JP4399162B2

JP4399162B2 - 免疫学的疾患治療用ハーブ系医薬組成物

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Publication number: JP4399162B2
Application number: JP2002549274A
Authority: JP
Inventors: スウ，チン・シャン; シュウ，シュン・チー
Original assignee: Sun Ten Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Sun Ten Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2000-12-14
Filing date: 2001-12-03
Publication date: 2010-01-13
Anticipated expiration: 2021-12-03
Also published as: JP2004518648A; US20020122833A1; CA2431852A1; EP1359927A4; AU4154402A; WO2002047704A1; CN1479625A; CN100482262C; AU2002241544B9; AU2002241544B2; WO2002047704A9; US6503542B2; EP1359927A1; CH695663A5

Description

本発明は、免疫学的疾患患者治療用の医薬組成物、ならびにその製造方法に関する。特に、この医薬組成物は、(1)ジャノヒゲ(Ophiopogon, Tuber Ophiopogonis)、(2)カラスビシャク(pinellia, Tuber Pinelliae)、及び(3)生カンゾウ(raw licorice, Radix Glycyrrhizae)、ならびに(4)長柄菊(lantern tridax, Herba Tridacis procumbentis)のハーブを含み、５番目のハーブとして、アメリカニンジン(American ginseng, Radix Pancis Quinquefolii)を含む。本ハーブ系医薬組成物は、免疫グロブリンＥ(ＩｇＥ)介在性疾患に有効な治療に使用され、このような疾患としては、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、アレルギー性喘息、アトピー性湿疹、アトピー性皮膚炎、食物アレルギー、高ＩｇＥ症候群（hyper IgE syndrome）が含まれる。

抗原誘発性、特にアレルゲン誘発性の免疫学的疾患は、全世界の人口の２０％を超える人々を苦しめ、重篤な健康上の問題を引き起こす。このような免疫学的疾患の一例が喘息である。近年、アレルギー関連性の免疫学的疾患の症状の発現が若年層にシフトしてきており、ますます多くの子供や青年がアレルゲン誘発性免疫学的疾患の徴候を発現してきている。

例えば、台湾では、小児喘息の患者が１９７４年の１．３％から１９８５年には５．０７％に、１９９１年には５．８％に増加した。また、アレルギー性鼻炎の発生率は、１９８５年の７．８４％から１９９１年の２０．６７％に増加した。さらに、アトピー性湿疹の発生は、１９７４年には１．４３％であったが、１９８５年には１．２３％、１９９１年には３．８４％に上昇した。アレルゲン関連性免疫学的疾患の早期の発現は、環境汚染によるのかもしれない。

呼吸器アレルギーは、ＩｇＥ介在性免疫反応である（Brinker, J. Naturopathic Medicine, 4: 64-68 (1993)）。主要な呼吸器アレルギー反応は２つあり、それはアレルギー性鼻炎とアレルギー性気管支喘息である。アレルギー性鼻炎は花粉症としても知られるが、これは抗原／ＩｇＥの感作マスト細胞及び好塩基球への結合により起こる。この結合はｃＡＭＰの減少を起こし、これが次々と好酸球走化因子及びヒスタミンの放出をもたらす。そして、ヒスタミンがＨ１−受容体に結合し、血管拡張、毛細管透過性、及び平滑筋収縮の増大を起こし、これらは水様分泌物、くしゃみ、及び目のかゆみを伴った鼻のうっ血として現れる。

アレルギー性喘息はもう一つのＩｇＥ介在性の免疫反応であり、この反応においてはマスト細胞がヒスタミン、ブラジキニン、及びアナフィラキシーならびにトロンボキサン／プロスタグランジン気管支収縮剤のロイコトリエン遅反応性物質を含むアラキドン酸代謝産物を放出する。血小板活性化因子は、たくさんの白血球から放出される別の強力な喘息メディエーターである。このような状況下で、ｃＡＭＰの減少後に放出されるヒスタミンは、Ｈ１−受容体に作用して気管支痙攣を起こす。また、ヒスタミンはコリン作動性反射作用及びアナフィラキシーにおけるプロスタグランジン生成の半分であることにより、気管支収縮の原因となる。

罹患人口のパーセンテージ及び疾患の深刻度は上昇しており、アレルギー性反応の治療方法は、科学的なアプローチよりもまだ主として経験的な偶然の発見に依存している。ほとんどのアレルギー患者は、効果細胞によるメディエーターの放出の結果生じた症状をコントロールすることを目的とした薬剤で治療される。いくつかの薬剤は、副作用なしに短期間の症状解消に効果的なようである。しかしながら、いかなる副作用もなく長期にわたって疾患進行を防止し、永久的に病気を撲滅する効果を有する薬剤はこれまで見出されていない。例えば、ステロイド治療のような喘息を治療するための長期経口療法は、成長遅滞、骨粗鬆症、及び副腎皮質機能抑制のような多数の衰弱作用を伴うことが現在知られている。

伝統的な中国のハーブ及び医薬用の組み合わせは、免疫学的疾患治療の選択肢を提供する。伝統的中国ハーブ及びハーブの組み合わせは、免疫系機能を改善し、様々な慢性免疫学的疾患を治療するものとして知られている。例えば、Hamasaki et al., J. Ethnopharmacology, (1997) 56:123-131は、漢方薬シンピ湯(Shinpi-To)を開示し、これは、ラット好塩基球性白血病−２Ｈ３細胞におけるＩｇＥ介在性ロイコトリエン合成を阻害する。シンピ湯は、Ephedrae herba (Ephedra sinica Stapf), Armeniacae semen (Prunus armeniaca Linne), Magnoliae cortex (Magnolia obovata Thunberg), Aurantii nobilis Pericarpium (Citrus unshiu Markovich), Glycyrrhizae radix (Glycyrrhiza uvalensis Fischer), Bupleuri radix (Bupleurum falcatum L.), and Perillae herba (Perilla frutescens Britton var. acuta Kudo)を含む７つの薬用ハーブの抽出物から調製されたフリーズドライの顆粒状漢方薬である。シンピ湯は、小児喘息の治療に有用である。

Toda et al., J. Ethnopharmacology, (1988) 24:303-309は、漢方薬サイボク湯(Saiboku-To)を開示しており、これはマウス腹膜マスト細胞からのヒスタミン放出に抑制効果を示す。サイボク湯は、喘息の治療に有用であり、Bupleurum falcatum L., Pinelliae ternata Breitenbach, Poria cocos Wolf., Scutellaria baicalensis Georgi, Zizyphus vulgaris Lam., Panax ginseng C.A. Meyer, Magnolia oborata Thumberg, Glycyrrhiza glabra L., Perilllae frutescens Britton var. acuta Kudo, and Zingiber officinale Roscoeを含む１０の薬用ハーブを含む。

Li et al., Immunopharmacology, (1999), 43:11-21は、漢方薬ホチュエッキ湯(Hochu-Ekki-To)を開示し、これはストレス誘発性免疫抑制を復活する効果を示す。ホチュエッキ湯は、Ginseng Rx., Atractylodis alba Rz., Astragali Rx., Angelicae sinensis Rx., Jujubae Fr., Citri reticulatae Pc., Bupleuri Rx., Glycyrrhizae Rx. Preparata, Zingiberis recens Rz., and Cimicifugae Rz を含む１０の成分からなる。

Zou et al., Chinese Traditional and Western Medical Magazine, 529-532 (1996)は、寒冷タイプの喘息患者の治療のための漢方薬ウェンヤントンロウ混合物(Wenyang Tongluo mixture)を開示している。これは、肺換気機能改善効果、末梢血リンパ球のアドレナリン作動性β−受容体の調節効果、及び５−ヒドロキシトリプタミンの血清レベルの減少効果を示す。ウェンヤントンロウ混合物は、Red Ginseng, Zhi Fu Pian, Yin Yang Huo, Dried Ginger (Zingiberis recens Rz.), Zhi Huang Zhi, Angelicae sinesis Rx., Ephedra, Polygalae Rx., Sang Baipi, Sheng Shi Gao, Schisandrae Fr., and Licorice (Glycyrrhizae Rx. Preparata)を含むの１２の薬用ハーブを含む。

気管支炎及び気管支喘息治療用の煎薬が、インターネットで公開されている(www.herb.com.tw)。この煎薬は、Ophiopogonis Rx., Pinelliae Rz. Preparata, Oryzae Sm., Jujubae Fr., Ginseng Rx., and Glycyrrhizae Rxを含む６のハーブの組み合わせからなる。
漢方薬の品質管理は、ハーブから医薬組成物を開発する上で重要である。ハーブの含有量及び活性成分は、生育条件や生育地、収穫時期や収穫技術、収穫したハーブの製造方法や加工方法などの因子で変動することがある。これら重要な因子が揃わなければ、漢方薬の有効性は脅かされる。にもかかわらず、漢方薬の品質を確実にモニターする科学的な方法は報告あるいは採用されていない。

本発明は、主として中国及び台湾で見られるハーブに由来する新規で無毒な医薬組成物を提供するものである。これらハーブの組み合わせ使用は、何れの文献や報告にも認められない。これら医薬組成物は、免疫学的疾患、特にＩｇＥ介在性疾患の患者の治療に有効である。本発明の医薬組成物は、インターロイキン４(IL-4)合成のダウンレギュレーション及びＩｇＥ抑制に顕著な効果を示す。また、本発明においては、ハーブの品質を効果的にコントロールするために、薄層クロマトグラフィー(TLC)及び高速液体クロマトグラフィー(HPLC)を用いて各ハーブの指紋をとり、組成物に用いた各ハーブが一貫した再現性のある成分を含むことを保証する。

本発明は、必須ハーブとして、ジャノヒゲ(Ophiopogon, Tuber Ophiopogonis)、カラスビシャク(Pinellia, Tuber Pinelliae)、及び生カンゾウ(raw Licorice, Radix Glycyrrhizae)と、長柄菊(Lantern Tridax, Herba Tridacis procumbentis)を含む医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物は、さらにアメリカニンジン(American ginseng, Radix Pancis Quinquefolii)を含む。好ましいハーブの重量比は、ジャノヒゲ：カラスビシャク：生カンゾウ：アメリカニンジン：長柄菊が３：２：１：１：１である。

最も好ましい医薬組成物は、ジャノヒゲ、カラスビシャク、生カンゾウ、アメリカニンジン、及び長柄菊を含む。これらハーブの有効成分は、水あるいは有機溶媒により抽出することができるか、あるいはハーブを直接粉砕して得られた粉末状であることができる。

一つの例として、この医薬組成物は水性抽出物のジャノヒゲ、及び粉末であるその他のハーブを含む。ジャノヒゲの水性抽出物は、好ましくは水中での抽出により調製される。
もう一つの例として、この医薬組成物は、ジャノヒゲ、カラスビシャク、生カンゾウ、及びアメリカニンジンの水性抽出物、好ましくは水抽出物と、長柄菊水性抽出物、好ましくはアルコール抽出物（最も好ましくは５０％アルコール抽出物）とを含む。

