JP5963735B2

JP5963735B2 - マイクロｒｎａ分子

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Publication number: JP5963735B2
Application number: JP2013249347A
Authority: JP
Inventors: トゥシュルトーマス; ラゴス−クウィンターナマリアナ; レンデッケルヴィンフリート; マイアーユッタ; ラウフートラインハルト
Original assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Current assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Priority date: 2001-09-28
Filing date: 2013-12-02
Publication date: 2016-08-03
Anticipated expiration: 2022-09-27
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Description

本発明は、特に発生コントロールにおける生理学的調節メカニズムと関連している新規の小さい発現（マイクロ）RNA分子に関する。

セノラブディティスエレガンス（Caenorhabditis elegans）中で、ｌｉｎ−４及びｌｅｔ−７は、それぞれ（１、２）発生タイミングの鍵レギュレーターとして機能する（３−５）２２−及び２１−ヌクレオチドＲＮＡをコードする。これらの短いＲＮＡの外見は、発生の間に調節されるので、これらは"マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）"又は小さい一時的なＲＮＡ（ｓｔＲＮＡ）とも称される（６）。ｌｉｎ−４及びｌｅｔ−２１は、現在までに公知のｍｉＲＮＡである。

その中で２１−〜２３−ヌクレオチドＲＮＡが遺伝子発現の転写後レギュレーターとして機能する動物及び植物中には、２つの独特な経路が存在する。小さい干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）での配列特異的ｍＲＮＡデグラデーシヨンのメディエーターとして作用し（７−１１）、他方、ｍｉＲＮＡは、ｍＲＮＡ翻訳の介在配列特異的抑制により発生タイミングを調節する（３−５）。ｓｉＲＮＡ及びｍｉＲＮＡは、Ｄｉｃｅｒにより二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）前駆体（１２、１３、２９）、マルチドメインＲＮアーゼＩＩＩプロテインから切出され、従って類似サイズのＲＮＡ種を産生する。しかしながら、ｓｉＲＮＡは、二本鎖であると信じられており（８、１１、１２）、他方ｍｉＲＮＡは一本鎖である（６）。

ところで、多くのより短い、特に２１−及び２２−ｎｔ発現ＲＮＡ（マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）と称される）が無脊椎動物及び脊椎動物中に存在し、これらの新規ＲＮＡのいくつかは、ｌｅｔ−７ＲＮＡ（６）に類似して、高度に保存されてもいることを説明する。このことは、小さいＲＮＡにより介在される配列特異的転写後調節メカニズムが、以前に認識されたよりもより一般的であることを示している。

本発明は、
（ａ）第１表、第２表、第３表又は第４表に示されるヌクレオチド配列、
（ｂ）（ａ）の相補体であるヌクレオチド配列、
（ｃ）（ａ）又は（ｂ）の配列に対して少なくとも８０％、有利には少なくとも９０％及びより有利には少なくとも９９％のアイデンティティを有するヌクレオチド配列及び／又は
（ｄ）ストリンジェント条件下に、（ａ）、（ｂ）及び／又は（ｃ）の配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列
を有する単離された核酸分子に関する。

有利な１態様で本発明は、ｍｉＲＮＡ分子及びその類似体、ｍｉＲＮＡ前駆体分子及びｍｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡ前駆体をコードするＤＮＡ分子に関する。

配列（ａ）又は（ｂ）に対する配列（ｃ）のアイデンティティは、少なくとも９０％、より有利には少なくとも９５％であるのが有利である。アイデンティティ（％）の測定は、次のように実施することができる：
Ｉ＝ｎ：Ｌ
［ここで、Ｉはアイデンティティ（％）であり、ｎは所定の配列と第１表、第２表、第３表又は第４表に示される比較配列との間の同じヌクレオチドの数であり、Ｌは比較配列の長さである］。第１、２、３及び４表に描かれているようなヌクレオチドＡ、Ｃ、Ｇ及びＵは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド及び／又は他のヌクレオチド類似体、即ち合成の非天然由来のヌクレオチド類似体を意味することができる。更に、ヌクレオ塩基は、相補的核酸配列への類似Ｈ−結合を形成することのできる相応するヌクレオ塩基により置換されることができ、例えば、ＵはＴで置換されていてよい。

更に、本発明は、ストリンジェント条件下に、第１表、第２表、第３表又は第４表に示されるヌクレオチド配列、その相補的配列又は高度に同じ配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列を包含する。ストリンジェントなハイブリダイゼーシヨン条件は、１×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳ中、４５℃での、有利には４８℃及び更に有利には５０℃での１時間、特に０．２×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳ中での１時間の洗浄からなる。

本発明の単離された核酸分子は、有利に１８〜１００ヌクレオチド、より有利には１８〜８０ヌクレオチドの長さを有する。成熟ｍｉＲＮＡは、通常１９〜２４ヌクレオチド、特に２１、２２又は２３ヌクレオチドの長さを有することに注目すべきである。しかしながら、これらのｍｉＲＮＡは、通常は５０〜９０ヌクレオチド、特に６０〜８０ヌクレオチドの長さを有する前駆体としても提供されうる。この前駆体は、＞１００ヌクレオチドの長さを有してよい一次転写産物のプロセッシングにより製造することができることに注目すべきである。

これらの核酸分子は、一本鎖又は二本鎖の形で存在することができる。このｍｉＲＮＡ自体は、通常一本鎖分子であるが、ｍｉ−前駆体は、通常は、二本鎖部分、例えばステム−及びループ−構造を形成することのできる、少なくとも部分的に自己相補的な分子である。ＤＮＡ分子は、ｍｉＲＮＡ及びｍｉＲＮＡ前駆体分子をコードする。核酸は、ＲＮＡ、ＤＮＡ又は核酸類似分子、例えば糖−、骨格−修飾リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドから選択することができる。しかしながら、他の核酸類似体、例えばペプチド核酸（ＰＮＡ）又はロックド核酸（ＬＮＡ）も好適であることに注目すべきである。

本発明の１態様において、核酸分子は、少なくとも１個の修飾ヌクレオチド類似体を含有するＲＮＡ−またはＤＮＡ分子であり、即ち天然由来のリボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドが非天然由来のヌクレオチドで置換されている。この修飾ヌクレオチド類似体は、例えば、核酸分子の５’−末端及び／又は３’−末端に局在することができる。

有利なヌクレオチド類似体は、糖−又は骨格−修飾リボヌクレオチドから選択される。しかしながら、ヌクレオ塩基修飾リボヌクレオチド、即ち天然由来のヌクレオ塩基の代わりに非天然由来のヌクレオ塩基を含有するリボヌクレオチド、例えば５−位で修飾されたウリジン又はシチジン、例えば５−（２−アミノ）プロピルウリジン、５−ブロモウリジン；８−位で修飾されたアデノシン及びグアノシン、例えば８−ブロモ−グアノシン；デアザヌクレオチド、例えば７−デアザアデノシン；Ｏ−及びＮ−アルキル化ヌクレオチド、例えばＮ６−メチルアデノシンが好適であることに注目すべきである。好ましい糖−修飾リボヌクレオチド中で、２’−ＯＨ−基は、Ｈ、ＯＲ、Ｒ、ハロ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ₂、ＮＨＲ、ＮＲ₂又はＣＮから選択された基で置換されており、ここで、ＲはＣ₁〜Ｃ₆−アルキル、アルケニル又はアルキニルであり、ハロはＦ、Ｃｌ、Ｂｒ又はＩである。好ましい骨格−修飾リボヌクレオチド中では、隣接リボヌクレオチドに連結しているホスホエステル基が、例えばホスホチオエート基の修飾基で置換されている。前記の修飾は組み合わさすことができることに注目すべきである。

