JP6235619B2 - Ｃｎｓターゲティングａａｖベクターおよびその使用方法 - Google Patents

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Description

関連出願
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）項の下、２０１０年４月２３日出願の、「CNS Targeting AAV Vectors and Methods of Use Thereof」と題する、米国仮特許出願第６１／３２７，６２７号明細書の利益を主張し、その全内容を参照により本明細書に援用する。
本発明は、いくつかの態様で、導入遺伝子をＣＮＳ組織にターゲットするのに有用な組み換えアデノ随伴ウイルス、および同物を含む組成物、およびその使用方法に関する。
様々なＣＮＳ疾患、たとえば、カナバン病、ＡＬＳ、パーキンソン病（ＰＤ）等々を治療するために、治療遺伝子をＣＮＳ細胞に送達するための遺伝子療法が調査研究されてきた。いくつかの限られた症例で、ある種のウイルス類、たとえば、組み換えアデノウイルス（ｒＡｄ）、レンチウイルス（ＬＶ）およびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を種々の治療遺伝子の発現に使用して、治療効果が確認されている。ＡＡＶ２は、ＰＤおよびレーバー先天性黒内障（眼疾患）を治療するための臨床試験で使用されており、予備的所見から、顕著な毒性を伴わずに症状の改善が示唆される［２−４］。
しかし、ＣＮＳ疾患を治療するためのＡＡＶに基づいた遺伝子療法は今なお重大な障害に直面している。たとえば、ＡＬＳを含む多くのＣＮＳ疾患は、ＣＮＳの非常に広い区域に分布している皮質運動ニューロンと脊髄運動ニューロンの両者を冒す。ＣＮＳ組織に注射されたウイルスベクターは、注射部位付近に限って細胞を形質導入し、極めて限られた広がりを有し、概してＣＮＳ疾患動物モデルの寿命に影響を及ぼさないことはしばしば事実である［たとえば、参考文献５参照］。今なお、種々の他のウイルス投与方法が試験されている。一例は、ウイルス粒子を骨格筋に注射して神経終末にウイルスゲノムを取り込ませ、それが次には脊髄運動ニューロンに逆行的に輸送されることを含む。この手法は、あるマウスモデルでいくつかの肯定的な結果を示した［６８］。しかし、この方法を成人のようなより大きい哺乳動物に適用することは非現実的である。総体的に、筋肉注射で認められる形質導入効率は比較的低い。破傷風毒素またはボツリヌス毒素の神経結合領域を含むウイルスのカプシドタンパク質を改変することにより、この効率を改善しようとした研究者もいる。こうした努力は、様々な技術的問題のために結実していない。より大きい哺乳動物における筋肉注射に関するもう一つの問題は大量を必要とすることであり、これは高度の技術を必要とし、高価であり、かつ免疫反応から意図せぬ細胞（たとえば、胚細胞）の形質導入までの有害作用のハイリスクを伴う。
運動ニューロンへの導入遺伝子送達について評価されてきたもう一つの方法は、ウイルスを大きな神経に注射することであって、この方法はウイルスの運動軸索への暴露を最大化し、運動ニューロンがウイルスゲノムを取り込んでそれらを細胞体へ逆行的に輸送することを可能にする。この方法は、運動ニューロンを形質導入する上で、筋肉注射より効率がよいことが証明されている［９］。今なお、このような方法を、より大きい哺乳動物で実行することは困難を伴う。
本発明の態様は、対象のＣＮＳ組織全体にわたって広範な分布を達成する組み換えＡＡＶの発見に基づく。いくつかの実施態様で、ｒＡＡＶは、たとえば、髄腔内注射および／または脳内注射によって、脳脊髄液（ＣＳＦ）中に直接投与後、ＣＮＳ組織全体にわって広がる。他の実施態様では、ｒＡＡＶは、静脈内投与後、血管脳関門を越えて対象のＣＮＳ組織全体にわたって広範な分布を達成する。いくつかの態様で、本発明は、安定した無毒の遺伝子移入を効率よく達成する、明確な中枢神経系組織ターゲティング能力（たとえば、ＣＮＳ組織トロピズム）を有するｒＡＡＶに関する。いくつかの態様では、ｒＡＡＶの髄腔内注射および脳内（たとえば、脳室内）注射による同時投与を含む方法が提供される。たとえば、配列番号９で示される配列を含むカプシドタンパク質を有するｒＡＡＶは、髄腔内注射後、ＣＮＳ全体にわたって広範な分布を達成し、したがって、ＣＮＳ関連障害、たとえば、ＡＬＳ等の治療に特に有用であることが分かっている。本発明のまたさらなる態様で、カナバン病を治療する方法が提供される。
本発明のいくつかの態様によれば、導入遺伝子を対象のＣＮＳ組織に送達する方法が提供される。いくつかの実施態様で、本方法は髄腔内投与によりｒＡＡＶの有効量を投与することを含み、ここでｒＡＡＶは、（ｉ）配列番号９で示される配列を含むカプシドタンパク質および（ｉｉ）導入遺伝子と操作可能に連結されたプロモーターを含む核酸を含む。いくつかの実施態様で、本方法は、脳内投与によりｒＡＡＶの有効量を投与することをさらに含む。いくつかの実施態様で、本方法は髄腔内投与および脳内投与によりｒＡＡＶの有効量を投与することを含み、ここでｒＡＡＶは、対象のＣＮＳ組織の細胞を感染させ、また導入遺伝子と操作可能に連結されたプロモーターを含む核酸を含む。ある実施態様で、脳内投与は脳室内投与である。一実施態様で、脳室内投与は、対象の前脳の脳室領域内への投与である。ある実施態様で、髄腔内投与は対象の腰部内である。いくつかの実施態様で、髄腔内投与のためのｒＡＡＶの用量は１０１０ゲノムコピー／対象〜１０１１ゲノムコピー／対象の範囲内である。いくつかの実施態様で、髄腔内投与のためのｒＡＡＶの用量は１０１１ゲノムコピー／対象〜１０１２ゲノムコピー／対象の範囲内である。いくつかの実施態様で、髄腔内投与のためのｒＡＡＶの用量は、１０１２ゲノムコピー／対象〜１０１３ゲノムコピー／対象の範囲内である。いくつかの実施態様で、髄腔内投与のためのｒＡＡＶの用量は１０１３ゲノムコピー／対象〜１０１４ゲノムコピー／対象の範囲内である。いくつかの実施態様で、脳内投与のためのｒＡＡＶの用量は１０１０ゲノムコピー／対象〜１０１１ゲノムコピー／対象の範囲内である。いくつかの実施態様で、脳内投与のためのｒＡＡＶの用量は１０１１ゲノムコピー／対象〜１０１２ゲノムコピー／対象の範囲内である。いくつかの実施態様で、脳内投与のためのｒＡＡＶの用量は１０１２ゲノムコピー／対象〜１０１３ゲノムコピー／対象の範囲内である。いくつかの実施態様で、脳内投与のためのｒＡＡＶの用量は１０１３ゲノムコピー／対象〜１０１４ゲノムコピー／対象の範囲である。いくつかの実施態様で、脳内投与または髄腔内投与のためのｒＡＡＶの用量は、１μｌ〜１０μｌの範囲内の量の注射用に処方される。いくつかの実施態様で、脳内投与または髄腔内投与のためのｒＡＡＶの用量は、１０μｌ〜１００μｌの範囲内の量の注射用に処方される。いくつかの実施態様で、脳内投与または髄腔内投与のためのｒＡＡＶの用量は、１００μｌ〜１ｍｌの範囲内の量の注射用に処方される。いくつかの実施態様で、脳内投与または髄腔内投与のためのｒＡＡＶは、１ｍｌ以上の量の注射用に処方される。いくつかの実施態様で、導入遺伝子はレポータータンパク質をコードする。ある実施態様で、レポータータンパク質は蛍光タンパク質、検出可能な生成物を産する反応を触媒する酵素、または細胞表面抗原である。ある実施態様で、その酵素はルシフェラーゼ、β−グルクロニダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ、アミノシクリトールホスホトランスフェラーゼ、またはピューロマイシンＮ−アセチル−トランスフェラーゼである。いくつかの実施態様で、導入遺伝子はＣＮＳ関連遺伝子である。いくつかの実施態様で、ＣＮＳ関連遺伝子は、神経細胞アポトーシス抑制タンパク質（ＮＡＩＰ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、グリア由来成長因子（ＧＤＮＦ）、脳由来成長因子（ＢＤＮＦ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）、ＧＴＰ−シクロヒドロラーゼ（ＧＴＰＣＨ）、アミノ酸デカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）またはアスパルトアシラーゼ（ＡＳＰＡ）である。いくつかの実施態様で、導入遺伝子は、対象において、ＳＯＤ１ ｍＲＮＡに特異的に結合してＳＯＤ１の発現を抑制する抑制性ＲＮＡをコードする。いくつかの実施態様で、抑制性ＲＮＡはアンチセンスＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはｍｉＲＮＡである。いくつかの実施態様で、抑制性ＲＮＡは配列番号２６で示される配列を有する。したがって、本発明のいくつかの態様によれば、配列番号２６で示される配列を含む核酸が提供される。いくつかの実施態様で、配列番号２６で示される配列を有する領域と操作可能に連結されたプロモーターを含む核酸が提供される。
本発明のさらなる態様で、配列番号２６で示される配列を含む核酸を含む組み換えＡＡＶが提供される。本発明のいくつかの態様で、配列番号２６で示される配列を有する領域と操作可能に連結されたプロモーターを含む核酸を含む組み換えＡＡＶが提供される。いくつかの実施態様で、組み換えＡＡＶは、配列番号９で示される配列を含むカプシドタンパク質をさらに含む。
本発明のいくつかの態様によれば、治療を必要としている対象における筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の治療方法が提供される。いくつかの実施態様で、本方法はｒＡＡＶの有効量を対象のＣＮＳ組織に投与することを含み、ここで、ｒＡＡＶは（ｉ）配列番号９で示される配列を含むカプシドタンパク質および（ｉｉ）対象において、ＳＯＤ１ ｍＲＮＡに特異的に結合してＳＯＤ１の発現を抑制する抑制性ＲＮＡをコードしている領域と操作可能に連結されたプロモーターを含む核酸を含む。いくつかの実施態様で、抑制性ＲＮＡは、アンチセンスＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはｍｉＲＮＡである。いくつかの実施態様で、抑制性ＲＮＡは配列番号２６で示される配列を有する。いくつかの実施態様で、本方法はｒＡＡＶの有効量を対象に投与することを含み、ここでｒＡＡＶは配列番号２６で示される配列をコードしている領域と操作可能に連結されたプロモーターを含む核酸を含み、またここでｒＡＡＶは、対象のＣＮＳ組織の細胞を感染させる。
本発明のいくつかの態様によれば、静脈内投与によってｒＡＡＶの有効量を投与することを含む、導入遺伝子を対象のＣＮＳ組織に送達する方法が提供され、ここでｒＡＡＶは対象におけるＣＮＳ組織の細胞を感染させ、また導入遺伝子と操作可能に連結されたプロモーターを含む核酸を含む。いくつかの実施態様で、静脈内投与のためのｒＡＡＶの用量は１０１０ゲノムコピー／対象〜１０１１ゲノムコピー／対象の範囲内である。いくつかの実施態様で、静脈内投与のためのｒＡＡＶの用量は１０１１ゲノムコピー／対象〜１０１２ゲノムコピー／対象の範囲内である。いくつかの実施態様で、静脈内投与のためのｒＡＡＶの用量は１０１２ゲノムコピー／対象〜１０１３ゲノムコピー／対象の範囲内である。いくつかの実施態様で、静脈内投与のためのｒＡＡＶの用量は１０１３ゲノムコピー／対象〜１０１４ゲノムコピー／対象の範囲内である。いくつかの実施態様で、静脈内投与のためのｒＡＡＶの用量は１０１４ゲノムコピー／対象〜１０１５ゲノムコピー／対象の範囲内である。いくつかの実施態様で、静脈内投与のためのｒＡＡＶの用量は１０１０ゲノムコピー／ｋｇ〜１０１１ゲノムコピー／ｋｇの範囲内である。いくつかの実施態様で、静脈内投与のためのｒＡＡＶの用量は１０１１ゲノムコピー／ｋｇ〜１０１２ゲノムコピー／ｋｇの範囲内である。いくつかの実施態様で、静脈内投与のためのｒＡＡＶの用量は１０１２ゲノムコピー／ｋｇ〜１０１３ゲノムコピー／ｋｇの範囲内である。いくつかの実施態様で、静脈内投与のためのｒＡＡＶの用量は１０１３ゲノムコピー／ｋｇ〜１０１４ゲノムコピー／ｋｇの範囲内である。
本発明のいくつかの態様によれば、（ｉ）配列番号１０〜１２のいずれか１つで示される配列を有するカプシドタンパク質および（ｉｉ）導入遺伝子と操作可能に連結されたプロモーターを含む核酸を含むｒＡＡＶの有効量を対象に投与することを含む、対象のＣＮＳ組織に導入遺伝子を送達する方法が提供される。いくつかの実施態様で、本方法は、導入遺伝子を含むｒＡＡＶの有効量を対象に投与することを含み、ここでｒＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ｒｈ．１０、ｒｈ．３９、ｒｈ．４３およびＣＳｐ３からなる群から選択される、ＡＡＶ血清型、または血清型変異形のカプシドタンパク質を含み、またここで（ａ）ＡＡＶ血清型がＡＡＶ１である場合、投与経路は、脳内、筋肉内、神経内、または脳室内ではなく、かつ／または対象はマウス、ラットまたはネコではない；（ｂ）ＡＡＶ血清型がＡＡＶ２である場合、投与経路は脳内投与または脳室内投与ではなく、かつ／または対象はラット、マウス、ネコ、マーモセット、またはマカクではない；（ｃ）ＡＡＶ血清型がＡＡＶ５である場合、投与経路は脳内投与または脳室内投与ではなく、かつ／または対象はラット、マウス、またはマーモセットではない；（ｄ）ＡＡＶ血清型がＡＡＶ６である場合、対象はマウスではない；（ｅ）ＡＡＶ血清型がＡＡＶ７である場合、投与経路は脳内投与ではなく、かつ／または対象はマウスまたはマカクではない；（ｆ）ＡＡＶ血清型がＡＡＶ８である場合、投与経路は脳内投与、腹腔内投与、または血管内投与ではなく、かつ／または対象はマウスまたはマカクではない；（ｇ）ＡＡＶ血清型がＡＡＶ９である場合、投与経路は脳内投与または血管内投与ではなく、かつ／または対象はラットまたはマウスではない；そして（ｈ）ＡＡＶ血清型がＡＡＶｒｈ．１０である場合、投与経路は脳内投与または血管内投与ではなく、かつ／または対象はラットまたはマウスではない。いくつかの実施態様で、ＡＡＶ血清型、または血清型変異形は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ｒｈ．３９、ｒｈ．４３、およびＣＳｐ３から選択され、投与経路は血管内投与である。いくつかの実施態様で、ＡＡＶ血清型はＡＡＶ７であり、投与経路は血管内投与である。いくつかの実施態様で、ＣＮＳ組織は、皮質、海馬、視床、視床下部、小脳、脳幹、頚髄、胸髄、および腰髄から選択される。いくつかの実施態様で、導入遺伝子はレポータータンパク質をコードする。ある実施態様で、レポータータンパク質は、蛍光タンパク質、検出可能な生成物を産する反応を触媒する酵素、または細胞表面抗原である。ある実施態様で、酵素はルシフェラーゼ、β−グルクロニダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ、アミノシクリトールホスホトランスフェラーゼ、またはピューロマイシンＮ−アセチル−トランスフェラーゼである。いくつかの実施態様で、導入遺伝子はＣＮＳ関連遺伝子である。ある実施態様で、ＣＮＳ関連遺伝子は神経細胞アポトーシス抑制タンパク質（ＮＡＩＰ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、グリア由来成長因子（ＧＤＮＦ）、脳由来成長因子（ＢＤＮＦ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）、ＧＴＰ−シクロヒドロラーゼ（ＧＴＰＣＨ）、アミノ酸デカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）またはアスパルトアシラーゼ（ＡＳＰＡ）である。いくつかの実施態様で、ｒＡＡＶは静脈内注射によって投与される。
本発明のいくつかの態様によれば、（ｉ）配列番号１０〜１２のいずれか１つで示される配列を有するカプシドタンパク質および（ｉｉ）ＣＮＳ関連遺伝子と操作可能に連結されたプロモーターを含む核酸を含むｒＡＡＶが提供される。ある実施態様で、ＣＮＳ関連遺伝子は神経細胞アポトーシス抑制タンパク質（ＮＡＩＰ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、グリア由来成長因子（ＧＤＮＦ）、脳由来成長因子（ＢＤＮＦ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）、ＧＴＰ−シクロヒドロラーゼ（ＧＴＰＣＨ）、アミノ酸デカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）またはアスパルトアシラーゼ（ＡＳＰＡ）である。いくつかの実施態様で、ＣＮＳ関連遺伝子から発現されるｍＲＮＡは、非ＣＮＳ組織で優先的に発現されるｍｉＲＮＡのｍｉＲＮＡ結合部位を含む。ある実施態様で、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲ−１２２用の結合部位である。ある実施態様で、ｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍｉＲ−１用の結合部位である。いくつかの実施態様で、ＣＮＳ関連遺伝子から発現されるｍＲＮＡは、ＣＮＳ組織で優先的に発現されるｍｉＲＮＡのｍｉＲＮＡ結合部位を含まない。いくつかの実施態様で、プロモーターはＣＮＳ組織特異的プロモーターである。ある実施態様で、プロモーターは、ニューロン核（ＮｅｕＮ）、グリア線性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）、大腸腺腫症（ＡＰＣ）、およびイオン化カルシウム結合アダプター分子１（Ｉｂａ−１）から選択される遺伝子のプロモーターである。
本発明のいくつかの態様によれば、（ｉ）配列番号１０〜１２で示される配列を有するカプシドタンパク質および（ｉｉ）ＣＮＳ関連遺伝子と操作可能に連結されたプロモーターを含む核酸を含むｒＡＡＶを含む組成物が提供される。ある実施態様で、本組成物は薬学的に許容される担体をさらに含む。本発明のいくつかの態様によれば、本組成物を収納する容器を含むキットが提供される。いくつかの実施態様で、容器は密封された小瓶またはアンプルである。いくつかの実施態様で、本容器は注射器である。
本発明のいくつかの態様によれば、配列番号１０〜１２のいずれか１つで示される配列を有するカプシドタンパク質をコードしている核酸、およびＣＮＳ疾患関連遺伝子をコードしている核酸を含むｒＡＡＶベクターを含む、単離された哺乳類細胞が提供される。いくつかの実施態様で、単離された哺乳類細胞は、ＡＡＶヘルパー機能ベクターをさらに含む。いくつかの実施態様で、単離された哺乳類細胞は、補助機能ベクターをさらに含む。ある実施態様で、ＣＮＳ関連遺伝子は神経細胞アポトーシス抑制タンパク質（ＮＡＩＰ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、グリア由来成長因子（ＧＤＮＦ）、脳由来成長因子（ＢＤＮＦ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）、ＧＴＰ−シクロヒドロラーゼ（ＧＴＰＣＨ）、アミノ酸デカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）またはアスパルトアシラーゼ（ＡＳＰＡ）である。
本発明のさらなる態様によれば、治療を必要としている対象におけるカナバン病を治療する方法が提供される。いくつかの実施態様で、本方法はｒＡＡＶの有効量を対象のＣＮＳ組織に投与することを含み、ここでｒＡＡＶは、（ｉ）ＡＡＶ血清型２のカプシドタンパク質以外のカプシドタンパク質および（ｉｉ）アスパルトアシラーゼ（ＡＳＰＡ）をコードしている領域と操作可能に連結されたプロモーターを含む核酸を含む。本明細書で開示されているｒＡＡＶ血清型のいずれも、カナバン病を治療する方法で使用することが可能である。いくつかの実施態様で、ｒＡＡＶは、配列番号８または９で示されるようなアミノ酸配列あるいはその変異形を有するカプシドタンパク質を有する。いくつかの実施態様で、投与は髄腔内的または脳内的に実施される。いくつかの実施態様で、投与は血管内的に実施される。
いくつかの実施態様で、本方法は、脳内投与以外の経路でｒＡＡＶの有効量を対象のＣＮＳ組織に投与することを含み、ここでｒＡＡＶは、アスパルトアシラーゼ（ＡＳＰＡ）をコードしている領域と操作可能に連結されたプロモーターを含む核酸を含む。いくつかの実施態様で、本方法はｒＡＡＶの有効量を対象のＣＮＳ組織に投与すること（ここでｒＡＡＶは、アスパルトアシラーゼ（ＡＳＰＡ）をコードしている領域と操作可能に連結されたプロモーターを含む核酸を含む）；および投与後少なくとも一度は対象の腎機能を評価することを含む。当該技術分野で知られている任意の好適な方法を使用して対象の腎機能を評価することが可能である。評価は、たとえば、血中または尿中尿素窒素レベルの検査、血中または尿中のクレアチニンレベルの検査、クレアチニンクリアランス率検査、糸球体濾過率検査、濾過率分画検査、腎血漿流量検査、超音波検査、腎臓組織生検の顕微鏡検査または他の好適な腎機能試験を含んでもよい。当然のことながら、いくつかの実施態様で、ｒＡＡＶ−介在遺伝子療法での治療後、対象の腎機能の改善は、カナバン病を治療するための遺伝子療法の有効性を示す。
いくつかの実施態様で、本方法はｒＡＡＶの有効量を対象のＣＮＳ組織に投与すること（ここでｒＡＡＶは、アスパルトアシラーゼ（ＡＳＰＡ）をコードしている領域と操作可能に連結されたプロモーターを含む核酸を含む）；および投与後少なくとも一度は対象の視力を評価することを含む。当該技術分野で知られている任意の好適な方法を使用して対象の視力をすることが可能である。評価は、たとえば、眼の外診、視力検査、瞳孔関数の検査、網膜検査、眼球運動性検査、眼圧テスト、または検眼鏡検査を含んでもよい。評価は、色、物体または形状を識別する対象の能力あるいは特定の距離から色、物体または形状を認識する対象の能力に関する測定を含んでもよい。当然のことながら、いくつかの実施態様で、ｒＡＡＶ−介在遺伝子療法での治療後、対象の視力の改善は、カナバン病を治療するための遺伝子療法の有効性を示す。
いくつかの実施態様で、本核酸は、ＣＮＳ組織と比較して１つ以上の非ＣＮＳ組織中の方が豊富である１つ以上のｍｉＲＮＡ用の１つ以上のｍｉＲＮＡ結合部位を含む、アスパルトアシラーゼ（ＡＳＰＡ）ｍＲＮＡを発現する。したがって、いくつかの実施態様で、ｍＲＮＡは、１つ以上の非ＣＮＳ組織中でｍｉＲＮＡで分解するために、標的とされる。いくつかの実施態様で、１つ以上の非ＣＮＳ組織は腎臓組織または網膜組織ではない。いくつかの実施態様で、ＣＮＳ組織と比較して非ＣＮＳ組織中の方が豊富である１つ以上のｍｉＲＮＡは、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、または少なくとも１０倍豊富である。ＣＮＳ組織と比較して非ＣＮＳ組織中の方が豊富であるＭｉＲＮＡは、当該技術分野で知られている。たとえば、一研究で、ＣＮＳ組織、腎組織を含む様々な４０組織における、３００超の様々なヒトｍｉＲＮＡの発現レベルが開示されている。（Liang Y,et al.,Characterization of microRNA expression profiles in normal human tissues.BMC Genomics.2007 Jun 12;8:166参照、ｍｉＲＮＡに関する内容を、参照により本明細書に援用する）。したがって、いくつかの実施態様で、熟練した技術者であれば、非ＣＮＳ組織中の方が豊富である好適なｍｉＲＮＡを、（たとえば、Ｌｉａｎｇらに開示されているようなデータに基づいて）容易に選択し、ｍｉＲＮＡ用の結合部位を、コードされたｍＲＮＡに組み込むことができるであろう。
本発明の各制限は、本発明の様々な実施態様を包含することができる。したがって、何れか１つの要素または要素の組合せを含む本発明の各制限は、本発明の各態様に含めることができると予期される。本発明は、その適用の点で、以下の説明に記述されているかあるいは図面に例示されている構造の詳細および構成要素の配置に限定されない。本発明は他の実施態様ができ、また様々な方法で実施または実行することができる。
ＥＧＦＰ発現ベクターを持つ様々なｒＡＡＶに感染した新生仔マウス由来のＣＮＳ組織切片のパネルの蛍光顕微鏡画像のＥＧＦＰ強度の定量的結果を表す。新生仔マウスに、静脈内投与（浅側頭静脈注射）でｒＡＡＶを投与した。 ＥＧＦＰ発現ベクターを持つ様々なｒＡＡＶに感染した成体マウス由来のＣＮＳ組織切片のパネルの蛍光顕微鏡画像のＥＧＦＰ強度の定量的結果を表す。成体マウスに、静脈内投与（尾静脈注射）でｒＡＡＶを投与した。 ＩＶ注射後２１日の、新生仔マウス脊髄（頚部、胸部および腰部）におけるＥＧＦＰ発現の定量を表す（グループ当たりマウス５匹）。新生仔マウスに、静脈内投与（浅側頭静脈注射）でｒＡＡＶを投与した。 ＥＧＦＰ遺伝子を持つＡＡＶｒｈ．１０の直接ＣＳＦ注射は、ＣＮＳの広域でＥＧＦＰ発現につながることを示す結果を表す。ウイルス注射後６０日に作製された、脳幹、頚髄、胸髄および腰髄由来の組織切片を表す。灰色／黒色画素はＥＧＦＰ発現と一致する。 ＥＧＦＰ遺伝子を持つＡＡＶｒｈ．１０の直接ＣＳＦ注射は、星状細胞でＥＧＦＰ発現につながることを示す結果を表す。灰色／黒色画素はＥＧＦＰ発現と一致する。 ＳＯＤ１をターゲットするマイクロＲＮＡを発現するｒＡＡＶｒｈ．１０ベクターを表す。本構築物は、ＥＧＦＰおよび３’−ＵＴＲ内のイントロンに位置するｍｉＲ−ＳＯＤ１の発現を推進するために、ＣＡＧ（ＣＭＶエンハンサーを含むニワトリβ−アクチンプロモーター）を使用する。ｐＡはポリＡ信号を表す。ＩＴＲは、ＡＡＶの逆方向反復を示す。 異なる９つのｍｉＲＮＡ構築物のサイレンシング効力を試験する実験の結果を表し、ｍｉＲ−ＳＯＤ１＃５がＳＯＤ１発現を最も強力に停止させた。 ｍｉＲ−ＳＯＤ１＃５がＡＡＶｒｈ．１０にパッケージされて、ＨＥＫ２９３細胞の感染に使用された実験の結果を表す。感染の４３時間後に細胞内総タンパク質を抽出し、ＳＯＤ１を検出するためにブロットした。Ｓｃｒは、スクランブルｍｉＲＮＡを表し；ＳｏｄはｍｉＲ−ＳＯＤ１＃５を表し；ＣはＥＧＦＰのみを発現する対照を表す。 ｐＡＡＶｓｃＣＢ６ ＥＧＦＰｍｉｒ ＳＯＤ５（５２４３ｂｐ）（配列番号２１）のプラスミドマップを表す。 ｒＡＡＶ ｒｈ．１０−ＳＯＤ１ ｍｉＲＮＡが星状細胞における変異ＳＯＤ１のレベルを下げることを示す、ＳＯＤ１（Ｇ９３Ａ）突然変異マウスにおける遺伝子移入試験の結果を表す。運動ニューロンにおける染色も認められた。 ｒＡＡＶ ｒｈ．１０−スクランブルｍｉＲＮＡと比較して、ｒＡＡＶ ｒｈ．１０−ＳＯＤ１ ｓｈＲＮＡが寿命を増加することを示す、ＳＯＤ１（Ｇ９３Ａ）突然変異マウスにおける遺伝子移入試験の結果を表す。 ｒＡＡＶ ｒｈ．１０−ＳＯＤ１ ｍｉＲＮＡに感染した個々のマウスの寿命と比較した、頚部、胸部、および腰部脊髄組織におけるＥＧＦＰ発現の定量を表す；ｒＡＡＶ ｒｈ．１０−ＳＯＤ１は、ＣＳＦに直接投与した。 ｒＡＡＶ ｒｈ．１０−スクランブルｍｉＲＮＡに感染した個々のマウスの寿命と比較した、頚部、胸部、および腰部脊髄組織におけるＥＧＦＰ発現の定量を表す；ｒＡＡＶ ｒｈ．１０−スクランブルｍｉＲＮＡは、ＣＳＦに直接投与した。 様々なＡＡＶの髄腔内注射を投与されていたマウスの蛍光顕微鏡分析を表す。この実験で、ＡＡＶ９およびＡＡＶｒｈ１０はともに、腰部くも膜下腔でＣＳＦ中に単回注射後、脊髄の全長に沿った細胞を形質導入する。 ＡＡＶ１０−ｍｉＲ−ＳＯＤ１処置の効果を表す。ＡＡＶ１０−ｍｉＲ−ＳＯＤ１処置は、対照Ｇ９３Ａマウスと比較して処置マウスで体重減少が遅いことによって示される通り、疾病進行を遅らせる。 様々なＡＡＶの髄腔内注射を投与しておいたマウスの蛍光顕微鏡分析を表す。この実験で、第三脳室でＣＳＦ中に単回注射した後、ＡＡＶ９およびＡＡＶｒｈ１０は広い前脳区域の細胞を形質導入できる。 ＡＡＶ９注射マウス由来の組織切片の蛍光顕微鏡分析を表す。第三脳室へのＡＡＶ９およびＡＡＶｒｈ１０の単回注射は、皮質、海馬、線条体、視床、小脳および脊髄のいくつかの散在性細胞を含む、広い前脳区域の細胞を形質導入できる。同じ一般的パターンがＡＡＶ１０注射マウスでも認められた。 レポーターサイレンシング用の人為的ｍｉＲＮＡ−結合部位のインビトロ検証を表す。ｍｉＲ−１結合部位またはｍｉＲ−１２２−結合部位を含むまたは含まないｒＡＡＶＣＢｎＬａｃＺゲノムを持つプラスミドを、ｍｉＲ−１２２を発現するヒトヘパトーマ（ＨｕＨ７）細胞に形質移入した（ａ）か、あるいはｐｒｉ−ｍｉＲ−１２２（ｂ）またはｐｒｉ−ｍｉＲ−１（ｃ）のいずれかを発現するプラスミドと一緒に、１：３（低）または１：１０（高）のモル比で、２９３細胞に共形質移入した。０Ｘ：ｍｉＲＮＡ−結合部位なし；１Ｘ：ｍｉＲＮＡ−結合部位１つ；３Ｘ：ｍｉＲＮＡ−結合部位３つ。形質移入の４８時間後、細胞を固定し、Ｘ−ｇａｌで組織化学的ｌに染色して、青色細胞を計数した。各形質移入におけるｎＬａｃＺ−陽性細胞のパーセンテージを、対照プラスミド（ｐｒＡＡＶＣＢｎＬａｃＺ）の形質移入と比較した。ＣＢ，ニワトリβ−アクチン；ｍｉＲ，マイクロＲＮＡ；ｎＬａｃＺ，β−ガラクトシダーゼレポーター導入遺伝子；ｒＡＡＶ，組み換えアデノ随伴ウイルス。 ｒＡＡＶ９形質導入における内因性ｍｉＲＮＡ−制御性導入遺伝子サイレンシングのインビボ評価を表す。