JP5400799B2 - 改善された質量分析法分析のための組成物およびプロセス - Google Patents

Description

関連特許出願
この特許出願は、２００８年１月１５日に出願された米国仮特許出願第１２／０１４，６７１号（すなわち、出願人としてＴｈｏｍａｓ Ｂｅｃｋｅｒ、表題ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＡＮＤ ＰＲＯＣＥＳＳＥＳ ＦＯＲ ＩＭＰＲＯＶＥＤ ＭＡＳＳ ＳＰＥＣＴＲＯＭＥＴＲＹ ＡＮＡＬＹＳＩＳ、そして代理人番号ＳＥＱ−６０１５−ＵＴによって指定される）の利益を主張する。この特許出願の全体は、全ての文字および図面を含めて、このような実施を可能にする範囲内で参考として本明細書に援用される。

発明の分野
本発明は一般的に、質量分析法とともに用いるための組成物および方法に関する。

質量分析法は、サンプル中の分析物の分子量を測定するために用いられる強力な分析ツールである。飛行時間型質量分析計を用いるとき、イオンの飛行速度は、電気泳動ゲルにおける分子の移動速度の約１０^７倍の速さであるため、たとえ良好な信号対ノイズ比を得るためにスペクトルの測定を１０回から１００回繰り返すときであっても、質量分析法は非常に迅速な分析方法を提供する。

質量分析法による分析は典型的に、あらゆる数の手段、たとえばマトリックス支援レーザー脱離イオン化法（Ｍａｔｒｉｘ Ａｓｓｉｓｔｅｄ Ｌａｓｅｒ Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ：ＭＡＬＤＩ）またはエレクトロスプレーイオン化（Ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ：ＥＳ）などによってサンプルをイオン化することから始まる。ＭＡＬＤＩ調製および測定手順はまず、サンプル担体上の通常は有機酸である固体または液体のＩＲまたはＵＶ吸収性のマトリックス中に分析物分子を埋め込むことからなる。マトリックスおよび分析物を含むサンプル担体は、質量分析計のイオン源に置かれる。マトリックスは短いレーザーパルスによって気化し、それによって分析物分子は非断片化状態で気相に移される。分析物分子は、同時に生じたマトリックスイオンと衝突して反応することによってイオン化する。イオンを無電界飛行チューブ内に向けて加速する電圧が印加される。イオン源のイオンは質量が異なるために異なる速度に加速され、より小さいイオンはより大きいイオンよりも早く検出器に達する。変動する飛行時間がイオンの異なる質量に変換される。

分析物をイオン化するための代替的な方法は、エレクトロスプレー（またはＥＳ）である。ＭＡＬＤＩと同様、エレクトロスプレーは極性分子のイオン化／気化を可能にする。最初に目的のサンプルを、そのサンプルがある程度までイオン化した形で存在するような溶媒に溶解する。従来のＥＳでは、次いでこの溶液をポンピングして高電位に上げられる細い毛細管に通す。小さい帯電小滴がＥＳ毛細管から大気圧の浴ガスにスプレーされて、質量分析計高真空系の開口部に向かって圧力および電位の勾配を下っていく。小滴はこの経路を横切る際に脱溶媒和されてサイズが小さくなることにより、表面クーロン力が表面張力に勝るようになる。その結果、小滴からイオンが脱離するか、または溶媒が完全に除去されるまで、小滴は壊れてより小さな小滴になる。イオン形成の正確な機構は完全に明らかにはなっていないが、結果的にイオンのビームが生じて、質量分析計にサンプリングされる。ＥＳプロセスのより詳細な説明は、Ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ：Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ，Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｃｏｌｅ編（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）に与えられている。

どのイオン化方法を用いても、イオン化の際に不必要な付加物が形成されることによって、質量分析法によって生成されるスペクトルの品質および分解能が損なわれるおそれがある。より特定的には、不必要な付加物の存在によって、分析物、特に低存在量または低質量の分析物を検出および分析することが困難になり得る。

本発明は、質量分析法による改善された分析のためのプロセスおよび組成物を提供する。本明細書には、サンプルイオンのイオン化、質量分析または検出を別様に阻害せず、対費用効果が高くかつ容易に実現できる態様で付加物形成を低減または最小化するような、質量分析サンプル調製法が提供される。本発明の改善された方法および組成物は、分析物ピークのより簡単な同定および定量化を可能にすることによって、正しいコール（ｃａｌｌｓ）の数を増やすことができる。これらの改善点は、ナトリウムおよび／またはアンモニア塩が混入したサンプルならびに分析物濃度が低いサンプルに対して特に有用であることが明らかになっている。特定の実施形態において、質量スペクトル中の付加物の存在を減らして、信号対ノイズ（ｓｉｇｎａｌ ｔｏ ｎｏｉｓｅ）（ｓ／ｎ）比を増やす付加物低減添加剤としてのアスコルビン酸またはその塩、互変異性体もしくは類似体の使用が以下に記載される。以下において本発明の実施形態は「アスコルビン酸」の使用に言及するが、当業者は、本明細書に記載される方法および組成物において、アスコルビン酸、アスコルビン酸塩、その塩、その互変異性体、またはその類似体（以下に記載される）を用い得ることが理解される。

１つの局面において、本発明は、質量分析法によって分析される分析物を含むサンプルにおける付加物形成を低減させるための方法を提供し、この方法は、質量分析法による分析物の分析の前に、アスコルビン酸を含む付加物低減添加剤をサンプルに加えるステップを含む。関連する実施形態において、付加物低減添加剤はシュウ酸アンモニウムをさらに含んでもよい。いくつかの実施形態において、付加物低減添加剤は他の付加物低減添加剤（公知または未発見の付加物低減添加剤）と組合せて用いられる。特定の実施形態において、付加物低減添加剤は１つまたはそれ以上の樹脂と組合せて用いられる。

特定の実施形態において、分析物はデオキシリボ核酸またはリボ核酸などの核酸である。質量分析前のサンプル取扱い手順は望ましくない付加物を生じ得るため、本明細書に記載される改善点はさまざまな質量分析形式に適用できる。質量分析形式の例は、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間型（Ｍａｔｒｉｘ−Ａｓｓｉｓｔｅｄ Ｌａｓｅｒ Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ Ｔｉｍｅ−ｏｆ−Ｆｌｉｇｈｔ：ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析法（Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ：ＭＳ）、レーザー脱離質量分析法（ＬＤＭＳ）、エレクトロスプレー（ＥＳ）ＭＳ、イオンサイクロトロン共鳴（Ｉｏｎ Ｃｙｃｌｏｔｒｏｎ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ：ＩＣＲ）ＭＳ、およびフーリエ変換ＭＳを含むがこれに限定されない。分析物が気化およびイオン化される質量分析形式（「イオン化ＭＳ」、例、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ、ＬＤＭＳ、ＥＳＭＳ）に対して、本明細書に記載される改善点を容易に適用できる。

本発明は、質量分析法によって分析される分析物を含むサンプルにおける付加物形成を低減させるための方法も提供し、この方法は、質量分析法による分析物の分析の前に、アスコルビン酸を含む付加物低減添加剤をマトリックスに加えるステップを含む。この方法は、質量分析法による分析物の分析の前に、付加物低減添加剤を（マトリックスと同様に）分析物に加える付加的なステップも含んでいてもよい。関連する実施形態において、付加物低減添加剤はシュウ酸アンモニウムをさらに含んでもよい。いくつかの実施形態において、マトリックス組成物は３-ヒドロキシピコリン酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙｐｉｃｏｌｉｎｉｃ ａｃｉｄ：３-ＨＰＡ）、クエン酸ジアンモニウム（ｄｉ−ａｍｍｏｎｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ：ＤＡＣ）、またはその組合せを含む。特定の実施形態において、分析物はデオキシリボ核酸またはリボ核酸などの核酸である。いくつかの実施形態において、付加物低減添加剤は分析物にも加えられる。

特定の実施形態において、本発明は、質量分析法において用いるために好適な基体（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）を調製するための方法を提供し、この方法は、付加物低減添加剤を含むマトリックス材料を基体上に堆積させるステップを含み、ここで付加物低減添加剤はアスコルビン酸を含む。関連する実施形態において、付加物低減添加剤はシュウ酸アンモニウムをさらに含んでもよい。別の関連する実施形態において、この方法は基体を密封するステップをさらに含む。基体を密封する方法は、包装プロセスによってもたらされる条件、たとえば真空密封および熱密封などを含むがこれに限定されない。いくつかの実施形態において、この方法は、酸化を最小限にするために薬剤またはガスによって基体を処理するステップをさらに含む。特定の実施形態において、基体は密封される前に、たとえばアルゴンなどの不活性ガスで洗浄される。特定の実施形態において、質量分析法による分析の前に、光またはＵＶ放射への露出を制限または排除するために、基体は密封および／または包装される。いくつかの実施形態において、所与のｐＨを維持するために基体は密封および／または包装される。特定の実施形態において、基体は、ポリマー容器（例、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン容器）を限定なしに含む容器中に包装される。いくつかの実施形態において、基体はシリカまたは二酸化ケイ素を含む。

本発明は、分析物と付加物低減添加剤とを含む、質量分析法によって分析される組成物も提供する。特定の実施形態において、付加物低減添加剤はアスコルビン酸を含む。関連する実施形態において、付加物低減添加剤はシュウ酸アンモニウムをさらに含んでもよい。

いくつかの実施形態において、本発明は、分析物と付加物低減添加剤とを含む、質量分析法による分析に好適な組成物を提供し、ここで添加剤はアスコルビン酸を含む。組成物はシュウ酸アンモニウムも含んでいてもよい。

特定の実施形態において、本発明は、基体と、アスコルビン酸を含む付加物低減添加剤とを含む、質量分析法のための標的部位を提供する。標的部位はシュウ酸アンモニウムも含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、標的部位はマトリックス材料をさらに含んでいてもよい。関連する実施形態において、マトリックス材料は基体上に前処置される。特定の実施形態において、標的部位は分析物をさらに含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、組成物は密封される。基体を密封する方法は、真空密封および熱密封を含むがこれに限定されない。特定の実施形態において、組成物は、酸化を最小限にするために薬剤またはガスで処理される。いくつかの実施形態において、組成物は密封される前に、たとえばアルゴンなどの不活性ガスで洗浄される。いくつかの実施形態において、光またはＵＶ放射への露出を制限または排除するために、組成物は密封および／または包装される。特定の実施形態において、所与のｐＨを維持するために組成物は密封および／または包装される。

本発明では質量分析法分析のための分析物を調製する方法も提供され、この方法は次のステップを含む：（ａ）分析物を含む溶液を、アスコルビン酸またはその塩、互変異性体もしくは類似体を含む組成物と接触させることによって、質量分析法分析のためのサンプルを調製するステップ；および（ｂ）サンプルを質量分析計に導入するステップ。特定の実施形態において、組成物はシュウ酸アンモニウムも含む。分析物はときには核酸であり、この核酸はデオキシリボ核酸、リボ核酸およびその類似物、またはその組合せを含むがこれに限定されない。いくつかの実施形態において、質量分析法分析は、以下からなる群より選択される：マトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析法、レーザー脱離質量分析法（ＬＤＭＳ）、エレクトロスプレー（ＥＳ）質量分析法、イオンサイクロトロン共鳴（ＩＣＲ）質量分析法、およびフーリエ変換質量分析法。いくつかの実施形態において、組成物はアスコルビン酸を含み、特定の実施形態において、組成物はアスコルビン酸の類似体を含まない。

