JP7366747B2 - 血液凝固抗体 - Google Patents

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Description

配列表の参照による組み込み
「１６０１６３ＷＯ０２＿ＳＴ２５」と題する配列表は１９８キロバイトであり、２０１８年１月３０日に作成され、参照により本明細書に組み込まれる。
血友病ＡおよびＢを有するヒトなどの凝固障害を持つ患者では、凝固カスケードの様々な工程が、例えば、機能的凝固因子の欠如または不十分な存在によって、機能不全となる。こうした凝固カスケードの一部の機能不全は、不十分な血液凝固および潜在的に生命を脅かす出血、または関節などの内臓への損傷をもたらす。
一般的に血友病Ａと呼ばれる凝固第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）欠損症は、世界中の約４２０，０００人に影響を及ぼす先天性出血障害であり、そのうち約１０５，０００人が現在診断されている。
血友病Ａを有する患者は、外因性ＦＶＩＩＩなどの凝固因子補充療法を受けうる。従来的治療は、出血症状の予防またはオンデマンド療法として提供される、補充療法からなる。最近まで、重度の血友病Ａを有する患者に対する予防処置は、血漿由来ＦＶＩＩＩまたは組み換えＦＶＩＩＩ、またはその長時間作用型変異体のいずれかで、一週間に最大三回の静脈内注射であった。
しかしながら、このような患者は、このような外因性因子に対する中和抗体、いわゆる阻害物質を発生させるリスクがあり、以前に効率的だった治療も無効にする。阻害物質を有する血友病Ａ患者は、部分的に先天的であり、部分的に後天的である凝固障害の非限定的な例である。ＦＶＩＩＩに対する阻害物質を発生させた患者は、従来の置換療法で治療できない。最近、ヘムライブラという新薬が、阻害物質を有する血友病Ａの皮下予防治療として承認された。外因性凝固因子は、静脈内にのみ投与される可能性があり、これは患者にとってかなりの不便と不快感である。例えば、乳児および幼児は、静脈へのアクセスを保証するために、胸部静脈に静脈内カテーテルを外科的に挿入する必要がありうる。これにより、細菌感染症の発症リスクが高まる。したがって、ヘムライブラを導入しても、阻害物質を有する血友病には、代替的皮下治療が必要である。
出血している個体では、血管外ＴＦが血液中の活性化ＦＶＩＩ（ＦＶＩＩａ）にさらされると、組織因子／第ＶＩＩａ因子（ＴＦ／ＦＶＩＩａ）複合体の形成によって凝固が開始される。ＴＦ／ＦＶＩＩａ複合体の形成は、凝固第Ｘ因子（ＦＸ）が活性化凝固第Ｘａ因子（ＦＸａ）に活性化され、活性化凝固第Ｖ因子（ＦＶａ）と共に、限られた量のトロンビンを生成し、次に血小板を活性化する。活性化された血小板は、活性化第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩａ）および活性化凝固第ＩＸ因子（ＦＩＸａ）から構成されるテナーゼ複合体のアセンブリをサポートする。テナーゼ複合体は、非常に効率的なＦＸ活性化の触媒であり、この第二の工程で生成されるＦＸａは、最終的なトロンビンバーストに関与するＦＶａ／ＦＸａプロトロンビナーゼ複合体中の活性プロテアーゼとして機能する。トロンビンは、フィブリノゲンを切断してフィブリンモノマーを生成し、これは重合してフィブリンネットワークを形成し、漏れた血管を封鎖して、出血を止める。急速および広範囲のトロンビンバーストは、固体化し安定なフィブリン血栓形成の必要条件である。
ＦＶＩＩＩ活性の低下または欠如によって引き起こされる不適切なＦＸａ形成およびトロンビン生成の低下は、血友病Ａ患者の出血素因の根底にある理由である。
言及したように、ＦＸの酵素的に活性な形態ＦＸａへのタンパク質分解変換は、ＦＩＸａおよびその補因子ＦＶＩＩＩａを含む固有のＦＸ活性化複合体によって達成されうる。補因子結合は、ＦＩＸａの酵素活性を約五桁のオーダーで増加させ、Ｓｃｈｅｉｆｌｉｎｇｅｒらが、（２００８）Ｊ Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ、６：３１５－３２２で概説したように、複数のメカニズムを通じて生じると考えられている。特に、ＦＶＩＩＩａは、ＦＸに対するタンパク質分解活性を増加させたＦＩＸａの構造を安定化させることがわかっている（Ｋｏｌｋｍａｎ ＪＡ、Ｍｅｒｔｅｎｓ Ｋ（２０００）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３９：７３９８－７４０５、Ｚｏｇｇ Ｔ、Ｂｒａｎｄｓｔｅｔｔｅｒ Ｈ（２００９）Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、３９０：３９１－４００）。この観察に基づき、抗体が様々なタンパク質間相互作用を模倣できる多用途の結合タンパク質であることを認識し、Ｓｃｈｅｉｆｌｉｎｇｅｒらは、リン脂質表面およびカルシウムの存在下、しかし天然補因子ＦＶＩＩＩａの非存在下で、ＦＩＸａによるＦＸ活性化を強化する能力を特徴とするアゴニスト抗ＦＩＸａ抗体のスクリーニングを実施した。５２８０のハイブリドーマ上清のスクリーニングから、８８が様々な程度のＦＩＸａアゴニスト活性を示す抗体を産生することがわかった。ＥＰ１２２０９２３ Ｂ１およびＥＰ１６６０５３６ Ｂ１を参照のこと。ＦＸ活性化の動態およびＦＶＩＩＩ欠損ヒト血漿におけるトロンビン生成を刺激する能力に関して、ＥＰ１６６０５３６ Ｂ１は一貫して最も効率的な抗体として２２４Ｆ３を示している（例えば、セクション００６０および００６２を参照のこと）。
ＡＣＥ９１０またはＥｍｉｃｉｚｕｍＡｂ（商名名Ｈｅｍｌｉｂｒａ（登録商標））は、血友病Ａの治療用に中外製薬が開発したヒト化二重特異性抗ＦＩＸ（ａ）／抗ＦＸ（ａ）モノクローナル抗体である。ＡＣＥ９１０は、ＦＶＩＩＩ補因子機能を模倣するように設計されている（Ｓａｍｐｅｉら：（２０１３）ＰｌｏＳ Ｏｎｅ、８、ｅ５７４７９、およびＷＯ２０１２０６７１７６を参照のこと）。
特に血友病コミュニティ、および一般に凝固障害を持つ対象において、まだ多くの満たされていない医療ニーズがあり、本発明は、ＦＶＩＩＩの代わりとなることができ、したがって血友病Ａなどの凝固障害の治療に有用である改善された化合物に関する。
本発明は、凝固障害を患う患者、特に阻害物質を有する血友病Ａ患者を含む、血友病Ａ患者などの機能性ＦＶＩＩＩを欠く患者において、凝固第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）の代替物として役立つ化合物に関する。
したがって、本発明の一態様は、ＦＸａの生成を増強し、したがってＦＶＩＩＩを欠く患者の凝固を部分的にまたは完全に回復させることができる化合物に関する。
一態様では、化合物は抗体である。こうした一態様では、化合物は二重特異性抗体などの多重特異性抗体である。
特定の一態様では、本発明は、血友病Ａ患者などのＦＶＩＩＩを欠く患者のＦＶＩＩＩの代替物として役立つ血液凝固抗体に関する。
そのような一態様では、抗体は、ＦＸに対するＦＩＸａの酵素活性に結合し、増加させ、任意でＦＸにも結合する。
一態様では、本発明は、ＦＸおよび結合ＦＸに対するＦＩＸａの酵素活性を増加させる二重特異性血液凝固抗体を含む、ＦＸに結合する血液凝固抗体に関する。
一態様では、本発明は、凝固ＦＩＸ／ＦＩＸａおよびＦＸ／ＦＸａに結合することができる血液凝固二重特異性抗体に関する。
一態様では、抗体はヒトまたはヒト化である。
本発明のさらなる態様は、特定の抗ＦＩＸまたは抗ＦＩＸａ抗体またはその抗原結合性断片などの血液凝固抗体の一部である個別抗体またはその抗原結合性断片に関する。本発明のさらなる態様は、特定の抗ＦＸまたは抗ＦＸａ抗体またはその抗原結合性断片などの血液凝固抗体の一部である個別抗体またはその抗原結合性断片に関する。
本発明のさらなる態様は、本明細書に開示される抗体、およびその中間体の製造に関する。
本発明のさらなる態様は、ＦＩＸ／ＦＩＸａへの結合について、本明細書に開示される血液凝固抗体またはこの抗原結合性断片と競合する抗体に関する。
本発明のさらなる態様は、ＦＸ／ＦＸａへの結合について、本明細書に開示される抗体またはこの抗原結合性断片と競合する血液凝固抗体に関する。
本発明のなおさらなる態様は、凝固障害の予防および／または治療のために該抗体の送達用に製剤化された本明細書に開示される血液凝固抗体を含む医薬組成物に関する。
本発明のさらなる態様は、凝固障害、凝固障害を伴う疾患、または凝固障害によって引き起こされる疾患の予防および／または治療のための本明細書に開示される血液凝固抗体に関する。
本発明はまた、例示的な実施形態の開示から明らかとなる、さらなる問題を解決する可能性がある。
図１は、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインの相補性決定領域１、２および３（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）がボックス内で連続的に強調されている、配列番号３～１８８の整列した配列を示す。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 図２は、ヒト組織因子活性化血友病Ａ乏血小板血漿（ＨＡ－ＰＰＰ）の二重特異性抗体ｍＡｂ４－７７６１、ｍＡｂ４－７７６２、ｍＡｂ４－７７８９、ｍＡｂ５－００５７、ｍＡｂ５－１４０９、およびＡＣＥ９１０からのトロンビン生成試験（ＴＧＴ）データを示す。実験は、実施例１７に記述されるように実施された。点線および点状線は、それぞれＨＡ－ＰＰＰおよび通常ＰＰＰにおける抗ＦＶＩＩＩ抗体が存在しない場合に観察されるピークトロンビンレベル（ｎＭ）を示し、それらの標準偏差は点線で示されている。ｍＡｂ４－７７６１、ｍＡｂ４－７７６２、ｍＡｂ４－７７８９、ｍＡｂ５－００５７、およびｍＡｂ５－１４０９のプロファイルは、上向きの三角形で示されているが、ＡＣＥ９１０のそれは下向きの三角形で示されている。実験Ａ～Ｄは、独立した実験を意味し、これらの各実験の中で、各抗体濃度におけるピークトロンビンのレベルは、少なくとも三つの独立した実験の平均±標準偏差を表す。 図３は、ヒト組織因子活性化血友病Ａ多血小板血漿（ＨＡ－ＰＲＰ）の二重特異性抗体ｍＡｂ５－００５７、ｍＡｂ５－１４０９、およびＡＣＥ９１０からのトロンビン生成試験（ＴＧＴ）データを示す。実験は、実施例１７に記述されるように実施された。点線および点状線は、それぞれＨＡ－ＰＲＰおよび通常ＰＲＰにおける抗ＦＶＩＩＩ抗体が存在しない場合に観察されるピークトロンビンレベル（ｎＭ）を示し、それらの標準偏差は点線で示されている。ｍＡｂ５－００５７およびｍＡｂ５－１４０９のプロファイルは、上向きの三角形で示されているが、ＡＣＥ９１０のそれは下向きの三角形で示されている。結果は、四つの独立した実験からの平均±標準偏差として示されている。 図４は、ヒト第ＸＩａ因子活性化乏血小板血漿中のｍＡｂ１－９０１６および２２４Ｆ３の一価ワンアームド（ＯＡ）抗体からのトロンビン生成試験（ＴＧＴ）データを示す。実験は、実施例１８に記述されるように実施された。点状線は、抗体が存在しない場合に観察された平均ピークトロンビンレベル（ｎＭ）を示し、その標準偏差（±１ＳＤ）は点線で示されている。ｍＡｂ１－９０１６および２２４Ｆ３（ｍＡｂ１－１５８２）のＯＡバージョンのプロファイルは、それぞれ三角形の上向きと下向きで示されている。
配列の簡単な説明
配列番号１は、ヒト凝固第ＩＸ因子のアミノ酸配列である。
配列番号２は、ヒト凝固第Ｘ因子のアミノ酸配列である。
配列番号３～１８８は、本明細書に記載の抗ＦＩＸおよび抗ＦＸモノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）の配列である。対応するワンアームド（ＯＡ）抗体ならびに特定の二重特異性抗体のＩＤも表に示す。ＣＤＲ１－３配列を図１のボックスで強調する。
抗体略語、標的、および対応するＶＨおよびＶＬ配列の配列番号の概要：
Figure 0007366747000001
Figure 0007366747000002
一列目（「ＯＡまたは二重特異性抗体ＩＤ」）は、一価ワンアームド（ＯＡ）抗体およびまたは二重特異性抗体の略語を含む。二列目（「ｍＡｂ ＩＤ」）は、対応する成分抗体の略語を表す（二重特異性抗体の場合、二列目の最初に記載されている抗体は抗ＦＩＸ／ＦＩＸａ抗体であり、二番目は抗ＦＸ／ＦＸａ抗体である）。四列目（「配列番号（ＶＨ）」）および五列目（「配列番号（ＶＬ）」）は、ＶＨおよびＶＬ配列の配列番号をそれぞれ表し、各列の最初の配列番号は、抗ＦＩＸ／ＦＩＸａ抗体を表し、二番目は抗ＦＸ／ＦＸａ抗体を表す。
血友病Ａを有するヒトなどの凝固障害を持つ対象では、凝固カスケードは機能的ＦＶＩＩＩの欠如または不十分な存在によって機能不全にされる。こうした凝固カスケードの一つの部分の機能不全は、不十分な血液凝固および潜在的に生命を脅かす出血、または関節などの内臓への損傷をもたらす。本発明は、凝固障害を患う患者、特に阻害物質を有する血友病Ａ患者を含む、血友病Ａ患者などの機能性ＦＶＩＩＩを欠く患者において、凝固第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）の代替物として役立つ化合物に関する。一態様では、こうした化合物は抗体である。
特に、本発明の発明者らは、高い効力および有効性を有するＦＶＩＩＩ補因子活性を模倣する驚くほど識別された抗体を持つ。
特定の一態様では、本発明は、血友病Ａ患者などの機能的ＦＶＩＩＩを欠く患者のＦＶＩＩＩの代替物として役立つ凝血原抗体に関する。
こうした一態様では、血液凝固抗体は、凝固第Ｘ因子（ＦＸ）に対する凝固第Ｘａ因子（ＦＩＸａ）の酵素活性に結合し、酵素活性を増加させ、任意でＦＸも結合する。かかる一態様において、本発明の抗体は、ＦＩＸ／ＦＩＸａおよびＦＸに結合することができる二重特異性抗体である。
凝固第ＩＸ因子
ＦＩＸは、第ＶＩＩ因子、プロトロンビン、第Ｘ因子、およびタンパク質Ｃと構造的に類似したビタミンＫ依存性凝固因子である。循環する酵素前駆体型は、Ｎ末端γ－カルボキシグルタミン酸リッチ（Ｇｌａ）ドメイン、二つのＥＧＦドメイン、およびＣ末端トリプシン様セリンプロテアーゼドメインを含む、四つの異なるドメインに分割された４１５個のアミノ酸から成る。ＦＩＸは、血漿中で単鎖酵素前駆体（配列番号１）として循環する。ＦＩＸの活性化は、Ａｒｇ１４５およびＡｒｇ１８０での限定的タンパク質分解によって生じ、活性化ペプチドを放出する（配列番号１の残基１４６～１８０）。したがって、活性化されたＦＩＸ（ＦＩＸａ）は、配列番号１（軽鎖）の残基１～１４５、および配列番号１（重鎖）の残基１８１～４１５から構成される。
したがって、循環ＦＩＸ分子は、ＦＩＸ酵素前駆体、および活性型のＦＩＸを含み、これは本明細書では一般に、配列番号１に関してＦＩＸおよびＦＩＸａと呼ばれる。
活性化第ＩＸ因子は、第ＩＸａ因子またはＦＩＸａと呼ばれる。「ＦＩＸ（配列番号１）および／またはその活性型（ＦＩＸａ）」という用語は、「ＦＩＸ／ＦＩＸａ」または「ＦＩＸ（ａ）」とも呼ばれる。
ＦＩＸａは、テナーゼ複合体の一部として、凝固中に適切なトロンビン形成をサポートするために必要な第Ｘａ因子のほとんどを生成することにより、止血において重要な役割を果たす、トリプシン様セリンプロテアーゼである。
ＦＩＸは、本明細書では、ヒトＦＩＸのＡｌａ１４８対立遺伝子型に対応する配列番号１で表される（Ａｎｓｏｎら、ＥＭＢＯ Ｊ．１９８４ ３：１０５３－１０６０；ＭｃＧｒａｗら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１９８５ ８２：２８４７－２８５１；Ｇｒａｈａｍら、Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．１９８８ ４２：５７３－５８０）。本発明では、ＦＩＸは、Ｔ１４８変異体（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｐ００７４０）などのＦＩＸのすべての天然変異体を網羅することを意図している。
凝固第Ｘ因子
ＦＸは、第ＶＩＩ因子、プロトロンビン、ＦＩＸ、およびタンパク質Ｃと構造的に類似したビタミンＫ依存性凝固因子である。ヒトＦＸ酵素前駆体は、Ｎ末端ガンマ－カルボキシグルタミン酸リッチ（Ｇｌａ）ドメイン、二つのＥＧＦドメイン、およびＣ末端トリプシン様セリンプロテアーゼドメインを含む、四つの異なるドメインを含む。ＦＸは、配列番号２（軽鎖）の残基１～１３９および配列番号２（重鎖）の残基１４３～４４８を含む、二鎖酵素前駆体として血漿中で循環する。ＦＸの活性化は、Ａｒｇ１９４での限定されたタンパク質分解によって起こり、活性化ペプチドの放出をもたらす（Ａａ１４３～１９４）。したがって、活性化ＦＸ（ＦＸａ）は、配列番号２（軽鎖）の残基１～１３９および配列番号２（活性化重鎖）の残基１９５～４４８から構成される。したがって、循環ＦＸ分子は、ＦＸ酵素前駆体、および活性型のＦＸを含み、これは本明細書では、配列番号２に関してそれぞれＦＸおよびＦＸａと呼ばれる。本発明では、ＦＸは、ＦＸのすべての天然変異体を網羅することを意図している。「ＦＸ（配列番号２）および／またはその活性型（ＦＸａ）」という用語は、「ＦＸ／ＦＸａ」または「ＦＸ（ａ）」とも呼ばれる。
抗体
本明細書において「抗体」という用語は、抗原またはその一部に結合する能力を有する免疫グロブリン配列に由来するタンパク質を指す。抗体という用語には、任意のクラス（またはアイソタイプ）、すなわち、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭおよび／またはＩｇＹの全長抗体が含まれるが、これらに限定されない。抗体という用語は、二重特異性抗体などの二価である抗体を含むが、これに限定されない。
天然全長抗体は、ジスルフィド結合によって結合される二つの重鎖（ＨＣ）および二つの軽鎖（ＬＣ）の少なくとも四つのポリペプチド鎖を含む。一部の事例では、天然抗体は、軟骨魚類に見られるＩｇＮＡＲの場合のように、四つ未満の鎖を含む。特定の医薬品の免疫グロブリンの一つのクラスはＩｇＧである。ヒトにおいて、ＩｇＧクラスは、それらの重鎖定常領域の配列に基づいて、四つのサブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４に分割されてもよい。軽鎖は、それらの配列組成物の差異に基づいて、二つのタイプ、カッパ鎖およびラムダ鎖に分けることができる。ＩｇＧ分子は、二つ以上のジスルフィド結合によって連結された二つの重鎖、およびそれぞれがジスルフィド結合によって重鎖に結合した二つの軽鎖で構成されている。ＩｇＧ重鎖は、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および最大三つの重鎖定常（ＣＨ）ドメイン：ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３を含んでもよい。軽鎖は、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）および軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）を含んでもよい。ＶＨおよびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存された領域が点在する、相補性決定領域（ＣＤＲ）または超可変領域（ＨｖＲ）と呼ばれる超可変性の領域にさらに細分化されうる。ＶＨおよびＶＬドメインは、一般に三つのＣＤＲと四つのＦＲから構成され、アミノ末端からカルボキシ末端まで以下の順序で配置される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。超可変領域（ＣＤＲ）を含有する重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインは、抗原と相互作用できる構造を形成する一方で、抗体の定常領域は、免疫グロブリンの宿主組織または因子への結合を媒介しうる。この宿主組織または因子には免疫系の種々の細胞（エフェクター細胞）、Ｆｃ受容体、および第一の構成要素である、伝統的補体系のＣ１複合体のＣ１ｑなどが含まれるが、これらに限定されない。
本発明の抗体は、単一Ｂ細胞からまたはＢ細胞のクローン集団によって発現される一連の固有の重鎖可変ドメイン配列および軽鎖可変ドメイン配列を表すという意味で、モノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）であってもよい。本発明の抗体は、当業者に公知の様々な方法を使用して生成および精製されてもよい。例えば、抗体はハイブリドーマ細胞から生成されてもよい。抗体は、Ｂ細胞増殖によって生成されうる。抗体またはその断片は、哺乳類または微生物の発現系で、またはインビトロ翻訳により組み換え発現されてもよい。抗体またはその断片はまた、例えば、ファージディスプレイ、細菌表示、酵母表示、哺乳類細胞表示、またはリボソームもしくはｍＲＮＡ表示によって、細胞表面結合分子として組み換え発現されてもよい。
本発明の抗体は単離されてもよい。「単離抗体」という用語は、それが生成された環境中の他の成分から分離および／または回収された抗体、および／またはそれが生成された環境中に存在する構成要素の混合物から精製された抗体を指す。
抗体のある抗原結合性断片は、抗体の抗原結合機能が全長抗体の断片によって実行できることが示されているため、本発明の文脈において適切でありうる。抗体の「抗原結合性断片」という用語は、本明細書に記載されるように、ＦＩＸ／ＦＩＸａ、ＦＸ／ＦＸａまたは別の標的分子などの抗原に特異的に結合または認識する能力を保持する抗体の一つまたは複数の断片を指す。抗原結合性断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ２、Ｆａｂ’２、Ｆｖ（通常、抗体の単一アームのＶＬドメインおよびＶＨドメインの組み合わせ）、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）（例えば、Ｂｉｒｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８８；２４２：４２３－４２６；およびＨｕｓｔｏｎら、ＰＮＡＳ １９８８；８５：５８７９－５８８３を参照のこと）、ｄＳｆｖ、Ｆｄ（通常、ＶＨおよびＣＨ１ドメイン）、単一のＶＨおよび単一のＶＬドメインの両方を含む一価分子、ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、カッパボディ（例えば、ＩＩＩなど（１９９７）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ１０：９４９－５７を参照のこと）、ならびに一つまたは複数の単離されたＣＤＲまたは機能的パラトープが含まれ（これらに限定されない）、単離されたＣＤＲまたは抗原結合残基もしくはポリペプチドが、機能性抗体断片を形成するように関連または一緒に連結されうる。これらの抗体断片は、当業者に公知の従来的技術を使用して取得されてもよく、また断片は、インタクトな抗体と同様の方法でスクリーニングされてもよい。