（ａ〜ｃ）成体オスＣ５８８Ｌ／６マウスに、各１ｋｇ当たり５×１０１３ゲノムコピー（ＧＣ／ｋｇ）のｒＡＡＶ９ＣＢｎＬａｃＺ（結合部位なし）、（ａ）ｒＡＡＶＣＢ９ｎＬａｃＺｍｉＲ−１２２ＢＳ（ｍｉＲ−１２２−結合部位１つ）およびｒＡＡＶ９Ｃ８ｎｌａｃＺ−（ｍｉＲ−１２２ＢＳ）３（ｍｉＲ−１２２−結合部位３つ）、（ｂ）ｒＡＡＶ９ＣＢｎＬａｃＺ−ｍｉＲ−１ＢＳ（ｍｉＲ−１結合部位１つ）およびｒＡＡＶ９ＣＢｎＬａｃＺ−（ｍｉＲ−１ＢＳ）３（ｍｉＲ−１−結合部位３つ）、（ｃ）ｒＡＡＶ９ＣＢｎＬａｃＺ−ｍｉＲ−１ＢＳ−ｍｉＲ−１２２ＢＳ（各１× 結合部位）およびｒＡＡＶ９ＣＢｎＬａｃＺ−（ｍｉＲ−１ＢＳ）３−（ｍｉＲ−１２２ＢＳ）３（ｍｉＲ−１−結合部位３つおよびｍｉＲ−１２２−結合部位３つ）を静脈内注射した。ベクター投与の４週間後に動物を剖検し、低温切片およびＸ−ｇａｌ組織化学的染色のために適切な組織を採取した。ｍｉＲ，マイクロＲＮＡ；ｎＬａｃＺ，β−ガラクトシダーゼレポーター導入遺伝子；ｒＡＡＶ，組み換えアデノ随伴ウイルス、および（ｄ）ｍｉＲＮＡ−結合部位を含むまたは含まないｒＡＡＶｎＬａｃＺベクターを受けた動物由来の肝臓組織におけるβ−ガラクトシダーゼ活性の定量化。 ｍｉＲＮＡ−結合部位を含むまたは含まないｒＡＡＶ９ＣＢｎＬａｃＺを形質導入されたマウスにおける、同族ｍｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、および内因性ｍｉＲＮＡ標的遺伝子のタンパク質の発現レベルの分析を表す。総細胞内ＲＮＡまたはタンパク質は、（ａ〜ｃ）肝臓または（ｄ）心臓から調製した。（ａ）ｍｉＲＮＡのノーザンブロット検出。Ｕ６核内低分子ＲＮＡは、ローディングコントロールを提供した。（ｂ）サイクリンＧｌ ｍＲＮＡを測定する定量的逆転写ＰＣＲ。データは、β−アクチンに正規化した相対的サイクリンＧｌ ｍＲＮＡレベルとして表す。（ｃ，ｄ）ｍｉＲ−１２２およびｍｉＲ−１の内因性標的のタンパク質レベルのウェスタンブロット分析。サイクリンＧ１およびカルモジュリンについて、（ｃ）肝臓または（ｄ）心臓から調製した細胞内総タンパク質を分析した。（ｅ）血清コレステロールレベル。４週間後に、ｍｉＲＮＡ−結合部位を含むまたは含まないｒＡＡＶ９を受けたマウス由来の血清試料を採取して、総コレステロール、高比重リポタンパク質（ＨＤＬ）および低比重リポタンパク質（ＬＤＬ）について測定した。ｍｉＲ，マイクロＲＮＡ；ｎＬａｃＺ，β−ガラクトシダーゼレポーター導入遺伝子；ｒＡＡＶ，組み換えアデノ随伴ウイルス。 ｍｉＲＮＡ結合部位を含むまたは含まない導入遺伝子ｍＲＮＡの分子特性決定を表す。（ａ）プローブおよびプライマーの位置、成熟ｍｉＲ−１２２の配列および導入遺伝子ｍＲＮＡにおけるその完全に相補的な結合部位を示す。（ｂ）ｎＬａｃＺの３’末端とポリ（Ａ）信号の５’末端との間に架かるプライマーを使用することにより、従来の逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）によるか（ｃ）または定量的ＲＴ−ＰＣＲによるかのいずれかによって、肝臓由来の総細胞内ＲＮＡを分析した；データは、β−アクチンに正規化した相対的ｎＬａｃＺ ｍＲＮＡレベルとして示す。（ｄ）ｎＬａｃＺ ｍＲＮＡのノーザンブロット分析については、１８Ｓ ＲＮＡがローディングコントロールの役割をし、ブロットを、導入遺伝子ＤＮＡ（ｅ）またはＲＮＡプローブのいずれかとハイブリダイズさせた。（ｆ）加えて、ｍｉＲ−１−結合部位３つおよびｍｉＲ−１２２−結合部位３つを含むｒＡＡＶを受けた動物の肝臓由来のｍＲＮＡを担持するポリ（Ａ）を５’ＲＡＣＥで分析した；ＰＣＲ産物を、臭化エチジウム染色したアガロースゲルで分析した。ｍｉＲ，マイクロＲＮＡ；ｎＬａｃＺ，β−ガラクトシダーゼレポーター導入遺伝子；ｒＡＡＶ，組み換えアデノ随伴ウイルス。 ５ ＲＡＣＥにより回収されたｍｉＲＮＡ−結合部位とポリ（Ａ）信号領域に跨る配列のアラインメントを表す。ポリ（Ａ）−含有ｍＲＮＡは、ｒＡＡＶ９ＣＢｎＬａｃＺ−（ｍｉＲ−１ＢＳ）３−（ｍｉＲ−１２２ＢＳ）３を注射した動物の（ａ）肝臓および（ｂ）心臓から単離した。２１の肝臓由来のクローンおよび２２の心臓由来のクローンをシーケンシングした。各クローンの想定される切断部位は、矢印によって同定される；各ｍｉＲＮＡ−結合部位について、ｍｉＲＮＡ−制御性の、部位特異的切断の頻度を報告する；三角形は、予想されるｍｉＲＮＡ−制御性の切断部位（ａ，ｂ）の位置を指し示す。ｍｉＲＮＡ，マイクロＲＮＡ、ｎＬａｃＺ，β−ガラクトシダーゼレポーター導入遺伝子；ｒＡＡＶ，組み換えアデノ随伴ウイルス。 全身的に送達されたｒＡＡＶ９による、内因性ｍｉＲＮＡ−抑制性の、ＣＮＳ−指向性ＥＧＦＰ遺伝子移入を表す。１０週令のオスＣ５７ＢＬ／６マウスに、ｓｃＡＡＶ９ＣＢＥＧＦＰまたはｓｃＡＡＶ９ＣＢｎＬａｃＺ（ｍｉＲ−１ＢＳ）３−（ｍｉＲ−１２２ＢＳ）３を、体重１ｋｇ当たり２×１０１４ゲノムコピー（ＧＣ／ｋｇ）の用量で、静脈内注射した。経心臓的灌流による全身固定のために、動物を３週間後に剖検した。（ａ）低温薄切、ＥＧＦＰ（脳および頚髄）の免疫蛍光染色、ＥＧＦＰを検出するための蛍光顕微鏡法のために、脳、脊髄、肝臓、心臓、および筋肉を採取した。総細胞内ＤＮＡおよび総細胞内ＲＮＡを脳、肝臓、心臓および筋肉から抽出して、持続性のベクターゲノムの量をｑＰＣＲで、またＥＧＦ ＰｍＲＮＡの量をｑＲＴ−ＰＣＲで測定した。（ｂ）各組織について、ｍｉＲＮＡ−結合部位を含むＥＧＦＰ ｍＲＮＡの相対的な存在量を、ｍｉＲＮＡ−結合部位が欠如しているＥＧＦＰ ｍＲＮＡのそれと比較した。各試料について、ｍＲＮＡ存在量を、組織内で検出されたベクターゲノムの量に正規化した。ＥＧＦＰ，高感度緑色蛍光タンパク質；ｍｉＲＮＡ，マイクロＲＮＡ；ｎＬａｃＺ，β−ガラクトシダーゼレポーター導入遺伝子；ｑＲＴ−ＰＣＲ，定量的逆転写ＰＣＲ；ｒＡＡＶ，組み換えアデノ随伴ウイルス。 内因性ｍｉＲＮＡ−制御性ｒＡＡＶ発現用の分子モデルを表す。ｍｉＲＮＡ，マイクロＲＮＡ；ｒＡＡＶ，組み換えアデノ随伴ウイルス。 様々なＡＡＶベクターを形質導入した新生仔マウスの脳および脊髄内のＧＦＰ強度レベルの定量化を表す。１０の異なるＡＡＶベクターの４×１０１１ゲノムコピー（ＧＣ）を、浅静脈により新生仔Ｐ１仔に注射した。注射の２１日後にマウスを屠殺した。脳組織を摘出して厚さ４０μｍの低温切片を作製した。この切片を抗−ＥＧＦＰ抗体に対して染色した。画像を分析し、Ｎｉｋｏｎ ＮＩＳ ｅｌｅｍｅｎｔｓ ＡＲソフトウェア バージョン３．２を使用することにより、脳および脊髄（Ａ）における様々な領域内の全てのＡＡＶ血清型の強度／ピクセル値を算出した。様々なｒＡＡＶについて、脳領域および脊髄領域の平均強度も示した（Ｂ）。並列比較を確実にするために、全ベクターについて各解剖学的構造の対象領域（ＲＯＩ）を固定した。 ｒＡＡＶを静脈内注射した後の、新生仔マウス脳における強くかつ広範なＥＧＦＰ発現を表す。ｒＡＡＶ７、ｒＡＡＶ９、ｒＡＡＶｒｈ．１０、ｒＡＡＶｒｈ．３９およびｒＡＡＶｒｈ．４３の４×１０１１ゲノムコピー（ＧＣ）を、浅静脈により新生仔Ｐ１仔に注射した。注射の２１日後にマウスを屠殺した。脳組織を摘出して厚さ４０μｍの低温切片を作製した。この切片を抗−ＥＧＦＰ抗体に対して染色した。バーは、１００μｍを表す。示した領域は、嗅球、線条体、海馬、皮質、視床下部、小脳および延髄である。 ｒＡＡＶを静脈内注射した後の、新生仔マウス脊髄におけるＥＧＦＰ発現を表す。ｒＡＡＶ７、ｒＡＡＶ９、ｒＡＡＶｒｈ．１０、ｒＡＡＶｒｈ．３９およびｒＡＡＶｒｈ．４３の４×１０１１ＧＣを、浅静脈により新生仔Ｐ１仔に注射した。注射の２１日後にマウスを屠殺した。脊髄組織を摘出して厚さ４０μｍの低温切片を作製した。頚部、胸部および腰部由来の切片を、抗−ＥＧＦＰ抗体に対して染色した。バーは、１００μｍを表す。 血管内的に送達されたｒＡＡＶ１、ｒＡＡＶ２、ｒＡＡＶ６、ｒＡＡＶ６．２、ｒＡＡＶ７、ｒＡＡＶ９、ｒＡＡＶｒｈ．１０およびｒＡＡＶｒｈ．３９により形質導入された後根神経節におけるＥＧＦＰ発現を表す。新生仔はＰ１に４×１０１１ＧＣのｒＡＡＶを受け、注射後２１日に剖検した。ＥＧＦＰ（緑色）および神経細胞（ＮｅｕＮ，赤色）の二重免疫組織化学的染色用に、厚さ４０μｍの低温切片を処理した。バーは、７５μｍを示す。 ｒＡＡＶをＰ１新生仔に全身送達した後のマウスＣＮＳにおける形質導入細胞型の共焦点顕微鏡分析を表す。様々なｒＡＡＶで処置した動物の、厚さ４０μｍの脳切片および脊髄切片を、抗−ＥＧＦＰ抗体および細胞型特異的マーカーに対して共染色した。抗−ＮｅｕＮを使用して、神経細胞を染色した；抗−ＧＦＡＰを使用して、星状細胞を染色した；抗−カルビンジンを使用して、プルキンエ細胞を染色した；抗−ＣｈＡＴを使用して、運動ニューロンを染色した；抗−ＤＡＲＰＰを使用して、黒質におけるドーパミン作動性ニューロンを染色した。全てのｒＡＡＶを検査したが、各細胞型について、代表的な写真を１枚だけ本明細書に示した。 血管内的に送達されたｒＡＡＶによる、脳室構造の形質導入を表す。新生仔はＰ１に４×１０１１ＧＣのｒＡＡＶを受け、注射後２１日に剖検した。異なる脳室の脈絡叢は、組織処理中、首尾よく保存された。厚さ４０μｍの低温切片を抗−ＥＧＦＰ抗体に対して染色した。バーは、１００μｍを表す。 ｒＡＡＶベクターの純度および形態学的完全性の分析を表す。Ａ．この試験で使用したＣｓＣｌ勾配精製ｒＡＡＶＣＢＥＧＦＰベクターの、銀染色ＳＤＳ−Ｐａｇｅ分析。ｒＡＡＶ１、ｒＡＡＶ２、ｒＡＡＶ５、ｒＡＡＶ６、ｒＡＡＶ６．２、ｒＡＡＶ７、ｒＡＡＶ９、ｒＡＡＶｒｈ１０、ｒＡＡＶｒｈ３９およびｒＡＡＶｒｈ４３のそれぞれ約１．５×１０１０ウイルス粒子を、対応するレーンに負荷した。Ｂ．負染色組み換えＡＡＶビリオンの透過電子顕微鏡法。ｒＡＡＶビリオンを、用時調製した炭素被覆−Ｆｏｒｍｖａｒ支持膜上に塗り、透過顕微鏡法用に１％酢酸ウラニルで染色した。代表的なベクターロット由来のウイルス粒子の画像を、９２，０００×で撮って示した。 全身的に送達されたｒＡＡＶ１、ｒＡＡＶ６、ｒＡＡＶ６．２およびｒＡＡＶｒｈ４３による新生仔マウス後根神経節の形質導入を表す。新生仔はＰ１に４×１０１１ＧＣのｒＡＡＶを受け、注射後２１日に剖検した。厚さ４０μｍの低温切片を抗−ＥＧＦＰ抗体に対して染色した。バーは、７５μｍを示す。 血管内的に送達されたｒＡＡＶによる脳毛細血管の形質導入を表す。新生仔はＰ１に４×１０１１ＧＣのｒＡＡＶを受け、注射後２１日に剖検した。厚さ４０μｍの脳の低温切片を、（ａ）抗−ＥＧＦＰ抗体（ＡＡＶ１、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ．１０、ＡＡＶｒｈ．３９およびＡＡＶｒｈ．４３）；（ｂ）抗−ＥＧＦＰおよび抗−ＣＤ３４抗体（ｒｈ．１０のみ）に対して染色した。バーは、１００μｍを表す。 Ｐ１新生仔にｒＡＡＶを全身送達した後の、マウス脳における小膠細胞症の評価を表す。様々なｒＡＡＶで処置した動物の、厚さ４０μｍの脳切片を、抗−ＥＧＦＰ抗体および抗−ＩＢａ−１に対して共染色した。ｒＡＡＶｒｈ．１０の染色結果のみを示した。 Ｐ１新生仔にｒＡＡＶを全身送達した後の、マウスＣＮＳにおける自然のＥＧＦＰ発現を表す。新生仔はＰ１に４×１０１１ＧＣのｒＡＡＶを受け、注射後２１日に剖検した。厚さ４０μｍの低温切片を、免疫染色せずに、載せて顕微鏡下で観察した。各画像の露光時間を示した。 カナバン病における、ｒＡＡＶに基づいた遺伝子療法の効果を示す結果を表す。図３０Ａは、治療が、ＣＤマウスの足取りおよび運動機能を直したことを示す。図３０Ｂは、治療が、ＣＤマウスの網膜症を緩和し、視力を回復したことを示す。図３０Ｃは、処置ＣＤマウスにおけるＮＡＡレベルが、正常マウスおけるものに近づくことを示す。図３０Ｄは、ＣＤマウスの脳でＡＰＳＡ活性が検出されることを示す。図３０Ｅは、ＣＤマウスの脳でＡＰＳＡ発現が検出されることを示す。 図３１Ａは、処置マウスの脳および脊髄の両者における空胞形成は、より斑状でかつ多様であり、概してより小さいサイズの空胞であること、および大脳皮質の一部領域は、空胞形成をほとんど何も示さないことを表す。図３１Ｂは、大脳皮質原位置におけるＡＳＰＡ発現を表す。 様々な脳領域における空胞形成の定量的分析の結果を表す。図３２Ａは、遺伝子療法後に、白質変性の点で嗅球が劇的に緩和していたこと、および他の組織で大きい空胞が本質的に除去されていたことを表す。図３２Ｂは、脊髄切片に対する同様の分析結果を示す。 ＣＤマウスの腎臓の組織病理学的評価の結果を表す。図３３Ａは、腎臓の腎尿細管上皮は、びまん的に減弱することおよび未処置ＣＤマウスの尿細管内腔の拡大を示す。図３３Ｂは、処置ＣＤマウスが正常な糸球体を有していたことを表す。図３３Ｃおよび図３３Ｄは、ＩＶ送達後の腎臓形質導入の効率に関する、２つの有力候補ベクター（それぞれｒＡＡＶ９およびｒＡＡｒｈ．１０）の分析結果を表す。
本発明のある特定の実施態様の詳細な説明
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、細胞中で増殖するために、アデノウイルスまたはヘルペスウイルス等の、第２のウイルスの存在に依存する、小さい（２６ｎｍ）複製欠損、非エンベロープウイルスである。ＡＡＶ疾病を引き起こさないことが知られており、非常に穏やかな免疫応答を誘発する。ＡＡＶは、分裂細胞も非分裂細胞も感染させることができ、そのゲノムを宿主細胞のゲノムに組み込むことが可能である。本発明の態様は、組み換えＡＡＶに基づいた遺伝子移入を使用して、導入遺伝子を対象のＣＮＳ組織に送達する方法を提供する。したがって、ＣＮＳ関連の障害を治療するための方法および組成物が本明細書で提供される。本発明のさらなる態様は、対象のＣＮＳ組織全体にわたって広範な分布を達成するＡＡＶの発見に基づく。いくつかの実施態様で、ｒＡＡＶは、たとえば、髄腔内注射および／または脳内注射によって脳脊髄液（ＣＳＦ）中に直接投与した後、ＣＮＳ組織全体にわたって広がる。他の実施態様で、ｒＡＡＶは、静脈内投与後、血管脳関門を越えて対象のＣＮＳ組織全体にわたって広範な分布を達成する。このようなｒＡＡＶは、たとえば、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）およびカナバン病（ＣＤ）を含む、ＣＮＳ関連の障害の治療に有用である。
ＣＮＳ組織をターゲットするための方法および組成物
導入遺伝子を対象の中枢神経系（ＣＮＳ）組織に送達する方法が本明細書で提供される。本方法は一般に、対象で導入遺伝子を発現するための核酸ベクターを含むｒＡＡＶの有効量を対象に投与することを含む。ｒＡＡＶの「有効量」は、対象の標的組織の十分な数の細胞を感染させるのに十分な量である。ｒＡＡＶの有効量は、対象で治療効果を有するのに十分な量、たとえば、対象の寿命を延ばす、対象において疾病の１つ以上の症状、たとえば、ＡＬＳの症状、カナバン病の症状等を改善するのに十分な量であってもよい。場合によっては、ｒＡＡＶの有効量は、安定した体細胞トランスジェニック動物モデルを作るのに十分な量であってもよい。有効量は、たとえば、対象の種、年令、体重、健康状態、ターゲットされるＣＮＳ組織等の、種々の要因に左右され、したがって対象および組織によって異なるであろう。有効量は投与方法によっても左右されるであろう。たとえば、血管内注射によるＣＮＳ組織のターゲティングは、場合によっては、髄腔内注射または脳内注射によるＣＮＳ組織のターゲティングとは異なる（たとえば、より高い）用量を必要とする可能性がある。場合によっては、ｒＡＡＶの多回投与が行われる。有効量は使用されるｒＡＡＶによっても左右されるであろう。たとえば、ＣＮＳ組織をターゲットするための投与量は、ｒＡＡＶの血清型（たとえば、カプシドタンパク質）によって左右されるであろう。たとえば、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ｒｈ．１０、ｒｈ．３９、ｒｈ．４３およびＣＳｐ３からなる群から選択されるＡＡＶ血清型のカプシドタンパク質を有していてもよい。ある実施態様で、ｒＡＡＶの有効量は、ｋｇ当たり１０１０、１０１１、１０１２、１０１３、または１０１４ゲノムコピーである。ある実施態様で、ｒＡＡＶの有効量は、対象当たり１０１０、１０１１、１０１２、１０１３、１０１４、または１０１５ゲノムコピーである。
導入遺伝子を対象のＣＮＳ組織に送達する方法は、単一経路で、または複数の経路で、ｒＡＡＶを投与することを含むであろう。たとえば、対象のＣＮＳ組織への導入遺伝子送達は、血管脳関門を越えるｒＡＡＶの有効量を、静脈内投与によって対象に投与することを含んでもよい。対象のＣＮＳ組織への導入遺伝子の送達は、髄腔内投与または脳内投与によって、たとえば脳室内注射によって、ｒＡＡＶの有効量を対象に投与することを含んでもよい。導入遺伝子を対象のＣＮＳ組織に送達する方法は、２つの異なる投与経路で、たとえば、髄腔内投与と脳内投与で、ｒＡＡＶの有効量を同時投与することを含んでもよい。同時投与は、ほぼ同時に実施してもよく、異なる時間に実施してもよい。
ターゲットすべきＣＮＳ組織は、たとえば、皮質、海馬、視床、視床下部、小脳、脳幹、頚髄、胸髄、および腰髄から選択されてもよい。ＣＮＳ組織をターゲットする投与経路は、一般にＡＡＶ血清型により左右される。たとえば、ＡＡＶ血清型がＡＡＶ１、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ｒｈ．１０、ｒｈ．３９、ｒｈ．４３およびＣＳｐ３から選択されるある特定の場合には、投与経路は血管内注射であってもよい。場合によっては、たとえばＡＡＶ血清型がＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ｒｈ．１０、ｒｈ．３９、ｒｈ．４３およびＣＳｐ３から選択される場合には、投与経路は髄腔内注射および／または脳内であってもよい。
血管内投与
本明細書で使用されるとき、用語「血管内投与」は、対象の静脈循環系および動脈循環系を含む、対象の血管系への、作用剤、たとえば、ｒＡＡＶを含む組成物の、投与を指す。一般に、ＣＮＳ組織をターゲットするために、血管脳関門を越えるｒＡＡＶを、血管内投与により送達することが可能である。場合によっては、血管内（たとえば、静脈内）投与は、他の投与形態（たとえば、髄腔内、脳内）より大量の使用を容易にすることもある。したがって、血管内（たとえば、静脈内）投与によって、一度に大量のｒＡＡＶ（たとえば、最高１０１５ＧＣ／対象）を送達できる。血管内投与の方法は、当該技術分野で周知であり、たとえば、皮下注射針、末梢カテーテル、中心静脈ライン等の使用を含む。
髄腔内および／または脳内投与
本明細書で使用されるとき、用語「髄腔内投与」は、作用剤、たとえば、ｒＡＡＶを含む組成物の、脊柱管への投与を指す。たとえば、髄腔内投与は、脊柱管の頚部、脊柱管の胸部、または脊柱管の腰部における注射を含むであろう。一般に、髄腔内投与は、作用剤、たとえば、ｒＡＡＶを含む組成物を、脊柱管のくも膜と軟膜との間の領域である、脊柱管のくも膜下腔（ｓｕｂａｒａｃｈｎｏｉｄ ｃａｖｉｔｙ，ｓｕｂａｒａｃｈｎｏｉｄ ｓｐａｃｅ）に注射することにより実施される。くも膜下腔は、小柱（くも膜から伸びて軟膜に融合する繊細な結合組織フィラメント）からなる海綿状組織、および脳脊髄液が入っている相互通信チャネルで占められている。いくつかの実施態様で、髄腔内投与は、脊髄血管系への投与ではない。
本明細書で使用されるとき、用語「脳内投与」は、脳内および／または脳周辺への、作用剤の投与を指す。脳内投与は、大脳、延髄、脳橋、小脳、頭蓋腔、および脳を取り囲んでいる髄膜への、作用剤の投与を含むが、その限りではない。脳内投与は、脳の硬膜、くも膜、および軟膜への投与を含んでもよい。脳内投与は、いくつかの実施態様で、脳を取り囲んでいるくも膜下腔の脳脊髄液（ＣＳＦ）中への、作用剤の投与を含んでもよい。脳内投与は、いくつかの実施態様で、脳室、たとえば、右側脳室、左側脳室、第三脳室、第四脳室への、作用剤の投与を含んでもよい。いくつかの実施態様で、脳内投与は、脳血管系への投与ではない。
脳内投与は、脳内および／または脳周辺への直接注射を含んでもよい。いくつかの実施態様で、脳内投与は、定位手技を使用する注射を含む。定位手技は、当該技術分野で周知であり、一般に、注射をある特定の脳内領域、たとえば、脳室領域へと導くために一緒に使用されるコンピューターと三次元スキャニング装置の使用を含む。微量注射ポンプ（たとえば、Ｗｏｒｌｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）も使用することが可能である。いくつかの実施態様で、微量注射ポンプを使用して、ｒＡＡＶを含む組成物が送達される。いくつかの実施態様で、本組成物の注入速度は１μｌ／分〜１００μｌ／分の範囲内である。熟練技術者には十分に理解されるであろうが、注入速度は、たとえば、対象の種、対象の年齢、対象の体重／サイズ、ＡＡＶの血清型、必要な用量、ターゲットされる脳内領域等を含む、種々の要因に左右されるであろう。したがって、ある特定の状況で、他の注入速度が適切であると、熟練技術者が考えることもある。
ＣＮＳ関連の障害を治療するための方法および組成物
ＣＮＳ関連の障害を治療するための方法および組成物が本明細書で提供される。本明細書で使用されるとき、「ＣＮＳ関連の障害」は、中枢神経系の疾患や病態である。ＣＮＳ関連の障害は、脊髄（たとえば、脊髄症）、脳（たとえば、脳症）または脳および脊髄を取り囲んでいる組織を冒す可能性がある。ＣＮＳ関連の障害は、遺伝性であれ、体細胞の突然変異を介して獲得されたのであれ、遺伝的原因による可能性がある。ＣＮＳ関連の障害は、心理状態または心理的障害、たとえば、注意欠陥多動性障害、自閉症スペクトラム障害、気分障害、統合失調症、抑鬱、レット症候群等であってもよい。ＣＮＳ関連の障害は自己免疫障害であってもよい。ＣＮＳ関連の障害はまた、ＣＮＳの癌、たとえば、脳腫瘍であってもよい。癌であるＣＮＳ関連の障害は、ＣＮＳの原発癌、たとえば、星状細胞腫、膠芽腫等であってもよく、またＣＮＳ組織に転移した癌、たとえば、脳に転移した肺癌であってもよい。ＣＮＳ関連障害の、さらなる非限定的な例としては、パーキンソン病、リソソーム蓄積症、虚血、神経因性疼痛、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、多発性硬化症（ＭＳ）、およびカナバン病（ＣＤ）等がある。
治療を必要としている対象における筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を治療する方法が、本明細書で提供される。ＡＬＳの治療を必要としている対象は、ＡＬＳに罹患しているかまたはＡＬＳに罹患していると疑われる対象である。場合によって、ＡＬＳは、スーパーオキシドジスムターゼをコードしている遺伝子（ＳＯＤ１）の突然変異と関連づけられてきた。高レベルのＳＯＤ１は、場合によってＡＬＳと関連があるようである。ＳＯＤ１に対するｓｈＲＮＡのトランスジェニック発現は、変異ＳＯＤ１発現をノックダウンし、疾患発症を遅らせ、生存期間を延ばせることが証明されている（Xia et al.2006,Neurobiol Dis 23:578）。疾患発症時にＳＯＤ１に対してｓｉＲＮＡを髄腔内注入することにより、変異体ＳＯＤ１発現をノックダウンし、生存期間を延ばすことも分かっている（Wang et al.2008,JBC 283:15845）。さらに、疾患発症時に、ＳＯＤ１に対して、ｓｈＲＮＡを発現するアデノウイルスの神経注射をすることにより、変異ＳＯＤ１発現をノックダウンして生存期間を延ばすことができる（Wu et al.2009,Antiox Redox Sig 11:1523）。
本発明の態様は、対象のＣＮＳ組織全体にわたって広範であるＳＯＤ１発現を、低毒性で、長期抑制するＡＡＶに基づいた治療法の発見に基づく。本明細書で提供されるＡＬＳを治療する方法は一般に、ＳＯＤ１ ｍＲＮＡに特異的に結合して（たとえば、配列番号１７または１９で示される配列を有する核酸に特異的にハイブリダイズして）対象のＳＯＤ１の発現を抑制する抑制性ＲＮＡをコードしている領域と操作可能に連結されたプロモーターを含む核酸を持つｒＡＡＶの有効量を対象のＣＮＳ組織に投与することを含む。配列番号９で示される配列を含むカプシドタンパク質を有するｒＡＡＶは、髄腔内注射および／または脳内注射後、ＣＮＳ全体にわたって広範な分布を達成し、したがってＡＬＳの治療に特に有用であることが分かっている。注射部位のごく近傍内のみの細胞を感染させる、すなわち髄腔内注射後、限られた分布のみを達成する、ある種のｒＡＡＶに照らして、この結果は意外である。したがって、ＣＮＳ全体にわたって広範な分布を達成するｒＡＡＶは、ＡＬＳを治療するための遺伝子移入ベクターとして特に有用である。
いくつかの実施態様で、配列番号９で示される配列を含むカプシドタンパク質およびＳＯＤ１ ｍＲＮＡに特異的に結合してＳＯＤ１の発現を抑制する抑制性ＲＮＡをコードしている領域と操作可能に連結されたプロモーターを含む核酸を有するｒＡＡＶの髄腔内注射および脳内注射、たとえば、脳室内注射による同時投与は、ＡＬＳの動物モデルで、ＳＯＤ１の長期抑制を達成し、転帰（たとえば、寿命）を改善することが分かっている（たとえば、図６Ａ参照）。いくつかの実施態様で、抑制性ＲＮＡは、アンチセンスＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはｍｉＲＮＡである。抑制性ＲＮＡは配列番号２６で示される配列を有してもよい。抑制性ＲＮＡは、配列番号２２〜３０のいずれか１つで示される配列を有してもよい。したがって、いくつかの実施態様で、配列番号２２〜３０のいずれか１つで示される配列を有する核酸と操作可能に連結されたプロモーターを含む核酸が提供される。いくつかの実施態様で、配列番号２２〜３０のいずれか１つで示される配列を含む核酸を持つ組み換えＡＡＶが提供される。組み換えＡＡＶは、配列番号９で示される配列を含むカプシドタンパク質を有していてもよい。組み換えＡＡＶは、配列番号１〜１２のいずれか１つで示される配列を含むカプシドタンパク質を有していてもよい。
治療を必要としている対象におけるカナバン病（ＣＤ）を治療する方法が、本明細書で提供される。ＣＤの治療を必要としている対象は、ＣＤに罹患しているかＣＤに罹患していると疑われる対象である。カナバン病は、酵素アスパルトアシラーゼの産生に関与する欠陥ＡＳＰＡ遺伝子に起因する。この酵素は通常、濃縮された脳分子Ｎ−アセチルアスパラギン酸を分解する。ＣＤに罹患した対象のアスパルトアシラーゼ活性低下は、Ｎ−アセチルアスパラギン酸の正常な分解を妨げ、また分解の欠如は脳内の神経線維のミエリン鞘の成長を妨害するようである。カナバン病の症状は、乳児期早期に現れて急速に進行する可能性があり、精神遅滞、以前に獲得した運動技能の喪失、摂食困難、筋緊張異常（すなわち、弛緩または硬直）、首のすわりが悪いこと、および巨大頭蓋症（異常に拡張した頭）などが含まれるであろう。麻痺、失明、または発作も起こることがある。本発明の態様は、アスパルトアシラーゼ（ＡＳＰＡ）を発現する核酸を持つ組み換えＡＡＶを対象に投与することによって、対象のＣＤの１つ以上の症状を改善する。たとえば、治療を必要としている対象におけるカナバン病を治療する方法は、血管内投与により、対象のＣＮＳ組織にｒＡＡＶの有効量を投与することを含んでもよく、ここでｒＡＡＶは、ＡＳＰＡをコードしている領域（たとえば、配列番号１４または１６で示される配列を有する領域）と操作可能に連結されたプロモーターを含む核酸を含む。治療を必要としている対象におけるカナバン病を治療する方法は、髄腔内投与により、対象のＣＮＳ組織にｒＡＡＶの有効量を投与することを含んでもよく、ここでｒＡＡＶは、ＡＳＰＡをコードしている領域と操作可能に連結されたプロモーターを含む核酸を含む。場合によっては、ＣＤを治療する方法は、対象のＣＮＳ組織に、ＡＡＶ血清型２のカプシドタンパク質以外（たとえば、配列番号２で示されるようなアミノ酸配列を有するタンパク質以外）のカプシドタンパク質およびＡＳＰＡをコードしている領域と操作可能に連結されたプロモーターを含む核酸を含むｒＡＡＶの有効量を投与することを含む。別の例で、治療を必要としている対象におけるカナバン病を治療する方法は、脳内投与以外の経路により、ｒＡＡＶの有効量を対象のＣＮＳ組織に投与することを含み、ここでｒＡＡＶは、ＡＳＰＡをコードしている領域と操作可能に連結されたプロモーターを含む核酸を含む。いくつかの実施態様で、ｒＡＡＶの投与後、ＣＮＳ組織で発現されるＡＳＰＡは、ＣＮＳ組織中のアスパルトアシラーゼ活性の低下およびＮ−アセチルアスパラギン酸の分解をもたらす。したがって、いくつかの実施態様で、配列番号１４または１６で示される配列をコードしている核酸を含む組み換えＡＡＶベクターが提供される。いくつかの実施態様で、配列番号１４または１６で示される配列を有する領域と操作可能に連結されたプロモーターを含む核酸を持つ組み換えＡＡＶが提供される。いくつかの実施態様で、配列番号１３または１５で示される配列を有するタンパク質をコードしている領域と操作可能に連結されたプロモーターを含む核酸を持つ組み換えＡＡＶが提供される。組み換えＡＡＶは、配列番号１〜１２のいずれか１つで示されるようなアミノ酸配列を含むカプシドタンパク質を有していてもよい。組み換えＡＡＶは、配列番号１および３〜１２のいずれか１つで示される配列を含むカプシドタンパク質を有していてもよい。
組み換えＡＡＶ
いくつかの態様で、本発明は単離されたＡＡＶを提供する。ＡＡＶに関して本明細書で使用されるとき、用語「単離された」は、その自然環境から（たとえば、宿主細胞、組織、または対象から）単離されているかまたは人為的に作り出されたＡＡＶを指す。単離されたＡＡＶは、組み換え方法を使用して作り出すことが可能である。このようなＡＡＶを、本明細書では「組み換えＡＡＶ」と呼ぶ。組み換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）は好ましくは、ｒＡＡＶの導入遺伝子が１つ以上の所定の組織に特異的に送達されるように、組織特異的ターゲティング能を有する。ＡＡＶカプシドは、これらの組織特異的ターゲティング能を決定する上で重要な要素である。したがって、ターゲットしようとしている組織に適したカプシドを有するｒＡＡＶを選択できる。いくつかの実施態様で、ｒＡＡＶは、配列番号１〜１２のいずれか１つで示されるようなアミノ酸配列を有するカプシドタンパク質か、またはそれと実質的な相同性を有するタンパク質を含む。
