種、Ｄｕｆｆｙ、Ｍ、Ｓ、Ｘｇａ、およびＧｅ抗原のうち少なくとも１種、Ｄｕｆｆｙ、Ｍ、Ｓ、およびＸｇａ抗原のうち少なくとも１種、またはＫｅｌｌ系抗原のうち少なくとも１種であることが好ましい。
【００２０】
本発明の血清学的検査容器は、同一プレート上に血清検体収容部としての複数のウェルを有するマイクロプレートであることが好ましい。検査容器はプラスチック製であることが好ましく、さらに、底面の形状がＵまたはＶ状であることが好ましいが、限定されるものではない。
【００２１】
また、本発明の血清学的検査容器は、マイクロプレートの各々のウェルの壁面に、抗原に対して処理を施していない非処理の赤血球および特定の抗原を選択的に失活させた種々の赤血球からなる群より選ばれる複数の赤血球のうちいずれかが乾燥固定されていてもよい。なお、特定の抗原を選択的に失活させた赤血球および非処理の赤血球は、同一の赤血球由来のものであってもよい。
【００２２】
酵素や化学物質で処理した赤血球を乾燥するには、それぞれ最適な条件が必須である。従って本発明者らは、赤血球を単に酵素処理または化学処理して乾燥するのではなく、異なる濃度の酵素に対して、各抗原がどのような反応挙動を取るかを明らかにし、乾燥固定化に適した条件を検討した。以下、本発明に係る血清学的検査容器の製造方法を示す。なお、以下の説明においてはマイクロプレートの各ウェルに赤血球を乾燥固定する方法を示すが、本発明はこれに限定するものではない。
【００２３】
本発明の製造方法の第１の実施形態としては、赤血球をウェルに固相後に、酵素または化学物質により処理し、これを乾燥固定する。具体的には、たとえばレクチンを使用する大釜らの方法（J Ohgama et al., Transfusion Medicine 1996; 6: 351-359）に従って、レクチン、抗赤血球抗体、またはポリカチオンなどを介して赤血球をウェル底面に固相後、洗浄して余分な赤血球を除去する。なお、レクチンは小麦胚芽レクチンであることが好ましい。
【００２４】
この固相赤血球に対して種々の濃度、ｐＨの酵素溶液または化学物質を添加し反応を行う。ここで用いる酵素としては、トリプシン、パパイン、ブロメリン、フィシン、キモトリプシン、およびプロナーゼなどが好ましい。また、化学物質としては、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）および２−メルカプトエタノール（２−Ｍｅ）等のスルフヒドリル試薬が好ましい。
【００２５】
酵素処理は、その酵素活性値とｐＨに強く影響を受ける。また、化学処理または酵素処理に対する抗原の感受性もそれぞれ異なり、強い処理でなければ消えない抗原もある。従って、失活させようとする抗原によってそれぞれ最適な条件を明らかにした上で、赤血球を乾燥する必要がある。本発明においては、失活させようとする抗原の抗体との反応性が消失し、かつ陰性検体に偽陽性反応が発生しないための条件を設定した。すなわち、失活させようとする抗原によって、ウェル内壁に固相した赤血球に対して以下の処理を施す。
【００２６】
赤血球上のＬｕｔｈｅｒａｎ、Ｍ、およびＸｇａ抗原のうち少なくとも１種を失活させるには、３２０Ｕ以上のトリプシンを含有するアルカリ性（好ましくはｐＨ８以上）の等張バッファーを固相した赤血球に添加し、室温〜３７℃において至適時間反応させる。
【００２７】
赤血球上のＤｕｆｆｙ、Ｍ、Ｓ、Ｘｇａ、およびＧｅ抗原のうち少なくとも１種を失活させるには、０．０５Ｕ〜３Ｕの濃度のパパインを含有するｐＨ６の等張バッファーを固相した赤血球に添加し、室温〜３７℃において至適時間反応させる。
【００２８】
赤血球上のＤｕｆｆｙ、Ｍ、Ｓ、およびＸｇａ抗原のうち少なくとも１種を失活させるには、０．０５Ｕ〜１Ｕの濃度のブロメリンを含有するｐＨ６〜８の等張バッファーを固相した赤血球に添加し、室温〜３７℃において至適時間反応させる。
【００２９】
赤血球上のＫｅｌｌ系抗原のうち少なくとも１種を失活させるためには、０．１〜０．００６ＭのＤＴＴを含有するアルカリ性（好ましくはｐＨ８以上）の等張バッファーを固相した赤血球に添加し、室温〜３７℃において至適時間反応させる。
【００３０】
なお、反応時間は条件によって異なるが、１０〜３０分程度が好ましい。
【００３１】
上述したような条件で処理した赤血球を、玉井らの方法（特開２０００−３２１２６９）に従って乾燥固定する。すなわち、処理した赤血球を洗浄後、低濃度の界面活性剤を含有する等張以上の液体を接触させることにより穏やかに内容物を排出し、さらに洗浄後、糖類およびタンパク質を含有する乾燥用溶液を添加し、軽く水切りした後に真空乾燥、自然乾燥、または風乾などにより乾燥させる。界面活性剤としては、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００等が使用できる。また、糖類としてはサッカロース等、タンパク質としてはＢＳＡ等の動物の血清タンパク質を使用することが好ましい。なお、赤血球の溶血方法としては、界面活性剤を用いる他に、低張液を用いて赤血球を破裂させる方法等を用いることも可能であるが、乾燥固定後の赤血球の状態を良好に保つためには界面活性剤を用いることが最も好ましい。
【００３２】
本発明の第２の実施形態においては、赤血球をマイクロプレートに固相する前に、予め試験管等で浮遊状態の赤血球を酵素または化学物質で処理する。処理した赤血球は洗浄後、第１の実施形態において説明したのと同様の方法でウェル底面に固相し、乾燥固定する。ここで、赤血球を処理するのに好ましい酵素または化学物質は、第１の実施形態において説明したものと同じである。しかしながら、固相前の赤血球処理は赤血球の濃度、処理するスケール、および撹拌条件など別のファクターが加わってくるため、前述した第１の実施形態において赤血球を固相後に酵素処理する場合とは、適正な濃度がそれぞれ異なる。赤血球をマイクロプレートに固相する前に処理を行う場合には、固相前の赤血球に対して次の処理を施す。
【００３３】