本発明では質量分析法によって分析物を分析するための方法も提供され、この方法は次のステップを含む：（ａ）サンプルを質量分析計に導入するステップ、ここでサンプルは分析物と、アスコルビン酸またはその塩、互変異性体もしくは類似体とを含む；および（ｂ）質量分析法によってサンプルを分析するステップ。いくつかの実施形態において、サンプルはシュウ酸アンモニウムをさらに含む。分析物はときには核酸であり、この核酸はデオキシリボ核酸、リボ核酸およびその類似物、またはその組合せを含むがこれに限定されない。いくつかの実施形態において、サンプルは分析物とアスコルビン酸とを含み、特定の実施形態において、サンプルはアスコルビン酸の類似体を含まない。

本発明ではスポットのアレイを含む基体も提供され、各スポットは（ｉ）マトリックス支援レーザー脱離／イオン化（ＭＡＬＤＩ）質量分析法のためのマトリックスと、（ｉｉ）アスコルビン酸またはその塩、互変異性体もしくは類似体とを含む。いくつかの実施形態において、各スポットはシュウ酸アンモニウムをさらに含み、特定の実施形態において、スポットの１つまたはそれ以上は分析物をさらに含む。分析物はときには核酸であり、この核酸はデオキシリボ核酸、リボ核酸およびその類似物、またはその組合せを含むがこれに限定されない。いくつかの実施形態において、マトリックスは３-ヒドロキシピコリン酸（３-ＨＰＡ）か、またはＭＡＬＤＩ質量分析法によって核酸を分析するために好適な他のマトリックスを含む。特定の実施形態において、アスコルビン酸およびマトリックス（例、３-ＨＰＡ）を含むスポットの組成物は、紫外光（ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ ｌｉｇｈｔ）を吸収する（たとえば、約２２０ｎｍから約３００ｎｍ（例、約２６０ｎｍから約２７０ｎｍ；２６６ｎｍ）のＵＶ光を吸収する）。いくつかの実施形態において、マトリックスは、ＭＡＬＤＩ質量分析法によるタンパク質またはペプチドに対して好適な構成要素を含み、その構成要素は、フェルラ酸、シナピン酸、アルファ−シアノ−３−ヒドロキシ−ケイ皮酸、およびアルファ−シアノ−４−ヒドロキシ−ケイ皮酸を含むがこれに限定されない。特定の実施形態において、基体はチップ（例、シリコンチップ）である。いくつかの実施形態において、各スポットはアスコルビン酸を含み、特定の実施形態において、各スポットはアスコルビン酸の類似体を含まない。

本発明の方法および組成物によって改善され得る質量分析法分析の例は、核酸シーケンシング、遺伝子型同定またはメチル化分析を含むがこれに限定されない。分析は、質量分析法によって行なわれる定性分析または定量分析であってもよい。
本発明の好ましい実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
質量分析法によって分析される分析物を含むサンプルにおける付加物形成を低減させるための方法であって、質量分析法による該分析物の分析の前に、アスコルビン酸またはその塩、互変異性体もしくは類似体を含む付加物低減添加剤を該サンプルに加えるステップを含む、方法。
（項目２）
前記付加物低減添加剤はシュウ酸アンモニウムをさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記分析物は核酸である、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記核酸はデオキシリボ核酸である、項目３に記載の方法。
（項目５）
前記核酸はリボ核酸である、項目３に記載の方法。
（項目６）
質量分析法による前記分析は、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析法、レーザー脱離質量分析法（ＬＤＭＳ）、エレクトロスプレー（ＥＳ）質量分析法、イオンサイクロトロン共鳴（ＩＣＲ）質量分析法、およびフーリエ変換質量分析法からなる群より選択される、項目１に記載の方法。
（項目７）
質量分析法によって分析される分析物を含むサンプルにおける付加物形成を低減させるための方法であって、質量分析法による該分析物の分析の前に、アスコルビン酸またはその塩、互変異性体もしくは類似体を含む付加物低減添加剤をマトリックスに加えるステップを含む、方法。
（項目８）
質量分析法による前記分析物の分析の前に、前記付加物低減添加剤を該分析物にも加えるステップをさらに含む、項目７に記載の方法。
（項目９）
前記付加物低減添加剤はシュウ酸アンモニウムをさらに含む、項目７または８に記載の方法。
（項目１０）
前記マトリックス組成物は３-ヒドロキシピコリン酸（３-ＨＰＡ）を含む、項目７または８に記載の方法。
（項目１１）
前記マトリックス組成物はクエン酸ジアンモニウム（ＤＡＣ）を含む、項目７または８に記載の方法。
（項目１２）
前記分析物は核酸である、項目７または８に記載の方法。
（項目１３）
質量分析法において用いるために好適な基体を調製するための方法であって、付加物低減添加剤を含むマトリックス材料を該基体上に堆積させるステップを含み、該付加物低減添加剤はアスコルビン酸またはその塩、互変異性体もしくは類似体を含む、方法。
（項目１４）
前記基体を密封するステップをさらに含む、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
酸化を最小限にするために薬剤またはガスによって前記基体を処理するステップをさらに含む、項目１３に記載の方法。
（項目１６）
前記基体はシリカを含む、項目１３に記載の方法。
（項目１７）
前記付加物低減添加剤はシュウ酸アンモニウムをさらに含む、項目１３に記載の方法。
（項目１８）
質量分析法によって分析される組成物であって、分析物と付加物低減添加剤とを含む、組成物。
（項目１９）
前記付加物低減剤は、アスコルビン酸またはその塩、互変異性体もしくは類似体を含む、項目１８に記載の組成物。
（項目２０）
シュウ酸アンモニウムをさらに含む、項目１９に記載の組成物。
（項目２１）
マトリックス組成物と、アスコルビン酸またはその塩、互変異性体もしくは類似体とを含む、組成物。
（項目２２）
マトリックス組成物と、アスコルビン酸またはその塩、互変異性体もしくは類似体と、シュウ酸アンモニウムとを含む、組成物。
（項目２３）
質量分析法による分析に好適な組成物であって、分析物と付加物低減添加剤とを含み、該添加剤はアスコルビン酸またはその塩、互変異性体もしくは類似体と、シュウ酸アンモニウムとを含む、組成物。
（項目２４）
質量分析法のための標的部位であって、基体と、アスコルビン酸またはその塩、互変異性体もしくは類似体およびシュウ酸アンモニウムを含む付加物低減添加剤とを含む、標的部位。
（項目２５）
マトリックス材料をさらに含む、項目２４に記載の標的部位。
（項目２６）
質量分析法分析のための分析物を調製するための方法であって、
分析物を含む溶液を、アスコルビン酸またはその塩、互変異性体もしくは類似体を含む組成物と接触させることによって、質量分析法分析のためのサンプルを調製するステップと；
該サンプルを質量分析計に導入するステップと
を含む、方法。
（項目２７）
前記組成物はシュウ酸アンモニウムを含む、項目２６に記載の方法。
（項目２８）
前記分析物は核酸である、項目２６に記載の方法。
（項目２９）
前記核酸はデオキシリボ核酸である、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
前記核酸はリボ核酸である、項目２８に記載の方法。
（項目３１）
前記質量分析法分析は、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析法、レーザー脱離質量分析法（ＬＤＭＳ）、エレクトロスプレー（ＥＳ）質量分析法、イオンサイクロトロン共鳴（ＩＣＲ）質量分析法、およびフーリエ変換質量分析法からなる群より選択される、項目２６に記載の方法。
（項目３２）
質量分析法によって分析物を分析するための方法であって、
サンプルを質量分析計に導入するステップであって、該サンプルは分析物と、アスコルビン酸またはその塩、互変異性体もしくは類似体とを含む、ステップ、ならびに
質量分析法によって該サンプルを分析するステップ
を含む、方法。
（項目３３）
前記サンプルはシュウ酸アンモニウムをさらに含む、項目３２に記載の方法。
（項目３４）
前記分析物は核酸である、項目３２に記載の方法。
（項目３５）
前記核酸はデオキシリボ核酸である、項目３４に記載の方法。
（項目３６）
前記核酸はリボ核酸である、項目３４に記載の方法。
（項目３７）
前記質量分析法分析は、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析法、レーザー脱離質量分析法（ＬＤＭＳ）、エレクトロスプレー（ＥＳ）質量分析法、イオンサイクロトロン共鳴（ＩＣＲ）質量分析法、およびフーリエ変換質量分析法からなる群より選択される、項目３２に記載の方法。
（項目３８）
スポットのアレイを含む基体であって、各スポットは（ｉ）マトリックス支援レーザー脱離／イオン化（ＭＡＬＤＩ）質量分析法のためのマトリックスと、（ｉｉ）アスコルビン酸またはその塩、互変異性体もしくは類似体とを含む、基体。
（項目３９）
各スポットはシュウ酸アンモニウムをさらに含む、項目３８に記載の基体。
（項目４０）
前記スポットの１つまたはそれ以上は分析物をさらに含む、項目３８に記載の基体。
（項目４１）
前記分析物は核酸である、項目４０に記載の基体。
（項目４２）
前記核酸はデオキシリボ核酸である、項目４１に記載の基体。
（項目４３）
前記核酸はリボ核酸である、項目４１に記載の基体。
（項目４４）
前記マトリックスは３-ヒドロキシピコリン酸を含む、項目３８に記載の基体。
（項目４５）
前記基体はチップである、項目３８に記載の基体。
（項目４６）
前記チップはシリコンチップである、項目４５に記載の基体。

図１は、標準的な未変更マトリックス上に直接スポットされた１７ｍｅｒ合成オリゴヌクレオチド（ＧＴＧ ＧＴＧ ＧＴＧ ＧＴＧ ＧＴＧ ＧＴ）を用いて生成された質量スペクトルを示す図である。この図面において、アンモニア付加物の存在が同定される（ピークの高さは５３３５Ｄａの親ピークの約１２％）。 図２は、アスコルビン酸で変更したマトリックス上に直接スポットされた同じ１７ｍｅｒ合成オリゴヌクレオチド（ＧＴＧ ＧＴＧ ＧＴＧ ＧＴＧ ＧＴＧ ＧＴ）を用いて生成された質量スペクトルを示す図である。この図面にみられるとおり、アンモニア付加物はもはや存在しない。 図３は、標準的な未変更マトリックス上にスポットされたＲｈＤ遺伝子伸長産物から生成された質量スペクトルを示す図であって、その結果として７５７１Ｄａの伸長ピークと、７６２６Ｄａの＋５５Ｄａ付加物ピーク（ＮＨ３＋Ｋ）とが示される。付加物ピークは偽陽性挿入コールをもたらす（ＳＮＲ：２；可能性：８８％）。 図４は、アスコルビン酸で変更したマトリックス上にスポットされたＲｈＤ遺伝子伸長産物から生成された質量スペクトルを示す図であって、その結果として７５７１Ｄａの伸長ピークが示されるが、＋５５Ｄａ付加物ピークは示されない。偽陽性挿入コールは除去される（ＳＮＲ：０；可能性：０％）。

質量分析法は、核酸およびペプチドなどの分析物の分子量を測定するための高度に正確かつ高感度のやり方を提供する。このため、質量分析法は別様では測定困難な分子の分析のための強力なツールを提供する。しかし、不必要な付加産物の存在によって、分析物、特に低存在量または低質量の分析物を正確に検出および分析することが困難になり得る。多重化反応の部分としての単一の質量スペクトルにおいて複数の分析物を検出するとき、この問題はさらに悪化する。

イオン、典型的には陽イオンが、質量分析法の条件下で生体分子と関連付けられるときに付加物が形成し、それによって不必要な質量ピークが生成される。サンプル処理（例、生化学、サンプル取扱い、サンプル調合など）、サンプル精製（例、樹脂の添加）、サンプルイオン化、またはサンプル検出のあらゆる部分が付加物の形成に寄与し得る。