所望のカプシドタンパク質を有する組み換えＡＡＶを得る方法は当該技術分野で周知である（たとえば、米国特許出願公開第２００３／０１３８７７２号明細書（その内容全体を参照により本明細書に援用する）参照）。本発明のｒＡＡＶで使用することが可能なＡＡＶカプシドタンパク質としては、たとえば、G.Gao,et al., J.Virol, 78(12):6381-6388(June 2004)；G.Gao,et al,Proc Natl Acad Sci USA, 100(10):6081-6086(May 13,2003)；米国特許出願公開第２００３−０１３８７７２号明細書、米国特許出願公開第２００７／００３６７６０号明細書、米国特許出願公開第２００９／０１９７３３８号明細書、２００９年５月２８日出願の米国仮特許出願第６１／１８２，０８４号明細書（ＡＡＶカプシドタンパク質および関連のヌクレオチドおよびアミノ酸配列と関係したその内容を、参照により本明細書に援用する）に開示されているものなどがある。一般に、本方法は、ＡＡＶカプシドタンパク質をコードしている核酸配列（たとえば、配列番号１〜１２のいずれか１つで示される配列を有するタンパク質をコードしている核酸）またはそのフラグメント；機能性ｒｅｐ遺伝子；ＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）および導入遺伝子からなる組み換えＡＡＶベクター；および組み換えＡＡＶベクターをＡＡＶカプシドタンパク質にパッケージすることを可能にするために十分なヘルパー機能；を含む宿主細胞を培養することを含む。
ｒＡＡＶベクターをＡＡＶカプシドにパッケージするために、宿主細胞中の培養されるべき構成要素を、トランスに宿主細胞に提供することが可能である。あるいは、所要の構成要素（たとえば、組み換えＡＡＶベクター、ｒｅｐ配列、ｃａｐ配列、および／またはヘルパー機能）のいずれか１つ以上を、当業者に周知の方法を使用して所要の構成要素の１つ以上を含むように操作された安定した宿主細胞により提供してもよい。最適なことは、このような安定した宿主細胞が、誘導性プロモーターの制御下にある所要の構成要素を含む。しかし、所要の構成要素は、構成的プロモーターの制御下にあってもよい。好適な誘導性プロモーターおよび構成的プロモーターの例を、本明細書の、導入遺伝子と共に使用するのに適した制御要素に関する論考に提供する。また別の代替例で、選択される安定した宿主細胞は、構成的プロモーターの制御下にある選択された構成要素および、１つ以上の誘導性プロモーターの制御下にある他の選択された構成要素を含んでもよい。たとえば、２９３細胞（構成的プロモーターの制御下にあるＥ１ヘルパー機能を含む）に由来するが、誘導性プロモーターの制御下にあるｒｅｐタンパク質および／またはｃａｐタンパク質を含む、安定した宿主細胞を生成することが可能である。当業者は、さらに他の安定した宿主細胞を生成することが可能である。
本発明のｒＡＡＶを生じさせるために必要な組み換えＡＡＶベクター、ｒｅｐ配列、ｃａｐ配列、およびルパー機能を、適切な遺伝要素（ベクター）を使用してパッケージング宿主細胞に送達することが可能である。選択された遺伝要素を、本明細書に記載の方法を含む、好適な方法で送達することが可能である。本発明の実施態様を構築するために使用される方法は、核酸操作技術を持つ者に知られており、また遺伝子工学、組み換え工学、および合成的技法を含む。たとえば、Sambrook et al,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,N.Y.を参照されたい。同様に、ｒＡＡＶビリオンを生成する方法は周知であり、また好適な方法の選択は、本発明に対する制限ではない。たとえば、K.Fisher et al,J.Virol.,70:520-532(1993)および米国特許第５，４７８，７４５号明細書を参照されたい。
いくつかの実施態様で、（たとえば、米国特許第６，００１，６５０号明細書（三重形質移入方法に関するその内容を、参照により本明細書に援用する）に詳細に記述されているような）三重形質移入方法を使用して組み換えＡＡＶを生じさせることが可能である。一般に、ＡＡＶ粒子にパッケージされる（導入遺伝子を含む）組み換えＡＡＶベクター、ＡＡＶヘルパー機能ベクター、および補助機能ベクターを含む組み換えＡＡＶは、宿主細胞を形質移入することによって生じさせる。ＡＡＶヘルパー機能ベクターは、増殖的ＡＡＶ複製およびカプシド形成に関してトランスに機能する、「ＡＡＶヘルパー機能」配列（すなわち、ｒｅｐおよびｃａｐ）をコードする。好ましくは、ＡＡＶヘルパー機能ベクターは、検出可能な野生型ＡＡＶビリオン（すなわち、機能性ｒｅｐ遺伝子および機能性ｃａｐ遺伝子を含むＡＡＶビリオン）を生成せずに、効率的なＡＡＶベクター産生を支援する。本発明と共に使用するのに好適なベクターの非限定的な例としては、米国特許第６，００１，６５０号明細書に記載のｐＨＬＰ１９、および米国特許第６，１５６，３０３号明細書に記載のｐＲｅｐ６ｃａｐ６ベクターなどがあり、両者の全内容を参照により本明細書に援用する。補助機能ベクターは、ＡＡＶが、複製を依存している非ＡＡＶ由来のウイルス機能および／または細胞機能（すなわち、「補助機能」）のためのヌクレオチド配列をコードする。補助機能は、ＡＡＶ遺伝子転写の活性化に関与する部分、段階特異的ＡＡＶｍＲＮＡスプライシングに関与する部分、ＡＡＶＤＮＡ複製に関与する部分、ｃａｐ発現生成物の合成に関与する部分、およびＡＡＶカプシド組み立てに関与する部分を含むがこれに限定されない、ＡＡＶ複製に必要な機能を含む。ウイルスに基づいた補助機能は、アデノウイルス、ヘルペスウイルス（単純ヘルペスウイルス１型以外）、およびワクシニアウイルス等の、既知のヘルパーウイルスのいずれからも誘導することができる。
いくつかの態様で、本発明は形質移入された宿主細胞を提供する。用語「形質移入」は、細胞による外来ＤＮＡの取り込みに言及するために使用され、外因性ＤＮＡが細胞膜の内側に導入されている時、細胞は「形質移入されている」。多くの形質移入技法が、当該技術分野で一般に知られている。たとえば、Graham et al.(1973)Virology,52:456、Sambrook et al.(1989)Molecular Cloning,a laboratory manual,Cold Spring Harbor Laboratories, New York、Davis et al.(1986)Basic Methods in Molecular Biology,Elsevier、およびChu et al.(1981)Gene 13:197を参照されたい。このような技法を使用して、１つ以上の外因性核酸、たとえばヌクレオチド組み込みベクターや他の核酸分子等を、好適な宿主細胞に導入することができる。
「宿主細胞」は、対象の物質を持つか、または持つことができる、細胞を指す。多くの場合、宿主細胞は哺乳類細胞である。宿主細胞を、ＡＡＶヘルパー構築物、ＡＡＶミニ遺伝子プラスミド、補助機能ベクター、または組み換えＡＡＶの産生と関連した他のトランスファーＤＮＡのレシピエントとして使用することが可能である。この用語は、形質移入されている原細胞の子孫を含む。したがって、本明細書で使用されるとき、「宿主細胞」は外因性ＤＮＡ配列で形質移入されている細胞を指すこともある。単一親細胞の子孫が、自然突然変異、偶発的突然変異または計画的突然変異のために、形態の点で、あるいはゲノムＤＮＡ補体または全ＤＮＡ補体の点で、元の親と必ずしも完全に同一であるとは限らないと理解される。
いくつかの態様で、本発明は単離された細胞を提供する。細胞に関して本明細書で使用されるとき、用語「単離された」は、その自然環境から（たとえば、組織または対象から）単離されている細胞を指す。本明細書で使用されるとき、用語「細胞株」は、インビトロで連続的なまたは長期に及ぶ増殖および分裂ができる細胞の個体群を指す。多くの場合、細胞株は１つの前駆細胞に由来するクローン集団である。さらに、このようなクローン集団の保管中またはトランスファー中に、核型の自然変化または誘起変化が起こり得ることは、当該技術分野で知られている。したがって、言及の細胞株に由来する細胞は、祖先細胞または祖先培養と精確に同一でないこともあり、また言及の細胞株はこのような変異形を含む。本明細書で使用されるとき、用語「組み換え細胞」は、生物学的に活性なポリペプチドの転写またはＲＮＡ等の生物学的に活性な核酸の産生を招くＤＮＡセグメント等の、外因性ＤＮＡセグメントが中に導入されている細胞を指す。
本明細書で使用されるとき、用語「ベクター」は、適当な調節要素と関連しているとき複製することができ、細胞間で遺伝子配列をトランスファーできる、たとえばプラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、染色体、人工染色体、ウイルス、ビリオン等々の遺伝要素を含む。したがって、本用語はクローニング媒体、発現媒体、ならびにウイルスベクターを含む。いくつかの実施態様で、有用なベクターは、転写される核酸セグメントが、プロモーターの転写調節下に置かれているベクターであると考えられる。「プロモーター」は、遺伝子の特異的転写の開始に必要な、細胞の合成装置によって認識されるＤＮＡ配列、または合成装置に導入されるＤＮＡ配列を指す。句「効果を生むように置かれた」、「調節下」または「転写調節下」は、プロモーターが、ＲＮＡポリメラーゼ開始および遺伝子の発現を調節するための核酸に関して正しい位置および方向にあることを意味する。用語「発現ベクターまたは発現構築物」は、配列をコードしている核酸の一部または全部が転写され得る核酸を含むあらゆるタイプの遺伝子構築物を意味する。いくつかの実施態様で、発現は、たとえば、生物学的に活性なポリペプチド産物または抑制性ＲＮＡ（たとえば、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ）を、転写された遺伝子から生成するための核酸の転写を含む。
本発明のｒＡＡＶを作りだすために、組み換えベクターを所望のＡＡＶカプシドにパッケージするための前述の方法は、限定を意味するものではなく、他の好適な方法は熟練技術者に明らかになるであろう。
組み換えＡＡＶベクター
本発明の「組み換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクター」は一般に、最低限で、導入遺伝子およびその制御配列、ならびに５’および３’ＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）からなる。カプシドタンパク質にパッケージされ、選択された標的細胞に送達されるのは、この組み換えＡＡＶベクターである。いくつかの実施態様で、導入遺伝子は、対象の、ポリペプチド、タンパク質、機能性ＲＮＡ分子(たとえば、ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡインヒビター)または他の遺伝子産物をコードする、ベクター配列に非相同な核酸配列である。核酸コード配列は、標的組織の細胞で導入遺伝子転写、翻訳、および／または発現を可能にする方法で、効果を生むように制御構成要素に連結される。
ベクターのＡＡＶ配列は一般に、シス作用性の５’逆方向末端反復配列および３’逆方向末端反復配列を含む（たとえば、B.J.Carter,in“Handbook of Parvoviruses”, ed., P.Tijsser, CRC Press,pp.155 168(1990)参照）。ＩＴＲ配列は、長さ約１４５ｂｐである。好ましくは、ＩＴＲをコードしている実質的に全配列が分子に使用されるが、こうした配列のある程度の軽微な改変は許容される。こうしたＩＴＲ配列を改変する能力は、当該技術分野の技術の範囲内である。（たとえば、Sambrook et al,「Molecular Cloning.A Laboratory Manual」,2d ed.,Cold Spring Harbor Laboratory,New York(1989)；およびK.Fisher et al.,J Virol.,70:520 532(1996)等のテキスト参照）。本発明で使用されるこのような分子の一例は、選択される導入遺伝子配列および関連制御要素に、５’ＡＡＶ ＩＴＲ配列および３’ＡＡＶ ＩＴＲ配列が隣接している、導入遺伝子を含む「シス作用性」プラスミドである。ＡＡＶ ＩＴＲ配列は、現在同定されている哺乳類ＡＡＶ型を含む、既知のＡＡＶから得ることが可能である。
組み換えＡＡＶベクターのために上で同定された主要な要素に加えて、ベクターは、プラスミドベクターで形質移入されるかまたは本発明によって作り出されたウイルスに感染した細胞において、転写、翻訳および／または発現を可能にする方法で導入遺伝子に操作可能に連結された、従来の調節要素も含む。本明細書で使用されるとき、「操作可能に連結された」配列は、対象の遺伝子と連続している発現調節配列および、トランスに作用するかまたは対象の遺伝子を調節する距離で作用する発現調節配列の両者を含む。発現調節配列は、適切な転写開始配列、転写終結配列、プロモーター配列およびエンハンサー配列；たとえばスプライシング信号やポリアデニル化（ｐｏｌｙＡ）信号等の、効率的ＲＮＡプロセシング信号；細胞質ｍＲＮＡを安定させる配列；翻訳効率を高める配列（すなわち、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列）；タンパク質安定性を高める配列；および必要に応じて、コードされた産物の分泌を高める配列を、含む。天然プロモーター、構成的プロモーター、誘導性プロモーターおよび／または組織特異的プロモーターを含む、多くの発現調節配列が当該技術分野で知られており、また利用することが可能である。
本明細書で使用されるとき、核酸配列（たとえば、コード配列）および制御配列は、核酸配列の発現または転写を制御配列の影響下または調節下に置くという方法で共有結合しているとき、操作可能に連結されていると言われる。核酸配列が機能性タンパク質に翻訳されることが望ましい場合、５’制御配列におけるプロモーターの誘導が、コード配列の転写をもたらすのであれば、また２つのＤＮＡ配列間の連結の性質が、（１）結果的にフレームシフト突然変異の導入を招かない、（２）プロモーター領域の、コード配列の転写を指令する能力を妨げない、または（３）対応するＲＮＡ転写物の、タンパク質に翻訳される能力を妨げないのであれば、２つのＤＮＡ配列は操作可能に連結されていると言われる。したがって、プロモーター領域が、結果として生じる転写物を所望のタンパク質またはポリペプチドに翻訳できるというように、ＤＮＡ配列の転写を遂行できたのであれば、プロモーター領域は、核酸配列に操作可能に連結されたのであろう。同様に、２つ以上のコード領域は、共通プロモーターからのそれらの転写が、フレームで翻訳された２つ以上のタンパク質の発現をもたらすという方法で連結されるとき、操作可能に連結される。いくつかの実施態様で、操作可能に連結されたコード配列は、融合タンパク質を産する。いくつかの実施態様で、操作可能に連結されたコード配列は、機能性ＲＮＡ（たとえば、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ）を産する。
タンパク質をコードしている核酸では、概してポリアデニル化配列は、導入遺伝子配列の後でかつ３’ＡＡＶ ＩＴＲ配列の前に挿入される。本発明で有用なｒＡＡＶ構築物は、望ましくはプロモーター／エンハンサー配列と導入遺伝子との間に位置する、イントロンも含んでもよい。１つの可能なイントロン配列はＳＶ−４０に由来し、ＳＶ−４０ Ｔイントロン配列と呼ばれる。使用することが可能な別のベクター要素は、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）である。ＩＲＥＳ配列を使用して、単一遺伝子転写物から２つ以上のポリペプチドが産生される。ＩＲＥＳ配列を使用すれば、２つ以上のポリペプチド鎖を含むタンパク質が産生されるであろう。これらおよび他の共通ベクター要素の選択は定型的であり、多くのそのような配列は入手できる［たとえば、Sambrook et al,およびその中で、たとえば３．１８ ３．２６ページおよび１６．１７ １６．２７ページに引用の参考文献、ならびにAusubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,New York,1989参照］。いくつかの実施態様で、口蹄疫ウイルス２Ａ配列がポリプロテインに含まれる；これは、ポリプロテインの切断を仲介することが証明されている小ペプチド（長さ約１８アミノ酸）である（Ryan,M D et al.,EMBO,1994;4:928-933；Mattion,N M et al.,J Virology,November 1996;p.8124-8127；Furler,S et al.,Gene Therapy, 2001; 8:864-873;およびHalpin,C et al.,The Plant Journal,1999;4:453-459）。２Ａ配列の切断活性は、プラスミド類および遺伝子療法ベクター類（ＡＡＶおよびレトロウイルス）を含む人工システムで以前に証明されている（Ryan,M D et al.,EMBO,1994;4:928-933；Mattion,N M et al.,J Virology,November 1996;p.8124-8127；Furler,S et al.,Gene Therapy,2001;8:864-873;およびHalpin,C et al.,The Plant Journal,1999;4:453-459；de Felipe,P et al.,Gene Therapy,1999;6:198-208；de Felipe,P et al.,Human Gene Therapy,2000;11:1921-1931.；およびKlump,H et al.,Gene Therapy,2001;8:811-817）。
宿主細胞における遺伝子発現に必要な制御配列の精確な性質は、種、組織または細胞型の間で異なる可能性があるが、一般に、必要に応じて、それぞれ転写の開始と翻訳の開始と関係がある５’非転写配列および５’非翻訳配列、たとえばＴＡＴＡボックス、キャッピング配列、ＣＡＡＴ配列、エンハンサー要素等々を含むものとする。特に、そのような５’非転写制御配列は、操作可能に結合された遺伝子の転写調節のためのプロモーター配列を含むプロモーター領域を含むであろう。制御配列は、必要に応じて、エンハンサー配列または上流活性化配列も含んでもよい。本発明のベクターは、任意選択的に５’リーダー配列または信号配列を含んでもよい。適切なベクターの選択および設計は、当業者の能力および裁量の範囲内である。
構成的プロモーターの例としては、レトロウイルスのラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター（任意選択的にＲＳＶエンハンサーを含む）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（任意選択的にＣＭＶエンハンサーを含む）［たとえば、Boshart et al,Cell,41:521-530(1985)参照］、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、β−アクチンプロモーター、ホスホグリセロキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、およびＥＦ１αプロモーター［Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ］などがあるが、これに限定されない。
誘導性プロモーターは、遺伝子発現の制御を可能にし、また外的に供給される化合物、温度等の環境因子、または特定の生理学的状態の存在、たとえば、急性期、細胞のある特定の分化状態、または複製中の細胞のみ、によって制御され得る。誘導性プロモーターおよび誘導系は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣｌｏｎｔｅｃｈおよびＡｒｉａｄ等を含むが、これに限定されない、種々の商業的供給源から入手できる。多くの他の系は、記述されており、また当業者により容易に選択され得る。外的に供給されるプロモーターによって制御される誘導性プロモーターの例としては、亜鉛誘導性ヒツジメタロチオニン（ＭＴ）プロモーター、デキサメタゾン（Ｄｅｘ）−誘導性マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、Ｔ７ポリメラーゼプロモーター系（国際公開第９８／１００８８号パンフレット）；エクジソン昆虫プロモーター（No et al,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,93:3346-3351(1996)）、テトラサイクリン抑制系（Gossen et al,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:5547-5551(1992)）、テトラサイクリン誘導系（Gossen et al,Science,268:1766-1769(1995)、Harvey et al,Curr.Opin.Chem.Biol.,2:512-518(1998)も参照）、ＲＵ４８６−誘導系（Wang et al,Nat.Biotech.,15:239-243(1997)およびWang et al,Gene Ther.,4:432-441(1997)）およびラパマイシン誘導系（Magari et al,J.Clin.Invest.,100:2865-2872(1997)）などがある。この関連で有用な可能性がある、さらに他の誘導性プロモーターは、特定の生理学的状態、たとえば、温度、急性期、細胞のある特定の分化状態、または複製中の細胞のみ、によって制御されるものである。
別の実施態様で、天然プロモーター、またはそのフラグメントが、導入遺伝子用に使用されるであろう。導入遺伝子の発現が天然の発現によく似ていることが望ましい時、天然プロモーターが好ましいこともある。導入遺伝子の発現を、時間的にまたは発生的に、あるいは組織特異的方法で、または特異的転写刺激に応答して、制御しなければならないとき、天然プロモーターを使用することが可能である。さらなる実施態様で、他の天然発現調節要素、たとえばエンハンサー要素、ポリアデニル化部位またはＫｏｚａｋコンセンサス配列を使用して天然の発現を模倣することも可能である。
いくつかの実施態様で、制御配列は、組織特異的遺伝子発現能を与える。場合によって、組織特異的制御配列は、組織特異的方法で転写を誘導する組織特異的転写因子を結合する。このような組織特異的制御配列（たとえば、プロモーター、エンハンサー等）は、当該技術分野で周知である。例示的な組織特異的制御配列としては、以下の組織特異的プロモーターなどがあるが、これに限定されない：ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）プロモーター（Andersen et al.,Cell.Mol.Neurobiol.,13:503-15(1993)）、ニューロフィラメント軽鎖遺伝子プロモーター（Piccioli et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88:5611-5(1991)）、およびニューロン特異的ｖｇｆ遺伝子プロモーター（Piccioli et al.,15:373-84(1995)）等のニューロン性。いくつかの実施態様で、組織特異的プロモーターは、ニューロン核（ＮｅｕＮ）、グリア線性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）、大腸腺腫症（ＡＰＣ）、およびイオン化カルシウム結合アダプター分子１（Ｉｂａ−１）から選択される遺伝子のプロモーターである。他の適切な組織特異的プロモーターは熟練技術者に明らかになるであろう。いくつかの実施態様で、プロモーターはニワトリβ−アクチンプロモーターである。
いくつかの実施態様で、導入遺伝子を持つ対象の１つ以上の組織、たとえば、非ＣＮＳ組織における導入遺伝子の発現を抑制するために、ｍｉＲＮＡ用の１つ以上の１つ以上の結合部位が、ｒＡＡＶベクターの導入遺伝子に組み込まれる。熟練技術者は、結合部位を選択して組織特異的方法で導入遺伝子の発現を調節することが可能なことを、十分に理解するであろう。たとえば、肝臓で、導入遺伝子から発現されるｍＲＮＡがｍｉＲ−１２２に結合してｍｉＲ−１２２により抑制されるようにｍｉＲ−１２２用の結合部位を組み込むことによって、肝臓における導入遺伝子の発現を抑制することが可能である。心臓で、導入遺伝子から発現されるｍＲＮＡがｍｉＲ−１３３ａまたはｍｉＲ−１に結合してｍｉＲ−１３３ａまたはｍｉＲ−１によって抑制されるようにｍｉＲ−１３３ａまたはｍｉＲ−１用の結合部位を組み込むことによって、心臓における導入遺伝子の発現を抑制することが可能である。ｍＲＮＡのｍｉＲＮＡ標的部位は、５’ＵＴＲ内、３’ＵＴＲまたはコード領域内であってもよい。一般に、標的部位はｍＲＮＡの３’ＵＴＲ内である。さらに、多様なｍｉＲＮＡが、同一部位または多様な部位を認識することによってｍＲＮＡを制御するように、導入遺伝子を設計することが可能である。多様なｍｉＲＮＡ結合部位が存在することは、多様なＲＩＳＣの共同作用をもたらし、極めて効率的に発現を抑制する。標的部位配列は、総計５〜１００、１０〜６０、またはそれより多いヌクレオチドを含んでもよい。標的部位配列は、標的遺伝子結合部位の配列の少なくとも５ヌクレオチドを含んでもよい。
導入遺伝子コード配列：ＣＮＳ関連遺伝子
ｒＡＡＶベクターの導入遺伝子配列の組成は、結果として生じるベクターの用途によって異なるであろう。たとえば、ある種の導入遺伝子配列は、発現に際して検出可能な信号を生じるレポーター配列を含む。別の例で、導入遺伝子は治療用タンパク質または治療用機能性ＲＮＡをコードしている。別の例で、導入遺伝子は、調査研究目的に、たとえば、導入遺伝子を持つ体細胞トランスジェニック動物モデルを作るために、たとえば、導入遺伝子産物の機能を研究するために、使用されることを目的とするタンパク質または機能性ＲＮＡをコードする。別の例で、導入遺伝子は、疾病の動物モデルを作るために使用されることを目的とするタンパク質または機能性ＲＮＡをコードする。適切な導入遺伝子コード配列は熟練技術者に明らかになるであろう。
いくつかの態様で、本発明は、哺乳動物における１つ以上の遺伝子欠損（たとえば、遺伝性遺伝子欠損、体細胞遺伝子変化）、たとえば、対象でポリペプチド欠乏やポリペプチド過剰を招く結果となる遺伝子欠損等を、予防または治療する方法で使用するためのｒＡＡＶベクター、特に、細胞および組織で、このようなポリペプチドの欠乏と関係したＣＮＳ関連障害を表している対象における欠乏を治療したり、その重症度または程度を低下させるための、ｒＡＡＶベクターを提供する。いくつかの実施態様で、方法は、薬学的に許容できる担体中の、１つ以上の治療用のペプチド、ポリペプチド、ｓｈＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、アンチセンスヌクレオチド等々をコードするｒＡＡＶベクターを、ＣＮＳ関連障害を有するかまたは有すると疑われる対象におけるそのような障害を治療するのに十分な量および期間、対象に投与することを含む。
ｒＡＡＶベクターは、ＣＮＳ関連障害を調整または治療するタンパク質または機能性ＲＮＡをコードしている核酸を、導入遺伝子として含んでもよい。以下は、ＣＮＳ関連障害と関連した遺伝子の非限定的リストである：神経細胞アポトーシス抑制タンパク質（ＮＡＩＰ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、グリア由来成長因子（ＧＤＮＦ）、脳由来成長因子（ＢＤＮＦ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）、ＧＴＰ−シクロヒドロラーゼ（ＧＴＰＣＨ）、アスパルトアシラーゼ（ＡＳＰＡ）、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ１）およびアミノ酸デカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）。たとえば、パーキンソン病の治療で有用な導入遺伝子は、ドーパミンの合成における律速酵素である、ＴＨをコードする。ＴＨ補因子テトラヒドロビオプテリンを生成する、ＧＴＰＣＨをコードしている導入遺伝子も、パーキンソン病の治療で使用することが可能である。ＧＤＮＦまたはＢＤＮＦ、あるいはＬ−ＤｏｐａのＤＡへの変換を促進する、ＡＡＤＣをコードしている導入遺伝子も、パーキンソン病の治療で使用することが可能である。ＡＬＳの治療のために、有用な導入遺伝子はＧＤＮＦ、ＢＤＮＦまたはＣＮＴＦをコードしてもよい。やはりＡＬＳの治療のために、有用な導入遺伝子は、ＳＯＤ１の発現を抑制する、機能性ＲＮＡ、たとえば、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡをコードしてもよい。虚血の治療のために、有用な導入遺伝子はＮＡＩＰまたはＮＧＦをコードしていてもよい。β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）をコードしている導入遺伝子は、ある種のリソソーム蓄積症（たとえば、ムコ多糖症ＶＩＩ型（ＭＰＳ ＶＩＩ））の治療に有用な可能性がある。プロドラッグ活性化遺伝子、たとえば、ガンシクロビルを（ＤＮＡ合成を中断させて細胞死に導く）有毒なヌクレオチドに変換するＨＳＶ−チミジンキナーゼをコードしている導入遺伝子は、たとえば、プロドラッグと併用されるとき、ある種の癌の治療に有用な可能性がある。β−エンドルフィン等の、内因性オピオイドをコードしている導入遺伝子は、疼痛の治療に有用な可能性がある。本発明のｒＡＡＶベクターで使用することが可能な導入遺伝子の他の例は、熟練技術者に明らかになるであろう（たとえば、Costantini LC,et al.,Gene Therapy(2000)7,93-109参照）。