「Ｆａｂ」断片および「Ｆａｂ’２」断片を含む、抗体の「Ｆａｂ断片」は、抗体の重鎖を接続するヒンジシステイン残基のＮ末端側またはＣ末端側それぞれのヒンジ領域の重鎖の切断することによって、抗体から誘導されうる。「Ｆａｂ」断片は、軽鎖の可変ドメインおよび定常ドメイン、ならびに重鎖の可変ドメインおよびＣＨ１領域を含む。「Ｆａｂ’２」断片は、それらのヒンジシステインによって一般に共有結合された一対の「Ｆａｂ」断片を含む。Ｆａｂ’は、Ｆａｂ’２の重鎖を接続するヒンジジスルフィド結合の切断により、Ｆａｂ’２断片から公式に誘導される。抗体断片のジスルフィド結合以外の他の化学的結合も当技術分野で公知である。Ｆａｂ断片は、潜在的に低い親和性で、その抗原に結合する親抗体の能力を保持する。Ｆａｂ’２断片は二価の結合が可能だが、Ｆａｂ断片およびＦａｂ’断片は一価しか結合できない。一般的に、Ｆａｂ断片には、定常ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメイン、すなわちＦｃ受容体とＣ１ｑとの相互作用が発生するＦｃ部位がない。したがって、Ｆａｂ断片は一般的にエフェクター機能を欠いている。Ｆａｂ断片は、抗体の酵素切断、例えば、Ｆａｂを得るためにパパインを使用して、またはＦａｂ’２を得るためにペプシンを使用して、当技術分野で公知の方法によって生成されうる。Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’２を含むＦａｂ断片は、当技術分野で公知の方法を使用して組み換え生成されうる。
「Ｆｖ」（断片可変）断片は、完全な抗原認識および結合部位を含有する抗体断片であり、一般的に、例えば、単鎖可変ドメイン断片（ｓｃＦｖ）において、自然に共有結合できることに関連して、一つの重鎖および一つの軽鎖可変ドメインを含む。この構成では、各可変ドメインの三つの超可変領域が相互作用して、ＶＨ－ＶＬ二量体の表面上に抗原結合部位を定義する。集合的に、六つの超可変領域またはそのサブセットは、抗体に対する抗原結合特異性を与える。
「単鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」抗体は、抗体のＶＨドメインおよびＶＬドメインを含み、これらのドメインは単一ポリペプチド鎖に存在する。一般的に、Ｆｖポリペプチドは、ＶＨドメインおよびＶＬドメインの間のポリペプチドリンカーをさらに含み、ｓｃＦｖが抗原結合のために望ましい構造を形成することを可能にする。ｓｃＦｖのレビューについては、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ、１９９４、Ｉｎ：Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｖｏｌ．１１３、Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ、およびＭｏｏｒｅ ｅｄｓ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ｐｐ．２６９－３１５を参照のこと。
「単鎖Ｆａｂ」または「ｓｃＦａｂ」抗体は、抗体のＶＨ、ＣＨ１、ＶＬおよびＣＬドメインを含み、これらのドメインは単一ポリペプチド鎖に存在する。一般的に、Ｆａｂポリペプチドは、抗原結合のための望ましい構造を形成することを可能にする、両方のＶＨとＣＬドメインとの間、またはＶＬとＣＨドメインとの間のどちらかの間のポリペプチドリンカーをさらに含む（Ｋｏｅｒｂｅｒら、（２０１５）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．４２７：５７６－８６）。
「ダイアボディ」という用語は、二つの抗原結合部位を有する小さな抗体断片を意味し、その断片は、同一ポリペプチド鎖（ＶＨおよびＶＬ）内の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に接続されている重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。同じ鎖上の二つの可変ドメイン間のペアリングを可能にするには短すぎるリンカーを使用して、可変ドメインは、別の鎖の相補的ドメインと強制的にペアリングされ、二つの抗原結合部位を作り出す。
「線形抗体」という表現は、ザパタら、（１９９５）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．８：１０５７－１０６２に記載される抗体を意味する。簡潔に述べると、これらの抗体は、相補的軽鎖ポリペプチドと共に、一対の抗原結合領域を形成する、一対のタンデムＦｄセグメント（ＶＨ－ＣＨ１～ＶＨ－ＣＨ１）を含有する。線形抗体は、二重特異性または単一特異性でありうる。
抗体断片は、従来的な組み換え型またはタンパク質エンジニアリング技術を使用して得ることができ、断片は、インタクトな抗体と同様の方法でＦＩＸおよびその活性化型、ＦＸまたは別の機能への結合についてスクリーニングすることができる。
本発明の抗体断片は、例えば、ポリペプチドのＮ末端および／またはＣ末端からの一つまたは複数のアミノ酸の除去によって、切断によって作製されてもよい。断片はまた、一つまたは複数の内部欠失によって生成されてもよい。
本発明の抗体は、抗体の断片、または本明細書に開示される抗体のいずれか一つの変異体であってもよく、またはそれを含んでもよい。本発明の抗体は、これらの抗体の一つの抗原結合部分、またはその変異体であってもよく、またはそれを含んでもよい。例えば、本発明の抗体は、これらの抗体のうちの一つのＦａｂ断片、もしくはその変異体であってもよく、またはこれらの抗体のうちの一つに由来する単鎖抗体、もしくはその変異体であってもよい。また、本発明の抗体は、全長抗体とその断片の組み合わせであってもよい。
本明細書において使用される場合、「ワンアームド」という用語は、抗体重鎖、Ｆａｂ領域を欠いている切断型重鎖、および単一軽鎖によって構成される特定のタイプの一価抗体を指す。
本明細書で使用される場合、「単一特異性」抗体という用語は、一つの特定のエピトープ（二価抗体を含むがこれに限定されない）に結合することができる抗体を指す。
本明細書で使用される場合、「二重特異性」抗体という用語は、二つの異なる抗原または同じ抗原上の二つの異なるエピトープに結合することができる抗体を指す。
本明細書で使用される場合、「三重特異性」抗体という用語は、三つの異なる抗原、または同じ抗原上の三つの異なるエピトープ、または二つの異なる抗原上に存在する三つの異なるエピトープに結合することができる抗体を指す。
本明細書で使用される場合、「多重特異性」抗体という用語は、二つ以上の異なる抗原または同じ抗原上の二つ以上の異なるエピトープに結合することができる抗体を指す。したがって、多重特異性抗体は、二重特異性抗体および三重特異性抗体を含む。
全長ＩｇＧ型の二重特異性抗体は、二つの個別ハイブリドーマの融合によって生成され、二重特異性ヘテロ二量体化抗体の断片を含む抗体の混合物を生成する、ハイブリッドクアドローマを形成することができる（Ｃｈｅｌｉｕｓ Ｄ．ら；ｍＡｂ．２０１０ Ｍａｙ－Ｊｕｎ；２（３）：３０９-３１９）。別の方法として、二重特異性ヘテロ二量体化抗体は、組み換え技術を使用することにより生成されうる。ヘテロ二量体化は、Ｆｃ領域の二量体化インターフェースを操作してヘテロ二量体化を促進することによって達成されうる。この一例は、いわゆるノブインホール変異であり、立体的に嵩高い側鎖（ノブ）が、対向するＦｃ上の立体的に小さな側鎖（ホール）に一致する一つのＦｃに導入され、それによってヘテロ二量体化を促進する立体的相補性を生み出す。操作されたヘテロ二量体化Ｆｃインターフェースの他の方法は、静電相補性、非ＩｇＧヘテロ二量体化ドメインへの融合、またはヘテロ二量化を制御するためのヒトＩｇＧ４の天然Ｆａｂアーム交換現象の利用である。ヘテロ二量体化二重特異性抗体の例は、文献、例えば、（Ｋｌｅｉｎ Ｃ．ら；ｍＡｂ．２０１２ Ｎｏｖ－Ｄｅｃ；４（６）：６５３-６６３）によく記載されている。ヘテロ二量体抗体の軽鎖には、特別な注意を払う必要がある。ＬＣとＨＣとの正しいペアリングは、共通の軽鎖の使用によって達成することができる。また、ＬＣ／ＨＣインターフェースのエンジニアリングを使用して、ＣｒｏｓｓＭａｂの場合ように、ヘテロ二量体化または軽鎖クロスオーバーエンジニアリングを促進することができる。適切な変異を含有する二つの個別ＩｇＧからの穏やかな還元条件下での抗体のインビトロ再構築も、二重特異性抗体の生成に使用できる（例えば、Ｌａｂｒｉｊｎら、ＰＮＳ、１１０、５１４５－５１５０（２０１３））。また、正しい軽鎖のペアリングを確実にするために、天然Ｆａｂアーム交換方法が報告されている。
多重特異性抗体ベースの分子はまた、文献に記載されるように、ＩｇＧの天然モジュールを組み合わせて多重特異性抗体誘導体および多価抗体誘導体を形成する融合タンパク質として組み換え発現させることもできる。融合抗体の例は、ＤＶＤ－Ｉｇｓ、ＩｇＧ－ｓｃＦＶ、ダイアボディ、ＤＡＲＴなどである。特定の検出タグ、精製タグ、半減期延長部分、または他の構成要素を、融合タンパク質に組み込むことができる。追加的な非ＩｇＧモダリティーも融合タンパク質に組み込まれうる。Ｆｃヘテロ二量化に基づく二重特異性全長抗体は、ＬＣペアリング法に関わらず、一般的に非対称ＩｇＧと呼ばれる。
一般的に、二重特異性抗体は、Ｂｒｉｎｋｍａｎｎらによって概説された様々な分子形式で生成されうる。（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎら。Ｔｈｅ ｍａｋｉｎｇ ｏｆ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｍａｂｓ ９、１８２－２１２（２０１７））。
多重特異性抗体ベースの分子はまた、文献に記載されるように、個々の全長ＩｇＧの化学結合もしくはカップリング、またはＩｇＧ断片のカップリングによって生成され、多重特異性抗体誘導体および多価抗体誘導体を形成する場合もある。例としては、化学結合Ｆａｂ断片、ＩｇＧ－二量体などが挙げられる。特定の検出タグまたは精製タグ、半減期延長分子またはその他の構成要素を、複合体タンパク質に組み込むことができる。追加的な非ＩｇＧポリペプチドも融合タンパク質に組み込まれうる。多重特異性分子は、上述のものを含む組み換え型および化学的方法を組み合わせることによって生成されうる。
一態様では、本発明の抗体は、キメラ抗体、ヒト抗体、またはヒト化抗体である。こうした抗体は、例えば、適切な抗体表示または免疫化プラットフォーム、または当分野で公知のその他の適切なプラットフォームまたは方法を使用することによって生成することができる。本明細書で使用される場合、「ヒト抗体」という用語は、フレームワーク領域の少なくとも一部分および／またはＣＤＲ領域の少なくとも一部が、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変ドメインを持つ抗体を含むことが意図される。例えば、ヒト抗体は、フレームワークとＣＤＲ領域の両方がヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変ドメインを有してもよい。さらに、抗体が定常領域を含有する場合、定常領域またはその一部は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列にも由来する。本発明のヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基を含んでもよい（例えば、インビトロでの無作為もしくは部位特異的変異誘発、またはインビボでの体細胞変異によって導入された変異）。
かかるヒト抗体は、ヒトモノクローナル抗体であってもよい。かかるヒトモノクローナル抗体は、遺伝子導入非ヒト動物から得られたＢ細胞を含むハイブリドーマによって生成されてもよい。例えば、不死化細胞に融合されたヒト免疫グロブリン重鎖および軽鎖の遺伝子セグメントレパートリーを含むゲノムを有する遺伝子導入のマウス。
ヒト抗体は、ヒト生殖系列配列の選択に基づいて構築された配列ライブラリから単離されてもよく、天然および合成の配列多様性でさらに多様化されている。
ヒト抗体は、ヒトリンパ球のインビトロでの免疫化に続いて、リンパ球のエプスタイン・バーウイルスでの形質転換によって調製されうる。
ヒト抗体は、当該技術分野で公知の組み換え方法によって生成されてもよい。
「ヒト抗体誘導体」という用語は、抗体と別の薬剤または抗体とのコンジュゲートなど、ヒト抗体の任意の改変形態を指す。
「ヒト化抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、非ヒト免疫グロブリンに由来する配列（ＣＤＲ領域またはその部分）を含有するヒト／非ヒト抗体を指す。したがって、ヒト化抗体は、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）であり、レシピエントの少なくとも超可変領域からの残基が、所望の特異性、親和性、配列組成および機能性を有するマウス、ラット、ウサギまたは非ヒト霊長類など非ヒト種（ドナー抗体）からの抗体の超可変領域からの残基で置換される。一部の実例では、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト残基で置換される。このような修飾の例は、一つまたは複数のいわゆる逆突然変異の導入であり、これは典型的にはドナー抗体に由来するアミノ酸残基である。抗体のヒト化は、当業者に公知の組み換え型技術を使用して実施されてもよい（例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、ｖｏｌ．２４８、Ｂｅｎｎｙ Ｋ．Ｌｏ編を参照のこと）。軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインの両方に対する適切なヒトレシピエントフレームワークは、例えば、配列または構造相同性によって識別されうる。あるいは、例えば、構造、生物物理学特性および生化学特性の知識に基づいて、固定レシピエントフレームワークを使用してもよい。レシピエントフレームワークは、生殖系列由来または成熟抗体配列由来であってもよい。ドナー抗体からのＣＤＲ領域は、ＣＤＲ移植によって導入することができる。ＣＤＲ移植ヒト化抗体は、ドナー抗体からのアミノ酸残基の再導入（逆突然変異）がヒト化抗体の特性に有益な影響を与える重要なフレームワーク位置の特定により、例えば、親和性、機能性および生物物理学特性をさらに最適化することができる。ドナー抗体の逆突然変異に加えて、ヒト化抗体は、ＣＤＲまたはフレームワーク領域への生殖系列残基の導入、免疫原性エピトープの除去、部位特異的突然変異誘発、親和性成熟などによって操作されうる。
さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体またはドナー抗体に見られない残基を含み得る。これらの修飾は、抗体性能をさらに改善するために作られる。一般的に、ヒト化抗体は少なくとも一つ、典型的に二つの可変ドメインを含み、その中で全てのまたは実質的に全てのＣＤＲ領域が、非ヒト免疫グロブリンのものと対応し、その中で全てのまたは実質的に全てのＦＲ残基がヒト免疫グロブリン配列のものである。ヒト化抗体は任意に、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部分、典型的にはヒト免疫グロブリンのものも含むことができる。
「ヒト化抗体誘導体」という用語は、抗体と化学的薬剤とのコンジュゲート、または抗体と別の抗体とのコンジュゲートなど、ヒト化抗体の任意の改変形態を指す。
「キメラ抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、二種以上の種に由来する抗体の部分を含む抗体を指す。例えば、このような抗体をコードする遺伝子は、可変ドメインをコードする遺伝子、および二つの異なる種から生じた定常ドメインをコードする遺伝子を含む。例えば、マウスモノクローナル抗体の可変ドメインをコードする遺伝子は、ヒト起源の抗体の定常ドメインをコードする遺伝子に結合されてもよい。
抗体の断片結晶可能領域（「Ｆｃ領域」／「Ｆｃドメイン」）は、抗体のＣ末端領域であり、これはヒンジおよび定常ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む。Ｆｃドメインは、Ｆｃ受容体と呼ばれる細胞表面受容体、ならびに補体システムのいくつかのタンパク質と相互作用する場合がある。Ｆｃ領域により、抗体が免疫系と相互作用することができる。本発明の一態様では、抗体は、とりわけ血清半減期、補体固定、Ｆｃ受容体結合、タンパク質の安定性、および／または抗原依存性細胞障害活性、またはそれらの欠如など、典型的にはその機能特性の一つまたは複数を変更するために、Ｆｃ領域内に修飾を含むように操作されてもよい。さらに、本発明の抗体は、もう一度いうが、抗体の機能的特性の一つまたは複数を変更するために、化学的に修飾されるか（例えば、一つまたは複数の化学的部分は抗体に取り付けられてもよい）、またはそのグリコシル化を変更するために修飾されてもよい。ＩｇＧ１抗体は、特定のＦｃガンマ受容体（Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ、およびＧ２３７Ａ）への親和性の低下、およびＣ１ｑ介在性補体結合（Ａ３３０ＳおよびＰ３３１Ｓ）の減少がそれぞれ結果として起こる、一つまたは複数、およびおそらく全ての以下の突然変異を含む、修飾Ｆｃドメインを担持しうる（ＥＵ指標による残基番ナンバリング）。別の方法として、Ｆｃガンマ受容体結合の変化（減少または増加）をもたらすことが当技術分野で公知のその他のアミノ酸置換、およびその組み合わせ、および上述との組み合わせが使用されうる。
本発明の抗体のアイソタイプは、ＩｇＧ１など、ＩｇＧ２など、ＩｇＧ４などのＩｇＧであってもよい。所望であれば、抗体のクラスは、公知の技術によって「切り替える」ことができる。例えば、元々ＩｇＭ分子として産生された抗体は、ＩｇＧ抗体にクラススイッチされる場合がある。クラススイッチング技術は、例えば、ＩｇＧ１～ＩｇＧ２またはＩｇＧ４、ＩｇＧ２～ＩｇＧ１またはＩｇＧ４、またはＩｇＧ４～ＩｇＧ１またはＩｇＧ２から、一つのＩｇＧサブクラスを別のものに変換するためにも使用されうる。異なるＩｇＧサブクラスからの領域の組み合わせによって、定常領域キメラ分子を生成する抗体のエンジニアリングも実施することができる。
一実施形態では、抗体のヒンジ領域は、ヒンジ領域内のシステイン残基の数が変化するように、例えば、増加または減少するように修飾される。このアプローチは、例えば、Ｂｏｄｍｅｒらによる米国特許第５，６７７，４２５号にさらに記載されている。
定常領域は、抗体を安定化させるように、例えば、半抗体に分離する二価抗体のリスクを低減させるように修飾されてもよい。例えば、ｌｇＧ４定常領域では、残基Ｓ２２８（ＥＵナンバリング指数およびＫａｂａｔによるＳ２４１による）は、ヒンジにおける重鎖ジスルフィド架橋形成を安定化するためのプロリン（Ｐ）残基に変異してもよい（例えば、Ａｎｇａｌら。Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９３；３０：１０５－８を参照のこと）。
抗体またはその断片は、それらの相補性決定領域（ＣＤＲ）の観点から定義されうる。「相補性決定領域」または「超可変領域」という用語は、本明細書で使用される場合、抗原結合に関与するアミノ酸残基が位置する抗体の領域を指す。超可変性の領域またはＣＤＲは、抗体可変ドメインのアミノ酸アライメントの最も高い可変性を有する領域として特定することができる。データベースは、ＫａｂａｔデータベースなどのＣＤＲ識別に使用でき、このＣＤＲは、例えば、軽鎖可変ドメインのアミノ酸残基２４－３４（Ｌ１）、５０－５６（Ｌ２）および８９－９７（Ｌ３）と、重鎖可変ドメインの３１－３５（Ｈ１）、５０－６５（Ｈ２）および９５－１０２（Ｈ３）を含むものとして定義される（Ｋａｂａｔら；１９９１；Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第五版、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ公開番号９１～３２４２）。別の方法として、ＣＤＲは、「超可変ループ」からのこれら残基として定義されうる（軽鎖可変ドメインの残基２６－３３（Ｌ１）、５０－５２（Ｌ２）および９１－９６（Ｌ３）、ならびに重鎖可変ドメインの２６－３２（Ｈ１）、５３－５５（Ｈ２）および９６－１０１（Ｈ３）；ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９８７；１９６：９０１－９１７）。典型的には、この領域におけるアミノ酸残基のナンバリングは、上述のＫａｂａｔらに記載される方法によって実施される。本明細書において、「Ｋａｂａｔ位置」、「Ｋａｂａｔ残基」、および「Ｋａｂａｔによれば」などの語句は、重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメインのためのこのナンバリングシステムを意味する。Ｋａｂａｔナンバリングシステムを使用すると、ペプチドの実際の線形アミノ酸配列は、可変ドメインのフレームワーク（ＦＲ）またはＣＤＲの短縮化または挿入に対応する、より少ないまたは追加のアミノ酸を含み得る。例えば、重鎖可変ドメインは、ＣＤＲ Ｈ２の残基５２の後のアミノ酸挿入（例えば、Ｋａｂａｔによる、残基５２ａ、５２ｂ、および５２ｃなど）、および重鎖ＦＲ残基８２の後に挿入された残基（例えば、Ｋａｂａｔによる、残基８２ａ、８２ｂ、および８２ｃなど）を含み得る。残基のＫａｂａｔナンバリングは、抗体の配列と、「標準」Ｋａｂａｔナンバリング配列との、相同性領域でのアライメントにより、所与の抗体について決定されうる。
「フレームワーク領域」または「ＦＲ」残基という用語は、本明細書に定義されるように、ＣＤＲ内ではないこれらのＶＨまたはＶＬアミノ酸残基を指す。
本発明の抗体は、本明細書に開示される特定の抗体のうちの一つまたは複数からのＣＤＲ領域を含み得る。
「血液凝固抗体」という用語は、例えば、血液凝固のプロセスを加速することによって、および／または一つまたは複数の凝固因子の酵素活性を増加させることによって血液凝固を増強する抗体を指す。
「血液凝固活性」という用語は、例えば、血液凝固のプロセスを加速することによって、および／または一つまたは複数の凝固因子の酵素活性を増加させることによって血液凝固を増強する抗体などの化合物の能力を指す。