また、本発明は、ハーブの水性抽出物及び／又は粉末を調製することを含む医薬組成物の製造方法を提供する。一つの例としては、ジャノヒゲ以外のその他の全てのハーブを細かく切り、乾燥、粉砕し、ふるいにかけてハーブ粉末を調製する。ジャノヒゲの成分は、ジャノヒゲを水中で煮沸、濃縮して抽出する。ジャノヒゲ抽出物（濾過したもの）は、濃縮されたジャノヒゲ−水混合物を濾過することにより得られる。次いで、このジャノヒゲ濾液を前記ハーブ粉末と混合してハーブ混合物を得る。このハーブ混合物を、顆粒化のために流動床式造粒機に入れる。この顆粒は、ふるいにかけて均一なサイズの顆粒とすることができる。顆粒はさらにカプセル化することができる。

もう一つの例としては、次のようにして調製された医薬組成物が挙げられる。
(a) ジャノヒゲ、カラスビシャク、生カンゾウ、アメリカニンジン、及び長柄菊の水性抽出物をそれぞれ、好ましくは別々に濾過及び濃縮する。
(b)ジャノヒゲは顆粒化せず、これ以外のカラスビシャク、生カンゾウ、アメリカニンジン、及び長柄菊の濃縮物をそれぞれ別々に濃縮物から顆粒化して、それぞれの顆粒を調製する。
(c) 顆粒化の前に、顆粒に適した状態とするために、賦形剤、好ましくはコーンスターチを濃縮物に添加する。
(d) それぞれの顆粒及びジャノヒゲの濃縮物を一緒に混合して混合顆粒を調製し、これをその後カプセル化する。

好ましくは、ジャノヒゲ濃縮物の固形分は、ジャノヒゲの原材料の約２０〜３０重量％、好ましくは約２５重量％である。濃縮物の固形分は、濃縮物から水を除いたものである。ジャノヒゲの場合、濃縮物は大量の水を含む（すなわち、ジャノヒゲ濃縮物の約５８％が水である）。その他のハーブの固形分は、濃縮物とほとんと同じである（すなわち、水分含量はわずかであった）。カラスビシャク濃縮物は、カラスビシャク原材料に対し約１５〜２５重量％、好ましくは約２０重量％である。生カンゾウ濃縮物は、生カンゾウ原材料に対し、約１５〜２５重量％、好ましくは約２０重量％である。アメリカニンジン濃縮物は、アメリカニンジン原材料に対し、約１９〜２９重量％、好ましくは約２４．３％である。長柄菊濃縮物は、長柄菊原材料に対し、約５〜１０重量％、好ましくは約７．８重量％である。

カラスビシャク顆粒は、カラスビシャク原材料に対し、約２０〜３０重量％、好ましくは約２５重量％である。生カンゾウ顆粒は、生カンゾウ材料に対し、約１６〜２６重量％、好ましくは約２１重量％である。アメリカニンジン顆粒は、アメリカニンジン原材料に対し、約２７〜３７重量％、好ましくは約３２重量％である。長柄菊顆粒は、長柄菊原材料に対し、約３７〜４７重量％、好ましくは約４２重量％である。

また、その本方法では、ジャノヒゲ、カラスビシャク、生カンゾウ、アメリカニンジン、及び長柄菊の抽出を別個に行うことが必要である。さらに、ジャノヒゲ、カラスビシャク、生カンゾウ、及びアメリカニンジンは、水中で煎じることによって抽出する。長柄菊は、アルコール中、好ましくは５０％アルコール中で還流により抽出する。抽出後、それぞれの抽出物を濾過して残存するハーブを除去する。濾液はその後、約５５℃、約３０ｔｏｒｒの減圧条件下で減圧濃縮し、濃縮物を調製する。充分な量の賦形剤、好ましくはコーンスターチをジャノヒゲ以外の各濃縮物に添加し、抽出物ペーストを調製する。このペーストを、入口温度約１０５℃、出口温度約７６〜７７℃でスプレードライし、顆粒化する。カラスビシャク、生カンゾウ、アメリカニンジン、及び長柄菊から得られたそれぞれの顆粒は、ジャノヒゲ濃縮物と混合し、混合顆粒を調製する。この混合顆粒は、カプセル化することができる。

また、水性抽出剤容量のハーブ重量に対する比は、約２０：１である。水抽出では、好ましい煎出時間は約３０分である。好ましいアルコール抽出時間もまた約３０分である。

本発明の２つの医薬組成物、一つは、ジャノヒゲ水性抽出物と他のハーブの粉末とを含むものであり、もう一つは、全てのハーブの水性抽出物を含むものであるが、これらは、両方とも免疫学的疾患の治療に有効である。しかしながら、全てのハーブの水性抽出物を含む医薬組成物の方が、ジャノヒゲ水性抽出物と他のハーブの粉末とを含む医薬組成物よりも良好な薬効評価及び効率を示すので、やや好ましい。これら２つの方法の治療効果の違いは、抽出中活性成分の放出が増加する効果によるのかもしれない。

本発明の医薬組成物は、免疫学的疾患、特にＩｇＥ介在性疾患の患者の治療に有効である。ＩｇＥ介在性疾患は、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、アレルギー性喘息、アトピー性皮膚炎、食物アレルギー、高ＩｇＥ症候群、アトピー性湿疹を含む。

抗原あるいはアレルゲン介在性喘息は、主として慢性炎症反応に起因する呼吸器疾患である。この炎症反応は、細胞からの血小板活性化因子、ヒスタミン、プロスタグランジン、及びロイコトリエンなどの炎症性因子の放出により仲介される。炎症反応は、Ｔリンパ球(T cells)、特にCD4+細胞における抗原反応を刺激する。CD4+細胞には２つのタイプがあり、それはTh1及びTh2 CD4+細胞である。Th1タイプのCD4+細胞は、サイトカイン(ＩＦＮ−γ)を分泌する。Th2タイプのCD4+細胞は、インターロイキン−４(ＩＬ−４)を分泌する。アレルギー性喘息患者のほとんどは、Th2タイプである。アレルゲンは、Th2細胞を刺激して、過剰のＩＬ−４を産生し、これが次々にＢリンパ球からＩｇＥの産生及び分泌を引き起こす。

本発明は、STA-31、STA-32、STA-33、STA-34、STA-35、STA-36、及びSTA-4の７つの医薬組成物を提供する。これら組成物は全て、免疫学的疾患、特にＩｇＥ産生の抑制及びインターロイキン−４(ＩＬ−４)遺伝子合成のダウンレギュレーションにおいて薬学的効果を有する。本ハーブ系医薬組成物のハーブの内容を、表１に示す。

７つの組成物のうち、好ましい組成物はSTA-36であり、最も好ましい組成物はSTA-4である。STA-36及びSTA-4は、ＩｇＥ産生の抑制を含む免疫学的疾患の治療に特に有効である。
各医薬組成物は、５つのハーブを含み、このうち３つが必須ハーブである。必須ハーブは、ジャノヒゲ（black leekとしても知られる）、カラスビシャク、及び生カンゾウである。４番目のハーブはトウジンあるいはアメリカニンジンの何れかとすることができる。５番目のハーブは、台湾アデノステマ、長柄菊、及びハートリーフドクダミからなる群から選択される。台湾アデノステマ及びハートリーフドクダミは、入手可能なハーブの文献によれば、台湾にのみ認められる。長柄菊は、台湾ならびに南米で認められる。薬学名、植物学名、科、及び組成物の主要成分を表２に示す。

ジャノヒゲ(Radix Ophiopogonis)は、ユリ科（Liliaceae）に属する。ジャノヒゲの塊茎（根）は、医学的な効果を有する。ジャノヒゲの最適収穫期は夏である。収穫後、ジャノヒゲの塊茎をきれいに洗って、望ましくない汚れや細根を取り除き、次いで太陽下で乾燥して、後の使用のために保存する。ジャノヒゲ塊茎は、根の大きくなった部分である。ジャノヒゲは、中国の浙江省、四川省、及び江蘇省などで見つけることができた。ジャノヒゲの水性抽出物は、Yu et al.(1991), China Journal of Chinese Materia Medica, 16:584-585によりマウスにおける静脈炭粒子のクリアランスを増強すること、ならびにクロポスアミド（clophosphamide）により生じた白血球減少を中和することが報告された。ハーブ組成物において有効に使用するために、ジャノヒゲ塊茎は水あるいは他の有機溶媒による水性抽出物により調製することができる。このハーブの投薬形態は、水による抽出が好ましい。

トウジン(Radix Codonopsitis Pilosulae)は、キキョウ科（Campanulaceae）に属する。トウジンの医学的効果は根にある。トウジンは、野生あるいは栽培のものを集めることができる。トウジンの代表的な収穫期は秋である。収穫後トウジンの根を太陽下で乾燥し、後の使用のためにセグメントに切断した。トウジンは、台湾の南投県及び台中県で見つけることができた。ハーブ組成物において有効に使用するため、該ハーブは水あるいは他の有機溶媒による水性抽出物により調製するか、あるいは原材料のハーブを粉砕した粉末により調製することができる。このハーブの好ましい投薬形態は、水により抽出された水性抽出物あるいは粉砕粉末である。

アメリカニンジン(Radix Panacis Quinquefolii)は、ウコギ科（Araliaceae）に属する。アメリカニンジンの医学的効果は根にある。アメリカニンジは北アメリカ及びカナダで見つけることができる。また、アメリカニンジンは、フランス及び中国北部でも広く栽培されてきた。アメリカニンジンの最適収穫期は、秋である。ハーブ組成物において有効に使用するために、このハーブは水あるいは他の有機溶媒による水性抽出物、あるいは粉砕粉末の状態に調製することができる。このハーブの好ましい投薬形態は、水により抽出された水性抽出物あるいは粉砕粉末である。

カラスビシャク（Tuber Pinelliae, Rhizoma Pinellia Ternatae)は、サトイモ科（Araceae）に属する。カラスビシャクの塊茎(コルク層を取り除いた後)は、医学的効果を有する。この植物は、中国の四川省、湖北省、河南省、貴州省、及び安徽省で生育する。カラスビシャクの通常の収穫期は、７月から９月の間である。カラスビシャクは、台湾の台中県で見つけることができる。ハーブ組成物において有効に使用するために、このハーブは水あるいは有機溶媒による水性抽出物あるいは粉砕粉末の状態に調製することができる。このハーブの好ましい投薬形態は、水による水性抽出物あるいは粉砕粉末である。

生カンゾウ (Radix Glycyrrhizae Uralensis)は、マメ科（Leguminosae）に属する。生カンゾウの根及び走根（stolon）は、周皮（periderm）を剥離するしないに関わらず、医学的効果を有する。生カンゾウは、乾燥した原材料に対し２．５％以上のグリチルリチン酸 (C₄₂H₆₂O₁₆)を含み、これは生カンゾウの化学マーカーとして使用することができる。生カンゾウは、内蒙古、甘粛、新疆、及び中国北東部で見つけることができる。生カンゾウの最適収穫期は、春か秋である。台湾では、生カンゾウは台中県で見つけることができる。カンゾウの根は抗炎症性を有し、それだけで喘息の症状を開放するのを助けるのに用いることができる。H.W. Morningstar, Sentient Times: Alternative for Personal and Community Transformation (1998), 6:16-17を参照。また、カンゾウの根は気管支炎治療にも有用である。T. David, Miracle Medicines of the Rainforest: A Doctor's Revolutionary Work With Cancer And AIDS Patients (1997), pp. 66-79を参照。ハーブ組成物において有効に使用するために、本ハーブは、水あるいは他の有機溶媒による水性抽出物、あるは粉砕粉末の状態に調製することができる。好ましい投薬形態は、水による水性抽出物あるいは粉砕粉末である。

