JP6825764B2 - リポソームカプセル化親和性薬物 - Google Patents

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［関連出願］
本出願は、２０１４年８月１４日出願の米国特許仮出願第６２／０３７，５９７号、２０１５年３月９日出願の米国特許仮出願第６２／１３０，４９３号及び２０１５年３月１３日出願の米国特許仮出願第６２／１３３，２６５号を基礎とする優先権の利益を主張する。これらの出願のそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

癌は、癌型の多様性、疾患進行に関与する機構、及び根底にある患者の遺伝的構成に伴う患者間のばらつきゆえに、治療が非常に困難な疾患である。癌を治療する初期の試みは、細胞毒性剤、たとえば抗葉酸剤の使用を伴っていた。抗葉酸剤とは、葉酸（ビタミンＢ９）の作用に拮抗（すなわち、それを遮断）する分子のクラスを指す。葉酸の身体中での主要な機能は、セリン、メチオニン、チミジン及びプリン生合成に関与する様々なメチルトランスフェラーゼに、補因子として寄与することである。結果として、抗葉酸剤は、細胞分裂、ＤＮＡ／ＲＮＡ合成及び修復並びにタンパク質合成を阻害する。

抗癌剤として抗葉酸剤を導入する理論的根拠は、葉酸が細胞複製中のＤＮＡ（核酸）合成に必須の成分であるがゆえに、すべての分裂細胞の生存にとって重要であることに基づいていた。正常細胞か癌細胞かを問わず、任意の細胞による葉酸吸収は、葉酸に対する親和性が低い豊富な膜横断トランスポーターである還元型葉酸キャリア（ＲＦＣ）により主に媒介される。

癌細胞は、急速に成長する細胞であり、それゆえ葉酸の形態のＤＮＡ前駆体を多く必要とするので、抗葉酸剤の影響を受けやすい。急速に成長する正常細胞、たとえば胃腸管の内表面を構成する細胞及び骨髄細胞は、主にＲＦＣを介して供給される葉酸を同様に使用して、急速に分裂する。したがって、抗葉酸剤が癌細胞に浸潤し、それを殺傷するために利用するＲＦＣ媒介性輸送機構はまた、急速に成長する正常細胞を殺傷する副作用をもたらす可能性があるので、正常細胞もまた抗葉酸剤の影響を受けやすく、そのことにより望ましくない抗葉酸剤関連毒性を引き起こす。

抗葉酸剤は、葉酸の作用に干渉することにより働き、癌細胞から、それらが増殖、又は成長するのに必要なＤＮＡ前駆体を奪う。一クラスとしての抗葉酸剤は、癌治療におけるそれらの抗増殖性効果のために使用され、細胞成長及び分裂を阻害し、癌細胞死をもたらす。急速に複製する癌細胞がほとんどの正常細胞と比較して多くの量の葉酸を必要とするため、ほぼ７０年前に抗癌剤として抗葉酸剤が臨床開発された。しかしながら、抗葉酸剤ベースの治療法が癌治療に有効と示されたとはいえ、それらの臨床開発は多くの場合、どうしようもない臨床的ジレンマにより頓挫させられてきた。このジレンマは、２つの競合する臨床ダイナミクスから生じる。一方では、抗葉酸剤は、葉酸模倣分子として設計され、そのほとんどが好ましい膜横断トランスポーター機構としてＲＦＣを使用することにより癌細胞に到達するよう意図される。他方、身体において急速に再生する正常組織、たとえば骨髄又は腸管組織細胞もまた、癌細胞と同様に、高度に葉酸依存的であり、やはりＲＦＣを主要な膜横断葉酸細胞供給機構として使用する。これら２つの臨床ダイナミクスの最終結果として、たとえば骨髄及び胃腸（ＧＩ）管細胞が、典型的には、患者の生命を脅かす抗葉酸剤関連毒性が非常に多く見られる部位であった。これらの毒性のいくつかには、粘膜炎、下痢、貧血、好中球減少、及び低白血球数が含まれていた。患者におけるこれらの抗葉酸剤関連難治性副作用の結果として、有効性の高い細胞毒性又は抗癌特性を示す抗葉酸剤は、典型的には、それらの開発中に挫折してきたか、又は、これまでのところ、臨床診療において限定的にしか使用されてこなかった。なぜなら、これらの抗葉酸剤はまた、正常細胞において許容できない毒性の形態の消耗性副作用を有する傾向にあるからである。

一クラスとしての抗葉酸剤は、患者にとって深刻な、生命を脅かしさえする毒性の関連リスクにもかかわらず、依然として、癌の有望な治療法である。課題は、正常細胞へのダメージを低減及び／又は回避する形で、抗葉酸剤を有効に送達する方法を明らかにすることだった。近年、癌のより新しい代替療法が利用可能になったことで、かかる治療法と比較して、抗葉酸剤は、癌細胞を殺傷するその並外れた有効性にもかかわらず、好まれなくなった。

水性生物活性剤、たとえば抗癌（抗腫瘍）剤を含有する、葉酸受容体（複数可）に対する親和性及び特異性を有する中性又はアニオン性免疫リポソームは、細胞表面に葉酸受容体を提示する細胞に対して驚くほど有効である。

例示的一実施形態において、リポソーム抗葉酸剤組成物が提供される。リポソーム抗葉酸剤組成物は、内部空間を含むリポソーム、上記内部空間内に配置された生物活性抗葉酸剤、リポソームの外部に付加されたＰＥＧ、及び少なくとも１つの葉酸受容体に対する特異的親和性を有するタンパク質を含むターゲッティング部分を含み、上記ターゲッティング部分は、ＰＥＧ及びリポソームの外部のうちの少なくとも一方に付加されている。請求項１のリポソーム抗葉酸剤組成物について、ＰＥＧは、２００〜５０００ダルトンの数平均分子量（Ｍｎ）を有していてもよい。

例示的リポソーム抗葉酸剤組成物もまた提供される。例示的リポソーム抗葉酸剤組成物は、内部空間を含むリポソームを含む媒体、上記内部空間内に配置された水性生物活性抗葉酸剤、少なくとも１つの葉酸受容体に対する特異的親和性を有するタンパク質を含むターゲッティング部分を含み、上記ターゲッティング部分は、リポソームの外部に配置されている。この組成物における媒体は、水性溶液であってもよい。水性溶液は、マンニトール、トレハロース、ソルビトール、及びスクロースからなる群から選択される、少なくとも１つの抗凍結剤を含んでいてもよい。リポソーム抗葉酸剤組成物は、リポソームの外部に付加された立体安定剤をさらに含んでいてもよく、ターゲッティング部分は、立体安定剤及びリポソームの外部のうちの少なくとも一方に付加されている。立体安定剤は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）、モノシアロガングリオシド（ＧＭ１）、ポリ（ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）、ポリ（アクリルアミド）（ＰＡＡ）、ポリ（２−メチル−２−オキサゾリン）、ポリ（２−エチル−２−オキサゾリン）、ホスファチジルポリグリセロール、ポリ［Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド］、両親媒性ポリ−Ｎ−ビニルピロリドン、Ｌ−アミノ酸ベースポリマー、及びポリビニルアルコールからなる群から選択される少なくとも１つである。ＰＥＧは、２００〜５０００ダルトンの数平均分子量（Ｍｎ）を有していてもよい。

例示的組成物、リポソーム、生成物、キット及び方法のうちの任意のものにおいて、以下の段落の追加の特徴が組み込まれてもよい：
リポソーム抗葉酸剤組成物は、ＰＥＧ及びリポソームの外部のうちの少なくとも一方に配置された免疫刺激剤及び検出可能なマーカーのうちの少なくとも一方をさらに含みうる。リポソーム抗葉酸剤組成物は、免疫刺激剤及び検出可能なマーカーのうちの少なくとも一方が、ＰＥＧ及びリポソームの外部のうちの少なくとも一方と共有結合している特徴を有していてもよい。免疫刺激剤は、タンパク質免疫刺激剤、核酸免疫刺激剤、化学免疫刺激剤、ハプテン、及びアジュバントからなる群から選択される少なくとも１つであってもよい。たとえば、免疫刺激剤は、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）であってもよい。別の一例として、免疫刺激剤は、フルオレセイン、ＤＮＰ、ベータグルカン、ベータ−１，３−グルカン、及びベータ−１，６−グルカンからなる群から選択される少なくとも１つである。検出可能なマーカーは、フルオレセイン及びフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）からなる群から選択される少なくとも１つであってもよい。一例として、免疫刺激剤及び検出可能なマーカーは同一であり、たとえば、それはフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）であってもよい。

リポソーム抗葉酸剤組成物は、３０〜１５０ｎｍの範囲、たとえば、４０〜７０ｎｍの範囲の直径を有していてもよい。別の一特徴として、リポソームは、アニオン性リポソーム又は中性リポソームでありうる。たとえば、リポソームのゼータ電位は、ゼロ以下、たとえば０〜−１５０ｍＶの範囲又は−３０〜−５０ｍＶの範囲でありうる。

リポソーム抗葉酸剤組成物は、リポソームを含む。リポソームは、任意のリポソーム成分から形成できる。たとえば、リポソーム成分は、アニオン性脂質及び中性脂質のうちの少なくとも１つを含んでいてもよい。別の一例として、リポソーム成分は、ＤＳＰＥ、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−マレイミド、ＨＳＰＣ、ＨＳＰＣ−ＰＥＧ、コレステロール、コレステロール−ＰＥＧ、及びコレステロール−マレイミドからなる群から選択される少なくとも１つである。別の一例として、リポソーム成分は、ＤＳＰＥ、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＦＩＴＣ、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−マレイミド、コレステロール、及びＨＳＰＣからなる群から選択される少なくとも１つを含む。

考察されるとおり、リポソームは、水性溶液を封入できる。たとえば、リポソームは、生物活性抗葉酸剤及び薬学的に許容される水性担体を封入できる。薬学的に許容される担体は、トレハロース、たとえば５％〜２０％の質量パーセントのトレハロースを含んでいてもよい。薬学的に許容される担体は、たとえば、クエン酸緩衝液を、５〜２００ｍＭの間の濃度及び２．８〜６の間のｐＨで含んでいてもよい。他の成分と独立に、薬学的に許容される担体は、５０ｍＭ〜５００ｍＭの間の総濃度の酢酸ナトリウム及び酢酸カルシウムを含んでいてもよい。

生物活性抗葉酸剤は、水溶性であってもよい。一例として、リポソーム抗葉酸剤組成物は、リポソームを有していてもよく、リポソームのうちのいくつかは、２００，０００分子未満の生物活性抗葉酸剤を含んでいてもよい。たとえば、リポソームは、１０，０００〜１００，０００分子の生物活性抗葉酸剤を含んでいてもよい。

生物活性抗葉酸剤は、ペメトレキセドを含んでいてもよい。別の例示的一実施形態において、生物活性抗葉酸剤は、ロメテレキソールを含んでいてもよい。別の例示的一実施形態において、生物活性抗葉酸剤は、メトトレキセート、ラリトレキセド、アミノプテリン、プララトレキセート、ロメテレキソール、ロメテレキソールのチオフェン類似体、ロメテレキソールのフラン類似体、トリメトレキセド（ｔｒｉｍｅｔｒｅｘｅｄ）、ＬＹ３０９８８７、及びＧＷ １８４３Ｕ８９からなる群から選択される少なくとも１つである。代わりに、又は加えて、生物活性抗葉酸剤は、プログアニル、ピリメタミン、トリメトプリム、並びに６−置換ピロロ及びチエノ［２，３−ｄ］ピロロピリミジンクラスのＧＡＲＦＴ阻害剤（６−Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ Ｐｙｒｒｏｌｏ ａｎｄ Ｔｈｉｅｏｎ［２，３−ｄ］ｐｙｒｒｏｌｏｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ ｃｌａｓｓ ｏｆ ＧＡＲＦＴ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ）からなる群から選択される少なくとも１つである。ロメテレキソール類似体は、たとえば、Ｈａｂｅｃｋら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、ｖ．５４、１０２１〜１０２６頁、１９９４年２月１５日に記載されている。

生物活性抗葉酸剤又は任意の生物活性剤は、リポソーム抗葉酸剤組成物中で５〜８のｐＨであってもよい。代わりに、リポソーム抗葉酸剤組成物は、２〜６のｐＨの生物活性抗葉酸剤を含んでいてもよい。

部分、たとえばターゲッティング部分、検出可能な標識、免疫刺激剤、立体安定剤、及び任意選択の部分及び試剤のうちの任意のものを、リポソーム又はリポソーム成分に直接又は間接に結合できる。間接結合には、立体安定剤（たとえば、ＰＥＧ）、官能基、たとえばマレイミド、イオン結合（アビジン、ストレプトアビジン、ビオチン等）、又は結合対（ＮＴＡ−ニッケル等）を通じた結合が含まれてもよい。これらの間接結合機構の組合せ、たとえば、ＰＥＧ−マレイミドもまた想定される。

リポソーム抗葉酸剤組成物又は他の組成物において、ターゲッティング部分は、マレイミド官能基を介して、リポソーム成分及びＰＥＧ分子からなる群から選択される少なくとも１つに結合できる。ターゲッティング部分は、葉酸受容体アルファ、葉酸受容体ベータ、及び葉酸受容体デルタからなる群から選択される少なくとも１つに対する特異的親和性を有していてもよい。たとえば、ターゲッティング部分は、葉酸受容体アルファ、葉酸受容体ベータ、及び葉酸受容体デルタからなる群から選択される少なくとも２つに対する特異的親和性を有していてもよい。さらなる一例として、ターゲッティング部分は、葉酸受容体アルファ、葉酸受容体ベータ、及び葉酸受容体デルタの３つすべてに対する特異的親和性を有していてもよい。

例示的一実施形態において、ターゲッティング部分は、腫瘍細胞には存在するが、非腫瘍細胞では存在しないか又は接触不能である、腫瘍細胞表面抗原上のエピトープに対する特異的親和性を有する。腫瘍細胞は、たとえば、悪性細胞であってもよい。腫瘍細胞表面抗原は、葉酸受容体アルファ、葉酸受容体ベータ、及び葉酸受容体デルタからなる群から選択される少なくとも１つでありうる。あるサンプル親和性測定において、ターゲッティング部分は、還元型葉酸キャリアに対する結合親和性よりも少なくとも２倍、５倍、１０倍、２５倍、１００倍、５００倍又は５０００倍強い親和性で、葉酸受容体に結合できる。

ターゲッティング部分を伴う例示的実施形態において、ターゲッティング部分は、抗体の抗原結合配列を含むタンパク質であってもよい。抗体の抗原結合配列は、抗体由来の１つ又は複数の相補性決定領域を含む。タンパク質は、抗体を含んでいてもよい。例示的一実施形態において、ターゲッティング部分は、抗体、ヒト化抗体、抗体の抗原結合断片、単鎖抗体、単一ドメイン抗体、二重特異性抗体、合成抗体、ＰＥＧ化抗体、及び多量体抗体からなる群から選択される少なくとも１つである。

リポソーム抗葉酸剤組成物又はリポソーム組成物のリポソームは、１つのリポソーム当たり２００個まで又は２５０個までのターゲッティング部分を含んでいてもよい。一例として、リポソームは、３０個〜２００個のターゲッティング部分を含んでいてもよい。

一態様はまた、生物活性抗葉酸剤を、葉酸受容体を表面上に発現する腫瘍に送達する方法に関し、この方法は、組成物、たとえばリポソーム抗葉酸剤組成物のうちの任意のものを、治療有効用量の生物活性抗葉酸剤を腫瘍に送達する量で投与するステップを含む。投与するステップは、注入、注射、非経口投与、及び局所投与からなる群から選択できる。対象は、任意の動物又は任意の哺乳動物であってもよい。好適な動物の例は、本開示に列挙される。たとえば、対象はヒトでありうる。

組成物は、任意の好適な方法を使用して調製できる。リポソーム抗葉酸剤組成物又はリポソーム組成物を調製する例示的な一方法は、（１）リポソーム成分、（２）水性溶液中の生物活性抗葉酸剤、（３）任意選択でリポソーム成分にすでに付加されていても又は結合していてもよいターゲッティング部分を含む混合物を形成するステップを含む。続くステップは、混合物を均質化して上記水性溶液中にリポソームを形成するステップ、及び、膜を通して混合物を押し出して、水性溶液中の生物活性抗葉酸剤を封入するリポソームを形成するステップを伴う。この方法は、上記押出しステップ後に、水性溶液中の過剰な生物活性抗葉酸剤をリポソームの外部に除去する任意選択のステップを含んでいてもよい。この方法は、上記除去ステップ後に、上記組成物を凍結乾燥させ、凍結乾燥組成物を形成する任意選択のステップをさらに含んでいてもよい。この方法は、別の任意選択のステップを含んでいてもよい。このステップは、上記凍結乾燥ステップ後に、上記凍結乾燥組成物を溶媒中に溶解させることにより、上記凍結乾燥組成物を復元する。

混合物は、マンニトール、トレハロース、ソルビトール、及びスクロースからなる群から選択される、少なくとも１つを含んでいてもよい。１つ又は複数のリポソーム成分は、立体安定剤をさらに含む。立体安定剤は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）、モノシアロガングリオシド（ＧＭ１）、ポリ（ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）、ポリ（アクリルアミド）（ＰＡＡ）、ポリ（２−メチル−２−オキサゾリン）、ポリ（２−エチル−２−オキサゾリン）、ホスファチジルポリグリセロール、ポリ［Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド］、両親媒性ポリ−Ｎ−ビニルピロリドン、Ｌ−アミノ酸ベースポリマー、及びポリビニルアルコールからなる群から選択される少なくとも１つであってもよい。ＰＥＧは、２００〜５０００ダルトンの数平均分子量（Ｍｎ）を有していてもよい。組成物を製造する方法において、溶媒は、水性溶媒であってもよい。

葉酸受容体を選択的に標的とする標的化リポソーム組成物が提供される。例示的標的化リポソーム組成物は、内部空間を含むリポソーム、上記内部空間内に配置された生物活性剤、リポソームの外部に付加された立体安定剤、及び少なくとも１つの葉酸受容体に対する特異的親和性を有するタンパク質を含むターゲッティング部分を含み、上記ターゲッティング部分は、立体安定剤分子及びリポソームの外部のうちの少なくとも一方に付加されている。立体安定剤は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）、モノシアロガングリオシド（ＧＭ１）、ポリ（ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）、ポリ（アクリルアミド）（ＰＡＡ）、ポリ（２−メチル−２−オキサゾリン）、ポリ（２−エチル−２−オキサゾリン）、ホスファチジルポリグリセロール、ポリ［Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド］、両親媒性ポリ−Ｎ−ビニルピロリドン、Ｌ−アミノ酸ベースポリマー、及びポリビニルアルコールからなる群から選択される少なくとも１つであってもよい。たとえば、ＰＥＧは、２００〜５０００ダルトンの数平均分子量（Ｍｎ）を有していてもよい。この標的化リポソーム組成物において、生物活性剤は、エリプチシン、パクリタキセル、ペメトレキセド、メトトレキセート、ラリトレキセド、アミノプテリン、プララトレキセート、ロメテレキソール、ロメテレキソールのチオフェン類似体、ロメテレキソールのフラン類似体、トリメトレキセド、ＬＹ３０９８８７、ＧＷ １８４３Ｕ８９、プログアニル、ピリメタミン、トリメトプリム、並びに６−置換ピロロ及びチエノ［２，３−ｄ］ピロロピリミジンクラスのＧＡＲＦＴ阻害剤からなる群のうちの少なくとも１つを含む。