「抗原」（Ａｇ）という用語は、Ａｇを認識する抗体（Ａｂ）を産生するために、免疫能力のある脊椎動物の免疫に使用される分子実体を指す。本明細書において、Ａｇはより広範に称され、Ａｂによって特異的に認識される標的分子を含むことが一般的に意図されており、したがって、Ａｂを生成するために使用される、免疫化プロセスまたはファージディスプレイなどの他のプロセスの断片または模倣物を含む。
本明細書で使用される場合、「エピトープ」という用語は、抗体（Ａｂ）とその対応する抗原（Ａｇ）などの「抗原結合ポリペプチド」の間の分子相互作用の文脈で定義される。一般的に、「エピトープ」は、Ａｂが結合するＡｇ上の面積、または領域、すなわち、Ａｂと物理的接触する面積、または領域を指す。物理的接触は、Ａｂ分子およびＡｇ分子の原子に対する、さまざまな基準（例えば、３Åなど、３．５Åなど、４．Åなど、４．５Åなど、５Ａなどの２～６Åの間隔遮断、または溶媒露出度）を使用して定義され得る。
ＦＩＸ／ＦＩＸａおよびＦＸ／ＦＸａは、多数の異なるエピトープを含み得、その中には（１）直鎖ペプチドエピトープ、（２）成熟ＦＩＸ／ＦＩＸａまたはＦＸ／ＦＸａ構造において相互に近接して位置する一つまたは複数の非連続アミノ酸からなる構造エピトープ、および（３）炭水化物基などのＦＩＸ／ＦＩＸａまたはＦＸ／ＦＸａに共有結合した分子構造の全部または一部のいずれかからなるエピトープが含まれる場合があるが、これらに限定されない。
所与の抗体（Ａｂ）／抗原（Ａｇ）対のエピトープを記述し、様々な実験的および計算的エピトープマッピング方法を用いて異なるレベルの詳細で特徴付けることができる。実験方法には、変異誘発法、Ｘ線結晶法、核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法、水素重水素交換質量分析法（ＨＤＸ－ＭＳ）および様々な競合結合方法、当分野に公知の方法が含まれる。各方法が独特の原則に依存するため、エピトープの説明は、それが決定された方法に本質的に連結される。したがって、用いられるエピトープマッピング方法に応じて、所与のＡｂ／Ａｇペアのエピトープを異なって説明することができる。
例えば、Ｆａｂ断片、およびそのＡｇなどのＡｂ間の複合体の空間座標によって定義されるＸ線由来結晶構造の文脈では、本明細書におけるエピトープという用語は、文脈により特に指定または矛盾しない限り、Ａｂの重原子から３．５Åの距離内の重原子（すなわち、非水素原子）を有することを特徴とするＦＩＸ／ＦＩＸａまたはＦＸ残基として特に定義される。
例えば、Ｘ線構造から決定されたアミノ酸レベルに記載されるエピトープは、同一のアミノ酸残基を含有する場合には同一であると言われる。少なくとも一つのアミノ酸残基がエピトープによって共有される場合、エピトープは重複すると言われる。アミノ酸残基がエピトープによって共有されない場合、エピトープは別々である（特有）と言われる。
「パラトープ」という用語の定義は、見方を逆転することによって「エピトープ」の上述の定義に由来する。したがって、「パラトープ」という用語は、Ａｇが結合するＡｂ上の面積または領域を指し、すなわち、それがＡｇに物理的接触をする。
Ｆａｂ断片、およびそのＡｇなどのＡｂ間の複合体の空間座標によって定義されるＸ線由来結晶構造の文脈では、本明細書におけるパラトープという用語は、文脈により特に指定または矛盾しない限り、ＦＩＸ／ＦＩＸａまたはＦＸの重原子から３．５Åの距離内の重原子（すなわち、非水素原子）を有することを特徴とするＡｂ残基として特に定義される。
所与の抗体（Ａｂ）／抗原（Ａｇ）対のエピトープおよびパラトープは、日常的な方法によって識別されうる。例えば、エピトープの一般的な位置は、ＦＩＸ／ＦＩＸａまたはＦＸの異なる断片または変異体に結合する抗体の能力を評価することによって決定されうる。抗体（エピトープ）と接触するＦＩＸ／ＦＩＸａまたはＦＸ内の特定のアミノ酸と、ＦＩＸ／ＦＩＸａまたはＦＸ（パラトープ）と接触する抗体における特定のアミノ酸は、日常的な方法を使用して決定されうる。例えば、抗体および標的分子を組み合わせてもよく、またＡｂ：Ａｇ複合体を結晶化してもよい。複合体の結晶構造は、抗体とその標的との間の相互作用の特定の部位を特定するために決定され、使用されてもよい。
抗原上のエピトープは、一つまたは複数のホットスポット残基、すなわち、同族抗体との相互作用に特に重要な残基を含んでもよく、該ホットスポット残基の側鎖によって媒介される相互作用は、抗体／抗原相互作用の結合エネルギーに有意に寄与する（Ｐｅｎｇら。（２０１４）。ＰＰＮＡＳ １１１、Ｅ２６５６－Ｅ２６６５）。ホットスポット残基は、抗原（ここでＦＩＸ／ＦＩＸａおよびＦＸ）の試験変異体によって特定することができ、ここで単一エピトープ残基は、例えば、同族抗体への結合のためにアラニンによって置換されている。アラニンとのエピトープ残基の置換が、抗体への結合に強い影響を及ぼす場合、該エピトープ残基はホットスポット残基とみなされ、したがって抗原への抗体の結合に特に重要である。
同じ抗原に結合する抗体は、それらの共通抗原に同時に結合する能力に関して特徴付けることができ、「競合結合」／「ビニング」を受けることができる。本文脈では、「ビニング」という用語は、同じ抗原に結合する抗体をグループ化する方法を指す。抗体の「ビニング」は、標準技術に基づいてアッセイにおける共通抗原に対する二つの抗体の競合結合に基づいてもよい。
抗体の「ビン」は、参照抗体を使用して定義される。二次抗体が参照抗体と同時に抗原に結合することができない場合、二次抗体は、参照抗体と同じ「ビン」に属すると言われる。この場合、参照抗体および二次抗体は、抗原の同一部分に競合的に結合し、「競合抗体」と呼ばれる。二次抗体が参照抗体と同時に抗原に結合することができる場合、二次抗体は、別々の「ビン」に属すると言われる。この場合、参照抗体および二次抗体は、抗原の同一部分に競合的に結合せず、「非競合抗体」と呼ばれる。
抗体「ビニング」は、エピトープに関する直接情報を提供しない。
競合抗体、すなわち、同一の「ビン」に属する抗体は、同一のエピトープ、オーバーラップしたエピトープ、またはさらには別個のエピトープを有してもよい。後者は、抗原上のそのエピトープに結合した参照抗体が、二次抗体が抗原上のそのエピトープに接触するために必要な空間を占有する場合である（「立体障害」）。非競合抗体は一般的に別個のエピトープを有する。したがって、いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、本明細書に特異的に開示される抗体の少なくとも一つと同じエピトープに結合する。
抗体が本明細書に開示される抗ＦＩＸ／ＦＩＸａまたは抗Ｘ抗体との結合について競合するかどうかを決定するための競合アッセイは、当該技術分野で公知である。例示的な競合アッセイには、免疫アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡアッセイ、ＲＩＡアッセイ）、表面プラズモン共鳴解析（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）機器の使用）、バイオレイヤー干渉法（ＦｏｒｔｅＢｉｏ（登録商標））およびフローサイトメトリーが含まれる。
典型的には、競合アッセイは、固体表面に結合したまたは細胞表面に発現した抗原、試験ＦＩＸまたはＦＩＸａ結合抗体、および参照抗体の使用を含む。参照抗体は標識化され、試験抗体は標識化されていない。競合阻害は、試験抗体の存在下での固体表面または細胞に結合した標識化された参照抗体の量を決定することによって測定される。通常、試験抗体は、過剰に存在する（例えば、１、５、１０、２０、１００、１０００、１００００または１０００００倍）。競合アッセイで競合的であると特定された抗体（すなわち、競合抗体）は、参照抗体と同じエピトープ、または重複エピトープに結合する抗体、および立体障害が生じるために参照抗体が結合するエピトープに十分に近位の隣接するエピトープに結合する抗体が含まれる。
例示的な競合アッセイでは、参照抗ＦＩＸまたは抗ＦＩＸａ抗体は、市販の試薬を使用してビオチン化される。ビオチン化参照抗体は、試験抗体または標識化されていない参照抗体の段階希釈液と混合し（自己競合対照）、標識化された参照抗体に対して、試験抗体（または標識化されていない参照抗体）の様々なモル比の混合物（例えば、１、５、１０、２０、１００、１０００、１００００または１０００００倍）が得られる。抗体混合物を、ＦＩＸまたはＦＩＸａポリペプチド被覆ＥＬＩＳＡプレートに添加する。次いで、プレートを洗浄し、検出試薬としてセイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）－ストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐａｖｉｄｉｎ）をプレートに添加する。標的抗原に結合した標識化された参照抗体の量は、当技術分野で公知である、発色基質（例えば、ＴＭＢ（３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン）またはＡＢＴＳ（２，２”－アジノ－ジ－（３－エチルベンズアゾリン－６－スルホナート））の添加後に検出される。光学密度読み取り値（ＯＤ単位）は、分光計（例えば、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）Ｍ２分光計（分子装置））を使用して作られる。ゼロパーセント阻害がに対応する応答（ＯＤ単位）は、任意の競合抗体を含まないウェルから決定される。１００％阻害、すなわち、アッセイバックグラウンドに対応する応答（ＯＤ単位）は、任意の標識化された参照抗体または試験抗体を含まないウェルから決定される。各濃度での試験抗体（または標識化されていない参照抗体）によるＦＩＸまたはＦＩＸａに対する標識化された参照抗体の阻害率は、以下のように計算される：％阻害＝（１－（ＯＤ単位－１００％阻害）／（０％阻害－１００％阻害））＊１００。
当業者であれば、二つ以上の抗ＦＸ／ＦＸａ抗体が、結合領域、ビンを共有し、および／または競合的に抗原を結合するかどうかを決定するために、類似のアッセイを実施しうることを理解するであろう。当業者であれば、競合アッセイが、当技術分野で知られている様々な検出システムを使用して実施できることも理解するであろう。
競合結合アッセイで測定されるように、過剰な一つの抗体（例えば、１、５、１０、２０、１００、１０００、１００００または１０００００倍）が他の抗体の結合を阻害する場合、例えば、少なくとも５０％、７５％、９０％、９５％、または９９％、試験抗体は、抗原への結合について参照抗体と競合する。
特に明記しない限り、競合は、上記の競合ＥＬＩＳＡアッセイを使用して決定される。
「結合親和性」という用語は、本明細書では、二つの分子間、例えば、抗体またはその断片と抗原との間の非共有相互作用の強度の測定値として使用される。「結合親和性」という用語は、一価の相互作用を記述するために使用される。
一価相互作用を介しての二つの分子間、例えば、抗体またはその断片と抗原との間の結合親和性は、平衡解離定数（ＫＤ）を決定することによって定量化され得る。ＫＤは、複合体形成および解離の動態を、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法または等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）法などで測定することによって決定できる。一価複合体の会合および解離に対応する速度定数は、それぞれ会合速度定数ｋａ（またはｋｏｎ）、および解離速度定数ｋｄ（またはｋｏｆｆ）と呼ばれる。ＫＤは、式ＫＤ＝ｋｄ／ｋａを介して、ｋａおよびｋｄと関連する。
上記の定義にしたがって、所与抗原に対する異なる抗体の結合親和性の比較など、異なる分子相互作用に関連する結合親和性は、個々の抗体／抗原複合体のＫＤ値の比較により比較してもよい。
解離定数の値は、周知の方法によって直接決定することができる。標的に向かう抗体などのリガンドの結合能力を評価する標準アッセイは、当技術分野で公知であり、例えば、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、ＲＩＡおよびフローサイトメトリー解析を含む。抗体の結合動態性および結合親和性も、ＳＰＲなどの当技術分野で公知の標準アッセイによって評価することができる。しかしながら、等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）を使用して、抗体／標的相互作用のための親和性を測定し、相互作用のための熱力学パラメータを導き出すことが好ましい。
標的への抗体の結合が、別の抗体などのその標的の別の配位子による標的の結合と比較される競合結合アッセイを行うことができる。
本発明の抗体は、その標的の１×１０－４Ｍ以下、１×１０－５Ｍ以下、１×１０－６Ｍ以下、１×１０－７Ｍ以下、１×１０－８Ｍ以下、または１×１０－９Ｍ以下、または１×１０－１０Ｍ以下、１×１０－１１Ｍ以下、１×１０－１２Ｍ以下、１×１０－１３Ｍ以下または１×１０－１４Ｍ以下のＫＤを有する。
本発明の抗体のＫＤが、１０μＭ未満、１μＭ未満、０．９μＭ未満、０．８μＭ未満、０．７μＭ未満、０．６μＭ未満、０．５μＭ未満、０．４μＭ未満、０．３μＭ未満、０．２μＭ未満、０．１μＭ未満など、１００μＭ未満であってもよい。
一つのこうした実施形態では、抗体は、１０μＭ未満、１μＭ未満、０．９μＭ未満、０．８μＭ未満、０．７μＭ未満、０．６μＭ未満、０．５μＭ未満、０．４μＭ未満、０．３μＭ未満、０．２μＭ未満、０．１μＭ未満、０．０９μＭ未満、０．０８μＭ未満、０．０７μＭ未満、０．０６μＭ未満、０．０５μＭ未満、０．０４μＭ未満、０．０３μＭ未満、０．０２μＭ未満、０．０１μＭ未満、９ｎＭ未満、８ｎＭ未満、７ｎＭ未満、６ｎＭ未満、５ｎＭ未満、４ｎＭ未満、３ｎＭ未満、２ｎＭ未満、１ｎＭ未満、０．５ｎＭ未満などの１００μＭ未満のＦＸに対するＫＤを有する抗ＦＸアームを含む二重特異性抗体である。
本明細書に記載される抗体およびその抗体断片は、当技術分野で公知の他の抗体および抗体断片と組み合わされて、二重特異性、三重特異性または多重特異性抗体分子を生成してもよい。ＦＶＩＩＩ補因子機能を模倣する化合物は、その他のＦＩＸ／ＩＸａおよびＦＸ／Ｘａ結合ドメインを使用して以前生成されてきたが、本明細書に記載されるＦＩＸ／ＩＸａおよび／またはＦＸ／Ｘａ結合ドメインを潜在的にそれぞれ置換する可能性がある。したがって、本発明のＦＩＸ／ＩＸａおよびＦＸ／Ｘａ結合ドメインは、個々の分子として別個の対象であり、ならびに少なくとも一つのＦＩＸ／ＩＸａおよび／またはＦＸ／Ｘａ結合ドメインを含む二重、三重、または多重特異性抗体の一部として「中間体」であることが明らかである。
二重、三重、および多重特異性抗体を含む血液凝固抗体の活性は、当分野に公知の方法によって決定されうる。標準アッセイには、全血－トロンビン産生試験（ＴＧＴ）が含まれ、トロンボエラストグラフィー（ＴＥＧ）およびＦＸａ生成アッセイによって凝固時間を測定する。
同一性
当技術分野で公知の「同一性」という用語は、配列を比較することによって決定される、二つ以上のポリペプチドの配列の間の関係を指す。当技術分野では、「同一性」はまた、二つ以上のアミノ酸残基の文字列の間の一致の数によって決定される、ポリペプチド間の配列の関連性の程度を意味する。「同一性」とは、特定の数学的モデルまたはコンピュータプログラム（すなわち、「アルゴリズム」）によって対処された隙間調整（もしあれば）を有する二つ以上の配列の小さい方の間の同一の一致の割合を測定する。関連するポリペプチドの同一性は、公知の方法によって容易に計算することができる。このような方法は、限定されるものではないが、以下に記載されている。Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｌｅｓｋ、Ａ．Ｍ．、ｅｄ．、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ、Ｓｍｉｔｈ、Ｄ．Ｗ．、ｅｄ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９３；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ、Ｐａｒｔ １、Ｇｒｉｆｆｉｎ、Ａ．Ｍ．、および Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ、１９９４；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９８７；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ Ｄｅｖｅｒｅｕｘ、Ｊ．，ｅｄｓ．、Ｍ．Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９１；および Ｃａｒｉｌｌｏら、ＳＩＡＭ Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ．１９８８；４８：１０７３。
同一性を決定するための好ましい方法は、試験された配列間で最大の一致が得られるように設計されている。同一性を判定する方法は、公的に利用可能なコンピュータプログラムに記載されている。二つの配列間の同一性を決定するための好ましいコンピュータプログラム方法には、ＧＡＰ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．１９８４；１２：３８７）を含むＧＣＧ プログラムパッケージ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、およびＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９０；２１５：４０３－４１０）が含まれる。ＢＬＡＳＴＸプログラムは、国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）およびその他のソース（ＢＬＡＳＴ Ｍａｎｕａｌ、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、ＮＣＢ／ＮＬＭ／ＮＩＨ Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．２０８９４；Ａｌｔｓｃｈｕｌら、上記参照）から公開されている。周知のスミス・ウォーターマン・アルゴリズムは、同一性を決定するためにも使用されうる。
例えば、コンピュータアルゴリズムＧＡＰ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）を使用して、配列同一性の割合が決定される二つのポリペプチドは、それぞれのアミノ酸（アルゴリズムにより決定される「一致したスパン」）の最適なマッチングのために整列させる。ギャップ開始ペナルティ（平均斜角の３倍として計算され、「平均斜角」は、使用される比較マトリクスの対角線の平均であり、「斜角」は特定の比較マトリクスによってそれぞれ完全アミノ酸一致に割り当てられたスコアまたは数値）およびギャップ伸張ペナルティ（通常、ギャップ開始ペナルティの｛分数（１／１０）｝倍）、およびＰＡＭ ２５０またはＢＬＯＳＵＭ ６２などの比較マトリクスが、アルゴリズムと組み合わせて使用される。標準比較マトリックス（ＰＡＭ ２５０比較マトリクスには、Ｄａｙｈｏｆｆら、１９７８；Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、ｖｏｌ．５、ｓｕｐｐ．３；ＢＬＯＳＵＭ ６２比較マトリクスには、Ｈｅｎｉｋｏｆｆら、ＰＮＡＳ １９９２；８９：１０９１５－１０９１９を参照）もアルゴリズムによって使用される。
ペプチド配列比較のための好ましいパラメータには以下が含まれる：アルゴリズム：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎら。Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９７０；４８：４４３－４５３；比較マトリクス：Ｈｅｎｉｋｏｆｆら、ＰＮＡＳ １９９２；８９：１０９１５－１０９１９からのＢＬＯＳＵＭ ６２；Ｇａｐペナルティ：１２、ギャップ長ペナルティ：４、類似性の閾値：０。
ＧＡＰプログラムは、上記のパラメータに有用である。前述のパラメータは、ＧＡＰアルゴリズムを使用したペプチド比較（末端ギャップのペナルティなし）のデフォルトパラメータである。
「類似性」という用語は、関連する概念であるが、「同一性」とは対照的に、同一性の一致と保存的置換の一致の両方を含む配列関係を指す。二つのポリペプチド配列が例えば、（分数（１０／２０））同一のアミノ酸を有し、残りの部分はすべて非保存的置換である場合、同一性および類似性の割合は両方とも５０％である。同じ例で、保存的置換がある位置がさらに５つある場合、同一性の割合は２５％で、類似性の割合は７５％（分数（１５／２０））になる。したがって、保存的置換がある場合、二つのポリペプチド間の類似性の程度は、二つのポリペプチド間の同一性の割合よりも高くなる。
医薬製剤
別の態様では、本発明は、本明細書に記載の抗体などの本発明の化合物を含む組成物および製剤を提供する。例えば、本発明は、薬学的に許容可能な担体と共に製剤化された、本発明の一つまたは複数の抗体を含む医薬組成物を提供する。
したがって、本発明の一つの目的は、０．２５ｍｇ／ｍｌ～２５０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在するこのような抗体を含む医薬製剤を提供することであり、該製剤は２．０～１０．０のｐＨを有する。製剤は、緩衝系、保存剤、等張化剤、キレート剤、安定剤、または界面活性剤、ならびにそれらの様々な組み合わせのうちの一つまたは複数をさらに含んでもよい。医薬組成物中の防腐剤、等張剤、キレート剤、安定剤および界面活性剤の使用は、当業者には周知である。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、１９ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ、１９９５を参照のこと。
一実施形態では、医薬製剤は水性製剤である。こうした製剤は典型的には溶液または懸濁液であるが、コロイド、分散剤、乳濁液、および多相材料も含み得る。用語「水性製剤」は、少なくとも５０％ｗ／ｗの水を含む製剤として定義される。同様に、「水溶液」という用語は、少なくとも５０％ｗ／ｗの水を含む溶液として定義され、「水性懸濁液」という用語は、少なくとも５０％ｗ／ｗの水を含む懸濁液として定義される。
別の実施形態では、医薬製剤は、使用前に医師または患者が溶媒および／または希釈剤を加える凍結乾燥製剤である。
さらなる態様では、医薬製剤はこのような抗体の水溶液、およびこの抗体が１ｍｇ／ｍｌ以上の濃度で存在する緩衝剤を含み、該製剤は約２．０～約１０．０のｐＨを有する。
投与