長柄菊(Herba Tridacis procumbentis）は、キク科（Compositae）に属する。長柄菊の医学的効果はその乾燥した植物全体から来る。長柄菊は、台湾の南投県、台中県、及びユンリンYunlin県、及び台中市で見つけることができる。また、長柄菊は、南米でも見られている。Diwan et al., Indian Journal of Physiology & Pharmacology (1983), 27: 32-36は、長柄菊の葉から抽出された液汁が、外傷縮小及び肉芽におけるデキサメサゾン様の効果を有するが、抗張力（tensile strength）及び上皮化（epithelization）におけるデキサメサゾンの効果を有意に抑制することを開示している。Gan et al., China Medical College Annual Bulletin (1977), 8: 526は、長柄菊の葉が炎症の減少、発熱症状の緩和、及び肺炎や風邪の治療に有用であると開示している。

ハーブ組成物において有効に使用するために、長柄菊は水あるいは他の有機溶媒による水性抽出物、又は粉砕粉末の状態に調製することができる。このハーブの好ましい投薬形態は、粉砕粉末あるいはアルコール、好ましくは５０％アルコールによる水性抽出物である。

台湾アデノステマ(Herba Adenostemmatis）は、キク科（Compositae）に属する。台湾アデノステマは、一般に、水辺あるいは湿地に生育する。台湾アデノステマの医学的効果は、フレッシュのあるいは乾燥状態の植物全体から来る。最適収穫期は夏あるいは初秋である。台湾アデノステマは、台湾だけでなく、中国の雲南省、広西省、貴州省、江西省、及び浙江省で見つけることができる。台湾アデノステマは、１１−ヒドロキシル化カウレン酸（11-hydroxylated kauranic acid）を含む。ハーブ組成物において有効に使用するために、このハーブは粉砕粉末の状態に調製することができる。このハーブの好ましい投薬形態は粉砕粉末である。

ハートリーフドクダミあるいはドクダミハーブ（Houttuynia Herb）(Houttuyniae cum Radice Houttuyniae Cordatae)は、Houttuynia cordata Thunbergの地上部である。これは、ドクダミ科（Saururaceae）に属する。ハートリーフドクダミは、長江流域及び中国南部にかけて生育する。最適収穫期は、晩夏から初秋の花期の間である。Hanhong Heartleaf houttuyniaは、台湾の台中県で見られる。ハーブ組成物において有効に使用するために、このハーブは、粉砕粉末の状態に調製できる。このハーブの好ましい投薬形態は、粉砕粉末である。

一般的に、本組成物は次のように調製される。
Ａ．STA-31、STA-32、STA-33、STA-34、STA-35、及びSTA-36の調製:
(1) カラスビシャク、生カンゾウ及びアメリカニンジンの根、ならびに長柄菊の植物全体を切断、乾燥、粉砕、及びふるいにかけ(好ましくは40-120メッシュ)、ハーブ粉末を得た。

(2) ジャノヒゲの根は、細断し、煎出器中で水に浸漬した。水量は、ジャノヒゲの最上部から上方に少なくとも１０ｃｍであった。浸水したジャノヒゲを、９７〜１０３℃で約６０分２回加熱し、ジャノヒゲ抽出液を得た。その後、このジャノヒゲ抽出液を濾過した(約１００メッシュ)。濾液を集め、このジャノヒゲ濾液を５０〜６０℃、４００〜６５０ｍｍ−Ｈｇの減圧下で濃縮し、所望の濃度の液状濃縮物を得た。この液状濃縮物はジャノヒゲ濾液の約１／１４であることが好適であった。

(3) ジャノヒゲの液状濃縮物を他のハーブのハーブ粉末と混合した。この混合物を流動床式造粒機に移し、濾布(filtered fabric)でできたスプレーチューブ中に置いた。造粒機は、９０〜１１０℃にセットした。約５分の予備加熱後、前記混合物を一回あたり約４０〜５５秒で適当な回数スプレーし、スプレーチューブは１０秒に一回の頻度で軽くたたいた。造粒後、顆粒を乾燥及び冷却した。顆粒は、ふるいにかけ、ＰＥバッグに入れた。顆粒の好ましい水分含量は、６％未満であった。顆粒は、さらに、通常用いられる何れのカプセル中にもカプセル化することができる。例えば、天然ゼラチン、ペクチン、カゼイン、コラーゲン、プロテイン、加工澱粉、及びポリビニルピロリドンなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。

Ｂ．STA-4ハーブ組成物の調製：
STA-4ハーブ組成物は、次の方法で調製した。

Ｉ．長柄菊：
(1) 長柄菊の植物全体を細断した。
(2) ５０％アルコール (v/v)(抽出溶媒)約２０部（容量）を、長柄菊の細片約１部（重量）に添加、混合した。
(3) このハーブを抽出溶媒と一緒に約３０分加熱還流した。この操作により、長柄菊のアルコール抽出物を調製した。

(4) 冷却後、この長柄菊アルコール抽出物を濾過した(約１００メッシュ)。濾液を集め、５０〜６０℃（好ましくは５５℃）、減圧下（３０ｔｏｒｒ）で減圧濃縮し、濃縮物を得た。好ましくは、濃縮物の固形分は、原材料の約７．８重量％である。濃縮物の固形分は、５０％アルコールを除いた濃縮物の量である。長柄菊の場合、濃縮物固形分は濃縮物重量とほぼ同じである(濃縮物中に水がほとんど含まれないため)。
(5) 適量のコーンスターチ(賦形剤)をこの濃縮物に添加しハーブペーストを得た。
(6) ハーブペーストは、スプレードライ法により乾燥し、長柄菊顆粒を調製した(好ましくは、原材料に対して約４２重量％)。

II．カラスビシャク、生カンゾウ及びアメリカニンジン：
(1) カラスビシャクの塊茎、カンゾウ及びアメリカニンジンの根を、別々に細断した。
(2) 各ハーブについて、約２０部（容量）の水を、各ハーブの細片約１部（重量）にそれぞれ添加、混合した。
(3) 各ハーブは、水に浸漬し、約３０分煎出により加熱して、ジャノヒゲ、カラスビシャク、生カンゾウ、及びアメリカニンジンの水性抽出物をそれぞれ調製した。

(4) それぞれの抽出物を冷却後、各抽出物を別々に濾過した（約１００メッシュ)。濾液を各々集め、５０〜６０℃（好ましくは５５℃）、減圧下（３０ｔｏｒｒ）の減圧条件下で濃縮し、各ハーブの液状濃縮物を得た。カラスビシャク濃縮物の固形分は、カラスビシャク原材料に対し約２０％、生カンゾウ濃縮物の固形分は、生カンゾウ原材料に対し約２０％、アメリカニンジン濃縮物の固形分は、アメリカニンジン原材料に対し約２４．３％であることが好適である。カラスビシャク、生カンゾウ、あるいはアメリカニンジンの濃縮物の固形分は、水を除いた濃縮物の量である。
(5) 十分な量のコーンスターチ(賦形剤)を各濃縮物に添加後、スプレードライ法により顆粒化して、それぞれの顆粒を調製した。
(6) それぞれの顆粒を、長柄菊の顆粒と一緒に混合し、混合顆粒とした。

III. ジャノヒゲ：
ジャノヒゲの塊茎は、II(1)-(4)の操作に従い濃縮した。ジャノヒゲ濃縮物と、カラスビシャク、生カンゾウ、及びアメリカニンジン濃縮物との唯一の違いは、ジャノヒゲ濃縮物はかなりの量の水を含んでいるが、その他の濃縮物は水をほとんど含まないことであった。９ｇのジャノヒゲ原材料に対し、濃縮物は約５．４ｇで、これは約２．２５ｇの固形分と３．１５ｇの水からなっていた。
ジャノヒゲの液状濃縮物は、その他のハーブの顆粒と混合した。
原材料、STA-36、及びSTA-4におけるハーブのｇ重量を下記表３ａに比較して示す。

表３ａ中、「原材料」の行は、各ハーブの加工前の重量を示す。「STA-36」及び「STA-4」の行は、(1)各ハーブの最終形態、及び(2)各ハーブの最終重量を示す。例えば、STA-36において、ジャノヒゲは濃縮物の形態であるが、ジャノヒゲ以外のカラスビシャク、生カンゾウ、アメリカニンジン、及び長柄菊は全てハーブ粉末の形態であった。また、ジャノヒゲはその原材料よりも少ない重量であったが、STA-36中では、ジャノヒゲ以外のその他のハーブ粉末は、それらの原材料と同じ重量を維持していた。

STA-4においては、ジャノヒゲだけがSTA-36中と同じ最終形態、すなわち、濃縮物であった。その他のハーブの抽出、濃縮、及び顆粒化後のｇ重量は、表３ａに示すように、実質的に減少していた。さらに、顆粒化の間の濃縮物の安定化を助けるため、賦形剤 (例えば、コーンスターチ)を各ハーブ濃縮物にそれぞれ添加した。各濃縮物に添加したコーンスターチ量は、濃縮物の安定性により変えた。STA-4とSTA-36とは同量の原材料から得られたものであるにもかかわらず、STA-4最終製品は顆粒状で、STA-36の重量の約半分であった。STA-4は、総ｇ重量は減少したが、STA-36と同等あるいはそれ以上の免疫学的疾患治療効果を有する。これは、患者が同等あるいはそれ以上の治療効果を得るために２倍量のハーブを取らなくてもよいことを意味し、STA-36に対するもう一つの改良点となった。

以下の実施例は説明するためのものであり、本発明の範囲を制限するものではない。合理的な技術者が行うような合理的な変更はここに含まれ、本発明の範囲から逸脱するものではない。

STA-31、STA-32、STA-33、STA-34、STA-35、及びSTA-36の調製
医薬組成物の内容を表１に、組成物中のハーブ重量を表３に示す。

医薬組成物の調製方法は、主として前記の一般的な組成物調製方法と同じであった。
(1) ジャノヒゲ以外の全ての適用ハーブを表３に示すような量で切断、乾燥、粉砕、及びふるいにかけ(好ましくは、４０〜１２０メッシュ)、ハーブ粉末を得た。
(2) 表３に示す量のジャノヒゲを、フライングボイリングコンテナー中で水に浸漬した。水は、ジャノヒゲ最上部の上方少なくとも１０ｃｍであった。浸水したジャノヒゲは、９７〜１０３℃で約６０分加熱を２回行い、ジャノヒゲ抽出液を調製した。ジャノヒゲ抽出液を濾過(約１００メッシュ)し、濾液を集めた。ジャノヒゲ濾液を５０〜６０℃、４００〜６５０ｍｍ−Ｈｇの減圧条件下で濃縮し、所望の濃度の液状濃縮物を得た。液状濃縮物は、ジャノヒゲ濾液の約１／１４であることが好適であった。