組成物は、たとえば、（１）リポソーム成分、（２）水性溶液中の生物活性剤、（３）ターゲッティング部分を含む混合物を形成することにより製造できる。続くステップは、混合物を均質化して上記水性溶液中にリポソームを形成するステップ、及び、膜を通して混合物を押し出して、水性溶液中の生物活性抗葉酸剤を封入するリポソームを形成するステップを伴う。任意選択のステップは、上記押出しステップ後に、水性溶液中の過剰な生物活性抗葉酸剤をリポソームの外部に除去するステップを伴っていてもよい。別の任意選択のステップは、上記除去ステップ後に、上記組成物を凍結乾燥させ、凍結乾燥組成物を形成するステップを伴う。別の任意選択のステップは、上記凍結乾燥ステップ後に、上記凍結乾燥組成物を溶媒中に溶解させることにより、上記凍結乾燥組成物を復元するステップを伴う。他の成分及びステップを、本明細書において考察される他の製造方法から共有できる。

任意のリポソーム組成物、たとえばリポソーム抗葉酸剤組成物を提供するためのキットもまた提供される。このキットは、リポソーム成分、組成物を使用して生物活性剤を封入するための説明書、及び任意選択で、別の容器に、生物活性剤を含みうる。

正常組織を示す概略図である。 癌組織を示す概略図である。 例示的一実施形態及びその結合機構を示す概略図である。 細胞表面上で葉酸受容体と結合する蛍光色素コンジュゲート抗体を示す概略図である。 葉酸受容体アルファを発現する細胞と結合してその内部に移行する例示的リポソームを示す概略図である。 ｐ３８タンパクキナーゼ経路を使用した、細胞増殖に対する例示的リポソーム組成物の内部移行の効果を示す概略図である。 蛍光色素を使用した、ＫＢ細胞のフローサイトメトリー解析からのデータを示す図である。 蛍光色素を使用した、ＯＶＣＡＲ−３（卵巣）細胞のフローサイトメトリー解析からのデータを示す。 蛍光色素を使用した、ＮＣＩＨ２４５２（中皮腫）細胞のフローサイトメトリー解析からのデータを示す図である。 蛍光色素を使用した、ＣＣＤ８４１（正常結腸）細胞のフローサイトメトリー解析からのデータを示す図である。 蛍光色素を使用した、ＳＬ０００３（肺）細胞のフローサイトメトリー解析からのデータを示す図である。 蛍光色素を使用した、ＣＣＤ８４１（正常結腸）細胞のフローサイトメトリー解析からのデータを示す図である。 正常又は癌細胞における例示的リポソーム組成物の表面レベルを示す棒グラフの図である。 ＲｈｏｄｏＲｅｄを使用した、卵巣癌細胞のフローサイトメトリー解析からのデータを示す図である。 ＲｈｏｄｏＲｅｄを使用した、ＫＢ葉酸受容体アルファ高発現細胞（ＫＢ ｆｏｌａｔｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｌｐｈａ ｈｉｇｈ ｃｅｌｌ）のフローサイトメトリー解析からのデータを示す図である。 ＲｈｏｄｏＲｅｄを使用した、正常乳腺細胞のフローサイトメトリー解析からのデータを示す図である。 ＲｈｏｄｏＲｅｄを使用した、正常結腸細胞のフローサイトメトリー解析からのデータを示す図である。 リポソーム濃度依存性標的化対非標的化リポソーム濃度依存性検出を示す棒グラフを示す図である。 未処理細胞のフローサイトメトリー解析からのデータを示す図である。 例示的一実施形態による例示的リポソーム組成物で処理された細胞のフローサイトメトリー解析からのデータを示す図である。 列挙された様々な試薬に曝露された肺癌細胞を示す図である。 成長阻害と葉酸受容体アルファ発現との間の相関を示す線グラフの図である。 結果を要約し、例示的一実施形態の例示的リポソーム組成物が、癌細胞成長を阻害することを実証する棒グラフの図である。 正常細胞の細胞周期を示す概略図である。 細胞周期の様々な段階における細胞のヨウ化プロピジウム定量を示す図である。 未処理の細胞のヨウ化プロピジウム定量からのデータを示す図である。 ペメトレキセドで処理された細胞のヨウ化プロピジウム定量からのデータを示す図である。 リポソーム組成物の例示的一実施形態による細胞周期停止を示す棒グラフの図である。 成熟好中球を決定するためのＭａｃ−１についての細胞の解析を示す図である。 正常細胞からのフローサイトメトリーデータを示す図である。 ペメトレキセド処理細胞からのフローサイトメトリーデータを示す図である。 ペメトレキセド処理及び例示的実施形態処理サンプルにおける分化好中球の数を示す棒グラフの図である。

抗葉酸薬は、上で論じたとおり、細胞内部に入ると葉酸の作用に干渉することにより働き、細胞から、それらが複製及び増殖するのに必要なＤＮＡ前駆体を奪う葉酸模倣分子として設計された。癌細胞は、葉酸の形態のＤＮＡ前駆体を多く必要とする、急速に成長する細胞であるので、葉酸と同様に抗葉酸薬を吸収し、結果として、抗葉酸剤の影響を受けやすい。しかしながら、急速に成長する正常細胞、たとえば胃腸（ＧＩ）管の内表面を構成する細胞及び骨髄細胞、たとえば好中球は、ＲＦＣを主に介して供給される葉酸を同様に使用して、急速に分裂する。したがって、正常細胞もまた、抗葉酸剤の毒性効果を受けやすい。なぜなら、ほとんどの抗葉酸剤が癌細胞に浸潤してそれを殺傷するために使用するよう設計されたＲＦＣ媒介性輸送機構は、正常細胞がそれら自体に葉酸を供給するために使用するのと同じ機構だからである。結果として、非常に有望で効果的な抗葉酸剤を使用した癌治療は、治療が副作用によるダメージを急速に成長する正常細胞に引き起こし、そのことにより抗葉酸剤関連の深刻で生命を脅かす可能性のある毒性を引き起こす高い可能性ゆえに、患者の臨床ケアにおいて困難な課題だった。

上で考察したとおり、一クラスとしての抗葉酸剤は、癌治療におけるそれらの抗増殖性効果のために使用され、細胞成長及び分裂を阻害し、癌細胞死をもたらす。急速に複製する癌細胞は、ほとんどの正常細胞と比較して、多くの量の葉酸を必要とする。このことは、ほぼ７０年前に抗癌剤としての抗葉酸剤の臨床開発をもたらした。しかしながら、抗葉酸剤ベースの治療法が癌治療に有効と示されたとはいえ、抗葉酸剤の臨床開発には問題があり、多くの場合、どうしようもない臨床的ジレンマを考慮して頓挫させられてきた。このジレンマは、２つの競合する臨床ダイナミクスから生じる。一方では、抗葉酸剤は、好ましい膜横断トランスポーター機構としてＲＦＣを使用して癌細胞にほとんどが到達するよう意図された、葉酸模倣分子であるように設計される。他方、身体において急速に再生する組織、たとえば骨髄又は腸管組織細胞もまた、癌細胞と同様に、高度に葉酸依存的であり、やはりＲＦＣを主要な膜横断葉酸細胞供給機構として使用する。これら２つの臨床ダイナミクスの最終結果として、骨髄及び胃腸（ＧＩ）管細胞が、患者の生命を脅かす抗葉酸剤関連毒性の最も多い部位であった。これらの毒性のいくつかには、粘膜炎、下痢、貧血、好中球減少、及び低白血球数が含まれていた。かかる毒性は、単独で又は組み合わせて、数多くの事例において、抗葉酸剤ベース治療からの患者の死亡の原因であった。結果として、今日まで、多くの有効で有望な抗葉酸剤が、癌細胞に対する有効性の欠如ゆえではなく、患者の安全性に対する懸念ゆえに、それらの開発中に挫折し続けている。薬剤となる段階に何とか到達したごく少数は、やはり安全性に対する懸念ゆえに、臨床診療における使用が限定されている。

一クラスとしての抗葉酸剤は、患者にとって深刻な、生命を脅かしさえする毒性の関連リスクにもかかわらず、依然として、癌の有望な治療法である。課題は、これらの高度に有効な抗葉酸剤を、正常細胞に対するダメージを回避する形で送達する手段を明らかにすることである。

これまでの試みは、概して、ＲＦＣを使用して抗癌剤を送達することに焦点を当ててきた。しかしながら、本発明者らは、たとえば葉酸受容体アルファ、葉酸受容体ベータ及び／又は葉酸受容体デルタを含むが、これに限定されない葉酸受容体を伴う、癌細胞にとりわけ多く見られる別の経路を利用する。癌細胞が、正常細胞とは対照的に、効率的に葉酸を取り込んでそれらの急速な複製及び増殖による必要性を支えるため、葉酸受容体アルファを優先的に発現することが、癌生物学において観察されてきた。癌細胞は、正常細胞と比較して、血流中に含有される葉酸をそれら自体に非常に効率的に供給する。癌細胞がこれを行う１つの方法は、それらが葉酸受容体、たとえば葉酸受容体アルファを過剰発現することによる。癌が進行するにつれて、腫瘍細胞表面の葉酸受容体アルファレベルは増加する傾向にあり、これは、葉酸供給の必要性の増加による可能性が最も高い。

葉酸受容体アルファに対するその高親和性ゆえに、葉酸は従来、細胞毒性薬を含有するリポソームにコンジュゲートされるか、又は、細胞毒性薬自体にコンジュゲートされるかのいずれかで、細胞毒性薬を癌細胞に優先的に送達することを意図して、抗癌又は細胞毒性分子を癌細胞に送達するためのターゲッティング部分として研究されてきた。このアプローチは、患者の安全性の改善をもたらさなかった。その主な理由は、本発明者らにより認識されていたとおり、このアプローチが、細胞毒性薬を癌細胞に送達するアプローチとして葉酸経路を利用することと、細胞毒性薬に対する正常細胞の曝露を低減及び／又は最小化することとの重要な生物学的相違を、認めていなかったからである。ターゲッティングリガンドとしての葉酸では、正常細胞は毒性を回避できない。なぜなら、かかる標的化薬物は、依然としてＲＦＣを介して正常細胞により取り込まれるからである。換言すれば、葉酸をターゲッティング部分として使用する標的化薬物は、生物学的に、通常の非標的化抗葉酸剤と変わらない。なぜなら、かかる構造の薬物は、癌及び正常細胞の両方により無差別的に取り込まれる任意の他の葉酸模倣分子とまったく同様に、葉酸受容体アルファ及びＲＦＣの両方と結合するからである。したがって、葉酸をターゲッティング部分として使用することは、正常細胞を回避しながらの癌細胞への細胞毒性剤の選択的送達を提供しない。したがって、ターゲッティング部分としての葉酸では、薬物関連毒性は、患者ケアにおける懸案のままだった。結果として、権威ある専門家は、葉酸受容体を癌細胞の選択的ターゲッティングのための手段として利用しようとすることが有効ではないことを示唆し、当業者は葉酸受容体を利用しない方向に導かれた。

抗葉酸剤をターゲッティング部分を有する葉酸受容体へとターゲッティングすることは、今日まで試みられてこなかった。抗葉酸剤は葉酸を模倣するので、葉酸経路を利用して標的化された方法で抗葉酸剤を送達すること検討しなかったのだろう。それは冗長的だと考えられただろう。なぜなら、還元型葉酸キャリアがすでに葉酸を細胞内に輸送しているからである。この理解から、抗葉酸剤は葉酸を模倣するので、抗葉酸薬は細胞により葉酸受容体により有効に取り込まれ、たとえば抗体を使用したさらなる補助は不要だろうと結論づけることは、元来は論理的だった。本発明者らは、直感に反するアプローチをとった。抗葉酸剤がＲＦＣを介して正常細胞により取り込まれないようにすることが、抗葉酸剤関連毒性を低減又は防止するために重要だったので、本発明者らは、この目的が、とりわけ、抗葉酸剤研究の分野において有用だと認められていなかった癌特異的形態、すなわち、腫瘍組織細胞による極性の消失を利用することにより達成できることを見出した。

細胞極性の破壊及び組織崩壊は、進行性上皮腫瘍の特徴である。図１Ａに図示するとおり、正常単層上皮は、明確な尖端−基底極性を示す単層の個別細胞を一般に含む。細胞は、密に詰まっており、尖端と側底膜領域とを分ける尖端結合複合体（図１Ａ−１０１）により互いに接続される。極性が保存された正常組織において、葉酸受容体アルファは、血液循環中の葉酸から離れて、それらと直接接触せずに位置する細胞の尖端表面に結合している（図１Ａ−１０２）。図１Ｂは、どのように高悪性度上皮腫瘍における細胞が尖端−基底極性の消失及び組織崩壊を示し、葉酸受容体アルファを血液循環中の葉酸と直接接触させるかを示す（１Ｂ−１０３）。腫瘍組織細胞のこの特徴が、抗葉酸剤ベースの治療法にとって、従来の考えにより認められるよりも大きな重要性を有すると、本発明者らは信じた。本発明者らは、このことが、抗葉酸剤を抗癌療法として復権させる重大な可能性を秘めている一方で、抗葉酸剤と関連づけられる深刻で時には生命を脅かす毒性を低減及び／又は最小化さえすることを発見した。

この点に関して、本発明者らは、癌細胞において高発現である葉酸受容体、たとえば葉酸受容体アルファ、ベータ及びデルタを選択的に標的とする一方で、ＲＦＣ（正常細胞により使用される葉酸経路）を回避する形で抗葉酸剤を送達し、抗葉酸剤を腫瘍組織細胞に選択的に曝露する一方で、正常細胞に対する抗葉酸剤の曝露を低減又は回避する化学物質を設計した。これは、極性の消失後に、腫瘍組織細胞が葉酸受容体、たとえば葉酸受容体アルファ過剰発現及び露出させることだけでなく、癌細胞における葉酸受容体が血液循環と直接接触するが、正常組織ではこれらのいずれも起きないことを認識することにより可能となる。このアプローチは、他の細胞表面葉酸受容体（たとえば、葉酸受容体ベータ、葉酸受容体デルタ等）にも、葉酸受容体アルファに対するそれらの構造的及び機能的類似性ゆえに拡張できる。

本開示は、様々な生物活性剤、たとえば抗葉酸剤を送達するのに有用なリポソーム組成物、リポソーム組成物を製造する方法及びリポソーム組成物を使用して患者を治療するための方法に一般に関する。葉酸受容体へと標的化されているが、還元型葉酸キャリアへは特異的に標的化されていない抗葉酸剤カプセル化リポソームを提供することには、特別な有用性がある。

より詳細には、本開示は、１つ又は複数の生物活性剤、たとえば抗癌（抗腫瘍）剤を含有する葉酸受容体又は複数の葉酸受容体に対する親和性及び特異性を有する中性又はアニオン性リポソーム（すなわち、非カチオン性リポソーム）が、細胞表面に葉酸受容体を提示及び発現する細胞に対して驚くほど有効であるという発見に基づく。

例示的一実施形態において、リポソーム抗葉酸剤組成物が提供される。リポソーム抗葉酸剤組成物は、内部空間を含むリポソーム、内部空間内に配置された生物活性抗葉酸剤、リポソームの外部に付加されたＰＥＧ分子、及び少なくとも１つの葉酸受容体に対する特異的親和性を有するタンパク質を含むターゲッティング部分を含んでいてもよく、上記ターゲッティング部分は、ＰＥＧ及びリポソームの外部のうちの少なくとも一方に付加されている。

付加する又は付加されるという用語は、たとえば、任意のタイプの結合、たとえば共有結合、イオン結合（たとえば、アビジン−ビオチン）、疎水性相互作用による結合、及び官能基、たとえばマレイミド、又はリンカー、たとえばＰＥＧを介した結合を指す。たとえば、検出可能なマーカー、立体安定剤、リポソーム、リポソーム成分、免疫刺激剤が、互いに直接に、マレイミド官能基により、又はＰＥＧ−マレイミド基により付加されていてもよい。

いくつかの例示的実施形態におけるリポソームは、循環中でのそれらの寿命を増加させうる立体安定剤を含む。基本的な着想は、１つ又は複数の立体安定剤、たとえば親水性ポリマー（ポリエチレングリコール（ＰＥＧ））、糖脂質（モノシアロガングリオシド（ＧＭ１））等が、リポソーム表面と直接隣接する空間を占め、この空間から他の高分子を排除するというものである。結果として、リポソーム表面に対する血漿オプソニンの接近及び結合が妨げられ、その結果、かかるリポソームとのマクロファージの相互作用、又は任意の他の除去機構が阻害され、循環中でのリポソームの寿命が高められる。例示的実施形態において、立体安定剤又は立体安定剤の集団は、ＰＥＧ又はＰＥＧを含む組合せであってもよい。例示的一実施形態において、立体安定剤は、２００〜５０００ダルトンの数平均分子量（Ｍｎ）を有するＰＥＧであってもよい。これらのＰＥＧは、任意の構造、たとえば直鎖状、分枝状、星状又はくし状構造のものでありえ、市販されている。

様々な例示的実施形態のリポソーム組成物中に含有されるリポソームは、当技術分野において既知又は今後発見される任意のリポソームでありうる。一般に、例示的実施形態のリポソームは、任意のリポソーム構造、たとえば、１つ又は複数の脂質二重層により外部媒体から隔離された内部空間を有する構造を有していてもよく、又は、半透膜を親油性中心部とともに有し、膜が内部を隔離する任意のマイクロカプセルであってもよい。脂質二重層は、親水性部（親水性部分）及び疎水性部（疎水性部分）により特徴づけられる両親媒性分子の任意の構成でありうる。通常は、二重層における両親媒性分子は、二次元シートへと構成され、そこでは、疎水性部分がシートの内側を向く一方で、親水性部分が外側を向く。例示的実施形態のリポソームを形成する両親媒性分子は、任意の既知又は今後発見される両親媒性分子、たとえば合成若しくは天然由来の脂質又は生体適合性脂質でありうる。例示的実施形態のリポソームはまた、両親媒性ポリマー及び表面活性剤により形成されてもよく、たとえばポリメロソーム（ｐｏｌｙｍｅｒｏｓｏｍｅｓ）及びニオソームであってもよい。本開示の目的のため、限定せずに、これらのリポソーム形成材料もまた「脂質」と称される。