抗体などの本発明の化合物は、静脈内、筋肉内、皮下など、非経口的に投与してもよい。別の方法として、本発明の抗体は、経口的または局所的など、経口経路を介して投与されてもよい。本発明の抗体は、予防的に投与されてもよい。本発明の抗体は、（要求に応じて）治療的に投与されてもよい。
投薬量
送達される化合物の用量は、一日あたり約０．０１ｍｇ～５００ｍｇの化合物、好ましくは一日あたり約０．１ｍｇ～２５０ｍｇ、より好ましくは一日あたり約０．５ｍｇ～約２５０ｍｇであってもよく、状態の重症度に応じて、初回量および維持量として、一日、一週間、二週間、または一ヶ月に一回でもよい。適切な用量は、特定の化合物について、そのインビボ半減期または平均滞留時間およびその生物活性を含む、その化合物の特性に基づいて調整されてもよい。例えば、送達される化合物は、一実施形態では一週間に一回、または別の実施形態では一週間おきに一回、または別の実施形態では一ヶ月に一回投与されてもよく、前記実施形態のいずれかにおいて、例えば体重一ｋｇあたり０．２５、０．５、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、または１０ｍｇの用量で投与されてもよい。
本明細書に開示される化合物を含有する組成物は、予防的処置および／または一部の実施形態では治療的処置で投与することができる。治療用途では、組成物は、上述のようないかなる出血障害などの疾患に罹患している被験者に、疾患およびその合併症を治癒、緩和、または部分的に阻止するのに十分な量で投与される。これを達成するために適切な量は、「治療有効量」と定義される。当業者によって理解されるように、この目的のための有効量は、疾患または傷害の重症度、ならびに対象の体重および全身状態にかかっている。
実施形態
一実施形態では、本発明の抗体は、ＦＩＸ（配列番号１）またはその活性型（ＦＩＸａ）の残基Ｈ２５６を含むエピトープを結合することができる。
一実施形態では、本発明の抗体は、ＦＩＸ（配列番号１）またはその活性型ＦＩＸａの残基Ｈ２５７を含むエピトープを結合することができる。
一実施形態では、本発明の抗体は、ＦＩＸ（配列番号１）またはその活性型（ＦＩＸａ）の残基Ｎ２５８を含むエピトープを結合することができる。
一実施形態では、本発明の抗体は、ＦＩＸ（配列番号１）またはその活性型（ＦＩＸａ）の残基Ｋ２９３を含むエピトープを結合することができる。
一実施形態では、本発明の抗体は、ＦＩＸ（配列番号１）またはその活性型（ＦＩＸａ）の残基Ｋ３０１を含むエピトープを結合することができる。
一実施形態では、本発明の抗体は、ＦＩＸ（配列番号１）またはその活性型（ＦＩＸａ）の残基Ｄ３３２を含むエピトープを結合することができる。
一実施形態では、本発明の抗体は、ＦＩＸ（配列番号１）またはその活性型（ＦＩＸａ）の残基Ｒ３３３を含むエピトープを結合することができる。
一実施形態では、本発明の抗体は、ＦＩＸ（配列番号１）またはその活性型（ＦＩＸａ）の残基Ａ３３４を含むエピトープを結合することができる。
一実施形態では、本発明の抗体は、ＦＩＸ（配列番号１）またはその活性型（ＦＩＸａ）の残基Ｔ３３５を含むエピトープを結合することができる。
一実施形態では、本発明の抗体は、ＦＩＸ（配列番号１）またはその活性型（ＦＩＸａ）の残基Ｌ３３７を含むエピトープを結合することができる。
一実施形態では、本発明の抗体は、ＦＩＸ（配列番号１）またはその活性型（ＦＩＸａ）の残基Ｒ３３８を含むエピトープを結合することができる。
一実施形態では、本発明の抗体は、ＦＩＸ（配列番号１）またはその活性型（ＦＩＸａ）の残基Ｓ３３９を含むエピトープを結合することができる。
一実施形態では、本発明の抗体は、ＦＩＸ（配列番号１）またはその活性型（ＦＩＸａ）の残基Ｔ３４０を含むエピトープを結合することができる。
一実施形態では、本発明の抗体は、ＦＩＸ（配列番号１）またはその活性型（ＦＩＸａ）の残基Ｋ３４１を含むエピトープを結合することができる。
一実施形態では、本発明の抗体は、ＦＩＸ（配列番号１）またはその活性型（ＦＩＸａ）の残基Ｔ３４３を含むエピトープを結合することができる。
一実施形態では、本発明の抗体は、ＦＩＸ（配列番号１）またはその活性型（ＦＩＸａ）の残基Ｎ３４６を含むエピトープを結合することができる。
一実施形態では、本発明の抗体は、ＦＩＸ（配列番号１）またはその活性型（ＦＩＸａ）の残基Ｒ４０３を含むエピトープを結合することができる。
一実施形態では、本発明の抗体は、ＦＩＸ（配列番号１）またはその活性型（ＦＩＸａ）の残基Ｙ４０４を含むエピトープを結合することができる。
一実施形態では、本発明の抗体は、ＦＩＸ（配列番号１）またはその活性型（ＦＩＸａ）の残基Ｎ４０６を含むエピトープを結合することができる。
一実施形態では、本発明の抗体は、ＦＩＸ（配列番号１）またはその活性型（ＦＩＸａ）の残基Ｗ４０７を含むエピトープを結合することができる。
一実施形態では、本発明の抗体は、ＦＩＸ（配列番号１）またはその活性型（ＦＩＸａ）の残基Ｅ４１０を含むエピトープを結合することができる。
一実施形態では、本発明の抗体は、ＦＩＸ（配列番号１）またはその活性型（ＦＩＸａ）の残基Ｋ４１１を含むエピトープを結合することができる。
一実施形態では、本発明の抗体は、ＦＩＸ（配列番号１）またはその活性型（ＦＩＸａ）の残基Ｌ３３７、Ｒ３３８、Ｓ３３９、Ｔ３４０、Ｋ３４１、およびＴ３４３を含むエピトープを結合することができる。
一実施形態では、本発明の抗体は、ＦＩＸ（配列番号１）またはその活性型（ＦＩＸａ）の残基Ｋ３０１、Ｄ３３２、Ｒ３３３、Ａ３３４、Ｔ３３５、Ｒ３３８、およびＮ３４６を含むエピトープを結合することができる。
一実施形態では、本発明の抗体は、ＦＩＸ（配列番号１）またはその活性型（ＦＩＸａ）の残基Ｈ２５６、Ｈ２５７、Ｎ２５８、Ｋ２９３、Ｒ４０３、Ｙ４０４、Ｎ４０６、Ｗ４０７、Ｅ４１０、およびＫ４１１を含むエピトープを結合することができる。
一実施形態では、本発明の抗体は、ＦＩＸ（配列番号１）またはその活性型（ＦＩＸａ）を結合することができ、ここで抗体はＦＩＸへの結合についてＦａｂ７２３６と競合する。
一実施形態では、本発明の抗体は、ＦＩＸ（配列番号１）またはその活性型（ＦＩＸａ）を結合することができ、ここで抗体はＦＩＸへの結合についてＦａｂ７２３７と競合する。
一実施形態では、本発明の抗体は、ＦＩＸ（配列番号１）またはその活性型（ＦＩＸａ）を結合することができ、ここで抗体はＦＩＸへの結合についてＦａｂ７２３８と競合する。
一実施形態では、本発明の抗体は、ＦＩＸ（配列番号１）またはその活性型（ＦＩＸａ）を結合し、ここで抗体はＦａｂ７２３６と同一の「ビン」に属する。
一実施形態では、本発明の抗体は、ＦＩＸ（配列番号１）またはその活性型（ＦＩＸａ）を結合し、ここで抗体はＦａｂ７２３７と同一の「ビン」に属する。
一実施形態では、本発明の抗体は、ＦＩＸ（配列番号１）またはその活性型（ＦＩＸａ）を結合し、ここで抗体はＦａｂ７２３８と同一の「ビン」に属する。
一実施形態では、本発明の抗体は、ＦＸ（配列番号２）またはその活性型のＦＸａを結合することができ、ここで抗体はｍＡｂ１－６７２３のＣＤＲを含む抗体と競合する。
一実施形態では、本発明の抗体は、ＦＸ／ＦＸａを結合することができ、ここで抗体は配列番号２１および配列番号２２によるｍＡｂ１－６７２３の可変ドメインを含む。
一実施形態では、本発明の抗体は、ＦＸ／ＦＸａを特異的に結合することができ、ここで抗体は配列番号２１および配列番号２２によるｍＡｂ１－６７２３のＣＤＲを含む。
一実施形態では、本発明の抗体は、ＦＸ／ＦＸａを結合することができ、ここで抗体は配列番号２１および配列番号２２によるｍＡｂ１－６７２３の可変ドメインを含む、Ｆａｂと同一の「ビン」に属する。
一実施形態では、本発明の抗体は、ＦＸ／ＦＸａを特異的に結合することができ、ここで抗体は配列番号２１および配列番号２２によるｍＡｂ１－６７２３と同一の「ビン」に属する。
一実施形態では、本発明の抗体は、ＦＸ／ＦＸａを特異的に結合することができ、ここで抗体は配列番号２１および配列番号２２による抗原結合ドメインを含む抗体またはＦａｂと同一の「ビン」に属する。
一実施形態では、本発明の抗体は、ＦＸ／ＦＸａを結合することができ、ここで抗体はｍＡｂ１－１３７１のＣＤＲを含む抗体と競合する。
一実施形態では、本発明の抗体は、ＦＸ／ＦＸａを結合することができ、ここで抗体は配列番号６５および配列番号６６によるｍＡｂ１－１３７１の可変ドメインを含む。
一実施形態では、本発明の抗体は、ＦＸ／ＦＸａを結合することができ、ここで抗体は配列番号６５および配列番号６６によるｍＡｂ１－１３７１のＣＤＲを含む。
一実施形態では、本発明の抗体は、ＦＸ／ＦＸａを結合することができ、ここで抗体は配列番号６５および配列番号６６によるｍＡｂ１－１３７１の可変ドメインを含む、Ｆａｂと同一の本明細書では「ビンＡ」と呼ぶ「ビン」に属する。
一実施形態では、本発明の抗体は、ＦＸ／ＦＸａを結合することができ、ここで抗体は配列番号６５および配列番号６６によるｍＡｂ１－１３７１と同一の「ビン」に属する。
一実施形態では、本発明の抗体は、ＦＸ／ＦＸａを結合することができ、ここで抗体は配列番号６５および配列番号６６による抗原結合ドメインを含む抗体またはＦａｂと同一の「ビン」に属する。
一実施形態では、本発明の抗体は、ＦＸ／ＦＸａを特異的に結合することができ、ここで抗体はｍＡｂ１－１３７６、ｍＡｂ１－６７０５、ｍＡｂ１－７３８８またはｍＡｂ１－７５６３のＣＤＲを含む抗体と競合する。かかる抗体は、本明細書ではビンＢに属すると呼ばれる。
一実施形態では、本発明の抗体は、ＦＸ／ＦＸａを結合することができ、ここで抗体は、配列番号６７および６８、配列番号２３および２４、配列番号３９および４０、配列番号５９および６０によりそれぞれ識別されるｍＡｂ１－１３７６、ｍＡｂ１－６７０５、ｍＡｂ１－７３８８またはｍＡｂ１－７５６３の可変ドメインを含む。
一実施形態では、本発明の抗体は、ＦＸ／ＦＸａを結合することができ、ここで抗体は、配列番号６７および６８、配列番号２３および２４、配列番号３９および４０、配列番号５９および６０によりそれぞれ識別されるｍＡｂ１－１３７６、ｍＡｂ１－６７０５、ｍＡｂ１－７３８８またはｍＡｂ１－７５６３のＣＤＲを含む。
一実施形態では、本発明の抗体は、ＦＸ／ＦＸａを結合することができ、ここで抗体は、配列番号６７および６８、配列番号２３および２４、配列番号３９および４０、配列番号５９および６０によりそれぞれ識別されるｍＡｂ１－１３７６、ｍＡｂ１－６７０５、ｍＡｂ１－７３８８またはｍＡｂ１－７５６３の可変ドメインを含むＦａｂと同一の「ビン」に属する。
一実施形態では、本発明の抗体は、ＦＸ／ＦＸａを結合することができ、ここで抗体は、配列番号６７および６８、配列番号２３および２４、配列番号３９および４０、配列番号５９および６０によりそれぞれ識別されるｍＡｂ１－１３７６、ｍＡｂ１－６７０５、ｍＡｂ１－７３８８またはｍＡｂ１－７５６３と同一の「ビン」に属する。
一実施形態では、本発明の抗体は、ＦＸ／ＦＸａを結合することができ、ここで抗体は配列番号６７および６８、配列番号２３および２４、配列番号３９および４０、または配列番号５９および６０による抗原結合ドメインを含む抗体またはＦａｂと同一の「ビン」に属する。
一実施形態では、本発明の抗体は、ＦＸ／ＦＸａを結合することができ、ここで抗体は、ｍＡｂ１－６７２３、１－６７１６、１－６７２１、１－６７３０、１－６７３１、１－６７３７、１－６７５４、１－７３７８、１－７４１３、１－７４２４、１－７４６６、１－７４８１、１－７４８３、およびｍＡｂ１－７５９１からなる群から選択される抗体のＣＤＲまたは可変ドメインを含む。
一実施形態では、本発明の抗体は、ＦＸ／ＦＸａを結合することができ、ここで抗体は、ｍＡｂ１－６７２３、１－６７１６、１－６７２１、１－６７３０、１－６７３１、１－６７３７、１－６７５４、１－７３７８、１－７４１３、１－７４２４、１－７４６６、１－７４８１、１－７４８３、１－７５９１、１－７３８８、１－７５６３、１－７４６２およびｍＡｂ１－７５７１からなる群から選択される抗体のＣＤＲまたは可変ドメインを含む。
一実施形態では、本発明の抗体は、ＦＸ／ＦＸａを結合することができ、ここで抗体は、以下から選択される変数配列またはそのＣＤＲを含むｍＡｂｓ群から選択されるｍＡｂと同一の「ビン」に属する。配列番号２１および２２、配列番号２５および２６、配列番号２７および２８、配列番号２９および３０、配列番号３１および３２、配列番号３３および３４、配列番号３５および３６、配列番号３７および３８、配列番号３９および４０、配列番号４１および４２、配列番号４３および４４、配列番号４５および４６、配列番号５１および５２、配列番号５３および５４、および配列番号５５および５６、配列番号５７および５８、配列番号５９および６０、配列番号６１および６２、ならびに配列番号６３および６４。抗体のこの「ビン」は、本明細書ではビンＣと呼ばれ、ｍＡｂ１－６７２３、１－６７１６、１－６７２１、１－６７３０、１－６７３１、１－６７３７、１－６７５４、１－７３７８、１－７４１３、１－７４２４、１－７４６６、１－７４８１、１－７４８３、１－７５９１、１－７３８８、１－７５６３、１－７４６２、およびｍＡｂ１－７５７１などの多数の個別抗体で例証されている。
一実施形態では、本発明の抗体は、ＦＸ／ＦＸａを結合することができ、ここで抗体は、以下から選択される変数配列またはそのＣＤＲを含むｍＡｂｓからなる抗体群から選択される参照抗体と、ＦＸ、ＦＸ酵素前駆体、またはＦＸａへの結合を競合する。配列番号２１および２２、配列番号２５および２６、配列番号２７および２８、配列番号２９および３０、配列番号３１および３２、配列番号３３および３４、配列番号３５および３６、配列番号３７および３８、配列番号４１および４２、配列番号４３および４４、配列番号５３および５４、および配列番号５５および５６、配列番号５７および５８、ならびに配列番号６３および６４。
一実施形態では、本発明による抗体またはその抗原結合性断片は、配列番号２１および２２、配列番号２５および２６、配列番号２７および２８、配列番号２９および３０、配列番号３１および３２、配列番号３３および３４、配列番号３５および３６、配列番号３７および３８、配列番号４１および４２、配列番号４３および４４、配列番号５３および５４、配列番号５５および５６、配列番号５７および５８、または配列番号６３および６４のＣＤＲを含む抗原結合性断片とＦＸ／ＦＸａへの結合を競合する。
一実施形態では、本発明の抗体は、ＦＸ／ＦＸａを結合することができ、ここで抗体はｍＡｂ１－７４４７、１－７４４１、１－７５７１または１－７４６２のＣＤＲを含む抗体と競合する。これらは本明細書ではビンＤの抗体と呼ばれる。
一実施形態では、本発明の抗体は、ＦＸ／ＦＸａを結合することができ、ここで抗体は、それぞれ配列番号４７および４８、配列番号４５および４６、配列番号５１および５３、または配列番号６１および６２によるｍＡｂ１－７４４７、１－７４４１、１－７５７１または１－７４６２の可変ドメインを含む。
一実施形態では、本発明の抗体は、ＦＸ／ＦＸａを結合することができ、ここで抗体は、それぞれ配列番号４７および４８、配列番号４５および４６によるｍＡｂ１－７４４７または１－７４４１の可変ドメインを含む。
一実施形態では、本発明の抗体は、ＦＸ／ＦＸａを結合することができ、ここで抗体は、それぞれ配列番号４７および４８、配列番号４５および４６、配列番号５１および５３、または配列番号６１および６２によるｍＡｂ１－７４４７、１－７４４１、１－７５７１または１－７４６２のＣＤＲを含む。
一実施形態では、本発明の抗体は、配列番号２によるＦＸ／ＦＸａを結合することができ、ここで抗体は、それぞれ配列番号４７および４８、配列番号４５および４６、配列番号５１および５３、または配列番号６１および６２によるｍＡｂ１－７４４７、１－７４４１、１－７５７１またはｍＡｂ１－７４６２の可変ドメインを含むＦａｂと同一の「ビン」に属する。
一実施形態では、本発明の抗体は、ＦＸ／ＦＸａを結合することができ、ここで抗体は、それぞれ配列番号４７および４８、配列番号４５および４６、配列番号５１および５３、または配列番号６１および６２によるｍＡｂ１－７４４７、１－７４４１、１－７５７１またはｍＡｂ１－７４６２と同一の「ビン」に属する。
一実施形態では、本発明の抗体は、ＦＸ／ＦＸａを結合することができ、ここで抗体は配列番号４７および４８、配列番号４５および４６、配列番号５１および５３、または配列番号６１および６２による抗原結合ドメインを含む抗体またはＦａｂと同一の「ビン」に属する。
一実施形態では、本発明の抗体は、前述の実施形態のいずれかによる抗体であり、ここで抗体は特異的にＦＸ酵素前駆体を結合する。
このような実施形態では、抗体は、配列番号２のアミノ酸残基１～１３９、１４３～４４８によるＦＸ酵素前駆体を特異的に結合する。
一実施形態では、本発明の抗体は、前述の実施形態のいずれかによる抗体であり、ここで抗体はＦＸを結合する。
一実施形態では、本発明の抗体は、前述の実施形態のいずれかによる抗体であり、ここで抗体はＦＸａを結合する。
このような一実施形態では、抗体は、配列番号２のアミノ酸残基１～１３９、１９５～４４８によるＦＸａを特異的に結合する。
一実施形態では、抗体は単一特異性抗体である。一実施形態では、抗体は多重特異性抗体である。かかる一実施形態では、抗体は二重特異性抗体である。かかる一実施形態では、二重特異性抗体は、ＦＩＸまたはその活性型（ＦＩＸａ）およびＦＸ／ＦＸａに結合することができる。かかる一実施形態では、二重特異性抗体は、ＦＩＸ／ＦＩＸａおよびＦＸ／ＦＸａに特異的に結合することができる。
一実施形態では、抗体は、ＦＩＸ／ＦＩＸａおよびＦＸ／ＦＸａを結合することができる二重特異性抗体であり、ＦＩＸ／ＦＩＸａ結合ドメインは、ビン１の抗体に由来し、ＦＸ／ＦＸａ結合ドメインはビンＡの抗体に由来する。
一実施形態では、抗体は、ＦＩＸ／ＦＩＸａおよびＦＸ／ＦＸａを結合する二重特異性抗体であり、ＦＩＸ／ＦＩＸａ結合ドメインは、ビン２の抗体に由来し、ＦＸ／ＦＸａ結合ドメインはビンＡの抗体に由来する。
一実施形態では、抗体は、ＦＩＸ／ＦＩＸａおよびＦＸ／ＦＸａを結合する二重特異性抗体であり、ＦＩＸ／ＦＩＸａ結合ドメインは、ビン２の抗体に由来し、ＦＸ／ＦＸａ結合ドメインはビンＢの抗体に由来する。
一実施形態では、抗体はＦＩＸ／ＦＩＸａおよびＦＸ／ＦＸａを結合する二重特異性抗体であり、ＦＩＸ／ＦＩＸａ結合ドメインはＢｉｎ２の抗体に由来し、ＦＸ／ＦＸａ結合ドメインはビンＢの抗体に由来する。
一実施形態では、抗体は、ＦＩＸ／ＦＩＸａおよびＦＸ／ＦＸａを結合する二重特異性抗体であり、ＦＩＸ／ＦＩＸａ結合ドメインはビン１の抗体に由来し、ＦＸ／ＦＸａ結合ドメインはビンＣまたはＤの抗体に由来する。
一実施形態では、抗体は、ＦＩＸ／ＦＩＸａおよびＦＸ／ＦＸａを結合する二重特異性抗体であり、結合ドメインは、ｍＡｂ１－１３７１／ｍＡｂ１－１３０７、ｍＡｂ１－６７０５／ｍＡｂ１－１３０７、ｍＡｂ１－１３７１／ｍＡｂ０－１８８６、ｍＡｂ１－７４４１／ｍＡｂ０－１８８６、ｍＡｂ１－７４４７／ｍＡｂ０－１８８６、ｍＡｂ１－７４８１／ｍＡｂ０－１８８６、ｍＡｂ１－１３７１／ｍＡｂ０－１９９８、ｍＡｂ１－６７１６／ｍＡｂ０－１９９８、ｍＡｂ１－６７２３／ｍＡｂ０－１９９８、ｍＡｂ１－６７３０／ｍＡｂ０－１９９８、ｍＡｂ１－６７３１／ｍＡｂ０－１９９８、ｍＡｂ１－６７３７／ｍＡｂ０－１９９８、ｍＡｂ１－６７５４／ｍＡｂ０－１９９８、ｍＡｂ１－７３７８／ｍＡｂ０－１９９８、ｍＡｂ１－７４４１／ｍＡｂ０－１９９８、ｍＡｂ１－７４４７／ｍＡｂ０－１９９８、ｍＡｂ１－７４８１／ｍＡｂ０－１９９８、ｍＡｂ１－１３７１／ｍＡｂ１－４７０７、ｍＡｂ１－６７０５／ｍＡｂ１－４７０７、ｍＡｂ１－１３７１／ｍＡｂ１－４０７１、ｍＡｂ１－７４４１／ｍＡｂ１－５７８８、ｍＡｂ１－７４４７／ｍＡｂ１－５７８８、ｍＡｂ１－７４８１／ｍＡｂ１－５７８８、ｍＡｂ１－１３７１／ｍＡｂ１－４８５７、ｍＡｂ１－６７１６／ｍＡｂ１－４８５７、ｍＡｂ１－６７２３／ｍＡｂ１－４８５７、ｍＡｂ１－６７３０／ｍＡｂ１－４８５７、ｍＡｂ１－６７３１／ｍＡｂ１－４８５７、ｍＡｂ１－６７３７／ｍＡｂ１－４８５７、ｍＡｂ１－６７５４／ｍＡｂ１－４８５７、ｍＡｂ１－７３７８／ｍＡｂ１－４８５７、ｍＡｂ１－７４４１／ｍＡｂ１－４８５７、ｍＡｂ１－７４４７／ｍＡｂ１－４８５７またはｍＡｂ１－７４８１／ｍＡｂ１－４８５７からなるｍＡｂ対由来である。
一実施形態では、本発明の二重特異性抗体は、ＦＸに結合する抗体アームと、ＦＩＸ／ＦＩＸａに結合する抗体アームを含む。かかる一実施形態では、ＦＸに結合する抗体アームは、ＦＸの活性化ペプチドの一つまたは複数の残基を含むエピトープに結合し、ＦＩＸ／ＦＩＸａに結合する抗体アームは、ＦＩＸプロテアーゼドメインの一つまたは複数の残基を含むエピトープに結合する。
一実施形態では、本発明の抗体は、二重、または三重特異性抗体などの多重特異性抗体である。
一実施形態では、本発明の抗体は、全長ＩｇＧ４などのＩｇＧ型である。
一実施形態では、本発明の抗体は、二つのＦａｂ断片またはｓｃＦｖ断片のコンジュゲート、またはそれらの組み合わせなど、二つの抗体断片の化学的コンジュゲートである。
一実施形態では、本発明の抗体は、ヒトまたはヒト化抗体である。
一実施形態では、本明細書に開示される抗体は、二重特異性抗体の製造で使用するための中間体である。
一実施形態では、本発明は、本明細書に開示される抗体と、ＦＩＸ／ＦＩＸａへの結合について競合する抗体を含む。
本発明の抗体は、凝固障害および特に血友病Ａを有する対象を治療するために使用できる。したがって、本発明はまた、それを必要とする対象の治療のためのＦＩＸ／ＦＩＸａのプロテアーゼドメインに結合することができるモノクローナル抗体の使用、ならびにそれを必要とする対象の治療のための薬剤の製造のための該抗体の使用に関する。さらに、本発明は、ＦＩＸ／ＦＩＸａのプロテアーゼドメインに結合することができるモノクローナル抗体を用いて、それを必要とする対象を治療する方法を含む。
一実施形態では、本発明の抗体は、ＦＩＸを結合する親和性よりも高い親和性でＦＩＸａを結合することができる。
一実施形態では、本発明の抗体は、ＦＸに対するＦＩＸａの酵素活性を増加させることができる。
かかる一実施形態では、本発明の抗体は、本明細書に記載される一価ワンアームド抗体を使用したＦＸａ生成アッセイにおいて測定されるＦＸに対するＦＩＸａの酵素活性を増加させることができる。
一実施形態では、本発明の抗体は、本明細書に記載される二価抗体を使用したＦＸａ生成アッセイにおいて測定されるＦＸに対するＦＩＸａの酵素活性を増加させることができる。
一実施形態では、本発明の抗体は、以下に記載される抗ＦＩＸ抗体ＣＬＢ－ＦＩＸ １３ではない。Ｒｏｈｌｅｎａら。（２００３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８（１１）：９３９４-９４０１。一実施形態では、本発明の抗体は、抗ＦＩＸ抗体ＨＩＸ－１（ＩｇＧ１マウス）（Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ、ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ社）ではない。一実施形態では、本発明の抗体は、抗ＦＩＸ抗体ＡＨＩＸ－５０４１（ＩｇＧ１）（Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ．）ではない。