(3) ジャノヒゲの液状濃縮物をその他のハーブのハーブ粉末と混合した。この混合物を、流動床式造粒機に移し、濾布(filtered fablic)でできたスプレーチューブに入れた。造粒機は、９０〜１１０℃にセットした。５分間の予備加熱後、前記混合物を１回約４０〜５５秒で適当な回数スプレーし、スプレーチューブは１０秒毎に１回の頻度で軽くたたいた。造粒後、顆粒を乾燥し、冷却した。顆粒をふるいにかけ、ＰＥバックに入れた。顆粒の好ましい水分量は、６％未満であった。顆粒は、さらに、通常用いられる何れのカプセル中にもカプセル化することができる。例えば、天然ゼラチン、ペクチン、カゼイン、コラーゲン、プロテイン、加工澱粉、及びポリビニルピロリドンなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。

高速液体クロマトグラフィー(ＨＰＬＣ)を用いた医薬組成物の品質管理
ハーブの品質を保証するためにＨＰＬＣ技術を用いた本発明は、充分な管理下にあった。３つのＨＰＬＣ法は、各ハーブの化学的及び生理学的特徴に適合するように改良した。３つのＨＰＬＣ法を以下に説明する。

(A)ＨＰＬＣ分析方法１
方法１は、エンドキャッププレカラムLichrospher RP-18 (5μｍ、4.0 ID X 10 mm、メルク)、及びCosmosil 5C18-MSカラム(5μｍ、ナカライテスク 5C18-MS、4.6 ID X 250 mm)を室温で用いた。カラムの移動相は、(A) H₂O: KH₂PO₄: 10% H₃PO₄ (1000 ml : 2.72 g : 1 ml、v/w/v)、(B) CH₃CN、(C) H₂O、及び(D) CH₃OHを含むグラジェントであった。溶出グラジエントを表４に示す。流速は１．０ｍｌ／分、検出波長は２５０ｎｍ、分析の総リテンションタイムは６０分であった。

(B)ＨＰＬＣ分析方法２
ＨＰＬＣ分析方法２では、エンドキャッププレカラムLichrospher RP-18(5μｍ、4.0 ID X 10 mm、メルク)、及びCosmosil 5C18-MSカラム(5μｍ、ナカライテスク 5C18-MS、4.6 ID X 250 mm)を３５℃で用いた。カラム移動相は、 (A) 10 mM KH₂PO₄ + 10 mM K₂HPO₄ + 0.01% H₃PO₄ (KH₂PO₄ : K₂HPO₄ : 10% H₃PO₄ : H₂O=1.36 g : 1.74 g : 1 ml :1000 ml)、(B) CH₃CN、(C) H₂O、及び(D) CH₃OHを含むグラジエントであった。溶出グラジエントを表５に示した。流速は１．０ｍｌ／分、検出波長は２６０ｎｍ、分析の総リテンションタイムは６０分であった。

(C)ＨＰＬＣ分析方法３
ＨＰＬＣ分析方法３では、エンドキャッププレカラムLichrospher RP-18(5μｍ、4.0 ID X 10 mm、メルク)、及びCosmosil 5C18-MSカラム(5μｍ、ナカライテスク 5C18-MS、4.6 ID X 250 mm)を３５℃で用いた。カラム移動相は、(A) H₂O: KH₂PO₄ (1000 ml : 2.72g、v/w)、(B) CH₃CN、(C) H₂O、及び(D) CH₃OHを含むグラジエントであった。溶出グラジエントを表６に示した。流速は１．０ｍｌ／分、検出波長は２０３ｎｍ、分析の総リテンションタイムは６０分であった。

組成物に用いたハーブのＨＰＬＣ分析は、各ハーブの方法、主要マーカー、ならびに検出波長を含み、それらを表７に要約する。STA-36ハーブのＨＰＬＣクロマトグラムを図１〜５に示す。

ＨＰＬＣ分析の前に、０．５gのハーブサンプルを７０％メタノール含有溶液２０ｍｌと混合した。サンプル溶液を室温で１５分間超音波処理し、４０℃の回転式水槽中に１６０ｒｐｍの回転速度で２０分間置いた。その後、サンプル溶液を約３０分間放置して、残渣を沈降させた。１０ｍｌの上澄液をピペットで採り、０．４５μｍのフィルターを通した。濾液をＨＰＬＣ分析のために用意した。２０μｌの濾液をＨＰＬＣ分析に供した。

結果：
ジャノヒゲのＨＰＬＣクロマトグラムを図１に示す。表７に示すように、ＨＰＬＣ分析方法１を２１４ｎｍでジャノヒゲを検出するのに用いた。６１１５−１及び６１１５−２の２つの別々のピークが、ジャノヒゲＨＰＬＣクロマトグラムで認められた。６１１５−１のリテンションタイムは１１．５分、６１１５−２のリテンションタイムは１３分であった。これら２つのピークの化学的成分はまだ同定されていないが、ジャノヒゲの品質を保証する目的のために使用することが可能であった。

カラスビシャクのＨＰＬＣクロマトグラムを図２に示す。表７に示すように、ＨＰＬＣ分析方法２を用いて波長２５０ｎｍでカラスビシャクを検出すると、カラスビシャクは２つの特有の化学マーカー、すなわち、アデニンとグアノシンを示した。両者は、核酸の構成成分である。また、アデニンは、血清アルドラーゼを上昇する効果も有する。アデニンのリテンションタイムは１４．８分、グアノシンのリテンションタイムは１７分であった。

図３に生カンゾウのＨＰＬＣクロマトグラムを示す。表７のように、ＨＰＬＣ分析方法１を用いて波長２５０ｎｍで生カンゾウを検出すると、化学マーカーである「グリチルリチン」が生カンゾウのＨＰＬＣクロマトグラムに認められた。グリチルリチン(C₄₂H₆₂O₁₆)は、非常に甘みのある物質で、解毒作用、抗炎症作用、及び溶血作用を有すること、ならびにアジソン病の治療に用いられることが知られている。グリチルリチンのリテンションタイムは４６．４分である。

アメリカニンジンのＨＰＬＣクロマトグラムを図４に示す。表７のように、方法３を用いて波長２０３ｎｍでアメリカニンジンを検出すると、化学マーカーである「ジンセノシド(ginsenoside)Ｒｂ_１」がアメリカニンジンのＨＰＬＣクロマトグラムにおいて認められた。ジンセノシドＲｂ_１は、血管拡張、疲労回復、溶血回避において医学的な効果を有する。

長柄菊のＨＰＬＣクロマトグラムを図５に示す。表７のように、ＨＰＬＣ分析方法１を用いて波長２５０ｎｍで長柄菊を検出すると、４つの特有のピークであるＦＹ−１〜ＦＹ−４が認められた。ＦＹ−１のリテンションタイムは２８．０分、ＦＹ−２のリテンションタイムは３１．６分、ＦＹ−３のリテンションタイムは３３．５分、ＦＹ−４のリテンションタイムは１８．３分であった。これら４つのピークは常に認められるので、これら４つのピークに関連する化学的成分はまだ同定されていないけれども、これらを長柄菊の同定ならびに品質保証の目的のために使用することができた。

生カンゾウ、ジャノヒゲ、カラスビシャク、及び長柄菊の薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）特性試験
生カンゾウ、ジャノヒゲ、カラスビシャク、及び長柄菊などのSTA-36組成物で使用したいくつかのハーブは、ＨＰＬＣの他に、薄層クロマトグラフィー(ＴＬＣ)法により評価することができる。

ＴＬＣ法は、シリカゲル60 F254固定相(ＴＬＣプレートに結合している)、及び、ハーブの特徴に応じて３つの移動相(あるいは解離)溶媒を用いた。第１の溶媒は、酢酸エチル、４Ｎアンモニア水、及びエタノールを容量比4 : 1 : 2 (v/v/v)で含んでいた。この第１溶媒は、生カンゾウの特性試験に特に有用であった。第２の溶媒は、ブタノール、４Ｎアンモニア水、及びエタノールを容量比5 : 2 : 1 (v/v/v)で含んでいた。この第２溶媒は、ジャノヒゲ及びアメリカニンジンの特性試験に特に有用であった。第３の溶媒は、クロロホルム(CHCl₃)及びメタノールを容量比5 : 1 (v/v)で含んでいた。この第３溶媒は、長柄菊の特性試験に特に有用であった。それぞれのＴＬＣ分析において、5μｌのサンプルをＴＬＣプレートの開始点に添加した。プレートを、移動相溶媒が入ったＴＬＣチャンバー内に置き、溶媒を９ｃｍ上方まで移動させた。ＴＬＣ分析結果を以下に記載する。

(A)生カンゾウ
生カンゾウは、ＴＬＣプレートに付着したシリカゲル 60 F254 固定相、及び酢酸エチル : ４Ｎアンモニア水 : エタノール= 4:1:2 (v/v/v)を含む移動相溶媒を用いたＴＬＣにより分析した。サンプル添加後、ＴＬＣプレートを、移動相溶媒の最上部の液線がサンプル添加点より高くならないように移動相溶媒を入れたＴＬＣチャンバー内に置いた。溶媒をサンプル添加点から９ｃｍ上方まで移動させ、その後、ＴＬＣプレートをＴＬＣチャンバーから取り出し、風乾した。乾かしたＴＬＣプレートにバニリン/Ｈ_２ＳＯ_４を含む噴霧試薬をスプレーした。その後、プレートを１０５℃で２分間加熱して活性化した。生カンゾウを示す黄色のスポットをプレート上約Ｒｆ＝0.5に認めた。Ｒｆ＝(スポットとサンプル添加点の間の距離［ｃｍ］／総移動距離［すなわち、9ｃｍ］である。

(B)ジャノヒゲ
ジャノヒゲは、ＴＬＣプレート付着シリカゲル 60 F254 固定相、及びブタノール: ４Ｎアンモニア水 : エタノール= 5:2:1 (v/v/v) を含む移動相溶媒を用いたＴＬＣにより分析した。サンプル添加後、ＴＬＣプレートを、移動相溶媒の最上液線がサンプル添加点より高くならないように移動相溶媒を入れたＴＬＣチャンバー内に置いた。溶媒をサンプル添加点から９ｃｍ上方まで移動させ、その後、ＴＬＣプレートをＴＬＣチャンバーから取り出して風乾した。乾かしたＴＬＣプレートに、バニリン/Ｈ_２ＳＯ_４を含む噴霧試薬をスプレーし、１０５℃で２分間加熱してプレートを活性化した。ジャノヒゲを示す褐色のスポットをプレート上約Ｒｆ＝０．４に認めた。

(C)アメリカニンジン
アメリカニンジンは、ＴＬＣプレート付着シリカゲル 60 F254固定相、及びブタノール: ４Ｎアンモニア水 : エタノール= 5:2:1 (v/v/v)を含む移動相溶媒を用いたＴＬＣにより分析した。サンプル添加後、ＴＬＣプレートを、移動相溶媒の最上液線がサンプル添加点より高くならないように移動相溶媒を入れたＴＬＣチャンバー内に置いた。溶媒をサンプル添加点から９ｃｍ上方まで移動させ、その後、ＴＬＣプレートをＴＬＣチャンバーから取り出して風乾した。乾かしたＴＬＣプレートに、バニリン/Ｈ_２ＳＯ_４を含む噴霧試薬をスプレーし、１０５℃で２分間加熱してプレートを活性化した。アメリカニンジンを示す紫がかったスポットをプレート上約Ｒｆ＝０．３に認めた。