リポソーム組成物は、液体であってもよく、又はそれは乾燥していてもよく、たとえば乾燥粉末若しくは乾燥ケーキの形態であってもよい。乾燥粉末若しくは乾燥ケーキは、一次乾燥をたとえば凍結乾燥条件下で経ていてもよく、又は任意選択で、それは一次乾燥のみ若しくは一次乾燥及び二次乾燥の両方を経ていてもよい。乾燥形態において、粉末又はケーキは、たとえば、１％〜６％の間の水分、たとえば２％〜５％の間の水分又は２％〜４％の間の水分を有していてもよい。例示的一乾燥方法は、凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｉｏｎ）（凍結乾燥（ｆｒｅｅｚｅ−ｄｒｙｉｎｇ）又は凍結乾燥（ｃｙｒｏｄｅｓｓｉｃａｔｉｏｎ）とも呼ばれる）である。本開示の組成物及び方法のうちの任意のものが、リポソーム、凍結乾燥リポソーム又は凍結乾燥リポソームから復元されたリポソームを伴っていてもよい。凍結乾燥において、凍結乾燥材料を保護する分子である凍結保護剤（ｌｙｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔｓ）又は抗凍結剤を使用できる。これらの分子は、典型的には、ポリヒドロキシ化合物、たとえば糖（単糖、二糖、及び多糖）、多価アルコール、及びそれらの誘導体、グリセロール、又はポリエチレングリコール、トレハロース、マルトース、スクロース、グルコース、ラクトース、デキストラン、グリセロール、並びにアミノグリコシドである。凍結保護剤又は抗凍結剤は、たとえば、１０％まで又は２０％までの溶液を、リポソームの外部又はリポソームの内部又はリポソームの外部及び内部の両方含んでいてもよい。

例示的実施形態のリポソームは、たとえば、３０〜１５０ｎｍ（ナノメートル）の範囲の直径を有していてもよい。他の例示的実施形態において、リポソームは、たとえば、４０〜７０ｎｍの範囲の直径を有していてもよい。

例示的実施形態のリポソームは、たとえば、好ましくは、アニオン性又は中性であってもよい。すなわち、リポソームは、カチオン性であるべきではない。電荷（すなわち、アニオン性、中性又はカチオン性）の決定は、リポソームのゼータ電位を測定することによりなされてもよい。例示的一実施形態において、リポソームのゼータ電位は、ゼロ以下である。別の例示的一実施形態において、リポソームのゼータ電位は、０〜−１５０ｍＶの範囲である。別の例示的一実施形態において、ゼータ電位は、−３０〜−５０ｍＶの範囲であるべきである。

リポソームの特性は、リポソームを製造するために使用される脂質の性質に影響を受ける。多様な脂質が、リポソームを製造するために使用されてきた。これらは、カチオン性、アニオン性及び中性脂質を含む。カチオン性脂質は、遺伝子導入剤として一般に使用されるカチオン性リポソームを製造するために使用される。カチオン性リポソームの正電荷は、細胞表面上の負電荷との相互作用を可能にする。細胞に対するカチオン性リポソームの結合後、リポソームはエンドサイトーシスを通じて細胞内部に移行する。しかしながら、カチオン性リポソームは、正常細胞と腫瘍細胞の両方に結合すると考えられる。例示的実施形態は、腫瘍細胞を特異的且つ選択的に標的とする一方で、正常細胞を実質的に回避することが意図されているので、カチオン性脂質の使用は好ましくない。たとえば、中性脂質、たとえばＨＳＰＣ、及びアニオン性脂質、たとえばＰＥＧ−ＤＳＰＥの混合物を使用することは、正常細胞と非特異的に結合する可能性がより低いアニオン性リポソームの形成をもたらす。腫瘍細胞に対する特異的結合は、腫瘍ターゲッティング抗体、たとえば葉酸受容体抗体、たとえば、葉酸受容体アルファ抗体、葉酸受容体ベータ抗体及び／又は葉酸受容体デルタ抗体を使用することにより達成できる。

一例として、脂質のうちの少なくとも１つ（又はいくつか）が両親媒性脂質であり、これは、親水性及び疎水性部分（典型的には、親水性頭部及び疎水性尾部）を有するものとして定義される。疎水性部分は、典型的には、疎水性相（たとえば、二重層内）へと向けられる一方で、親水性部分は、典型的には、水相（たとえば、二重層の外部）へと向けられる。疎水性部分は、極性又は荷電基、たとえば炭水化物、リン酸基、カルボキシル基、硫酸基、アミノ基、スルフヒドリル基、ニトロ基、ヒドロキシ基及び他の同様の基を含んでいてもよい。疎水性部分は、長鎖飽和及び不飽和脂肪族炭化水素基並びに１つ又は複数の芳香族、脂環式又は複素環式基により置換された基を含むがこれらに限定されない、無極性基を含んでいてもよい。両親媒性化合物の例には、リン脂質、アミノ脂質及びスフィンゴ脂質が含まれるが、これらに限定されない。

典型的には、たとえば、脂質はリン脂質である。リン脂質には、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン等が含まれるが、これらに限定されない。他の脂質膜成分、たとえばコレステロール、スフィンゴミエリン、カルジオリピン等を使用できることが理解されるべきである。

例示的一実施形態において、脂質は、アニオン性及び中性（たとえば双性イオン性及び極性）脂質、たとえばアニオン性及び中性リン脂質であってもよい。中性脂質は、選択されたｐＨで非荷電又は中性双性イオン性形態で存在する。生理的ｐＨでは、かかる脂質には、たとえば、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、セファリン、コレステロール、セレブロシド及びジアシルグリセロールが含まれる。双性イオン性脂質の例には、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、及びジオレオイルホスファチジルセリン（ＤＯＰＳ）が含まれるが、これらに限定されない。アニオン性脂質は、生理的ｐＨで負に荷電した脂質である。これらの脂質には、ホスファチジルグリセロール、カルジオリピン、ジアシルホスファチジルセリン、ジアシルホスファチジン酸、Ｎ−ドデ−カノイルホスファチジルエタノールアミン、Ｎ−スクシニルホスファチジルエタノールアミン、Ｎ−グルタリルホスファチジルエタノールアミン、リシルホスファチジルグリセロール、パルミトイルオレオイルホスファチジルグリセロール（ｐａｌｍｉｔｏｙｌｏｌｅｙｏｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ）（ＰＯＰＧ）、及び中性脂質と連結された他のアニオン性修飾基が含まれるが、これらに限定されない。

集合的に、アニオン性及び中性脂質は、非カチオン性脂質と本明細書において称する。かかる脂質は、リンを含有していてもよいが、そのように限定されない。非カチオン性脂質の例には、レシチン、リゾレシチン、ホスファチジルエタノールアミン、リゾホスファチジルエタノールアミン、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイルホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルグリセロール（ＰＯＰＧ）、１６−０−モノメチルＰＥ、１６−０−ジメチルＰＥ、１８−１−ｔｒａｎｓ ＰＥ、パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、１−ステアロイル−２−オレオイルホスファチジルエタノールアミン（ｌ−ｓｔｅａｒｏｙｌ−２−ｏｌｅｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）（ＳＯＰＥ）、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン、セファリン、カルジオリピン、ホスファチジン酸、セレブロシド、ジセチルホスフェート、及びコレステロールが含まれる。

例示的実施形態のリポソームは、リポソーム成分（ｌｉｐｏｓｏｍａｌ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ）（リポソーム成分（ｌｉｐｏｓｏｍｅ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ）とも呼ばれる）を使用した任意のリポソーム構築方法を使用して構築できる。リポソーム成分には、たとえば、脂質、たとえばＤＳＰＥ、ＨＳＰＣ、コレステロール及びこれらの成分の誘導体が含まれる。他の好適な脂質は、たとえば、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ．（Ａｌａｂａｓｔｅｒ，Ａｌａｂａｍａ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）により市販されている。アニオン性リポソームを製造するのに好適な入手可能な負に又は中性に荷電した脂質として部分的に挙げられるのは、たとえば、以下のもののうちの少なくとも１つであってもよい。すなわち、ＤＬＰＣ、ＤＭＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＳＰＣ、ＤＯＰＣ、ＤＭＰＥ、ＤＰＰＥ、ＤＯＰＥ、ＤＭＰＡ・Ｎａ、ＤＰＰＡ・Ｎａ、ＤＯＰＡ・Ｎａ、ＤＭＰＧ・Ｎａ、ＤＰＰＧ・Ｎａ、ＤＯＰＧ・Ｎａ、ＤＭＰＳ・Ｎａ、ＤＰＰＳ・Ｎａ、ＤＯＰＳ・Ｎａ、ＤＯＰＥ−グルタリル・（Ｎａ）_２、テトラミリストイルカルジオリピン・（Ｎａ）_２、ＤＳＰＥ−ｍＰＥＧ−２０００・Ｎａ、ＤＳＰＥ−ｍＰＥＧ−５０００・Ｎａ、及びＤＳＰＥ−マレイミドＰＥＧ−２０００・Ｎａ。

これらの脂質の誘導体は、たとえば、少なくとも、リポソーム成分に対する１つ又は複数の立体安定剤及び／又は官能基の結合（好ましくは共有結合）を含んでいてもよく、その後、立体安定剤及び／又は官能基は、リポソーム成分の一部と考えられるべきである。官能基には、リポソーム成分を別の部分、たとえばタンパク質に付加するために使用できる基が含まれる。かかる官能基には、少なくとも、マレイミドが含まれる。これらの立体安定剤には、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）、モノシアロガングリオシド（ＧＭ１）、ポリ（ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）、ポリ（アクリルアミド）（ＰＡＡ）、ポリ（２−メチル−２−オキサゾリン）、ポリ（２−エチル−２−オキサゾリン）、ホスファチジルポリグリセロール、ポリ［Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド］、両親媒性ポリ−Ｎ−ビニルピロリドン、Ｌ−アミノ酸ベースポリマー、及びポリビニルアルコールからなる群からの少なくとも１つが含まれる。

リポソーム成分は、それに結合している任意の分子（複数可）（すなわち、化学物質／試薬／タンパク質）を含んでいてもよいので、リポソーム成分は、たとえば、少なくとも、ＤＳＰＥ、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ、ＤＳＰＥ−マレイミド、ＨＳＰＣ、ＨＳＰＣ−ＰＥＧ、ＨＳＰＣ−マレイミド、コレステロール、コレステロール−ＰＥＧ、及びコレステロール−マレイミドを含んでいてもよい。好ましい一実施形態において、リポソームを構成するリポソーム成分は、ＤＳＰＥ、ＤＳＰＥ−ＦＩＴＣ、ＤＳＰＥ−マレイミド、コレステロール、及びＨＳＰＣを含む。

例示的一実施形態において、脂質二重層の少なくとも１つの成分が官能化されている（か又は反応性である）。本明細書において使用される官能化成分は、試薬及び部分を脂質に架橋するために使用できる反応基を含む成分である。脂質が官能化される場合、それが形成する任意のリポソームもまた官能化される。

例示的実施形態において、反応基は、架橋剤（又は他の部分）と反応して架橋を形成すると考えられるものである。反応基は、それが架橋剤と接触して他の部分（すなわち、立体安定剤、ターゲッティング部分等）と架橋されることを可能にする脂質上のどこに位置していてもよい。いくつかの実施形態において、脂質、たとえばリン脂質の頭部基にある。反応基の一例は、マレイミド基である。マレイミド基は、ジチオール架橋剤、たとえばこれに限定されないが、ジチオトレイトール（ｄｉｔｈｉｏｌｔｈｒｉｅｔｏｌ）（ＤＴＴ）の存在下で互いに対して架橋できる。

例示的実施形態は、他の官能化脂質、他の反応基、及び他の架橋剤の使用を考慮することが理解されるべきである。マレイミド基に加えて、反応基の他の例には、他のチオール反応基、アミノ基、たとえば一級及び二級アミン、カルボキシル基、ヒドロキシル基、アルデヒド基、アルキン基、アジド基、カルボニル、ハロアセチル（たとえば、ヨードアセチル）基、イミドエステル基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、スルフヒドリル基、ピリジルジスルフィド基等が含まれるが、これらに限定されない。

官能化及び非官能化脂質は、数多くの市販元、たとえばＡｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ ５ Ｌｉｐｉｄｓ（Ａｌａｂａｓｔｅｒ，Ａｌａ．）から入手可能である。

例示的実施形態のリポソームは、その外部に配置された免疫刺激剤、検出可能なマーカー、又は両方をさらに含んでいてもよい。たとえば、免疫刺激剤又は検出可能なマーカーは、たとえば任意選択で立体安定剤を含めて、リポソームの外部とイオン結合又は共有結合していてもよい。

免疫刺激剤（ｉｍｍｕｎｏｓｔｉｍｕｌａｎｔｓ）、免疫刺激剤（ｉｍｍｕｎｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｓ）、ハプテン及びアジュバントとしても知られている免疫刺激剤（ｉｍｍｕｎｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ａｇｅｎｔｓ）は、免疫系の構成要素のうちの任意のものの活性化を誘導すること又は活性を増加させることにより、免疫系を刺激する物質である。

これらの免疫刺激剤は、ハプテン、アジュバント、タンパク質免疫刺激剤、核酸免疫刺激剤、及び化学免疫刺激剤のうちの１つ又は複数を含みうる。多くのアジュバントが、免疫反応を刺激するよう設計された物質、たとえばリピドＡ、ボルタデラ・パーツッシス（Ｂｏｒｔａｄｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）又はマイコバクテリウム・ツバーキュローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）由来タンパク質を含有する。いくつかのアジュバントが、たとえば、フロイント不完全アジュバント及び完全アジュバント（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，Ｍｉｃｈ．）、Ｍｅｒｃｋ Ａｄｊｕｖａｎｔ ６５（Ｍｅｒｃｋ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｉｎｃ．，Ｒａｈｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）、ＡＳ−２（ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ Ｂｅｅｃｈａｍ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ．）、アルミニウム塩、たとえば、水酸化アルミニウムゲル（ミョウバン）又はリン酸アルミニウム、カルシウム、鉄又は亜鉛の塩、アシル化チロシンの不溶性懸濁液、アシル化糖、カチオン性又はアニオン性誘導体化多糖、ポリホスファゼン、生分解性マイクロスフェア、モノホスホリルリピドＡ及びｑｕｉｌ Ａとして市販されている。サイトカイン、たとえばＧＭ−ＣＳＦ、インターロイキン−２、−７、−１２及び他の同様の成長因子もまた、アジュバントとして使用できる。好ましい一実施形態において、免疫刺激剤は、フルオレセイン、ＤＮＰ、ベータグルカン、ベータ−１，３−グルカン、ベータ−１，６−グルカンからなる群から選択される少なくとも１つであってもよい。

検出可能なマーカーには、たとえば、少なくとも、当技術分野において知られている任意の好適な手段、たとえば磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）、光学イメージング、蛍光／発光イメージング、又は磁気共鳴イメージング手法により検出可能な、放射性同位体、蛍光化合物、生物発光化合物、化学発光化合物、金属キレート剤、酵素、色素、インク、磁性化合物、生体触媒又は顔料が含まれる。

免疫刺激剤及び／又は検出可能なマーカーは、それをリポソームと共インキュベートすることにより外部に付加することができる。たとえば、免疫刺激剤及び／又は検出可能なマーカーは、疎水性相互作用又はイオン結合、たとえばアビジン／ビオチン結合若しくは金属キレート化結合（たとえば、Ｎｉ−ＮＴＡ）によりリポソーム膜と関連づけられてもよい。代わりに、免疫刺激剤又は検出可能なマーカーは、たとえばリポソーム成分又はＰＥＧである立体安定剤と共有結合することによって、リポソームの外部と共有結合していてもよい。

例示的一試薬は、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）であり、これは、本発明者らの実験に基づくと、免疫刺激剤及び検出可能なマーカーの両方として驚くほど寄与できる。

例示的実施形態はまた、内部空間を封入するリポソームを提供する。例示的一実施形態において、内部空間は水性溶液を含んでいてもよいが、これに限定されない。内部空間は、生物活性剤、たとえば抗葉酸剤及び薬学的に許容される水性担体を含んでいてもよい。薬学的に許容される担体は、たとえば、トレハロースを含んでいてもよい。例示的一実施形態において、トレハロースは、たとえば、約５％〜２０％質量パーセントのトレハロース又は５％〜２０％の総濃度の１つ若しくは複数の凍結保護剤若しくは抗凍結剤の任意の組合せで存在していてもよい。内部空間は、たとえば、クエン酸緩衝液を５〜２００ｍＭの間の濃度で含んでいてもよい。クエン酸緩衝液は、内部空間を２．８〜６の間のｐＨに緩衝できる。トレハロース又はクエン酸濃度と独立に、薬学的に許容される担体は、５０ｍＭ〜５００ｍＭの間の総濃度の酢酸ナトリウム及び酢酸カルシウムを含んでいてもよい。

例示的一実施形態において、生物活性抗葉酸剤は、たとえば、水溶性生物活性剤であってもよい。つまり、生物活性剤は、水性溶液を形成できる。例示的実施形態によれば、各リポソームは、２００，０００分子未満の生物活性剤を含有する内部空間を含んでいてもよい。たとえば、例示的一実施形態において、リポソームは、１０，０００個〜１００，０００個の間の生物活性抗葉酸剤を含んでいてもよい。

例示的一実施形態において、生物活性剤は、ペメトレキセド、ロメテレキソール、メトトレキセート、ラリトレキセド、アミノプテリン、プララトレキセート、それらのロメテレキソール類似体、ロメテレキソールのチオフェン類似体、ロメテレキソールのフラン類似体、トリメトレキセド、ＬＹ３０９８８７、及びＧＷ １８４３Ｕ８９からなる群からの少なくとも１つでありうる。別の一実施形態において、生物活性剤は、プログアニル、ピリメタミン、トリメトプリム、並びに６−置換ピロロ及びチエノ［２，３−ｄ］ピロロピリミジンクラスのＧＡＲＦＴ阻害剤からなる群からの少なくとも１つでありうる。好ましい一実施形態において、生物活性抗葉酸剤は、ペメトレキセドである。別の例示的一実施形態において、生物活性抗葉酸剤は、ロメテレキソールである。