本発明の核酸分子は、化学的合成法で又は組み換え法で、例えば合成ＤＮＡ−テンプレートから又は組み換え生物から単離されたＤＮＡ−プラスミドからの酵素的転写によって得ることができる。転写のためには、典型的なファージＲＮＡ−ポリメラーゼ、例えばＴ７、Ｔ３又はＳＰ６ＲＮＡ−ポリメラーゼが使用される。

本発明は、発現コントロール配列にオペラティブに連結された組み換え核酸を有する組み換え発現ベクターにも関し、ここで、発現、即ち転写及び場合による更なるプロセッシングは、結果として前記のようなｍｉＲＮＡ−分子又はｍｉＲＮＡ前駆体分子を生じる。このベクターは、有利にはＤＮＡ−ベクター、例えばウイルスベクター又はプラスミド、特に真核細胞、より特別には哺乳動物細胞中の核酸発現のために好適な発現ベクターである。前記のベクター中に含有される組み換え核酸は、ｍｉＲＮＡ−分子それ自体の転写をする配列、その前駆体又は一次転写産物であってよく、これらは、更にプロセッシングされてｍｉＲＮＡ−分子を生じることができる。

更に、本発明は、特許請求の範囲に記載の核酸分子の診断的又は治療的適用に関する。例えば、ｍｉＲＮＡは、特定の細胞タイプ又は組織タイプ又はｍｉＲＮＡ−関連病原性疾病（これはｍｉＲＮＡ−分子又はｍｉＲＮＡ−分子パターンのデイファレンシャル発現によりキャラクテライズされる）を特定しかつ分類するために、生物学的試料中、例えば組織部分中で検出することができる。更に、細胞の発生段階は、一時的に発現されるｍｉＲＮＡ−分子を測定することにより分類することができる。

更に、特許請求されている核酸分子は治療的適用のために好適である。例えば、この核酸分子は、発生プロセス及び発生機能障害、例えば癌に結びついている疾病のモジュレーター又はターゲットとして使用することができる。例えば、ｍｉＲ−１５及びｍｉＲ−１６は、おそらく腫瘍−サプレッサーとして機能し、従って、これらＲＮＡ又はその類似体又は前駆体の腫瘍細胞への発現又は放出は、特に白血病、例えばＢ−細胞慢性リンパ球性白血病（Ｂ−ＣＬＬ）に対して治療効果を提供することができる。更に、ｍｉＲ−１０は、Ｈｏｘ遺伝子、特にＨｏｘ３及びＨｏｘ４（又はショウジョウバエ中のＳｃｒ及びＤｆｔ）の翻訳の可能なレギュレーターである。

一般に、特許請求の範囲に記載の核酸分子は、記載の核酸に対して少なくとも部分的に相補的である遺伝子の発現のモジュレーターとして使用することができる。更に、ｍｉＲＮＡ分子は治療的スクリーニング法のターゲットとして作用することができ、例えば、ｍｉＲＮＡ分子の抑制又は活性化は、細胞分化プロセス、例えばアポトーシスを変調することができる。

更に、現存するｍｉＲＮＡ分子は、そのターゲット−特異性を変調するために、配列−修飾ｍｉＲＮＡ分子、例えば癌遺伝子、多剤耐性遺伝子又は他の治療ターゲット遺伝子の製造のための出発物質として使用することができる。新規に設計されたｍｉＲＮＡ分子は、有利に、例えば第１、２、３及び４表に記載のような出発ｍｉＲＮＡに対して少なくとも８０％のアイデンティティを有する。更に、ｍｉＲＮＡ分子は、それらが対称的にプロセッシングされ、かつ再び治療に関連したターゲットに向けられている二本鎖ｓｉＲＮＡとして発生されるように修飾することができる。

更に、ｍｉＲＮＡ分子は、組織再プログラミング法のために使用することができ、例えば、分化されたセルラインは、ｍｉＲＮＡ分子の発現により、異なる細胞タイプ又は幹細胞に形質転換できた。

診断又は治療的適用のために、特許請求の範囲に記載のＲＮＡ分子は、薬剤学的組成物として提供されるのが有利である。この薬剤学的組成物は、活性薬剤として少なくとも１種の前記のような核酸分子及び場合による薬剤学的に認容しうる賦形剤を含有する。

この薬剤学的組成物の投薬は、公知方法で実施することができ、ここで、核酸が所望のターゲット細胞中にインビトロ又はインビボで導入される。

一般に使用される遺伝子導入法には、燐酸カルシウム、ＤＥＡＥ−デキストラン、電気泳動及びマイクロインジェクシヨン及びウイルス法が包含される「３０、３１、３２、３３、３４］。細胞中へＤＮＡを導入するためのこの公知技術への最近の追加は、カチオン性リポソームの使用である［３５］。

市場で入手可能なカチオン性脂質処方物は、例えばＴｆｘ５０（Promega)又はリポフェクタミン２０００（Life Technologies)である。

この組成物は、溶液、例えば、注射液、クリーム、軟膏、錠剤、懸濁液又は類似物の形であってよい。この組成物は、任意の適当な方法で、例えば注射、経口、局所、経鼻、直腸適用等により投薬することができる。賦形剤は任意の好適な薬剤学的賦形剤であってよい。ターゲット細胞へ入るためのＲＮＡ分子の効果を増加することのできる賦形剤が有利に使用される。このような賦形剤の好適な例は、リポソーム、特にカチオン性リポソームである。

更に、本発明は、真核生物、特に脊椎動物及び特に哺乳動物、例えばヒト又はマウス中の新規マイクロＲＮＡ−分子及びその前駆体を同定する方法に関する。この方法は次のことからなる：サイズ−分別されたＲＮＡ−集団の末端への５’−及び３’−アダプター分子のライゲーション、前記アダプターライゲートされたＲＮＡ−集団の逆翻訳及び前記の逆翻訳されたＲＮＡ−分子の、例えば増幅、コンカテマー化、クローニング及びシークエンシングによるキャラクテライゼーション。

前記のような方法は既に文献に記載されている［８］が、ｓｉＲＮＡ分子の同定のためである。意外にも、今般、この方法は、本発明の請求の範囲に記載のようなｍｉＲＮＡ分子又はその前駆体の同定のためにも好適であることが判明した。

更に、３’−ＯＨ基の誘導のための３’−アダプターとしては、４−ヒドロキシメチルベンジルだけでなく他のタイプの誘導化基、例えばアルキル、アルキルアミノ、エチレングリコール又は３’−デオキシ基も好適であることに注目すべきである。

更に、本発明を、次の図面及び実施例につき、より詳細に説明する。

図１Ａ．キイロショウジョウバエ（D.melanogaster）ｍｉＲＮＡの発現。キイロショウジョウバエの段階集団から単離された全てのＲＮＡのノーザンブロットを、指示ｍｉＲＮＡのプローブとした。このブロット上に７６−ｎｔｖａｌ−ｔＲＮＡの位置も指示されている。５ＳｒＲＮＡは、ローデイングコントロールとしての役目をする。Ｅは胚；Ｌは幼虫段階；Ｐは蛹；Ａは成虫；Ｓ２はシュナイダー−２細胞。Ｓ２細胞はポリクローナルであり、胚組織の未知のサブセットから誘導されており、培養液中に保持されている間のオリジンのそれらの組織の失われたいくつかの特徴も有しうることが指摘されるべきである。ｍｉＲ−３〜ｍｉＲ−６ＲＮＡは、Ｓ２細胞中に検出不可能であった（データが示されていない）。ｍｉＲ−１４はノーザンブロッティングで検出されず、おそらく非常に弱く発現されており、これはそのクローニング頻度と一致した。類似のｍｉＲＮＡ配列は、プローブの潜在的クロス−ハイブリダイゼーシヨンの故に、ノーザンブロッティングで区別するのが困難である。図１Ｂ．脊椎動物ｍｉＲＮＡの発現。ＨｅＬａ細胞、マウス腎臓、ゼブラフィッシュ成魚、カエル卵巣及びＳ２細胞から単離された全てのＲＮＡのノーザンブロットを、指示ｍｉＲＮＡのプローブとした。７６−ｎｔｖａｌ−ｔＲＮＡの位置もこのブロット上に指示されている。指示された種からの全てのＲＮＡの集団からの５ＳｒＲＮＡも示されている。ｍｉＲ−１８、ｍｉＲ−１９ａ、ｍｉＲ−３０及びｍｉＲ−３１のプロービングのために使用されたゲルは、他のゲルのようにはランしなかった（ｔＲＮＡマーカー位置参照）。ノーザンブロッティングで、ｍｉＲ−３２及びｍｉＲ−３３は検出されておらず、これはそれらの低いクローニング頻度に一致していた。ノーザンプローブとして使用されたオリゴデオキシヌクレオチドは、次の通りであった：