(D)長柄菊
長柄菊は、ＴＬＣプレート付着シリカゲル 60 F254固定相、及びクロロホルム : メタノール= 5 : 1 (v/v) を含む移動相溶媒を用いたＴＬＣにより分析した。サンプル添加後、ＴＬＣプレートを、移動相溶媒の最上液線がサンプル添加点より高くならないように移動相溶媒を入れたＴＬＣチャンバー内に置いた。溶媒をサンプル添加点から９ｃｍ上方まで移動させ、その後、ＴＬＣプレートをＴＬＣチャンバーから取り出して風乾した。乾かしたＴＬＣプレートをＵＶ検出器の下に置き、波長３６６ｎｍで検出した。長柄菊を示す淡黄色の蛍光スポットをプレート上約Ｒｆ＝０．３に認めた。

マウスのアレルゲン誘発性ＩｇＧ、ＩｇＥ、及びＩＬ−４における５つの漢方煎薬製剤の効果
アレルゲン誘発性免疫グロブリンＧ(ＩｇＧ)抑制、免疫グロブリンＥ(ＩｇＥ)合成、及びインターロイキン−４ (ＩＬ−４)遺伝子発現における５種の漢方煎薬製剤の効果を、D.P.(Dermatophagoides pteronyssimus)アレルゲン「Der p 5」で感作したＢＡＬＢ／ｃマウスを用いて調べた。Dermatophagoides pteronyssimus は、ハウスダストダニで、抗原として作用し、アトピーのヒトにアレルギー性喘息反応を引き起こす。
５つの漢方煎薬製剤を表８に示す。これらの漢方煎薬群は、喘息などの肺関連病の患者の治療に特に効果があることが知られている。

試験方法：
(A)ハーブ材料の調製：
上記ハーブ製剤各５０ｍｇ (全てSun Ten Sci. Pharm. Corp., Taipei, Taiwanから)をそれぞれ別々に１８０μｌのツイーン８０と混合し、ホモジナイズした(homogenizer DC-3S, Xinguang Precision Instrument Industrial Limited, Inc., Taiwan)。水をホモジネートに添加して終容量２ｍｌ、終濃度２５ｍｇ／ｍｌとした。各マウスに、このハーブ組成物溶液の１種、あるいはプラセボを０．４ｍｌ／２０ｇ体重、１日おきに１４日間投与した。

(B)動物
４〜６週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスをthe National Animal-breeding Center, Republic of Chinaから入手し、試験に用いた。マウスは、各実験で週齢、性別を合わせた。

(C)アレルゲン Derp5 (Dermatophagoidespteronyssinus group 5 allergen)の精製
pGEX-2Tプラスミドを用い、大腸菌中でDer p 5-グルタチオン S-トランスフェラーゼ(GST)を発現させた。融合タンパクの分子量は、約４２ｋＤであった。このタンパクをグルタチオン結合アガロースゲルカラムクロマトグラフィーにより精製した。Der p 5-GST 陽性細菌株の単一コロニーを、アンピシリン(１００μｇ／ｍｌ)を含むＬＢ培養液上でトランスフェクトした大腸菌を増殖させることにより選別した。このDer p 5-GST 陽性大腸菌コロニーをさらに培養して相当量のDer p 5-GSTを生産した。その後、この細菌培地を集め、遠心分離した。上澄液を除き、ペレットをＴＢＳ(ｐＨ７．５)で洗浄し、遠心管中に集めた。ＴＢＳ洗浄後直ちに、０．１Ｍフェニルメチルスルホニルフッ化物をペレットに添加し、次いでデオキシリボヌクレアーゼ I(DNase I)、ツイーン２０、及びリゾチームを添加した。ペレットを凍結融解操作により溶菌して、Der p 5 + GSTタンパクを放出させた。次に、ＥＤＴＡを細胞溶菌液に添加し、その後、遠心分離した。ペレットを除き、上澄液をグルタチオン結合アガロースゲルカラム吸着カラムに注入し、Der p 5-GST タンパクをカラムに吸着させた。カラムを最初に４℃のＴＢＳ緩衝液により洗浄し、その後トリス塩基(ｐＨ８．０)中還元グルタチオンで洗浄して、アガロースゲルカラムからDer p 5-GSTを分離した。Der p 5-GST タンパクの純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認した。タンパクの定量は、通常のタンパク分析法により測定した。

(D)動物感作
ＢＡＬＢ／ｃマウスを、初め１０μｇのDermatophagoides pteronyssimus group 5 (Der p 5) アレルゲン及び４ｍｇの水酸化アルミニウム(Wyeth Pharmaceuticals, Punchbowl, Australia)で腹腔内感作した。最初の感作の７日後、プラセボコントロールグループを除いたマウスに漢方煎薬を与えた。

最初の感作から３週間後、マウスに再度Der p 5を追加注射した。２回目の追加注射から３日後、マウスを円形のプラスティック容器に入れ、マウスをさらに０．１％Der p 5スプレーで惹起した。
追加注射後毎回、翌日に各マウスの尾部静脈から５０μｌの血液を採取した。血液は室温で１時間放置後、遠心分離した。血清を集め、後述のＥＬＩＳＡ分析のために−８０℃で保存した。

(E)Der p 5特異的ＩｇＧ及びＩｇＥの測定
Der p 5特異的ＩｇＧ及びＩｇＥの量を酵素免疫測定法(ＥＬＩＳＡ)により測定した。タンパク高結合プレートをコーティング緩衝液(0.1 M NaHCO₃、pH 8.2)で５μｇ／ｍｌの濃度に希釈した精製Der p 5 １００μｌでコーティングした。４℃で一晩インキュベーションした後、プレートを３回洗浄し、３％(wt/vol)ＢＳＡ−ＰＢＳ緩衝液で２５℃で２時間ブロックした。血清を、ＩｇＧ測定には１：１００希釈で、ＩｇＥ測定には１：１０希釈で、デュプリケートで用いた。４℃で一晩インキュベーションした後、０．０５％ゼラチン緩衝液で希釈したビオチン結合モノクローナルラット抗マウスＩｇＥｍＡｂ、あるいはラット抗マウスＩｇＧｍＡｂをもう１時間添加した。アビジン−アルカリフォスファターゼ（１：１０００）を添加し、２５℃で１時間インキュベートした後、６回洗浄した。フォスファターゼ基質p-ニトロフェニルフォスフェート２ナトリウムを添加して、呈色反応を行った。プレートはマイクロプレートオートリーダー(Metertech, Taiwan)で４０５ｎｍで読みとった。読みとりには、マウス抗ＴＮＰｍＡｂ、ＩｇＧ１（１０７．３）、ＩｇＧ_２ａ（Ｇ１５５−１７８）、及びＩｇＥ（ＩｇＥ−３）の市販アイソタイプ標品を参照した。

(F)ＲＴ−ＰＣＲ(逆転写酵素-ポリメラーゼ連鎖反応)による脾細胞中のＩＬ−４遺伝子の発現
Der p 5 アレルゲンで感作及び惹起後、表８記載の５つのハーブ煎薬あるいはプラセボでそれぞれ処置したＢＡＬＢ／ｃマウスから脾細胞を分離した。この脾細胞をDer p 5(１５μｇ／ｍｌ)で４時間インキュベートした。ＲＮＡをTridzol試薬(Gibco BRL、Life Technologies, U.S.A)を用いて抽出した。抽出したＲＮＡは、Ready to go T-Primed First-Strand Kit (Pharmacia Biotch, USA)を用いたｃＤＮＡ産生に使用した。ｃＤＮＡは、ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)のテンプレートとして用いた。次の配列を有する一対のＩＬ−４特異的プライマーをＩＬ−４遺伝子のＰＣＲ増幅及び検出に用いた。
5’-GAATGTACCAGGAGCCATATC-3’ (配列番号：1)；及び
5’-CTCAGTACTACGAGTAATCCA-3’ (配列番号：2)

また、次の配列を有する一対のＨＰＲＴ(ヒポキサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ)特異的プライマーを、ＨＰＲＴのＰＣＲ増幅及び検出に用いた。
5’-GTTGGATACAGGCCAGACTTTGTTG-3’ (配列番号：3)；及び
5’-GATTCAACTTGCGCTCATCTTAGGC-3’ (配列番号：4)
ＰＣＲ条件は次の通り：９５℃変性を５分間、続いて、９５℃１分間、７２℃１分間、５５℃３分間のサイクルをサーモサイクラー(Thermo-cycler)中で３５サイクル。ＰＣＲ産物は、２％アガロースゲルで電気泳動した。

(G)統計学的分析
Der p 5惹起後のDer p 5特異的ＩｇＧ、ＩｇＥ、及びＩＬ−４/ＨＰＲＴ比の変化を評価するために、ＡＮＯＶＡについて繰り返し測定を行い、グループ間の差異を比較した。分散分析の後、ダンカン多重範囲検定(Duncan multiple range test)を用いて、試験グループとコントロールグループの間の差を調べた。ｐ＜０．０５は、統計学的有意差を示すのに使用した。

結果：
図６に示すように、Der p 5惹起後５種の漢方煎薬で処置したマウスのＩｇＧ及びＩｇＥレベルは、コントロール（プラセボ）グループに対して有意差はなかった。瀉白散グループ（Ａ）、小青竜湯グループ（Ｂ）、麦門冬湯グループ（Ｃ）、清燥救肺湯グループ（Ｄ）、蘇子降気湯グループ（Ｅ）、及びプラセボグループ（Ｆ）におけるＩｇＧのＥＬＩＳＡユニットは、それぞれ７０．９±４２、６２．５±４４、６３．３±４４、６３．３±４３、５９．７±３８、及び６７．４±４２であった。瀉白散グループ（Ａ）、小青竜湯グループ（Ｂ）、麦門冬湯グループ（Ｃ）、清燥救肺湯グループ（Ｄ）、蘇子降気湯グループ（Ｅ）、及びプラセボグループ（Ｆ）におけるＩｇＥのＥＬＩＳＡユニットは、それぞれ９９．３±２３、１０６．３±３４、１０４．９±２３、１０５．７±２３、９３．９±２１、及び９７．８±１９であった。

図６の結果は、５つの漢方煎薬はＩｇＥ産生を抑制しなかったことを示すものである。
図７のように、麦門冬湯は、ＩＬ−４/ＨＰＲＴにおいて有意な減少を示したが、これ以外の漢方煎薬は、ＩＬ−４遺伝子産生の抑制に関して効果がない。

マウスのアレルゲン誘発性ＩｇＧ、ＩｇＥ、及びＩＬ−４におけるSTA-31、STA-32、STA-33、STA-34、STA-35、及びSTA-36中の各ハーブの効果
ジャノヒゲ、カラスビシャク、生カンゾウ、及びトウジンの各ハーブ、ならびにSTA-36のアレルゲン誘発性ＩｇＧ、ＩｇＥ、及びＩＬ−４における効果を、D.P.アレルゲン「Der p 5」感作ＢＡＬＮ／ｃマウスを用いて調べた。試験方法は、前記実施例５に記載した方法と同じであった。