生物活性剤を含む溶液のｐＨは、たとえば、５〜８又は２〜６に設定できる。

例示的実施形態によれば、例のリポソーム組成物中に含有されるリポソームはまた、ターゲッティングリポソーム、たとえば、リポソームの表面上の１つ若しくは複数のターゲッティング部分又は生体内分布修正剤を含むリポソームでありうる。ターゲッティングリポソームの例示的実施形態は、たとえば、免疫リポソームと呼ばれてもよい。ターゲッティング部分は、所望の標的と特異的に結合又は相互作用可能な、任意の試剤でありうる。例示的一実施形態において、ターゲッティング部分は、葉酸受容体、たとえば葉酸受容体アルファ、葉酸受容体ベータ及び／又は葉酸受容体デルタと特異性及び親和性をもって結合する部分であってもよい。葉酸受容体は、還元型葉酸キャリアとは別個の異なるものであり、細胞内部への異なる経路を利用する。例示的実施形態によれば、ターゲッティング部分は、リポソーム封入体がその所望の効果を発揮する標的細胞と特異的且つ優先的に結合し、及び／又はその内部に移行する。標的細胞は、たとえば、癌細胞、腫瘍細胞及び／又は転移細胞であってもよい。例示的一実施形態において、ターゲッティング部分を担持するリポソームは、標的細胞により内部移行させられる。

本開示の例示的実施形態のうちの任意のものにおいて、ターゲッティング部分は、抗体の抗原結合配列であるタンパク質であってもよい。例示的一実施形態において、タンパク質は、たとえば、少なくとも、抗体の抗原結合部位の三次元構造を有していてもよい。ターゲッティング部分としてのかかるタンパク質の一例は、抗体である。しかしながら、完全抗体は必要ではない。たとえば、例示的実施形態のうちの任意のもののターゲッティング部分であるタンパク質は、抗体由来の１つ又は複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含んでいてもよい。ターゲッティング部分として寄与する好適なタンパク質の例には、抗体、ヒト化抗体、抗体の抗原結合断片、単鎖抗体、単一ドメイン抗体、二重特異性抗体、合成抗体、ＰＥＧ化抗体、及び多量体抗体からなる群から選択される少なくとも１つが含まれる。抗体は、これらの特徴の組合せを有していてもよい。たとえば、ヒト化抗体は、抗原結合断片であっても、ＰＥＧ化されていても多量体化されていてもよい。葉酸受容体アルファに対する抗体は、市販されている。

利用できる例示的一抗体は、葉酸受容体アルファに対するマウス抗体である。配列は、米国特許第５６４６２５３号に記載されている。たとえば、開示の配列に基づいて、遺伝子が合成され、一過性発現ベクター内に配置され、抗体がＨＥＫ−２９３一過性発現系において産生された。抗体は、完全抗体、Ｆａｂ、又は考察される様々な抗体ヴァリエーションのうちの任意のものでありうる。

リポソームのそれぞれが、たとえば、３０個〜２５０個のターゲッティング部分、たとえば３０個〜２００個のターゲッティング部分を含んでいてもよい。代わりに、リポソームのそれぞれが、２２０個未満のターゲッティング部分、たとえば２００個未満の部分を含んでいてもよい。ターゲッティング部分は、たとえば共有結合により、リポソームの外部と付加されうる。リポソームの外部上の分子は、たとえば、少なくとも、脂質、立体安定剤、マレイミド、コレステロール等を含んでいてもよい。例示的一実施形態において、ターゲッティング部分は、マレイミド官能基を介して、リポソーム成分及び立体安定剤、たとえばＰＥＧ分子からなる群から選択される少なくとも１つに共有結合できる。すべてのターゲッティング部分が、一成分、たとえばＰＥＧに結合させることが可能である。ターゲッティング部分が、異なる成分に結合させることも可能である。たとえば、いくつかのターゲッティング部分は、脂質成分又はコレステロールに結合でき、いくつかのターゲッティング部分は、立体安定剤（たとえばＰＥＧ）に結合でき、また別のターゲッティング部分は、検出可能なマーカー又は別のターゲッティング部分に結合できる。

例示的一実施形態において、ターゲッティング部分は、少なくとも１つ又は複数の抗原に対する親和性及び特異性を有し、抗原は、葉酸受容体アルファ、葉酸受容体ベータ、及び葉酸受容体デルタからなる群から選択される。例示的一実施形態において、ターゲッティング部分は、葉酸受容体アルファ、葉酸受容体ベータ、及び葉酸受容体デルタからなる群から選択される少なくとも２つの抗原に対する特異的親和性（すなわち、親和性及び特異性）を有する。別の例示的一実施形態において、ターゲッティング部分は、たとえば、葉酸受容体アルファ、葉酸受容体ベータ、及び葉酸受容体デルタである３つの抗原に対する特異的親和性を有する。ターゲッティング部分は、抗原のエピトープに対する親和性及び特異性を有していてもよい。なぜなら、時に、ターゲッティング部分は完全抗原に結合せず、抗原における多くのエピトープのうちの一エピトープだけに結合するからである。例示的一実施形態において、ターゲッティング部分は、腫瘍細胞には存在するが、非腫瘍細胞では存在しないか又は接触不能である、腫瘍細胞表面抗原上のエピトープに対する特異的親和性を有する。たとえば、いくつかの状況において、腫瘍抗原は、正常細胞及び悪性癌細胞の両方の表面上にあってもよいが、腫瘍エピトープは、癌細胞においてのみ曝露されていてもよい。さらなる一例として、腫瘍抗原は、癌細胞特異的エピトープが存在するようになるよう、癌におけるコンホメーション変化を経てもよい。上述のエピトープに対する特異的親和性を有するターゲッティング部分は有用であり、例示的実施形態において想定されている。これらの実施形態において、癌細胞特異的エピトープを有する腫瘍細胞は、癌細胞であってもよい。かかる腫瘍細胞表面抗原の例には、少なくとも、葉酸受容体アルファ、葉酸受容体ベータ及び葉酸受容体デルタが含まれる。

例示的実施形態は、内部空間を含むリポソームを含む媒体、上記内部空間内に配置された水性生物活性抗葉酸剤、少なくとも１つの葉酸受容体に対する特異的親和性を有するタンパク質を含むターゲッティング部分を含み、上記ターゲッティング部分が、リポソームの外部に配置されている、リポソーム抗葉酸剤組成物に関する。例示的実施形態において、媒体は、水性溶液である。例示的一実施形態において、内部空間、外部空間（すなわち、媒体）、又は内部空間及び媒体の両方が、上に列挙した１つ又は複数の凍結保護剤又は抗凍結剤を含有する。例示的一実施形態において、抗凍結剤マンニトール、トレハロース、ソルビトール、及びスクロースが好ましい。

上で考察したとおり、例示的実施形態のリポソームは、循環中でのそれらの寿命を増加させうる立体安定剤を含んでいてもよい。基本的な着想は、１つ又は複数の立体安定剤、たとえば親水性ポリマー（ポリエチレングリコール（ＰＥＧ））、糖脂質（モノシアロガングリオシド（ＧＭ１））等が、リポソーム表面と直接隣接する空間を占め、この空間から他の高分子を排除するというものである。結果として、リポソーム表面に対する血漿オプソニンの接近及び結合が妨げられ、その結果、かかるリポソームとのマクロファージの相互作用、又は任意の他の除去機構が阻害され、循環中でのリポソームの寿命が高められる。

立体安定剤を組み込む例示的実施形態のうちの任意のものについて、立体安定剤は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）、モノシアロガングリオシド（ＧＭ１）、ポリ（ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）、ポリ（アクリルアミド）（ＰＡＡ）、ポリ（２−メチル−２−オキサゾリン）、ポリ（２−エチル−２−オキサゾリン）、ホスファチジルポリグリセロール、ポリ［Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド］、両親媒性ポリ−Ｎ−ビニルピロリドン、Ｌ−アミノ酸ベースポリマー、及びポリビニルアルコールからなる群からの少なくとも１つであってもよい。例示的実施形態において、立体安定剤又は立体安定剤の集団は、ＰＥＧである。例示的一実施形態において、立体安定剤は、２００〜５０００ダルトンの数平均分子量（Ｍｎ）を有するＰＥＧである。これらのＰＥＧは、任意の構造、たとえば直鎖状、分枝状、星状又はくし状構造のものでありえ、市販されている。

例示的実施形態によれば、リポソーム組成物は、例示的実施形態の例示的リポソーム組成物及び担体、たとえば薬学的に許容される担体を含有する医薬組成物として提供できる。薬学的に許容される担体の例は、生理食塩水、等張デキストロース、等張スクロース、リンガー溶液、及びハンクス溶液である。貯蔵安定性に最適なｐＨを提供するために、緩衝物質を添加できる。たとえば、約６．０〜約７．５の間のｐＨ、より好ましくは約６．５のｐＨが、リポソーム膜脂質の安定性のために最適であり、封入物の優れた保持を提供する。典型的には２〜２０ｍＭの濃度の、ヒスチジン、ヒドロキシエチルピペラジン−エチルスルホネート（ＨＥＰＥＳ）、モルホリポエチルスルホネート（ｍｏｒｐｈｏｌｉｐｏｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎａｔｅ）（ＭＥＳ）、コハク酸塩、酒石酸塩、及びクエン酸塩が、例示的緩衝物質である。他の好適な担体には、たとえば、水、緩衝水性溶液、０．４％ＮａＣｌ、０．３％グリシン等が含まれる。タンパク質、炭水化物、又は高分子安定剤及び等張化剤、たとえば、ゼラチン、アルブミン、デキストラン、又はポリビニルピロリドンを添加できる。組成物の張度は、グルコース又はより不活性な化合物、たとえばラクトース、スクロース、マンニトール、又はデキストリンを用いて、０．２５〜０．３５ｍｏｌ／ｋｇの生理的レベルに調整できる。これらの組成物は、従来のよく知られている滅菌手法、たとえば濾過により滅菌できる。得られた水性溶液を、無菌条件下で使用のためにパッケージ又は濾過し、凍結乾燥でき、凍結乾燥調製物は、投与前に滅菌水性媒体と組み合わせられる。

医薬リポソーム組成物はまた、生理条件に近づけるために必要とされる薬学的に許容される補助物質、たとえばｐＨ調整剤及び緩衝剤、等張化剤等、たとえば酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム等を含有しうる。加えて、リポソーム懸濁液は、貯蔵中にフリーラジカル及び脂質過酸化ダメージに対して脂質を保護する脂質保護剤を含んでいてもよい。親油性フリーラジカル失活剤、たとえばアルファ−トコフェロール及び水溶性鉄特異的キレート剤、たとえばフェリオキサミンが好適である。

液体医薬配合物中の例示的実施形態のリポソームの濃度は、広範に、すなわち、通常は約０．０５質量％未満、又は少なくとも約２〜１０質量％から、３０又は５０質量％まで変化しうるのであり、選択された特定の投与方法に従って、主に流体体積、粘度等により選択されると考えられる。たとえば、濃度は、治療と関連づけられる流体負荷を低下させるよう増加させられうる。これは、アテローム性動脈硬化症関連鬱血性心不全又は重篤な高血圧を有する患者において特に所望されてもよい。代わりに、刺激性脂質から構成されるリポソーム医薬組成物を、炎症を抑えるよう投与の現場で低濃度に希釈できる。

例示的実施形態は、生物活性剤、たとえば抗葉酸剤を、葉酸受容体を表面上に発現する腫瘍に送達する方法に関する。例示的一方法は、本開示のリポソームを含む組成物のうちの任意のもののうちの少なくとも１つを、治療有効用量の生物活性抗葉酸剤を腫瘍に送達する量で投与するステップを含む。

投与されるリポソーム医薬組成物の量は、リポソーム内に封入された特定の治療物質、治療される疾患状態、使用されるリポソームのタイプ、及び臨床医の判断に依存すると考えられる。一般に、投与されるリポソーム医薬組成物の量は、治療有効用量の特定の治療物質を送達するのに十分であると考えられる。

治療有効用量を送達するのに必要なリポソーム医薬組成物の量は、薬物試験の分野において一般的なインビトロ及びインビボの常法により決定できる。たとえば、Ｄ．Ｂ．Ｂｕｄｍａｎ、Ａ．Ｈ．Ｃａｌｖｅｒｔ、Ｅ．Ｋ．Ｒｏｗｉｎｓｋｙ（編）．Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、ＬＷＷ、２００３年を参照のこと。様々な治療物質のための治療有効用量は、当業者によく知られている。そして、例示的実施形態によれば、医薬リポソーム組成物を介して送達された治療物質は、同じ量の治療物質をその常法の非リポソーム配合物において投与することにより得られる活性と、少なくとも同じか、又はそれよりも高い活性を提供する。典型的には、例示的実施形態のリポソーム医薬組成物のための用量は、たとえば、体重１キログラム当たり約０．００５〜約５００ｍｇの間、最も多くの場合、体重１ｋｇ当たり約０．１〜約１００ｍｇの間の範囲の治療物質であってもよい。

有効量とは、医学的に所望される結果を提供するのに十分な試剤の用量である。有効量は、所望される結果、治療又は予防される特定の症状、治療される対象の年齢及び健康状態、症状の重症度、治療の持続期間、併用又は複合療法（利用される場合）の性質、具体的な投与経路、並びに保健従事者の知識及び専門的意見の範囲内の同様の要因とともに変化すると考えられる。最大限の用量、すなわち、妥当な医学的判断による最高の安全用量が使用されることが一般に好ましい。

たとえば、対象が腫瘍を有する場合、有効量は、腫瘍体積又は腫瘍量（たとえば、腫瘍のイメージングにより決定される）を低減する量であってもよい。有効量はまた、血中又は他の体液若しくは組織（たとえば、生検）中の癌細胞の存在及び／又は頻度により評価されてもよい。腫瘍が組織又は器官の正常な機能に影響を与える場合、有効量は、組織又は器官の正常な機能を測定することにより評価できる。いくつかの例において、有効量は、１つ又は複数、好ましくはすべての症状を抑えるか、又は除去するのに必要な量である。

例示的実施形態は、医薬組成物を提供する。医薬組成物は、サンプルリポソーム及び好ましくは抗葉酸剤を、好ましくは薬学的に許容される担体中に含む滅菌組成物である。

「薬学的に許容される担体」という用語は、たとえば、例示的実施形態により考慮されるヒト又は他の対象への投与に好適な、１つ又は複数の適合性固体又は液体フィラー、希釈剤又はカプセル化物質を指していてもよい。

「担体」という用語は、天然又は合成の有機又は無機成分を意味し、投与を容易にするためにリポソーム組成物がこれと組み合わされる。医薬組成物の成分は、それらの所望の薬学的効率を実質的に損なうと考えられる相互作用を排除する形で混合される。好適な緩衝剤は、酢酸及び塩（１〜２％ Ｗ／Ｖ）、クエン酸及び塩（１〜３％ Ｗ／Ｖ）、ホウ酸及び塩（０．５〜２．５％ Ｗ／Ｖ）、並びにリン酸及び塩（０．８〜２％ Ｗ／Ｖ）を含む。好適な保存剤は、塩化ベンザルコニウム（０．００３〜０．０３％ Ｗ／Ｖ）、クロロブタノール（０．３〜０．９％ Ｗ／Ｖ）、及びパラベン（０．０１〜０．２５％ Ｗ／Ｖ）を含む。

本明細書において特段の記載のない限り、様々な投与経路が利用可能である。選択される特定の方法は、選択される特定の活性剤、治療される特定の症状及び治療有効性に必要な用量に、もちろん依存する。提供される方法は、一般的に言えば、医学的に許容できる任意の投与方法を使用して実施でき、これは、有効レベルの所望の反応を、臨床的に許容できない有害作用を引き起こすことなしにもたらす、任意の方法を意味する。可能な投与経路には、注射、非経口的経路、たとえば、筋内、皮下、静脈内、動脈内、腹腔内、関節内、硬膜外内（ｉｎｔｒａｅｐｉｄｕｒａｌ）、髄腔内、静脈内、筋内、胸骨内（ｉｎｔｒａ ｓｔｅｒｎａｌ）注射若しくは注入等、及び経口、経鼻、粘膜、舌下、気管内、眼、直腸、膣、眼球、局所、経皮、肺吸入によるものが含まれる。

例示的一実施形態において、リポソーム医薬組成物は、たとえば、注入組成物、注射組成物、非経口組成物、又は局所用組成物として、液体溶液又は懸濁液のいずれかとして調製できる。しかしながら、注射前の液体ビヒクル中の溶液又は懸濁液に好適な固体形態もまた調製できる。組成物はまた、たとえば、当技術分野において知られている方法により、腸溶性コーティング錠剤又はゲルカプセル内に配合できる。

例示的実施形態により配合されたリポソーム薬物を、中枢神経系の腫瘍に送達するために、腫瘍内への直接的なリポソームの緩徐で持続的な頭蓋内注入（対流強化送達法（ｃｏｎｖｅｃｔｉｏｎ−ｅｎｈａｎｃｅｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ）、又はＣＥＤ）が特に有利でありうる。Ｓａｉｔｏら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、ｖｏｌ．６４、２５７２〜２５７９頁、２００４年；Ｍａｍｏｔら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏ−Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、ｖｏｌ．６８、１〜９頁、２００４年を参照のこと。組成物はまた、たとえば、組織表面に直接適用されてもよい。徐放、ｐＨ依存性放出、又は他の特定の化学又は環境条件媒介性放出投与もまた、たとえば蓄積注射又は侵食性インプラント（ｅｒｏｄｉｂｌｅ ｉｍｐｌａｎｔｓ）等の手段により、例示的実施形態に特に含まれる。少数の具体例が、例示のために下に列挙される。

経口投与について、化合物は、たとえば、リポソーム組成物を、当技術分野においてよく知られている薬学的に許容される担体と組み合わせることにより容易に配合できる。かかる担体は、治療される対象による経口摂取のための、錠剤、丸薬、糖衣錠、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、フィルム、懸濁液等としての配合を可能にする。好適な賦形剤には、たとえば、フィラー、たとえば糖、たとえばラクトース、スクロース、マンニトール、若しくはソルビトール、セルロース調製物、たとえばトウモロコシデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、及び／又はポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）が含まれていてもよい。任意選択で、経口配合物はまた、内部酸性条件を中和するために生理食塩水又は緩衝液中に配合でき、又は担体なしに投与できる。

経口的に使用できる医薬調製物には、ゼラチンでできた押込み型カプセルが、ゼラチン及び可塑剤、たとえばグリセロール又はソルビトールでできた柔軟で密封されたカプセルとともに含まれる。押込み型カプセルは、好適な液体、たとえば水性溶液、緩衝液、脂肪油、流動パラフィン、又は液体ポリエチレングリコール中に懸濁されたリポソーム組成物を含有しうる。加えて、安定剤を添加できる。経口投与のためのすべての配合物が、かかる投与に好適な用量であるべきである。

頬側投与のため、組成物は、従来の形で配合された錠剤又はトローチ剤の形態をとっていてもよい。

吸入による投与のため、組成物は、加圧パック又はネブライザーからのエアロゾルスプレー噴射の形態で、好適な噴霧剤、たとえばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、イクロロテトラフルオロエタン（ｉｃｈｌｏｒｏｔｅｔｒａｆｌｕｏｒｏｅｔｈａｎｅ）、二酸化炭素又は他の好適な気体を用いて、簡便に送達されてもよい。加圧エアロゾルの場合には、用量単位は、一定量を送達するためのバルブを提供することにより決定できる。