赤血球上のＬｕｔｈｅｒａｎ、Ｍ、およびＸｇａ抗原を失活させるには、血球濃度３％に対して２０Ｕ以上のトリプシンを含有するアルカリ性の等張バッファーを赤血球に添加し、室温〜３７℃において至適時間反応させる。
【００３４】
赤血球上のＤｕｆｆｙ、Ｍ、Ｓ、Ｘｇａ、およびＧｅ抗原のうち少なくとも１種を失活させるには、血球濃度３％に対して０．４Ｕ以下の濃度のパパインを含有するｐＨ６の等張バッファーを赤血球に添加し、室温〜３７℃において至適時間反応させる。
【００３５】
赤血球上のＤｕｆｆｙ、Ｍ、およびＸｇａ抗原のうち少なくとも１種を失活させるには、血球濃度３％に対して０．４Ｕ以下のブロメリンを含有するｐＨ６の等張バッファーを赤血球に添加し、室温〜３７℃において至適時間反応させる。
【００３６】
なお、反応時間は条件によって異なるが、１０〜３０分程度が好ましい。
【００３７】
また、上述した条件で処理した各種赤血球と非処理の赤血球からなる群の中から選ばれる少なくとも２種の赤血球とを同一のマイクロプレートの別々のウェルにそれぞれ乾燥固定することにより、抗体の同定、確認が容易に実施できる赤血球パネルを作製することができる。さらに、これらの赤血球を全て同一の赤血球から作製しても良い。
【００３８】
通常、目的の抗原性を有する赤血球は必ずしも自然界に存在するものではない。従って従来は、所望の赤血球が見つからない場合には、その都度既存の赤血球に対して種々の処理を行う必要があった。しかも処理した血球は長期間の保存ができなかった。本発明によれば、所望の処理方法を用いることにより目的の抗原性を有する種々の赤血球を調製することができる。さらに、同一の赤血球から異なる抗原性を有する複数種の赤血球を作製することも可能である。これらを予めマイクロプレートの各ウェルに乾燥固定した検査容器を提供することにより、今まで煩わしかった酵素処理をする必要がなくなる。
【００３９】
本発明の検査容器を用いて不規則性抗体を同定するには、ＥＩＡ法（酵素免疫測定法）、ＲＩＡ法（ラジオイムノアッセイ）、ＦＩＡ法（蛍光標識免疫測定法）、またはＣＩＡ法（化学発光免疫測定法）などを用いることができる。また、抗ヒトグロブリン抗体が感作されている磁性体含有の指示粒子を用いる玉井らの方法（T Tamai. et al., Transfusion Medicine 1999; 9: 351-359.）を用いることもできる。すなわち、赤血球が乾燥固定された本発明の容器にグリシンＬＩＳＳ（低イオン強度溶液）を添加し、ここに血清などの検体を添加し、３７℃で１０分間インキュベート後、生食溶液で洗浄する。ここに抗ヒトＩｇＧ抗体が感作された磁性体含有の指示粒子を添加し、容器を磁石上に一定時間放置する。これを容器の上または下から観察すると、陽性の場合は指示粒子が広がった像が得られ、陰性の場合は中心に集まった像が得られる。この方法によれば、遠心操作を使用せずに磁力によってパターン形成することができる。なお、ここで用いる指示粒子に予め感作された物質は抗ヒトＩｇＧ抗体に限定されず、プロテインＧまたはプロテインＡ等の、免疫グロブリンに特異的に結合する物質であれば良い。
【００４０】
【実施例】
以下本発明を実施例により説明するが、本発明はそれらに限定されるものではない。
【００４１】
＜実施例１：トリプシン処理血球の乾燥固定＞
小麦胚芽レクチンを固相したマイクロプレートに、Ｏ型のスクリーニング血球（Ｌｕａ、Ｍ、ＦｙａまたはＦｙｂ陽性）を固相した。ｐＨ６〜８のＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）に溶解した０〜２７２０Ｕのトリプシン溶液を各ウェルに５０μＬずつ分注して３７℃或いは室温で１０〜３０分間処理した。その後０．０１２５％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００（シグマ社製）を含む生食溶液を分注し、血球を溶血させた。これを洗浄して血球の内容物とＴｒｉｔｏｎＸ−１００を除去した後、ＢＳＡ添加のサッカロース溶液を分注して軽く水切りを行い、常温減圧下で乾燥した。その後、玉井らの方法（T Tamai. et al., Transfusion Medicine 1999; 9: 351-359.）に従ってアッセイした。すなわち、乾燥後グリシンＬＩＳＳ（低イオン強度溶液）を分注して抗Ｌｕａ抗体、抗Ｍ抗体、抗Ｆｙａ抗体、抗Ｆｙｂ抗体、および陰性検体を分注し、３７℃１０分間インキュベート後、生食溶液で５回洗浄した。最後に抗ヒトＩｇＧ抗体感作磁性体粒子を分注し、これを磁石上に放置してパターン形成することにより、抗Ｌｕａ抗体、抗Ｍ抗体、抗Ｆｙａ抗体、および抗Ｆｙｂ抗体との反応性と陰性検体の偽陽性反応の発生を観察した。
【００４２】
その結果、固相した赤血球のトリプシン処理において、ｐＨ７以下では抗Ｍ抗体、抗Ｌｕａ抗体の反応性は消失しなかった。ｐＨ８で室温〜３７℃において３０分間インキュベートすることによって３２０Ｕ以上で抗Ｍ抗体、抗Ｌｕａ抗体との反応性は消失し、抗Ｆｙａ抗体との反応性は残り、偽陽性反応の発生も２５６０Ｕまで認めなかった。
【００４３】
また、赤血球を固相前に、赤血球の濃度が３％になるように０〜２７２０Ｕのトリプシン含有ＰＢＳ（ｐＨ８）溶液で調製し、３７℃或いは室温で１０〜３０分間処理したものを、小麦胚芽レクチンを固相したマイクロプレートに固相し、乾燥を行ったものについても同様に試験した。
【００４４】
固相前の血球処理では、室温〜３７℃で３０分間、２０Ｕで処理することで、抗Ｍ、抗Ｌｕａ抗体との反応性は消失し、偽陽性反応の発生も２５６０Ｕまで認めなかった。
【００４５】
＜実施例２：パパイン処理血球の乾燥固定＞
実施例１と同様に小麦胚芽レクチンを固相したマイクロプレートに、Ｏ型のスクリーニング血球（Ｓ、ｓ、Ｍ、Ｆｙａ、またはＦｙｂ陽性）を固相した。カゼイン分解法で活性値を求めたパパイン溶液をｐＨ６〜８のＰＢＳで希釈して０〜１６Ｕに調整した。各ウェルにパパイン溶液を５０μＬずつ分注して室温で１０〜３０分間処理した。その後、実施例１と同様に処理して抗Ｆｙａ抗体、抗Ｆｙｂ抗体、抗Ｓ抗体、抗ｓ抗体、および陰性検体との反応性と陰性検体の偽陽性反応の発生を観察した。