いくつかの実施態様で、組み換えＲＮＡベクターのクローニング能力は限られている可能性があり、所望のコード配列はウイルスの４．８キロベースゲノムの完全置換を含むことがある。ラージ遺伝子は、したがって、標準的組み換えＡＡＶベクターでの使用に適さない場合もある。熟練技術者は、限られたコーディング能力を克服するための選択肢を当該技術分野で利用できることを十分に理解するであろう。たとえば、２つのゲノムのＡＡＶ ＩＴＲをアニーリングして頭尾コンカテマーを形成し、ベクターの能力をほぼ倍加する。スプライス部位を挿入することにより、転写物からＩＴＲを除去することが可能になる。限られたクローニング能力を克服するための他の選択肢は、熟練技術者に明らかになるであろう。
組み換えＡＡＶ投与
ｒＡＡＶＳは、所望の組織の細胞を形質移入し、過度の有害作用なしに、十分なレベルの遺伝子移入および発現を提供するのに十分な量で投与される。従来の、薬学的に許容される投与経路は選択された組織への直接送達（たとえば、脳内投与、髄腔内投与）、静脈内、経口、吸入（鼻腔内送達および気管内送達を含む）、眼内、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、腫瘍内、および他の親投与経路を含むが、これに限定されない。投与経路は、必要に応じて組み合わせてもよい。
ある種のｒＡＡＶの対象への送達は、たとえば、対象の血流中への投与によってもよい。血流中への投与は、静脈、動脈、または任意の他の人工血管への注射によってもよい。さらに、場合によっては、ｒＡＡＶを脳組織、髄膜、神経細胞、グリア細胞、星状細胞、乏突起膠細胞、脳脊髄液（ＣＳＦ）、間質腔等々に送達することが望ましいこともある。いくつかの実施態様で、組み換えＡＡＶを、脳室領域への注射によって脊髄または脳に直接送達することも可能であり、また線条体（たとえば、尾状核または線条体の被殻）、および神経筋接合部、または小脳小葉に、当該技術分野で知られている神経外科的技法を使用して、たとえば定位的注射によるなど、針、カテーテルまたは関連装置で直接送達することも可能である（たとえば、Stein et al.,J Virol 73:3424-3429,1999；Davidson et al.,PNAS 97:3428-3432,2000；Davidson et al.,Nat.Genet.3:219-223,1993；およびAlisky and Davidson,Hum.Gene Ther.11:2315-2329,2000参照）。ある特定の環境では、本明細書に開示されている適切に処方された医薬組成物の状態で、ｒＡＡＶに基づいた治療用構築物を、皮下的、膵内的、鼻腔内的、非経口的、静脈内的、筋肉内的、脳内的、髄腔内的、脳内的、経口的、腹腔内的のいずれかで、または吸入により、送達することが望ましいであろう。いくつかの実施態様で、米国特許第５，５４３，１５８号明細書；米国特許第５，６４１，５１５号明細書および米国特許第５，３９９，３６３号明細書（それぞれ、その全体を参照により本明細書に明確に援用する）に記述されているような投与方式を使用してｒＡＡＶを送達することも可能である。
組み換えＡＡＶ組成物
ｒＡＡＶは、当該技術分野で知られている適切な方法に従って、組成物の状態で対象に送達することが可能である。好ましくは生理学的に適合する担体中に懸濁された（たとえば、組成物の状態で）ｒＡＡＶを、対象、たとえば、ヒト、マウス、ラット、ネコ、イヌ、ヒツジ、ウサギ、ウマ、ウシ、ヤギ、ブタ、モルモット、ハムスター、ニワトリ、七面鳥、または非ヒト霊長類（たとえば、マカク）に投与することが可能である。本発明の組成物は、ｒＡＡＶを単独で含んでもよく、また１つ以上の他のウイルス（たとえば、１つ以上の異なる導入遺伝子をコードしている第２のｒＡＡＶ）と組み合わせて含んでもよい。いくつかの実施態様で、組成物は、それぞれ１つ以上の異なる導入遺伝子を有する１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれより多い異なるｒＡＡＶを含む。
好適な担体は、ｒＡＡＶが向けられた指示を考慮して、当該技術分野における熟練者により容易に選択され得る。たとえば、１つの好適な担体は、種々のバッファ液（たとえば、リン酸緩衝生理食塩水）と共に処方することが可能な、生理食塩水を含む。他の例示的な担体としては、滅菌食塩水、ラクトース、スクロース、リン酸カルシウム、ゼラチン、デキストラン、寒天、ペクチン、落花生油、ゴマ油、および水などがある。担体の選択は、本発明を限定するものではない。
任意選択的に、本発明の組成物は、ｒＡＡＶおよび担体に加えて、他の従来の医薬品成分、たとえば保存料や化学安定剤等を含んでもよい。好適な例示的な保存料としては、クロロブタノール、ソルビン酸カリウム、ソルビン酸、二酸化硫黄、没食子酸プロピル、パラベン類、エチルバニリン、グリセリン、フェノール、およびパラクロロフェノールなどがある。好適な化学安定剤としては、ゼラチンやアルブミンなどがある。
所望の効果すなわち「治療効果」を達成するために必要なｒＡＡＶビリオンの用量、たとえば、ベクターゲノム／体重ｋｇ（ｖｇ／ｋｇ）で表した用量の単位は、ｒＡＡＶ投与経路、治療効果を達成するために必要な遺伝子またはＲＮＡ発現のレベル、治療しようとしている具体的な疾病または障害、および遺伝子またはＲＮＡ産物の安定性を含むが、これに限定されない幾つかの要因によって異なるであろう。当該技術分野における熟練者は、ある特定の疾病または障害を有する対象を治療するためのｒＡＡＶビリオン用量範囲を、前述の要因ならびに当該技術分野で周知の他の因子に基づいて、容易に決定することができる。ｒＡＡＶの有効量は概して、対象当たり約１０９〜１０１６ゲノムコピーを含んでいる溶液約１０μｌ〜約１００ｍｌの範囲である。他の容量の溶液を使用することも可能である。使用される容量は一般に、とりわけ、対象のサイズ、ｒＡＡＶの用量、および投与経路によって異なるであろう。たとえば、髄腔内投与または脳内投与では、１μｌ〜１０μｌまたは１０μｌ〜１００μｌの容量を使用することが可能である。静脈内投与では、１０μｌ〜１００μｌ、１００μｌ〜１ｍｌ、１ｍｌ〜１０ｍｌの範囲、またはそれより多い容量を使用することが可能である。場合によっては、対象当たり約１０１０〜１０１２ ｒＡＡＶゲノムコピーの用量が適する。ある実施態様で、ＣＮＳ組織をターゲットするために、対象当たり１０１２ ｒＡＡＶゲノムコピーが有効である。いくつかの実施態様で、ｒＡＡＶは、対象当たり１０１０、１０１１、１０１２、１０１３、１０１４、または１０１５ゲノムコピーの用量で投与される。いくつかの実施態様で、ｒＡＡＶは、１ｋｇ当たり１０１０、１０１１、１０１２、１０１３、または１０１４ゲノムコピーの用量で投与される。
いくつかの実施態様で、特に高濃度ｒＡＡＶが存在する場合（たとえば、約１０１３ＧＣ／ｍｌ以上）、ｒＡＡＶ組成物は、組成物中でＡＡＶ粒子の凝集が減少するように処方される。ｒＡＡＶの凝集を減少させる方法は当該技術分野で周知であり、たとえば、界面活性剤の添加、ｐＨ調整、塩濃度調整等がある（たとえば、Wright FR,et al.,Molecular Therapy(2005)12,171-178（その内容を参照により本明細書に援用する）参照）。
本明細書に記載の独特の組成物を種々の治療方式で使用するのに好適な投与方式および治療方式の開発通り、薬学的に許容される賦形剤および担体溶液の調剤は、当業者に周知である。一般に、こうした製剤は少なくとも約０．１％以上の有効成分を含むであろうが、有効成分のパーセンテージは、もちろん、変化してもよく、また便宜上、全製剤の重量または容量の約１％または２％〜約７０％または８０％以上の間であろう。当然のことながら、調製されることが可能な各治療上有用な組成物中の有効成分の量は、化合物の所与の単位用量で好適な投薬量が得られるという方法である。溶解性、バイオアベイラビリティ、生物学的半減期、投与経路、製剤の有効期限等の要因、ならびに他の薬理学的検討事項は、このような医薬製剤を調製する技術分野の熟練者により熟考されることが可能であり、したがって種々の投薬量および治療方式も望ましいであろう。
注射用途に好適な剤形としては、滅菌水剤または滅菌分散剤、および滅菌注射液または滅菌分散の即時調製用滅菌散剤などがある。分散剤は、グリセロール、液体ポリエチレングリコール類、およびその混合物中でも、また油中でも、調製することが可能である。通常の保管条件および使用条件で、こうした調製物は、微生物の増殖を防ぐために保存料を含む。多くの場合、その形態は無菌であり、また容易に注射可能な程度まで流動性が存在する。調製物は、製造条件下および保管条件下で安定していなければならず、また細菌類や真菌類等の、微生物の汚染作用から保護されなければならない。担体は、たとえば、水、エタノール、ポリオール（たとえば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール等々）、その好適な混合物、および／または植物油を含む溶媒または分散媒であってもよい。適当な流動性は、たとえば、レシチン等のコーティングの使用によって、分散剤の場合には必要な粒径の維持によって、また界面活性剤の使用によって、維持することが可能である。微生物の活動の防止は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、たとえば、パラベン類、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール等々によりもたらすことができる。多くの場合、たとえば、糖類または塩化ナトリウム等の、等張剤を含むことが好ましいであろう。注射用組成物の持続的吸収は、吸収を遅らせる物質、たとえば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物中に使用することによってもたらすことができる。
注射用液の投与では、たとえば、溶液を、必要に応じて、適当に緩衝化してもよく、また液体希釈剤を先ず、十分な生理食塩水またはグルコースで等張にしてもよい。こうした特定の水溶液は、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与および腹腔内投与に特に適する。これに関連して、使用することが可能な無菌の水性媒体は、当該技術分野における熟練者に分かるであろう。たとえば、１回量を等張のＮａＣｌ溶液１ｍｌに溶解し、皮下注入流体１０００ｍｌに加えるかまたは提案された注入部位に注射する（たとえば、“Remington’s Pharmaceutical Sciences” 15th Edition,pages 1035-1038 and 1570-1580参照）。宿主の状態に応じて、投与量のいくつかの変化が必然的に生じるであろう。いずれにしても、投与に責任がある者が、個々の宿主に適切な用量を決定するであろう。
滅菌注射液は、活性なｒＡＡＶを必要な量で、必要に応じて、本明細書に列挙されている様々な他の成分と一緒に溶媒に組み込み、続いて濾過滅菌することにより調製される。概して、分散剤は、様々な滅菌した有効成分を、基本的な分散媒体および上に列挙したものの中から所望の他の成分を含む滅菌媒体に組み込むことによって調製される。滅菌注射液を調製するための滅菌散剤の場合、好ましい調製方法は、予め滅菌濾過した溶液から有効成分に追加的な所望の成分を加えた散剤を生じる、真空乾燥技法およびフリーズドライ技法である。
本明細書に開示されているｒＡＡＶ組成物は、中性で、または塩形で、調剤することが可能である。薬学的に許容される塩類は、酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基とで形成される）を含み、また、たとえば、塩酸またはリン酸等の無機酸とで、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸等々の有機酸とで形成される。遊離カルボキシル基とで形成される塩類は、たとえば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニム、水酸化カルシウム、または水酸化第二鉄等の無機塩基類、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカイン等々の有機塩基類から誘導することもできる。製剤に際して、液剤は好ましくは、投与量製剤と適合する方法で、かつ治療に有効な量で投与される。製剤は、たとえば注射液および薬物放出カプセル等々の種々の剤形で、容易に投与することができる。
本明細書で使用されるとき、「担体」は、ありとあらゆる溶媒、分散媒、媒体、コーティング、希釈剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤、バッファ、担体溶液、懸濁液、コロイド等々を含む。このような媒体および薬剤の、薬学的に活性な物質への使用は、当該技術分野で周知である。補助的な有効成分も組成物に組み込むことができる。句「薬学的に許容される」は、宿主に投与したとき、アレルギー反応または類似した有害反応を生じさせない分子実体および組成物を指す。
リポソーム、ナノカプセル、微粒子、ミクロスフェア、脂質粒子、小胞、等々の送達媒体を、本発明の組成物を好適な宿主細胞に導入するために使用することが可能である。特に、ｒＡＡＶベクター送達導入遺伝子を、脂質粒子、リポソーム、小胞、ナノスフェアまたはナノ粒子等々のいずれかでカプセル化して、送達用に製剤することが可能である。
このような製剤は、本明細書に開示されている核酸またはｒＡＡＶ構築物の薬学的に許容される製剤を導入するのに好ましいであろう。リポソームの形成および使用は概して、当業者に周知である。最近、改良された血清安定性および循環半減期を有するリポソームが開発された（米国特許第５，７４１，５１６号明細書）。さらに、潜在的薬物担体としてのリポソームおよびリポソーム様調製物の様々な方法が記述されている（米国特許第５，５６７，４３４号明細書；米国特許第５，５５２，１５７号明細書；米国特許第５，５６５，２１３号明細書；米国特許第５，７３８，８６８号明細書および米国特許第５，７９５，５８７号明細書）。
リポソームは、他の手順による形質移入に対して通常は抵抗性を示す多くの細胞型と共に首尾よく使用されてきた。加えて、リポソームは、ウイルスに基づいた送達系に特有のＤＮＡ長さに制限がない。リポソームは、遺伝子、薬物、放射線治療薬、ウイルス、転写因子およびアロステリックエフェクターを種々の培養細胞株や動物に導入するために、効果的に使用されてきた。加えて、リポソーム介在薬物送達の有効性を試験する幾つかの成功した臨床治験が完了している。
リポソームは、水性媒体中に分散して多重膜同心二層小胞（多重膜小胞（ＭＬＶ）とも呼ばれる）を自然形成するリン脂質から形成される。ＭＬＶは概して、２５ｎｍ〜４μｍの直径を有する。ＭＬＶの超音波処理により、中心部に水溶液を含む、直径２００〜５００Åの範囲内の小型単層小胞（ＳＵＶ）が結果的に生じる。
あるいは、ｒＡＡＶのナノカプセル製剤を使用してもよい。ナノカプセルは概して、安定かつ再現性のある方法で物質を封入する。細胞内ポリマー過負荷に起因する副作用を回避するために、そのような超微細粒子（粒径約０．１μｍ）は、インビボで分解できるポリマーを使用して設計すべきである。こうした要件を満たす生分解性ポリアルキル−シアノアクリレートナノ粒子の使用が考慮される。
上述の送達方法に加えて、ｒＡＡＶ組成物を宿主に送達する代替法として下記の技法も考えられる。ソノフォレシス（すなわち、超音波）は、循環系中への薬物浸透および循環系を介した薬物浸透の速度および有効性を高める装置として使用されており、また米国特許第５，６５６，０１６号明細書に記述されている。考えられる他の薬物送達代替法は、骨内注射（米国特許第５，７７９，７０８号明細書）、マイクロチップ装置（米国特許第５，７９７，８９８号明細書）、眼科用製剤（Bourlais et al.,1998）、経皮マトリックス（米国特許第５，７７０，２１９号明細書および米国特許第５，７８３，２０８号明細書）およびフィードバック制御送達（米国特許第５，６９７，８９９号明細書）である。
キットおよび関連組成物
本明細書に記載の薬剤は、いくつかの実施態様で、治療用途、診断用途調査研究用途での使用を容易にするために調剤キットまたは診断キットまたは調査研究キットに組み立てることが可能である。キットは、本発明の構成要素および使用説明書を収納する１つ以上の容器を含む。具体的には、このようなキットは、本明細書に記載の１つ以上の薬剤を、こうした薬剤の所期の用途および適切な使用を説明する説明書と一緒に含む。ある実施態様で、キット内の薬剤は、医薬製剤の状態でありかつ薬剤のある特定の用途および投与方法に好適な投与量であってもよい。調査研究目的のキットは、構成要素を、様々な実験の実行に適切な濃度または量で含むことが可能である。
キットは、研究者が本明細書に記載の方法を使用しやすくするように設計することが可能であり、また多くの形態をとることができる。キットの各組成物は、該当する場合、液体で（たとえば、溶液で）、または固体（たとえば、乾燥粉末）で提供することが可能である。場合によって、組成物の一部は、たとえば、キットと一緒に提供されてもされなくてもよい好適な溶媒または他の種（たとえば、水または細胞培地）を加えることによって、構成可能であってもよくあるいは（たとえば、活性型に）加工可能であってもよい。本明細書で使用されるとき、「使用説明書」は、指示および／または販売促進の構成要素を明示することができ、また一般に、本発明のパッケージングの、または本発明のパッケージングと関連した、書面による使用説明を含む。使用説明書がキットと関係があることをユーザーが明らかに認識するという方法で、たとえば、視聴覚的（たとえば、ビデオテープ、ＤＶＤ等）、インターネット、および／またはウェブベースのコミュニケーション等で提供される、あらゆる口伝または電子指示も、使用説明書は含む。書面による使用説明書は、医薬品または生物学的製剤の製造、使用または販売を管理する政府機関によって規定された様式であってもよく、その使用説明書は、動物投与用の製造、使用または販売の機関による認可も示すことができる。
キットは、１つ以上の容器の中に、本明細書に記載の構成要素のいずれか１つ以上を含む。一例として、一実施態様で、キットは、キットの１つ以上の構成要素を混合するためおよび／またはサンプルを取り出して混合し、対象に適用するための使用説明書を含んでもよい。キットは、本明細書に記載の薬剤を収納する容器を含んでもよい。薬剤は、液体、ゲルまたは固体（散剤）の形態であってもよい。薬剤は、無菌的に調製し、注射器に充填して冷凍輸送することが可能である。あるいは、薬剤は、小瓶または他の保存容器に収納されていてもよい。無菌的に調製された他の薬剤が第２の容器に入っていてもよい。あるいは、キットは、注射器、小瓶、チューブ、または他の容器の中に前もって混合された作用剤が入っていて輸送することが可能である。キットは、薬剤を対象に投与するために必要な構成要素、たとえば注射器、局所適用装置、または、ＩＶ針チューブおよびバッグ等の、１つ以上または全てを具有してもよい。
例１：ｍｉＲＮＡ制御により、ＣＮＳをターゲットしかつ非ＣＮＳ組織をターゲット解除するための血管内送達のための、１２のＡＡＶベクターの特性決定
異なる血清型の、１２のｓｃＡＡＶＥＧＦＰベクター、または自然変異体の、ＣＮＳ遺伝子移入特性を評価した。血管脳関門（ＢＢＢ）を越えて乏突起膠細胞をターゲットするＲＡＡＶが発見された。実験は、新生仔マウス（１日令）および成体マウス（１０週令）（Ｃ５７ＢＬ／６）で実施した。以下のＡＡＶ血清型を試験した：ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ｒｈ．１０（本明細書ではＡＡＶｒｈ．１０とも呼ばれる）、ｒｈ．３９、ｒｈ．４３、ＣＳｐ３。
組み換えＡＡＶベクターは、ＣＭＶ強化ニワトリβ−アクチンハイブリッドプロモーターのもとで、強化されたＧＦＰレポーター遺伝子を発現し、２９３細胞における一時的形質移入によって産生された。生後１日の新生仔マウスをイソフルランで麻酔した。次いで、解剖顕微鏡下で浅側頭静脈を介して１００μＬのｒＡＡＶベクター（マウス１匹当たり４×１０１１ＧＣ）を新生仔マウスに注射した。成体マウスでは、ｒＡＡＶを尾静脈注射によって投与した（異なる２つの用量を評価した）。マウス１匹当たり４×１０１１ＧＣまたはマウス１匹当たり４×１０１２ＧＣ）。注射後２１日に、処置した動物を麻酔し、冷ＰＢＳおよび４％（ｖ／ｖ）パラホルムアルデヒドを経心臓的に灌流した。脳を摘出し、２０％スクロースに浸漬し、Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ ＯＣＴに包埋した。厚さ４０μｍの切片を切断し、１２ウェルプレート内で、一次抗体で、たとえば、抗ＮｅｕＮ、抗ＥＧＦＰおよび抗ＧＦＡＰで、４℃で一晩染色し、次いで二次抗体で、室温で２時間染色した。対照のマウスはＰＢＳ注射を受けた。
新生仔の試験で、注入後３週間に脳全体にわたってＥＧＦＰ（＋）細胞の分布が認められた。多様な強度を有する多数のＥＧＦＰ（＋）細胞が、１２のうち１０のベクターで処置した動物の脳の様々な領域で見られた。多くの場合、脈絡叢は非常に強いＥＧＦＰ発現を示し、形質導入された脳実質細胞は、主に脳室周囲領域に現れた。このことは、ＩＶ送達ベクターのほんの一部が脈絡叢血液インターフェースを介してＣＮＳに入る可能性があることを示す。成体では、脳血管系のかなりの染色が認められた。脳の様々な領域への、ＡＡＶによる総体的なターゲティング効率は、視床下部＞延髄＞皮質＞海馬＞小脳＞視床とランク付けされた。マウス１匹当たり４×１０１１ＧＣを浅側頭静脈に注射することによってＥＧＦＰレポーター遺伝子を持つｒＡＡＶ２またはｒＡＡＶ５を投与された新生仔マウスでは、ＥＧＦＰ発現は高レベルで検出されなかった。（要約データについては、表１ならびに図１および図２を参照されたい）。
ＣＮＳにおけるＥＧＦＰ（＋）細胞型を分類するために、組織切片を、抗ＥＧＦＰおよび抗細胞型特異的マーカー抗体で免疫蛍光的にも染色した。ＥＧＦＰ（＋）細胞、特に神経細胞および乏突起膠細胞の、検出感度は劇的に向上した。異なるベクターが多様な効率で神経細胞を形質導入したが、全１０のベクター（ＡＡＶ９を含む）が、非神経細胞、特に星状細胞に、より強いトロピズムを示した。１つのベクター（ＡＡＶ７）が、他の９ベクターより効率よく乏突起膠細胞をターゲットした。幾つかのｒＡＡＶは、ｒＡＡＶ９と比べて効率よく、神経細胞および／または星状細胞の両者を形質導入した（ＡＡＶｒｈ．１０、ｒｈ．３４、およびｒｈ．４３）。視床下部および延髄で、広範におよぶ星状細胞形質導入が認められた。ある特定のベクターの注射は、新皮質、海馬、および視床下部を含む、脳の様々な領域で、かなりの神経細胞形質導入を招いた。小脳皮質内のプルキンエ細胞を形質導入すると思われるベクターもあった（たとえば、ＣＳｐ３）が、新皮質、視床および視床下部の血管を効果的に形質導入するベクターもあった。加えて、第三脳室、側脳室および第第四脳室の脈絡叢は強いＥＧＦＰ発現を示した。新生仔マウスおよび成体マウスの様々な脊髄領域でも、ＥＧＦＰ発現を評価した（新生仔試験の結果を図３に示す）。
心臓や骨格筋等の非ＣＮＳ組織の形質導入が認められた（たとえば、ＡＡＶ９、ＡＡＶ８、およびＣＳｐ３）。場合によって、これは望ましくない副作用につながることがある。この問題点に対処するために、ｍｉＲＮＡ結合部位を導入遺伝子カセットの３’ＵＴＲに組み込んで、非ＣＮＳ組織からのＡＡＶ形質導入を極めて特異的かつ効果的にターゲティング解除した。肝臓における発現を抑制するために、ｍＲ−１２２に対するｍｉＲＮＡ結合を使用した。骨格筋および心臓での発現を抑制するために、ｍＲ−１に対するｍｉＲＮＡ結合を使用した。
例２：ＣＤを治療するための組み換えＡＡＶｒｈ．１０ベクターの構築および評価
カナバン病（ＣＤ）は、アスパルトアシラーゼ遺伝子（ＡＳＰＡ）における突然変異に起因する遺伝性の神経変性障害であって、乏突起膠細胞におけるＮ−アセチル−アスパラギン酸（ＮＡＡ）の蓄積につながり、結果として脳内の白質の海綿状変性を生じる。ＣＤのためのｒＡＡＶ２に基づいたＡＳＰＡ遺伝子療法に関する最初の臨床試験は、非常に限られた成功をおさめた。理論に束縛されることを望むことなく、有効なＣＤ遺伝子療法は、ＣＮＳ全体にわたって乏突起膠細胞を形質導入するであろうと確信される。
ＣＤのための遺伝子療法ベクターとしてＡＳＰＡタンパク質（配列番号１３または配列番号１５）をコードしている領域と操作可能に連結されたプロモーターを含むｒＡＡＶベクターを構築する。本構築物は配列番号１４または配列番号１６で示されるようなコード配列を有するＡＳＰＡの発現を推進するために、ＣＡＧ（ＣＭＶエンハンサーを含むニワトリβ−アクチンプロモーター）を使用する。ｒＡＡＶベクターは、三重形質移入法を使用してｒＡＡＶ粒子にパッケージされる。その有効性を評価するために、ホモ接合ＡＳＰＡノックアウトマウスのＣＤ様表現型を除去したり減じたりする能力について、ＣＤのＡＳＡＰノックアウトマウスモデルで、ｒＡＡＶ−ＡＳＰＡを試験する（Matalon R et al.The Journal of Gene Medicine,Volume 2 Issue 3,Pages 165-175）。ホモ接合ＡＳＰＡノックアウトマウスは神経学的障害、大頭、全身性白質疾患、ＡＳＰＡ活性欠損および高濃度の尿中ＮＡＡを示す。ホモ接合マウスの脳の磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）および分光法（ＭＲＳ）は、カナバン病に特有の白質変化およびＮＡＡ濃度上昇を示す。出生時に明白な表現型を持たない、ヘテロ接合ＡＳＰＡノックアウトマウスが、対照の役割をする。
例３：ＣＤ治療用ＡＡＶベクターの治療効果および安全性評価
ＣＤのマウスモデルはＣ５７ＢＬ／６由来のＡＳＰＡ遺伝子ＫＯ株である。ホモ接合ＫＯ動物は、ＣＤ患者で認められるものと類似した生化学的欠陥および神経学的欠陥を呈する。ＣＤマウスは、ＣＤを治療するための遺伝子療法および他の治療法を評価するための動物モデルを提供する。ＣＤマウスは、ＣＤを治療するための新規な遺伝子療法戦略の有効性および安全性を試験するために使用される。
実験計画
治療効果および安全性を試験するために、最適化ＡＳＰＡ発現カセットを担持するｓｃＡＡＶベクター（たとえば、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＣＳｐ３およびＡＡＶ９）を、ＣＤの前臨床遺伝子療法治験で調査する。ベクターは、非ＣＮＳ組織におけるＡＳＰＡ発現を抑制するために、ｍｉＲＮＡ結合部位を含む。出生後１日令と３カ月令の成体との両動物を、２つの用量（１×１０１４ＧＣ／ｋｇおよび３×１０１４ＧＣ／ｋｇ）の各ベクターで、静脈内投与により処置する。新生仔ＣＤマウスについては、１か月および３カ月の時点でそれぞれ同腹子１匹を剖検するため、同腹子２匹が側頭の静脈注射により、各用量の各ベクターを受ける。３か月令の成体ＣＤマウスについては、１２匹のオス動物を、尾静脈注射により、各用量の各ベクターで処置する。１カ月後および３カ月後に、各６匹の処置動物を剖検する。さらなる実験で、出生後１日と３カ月令の成体との両動物を、直接脳室内投与によって、１０１１〜１０１２ＧＣ／対象の範囲の用量のベクターで処置する。
試験の生存相中の、機能的測定および神経学的測定
１）．ＮＡＡ代謝。１４日、３０日、４５日、６０日、７５日、および９０日に、処置動物、未処置対照動物、および野生型動物から尿試料を採取する。試料をＨＰＬＣで分析してＮＡＡを決定する。
２）．脳内のＮＡＡ蓄積およびＮＡＡ誘導性水分貯留。クレアチン／クレアチンリン酸およびＮＡＡのスペクトルピーク積分ならびに脳内の異常な高信号区域を測定するために、ベクター処理後１カ月、２カ月、および３カ月に、全試験群の生存動物に対してＭＲＩ／ＭＲＳに基づいた神経画像試験を実施する。
３）．肝機能テスト。ベクター関連の肝毒性の指標として、アラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）およびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）の濃度を測定するために、１４日、３０日、６０日、および９０日に、全試験群の動物から血清試料を採取する。
４）．神経学的テスト。振顫、脚を広げてスローペースまたは不安定なペースでの歩行、および運動失調は、ＣＤマウスの突出した神経学的特徴の中でも最たるものである。遺伝子療法治療の１カ月後、２カ月後および３カ月後に、足をカラーインクで着色し、次いで歩行パターンを足跡として白紙上に記録することにより、全試験群の動物を歩行パターン分析にかける。平衡を保つ能力についても、動物をローターロッドテストでテストして採点する。
試験の終点における酵素分析および組織病理学的分析