組成物を全身に送達することが所望されるときには、それらを注射、たとえばボーラス注入又は持続注入による非経口投与のために配合できる。注射のための配合物は、単位用量形態、たとえばアンプル又は複数回用量容器で提示できる。医薬非経口配合物は、成分の水性溶液を含む。水性注射懸濁液は、懸濁液の粘度を増加させる物質、たとえばカルボキシルメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、又はデキストランを含有しうる。代わりに、リポソームの懸濁液は、油ベースの懸濁液として調製できる。好適な親油性溶媒又はビヒクルには、脂肪油、たとえばゴマ油、又は合成脂肪酸エステル、たとえばオレイン酸エチル若しくはトリグリセリドが含まれる。

代わりに、リポソーム組成物は、好適なビヒクル、たとえば滅菌発熱物質除去水での使用前の構成のための粉末形態又は凍結乾燥形態であってもよい。

組成物はまた、直腸又は膣用組成物、たとえば坐剤又は停留浣腸中に、たとえば従来の坐剤基材、たとえばココアバター又は他のグリセリドを含有して、配合されてもよい。

例示的実施形態は、例示的実施形態の組成物及びリポソームを使用した、癌、たとえば固形腫瘍癌を有するか、又はその発症のリスクがある対象への試剤の投与を考慮する。例示的一実施形態において、癌は、たとえば、その細胞表面上の葉酸受容体の発現により識別できる。葉酸受容体には、たとえば、葉酸受容体アルファ、葉酸受容体ベータ又は葉酸受容体デルタが含まれてもよい。例示的実施形態は、組成物が、より高い質の生物活性剤を、単独で又は組み合わせて、これらの対象に、正常細胞（すなわち、葉酸受容体を発現しない細胞）への過剰な送達なしに、送達可能なことを考慮する。

葉酸受容体を発現する任意の癌を治療できる。一部の癌は葉酸受容体を初期に発現しうる一方で、癌の大部分が葉酸受容体を末期に発現しうることに留意すべきである。癌は、癌腫、肉腫又は黒色腫であってもよい。癌腫には、基底細胞癌（ｂａｓａｌ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、胆道癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、絨毛癌、ＣＮＳ癌、結腸及び直腸癌（ｃｏｌｏｎ ａｎｄ ｒｅｃｔｕｍ ｃａｎｃｅｒ）、腎臓又は腎細胞癌、喉頭癌、肝臓癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ、腺癌、巨（燕麦）細胞癌、及び扁平上皮癌（ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）を含む）、口腔癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、皮膚癌（基底細胞癌（ｂａｓａｌ ｃｅｌｌ ｃａｎｃｅｒ）及び扁平上皮癌（ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃｅｌｌ ｃａｎｃｅｒ）を含む）、胃癌、精巣癌、甲状腺癌、子宮癌、直腸癌（ｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ）、呼吸器系の癌、及び泌尿器系の癌が含まれるが、これらに限定されない。

肉腫は、骨（骨肉腫）及び軟部組織（線維肉腫）に生じる間葉性新生物である。肉腫には、脂肪肉腫（粘液性脂肪肉腫及び多形性脂肪肉腫を含む）、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、悪性末梢神経鞘腫瘍（悪性シュワン腫、神経線維肉腫、又は神経原性肉腫とも呼ばれる）、ユーイング腫瘍（骨のユーイング腫瘍、骨外性（すなわち、骨ではない）ユーイング肉腫、及び原始神経外胚葉性腫瘍を含む）、滑膜肉腫、管肉腫、血管肉腫、リンパ管肉腫、カポジ肉腫、血管内皮腫、類腱腫（侵襲性線維腫症とも呼ばれる）、隆起性皮膚線維肉腫（ＤＦＳＰ）、悪性線維性組織球腫（ＭＦＨ）、血管周囲細胞腫、悪性間葉腫、胞巣状軟部肉腫、類上皮肉腫、明細胞肉腫、線維形成性小細胞腫瘍、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、及び軟骨肉腫が含まれるが、これらに限定されない。

黒色腫は、皮膚及び他の器官のメラニン細胞系から生じる腫瘍である。メラノーマの例には、悪性黒子型黒色腫、表在拡大型黒色腫、結節型黒色腫、及び末端黒子型黒色腫が含まれるが、これらに限定されない。

癌は、固形腫瘍リンパ腫であってもよい。例には、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、及びＢ細胞リンパ腫が含まれる。

癌は、骨癌、脳癌、乳癌、結腸直腸癌、結合組織癌、消化器系の癌、子宮体癌、食道癌、眼癌、頭頚部の癌、胃癌、上皮内新生物、黒色腫、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、非小細胞肺癌、前立腺癌、網膜芽細胞腫、又は横紋筋肉腫であってもよいが、これらに限定されない。

例示的実施形態は、本明細書において考慮される試剤の送達から利益を得る可能性が高い任意の対象において実施できる。ヒト対象が、例示的実施形態において好ましい対象であるが、対象はまた、動物、たとえば家庭用ペット（たとえば、イヌ、ネコ、ウサギ、フェレット等）、家畜又は農場用動物（たとえば、ウシ、ブタ、ヒツジ、ニワトリ及び他の家禽）、ウマ、たとえばサラブレッド馬、実験動物（たとえば、マウス、ラット、ウサギ等）、哺乳動物等を含んでいてもよい。対象はまた、魚及び他の水生種を含む。

試剤が送達される対象は、正常対象であってもよい。代わりに、それらは、診断されうるか、又は１つ又は複数の特定の試剤の送達から利益を得られる症状を有していてもよいか、又はそれを発症するリスクがあってもよい。例示的一実施形態において、かかる症状は、癌（たとえば、固形腫瘍癌又は非固形癌、たとえば白血病）を含む。より好ましい一実施形態において、これらの症状は、細胞表面上に葉酸受容体を発現する細胞を伴う癌を含む。

例示的実施形態が包含する症状を診断するための試験は、当技術分野において知られており、通常の医師によく知られていると考えられる。細胞タイプが葉酸受容体を発現するかどうかは、市販の抗体を使用して決定できる。これらの実験室試験には、顕微分析、培養依存性試験（たとえば、培養物）、及び核酸検出試験が含まれるが、これらに限定されない。これらは、湿式マウント、染色増強顕微鏡法、免疫顕微鏡法（たとえば、ＦＩＳＨ）、ハイブリダイゼーション顕微鏡法、粒子凝集、酵素結合免疫吸着アッセイ、尿スクリーニング試験、ＤＮＡプローブハイブリダイゼーション、血清試験等を含む。医師はまた、一般に、上に列挙した実験室試験を行うことに加えて、病歴を十分調査し、完全な身体検査を行うと考えられる。

癌を有する対象は、たとえば、検出可能な癌細胞を有する対象であってもよい。癌を発症するリスクのある対象は、たとえば、癌を発症する確率が通常よりも高い対象であってもよい。これらの対象には、たとえば、癌を発症する高い可能性と関連づけられることが実証されている遺伝的異常を有する対象、癌に対する家系的素因を有する対象、癌を引き起こす物質（すなわち、発癌物質）、たとえばタバコ、アスベスト、又は他の化学的毒素に曝露された対象、並びに以前に癌の治療を受け、寛解状態にあると見られる対象が含まれる。

例示的一実施形態において、この方法は、リポソーム抗葉酸剤組成物を腫瘍に対して、葉酸受容体を発現しない細胞よりも高い割合、たとえば少なくとも２倍多く、選択的に送達できる。

例示的実施形態は、本開示の組成物のうちの任意のものを製造する方法に関する。例示的一実施形態において、この方法は、（１）リポソーム成分、（２）水性溶液中の生物活性抗葉酸剤、及び（３）ターゲッティング部分を含む混合物を形成することを伴う。次に、混合物は均質化して、上記水性溶液中でリポソームを形成してもよい。さらに、膜を通して混合物を押し出して、水性溶液中で生物活性抗葉酸剤を封入するリポソームを形成してもよい。リポソーム成分は、本開示の任意の脂質（コレステロールを含む）、たとえば官能化脂質並びにターゲッティング部分、検出可能な標識、及び立体安定剤、又はこれらのすべての任意のサブセットに付加された脂質を含むことが理解される。水性溶液中の生物活性抗葉酸剤が、たとえば緩衝液、塩、抗凍結剤等を含むリポソームの内部又は外部のための論じられた任意の試薬及び化学物質を含んでいてもよいことにさらに留意される。

この方法は、上記除去ステップ後に、組成物を凍結乾燥させ、凍結乾燥組成物を形成する任意選択のステップをさらに含んでいてもよい。上述のとおり、水性溶液中の生物活性抗葉酸剤は、本開示に列挙された任意の抗凍結剤であってもよい抗凍結剤を含んでいてもよい。組成物が凍結乾燥される場合、抗凍結剤が好ましくてもよい。

さらに、凍結乾燥ステップ後、この方法は、上記凍結乾燥ステップ後に、凍結乾燥組成物を溶媒中に溶解させることにより、上記凍結乾燥組成物を復元する任意選択のステップを含みうる。復元の方法はよく知られている。好ましい一溶媒は、水である。他の好ましい溶媒には、生理食塩水及び緩衝液が含まれる。

いくつかの例示的実施形態が論じられる一方で、リポソームは、当技術分野において知られているか、又は知られるようになると考えられる任意の方法により製造できることが理解されるべきである。たとえば、Ｇ．Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ（編）、Ｌｉｐｏｓｏｍｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第１巻〜第３巻、第１版、１９８３年；第２版、１９９３年、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、４５ Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ、Ｆｌａ．を参照のこと。リポソーム組成物を製造するのに好適な方法の例には、押出し、逆相蒸発、超音波処理、溶媒（たとえば、エタノール）注射、マイクロ流体処理、洗剤透析、エーテル注射、及び脱水／再水和が含まれる。リポソームのサイズは、低圧押出しのために使用される膜の細孔サイズを制御すること又はマイクロ流体処理において利用される圧力及び流路の数又は任意の他の好適な方法により制御できる。

一般に、生物活性抗葉酸剤は、内部、すなわち、リポソームの内側（内部）空間に含有される。例示的一実施形態において、置換アンモニウムは、リポソームを囲む外部媒体から部分的又は実質的に完全に除去される。かかる除去は、当業者に知られている任意の好適な手段、たとえば希釈、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、透析、限外濾過、沈降等により達成できる。したがって、任意選択の一ステップは、上記押出しステップ後に、水性溶液中の生物活性抗葉酸剤をリポソームの外部に除去するステップを含む。

別の例示的一実施形態は、内部空間を含むリポソーム、上記内部空間内に配置された生物活性剤、リポソームの外部に付加された立体安定剤分子、及び少なくとも１つの葉酸受容体に対する特異的親和性を有するタンパク質を含むターゲッティング部分を含み、上記ターゲッティング部分が、立体安定剤及びリポソームの外部のうちの少なくとも一方に付加されている、葉酸受容体を選択的に標的とする標的化リポソーム組成物に関する。

この例示的実施形態の成分は、本開示の他の実施形態について記載されたものと同じであってもよい。たとえば、生物活性剤、ＰＥＧであってもよい立体安定剤は、本開示の他の部分に記載のものである。

例示的実施形態において、例示的実施形態の生物活性剤は、エリプチシン、パクリタキセル又は本開示に列挙された任意の他の生物活性剤であってもよい。エリプチシン又はパクリタキセルと関連する試剤もまた想定される。これらには、少なくとも、タキサン、たとえばドセタキセル及びカバジタキセルが含まれる。

例示的実施形態は、組成物及び方法のインビトロ用途をさらに考慮する。インビトロでの使用は、たとえば、細胞培養及び組織工学等の使用であってもよく、細胞の亜集団の選択的処理が所望される。たとえば、正常患者又は癌に罹患した患者からの幹細胞の培養中、細胞を、考察されたとおり、細胞の癌性亜集団に対処するためにサンプル組成物又はサンプルリポソームで処理できる。癌性亜集団は、ドナーが元々癌を有するがゆえに、又は、細胞がインビトロ処置中に自然に形質転換するゆえに生じうる。

例示的実施形態によれば、リポソーム及びリポソーム組成物を、リポソームを有する容器、並びに任意選択で、物質及び説明書、たとえば１つ又は複数の用途にリポソーム組成物を使用することに関する手順又は情報を有する容器を含むキットとして提供できる。かかる説明書は、任意の媒体、たとえば紙のハードコピー、電子媒体、又は、説明書を含むデータベース若しくはウェブサイトへのアクセスを介して提供できる。

以下の例は、本発明を例示することが意図されているが、いかなる方式、形状、又は形態においても、それを明示的にであれ暗示的にであれ限定するものではない。これらは、使用されうるものの典型であるが、当業者に知られている他の手順、方法、又は手法を代わりに使用することもできる。

実施例セクションの手順を含む本開示の手順を使用して、例示的組成物及び例示的リポソーム、たとえばリポソーム抗葉酸剤組成物が構築される。例示的組成物は、例示的リポソームを含む。例示的組成物及び例示的リポソームの両方が、実施例セクションに記載の実験において、また本開示全体を通じて使用され、本開示の特定の実施形態は、本開示の範囲全体を定めることを意図していない。

実施例１：ペメトレキセド及びハプテンを含有する葉酸受容体アルファ標的化リポソームの製造
ペメトレキセドリポソームの製造
ペメトレキセド二ナトリウム七水和物（ＡＬＩＭＴＡ）は、高度に水溶性であり、中性ｐＨで１００ｍｇ／ｍｌの溶解性を有する。以下の手順により、ペメトレキセドをリポソーム内にカプセル化する。まず、リポソーム膜の脂質成分を量り分け、およそ６５℃の温度でエタノール中の濃縮溶液として組み合わせる。この実施例において、使用される脂質は、水添ダイズホスフィチジルコリン（ｈｙｄｒｏｇｅｎａｔｅｄ ｓｏｙ ｐｈｏｓｐｈｉｔｉｄｙｌ ｃｈｏｌｉｎｅ）、コレステロール、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−２０００（１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］）、ＰＥＧ−ＤＳＰＥ−マレイミド及びＰＥＧ−ＤＳＰＥ−ＦＩＴＣである。ＨＳＰＣ：コレステロール：ＰＥＧ−ＤＳＰＥのモル比は、およそ５５：４０：５である。次に、ペメトレキセドを、１００ｍｇ／ｍｌの濃度で水性緩衝液中に溶解する。薬物溶液を６５℃まで加熱する。エタノール脂質溶液を、小口径針を使用してペメトレキセド溶液へと注入する。このステップ中、電磁撹拌器を使用して薬物溶液をよく撹拌する。高温（６３℃〜７２℃）で混合を実施し、脂質が液晶状態（それらが脂質転移温度Ｔｍ＝５１℃〜５４℃未満の温度で達成するゲル状態の反対）であることを保証する。結果として、脂質は水和され、水性コア中にペメトレキセドを含有する多数の二重層（多重膜）ベシクル（ＭＬＶ）を形成する。

フィルター押出しを使用したＭＬＶのダウンサイズ
ＭＬＶを、積層（トラックエッチドポリカーボネート）膜を通過する３つのパスを使用した高圧押出しにより、所望のサイズの単層（単一の二重層）ベシクルへと断片化する。第１のパス中に使用された膜は、２００ｎｍの細孔サイズを有する。第２のパス中に使用された膜は、１００ｎｍの細孔サイズを有し、最終パスとして８０ｎｍの細孔サイズが続く。押出し中、温度は、脂質膜の可塑性を保証するためにＴｍを超えるよう維持される。押出しの結果として、サイズ及び層状性が大きく不均質なＭＬＶが、小さく均質（８０〜１００ｎｍ）な単層ベシクル（ＵＬＶ）に変化し、これらは、その内部に薬物を隔離する。後方散乱検出器（９０°）とともにＭａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ機器（Ｓｏｕｔｈｂｏｒｏｕｇｈ，ＭＡ）を、石英マイクロキュベットにおいて２５℃で流体力学的サイズ（直径）を測定するために使用した。サンプルを、解析前に配合物マトリクス中で５０倍に希釈した。

本発明者らの結果は、フィルター押出しを使用してダウンサイズされたリポソームが、８５ｎｍの平均粒径を、０．００７のＰＤＩ及び−４３．７のゼータ電位とともに有していたことを示す。フィルター押出しの代替として、高圧マイクロ流体処理もまた、リポソームをダウンサイズするために使用できる。本発明者らは、高圧フィルター押出し又はマイクロ流体処理等の方法を単独で又は組み合わせて使用して、４０ｎｍ以上、たとえば３０〜１５０ｎｍの間（データは示さず）又は３０ｎｍよりもさらに小さい、特に４０ｎｍ〜１２０ｎｍの間のサイズを有するリポソームを製造できた。

タンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）及び薬物配合
ペメトレキセドを含有するＵＬＶが製造された後、リポソームの余分なペメトレキセドを、好適な緩衝液に対する透析又はタンジェンシャルフロー透析濾過を使用して除去する。任意の緩衝液を使用できるが、本実施例においては、使用された緩衝液は、５ｍＭクエン酸ナトリウム、６０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ６．１だった。透析完了後、０．２２ミクロンフィルターを使用してフィルター滅菌する。

抗葉酸受容体アルファ抗体のチオール化
抗体をリポソームのＰＥＧ−ＤＳＰＥ−マレイミド部分にコンジュゲートするため、抗体をチオール化する必要がある。この実施例において、抗体のチオール化は、トラウト試薬（Ｔｈｅｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して達成される。抗体を、新たに調製した８．１のｐＨのリン酸緩衝生理食塩水中の１４ｍＭトラウト試薬及び５ｍＭＥＤＴＡに添加する。緩徐に撹拌しながらの６０分間のインキュベーション後に、チオール化抗体を、２００量の２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．０、６０ｍＭ ＮａＣｌに対する最低４時間の透析により、過量のトラウト試薬から分離する。

ペメトレキセドリポソームに対するチオール化抗体のコンジュゲーション
使用されるチオール化抗体の量は、リポソーム１個当たりの所望の抗体数に基づいて算出される。２倍の過量のチオール化抗体の各調製物を、透析濾過された滅菌リポソームに添加する。反応容器を窒素ガスで覆い、緩徐に撹拌しながら４℃の室温で一晩インキュベートする。水性１００ｍＭ Ｌ−システイン−ＨＣｌ原液を、反応混合物中１５ｍＭの最終濃度まで添加することにより未反応マレイミド基をブロッキングすることによって、コンジュゲーション反応を停止する。次に、遊離チオール化抗体を、サイズ排除クロマトグラフィーを使用することにより、抗体コンジュゲートリポソームから分離する。

実施例２：実験に使用される細胞株
実験に使用される細胞株は、ＡＴＣＣ （Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ，Ｕ．Ｓ．Ａ）等のソースから市販されている。細胞株、それらのＡＴＣＣ受託番号及び成長条件を下に列挙する。