マトリックス支援レーザー脱離／イオン化（ＭＡＬＤＩ）質量分析法の場合には、マトリックス材料自体が付加物形成の原因となり得る。たとえば、３-ヒドロキシピコリン酸（３-ＨＰＡ）とクエン酸ジアンモニウム（ＤＡＣ）との混合物は、ＭＡＬＤＩに基づく核酸分析のための有効なＵＶマトリックスとしてしばしば使用される。アンモニウム塩（例、ＤＡＣ）は、一本鎖ＤＮＡ（ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ：ｓｓＤＮＡ）に対する陽イオン付加物形成をさらに低減させることが公知であるため、マトリックスに加えられ、特に３-ＨＰＡに加えられる（Ｗｕ，Ｊ．Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍ．Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．１９９３，７，１９１；Ｐｉｅｌｅｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９３，２１，１４，３１９１）。しかし、本明細書において提供される結果では、ＤＡＣがアンモニア（ＮＨ_３）付加物形成の主要な原因であることが示される。たとえば図１は、質量スペクトルの＋１７ＤａにおけるＮＨ_３付加物質量ピークの存在を示す。

アンモニア付加物形成の別の要因は、ＭＡＬＤＩ分析の前に分析物を脱塩するために用いられることがあるアンモニア化陽イオン交換樹脂である（Ｎｏｒｄｈｏｆｆ，Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍ．Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．１９９２，６，７７１）。以下の実施例に記載されるとおり、アンモニア付加物は主にグアニンおよびチミン塩基によって形成される。よってこれらの付加物は、核酸分析物がこれらの塩基を豊富に含むようなアッセイにおいてより顕著である。

加えて、アンモニア化陽イオン交換樹脂は、ＤＮＡの骨格からすべてのナトリウムイオンを完全には除去しないかもしれない。この除去不足によって、＋２２Ｄａにナトリウムイオン付加物質量ピークがもたらされる。他の付加物はマトリックス材料から形成してもよく、チミン塩基の存在下ではより一般的であり得る。たとえば、３−ヒドロキシピコリン酸がマトリックスとして用いられるとき、付加物質量ピークは９４Ｄａ、１３８Ｄａおよび１８８Ｄａに見出される。全体として、これらの付加物ピークすべてが質量分析結果の誤解釈をもたらし得る。よって、付加物、特にアルカリおよびアンモニア付加物の量および頻度を大きく低減させる組成物およびプロセスは、質量分析法に基づく分析の正確さ、感度およびスループットを改善するために有用である。付加物低減添加剤が存在することによって、付加物低減添加剤なしに分析されたサンプルに対して存在する付加物ピークを低減または排除できる。本明細書において示されるとおり、アスコルビン酸を付加することによって、相当する伸長産物強度における樹脂処理標準マトリックスに比べて平均付加物形成スコア（本明細書において定義される）が最高４０％まで低減されることが示された（実施例１〜３を参照）。加えて、アスコルビン酸添加剤によって変更されたマトリックスは、６ヵ月の期間にわたって物理的および化学的に安定であることが明らかになり（実施例４を参照）、基体を製造の際にアスコルビン酸で前処理することが可能になった。

分析物
本発明は、たとえば核酸（例、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチド）、タンパク質、ペプチドおよび脂質など、ならびにそれらの特定の類似体および結合体、たとえば糖タンパク質またはリポタンパク質などを含む分析物の質量分析法に基づく分析の改善を可能にする。本教示内でＭＡＬＤＩ分析に適用できるその他の物質は、小さな分子、代謝産物、天然生成物および医薬品である。本発明の方法および組成物は、多数のグアニンおよびチミンを含むポリヌクレオチドに対して特に有用である。なぜならこれらのポリヌクレオチドはアンモニア付加物形成をより起こしやすいためである。

本明細書において用いられる「核酸」という用語は、一本鎖および／または二本鎖のポリヌクレオチド、たとえばデオキシリボ核酸（ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ：ＤＮＡ）およびリボ核酸（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ：ＲＮＡ）、ならびにＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかの類似体または誘導体などを示す。「核酸」という用語には、核酸の類似体、たとえばペプチド核酸（ｐｅｐｔｉｄｅ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ：ＰＮＡ）、ホスホロチオエートＤＮＡ、アシクロヌクレオチド、ならびにその他のこうした類似体および誘導体またはその組合せなども含まれる。

ポリヌクレオチドに含まれるヌクレオチド類似体は、たとえば以下のものなどであってもよい：ポリヌクレオチドの質量分化（ｍａｓｓ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）を可能にする質量変更したヌクレオチド；ポリヌクレオチドの検出を可能にする、蛍光性、放射性、発光性、または化学発光性のラベルなどの検出可能なラベルを含有するヌクレオチド;または、固体支持へのポリヌクレオチドの固定を容易にする、ビオチンまたはチオール基などの反応基を含有するヌクレオチド。ポリヌクレオチドは、たとえば化学的、酵素的または光分解的に、選択的に切断可能な１つまたはそれ以上の骨格結合も含有していてもよい。たとえば、ポリヌクレオチドは１つまたはそれ以上のデオキシリボヌクレオチドと、それに続く１つまたはそれ以上のリボヌクレオチドとを含んでもよく、その後に１つまたはそれ以上のデオキシリボヌクレオチドが続いてもよく、こうした配列はリボヌクレオチド配列において塩基加水分解によって切断可能である。ポリヌクレオチドは、切断に対して比較的に耐性である１つまたはそれ以上の結合、たとえばキメラオリゴヌクレオチドプライマーなども含有してもよく、これはペプチド核酸結合によってつながれたヌクレオチドと、ホスホジエステル結合などによってつながれて、ポリメラーゼによって伸長され得る３’末端の少なくとも１つのヌクレオチドとを含んでもよい。

サンプル
本明細書において用いられる「サンプル」とは、分析される分析物を含有する組成物を示す。特定の実施形態において、サンプルは「生物学的サンプル」からのものである。一般的に生物学的材料は、生きた供給源（例、ヒト、動物、植物、バクテリア、真菌、原生生物、ウイルス））から得られるあらゆる材料と考えられる。生物学的サンプルは、固体材料（例、組織、細胞ペレットおよび生検）および生物学的流体（例、尿、血液、唾液、羊水および（頬側細胞を含有する）口腔洗浄薬）を含むあらゆる形であってもよい。好ましくは、固体材料は流体と混合される。

マトリックス
マトリックス材料は、たとえばＭＡＬＤＩ分析法など、特定の形の質量分析法において使用される。マトリックス材料は、分析物分子を互いに分離し、レーザー光子によって与えられたエネルギーを吸収し、そのエネルギーを分析物分子に移すことによって分析物分子の脱離およびイオン化をもたらす働きをする。一旦分析物がイオン化されると、飛行時間（ＴＯＦ）分析計などの質量分析計を用いてイオン質量を測定できる。

質量分析法分析のためのマトリックス材料の選択はしばしば、分析される生体分子のタイプに依存する。たとえば、質量分析法による核酸分析に対してしばしば用いられるマトリックスは、３-ヒドロキシピコリン酸（３-ＨＰＡ）とクエン酸ジアンモニウム（ＤＡＣ）との混合物である。サンプル分析物のイオン化を容易にするために用いられる別のマトリックス材料は、２，５−ジヒドロキシ安息香酸（２，５−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ：ＤＨＢ）である。ＤＨＢも、付加物形成およびサンプル分析を妨げる化学的ノイズ発生を受ける。アルファ−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（Ａｌｐｈａ−ｃｙａｎｏ−４−ｈｙｄｒｏｘｙｃｉｎｎａｍｉｃ ａｃｉｄ：α-ＣＨＣＡ）は、マトリックス支援レーザー飛行時間型質量分析法におけるタンパク質およびペプチド分析物のイオン化のための、広く用いられるマトリックスの例である。しかし、α-ＣＨＣＡ付加物は一般的であり、低存在量、低質量の分析物を正確に検出する能力を妨げるおそれがある。改善された質量分析法分析に対して本明細書に記載されるフリーラジカルスカベンジャー添加剤とともに用いられてもよい付加的なマトリックスは、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．（Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍ．Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．１２：９９３−９９８（１９９８），Ｍ．Ｃ．Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ ａｎｄ Ｌ．Ｍ．Ｓｍｉｔｈ（Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃ．１９９５．２４：１１７−４０）、およびＮｏｒｄｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ．（Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ，１９９６，１５，６７−１３８；これらすべてはこれにより引用により援用される）に記載されており、マトリックスの例は、２，４，６−トリヒドロキシアセトフェノン（２，４，６−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙａｃｅｔｏｐｈｅｎｏｎｅ：ＴＨＡＰ）、アントラニル酸、ニコチン酸、サリチルアミド、１−イソキノリノール、Ｔ−２−（３−（４−ｔ−ブチル−フェニル）−２−メチル−２−プロペニリデン）マロノニトリル（ＤＣＴＢ）、シナピン酸（ｓｉｎａｐｉｃ ａｃｉｄ：ＳＡ）、ジトラノール（ｄｉｔｈｒａｎｏｌ：ＤＩＴ）、３−アミノキノリン、トランス−３−インドールアクリル酸（ｔｒａｎｓ−３−ｉｎｄｏｌｅａｃｒｙｌｉｃ ａｃｉｄ：ＩＡＡ）、２−（４−ヒドロキシフェニルアゾ）安息香酸（２−（４−ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌａｚｏ）ｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ：ＨＡＢＡ）、コハク酸、２，６−ジヒドロキシアセトフェノン、フェルラ酸、コーヒー酸、グリセロールおよびニトロアニリンを限定なしに含む。

マトリックスが基体上に堆積される前または後に、マトリックス材料は添加剤または分析物と組合されてもよい。分析物が光吸収性材料のマトリックスに埋込まれるとき、一般的にマトリックスは分析物に対して過剰に存在する。ＭＡＬＤＩプロセスに対しては、ある形の分析物分子を、通常結晶性であるマトリックス材料に、その結晶化の際に組込むか、または少なくとも小さいマトリックス結晶間の境界面に組込むことが有利である。いくつかの実施形態においては、添加剤は最初に溶液中でマトリックス材料と混合され、組合されたマトリックス材料／添加剤溶液が基体上に堆積されてそこで結晶化する。

さまざまな実施形態において、アスコルビン酸と水などの好適な溶媒とを含む溶液にマトリックスを溶解することによって、マトリックスは基体上に堆積されて別個のスポットを形成する。結果的に得られる溶液はＭＡＬＤＩ基体上に堆積され、基体は真空チャンバ内に置かれることによって、マトリックス／アスコルビン酸溶液が真空下で乾燥されてもよい。実施形態の１つにおいて、アスコルビン酸は、単独または他のマトリックスと組合せて、マトリックス材料として働く。

マトリックス、添加剤または分析物を基体に堆積させるために、さまざまな方法を用いることができる。実施形態の１つにおいて、各構成要素の適用は別々のステップで行なわれる。たとえば、マトリックス材料は基体に前処理されていてもよく、その後に適切な液体分配装置（例、圧電性のピンツール分配装置）を用いて分析物が加えられてもよい。いくつかの実施形態において、構成要素は組合せて堆積される。たとえば、最初にマトリックスと添加剤とが組合されて（すなわち溶媒中に溶解されて）ともに基体に堆積され、その後に分析物が加えられてもよい。いくつかの実施形態において、マトリックスまたはマトリックス／添加剤堆積物は基体上で乾燥されて、溶媒が蒸発する際にマトリックスの結晶を形成してもよい。その後、乾燥したマトリックスの頂部に分析物溶液が堆積することによって、乾燥マトリックス堆積物が部分的に溶解し、再溶解したマトリックスが分析物とともに共結晶化する。