結果：
アレルゲン Der p 5惹起後ジャノヒゲ、トウジン、カラスビシャク、及び生カンゾウで処置したマウス血清中のＩｇＧレベルを図８に示す。この結果により、ジャノヒゲ、トウジン及びカラスビシャク処置と、プラセボ処置との間にＩｇＧレベルの有意差がないことが示された。生カンゾウ処置後のＩｇＧレベルは、プラセボ処置の場合よりも有意に低かった。
しかし、図９のように、Der p 5惹起後ジャノヒゲ、トウジン、及びSTA-36組成物で処置したマウス血清中のＩｇＥレベルはプラセボの場合よりも有意に低かった。実際、STA-36組成物処置後、ＩｇＥレベルは、２．５倍以上低下した。カラスビシャク及び生カンゾウ処置後のＩｇＥレベルは、プラセボ処置の場合に対して有意差はなかった。

図１０のように、Der p 5惹起後ジャノヒゲ、トウジン、カラスビシャク、及び生カンゾウでそれぞれ処置したマウスの脾細胞におけるＩＬ−４遺伝子の発現(ＲＴ−ＰＣＲにより測定、ＩＬ−４/ＨＰＲＴ比で表す)は、プラセボ処置に対し有意差はなかった。しかし、STA-36処置後のＩＬ−４遺伝子の発現は、プラセボよりも有意に低下し、STA-36がＩＬ−４遺伝子の発現をダウンレギュレーションできることを示した。

動物中のＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩＬ−４及びＩＦＮ−γの測定方法
アレルゲン誘発性免疫グロブリンＧ(ＩｇＧ)、免疫グロブリンＥ(ＩｇＥ)、インターロイキン−４(ＩＬ−４)、及びインターフェロンγ(ＩＦＮ−γ)の抑制におけるSTA-36及びSTA-4ハーブ組成物ならびに各ハーブの効果をD.P.(Dermatophagoides pteronyssimus)アレルゲン「Der p 5」感作ＢＡＬＢ／ｃマウスを用いて調べた。Dermatophagoides pteronyssimusは、ハウスダストダニで、抗原として作用し、アトピーのヒトにアレルギー性喘息反応を引き起こす。

試験方法：
(A)動物
４〜６週齢、体重約２０ｇの雌ＢＡＬＢ／ｃマウスをthe National Animal-breeding Center, Republic of Chinaから入手し、試験に用いた。マウスは、各実験で週齢、性別を合わせた。

(B)アレルゲン Derp5 (Dermatophagoidespteronyssinus group 5 allergen)の精製
pGEX-2Tプラスミドを用いて、大腸菌中でDer p 5-グルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)を発現させた。融合タンパクの分子量は、約４２ｋＤであった。このタンパクをグルタチオン結合アガロースゲルカラムクロマトグラフィーにより精製した。Der p 5-GST 陽性細菌株の単一コロニーを、アンピシリン(１００μｇ／ｍｌ)を含むＬＢ培養液上でトランスフェクトした大腸菌を増殖させることにより選別した。このDer p 5-GST陽性大腸菌コロニーをさらに培養して相当量のDer p 5-GSTを生産した。その後、この細菌培地を集め、遠心分離した。上澄液を除き、ペレットをＴＢＳ(ｐＨ７．５)で洗浄し、遠心管中に集めた。ＴＢＳ洗浄後直ちに、０．１Ｍフェニルメチルスルホニルフッ化物をペレットに添加し、次いでデオキシリボヌクレアーゼ I(DNase I)、ツイーン２０、及びリゾチームを添加した。ペレットを凍結融解操作により溶菌して、Der p 5 + GSTタンパクを放出させた。次に、ＥＤＴＡを細胞溶菌液に添加し、その後、遠心分離した。ペレットを除き、上澄液をグルタチオン結合アガロースゲルカラム吸着カラムに注入し、Der p 5-GST タンパクをカラムに吸着させた。カラムを最初に４℃のＴＢＳ緩衝液により洗浄し、その後トリス塩基(ｐＨ８．０)中還元グルタチオンで洗浄して、アガロースゲルカラムからDer p 5-GSTを分離した。Der p 5-GST タンパクの純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認した。タンパクの定量は、通常のタンパク分析法により測定した。

(C)動物感作
ＢＡＬＢ／ｃマウスを、初めに１０μｇのDermatophagoides pteronyssimus group 5(Der p 5)アレルゲン及び４ｍｇの水酸化アルミニウム(Wyeth Pharmaceuticals, Punchbowl, Australia)で腹腔内感作した。最初の感作の７日後、プラセボコントロール群を除いたマウスにSTA-36及びSTA-4ハーブ組成物を２１日目の終わりまで与えた。
２１日めの最後に、マウスにDer p 5の２回目の追加注射を行った。２回目の追加注射から４８時間後、マウスを円形のプラスティック容器に入れ、０．１％Der p 5スプレーでさらに惹起した。

惹起から数時間後、マウスを１００ｍｇ／ｍｌフェノバルビタールで麻酔した。尾部静脈又は心臓から血液を採取した。血液は室温で１時間放置後、１０００ｒｐｍで約１０分間遠心分離し、血清を集め、後述のＩｇＥ及びＩｇＧ_２ａのＥＬＩＳＡ分析のために−８０℃で保存した。肺胞洗浄から集めた流動体を１０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、その上澄液をサイトカイン、インターロイキン−４ (ＩＬ−４)及びインターフェロン−γ(ＩＦＮ−γ)の分析に用いた。流動体のペレット(細胞を含む)は、ＰＢＳを用いて再度分離し、炎症細胞に対しサイトスピンカウント(cytospin count)を行った。

(D)Der p 5特異的ＩｇＧ及びＩｇＥのＥＬＩＳＡ分析
Der p 5特異的ＩｇＧ及びＩｇＥの量を酵素免疫測定法(ＥＬＩＳＡ)により測定した。高タンパク高結合マイクロウエルプレート(Costar, No. 3590)をコーティング緩衝液(３％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液、ｐＨ７．４)で５μｇ／ｍｌの濃度に希釈した精製Der p 5 １００μｌ(１０ｍｇ／ｍｌ)でコーティングした。４℃で一晩インキュベーションした後、プレートを０．０５％ツイーン２０含有ＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）中で３回洗浄し、３％(wt/vol)ＢＳＡ-ＰＢＳ緩衝液で２５℃で２時間ブロックした。

血清を、ＩｇＧ測定には１：１００希釈で、ＩｇＥ測定には１：１０希釈で、デュプリケートで用いた。４℃で一晩インキュベーションした後、０．０５％ゼラチン緩衝液中希釈したビオチン結合モノクローナルラット抗マウスＩｇＥｍＡｂ(PharMinge 02122D)、あるいはラット抗マウスＩｇＧｍＡｂ(PharMinge, 02022D)をさらに２時間添加した。アビジン-アルカリフォスファターゼ(1:1000) (Strptavidin-AP, PharMinge 13043E)を添加し、２５℃で１時間インキュベートした後、６回洗浄した。フォスファターゼ基質p-ニトロフェニルフォスフェート２ナトリウム(pNPP alkalinephosphatase substrate , Sigma N-2770)を添加して、呈色反応を行った。プレートはマイクロプレートオートリーダー(ELISA reader, Dynex MRX)で４０５ｎｍで読みとった。読みとりには、マウス抗ＴＮＰｍＡｂ、ＩｇＧ１（１０７．３）、ＩｇＧ_２ａ（Ｇ１５５−１７８）、及びＩｇＥ（ＩｇＥ−３）の市販のアイソタイプ標品を参照した。

(E)サイトカイン(ＩＬ−４及びＩＦＮ−γ)のＥＬＩＳＡ測定
高タンパク高結合マイクロウエルプレート(Costar, No. 3590)を、精製抗サイトカイン抗体(ＩＬ−４にはPharMinge 18191DからのＩＬ−４抗体２μｇ／ｍｌを用い、ＩＦＮ−γには、３μｇ／ｍｌのＩＦＮ−γ抗体、PharMinge 18181Dを用いた)でコーティングした。このプレートを３％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液でコーティング後、０．０５％ツイーン２０含有ＰＢＳ溶液、ｐＨ７．４で洗浄した。

肺胞の流動物からの上澄液１００μｌをマイクロウエルにサイトカイン標準液と一緒に添加し、４℃で一晩反応した。その後、ビオチン−抗マウスＩＬ−４ (PharMinge 18042D, １μｇ／ｍｌ)あるいはビオチン−抗マウスＩＦＮ−γ (PharMinge 18112D, １μｇ／ｍｌ) １００μｌをマイクロウエルに添加した。２時間反応後、１００μｌのアビジン-アルカリホスファターゼ (1:1000) (streptavidin-AP, PharMinge 13043E)をマイクロウエルに添加し、１時間振盪した。２００μｌのフォスファターゼ基質p-ニトロフェニルフォスフェート２ナトリウム(pNPP alkalinephosphatase substrate, Sigma N-2770)をマイクロウエルに添加し、発色させた。プレートは、マイクロプレートオートリーダー(ELISA reader, Dynex MRX)で４０５ｎｍで読みとった。

(F)肺機能の測定
１００ｍｇ／ｍｌのフェノバルビタールをマウスに静脈注射後、ＰＥ５０チューブを気管に挿入した。チューブを圧力検出装置に接続し、吸入及び呼気の間の呼吸圧の変化を測定した。別のＰＥ５０チューブを食道に挿入し、食道肺内外圧差（ＴＰＰ）の代用として食道圧を測定した。圧力シグナルをBio-Recorder BR8000に送り、シグナルを増幅して呼吸及び食道肺内外圧差の量に変換し、気管圧を算出した。試験の間、針を尾部静脈に保持してアセチルコリン(Ach)注射を行い、気管圧の変化を誘発した。

（G）統計
試験データは全て、「平均値±平均標準誤差」で算出した。PC 100に変換後アセチルコリンにより誘発された気管抵抗性変化(trachea resistance change)はμｇ／ｋｇで測定した。ＩｇＥ及びＩｇＧ_２ａ測定は、光吸収値に基づいて示した。アンペアドスチューデント検定(unpaired student’s t test)を用いて、グループ間の有意差を決定した。ｐ＜０．０５は、統計学的有意差を示すのに用いた。

ＩｇＧ及びＩｇＥにおけるハーブの水性抽出の効果
様々な水性抽出方法をアメリカニンジン及び長柄菊に試みて、ハーブ組成物に用いる水性抽出物の最適な形態を決定した。

(1) 粉末、(2)９５％アルコール抽出物、(3)水抽出物、及び(4)５０％アルコール抽出物の形態のアメリカニンジンをＩｇＥ及びＩｇＧ_２ａの抑制における医学的効果について試験した。図１１のように、５０％アルコールで抽出されたアメリカニンジンは、ＩｇＧ_２ａ減少におけるアメリカニンジンの効果は９５％アルコールで抽出された場合ほど良くなかったにもかかわらず、最も高いＩｇＥ抑制効果を示した。抗原誘発性免疫学的疾患は、主としてＩｇＥ介在性疾患であるので、ハーブ組成物中に５０％アルコール抽出のアメリカニンジンを用いることは、組成物に対して最もよいＩｇＥ減少結果を与えるように思われる。しかし、アメリカニンジンのアルコール抽出物から調製した顆粒を他の顆粒に添加すると、アメリカニンジンの水抽出物から調製した顆粒は、ＩｇＥ抑制及びＩｇＧ上昇の両方においてより高い効果を発揮した。よって、STA-4組成物においてアメリカニンジンは水により抽出した。