Ｃａｌｕ−３（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−５５）、ＥＭＥＭ（Ｃａｔ．＃３０−２００３）、１０％ＨＩ ＦＢＳ、１％Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、１％Ｌ−グルタミン。
ＫＢ、ＥＭＥＭ（Ｃａｔ．＃３０−２００３）、１０％ＨＩ ＦＢＳ、１％Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、１％Ｌ−グルタミン。
ＣＣＤ８４１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１７９０）、ＥＭＥＭ（Ｃａｔ．＃３０−２００３）、１０％ＨＩ ＦＢＳ、１％Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、１％Ｌ−グルタミン。
Ｈｓ５７８Ｂｓｔ（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−１２５）、Ｈｙｂｒｉ−Ｃａｒｅ培地ｐＨ７．０（Ｃａｔ．＃４６−Ｘ）、３０ｎｇ／ｍｌマウスＥＧＦ、１０％ＨＩ ＦＢＳ、１％Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、１％Ｌ−グルタミン。
ＮＣＩ−Ｈ２０８７（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−５９２２）、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｃａｔ．＃３０−２００１）、５％ＨＩ ＦＢＳ、１％Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、１％Ｌ−グルタミン。
ＮＣＩ−Ｈ２４５２（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−５９４６）、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｃａｔ．＃３０−２００１）、１０％ＨＩ ＦＢＳ、１％Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、１％Ｌ−グルタミン。
ＯＶＣＡＲ−３（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−１６１）、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｃａｔ．＃３０−２００１）、２０％ＨＩ ＦＢＳ、１％Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、１％Ｌ−グルタミン。
ＳＫＢＲ３、ＭｃＣｏｙ ５Ａ培地、１０％ＨＩ ＦＢＳ、１％Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、１％Ｌ−グルタミン。
ＳＬ０００３（ＡＴＣＣ ＰＴＡ−６２３１）、Ｆ−１２Ｋ培地、１０％ＨＩ ＦＢＳ、１％Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、１％Ｌ−グルタミン。
Ａ５４９（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−１８５）、Ｆ−１２Ｋ培地、１０％ＨＩ ＦＢＳ、１％Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、１％Ｌ−グルタミン。

実施例３ 一サンプルコンストラクトの結合特異性の決定
細胞表面上の葉酸受容体アルファのレベルを、蛍光色素とコンジュゲートされたモノクローナル抗体を用いてフローサイトメトリーにより測定した。抗体処理前のライン（たとえば、図６、ライン６０２及び６０４を参照のこと）と比較した抗体の結合後の右側へのシフト（たとえば、図６、ライン６０６を参照のこと）は、フローサイトメトリーによる受容体の検出を示す。未処理細胞（たとえば、図６、ライン６０２及び６０４を参照のこと）に対してヒストグラム（たとえば、図６、ライン６０６）が右側にシフトするほど、細胞表面上の受容体のレベルは高くなる。プロットは、癌細胞上の高レベルの葉酸受容体アルファを示すが、正常細胞上ではほぼ検出不能なレベルである。

構築された例示的リポソーム組成物の一部である例示的リポソームは、葉酸受容体アルファ陽性の細胞の細胞表面と結合するが、葉酸受容体アルファ陰性の細胞とは結合しない。例示的リポソームは、葉酸受容体アルファに対する抗体を含有する。例示的リポソームが短期間（３０分間）葉酸受容体アルファ＋細胞とインキュベートされるとき、リポソームに組み込まれたＦＩＴＣのレベルをフローサイトメトリーにより測定することにより、細胞表面上の例示的リポソームを検出できる。ヒストグラムのピークのシフトは、例示的リポソームが細胞表面上に検出されることを示す。ピークが右側にシフトするほど、より多くの例示的リポソームが細胞上に検出される。

この実験において、本発明者らは、細胞に対する例示的リポソームの結合を、それらの親和性及び特異性を知るために決定した。簡潔に述べると、検出可能な標識を含む例示的リポソームを細胞と共インキュベートし、細胞をフローサイトメトリーにより解析した。以下のデータは、例示的リポソームが葉酸受容体アルファ陽性癌細胞と結合するが、葉酸受容体アルファ陰性の正常細胞とは結合しないことを示す。

図３は、細胞表面上の葉酸受容体アルファの測定を示す概略図である。

図６は、フローサイトメトリーによる測定で、高い表面レベルの葉酸受容体アルファを発現するＫＢ癌細胞株の代表的なヒストグラムである。図６において、符号６０２＝抗体なし、符号６０４＝アイソタイプコントロール、符号６０６＝抗葉酸受容体アルファＡＰＣである。

図７は、フローサイトメトリーによる測定で、高い表面レベルの葉酸受容体アルファを発現するＯＶＣＡＲ−３癌細胞株の代表的なヒストグラムである。図７において、符号７０２＝抗体なし、符号７０４＝抗葉酸受容体アルファＡＰＣである。

図８は、フローサイトメトリーによる測定で、高い表面レベルの葉酸受容体アルファを発現するＮＣＩＨ２４５２癌細胞株の代表的なヒストグラムである。図８において、符号８０２＝抗体なし、符号８０４＝アイソタイプコントロール、符号８０６＝抗葉酸受容体アルファＡＰＣである。

図９は、低表面レベルの葉酸受容体アルファを発現する、結腸上皮に由来する正常細胞株の代表的なヒストグラムである。図９において、符号９０２＝抗体なし、符号９０４＝アイソタイプコントロール、９０６＝抗葉酸受容体アルファＡＰＣである。

図２は、細胞表面と結合する例示的リポソームを示す概略図である。

図１０は、ＳＬ０００３（肺）細胞株の代表的ヒストグラムである。この肺癌細胞株は、高レベルの例示的リポソームと結合する。符号１００２＝未処理細胞。符号１００４＝例示的リポソーム処理細胞。

図１１は、ＣＣＤ８４１（正常結腸）細胞株の代表的ヒストグラムである。葉酸受容体アルファ陰性細胞株は、ほとんど例示的リポソームと結合しない。符号１１０２＝未処理細胞。符号１１０４＝例示的リポソーム処理細胞。

図１２は、肺（ＳＬ０００３）及び卵巣（ＯＶＣＡＲ−３）細胞に由来する複合データを示し、結腸（ＣＣＤ８４１）及び乳腺（Ｈｓ５７８）に由来する正常細胞と比較した、細胞表面上での高レベルの例示的リポソーム結合を実証する、Ｐ＜０．０５。３７℃でのインキュベーション３０分又は４時間で検出された例示的リポソームの表面レベルが示されている。

これらの実験において、アッセイは、以下のとおり実施された。
細胞を回収し、ＰＢＳ中の０．２％ウシ血清アルブミン（ＦＡＣＳ緩衝液）中で洗浄した。細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液中１００μｌ量で再懸濁した。５μｌのＡＰＣとコンジュゲートされた抗葉酸受容体アルファモノクローナルを添加した（ｃａｔ＃ ＦＡＢ５６４６Ａ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）。細胞を３０分間、暗所で、４℃でインキュベートした。１００μｌのＦＡＣＳ緩衝液を添加して細胞を洗浄し、次に、細胞表面上の例示的リポソームを測定するため、細胞をフローサイトメトリーにより評価した（ＦＬ４）。細胞を回収し、計数し、ＰＢＳ中の０．２％ウシ血清アルブミン（ＦＡＣＳ緩衝液）中で洗浄した。２０，０００個の細胞をＦＡＣＳ緩衝液中１００μｌ量で再懸濁した。２μｌの例示的リポソームを細胞に添加した。細胞を３７℃で３０分間インキュベートし、ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、フローサイトメトリーにより評価した。

実施例４ サンプル組成物及びサンプルリポソーム上でのＲｈｏｄｏＲｅｄ実験
図４は、細胞内のサンプルリポソームを示す概略図である。サンプルリポソームは、低下したｐＨの存在下、たとえば細胞のリソソームで蛍光を発するｐＨ−ＲｈｏｄｏＲｅｄで標識化された。内部移行は、未処理細胞に対するピークの右側へのシフトとして見られる。

図１３は、例示的リポソームのＲｈｏｄｏＲｅｄ標識化細胞が、卵巣癌細胞により内部移行することを示す。これは、ピーク１５０４（例示的組成物／例示的リポソームで処理された細胞）が、未処理ピーク１５０２の右側にシフトしているので、明らかである。同様に、図１４において、本発明者らは、未処理ピーク１５０２に対して、処理ピークが、例示的リポソームの量を漸増させるにつれて、それぞれ１０μｌ、２０μｌ、３０μｌ、４０μｌ、及び５０μｌを指す（図１７を参照のこと）ピーク１５０４、１５０６、１５０８、１５１０及び１５１２に見出されるとおり、右にシフトし始めることを見出す。同じデータを、図１７に棒グラフでプロットする。図１７において、抗葉酸受容体ａ（ＦＯＬＲ１）を欠くコントロールｐＨ−ＲｈｏｄｏＲｅｄ標識化リポソームを、比較のために評価した。抗ＦＯＬＲ１を欠くリポソームは、ＫＢ細胞により内部移行しなかった。対照的に、ｐＨ−ＲｈｏｄｏＲｅｄ標識化サンプルリポソームは、ＫＢ細胞により内部移行した。図１７のこのデータは、示すとおり、３７℃での１８時間のインキュベーションの結果であり、図１４において用量反応もまた定量される。葉酸受容体アルファ陰性正常細胞株（乳腺細胞、左パネル及び結腸、右パネル）は、ｐＨ−ＲｈｏｄｏＲｅｄ標識化サンプルリポソームを内部移行させなかった。図１５は、内部移行が正常乳腺細胞において最小限であることを示す。ピーク１７０４は、ピーク１７０２に対してほんのわずかしかシフトしない。図１６は、内部移行が正常結腸細胞において最小限であることを示す。なぜなら、ピーク１８０２及び１８０４は実質的にシフトしなかったからである。

内部移行をさらに評価するため、ＳＬ０００３肺癌細胞をＭＡＰキナーゼ活性化レベルについてＰｈｏｓＦｌｏｗにより評価した。キナーゼを活性化させる、細胞内のサンプルリポソームを示す概略図を図５に示す。図１８Ａ及び図１８Ｂは、処理後３０分でのｐ３８のリン酸化の基底レベルの低減に対するペメトレキセドの効果を示す。図１８Ａは、５２．５％リン酸化ｐ３８を有する未処理細胞を示す。図１８Ｂにおいて、細胞を、例示的リポソームを含む例示的組成物で処理したとき、このパーセンテージは８．９５％まで低減する。図１９は、処理後３０分での癌細胞及び正常細胞におけるｐ３８のリン酸化レベルの定量を示す。「標的化リポソーム」と標示されるサンプル組成物及びサンプルリポソームは、ＳＬ０００３肺癌細胞におけるｐ３８活性化に影響を及ぼす。

本発明者らは、データを以下のとおり解釈する。すなわち、サンプルリポソームは、ＦＯＬＲ１陽性の細胞内に移行する。サンプルリポソームを、細胞内に移行する場合にはフローサイトメトリーでしか検出できない色素（ＲｈｏｄｏＲｅｄ）で標識化した。様々な細胞を、異なる量のＲｈｏｄｏＲｅｄ標識化サンプルリポソームとインキュベートし、蛍光のレベルをフローサイトメトリーにより測定した（ＦＬ２）。ＲｈｏｄｏＲｅｄ標識化サンプルリポソームは、ＦＯＬＲ１を発現する癌細胞内に移行するが、ＦＯＬＲ１陰性の正常細胞内には移行しない。右側にシフトしたピークを有する卵巣癌細胞が示されており、これは薬物が細胞内に移行したことを示す（図１３）。同じ実験が、ＦＯＬＲ１高ＫＢ細胞で、漸増量のＲｈｏｄｏＲｅｄ標識化サンプルリポソームとともになされた（図１４）。これらのデータは図１７で定量される。サンプルリポソームは、高濃度で処置されたときにはＫＢ細胞内に移行したが、抗ＦＯＬＲ１抗体を欠いたコントロールリポソームは、細胞内に移行できなかった。

細胞内に移行するサンプルリポソームの第２の尺度は、細胞内活性化経路である。細胞は、キナーゼ、この場合にはｐ３８を活性化させることにより、それらの受容体と結合するリガンドに反応する。活性化キナーゼは、フローサイトメトリーにより測定できる。細胞を、サンプルリポソームと３０分間インキュベートし、次に、弱い洗剤で溶解させる。活性化ｐ３８キナーゼを、フローサイトメトリーにより抗体で検出する。赤線ゲートの下のシフトは、より高いレベルのリン酸化ｐ３８を示す（図１８Ａ及び図１８ＢＧを参照のこと）。癌細胞は、より高い基底レベルの活性化キナーゼを有していてもよい。この場合、ペメトレキセドは、サンプルリポソームと同様にｐ３８活性化を低減し、サンプルリポソームの内部のペメトレキセドが活性であることを実証する（図１９）。

実験条件は以下のとおりである：
図４、図１３、図１４、図１５、図１６及び図１７について、ＲｈｏｄｏＲｅｄ標識化サンプルリポソームの取込みを測定する。細胞（ＯｖＣＡＲ−３、ＫＢ、正常結腸及び正常乳腺）を、実験前の夜に細胞７，０００個／ウェルでプレートした。翌日、細胞を以下の１）薬物なし、２）ＲｈｏｄｏＲｅｄ標識化抗ＦＯＬＲ１モノクローナル抗体（ＭＡＢＦＲＡＨ Ｈ／Ｌ）Ａｂ−（１μｌ）、３）サンプルリポソーム（リポソームＦＯＬＲ１Ａｂコンジュゲート−（５μｌ）、４）非標的化ｐＨ Ｒｈｏｄｏｒｅｄリポソーム−（５μｌ）／抗ＦＯＬＲ１なしのリポソームで処理した。細胞を３７℃で、１８時間及び２４時間インキュベートした。１００μｌの氷冷ＦＡＣＳ緩衝液を添加し、細胞をフローサイトメトリーにより評価した（ＦＬ２）。

加えて、図１７について、ｐ３８リン酸化を測定し（ＰｈｏｓＦｌｏｗ）、ＳＬ０００３、正常結腸細胞、及び正常乳腺細胞を細胞１０，０００個／ウェルで播種した。細胞を、新鮮なペメトレキセド（５０μＭ、１０μＭ）、ＬＥＡＦ−００１（リポソーム０７０７１５ ＭＰＦ、５ｔｒａｕｔ／５０Ｍａｂ、１５ｔｒａｕｔ／５０Ｍａｂ、４５ｔｒａｕｔ／５０Ｍａｂ）（１３．３３×希釈）、抗葉酸受容体アルファ（ＭＡＢＦＲＡ Ｈ／Ｌ １．０１ｍｇ／ｍｌ）（１３．３３×希釈）で処理し、サンプルリポソームにおける抗体の効果を決定するか、又は処理しなかった。細胞を穏やかに混合し、すばやくインキュベーター内に置いた。各時点（３０分〜４時間）で、プレートをインキュベーターから除去し、すぐにホルムアルデヒドで固定し、２％の最終濃度とした。プレートを５分間、室温でインキュベートした。２５μｌの培地を除去した。２５μｌのＦＡＣＳ緩衝液を添加した。１００μｌの細胞溶解緩衝液（ＦＡＣＳ緩衝液、０．２％ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、０．３％ホルムアルデヒド）を添加した。細胞を１．５ｍｌ遠心管内に回収し、３分間ボルテックスに供し、細胞を溶解させた。ＰＥコンジュゲート抗Ｐ３８（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）抗体又はＰＥコンジュゲートアイソタイプコントロールを添加し、細胞を３０分間、暗所で、４℃でインキュベートした。２００μｌのＦＡＣＳ緩衝液を添加して洗浄した。管をスピンに供し、上清を注意深く除去した。細胞をフローサイトメーター上で読み取った（ＦＬ２における）。

実施例５ ＭＴＳアッセイ
ＭＴＳ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム）アッセイは、細胞代謝活性を評価するためのよく知られている比色アッセイである。細胞株がアッセイのために使用され、それらの成長条件は以下のとおりである：
（ａ）Ｃａｌｕ−３：ＥＭＥＭ、１０％ＨＩ ＦＢＳ、１％Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、１×Ｌ−グルタミン、
（ｂ）ＫＢ：ＥＭＥＭ、１０％ＨＩ ＦＢＳ、１％Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、１×Ｌ−グルタミン、
（ｃ）ＮＣＩ−Ｈ２０８７：ＲＰＭＩ、５％ＨＩ ＦＢＳ、１％Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、１×Ｌ−グルタミン、
（ｄ）ＮＣＩ−Ｈ２４５２：ＲＰＭＩ、１０％ＨＩ ＦＢＳ、１％Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、１×Ｌ−グルタミン、
（ｅ）ＳＫＢＲ３：ＭｃＣｏｙ’ｓ、１０％ＨＩ ＦＢＳ、１％Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、１×Ｌ−グルタミン、
（ｆ）ＣＨＯ：ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ＣＨＯ、５％ＨＩ ＦＢＳ、１％Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、１×Ｌ−グルタミン、
（ｇ）Ａ５４９：Ｆ−１２Ｋ、１０％ＨＩ ＦＢＳ、１％Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、１×Ｌ−グルタミン、及び
（ｈ）ＳＬ０００３：Ｆ−１２Ｋ、１０％ＨＩ ＦＢＳ、１％Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、１×Ｌ−グルタミン。

前夜に、各細胞株について必要な細胞の量に従い、９６ウェル組織培養プレート中に細胞を播種する。各ウェル中の最終体積は１００μＬである（参考の細胞株の表を参照のこと。すべての細胞株がＡＴＣＣから得られる）。使用される細胞株及びアッセイ条件は、以下のとおりである：
（１）Ｃａｌｕ−３：１ウェル当たり細胞１００００個。原液は３．１×１０^５／ｍｌ：３．５５ｍＬの細胞を７．４５ｍＬの完全培地に希釈した。１００μｌを各ウェルに移す（μｌはマイクロリットルを指す）。
（２）ＫＢ：１ウェル当たり細胞３０００個。原液は２．０×１０^５／ｍｌ：１．６５ｍＬの細胞を９．３５ｍＬの完全培地に希釈した。１００μｌを各ウェルに移す。
（３）ＮＣＩ−Ｈ２０８７：１ウェル当たり細胞３０００個。原液は３．７×１０^５／ｍｌ：８９２μｌの細胞を１０．１ｍＬの完全培地に希釈した。１００μｌを各ウェルに移す。
（４）ＮＣＩ−Ｈ２４５２：１ウェル当たり細胞５０００個。原液は５．０×１０^４／ｍｌ：希釈の必要なし。
（５）ＳＫＢＲ３：１ウェル当たり細胞４０００個。原液は５．５×１０^５／ｍｌ：８００μｌの細胞を１０．２ｍＬの完全培地に希釈した。１００μｌを各ウェルに移す。
（６）ＣＨＯ：１ウェル当たり細胞３０００個。原液は３．６×１０^５／ｍｌ：１ｍＬの細胞を１１ｍＬの完全培地に希釈した。１００μｌを各ウェルに移す。
（７）Ａ５４９：１ウェル当たり細胞３０００個。原液は２．３×１０^５／ｍｌ：１．４３ｍＬの細胞を９．５７ｍＬの完全培地に希釈した。１００μｌを各ウェルに移す。
（８）ＳＬ０００３：１ウェル当たり細胞３０００個。原液は２．３×１０^５／ｍｌ：１．４３ｍＬの細胞を９．５７ｍＬの完全培地に希釈した。１００μｌを各ウェルに移す。