【００４６】
その結果、ｐＨ７以上では抗Ｍ，ｓ抗体との反応性は消失しなかった。ｐＨ６では、室温で１０〜３０分間インキュベートした場合、３．７５Ｕ以上で偽陽性反応が発生したので、パパイン処理においては０．０５Ｕ〜３Ｕを至適濃度と考えた。１Ｕで抗Ｆｙａ、Ｆｙｂ、Ｍ、Ｓ抗体との反応性は陰性化したが抗ｓ抗体との反応性は残った。０．０５Ｕでは抗Ｆｙａ、Ｆｙｂ抗体との反応性は陰性化したが、抗Ｍ、Ｓ、ｓ抗体との反応性は残った。
【００４７】
また、血球を固相前に、血球の濃度が３％になるように０〜３０Ｕのパパイン含有ＰＢＳ（ｐＨ６）溶液で調整し、３７℃或いは室温で１０〜３０分間処理したものを小麦胚芽レクチン固相マイクロプレートに固相し、乾燥を行ったものについても同様に試験した。
【００４８】
固相前に血球処理した場合、室温で３０分間、０．４Ｕ以上のパパインで処理したものにおいて偽陽性反応が発生し、０．４Ｕでの処理では、抗Ｆｙａ、Ｆｙｂ、Ｍ、Ｓ抗体との反応性が消失した。
【００４９】
＜実施例３：ブロメリン処理血球の乾燥固定＞
実施例１と同様に、小麦胚芽レクチンを固相したマイクロプレートに、Ｏ型のスクリーニング血球（Ｓ、ｓ、Ｍ、Ｆｙａ、またはＦｙｂ陽性）を固相した。予めカゼイン分解法で活性値を求めたブロメリン溶液をｐＨ６〜８のＰＢＳで希釈して０〜１６Ｕの濃度になるように調整した。各ウェルにブロメリン溶液を５０μＬずつ分注して室温で１０分間処理した。その後、実施例１と同様に処理して抗Ｆｙａ抗体、抗Ｆｙｂ抗体、抗Ｍ抗体、抗Ｓ抗体、抗ｓ抗体および陰性検体との反応性と陰性検体の偽陽性反応の発生を観察した。
【００５０】
その結果、ｐＨ６以下では０．０５Ｕ〜２Ｕの範囲で抗Ｆｙａ、Ｆｙｂ、Ｍ抗体との反応性は消失したが、抗Ｓ、ｓ抗体との反応性は消失せず、２Ｕ以上で陰性検体の偽陽性反応が発生した。ｐＨ７，８においては０．０５Ｕ〜２Ｕにおいて抗Ｆｙａ、Ｆｙｂ、Ｍ、Ｓ抗体との反応性は消失したが、抗ｓ抗体との反応性は残った。２Ｕ以上に偽陽性反応が発生したので０．０５Ｕ〜１Ｕが至適濃度であると考えた。１Ｕで抗Ｆｙａ、Ｆｙｂ、Ｍ、ｓ抗体との反応性は陰性化したが抗ｓ抗体との反応性は残った。
【００５１】
また、固相前に血球が３％の濃度になるように０〜１６Ｕのブロメリン含有ＰＢＳ（ｐＨ６）溶液で調整し、３７℃で１０〜３０分間処理したものを小麦胚芽レクチン固相マイクロプレートに固相し乾燥を行ったものについても同様に試験した。
【００５２】
固相前に血球処理した場合、室温で１０分間、０．４Ｕ以上の処理で偽陽性反応が発生した。また、０．４Ｕでの処理では、抗Ｆｙａ、Ｆｙｂ、Ｍ抗体との反応性のみが消失した。
【００５３】
＜実施例４：ジチオスレイトール（ＤＴＴ）処理血球の乾燥固定＞
実施例１と同様に小麦胚芽レクチンを固相したマイクロプレートに、Ｏ型のスクリーニング血球（Ｋ、ｋ、Ｋｐｂ、またはＪｓｂ陽性）を固相した。ｐＨ６〜８のＰＢＳに溶解した０〜０．２ＭのＤＴＴを各ウェルに５０μＬずつ分注して室温或いは３７℃で１０〜３０分間処理した。その後、実施例１と同様に処理して抗Ｋ抗体、抗ｋ抗体、抗Ｋｐｂ抗体、抗Ｊｓｂ抗体及び陰性検体との反応性と陰性検体の偽陽性反応の発生を観察した。
【００５４】
その結果、ｐＨ７以下では３７℃で３０分間処理しても抗Ｋ、ｋ、Ｋｐｂ抗体との反応性は消失しなかった。ｐＨ８、３７℃で３０分間インキュベートした場合、０．００６Ｍ以上で抗Ｋ、ｋ、Ｋｐｂ、Ｊｓｂ抗体との反応性が消失した。０．２Ｍ以上に偽陽性反応が発生したので０．００６〜０．１Ｍを至適と考えた。
【００５５】
また、血球を固相前に、血球の濃度が３％になるように０〜０．２ＭのＤＴＴ含有ＰＢＳ（ｐＨ８）で調整し、３７℃で１０〜３０分間処理したものを小麦胚芽レクチン固相マイクロプレートに固相し乾燥を行ったものについても同様に試験した。
【００５６】
しかしながら、固相前のＤＴＴ処理では０．２Ｍでもこれらの反応性は完全に消失しなかったので、固相前のＤＴＴ処理は好ましくないと考えられた。
【００５７】
＜実施例５：抗原処理後に乾燥固定した赤血球の保存性＞
Ｏ型赤血球をマイクロプレートに固相後に、３２０Ｕのトリプシン（ｐＨ８）、１Ｕのパパイン（ｐＨ６）、０．０１２５ＭのＤＴＴ（ｐＨ８）を含む溶液を用いて実施例１〜３と同様に処理後、乾燥固定し、冷蔵庫で６ヶ月間保管したものについて、それぞれの抗体との反応を観察した。この結果を表１に示す。
【００５８】
【表１】
【００５９】
乾燥保存後もＤＴＴ処理血球はＫ、ｋ、ＫｐｂといったＫｅｌｌ系の抗原が失活しており、その他の抗原は保持されていた。パパイン処理血球はＤｕｆｆｙ、Ｍ、Ｓ、Ｇｅ、Ｘｇａ抗原が失活し、その他の抗原は保持されていた。ｓ抗原に関しては反応性が低下しているものの失活はしていなかった。トリプシン処理血球はＬｕｔｈｅｒａｎ、Ｍ、Ｘｇａ抗原が失活していたが、その他の抗原は保持されていた。
【００６０】
【発明の効果】
以上詳述したように、本発明によれば、予め特定の抗原が選択的に失活された赤血球を、長期間安定して使用することが可能となる。
【発明の属する技術分野】
本発明は、血清学的検査容器、特に不規則性抗体の同定に用いる検査容器、およびその製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
輸血、妊娠等のアロ免疫刺激を受けるとしばしば抗赤血球抗体を産生する。この抗赤血球抗体は不規則性抗体と呼ばれ、次回の輸血時に抗体に対して抗原陽性血が体内に入った場合、輸血効果が得られないばかりか重篤な副作用を呈することがある。輸血を行う場合、この副作用を防止する意味合いから、輸血を受ける患者は数種類のＯ型血球（スクリーニング血球）に対して不規則性抗体の有無を調べるいわゆる抗体スクリーニングを実施する。患者がこれらのスクリーニング血球に反応する抗体を持っていた場合は陽性となる。次に、患者が保有する抗体の種類を決定し、その抗体とは反応しない血液を輸血する。この抗体の種類の決定を抗体同定という。抗体同定には、スクリーニングより更に多く（通常１０種類以上）のＯ型血球（パネル血球）を使用して、抗体の特異性を決定する。パネル血球は様々な異なる抗原性の血球からなる。通常は、パネル血球のみで抗体の同定が可能であるが、複数の抗体を保有している場合はパネル血球のみでは判定できない場合があり、さらに異なる抗原性の血球の必要性が生じている。