図２．ｍｉＲＮＡ遺伝子クラスターのゲノム構成。前駆体構造がボックスとして指示されており、この前駆体中のｍｉＲＮＡの位置が灰色で示されている；染色体位置も右に指示されている。（Ａ）キイロショウジョウバエｍｉＲＮＡ遺伝子クラスター。（Ｂ）ヒトｍｉＲＮＡ遺伝子クラスター。ｌｅｔ−７ａ−１及びｌｅｔ−７ｆ−１のクラスターは、染色体９及び１７上でｌｅｔ−７ｄのコピーから２６５００ｎｔだけ離れている。染色体２２上で９３８ｎｔだけ離れているｌｅｔ−７ａ−３及びｌｅｔ−７ｂのクラスターは図示されていない。図３．キイロショウジョウバエｍｉＲＮＡの予言前駆体構造。ＲＮＡ二次構造予言をｍフォールドバージョン３．１を用いて行い［２８］、らせんセグメント中でのＧ／Ｕゆらぎ塩基対を適応させるために手で精製した。ｍｉＲＮＡ配列に下線が付されている。ステムループ構造の実際のサイズは実験的には未知であり、描写されているより僅かに短いか又は長いかもしれない。マルチコピーｍｉＲＮＡ及びそれらの相応する前駆体構造も示されている。図４．ヒトｍｉＲＮＡの予言前駆体構造。説明に関しては図３を参照。図５．新規マウスｍｉＲＮＡの発現。新規マウスｍｉＲＮＡのノーザンブロット分析。種々のマウス組織からの全てのＲＮＡをブロッテイングし、指示ｍｉＲＮＡに対して相補的な５’−放射能ラベルされたオリゴデオキシヌクレオチドを用いて試験した。ゲル上の全てのＲＮＡのイコールローデイングは、形質転換の前の臭化エチジウムステイニングにより実証され；ｔＲＮＡを表しているバンドが示されている。フォールドバック前駆体が大文字Ｌで示されている。マウス脳を中脳ｍｂ、皮質ｃｘ、小脳ｃｂ中まで解剖した。この脳の残分ｒｂも使用した。他の組織は、心臓ｈｔ、肺ｌｇ、肝臓ｌｖ、結腸ｃｏ、小腸ｓｉ、膵臓ｐｃ、脾臓ｓｐ、腎臓ｋｄ、骨格筋ｓｍ、胃ｓｔであり、Ｈは、ヒトＨｅＬａＳＳ３細胞である。ノーザンプローブとして使用されたオリゴデオキシヌクレオチドは次の通りであった：

図６．ｌｉｎ−４ｓｔＲＮＡの可能なオーソログ。（Ａ）マウスｍｉＲ−１２５ａ及びｍｉＲ−１２５ｂ及びキイロショウジョウバエｍｉＲ−１２５と一緒のＣ．エレガンスｌｉｎ−４ｓｔＲＮＡの配列アラインメント。差異は、灰色ボックスで強調されている。（Ｂ）キイロショウジョウバエの段階集団から単離された全てのＲＮＡのノーザンブロットをｍｉＲ−１２５に関して試験した。Ｅは胚；Ｌは幼虫段階；Ｐは蛹；Ａは成虫；Ｓ２はシュナイダー−２細胞。図７．ｍｉＲＮＡｓの予言前駆体構造、配列アクセッシヨン番号及び相同性情報。ＲＮＡ二次構造予言は、ｍフォールドバージョン３．１を用いて行われ、らせんセグメント中でのＧ／Ｕゆらぎ塩基対に適応させるために手で精製された。非対称的に膨らんだヌクレオチドが適応されるべき場合には、二次構造表示中にダッシュを挿入した。切出されるｍｉＲＮＡ配列には下線が付されている。ステムループ構造の実際のサイズは実験的には知られておらず、表示されているより僅かに短いか又は長いかもしれない。マルチコピーｍｉＲＮＡ及びそれらの相応する前駆体構造も指示されている。マウス前駆体がなおこのデータベースに寄託されていない場合には、ヒトオーソログが指示されている。ショウジョウバエ又はヒト配列に相応するｍｉＲＮＡが包含されている。この表中には、公表されているＣ．エレガンスｍｉＲＮＡ［３６、３７］も包含されている。新しいＨｅＬａ細胞ｍｉＲＮＡの最新のセットも指示されている［４６］。データベースで、１つの生物に関していくつかのＥＳＴが想起された場合は、異なる前駆体配列を有するもののみが挙げられている。他の種中に見出されるｍｉＲＮＡ相同体が指示されている。染色体位置及び配列アクセッション番号及びｍｉＲＮＡ遺伝子のクラスターが指示されている。クローニングされたｍｉＲＮＡからの配列を、マウス及びヒトに関しては遺伝子バンク（トレースデータを包含）で、かつフグルブリペス（Fugu rubripes）及びダニオレリオ（Danio rerio）に関しては、それぞれｗｗｗ．ｊｇｉ．ｄｏｅ．ｇｏｖ及びｗｗｗ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋでサーチした。

実施例１：キイロショウジョウバエ及びヒトからのマイクロＲＮＡ
本発明者は、以前に、キイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）胚リゼート中での長いｄｓＲＮＡのプロセッシングの後のｓｉＲＮＡを単離するために、方向性クローニング法を開発した（８）。簡単にいえば、５’及び３’アダプター分子をサイズ−分別されたＲＮＡ集団の末端にライゲートさせ、引き続き、逆転写、ＰＣＲ増幅、コンカテマー化、クローニング及びシークエンシングを行った。元来ｓｉＲＮＡを単離するために意図されたこの方法は、１４の新規２０−〜２３−ｎｔの短かいＲＮＡ（これらはキイロショウジョウバエゲノムでコードされ、かつ０〜２ｈ胚中に発現されている）の同時同定をもたらした（第１表）。この方法は、ＨｅＬａ細胞全ＲＮＡからの類似サイズ範囲内のクローンＲＮＡに適応され、これは１９の新規ヒトｓｔＲＮＡの同定をもたらし（第２表）、従って、更に、潜在的調節役割を有する小さいＲＮＡの大クラスの存在の証拠を提供していた。それらの小さいサイズに従って、これらの新規ＲＮＡをマイクロＲＮＡ又はｍｉＲＮＡと称する。これらのｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−１〜ｍｉＲ−３３と略記され、この遺伝子をコードしているｍｉＲＮＡは、ｍｉｒ−１〜ｍｉｒ−３３と名付けられている。高い相同性のｍｉＲＮＡが、小文字の付加、引き続くダッシュ及びｍｉｒ遺伝子のマルチプルゲノミックコピーを指名する番号により分類されている。

クローニングされた内因性の短かいＲＮＡの発現及びサイズもノーザンブロッティングにより検査された（図１、第１及び２表）。酸性グアニジニウムチオシアネート−フェノール−クロロフォルム抽出により全てのＲＮＡ単離を実施した［４５］。全てのＲＮＡを１５％変性ポリアクリルアミドゲル上に溶かし、ハイボンド−Ｎ＋メンブラン（Amersham Pharmacia Biotech）上に移行させ、かつハイブリダイゼーシヨン及び洗浄工程を５０℃で行ったことを除き、［１］に記載のようにノーザン分析を行った。ノーザンプローブとして使用されたオリゴデオキシヌクレオチドは、５’−３２Ｐ−リン酸化されており、ｍｉＲＮＡ配列に対して相補的であり、かつ長さが２０〜２５ｎｔであった。