１）．脳組織および非ＣＮＳ組織におけるＡＳＰＡ活性。脳組織、肝組織、心組織および膵組織を剖検時に採取してそれぞれの組織ホモジネート中のＡＳＡＰ活性を測定することにより、ＡＳＰＡの的確な発現および的外れな発現を分析する。
２）．脳白質病理および肝臓病理。遺伝子療法に起因する脳白質病理およびベクター関連の肝毒性の潜在的改善を検査するために、脳組織および肝組織を採取して固定し、パラフィン包埋して薄切し、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色する。病理学者により組織病理学的検査を実施する。
例４：ＡＡＶｒｈ．１０によるＣＮＳ細胞への治療遺伝子の送達
ＣＮＳに治療遺伝子移入する候補を同定するために、様々なＡＡＶ血清型のスクリーンを開発した。ＥＧＦＰを発現する組み換えＡＡＶベクターを構築した。ｒＡＡＶベクターを、４つの異なるＡＡＶ（ＡＡＶ１、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９およびＡＡＶ１０）にパッケージした。成体マウスには、腰位のＣＳＦ中にＡＡＶを注射した。ＡＡＶ１、ＡＡＶ８およびＡＡＶ９は、〜４．８×１０１０粒子の投与後、脊髄の腰部の注射部位付近の細胞のみを形質導入した。意外なことに、ＡＡＶｒｈ．１０は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ８およびＡＡＶ９と同じ注射プロトコールおよび投与量の後、脊髄全体に沿った灰白質および脳幹の細胞を形質導入した（図４Ａ）。近年、ＡＡＶ９は、静脈内注射後、血管脳関門（ＢＢＢ）を越えて脊髄細胞を形質導入することが証明された。弱い信号が小脳で観測され、また強い信号が脳幹および脊髄で観測された。（小脳と同様の）弱い信号が、前脳でも観測された。理論に束縛されることを望むことなく、ＣＳＦの流れおよび拡散は、脊髄全体に沿ったウイルスの広がりを可能にするが、ウイルスの流れて拡散する能力はウイルスのカプシドの構造に依存すると考えられる。形質導入される細胞型には、神経細胞および乏突起膠細胞が含まれる。しかし、ＥＧＦＰとＧＦＡＰ陽性細胞のオーバーラップから分かるように、大部分は星状細胞のようである（図４Ｂ）。小膠細胞マーカー、Ｉｂａ−１との実質的なオーバーラップは認められなかった。ＥＧＦＰ発現とＮｅｕＮ染色とのオーバーラップから分かるように、多くの運動ニューロンが形質導入された。星状細胞の中で、灰白質内に位置しているもののみが形質導入され、白質内および軟膜下に位置しているものは形質導入されなかったことは意外であった。ウイルスは、くも膜下腔に投与されたので、こうした区域内の星状細胞に暴露された可能性があるため、このことは印象的であった。
例５：ＡＬＳを治療するための組み換えＡＡＶｒｈ．１０ベクターの構築
ＡＬＳの治療法として、組み換えＡＡＶ系を開発した。ＳＯＤ１をターゲットするマイクロＲＮＡを発現するｒＡＡＶｒｈ．１０ベクターを構築した（図５Ａ）。このマイクロＲＮＡは、ｍｉＲ−ＳＯＤ１と同定された。本構築物は、ＥＧＦＰおよび３’−ＵＴＲのイントロンに位置するｍｉＲ−ＳＯＤ１の発現を推進するために、ＣＡＧ（ＣＭＶエンハンサーを含むニワトリβ−アクチンプロモーター）を使用した。
９つのｍｉＲＮＡ構築物のサイレンシング効力を評価した。この構築物をＨＥＫ２９３細胞に形質移入した。４８時間後、ＳＯＤ１ ｍＲＮＡを検出するために、ＲＮＡを単離してノーザンブロットを実施した（図５Ｂ）。ＭｉＲ−ＳＯＤ１＃５（配列番号２６）が、最も強力にＳＯＤ１発現を停止させた。次に、ｍｉＲ−ＳＯＤ１＃５をＡＡＶｒｈ．１０にパッケージし（図５Ｄ）、これを使用してＨＥＫ２９３細胞を感染させた。ＳＯＤ１を検出するために、感染の４３時間後に細胞内総タンパク質を抽出してブロットした（図５Ｃ）。タンパク質レベルでのＳＯＤ１の発現抑制が認められた。
例６：ＡＬＳを治療するための治療遺伝子のＣＮＳ細胞への送達
標準技法を使用して、大量のＡＡＶｒｈ．１０−ｍｉＲ−ＳＯＤ１およびＡＡＶｒｈ．１０−ｍｉＲ−Ｓｃｒ（スクランブルｍｉＲＮＡ）を産生した。自己相補的ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）は、従来の一本鎖ＡＡＶより高い効率で形質導入を仲介する［１４］ため、これを作った。ｓｃＡＡＶｒｈ．１０をテストし、一本鎖ＡＡＶより急速に（１週間以内）かつ強くＥＧＦＰを発現することが分かった。
ＡＡＶｒｈ．１０−ｍｉＲ−ＳＯＤ１をＧ９３Ａマウスの１グループ（ＳＯＤ１高発現マウス）に投与し、ＡＡＶｒｈ．１０−ｍｉＲ−ＳｃｒをＧ９３Ａマウスの別のグループ（ｎ＝１５）に投与した。６０日令のマウスに、ＡＡＶｒｈ．１０を、髄腔内的に腰部区域のＣＳＦ中に注射し、また脳室内的に前脳に注射した（８μｌ中に約４．８×１０１０粒子）。
ＡＬＳで死ぬまで、動物に天寿を全うさせた。２つのグループ間で寿命を比較した。ＡＡＶｒｈ．１０−ｍｉＲ−ＳＯＤ１ウイルス（ＳＯＤ１ｍｉＲ５（配列番号２６）を発現する）を受けたマウスは、平均して１３５日（±１４日）生き続けたが、ＡＡＶｒｈ．１０−ｍｉＲ−Ｓｃｒ（スクランブルｍｉＲＮＡ（配列番号３１）を発現する）を受けたマウスは、平均して１２２日（±６日）生き続けた（図６Ｂ）ことを見出した。さらに、頚髄組織、胸髄組織、および腰髄組織におけるＥＧＦＰ発現の程度を検査することによって、こうした組織における発現レベルと、特に頚部組織と、寿命との相関関係が、ＡＡＶｒｈ．１０−ｍｉＲ−ＳＯＤ１処置マウスでは認められた（図７Ａ）が、ＡＡＶｒｈ．１０−ｍｉＲ−Ｓｃｒ処置マウスでは認められなかった（図７Ｂ）。これらの結果から、頚髄における変異体ＳＯＤ１発現を停止させることは、生存期間を延ばす上で特に有益なことが示唆される。各グループの動物のサブセットに固定剤を灌流し、薄切し、脊髄におけるＳＯＤ１を染色した。ＳＯＤ１は、標準技法を使用して検出した［９］。ＥＧＦＰ発現細胞におけるＳＯＤ１染色強度は、ＡＡＶｒｈ．１０−ｍｉＲ−ＳＯＤ１を形質導入された非ＥＧＦＰ細胞と比較して低下していた（星状細胞におけるＳＯＤ１発現のノックダウンを示す、図６Ａ）。ＳＯＤ１の発現の減少は、ＡＡＶｒｈ．１０−ｍｉＲ−Ｓｃｒを形質導入された細胞では認められなかった。
両グループの動物の別のサブセットに由来する組織を詳細に分析して形質導入レベルを推定した。形質導入レベルは、様々なＣＮＳ領域および非ＣＮＳ領域から得たＤＮＡ試料に対してＰＣＲを使用し、ウイルスゲノム含量を測定することによって推定した。非ＣＮＳ組織（たとえば肝臓）における測定値は、ウイルスが末梢に漏出したかどうかを示した。ノーザンブロット解析およびウェスタンブロット解析を実施して、脊髄におけるＳＯＤ１レベルを測定した。ＳＯＤ１検出に使用した抗体は、Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌによるカタログ番号Ｋ９００７７Ｃの、ポリクローナル、ヒツジ抗ヒトＳＯＤ１であった。
例７：髄腔内／脳室内併用投与プロトコール
ＡＡＶウイルスを、腰部髄腔内注射および／または脳第三脳室注射により、マウスＣＳＦ中に注射した。マウス腰部くも膜下腔への注射は、Wu et al.［２２］から改変した方法を使用して実施した。細いカテーテル（約５ｃｍ）は、ＰＥ１０チューブを内径０．１２ｍｍまで伸ばすことによって作った。伸長した部分を１．７〜１．９ｍｍに切り、チューブを加熱して加圧することにより、細い部分と太い部分の間にビーズ２個を（１ｍｍ離して）作った。カテーテルを埋め込むために、０．２３ｍｌ／１０ｇ体重の腹腔内アベルチン（２％ ｔｅｒｔ−アミルアルコール中１．２％２，２，２−トリブロモエタノールおよびＰＢＳ）注射でマウスを麻酔した［２３］。次いで、カテーテルをＬ５椎骨とＬ６椎骨の間に埋め込んだ。ビーズが付いた区域で、カテーテルを表面筋肉に縫合した。４．８０Ｅ＋１０ゲノムコピー（ウイルススクリーニング用、６μｌ中）から２．４０Ｅ＋１０ゲノムコピー（治療用、８μｌ中）までの用量のウイルスを、２μｌ／分の速度で、Ｈａｍｉｌｔｏｎ注射器により、カテーテルを介して注入した。カテーテルは、熱でその終端を密封し、適所に１日置いておいた。創傷は、クリップで閉じた。第三脳室への注射は、Ｓｔｏｅｌｔｉｎｇ Ｓｔｅｒｅｏｔａｘｉｃ ＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔおよびＷｏｒｌｄ ＰｒｅｃｉｓｉｏｎＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓの微量注入ポンプを使用して、標準定位手技に従って実施した。同用量のウイルスを、速度１μｌ／分で第三脳室に注射した。
推定されるヒトおよびサルの用量およびＩＶ注射との比較を下表に示す。２種類のサルは大きさが似ている。
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例８．マイクロＲＮＡで制御された、全身的に送達されたｒＡＡＶ９
本例の序文
本例は、完全に相補的なｍｉＲＮＡ−結合部位をｒＡＡＶ９ゲノムの中に工作することによる、ＣＮＳ外でのｒＡＡＶ発現を抑制するための、組織特異的な、内因性マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の使用を含む。本例は、血管脳関門を越えて、中枢神経系（ＣＮＳ）に効率的でかつ安定した経血管遺伝子移入を達成できるが、ある特定の他の組織（たとえば、肝臓、心臓、骨格筋および他の組織）はターゲティング解除する、組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）について説明する。本例に記載の手法は、内因性ｍｉＲＮＡ経路を検出可能なほど混乱させずに、同時多組織制御およびＣＮＳ−指向性の安定した導入遺伝子発現を可能にする。ｍｉＲＮＡによるｒＡＡＶ発現の制御は、主として導入遺伝子ｍＲＮＡの部位特異的切断によるものであって、特異的５’フラグメントおよび特異的３’ｍＲＮＡフラグメントを生成した。
本明細書に開示されているような、組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）が介在する遺伝子移入は、多くの神経学的障害の治療に有用である。本明細書に開示されているｒＡＡＶベクターは、血管脳関門を越えて、ＣＮＳで特異的に発現されることが分かっている。したがって、本ベクターは、脳および脊髄の広範囲を冒すものを含む、ＣＮＳ疾患の遺伝子療法のための、ｒＡＡＶの血管内送達に使用することが可能である。
この例は、ＣＮＳ外での導入遺伝子発現を抑制するための、内因性マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の使用について説明する。ｍｉＲＮＡは、転写後サイレンシングによって遺伝子発現を制御する、低分子非コードＲＮＡである。概して、ｍｉＲＮＡは、２通りの機序によって遺伝子を発現停止させることが可能である。ｍＲＮＡ配列に部分的に相補的なとき、ｍｉＲＮＡは一般に、ｍＲＮＡ発現を調整すると考えられる制御の一法である、標的ｍＲＮＡ安定性およびタンパク質発現を減少させる（たとえば、２〜４倍以下）。対照的に、ｍｉＲＮＡが、そのｍＲＮＡ標的にほぼ完全に相補的なとき、ｍｉＲＮＡは一般にｍＲＮＡの切断をもたらし、ｍＲＮＡの大量破壊を誘発する。
特に、この例は、肝臓、心臓および骨格筋（静脈内送達されたｒＡＡＶ９によって最も効率よくターゲットされる３組織）で、別々にも同時にも、ｒＡＡＶ９発現をターゲット解除するためのｍｉＲＮＡの使用について説明する。肝臓、心臓、および筋肉における導入遺伝子発現のサイレンシングは、豊富な（≧６０，０００コピー／細胞）ｍｉＲＮＡ類、ｍｉＲ−１２２（肝細胞で発現される）、およびｍｉＲ−１（実質的に全ての動物の心臓および骨格筋で見られるｍｉＲＮＡ）の自然発現を利用した。ｍｉＲ−１２２−結合部位は、アデノウイルスベクター由来の導入遺伝子の肝毒性を防止するために首尾よく使用されてきた。ｍｉＲ−１、ｍｉＲ−１２２、または両者のための、完全に相補的な部位を、サイトメガロウイルス−エンハンサー、ニワトリβ−アクチン（ＣＢ）プロモーターによって発現が推進される、核を標的とした、β−ガラクトシダーゼ（ｎＬａｃＺ）レポーター導入遺伝子の３’非翻訳領域（ＵＴＲ）の中に工作した。この例は、真核細胞における全てのアルゴノート結合した低分子ＲＮＡによるものと正確に同じ部位で導入遺伝子ｍＲＮＡを切断することによって、ｍｉＲＮＡがｎＬａｃＺ発現を抑制することを示す、多数の独立した結果を提示する。インビボで全身的に送達されるとき、ｍｉＲＮＡターゲット解除したｒＡＡＶ９ベクターは、レポーター導入遺伝子をＣＮＳで首尾よく発現したが、肝臓または心臓または骨格筋では発現しなかった。
結果
ｍｉＲＮＡは、培養細胞でレポーター遺伝子発現を効率よく抑制する。
ｒＡＡＶ−介在形質導入のための戦略を評価するために、ｍｉＲ−１またはｍｉＲ−１２２のための、完全に相補的な結合部位の１つまたは３つのタンデムコピーを、ｒＡＡＶプラスミドベクターにおけるｎＬａｃＺの３’ＵＴＲに導入した。この構築物をＨｕＨ７細胞（細胞当たり１６，０００コピーのｍｉＲ−１２２を発現するヒト ヘパトーマ細胞株）に形質移入し、ｎＬａｃＺ−陽性細胞の数を測定した。ｎＬａｃＺ発現ＨｕＨ７細胞数は、１部位プラスミドでは、無部位対照の約半数であり；３部位は、ｎＬａｃＺ−発現細胞を７倍以上減少させた（図１２ａ）。
次に、ｎＬａｃＺ構築物の発現を、ヒト胚性腎臓２９３細胞（ｍｉＲ−１またはｍｉＲ１２２がｐｒｉ−ｍｉＲＮＡとして第２プラスミドから導入されたとき、低レベルのｍｉＲ−１２２とｍｉＲ−１の両者を自然に発現する）で、分析した。ｐｒｉ−ｍｉＲ−１２２（図ｌ２ｂ）またはｐｒｉ−ｍｉＲ−１（図ｌ２ｃ）のいずれかを発現するプラスミドと一緒に、０、１、または３つのｍｉＲ−１２２結合部位またはｍｉＲ−１結合部位を担持するｎＬａｃＺレポータープラスミドを用いて、２９３細胞を形質移入した。ｍｉＲＮＡの濃度を変えるために、低い（１：３）または高い（１：１０）、ｎＬａｃＺ−結合部位プラスミドとｍｉＲＮＡ発現プラスミドのモル比を使用した。ｍｉＲ−１２２またはｍｉＲ−１を細胞に導入したとき、ｎＬａｃＺレポーターｍＲＮＡが対応するｍｉＲＮＡ−結合部位を含むときだけｎＬａｃＺ発現が抑制された；ｍｉＲ−１がｍｉＲ−１２２−結合部位を含むｎＬａｃＺと共発現されたとき、またはｍｉＲ−１２２がｍｉＲ−１−結合部位を含むｎＬａｃＺと共発現されたとき、ｎＬａｃＺ−陽性細胞は減少しなかった（図ｌ２ｂ、図ｌ２ｃ）。
組織特異的内因性ｍｉＲＮＡは、成体マウスで全身的に送達されたｒＡＡＶ９の発現を制御する。
インビボで、全身的に送達されたＡＡＶ９ＣＢｎＬａｃＺベクターのｍｉＲＮＡ制御を評価するために、ｍｉＲ−１２２またはｍｉＲ−１のいずれかに完全に相補的な、０、１、または３つのｍｉＲＮＡ−結合部位を担持するＡＡＶ９ＣＢｎＬａｃＺベクターを製造した。このベクターを、体重１ｋｇ当たり５×１０１３ゲノムコピー（ＧＣ／ｋｇ）の用量で、尾静脈注射により、Ｃ５６ＢＬ／６オス成体マウスに投与した。４週間後、形質導入動物の肝臓および心臓を検査した。ｎＬａｃＺ導入遺伝子は、ｍｉＲＮＡが優勢に発現される細胞型および臓器で、内因性ｍｉＲＮＡにより発現停止されることが、ＬａｃＺ染色で明らかになった：この導入遺伝子は、肝臓ではｍｉＲ−１２２により、また心臓ではｍｉＲ−１により、特異的に発現停止された（図１３ａ、図１３ｂ）。ｎＬａｃＺ陽性細胞は、１つまたは３つのｍｉＲ−１２２−結合部位を担持するｒＡＡＶ９ＣＢｎＬａｃＺで処置した動物の肝臓で減少していたが、同じ動物の心臓におけるｎＬａｃＺ発現レベルは、部位を担持しないＡＡＶ９ＣＢｎＬａｃＺで処置した動物におけるものと似ていた（図１３ａ）。同様に、ｎＬａｃＺ発現は、１つまたは３つのｍｉＲ−１−結合部位を含むＡＡＶ９ＣＢｎＬａｃＺを受けた動物の心臓で検出されなかったが、同じ動物の肝臓におけるｎＬａｃＺ発現は、対照動物におけるものと比較して影響を受けていなかった（図１３ｂ）。こうしたデータから、ａｒＡＡＶにおけるｍｉＲＮＡに対する部位が多いほど、対応するｍｉＲＮＡが発現される組織におけるｎＬａｃＺ発現は低いことが示唆される（図１３ａ、図１３ｂ）。
次に、導入遺伝子サイレンシングが、多数の組織で同時に達成できるかどうかを評価するために、様々な数のｍｉＲ−１２２−結合部位とｍｉＲ−１−結合部位の両者を、ｒＡＡＶ９ＣＢｎＬａｃＺゲノムの３’ＵＴＲに挿入し、ｒＡＡＶ９形質導入マウスにおけるそれらの発現について試験した。ｍｉＲ−１−結合部位およびｍｉＲ−１２２−結合部位のそれぞれを１コピーまたは３コピー含むｒＡＡＶ９ＣＢｎＬａｃでは、ｎＬａｃＺ発現は、心臓でも肝臓でも抑制されたが、ｍｉＲ−１２２の発現もｍｉＲ−１の発現も低かった膵臓では、ｎＬａｃＺが容易に検出できることが、組織切片の組織化学的染色から分かった（図１３ｃ）。ホモジナイズした肝臓組織の、定量的な、β−ガラクトシダーゼ検定は、導入遺伝子がｍｉＲＮＡ−結合部位を含む時、ｎＬａｃＺ発現が有意に低いことを同様に示した（ｍｉＲ−１２２−結合部位１つ：７．８±７．４％，Ｐ値＝０．００５；ｍｉＲ−１２２−結合部位３つ：１．６±１．０％，Ｐ値＝０．００５；ｍｉＲ−１−結合部位１つに加えてｍｉＲ−１２２−結合部位１つ：８．６±５．７％，Ｐ値＝０．００５；ｍｉＲ−１−３つに加えてｍｉＲ−１２２−結合部位３つ：３．１±１．２％，Ｐ値＝０．００５；ｍｉＲ−１−結合部位３つ：１０５．７±１１．６％）（図１３ｄ）。
ｒＡＡＶ発現のｍｉＲＮＡ抑制は内因性ｍｉＲＮＡ経路を混乱させない
ｍｉＲＮＡ−相補的部位を担持する高度に発現された導入遺伝子は、対応するｍｉＲＮＡの分解を促進すると報告されている。ｍｉＲ−１２２、ｍｉＲ−２２、ｍｉＲ−２６ａ、およびｌｅｔ−７のレベルは、ｒＡＡＶ形質導入肝で測定した。３つの試験群の中で、４つのｍｉＲＮＡの存在量に差は認められなかった（図１４ａ）。さらに、３つの試験群から各１匹の肝臓に由来する低分子量ＲＮＡのハイスループットシーケンシング分析によるデータから、ｍｉＲＮＡレベルに変化はないことが分かる。
導入遺伝子転写物におけるｍｉＲＮＡ−結合部位が、ｍｉＲ−１２２またはｍｉＲ−１の既知の内因性標的ｍＲＮＡの発現を制御解除するかどうかを決定するために、環状Ｇ１（肝臓におけるｍｉＲ−１２２標的）（図１４ｂ、図１４ｃ）およびカルモジュリン（心臓におけるｍｉＲ−１標的）（図１４ｄ）の発現を分析した。環状Ｇ１発現またはカルモジュリン発現に有意な変化は認められなかった。ｍｉＲ−１２２は、肝臓でのコレステロール生合成を制御し、またｍｉＲ−１２２機能を妨げる薬剤は、血清コレステロールレベルの容易に検出可能な変化を生じさせる。対照ｒＡＡＶ９またはｍｉＲ−１２２−結合部位を担持する導入遺伝子を発現するｒＡＡＶ９のいずれかで形質導入した４週間後に、マウスで、総コレステロールレベル、高比重リポタンパク質レベル、または低比重リポタンパク質レベルの変化は認められなかった（図１４ｅ）。この例で、ｒＡＡＶ発現のｍｉＲＮＡ−介在性のターゲティング解除は、内因性ｍｉＲＮＡ発現または機能に対して検出可能な影響はなかったと結論づけられた。
内因性ｍｉＲＮＡは、導入遺伝子ｍＲＮＡの部位特異的切断によりｒＡＡＶ形質導入を停止させる。
インビボで、ｒＡＡＶにより送達された導入遺伝子の発現を、ｍｉＲＮＡがいかにして抑制するかを決定するために、従来のＰＣＲ（図１５ｂ）、定量的逆転写ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）（図１５ｃ）、ノーザンハイブリダイゼーション（図１５ｄ、図１５ｅ）、および５’相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）末端の迅速増幅（５’ＲＡＣＥ；図１５ｆ）によって、肝臓における導入遺伝子ｍＲＮＡを特性決定した。ｎＬａｃＺ（Ａ＋Ｆプライマー）の３’末端とポリ（Ａ）信号（Ａ＋Ｒプライマー）の５’末端との間の領域を増幅するプライマーを使用したとき、対照ｒＡＡＶを受けた試料では、２６サイクルの増幅後に、ｍｉＲＮＡ−結合部位に架かるアンプリコン（１４５塩基対（ｂｐ）の産物）が検出された。３つのｍｉＲ−１２２−結合部位を含んでいるｒＡＡＶにより形質導入された試料では、弱い２２０ｂｐのバンドを検出するために、さらに６サイクルの増幅が必要であった。こうしたデータは、低レベルの無傷ｎＬａｃＺｍＲＮＡ（図１５ａ、図１５ｂ）と一致している。
ｍｉＲＮＡ指向性の導入遺伝子転写物の抑制の程度を定量的に評価するために、逆転写用のオリゴ（ｄＴ）またはランダムヘキサマープライマーおよびｎＬａｃＺコード配列の５’（ｎＬａｃＺ５’Ｆ／５’Ｒ）領域、または３’（ｎＬａｃＺ ３’Ｆ１３’Ｒ）領域（図１５ａ）のいずれかに架かるＰＣＲプライマー対を使用して、ｑＲＴ−ＰＣＲを実施した。対照ｒＡＡＶ９ＣＢｎＬａｃＺを受けた動物４匹および３’ＵＴＲに３つのｍｉＲ−１２２−結合部位を含むｒＡＡＶ９ＣＢｎＬａｃＺを受けた４匹から抽出された総肝臓ＲＮＡ中の、無傷５’末端および３’末端を有するｎＬａｃＺ ｍＲＮＡのレベルを試験した。ｍｉＲ−１２２−結合部位を含むｒＡＡＶ９を受けた動物では、対照と比較して、３±１倍（ランダムヘキサマー）から７±１倍（オリゴ［ｄＴ］）までの範囲の、無傷３’末端を有するｎＬａｃＺ ｍＲＮＡの減少が認められた。対照的に、５’Ｆ／５’Ｒプライマー対を使用した同試料については、無傷５’末端を有するｎＬａｃＺ ｍＲＮＡの減少は、ほとんどまたは全く検出されなかった（図１５ｃ）。これらの結果から、ｍｉＲＮＡで切断されていたｍＲＮＡの主なターンオーバー方法は、３’→５’エキソヌクレアーゼ分解であったことが分かる。
ｍｉＲ−１またはｍｉＲ−１２２によってターゲットされた導入遺伝子ｍＲＮＡの運命をさらに特性決定するために、ノーザンブロット分析を実施した。ｎＬａｃＺ ｍＲＮＡの５’末端に結合している導入遺伝子プローブは、対照ｒＡＡＶ９ＣｂｎＬａｃＺを注射した動物で、全長ｎＬａｃＺ転写物の予想されるサイズである、〜３．４ｋｂのＲＮＡを検出し；３つのｍｉＲ１−結合部位を担持するｒＡＡＶ９ＣＢｎＬａｃＺで処置したマウス由来の肝試料で、僅かに大きいバンドが検出された（図１５ａ、図１５ｄ）。３つのｍｉＲ−１−結合部位を担持するｎＬａｃＺを発現するｒＡＡＶ９では、単一の転写物が検出されたのと対照的に、３つのｍｉＲ−１２２部位を担持するｎＬａｃＺを発現するｒＡＡＶでは、サイズが異なる２つのＲＮＡが検出された（図１５ｄ）。
こうした転写物の長さは、より長い転写物は全長ｍＲＮＡを表す可能性があるが、より短い、より豊富な転写物は、３’ＵＴＲにおける対応するｍｉＲ−１２２−結合部位でｍｉＲ−１２２によって切断されたｎＬａｃＺ ＲＮＡの５’フラグメントに相当することを示す（図１５ｄ）。
観察結果を確認するために、導入遺伝子ｍＲＮＡの３’ＵＴＲの一部に架かるＲＮＡプローブを使用して、ノーザンブロット分析を繰り返した。ｍｉＲＮＡ−結合部位が欠如しているｒＡＡＶ９によって形質導入された試料中で全長ｎＬａｃＺ転写物が検出されたほかに、２８１ヌクレオチドＲＮＡマーカーより小さい２つの接近して移動している種が検出された。こうしたフラグメントのサイズは、ｍｉＲＮＡ指向性のｎＬａｃＺｍＲＮＡの３’切断生成物と一致していた（図１５ｅ）。これらの２つの３’切断生成物は、下記の５’ＲＡＣＥ実験による生成物のゲル電気泳動法でも検出された（図１５ｆ）。
ｎＬａｃＺ転写物がｍｉＲ−１結合部位またはｍｉＲ−１２２−結合部位を含むとき、このようなターゲット切断がインビボで起こるかどうかを決定するために、５’ｃＤＮＡ末端の迅速増幅（５’ＲＡＣＥ）を実施した。図１６は、ｎＬａｃＺ ３’ＵＴＲが３つのｍｉＲ−１結合部位および３つのｍｉＲ−１２２−結合部位を中に含んだｒＡＡＶ９を注射された動物の、肝臓ＲＮＡから５’ＲＡＣＥを使用して回収された２１クローン（図１６ａ）、および心臓ＲＮＡから単離された２２クローン（図１６ｂ）の配列を示す。肝臓では、ｍｉＲ−１２２指向性の導入遺伝子ｍＲＮＡの切断の配列特徴が各ｍｉＲ−１２２−結合部位で検出された：第１結合部位では５％、第２結合部位では４８％、第３結合部位では４３％。全ての５’末端は、ｍｉＲ−１２２に完全に相補的な配列の１０位および１１位とペアを組む標的ヌクレオチドの間にあるリン酸（全ての真核細胞でアルゴノートタンパク質に結合した低分子量ＲＮＡによって切断される正確な部位）に位置していた（図１７ａ）。ｒｎｉＲ−１部位について、類似した結果が心臓で得られた（図１７ｂ）。
表３は、さらなるベクター群の５’ＲＡＣＥ拡張分析を示す。配列決定された５’ＲＡＣＥ産物のどれも、肝臓におけるｍｉＲ−１指向性の部位特異的切断または心臓におけるｍｉＲ−１２２指向性の部位特異的切断に相当しないことに注目された（表３）。肝臓におけるｍｉＲ−１−結合部位内で切断は何も検出されなかったが、心臓由来の幾つかのクローンはｍｉＲ−１２２−結合部位内で切断されていたものの、ｍｉＲＮＡ指向性の切断の特徴位置ではなかった。
血管内送達されたｒＡＡＶ９は、内因性ｍｉＲＮＡによって効率的に制御できる
ＭｉＲＮＡ−１結合部位およびｍｉＲＮＡ−１２２−結合部位をｓｃＡＡＶ９ＣＢ強化ＧＦＰ（ＥＧＦＰ）ベクターゲノムに付加し、２×１０１４ＧＣ／ｋｇを１０週令のＣ５７ＢＬ／６オスマウスに注射した。３週間後、脳および脊髄の４０μｍ切片ならびに肝臓、心臓および骨格筋の８μｍ切片を作製して、ＥＧＦＰタンパク質発現について検査した。静脈内送達されたｓｃＡＡＶ９ＣＢＥＧＦＰは、ＣＮＳを効率的に形質導入；ＥＧＦＰは、脳の視床領域および脊髄の頚部のみならず肝臓、心臓および筋肉等の非ＣＮＳ組織でも容易に検出可能であった（図１７ａ）。対照的に、ｍｉＲ−１−結合部位およびｍｉＲ１２２−結合部位が導入遺伝子に含まれていたとき、そのような非ＣＮＳ組織における導入遺伝子発現は減少していた；ｍｉＲ−１およびｍｉＲ−１２２が存在しなかった、ＣＮＳでは、ＥＧＦＰ発現は不変であった（図１７ａ）ことが分かった。脳（４１．２±７．７％）、肝臓（３．０±０．５％）、心臓（０．４±０．１％）、および筋肉（１．３±０．４％）における、ｍｉＲＮＡ−結合部位が欠如しているＥＧＦＰ導入遺伝子と比較して、ｒｎｉＲＮＡで抑制されたＥＧＦＰ導入遺伝子の差次的発現を測定するために、定量的ＲＴ−ＰＣＲを使用した（図１７ｂ）。実験間の形質導入効率と関連した変化を除去するために、データを、実験試料および対照試料で検出されたベクターゲノム数に正規化した。自然のＥＧＦＰ発現の顕微鏡分析と同様に、ｍｉＲ−１２２−結合部位またはｍｉＲ−１−結合部位の存在は、肝臓（２０倍）、心臓（１００倍）、および筋肉（５０倍）における導入遺伝子発現を減少させたが、脳における導入遺伝子発現を検出できるほど変えなかったことが、ｑＲＴ−ＰＣＲデータから分かる。
結果の考察
本例は、内因性ｍｉＲＮＡがＣＮＳ外での導入遺伝子発現を抑制できるように、ｒＡＡＶ９を操作できることを表す。結果から、神経栄養成長因子、たとえばインスリン様成長因子、脳由来神経栄養因子またはグリア由来神経栄養因子等を、形質導入された星状細胞で発現することにより、パーキンソン病、アルツハイマー病および筋萎縮性側索硬化症と関連した変性ニューロンのための治療で、このような操作されたｒＡＡＶ９を使用することが可能なことが分かる。この手法は、全身的に送達されたｒＡＡＶ９によって形質導入された末梢組織から誘導される非ＣＮＳ発現を除去または減少させる。
主として標的組織のみで導入遺伝子発現を達成することは、安全なＣＮＳ遺伝子送達を臨床開発するための検討事項である。レンチウイルスベクターについて最初に示したように、内因性ｍｉＲＮＡを使用して、ｒＡＡＶ発現の組織型特異性および細胞型特異性を制限できることが、本例の結果から分かる。データは、内因性ｍｉＲＮＡがｒＡＡＶによる導入遺伝子発現を効果的に抑制できることを示す。心臓でも肝臓でも、ｍｉＲＮＡは、導入遺伝子ｍＲＮＡのヌクレオチド鎖的切断を指令することによって、導入遺伝子発現を抑制した（図１８）。ｒＡＡＶ発現のｍｉＲＮＡ制御は、対応する内因性ｍｉＲＮＡの発現または機能を混乱させず、マウスでは導入遺伝子発現をＣＮＳに限定させた。本例は、末梢で発現したがＣＮＳでは発現しなかったｍｉＲＮＡのための複数の結合部位を結合する戦略は、より安全な、ＣＮＳ特異的遺伝子療法ベクターの開発に有用なことを示す。
材料と方法
ベクター設計、構築および製造。完全に相補的なｍｉＲＮＡ−結合部位は、ｍｉＲＢａｓｅにおける注釈付きｍｉＲ−１配列およびｍｉＲ−１２２配列に基づいて設計され、合成オリゴヌクレオチドを使用して、遍在的に発現されるｐＡＡＶＣＢ核を標的とするβ−ガラクトシダーゼ（ｎＬａｃＺ）プラスミドのｎＬａｃＺ発現カセットの３’ＵＴＲにおけるＢｓｔＢＩ制限部位に挿入された（図１５ａおよび表３）。このベクターは、殆どの細胞および組織で活性な、ハイブリッドサイトメガロウイルスエンハンサー／ＣＢプロモーターカセットを使用する。ｍｉＲ−１２２およびｍｉＲ−１を発現するために、ｐｒｉ−ｍｉＲ−１２２フラグメントおよびｐｒｉ−ｍｉＲ−１フラグメントをＰＣＲでＣ５７／Ｂ６マウスゲノムＤＮＡから増幅し（表４）、ｐＡＡＶＣＢＥＬｕｃプラスミドにおけるホタルルシフェラーゼｃＤＮＡのＸｂａＩ制限部位３’に挿入した。各ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡの同一性は、シーケンシングによって検証した。本試験で使用したＡＡＶ９ベクターを、生成し、精製して力価測定した。
細胞培養および形質移入。ＨＥＫ−２９３細胞およびＨｕＨ７細胞を、１０％ウシ胎仔血清および１００ｍｇ／ｌのペニシリン−ストレプトマイシンを加えたダルベッコ変法イーグル培地（Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｓｏｕｔｈ Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）中で培養した。細胞を、加湿したインキュベーター内、３７℃および５％ＣＯ２で維持した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用し、製造業者の使用説明書に従って、プラスミドを一時的に形質移入した。