【０００３】
一方、赤血球上の抗原は、ある種の酵素（血清学でよく使用されるものはパパイン、フィシン、ブロメリン、プロナーゼ、キモトリプシンなど）やスルフヒドリル試薬（ジチオスレイトールや２−メルカプトエタノール）で処理を行うと特定の抗原性が消失するか、または抗体との反応が増強されることは良く知られている（American Red Cross (1993) Immunohematology Methods and Procedures, American Red Cross National Reference Laboratory, Rockville, MD）。たとえば、Ｆｙａ抗原はパパイン処理を行った血球で反応性が消失してしまうが、Ｄ抗原はむしろ反応性が強まる。このように同一血球であっても酵素処理によって特定の抗原が陰性となった血球を調製できる。
【０００４】
さらに、酵素の種類によって血球上の抗原に対して及ぼす効果が違うという特徴もある。たとえばＦｙａ抗原はパパインでは失活するがトリプシンでは失活しない。血清学においてはこのように異なる種類の酵素や化学物質で処理した血球に対して反応性の変化を見て抗体同定を行うことは良く行われている（JR Storry. Immunohematology 2000; 16:101-104）。
【０００５】
このような技術を用いて、酵素や化学物質の種類を変えて処理をすれば、元の血球に対して何種類かの異なる特異性を持つ血球を作ることが出来る。しかしながら、それぞれの処理方法が極めて厳密であり、過剰の処理を行うと偽陽性反応が発生し、また処理が足りないと失活するはずの抗原性が残ることになる。従って、それぞれ最適条件を設定し、正しく処理を行う必要がある。しかも、酵素や化学物質によって最適条件が異なるので数種類の血球を処理することは容易ではない。また、処理した血球を保管するには液体窒素等で凍結する必要があり、その維持管理と血球の凍結、解凍処理が非常に煩雑である。
【０００６】
一方、特開２０００−３２１２６９、特許第３０３０７１０号で述べられているように、赤血球を乾燥固定することで長期にわたり保存が可能であることが知られている。しかしながら、酵素や化学物質で処理した血球をそのまま乾燥固定してもうまくいかない場合が多い。その原因は、酵素処理することで赤血球のペプチド鎖が分解を受けるので、溶血＋乾燥操作により、固相面から血球がはがれてしまったり、血球そのものの構造が破壊されてしまうからだと考えられる。今まで、血球の酵素処理条件については AABB Technical Mannual 13ed p.673-679. に述べられているように、主にパパイン処理による血球上のＤｕｆｆｙ抗原の失活についてのみ調べられていた。また、血球上の抗原に対して酵素の作用は一様でなく、抗原によっても感受性が異なるということは詳細に検討されていなかった。さらに、乾燥固定に適した酵素処理の条件は検討されていなかった。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
従って本発明の目的は、予め特定の抗原を選択的に失活させた赤血球を長期間安定して使用することが可能な血清学的検査容器、およびその製造方法を提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明の一態様に係る血清学的検査容器は、同一プレート上に血清検体収容部としての複数のウェルを有し、各々のウェルの壁面に、非処理の赤血球および特定の抗原を選択的に失活させた赤血球からなる群より選ばれる複数の赤血球のうちいずれかを乾燥固定したことを特徴とする。なお、特定の抗原を選択的に失活させた赤血球および非処理の赤血球は、同一の赤血球由来のものが好ましい。
【０００９】
本発明の他の態様に係る血清学的検査容器の製造方法は、（ａ）未処理の赤血球を血清検体収容部の壁面に固相する工程と、（ｂ）固相した赤血球上の特定の抗原を酵素処理または化学処理により選択的に失活させる工程と、（ｃ）処理後の赤血球に界面活性剤を含有する等張以上の液体を接触させて赤血球の内容物を溶出させる工程と、（ｄ）内容物を溶出させた赤血球に乾燥用溶液を添加した後に乾燥操作を行う工程とを含むことを特徴とする。
【００１０】
工程（ｂ）はたとえば、３２０Ｕ以上のトリプシンを含有するアルカリ性の等張バッファーで室温〜３７℃において至適時間反応させることにより、赤血球上のＬｕｔｈｅｒａｎ、Ｍ、およびＸｇａ抗原のうち少なくとも１種を選択的に失活させる工程である。
【００１１】
工程（ｂ）はたとえば、０．０５Ｕ〜３Ｕの濃度のパパインを含有するｐＨ６の等張バッファーで室温〜３７℃において至適時間反応させることにより、赤血球上のＤｕｆｆｙ、Ｍ、Ｓ、Ｘｇａ、およびＧｅ抗原のうち少なくとも１種を選択的に失活させる工程である。
【００１２】
工程（ｂ）はたとえば、０．０５Ｕ〜１Ｕの濃度のブロメリンを含有するｐＨ６〜８の等張バッファーで室温〜３７℃において至適時間反応させることにより、赤血球上のＤｕｆｆｙ、Ｍ、Ｓ、およびＸｇａ抗原のうち少なくとも１種を選択的に失活させる工程である。
【００１３】
工程（ｂ）はたとえば、０．１〜０．００６Ｍのジチオスレイトールを含有するアルカリ性の等張バッファーで室温〜３７℃において至適時間反応させることにより、赤血球上のＫｅｌｌ系抗原のうち少なくとも１種を選択的に失活させる工程である。
【００１４】