播種細胞を３７℃及び５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。翌日、細胞特異的細胞培養培地中で薬物を調製し、漸増２倍希釈濃度を細胞に添加した。調製物は以下のとおりである：
ペメトレキセド七水和物（５ｍＭ原液）。トップ希釈（Ｔｏｐ ｄｉｌｕｔｉｏｎ）１０μＭ：２μｌの原液を９９８μｌの完全培地に添加。
例示的リポソーム／リポソームＦＯＬＲ−１Ａｂ（０．４ｍｇ／ｍｌ＝６６６．６７μμＭ）。トップ希釈１０μＭ：９μｌの原液を５９１μｌの完全培地に添加。
リポソームロット０７０７Ｆ（原液は２ｍＭ）。トップ希釈１０μＭ：３μｌの原液を５９７μｌの完全培地に添加。

第４日に、細胞増殖に対する効果をＭＴＳアッセイで測定した。１０μｌの試薬（セルタイター（Ｃｅｌｌｔｉｔｅｒ）９６（登録商標）Ａｑｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を、各ウェルに添加した。これは、広範な細胞増殖があるときに深紫色になる比色アッセイである。プレートを２時間、３７℃でインキュベートし、吸光度を４９０ｎｍで測定した。各細胞株について１００％に設定された未処理細胞吸光度値を使用して、細胞成長のパーセント阻害を算出した。

実施例６ 細胞増殖に対するサンプルリポソーム効果
図２０は、癌細胞上の葉酸受容体アルファ表面レベルが、サンプルリポソーム成長阻害に対する感受性と相関することを示す。Ａにおける阻害のレベルが示されている。ｐ＝０．０５。細胞周期に対するサンプルリポソームの効果をさらに評価するため、ＳＬ０００３（肺癌）細胞を、ペメトレキセド又はサンプルリポソームで４日間処理した。

図２１は、肺癌又は乳癌の患者に由来する細胞株が、漸増濃度のペメトレキセド又は例示的リポソームで処理されたことを示す図である。細胞を９０時間、３７℃でインキュベートし、細胞生存率及び細胞数をＭＴＳにより評価した。推定１０ｍＭのペメトレキセドを有するサンプルリポソームと比較した１０ｍＭのペメトレキセドからの結果が示されている。サンプルリポソームは、ペメトレキセドと同様の効果を実証する。

細胞を溶解させ、ＤＮＡをヨウ化プロピジウム（ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ ｉｄｏｄｉｎｅ）で標識化して細胞周期を定量した（図２３Ａ）。ペメトレキセド処理は、Ｓ期に蓄積するよう細胞を誘導する（図２３Ｂ）。サンプルリポソームが、Ｓ期の細胞の蓄積を伴うペメトレキセドと同じ効果を細胞周期に対して誘導することを実証する複合データを図２４に示す。

このデータは、ペメトレキセドが癌細胞の分裂を停止させることによる、有効な化学療法であることを示す。本発明者らは、サンプルリポソーム内に含有されたペメトレキセドが、細胞の分裂を阻害するのに有効かどうかを試験した。複数の癌細胞株を、１０ｍＭペメトレキセド又は推定対応濃度のペメトレキセドを有するサンプルリポソームいずれかで、４日間処理した。次に細胞を、分裂した細胞数について評価した。データは、サンプルリポソーム及びペメトレキセドが、細胞株のそれぞれに対して類似の効果を有することを示す。

細胞表面上のＦＯＬＲ１発現（図２０を参照のこと）は、サンプルリポソームに対する感受性と相関する。本発明者らは、細胞の分裂能力に対するペメトレキセドの効果の第２の尺度を使用した。ペメトレキセドで処理された細胞は、新しいＤＮＡを産生できず、細胞周期のＳ期から脱することができなくなる。サンプルリポソームは、ペメトレキセドと同じ効果を有する。

実施例７ 細胞周期に対するサンプルリポソームの効果の評価
ＳＬ０００３（肺癌）細胞を、ＭＴＳアッセイを記載する実施例（実施例５）に記載のとおり調製した。

このアッセイのため、細胞を４又は５日間培養した（第５日について示されている）。より詳細には、ＳＣ０００３細胞（肺腺癌）を、９６ウェルプレート内に播種し、翌日に漸増濃度のＬＥＡＦ−００１又はペメトレキセドで処理した。第５日に、ＦＡＣＳ緩衝液、０．２％ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、０．３％ホルムアルデヒドで細胞を溶解させた。ＤＮＡを、ヨウ化プロピジウムで３０分間染色し、ヨウ化プロピジウムで標識化し、細胞周期を評価した。

細胞を洗浄し、フローサイトメトリーにより評価した（ＦＬ２）。図２２Ａは、細胞周期を示す概略図を示す。実験結果を図２２Ｂに示す。前駆体プリン及びピリミジンヌクレオチドの形成を阻害することにより、ペメトレキセドは、正常細胞及び癌細胞の両方の成長及び生存に必要なＤＮＡ及びＲＮＡの形成を妨げる。

実施例８ サンプルリポソームは、骨髄由来好中球に対するペメトレキセドの毒性を低減する。
ＣＤ３４＋細胞を、好中球へと分化するようＩＬ−３、幹細胞因子、及びＧ−ＣＳＦで誘導した。第２日までに、楕円に示される成熟好中球の劇的な増加がある（図２６Ａ）。ペメトレキセド（２〜５０ｍＭ）の存在下で、好中球分化が阻害される（図２６Ｂ、ｎ＝４人のドナー）。

図２５Ａ及び図２５Ｂに描かれた円内の好中球上のＭａｃ−１発現を図２５に示す。図２７に見られるとおり、サンプルリポソーム（１０ｍＭペメトレキセドで）は、好中球分化に対するペメトレキセドの毒性を低減する（ｎ＝３人のドナー）。細胞を、算出された推定値で１０ｍＭのペメトレキセドのサンプルリポソームで２日間処理した。分化好中球の数を、図２６Ａ及び図２６Ｂに示すとおり、フローサイトメトリーにより評価した。円は、Ｍａｃ−１及びＣＤ１５を発現する成熟好中球を意味する。

ペメトレキセド治療からの副作用のうちの１つは、血流中の好中球の低減である。これは、ＣＤ３４＋幹細胞が骨髄において成熟好中球に分化又は発達しないことの結果である。本発明者らは、同一用量のペメトレキセド（１０ｍＭ）と比較した、好中球分化に対するサンプルリポソームの効果を測定した。４人のドナーからの幹細胞を購入し、一群の成長因子で処理し、好中球分化を誘導した。やはりペメトレキセドで処理したＣＤ３４＋細胞は、成熟好中球へと発達できなかった。

Ｍａｃ−１と呼ばれる分子のレベルは、より成熟した好中球で増加する。この分子は、プロット上に描かれた円内の細胞上で増加する。赤色へのシフトは、細胞上でのレベルの増加を示す。

対照的に、サンプルリポソームは、より多くの細胞が好中球へと発達することを可能にすることで、この毒性を低減できた。たとえば、図２７を参照のこと。

実験を以下のとおり実施した。すなわち、ＣＤ３４＋幹細胞をＡＴＣＣから得た。ＣＤ３４＋細胞を３７℃で１分間解凍した。氷上で、細胞を冷たい幹細胞培地（「ＳｔｅｍＳｐａｎ ＳＦＥＭ」−Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈ．ｃａｔ．＃ ９６５０）、１０％加熱活性化ウシ胎児血清（ＨＩ ＦＢＳ）に移した。各バイアルは、およそ細胞５×１０^５個／ｍｌを含有した。細胞を、９６ウェル組織培養プレート内に、細胞約３５，０００個／ウェルで置いた。

好中球成長培地は、１００ｎｇ／ｍｌの幹細胞因子ヒト（ＳＣＦ−Ｓｉｇｍａ Ｈ８４１６、ロット＃ ＭＫＢＴ８０３６Ｖ）、２０ｎｇ／ｍｌの顆粒球コロニー刺激因子、ヒト（Ｇ−ＣＳＦ−Ｓｉｇｍａ Ｈ５５４１、ロット＃ ＳＬＢＣ９６０２Ｖ）、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ３組換え体ヒト（Ｓｉｇｍａ ＳＲＰ３０９０、ロット＃１００８ＡＦＣ１３）を、ＳｔｅｍＳｐａｍ培地中に上のとおり含有した。

細胞はまた、以下のとおり処理された。すなわち、１）成長サイトカインなしでＳｔｅｍＳｐａｍ培地のみ、２）ＳｔｅｍＳｐａｍ培地＋成長サイトカイン、３）５０、１０又は２μＭペメトレキセド、４）サンプルリポソーム（１０μＭペメトレキセドと等しい）、又は５）抗葉酸剤アルファＡｂ（１．０１ｍｇ／ｍｌ）−５μｇ／ｍｌ。

細胞を１〜５日間インキュベートし、各時点で成熟好中球について、ＣＤ１５、Ｍａｃ−１、及びＣＤ３４に対する抗体でのフローサイトメトリーによるアッセイに供した。プロットの円内に示す細胞は、Ｍａｃ−１及びＣＤ３４を発現する成熟好中球である。

実施例９ 結果及び考察
葉酸受容体アルファ発現は、ヒトにおいて非癌性状態では、胎児／胚期を超えては特定の器官に制限される。図１Ａに示すとおり、正常極性の状態では、正常単層上皮は、明確な尖端−基底極性を示す単層の個別細胞を含む。細胞は、密に詰まっており、尖端と側底膜領域とを分ける尖端結合複合体により互いに接続される（図１Ａ符号１０１）。極性が保存された正常組織において、葉酸受容体アルファは、血液循環中の葉酸から離れて、それらと直接接触せずに位置する細胞の尖端表面に結合している（図１Ａ符号１０２）。対照的に、細胞極性の破壊及び組織崩壊は、進行性上皮腫瘍の特徴である。図１Ｂは、どのように高悪性度上皮腫瘍における細胞が尖端−基底極性の消失及び全体的組織崩壊を示し、葉酸受容体アルファを血液循環中の葉酸と直接接触させるかを示す（図１Ｂ、符号１０３）。加えて、腫瘍組織細胞は一般に、葉酸受容体アルファを、この受容体を偶然的に発現する正常細胞よりも高いレベルで発現する。正常上皮細胞から区別される腫瘍組織細胞のこの特徴が、抗葉酸剤を抗癌療法として復権させる一方で、関連する深刻で時には生命を脅かす毒性を最小化するよう設計される、新しい化学物質の設計の核心である。かかる化学物質は、葉酸ではなく、ＲＦＣを迂回する葉酸受容体アルファ特異的ターゲッティング部分を用いて、特異的に葉酸受容体アルファを選択的に標的とする形で、抗葉酸剤を送達する。このアプローチは、抗葉酸剤の曝露を、細胞極性の消失による腫瘍組織細胞のみに限定する。なぜなら、これらの腫瘍組織細胞は、葉酸受容体アルファを、この受容体が血液循環と直接接触する間に過剰発現するからである。これは、葉酸受容体アルファが発現する限定的な正常組織には当てはまらない。なぜなら受容体は、循環する血液と直接接触しないからである。

以降、葉酸受容体アルファはまた、葉酸受容体アルファタンパク質をコードする遺伝子を記述する葉酸受容体アルファと互換的に使用できる。両方の用語が、葉酸受容体アルファタンパク質を記述するために互換的に使用される。加えて、新しい化学物質は、例証の目的のため、例示的リポソームと呼ばれる（標的化リポソームとも呼ばれる）。例示的組成物及び例示的リポソームを製造するための方法は、本明細書全体を通じて、また少なくとも実施例１において開示される。下の考察は、少数の例示的組成物及び少数の例示的リポソームについて実施されたいくつかの実験に言及する。あらゆる例示的組成物及びあらゆる例示的リポソームを定義することは意図されていない。

図２は、例示的リポソームと、どのようにそれが葉酸受容体アルファを発現する細胞と結合するのかを示す。ハプテンであることに加えて、ＦＴＩＣは、葉酸受容体アルファ発現細胞の表面上の葉酸受容体アルファに対する例示的リポソームの結合の視覚化を可能にする造影剤として寄与する。また図３は、一方では、葉酸受容体アルファとの結合を記録するために、他方では、細胞表面上に露出した葉酸アルファ受容体の数を定量するために設計されたコンストラクトを示す。

図４は、葉酸受容体アルファ発現細胞内への例示的リポソームの内部移行をＲｈｏｄｏＲｅｄを使用して示す。課題は、例示的リポソームが、生物活性剤ペイロードとは独立に内部移行することを実証することである。図５は、ｐ３８タンパクキナーゼ経路を、ストレスに対する細胞反応の読出しとして使用した、細胞増殖に対する例示的リポソームの内部移行の効果をさらに示す。

続く一連の図示（図６〜１１）は、使用された葉酸受容体アルファターゲッティング抗体が、葉酸受容体アルファに優先的に結合することをまず示す、実験及び結果を記載している。これらの実験において、細胞表面上の葉酸受容体アルファのレベルを、蛍光色素とコンジュゲートされたモノクローナル抗体を用いてフローサイトメトリーにより測定した。右側へのシフトは、フローサイトメトリーによる受容体の検出を示す。ヒストグラムが右側にシフトするほど、細胞表面上の受容体のレベルは高くなる。プロットは、癌細胞上の高レベルの葉酸受容体アルファを示す（図６〜図８）が、正常細胞上ではほぼ検出不能なレベルである（図９）。

例示的リポソームは、葉酸受容体アルファを優先的に標的とする抗体を有しうる。例示的リポソームが短期間（３０分間）葉酸受容体アルファ陽性細胞とインキュベートされるとき、例示的リポソームに組み込まれたＦＩＴＣのレベルをフローサイトメトリーにより測定することにより、細胞表面上の例示的リポソームを検出できる。右側へのヒストグラムラインのシフトは、例示的リポソームが細胞表面上に検出されることを示す。ヒストグラムが右側にシフトするほど、より多くの例示的リポソーム薬物が細胞上に検出される。実験は、例示的リポソームが、葉酸受容体アルファ発現肺癌細胞と結合する（図１０）が、正常結腸上皮細胞とは結合しない（図１１）ことを示す。

上述の例示的リポソーム結合実験を、葉酸受容体アルファを過剰発現する複数の癌細胞株（肺−ＳＬ０００３及び卵巣−ＯＶＣＡＲ−３）並びに結腸（ＣＣＤ８４１）及び乳腺（Ｈｓ５７８）組織に由来する正常細胞を使用して反復した。図１２は、高レベルの細胞表面葉酸受容体アルファを有する肺（ＳＬ０００３）及び卵巣（ＯＶＣＡＲ−３）癌細胞に由来する複合データが、結腸（ＣＣＤ８４１）及び乳腺（Ｈｓ５７８）に由来する正常細胞と比較して、細胞表面上での有意に高いレベルの例示的リポソーム結合を実証することを示す（ｐ値＜０．０５）。図１２に示すデータは、摂氏３７度でのインキュベーション３０分及び４時間で検出された例示的リポソームの表面レベルを含む。

別の一連の実験を、葉酸受容体アルファ発現細胞との結合時に、例示的リポソームが細胞内にさらに摂取される（内部移行する）ことを示すために実施した。これを以下の２つの方法で評価した：
第１に、例示的リポソームを、細胞内に移行する場合にはフローサイトメトリーでしか検出できない色素（ＲｈｏｄｏＲｅｄ）で標識化した（図４）。様々な細胞を、異なる量のＲｈｏｄｏＲｅｄ標識化例示的リポソームとインキュベートし、蛍光のレベルをフローサイトメトリーにより測定した（ＦＬ２）。右側へのシフトを有する卵巣癌細胞が図１３に示されており、例示的リポソームが細胞内に移行したことを示す。ＲｈｏｄｏＲｅｄ標識化例示的リポソームは、葉酸受容体アルファを発現する癌細胞内に移行する（図１３〜図１４）が、葉酸受容体アルファ陰性の正常細胞内には移行しない（図１５〜図１６）。

同じ実験が、葉酸受容体アルファ高発現ＫＢ細胞で、今度は漸増量のＲｈｏｄｏＲｅｄ標識化例示的リポソームとともに特に実施された。図１７に示すとおり、例示的リポソームは、高濃度で処置されたときにはＫＢ細胞内に移行したが、抗葉酸受容体アルファ抗体を欠いたコントロールリポソームは、細胞内に移行できなかった。

まとめると、ＲｈｏｄｏＲｅｄ実験からのこれらの結果は、例示的リポソームの設計コンストラクトにおいて使用された技術は、葉酸又はその類似体以外の葉酸受容体ターゲッティング部分を備えた、送達システムとしての例示的リポソームが、そのリポソーム生物活性剤ペイロードにかかわらず、葉酸受容体アルファを発現する癌細胞内に移行するような技術であるという証拠を提供する。さらに、同じ実験は、例示的リポソームによる葉酸受容体アルファ発現癌細胞が優先的なターゲッティングの一方で、生物活性剤ペイロードに対する正常細胞の曝露を制限することを実証する。

細胞内に移行する例示的リポソームの第２の尺度は、細胞内活性化経路を評価することに基づく。細胞は、ｐ３８タンパクキナーゼ経路を活性化させることにより、それらの受容体と結合するリガンドからのストレス又は内部移行に反応する（図２０）。活性化キナーゼは、フローサイトメトリーにより測定できる。細胞を、例示的リポソームと３０分間インキュベートし、次に、弱い洗剤で溶解させた。活性化ｐ３８キナーゼを、フローサイトメトリーにより抗体で検出した。癌細胞は、より高い基底レベルの活性化キナーゼを有していてもよい（図１８Ａ）。コントロール線ゲートの下のシフトは、より高いレベルのリン酸化ｐ３８を示す。この場合、ペメトレキセドは、２つの異なる濃度（１０μＭ及び５０μＭ）で同様にｐ３８活性化を低減する。例示的リポソームはリン酸化ｐ３８をより実質的に低減し、例示的リポソームの内部のペメトレキセドが活性であることを実証する（図１９）。