トランスファーの前に、ポリアクリルアミドゲルのエチジウムステイニングにより、５ＳｒＲＮＡを検出した。ブロットを、０．１％水性ドデシル硫酸ナトリウム／０．１×ＳＳＣ（１５ｍＭ塩化ナトリウム、１．５ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）中での１０分間の沸騰によりストリッピングし、２１−ｎｔシグナルが検出のためには弱すぎるようになるまで４回まで再プローブ化させた。最後に、ブロットをサイズマーカーとしてのｖａｌ−ｔＲＮＡのプローブとした。

キイロショウジョウバエＲＮＡの分析のために、全てのＲＮＡを、異なる発生段階から、同様に培養シュナイダーー２（Ｓ２）細胞（これは、元来２０−２４ｈキイロショウジョウバエ胚から誘導された［１５］）から製造した（図１、第１表）。ｍｉＲ−３〜ｍｉＲ−７は、胚形成の間にのみ発現されており、後期発生段階には発現されていない。ｍｉＲ−１、ｍｉＲ−２及びｍｉＲ−８〜ｍｉＲ−１３の一時的発現は、ほとんど制限されなかった。これらのｍｉＲＮＡは、すべての発生段階で観察されたが、発現レベルでの著しい変異が屡々観察された。興味深いことに、ｍｉＲ−１、ｍｉＲ−３〜ＭｉＲ−６及びＭｉＲ−８〜ｍｉＲ−１１は、元来２０〜２４ｈキイロショウジョウバエ胚から誘導された培養シュナイダー−２（Ｓ２）細胞からは完全に不在であったが、ｍｉＲ−２、ｍｉＲ−７、ｍｉＲ−１２及びｍｉＲ−１３は、Ｓ２細胞中に存在したので、細胞タイプ−特異的ｍｉＲＮＡ発現を示している。ｍｉＲ−１、ｍｉＲ−８及びｍｉＲ−１２発現パターンは、Ｃ．エレガンス中のｌｉｎ−４ｓｔＲＮＡのそれに類似しており、それらの発現は、幼虫中で強くアップレギュレートされており、成虫期まで保持されている［１６］。ｍｉＲ−９及びｍｉＲ−１１は、全ての段階で存在するが、生殖細胞からの母系寄与又は１セックス中のみでの発現を反映することができる成虫中では著しく減少されている。

ｍｉｒ−３〜ｍｉｒ−６遺伝子はクラスター化されており（図２Ａ）、ｍｉｒ−６が、ｍｉＲＮＡ配列それ自体中ではなく、ｍｉｒ−６前駆体配列中に、僅かな変異を有するトリプル反復として存在している。ｍｉＲ−３〜ｍｉＲ−６の発現プロフィルは、高度に類似しており（第１表）、これは、単一胚−特異性前駆体転写産物が、異なるｍｉＲＮＡの元でありうるか、又は同じエンハンサーが、ｍｉＲＮＡ−特異性プロモーターを調節することを示している。いくつかの他のハエｍｉＲＮＡが、遺伝子クラスター中にも見出されている（図２Ａ）。

ＨｅＬａ細胞ｍｉＲ−５〜ｍｉＲ−３３の発現を、マウス腎臓、ゼブラフィッシュ成魚、アフリカツメガエル(Xenopus laevis）卵巣及びキイロショウジョウバエＳ２細胞から製造された全ＲＮＡに加えて、ＨｅＬａ細胞全ＲＮＡを用いるノーザンブロッティングにより検査した（図１Ｂ、第２表）。ｍｉＲ−15及びｍｉＲ−１６が、遺伝子クラスター中でコードされており（図２Ｂ）、マウス腎臓、フィッシュ中で、かつ非常に弱くカエル卵巣中で検出されており、これは、卵母細胞中よりも体性卵巣組織中でのｍｉＲＮＡ発現からの結果でありうる。ｍｉｒ−１７〜ｍｉｒ−２０もクラスター化されており（図２Ｂ）、ＨｅＬａ細胞及びフィッシュ中に発現されているが、マウス腎臓及びカエル卵巣中では検出不能であり（図１、第２表）、従って組織−特異的ｍｉＲＮＡ発現の有望なケースを表している。

この研究で同定された脊椎動物及び無脊椎動物ｍｉＲＮＡの大部分は、配列で関係付けられていないが、高度に保存されたｌｅｔ−７ＲＮＡ［６］と類似する僅かな例外が存在する。キイロショウジョウバエｍｉＲＮＡの配列分析は、無脊椎動物と脊椎動物との間の配列保存の４つのこのような例を示していた。ｍｉＲ−１同族体（homolog）が、Ｃ．エレガンス、Ｃ．ビリッグサエ（briggsae）及びヒトのゲノム中でコードされており、ゼブラフィッシュ、マウス、牛及びヒトからのｃＤＮＡ中に見出されている。ｍｉｒ−１の発現は、ゼブラフィッシュ成魚及びＣ．エレガンスからの全ＲＮＡ中でのノーザンブロッティングにより検出されたが、ＨｅＬａ細胞又はマウス腎臓からの全ＲＮＡ中には検出されなかった（第２表及び示されていないデータ）。興味深いことに、ｍｉｒ−１及びｌｅｔ−７が共に成熟ハエ中に発現されており（図１．Ａ）［６］、かつ双方はＳ２細胞中には検出されておらず、ｍｉＲ−１は、ｌｅｔ−７とは異なり、ＨｅＬａ細胞中に検出不能である。このことは、ｍｉＲＮＡの組織−特異的発現の他のケースを表しており、ｍｉＲＮＡが発生タイミングにおいてだけでなく、組織特異化時においても調節役割を演じることができることを示している。ｍｉＲ−７同族体がマウス及びヒトゲノム及び発現配列ｔａｇ配列（ＥＳＴｓ）のデータベースサーチによって見出された。２つの哺乳動物ｍｉＲ−７変異体がマウス及びヒトでの配列分析により予言されており、ＨｅＬａ細胞及びフィッシュ中でのノーザンブロッティングで検出されたが、マウス腎臓中では検出されなかった（第２表）。同様に、データベースサーチにより、マウス及びヒトｍｉＲ−９及びｍｉＲ−１０同族体を同定したが、マウス腎臓中ではｍｉｒ−１０発現を検出しただけである。

既にマルチプル配列突然変異を獲得している進化に関連するｍｉＲＮＡの同定は、標準的なバイオ情報サーによっては不可能であった。キイロショウジョウバエｍｉＲＮＡとヒトｍｉＲＮＡとの直接比較は、キイロショウジョウバエｍｉＲ−６とＨｅＬａｍｉＲ−２７との間に分配された１１ｎｔ−セグメントを同定したが、更なる関連性を検出しなかった。大抵のｍｉＲＮＡは、単一ターゲット上に作用するだけであり、従って共変による迅速評価を可能とすること、及び高度に保存されたｍｉＲＮＡは、１より多いターゲット配列上に作用し、従って共変による進化による移動の低い可能性を有することが推測できる［６］。二者択一的解釈は、キイロショウジョウバエ及びヒトからのｍｉＲＮＡのセットはかなり不完全であり、かつ失われた進化リンクを提供する多くのｍｉＲＮＡがなお発見されるべきことである。

ｌｉｎ−４及びｌｅｔ−７ｓｔＲＮＡは、ほぼ３０塩基対のステムループ構造を有する長い転写物から切出されると予言されていた［１、６］。新たに同定されたｍｉＲＮＡのデータベースサーチは、全てのｍｉＲＮＡが安定なステム−ループ構造を形成する能力を有する配列によりフランクされていることを示していた（図３及び４）。多くの場合に、ノーザンブロッティングにより、予言されたほぼ７０−ｎｔの前駆体を検出することができた（図１）。