本発明の他の態様に係る血清学的検査容器の製造方法は、（ａ）赤血球上の特定の抗原を酵素処理または化学処理により選択的に失活させる工程と、（ｂ）処理した赤血球を血清検体収容部の壁面に固相する工程と、（ｃ）固相した赤血球に界面活性剤を含有する等張以上の液体を接触させて赤血球の内容物を溶出させる工程と、（ｄ）内容物を溶出させた赤血球に乾燥用溶液を添加した後に乾燥操作を行う工程とを含むことを特徴とする。
【００１５】
工程（ａ）はたとえば、血球濃度３％に対して２０Ｕ以上のトリプシンを含有するアルカリ性の等張バッファーで室温〜３７℃において至適時間反応させることにより、赤血球上のＬｕｔｈｅｒａｎ、Ｍ、およびＸｇａ抗原のうち少なくとも１種を選択的に失活させる工程である。
【００１６】
工程（ａ）はたとえば、血球濃度３％に対して０．４Ｕ以下の濃度のパパインを含有するｐＨ６の等張バッファーで室温〜３７℃において至適時間反応させることにより、赤血球上のＤｕｆｆｙ、Ｍ、Ｓ、Ｘｇａ、およびＧｅ抗原のうち少なくとも１種を選択的に失活させる工程である。
【００１７】
工程（ａ）はたとえば、血球濃度３％に対して０．４Ｕ以下のブロメリンを含有するｐＨ６の等張バッファーで室温〜３７℃において至適時間反応させることにより、赤血球上のＤｕｆｆｙ、Ｍ、およびＸｇａ抗原のうち少なくとも１種を選択的に失活させる工程である。
【００１８】
【発明の実施の形態】
以下、本発明をより詳しく説明する。
【００１９】
本発明に係る血清学的検査容器は、赤血球上に存在する特定の抗原を、酵素または化学物質で処理することにより選択的に失活させた赤血球を血清検体収容部の壁面に乾燥固定することにより、所望の抗原性を有する赤血球を長期にわたり安定して使用できるようにしたものである。ここで、本発明において特定の抗原とは、通常赤血球上に存在し得るいかなる抗原であっても良い。たとえば、Ｌｕｔｈｅｒａｎ、Ｍ、およびＸｇａ抗原のうち少なくとも１種、Ｄｕｆｆｙ、Ｍ、Ｓ、Ｘｇａ、およびＧｅ抗原のうち少なくとも１種、Ｄｕｆｆｙ、Ｍ、Ｓ、およびＸｇａ抗原のうち少なくとも１種、またはＫｅｌｌ系抗原のうち少なくとも１種であることが好ましい。
【００２０】
本発明の血清学的検査容器は、同一プレート上に血清検体収容部としての複数のウェルを有するマイクロプレートであることが好ましい。検査容器はプラスチック製であることが好ましく、さらに、底面の形状がＵまたはＶ状であることが好ましいが、限定されるものではない。
【００２１】
また、本発明の血清学的検査容器は、マイクロプレートの各々のウェルの壁面に、抗原に対して処理を施していない非処理の赤血球および特定の抗原を選択的に失活させた種々の赤血球からなる群より選ばれる複数の赤血球のうちいずれかが乾燥固定されていてもよい。なお、特定の抗原を選択的に失活させた赤血球および非処理の赤血球は、同一の赤血球由来のものであってもよい。
【００２２】
酵素や化学物質で処理した赤血球を乾燥するには、それぞれ最適な条件が必須である。従って本発明者らは、赤血球を単に酵素処理または化学処理して乾燥するのではなく、異なる濃度の酵素に対して、各抗原がどのような反応挙動を取るかを明らかにし、乾燥固定化に適した条件を検討した。以下、本発明に係る血清学的検査容器の製造方法を示す。なお、以下の説明においてはマイクロプレートの各ウェルに赤血球を乾燥固定する方法を示すが、本発明はこれに限定するものではない。
【００２３】
本発明の製造方法の第１の実施形態としては、赤血球をウェルに固相後に、酵素または化学物質により処理し、これを乾燥固定する。具体的には、たとえばレクチンを使用する大釜らの方法（J Ohgama et al., Transfusion Medicine 1996; 6: 351-359）に従って、レクチン、抗赤血球抗体、またはポリカチオンなどを介して赤血球をウェル底面に固相後、洗浄して余分な赤血球を除去する。なお、レクチンは小麦胚芽レクチンであることが好ましい。
【００２４】
この固相赤血球に対して種々の濃度、ｐＨの酵素溶液または化学物質を添加し反応を行う。ここで用いる酵素としては、トリプシン、パパイン、ブロメリン、フィシン、キモトリプシン、およびプロナーゼなどが好ましい。また、化学物質としては、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）および２−メルカプトエタノール（２−Ｍｅ）等のスルフヒドリル試薬が好ましい。
【００２５】
酵素処理は、その酵素活性値とｐＨに強く影響を受ける。また、化学処理または酵素処理に対する抗原の感受性もそれぞれ異なり、強い処理でなければ消えない抗原もある。従って、失活させようとする抗原によってそれぞれ最適な条件を明らかにした上で、赤血球を乾燥する必要がある。本発明においては、失活させようとする抗原の抗体との反応性が消失し、かつ陰性検体に偽陽性反応が発生しないための条件を設定した。すなわち、失活させようとする抗原によって、ウェル内壁に固相した赤血球に対して以下の処理を施す。
【００２６】
赤血球上のＬｕｔｈｅｒａｎ、Ｍ、およびＸｇａ抗原のうち少なくとも１種を失活させるには、３２０Ｕ以上のトリプシンを含有するアルカリ性（好ましくはｐＨ８以上）の等張バッファーを固相した赤血球に添加し、室温〜３７℃において至適時間反応させる。
【００２７】
赤血球上のＤｕｆｆｙ、Ｍ、Ｓ、Ｘｇａ、およびＧｅ抗原のうち少なくとも１種を失活させるには、０．０５Ｕ〜３Ｕの濃度のパパインを含有するｐＨ６の等張バッファーを固相した赤血球に添加し、室温〜３７℃において至適時間反応させる。
【００２８】
赤血球上のＤｕｆｆｙ、Ｍ、Ｓ、およびＸｇａ抗原のうち少なくとも１種を失活させるには、０．０５Ｕ〜１Ｕの濃度のブロメリンを含有するｐＨ６〜８の等張バッファーを固相した赤血球に添加し、室温〜３７℃において至適時間反応させる。
【００２９】
赤血球上のＫｅｌｌ系抗原のうち少なくとも１種を失活させるためには、０．１〜０．００６ＭのＤＴＴを含有するアルカリ性（好ましくはｐＨ８以上）の等張バッファーを固相した赤血球に添加し、室温〜３７℃において至適時間反応させる。
【００３０】
なお、反応時間は条件によって異なるが、１０〜３０分程度が好ましい。
【００３１】