特定の実施形態においては、付加物低減添加剤がマトリックス材料として直接使用され、いくつかの実施形態においては、付加物低減添加剤がマトリックス材料の構成要素として使用される。いくつかの実施形態におけるマトリックス材料は、付加物低減添加剤と、本明細書に記載される質量分析法マトリックス材料の１つまたはそれ以上（例、３-ＨＰＡ、ＤＡＣ、ＤＨＢ、ＣＨＣＡ、ＴＨＡＰ、ＤＣＴＢ、ＤＩＴ、ＳＡ、ＩＡＡ、ＨＡＢＡのうちの１つまたはそれ以上）とを含む。付加物低減添加剤が１つまたはそれ以上の質量分析法マトリックス材料とともに使用される実施形態に対して、付加物低減添加剤は、マトリックス材料の全体重量の９９重量％から１重量％の範囲（例、マトリックス材料の全体重量の約５重量％、１０重量％、１５重量％、２０重量％、２５重量％、３０重量％、３５重量％、４０重量％、４５重量％、５０重量％、５５重量％、６０重量％、６５重量％、７０重量％、７５重量％、８０重量％、８５重量％、９０重量％または９５重量％）にわたり、ときには付加物低減添加剤のモル比（すなわちモル添加剤対モル質量分析マトリックス）は、たとえば約１：２０、１：１９、１：１８、１：１７、１：１６、１：１５、１：１４、１：１３、１：１２、１：１１、１：１０、１：９、１：８、１：７、１：６、１：５、１：４、１：３または１：２である。

添加剤
本明細書において用いられる「付加物低減添加剤」という用語は、質量分析法による分析に必要なあらゆる１つまたはそれ以上の構成要素または試薬に添加される物質である。これらの構成要素または試薬は、サンプル、分析物、マトリックス材料、基体、またはその組合せを含む。特定の実施形態において、付加物低減添加剤はアスコルビン酸か、または実質的に等しい付加物低減効果を有するアスコルビン酸のあらゆる誘導体である。

特定の実施形態において、付加物低減添加剤はフリーラジカルスカベンジャーである。質量分析法分析における使用に好適な、かつ特定の場合には核酸の質量分析法分析における使用に好適な、あらゆるフリーラジカルスカベンジャーを使用できる。フリーラジカルスカベンジャーの例は、アスコルビン酸、レチノール、トコトリエノール、トコフェロール、補酵素Ｑ１０、メラトニン、リコピン、ルテイン、アルファカロチン、ベータカロチン、ゼアキサンチン、アスタキサンチン、カンタキサンチン、フラボン（例、ルテオリン、アピゲニン、タンゲリチン）、ファボノール（ｆａｖｏｎｏｌｓ）（例、ケルセチン、ケンペロール、ミリセチン、イソラムネチン、プロアントシアニジン）、ファバノン（ｆａｖａｎｏｎｅｓ）（例、ハスペレチン（ｈａｓｐｅｒｅｔｉｎ）、ナリンゲニン、エリオジクチオール）、イソフラボンフィトエストロゲン（例、ゲニステイン、ダイドゼイン、グリシテイン）、スチルベノイド（例、レスベラトロル、プテロスチルベン）、アントシアニン（例、シアニジン、デルフィニジン、マルビジン、ペラルゴニジン、ペオニジン、ペツニジン）、フェノール酸およびエステル（例、エラグ酸、没食子酸、サリチル酸、ロスマリン酸、ケイ皮酸、クロロゲン酸、チコリ酸、ガロタンニン、エラジタンニン）、非フラボノイドフェノール（例、クルクミン、キサントン、シリマリン、オイゲノール）、ならびに有機酸化防止剤（例、クエン酸、シュウ酸、フィチン酸、リグナン、尿酸、Ｎ-アセチルシステイン）を限定なしに含む。本明細書の実施例に示されるとおり、当業者は、こうしたスカベンジャーを並行分析（ｓｉｄｅ−ｂｙ−ｓｉｄｅ ａｎａｌｙｓｅｓ）においてルーチン的にテストすることによって、質量分析法のための添加剤またはマトリックスとして好適なフリーラジカルスカベンジャーを容易に識別できる。

いくつかの実施形態において、添加剤は実質的に不純物を含まないために精製される必要がない。付加物低減添加剤が実質的に純粋ではないとき、添加剤は不純物を除去するための当該技術分野において公知の方法、たとえばイオン交換樹脂精製などによって精製されてもよい。

添加剤は溶解されて液体の形にされ（例、水に溶解され）、次いで前処理されたマトリックス上に堆積されるか、または前処理されたマトリックスを有さない基体上に直接堆積されてもよい。代替的に、添加剤は基体上に堆積される前にマトリックスと組合されてもよい。添加剤とマトリックスとを組合せて、１ｍｇ／ｍｌから約２０ｍｇ／ｍｌのマトリックス濃度と、約５ｍＭから約５０ｍＭの添加剤濃度とを得てもよい。不十分な量の添加剤を使用すると付加物形成が顕著に低減されないが、使用する添加剤が多すぎると質量スペクトル中の親シグナルが抑制されるおそれがある。当業者は、添加剤の量を変えてスペクトル特性への影響を定めることによって、過度の実験なしに添加剤の適切な量を定めて特定の分析物の分析を最適化することができる。

いくつかの実施形態において、付加物低減添加剤は単独で用いられてもよいし、不必要な付加物の存在を低減または除去する他の物質と組合せて用いられてもよい。アスコルビン酸添加剤は、質量スペクトルにおけるバックグラウンドノイズを低減できる他の添加剤と組合せることができる。その他の公知の好適な添加剤は、樹脂、揮発性のアンモニウム塩、特に揮発性の一塩基性、二塩基性、または三塩基性アンモニウム塩を含む。好ましくは、塩添加剤は分析されるサンプルを妨げるほど過剰に塩基性ではない。添加剤は、一塩基性リン酸塩および硫酸塩（例、一塩基性リン酸アンモニウム）、および二塩基性クエン酸塩（例、二塩基性クエン酸アンモニウム）、および三塩基性クエン酸塩（例、三塩基性クエン酸アンモニウム）であってもよい。

特定の実施形態において、付加物低減添加剤はアスコルビン酸、アスコルビン酸塩、その塩、その互変異性体、またはアスコルビン酸類似体（類似体の塩および互変異性体を含む）であり、次の式に従う構造を有する：

ここで：
Ｒ^１およびＲ^２は独立にＯＨ、ハロゲン、Ｒ^３、ＯＲ^３、アジド、シアノ、ＣＨ_２Ｒ^３、ＣＨＲ^３Ｒ^４、ＳＲ^３、ＮＲ^３Ｒ^４であり；
Ｒ^３およびＲ^４は独立にＨ、アルキル、アセチレンもしくはシアノ、または任意に置換されたアリール環状炭素、アリール複素環、非アリール環状炭素もしくは非アリール複素環である。本発明において用いられるアスコルビン酸類似体は一般的にフリーラジカル消去剤（ｓｃａｖｅｎｇｉｎｇ ａｇｅｎｔｓ）であり、アスコルビン酸類似体のフリーラジカル消去活性は、当業者によって決定され得る（例、２,６-ジクロロフェノール-インドフェノール（２，６−ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｏｌ−ｉｎｄｏｐｈｅｎｏｌ：ＤＣＰＩＰ）、ヨウ素、ヨウ素酸塩およびヨウ化物の混合物またはＮ‐ブロモスクシンイミドなどの酸化剤による滴定）。

本明細書において使用される「任意に置換された」という用語は、記載される特定の１つまたは複数の基が非水素置換基を有さなくてもよいし、その１つまたは複数の基が１つまたはそれ以上の非水素置換基を有してもよいことを示す。別様に指定されていなければ、存在し得るこうした置換基の総数は、記載される基の置換されていない形に存在するＨ原子の数に等しい。カルボニル酸素（＝Ｏ）など、任意の置換基が二重結合を介して付着されているとき、この基は利用可能な原子価を２つ取るため、含まれ得る置換基の総数は利用可能な原子価の数に従って減少する。

アスコルビン酸およびその類似体は、塩としての調製が可能となるようなイオン化可能な基を有してもよい。この場合、その化合物が参照されるときにはいつも、医薬的に許容できる塩も用いられてもよいことが当該技術分野において理解される。これらの塩は無機酸または有機酸を含む酸付加塩であってもよいし、本発明の化合物の酸性形の場合には、塩は無機塩基または有機塩基から調製されてもよい。化合物はしばしば、医薬的に許容できる酸または塩基の付加産物として調製された医薬的に許容できる塩として調製または使用される。好適な医薬的に許容できる酸および塩基は当該技術分野において周知であり、たとえば酸付加塩を形成するための塩酸、硫酸、臭化水素酸、酢酸、乳酸、クエン酸、または酒石酸、および塩基性塩を形成するための水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、水酸化アンモニウム、カフェイン、さまざまなアミンなどである。適切な塩を調製するための方法は当該技術分野においてよく確立されている。いくつかの場合には、化合物が酸性官能基および塩基性官能基の両方を含有することがあり、この場合には化合物は２つのイオン化基を有するかもしれないが正味電荷を有さない。

アスコルビン酸類似体は、しばしば１つまたはそれ以上のキラル中心を含有する。本発明は、各々の単離された立体異性形に加えて、ラセミ混合物を含むさまざまな程度のキラル純度の立体異性体の混合物も含む。本発明は、形成され得るさまざまなジアステレオマーおよび互変異性体も包含する。本発明の化合物は、２つ以上の互変異性形で存在することもある；本明細書における１つの互変異性体の描写は利便性のためのみのものであり、示される形の他の互変異性体も包含することが理解される。

本明細書において用いられる「アルキル」、「アルケニル」および「アルキニル」という用語は、直鎖、分岐鎖および環状の一価のヒドロカルビルラジカル、ならびにこれらの組合せを含み、これらは未置換のときにはＣおよびＨのみを含有する。その例にはメチル、エチル、イソブチル、シクロヘキシル、シクロペンチルエチル、２プロペニル、３ブチニルなどが含まれる。本明細書においてはこうした基の各々における炭素原子の総数をしばしば記載しており、たとえばその基が最高１０個の炭素原子を含有できるとき、それは１−１０ＣまたはＣ１−Ｃ１０もしくはＣ１−１０と表わすことができる。たとえば、ヘテロアルキル基のようにヘテロ原子（典型的にはＮ、ＯおよびＳ）が炭素原子を置換したとき、その基を説明する数はなおもたとえばＣ１−Ｃ６などと書かれるが、その数は基の中の炭素原子の数と、記載される環または鎖の骨格における炭素原子に対する置換として含まれるこうしたヘテロ原子の数との和を表わす。

典型的に、本発明のアルキル、アルケニルおよびアルキニル置換基は、１つの１０Ｃ（アルキル）または２つの１０Ｃ（アルケニルもしくはアルキニル）を含有する。好ましくは、それらの置換基は１つの８Ｃ（アルキル）または２つの８Ｃ（アルケニルもしくはアルキニル）を含有する。時には、それらの置換基は１つの４Ｃ（アルキル）または２つの４Ｃ（アルケニルもしくはアルキニル）を含有する。単一の基が２つ以上のタイプの多重結合または２つ以上の多重結合を含んでもよい；こうした基は、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を含有するときには「アルケニル」という用語の定義に含まれ、少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を含有するときには「アルキニル」という用語に含まれる。