いくつかのｍｉＲＮＡ前駆体配列も哺乳動物ｃＤＮＡ（ＥＳＴ）データベース［２７］で同定されており、７０−ｎｔステム−ループ前駆体より長い一次転写産物も存在することを示していた。本発明者は、新たに同定されたｍｉＲＮＡに対して相補的な２２ｎｔ−ＲＮＡをクローニングしなかったし、ｍｉＲＮＡとその相補的ストランドとの間の細胞プロセッシング機械的区別をいかにして行うかはなお未知である。前駆体ステム−ループ構造の比較分析は、塩基対合ｍｉＲＮＡセグメントに隣接するループがｍｉＲＮＡ配列のどちら側上にも局在することができることを示しており（図３及び４）、ステム−終結ループの５’又は３’位置はｍｉＲＮＡ切出しのデテルミナントではないことを暗示している。前駆体ステムの構造、長さ又は安定性は、この塩基対合構造が屡々不完全であり、低い安定性の非−ワトソン−クリック塩基対、例えばＧ／Ａ、Ｕ／Ｕ、Ｃ／Ｕ、Ａ／Ａ及びＧ／Ｕゆらぎにより散在されているので、重要なデテルミナントでありそうもない。従って、配列−特異的認識プロセスは、おそらくアルゴナウテ（Argonaute）（ｒｄｅ−１／ａｇｏ１／ｐｉｗｉ）蛋白質ファミリーのメンバーにより介在されるｍｉＲＮＡ切出しのための有望なデテルミナントである。最近、このファミリーの２メンバー、ａｌｇ−１及びａｌｇ−２は、Ｃ．エレガンス中のｓｔＲＮＡプロセッシングのために重要であることが明らかにされた［１３］。このアルゴナウテ蛋白質ファミリーのメンバーは、ＲＮＡｉ及びＰＴＧＳ中にも包含されている。キイロショウジョウバエ中でこれらは、アルゴナウテ２、ｓｉＲＮＡ−エンドヌクレアーゼ複合体の１成分（ＲＩＳＣ）［１７］及びその関連オーバージーン（aubergine）（これは反復遺伝子のサイレンシングのために重要である）［１８］を包含する。他の種において、これらは、ｒｄｅ−１、アルゴナウテ１及びｑｄｅ−２を、それぞれＣ．エレガンス［１９］、シロイロナズナ（Arabidopsis thaliana）［２０］及びアカパンカビ（Neurospora crassa）［２１］中に包含する。従って、このアルゴナウテ蛋白質ファミリーは、RNアーゼIII Ｄｉｃｅｒ［１２、１３］と並んで、ＲＮＡｉとｍｉＲＮＡ突然変異との間の他の進化リンクを表す。

進んだゲノムプロジェクトにもかかわらず、遺伝子をコードする機能的ＲＮＡのコンピュータ−補助検査は、問題が残っている［２２］。発現された短い機能的ＲＮＡのクローニングは、ＥＳＴアプローチ（ＲＮｏｍｉｃｓ）と同様に、有力な選択的で、かつおそらくこのような新規遺伝子産生物の同定のための最も有効な方法である「２３−２６］。機能的ＲＮＡの数は、すこぶる過小評価されており、新規の機能的ＲＮＡクローニング方法論の開発の故に急速に成長することが期待されている。

将来への挑戦は、バイオ情報学並びに遺伝子学を用いることによりこれら新規ｍｉＲＮＡの機能及び可能なターゲットを定義し、かつ既に同定された及びなお同定されていないｍｉＲＮＡの時間−及び組織−特異的分布の完全なカタログを確立することである。ｌｉｎ−４及びｌｅｔ−７ｓｔＲＮＡは、その３’未翻訳領域がｓｔＲＮＡに対して相補性の部位を有するｍｉＲＮＡによりコードされた蛋白質の発現を負に調節する［３−５］。

従って、１９−〜２３−ヌクレオチドマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）をコードする一連の３３の新規遺伝子が、ハエ胚及びヒト細胞からクローニングされている。これらｍｉＲＮＡのいくつかは、脊椎動物と無脊椎動物との間で高度に保存されており、発生学的に又は組織−特異的に発現されている。キャラクテライズされたヒトｍｉＲＮＡの２つは、Ｂ−細胞慢性リンパ球白血病で腫瘍サプレッサーとして機能することができる。ｍｉＲＮＡは、既に記載の２１−及び２２−ｎｔＲＮＡの小クラス（ｌｉｎ−４及びｌｅｔ−７ＲＮＡ）、いわゆる小さい一時的なＲＮＡ（ｓｔＲＮＡ）と関連しており、Ｃ．エレガンス及び他の種中での発生タイミングを調節する。ｓｔＲＮＡと同様に、ｍｉＲＮＡは、それらの３’−未翻訳領域中に存在している部分的に相補的な部位への結合により特異的ターゲットｍＲＮＡの翻訳を調節すると考えられている。

ｍｉＲＮＡ発現の脱調節は、ヒト疾病の原因となり得、ｍｉＲＮＡの発現の検出は、診断学として有用になり得る。特別なｍｉＲＮＡを欠いている細胞又は組織中でのｍｉＲＮＡの調節された発現は、組織工学のために有用であり、かつｍｉＲＮＡの放出又はトランスジェニック発現は、治療的介在のために有用でありうる。ｍｉＲＮＡは、有用な薬剤ターゲットそれ自体をも意味することができる。最後に、ｍｉＲＮＡ及びそれらの前駆体配列は、治療学的に重要なターゲットを認識するために巧みに計画することができる。

実施例２：マウスからのｍｉＲＮＡ
哺乳動物中のｍｉＲＮＡの分布及び機能へのより詳細な洞察を得るために、成熟マウスでのｍｉＲＮＡの組織−特異的分布を調査した。通常はノーザンブロット分析で検出されない低量ｍｉＲＮＡはクローン的に同定されるので、特異組織からのｍｉＲＮＡのクローニングを、全体の生物−ベースクローニングに渡って実施した。２１−ｎｔＲＮＡを検出するためのin situ ハイブリダイゼーシヨン法は、未だ開発されてもいない。従って、１８．５週齢ＢＬ６マウスから単離された全ＲＮＡから１９−〜２５−ヌクレオチドＲＮＡをクローニングし、かつシークエンシングした。ｍｉＲＮＡのクローニングを次のように実施した：全ＲＮＡの０．２〜１ｍｇを１５％変性ポリアクリルアミドゲル上で分離し、１９−〜２５−ｎｔサイズのＲＮＡを回収した。５’−リン酸化された３’−アダプターオリゴヌクレオチド（５’−ｐＵＵＵａａｃｃｇｃｇａａｔｔｃｃａｇｘ：大文字はRNA；小文字はDNA；ｐはホスフェート；ｘは３’−アミノ−モディファイアーＣ−７、ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ，Ａｓｈｌａｎｄ，Ｍａ，ＵＳＡ，Ｃａｔ．Ｎｏ．ＮＳＳ−１００４；ＳＥＱＩＤＮＯ：５４）及び５’−アダプターオリゴヌクレオチド（５’−ａｃｇｇａａｔｔｃｃｔｃａｃｔＡＡＡ：大文字はＲＮＡ；小文字はＤＮＡ；ＳＥＱＩＤＮＯ：５５）を短かいＲＮＡにライゲートさせた。ＲＴ／ＰＣＲを、３’−プライマー（５’−ＧＡＣＴＡＧＣＴＧＧＡＡＴＴＣＧＣＧＧＴＴＡＡＡ；ＳＥＱＩＤＮＯ：５６）及び５’−プライマー（５’−ＣＡＧＣＣＡＡＣＧＧＡＡＴＴＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡ；ＳＥＱＩＤＮＯ：５７）を用いて実施した。ＢａｎＩ制限部位を導入するために、プライマー対５’−ＣＡＧＣＣＡＡＣＡＧＧＣＡＣＣＧＡＡＴＴＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５７）及び５’−ＧＡＣＴＡＧＣＴＴＧＧＴＧＣＣＧＡＡＴＴＣＧＣＧＧＴＴＡＡＡ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５６）を用いて第２ＰＣＲを実施し、引き続きＢａｎＩ消化の後のコンカテマー化及びＴ４ＤＮＡライゲーションを行った。４００〜６００塩基対のコンカテマーを、１．５％アガロースゲルから切出し、バイオトラップ（Schleicher & Schuell）電気溶出（１×ＴＡＥバッファ）及びエタノール沈殿により回収した。引き続き、このコンカテマーの３’末端を、７２℃で、Ｔａｑポリメラーゼと一緒の１５分間インキュベーシヨンにより、充填した。この溶液を水で３倍に希釈し、直接、ｐＣＲ２．１ＴＯＰＯベクター中へのライゲーションのために使用した。クローンをＰＣＲでの挿入のためにスクリーニングし、３０〜５０試料をシークエンシングに供した。ＲＮＡが数匹のマウスの結合組織から製造されたので、多クローン中で複数回検出された微量配列変異は、ＲＴ／ＰＣＲ突然変異よりもむしろ多型を反映しているらしい。約２１−ｎｔのＲＮＡをコードするゲノム配列の同定のためにパブリックデータベースサ−チングを使用した。隣接上流又は下流フランキング配列を包含する２０〜３０塩基対フォールド−バック構造の発生が、ｍｉＲＮＡを指定するために用いられた［３６−３８］。