上述したような条件で処理した赤血球を、玉井らの方法（特開２０００−３２１２６９）に従って乾燥固定する。すなわち、処理した赤血球を洗浄後、低濃度の界面活性剤を含有する等張以上の液体を接触させることにより穏やかに内容物を排出し、さらに洗浄後、糖類およびタンパク質を含有する乾燥用溶液を添加し、軽く水切りした後に真空乾燥、自然乾燥、または風乾などにより乾燥させる。界面活性剤としては、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００等が使用できる。また、糖類としてはサッカロース等、タンパク質としてはＢＳＡ等の動物の血清タンパク質を使用することが好ましい。なお、赤血球の溶血方法としては、界面活性剤を用いる他に、低張液を用いて赤血球を破裂させる方法等を用いることも可能であるが、乾燥固定後の赤血球の状態を良好に保つためには界面活性剤を用いることが最も好ましい。
【００３２】
本発明の第２の実施形態においては、赤血球をマイクロプレートに固相する前に、予め試験管等で浮遊状態の赤血球を酵素または化学物質で処理する。処理した赤血球は洗浄後、第１の実施形態において説明したのと同様の方法でウェル底面に固相し、乾燥固定する。ここで、赤血球を処理するのに好ましい酵素または化学物質は、第１の実施形態において説明したものと同じである。しかしながら、固相前の赤血球処理は赤血球の濃度、処理するスケール、および撹拌条件など別のファクターが加わってくるため、前述した第１の実施形態において赤血球を固相後に酵素処理する場合とは、適正な濃度がそれぞれ異なる。赤血球をマイクロプレートに固相する前に処理を行う場合には、固相前の赤血球に対して次の処理を施す。
【００３３】
赤血球上のＬｕｔｈｅｒａｎ、Ｍ、およびＸｇａ抗原を失活させるには、血球濃度３％に対して２０Ｕ以上のトリプシンを含有するアルカリ性の等張バッファーを赤血球に添加し、室温〜３７℃において至適時間反応させる。
【００３４】
赤血球上のＤｕｆｆｙ、Ｍ、Ｓ、Ｘｇａ、およびＧｅ抗原のうち少なくとも１種を失活させるには、血球濃度３％に対して０．４Ｕ以下の濃度のパパインを含有するｐＨ６の等張バッファーを赤血球に添加し、室温〜３７℃において至適時間反応させる。
【００３５】
赤血球上のＤｕｆｆｙ、Ｍ、およびＸｇａ抗原のうち少なくとも１種を失活させるには、血球濃度３％に対して０．４Ｕ以下のブロメリンを含有するｐＨ６の等張バッファーを赤血球に添加し、室温〜３７℃において至適時間反応させる。
【００３６】
なお、反応時間は条件によって異なるが、１０〜３０分程度が好ましい。
【００３７】
また、上述した条件で処理した各種赤血球と非処理の赤血球からなる群の中から選ばれる少なくとも２種の赤血球とを同一のマイクロプレートの別々のウェルにそれぞれ乾燥固定することにより、抗体の同定、確認が容易に実施できる赤血球パネルを作製することができる。さらに、これらの赤血球を全て同一の赤血球から作製しても良い。
【００３８】
通常、目的の抗原性を有する赤血球は必ずしも自然界に存在するものではない。従って従来は、所望の赤血球が見つからない場合には、その都度既存の赤血球に対して種々の処理を行う必要があった。しかも処理した血球は長期間の保存ができなかった。本発明によれば、所望の処理方法を用いることにより目的の抗原性を有する種々の赤血球を調製することができる。さらに、同一の赤血球から異なる抗原性を有する複数種の赤血球を作製することも可能である。これらを予めマイクロプレートの各ウェルに乾燥固定した検査容器を提供することにより、今まで煩わしかった酵素処理をする必要がなくなる。
【００３９】
本発明の検査容器を用いて不規則性抗体を同定するには、ＥＩＡ法（酵素免疫測定法）、ＲＩＡ法（ラジオイムノアッセイ）、ＦＩＡ法（蛍光標識免疫測定法）、またはＣＩＡ法（化学発光免疫測定法）などを用いることができる。また、抗ヒトグロブリン抗体が感作されている磁性体含有の指示粒子を用いる玉井らの方法（T Tamai. et al., Transfusion Medicine 1999; 9: 351-359.）を用いることもできる。すなわち、赤血球が乾燥固定された本発明の容器にグリシンＬＩＳＳ（低イオン強度溶液）を添加し、ここに血清などの検体を添加し、３７℃で１０分間インキュベート後、生食溶液で洗浄する。ここに抗ヒトＩｇＧ抗体が感作された磁性体含有の指示粒子を添加し、容器を磁石上に一定時間放置する。これを容器の上または下から観察すると、陽性の場合は指示粒子が広がった像が得られ、陰性の場合は中心に集まった像が得られる。この方法によれば、遠心操作を使用せずに磁力によってパターン形成することができる。なお、ここで用いる指示粒子に予め感作された物質は抗ヒトＩｇＧ抗体に限定されず、プロテインＧまたはプロテインＡ等の、免疫グロブリンに特異的に結合する物質であれば良い。
【００４０】
【実施例】
以下本発明を実施例により説明するが、本発明はそれらに限定されるものではない。
【００４１】
＜実施例１：トリプシン処理血球の乾燥固定＞
小麦胚芽レクチンを固相したマイクロプレートに、Ｏ型のスクリーニング血球（Ｌｕａ、Ｍ、ＦｙａまたはＦｙｂ陽性）を固相した。ｐＨ６〜８のＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）に溶解した０〜２７２０Ｕのトリプシン溶液を各ウェルに５０μＬずつ分注して３７℃或いは室温で１０〜３０分間処理した。その後０．０１２５％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００（シグマ社製）を含む生食溶液を分注し、血球を溶血させた。これを洗浄して血球の内容物とＴｒｉｔｏｎＸ−１００を除去した後、ＢＳＡ添加のサッカロース溶液を分注して軽く水切りを行い、常温減圧下で乾燥した。その後、玉井らの方法（T Tamai. et al., Transfusion Medicine 1999; 9: 351-359.）に従ってアッセイした。すなわち、乾燥後グリシンＬＩＳＳ（低イオン強度溶液）を分注して抗Ｌｕａ抗体、抗Ｍ抗体、抗Ｆｙａ抗体、抗Ｆｙｂ抗体、および陰性検体を分注し、３７℃１０分間インキュベート後、生食溶液で５回洗浄した。最後に抗ヒトＩｇＧ抗体感作磁性体粒子を分注し、これを磁石上に放置してパターン形成することにより、抗Ｌｕａ抗体、抗Ｍ抗体、抗Ｆｙａ抗体、および抗Ｆｙｂ抗体との反応性と陰性検体の偽陽性反応の発生を観察した。