マウス試験。オスＣ５７ＢＬ／６マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）を入手して維持した。試験動物の脂質プロフィールを監視するために、ｒＡＡＶ９注射の４週間後に血清試料を採取し、総コレステロール、高比重リポタンパク質および低比重リポタンパク質をＣＯＢＡＳ Ｃ １１１アナライザー（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｌｅｗｅｓ，ＵＫ）で分析した。内因性ｍｉＲＮＡ介在性の、ＣＮＳ限定のＥＧＦＰ遺伝子移入を評価するために、１０週令のオスＣ５７ＢＬ／６マウスにＡＡＶ９ＣＢｎＬａｃＺ−［ｍｉＲ−１２２−結合部位（ＢＳ）１］．ＡＡＶ９ＣＢｎＬａｃＺ−（ｍｉＲ−１２２ＢＳ）３．ＡＡＶ９ＣＢｎＬａｃＺ−（ｍｉＲ−１ＢＳ）１．ＡＡＶ９ＣＢｎＬａｃＺ−（ｍｉＲ−１ＢＳ）３．ＡＡＶ９ＣＢｎＬａｃＺ−（ｍｉＲ−１ＢＳ）１−（ｍｉＲ−１２２ＢＳ）１，およびＡＡＶ９ＣＢｎＬａｃＺ−（ｍｉＲ−１ＢＳ）３−（ｍｉＲ−１２２ＢＳ）３，を、それぞれ５×１０１３ＧＣ／ｋｇ体重）で、またはｓｃＡＡＶ９ＣＢＥＧＦＰ（２×１０１４ＧＣ／ｋｇ体重）を、静脈内（尾静脈）注射した。ｎＬａｃＺベクターを受けた動物を４週間後に剖検した；Ｘ−ｇａｌ−組織化学的染色用に、肝臓組織、心臓組織、および膵臓組織の８μｍ低温切片を作製した。ＥＧＦＰベクターを受けた動物を３週間後に剖検し、４％（ｗｔ／ｖｏｌ）パラホルムアルデヒドの経心臓的灌流によって固定した。低温薄切用に、脳、脊髄、肝臓、心臓、および筋肉を採取した。脳組織および頚髄組織は、１：５００希釈したウサギ抗−ＥＧＦＰ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、続いて１：４００希釈したヤギ抗−ウサギ二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、１２ウェルプレート内で、浮遊切片として染色した。ＣＮＳ外で、ＥＧＦＰ発現は蛍光により直接検出された。倍率×１０のＮｉｋｏｎ ＴＥ−２０００Ｓ倒立顕微鏡、ならびに肝臓、心臓、および筋肉には３秒、視床（脳）および頚髄には５秒の露光時間を使用して、ＥＧＦＰおよび抗体蛍光を記録した。
ｑＰＣＲによるベクターゲノム定量化。ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｗｅｓｔ Ｓｕｓｓｅｘ，ＵＫ）を使用し、製造業者の使用説明書に従って、選択された組織からゲノムＤＮＡを抽出した。定量的ＰＣＲは、ＳｔｅｐＯｎｅ Ｐｌｕｓ ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）内で、ＧｏＴａｑ ｑＰＣＲマスターミックス（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用し、Ｒｉｎｇ ＤＮＡおよび０．３μｍｏｌ／１のＥＧＦＰ−特異的プライマー（ＥＧＦＰ−ＦおよびＥＧＦＰ−Ｒ）を使用して、三重に実施した。
ｑＲＴ−ＰＣＲ分析。ＲＮＡは、Ｔｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用し、製造業者の使用説明書に従って抽出した。総ＲＮＡ（０．５〜１．０μｇ）は、ランダムヘキサマーまたはｏｌｉｇｏ（ｄＴ）でプライミングし、ＭｕｌｔｉＳｃｒｉｂｅ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で逆転写した。定量的ＰＣＲは、ＳｔｅｐＯｎｅ Ｐｌｕｓ Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｄｅｖｉｃｅ内で、ＧｏＴａｑ ｑＰＣＲマスターミックスを使用して、０．３μｍｏｌ／１の遺伝子−特異的プライマー対（ｎＬａｃＺ５’Ｆ／５’Ｒ、ｎＬａｃＺ３’Ｆ／３’Ｒ、サイクリンＧ１Ｆ／ＲおよびＥＧＦＰ−Ｆ／ＥＧＦＰ−Ｒ）で三重に実施した。ｎｌａｃＺ ｍＲＮＡの５’末端および３’末端に由来するｑＲＴ−ＰＣＲ産物の特異性は、ゲル電気泳動法で確認した。
ノーザンブロット分析。総ＲＮＡは、マウス肝臓から抽出し、ノーザンハイブリダイゼーションで分析した。ｎＬａｃＺｍＲＮＡを検出するために、ｎＬａｃＺ ｃＤＮＡの６１８ｂｐフラグメントを、ｐＡＡＶＣＢｎＬａｃＺのＮｃｏＩおよびＰｃｉＩ消化によって分離し、ランダムプライミングによってα−３２Ｐ ｄＣＴＰで標識した（Ｔａｋａｒａ，滋賀，日本）。切断されたｎＬａｃＺ ｍＲＮＡの３’フラグメントを検出するために、Ｒｉｂｏｐｒｏｂｅ Ｓｙｓｔｅｍ Ｔ７キット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用したインビトロ転写中に、α−３２Ｐ ＣＴＰで標識されたアンチセンスＲＮＡプローブを調製するために、ベクターゲノム中のポリ（Ａ）配列の１１１ｂｐフラグメントをｐＣＲ４−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングした。総肝臓ＲＮＡ中のｍｉＲ−１２２、ｍｉＲ−２６ａ、ｍｉＲ−２２、およびｌｅｔ−７またはＵ６を検出するために、低分子量ＲＮＡを変性１５％ポリアクリルアミドゲルで溶解し、Ｈｙｂｏｎｄ Ｎ＋膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）にトランスファーし、２５４ｎｍ光（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）で架橋させた。Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）を使用してγ−３２Ｐ ＡＴＰで５’末端を標識した、合成オリゴヌクレオチドを、ＤＮＡプローブとして使用し（表４）、３７℃のＣｈｕｒｃｈバッファ（０．５ｍｏｌ／ｌ ＮａＨＰＯ４，ｐＨ７．２，１ｍｍｏｌ／ｌ ＥＤＴＡ，７％（ｗ／ｖ）ドデシル硫酸ナトリウム）中でハイブリダイズした。１×ＳＳＣ（１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウム）、０．１％ドデシル硫酸ナトリウムバッファを使用して膜を洗浄し、次いでＦＬＡ−５１００ Ｉｍａｇｅｒ（富士フィルム，東京，日本）を使用して可視化した。
ウェスタンブロット分析。プロテアーゼインヒビター混合物（Ｂｏｓｔｏｎ ＢＰ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）を含む放射性免疫沈降分析バッファ［２５ｍｍｏｌ／１ Ｔｒｉｓ−ＨＣ１，ｐＨ ７．６，１５０ｍｍｏ１／１ ＮａＣｌ，１％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ＮＰ−４０、１％（ｗｔ／ｖｏｌ）デオキシコール酸ナトリウム、０．１％（ｗ／ｖ）ドデシル硫酸ナトリウム］で、タンパク質を抽出した。Ｂｒａｄｆｏｒｄ法（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｍｅｌｖｉｌｌｅ，ＮＹ）を使用して、タンパク質濃度を測定した。タンパク質試料（各５０μｇ）を１２％ポリアクリルアミドゲル上に負荷し、電気泳動し、ニトロセルロース膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ）にトランスファーした。簡単に記載すると、膜をブロッキングバッファ（ＬＩ−ＣＯＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｌｉｎｃｏｌｎ，ＮＥ）を、室温で２時間ブロックし、続いて抗−ＧＡＰＤＨ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）、抗−サイクリンＧＩ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ）または抗−カルモジュリン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）のいずれかと共に、室温で２時間インキュベートした。０．１％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳで３回洗浄した後、膜を、ＬＩ−ＣＯＲ ＩＲＤｙｅに接合された二次抗体と共に、室温で１時間インキュベートし、次いでＯｄｙｓｓｅｙ Ｉｍａｇｅｒ（ＬＩ−ＣＯＲ）を使用して抗体を検出した。
β−ガラクトシダーゼアッセイ。タンパク質を放射性免疫沈降分析バッファで抽出し、上記の通りに定量化した。Ｇａｌａｃｔｏ−Ｓｔａｒ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用し、製造業者の使用説明書に従って、５０μｇのタンパク質を各β−ガラクトシダーゼ検定に使用した。
５’ＲＡＣＥ。５’ＲＡＣＥを記述通りに実施した。５’ＲＡＣＥ ＯｕｔｅｒＰｒｉｍｅｒおよびｎＬａｃＺ遺伝子特異的プライマーｂＧＨｐｏｌｙＡＲ（表４）を、第１回ネステッドＰＣＲに使用した。５’ＲＡＣＥＩｎｎｅｒＰｒｉｍｅｒおよびｎＬａｃＺ遺伝子特異的プライマーｎＬａｃＺｐｏｌｙＲ（ｎＬａｃＺ ｃＤＮＡの終止コドン付近に位置する）を第２回ネステッドＰＣＲに使用した（表４）。ＰＣＲ産物をｐＣＲ−４．０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にＴＯＰＯ−クローニングして配列決定した。
統計解析。全ての結果を平均値±ＳＤとして報告し、両側Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ検定法を使用してグループ間で比較する。
例９：ｒＡＡＶの静脈内注射は、新生仔マウスＣＮＳで広範な形質導入を仲介した。
本例の序文
この例は、９つのｓｃＡＡＶベクターを全身投与した後のＣＮＳ遺伝子移入特性に関する分析について記述する。この試験は、ＣＮＳ遺伝子移入により効果的なベクターを同定することを含んでいた。幾つかの態様で、本試験は、ＢＢＢの浸透強化について、ｒＡＡＶの血清型または天然の変異体を試験した。場合によって、本試験は、出生後１日（Ｐ１）に顔面静脈注射をした後、ＣＮＳへの高感度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）の送達が改善されたｒＡＡＶベクターを同定しようとした。ＡＡＶ９は本試験に含まれていた。本試験では、ｒＡＡＶ２およびｒＡＡＶ５を除き、他の全ての７ベクターが様々な形質導入効率でＢＢＢを越え（中でもｒＡＡＶｒｈ．１０、ｒＡＡＶｒｈ．３９、ｒＡＡＶｒｈ．４３、ｒＡＡＶ９およびｒｈＡＡＶ７が上位５位を占めた）、ＣＮＳ全体にわたり神経細胞およびグリア細胞の両細胞で強力なＥＧＦＰ発現を仲介した。ｒＡＡＶｒｈ．１０の性能はｒＡＡＶ９の性能と類似しており、場合によっては優れていた。幾つかのｒＡＡＶは、神経細胞、運動ニューロン、星状細胞およびプルキンエ細胞を効率的に形質導入し；その中で、ｒＡＡＶｒｈ．１０は、試験した領域の多くで、少なくともｒＡＡＶ９と同じくらい効率的である。静脈内送達されたｒＡＡＶは、ＣＮＳで異常な小膠細胞症を引き起こさなかった。ＣＮＳで安定した広範な遺伝子移入を達成したｒＡＡＶは、ＣＮＳの広い領域を冒す神経学的障害のための治療用ベクターとして、ならびに神経科学調査研究のための便利な生物学的ツールとして、有用である。
結果
Ｐ１マウスにベクターを投与した２１日後、以下の、ＥＧＦＰをコードしている組み換えＡＡＶベクターのＣＮＳ形質導入プロフィールを比較した：ｒＡＡＶ１、ｒＡＡＶ２、ｒＡＡＶ５、ｒＡＡＶ６、ｒＡＡＶ６．２、ｒＡＡＶ７、ｒＡＡＶ９、ｒＡＡＶｒｈ．１０、ｒＡＡＶｒｈ．３９およびｒｈＡＡＶｒｈ．４３。この試験で使用したベクターは、純度および形態学的完全性の点で類似していた（図１９）。本法に記載の採点システムによって評価するとき、ｒＡＡＶ９は成績優秀者の中でも最たるものであった；テストした他の殆どのｒＡＡＶ（ｒＡＡＶ１、ｒＡＡＶ６、ｒＡＡＶ６．２、ｒＡＡＶ７、ｒＡＡＶｒｈ．１０、ｒＡＡＶｒｈ．３９およびｒＡＡＶｒｈ．４３）も、ＣＮＳ全体にわたってＥＧＦＰ発現を生じさせた（表２）。亜解剖学的構造の中で、見掛け上ＥＧＦＰ陽性の細胞数（表５）は使用した特定のベクターに影響を受けた。ｉ．ｖ．送達後、ＢＢＢを透過してＣＮＳ形質導入を成し遂げた、これら７つのｒＡＡＶ、およびｒＡＡＶ９（合計８つのｒＡＡＶ）については、視床下部に続いて延髄、線条体、海馬、皮質および小脳で、ＥＧＦＰ陽性細胞が見られた。対照的に、嗅球および視床における形質導入効率は比較的低かった（表５）。各ｒＡＡＶのＥＧＦＰ遺伝子移入効率の定量的評価がなされた。Ｎｉｋｏｎ ＮＩＳ ｅｌｅｍｅｎｔｓ ＡＲ ソフトウェアＶ．３２を使用して、各ｒＡＡＶについて、各領域における平均ＥＧＦＰ強度／ピクセルを定量的に分析するために、脳内の亜解剖学的および機能的に重要な１２の領域を選択した（図１９ａ）（方法参照）。ｉ．ｖ．注射後にＣＮＳ形質導入を達成した８ベクターについては、平均ＥＧＦＰ強度／ピクセルは、皮質、手綱核、アンモン角、歯状回、視床、小脳および嗅球で比較的低く、脈絡叢および尾状核被殻では中等度であったが、視床下部、延髄および扁桃では高かった（図１９ａ）。様々なｒＡＡＶについて、全１２領域の平均ＥＧＦＰ強度を図１９ｂで比較した。ＡＡＶｒｈ．１０、ＡＡＶｒｈ．３９およびＡＡＶｒｈ．４３は、脳における遺伝子形質導入効率で際立っており、その後にＡＡＶ７、ＡＡＶ９、およびＡＡＶ１が続いた（図１９ａおよび図１９ｂ）。これらの効果的な８血清型は脊髄全体にわたって、様々な程度に、ＥＧＦＰ発現も仲介した。脊髄の頚部切片、胸部切片および腰部切片における各ｒＡＡＶについて、同じ定量分析を実施した（図１９ａ）；様々なｒＡＡＶについて、３切片の平均ＥＧＦＰ強度も比較した（図１９ｂ）。ＡＡＶ１、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ．ｒｈ３９およびＡＡＶ．ｒｈ４３は、脊髄で強力な形質導入を示し、高いＥＧＦＰ強度が脊髄の頚部で確認され、その後に脊髄の胸部切片および腰部切片が続いた（図１９ａおよび１９ｂ）。ｒＡＡＶ２については、海馬、皮質および視床下部にＥＧＦＰ−陽性細胞はほとんどなかった。ＡＡＶ５注射したマウスでは、視床下部にＥＧＦＰ−陽性細胞が認められた。様々なＣＮＳ構造で行われた観察結果を以下に記述する。亜解剖学的ＣＮＳ構造は、ＣＮＳ遺伝子療法の標的の役割を果たす可能性がある。場合によっては、亜解剖学的ＣＮＳ構造は、１つ以上の神経学的障害の病理学的変化と関連している。場合によっては、亜解剖学的ＣＮＳ構造は、１つ以上のｒＡＡＶに対して、異なる形質導入プロフィールを有する。
線条体。線条体の病理は、ハンチントン病、舞踏病、舞踏病アテトーゼ、およびジスキネジアと関連している。耽溺は、線条体シナプスの可塑性を含むことがある。新生仔マウスにおけるｒＡＡＶ９の全身性注射は、線条体組織を形質導入する。この試験で、この領域における神経細胞の形態を有する多数の細胞も、ｒＡＡＶｒｈ．１０により形質導入され（図２０）、これは下記の通り神経細胞のマーカーを用いた共染色によって確認された。ｒＡＡＶｒｈ．３９およびｒＡＡＶ７を含む、他のベクターも、線条体で中等度の形質導入を仲介した（図２０）。対照的に、ｒＡＡＶ６、ｒＡＡＶ６．２、およびｒＡＡＶ１は、この構造で相対的に低いＥＧＦＰを発現する結果となった（図２０）。
海馬。海馬は、長期記憶および空間ナビゲーションと関連した領域であり、通常、ストレスおよび癲癇や統合失調症等の疾病の原因によって損傷を受ける。静脈内ｒＡＡＶｒｈ．１０、ｒＡＡＶ９、ｒＡＡＶ７、ｒＡＡＶｒｈ．３９、およびｒＡＡＶｒｈ．４３を受けたマウスでは、多くのＥＧＦＰ−陽性神経細胞が、海馬の全領域で、すなわち歯状回、門、ＣＡ１、ＣＡ２およびＣＡ３で、両側に見られた（この構造における形質導入効率によってランク付けした、表５ならびに図１９および図２０）。神経細胞形質導入パターンに加えて、ＥＧＦＰ−陽性細胞は星状細胞の形態学的外観を有していた（図２０）。このことは、下記の通りＥＧＦＰに対する抗体および星状膠細胞マーカーを用いた二重染色法でさらに確認された。静脈内送達されたｒＡＡＶ１、ｒＡＡＶ６およびｒＡＡＶ６．２ベクターについては、少数のＥＧＦＰ−陽性細胞が海馬にあった（図２０）。
皮質。皮質における病理学的変化は、アルツハイマー病およびパーキンソン病に関係があるとされてきた。ＡＡＶ７、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ．１０、ＡＡＶｒｈ．３９およびＡＡＶｒｈ．４３ベクターは、皮質で中等度のＥＧＦＰ形質導入を達成した（表５ならびに図１９および図２０）。細胞マーカー染色法および共焦点顕微鏡分析法でさらに確認するとき、形質導入細胞の形態学は、神経細胞および星状細胞の両者と一致していた。顕著なＥＧＦＰ−陽性細胞は一般に、後部無顆粒島皮質、梨状皮質、外側嗅内皮質、後外側皮質扁桃核および後内側皮質扁桃核を含む、皮質の腹側外側領域で認められた（図２０）。強いＥＧＦＰ信号は、ブレグマ（０．０ｍｍ）に関して、＋１．５ｍｍから−３．３ｍｍに及んだ。ｒＡＡＶｒｈ．１０、ｒＡＡＶ９、ｒＡＡＶｒｈ．３９およびｒＡＡＶｒｈ．４３の皮質形質導入効率は類似していた（表５ならびに図１９および図２０）。ＡＡＶ１、ＡＡＶ６およびＡＡＶ６．２ベクターも、皮質内の細胞を形質導入した（図２０）。
視床下部。視床下部が果たす役割は、神経ホルモンを分泌して、ある特定の代謝過程を制御することである。視床下部はまた、糖尿病の病因でも指摘される。８ベクターについて、ＥＧＦＰ信号が視床下部で観測された。ｒＡＡＶｒｈ．１０の静脈内投与は、視床下部全体で、最高のＥＧＦＰ発現をもたらし、その後にｒＡＡＶｒｈ．３９、ｒＡＡＶ７、ｒＡＡＶ６．２、ｒＡＡＶｒｈ．４３、ｒＡＡＶ９、ｒＡＡＶ１およびｒＡＡＶ６が続いた（図１９および図２０ならびに表５）。興味深いことに、この構造内の殆どのＥＧＦＰ−陽性細胞は、下記の通り、星状細胞の細胞型特異的マーカーの免疫染色によって確認された、星状細胞の形態学を有していた。星状細胞のＥＧＦＰ信号は、他の形質導入細胞の形態学的詳細の直接検査を不明瞭にする傾向があった。しかし、下記の通り、これはＥＧＦＰに対する抗体および神経細胞マーカーを用いた、組織切片の二重免疫蛍光染色によって明確にされた。
小脳。小脳の病変は、小脳認知情動症候群、発達性協調運動障害、後頭窩症候群、言語欠陥、加齢、注意欠陥多動障害、自閉症、痴呆および統合失調症等の疾病でしばしば見られる。殆どのｒＡＡＶベクターについて、ＥＧＦＰ−陽性細胞およびＥＧＦＰ−陽性繊維が、小脳で検出された（表５ならびに図１９および図２０）。ｒＡＡＶ７、ｒＡＡＶ９、ｒＡＡＶｒｈ．１０、ｒＡＡＶｒｈ．３９およびｒＡＡＶｒｈ．４３については、多数のＥＧＦＰ発現細胞がプルキンエ細胞層および果粒細胞層で見られた（図２０）。ｒＡＡＶ１ベクターの形質導入プロフィールは、果粒細胞層内の細胞における発現を示したが、ｒＡＡＶ６およびｒＡＡＶ６．２は、プルキンエ細胞層内の細胞に局在していた（図２０）。
延髄。延髄は、慢性疼痛を治療するための潜在的な遺伝子療法標的である。殆どのｒＡＡＶは、延髄における中等度から強力なＥＧＦＰ発現を仲介し、殆どの緑色細胞は外縁に存在していた（図２０）。この領域におけるこれらのｒＡＡＶの形質導入効率は、次の順序でランク付けされた：ｒＡＡＶｒｈ．３９＝ｒＡＡＶｒｈ．４３＞ｒＡＡＶ．ｒｈ１０＞ｒＡＡＶ１＞ｒＡＡＶ９＞ｒＡＡＶ７＞ｒＡＡＶ６．２＞ｒＡＡＶ６（表５および図１９ａ）。殆どのＥＧＦＰ−形質導入細胞の形態は、星状細胞である細胞と一致していた。
脊髄。脊髄は、運動ニューロン病に関与している。ｒＡＡＶｒｈ．１０、ｒＡＡＶ９、ｒＡＡＶｒｈ．３９およびｒＡＡＶｒｈ．４３は、頚部灰白質および白質で、非常に強いＥＧＦＰ発現を生じさせたが、ｒＡＡＶ１、ｒＡＡＶ６．２およびｒＡＡＶ７は中等度のＥＧＦＰ強度を示した（表５ならびに図１９および図２１）。ｒＡＡＶ１については、ＥＧＦＰ信号が白質で認められた。全ての効果的なｒＡＡＶの形質導入能力は、頚部から腰髄まで低下した。ＥＧＦＰ−陽性細胞は、後者領域で目に見えた。星状細胞の形態を有するＥＧＦＰ−陽性細胞の大集団が、脊髄全体にわたって認められた（図２１）。加えて、ｒＡＡＶｒｈ．１０、ｒＡＡＶ９、ｒＡＡＶｒｈ．３９、ｒＡＡＶｒｈ．４３およびｒＡＡＶ７はまた、脊髄の腹側領域内の、運動ニューロン形態を有する細胞も形質導入した（図２１）。上行後索線維は明らかなＥＧＦＰ信号を示した。加えて、後根神経節（ＤＲＧ）は、ＤＲＧ神経細胞で強いＥＧＦＰ発現を伴う顕著な形質導入を示した（図２２および図２６）。脊髄におけるｒＡＡＶ形質導入細胞型の同一性は、下記の通り、ＥＧＦＰに対する抗体および細胞型特異的マーカーを用いた共蛍光免疫染色によって特性決定した。
ＡＡＶベクターのＩＶ投与は、ＣＮＳにおける様々な細胞型の形質導入につながる
ＣＮＳの様々な領域における形質導入細胞の同一性を確認するために、ＥＧＦＰに対する抗体およびＮｅｕＮ（一般的な神経細胞マーカー）、グリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ；星状細胞マーカー）、カルビンジン−Ｄ２８Ｋ（プルキンエ細胞マーカー）、およびコリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ；運動ニューロンマーカー）を用いて二重免疫蛍光染色を実施した（図２３）。免疫染色の結果から、多数のＮｅｕＮ陽性細胞がマウス脳の全体にわたってＥＧＦＰを発現することが分かり、これは広範な神経細胞の形質導入を示す。高密度の形質導入神経細胞を有する領域としては、線条体、海馬、皮質および視床下部などがあった。ｒＡＡＶｒｈ．１０、ｒＡＡＶ９、ｒＡＡＶ７およびｒＡＡＶｒｈ．３９ベクターは、神経細胞の形質導入を仲介する上で効率的であり、その後にＡＡＶ６．２、ＡＡＶ１およびＡＡＶ６が続いた（図１９および図２３）。加えて、黒質におけるドーパミン作動性ニューロンは、ＡＡＶ．ｒｈ１０によって形質導入された（図２３）。ＣＮＳにおける形質導入細胞は、小細胞体および高度に分枝した突起を有するＧＦＡＰ−陽性星状細を含んでいた（図２３）。細胞体およびそれらの樹状突起の両者でＥＧＦＰ発現を示し、カルビンジン−Ｄ２８Ｋ免疫染色法で、プルキンエ細胞として、小脳における多数の形質導入細胞の同一性が確認された（図２３）。プルキンエ細胞を形質導入する上で能力の高いｒＡＡＶは、以下を含む：ｒＡＡＶｒｈ．１０、ｒＡＡＶ９、ｒＡＡＶｒｈ．３９、ｒＡＡＶ７、ｒＡＡＶ６．２およびｒＡＡＶｒｈ．４３。ｒＡＡＶ１およびｒＡＡＶ６は、プルキンエ細胞の一部を比較的低いＥＧＦＰ強度で形質導入した（図１９）。幾つかのｒＡＡＶベクターについては、脊髄腹側部に大きいＥＧＦＰ＋／ＣｈＡＴ＋細胞が存在することによって、運動ニューロンの形質導入が確認された（図２３）。ｒＡＡＶｒｈ．１０、ｒＡＡＶ９、ｒＡＡＶ７、ｒＡＡＶｒｈ．３９は、類似した効率の運動ニューロンの形質導入を示した（図２１）。
ＡＡＶベクターのＩＶ投与は、脳室および脳血管で強い形質導入を仲介した。
ｒＡＡＶｒｈ．３９、ｒＡＡＶｒｈ．１０、ｒＡＡＶｒｈ．４３、ｒＡＡＶ７およびｒＡＡＶ９を注入した動物の側脳室、第三脳質および第四脳室における脈絡叢細胞で、ＥＧＦＰ発現が認められた（形質導入効率によってランク付けした、表５ならびに図１９および図２４）。同じマウス脳の様々な脳室におけるＥＧＦＰ発現は類似していた（図２４）。脳室の内側を覆う脳室上皮細胞も形質導入された。ＥＧＦＰ−陽性細胞の分布に関する観察結果は、明らかな勾配を示し、形質導入細胞数は脳室周囲領域で最多数であり、また脳室までの距離が増加するにつれて次第に減少した。このことは、側脳室よりも、第三脳室および第四脳室の周囲の領域で明白であった（図２４）。マウスの脳および脊髄の全体にわたる血管でも、広範なＥＧＦＰ信号が見られた。これは、ＥＧＦＰに対する抗体および血管内皮特異的マーカー、ＣＤ３４を用いた二重の免疫蛍光染色法によって検証された（図２７ａおよび図２７ｂ）。脳実質の様々な領域におけるｒＡＡＶ形質導入プロフィールと違って、ＣＮＳ全体にわたる血管のＥＧＦＰ形質導入は、所与のあらゆるベクターで、比較的一様である。しかし、血管の形質導入は、使用した特定のｒＡＡＶによる影響を受けた。大半のｒＡＡＶは、ＣＮＳで、中等度（たとえば、ｒＡＡＶ６）ないし極めて効率的な（たとえばｒＡＡＶｒｈ．１０）血管形質導入を仲介した。
ＡＡＶベクターのＩＶ注射は、小膠細胞症を引き起こさなかった。
脳切片を、Ｉｂａ−１に対する抗体でも染色して、小膠細胞を標識した。ｒＡＡＶｒｈ．１０を受けたマウス由来の切片におけるＩｂａ−１−陽性細胞は、未処理マウスまたはＰＢＳ注射マウスにおけるもの同然であった（図２８）。この結果は、血管内送達されたｒＡＡＶが、Ｐ１新生仔に注射した３週間後に、マウスのＣＮＳで持続性の炎症を引き起こさないことを示した。
結果の考察
この試験では、新生仔マウスで、血管内注入により送達された異なる１０のｒＡＡＶベクターについて、ＣＮＳ形質導入プロフィールを評価した。殆どのｒＡＡＶは、ＢＢＢを越えることができ、様々な程度の効率で新生仔マウスＣＮＳへの遺伝子移入を仲介する（図１９〜２１および表５）。ＣＮＳにおける総体的なＥＧＦＰ発現によって評価するとき、ｒＡＡＶｒｈ．１０、ｒＡＡＶｒｈ．３９、ｒＡＡＶｒｈ．４３、およびｒＡＡＶ９は、全身投与後、類似した形質導入能力および細胞トロピズムを有する効果的なｒＡＡＶである。具体的には、線条体、海馬、皮質、視床下部、小脳、延髄、および頚髄、を含む、マウスＣＮＳにおける多くの領域が、かなりのＥＧＦＰ発現を示した。加えて、ｒＡＡＶ６．２およびｒＡＡＶ７も効果的であった。ＡＡＶ１およびＡＡＶ６は、ＣＮＳ形質導入を達成した（表５）。殆どのｒＡＡＶについては、免疫染色せずに、脳切片および脊髄切片で自然のＥＧＦＰ発現が検出できた（図２９）。
この例には、若い患者のためを含む、ＣＮＳ関連の障害の遺伝子療法のための臨床的意義があった。種々の神経性疾患には、不可逆的ＣＮＳ損傷を予防するために幼年期の間の早期治療が必要なことがある。ｒＡＡＶが様々な領域で多くの神経細胞を形質導入する能力は、脊髄性筋萎縮症、神経セロイドリポフスチン症、および脊髄小脳変性症等の神経性疾患を治療するのに適切である。プルキンエ細胞および顆粒層細胞を形質導入する上でのいくつかのｒＡＡＶベクターの効率は、脊髄小脳運動失調の治療にベクターを使用することが可能なことを示す。分泌される神経栄養因子を発現するｒＡＡＶによる星状細胞の形質導入もまた、カナバン病や筋萎縮性側索硬化症等の多くの神経変性疾患に有益な可能性がある。ＣＮＳにおける血管的形質導入は、脳虚血および卒中の治療に適切な可能性がある。血管内ｒＡＡＶ−介在性遺伝子送達の臨床応用は、末梢神経系（ＰＮＳ）にも及ぶ可能性がある。ＤＲＧの効率的な形質導入は、慢性疼痛に罹患している患者に新たな治療戦略を提供する。
ＣＮＳへの全身的遺伝子送達は、調査研究で遺伝子発現を操作する方法としても有用である。ｒＡＡＶの静脈内投与による、ＣＮＳにおける有効でかつ安定した導入遺伝子発現は、体細胞トランスジェニック動物モデルの確立に応用できる可能性があり、これは従来の遺伝子導入より安価で、速くかつ簡単な可能性がある方法である。体細胞ＣＮＳ遺伝子ノックダウン動物モデルを、本明細書に記載の方法を使用して作り出すことも可能である。
一部のｒＡＡＶは実際に、ＣＮＳで独特の形質導入プロフィールを証明した。たとえば、ｒＡＡＶ１は、形質導入された果粒細胞を小脳で示したが、ｒＡＡＶ６およびｒＡＡＶ６．２はプルキンエ細胞を形質導入し、また両タイプの細胞を形質導入したものもあった（図９）。このことは、いったんＢＢＢを越えると、ｒＡＡＶは明確なトロピズムを示すが、全てのベクターで使用されたベクターゲノムは同じであったため、これはカプシドに原因があると考えられる。
本明細書に開示されているＡＡＶ血清型は、脳毛細血管内皮細胞、神経細胞および星状細胞を効率的に形質導入できる。このことは、これらのベクターが、たぶんＢＢＢを越えることによって、循環から浸出してＣＮＳ実質に到達することが可能なことを示す。ＡＡＶは、トランスサイトーシス経路によって内皮バリアーを越えることが可能である。この試験で、脈絡叢およびそれらの周囲の実質組織は、効率的に形質導入された。加えて、脳室周囲組織（高い）から深部実質組織（低い）まで、ＥＧＦＰ強度の明白な勾配があった。これらの観察結果は、ＡＡＶが脈絡叢を通り抜けて新生仔マウスＣＮＳに入り、続いてＣＳＦおよび／または間質液流を介して広範に分布し、神経細胞およびグリア細胞を形質導入することが可能なことを示す。
神経細胞特異的プロモーターまたはグリア特異的プロモーター（たとえばシナプシン−１等）、およびＧＦＡＰプロモーターを使用して、遺伝子発現を特異的細胞型に制限することが可能である。ターゲッテドＣＮＳ遺伝子送達を達成するためのさらなる方法は、転写後制御機序によって末梢組織をターゲット解除するために、ＲＮＡ干渉を使用する。マイクロＲＮＡ結合部位を導入遺伝子カセットの３’末端に付加することによって、ＡＡＶベクター全身投与後の導入遺伝子発現を、ＣＮＳ形質導入は維持しつつ、肝臓、心臓および骨格筋等の組織では減少または除去することが可能である。
材料と方法
ＡＡＶ製造