アルキル、アルケニルおよびアルキニル基はしばしば、その置換が化学的に意味をなす程度まで任意に置換される。典型的な置換基は、以下を含むがこれに限定されない：ハロ、＝Ｏ、＝Ｎ−ＣＮ、＝Ｎ−ＯＲ、＝ＮＲ、ＯＲ、ＮＲ_２、ＳＲ、ＳＯ_２Ｒ、ＳＯ_２ＮＲ_２、ＮＲＳＯ_２Ｒ、ＮＲＣＯＮＲ_２、ＮＲＣＯＯＲ、ＮＲＣＯＲ、ＣＮ、ＣＯＯＲ、ＣＯＮＲ_２、ＯＯＣＲ、ＣＯＲ、およびＮＯ_２、ここで各Ｒは独立にＨ、Ｃ１−Ｃ８アルキル、Ｃ２−Ｃ８ヘテロアルキル、Ｃ１−Ｃ８アシル、Ｃ２−Ｃ８ヘテロアシル、Ｃ２−Ｃ８アルケニル、Ｃ２−Ｃ８ヘテロアルケニル、Ｃ２−Ｃ８アルキニル、Ｃ２−Ｃ８ヘテロアルキニル、Ｃ６−Ｃ１０アリール、またはＣ５−Ｃ１０ヘテロアリールであり、各Ｒは任意にハロ、＝Ｏ、＝Ｎ−ＣＮ、＝Ｎ−ＯＲ’、＝ＮＲ’、ＯＲ’、ＮＲ’_２、ＳＲ’、ＳＯ_２Ｒ’、ＳＯ_２ＮＲ’_２、ＮＲ’ＳＯ_２Ｒ’、ＮＲ’ＣＯＮＲ’_２、ＮＲ’ＣＯＯＲ’、ＮＲ’ＣＯＲ’、ＣＮ、ＣＯＯＲ’、ＣＯＮＲ’_２、ＯＯＣＲ’、ＣＯＲ’、およびＮＯ_２で置換され、ここで各Ｒ’は独立にＨ、Ｃ１−Ｃ８アルキル、Ｃ２−Ｃ８ヘテロアルキル、Ｃ１−Ｃ８アシル、Ｃ２−Ｃ８ヘテロアシル、Ｃ６−Ｃ１０アリール、またはＣ５−Ｃ１０ヘテロアリールである。アルキル、アルケニルおよびアルキニル基は、Ｃ１−Ｃ８アシル、Ｃ２−Ｃ８ヘテロアシル、Ｃ６−Ｃ１０アリールまたはＣ５−Ｃ１０ヘテロアリールで置換されてもよく、その各々が特定の基に対して適切な置換基によって置換されてもよい。

「アセチレン」置換基は任意に置換される２−１０Ｃアルキニル基であって、式−Ｃ≡Ｃ-Ｒａを有し、ここでＲａはＨまたはＣ１−Ｃ８アルキル、Ｃ２−Ｃ８ヘテロアルキル、Ｃ２−Ｃ８アルケニル、Ｃ２−Ｃ８ヘテロアルケニル、Ｃ２−Ｃ８アルキニル、Ｃ２−Ｃ８ヘテロアルキニル、Ｃ１−Ｃ８アシル、Ｃ２−Ｃ８ヘテロアシル、Ｃ６−Ｃ１０アリール、Ｃ５−Ｃ１０ヘテロアリール、Ｃ７−Ｃ１２アリールアルキル、もしくはＣ６−Ｃ１２ヘテロアリールアルキルであり、各Ｒａ基はハロ、＝Ｏ、＝Ｎ−ＣＮ、＝Ｎ−ＯＲ’、＝ＮＲ’、ＯＲ’、ＮＲ’２、ＳＲ’、ＳＯ_２Ｒ’、ＳＯ_２ＮＲ’_２、ＮＲ’ＳＯ_２Ｒ’、ＮＲ’ＣＯＮＲ’_２、ＮＲ’ＣＯＯＲ’、ＮＲ’ＣＯＲ’、ＣＮ、ＣＯＯＲ’、ＣＯＮＲ’_２、ＯＯＣＲ’、ＣＯＲ’、およびＮＯ_２から選択される１つまたはそれ以上の置換基によって任意に置換され、ここで各Ｒ’は独立にＨ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ２−Ｃ６ヘテロアルキル、Ｃ１−Ｃ６アシル、Ｃ２−Ｃ６ヘテロアシル、Ｃ６−Ｃ１０アリール、Ｃ５−Ｃ１０ヘテロアリール、Ｃ７−１２アリールアルキル、またはＣ６−１２ヘテロアリールアルキルであり、これらの各々はハロ、Ｃ１−Ｃ４アルキル、Ｃ１−Ｃ４ヘテロアルキル、Ｃ１−Ｃ６アシル、Ｃ１−Ｃ６ヘテロアシル、ヒドロキシ、アミノ、および＝Ｏから選択される１つまたはそれ以上の基によって任意に置換され；２つのＲ’がつながれて、Ｎ、ＯおよびＳから選択される最高３個のヘテロ原子を任意に含有する３−７員環を形成してもよい。いくつかの実施形態において、−Ｃ≡Ｃ-ＲａのＲａはＨまたはＭｅである。

「ヘテロアルキル」、「ヘテロアルケニル」および「ヘテロアルキニル」などは、対応するヒドロカルビル（アルキル、アルケニルおよびアルキニル）基と同様に定義されるが、「ヘテロ」という用語は、骨格残基に１個から３個のＯ、ＳもしくはＮヘテロ原子またはその組合せを含有する基を示す；つまり、対応するアルキル、アルケニルまたはアルキニル基の少なくとも１つの炭素原子が指定のヘテロ原子の１つによって置換されて、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニルまたはヘテロアルキニル基を形成する。一般的に、アルキル、アルケニルおよびアルキニル基のヘテロ形に対する典型的かつ好ましいサイズは、対応するヒドロカルビル基と同じであり、ヘテロ形に存在し得る置換基はヒドロカルビル基に対して上述した置換基と同じである。化学的安定性の理由から、別様に指定されない限り、ニトロまたはスルホニル基のようにＮまたはＳにオキソ基が存在する場合を除き、こうした基は２つより多くの隣接するヘテロ原子を含まないことも理解される。

本明細書において用いられる「アルキル」はシクロアルキルおよびシクロアルキルアルキル基を含むが、本明細書において「シクロアルキル」という用語は、環状炭素原子を介して接続される炭素環式非芳香族基を説明するために用いられることがあり、「シクロアルキルアルキル」はアルキルリンカーを通じて分子に接続された炭素環式非芳香族基を説明するために用いられることがある。同様に、「ヘテロシクリル」は、少なくとも１つのヘテロ原子を環の構成員として含有し、かつＣまたはＮであってもよい環の原子を介して分子に接続される非芳香族環状基を説明するために用いられることがあり；「ヘテロシクリルアルキル」は、リンカーを通じて別の分子に接続されるこうした基を説明するために用いられることがある。シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ヘテロシクリル、およびヘテロシクリルアルキル基に対して好適なサイズおよび置換基は、アルキル基に対して上述したものと同じである。本明細書において用いられるこれらの用語は、１つまたは２つの二重結合を含有する芳香族でない環も含む。

本明細書において用いられる「アシル」は、カルボニル炭素原子の２つの利用可能な原子価位置の一方において付着されたアルキル、アルケニル、アルキニル、アリールまたはアリールアルキルラジカルを含む基を包含し、ヘテロアシルとはカルボニル炭素以外の少なくとも１つの炭素がＮ、ＯおよびＳから選択されるヘテロ原子によって置換された対応する基を示す。よってヘテロアシルは、たとえば−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲおよび−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ_２ならびに−Ｃ（＝Ｏ）−ヘテロアリールなどを含む。

アシルおよびヘテロアシル基は、カルボニル炭素原子の開いた原子価を通じてあらゆる基または分子に付着して結合される。典型的に、それらはホルミル、アセチル、ピバロイルおよびベンゾイルを含むＣ１−Ｃ８アシル基、ならびにメトキシアセチル、エトキシカルボニルおよび４−ピリジノイルを含むＣ２−Ｃ８ヘテロアシル基である。アシルまたはヘテロアシル基を含むヒドロカルビル基、アリール基、およびこうした基のヘテロ形は、アシルまたはヘテロアシル基の対応する構成要素の各々に対する一般的に好適な置換基として本明細書に記載される置換基で置換されてもよい。

「芳香族」部分または「アリール」部分とは、芳香性の周知の特徴を有する単環式または融合二環式の部分を示す；その例にはフェニルおよびナフチルが含まれる。同様に、「芳香族複素環」および「ヘテロアリール」とは、環の構成員としてＯ、ＳおよびＮから選択される１つまたはそれ以上のヘテロ原子を含有するこうした単環式または融合二環式の環系を示す。ヘテロ原子を含むことによって、６員環だけでなく５員環の芳香性も可能になる。典型的な芳香族複素環系は、単環式Ｃ５−Ｃ６芳香族基、たとえばピリジル、ピリミジル、ピラジニル、チエニル、フラニル、ピロリル、ピラゾリル、チアゾリル、オキサゾリルおよびイミダゾリルなど、ならびにこれらの単環基の１つをフェニル環または芳香族複素環単環基のいずれかと融合してＣ８−Ｃ１０二環基を形成することによって形成される融合二環式部分、たとえばインドリル、ベンズイミダゾリル、インダゾリル、ベンゾトリアゾリル、イソキノリル、キノリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾフラニル、ピラゾロピリジル、キナゾリニル、キノキサリニル、シンノリニルなどを含む。環系全体の電子分布の観点から芳香性の特徴を有するあらゆる単環式または融合環二環式の系がこの定義に含まれる。この定義は、少なくとも分子の残り部分に直接付着する環が芳香性の特徴を有するような二環基も含む。典型的に、この環系は５〜１２個の環構成員原子を含有する。好ましくは、単環式ヘテロアリールは５〜６個の環構成員を含有し、二環式ヘテロアリールは８〜１０個の環構成員を含有する。

アリールおよびヘテロアリール部分は、Ｃ１−Ｃ８アルキル、Ｃ２−Ｃ８アルケニル、Ｃ２−Ｃ８アルキニル、Ｃ５−Ｃ１２アリール、Ｃ１−Ｃ８アシル、およびこれらのヘテロ形を含むさまざまな置換基で置換されてもよく、これらの置換基の各々自身がさらに置換されてもよい；アリールおよびヘテロアリール部分に対するその他の置換基はハロ、ＯＲ、ＮＲ_２、ＳＲ、ＳＯ_２Ｒ、ＳＯ_２ＮＲ_２、ＮＲＳＯ_２Ｒ、ＮＲＣＯＮＲ_２、ＮＲＣＯＯＲ、ＮＲＣＯＲ、ＣＮ、ＣＯＯＲ、ＣＯＮＲ_２、ＯＯＣＲ、ＣＯＲ、およびＮＯ_２を含み、ここで各Ｒは独立にＨ、Ｃ１−Ｃ８アルキル、Ｃ２−Ｃ８ヘテロアルキル、Ｃ２−Ｃ８アルケニル、Ｃ２−Ｃ８ヘテロアルケニル、Ｃ２−Ｃ８アルキニル、Ｃ２−Ｃ８ヘテロアルキニル、Ｃ６−Ｃ１０アリール、Ｃ５−Ｃ１０ヘテロアリール、Ｃ７−Ｃ１２アリールアルキル、またはＣ６−Ｃ１２ヘテロアリールアルキルであり、各Ｒは任意に、アルキル基に対して前述したとおりに置換される。アリールまたはヘテロアリール基上の置換基は当然、各種のこうした置換基または置換基の各構成要素に対して好適であると本明細書に記載される基によってさらに置換されてもよい。よって、たとえばアリールアルキル置換基は、アリール部分において、アリール基に対して典型的であると本明細書に記載される置換基によって置換されてもよく、アルキル部分において、アルキル基に対して典型的または好適であると本明細書に記載される置換基によってさらに置換されてもよい。