一実施形態では、本発明の抗体は、当技術分野の血液凝固抗体と比較して免疫原性が低減している。
一実施形態では、二重特異性抗体またはその抗原結合性断片は、ＦＩＸ（配列番号１）またはその活性型（ＦＩＸａ）を認識する第一の抗原結合部位、、およびＦＸ（配列番号２）またはその活性型（ＦＸａ）を認識する第二の抗原結合部位、を含み、ここで
ａ）第一の抗原結合部位は、以下のＣＤＲ配列を含み、
ＶＨ－ＣＤＲ１：ＤＹＡＭＨ
ＶＨ－ＣＤＲ２：ＧＩＳＷＲＧＤＩＩＧＹＶＤＳＶＫＧ
ＶＨ－ＣＤＲ３：ＳＹＧＳＧＳＦＹＮＡＦＤＳ
ＶＬ－ＣＤＲ１：ＲＡＳＱＳＩＳＳＷＬＡ
ＶＬ－ＣＤＲ２：ＫＡＳＲＬＤＲ
ＶＬ－ＣＤＲ３：ＬＥＹＳＳＹＩＲＴ
および
ｂ）第二の抗原結合部位は、以下のＣＤＲ配列を含み、
ＶＨ－ＣＤＲ１：ＴＳＷＩＶ
ＶＨ－ＣＤＲ２：ＭＩＤＰＳＤＳＦＴＳＹＳＰＳＦＱＧ
ＶＨ－ＣＤＲ３：ＬＨＹＹＨＳＥＥＦＤＶ
ＶＬ－ＣＤＲ１：ＲＡＳＱＳＶＳＳＳＹＬＡ
ＶＬ－ＣＤＲ２：ＧＡＳＳＲＡＲ
ＶＬ－ＣＤＲ３：ＱＱＦＧＳＳＲＬＦＴ
一実施形態では、二重特異性抗体またはその抗原結合性断片は、ＦＩＸ（配列番号１）またはその活性型（ＦＩＸａ）を認識する第一の抗原結合部位、、およびＦＸ（配列番号２）またはその活性型（ＦＸａ）を認識する第二の抗原結合部位、を含み、ここで
ａ）第一の抗原結合部位は、以下のＣＤＲ配列を含み、
ＶＨ－ＣＤＲ１：ＤＹＡＭＨ
ＶＨ－ＣＤＲ２：ＧＩＳＷＲＧＤＩＩＧＹＶＤＳＶＫＧ
ＶＨ－ＣＤＲ３：ＳＹＧＳＧＳＦＹＮＡＦＤＳ
ＶＬ－ＣＤＲ１：ＲＡＳＱＳＩＳＳＷＬＡ
ＶＬ－ＣＤＲ２：ＫＡＳＲＬＤＲ
ＶＬ－ＣＤＲ３：ＬＥＹＳＳＹＩＲＴ
および
ｂ）第二の抗原結合部位は、以下のＣＤＲ配列を含み、
ＶＨ－ＣＤＲ１：ＴＳＷＩＶ
ＶＨ－ＣＤＲ２：ＭＩＤＰＳＤＳＦＴＳＹＳＰＳＦＱＧ
ＶＨ－ＣＤＲ３：ＬＨＹＹＨＳＥＥＦＤＶ
ＶＬ－ＣＤＲ１：ＲＡＳＱＳＶＳＳＳＹＬＡ
ＶＬ－ＣＤＲ２：ＧＡＳＳＲＴＲ
ＶＬ－ＣＤＲ３：ＱＱＦＧＳＳＲＬＦＴ
本発明は以下の実施形態によってさらに説明される。
１．配列番号１による第ＩＸ因子（ＦＩＸ）またはこの活性型（ＦＩＸａ）に結合することができる抗体またはその抗原結合性断片。
２．抗体またはその抗原結合性断片が「ビン１」の一部である、実施形態１に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
３．実施形態１に記載の抗体またはその抗原結合性断片であって、抗体またはその抗原結合性断片が参照抗体と競合し、該参照抗体が、
ａ．配列番号１５によって識別された重鎖可変ドメイン、および配列番号１６によって識別された軽鎖可変ドメイン、または
ｂ．配列番号１９によって識別された重鎖可変ドメイン、および配列番号２０によって識別された軽鎖可変ドメインを含む、抗体またはその抗原結合性断片。
４．参照抗体がＦａｂである、前述の実施形態に記載の抗体。
５．抗体またはその抗原結合性断片が、
ａ．配列番号１５によって識別された配列に対し、少なくとも９０％同一である重鎖可変ドメイン、および配列番号１６によって識別された配列に対し、少なくとも９０％同一である軽鎖可変ドメイン、
ｂ．配列番号１９によって識別された配列に対し、少なくとも９０％同一である重鎖可変ドメイン、および配列番号２０によって識別された配列に対し、少なくとも９０％同一である軽鎖可変ドメイン、
ｃ．配列番号６９によって識別された配列に対し、少なくとも９０％同一である重鎖可変ドメイン、および配列番号７０によって識別された配列に対し、少なくとも９０％同一である軽鎖可変ドメイン、
ｄ．配列番号７１によって識別された配列に対し、少なくとも９０％同一である重鎖可変ドメイン、および配列番号７２によって識別された配列に対し、少なくとも９０％同一である軽鎖可変ドメイン、
ｅ．配列番号７３によって識別された配列に対し、少なくとも９０％同一である重鎖可変ドメイン、および配列番号７４によって識別された配列に対し、少なくとも９０％同一である軽鎖可変ドメイン、
ｆ．配列番号８３によって識別された配列に対し、少なくとも９０％同一である重鎖可変ドメイン、および配列番号８４によって識別された配列に対し、少なくとも９０％同一である軽鎖可変ドメイン、
ｇ．配列番号８１によって識別された配列に対し、少なくとも９０％同一である重鎖可変ドメイン、および配列番号８２によって識別された配列に対し、少なくとも９０％同一である軽鎖可変ドメイン、
ｈ．配列番号７５によって識別された配列に対し、少なくとも９０％同一である重鎖可変ドメイン、および配列番号７６によって識別された配列に対し、少なくとも９０％同一である軽鎖可変ドメイン、
ｉ．配列番号７７によって識別された配列に対し、少なくとも９０％同一である重鎖可変ドメイン、および配列番号７８によって識別された配列に対し、少なくとも９０％同一である軽鎖可変ドメイン、または
ｊ．配列番号１７７によって識別された配列に対し、少なくとも９０％同一である重鎖可変ドメイン、および配列番号１７８によって識別された配列に対し、少なくとも９０％同一である軽鎖可変ドメインを含む、前述の実施形態のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
６．重鎖可変ドメインで、識別された配列番号に対して少なくとも９２％、９４％、９６％または９８％同一である、実施形態５に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
７．軽鎖可変ドメインで、識別された配列番号に対して少なくとも９２％、９４％、９６％または９８％同一である、実施形態５に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
８．重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインの両方で、識別された配列番号に対して少なくとも９２％、９４％、９６％または９８％同一である、実施形態６および７に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
９．抗体またはその抗原結合性断片が、
ａ．
ｉ．配列番号１５によって識別された重鎖可変ドメインのＣＤＲ配列と比較して、最大で１０個のアミノ酸変化を有する三つの重鎖ＣＤＲ配列、および
ｉｉ．配列番号１６によって識別された軽鎖可変ドメインのＣＤＲ配列と比較して、最大で１０個のアミノ酸変化を有する三つの軽鎖ＣＤＲ配列、
ｂ．
ｉ．配列番号１９によって識別された重鎖可変ドメインのＣＤＲ配列と比較して、最大で１０個のアミノ酸変化を有する三つの重鎖ＣＤＲ配列、および
ｉｉ．配列番号２０によって識別された軽鎖可変ドメインのＣＤＲ配列と比較して、最大で１０個のアミノ酸変化を有する三つの軽鎖ＣＤＲ配列、
ｃ．
ｉ．配列番号６９によって識別された重鎖可変ドメインのＣＤＲ配列と比較して、最大で１０個のアミノ酸変化を有する三つの重鎖ＣＤＲ配列、および
ｉｉ．配列番号７０によって識別された軽鎖可変ドメインのＣＤＲ配列と比較して、最大で１０個のアミノ酸変化を有する三つの軽鎖ＣＤＲ配列、
ｄ．
ｉ．配列番号７１によって識別された重鎖可変ドメインのＣＤＲ配列と比較して、最大で１０個のアミノ酸変化を有する三つの重鎖ＣＤＲ配列、および
ｉｉ．配列番号７２によって識別された軽鎖可変ドメインのＣＤＲ配列と比較して、最大で１０個のアミノ酸変化を有する三つの軽鎖ＣＤＲ配列、
ｅ．
ｉ．配列番号７３によって識別された重鎖可変ドメインのＣＤＲ配列と比較して、最大で１０個のアミノ酸変化を有する三つの重鎖ＣＤＲ配列、および
ｉｉ．配列番号７４によって識別された軽鎖可変ドメインのＣＤＲ配列と比較して、最大で１０個のアミノ酸変化を有する三つの軽鎖ＣＤＲ配列、
ｆ．
ｉ．配列番号８３によって識別された重鎖可変ドメインのＣＤＲ配列と比較して、最大で１０個のアミノ酸変化を有する三つの重鎖ＣＤＲ配列、および
ｉｉ．配列番号８４によって識別された軽鎖可変ドメインのＣＤＲ配列と比較して、最大で１０個のアミノ酸変化を有する三つの軽鎖ＣＤＲ配列、
ｇ．
ｉ．配列番号８１によって識別された重鎖可変ドメインのＣＤＲ配列と比較して、最大で１０個のアミノ酸変化を有する三つの重鎖ＣＤＲ配列、および
ｉｉ．配列番号８２によって識別された軽鎖可変ドメインのＣＤＲ配列と比較して、最大で１０個のアミノ酸変化を有する三つの軽鎖ＣＤＲ配列、
ｈ．
ｉ．配列番号７５によって識別された重鎖可変ドメインのＣＤＲ配列と比較して、最大で１０個のアミノ酸変化を有する三つの重鎖ＣＤＲ配列、および
ｉｉ．配列番号７６によって識別された軽鎖可変ドメインのＣＤＲ配列と比較して、最大で１０個のアミノ酸変化を有する三つの軽鎖ＣＤＲ配列、または
ｉ．
ｉ．配列番号７７によって識別された重鎖可変ドメインのＣＤＲ配列と比較して、最大で１０個のアミノ酸変化を有する三つの重鎖ＣＤＲ配列、および
ｉｉ．配列番号７８により識別された軽鎖可変ドメインのＣＤＲ配列と比較して、最大で１０個のアミノ酸変化を有する三つの軽鎖ＣＤＲ配列、または
ｊ．
ｉ．配列番号１７７により識別された重鎖可変ドメインのＣＤＲ配列と比較して、最大で１０個のアミノ酸変化を有する三つの重鎖ＣＤＲ配列、および
ｉｉ．配列番号１７８によって識別された軽鎖可変ドメインのＣＤＲ配列と比較して、最大で１０個のアミノ酸変化を有する三つの軽鎖ＣＤＲ配列を含む、前述の実施形態のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
１０．三つの重鎖ＣＤＲ配列が、識別された配列番号のＣＤＲと比較して、８、７、６個などの最大で９個のアミノ酸変化を有する、実施形態９に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
１１．三つの重鎖ＣＤＲ配列が、識別された配列番号のＣＤＲと比較して、４、３、２個などの最大で５個、または最大で１個のアミノ酸変化を有する、実施形態９に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
１２．三つの軽鎖ＣＤＲ配列が、識別された配列番号のＣＤＲと比較して、８、７、６個などの最大で９個のアミノ酸変化を有する、実施形態９に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
１３．三つの軽鎖ＣＤＲ配列が、識別された配列番号のＣＤＲと比較して、４、３、２個などの最大で５個、または最大で１個のアミノ酸変化を有する、実施形態９に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
１４．抗体またはその抗原結合性断片が、
ａ．配列番号１５によって識別された重鎖可変ドメインのＣＤＲ配列、および配列番号１６によって識別された軽鎖可変ドメインのＣＤＲ配列、または
ｂ．配列番号１９によって識別された重鎖可変ドメインのＣＤＲ配列、および配列番号２０によって識別された軽鎖可変ドメインのＣＤＲ配列、または
ｃ．配列番号３によって識別された重鎖可変ドメインのＣＤＲ配列、および配列番号４によって識別された軽鎖可変ドメインのＣＤＲ配列、または
ｄ．配列番号１０９によって識別された重鎖可変ドメインのＣＤＲ配列、および配列番号１１０によって識別された軽鎖可変ドメインのＣＤＲ配列、または
ｅ．配列番号１５３によって識別された重鎖可変ドメインのＣＤＲ配列、および配列番号１５４によって識別された軽鎖可変ドメインのＣＤＲ配列、または
ｆ．配列番号１７１によって識別された重鎖可変ドメインのＣＤＲ配列、および配列番号１７２によって識別された軽鎖可変ドメインのＣＤＲ配列、または
ｇ．配列番号１７７によって識別された重鎖可変ドメインのＣＤＲ配列、および配列番号１７８によって識別された軽鎖可変ドメインのＣＤＲ配列、または
ｈ．配列番号１８７によって識別された重鎖可変ドメインのＣＤＲ配列、および配列番号１８８によって識別された軽鎖可変ドメインのＣＤＲ配列を含む、前述の実施形態のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
１５．抗体またはその抗原結合性断片が、
ａ．配列番号１５によって識別された重鎖可変ドメイン、および配列番号１６によって識別された軽鎖可変ドメイン、または
ｂ．配列番号１９によって識別された重鎖可変ドメイン、および配列番号２０によって識別された軽鎖可変ドメイン、または
ｃ．配列番号３によって識別された重鎖可変ドメイン、および配列番号４によって識別された軽鎖可変ドメイン、または
ｄ．配列番号１０９によって識別された重鎖可変ドメイン、および配列番号１１０によって識別された軽鎖可変ドメイン、または
ｅ．配列番号１５３によって識別された重鎖可変ドメイン、および配列番号１５４によって識別された軽鎖可変ドメイン、または
ｆ．配列番号１７１によって識別された重鎖可変ドメイン、および配列番号１７２によって識別された軽鎖可変ドメイン、または
ｇ．配列番号１７７によって識別された重鎖可変ドメイン、および配列番号１７８によって識別された軽鎖可変ドメイン、または
ｈ．配列番号１８７によって識別された重鎖可変ドメイン、および配列番号１８８によって識別された軽鎖可変ドメインを含む、前述の実施形態のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
１６．抗体またはその抗原結合性断片が、配列番号１のアミノ酸残基Ｌ３３７、Ｒ３３８、Ｓ３３９、Ｔ３４０、Ｋ３４１およびＴ３４３のうちの一つまたは複数を含むエピトープを結合することができる、前述の実施形態のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
１７．抗体またはその抗原結合性断片が、配列番号１のアミノ酸残基Ｒ３３８を含むエピトープを結合することができる、前述の実施形態のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
１８．抗体またはその抗原結合性断片が、配列番号１のアミノ酸残基Ｒ３３８およびＫ３４１を含むエピトープを結合することができる、前述の実施形態のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
１９．抗体またはその抗原結合性断片が、配列番号１のアミノ酸残基Ｌ３３７、Ｒ３３８、Ｓ３３９、Ｔ３４０、Ｋ３４１およびＴ３４３のうちの二つまたは三つを含むエピトープを結合することができる、前述の実施形態のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
２０．抗体またはその抗原結合性断片が、配列番号１のアミノ酸残基Ｌ３３７、Ｒ３３８、Ｓ３３９、Ｔ３４０、Ｋ３４１およびＴ３４３のうちの四つまたは五つを含むエピトープを結合することができる、前述の実施形態のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
２１．抗体またはその抗原結合性断片が、配列番号１の
ａ．Ｒ３３８、Ｓ３３９、Ｔ３４０、Ｋ３４１およびＴ３４３、
ｂ．Ｌ３３７、Ｓ３３９、Ｔ３４０、Ｋ３４１およびＴ３４３、
ｃ．Ｌ３３７、Ｒ３３８、Ｔ３４０、Ｋ３４１およびＴ３４３、
ｄ．Ｌ３３７、Ｒ３３８、Ｓ３３９、Ｋ３４１およびＴ３４３、
ｅ．Ｌ３３７、Ｒ３３８、Ｓ３３９、Ｔ３４０およびＴ３４３または
ｆ．Ｌ３３７、Ｒ３３８、Ｓ３３９、Ｔ３４０およびＫ３４１
を含むエピトープを結合することができる、前述の実施形態のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
２２．抗体またはその抗原結合性断片が、配列番号１のアミノ酸残基Ｌ３３７、Ｒ３３８、Ｓ３３９、Ｔ３４０、Ｋ３４１およびＴ３４３を含むエピトープを結合することができる、前述の実施形態のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
２３．抗体またはその抗原結合性断片が、配列番号１のアミノ酸残基Ｋ３０１、Ｄ３３２、Ｒ３３３、Ａ３３４、Ｔ３３５、Ｒ３３８およびＮ３４６のうちの一つまたは複数を含むエピトープを結合することができる、前述の実施形態のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
２４．抗体またはその抗原結合性断片が、配列番号１のアミノ酸残基Ｌ３３７、Ｒ３３８、Ｓ３３９、Ｔ３４０、Ｋ３４１およびＴ３４３を含むエピトープを結合することができる、前述の実施形態のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
２５．抗体またはその抗原結合性断片が、配列番号１のアミノ酸残基Ｋ３０１、Ｄ３３２、Ｒ３３３、Ａ３３４、Ｔ３３５、Ｒ３３８およびＮ３４６のうちの二つまたは三つを含むエピトープを結合することができる、前述の実施形態のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
２６．抗体またはその抗原結合性断片が、配列番号１のアミノ酸残基Ｋ３０１、Ｄ３３２、Ｒ３３３、Ａ３３４、Ｔ３３５、Ｒ３３８およびＮ３４６のうちの四つまたは五つを含むエピトープを結合することができる、前述の実施形態のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
２７．抗体またはその抗原結合性断片が、配列番号１のアミノ酸残基Ｋ３０１、Ｄ３３２、Ｒ３３３、Ａ３３４、Ｔ３３５、Ｒ３３８およびＮ３４６のうちの五つまたは六つを含むエピトープを結合することができる、前述の実施形態のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
２８．抗体またはその抗原結合性断片が、配列番号１の
ａ．Ｄ３３２、Ｒ３３３、Ａ３３４、Ｔ３３５、Ｒ３３８およびＮ３４６
ｂ．Ｋ３０１、Ｒ３３３、Ａ３３４、Ｔ３３５、Ｒ３３８およびＮ３４６
ｃ．Ｋ３０１、Ｄ３３２、Ａ３３４、Ｔ３３５、Ｒ３３８およびＮ３４６
ｄ．Ｋ３０１、Ｄ３３２、Ｒ３３３、Ｔ３３５、Ｒ３３８およびＮ３４６
ｅ．Ｋ３０１、Ｄ３３２、Ｒ３３３、Ａ３３４、Ｒ３３８およびＮ３４６
ｆ．Ｋ３０１、Ｄ３３２、Ｒ３３３、Ａ３３４、Ｔ３３５およびＮ３４６または
ｇ．Ｋ３０１、Ｄ３３２、Ｒ３３３、Ａ３３４、Ｔ３３５およびＲ３３８
を含むエピトープを結合することができる、前述の実施形態のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
２９．抗体またはその抗原結合性断片が、配列番号１のアミノ酸残基Ｄ３３２、Ｒ３３３、Ｌ３３７およびＲ３３８を含むエピトープを結合することができる、前述の実施形態のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
３０．抗体またはその抗原結合性断片が、配列番号１のアミノ酸残基Ｋ３０１、Ｄ３３２、Ｒ３３３、Ａ３３４、Ｔ３３５、Ｒ３３８およびＮ３４６を含むエピトープを結合することができる、前述の実施形態のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
３１．抗体またはその抗原結合性断片が「ビン２」に属する、実施形態１に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
３２．抗体またはその抗原結合性断片が参照抗体と競合し、参照抗体は配列番号１７の配列によって識別された重鎖可変ドメインと、配列番号１８の配列によって識別された軽鎖可変ドメインとを含む、実施形態１に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
３３．参照抗体がＦａｂである、前述の実施形態に記載の抗体。
３４．抗体またはその抗原結合性断片が、
ａ．配列番号１７によって識別された配列に対し、少なくとも９０％同一である重鎖可変ドメイン、および配列番号１８によって識別された配列に対し、少なくとも９０％同一である軽鎖可変ドメイン、
ｂ．配列番号８５によって識別された配列に対し、少なくとも９０％同一である重鎖可変ドメイン、および配列番号８６によって識別された配列に対し、少なくとも９０％同一である軽鎖可変ドメイン、または
ｃ．配列番号７９によって識別された配列に対し、少なくとも９０％同一である重鎖可変ドメイン、および配列番号８０によって識別された配列に対し、少なくとも９０％同一である軽鎖可変ドメインを含む、前述の実施形態のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
３５．重鎖可変ドメインで、識別された配列番号に対して少なくとも９２％、９４％、９６％または９８％同一である、実施形態３４に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
３６．軽鎖可変ドメインで、識別された配列番号に対して少なくとも９２％、９４％、９６％または９８％同一である、実施形態３４に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
３７．重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインの両方で、識別された配列番号に対して少なくとも９２％、９４％、９６％または９８％同一である、実施形態３５および３６に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
３８．抗体またはその抗原結合性断片が、
ａ．
ｉ．配列番号１７によって識別された重鎖可変ドメインのＣＤＲ配列と比較して、最大で１０個のアミノ酸変化を有する三つの重鎖ＣＤＲ配列、および
ｉｉ．配列番号１８によって識別された軽鎖可変ドメインのＣＤＲ配列と比較して、最大で１０個のアミノ酸変化を有する三つの軽鎖ＣＤＲ配列、
ｂ．
ｉ．配列番号８５によって識別された重鎖可変ドメインのＣＤＲ配列と比較して、最大で１０個のアミノ酸変化を有する三つの重鎖ＣＤＲ配列、および
ｉｉ．配列番号８６によって識別された軽鎖可変ドメインのＣＤＲ配列と比較して、最大で１０個のアミノ酸変化を有する三つの軽鎖ＣＤＲ配列、または
ｃ．
ｉ．配列番号７９によって識別された重鎖可変ドメインのＣＤＲ配列と比較して、最大で１０個のアミノ酸変化を有する三つの重鎖ＣＤＲ配列、および
ｉｉ．配列番号８０によって識別された軽鎖可変ドメインのＣＤＲ配列と比較して、最大で１０個のアミノ酸変化を有する三つの軽鎖ＣＤＲ配列を含む、前述の実施形態のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