既述の通りに、２９３細胞の一時的形質移入方法およびＣｓＣｌ勾配沈降法を使用した、異なるＡＡＶのカプシドを有するＡＡＶ２由来の逆方向末端反復（ＩＴＲ）が隣接しているｒＡＡＶベクターゲノムのトランス−カプシド形成によって、ＳｃＡＡＶベクターを製造した。ベクター調製物は、定量的ＰＣＲで力価測定した。ベクターの純度は、４〜１２％ ＳＤＳ−アクリルアミドゲル電気泳動法および銀染色法（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）で評価した。本試験で使用した各ベクターの形態学的完全性は、負染色した組み換えＡＡＶビリオンの透過電子顕微鏡検査によって試験した。ｃＡＡＶベクターゲノムにおけるＥＧＦＰの発現は、ハイブリッドＣＭＶエンハンサー／ニワトリβ−アクチンプロモーターによって指令される。
新生仔マウス注射
野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウス同腹子を使用した。マウス繁殖は、計画的タイミング法を使用して実施した。Ｐ１に、新生仔に確実にベクターを投与できるように、妊娠マウスを、胎生１７日から２１日まで毎日監視した。注射される各同腹子の母親（単独収容）をケージから取り出した。ベクターを、ＰＢＳで４×１０１２ＧＣ／ｍＬの濃度に希釈し、続いて溶液１００μｌを３１Ｇインスリン注射器（ＢＤ Ｕｌｔｒａ−Ｆｉｎｅ ＩＩ Ｕ−１００ Ｉｎｓｕｌｉｎ Ｓｙｒｉｎｇｅｓ）に吸い込んだ。Ｃ５７ＢＬ／６マウスのＰ１仔を、イソフルランを使用して麻酔し、氷上に置いた。静脈内注射のために、解剖顕微鏡を使用して、側頭静脈（耳の直前に位置する）を可視化した。針を静脈に挿入して、プランジャーを手で押し下げた。正しい注射は、静脈のブランチングに注目することによって検証した。各仔は、浅側頭静脈を介して、４×１０１１ＧＣの様々なｓｃｒＡＡＶＣＢＥＧＦＰベクター（ｒＡＡＶ１、ｒＡＡＶ２、ｒＡＡＶ５、ｒＡＡＶ６、ｒＡＡＶ６．２、ｒＡＡＶ７、ｒＡＡＶ９、ｒＡＡＶｒｈ．１０、ｒＡＡＶｒｈ．３９、ｒＡＡＶｒｈ．４３；群当たりｎ＝６〜８マウス）を受けた。注射後、仔を注意深くきれいにし、本来の床敷で擦り、次いで本来のケージに戻した。次いで、エタノールパッドを使用して、鼻を短時間無感覚にした後、母親をケージに再導入した。
組織学的処理
本試験動物は、注射後２１日に麻酔し、次いで冷ＰＢＳ １５ｍＬを、続いてＰＢＳ中に０．２％のグルタルアルデヒド（ｖ／ｖ）と共に４％パラホルムアルデヒド（ｖ／ｖ）を含む固定液１５ｍＬを、経心臓的に灌流した。次いで、全死体を固定液中で５日間、後固定した。脊髄および脳を明視野解剖顕微鏡下で摘出し、ＰＢＳですすぎ、次いで４℃の、ＰＢＳ中３０％のスクロース（ｗ／ｖ）で凍結保護した。いったん組織をスクロース溶液の底まで沈め、組織をＴｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ ＯＣＴ化合物（Ｓａｋｕｒａ Ｆｉｎｅｔｅｋ，Ｔｏｒｒａｎｃｅ，ＣＡ）中に包埋し、ドライアイス／エタノール浴中で凍結した。組織塊を、−８０℃で薄切まで保管した。脳全体の連続した４０μｍ浮遊切片をＣｒｙｏｓｔａｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｍｉｃｒｏｍ ＨＭ５５０）で切断した。脊髄については、長さ３ｍｍの切片を頚部、胸部および腰部から取り、次いで、連続した４０μｍの横断切片を上記の通りに作製した。
免疫染色法および顕微鏡画像分析法
脳切片および脊髄切片を、１２ウェルプレート内で、浮遊切片として染色した。切片をＰＢＳ中で、各回５分間ずつ３回洗浄し、次いで、１％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００（ｖ／ｖ）（Ｆｉｓｈｅｒ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇ，ＰＡ）、５％ドライミルク（ｗ／ｖ）および１０％ヤギ血清（ｖ／ｖ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むブロッキング液中、室温で２時間、インキュベートした。次いで、この切片を、ブロッキング液で希釈した一次抗体と共に、４℃で一晩インキュベートした。翌日、組織切片を、ＰＢＳ中０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０（ｖ／ｖ）（ＰＢＳＴ）で２回と、ＰＢＳで１回洗浄した（各洗浄段階は１０分続いた）。その後、切片を、適切な二次抗体と共に、ブロッキング液中、室温で２時間、インキュベートした。切片を上記の通りに再度洗浄してからスライドガラスに載せた。ＤＡＰＩを含むＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）を使用して、全てのスライドをカバースリップし、次いで蛍光倒立顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｔｉ）か、または６３×油浸レンズおよびＤＭ−ＩＲＥ２倒立顕微鏡を具備するＬｅｉｃａ ＴＳＣ−ＳＰ２ ＡＯＢＳ共焦点顕微鏡を使用して、それらを分析した。本試験で使用した一次抗体は、以下の通りであった：ウサギ抗−ＧＦＰ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ヤギ抗−ＣｈＡＴおよびマウス抗−ＮｅｕＮ（両者ともＭｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）、マウス抗−ＧＦＡＰ（Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ）、ラット抗−ＣＤ３４（Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）、マウス抗−カルビンジンＤ−２８ｋ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）およびウサギ抗−ＤＡＲＰＰ（Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）。本試験で使用した二次抗体は、以下を含んでいた：ＤｙＬｉｇｈｔ ４８８ ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ ロバ抗−ウサギＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）；ＤｙＬｉｇｈｔ ５４９ ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ ロバ抗−ヤギＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）；ＤｙＬｉｇｈｔ ５４９ Ａｆｆｉｎｉｐｕｒｅ ヤギ抗−ラットＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）；ＤｙＬｉｇｈｔ ５９４ ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ ヤギ抗−マウスＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）；ヤギ抗−ウサギＩｇＧ−Ａｌｅｘａ フルロ ４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびヤギ抗−マウスＩｇＧ−Ａｌｅｘａフルロ５６８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。
様々なベクターによるＥＧＦＰ形質導入の半定量的比較および定量的比較
定量化可能でかつ比較可能なデータ形式を作成するために、半定量的採点システムを開発して、マウスＣＮＳの様々な領域における、様々なｒＡＡＶベクターの形質導入効率を推定した。簡単に記載すると、ＥＧＦＰ陽性細胞が皆無であった領域を（−）と表示した。ＥＧＦＰ陽性細胞が非常に少ない領域を（＋）と採点し、ＥＧＦＰ陽性細胞が若干であった領域を（＋＋）と位置づけ、ＥＧＦＰ陽性細胞が多かった領域を（＋＋＋）と表示した。最終的に、ＥＧＦＰ陽性細胞で満たされた領域を（＋＋＋＋）と表示した。
次に、脳切片、ならびに脊髄の頚部切片、胸部切片および腰部切片で、亜解剖学的および機能的に重要な１２領域を、Ｒｅｔｉｇａ ２０００−ＲＶ ＣＣＤ 冷却カメラを具備するＮｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｔｉ倒立顕微鏡で撮った画像の定量的分析用に選択した。Ｎｉｋｏｎ ＮＩＳ ｅｌｅｍｅｎｔｓ ＡＲソフトウェアｖ．３．２を強度定量化に使用した。定量化の前に、蛍光リファレンススライド（Ｔｅｄ Ｐｅｌｌａ，ｐｒｏｄ．２２７３）を使用して、強度／露光時間曲線をプロットすることにより、最適な光源強度および露光時間を得た。強度と露光時間には線形相関があった。加えて、露光過多および極端な露光不足は、線形相関をゆがめる。露光過多を避けるために、全ての切片に最大強度（ＮＤ１）および２０ｍｓ露光を使用した。定量化については、固定された対象領域（ＲＯＩ）を使用して、所与のあらゆる脳領域の中で最も明るい区域を定量化した。全ての血清型の各領域ごとに平均強度（総強度／ＲＯＩのサイズ）を得た。
例１０：カナバン病モデルにおける、ｒＡＡＶに基づいた治療の評価
本例の序文
ＣＤは、アスパルトアシラーゼ遺伝子（ＡＳＰＡ）における常染色体の劣性突然変異に起因する希少でかつ致命的な幼児期白質ジストロフィーである［Ｇ．Ｇ．の大学院の研究で立証された（１２）］。ＣＤ患者におけるＡＳＰＡ欠乏は、尿中Ｎ−アセチル−アスパラギン酸（ＮＡＡ）上昇（ＣＤの特徴）およびＣＮＳ全体にわたる白質の海綿状変性につながり、重度の精神運動遅滞および早期死亡を招来する。ＡＳＰＡ−／−マウスモデルは、ＣＤ患者でみられる神経病理学および臨床症状、すなわち、白質の海綿状変性、運動障害、発達遅延、および早期死亡（生後３週間以内）に似た症状を呈する。
この試験で、ＣＤマウスにおけるびまん性白質変性を治療するために、静脈内送達可能なｒＡＡＶを使用してＣＮＳを全体的にターゲットした。新生仔ＣＤマウスにＡＳＰＡベクターを単回静脈内注射することにより、代謝障害、精神運動機能不全および他の疾病表現型を直し、生存期間を延長した。未処置ＣＤマウスは、生後第２週に成長遅滞、精神運動機能不全を示し始め、離乳後間もなく一様に死亡したが、処置マウスは、ベクター注射の２週間後に体重が増加し始め、７〜８週以内にそれらのヘテロ接合同腹子にほぼ追い付いた。ＣＤマウスと違って、処置動物の可動性は野生型同腹子と類似していた。処置マウスに対するローターロッドテストのデータは、処置ＣＤマウスとそれらの同年令野生型同腹子との間で待機時間に有意差はないことを表し、遺伝子療法は、ＣＤの例示的な神経筋症状である、運動失調を直すことを示した。生化学的特性決定は、尿試料中のＮＡＡレベルの低下ならびに脳組織および腎臓組織におけるＡＳＰＡ活性の回復を示した。生化学的表現型および臨床表現型の緩和は、脳、脊髄のみならず、腎臓等の末梢組織でも、全体的に寛解した組織病理とよく相関し、ＣＤはＣＮＳ障害に限らないことを示した。
結果
Ｐ１のＣＤマウスにＡＡＶ９ＡＳＰＡを投与した（顔面静脈、４×１０１１ＧＣ）。成長、足取り、ローターロッドを用いた運動機能、尿中ＮＡＡレベルおよび脳内ＡＳＰＡ活性についてマウスを監視した。結果から以下のことが分かった。ｉ）未処置ＣＤマウスは、生後第２週に体重減少を始め、第３週に死亡した；ｉｉ）処置動物は、第５週の間に成長する能力を回復して第１０週までにＡＳＰＡ＋／−動物に追いついた；ｉｉｉ）．ローターロッドテストで測定するとき、遺伝子療法は、Ｐ１に処置した、ＣＤマウスの足取りならびにＣＤマウスの運動機能を完全に直した（図３０Ａ）；ｉｖ）．遺伝子療法はＣＤマウスの視力を回復した。ＣＤマウスの眼に対する網膜電図写真（ＥＲＧ）テストは、光への記録不可能な応答を示したが、処置したＣＤマウスでは、明確に定義されたＥＲＧ応答が容易に検出できた（図３０Ｂ）。これらのデータから、ＣＤマウスにおける、より重症の網膜症および視力喪失ならびに遺伝子療法はＣＤマウスの網膜症を緩和して視力を回復することが分かる；ｖ）．遺伝子療法は、処置ＣＤマウスにおけるＮＡＡレベルが対照マウスにおけるものに近づいたため、ＮＡＡの代謝障害を明らかに改善した（図３０Ｃ）；およびｖｉ）ＮＡＡ代謝の是正は、処置ＣＤマウスの脳におけるＡＳＰＡ発現の回復（図３０Ｅ）および活性（図３０Ｄ）の回復とよく相関していた。
表現型の是正が、処置ＣＤマウスの脳切片における神経病理緩和ならびにＡＳＰＡの原位置発現と相関しているかどうかを決定するために、遺伝子療法の３カ月後に、神経病理学およびＡＳＰＡ免疫組織化学について脳切片を分析した。未処置マウス脳は、脳および脊髄の全領域を散在的に含む著明な空胞形成を示すが、処置動物の脳および脊髄の両者における空胞形成は、より斑状でかつ多様であり、概してより小さいサイズの空胞を示すようである。大脳皮質の一部の区域は、空胞形成を殆ど何も示さない（図３１Ａ）。加えて、大脳皮質原位置におけるＡＳＰＡ発現を検出するために、アビジン−ビオチン複合体（ＡＢＣ）系を使用して、脳切片を染色した（図３１Ｂ）。処置ＣＤマウスにおける神経病理学の改善に関する定量的測定値を生成するために、遺伝子療法処置の前後に、ＣＤマウスにおける白質変性に起因する、脳切片および脊髄切片の「空胞」を定量化した。この定量的分析のために、Ｎｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｔｉ倒立顕微鏡およびＮｉｋｏｎ ＮＩＳ ｅｌｅｍｅｎｔｓ ＡＲソフトウェアＶ．３．２を使用した。＞３，０００ピクセル、１，０００〜３，０００ピクセルおよび１００〜１，０００ピクセルであった空胞を、それぞれ大型空胞、中型空胞および小型空胞と定義した。この実験で評価した５脳領域の中で、嗅球は、遺伝子療法後、白質変性における最も劇的な緩和を示した（図３２Ａ）。他の３領域については、大型空胞は完全に除去され、また中型空胞数は著明減少したが、小型空胞（＜１００ｕｍ）数の減少は、この実験では有意ではなかった（図３２Ａ）。脊髄切片に対する同じ分析は、同様の傾向を示した（図３２Ｂ）。
ＣＤマウスにおける腎臓の組織病理学を評価した。糸球体は正常な構造を示したが、ボーマン隙の拡張を随伴していた。腎尿細管上皮は、尿細管内腔の拡大と関連して、びまん的に減弱（または委縮）していた（図３３Ａ）。対照的に、処置ＣＤマウスは正常な糸球体を有していた。腎尿細管上皮細胞は首尾よく染色され、その量は正常であった（図３３Ｂ）。こうした結果は、ＣＤの病態生理学における腎臓の関与およびＣＤ遺伝子療法の末梢標的としての腎臓を示す。この結果は、ＣＤ遺伝子治療用のベクトル選択の検討事項としての、ＡＡＶベクターの腎トロピズムも示す。１０週令のＣ５７ＢＬ／６マウスに静脈内送達した後の、腎臓形質導入の効率について、２ベクター、ｒＡＡＶ９およびｒｈ．１０を評価した。結果は、ｒＡＡＶｒｈ．１０は効率的なＣＮＳ形質導入（図３３Ｃ）に加えて、腎臓を効率的に形質導入するため、ＣＤ遺伝子療法のための有用なベクターとしてｒＡＡＶｒｈ．１０が使用される（図３３Ｄ）ことを示した。
核酸配列およびアミノ酸配列
＞ｇｉ｜９６３２５４８｜ｒｅｆ｜ＮＰ＿０４９５４２．１｜カプシドタンパク質［アデノ随伴ウイルス−１］
（配列番号１）
MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWDLKPGAPKPKANQQKQDDGRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLRYNHADAEFQERLQEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEGAKTAPGKKRPVEQSPQEPDSSSGIGKTGQQPAKKRLNFGQTGDSESVPDPQPLGEPPATPAAVGPTTMASGGGAPMADNNEGADGVGNASGNWHCDSTWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSASTGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTTNDGVTTIANNLTSTVQVFSDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEEVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLNRTQNQSGSAQNKDLLFSRGSPAGMSVQPKNWLPGPCYRQQRVSKTKTDNNNSNFTWTGASKYNLNGRESIINPGTAMASHKDDEDKFFPMSGVMIFGKESAGASNTALDNVMITDEEEIKATNPVATERFGTVAVNFQSSSTDPATGDVHAMGALPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKNPPPQILIKNTPVPANPPAEFSATKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEVQYTSNYAKSANVDFTVDNNGLYTEPRPIGTRYLTRPL
＞ｇｉ｜１１０６４５９２３｜ｒｅｆ｜ＹＰ＿６８０４２６．１｜主要コートタンパク質ＶＰ１［アデノ随伴ウイルス−２］
（配列番号２）
MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEPVKTAPGKKRPVEHSPVEPDSSSGTGKAGQQPARKRLNFGQTGDADSVPDPQPLGQPPAAPSGLGTNTMATGSGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTNTPSGTTTQSRLQFSQAGASDIRDQSRNWLPGPCYRQQRVSKTSADNNNSEYSWTGATKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPQSGVLIFGKQGSEKTNVDIEKVMITDEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNRQAATADVNTQGVLPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPSTTFSAAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRNL
＞ｇｉ｜５１５９３８３８｜ｒｅｆ｜ＹＰ＿０６８４０９．１｜カプシドタンパク質［アデノ随伴ウイルス−５］
（配列番号３）
MSFVDHPPDWLEEVGEGLREFLGLEAGPPKPKPNQQHQDQARGLVLPGYNYLGPGNGLDRGEPVNRADEVAREHDISYNEQLEAGDNPYLKYNHADAEFQEKLADDTSFGGNLGKAVFQAKKRVLEPFGLVEEGAKTAPTGKRIDDHFPKRKKARTEEDSKPSTSSDAEAGPSGSQQLQIPAQPASSLGADTMSAGGGGPLGDNNQGADGVGNASGDWHCDSTWMGDRVVTKSTRTWVLPSYNNHQYREIKSGSVDGSNANAYFGYSTPWGYFDFNRFHSHWSPRDWQRLINNYWGFRPRSLRVKIFNIQVKEVTVQDSTTTIANNLTSTVQVFTDDDYQLPYVVGNGTEGCLPAFPPQVFTLPQYGYATLNRDNTENPTERSSFFCLEYFPSKMLRTGNNFEFTYNFEEVPFHSSFAPSQNLFKLANPLVDQYLYRFVSTNNTGGVQFNKNLAGRYANTYKNWFPGPMGRTQGWNLGSGVNRASVSAFATTNRMELEGASYQVPPQPNGMTNNLQGSNTYALENTMIFNSQPANPGTTATYLEGNMLITSESETQPVNRVAYNVGGQMATNNQSSTTAPATGTYNLQEIVPGSVWMERDVYLQGPIWAKIPETGAHFHPSPAMGGFGLKHPPPMMLIKNTPVPGNITSFSDVPVSSFITQYSTGQVTVEMEWELKKENSKRWNPEIQYTNNYNDPQFVDFAPDSTGEYRTTRPIGTRYLTRPL
＞ｇｉ｜２７６６６０７｜ｇｂ｜ＡＡＢ９５４５０．１｜カプシドタンパク質ＶＰ１［アデノ随伴ウイルス−６］
（配列番号４）
MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWDLKPGAPKPKANQQKQDDGRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLRYNHADAEFQERLQEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPFGLVEEGAKTAPGKKRPVEQSPQEPDSSSGIGKTGQQPAKKRLNFGQTGDSESVPDPQPLGEPPATPAAVGPTTMASGGGAPMADNNEGADGVGNASGNWHCDSTWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSASTGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTTNDGVTTIANNLTSTVQVFSDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLNRTQNQSGSAQNKDLLFSRGSPAGMSVQPKNWLPGPCYRQQRVSKTKTDNNNSNFTWTGASKYNLNGRESIINPGTAMASHKDDKDKFFPMSGVMIFGKESAGASNTALDNVMITDEEEIKATNPVATERFGTVAVNLQSSSTDPATGDVHVMGALPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPPAEFSATKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEVQYTSNYAKSANVDFTVDNNGLYTEPRPIGTRYLTRPL
＞ｇｉ｜１７１８５０１２５｜ｇｂ｜ＡＣＢ５５３０２．１｜カプシドタンパク質ＶＰ１［アデノ随伴ウイルス−６．２］（配列番号５）
MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWDLKPGAPKPKANQQKQDDGRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLRYNHADAEFQERLQEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEGAKTAPGKKRPVEQSPQEPDSSSGIGKTGQQPAKKRLNFGQTGDSESVPDPQPLGEPPATPAAVGPTTMASGGGAPMADNNEGADGVGNASGNWHCDSTWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSASTGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTTNDGVTTIANNLTSTVQVFSDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLNRTQNQSGSAQNKDLLFSRGSPAGMSVQPKNWLPGPCYRQQRVSKTKTDNNNSNFTWTGASKYNLNGRESIINPGTAMASHKDDKDKFFPMSGVMIFGKESAGASNTALDNVMITDEEEIKATNPVATERFGTVAVNLQSSSTDPATGDVHVMGALPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPPAEFSATKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEVQYTSNYAKSANVDFTVDNNGLYTEPRPIGTRYLTRPL
＞ｇｉ｜２２６５２８６１｜ｇｂ｜ＡＡＮ０３８５５．１｜ＡＦ５１３８５１＿２カプシドタンパク質［アデノ随伴ウイルス−７］
（配列番号６）
MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWDLKPGAPKPKANQQKQDNGRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLRYNHADAEFQERLQEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEGAKTAPAKKRPVEPSPQRSPDSSTGIGKKGQQPARKRLNFGQTGDSESVPDPQPLGEPPAAPSSVGSGTVAAGGGAPMADNNEGADGVGNASGNWHCDSTWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSETAGSTNDNTYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKKLRFKLFNIQVKEVTTNDGVTTIANNLTSTIQVFSDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNNGSQSVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFEFSYSFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLARTQSNPGGTAGNRELQFYQGGPSTMAEQAKNWLPGPCFRQQRVSKTLDQNNNSNFAWTGATKYHLNGRNSLVNPGVAMATHKDDEDRFFPSSGVLIFGKTGATNKTTLENVLMTNEEEIRPTNPVATEEYGIVSSNLQAANTAAQTQVVNNQGALPGMVWQNRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPPEVFTPAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNFEKQTGVDFAVDSQGVYSEPRPIGTRYLTRNL
＞ｇｉ｜２２６５２８６４｜ｇｂ｜ＡＡＮ０３８５７．１｜ＡＦ５１３８５２＿２カプシドタンパク質［アデノ随伴ウイルス−８］
（配列番号７）
MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWALKPGAPKPKANQQKQDDGRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLQAGDNPYLRYNHADAEFQERLQEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEGAKTAPGKKRPVEPSPQRSPDSSTGIGKKGQQPARKRLNFGQTGDSESVPDPQPLGEPPAAPSGVGPNTMAAGGGAPMADNNEGADGVGSSSGNWHCDSTWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNGTSGGATNDNTYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLSFKLFNIQVKEVTQNEGTKTIANNLTSTIQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFQFTYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTQTTGGTANTQTLGFSQGGPNTMANQAKNWLPGPCYRQQRVSTTTGQNNNSNFAWTAGTKYHLNGRNSLANPGIAMATHKDDEERFFPSNGILIFGKQNAARDNADYSDVMLTSEEEIKTTNPVATEEYGIVADNLQQQNTAPQIGTVNSQGALPGMVWQNRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPADPPTTFNQSKLNSFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSTSVDFAVNTEGVYSEPRPIGTRYLTRNL
＞ｇｉ｜４６４８７８０５｜ｇｂ｜ＡＡＳ９９２６４．１｜カプシドタンパク質ＶＰ１［アデノ随伴ウイルス９］
（配列番号８）
MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWALKPGAPQPKANQQHQDNARGLVLPGYKYLGPGNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRLLEPLGLVEEAAKTAPGKKRPVEQSPQEPDSSAGIGKSGAQPAKKRLNFGQTGDTESVPDPQPIGEPPAAPSGVGSLTMASGGGAPVADNNEGADGVGSSSGNWHCDSQWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNSTSGGSSNDNAYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTDNNGVKTIANNLTSTVQVFTDSDYQLPYVLGSAHEGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNDGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFQFSYEFENVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSKTINGSGQNQQTLKFSVAGPSNMAVQGRNYIPGPSYRQQRVSTTVTQNNNSEFAWPGASSWALNGRNSLMNPGPAMASHKEGEDRFFPLSGSLIFGKQGTGRDNVDADKVMITNEEEIKTTNPVATESYGQVATNHQSAQAQAQTGWVQNQGILPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGMKHPPPQILIKNTPVPADPPTAFNKDKLNSFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSNNVEFAVNTEGVYSEPRPIGTRYLTRNL