ペメトレキセドは癌細胞が分裂するのを止めるのに有効な化学療法であるので、例示的リポソームが対応濃度の遊離ペメトレキセドと同程度に細胞増殖を阻害することを示すために、別の一連の実験が実施された。前駆体プリン及びピリミジンヌクレオチドの形成を阻害することにより、ペメトレキセドは、正常細胞及び癌細胞の両方の成長及び生存に必要なＤＮＡ及びＲＮＡの形成を妨げる。これを以下の２つの方法で行った：
第１に、本発明者らは、例示的リポソーム内に含有されたペメトレキセドが、細胞増殖とも呼ばれる細胞の分裂を阻害するのに有効かどうかを試験した。複数の癌細胞株を、１０ｍＭペメトレキセド又は推定対応濃度のペメトレキセドを有する例示的リポソームいずれかで、４日間処理した。次に細胞を、分裂した細胞数について評価した。結果は、細胞成長阻害と癌細胞表面上の葉酸受容体アルファ発現との間に相関があることを実証した（図２０）。結果は、例示的リポソームに対する感受性が葉酸受容体アルファ発現癌細胞にあるだけでなく、例示的リポソーム及びペメトレキセドが、細胞株のそれぞれに対して類似の効果を有することもさらに示した（図２１）。

細胞周期に対する例示的リポソームの効果をさらに評価するため、第２のアプローチを使用して、細胞の分裂能力に対するペメトレキセドの効果を測定した。理論的根拠は、ペメトレキセドで処理された細胞が、新しいＤＮＡを産生できず、細胞周期のＳ期から脱することができなくなることだった。（図２２ａ及び図２２ｂ）。肺癌又は乳癌の患者に由来する細胞株が、漸増濃度のペメトレキセド又は例示的リポソームで処理された。細胞を９０時間、摂氏３７度でインキュベートし、細胞生存率及び細胞数をＭＴＳにより評価した。細胞を溶解させ、ＤＮＡをヨウ化プロピジウムで標識化して細胞周期を定量した（図２３ａ）。データは、ペメトレキセド処理がＳ期に蓄積するよう細胞を誘導することを示した（図２３ｂ）。さらに、ＳＣ０００３細胞（肺腺癌）を、９６ウェルプレート内に播種し、翌日に漸増濃度の例示的リポソーム又はペメトレキセドで処理した。第５日に、細胞を固定して溶解させ、ＤＮＡをヨウ化プロピジウムで標識化し、細胞周期を評価した。結果は、例示的リポソームが、Ｓ期の細胞の蓄積により測定される、細胞株のそれぞれに対するペメトレキセドと同じ効果を細胞周期に対して誘導することを実証した（図２４）。

別の実験を、骨髄細胞に対する例示的リポソームの影響を評価するために実施した。理論的根拠は、抗葉酸剤治療、たとえばペメトレキセド含有治療からの副作用のうちの１つは、血流中の好中球の低減であり、深刻で時には生命を脅かす感染症をもたらすというものである。これは、ＣＤ３４＋幹細胞が骨髄において成熟好中球に分化又は発達しないことによる。本発明者らは、同一用量のペメトレキセド（１０ｍＭ）と比較した、好中球分化に対する例示的リポソームの効果を測定した。４人のヒトドナーからの幹細胞を購入し、一群の成長因子で処理し、好中球分化を誘導した。より詳細には、ＣＤ３４＋幹細胞を、好中球へと分化するようＩＬ−３、幹細胞因子、及びＧ−ＣＳＦで誘導した。細胞を、１０ｍＭペメトレキセドで２日間、又は、算出された推定値で１０ｍＭのペメトレキセドの例示的リポソームで２日間処理した。分化好中球の数を、フローサイトメトリーにより評価した。

結果は、図２５及び図２６Ａの楕円領域に示すとおり、ペメトレキセドの非存在下で、第２日までに、成熟好中球の劇的な増加があることを示した。しかしながら、ペメトレキセド（２〜５０ｍＭ）の存在下では、好中球分化が阻害され（図２６Ｂ、ｎ＝４人のドナー）、これは、ペメトレキセドで処理したＣＤ３４＋細胞が成熟好中球へと発達できなかったことを実証する。遊離ペメトレキセドとは対照的に、例示的リポソームは、同等のペメトレキセド濃度のペメトレキセドと比較して、より多くのＣＤ３４＋幹細胞が分化好中球へと発達及び成熟することを可能にすることで、この毒性を低減できた（図２７）。

まとめると、実施された実験からのこれらの結果は、例示的リポソームの設計コンストラクトにおいて使用された技術は、葉酸又はその類似体以外の葉酸受容体ターゲッティング部分を備えた、生物活性剤／ペイロードの送達システムとしての例示的リポソームが、そのリポソーム生物活性剤ペイロードにかかわらず、葉酸受容体アルファを発現する腫瘍細胞内に移行し、葉酸受容体アルファ発現癌細胞における生物活性剤の有効性を保存し、抗葉酸剤ペイロード、たとえばペメトレキセドペイロードの毒性効果に対する正常細胞の曝露を最小化し、そのことにより、その他の面では非常に有効であるが毒性の試剤、たとえば一クラスとしての抗葉酸剤を、典型的に付随する深刻で時には生命を脅かす毒性なしに、臨床的状況に再導入する機会を提示するような技術であるという証拠を提供する。

ここで好ましい実施形態を参照して本発明を説明したが、様々な修正が、本発明の趣旨から逸脱することなしになされうることが理解されるべきである。したがって、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲を、かかる特許請求の範囲により権利が与えられる均等物の範囲全体とともに参照して決定されるべきである。特許出願及び公開公報を含むすべての引用文献及び参照文献の開示は、あらゆる目的のために本明細書に参照により組み込まれる。

Claims (24)

1. 内部空間を含むリポソーム、
   前記内部空間内に配置された生物活性抗葉酸剤、
   リポソームの外部に付加されたＰＥＧ、及び
   葉酸受容体アルファに対する特異的親和性を有する抗体であって、前記ＰＥＧ及び前記リポソームの外部のうちの少なくとも一方に付加されている抗体
   を含み、
   前記リポソームのゼータ電位が−３０〜−５０ｍＶであり、
   前記ＰＥＧが、２００〜５０００ダルトンの数平均分子量（Ｍ_ｎ）を有していてもよい、リポソーム抗葉酸剤組成物。
2. リポソームが、生物活性抗葉酸剤及び薬学的に許容される水性担体を封入しており、
   前記薬学的に許容される担体がトレハロースを含んでいてもよく、
   前記薬学的に許容される担体が、５％〜２０％質量パーセントのトレハロースを含んでいてもよく、
   前記薬学的に許容される担体が、５〜２００ｍＭの間の濃度及び２．８〜６の間のｐＨのクエン酸緩衝液を含んでいてもよく、
   前記薬学的に許容される担体が、５０ｍＭ〜５００ｍＭの間の総濃度の酢酸ナトリウム及び酢酸カルシウムを含んでいてもよい、
   請求項１に記載のリポソーム抗葉酸剤組成物。
3. ＤＳＰＥ、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−マレイミド、ＨＳＰＣ、ＨＳＰＣ−ＰＥＧ、コレステロール、コレステロール−ＰＥＧ及びコレステロール−マレイミドの少なくとも一つ、又は、ＤＳＰＥ、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＦＩＴＣ、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−マレイミド、コレステロール及びＨＳＰＣの少なくとも一つ、
   水性溶液中の生物活性抗葉酸剤、
   抗体
   を含む混合物を形成するステップ、
   前記混合物を均質化して、前記水性溶液中にリポソームを形成するステップ、及び
   膜を通して前記混合物を押し出して、前記水性溶液中に前記生物活性抗葉酸剤を封入するリポソームを形成するステップ
   を含み、
   前記押出しステップ後に、前記水性溶液中の過剰な生物活性抗葉酸剤を前記リポソームの外部に除去するステップを含んでもよく、
   前記除去ステップ後に、前記組成物を凍結乾燥させ、凍結乾燥組成物を形成するステップを含んでもよく、
   前記凍結乾燥ステップ後に、前記凍結乾燥組成物を溶媒中に溶解させることにより、前記凍結乾燥組成物を復元するステップを含んでもよく、
   前記溶媒が水性溶媒であってもよく、
   前記混合物が、マンニトール、トレハロース、ソルビトール、及びスクロースからなる群から選択される少なくとも１つを含んでいてもよい、
   請求項１に記載の組成物を調製する方法。
4. 内部空間を含むリポソームを含む媒体、
   前記内部空間内に配置された水性生物活性抗葉酸剤、
   葉酸受容体アルファに対する特異的親和性を有する抗体であって、前記リポソームの外部に配置されている抗体
   を含み、
   前記リポソームのゼータ電位が−３０〜−５０ｍＶであり、
   前記媒体は、水性溶液であってもよく、
   前記媒体は、マンニトール、トレハロース、ソルビトール、及びスクロースからなる群から選択される、少なくとも１つの抗凍結剤を含む水性溶液であってもよく、
   前記リポソームの外部に付加された立体安定剤をさらに含み、前記抗体が、前記立体安定剤及び前記リポソームの外部のうちの少なくとも一方に付加されていてもよく、
   前記立体安定剤が、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）、モノシアロガングリオシド（ＧＭ１）、ポリ（ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）、ポリ（アクリルアミド）（ＰＡＡ）、ポリ（２−メチル−２−オキサゾリン）、ポリ（２−エチル−２−オキサゾリン）、ホスファチジルポリグリセロール、ポリ［Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド］、両親媒性ポリ−Ｎ−ビニルピロリドン、Ｌ−アミノ酸ベースポリマー及びポリビニルアルコールからなる群から選択される少なくとも１つであってもよく、
   前記ＰＥＧが、２００〜５０００ダルトンの数平均分子量（Ｍｎ）を有していてもよい、
   リポソーム抗葉酸剤組成物。
5. 前記立体安定剤及び前記リポソームの外部のうちの少なくとも一方に配置された免疫刺激剤及びマレイミドのうちの少なくとも１つをさらに含み、
   前記免疫刺激剤が、前記立体安定剤及び前記リポソームの外部のうちの少なくとも一方と共有結合していてもよく、
   前記免疫刺激剤が、ハプテン及びアジュバントからなる群から選択される少なくとも１つ、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、又は、フルオレセイン、ＤＮＰ、ベータグルカン、ベータ−１，３−グルカン及びベータ−１，６−グルカンからなる群から選択される少なくとも１つであってもよい、
   請求項１又は４に記載のリポソーム抗葉酸剤組成物。
6. 前記リポソームが、３０〜１５０ｎｍの範囲の、好ましくは４０〜７０ｎｍの範囲の、直径を有する、請求項１又は４に記載のリポソーム抗葉酸剤組成物。
7. アニオン性脂質及び中性脂質のうちの少なくとも１つ、
   ＤＳＰＥ、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ、ＤＳＰＥ−マレイミド、ＨＳＰＣ、ＨＳＰＣ−ＰＥＧ、ＨＳＰＣ−マレイミド、コレステロール、コレステロール−ＰＥＧ及びコレステロール−マレイミドからなる群から選択されるすくなくとも１つ、及び
   ＤＳＰＥ、ＤＳＰＥ−ＦＩＴＣ、ＤＳＰＥ−マレイミド、コレステロール及びＨＳＰＣからなる群から選択される少なくとも１つ
   から形成される、請求項１又は４に記載のリポソーム抗葉酸剤組成物。
8. 前記リポソームが水性溶液を封入しており、
   前記リポソームが生物活性抗葉酸剤及び薬学的に許容される水性担体を封入していてもよく、
   前記薬学的に許容される担体がトレハロースを含んでいてもよく、
   前記薬学的に許容される担体が、５％〜２０％質量パーセントのトレハロースを含んでいてもよく、
   前記薬学的に許容される担体が、５〜２００ｍＭの間の濃度及び２．８〜６の間のｐＨのクエン酸緩衝液を含んでいてもよく、
   前記薬学的に許容される担体が、５０ｍＭ〜５００ｍＭの間の総濃度の酢酸ナトリウム及び酢酸カルシウムを含んでいてもよい、
   請求項１又は４に記載のリポソーム抗葉酸剤組成物。
9. 前記生物活性抗葉酸剤が水溶性である、請求項１又は４に記載のリポソーム抗葉酸剤組成物。
10. 各リポソームが、２００，０００分子未満の、好ましくは１０，０００〜１００，０００分子の、前記生物活性抗葉酸剤を含む、請求項１又は４に記載のリポソーム抗葉酸剤組成物。
11. 前記生物活性抗葉酸剤がペメトレキセド、ロメテレキソール、メトトレキセート、ラリトレキセド、アミノプテリン、プララトレキセート、ロメテレキソール、トリメトレキセド、ＬＹ３０９８８７、ＧＷ１８４３Ｕ８９、プログアニル、ピリメタミン、トリメトプリム、並びに、６−置換ピロロ及びチエノ［２，３−ｄ］ピロロピリミジンクラスのＧＡＲＦＴ阻害剤からなる群から選択される少なくとも１つであるである、請求項１又は４に記載のリポソーム抗葉酸剤組成物。
12. 前記生物活性抗葉酸剤が５〜８の、好ましくは２〜６の、ｐＨである、請求項１又は４に記載のリポソーム抗葉酸剤組成物。
13. 前記抗体が、マレイミド官能基を介して、立体安定剤分子に共有結合している、請求項４に記載のリポソーム抗葉酸剤組成物。
14. 前記抗体が、腫瘍細胞には存在するが、非腫瘍細胞では存在しないか又は接触不能である、腫瘍細胞表面上の葉酸受容体アルファのエピトープに対する特異的親和性を有し、
    前記腫瘍細胞が悪性細胞であってよい、
    請求項１又は４に記載のリポソーム抗葉酸剤組成物。
15. 前記抗体が、ヒト化抗体、抗体の抗原結合断片、単鎖抗体、単一ドメイン抗体、二重特異性抗体、合成抗体、ＰＥＧ化抗体、及び多量体抗体からなる群から選択される少なくとも１つである、請求項１３又は１４に記載のリポソーム抗葉酸剤組成物。
16. 各リポソームが、２００個までの、好ましくは３０個〜２００個の、ターゲッティング部分を含む、請求項１又は４に記載のリポソーム抗葉酸剤組成物。
17. アニオン性脂質及び中性脂質のうちの少なくとも１つ、
    ＤＳＰＥ、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ、ＤＳＰＥ−マレイミド、ＨＳＰＣ、ＨＳＰＣ−ＰＥＧ、ＨＳＰＣ−マレイミド、コレステロール、コレステロール−ＰＥＧ及びコレステロール−マレイミドからなる群から選択される少なくとも１つ、
    水性溶液中の生物活性抗葉酸剤、
    抗体
    を含む混合物を形成するステップ、
    前記混合物を均質化して、前記水性溶液中にリポソームを形成するステップ、及び
    膜を通して前記混合物を押し出して、前記水性溶液中に前記生物活性抗葉酸剤を封入するリポソームを形成するステップ
    を含み、
    前記押出しステップ後に、前記水性溶液中の過剰な生物活性抗葉酸剤を前記リポソームの外部に除去するステップを含んでいてもよく、
    前記除去ステップ後に、前記組成物を凍結乾燥させ、凍結乾燥組成物を形成するステップを含んでいてもよく、
    前記凍結乾燥ステップ後に、前記凍結乾燥組成物を溶媒中に溶解させることにより、前記凍結乾燥組成物を復元するステップを含んでいてもよく、
    前記混合物が、マンニトール、トレハロース、ソルビトール、及びスクロースからなる群から選択される少なくとも１つを含んでいてもよく、
    前記溶媒が水性溶媒であってもよい、
    請求項１又は４に記載の組成物を調製する方法。
18. 形成されたリポソームが、立体安定剤をさらに含み、
    前記立体安定剤が、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）、モノシアロガングリオシド（ＧＭ１）、ポリ（ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）、ポリ（アクリルアミド）（ＰＡＡ）、ポリ（２−メチル−２−オキサゾリン）、ポリ（２−エチル−２−オキサゾリン）、ホスファチジルポリグリセロール、ポリ［Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド］、両親媒性ポリ−Ｎ−ビニルピロリドン、Ｌ−アミノ酸ベースポリマー及びポリビニルアルコールからなる群から選択される少なくとも１つであってもよく、
    前記ＰＥＧが、２００〜５０００ダルトンの数平均分子量（Ｍｎ）を有していてもよい、
    請求項１７に記載の方法。
19. 内部空間を含むリポソーム、
    前記内部空間内に配置された生物活性剤、
    前記リポソームの外部に付加された立体安定剤分子、及び
    葉酸受容体アルファに対する特異的親和性を有する抗体であって、前記立体安定剤及び前記リポソームの外部のうちの少なくとも一方に付加されている抗体
    を含み、
    前記立体安定剤が、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）、モノシアロガングリオシド（ＧＭ１）、ポリ（ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）、ポリ（アクリルアミド）（ＰＡＡ）、ポリ（２−メチル−２−オキサゾリン）、ポリ（２−エチル−２−オキサゾリン）、ホスファチジルポリグリセロール、ポリ［Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド］、両親媒性ポリ−Ｎ−ビニルピロリドン、Ｌ−アミノ酸ベースポリマー、及びポリビニルアルコールからなる群から選択される少なくとも１つであってよく、
    前記ＰＥＧが、２００〜５０００ダルトンの数平均分子量（Ｍｎ）を有していてもよく、
    前記生物活性剤が、エリプチシン、パクリタキセル、ペメトレキセド、メトトレキセート、ラリトレキセド、アミノプテリン、プララトレキセート、ロメテレキソール、トリメトレキセド、ＬＹ３０９８８７、ＧＷ１８４３Ｕ８９、プログアニル、ピリメタミン、トリメトプリム、並びに、６−置換ピロロ及びチエノ［２，３−ｄ］ピロロピリミジンクラスのＧＡＲＦＴ阻害剤からなる群のうちの少なくとも１つを含んでいてもよい、
    葉酸受容体アルファを選択的に標的とする標的化リポソーム組成物。
20. 癌治療薬を製造するための、請求項１、２、４〜１６及び１９のいずれか一項に記載の組成物の使用。
21. ＤＳＰＥ、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ、ＤＳＰＥ−マレイミド、ＨＳＰＣ、ＨＳＰＣ−ＰＥＧ、ＨＳＰＣ−マレイミド、コレステロール、コレステロール−ＰＥＧ及びコレステロール−マレイミドからなる群から選択されるすくなくとも１つ、及び、ＤＳＰＥ、ＤＳＰＥ−ＦＩＴＣ、ＤＳＰＥ−マレイミド、コレステロール及びＨＳＰＣからなる群から選択される少なくとも１つ、及び
    生物活性抗葉酸剤をカプセル化するための組成物を使用するための説明書、
    を含み、
    別の容器に入った、生物活性抗葉酸剤を含んでいてもよい、
    請求項７に記載の組成物を提供するためのキット。
22. 生物活性抗葉酸剤がペメトレキセドである、請求項１、２、４〜１６及び１９のいずれか一項に記載の組成物。
23. 生物活性抗葉酸剤がペメトレキセドである、請求項２０に記載の使用。
24. 生物活性抗葉酸剤がペメトレキセドである、請求項２１に記載のキット。