【００４２】
その結果、固相した赤血球のトリプシン処理において、ｐＨ７以下では抗Ｍ抗体、抗Ｌｕａ抗体の反応性は消失しなかった。ｐＨ８で室温〜３７℃において３０分間インキュベートすることによって３２０Ｕ以上で抗Ｍ抗体、抗Ｌｕａ抗体との反応性は消失し、抗Ｆｙａ抗体との反応性は残り、偽陽性反応の発生も２５６０Ｕまで認めなかった。
【００４３】
また、赤血球を固相前に、赤血球の濃度が３％になるように０〜２７２０Ｕのトリプシン含有ＰＢＳ（ｐＨ８）溶液で調製し、３７℃或いは室温で１０〜３０分間処理したものを、小麦胚芽レクチンを固相したマイクロプレートに固相し、乾燥を行ったものについても同様に試験した。
【００４４】
固相前の血球処理では、室温〜３７℃で３０分間、２０Ｕで処理することで、抗Ｍ、抗Ｌｕａ抗体との反応性は消失し、偽陽性反応の発生も２５６０Ｕまで認めなかった。
【００４５】
＜実施例２：パパイン処理血球の乾燥固定＞
実施例１と同様に小麦胚芽レクチンを固相したマイクロプレートに、Ｏ型のスクリーニング血球（Ｓ、ｓ、Ｍ、Ｆｙａ、またはＦｙｂ陽性）を固相した。カゼイン分解法で活性値を求めたパパイン溶液をｐＨ６〜８のＰＢＳで希釈して０〜１６Ｕに調整した。各ウェルにパパイン溶液を５０μＬずつ分注して室温で１０〜３０分間処理した。その後、実施例１と同様に処理して抗Ｆｙａ抗体、抗Ｆｙｂ抗体、抗Ｓ抗体、抗ｓ抗体、および陰性検体との反応性と陰性検体の偽陽性反応の発生を観察した。
【００４６】
その結果、ｐＨ７以上では抗Ｍ，ｓ抗体との反応性は消失しなかった。ｐＨ６では、室温で１０〜３０分間インキュベートした場合、３．７５Ｕ以上で偽陽性反応が発生したので、パパイン処理においては０．０５Ｕ〜３Ｕを至適濃度と考えた。１Ｕで抗Ｆｙａ、Ｆｙｂ、Ｍ、Ｓ抗体との反応性は陰性化したが抗ｓ抗体との反応性は残った。０．０５Ｕでは抗Ｆｙａ、Ｆｙｂ抗体との反応性は陰性化したが、抗Ｍ、Ｓ、ｓ抗体との反応性は残った。
【００４７】
また、血球を固相前に、血球の濃度が３％になるように０〜３０Ｕのパパイン含有ＰＢＳ（ｐＨ６）溶液で調整し、３７℃或いは室温で１０〜３０分間処理したものを小麦胚芽レクチン固相マイクロプレートに固相し、乾燥を行ったものについても同様に試験した。
【００４８】
固相前に血球処理した場合、室温で３０分間、０．４Ｕ以上のパパインで処理したものにおいて偽陽性反応が発生し、０．４Ｕでの処理では、抗Ｆｙａ、Ｆｙｂ、Ｍ、Ｓ抗体との反応性が消失した。
【００４９】
＜実施例３：ブロメリン処理血球の乾燥固定＞
実施例１と同様に、小麦胚芽レクチンを固相したマイクロプレートに、Ｏ型のスクリーニング血球（Ｓ、ｓ、Ｍ、Ｆｙａ、またはＦｙｂ陽性）を固相した。予めカゼイン分解法で活性値を求めたブロメリン溶液をｐＨ６〜８のＰＢＳで希釈して０〜１６Ｕの濃度になるように調整した。各ウェルにブロメリン溶液を５０μＬずつ分注して室温で１０分間処理した。その後、実施例１と同様に処理して抗Ｆｙａ抗体、抗Ｆｙｂ抗体、抗Ｍ抗体、抗Ｓ抗体、抗ｓ抗体および陰性検体との反応性と陰性検体の偽陽性反応の発生を観察した。
【００５０】
その結果、ｐＨ６以下では０．０５Ｕ〜２Ｕの範囲で抗Ｆｙａ、Ｆｙｂ、Ｍ抗体との反応性は消失したが、抗Ｓ、ｓ抗体との反応性は消失せず、２Ｕ以上で陰性検体の偽陽性反応が発生した。ｐＨ７，８においては０．０５Ｕ〜２Ｕにおいて抗Ｆｙａ、Ｆｙｂ、Ｍ、Ｓ抗体との反応性は消失したが、抗ｓ抗体との反応性は残った。２Ｕ以上に偽陽性反応が発生したので０．０５Ｕ〜１Ｕが至適濃度であると考えた。１Ｕで抗Ｆｙａ、Ｆｙｂ、Ｍ、ｓ抗体との反応性は陰性化したが抗ｓ抗体との反応性は残った。
【００５１】
また、固相前に血球が３％の濃度になるように０〜１６Ｕのブロメリン含有ＰＢＳ（ｐＨ６）溶液で調整し、３７℃で１０〜３０分間処理したものを小麦胚芽レクチン固相マイクロプレートに固相し乾燥を行ったものについても同様に試験した。
【００５２】
固相前に血球処理した場合、室温で１０分間、０．４Ｕ以上の処理で偽陽性反応が発生した。また、０．４Ｕでの処理では、抗Ｆｙａ、Ｆｙｂ、Ｍ抗体との反応性のみが消失した。
【００５３】
＜実施例４：ジチオスレイトール（ＤＴＴ）処理血球の乾燥固定＞
実施例１と同様に小麦胚芽レクチンを固相したマイクロプレートに、Ｏ型のスクリーニング血球（Ｋ、ｋ、Ｋｐｂ、またはＪｓｂ陽性）を固相した。ｐＨ６〜８のＰＢＳに溶解した０〜０．２ＭのＤＴＴを各ウェルに５０μＬずつ分注して室温或いは３７℃で１０〜３０分間処理した。その後、実施例１と同様に処理して抗Ｋ抗体、抗ｋ抗体、抗Ｋｐｂ抗体、抗Ｊｓｂ抗体及び陰性検体との反応性と陰性検体の偽陽性反応の発生を観察した。
【００５４】
その結果、ｐＨ７以下では３７℃で３０分間処理しても抗Ｋ、ｋ、Ｋｐｂ抗体との反応性は消失しなかった。ｐＨ８、３７℃で３０分間インキュベートした場合、０．００６Ｍ以上で抗Ｋ、ｋ、Ｋｐｂ、Ｊｓｂ抗体との反応性が消失した。０．２Ｍ以上に偽陽性反応が発生したので０．００６〜０．１Ｍを至適と考えた。
【００５５】
また、血球を固相前に、血球の濃度が３％になるように０〜０．２ＭのＤＴＴ含有ＰＢＳ（ｐＨ８）で調整し、３７℃で１０〜３０分間処理したものを小麦胚芽レクチン固相マイクロプレートに固相し乾燥を行ったものについても同様に試験した。
【００５６】
しかしながら、固相前のＤＴＴ処理では０．２Ｍでもこれらの反応性は完全に消失しなかったので、固相前のＤＴＴ処理は好ましくないと考えられた。
【００５７】
＜実施例５：抗原処理後に乾燥固定した赤血球の保存性＞