同様に、「アリールアルキル」および「ヘテロアリールアルキル」とは、置換または未置換の、飽和または不飽和の、環式または非環式のリンカーを含む、アルキレンなどのリンク基を通じて付着点に結合された芳香族および芳香族複素環系を示す。典型的に、リンカーはＣ１−Ｃ８アルキルまたはそのヘテロ形である。これらのリンカーは、カルボニル基をも含むことによって、アシルまたはヘテロアシル部分としての置換基を提供できるようにしてもよい。アリールアルキルまたはヘテロアリールアルキル基中のアリールまたはヘテロアリール環は、アリール基に対して上述したものと同じ置換基で置換されてもよい。好ましくは、アリールアルキル基は、アリール基に対して上に定義された基で任意に置換されるフェニル環と、未置換であるかまたは１つもしくは２つのＣ１−Ｃ４アルキル基もしくはヘテロアルキル基で置換されるＣ１−Ｃ４アルキレンとを含み、アルキルまたはヘテロアルキル基は任意に環化してシクロプロパン、ジオキソランまたはオキサシクロペンタンなどの環を形成してもよい。同様に、ヘテロアリールアルキル基は好ましくは、アリール基の典型的な置換基として上述された基で任意に置換されるＣ５−Ｃ６単環式ヘテロアリール基と、未置換であるかまたは１つもしくは２つのＣ１−Ｃ４アルキル基もしくはヘテロアルキル基で置換されるＣ１−Ｃ４アルキレンとを含むか、または任意に置換されるフェニル環もしくはＣ５−Ｃ６単環式ヘテロアリールと、未置換であるかまたは１つもしくは２つのＣ１−Ｃ４アルキル基もしくはヘテロアルキル基で置換されるＣ１−Ｃ４ヘテロアルキレンとを含み、アルキルまたはヘテロアルキル基は任意に環化してシクロプロパン、ジオキソランまたはオキサシクロペンタンなどの環を形成してもよい。

アリールアルキルまたはヘテロアリールアルキル基が任意に置換されると記載されるとき、置換基はその基のアルキルまたはヘテロアルキル部分にあっても、アリールまたはヘテロアリール部分にあってもよい。アルキルまたはヘテロアルキル部分に任意に存在する置換基は、アルキル基に対して一般的に上述されたものと同じである；アリールまたはヘテロアリール部分に任意に存在する置換基は、アリール基に対して一般的に上述されたものと同じである。

本明細書において用いられる「アリールアルキル」基は、未置換のときにはヒドロカルビル基であり、環およびアルキレンまたは類似のリンカー中の炭素原子の総数によって記載される。つまりベンジル基はＣ７−アリールアルキル基であり、フェニルエチルはＣ８−アリールアルキルである。

上述の「ヘテロアリールアルキル」はリンク基を通じて付着されるアリール基を含む部分を示し、「アリールアルキル」と異なる点は、アリール部分の少なくとも１つの環原子またはリンク基の１つの原子がＮ、ＯおよびＳから選択されるヘテロ原子であるところである。本明細書において、ヘテロアリールアルキル基は組合される環およびリンカーの原子の総数によって記載され、それはヘテロアルキルリンカーを通じて結合されたアリール基と；アルキレンなどのヒドロカルビルリンカーを通じて結合されたヘテロアリール基と；ヘテロアルキルリンカーを通じて結合されたヘテロアリール基とを含む。よって、たとえばＣ７−ヘテロアリールアルキルは、ピリジルメチル、フェノキシ、およびＮ−ピロリルメトキシを含む。

本明細書において用いられる「アルキレン」とは、二価のヒドロカルビル基を示す；二価であるため、アルキレンは２つの他の基をつなぎ合せることができる。典型的にアルキレンは−（ＣＨ_２）_ｎ−を示し、ここでｎは１〜８であり、好ましくはｎは１〜４であるが、指定されるときにはアルキレンは他の基で置換されてもよいし、他の長さであってもよいし、開いた原子価は鎖の反対側端部になくてもよい。よって−ＣＨ（Ｍｅ）−および−Ｃ（Ｍｅ）_２−もアルキレンと呼ばれてもよく、シクロプロパン−１，１−ジイルなどの環状基も同様である。アルキレン基が置換されるとき、置換基は、本明細書に記載されるとおり典型的にアルキル基に存在する置換基を含む。

一般的に、置換基に含有されるあらゆるアルキル、アルケニル、アルキニル、アシル、またはアリールもしくはアリールアルキル基またはこれらの基のうち１つのあらゆるヘテロ形自身が、付加的な置換基によって任意に置換されてもよい。置換基が別様に記載されていなければ、これらの置換基の性質は一次置換基自体に関して挙げられるものと同様である。よって、たとえばＲ７の実施形態がアルキルであるとき、このアルキルはＲ７に対する実施形態として列挙される残りの置換基によって任意に置換されてもよく、ここではこの置換が化学的に意味をなし、かつこの置換がアルキル自身に対して与えられたサイズ制限を損なわないものとする；たとえば、アルキルまたはアルケニルによって置換されたアルキルは、これらの実施形態に対する炭素原子の上限を単純に超えるために含まれない。しかし、アリール、アミノ、アルコキシ、＝Ｏなどによって置換されたアルキルは本発明の範囲に含まれ、これらの置換基の原子は、記載されるアルキル、アルケニルなどの基を説明するために用いられる数に入れられない。置換基の数が指定されていないとき、こうしたアルキル、アルケニル、アルキニル、アシルまたはアリール基の各々が、その利用可能な原子価に従っていくつかの置換基で置換されてもよい；特に、たとえばこれらの基のいずれかが、その利用可能な原子価のいずれかまたはすべてにおいてフッ素原子で置換されてもよい。

本明細書において用いられる「ヘテロ形」とは、アルキル、アリールまたはアシルなどの基の誘導体を示し、ヘテロ形では所定の炭素環基の少なくとも１つの炭素原子がＮ、ＯおよびＳから選択されるヘテロ原子によって置換されている。よってアルキル、アルケニル、アルキニル、アシル、アリールおよびアリールアルキルのヘテロ形は、それぞれヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、ヘテロアルキニル、ヘテロアシル、ヘテロアリールおよびヘテロアリールアルキルである。オキソ基がＮまたはＳに付けられてニトロまたはスルホニル基を形成する場合を除いて、通常２つより多くのＮ、ＯまたはＳ原子が連続的に接続されることはないことが理解される。

本明細書において用いられる「ハロ」は、フルオロ、クロロ、ブロモおよびヨードを含む。しばしばフルオロおよびクロロが好まれる。本明細書において用いられる「アミノ」はＮＨ_２を示すが、アミノが「置換される」または「任意に置換される」と記載されるとき、この用語はＮＲ’Ｒ’’を含み、ここでＲ’およびＲ’’の各々は独立にＨであるか、またはアルキル、アルケニル、アルキニル、アシル、アリール、もしくはアリールアルキル基であるか、またはこれらの基のうち１つのヘテロ形であり、このアルキル、アルケニル、アルキニル、アシル、アリール、もしくはアリールアルキル基、またはこれらの基のうち１つのヘテロ形の各々は、本明細書において対応の基に対して好適であると記載される置換基で任意に置換される。この用語は、Ｒ’およびＲ’’がともにつながれて３〜８員環を形成した形も含み、この形は飽和、不飽和または芳香族であってもよく、環構成員としてＮ、ＯおよびＳから独立に選択される１〜３個のヘテロ原子を含有し、アルキル基に対して好適であると記載される置換基で任意に置換されるか、またはＮＲ’Ｒ’’が芳香族基であるときには、ヘテロアリール基に対して典型的であると記載される置換基で任意に置換される。

本明細書において用いられる「炭素環（ｃａｒｂｏｃｙｃｌｅ）」という用語は、環に炭素原子のみを含有する環状化合物を示すのに対し、「複素環（ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｅ）」とはヘテロ原子を含む環状化合物を示す。炭素環式構造および複素環式構造は、単環式、二環式または複数環の系を有する化合物を包含する。本明細書において用いられる「ヘテロ原子」という用語は、炭素または水素ではないあらゆる原子、たとえば窒素、酸素または硫黄などを示す。複素環の実例は、テトラヒドロフラン、１，３ジオキソラン、２，３ジヒドロフラン、ピラン、テトラヒドロピラン、ベンゾフラン、イソベンゾフラン、１，３ジヒドロイソベンゾフラン、イソキサゾール、４，５ジヒドロイソオキサゾール、ピペリジン、ピロリジン、ピロリジン２オン、ピロール、ピリジン、ピリミジン、オクタヒドロピロロ［３，４ｂ］ピリジン、ピペラジン、ピラジン、モルホリン、チオモルホリン、イミダゾール、イミダゾリジン２，４ジオン、１，３ジヒドロベンゾイミダゾール２オン、インドール、チアゾール、ベンゾチアゾール、チアジアゾール、チオフェン、テトラヒドロチオフェン１，１ジオキシド、ジアゼピン、トリアゾール、グアニジン、ジアザビシクロ［２．２．１］ヘプタン、２，５ジアザビシクロ［２．２．１］ヘプタン、２，３，４，４ａ，９，９ａヘキサヒドロ１Ｈベータカルボリン、オキシラン、オキセタン、テトラヒドロピラン、ジオキサン、ラクトン、アジリジン、アゼチジン、ピペリジン、ラクタムを含むがこれらに限定されず、さらにヘテロアリールを包含してもよい。ヘテロアリールのその他の実例は、フラン、ピロール、ピリジン、ピリミジン、イミダゾール、ベンズイミダゾール、およびトリアゾールを含むがこれらに限定されない。

基体
本明細書において用いられる「基体（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）」とは不溶性の支持を示し、その上に分析物を堆積させて分析する。基体は、シリカ、ガラス（例、ガラス、制御細孔ガラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ−ｐｏｒｅ ｇｌａｓｓ：ＣＰＧ））、ナイロン、Ｗａｎｇ樹脂、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ樹脂、セファデックス、セファロース、セルロース、磁気ビーズ、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ、金属面（例、鋼、金、銀、アルミニウム、シリコンおよび銅）、プラスチック材料（例、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリアミド、ポリエステル、ポリビニリデンジフルオリド（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅｄｉｆｌｕｏｒｉｄｅ：ＰＶＤＦ））または、プレートを有するかもしくは有さないウエハ（例、シリコンウエハ）などの平坦面のピット中のビーズまたはピン（例、組合せの合成または分析に好適なピンのアレイを含んでもよいが、これらに限定されない。固体支持は、以下を含むがこれらに限定されないあらゆる所望の形であってもよい：ビーズ、チップ、毛細管、プレート、膜、ウエハ、コーム、ピン、ピットを有するウエハ、実質的に平坦な表面、ピットもしくはナノリットルウェルのアレイ、ならびに当業者に公知のその他のジオメトリおよび形。好ましい支持は、サンプルを別々の位置に受取るかまたは結合するように設計された平坦面である。最も好ましいのは、サンプルを受取るか、含有するか、結合するための親水性の位置を囲む疎水性の領域を有する平坦面である。基体材料は、装置の動作に対して、またはＭＡＬＤＩ質量分析法の典型的なマトリックス材料および溶媒を含む、この手順において用いられる試薬に対して不活性であってもよい。