９種の異なるマウス組織を試験し、そのいくつかが高度に組織−特異的に発現される３４の新規ｍｉＲＮＡを同定した（第３表及び図５）。更に、異なるマウス組織から、かつヒトＳｏａｓ−２骨肉腫細胞からも３３の新しいｍｉＲＮＡを同定した（第４表）。ｍｉＲ−１は、以前に、ノーザン分析で成体心臓中に強く発現されるが、脳、肝臓、腎臓、肺又は結腸中には発現されないことが明らかにされた［３７］。ここで、本発明者は、ｍｉＲ−１が、心臓中に見出される全てのマウスｍｉＲＮＡの４５％を占めるが、なおｍｉＲ−１は、ノーザン分析で検出不可能のままであるとはいえ肝臓及び中脳中に低いレベルで発現されていたことを明らかにする。ｍｉＲ−１の３コピー又は多型対立遺伝子がマウス中に見出された。マウスとヒトとの間の組織−特異的ｍｉＲ−１発現の保存は、このｍｉＲＮＡの保存された調節役割の付加的証拠を提供する。肝臓中で、ｍｉＲ−１２２の変異体が全てのクローニングされたｍｉＲＮＡの７２％を占め、ｍｉＲ−１２２は分析された他の全ての組織中には検出されなかった。脾臓中で、ｍｉＲ−１４３が、最も豊富に、ほぼ３０％の頻度で現われた。結腸中で、ｍｉＲ−１４２−ａｓが数回クローニングされ、３０％の頻度で現われてもいた。小腸中では、統計的分析を許容するためには少なすぎるｍｉＲＮＡ配列が得られた。これは、この組織中の強力なＲＮアーゼ活性（これが、多量の非−コーデイングＲＮＡ即ちｒＲＮＡの顕著なブリークダウンを引き起こした）に基づいたので、このクローニングされた配列中のｍｉＲＮＡのこのフラクシヨンは、非常に低かった。同様な理由で、膵臓からｍｉＲＮＡ配列は得られなかった。

神経組織ｍｉＲＮＡ分布での洞察を得るために、皮質、小脳及び中脳を分析した。心臓、肝臓及び小腸と同様に、特別なｍｉＲＮＡの変異体ｍｉＲ−１２４が優位を占め、全ての脳ｍｉＲＮＡの２５〜４８％を占めた。脳組織からもクローニングされたｍｉＲ−１０１、−１２７、−１２８、−１３１及び−１３２を、更にノーザンブロッティングで分析し、かつ主に脳−特異的であることが明らかにした。ノーザンブロット分析を、実施例１の記載と同様に実施した。イコールローデイング（equal loading）を立証するために、転写の前に、ポリアクリルアミドゲルのエチジウムステイニングにより、ｔＲＮＡ及び５ＳｒＲＮＡを検出した。脱イオン化水中で５分間の沸騰によりブロットをストリッピングし、２１−ｎｔシグナルが検出のために弱すぎるようになるまで、４回まで再プローブ化した。

ｍｉＲ−１２５ａ及ｍｉＲ−１２５ｂは、Ｃ．エレガンスｌｉｎ−４ｓｔＲＮＡの配列に非常に類似しており、そのオーソログを意味することができる（図６Ａ）。他の種中で既に検出されたｌｅｔ−７に似ず、ｌｉｎ−４は、中心領域中に僅かな突然変異を獲得し、従って、バイオ情報データベースサーチを脱したので、このことは非常に重要である。マウス配列ｍｉＲ−１２５ｂを用いて、容易に、キイロショウジョウバエゲノム中で、そのオーソログを同定することができた。ｍｉＲ−１２５ａ及びｍｉＲ−１２５ｂは、中心ジウリジン挿入によって、かつＵからＣへの変化によってのみ異なっている。ｍｉＲ−１２５ｂは、ターゲットｍＲＮＡ認識の間に膨張すると推定されている中心領域中のみに位置する差異を有して、ｌｉｎ−４ｓｔＲＮＡに非常に類似している［４１］。脳組織から、ｍｉＲ−１２５ａ及びｍｉＲ−１２５ｂがクローニングされたが、他の組織中でのノーザン分析でも、発現が検出され、ｌｉｎ−１４発現をコントロールすることによる調節性神経リモデリングでのｌｉｎ−４の役割と一致した［４３］。不幸にも、Ｃ．エレガンスｌｉｎ−１４に対するオーソログは記載されておらず、ｍｉＲ−１２５ターゲットは、キイロショウジョウバエ又は哺乳動物中で同定されるべきことが残っている。最後に、ｍｉＲ−１２５ｂ発現は発生的にも調節されており、キイロショウジョウバエの蛹及び成虫中でのみ検出可能であるが、胚又は幼虫中では検出不能である（図６Ｂ）。

マウスｍｉＲＮＡと既に記載のｍｉＲＮＡとの配列比較は、ｍｉＲ−９９ｂ及びｍｉＲ−９９ａが、キイロショウジョウバエ、マウス及びヒトｍｉＲ−１０、並びにＣ．エレガンスｍｉＲ−５１に類似しており［３６］、ｍｉＲ−１４１はキイロショウジョウバエｍｉＲ−８に類似し、ｍｉＲ−２９ｂはＣ．エレガンスｍｉＲ−８３に類似し、かつ、ｍｉＲ−１３１及びｍｉＲ−１４２−ｓはキイロショウジョウバエｍｉＲ−４及びＣ．エレガンスｍｉＲ−７９に類似している［３６］ことを表している。ｍｉＲ−１２４ａは、無脊椎動物と脊椎動物との間で保存されている。この関係で、マウスからクローニングされた殆ど全てのｍｉＲＮＡもヒトゲノム中でコードされており、屡々、他の脊椎動物、例えばフグ類、フグリブリペス（Fugu rubripesu）及びゼブラフィッシュダニオレリオ（Danio rerio）中に検出されたことに注目すべきである。配列保存は、これらのｍｉＲＮＡの機能での保存を指摘することができる。図７中に、オーソロガス配列に関する包括的情報が挙げられている。