Ｏ型赤血球をマイクロプレートに固相後に、３２０Ｕのトリプシン（ｐＨ８）、１Ｕのパパイン（ｐＨ６）、０．０１２５ＭのＤＴＴ（ｐＨ８）を含む溶液を用いて実施例１〜３と同様に処理後、乾燥固定し、冷蔵庫で６ヶ月間保管したものについて、それぞれの抗体との反応を観察した。この結果を表１に示す。
【００５８】
【表１】
乾燥保存後もＤＴＴ処理血球はＫ、ｋ、ＫｐｂといったＫｅｌｌ系の抗原が失活しており、その他の抗原は保持されていた。パパイン処理血球はＤｕｆｆｙ、Ｍ、Ｓ、Ｇｅ、Ｘｇａ抗原が失活し、その他の抗原は保持されていた。ｓ抗原に関しては反応性が低下しているものの失活はしていなかった。トリプシン処理血球はＬｕｔｈｅｒａｎ、Ｍ、Ｘｇａ抗原が失活していたが、その他の抗原は保持されていた。
【００６０】
【発明の効果】
以上詳述したように、本発明によれば、予め特定の抗原が選択的に失活された赤血球を、長期間安定して使用することが可能となる。
Claims (10)
- （ａ）未処理の赤血球を血清検体収容部の壁面に固相する工程と、
（ｂ）３２０Ｕ以上のトリプシンを含有するアルカリ性の等張バッファーで室温〜３７℃において至適時間反応させることにより、前記赤血球上のＬｕｔｈｅｒａｎ、Ｍ、およびＸｇ ａ 抗原のうち少なくとも１種を選択的に失活させる工程と、
（ｃ）前記処理後の赤血球に界面活性剤を含有する等張以上の液体を接触させて前記赤血球の内容物を溶出させる工程と、
（ｄ）前記内容物を溶出させた赤血球に乾燥用溶液を添加した後に乾燥操作を行う工程と
を含む血清学的検査容器の製造方法。 - （ａ）未処理の赤血球を血清検体収容部の壁面に固相する工程と、
（ｂ）０．０５Ｕ〜３Ｕの濃度のパパインを含有するｐＨ６の等張バッファーで室温〜３７℃において至適時間反応させることにより、前記赤血球上のＤｕｆｆｙ、Ｍ、Ｓ、Ｘｇ ａ およびＧｅ抗原のうち少なくとも１種を選択的に失活させる工程と、
（ｃ）前記処理後の赤血球に界面活性剤を含有する等張以上の液体を接触させて前記赤血球の内容物を溶出させる工程と、
（ｄ）前記内容物を溶出させた赤血球に乾燥用溶液を添加した後に乾燥操作を行う工程と
を含む血清学的検査容器の製造方法。 - （ａ）未処理の赤血球を血清検体収容部の壁面に固相する工程と、
（ｂ）０．０５Ｕ〜１Ｕの濃度のブロメリンを含有するｐＨ６〜８の等張バッファーで室温〜３７℃において至適時間反応させることにより、前記赤血球上のＤｕｆｆｙ、Ｍ、Ｓ、およびＸｇ ａ 抗原のうち少なくとも１種を選択的に失活させる工程と、
（ｃ）前記処理後の赤血球に界面活性剤を含有する等張以上の液体を接触させて前記赤血球の内容物を溶出させる工程と、
（ｄ）前記内容物を溶出させた赤血球に乾燥用溶液を添加した後に乾燥操作を行う工程と
を含む血清学的検査容器の製造方法。 - （ａ）未処理の赤血球を血清検体収容部の壁面に固相する工程と、
（ｂ）０．１〜０．００６Ｍのジチオスレイトールを含有するアルカリ性の等張バッファーで室温〜３７℃において至適時間反応させることにより、前記赤血球上のＫｅｌｌ系抗原のうち少なくとも１種を選択的に失活させる工程と、
（ｃ）前記処理後の赤血球に界面活性剤を含有する等張以上の液体を接触させて前記赤血球の内容物を溶出させる工程と、
（ｄ）前記内容物を溶出させた赤血球に乾燥用溶液を添加した後に乾燥操作を行う工程と
を含む血清学的検査容器の製造方法。 - （ａ）血球濃度３％に対して２０Ｕ以上のトリプシンを含有するアルカリ性の等張バッファーで室温〜３７℃において至適時間反応させることにより、赤血球上のＬｕｔｈｅｒａｎ、Ｍ、およびＸｇ ａ 抗原のうち少なくとも１種を選択的に失活させる工程と、
（ｂ）前記処理した赤血球を血清検体収容部の壁面に固相する工程と、
（ｃ）前記固相後の赤血球に界面活性剤を含有する等張以上の液体を接触させて前記赤血球の内容物を溶出させる工程と、
（ｄ）前記内容物を溶出させた赤血球に乾燥用溶液を添加した後に乾燥操作を行う工程と
を含む血清学的検査容器の製造方法。 - （ａ）血球濃度３％に対して０．４Ｕ以下の濃度のパパインを含有するｐＨ６の等張バッファーで室温〜３７℃において至適時間反応させることにより、赤血球上のＤｕｆｆｙ、Ｍ、Ｓ、Ｘｇ ａ 、およびＧｅ抗原のうち少なくとも１種を選択的に失活させる工程と、
（ｂ）前記処理した赤血球を血清検体収容部の壁面に固相する工程と、
（ｃ）前記固相後の赤血球に界面活性剤を含有する等張以上の液体を接触させて前記赤血球の内容物を溶出させる工程と、
（ｄ）前記内容物を溶出させた赤血球に乾燥用溶液を添加した後に乾燥操作を行う工程と
を含む血清学的検査容器の製造方法。 - （ａ）血球濃度３％に対して０．４Ｕ以下のブロメリンを含有するｐＨ６の等張バッファーで室温〜３７℃において至適時間反応させることにより、赤血球上のＤｕｆｆｙ、Ｍ、およびＸｇ ａ 抗原のうち少なくとも１種を選択的に失活させる工程と、
（ｂ）前記処理した赤血球を血清検体収容部の壁面に固相する工程と、
（ｃ）前記固相後の赤血球に界面活性剤を含有する等張以上の液体を接触させて前記赤血球の内容物を溶出させる工程と、
（ｄ）前記内容物を溶出させた赤血球に乾燥用溶液を添加した後に乾燥操作を行う工程と
を含む血清学的検査容器の製造方法。 - 請求項１から請求項７の何れか 1 項に記載の製造方法によって製造された血清学的検査容器。
- 同一プレート上に血清検体収容部としての複数のウェルを有した血清学的検査容器であって、
前記複数のウェルのうち少なくとも１つのウェルの壁面に、請求項１から請求項７の何れか 1 項に記載の製造方法の工程（ａ）から（ｄ）によって特定の抗原を選択的に失活させ乾燥固定させた赤血球を具備し、
当該同一プレート上の前記特定の抗原を失活させた赤血球を乾燥固定させたウェルとは異なるウェルの壁面に、乾燥固定させた非処理の赤血球を具備する
血清学的検査容器。 - 前記特定の抗原を選択的に失活させた赤血球および前記非処理の赤血球が、同一の赤血球由来であることを特徴とする請求項９に記載の血清学的検査容器。
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