(1)粉末、(2)９５％アルコール抽出物、(3)水抽出物、及び(4)５０％アルコール抽出物の長柄菊についても、ＩｇＥ、ＩｇＧ_２ａ、ＩＬ−４及びＩＦＮ−γの抑制における医学的効果を試験した。図１２に示すように、長柄菊の水抽出物は、ＩＬ−４及びＩＦＮ−γを最も抑制する効果を示したが、５０％アルコールで抽出した長柄菊は、最も高いＩｇＥ及びＩｇＧ_２ａ抑制効果を示した。しかし、長柄菊の水抽出物は試験中動物の血液凝固を誘発したので、ヒトに使用することは検討しなかった。

ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩＬ−４、ＩＦＮ−γ及び肺機能におけるSTA-36及びSTA-4の効果の比較
ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩＬ−４、及びＩＦＮ−γ、ならびに肺機能におけるSTA-36及びSTA-4のハーブ組成物の医学的効果の比較検討を、前記実施例３記載の試験動物で行った。検討の結果を図１３〜１５に示した。

図１３にマウスのＩｇＧ及びＩｇＥにおけるSTA-36及びSTA-4のハーブ組成物の効果の比較検討を示した。図１３のように、STA-36及びSTA-4ハーブ組成物は共に、コントロールに比較してＩｇＥ抑制効果を示し、STA-4の効果はSTA-36よりも大きかった。STA-4によるＩｇＥ抑制効果は、コントロールに対して統計的に有意であった。しかしながら、STA-36もSTA-4もＩｇＧにおける抑制効果を示さなかった。実際には、逆に、ＩｇＧレベルは、STA-36及びSTA-4処置群共にコントロールに比較して増加した。

図１４に、マウスの肺機能におけるSTA-36及びSTA-4の効果を示した。STA-36及びSTA-4は共に、コントロールよりも肺機能の有意な改善を示した(ｐ＜０．０５)。おそらく各試験群において動物の数が十分でなかったことによると思われるが、STA-4及びSTA-36の間の値には有意差はなかったけれども、STA-4はSTA-36よりも肺機能の改善を示した。

図１５に、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩＬ−４及びＩＦＮ−γにおける、ＳＴＡ−４の効果をケトチフェン、プレドニゾロン、及びアミノフィリンという通常の喘息薬と比較した。その結果、STA-4だけがＩｇＥの有意な減少と、ＩｇＧ、ＩＬ−４、及びＩＦＮ−γの有意な増加を示し、STA-4がケトチフェン、プレドニゾロン、及びアミノフィリンよりも喘息治療において良好な治療効果を有することが示唆された。

また、図１５の結果は、STA-4の治療効果は、前記喘息薬がＩＬ−４の合成を抑制し、これが間接的にＩｇＥレベルを減少させるという通常のメカニズムとは異なるかもしれないことを示唆した。本発明の場合、STA-4摂取後ＩＬ−４及びＩＦＮ−γは大幅に増加したので、ＩｇＥの減少はＩＬ−４の減少によるものではなかった。逆に、ＩＦＮ−γ(ＴＨ１細胞により産生及び分泌された)の量は、ＳＴＡ−４処置後有意に増加した。ＩＦＮ−γは、Ｂ細胞を刺激し、ＩｇＧ_２ａを合成、分泌するが、これはSTA-4処置の間ＩｇＧ_２ａ量がなぜ増加したのかということを説明するものである。このように、STA-4の効果は、少なくとも部分的にＩｇＧ_２ａに由来し、これがアレルゲンとの２回目の接触でアレルゲンと相互作用してアレルギー性反応を減少させると仮定される。

STA-36及びSTA-4ハーブ組成物の毒性試験
ハーブ組成物を、２８日間の亜急性経口毒性試験により毒性を試験し、死亡率、眼科診察、臨床的徴候、及び全体剖検について調べた。結果を表９〜１１に示した。

表９〜１１の結果により、本試験において、STA-36及びSTA-4は共に亜急性毒性の徴候を全く示さなかったことが示された。
詳細且つ好ましい形態により本発明を記載したが、請求項に定義した本発明の範囲を逸脱せずに当業者が修正や変更を行うことは可能であろう。

図１は、ジャノヒゲのＨＰＬＣクロマトグラムである。クロマトグラムプロファイル全体は、ＨＰＬＣ分析方法１を用いて波長２１４ｎｍで検出した。このクロマトグラムに示されるように、６１１５−１及び６１１５−２の２つの別々のピークがあり、これらはそれぞれ１１．５分及び１３分のリテンションタイムを有していた。これら２つのピークは、ジャノヒゲの同定に用いることができた。図２は、カラスビシャクのＨＰＬＣクロマトグラムである。２つの化学マーカー、アデニンとグアノシンをＨＰＬＣ分析方法２を用いて波長２６０ｎｍで検出した。アデニンのリテンションタイムは１４．８分、グアノシンのリテンションタイムは１７分であった。図３は、生カンゾウのＨＰＬＣクロマトグラムである。化学マーカーであるグリチルリチン（Ｇｌｙ）は、ＨＰＬＣ分析方法１を用いて波長２５０ｎｍで検出した。Ｇｌｙのリテンションタイムは４６．４分であった。図４は、アメリカニンジンのＨＰＬＣクロマトグラムである。化学マーカーであるジンセノシドＲｂ_１（Ｒｂ_１）は、ＨＰＬＣ分析方法３を用いて波長２０３ｎｍで検出した。Ｒｂ_１のリテンションタイムは３７．５分であった。図５は、長柄菊のＨＰＬＣクロマトグラムである。４つの特有のピークであるＦＹ−１〜ＦＹ−４をＨＰＬＣ分析方法２を用いて波長２５０．０ｎｍで検出した。ＦＹ−１のリテンションタイムは２８分、ＦＹ−２のリテンションタイムは３１．６分、ＦＹ−３のリテンションタイムは３３．５分、ＦＹ−４のリテンションタイムは１８．３分であった。図６は、Der p 5(Dermatophagoides pteronyssimus allergen 5)吸入惹起後５つの煎薬グループ（Ａ−Ｆ）で処置した後のDer p 5特異的ＩｇＧ及びＩｇＥ抗体のレベルを示す。血清ＩｇＧ及びＩｇＥレベルは、ＥＬＩＳＡで測定した。値は、平均値±平均標準誤差であり、バーは平均標準誤差を示す。Ａ：瀉白散グループ、Ｂ：小青竜湯グループ、Ｃ：麦門冬湯グループ、Ｄ：清燥救肺湯グループ、Ｅ：蘇子降気湯グループ、及びＦ：プラセボグループである。図７は、Der p 5吸入惹起後５つの煎薬グループ（Ａ−Ｆ）で処置した後の脾細胞(splenocytes)におけるＩＬ−４遺伝子発現を示す。ＩＬ−４遺伝子の発現は、ＲＴ−ＰＣＲ法(逆転写酵素 - ポリメラーゼ連鎖反応)により検出した。値は、平均値±平均標準誤差であり、バーは平均標準誤差を示す。Ａ：瀉白散グループ、Ｂ：小青竜湯グループ、Ｃ：麦門冬湯グループ、Ｄ：清燥救肺湯グループ、Ｅ：蘇子降気湯グループ、及びＦ：プラセボグループである。＊はｐ＜０．０５を示す。図８は、アレルゲンDer p 5 (Dermatophagoides pteronyssimus allergen 5)による惹起及び各々のハーブで処置後のマウス血清ＩｇＧレベルを示す。レーン１は、ジャノヒゲ処置の効果を示す。レーン２は、トウジン処置の効果を示す。レーン３は、カラスビシャク処置の効果を示す。レーン４は、生カンゾウ処置の効果を示す。レーン５は、プラセボ処置を示す。血清ＩｇＧレベルは、ＥＬＩＳＡで測定した。値は、平均値±平均標準誤差であり、バーは平均標準誤差を示す。図９は、Der p 5 (Dermatophagoides pteronyssimus allergen 5)による惹起及び各ハーブあるいは医薬組成物（すなわち、STA-36）処置後のマウス血清ＩｇＥレベルを示す。レーン１は、ジャノヒゲ処置の効果を示す。レーン２は、トウジン処置の効果を示す。レーン３は、カラスビシャク処置の効果を示す。レーン４は生カンゾウ処置の効果を示す。レーン５は、STA-36処置の効果を示す。レーン６はプラセボ処置を示す。血清ＩｇＧレベルは、ＥＬＩＳＥＡで測定した。値は、平均値±平均標準誤差であり、バーは平均標準誤差を示す。図１０は、Der p 5 (Dermatophagoides pteronyssimus allergen 5)による惹起及び各ハーブあるいは医薬組成物（すなわち、STA-36）処置後のマウス脾細胞におけるＩＬ−４遺伝子の発現を示す。ＩＬ−４遺伝子の発現は、ＲＴ−ＰＣＲ法(逆転写酵素 -ポリメラーゼ連鎖反応)で測定した。レーン１は、ジャノヒゲ処置の効果を示す。レーン２は、トウジン処置の効果を示す。レーン３は、カラスビシャク処置の効果を示す。レーン４は、生カンゾウ処置の効果を示す。レーン５は、STA-36処置の効果を示す。レーン６はプラセボ処置を示す。図１１は、(1)粉末、(2)９５％アルコール中の水性抽出物、(3)水中の水性抽出物、及び(4)５０％アルコール中の水性抽出物の形態でのアメリカニンジンの効果を、ＩｇＧ_２ａ及びＩｇＥレベルで比較したものである。値は、平均値±平均標準誤差である。図は、５０％アルコールで抽出されたアメリカニンジンが、水抽出物よりもＩｇＥ減少ならびにＩｇＧ増加の点で、わずかによい効果を発揮することを示している。図１２は、(1)粉末、(2) ９５％アルコール中の水性抽出物、(3)水中の水性抽出物、及び(4)５０％アルコール中の水性抽出物の形態での長柄菊の効果を、ＩｇＥ、ＩｇＧ_２ａ、ＩＬ−４、及びＩＦＮ−γレベルで比較したものである。値は、平均値±平均標準誤差である。*は、コントロールに対する有意差を示す。結果は、長柄菊の５０％エタノール抽出物がＩｇＥ抑制及びＩｇＧ増加において、最も有効であったことを示している。図１３は、雌ＢＡＬＢ／ｃマウスの血清中のＩｇＧ及びＩｇＥにおける STA-36、STA-4、及びコントロール（プラセボグループ）の効果の比較検討である。*は、 STA-4とコントロールの間の有意差 (p＜0.05)を示す。値は、平均値±平均標準誤差である。STA-36の投与量(２０ｍｇ／２０ｇマウス)は、STA-4 の投与量(１０ｍｇ／２０ｇマウス)の２倍であった(すなわち、STA-36：STA-4 = 2: 1)。結果は、ＩｇＥに関して、STA-36及びSTA-4が共にＩｇＥを抑制したが、STA-4だけがコントロールに対し統計的に有意であることを示している。ＩｇＧについては、STA-36及びSTA-4は共にＩｇＧの増加を示す。しかし、STA-36はSTA-4よりもＩｇＧレベルの増加が大きいように見えるが、何れもコントロールに対して有意差はない。図１４は、肺機能におけるSTA-36及びSTA-4の比較検討である。値は、平均値±平均標準誤差である。STA-36及びSTA-4は共に、(アセチルコリン測定により判定されるように)コントロールに比べて肺機能の有意な改善を示す(P＜0.05)。STA-4はSTA-36よりも効果があるように見えるが、STA-36及びSTA-4の間の差異は、おそらく各グループで用いた動物数が充分でないことによると思われるが、統計的に有意なものではない。STA-36の投与量(２０ｍｇ／２０ｇマウス)は、STA-4の投与量(１０ｍｇ／２０ｇマウス)の２倍であった。 STA-4のＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩＬ−４、及びＩＦＮ−γにおける効果を、ケトチフェン、プレドニゾロン、及びアミノフィリンを含む従来の（喘息治療のための）薬剤の効果と比較したものである。値は、平均値±平均標準誤差である。*はコントロールに対する有意差を示す。本検討結果は、STA-4はＩｇＥレベルを有意に低下し、ＩｇＧ_２ａ、ＩＬ−４及びＩＦＮ−γレベルを有意に増加したことを示す。