二つのケースで、以前にＣ．エレガンスｍｉＲＮＡに関して観察されたｍｉＲＮＡ前駆体の双方のストランドをクローニングした（第３表）［３６］。ｍｉＲＮＡ前駆体の最も頻繁にクローニングされたストランドは機能的ｍｉＲＮＡを表すと考えられており、これは、ｍｉＲ−３０ｃ−ｓ及びｍｉＲ−１４２−ａｓ（ｓ及びａｓはそれぞれフォールド−バック構造の５’又は３’側を指示している）である。

ｍｉｒ−１４２遺伝子は、染色体１７上に位置しているがｔ（８；１７）転座の切断点接合部にも見出されており、これが、転座されたＭＹＣ遺伝子の強いアップレギュレーションに基づく攻撃的Ｂ−細胞白血病を起こさせる［４４］。最初のエキソンの所で先端切断されてもいる転座されたＭＹＣ遺伝子は、ｍｉＲ−１４２前駆体の３’−末端の４−ｎｔだけ下流に局在していた。このことは、転座されたＭＹＣが上流ｍｉＲ−１４２プロモーターのコントロール下にあったことを示している。ＥＳＴ配列を有するマウス及びヒトｍｉＲ−１４２のアラインメントは、ｍｉｒ−１４２ヘアピンのほぼ２０ｎｔ保存された配列エレメント下流を指示している。このエレメントは、転座時に失われた。推定ｍｉＲ−１４２／ｍｉＲＮＡ融合時に保存された下流配列エレメントの不存在は、ｍｉＲＮＡ前駆体としての転写産物の認識を妨げたので、融合転写産物の集積及びＭＹＣの過剰発現を起こさせたかもしれないと考えられる。

結腸からクローニングされたｍｉＲ−１５５が公知の非コーディングＢＩＣＲＮＡから切出されている［４７］。ＢＩＣは、元来、トリ白血病ウイルスにより誘発されるＢ細胞リンパ腫中の共通レトロウイルス組み込み部位でのプロモーター挿入により転写活性化された遺伝子として同定されていた。ヒト、マウス及びニワトリからのＢＩＣｃＤＮＡの比較は、１３８ヌクレオチドにわたる７８％アイデンティティを示した［４７］。このアイデンティティ領域は、ｍｉＲ−１５５フォールド−バック前駆体及びこのフォールド−バック配列のいくつかの保存ボックス下流をカバーする。ヒト、マウス及びニワトリ中のリンパ器官及び細胞中のＢＩＣの発現の比較的高いレベルは、進化により保存された機能を意味しているが、ＢＩＣＲＮＡは非−造血組織中に低レベルで検出されてもいる［４７］。

他の重要な観察は、ｍｉＲＮＡに対して完全に相補性のセグメントは、ｍＲＮＡ配列中又はｍｉＲＮＡ逆方向反復の外側のゲノム配列中には観察されないことであった。これはＲＮＡｉとｍｉＲＮＡプロセッシングの間のリンクに基づく偶然であり得る［１１、１３、４３］とはいえ、ｍｉＲＮＡは完全に相補的なターゲットＲＮＡを分断する能力を保持していることが推測できる。ターゲットデグラデーションなしの翻訳コントロールは、よりフレキシビリティを提供することができるはずなので、ｍＲＮＡデグラデーシヨンよりも有利であり得る。

要約すると、６３の新規ｍｉＲＮＡがマウスから同定され、ヒトＳｏａｓ−２骨肉腫細胞から４の新規ｍｉＲＮＡが同定され（第３表及び第４表）、これらはヒト及び屡々他の非哺乳脊椎動物中でも保存されている。これらのｍｉＲＮＡのいくつかは、極めて組織特異性であることが明らかであり、組織−特異性及び細胞系譜決定でのいくつかのｍｉＲＮＡの重大な役割を暗示している。本発明者は、Ｃ．エレガンスｌｉｎ−４ｓｔＲＮＡのミバエ及び哺乳動物オーソログも同定することができた。ｍｉＲＮＡ配列の総括的なリストの確立は、ｍｉＲＮＡ−調節ターゲットｍＲＮＡを同定するために完全ゲノム及び系統発生学的比較の力を使用させるバイオ情報学的研究のための手段になるであろう。

参照文献及び注意事項

１４．キイロショウジョウバエ０−２ｈ胚リゼートからの１９−〜２４−ｎｔＲＮＡのクローニングを、記載のように実施した（８）。ＨｅＬａｍｉＲＮＡのクローニングのために、ＨｅＬａ全ＲＮＡの１ｍｇを１５％変性ポリアクリルアミドゲル上で分離させ、１９−〜２５ｎｔ−サイズのＲＮＡを回収した。５’リン酸化された３’アダプターオリゴヌクレオチド（５’ｐＵＵＵ−ａａｃｃｇｃｇａａｔｔｃｃａｇｘ：大文字はＲＮＡ；小文字はＤＮＡ；ｐはホスフェート；ｘは４−ヒドロキシメチルベンジル；ＳＥＱＩＤＮＯ：５４）及び５’アダプターオリゴヌクレオチド（５’ａｃｇｇａａｔｔｃｃｔｃａｃｔＡＡＡ：大文字はＲＮＡ；小文字はＤＮＡ；ＳＥＱＩＤＮＯ：５５）を短かいＨｅＬａ細胞ＲＮＡにライゲートさせた。ＲＴ／ＰＣＲを、３’プライマー（５’ＧＡＣＴＡＧＣＴＧＧＡＡＴＴＣＧＣＧＧＴＴＡＡＡ；ＳＥＱＩＤＮＯ：５６）及び５’プライマー（５’ＣＡＧＣＣＡＡＣＧＧＡＡＴＴＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡ；ＳＥＱＩＤＮＯ：５７）を用いて実施し、かつ引き続きＥｃｏＲＩ消化後のコンカテマー化及びＴ４ＤＮＡライゲーションを行った（８）。コンカテマーのｐＣＲ２．１ＴＯＰＯベクター中へのライゲーションの後に、約１００のクローンを選択し、シークエンシングに供した。

２７．ｗｗｗ．ｓｃｉｅｎｃｅｍａｇ．ｏｒｇ／ｃｇｉ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ｆｕｌｌ／ｘｘｘでのサイエンスオンラインで補助的Ｗｅｂマテリアルが利用できる。

第１表
キイロショウジョウバエｍｉＲＮＡ。与えられている配列は、クローニングにより同定された最も豊富で、かつ典型的な最長のｍｉＲＮＡ配列を表し；ｍｉＲＮＡは、屡々その３’末端で１又は２個のヌクレオチドの長さで変動する。シークエンシングされた２２２の短かいＲＮＡのうち、６９（３１％）はｍｉＲＮＡに、１０３（４６％）は既にキャラクテライズされた機能的ＲＮＡ（ｒＲＮＡ、７ＳＬＲＮＡ、ｔＲＮＡ）に、３０（１４％）はトランスポゾンＲＮＡフラグメントに、かつ２０（１０％）はデータベース登録のない配列に相当した。全ての同定されたｍｉＲＮＡに関連している特別なｍｉＲＮＡをクローニングの頻度（freq）が、パーセントで示されている。キイロショウジョウバエの段階集団から単離された全ＲＮＡのノーザンブロッティングの結果がまとめられている。Ｅは胚；Ｌは幼虫段階；Ｐは蛹；Ａは成虫：Ｓ２はＳｃｈｎｅｉｄｅｒ−２細胞。各ブロットのシグナルの強さは、最強（＋＋＋）〜非検出（−）で表されている。対照としてｌｅｔ−７ｓｔＲＮＡを検査した。他の種中でのデータベースサーチングにより同定された遺伝子バンクアクセッシヨン番号及びｍｉＲＮＡの相同体が補助的マテリアルとして提供されている。