＞ｇｉ｜２９６５０５２６｜ｇｂ｜ＡＡＯ８８２０１．１｜カプシドタンパク質［非−ヒト霊長類アデノ随伴ウイルス］
（配列番号９）ｒｈ−１０
MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWDLKPGAPKPKANQQKQDDGRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLRYNHADAEFQERLQEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEGAKTAPGKKRPVEPSPQRSPDSSTGIGKKGQQPAKKRLNFGQTGDSESVPDPQPIGEPPAGPSGLGSGTMAAGGGAPMADNNEGADGVGSSSGNWHCDSTWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNGTSGGSTNDNTYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNEGTKTIANNLTSTIQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFEFSYQFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTQSTGGTAGTQQLLFSQAGPNNMSAQAKNWLPGPCYRQQRVSTTLSQNNNSNFAWTGATKYHLNGRDSLVNPGVAMATHKDDEERFFPSSGVLMFGKQGAGKDNVDYSSV
MLTSEEEIKTTNPVATEQYGVVADNLQQQNAAPIVGAVNSQGALPGMVWQNRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPADPPTTFSQAKLASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSTNVDFAVNTDGTYSEPRPIGTRYLTRNL
＞ｇｉ｜１７１８５０１４７｜ｇｂ｜ＡＣＢ５５３１３．１｜カプシドタンパク質ＶＰ１［アデノ随伴ウイルス−ｒｈ．３９］
（配列番号１０）
MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWALKPGAPKPKANQQKQDDGRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLRYNHADAEFQERLQEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEAAKTAPGKKRPVEPSPQRSPDSSTGIGKKGQQPAKKRLNFGQTGDSESVPDPQPIGEPPAGPSGLGSGTMAAGGGAPMADNNEGADGVGSSSGNWHCDSTWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNGTSGGSTNDNTYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLSFKLFNIQVKEVTQNEGTKTIANNLTSTIQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFEFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTQSTGGTQGTQQLLFSQAGPANMSAQAKNWLPGPCYRQQRVSTTLSQNNNSNFAWTGATKYHLNGRDSLVNPGVAMATHKDDEERFFPSSGVLMFGKQGAGRDNVDYSSVMLTSEEEIKTTNPVATEQYGVVADNLQQTNTGPIVGNVNSQGALPGMVWQNRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPADPPTTFSQAKLASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSTNVDFAVNTEGTYSEPRPIGTRYLTRNL
＞ｇｉ｜４６４８７７６７｜ｇｂ｜ＡＡＳ９９２４５．１｜カプシドタンパク質ＶＰ１［アデノ随伴ウイルスｒｈ．４３］
（配列番号１１）
MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWDLKPGAPKPKANQQKQDDGRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLEAGDNPYLRYNHADAEFQERLQEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEGAKTAPGKKRPVEQSPQEPDSSSGIGKKGQQPARKRLNFGQTGDSESVPDPQPLGEPPAAPSGVGPNTMAAGGGAPMADNNEGADGVGSSSGNWHCDSTWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNGTSGGATNDNTYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLSFKLFNIQVKEVTQNEGTKTIANNLTSTIQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFQFTYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTQTTGGTANTQTLGFSQGGPNTMANQAKNWLPGPCYRQQRVSTTTGQNNNSNFAWTAGTKYHLNGRNSLANPGIAMATHKDDEERFFPVTGSCFWQQNAARDNADYSDVMLTSEEEIKTTNPVATEEYGIVADNLQQQNTAPQIGTVNSQGALPGMVWQNRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPADPPTTFNQSKLNSFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSTSVDFAVNTEGVYSEPRPIGTRYLTRNL
＞カプシドタンパク質ＶＰ１［アデノ随伴ウイルス］ＣＳｐ３（配列番号１２）
MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWALKPGAPQPKANQQHQDNARGLVLPGYKYLGPGNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRLLEPLGLVEEAAKTAPGKKRPVEQSPQEPDSSAGIGKSGAQPAKKRLNFGQTGDTESVPDPQPIGEPPAAPSGVGSLTIASGGGAPVADNNEGADGVGSSSGNWHCDSQWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKRISNSTSGGSSNDNAYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIRVKEVTDNNGVKTITNNLTSTVQVFTDSDYQLPYVLGSAHEGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNDGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFQFSYEFENVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSKTINGSGQNQQTLKFSVAGPSNMAVQGRNYIPGPSYRQQRVSTTVTRNNNSEFAWPGASSWALNGRNSLMNPGPAMASHKEGEDRFFPLSGSLIFGKQGTGRDNVDADKVMITNEEEIKTTNPVATESYGQVATNHQSAQAQAQTGWVQNQGILPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGVKHPPPQILIKNTPVPADPPTAFNKDKLNSFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSNNVEFAVNTEGVYSEPRPIGTRYLTRNL
＞ｇｉ｜１８９３３９２０２｜ｒｅｆ｜ＮＰ＿００１１２１５５７．１｜アスパルトアシラーゼ［ヒト］
（配列番号１３）
MTSCHIAEEHIQKVAIFGGTHGNELTGVFLVKHWLENGAEIQRTGLEVKPFITNPRAVKKCTRYIDCDLNRIFDLENLGKKMSEDLPYEVRRAQEINHLFGPKDSEDSYDIIFDLHNTTSNMGCTLILEDSRNNFLIQMFHYIKTSLAPLPCYVYLIEHPSLKYATTRSIAKYPVGIEVGPQPQGVLRADILDQMRKMIKHALDFIHHFNEGKEFPPCAIEVYKIIEKVDYPRDENGEIAAIIHPNLQDQDWKPLHPGDPMFLTLDGKTIPLGGDCTVYPVFVNEAAYYEKKEAFAKTTKLTLNAKSIRCCLH
＞ｇｉ｜１８９３３９２０１：９２−１０３３ヒト アスパルトアシラーゼ（カナバン病）（ＡＳＰＡ），転写物変異形２，ｍＲＮＡ
（配列番号１４）
ATGACTTCTTGTCACATTGCTGAAGAACATATACAAAAGGTTGCTATCTTTGGAGGAACCCATGGGAATGAGCTAACCGGAGTATTTCTGGTTAAGCATTGGCTAGAGAATGGCGCTGAGATTCAGAGAACAGGGCTGGAGGTAAAACCATTTATTACTAACCCCAGAGCAGTGAAGAAGTGTACCAGATATATTGACTGTGACCTGAATCGCATTTTTGACCTTGAAAATCTTGGCAAAAAAATGTCAGAAGATTTGCCATATGAAGTGAGAAGGGCTCAAGAAATAAATCATTTATTTGGTCCAAAAGACAGTGAAGATTCCTATGACATTATTTTTGACCTTCACAACACCACCTCTAACATGGGGTGCACTCTTATTCTTGAGGATTCCAGGAATAACTTTTTAATTCAGATGTTTCATTACATTAAGACTTCTCTGGCTCCACTACCCTGCTACGTTTATCTGATTGAGCATCCTTCCCTCAAATATGCGACCACTCGTTCCATAGCCAAGTATCCTGTGGGTATAGAAGTTGGTCCTCAGCCTCAAGGGGTTCTGAGAGCTGATATCTTGGATCAAATGAGAAAAATGATTAAACATGCTCTTGATTTTATACATCATTTCAATGAAGGAAAAGAATTTCCTCCCTGCGCCATTGAGGTCTATAAAATTATAGAGAAAGTTGATTACCCCCGGGATGAAAATGGAGAAATTGCTGCTATCATCCATCCTAATCTGCAGGATCAAGACTGGAAACCACTGCATCCTGGGGATCCCATGTTTTTAACTCTTGATGGGAAGACGATCCCACTGGGCGGAGACTGTACCGTGTACCCCGTGTTTGTGAATGAGGCCGCATATTACGAAAAGAAAGAAGCTTTTGCAAAGACAACTAAACTAACGCTCAATGCAAAAAGTATTCGCTGCTGTTTACATTAG
＞ｇｉ｜３１５６０２７９｜ｒｅｆ｜ＮＰ＿０７５６０２．２｜アスパルトアシラーゼ［ハツカネズミ］
（配列番号１５）
MTSCVAKEPIKKIAIFGGTHGNELTGVFLVTHWLRNGTEVHRAGLDVKPFITNPRAVEKCTRYIDCDLNRVFDLENLSKEMSEDLPYEVRRAQEINHLFGPKNSDDAYDLVFDLHNTTSNMGCTLILEDSRNDFLIQMFHYIKTCMAPLPCSVYLIEHPSLKYATTRSIAKYPVGIEVGPQPHGVLRADILDQMRKMIKHALDFIQHFNEGKEFPPCSIDVYKIMEKVDYPRNESGDMAAVIHPNLQDQDWKPLHPGDPVFVSLDGKVIPLGGDCTVYPVFVNEAAYYEKKEAFAKTTKLTLSAKSIRSTLH
＞ｇｉ｜１４２３５４２７３：１４８−１０８６ ハツカネズミ アスパルトアシラーゼ（Ａｓｐａ），ｍＲＮＡ
（配列番号１６）
ATGACCTCTTGTGTTGCTAAAGAACCTATTAAGAAGATTGCCATCTTTGGAGGGACTCATGGAAATGAACTGACCGGAGTGTTTCTAGTTACTCACTGGCTAAGGAATGGCACTGAAGTTCACAGAGCAGGGCTGGACGTGAAGCCATTCATTACCAATCCAAGGGCGGTGGAGAAGTGCACCAGATACATTGACTGTGACCTGAATCGTGTTTTTGACCTTGAAAATCTTAGCAAAGAGATGTCTGAAGACTTGCCATATGAAGTGAGAAGGGCTCAAGAAATAAATCATTTATTTGGTCCAAAAAATAGTGATGATGCCTATGACCTTGTTTTTGACCTTCACAACACCACTTCTAACATGGGTTGCACTCTTATTCTTGAGGATTCCAGGAATGACTTTTTAATTCAGATGTTTCACTATATTAAGACTTGCATGGCTCCATTACCCTGCTCTGTTTATCTCATTGAGCATCCTTCACTCAAATATGCAACCACTCGTTCCATTGCCAAGTATCCTGTTGGTATAGAAGTTGGTCCTCAGCCTCACGGTGTCCTTAGAGCTGATATTTTAGACCAAATGAGAAAAATGATAAAACATGCTCTTGATTTTATACAGCATTTCAATGAAGGAAAAGAATTTCCTCCCTGTTCTATTGACGTCTATAAAATAATGGAGAAAGTTGATTATCCAAGGAATGAAAGTGGAGACATGGCTGCTGTTATTCATCCTAATCTGCAGGATCAAGACTGGAAACCATTGCACCCTGGAGATCCTGTGTTTGTGTCTCTTGATGGAAAAGTTATTCCACTGGGTGGAGACTGTACCGTGTACCCAGTGTTTGTGAATGAAGCTGCATATTATGAAAAAAAAGAAGCATTTGCAAAGACAACAAAACTAACACTCAGCGCAAAAAGCATCCGCTCCACTTTGCACTAA
＞ｇｉ｜４８７６２９４５：１４９−６１３ヒト スーパーオキシドジスムターゼ１，可溶性（ＳＯＤ１），ｍＲＮＡ
（配列番号１７）
ATGGCGACGAAGGCCGTGTGCGTGCTGAAGGGCGACGGCCCAGTGCAGGGCATCATCAATTTCGAGCAGAAGGAAAGTAATGGACCAGTGAAGGTGTGGGGAAGCATTAAAGGACTGACTGAAGGCCTGCATGGATTCCATGTTCATGAGTTTGGAGATAATACAGCAGGCTGTACCAGTGCAGGTCCTCACTTTAATCCTCTATCCAGAAAACACGGTGGGCCAAAGGATGAAGAGAGGCATGTTGGAGACTTGGGCAATGTGACTGCTGACAAAGATGGTGTGGCCGATGTGTCTATTGAAGATTCTGTGATCTCACTCTCAGGAGACCATTGCATCATTGGCCGCACACTGGTGGTCCATGAAAAAGCAGATGACTTGGGCAAAGGTGGAAATGAAGAAAGTACAAAGACAGGAAACGCTGGAAGTCGTTTGGCTTGTGGTGTAATTGGGATCGCCCAATAA
＞ｇｉ｜４５０７１４９｜ｒｅｆ｜ＮＰ＿０００４４５．１｜スーパーオキシドジスムターゼ［ヒト］
（配列番号１８）
MATKAVCVLKGDGPVQGIINFEQKESNGPVKVWGSIKGLTEGLHGFHVHEFGDNTAGCTSAGPHFNPLSRKHGGPKDEERHVGDLGNVTADKDGVADVSIEDSVISLSGDHCIIGRTLVVHEKADDLGKGGNEESTKTGNAGSRLACGVIGIAQ
＞ｇｉ｜４５５９７４４６：１１７−５８１ハツカネズミスーパーオキシドジスムターゼ１，可溶性（Ｓｏｄ１），ｍＲＮＡ
（配列番号１９）
ATGGCGATGAAAGCGGTGTGCGTGCTGAAGGGCGACGGTCCGGTGCAGGGAACCATCCACTTCGAGCAGAAGGCAAGCGGTGAACCAGTTGTGTTGTCAGGACAAATTACAGGATTAACTGAAGGCCAGCATGGGTTCCACGTCCATCAGTATGGGGACAATACACAAGGCTGTACCAGTGCAGGACCTCATTTTAATCCTCACTCTAAGAAACATGGTGGCCCGGCGGATGAAGAGAGGCATGTTGGAGACCTGGGCAATGTGACTGCTGGAAAGGACGGTGTGGCCAATGTGTCCATTGAAGATCGTGTGATCTCACTCTCAGGAGAGCATTCCATCATTGGCCGTACAATGGTGGTCCATGAGAAACAAGATGACTTGGGCAAAGGTGGAAATGAAGAAAGTACAAAGACTGGAAATGCTGGGAGCCGCTTGGCCTGTGGAGTGATTGGGATTGCGCAGTAA
＞ｇｉ｜４５５９７４４７｜ｒｅｆ｜ＮＰ＿０３５５６４．１｜スーパーオキシドジスムターゼ［ハツカネズミ］
（配列番号２０）
MAMKAVCVLKGDGPVQGTIHFEQKASGEPVVLSGQITGLTEGQHGFHVHQYGDNTQGCTSAGPHFNPHSKKHGGPADEERHVGDLGNVTAGKDGVANVSIEDRVISLSGEHSIIGRTMVVHEKQDDLGKGGNEESTKTGNAGSRLACGVIGIAQ
＞ｐＡＡＶｓｃＣＢ６ ＥＧＦＰｍｉｒ ＳＯＤ５（ダイレクト）５２４３ｂｐ（配列番号２１）
CTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGTAGCCATGCTCTAGGAAGATCAATTCAATTCACGCGTCGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGATATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGTCGAGGCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCGGGAGCAAGCTCTAGCCTCGAGAATTCACGCGTGGTACCTCTAGAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGTTCGAAATCGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAAGTAACAGGTAAGTGCGATCGCTAATGCGGGAAAGCTCTTATTCGGGTGAGATGGGCTGGGGCACCATCTGGGGACCCTGACGTGAAGTTTGTCACTGACTGGAGAACTCGGTTTGTCGTCTGTTGCGGGGGCGGCAGTTATGGCGGTGCCGTTGGGCAGTGCACCCGTACCTTTGGGAGCGCGCGCCCTCGTCGTGTCGTGACGTCACCCGTTCTGTTGGTACCTGCTGTTGACAGTGAGCGACGCAATGTGACTTCGCTGACAAAGCTGTGAAGCCACAGATGGGCTTTGTCAGCAGTCACATTGCGCTGCCTACTGCCTCGGACTTCAAGGGCTCGAGAATTCAGGGTGGGGCCACCTGCCGGTAGGTGTGCGGTAGGCTTTTCTCCGTCGCAGGACGCAGGGTTCGGGCCTAGGGTAGGCTCTCCTGAATCGACAGGCGCCGGACCTCTGGCGGCCGCAACAACGCGTTCCTGACCATTCATCCTCTTTCTTTTTCCTGCAGGCTTGTGGAAGAAATGGGATCCGATCTTTTTCCCTCTGCCAAAAATTATGGGGACATCATGAAGCCCCTTGAGCATCTGACTTCTGGCTAATAAAGGAAATTTATTTTCATTGCAATAGTGTGTTGGAATTTTTTGTGTCTCTCACTCGGCCTAGGTAGATAAGTAGCATGGCGGGTTAATCATTAACTACAAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCCTTAATTAACCTAATTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGGACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGCTTACAATTTAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTTCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCAGATTTAATTAAGGCCTTAATTAGG
＞ｓｏｄ１ｍｉｒ１（ダイレクト）１０８ｂｐ（配列番号２２）
TGCTGTTGACAGTGAGCGACATCATCAATTTTCCGAGCAGAACTGTGAAGCCACAGATGGGTTCTGCTCGAAATTGATGATGCTGCCTACTGCCTCGGACTTCAAGGG
＞ｓｏｄ１ｍｉｒ２（ダイレクト）１０６ｂｐ（配列番号２３）
TGCTGTTGACAGTGAGCGACGCATTAAAGGATCCTGACTGACTGTGAAGCCACAGATGGGTCAGTCAGTCCTTTAATGCGCTGCCTACTGCCTCGGACTTCAAGGG
＞ｓｏｄ１ｍｉｒ３（ダイレクト）１０８ｂｐ（配列番号２４）
TGCTGTTGACAGTGAGCGACTGCATGGATTCTCCATGTTCATCTGTGAAGCCACAGATGGGATGAACATGGAATCCATGCAGCTGCCTACTGCCTCGGACTTCAAGGG
＞ｓｏｄ１ｍｉｒ４（ダイレクト）１０６ｂｐ（配列番号２５）
TGCTGTTGACAGTGAGCGACAAGGATGAAGATCGAGGCATGCTGTGAAGCCACAGATGGGCATGCCTCTCTTCATCCTTGCTGCCTACTGCCTCGGACTTCAAGGG
＞ｓｏｄ１ｍｉｒ５（ダイレクト）１１０ｂｐ（配列番号２６）
TGCTGTTGACAGTGAGCGACGCAATGTGACTTCGCTGACAAAGCTGTGAAGCCACAGATGGGCTTTGTCAGCAGTCACATTGCGCTGCCTACTGCCTCGGACTTCAAGGG
＞ｓｏｄ１ｍｉｒ６（ダイレクト）１０８ｂｐ（配列番号２７）
TGCTGTTGACAGTGAGCGACCGATGTGTCTATCTTGAAGATTCTGTGAAGCCACAGATGGGAATCTTCAATAGACACATCGGCTGCCTACTGCCTCGGACTTCAAGGG
＞ｓｏｄ１ｍｉｒ７（ダイレクト）１０６ｂｐ
（配列番号２８）
TGCTGTTGACAGTGAGCGACGGTGGAAATGATCAGAAAGTACTGTGAAGCCACAGATGGGTACTTTCTTCATTTCCACCGCTGCCTACTGCCTCGGACTTCAAGGG
＞ｓｏｄ１ｍｉｒ８（ダイレクト）１１０ｂｐ（配列番号２９）
TGCTGTTGACAGTGAGCGACGCTGTAGAAATTCGTATCCTGATCTGTGAAGCCACAGATGGGATCAGGATACATTTCTACAGCGCTGCCTACTGCCTCGGACTTCAAGGG
＞ｓｏｄ１ｍｉｒ９（ダイレクト）１０６ｂｐ（配列番号３０）
TGCTGTTGACAGTGAGCGAGGTATTAAACTTGTCAGAATTTAGTGAAGCCACAGATGTAAATTCTGACAAGTTTAATACCCTGCCTACTGCCTCGGACTTCAAGGG
＞ｐＡＡＶｓｃＣＢ６ ＥＧＦＰｍｉｒ ｓｃｒ（１８２０ｂｐ−１９２５ｂｐ，ダイレクト）１０６ｂｐ（配列番号３１）
TGCTGTTGACAGTGAGCGACGATGCTCTAATCGGTTCTATCAAGTGAAGCCACAGATGTTGATAGAACCTTAGAGCATCGCTGCCTACTGCCTCGGACTTCAAGGG
本発明は、本説明に記述されているかまたは図面に例示されている、構築の詳細および構成要素の配置への適用に限定されない。本発明は他の実施態様ができ、また実行したり様々な方法で実施したりすることができる。また、本明細書で使用される表現法および専門用語は説明のためであって、限定的であると考えてはならない。「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、または「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「含む(ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ）」、およびその変形の使用は、本明細書では、その後に列挙された事項およびその等価物、ならびに追加事項を包含することを意味する。
このように本発明の少なくとも１つの実施態様の幾つかの態様を記述してきたが、当業者には、様々な変更、改変、および改良が容易に浮かぶことは十分に理解されるであろう。そのような変更、改変、および改良は本開示内容の一部であることは意図され、また本発明の精神および範囲の中であると解釈される。したがって、前述の説明および図面は一例に過ぎない。

Claims (10)

  1. ｒＡＡＶの有効量を治療を必要としている対象のＣＮＳ組織に投与することによって前記対象におけるカナバン病を治療するための医薬組成物であって、
    前記ｒＡＡＶが、（ｉ）配列番号８または９で示されるアミノ酸配列を有するカプシドタンパク質および（ｉｉ）アスパルトアシラーゼ（ＡＳＰＡ）をコードしている領域と操作可能に連結されたプロモーターを含む核酸を含み、
    前記ｒＡＡＶの用量が１０９ゲノムコピー〜１０１６ゲノムコピーの範囲内であり、ならびに
    前記投与は、ＣＮＳ組織でのＡＳＰＡの発現、および前記ＣＮＳ組織中のＮ−アセチルアスパラギン酸の分解をもたらす、前記医薬組成物。
  2. ｒＡＡＶの有効量を、脳内投与以外の経路によって治療を必要としている対象のＣＮＳ組織に投与することによって前記対象におけるカナバン病を治療するための医薬組成物であって、
    前記ｒＡＡＶが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ．１０、ＡＡＶｒｈ．３９およびＡＡＶｒｈ．４３から選択される血清型を有するカプシドタンパク質を含み、
    前記ｒＡＡＶが、アスパルトアシラーゼ（ＡＳＰＡ）をコードしている領域と操作可能に連結されたプロモーターを含む核酸を含み、および
    前記ｒＡＡＶの用量が１０９ゲノムコピー〜１０１６ゲノムコピーの範囲内である、前記医薬組成物。
  3. 投与が髄腔内的または脳内的に実施される、請求項１に記載の医薬組成物。
  4. 投与が血管内的に実施される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  5. 前記核酸が、ＣＮＳ組織と比較して、１つ以上の非ＣＮＳ組織中の方が豊富である１つ以上のｍｉＲＮＡの１つ以上のｍｉＲＮＡ結合部位を含むアスパルトアシラーゼ（ＡＳＰＡ）ｍＲＮＡを発現する、請求項４に記載の医薬組成物であって、
    前記ｍｉＲＮＡが、ｍｉＲ−１およびｍｉＲ−１２２から選択される、前記医薬組成物。
  6. 前記ＣＮＳ組織と比較して、１つ以上の非ＣＮＳ組織中の方が豊富である前記１つ以上のｍｉＲＮＡが、少なくとも２倍豊富である、請求項５に記載の医薬組成物。
  7. 前記１つ以上の非ＣＮＳ組織が腎臓組織または網膜組織ではない、請求項５または６に記載の医薬組成物。
  8. 請求項１〜７のいずれか一項に記載の医薬組成物を収納する容器を含むキット。
  9. 前記容器が、密封された小瓶またはアンプルである、請求項８に記載のキット。
  10. 前記容器が注射器である、請求項８に記載のキット。
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