３９．三つの重鎖ＣＤＲ配列が、識別された配列番号のＣＤＲと比較して、８、７、６個などの最大で９個のアミノ酸変化を有する、実施形態３８に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
４０．三つの重鎖ＣＤＲ配列が、識別された配列番号のＣＤＲと比較して、４、３、２個などの最大で５個、または最大で１個のアミノ酸変化を有する、実施形態３８に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
４１．三つの軽鎖ＣＤＲ配列が、識別された配列番号のＣＤＲと比較して、８、７、６個などの最大で９個のアミノ酸変化を有する、実施形態３８に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
４２．三つの軽鎖ＣＤＲ配列が、識別された配列番号のＣＤＲと比較して、４、３、２個などの最大で５個、または最大で１個のアミノ酸変化を有する、実施形態３８に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
４３．抗体またはその抗原結合性断片が、
ａ．配列番号１７によって識別された重鎖可変ドメインのＣＤＲ配列と、
配列番号１８によって識別された軽鎖可変ドメインのＣＤＲ配列とを含む、前述の実施形態のいずれかに記載の抗体または抗原結合性断片。
４４．抗体またはその抗原結合性断片が、
ａ．配列番号１７によって識別された重鎖可変ドメイン、および配列番号１８によって識別された軽鎖可変ドメインを含む、前述の実施形態のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
４５．抗体またはその抗原結合性断片が、配列番号１のアミノ酸残基Ｈ２５６、Ｈ２５７、Ｎ２５８、Ｋ２９３、Ｒ４０３、Ｙ４０４、Ｎ４０６、Ｗ４０７、Ｅ４１０およびＫ４１１のうちの一つまたは複数を含むエピトープを結合することができる、前述の実施形態のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
４６．抗体またはその抗原結合性断片が、配列番号１アミノ酸残基Ｈ２５６、Ｈ２５７、Ｎ２５８、Ｋ２９３、Ｒ４０３、Ｙ４０４、Ｎ４０６、Ｗ４０７、Ｅ４１０およびＫ４１１を含むエピトープを結合することができる、前述の実施形態のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
４７．抗体またはその抗原結合性断片が、配列番号１のアミノ酸残基Ｈ２５６、Ｈ２５７、Ｎ２５８、Ｋ２９３、Ｒ４０３、Ｙ４０４、Ｎ４０６、Ｗ４０７、Ｅ４１０およびＫ４１１のうちの二つ、三つ、または四つを含むエピトープを結合することができる、前述の実施形態のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
４８．抗体またはその抗原結合性断片が、配列番号１のアミノ酸残基Ｈ２５６、Ｈ２５７、Ｎ２５８、Ｋ２９３、Ｒ４０３、Ｙ４０４、Ｎ４０６、Ｗ４０７、Ｅ４１０およびＫ４１１のうちの五つ、六つ、または七つを含むエピトープを結合することができる、前述の実施形態のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
４９．抗体またはその抗原結合性断片が、配列番号１のアミノ酸残基Ｈ２５６、Ｈ２５７、Ｎ２５８、Ｋ２９３、Ｒ４０３、Ｙ４０４、Ｎ４０６、Ｗ４０７、Ｅ４１０およびＫ４１１のうちの八つ、九つ、または十を含むエピトープを結合することができる、前述の実施形態のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
５０．抗体またはその抗原結合性断片が、配列番号１のアミノ酸残基
ａ．Ｈ２５７、Ｎ２５８、Ｋ２９３、Ｒ４０３、Ｙ４０４、Ｎ４０６、Ｗ４０７、Ｅ４１０およびＫ４１１、
ｂ．Ｈ２５６、Ｎ２５８、Ｋ２９３、Ｒ４０３、Ｙ４０４、Ｎ４０６、Ｗ４０７、Ｅ４１０およびＫ４１１、
ｃ．Ｈ２５６、Ｈ２５７、Ｋ２９３、Ｒ４０３、Ｙ４０４、Ｎ４０６、Ｗ４０７、Ｅ４１０およびＫ４１１、
ｄ．Ｈ２５６、Ｈ２５７、Ｎ２５８、Ｒ４０３、Ｙ４０４、Ｎ４０６、Ｗ４０７、Ｅ４１０およびＫ４１１、
ｅ．Ｈ２５６、Ｈ２５７、Ｎ２５８、Ｋ２９３、Ｙ４０４、Ｎ４０６、Ｗ４０７、Ｅ４１０およびＫ４１１、
ｆ．Ｈ２５６、Ｈ２５７、Ｎ２５８、Ｋ２９３、Ｒ４０３、Ｎ４０６、Ｗ４０７、Ｅ４１０およびＫ４１１、
ｇ．Ｈ２５６、Ｈ２５７、Ｎ２５８、Ｋ２９３、Ｒ４０３、Ｙ４０４、Ｗ４０７、Ｅ４１０およびＫ４１１、
ｈ．Ｈ２５６、Ｈ２５７、Ｎ２５８、Ｋ２９３、Ｒ４０３、Ｙ４０４、Ｎ４０６、Ｅ４１０およびＫ４１１、
ｉ．Ｈ２５６、Ｈ２５７、Ｎ２５８、Ｋ２９３、Ｒ４０３、Ｙ４０４、Ｎ４０６、Ｗ４０７およびＫ４１１または
ｊ．Ｈ２５６、Ｈ２５７、Ｎ２５８、Ｋ２９３、Ｒ４０３、Ｙ４０４、Ｎ４０６、Ｗ４０７およびＥ４１０
を含むエピトープを結合することができる、前述の実施形態のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
５１．抗体またはその抗原結合性断片が、配列番号１のアミノ酸残基Ｈ２５６、Ｈ２５７、Ｎ２５８、Ｋ２９３、Ｒ４０３、Ｙ４０４、Ｎ４０６、Ｗ４０７、Ｅ４１０およびＫ４１１を含むエピトープを結合することができる、前述の実施形態のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
５２．抗体またはその抗原結合性断片が、配列番号１のアミノ酸残基Ｈ２５７、Ｋ２９３およびＮ４０６を含むエピトープを結合することができる、前述の実施形態のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
５３．抗体が血液凝固抗体である、前述の実施形態のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
５４．抗体またはその抗原結合性断片が、ＦＩＸａの血液凝固活性を増加させることができる、前述の実施形態のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
５５．抗体が、ＦＸに対するＦＩＸａの酵素活性を増加させることができる、前述の実施形態のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
５６．抗体がＦＶＩＩＩおよび／またはＦＶＩＩＩａを機能的に置換することができる、前述の実施形態のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
５７．ＦＸ（配列番号２）またはその活性型（ＦＩＸａ）に結合することができる抗体またはその抗原結合性断片。
５８．抗体またはその抗原結合性断片が「ビンＡ」の一部である、実施形態５７に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
５９．抗体またはその抗原結合性断片が参照抗体と競合し、参照抗体は配列番号６５によって識別された重鎖可変ドメインと、配列番号６６によって識別された軽鎖可変ドメインとを含む、実施形態５７に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
６０．参照抗体がＦａｂである、前述の実施形態に記載の抗体。
６１．抗体またはその抗原結合性断片が、ＦＸ／ＦＸａのアミノ酸残基Ｈ１０１、Ｅ１０３、Ｒ１１３、Ｔ１１６、Ｌ１１７、Ａ１１８、Ｔ１２７、Ｓ２２７、Ｅ２２８、Ｆ２２９、Ｙ２３０、Ｅ２６６、Ｒ２８７、Ｌ３０３、Ｐ３０４、Ｅ３０５、Ｌ４１９、Ｋ４２０、Ｄ４２３、Ｒ４２４、Ｍ４２６、Ｋ４２７およびＴ４２８のうちの一つまたは複数を含むエピトープを結合することができる、前述の実施形態のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
６２．抗体またはその抗原結合性断片が、ＦＸ／ＦＸａのアミノ酸残基Ｈ１０１、Ｅ１０３、Ｒ１１３、Ｔ１１６、Ｌ１１７、Ａ１１８、Ｔ１２７、Ｓ２２７、Ｅ２２８、Ｆ２２９、Ｙ２３０、Ｅ２６６、Ｒ２８７、Ｐ３０４、Ｌ３０３、Ｐ３０４、Ｅ３０５、Ｌ４１９、Ｋ４２０、Ｄ４２３、Ｒ４２４、Ｍ４２６、Ｋ４２７およびＴ４２８を含むエピトープを結合することができる、前述の実施形態のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
６３．抗体またはその抗原結合性断片が、ＦＸ／ＦＸａのアミノ酸残基Ｒ１１３、Ｙ２３０、Ｋ４２０ Ｄ４２３、Ｒ４２４およびＫ４２７のうちの一つまたは複数を含むエピトープを結合することができる、前述の実施形態のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
６４．抗体またはその抗原結合性断片が、ＦＸ／ＦＸａのアミノ酸残基Ｒ１１３、Ｙ２３０、Ｋ４２０ Ｄ４２３、Ｒ４２４およびＫ４２７を含むエピトープを結合することができる、前述の実施形態のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
６５．抗体またはその抗原結合性断片が、配列番号６５によって識別された配列と少なくとも９０％同一の重鎖可変ドメインと、配列番号６６によって識別された配列と少なくとも９０％同一の軽鎖可変ドメインとを含む、前述の実施形態のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
６６．重鎖可変ドメインで、識別された配列番号に対して少なくとも９２％、９４％、９６％または９８％同一である、実施形態６５に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
６７．軽鎖可変ドメインで、識別された配列番号に対して少なくとも９２％、９４％、９６％または９８％同一である、実施形態６５に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
６８．重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインの両方で、識別された配列番号に対して少なくとも９２％、９４％、９６％または９８％同一である、実施形態６６および６７に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
６９．抗体またはその抗原結合性断片が、
ａ．配列番号６５によって識別された重鎖可変ドメインのＣＤＲ配列と比較して、最大で１０個のアミノ酸変化を有する三つの重鎖ＣＤＲ配列、および
ｂ．配列番号６６によって識別された軽鎖可変ドメインのＣＤＲ配列と比較して、最大で１０個のアミノ酸変化を有する三つの軽鎖ＣＤＲ配列を含む、前述の実施形態のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
７０．三つの重鎖ＣＤＲ配列が、識別された配列番号のＣＤＲと比較して、８、７、６個などの最大で９個のアミノ酸変化を有する、実施形態６９に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
７１．三つの重鎖ＣＤＲ配列が、識別された配列番号のＣＤＲと比較して、４、３、２個などの最大で５個、または最大で１個のアミノ酸変化を有する、実施形態６９に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
７２．三つの軽鎖ＣＤＲ配列が、識別された配列番号のＣＤＲと比較して、８、７、６個などの最大で９個のアミノ酸変化を有する、実施形態６９に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
７３．三つの軽鎖ＣＤＲ配列が、識別された配列番号のＣＤＲと比較して、４、３、２個などの最大で５個、または最大で１個のアミノ酸変化を有する、実施形態６９に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
７４．抗体またはその抗原結合性断片が、配列番号６５によって識別された重鎖可変ドメインのＣＤＲ配列と、配列番号６６によって識別された軽鎖可変ドメインのＣＤＲ配列とを含む、前述の実施形態のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
７５．抗体またはその抗原結合性断片が、配列番号６５によって識別された重鎖可変ドメインと、配列番号６６によって識別された軽鎖可変ドメインとを含む、前述の実施形態のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
７６．抗体またはその抗原結合性断片が「ビンＢ」の一部である、実施形態５７に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
７７．抗体またはその抗原結合性断片が参照抗体と競合し、参照抗体は配列番号６７によって識別された重鎖可変ドメインと、配列番号６８によって識別された軽鎖可変ドメインとを含む、実施形態５７に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
７８．参照抗体がＦａｂである、前述の実施形態に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
７９．抗体またはその抗原結合性断片が、
ａ．配列番号６７によって識別された配列に対し、少なくとも９０％同一である重鎖可変ドメイン、および配列番号６８によって識別された配列に対し、少なくとも９０％同一である軽鎖可変ドメイン、
ｂ．配列番号２３によって識別された配列に対し、少なくとも９０％同一である重鎖可変ドメイン、および配列番号２４によって識別された配列に対し、少なくとも９０％同一である軽鎖可変ドメイン、
ｃ．配列番号３９によって識別された配列に対し、少なくとも９０％同一である重鎖可変ドメイン、および配列番号４０によって識別された配列に対し、少なくとも９０％同一である軽鎖可変ドメイン、または
ｄ．配列番号５９によって識別された配列に対し、少なくとも９０％同一である重鎖可変ドメイン、および配列番号６０によって識別された配列に対し、少なくとも９０％同一である軽鎖可変ドメインを含む、前述の実施形態のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
８０．重鎖可変ドメインで、識別された配列番号に対して少なくとも９２％、９４％、９６％または９８％同一である、実施形態７９に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
８１．軽鎖可変ドメインで、識別された配列番号に対して少なくとも９２％、９４％、９６％または９８％同一である、実施形態７９に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
８２．重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインの両方で、識別された配列番号に対して少なくとも９２％、９４％、９６％または９８％同一である、実施形態８０および８１に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
８３．抗体またはその抗原結合性断片が、
ａ．
ｉ．配列番号６７によって識別された重鎖可変ドメインのＣＤＲ配列と比較して、最大で１０個のアミノ酸変化を有する三つの重鎖ＣＤＲ配列、および
ｉｉ．配列番号６８によって識別された軽鎖可変ドメインのＣＤＲ配列と比較して、最大で１０個のアミノ酸変化を有する三つの軽鎖ＣＤＲ配列、
ｂ．
ｉ．配列番号２３によって識別された重鎖可変ドメインのＣＤＲ配列と比較して、最大で１０個のアミノ酸変化を有する三つの重鎖ＣＤＲ配列、および
ｉｉ．配列番号２４によって識別された軽鎖可変ドメインのＣＤＲ配列と比較して、最大で１０個のアミノ酸変化を有する三つの軽鎖ＣＤＲ配列、
ｃ．
ｉ．配列番号３９によって識別された重鎖可変ドメインのＣＤＲ配列と比較して、最大で１０個のアミノ酸変化を有する三つの重鎖ＣＤＲ配列、および
ｉｉ．配列番号４０によって識別された軽鎖可変ドメインのＣＤＲ配列と比較して、最大で１０個のアミノ酸変化を有する三つの軽鎖ＣＤＲ配列、または
ｄ．
ｉ．配列番号５９によって識別された重鎖可変ドメインのＣＤＲ配列と比較して、最大で１０個のアミノ酸変化を有する三つの重鎖ＣＤＲ配列、および
ｉｉ．配列番号６０によって識別された軽鎖可変ドメインのＣＤＲ配列と比較して、最大で１０個のアミノ酸変化を有する三つの軽鎖ＣＤＲ配列を含む、前述の実施形態のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
８４．三つの重鎖ＣＤＲ配列が、識別された配列番号のＣＤＲと比較して、８、７、６個などの最大で９個のアミノ酸変化を有する、実施形態８３に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
８５．三つの重鎖ＣＤＲ配列が、識別された配列番号のＣＤＲと比較して、４、３、２個などの最大で５個、または最大で１個のアミノ酸変化を有する、実施形態８３に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
８６．三つの軽鎖ＣＤＲ配列が、識別された配列番号のＣＤＲと比較して、８、７、６個などの最大で９個のアミノ酸変化を有する、実施形態８３に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
８７．三つの軽鎖ＣＤＲ配列が、識別された配列番号のＣＤＲと比較して、４、３、２個などの最大で５個、または最大で１個のアミノ酸変化を有する、実施形態８３に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
８８．抗体またはその抗原結合性断片が、
ａ．配列番号６７によって識別された重鎖可変ドメインのＣＤＲ配列、および配列番号６８によって識別された軽鎖可変ドメインのＣＤＲ配列を含む、前述の実施形態のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
ｂ．配列番号２３によって識別された重鎖可変ドメインのＣＤＲ配列、および配列番号２４によって識別された軽鎖可変ドメインのＣＤＲ配列を含む、前述の実施形態のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
ｃ．配列番号３９によって識別された重鎖可変ドメインのＣＤＲ配列、および配列番号４０によって識別された軽鎖可変ドメインのＣＤＲ配列、または
ｄ．配列番号５９によって識別された重鎖可変ドメインのＣＤＲ配列、および配列番号６０によって識別された軽鎖可変ドメインのＣＤＲ配列を含む、前述の実施形態のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
８９．抗体またはその抗原結合性断片が、
ａ．配列番号６７によって識別された重鎖可変ドメイン、および配列番号６８によって識別された軽鎖可変ドメイン、
ｂ．配列番号２３によって識別された重鎖可変ドメイン、および配列番号２４によって識別された軽鎖可変ドメイン、
ｃ．配列番号３９によって識別された重鎖可変ドメイン、および配列番号４０によって識別された軽鎖可変ドメイン、または
ｄ．配列番号５９によって識別された重鎖可変ドメイン、および配列番号６０によって識別された軽鎖可変ドメインを含む、前述の実施形態のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
９０．抗体またはその抗原結合性断片が「ビンＣ」の一部である、実施形態５７に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
９１．抗体またはその抗原結合性断片が参照抗体と競合し、参照抗体は配列番号２１によって識別された重鎖可変ドメインと、配列番号２２によって識別された軽鎖可変ドメインとを含む、実施形態５７に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
９２．参照抗体がＦａｂである、前述の実施形態に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
９３．抗体またはその抗原結合性断片が、
ａ．配列番号２１によって識別された配列に対し、少なくとも９０％同一である重鎖可変ドメイン、および配列番号２２によって識別された配列に対し、少なくとも９０％同一である軽鎖可変ドメイン、
ｂ．配列番号２５によって識別された配列に対し、少なくとも９０％同一である重鎖可変ドメイン、および配列番号２６によって識別された配列に対し、少なくとも９０％同一である軽鎖可変ドメイン、
ｃ．配列番号２７によって識別された配列に対し、少なくとも９０％同一である重鎖可変ドメイン、および配列番号２８によって識別された配列に対し、少なくとも９０％同一である軽鎖可変ドメイン、
ｄ．配列番号２９によって識別された配列に対し、少なくとも９０％同一である重鎖可変ドメイン、および配列番号３０によって識別された配列に対し、少なくとも９０％同一である軽鎖可変ドメイン、
ｅ．配列番号３１によって識別された配列に対し、少なくとも９０％同一である重鎖可変ドメイン、および配列番号３２によって識別された配列に対し、少なくとも９０％同一である軽鎖可変ドメイン、
ｆ．配列番号３３によって識別された配列に対し、少なくとも９０％同一である重鎖可変ドメイン、および配列番号３４によって識別された配列に対し、少なくとも９０％同一である軽鎖可変ドメイン、
ｇ．配列番号３５によって識別された配列に対し、少なくとも９０％同一である重鎖可変ドメイン、および配列番号３６によって識別された配列に対し、少なくとも９０％同一である軽鎖可変ドメイン、
ｈ．配列番号３７によって識別された配列に対し、少なくとも９０％同一である重鎖可変ドメイン、および配列番号３８によって識別された配列に対し、少なくとも９０％同一である軽鎖可変ドメイン、
ｉ．配列番号３９によって識別された配列に対し、少なくとも９０％同一である重鎖可変ドメイン、および配列番号４０によって識別された配列に対し、少なくとも９０％同一である軽鎖可変ドメイン、
ｊ．配列番号４１によって識別された配列に対し、少なくとも９０％同一である重鎖可変ドメイン、および配列番号４２によって識別された配列に対し、少なくとも９０％同一である軽鎖可変ドメイン、
ｋ．配列番号４３によって識別された配列に対し、少なくとも９０％同一である重鎖可変ドメイン、および配列番号４４によって識別された配列に対し、少なくとも９０％同一である軽鎖可変ドメイン、
ｌ．配列番号５１によって識別された配列に対し、少なくとも９０％同一である重鎖可変ドメイン、および配列番号５２によって識別された配列に対し、少なくとも９０％同一である軽鎖可変ドメイン、
ｍ．配列番号５３によって識別された配列に対し、少なくとも９０％同一である重鎖可変ドメイン、および配列番号５４によって識別された配列に対し、少なくとも９０％同一である軽鎖可変ドメイン、