基体上で、マトリックスまたはマトリックス/添加剤またはマトリックス/分析物/添加剤のスポットは、しばしば特定の特徴を有する。基体上の各スポットは、直径が約２００マイクロメートルから約１ｍｍであってもよい。スポット直径はしばしば実質的に均一であり、スポット間の直径の変動はしばしば最小限である（例、約２０マイクロメートルの変動）。質量分析法に対して有用な基体上のスポットに対するあらゆる中心間距離が用いられてもよく、たとえば中心間距離は２．２５ｍｍまたは１．１２５ｍｍなどであってもよく、基体上のスポット間の中心間距離はしばしば実質的に均一である。基体上のスポットの厚さは、約１０マイクロメートルから約１００マイクロメートルの範囲であってもよい。基体上の各スポットの厚さはしばしば実質的に均一であり、スポット間の厚さの変動はしばしば最小限である（例、約３０マイクロメートル）。

標的部位
本明細書において用いられる「標的部位」という用語は、たとえばマトリックス材料、マトリックス材料と添加剤、または分析物などの材料を堆積および保持できる、基体上の特定の位置を示す。基体は１つまたはそれ以上の標的部位を含有していてもよく、その標的部位はランダムに配置されてもよいし、規則的なアレイまたはその他のパターンであってもよい。ＭＡＬＤＩ分析などの質量分析法分析のために用いられるときには、標的部位または堆積された材料によってもたらされる部位は、脱離をもたらすために基体上に焦点合せされるレーザースポットのサイズに等しいか、またはそれより小さいことが好ましい。よって標的部位は、たとえば固体支持の表面に位置決めされるウェルもしくはピット、ピンもしくはビーズ、または物理的障壁、またはそれらの組合せ、たとえばチップ上のビーズ、ウェル中のチップなどであってもよい。標的部位は基体上に物理的に置かれてもよいし、基体の表面にエッチングされてもよいし、ある位置の周囲をエッチングした後に残る「タワー」であってもよいし、たとえば相対的な親水性、疎水性などの物理化学的パラメータ、または中もしくは上に液体を保持するあらゆるその他の界面化学によって定められてもよい。

プラットホーム
本発明の方法および組成物は、以下を含むあらゆるイオン化源とともに用いられてもよい：大気圧化学イオン化（Ａｔｍｏｓｐｈｅｒｉｃ Ｐｒｅｓｓｕｒｅ，Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｏｎｉｓａｔｉｏｎ：ＡＰＣＩ）、化学イオン化（ＣＩ）、電子衝撃（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｉｍｐａｃｔ：ＥＩ）、エレクトロスプレーイオン化（Ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ Ｉｏｎｉｓａｔｉｏｎ：ＥＳＩまたはＥＳ）、高速原子衝撃（Ｆａｓｔ Ａｔｏｍ Ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ：ＦＡＢ）、電界脱離／電界イオン化（Ｆｉｅｌｄ Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／Ｆｉｅｌｄ Ｉｏｎｉｓａｔｉｏｎ：ＦＤ／ＦＩ）、マトリックス支援レーザー脱離イオン化法（ＭＡＬＤＩ）、および熱スプレーイオン化（Ｔｈｅｒｍｏｓｐｒａｙ Ｉｏｎｉｓａｔｉｏｎ：ＴＳＰ）。特定の実施形態において、イオン化源はＭＡＬＤＩまたはＥＳである。

本発明の方法および組成物は、あらゆる質量分析計とともに用いられてもよい。現在いくつかの質量分析計が利用可能であり、その中でよく知られるものには、四重極の飛行時間（ＴＯＦ）分析計、磁気セクタ、ならびにフーリエ変換および四重極のイオントラップの両方が含まれる。加えて、分析計はタンデム（ＭＳ−ＭＳ）質量分析計としてタンデムで用いられてもよい。いくつかの実施形態において、質量分析計はＴＯＦ分析計である。

特定の実施形態において、分析物は質量分析法分析によって分析され、分光学的方法では分析されない。いくつかの実施形態において、分析物は赤外分光法（例、フーリエ変換赤外分光法）によって分析されず、この赤外分光法は一般的に特定の分子の振動周波数を測定するものであって、通常は分析物のイオン化およびイオン化した分析物の質量測定を含まない。

以下の実施例は非限定的なものであり、本発明の特定の実施形態を例示するものである。

実施例１
分析物に対する添加剤
以下の実施例において、Ｓｅｑｕｅｎｏｍ ｉＰＬＥＸ（商標）反応からの分析物を、ナノ純水またはアスコルビン酸添加剤のいずれかと混合して、付加物形成に対する添加剤の影響を定めた。どちらもこれにより引用により援用されるＪｕｒｉｎｋｅ，Ｃ．，Ｏｅｔｈ，Ｐ．，ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｏｏｍ，Ｄ．，ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ：ａ ｖｅｒｓａｔｉｌｅ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｈｉｇｈ−ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ＤＮＡ ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２６，１４７−１６４（２００４）；およびＯｅｔｈ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．，ｉＰＬＥＸ^ＴＭ Ａｓｓａｙ：Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ Ｐｌｅｘｉｎｇ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ａｎｄ Ｆｌｅｘｉｂｉｌｉｔｙ ｆｏｒ ＭａｓｓＡＲＲＡＹ（登録商標）Ｓｙｓｔｅｍ ｔｈｒｏｕｇｈ ｓｉｎｇｌｅ ｂａｓｅ ｐｒｉｍｅｒ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｗｉｔｈ ｍａｓｓ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒｓ．ＳＥＱＵＥＮＯＭ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏｔｅ（２００５）に記載されるとおりのＳｅｑｕｅｎｏｍ ｉＰＬＥＸ（商標）プロトコルに続いて、プレートは並行して処理された。希釈／条件付けステップの際に、標準的なプロトコルの指示どおりに９□ｌの分析物溶液を２５□ｌのナノ純水と混合する一方で、他方のプレートをアスコルビン酸と混合して２０ｍＭの最終アスコルビン酸濃度を得た。

アスコルビン酸から残留陽イオンを除去し、アンモニア化陽イオン交換樹脂からのあらゆる可能な推論を排除するために、アスコルビン酸のストック溶液を１ｇ／ｍｌのプロトン化樹脂で脱塩した。ワークフローに依存して、添加剤は直接分析物と混合してもよいし、さらに希釈してからサンプルに加えてもよい。この特定の実施例において、希釈ステップは自動液体ハンドラ上で完了し、希釈液は分析物溶液に加えられる前に１／２５の体積比で５０ｍｌトレイに保存された。

それぞれの希釈／条件付けステップに続いて、Ｓｅｑｕｅｎｏｍ Ｎａｎｏｄｉｓｐｅｎｓｅｒを用いて両方のプレートを１０ｎｌ／ドメインにて予めマトリックス化した（ｐｒｅ−ｍａｔｒｉｘｅｄ）標準ＳｐｅｃｔｒｏＣｈｉｐ（商標）（３００ｍＭ ３−ＨＰＡ／２５ｍＭＤＡＣ）に分配し、Ｓｅｑｕｅｎｏｍ ＭａｓｓＡＲＲＡＹ（登録商標）Ａｎａｌｙｚｅｒ Ｃｏｍｐａｃｔ上で分析した。

結果：アスコルビン酸の使用によって、アスコルビン酸処理サンプルに対するコール数が８％高くなった。ナトリウムおよびアンモニア付加物は、アスコルビン酸処理サンプルにおいて検出限界まで抑制された。その結果、アスコルビン酸処理サンプルに対するアンモニアおよび／またはナトリウム付加物による疑陽性コールは無かったのに対し、水条件付けサンプル中のアンモニア付加物によって１つのアッセイが繰り返しヘテロ接合体に割当てられた（疑陽性コール）。

実施例２
マトリックスに対する添加剤
以下の実施例において、アスコルビン酸（ａｓｃｏｒｂｉｃ ａｃｉｄ：ＡＡ）を含む新たなマトリックス組成物が、付加物形成を低減することによってスペクトル品質を改善することが示された。

マトリックス溶液
以下のストック溶液およびナノ純水からマトリックスの組合せを調製した（異なるマトリックス構成要素のストック溶液は、その構成要素の官能基に従って陽イオン交換樹脂で処理した−酸はＨ＋形の交換樹脂で、アンモニア塩はＮＨ４＋形の樹脂で処理した）：
３-ＨＰＡ：３０％の水性アセトニトリル中に３５０ｍＭ。

ＡＡ：水溶液中に１Ｍ。

ＤＡＣ：２２６ｍｇ１Ｍｉｎ水溶液。

標準マトリックスは３００ｍＭの３ＨＰＡと２５ｍＭのＤＡＣとで調製したのに対し、新たなマトリックスは３００ｍＭの３ＨＰＡと２０ｍＭのＮＨ_４−オキサレートと２０ｍＭのアスコルビン酸とで調製した。表１を参照。最終マトリックスは、Ｇｅｓｉｍ Ｎａｎｏｐｌｏｔｔｅｒを用いて１５−２０ｎｌにてＳｐｅｃｔｒｏＣｈｉｐ上に分配した。

合成オリゴヌクレオチドサンプル
表１のマトリックスに直接スポットされた合成オリゴヌクレオチドを用いて２つの実験を行なった。第１の実験において、１７ｍｅｒ合成オリゴヌクレオチド（ＧＴＧ ＧＴＧ ＧＴＧ ＧＴＧ ＧＴＧ ＧＴ）を、「古い」樹脂処理したマトリックスと、「新しい」アスコルビン酸で変更したマトリックスの両方でテストした。図１（古いマトリックス）においてはアンモニア付加物が明らかに存在する（ピークの高さは５３３５Ｄａにおける親ピークの約１２％）のに対し、図２（新しいマトリックス）においてはアンモニア付加物が存在しない。この新しいマトリックスは代替的に「マトリックス６３Ｃ」と呼ばれることもある。

第２の実験において、低質量の１７ｍｅｒ合成オリゴヌクレオチド（５０４４Ｄａ）と、高質量の２８ｍｅｒ合成オリゴヌクレオチド（８４３６Ｄａ）との付加物形成および脱プリンをテストした。両方の実験において、合成オリゴヌクレオチド分析物を、Ｇｅｓｉｍ ｎａｎｏｐｌｏｔｔｅｒを用いてスポット当り１０ｎｌにて表１のマトリックス上に分配した。低質量および高質量オリゴヌクレオチドに対する結果を、それぞれ表２および表３に示す。

マトリックス比較は、相対的な付加物および脱プリンピークの高さ、ならびにプローブの高さおよびＳＮＲに基づいている。分析に、ピークスコア閾値を超えるパッドの相対度数を説明するために、付加物形成スコアを導入した：
付加物形成スコア＝
＝（閾値を超えるパッドの相対度数）＊（平均付加物ピーク高さ）
基体上の「パッド」および「スポット」という用語は、互いに交換可能である。平均付加物ピーク高さに対する標準偏差はすべてのマトリックスに対して低くて同等であり、表中には報告されていない。

合成１７ｍｅｒについて、新しいマトリックスにおける平均付加物形成スコアは樹脂処理した標準マトリックスに比べて１３％低く（表２Ａ）、合成２８ｍｅｒについては、新しいマトリックスにおける平均付加物形成スコアは２９％低かった（表３Ａ）。