Claims

ジャノヒゲ（Tuber Ophiopogonis）、カラスビシャク（Tuber Pinelliae）、生カンゾウ（Radix Glycyrrhizae）、長柄菊（Herba Tridacis procumbentis）、及びアメリカニンジン（Radix Pancis Quinquefolii）を有効量含み、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、アレルギー性喘息、アトピー性湿疹、アトピー性皮膚炎、食物アレルギー、及び高ＩｇＥ症候群からなる群から選ばれる免疫学的疾患の治療用である免疫学的疾患治療用医薬組成物。
請求項１記載の医薬組成物において、前記ジャノヒゲが水性抽出物であり、
前記カラスビシャク、生カンゾウ、及び長柄菊が粉末状であることを特徴とする免疫学的疾患治療用医薬組成物。
請求項１又は２記載の医薬組成物において、ジャノヒゲ、カラスビシャク、生カンゾウ、及び長柄菊が、３：２：１：１の重量比であることを特徴とする免疫学的疾患治療用医薬組成物。
請求項１〜３の何れかに記載の医薬組成物において、前記アメリカニンジンが粉末状であることを特徴とする免疫学的疾患治療用医薬組成物。
請求項１〜４の何れかに記載の医薬組成物において、前記ジャノヒゲ、カラスビシャク、生カンゾウ、長柄菊、及びアメリカニンジンが、３：２：１：１：１の重量比であることを特徴とする免疫学的疾患治療用医薬組成物。
請求項１記載の医薬組成物において、前記ジャノヒゲ、カラスビシャク、生カンゾウ、長柄菊、及びアメリカニンジンが水性抽出物であることを特徴とする免疫学的疾患治療用医薬組成物。
請求項６記載の医薬組成物において、ジャノヒゲ、カラスビシャク、生カンゾウ、長柄菊、及びアメリカニンジンの前記水性抽出物を、それぞれ別々に濾過及び濃縮して、ジャノヒゲ、カラスビシャク、生カンゾウ、長柄菊、及びアメリカニンジンの各濃縮物とすることを特徴とする免疫学的疾患治療用医薬組成物。
請求項７記載の医薬組成物において、カラスビシャク、生カンゾウ、長柄菊、及びアメリカニンジンの前記各濃縮物を別々に顆粒化してそれぞれの顆粒を調製し、これら顆粒をジャノヒゲの前記濃縮物と混合して混合顆粒とすることを特徴とする免疫学的疾患治療用医薬組成物。
請求項８記載の医薬組成物において、顆粒化の前に、カラスビシャク、生カンゾウ、長柄菊、及びアメリカニンジンの前記各濃縮物に賦形剤を添加することを特徴とする免疫学的疾患治療用医薬組成物。
請求項９記載の医薬組成物において、前記賦形剤がコーンスターチであることを特徴とする免疫学的疾患治療用医薬組成物。
請求項２〜１０の何れかに記載の医薬組成物において、ジャノヒゲの前記水性抽出物が、水抽出物であることを特徴とする免疫学的疾患治療用医薬組成物。
請求項６〜１１の何れかに記載の医薬組成物において、カラスビシャクの前記水性抽出物が、水抽出物であることを特徴とする免疫学的疾患治療用医薬組成物。
請求項６〜１２の何れかに記載医薬組成物において、生カンゾウの前記水性抽出物が、水抽出物であることを特徴とする免疫学的疾患治療用医薬組成物。
請求項６〜１３の何れかに記載の医薬組成物において、長柄菊の前記水性抽出物が、水を含むアルコールで抽出された抽出物であることを特徴とする免疫学的疾患治療用医薬組成物。
請求項１４記載の医薬組成物において、前記長柄菊抽出物が、５０％アルコール抽出物であることを特徴とする免疫学的疾患治療用医薬組成物。
請求項６〜１５の何れかに記載の医薬組成物において、アメリカニンジンの水性抽出物が、水抽出物であることを特徴とする免疫学的疾患治療用医薬組成物。
請求項７〜１６の何れかに記載の医薬組成物において、ジャノヒゲの前記濃縮物の固型分がジャノヒゲに対し２０〜３０重量％、カラスビシャクの前記濃縮物の固型分がカラスビシャクに対し１５〜２５重量％、生カンゾウの前記濃縮物の固型分が生カンゾウに対し１５〜２５重量％、アメリカニンジンの前記濃縮物の固型分がアメリカニンジンに対し１９〜２９重量％、及び長柄菊の前記濃縮物の固型分が長柄菊に対し５〜１０重量％であることを特徴とする免疫学的疾患治療用医薬組成物。
請求項８〜１７の何れかに記載の医薬組成物において、前記カラスビシャク顆粒がカラスビシャクに対し２０〜３０重量％、前記生カンゾウ顆粒が生カンゾウに対し１６〜２６重量％、前記アメリカニンジン顆粒がアメリカニンジンに対し２７〜３７重量％、及び前記長柄菊顆粒が長柄菊に対し３７〜４７重量％であることを特徴とする免疫学的疾患治療用医薬組成物。
請求項１〜１８の何れかに記載の医薬組成物において、前記医薬組成物がアレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、アレルギー性喘息、アトピー性湿疹、アトピー性皮膚炎、食物アレルギー、及び高ＩｇＥ症候群からなる群から選ばれる免疫学的疾患の患者の治療用であることを特徴とする免疫学的疾患治療用医薬組成物。
カラスビシャク、生カンゾウ、及び長柄菊を粉砕してハーブ粉末を調製し、
ジャノヒゲを水中で煮沸してジャノヒゲの水性抽出物を調製し、
前記ハーブ粉末と前記ジャノヒゲ水性抽出物とを混合してハーブ混合物とし、
アメリカニンジンを粉砕してアメリカニンジン粉末を調製し、このアメリカニンジン粉末を前記ハーブ混合物と混合することを特徴とする請求項１〜５の何れかに記載の医薬組成物の製造方法。
請求項２０記載の方法において、ハーブ混合物を顆粒化することを特徴とする医薬組成物の製造方法。
請求項２１記載の方法において、前記顆粒化したハーブ混合物をカプセル化することを特徴とする医薬組成物の製造方法。
請求項１〜１９の何れかに記載の医薬組成物の有効量を含むことを特徴とする、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、アレルギー性喘息、アトピー性湿疹、アトピー性皮膚炎、食物アレルギー、及び高ＩｇＥ症候群からなる群から選ばれる免疫学的疾患治療剤。
ジャノヒゲを水中で煎じて抽出し、このジャノヒゲ水抽出物を濾過及び濃縮してジャノヒゲ濃縮物を調製し、
カラスビシャクを水中で煎じて抽出し、このカラスビシャク水抽出物を濾過及び濃縮してカラスビシャク濃縮物とし、さらにこのカラスビシャク濃縮物をスプレードライにより顆粒化し、
生カンゾウを水中で煎じて抽出し、この生カンゾウ水抽出物を濾過及び濃縮して生カンゾウ濃縮物とし、さらにこの生カンゾウ濃縮物をスプレードライにより顆粒化し、
長柄菊を水を含むアルコール中還流して抽出し、この長柄菊抽出物を濾過及び濃縮して長柄菊濃縮物とし、さらにこの長柄菊濃縮物をスプレードライにより顆粒化し、
カラスビシャク、生カンゾウ、及び長柄菊の顆粒をジャノヒゲ濃縮物と一緒に混合して混合顆粒とし、
アメリカニンジンを水中で煎じて抽出し、このアメリカニンジン水抽出物を濾過及び濃縮してアメリカニンジン濃縮物とし、このアメリカニンジン濃縮物をスプレードライにより顆粒化し、このアメリカニンジン顆粒を前記混合顆粒と混合することを特徴とする請求項１及び６〜１８の何れかに記載の医薬組成物の製造方法。
請求項２４記載の方法において、長柄菊抽出物が、５０％アルコール抽出物であることを特徴とする医薬組成物の製造方法。
請求項２４又は２５記載の方法において、顆粒化前に、前記カラスビシャク、生カンゾウ、及び長柄菊の各濃縮物に賦形剤を添加することを特徴とする医薬組成物の製造方法。
請求項２６記載の方法において、前記賦形剤がコーンスターチであることを特徴とする医薬組成物の製造方法。
請求項２４〜２７の何れかに記載の方法において、ジャノヒゲ濃縮物の固形分がジャノヒゲに対して２０〜３０重量％、カラスビシャク濃縮物の固形分がカラスビシャクに対して１５〜２５重量％、生カンゾウ濃縮物の固形分が生カンゾウに対し１５〜２５重量％、アメリカニンジン濃縮物の固形分がアメリカニンジンに対し２０〜３０重量％、長柄菊濃縮物の固形分が長柄菊に対し５〜１０重量％であることを特徴とする医薬組成物の製造方法。
請求項２４〜２８の何れかに記載の方法において、カラスビシャク顆粒がカラスビシャクに対し２０〜３０重量％、生カンゾウ顆粒が生カンゾウに対し１６〜２６重量％、アメリカニンジン顆粒がアメリカニンジンに対し２７〜３７重量％、長柄菊顆粒が長柄菊に対し３７〜４７重量％であることを特徴とする医薬組成物の製造方法。
請求項２４〜２９の何れかに記載の方法において、前記濃縮物は、５５℃、３０ｔｏｒｒの減圧下で減圧濃縮されたものであることを特徴とする医薬組成物の製造方法。
請求項２４〜３０の何れかに記載の方法において、各前記濃縮物を入口温度１０５℃及び出口温度７６〜７７℃でスプレードライすることを特徴とする医薬組成物の製造方法。