ｎ．配列番号５５によって識別された配列に対し、少なくとも９０％同一である重鎖可変ドメイン、および配列番号５６によって識別された配列に対し、少なくとも９０％同一である軽鎖可変ドメイン、
ｏ．配列番号５７によって識別された配列に対し、少なくとも９０％同一である重鎖可変ドメイン、および配列番号５８によって識別された配列に対し、少なくとも９０％同一である軽鎖可変ドメイン、
ｐ．配列番号５９によって識別された配列に対し、少なくとも９０％同一である重鎖可変ドメイン、および配列番号６０によって識別された配列に対し、少なくとも９０％同一である軽鎖可変ドメイン、
ｑ．配列番号６１によって識別された配列に対し、少なくとも９０％同一である重鎖可変ドメイン、および配列番号６２によって識別された配列に対し、少なくとも９０％同一である軽鎖可変ドメイン、または
ｒ．配列番号６３によって識別された配列に対し、少なくとも９０％同一である重鎖可変ドメイン、および配列番号６４によって識別された配列に対し、少なくとも９０％同一である軽鎖可変ドメインを含む、前述の実施形態のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
９４．重鎖可変ドメインで、識別された配列番号に対して少なくとも９２％、９４％、９６％または９８％同一である、実施形態９３に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
９５．軽鎖可変ドメインで、識別された配列番号に対して少なくとも９２％、９４％、９６％または９８％同一である、実施形態９３に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
９６．重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインの両方で、識別された配列番号に対して少なくとも９２％、９４％、９６％または９８％同一である、実施形態９４および９５に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
９７．抗体またはその抗原結合性断片が、
ａ．
ｉ．配列番号２１によって識別された重鎖可変ドメインのＣＤＲ配列と比較して、最大で１０個のアミノ酸変化を有する三つの重鎖ＣＤＲ配列、および
ｉｉ．配列番号２２によって識別された軽鎖可変ドメインのＣＤＲ配列と比較して、最大で１０個のアミノ酸変化を有する三つの軽鎖ＣＤＲ配列、
ｂ．
ｉ．配列番号２５によって識別された重鎖可変ドメインのＣＤＲ配列と比較して、最大で１０個のアミノ酸変化を有する三つの重鎖ＣＤＲ配列、および
ｉｉ．配列番号２６によって識別された軽鎖可変ドメインのＣＤＲ配列と比較して、最大で１０個のアミノ酸変化を有する三つの軽鎖ＣＤＲ配列、
ｃ．
ｉ．配列番号２７によって識別された重鎖可変ドメインのＣＤＲ配列と比較して、最大で１０個のアミノ酸変化を有する三つの重鎖ＣＤＲ配列、および
ｉｉ．配列番号２８によって識別された軽鎖可変ドメインのＣＤＲ配列と比較して、最大で１０個のアミノ酸変化を有する三つ軽鎖ＣＤＲ配列、または
ｄ．
ｉ．配列番号２９によって識別された重鎖可変ドメインのＣＤＲ配列と比較して、最大で１０個のアミノ酸変化を有する三つの重鎖ＣＤＲ配列、および
ｉｉ．配列番号３０によって識別された軽鎖可変ドメインのＣＤＲ配列と比較して、最大で１０個のアミノ酸変化を有する三つの軽鎖ＣＤＲ配列、
ｅ．
ｉ．配列番号３１によって識別された重鎖可変ドメインのＣＤＲ配列と比較して、最大で１０個のアミノ酸変化を有する三つの重鎖ＣＤＲ配列、および
ｉｉ．配列番号３２によって識別された軽鎖可変ドメインのＣＤＲ配列と比較して、最大で１０個のアミノ酸変化を有する三つの軽鎖ＣＤＲ配列、
ｆ．
ｉ．配列番号３３によって識別された重鎖可変ドメインのＣＤＲ配列と比較して、最大で１０個のアミノ酸変化を有する三つの重鎖ＣＤＲ配列、および
ｉｉ．配列番号３４によって識別された軽鎖可変ドメインのＣＤＲ配列と比較して、最大で１０個のアミノ酸変化を有する三つの軽鎖ＣＤＲ配列、
ｇ．
ｉ．配列番号３５によって識別された重鎖可変ドメインのＣＤＲ配列と比較して、最大で１０個のアミノ酸変化を有する三つの重鎖ＣＤＲ配列、および
ｉｉ．配列番号３６によって識別された軽鎖可変ドメインのＣＤＲ配列と比較して、最大で１０個のアミノ酸変化を有する三つ軽鎖ＣＤＲ配列、または
ｈ．
ｉ．配列番号３７によって識別された重鎖可変ドメインのＣＤＲ配列と比較して、最大で１０個のアミノ酸変化を有する三つの重鎖ＣＤＲ配列、および
ｉｉ．配列番号３８によって識別された軽鎖可変ドメインのＣＤＲ配列と比較して、最大で１０個のアミノ酸変化を有する三つの軽鎖ＣＤＲ配列、
ｉ．
ｉ．配列番号３９によって識別された重鎖可変ドメインのＣＤＲ配列と比較して、最大で１０個のアミノ酸変化を有する三つの重鎖ＣＤＲ配列、および
ｉｉ．配列番号４０によって識別された軽鎖可変ドメインのＣＤＲ配列と比較して、最大で１０個のアミノ酸変化を有する三つの軽鎖ＣＤＲ配列、
ｊ．
ｉ．配列番号４１によって識別された重鎖可変ドメインのＣＤＲ配列と比較して、最大で１０個のアミノ酸変化を有する三つの重鎖ＣＤＲ配列、および
ｉｉ．配列番号４２によって識別された軽鎖可変ドメインのＣＤＲ配列と比較して、最大で１０個のアミノ酸変化を有する三つの軽鎖ＣＤＲ配列、
ｋ．
ｉ．配列番号４３によって識別された重鎖可変ドメインのＣＤＲ配列と比較して、最大で１０個のアミノ酸変化を有する三つの重鎖ＣＤＲ配列、および
ｉｉ．配列番号４４によって識別された軽鎖可変ドメインのＣＤＲ配列と比較して、最大で１０個のアミノ酸変化を有する三つ軽鎖ＣＤＲ配列、または
ｌ．
ｍ．
ｉ．配列番号５１によって識別された重鎖可変ドメインのＣＤＲ配列と比較して、最大で１０個のアミノ酸変化を有する三つの重鎖ＣＤＲ配列、および
ｉｉ．配列番号５２によって識別された軽鎖可変ドメインのＣＤＲ配列と比較して、最大で１０個のアミノ酸変化を有する三つ軽鎖ＣＤＲ配列、または
ｎ．
ｉ．配列番号５３によって識別された重鎖可変ドメインのＣＤＲ配列と比較して、最大で１０個のアミノ酸変化を有する三つの重鎖ＣＤＲ配列、および
配列番号５４によって識別された軽鎖可変ドメインのＣＤＲ配列と比較して、最大で１０個のアミノ酸変化を有する三つの軽鎖ＣＤＲ配列、
ｏ．
ｉ．配列番号５５によって識別された重鎖可変ドメインのＣＤＲ配列と比較して、最大で１０個のアミノ酸変化を有する三つの重鎖ＣＤＲ配列、および
ｉｉ．配列番号５６によって識別された軽鎖可変ドメインのＣＤＲ配列と比較して、最大で１０個のアミノ酸変化を有する三つの軽鎖ＣＤＲ配列、
ｐ．
ｉ．配列番号５７によって識別された重鎖可変ドメインのＣＤＲ配列と比較して、最大で１０個のアミノ酸変化を有する三つの重鎖ＣＤＲ配列、および
ｉｉ．配列番号５８によって識別された軽鎖可変ドメインのＣＤＲ配列と比較して、最大で１０個のアミノ酸変化を有する三つの軽鎖ＣＤＲ配列、
ｑ．
ｉ．配列番号５９によって識別された重鎖可変ドメインのＣＤＲ配列と比較して、最大で１０個のアミノ酸変化を有する三つの重鎖ＣＤＲ配列、および
ｉｉ．配列番号６０によって識別された軽鎖可変ドメインのＣＤＲ配列と比較して、最大で１０個のアミノ酸変化を有する三つの軽鎖ＣＤＲ配列、
ｒ．
ｉ．配列番号６１によって識別された重鎖可変ドメインのＣＤＲ配列と比較して、最大で１０個のアミノ酸変化を有する三つの重鎖ＣＤＲ配列、および
ｉｉ．配列番号６２によって識別された軽鎖可変ドメインのＣＤＲ配列と比較して、最大で１０個のアミノ酸変化を有する三つ軽鎖ＣＤＲ配列、または
ｓ．
ｉ．配列番号６３によって識別された重鎖可変ドメインのＣＤＲ配列と比較して、最大で１０個のアミノ酸変化を有する三つの重鎖ＣＤＲ配列、および
ｉｉ．配列番号６４によって識別された軽鎖可変ドメインのＣＤＲ配列と比較して、最大で１０個のアミノ酸変化を有する三つの軽鎖ＣＤＲ配列を含む、前述の実施形態のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
９８．三つの重鎖ＣＤＲ配列が、識別された配列番号のＣＤＲと比較して、８、７、６個などの最大で９個のアミノ酸変化を有する、実施形態９７に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
９９．三つの重鎖ＣＤＲ配列が、識別された配列番号のＣＤＲと比較して、４、３、２個などの最大で５個、または最大で１個のアミノ酸変化を有する、実施形態９７に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
１００．三つの軽鎖ＣＤＲ配列が、識別された配列番号のＣＤＲと比較して、８、７、６個などの最大で９個のアミノ酸変化を有する、実施形態９７に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
１０１．三つの軽鎖ＣＤＲ配列が、識別された配列番号のＣＤＲと比較して、４、３、２個などの最大で５個、または最大で１個のアミノ酸変化を有する、実施形態９７に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
１０２．抗体またはその抗原結合性断片が、
ａ．配列番号２１によって識別された重鎖可変ドメインのＣＤＲ配列、および配列番号２２によって識別された軽鎖可変ドメインのＣＤＲ配列、
ｂ．配列番号２５によって識別された重鎖可変ドメインのＣＤＲ配列、および配列番号２６によって識別された軽鎖可変ドメインのＣＤＲ配列、
ｃ．配列番号２７によって識別された重鎖可変ドメインのＣＤＲ配列、および配列番号２８によって識別された軽鎖可変ドメインのＣＤＲ配列、
ｄ．配列番号２９によって識別された重鎖可変ドメインのＣＤＲ配列、および配列番号３０によって識別された軽鎖可変ドメインのＣＤＲ配列、
ｅ．配列番号３１によって識別された重鎖可変ドメインのＣＤＲ配列、および配列番号３２によって識別された軽鎖可変ドメインのＣＤＲ配列、
ｆ．配列番号３３によって識別された重鎖可変ドメインのＣＤＲ配列、および配列番号３４によって識別された軽鎖可変ドメインのＣＤＲ配列、
ｇ．配列番号３５によって識別された重鎖可変ドメインのＣＤＲ配列、および配列番号３６によって識別された軽鎖可変ドメインのＣＤＲ配列、
ｈ．配列番号３７によって識別された重鎖可変ドメインのＣＤＲ配列、および配列番号３８によって識別された軽鎖可変ドメインのＣＤＲ配列、
ｉ．配列番号３９によって識別された重鎖可変ドメインのＣＤＲ配列、および配列番号４０によって識別された軽鎖可変ドメインのＣＤＲ配列、
ｊ．配列番号４１によって識別された重鎖可変ドメインのＣＤＲ配列、および配列番号４２によって識別された軽鎖可変ドメインのＣＤＲ配列、
ｋ．配列番号４３によって識別された重鎖可変ドメインのＣＤＲ配列、および配列番号４４によって識別された軽鎖可変ドメインのＣＤＲ配列、
ｌ．配列番号５１によって識別された重鎖可変ドメインのＣＤＲ配列、および配列番号５２によって識別された軽鎖可変ドメインのＣＤＲ配列、
ｍ．配列番号５３によって識別された重鎖可変ドメインのＣＤＲ配列、および配列番号５４によって識別された軽鎖可変ドメインのＣＤＲ配列、
ｎ．配列番号５５によって識別された重鎖可変ドメインのＣＤＲ配列、および配列番号５６によって識別された軽鎖可変ドメインのＣＤＲ配列、
ｏ．配列番号５７によって識別された重鎖可変ドメインのＣＤＲ配列、および配列番号５８によって識別された軽鎖可変ドメインのＣＤＲ配列、
ｐ．配列番号５９によって識別された重鎖可変ドメインのＣＤＲ配列、および配列番号６０によって識別された軽鎖可変ドメインのＣＤＲ配列、
ｑ．配列番号６１によって識別された重鎖可変ドメインのＣＤＲ配列、および配列番号６２によって識別された軽鎖可変ドメインのＣＤＲ配列、または
ｒ．配列番号６３によって識別された重鎖可変ドメインのＣＤＲ配列、および配列番号６４によって識別された軽鎖可変ドメインのＣＤＲ配列を含む、前述の実施形態のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
１０３．抗体またはその抗原結合性断片が、
ａ．配列番号２１および２２、
ｂ．配列番号２５および２６、
ｃ．配列番号２７および２８、
ｄ．配列番号２９および３０、
ｅ．配列番号３１および３２、
ｆ．配列番号３３および３４、
ｇ．配列番号３５および３６、
ｈ．配列番号３７および３８、
ｉ．配列番号３９および４０、
ｊ．配列番号４１および４２、
ｋ．配列番号４３および４４、
ｌ．配列番号５１および５２、
ｍ．配列番号５３および５４、
ｎ．配列番号５５および５６、
ｏ．配列番号５７および５８、
ｐ．配列番号５９および６０、
ｑ．配列番号６１および６２または
ｒ．配列番号６３および配列番号６４によってそれぞれ識別された、重鎖可変ドメインと軽鎖可変ドメインとを含む、前述の実施形態のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
１０４．抗体またはその抗原結合性断片が「ビンＤ」に属する、実施形態５７に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
１０５．抗体またはその抗原結合性断片が参照抗体と競合し、参照抗体は配列番号４７によって識別された重鎖可変ドメインと、配列番号４８によって識別された軽鎖可変ドメインとを含む、実施形態５７に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
１０６．参照抗体がＦａｂである、前述の実施形態に記載の抗体。
１０７．抗体またはその抗原結合性断片が、
ａ．配列番号４７によって識別された配列に対し、少なくとも９０％同一である重鎖可変ドメイン、および配列番号４８によって識別された配列に対し、少なくとも９０％同一である軽鎖可変ドメイン、
ｂ．配列番号４５によって識別された配列に対し、少なくとも９０％同一である重鎖可変ドメイン、および配列番号４６によって識別された配列に対し、少なくとも９０％同一である軽鎖可変ドメイン、
ｃ．配列番号５１によって識別された配列に対し、少なくとも９０％同一である重鎖可変ドメイン、および配列番号５２によって識別された配列に対し、少なくとも９０％同一である軽鎖可変ドメイン、
または
ｄ．配列番号６１によって識別された配列に対し、少なくとも９０％同一である重鎖可変ドメイン、および配列番号６２によって識別された配列に対し、少なくとも９０％同一である軽鎖可変ドメインを含む、前述の実施形態のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
１０８．重鎖可変ドメインで、識別された配列番号に対して少なくとも９２％、９４％、９６％または９８％同一である、実施形態１０７に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
１０９．軽鎖可変ドメインで、識別された配列番号に対して少なくとも９２％、９４％、９６％または９８％同一である、実施形態１０７に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
１１０．重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインの両方で、識別された配列番号に対して少なくとも９２％、９４％、９６％または９８％同一である、実施形態１０８および１０９に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
１１１．抗体またはその抗原結合性断片が、
ａ．
ｉ．配列番号４７によって識別された重鎖可変ドメインのＣＤＲ配列と比較して、最大で１０個のアミノ酸変化を有する三つの重鎖ＣＤＲ配列、および
ｉｉ．配列番号４８によって識別された軽鎖可変ドメインのＣＤＲ配列と比較して、最大で１０個のアミノ酸変化を有する三つの軽鎖ＣＤＲ配列、
ｂ．
ｉ．配列番号４５によって識別された重鎖可変ドメインのＣＤＲ配列と比較して、最大で１０個のアミノ酸変化を有する三つの重鎖ＣＤＲ配列、および
ｉｉ．配列番号４６によって識別された軽鎖可変ドメインのＣＤＲ配列と比較して、最大で１０個のアミノ酸変化を有する三つの軽鎖ＣＤＲ配列、
ｃ．
ｉ．配列番号５１によって識別された重鎖可変ドメインのＣＤＲ配列と比較して、最大で１０個のアミノ酸変化を有する三つの重鎖ＣＤＲ配列、および
ｉｉ．配列番号５２によって識別された軽鎖可変ドメインのＣＤＲ配列と比較して、最大で１０個のアミノ酸変化を有する三つ軽鎖ＣＤＲ配列、または
ｄ．
ｉ．配列番号６１によって識別された重鎖可変ドメインのＣＤＲ配列と比較して、最大で１０個のアミノ酸変化を有する三つの重鎖ＣＤＲ配列、および
ｉｉ．配列番号６２によって識別された軽鎖可変ドメインのＣＤＲ配列と比較して、最大で１０個のアミノ酸変化を有する三つの軽鎖ＣＤＲ配列を含む、前述の実施形態のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
１１２．三つの重鎖ＣＤＲ配列が、識別された配列番号のＣＤＲと比較して、８、７、６個などの最大で９個のアミノ酸変化を有する、実施形態１１１に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
１１３．三つの重鎖ＣＤＲ配列が、識別された配列番号のＣＤＲと比較して、４、３、２個などの最大で５個、または最大で１個のアミノ酸変化を有する、実施形態１１１に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
１１４．三つの軽鎖ＣＤＲ配列が、識別された配列番号のＣＤＲと比較して、８、７、６個などの最大で９個のアミノ酸変化を有する、実施形態１１１に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
１１５．三つの軽鎖ＣＤＲ配列が、識別された配列番号のＣＤＲと比較して、４、３、２個などの最大で５個、または最大で１個のアミノ酸変化を有する、実施形態１１１に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
１１６．抗体またはその抗原結合性断片が、
ａ．配列番号４７によって識別された重鎖可変ドメインのＣＤＲ配列、および配列番号４８によって識別された軽鎖可変ドメインのＣＤＲ配列、
ｂ．配列番号４５によって識別された重鎖可変ドメインのＣＤＲ配列、および配列番号４６によって識別された軽鎖可変ドメインのＣＤＲ配列、
ｃ．配列番号５１によって識別された重鎖可変ドメインのＣＤＲ配列、および配列番号５２によって識別された軽鎖可変ドメインのＣＤＲ配列、
または
ｄ．配列番号６１によって識別された重鎖可変ドメインのＣＤＲ配列、および配列番号６２によって識別された軽鎖可変ドメインのＣＤＲ配列を含む、前述の実施形態のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
１１７．抗体またはその抗原結合性断片が、
ａ．配列番号４７によって識別された重鎖可変ドメイン、および配列番号４８によって識別された軽鎖可変ドメイン、
ｂ．配列番号４５によって識別された重鎖可変ドメイン、および配列番号４６によって識別された軽鎖可変ドメイン、
ｃ．配列番号５１によって識別された重鎖可変ドメイン、および配列番号５２によって識別された軽鎖可変ドメイン、
または
ｄ．配列番号６１によって識別された重鎖可変ドメイン、および配列番号６２によって識別された軽鎖可変ドメインを含む、前述の実施形態のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
１１８．抗体またはその抗原結合性断片が「ビンＥ」に属する、実施形態５７に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
１１９．抗体またはその抗原結合性断片が参照抗体と競合し、参照抗体は配列番号４９によって識別された重鎖可変ドメインと、配列番号５０によって識別された軽鎖可変ドメインとを含む、実施形態５７に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
１２０．参照抗体がＦａｂである、前述の実施形態に記載の抗体。
１２１．抗体またはその抗原結合性断片が、配列番号４９によって識別された配列と少なくとも９０％同一の重鎖可変ドメインと、配列番号５０によって識別された配列と少なくとも９０％同一の軽鎖可変ドメインとを含む、前述の実施形態のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
１２２．重鎖可変ドメインで、識別された配列番号に対して少なくとも９２％、９４％、９６％または９８％同一である、実施形態１２１に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
１２３．軽鎖可変ドメインで、識別された配列番号に対して少なくとも９２％、９４％、９６％または９８％同一である、実施形態１２１に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
１２４．重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインの両方で、識別された配列番号に対して少なくとも９２％、９４％、９６％または９８％同一である、実施形態１２２および１２３に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
１２５．抗体またはその抗原結合性断片が、
ａ．配列番号４９によって識別された重鎖可変ドメインのＣＤＲ配列と比較して、最大で１０個のアミノ酸変化を有する三つの重鎖ＣＤＲ配列、および
ｂ．配列番号５０によって識別された軽鎖可変ドメインのＣＤＲ配列と比較して、最大で１０個のアミノ酸変化を有する三つの軽鎖ＣＤＲ配列を含む、前述の実施形態のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
１２６．三つの重鎖ＣＤＲ配列が、識別された配列番号のＣＤＲと比較して、８、７、６個などの最大で９個のアミノ酸変化を有する、実施形態１２５に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
１２７．三つの重鎖ＣＤＲ配列が、識別された配列番号のＣＤＲと比較して、４、３、２個などの最大で５個、または最大で１個のアミノ酸変化を有する、実施形態１２５に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
１２８．三つの軽鎖ＣＤＲ配列が、識別された配列番号のＣＤＲと比較して、８、７、６個などの最大で９個のアミノ酸変化を有する、実施形態１２５に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