プライマー伸長サンプル
ＲｈＤおよびＡＭＧ遺伝子における多型性に向けられた、検証されたＳｅｑｕｅｎｏｍ遺伝子型同定アッセイを用いて、付加的な実験を行なった。これらのアッセイはｉＰＬＥＸ（商標）アッセイおよびＭａｓｓＡＲＲＡＹ（登録商標）技術を用いて行なわれた（Ｊｕｒｉｎｋｅ，Ｃ．，Ｏｅｔｈ，Ｐ．，ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｏｏｍ，Ｄ．，ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ：ａ ｖｅｒｓａｔｉｌｅ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｈｉｇｈ−ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ＤＮＡ ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２６，１４７−１６４（２００４）；およびＯｅｔｈ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．，ｉＰＬＥＸ^ＴＭ Ａｓｓａｙ：Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ Ｐｌｅｘｉｎｇ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ａｎｄ Ｆｌｅｘｉｂｉｌｉｔｙ ｆｏｒ ＭａｓｓＡＲＲＡＹ（登録商標）Ｓｙｓｔｅｍ ｔｈｒｏｕｇｈ ｓｉｎｇｌｅ ｂａｓｅ ｐｒｉｍｅｒ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｗｉｔｈ ｍａｓｓ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒｓ．ＳＥＱＵＥＮＯＭ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏｔｅ（２００５）、どちらもこれにより引用により援用される）。簡単には、ＳＮＰを囲む標的領域が最初にＰＣＲによって増幅される。その後、ＰＣＲ産物にオリゴヌクレオチドプライマーをアニーリングし、４つのターミネーターヌクレオチドの混合物とＤＮＡポリメラーゼとを用いて、対立遺伝子特異的に単一ヌクレオチドだけ伸長させる。伸長産物を小型化したチップアレイに移し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法によって分析する。伸長産物の分子量を決定することによって、サンプル中に存在するＳＮＰ対立遺伝子の明確な同定が可能になる。質量シグナルのピーク面積比によって、所与のサンプル中の対立遺伝子の相対的存在量の推定が可能になる。

この実験においては、表１のマトリックス上にスポットされた７３１６ＤａのＡＭＧプライマー伸長産物に対して、（上述の合成オリゴヌクレオチド実験と比べて）２０％高いレーザーエネルギーを用いた。表４および表５が示すとおり、標準マトリックスに比べて、新しいマトリックス上に分配された伸長産物に対する平均付加物形成スコアは減少し（４０〜５０％の減少）、レーザーエネルギーの増加は付加物形成に負の影響を有さなかった。

より多量の分析物の存在下での新しいマトリックスの有効性をテストするために、表１のマトリックス上で、増量した（１０、１５および２０ｎｌ）７５２８ＤａのＡＭＧプライマー伸長産物を分析した。下の表６を参照。新しいマトリックスの平均付加物形成スコアは、１０ｎｌおよび１５ｎｌの分析物体積においてはより低くなっている；しかし、２０ｎｌにおいては両方のマトリックスに対して同じスコア（０．６）が観察された。

改善された質量スペクトル
付加物形成を低減して疑陽性コールを排除することの重要性は、ＲＨＤ−４−ｐｓｉ３−ｉ遺伝子型同定アッセイの結果を示す図３および図４に明瞭に示されている。７６２６Ｄａのピークは、標準マトリックスに対して報告されるような挿入（図３）ではなく、７５７１Ｄａの伸長産物に対する５５Ｄａ（ＮＨ_３＋Ｋ）付加物である。この付加物は新しいマトリックスにおいては明瞭に除去されている（図４）。

実施例３
マトリックスおよび分析物に対する添加剤
新しい、アスコルビン酸で変更したマトリックスを、分析物溶液（８２８９ＤａのＡＭＧプライマー伸長産物）に加えられたアスコルビン酸とも組合せてテストした。実施例１および実施例２の表２〜６にみられるとおり、アスコルビン酸を分析物に加えるか、または標準マトリックスと組合せることによって、アンモニアおよびナトリウム付加物が大きく低減した。下の表７を参照。標準マトリックスにおいてはアスコルビン酸処理分析物に対して４３％の減少があり、新しいマトリックス上に堆積されたアスコルビン酸処理分析物に対しては５７％の減少があった（未処理マトリックス上に分配された未処理分析物との比較）。

実施例４
安定性テスト
６ヵ月の期間にわたり、４つの安定性テストを行なって、時間によるアスコルビン酸の付加物低減特性を定めた。テストされたマトリックスの性能が時間経過によって減少することは示されなかった。その代わりに、アンモニアおよびアルカリ付加物に対して得られたＳＮＲおよび一定の付加物形成スコアから、アスコルビン酸と組合せた３−ＨＰＡおよびその添加剤ＤＡＣ、ＮＨ_４−オキサレートの安定性が確認された。

本明細書において参照される各特許、特許出願、出版物および文書の全体が引用により援用される。上述の特許、特許出願、出版物および文書の引用は、前述のいずれかが関連先行技術であることを承認するものではないし、これらの出版物および文書の内容または日付に関するいかなる承認も構成しない。

本発明の基本的な局面から逸脱することなく前述に修正が加えられてもよい。１つまたはそれ以上の特定の実施形態を参照しながら本発明をかなり詳細に説明したが、本出願に特定的に開示される実施形態に変更が加えられてもよく、これらの修正および改善は本発明の範囲および趣旨内にあることが当業者に認識されるであろう。

本明細書において例示的に記載される本発明は、本明細書に特定的に開示されていないあらゆる構成要素の不在下で好適に実施されてもよい。よって、たとえば本明細書における各実例において、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「から実質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」、および「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」という用語はいずれも、他の２つの用語のいずれかと入れ替えられてもよい。使用されている用語および表現は説明の用語として用いられているのであって限定の用語ではなく、こうした用語および表現の使用によって、示され記載される特徴のあらゆる同等物およびその部分が除外されることはなく、請求される本発明の範囲内でさまざまな修正が可能である。「ａ」または「ａｎ」という用語は、１つの構成要素または２つ以上の構成要素のいずれかを記載していることが文脈上明らかである場合を除き、その用語が修飾する構成要素の１つまたは複数を示すことができる（例、「装置（ａ ｄｅｖｉｃｅ）」は１つまたはそれ以上の装置を意味し得る）。本明細書で用いられる「約（ａｂｏｕｔ）」という用語は、基礎となるパラメータの１０％（すなわちプラスまたはマイナス１０％）以内の値を示し、一連の値の最初に使用される「約」という用語は各々の値を修飾する（すなわち、「約１、２および３」とは約１、約２および約３である）。たとえば、「約１００グラム」の重量は９０グラムから１１０グラムの重量を含み得る。よって、本発明は代表的な実施形態および任意の特徴によって特定的に開示されているが、本明細書に開示される概念の修正および変更形が当業者によって用いられてもよく、こうした修正および変更形は本発明の範囲内であると考えられることが理解されるべきである。

本発明の実施形態は以下の請求項に示される。

Claims (31)

1. 質量分析基体であって、
   スポットのアレイを含む支持体を含み、
   該スポットの一部または全ては、質量分析条件下で形成される付加物の量を低減させる量のアスコルビン酸またはその塩、互変異性体もしくは類似体を含む、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化（ＭＡＬＤＩ）質量分析法のためのマトリックスを含む、基体。
2. 各スポットは直径が２００マイクロメーターから１ミリメーターである、請求項１に記載の基体。
3. スポットの中心間距離が約２．２５ミリメートルである、請求項１または２に記載の基体。
4. スポットの中心間距離が約１．１２５ミリメートルである、請求項１または２に記載の基体。
5. 各スポットの厚さが１０マイクロメートルから１００マイクロメートルである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の基体。
6. 前記マトリックスがアスコルビン酸またはその塩、互変異性体もしくは類似体からなる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の基体。
7. 前記スポットの一部または全てが核酸分析物を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の基体。
8. 前記核酸がデオキシリボ核酸である、請求項７に記載の基体。
9. 前記核酸がリボ核酸である、請求項７に記載の基体。
10. 前記マトリックスが５ｍＭから５０ｍＭのアスコルビン酸またはその塩、互変異性体もしくは類似体を含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の基体。
11. 前記マトリックスが５ｍＭから５０ｍＭのアスコルビン酸を含む、請求項１０に記載の基体。
12. 前記マトリックスが３−ヒドロキシピコリン酸（３−ＨＰＡ）を含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の基体。
13. 前記マトリックスがクエン酸ジアンモニウム（ＤＡＣ）を含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の基体。
14. 前記支持体がビーズ、チップ、毛細管、プレート、膜、ウエハ、コーム、ピン、ピットを有するウエハ、ピットもしくはナノリットルウェルのアレイおよび実質的に平坦な表面からなる群より選択される、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の基体。
15. 前記支持体がシリコンウエハである、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の基体。
16. 前記支持体が、親水性位置を囲む疎水性領域を有する実質的に平坦な表面であり、該位置の一部または全てがスポットを含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の基体。
17. 前記アスコルビン酸の類似体が以下の式：
    
    に従うものであり、ここで：
    Ｒ^１およびＲ^２は独立にＯＨ、ハロゲン、Ｒ^３、ＯＲ^３、アジド、シアノ、ＣＨ_２Ｒ^３、ＣＨＲ^３Ｒ^４、ＳＲ^３、ＮＲ^３Ｒ^４であり；そして
    Ｒ^３およびＲ^４は独立にＨ、アルキル、アセチレンもしくはシアノ、または任意に置換されたアリール炭素環式環、アリール複素環、非アリール炭素環式環もしくは非アリール複素環である、請求項１〜１０および１２〜１６のいずれか１項に記載の基体。
18. 質量分析計および請求項１〜１７のいずれか１項に記載の質量分析基体を備える、質量分析システム。
19. 方法であって、
    （ａ）核酸と、アスコルビン酸またはその塩、互変異性体もしくは類似体を含む添加剤とを含む組成物を提供するステップと
    （ｂ）質量分析法によって該核酸を分析するステップと
    を包含し、ここで、質量分析条件下で形成される付加物が低減される、方法。
20. 前記添加剤がアスコルビン酸またはその塩、互変異性体もしくは類似体からなる、請求項１９に記載の方法。
21. 前記添加剤がアスコルビン酸からなる、請求項２０に記載の方法。
22. 前記添加剤がシュウ酸アンモニウムをさらに含む、請求項１９または２０のいずれか１項に記載の方法。
23. 前記核酸がデオキシリボ核酸である、請求項１９〜２２のいずれか１項に記載の方法。
24. 前記核酸がリボ核酸である、請求項１９〜２２のいずれか１項に記載の方法。
25. 前記質量分析法が、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析法、レーザー脱離質量分析法（ＬＤＭＳ）、エレクトロスプレー（ＥＳ）質量分析法、イオンサイクロトロン共鳴（ＩＣＲ）質量分析法、およびフーリエ変換質量分析法からなる群より選択される、請求項１９〜２４のいずれか１項に記載の方法。
26. 前記組成物がマトリックス支援レーザー脱離／イオン化（ＭＡＬＤＩ）質量分析法用のマトリックスを含む、請求項１９〜２５のいずれか１項に記載の方法。
27. 前記マトリックスが３−ヒドロキシピコリン酸（３−ＨＰＡ）を含む、請求項２６に記載の方法。
28. 前記マトリックスがクエン酸ジアンモニウム（ＤＡＣ）を含む、請求項２６に記載の方法。
29. 前記組成物が５ｍＭから５０ｍＭのアスコルビン酸またはその塩、互変異性体もしくは類似体を含む、請求項１９〜２８のいずれか１項に記載の方法。
30. 前記組成物が５ｍＭから５０ｍＭのアスコルビン酸を含む、請求項１９〜２８のいずれか１項に記載の方法。
31. 前記アスコルビン酸の類似体が以下の式：
    
    に従うものであり、ここで：
    Ｒ^１およびＲ^２は独立にＯＨ、ハロゲン、Ｒ^３、ＯＲ^３、アジド、シアノ、ＣＨ_２Ｒ^３、ＣＨＲ^３Ｒ^４、ＳＲ^３、ＮＲ^３Ｒ^４であり；そして
    Ｒ^３およびＲ^４は独立にＨ、アルキル、アセチレンもしくはシアノ、または任意に置換されたアリール炭素環式環、アリール複素環、非アリール炭素環式環もしくは非アリール複素環である、請求項１９、２０および２２〜２９のいずれか１項に記載の方法。