＊類似のｍｉＲＮＡ配列は、プローブの潜在的クロスハイブリダイゼーシヨンの故に、ノーザンブロッティングにより区別することが困難である。

第２表
ヒトｍｉＲＮＡ。シークエンシングされた２２０の短かいＲＮＡのうち、１００（４５％）はｍｉＲＮＡに、５３（２４％）は既にキャラクテライズされた機能的ＲＮＡ（ｒＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｔＲＮＡ）に、かつ６７（３０％）はデータベース登録のない配列に相当した。異なる脊椎動物種及びＳ２から単離された全ＲＮＡのノーザンブロッティングの結果が示されている。説明に関しては第１表を参照。

＊類似のｍｉＲＮＡ配列は、プローブの潜在的クロス−ハイブリダイゼーシヨンの故に、ノーザンブロッティングにより区別するのが困難である。

第３表
マウスｍｉＲＮＡ。指示されている配列は、クローニングにより同定された最長のｍｉＲＮＡ配列を表す。ｍｉＲＮＡの３’−末端は、屡々１又は２個のヌクレオチドで先端切断されている。８５％（即ち、２１ヌクレオチドの１８を占める）より多くが配列において同じであるか又は１−又は２−ヌクレオチド内部欠失を有するｍｉＲＮＡは、同じ遺伝子番号、引き続く小文字で記載されている。関連ｍｉＲＮＡの間の微量配列変異は、一般にｍｉＲＮＡ配列の末端近くに見出され、ターゲットＲＮＡ認識を害しないと考えられている。微量配列変異は、ターゲット認識の間にＧ−Ｕゆらぎ塩基対として適応されるＡからＧへ及びＣからＵへの変化をも表すことができる。末尾の−ｓ又は−ａｓを有するｍｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡ前駆体の５’−ハーフ又は３’−ハーフのいずれかから誘導されたＲＮＡを示している。マウス脳を中脳ｍｂ、皮質ｃｘ、小脳ｃｂ中まで解剖した。分析された組織は、心臓ｈｔ；肝臓ｌｖ；小腸ｓｉ；結腸ｃｏ；皮質ｃｔ；小脳ｃｂ；中脳ｍｂであった。

^a)当初に記載されたｍｉＲ−３０が、ｍｉｒ−３０ａ遺伝子でコードされた前駆体の反対側のストランドから誘導されたｍｉＲＮＡから区別するために、ｍｉＲ−３０ａ−ａｓに名称変更された。ｍｉＲ−３ａ−ｓはｍｉＲ−９７に均等である［４６］。

^b)１−ｎｔ長さ不均一が５’及び３’末端の双方上に見出されている。２２−ｎｔｍｉＲ配列が示されているが、２１−ｎｔｍｉＲＡのみがクローニングされた。

第４表
マウス及びヒトｍｉＲＮＡ。指示されている配列は、クローニングにより同定された最長のｍｉＲＮＡ配列を表している。ｍｉＲＮＡの３’末端は、屡々１又は２個のヌクレオチドで先端切断されている。８５％（即ち２１ヌクレオチドの１８を占める）より多くが配列において同じであるか、又は１−又は２−ヌクレオチド内部欠失を有するｍｉＲＮＡが、同じ遺伝子番号、引き続く小文字で記載されている。関連ｍｉＲＮＡの間の微量配列変異は、一般にｍｉＲＮＡ配列の末端近くに見出され、ターゲットＲＮＡ認識を害しないと考えられている。微量配列変異は、ターゲット認識の間のＧ−Ｕゆらぎ塩基対として適応されるＡからＧ及びＣからＵへの変化をも表すこともできる。マウス脳を中脳ｍｂ；皮質ｃｘ；小脳ｃｂ中まで解剖した。分析された組織は、肺ｌｎ；肝臓ｌｖ；脾臓ｓｐ；腎臓ｋｄ；皮膚ｓｋ；精巣ｔｓ；卵巣ｏｖ；胸腺ｔｈｙ；眼ｅｙ；皮質ｃｔ；小脳ｃｂ；中脳ｍｂであった。ヒト骨肉腫細胞ＳＡＯＳ−２細胞は、誘導可能なｐ５３遺伝子（ｐ５３−は誘導されていないｐ５３；ｐ５３＋は誘導されたｐ５３）を含有し、誘導された及び誘導されていないＳＡＯＳ細胞から同定されたｍｉＲＮＡ中の差異は、統計的に有意ではなかった。

第５表
キイロショウジョウバエｍｉＲＮＡ配列及びゲノム位置。挙げられている配列は、クローニングにより同定された最も豊富でかつ典型的な最長のｍｉＲＮＡ配列を表している。ｍｉＲＮＡｓは、それらの３’−末端で１又は２個のヌクレオチドの長さで変動することが屡々観察された。シークエンシングされた２２２の短かいＲＮＡのうち、６９（３１％）はｍｉＲＮＡに、１０３（１４％）は既にキャラクテライズされた機能的ＲＮＡ（ｒＲＮＡ、７ＳＬＲＮＡ、ｔＲＮＡ）に、３０（１４％）はトランスポゾンＲＮＡフラグメントに、かつ２０（１０％）はデータベース登録のない配列に相当していた。５’−グアノシンを有するＲＮＡ配列は、クローニング操作の故に、おそらく他より少ない（８）。他の種中に見出されたｍｉＲＮＡ相同体が指示されている。染色体位置（ｃｈｒ）及び遺伝子バンクアクセッシヨン番号（acc.nb.）が示されている。データベースサーチングによってＥＳＴマッチングｍｉＲ−１〜ｍｉＲ−４は検出不能であった。

第６表
ヒトｍｉＲＮＡ配列及びゲノム位置。シークエンシングされた２２０の短かいＲＮＡのうち、１００（４５％）はｍｉＲＮＡｓに、５３（２４％）は既にキャラクテライズされた機能的ＲＮＡ（ｒＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｔＲＮＡ）に、かつ６７（３９％）はデータベース登録のない配列に相当した。

＊データベースで１生物に関していくつかのＥＳＴが引出された場合には、異なる前駆体配列を有するもののみが挙げられている。

＋前駆体構造は、図４中に示されている。

Claims

（ａ）配列番号２１１に示されているヌクレオチド配列、
（ｂ）（ａ）の相補体であるヌクレオチド配列、又は
（ｃ）（ａ）又は（ｂ）の配列に対して少なくとも９０％のアイデンティティを有する、皮膚細胞同定のためのヌクレオチド配列
を有し、１８〜２５ヌクレオチドの長さを有する単離された核酸分子。
配列（ｃ）のアイデンティティが少なくとも９５％である、請求項１に記載の核酸分子。
ｍｉＲＮＡ分子である、請求項１又は２に記載の核酸分子。
ｍｉＲＮＡ分子である請求項３に記載の核酸分子のｍｉＲＮＡ前駆体分子であって、かつ、６０〜８０ヌクレオチドの長さを有するｍｉＲＮＡ前駆体分子又はそれをコードするＤＮＡ分子。
一本鎖である、請求項１から３までのいずれか１項に記載の核酸分子。
少なくとも部分的に二本鎖である、請求項１から３までのいずれか１項に核酸分子。
ＲＮＡ、ＤＮＡ又は糖−若しくは骨格−修飾リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）若しくはロックド核酸（ＬＮＡ）から選択されている、請求項１、２、３、５、６のいずれか１項に記載の核酸分子。
少なくとも１個の糖−又は骨格−修飾リボヌクレオチドを含有する分子である、請求項７に記載の核酸分子。
請求項７に記載の核酸分子を含む、組み換え発現ベクター。
活性薬剤としての請求項１、２、３、５〜８のいずれか１項に記載の核酸分子少なくとも１種及び場合により薬剤学的に認容性の賦形剤を含有する、皮膚細胞のｉｎｖｉｖｏ同定のためのマーカー組成物。
サイズ−分別されたＲＮＡ集団の末端への５’−及び３’−アダプター分子のライゲーション、前記アダプターでライゲーションされたＲＮＡ集団の逆転写及びこの逆転写産生物のキャラクテライゼーションからなる、請求項１、２、３、５〜８のいずれか１項記載の核酸分子を同定する方法。