１２９．三つの軽鎖ＣＤＲ配列が、識別された配列番号のＣＤＲと比較して、４、３、２個などの最大で５個、または最大で１個のアミノ酸変化を有する、実施形態１２５に記載の抗体またはその抗原結合性断片。
１３０．抗体またはその抗原結合性断片が、配列番号４９によって識別された重鎖可変ドメインのＣＤＲ配列と、配列番号５０によって識別された軽鎖可変ドメインのＣＤＲ配列とを含む、前述の実施形態のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
１３１．抗体またはその抗原結合性断片が、配列番号４９によって識別された重鎖可変ドメインと、配列番号５０によって識別された軽鎖可変ドメインとを含む、前述の実施形態のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
１３２．ＦＩＸ／ＦＩＸａおよびＦＸ／ＦＸａに結合することができる多重特異性抗体またはその抗原結合性断片。
１３３．抗体が前述の実施形態１～１３１のいずれかに記載の抗原結合性断片を含む、実施形態１３２に記載の多重特異性抗体またはその抗原結合性断片。
１３４．抗体が前述の実施形態２～３０のいずれかに記載の抗原結合性断片を含む、実施形態１３２に記載の多重特異性抗体またはその抗原結合性断片。
１３５．抗体が前述の実施形態３１～５２のいずれかに記載の抗原結合性断片を含む、実施形態１３２に記載の多重特異性抗体またはその抗原結合性断片。
１３６．抗体が前述の実施形態５７～１３１のいずれかに記載の抗原結合性断片を含む、実施形態１３２に記載の多重特異性抗体またはその抗原結合性断片。
１３７．抗体が前述の実施形態５８～７５のいずれかに記載の抗原結合性断片を含む、実施形態１３２に記載の多重特異性抗体またはその抗原結合性断片。
１３８．抗体が前述の実施形態７６～８９のいずれかに記載の抗原結合性断片を含む、実施形態１３２に記載の多重特異性抗体またはその抗原結合性断片。
１３９．抗体が前述の実施形態９０～１０３のいずれかに記載の抗原結合性断片を含む、実施形態１３２に記載の多重特異性抗体またはその抗原結合性断片。
１４０．抗体が前述の実施形態１０４～１１７のいずれかに記載の抗原結合性断片を含む、実施形態１３２に記載の多重特異性抗体またはその抗原結合性断片。
１４１．抗体が前述の実施形態１１８～１３１のいずれかに記載の抗原結合性断片を含む、実施形態１３２に記載の多重特異性抗体またはその抗原結合性断片。
１４２．抗体が前述の実施形態１～５６のいずれかに記載の抗原結合性断片および前述の実施形態５７～１３１のいずれかに記載の抗原結合性断片を含む、実施形態１３２に記載の多重特異性抗体またはその抗原結合性断片。
１４３．抗体が前述の実施形態２～３０のいずれかに記載の抗原結合性断片および前述の実施形態５８～７５のいずれかに記載の抗原結合性断片を含む、実施形態１３２に記載の多重特異性抗体またはその抗原結合性断片。
１４４．抗体が前述の実施形態２～３０のいずれかに記載の抗原結合性断片および前述の実施形態７６～８９のいずれかに記載の抗原結合性断片を含む、実施形態１３２に記載の多重特異性抗体またはその抗原結合性断片。
１４５．抗体が前述の実施形態２～３０のいずれかに記載の抗原結合性断片および前述の実施形態９０～１０３のいずれかに記載の抗原結合性断片を含む、実施形態１３２に記載の多重特異性抗体またはその抗原結合性断片。
１４６．抗体が前述の実施形態３１～５２のいずれかに記載の抗原結合性断片および前述の実施形態５８～７５のいずれかに記載の抗原結合性断片を含む、実施形態１３２に記載の多重特異性抗体またはその抗原結合性断片。
１４７．抗体が前述の実施形態３１～５２のいずれかに記載の抗原結合性断片および前述の実施形態７６～８９のいずれかに記載の抗原結合性断片を含む、実施形態１３２に記載の多重特異性抗体またはその抗原結合性断片。
１４８．抗体が前述の実施形態３１～５２のいずれかに記載の抗原結合性断片および前述の実施形態９０～１０３のいずれかに記載の抗原結合性断片を含む、実施形態１３２に記載の多重特異性抗体またはその抗原結合性断片。
１４９．抗体は、ＦＩＸ／ＦＩＸａおよびＦＸ／ＦＸａを特異的に結合することのできる二重特異性抗体であり、結合ドメインは、ｍＡｂ１－１３７１／ｍＡｂ１－１３０７、ｍＡｂ１－６７０５／ｍＡｂ１－１３０７、ｍＡｂ１－１３７１／ｍＡｂ０－１８８６、ｍＡｂ１－７４４１／ｍＡｂ０－１８８６、ｍＡｂ１－７４４７／ｍＡｂ０－１８８６、ｍＡｂ１－７４８１／ｍＡｂ０－１８８６、ｍＡｂ１－１３７１／ｍＡｂ０－１９９８、ｍＡｂ１－６７１６／ｍＡｂ０－１９９８、ｍＡｂ１－６７２３／ｍＡｂ０－１９９８、ｍＡｂ１－６７３０／ｍＡｂ０－１９９８、ｍＡｂ１－６７３１／ｍＡｂ０－１９９８、ｍＡｂ１－６７３７／ｍＡｂ０－１９９８、ｍＡｂ１－６７５４／ｍＡｂ０－１９９８、ｍＡｂ１－７３７８／ｍＡｂ０－１９９８、ｍＡｂ１－７４４１／ｍＡｂ０－１９９８、ｍＡｂ１－７４４７／ｍＡｂ０－１９９８、ｍＡｂ／ｍＡｂ０－１９９８、ｍＡｂ１－６７２３／ｍＡｂ１－１３０７、ｍＡｂ１－６７２３／ｍＡｂ０－１８８６、ｍＡｂ１－６７０５／ｍＡｂ０－１８８６、ｍＡｂ１－７４８１／ｍＡｂ０－１９９８およびｍＡｂ１－６７０５／ｍＡｂ０－１９９８からなるｍＡｂ対由来である、実施形態１３２に記載の多重特異性抗体またはその抗原結合性断片。
１５０．抗体が血液凝固二重特異性抗体である、実施形態１３２～１４９のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
１５１．抗体がＦＩＸａの血液凝固活性を増加させることができる二重特異性抗体である、実施形態１３２～１４９のいずれか一つに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
１５２．抗体がＦＸに対するＦＩＸａの酵素活性を増加させることができる二重特異性抗体である、実施形態１３２～１４９のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
１５３．抗体がＦＶＩＩＩおよび／またはＦＶＩＩＩａを機能的に置換することができる二重特異性抗体である、実施形態１３２～１４９のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
１５４．ＦＸに対するＦＩＸａの酵素活性を刺激することができる多重特異性抗体であって、ＦＩＸ（配列番号１）またはその活性型（ＦＩＸａ）を認識する第一の抗原結合部位、、およびＦＸ（配列番号２）またはその活性型（ＦＸａ）を認識する第二の抗原結合部位、を含み、
ａ）第一の抗原結合部位は、ｍＡｂ１－５７４３、ｍＡｂ１－６５８４、ｍＡｂ１－８７６８、ｍＡｂ１－６０３７、ｍＡｂ１－６０８１、ｍＡｂ１－４８５７、ｍＡｂ１－８７８０、ｍＡｂ１－９０１６、ｍＡｂ１－９０１５、ｍＡｂ１－８４６７、ｍＡｂ１－５７８３、またはｍＡｂ１－５７８１からなる群から選択される抗体のＣＤＲを含み、
ｂ）第二の抗原結合部位は、ｍＡｂ１－６７３８、ｍＡｂ１－６４６３、ｍＡｂ１－６７２３、ｍＡｂ１－７５０３、またはｍＡｂ１－６０９７からなる群から選択される抗体のＣＤＲを含む、多重特異性抗体。
１５５．ＦＸに対するＦＩＸａの酵素活性を刺激することができる多重特異性抗体であって、
ＦＩＸ／ＦＩＸａを認識する第一のポリペプチドと、
ＦＸ／ＦＸａを認識する第二のポリペプチドを含み、
ａ）第一のポリペプチドが、ｍＡｂ１－５７４３、ｍＡｂ１－６５８４、ｍＡｂ１－８７６８、ｍＡｂ１－６０３７、ｍＡｂ１－６０８１、ｍＡｂ１－４８５７、ｍＡｂ１－８７８０、ｍＡｂ１－９０１６、ｍＡｂ１－９０１５、ｍＡｂ１－８４６７、ｍＡｂ１－５７８３、またはｍＡｂ１－５７８１の重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含み、
ｂ）第二のポリペプチドは、ｍＡｂ１－６７３８、ｍＡｂ１－６４６３、ｍＡｂ１－６７２３、ｍＡｂ１－７５０３、またはｍＡｂ１－６０９７の重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含む、多重特異性抗体。
１５６．抗体が二重特異性抗体である、実施形態１５４または１５５のいずれか一つに記載の抗体。
１５７．ＦＸに対するＦＩＸａの酵素活性の刺激は、一価ワンアームドの抗ＦＩＸ／ＦＩＸａ抗体を用いた本明細書に記載のＦＸａ生成アッセイで決定され、ＦＩＸａが少なくとも８０％の飽和をもたらすワンアームドの抗体濃度を使用して測定された場合、刺激指数は少なくとも９４、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、２５００、３０００、４０００または５０００倍である、実施形態１５０～１５６のいずれか一つに記載の抗体。
１５８．ＦＸに対するＦＩＸａの酵素活性を刺激することができる多重特異性抗体であって、
ＦＩＸ（配列番号１）またはその活性型（ＦＩＸａ）を認識する第一の抗原結合部位、、およびＦＸ（配列番号２）またはその活性型（ＦＸａ）を認識する第二の抗原結合部位、を含み、ここで
第一の抗原結合部位は、ＦＩＸ／ＦＩＸａのアミノ酸残基Ｒ３３８を含むエピトープを特異的に結合することができ、および
第二の抗原結合部位は、ＥＧＦ－２ドメインおよび／またはＦＸ／ＦＸａの触媒サブユニットで結合することができる、多重特異性抗体。
１５９．実施形態１５８に記載の多重特異性抗体であって、
第一の抗原結合部位は、ＦＩＸ／ＦＩＸａのアミノ酸残基Ｒ３３８およびＫ３４１を含むエピトープを特異的に結合することができる、多重特異性抗体。
１６０．実施形態１５９に記載の多重特異性抗体であって、
第一の抗原結合部位は、ＦＩＸ／ＦＩＸａのアミノ酸残基Ｌ３３７、Ｒ３３８、Ｓ３３９、Ｔ３４０、Ｋ３４１およびＴ３４３を含むエピトープを特異的に結合することができる、多重特異性抗体。
１６１．ＦＸに対するＦＩＸａの酵素活性を刺激することができる多重特異性抗体であって、ＦＩＸ（配列番号１）またはその活性型ＦＩＸａを認識する第一の抗原結合部位、、およびＦＸ（配列番号２）またはその活性型（ＦＸａ）を認識する第二の抗原結合部位、を含み、
ここで
第一の抗原結合部位は、ＦＩＸ／ＦＩＸａのアミノ酸残基Ｄ３３２、Ｒ３３３、Ｌ３３７およびＲ３３８を含むエピトープを特異的に結合することができ、および
第二の抗原結合部位は、ＥＧＦ－２ドメインおよび／またはＦＸ／ＦＸａの触媒サブユニットで結合することができる、多重特異性抗体。
１６２．実施形態１６１に記載の多重特異性抗体であって、
第一の抗原結合部位は、ＦＩＸ／ＦＩＸａのアミノ酸残基Ｋ３０１、Ｄ３３２、Ｒ３３３、Ａ３３４、Ｔ３３５、Ｒ３３８、Ｎ３４６を含むエピトープを特異的に結合することができる、多重特異性抗体。
１６３．ＦＸに対するＦＩＸａの酵素活性を刺激することができる多重特異性抗体であって、
ＦＩＸ／ＦＩＸａを認識する第一の抗原結合部位と、
ＦＸ／ＦＸａを認識する第二の抗原結合部位とを含み、
ここで
第一の抗原結合部位は、ＦＩＸ／ＦＩＸａのアミノ酸残基Ｈ２５７、Ｋ２９３およびＮ４０６を含むエピトープを特異的に結合することができ、および
第二の抗原結合部位は、ＥＧＦ－２ドメインおよび／またはＦＸ／ＦＸａの触媒サブユニットで結合することができる、多重特異性抗体。
１６４．ＦＸに対するＦＩＸａの酵素活性の刺激は、一価ワンアームドの抗ＦＩＸ／ＦＩＸａ抗体を用いた本明細書に記載のＦＸａ生成アッセイで測定され、ＦＩＸａが少なくとも８０％の飽和をもたらすワンアームドの抗体濃度を使用して測定された場合、刺激指数は少なくとも９４、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、２５００、３０００、４０００または５０００倍である、実施形態１～５６および１３２～１５６のいずれか一つに記載の抗体。
１６５．ＦＸに対するＦＩＸａの酵素活性の刺激は、一価ワンアームドの抗ＦＩＸ／ＦＩＸａ抗体を用いた本明細書に記載のＦＸａ生成アッセイで測定され、ＦＩＸａが少なくとも８０％の飽和をもたらすワンアームドの抗体濃度を使用して測定された場合、刺激指数は、９４～２５００倍など、１００～２５００倍など、２００～２５００倍など、３００～２５００倍など、４００～２５００倍など、５００～２５００倍など、６００～２５００倍など、７００～２５００倍など、８００～２５００倍など、５００～２５００倍など、６００～２５００倍など、７００～２５００倍など、８００～２５００倍など、９００～２５００倍など、１０００～２５００倍など、または１５００～２５００倍などの５０～５０００倍の間である、実施形態１～５６および１３２～１５６のいずれか一つに記載の抗体。
１６６．抗体が血液凝固抗体である、前述の実施形態のいずれか一つに記載の抗体。
１６７．該抗体がＦＶＩＩＩおよび／またはＦＶＩＩＩａを機能的に置換する、前述の実施形態のいずれか一つに記載の抗体。
１６８．抗体が二重特異性抗体である、前述の実施形態のいずれか一つに記載の抗体。
１６９．抗体アイソタイプがＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４またはそれらの組み合わせである、前述の実施形態のいずれか一つに記載の抗体。
１７０．該抗体またはその抗原結合性断片の軽鎖可変ドメインが、アミノ酸残基Ｒ５７、Ｒ９６（配列番号２２）を含み、該抗体の重鎖可変ドメインが、アミノ酸残基Ｗ３３、Ｄ５２、Ｄ５５、Ｈ１００、Ｙ１０１、Ｙ１０２、Ｈ１０３（配列番号２１）を含む、実施形態５７～１３１のいずれか一つに記載の抗体。
１７１．凝固障害または血液凝固障害の治療方法で使用するための前述の実施形態のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片。
１７２．凝固障害または血液凝固障害の治療のための前述の実施形態のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片を含む、医薬組成物。
１７３．凝固障害性血液凝固障害に罹患している対象を治療する方法であって、前述の実施形態のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合性断片を該対象に投与することを含む、方法。
１７４．凝固障害または血液凝固障害が、血友病Ａまたは阻害物質を有する血友病Ａである、実施形態１７３に記載の方法。
略語のリスト
ＡＣＮ：アセトニトリル
ＣＤＲ：相補性決定領域
ＥＧＲ－ＣＫ：ＥＧＲ－クロロメチルケトン
ＬＣ－ＭＳ 液体クロマトグラフィー質量分析
ＦＡＣＳ：蛍光活性化細胞ソーティング
ＦＩＸ：凝固第ＩＸ因子
ＦＩＸａ：凝固第ＩＸａ因子
ＦＸ：凝固第Ｘ因子
ＦＸａ：凝固第Ｘａ因子
ＨＡ：血友病Ａ
ＨＡ－ＰＰＰ：ＨＡ誘発ヒト乏血小板血漿
ＨＡ－ＰＲＰ：ＨＡ誘発ヒト多血小板血漿
ｈＦＩＸａ：ヒト凝固第ＩＸａ因子
ＩＴＣ：等温滴定熱量測定
ＭＡＣＳ：磁気活性化細胞ソーティング
ＯＡ：ワンアームド
ＰＣＲ：ポリメラーゼ連鎖反応
ＳＰＲ：表面プラズモン共鳴
実施例１ 第ＩＸ因子／ＦＩＸａ ＦａｂおよびｍＡｂ発現プラスミドの開発
本明細書に開示されるようなＦＩＸ／ＦＩＸａ結合抗体は、様々な抗体開発方法を使用して特定された。ＦＩＸａおよびＦＸ を標的とする多様な抗体のセットを生成するために、マウスおよびウサギの免疫化ならびにファージディスプレイおよびＡｄｉｍａｂ酵母ディスプレイからの選択が実施された。
Ａｄｉｍａｂ酵母ディスプレイ
Ａｄｉｍａｂプラットフォームは、１０１０の多様性を持ち、４２のＶＨファミリーのうち２０をカバーする、完全ヒトナイーブ型ＩｇＧ１／カッパライブラリを包含する酵母ディスプレイシステムである。利用される抗体ファージディスプレイプラットフォームは、専有の完全ヒトＦａｂディスプレイライブラリである。ライブラリには１０１０のサイズがあり、軽鎖の化学合成を利用する組み合わせ可能なアプローチ、ならびにヒト末梢血単核細胞からの重鎖ＣＤＲ３のＰＣＲ増幅により相補された重鎖ＣＤＲ１およびＣＤＲ２によって構築された。抗体選択プロセスは、リアルタイムで適用された選択基準を監視することを可能にするＭＡＣＳおよびＦＡＣＳベースの方法を使用して指示される。選択はＭＡＣＳおよびＦＡＣＳに基づいているため、標識された抗原（例えば、ビオチン）が必要である。ビオチン標識された活性部位阻害ｈＦＩＸａ（ＦＩＸａ－ＥＧＲ－ビオチン）、またはｈＦＩＸａの抗体媒介性固定化をを使用して選択キャンペーンを実施した。バイオレイヤー干渉法（Ｏｃｔｅｔ ｆｏｒｔｅｂｉｏ ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、結合のヒットを評価した。
ファージディスプレイ
エピトープ多様性のカバレッジを最大化するために、ビオチン化ＦＩＸａ－ＥＧＲ、ＦＸ、活性部位阻害ＦＸａ、または抗ＦＩＸａ抗体を使用した抗原捕捉を使用したパニングを含む、異なるパニング戦略を実施した。初期ヒットはファージＥＬＩＳＡによって識別された。配列分析後、特有のヒットがクローン化され、ＩｇＧ１として発現し、ＳＰＲ（Ｂｉａｃｏｒｅ）またはバイオレイヤー干渉法（Ｏｃｔｅｔ ｆｏｒｔｅｂｉｏ ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用してランク付けした。
インビボプラットフォーム
マウスにおける完全ヒト抗体の生成については、Ｋｙｍｏｕｓｅ（商標）マウスＨＫおよびＨＬ１．０（それぞれカッパ鎖およびラムダ鎖を利用）を使用した。抗体多様性を最大化するために、野生型マウスおよびウサギで追加免疫を実施した。
抗ＦＩＸａ抗体の生成
標準的なプロトコルを使用して、マウスまたはウサギをＦＩＸａ、ＦＩＸａ－ＥＧＲ、またはＦＸで免疫化した。マウスまたはウサギで生成された抗体を、ＥＬＩＳＡでスクリーニングした。ＦＩＸａ結合ウサギＢ細胞は、ランダムにビオチン化されたＦＩＸａ－ＥＧＲを使用してＦＡＣＳソーティングされた。ウサギおよびマウスからの抗体ヒットは、組み換えで発現（ウサギｍＡｂｓ）または繁殖（マウスハイブリドーマ）のいずれかであり、続いて抗体は小規模精製された。
抗ＦＸ抗体の生成
Ｋｙｍｏｕｓｅマウスおよびウサギは、標準または複数部位での反復免疫（ＲＩＭＭＳ）プロトコルを用いてＦＸで免疫化した。ウサギＢ細胞を、ランダムにビオチン化されたＦＸを使用してＦＡＣＳソーティングにより単離した。融合およびソーティングからの抗ＦＸ ｍＡｂは、ＥＬＩＳＡおよびＯｃｔｅｔ ｆｏｒｔｅｂｉｏ ｓｙｓｔｅｍｓを使用してスクリーニングされた。
Ｋｙｍｏｕｓｅおよびｗｔマウス由来抗体のシーケンシング
Ｋｙｍｏｕｓｅのマウスまたはｗｔマウスに由来するハイブリドーマを産生する抗ＦＩＸａおよび抗ＦＸ抗体を配列決定し、標準技術を使用してＨＥＫ２９３細胞に発現した。Ｏｃｔｅｔ ｆｏｒｔｅｂｉｏ ｓｙｓｔｅｍｓを使用して、発現抗体の結合を評価した。
選択された抗体のＤＮＡ配列をコードする得られた変数ドメイン（ＶＨおよＶＬ）は、ｐＴＴベースの哺乳類発現ベクター（Ｄｕｒｏｃｈｅｒら（２００２）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．３０：Ｅ９）、またはＤＮＡ配列をコードする抗体定常領域を含有するｐｃＤＮＡ３．４哺乳類発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に挿入された。ｐＴＴ／ｐｃＤＮＡ３．４ｍＡｂ発現ベクターの場合、ＶＨおよびＶＬ ＤＮＡ配列は、それぞれ、ヒトＩｇＧ１、またはＩｇＧ４ Ｓ２２８Ｐ（ＣＨ１ＣＨ２ＣＨ３）、またはＤＮＡ配列をコードするヒトＣＬカッパ定常領域で、フレーム内に挿入された。対応するｐＴＴ／ｐｃＤＮＡ３．４Ｆａｂ発現ベクターの場合、ＶＨ ＤＮＡ配列は、ＤＮＡ配列をコードするヒトＩｇＧ１ ＣＨ１でフレーム内に挿入された。
以下の実施例６、８および１８で使用される２２４Ｆ３参照化合物について、２２４Ｆ３ＶＨおよびＶＬ配列は、ＥＰ１６６０５３６ Ｂ１（それぞれ配列番号１および２）から得た。ＤＮＡ配列をコードする２２４Ｆ３ ＶＨおよびＶＬは、それぞれ、ヒトＩｇＧ１（ＣＨ１ＣＨ２ＣＨ３）、またはＤＮＡ配列をコードするヒトＣＬカッパ定常領域と、フレーム内で、ｐＴＴ５／ｐｃＤＮＡ３．４ベースの哺乳類発現ベクターに挿入された。
すべての発現ベクターは、コザック配列を含有する５’末端ＤＮＡ配列と、ＤＮＡ配列をコードする抗体とフレーム内でシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列とを含んでいた。
実施例２ 抗体および抗体Ｆａｂ断片の組み換え発現
抗体および抗体Ｆａｂ断片は、製造業者の指示に本質的に従って、ＨＥＫ２９３懸濁細胞（２９３Ｅｘｐｉ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の一過性導入を使用して発現された。２９３Ｅｘｐｉ細胞は典型的には、１％のＰ／Ｓ（ＧＩＢＣＯカタログ番号１５１４０－１２２）で補充されたＥｘｐｉ２９３Ｆ発現培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ａ１４３５１０４）で、３～４日ごとに継代培養された。Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞は、Ｅｘｐｉｆｅｃｔａｍｉｎｅを使用して２．５～３ｍｉｌｌ／ｍＬの細胞密度でトランスフェクトされた。Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞の各リットルについて、合計１ ｍｇのプラスミドＤＮＡ（ＶＨ－ＣＨ１（Ｆａｂ）またはＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３（ｍＡｂ）およびＬＣプラスミドを１：１の比で）を、５０ｍＬのＯｐｔｉｍｅｍ（ＧＩＢＣＯ、カタログ番号番号５１９８５－０２６、希釈Ａ）に希釈することによって、および２．７ｍＬのＥｘｐｉｆｅｃｔａｍｉｎｅを５０ｍＬのＯｐｔｉｍｅｍ（希釈Ｂ）に希釈することによって、トランスフェクションを実施した。同時導入を産生するＦａｂおよびｍＡｂの場合、ＶＨ－ＣＨ１およびＬＣプラスミド（Ｆａｂ）ならびにＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３およびＬＣプラスミド（ｍＡｂ）をそれぞれ１：１の比で使用した。希釈ＡおよびＢを混合し、室温で１０～２０分間インキュベートした。この後、導入混合物をＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞に加え、細胞を軌道回転（８５～１２５ ｒｐｍ）を有する加湿インキュベーター中で、３７℃でインキュベートした。導入一日後、導入された細胞を、５ｍｌのＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ２９３トランスフェクションエンハンサー１および５０ｍｌのＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ２９３トランスフェクションエンハンサー２で補充した。細胞培養上清は、遠心分離によって導入４～５日後に典型的に回収し、濾過した。
実施例３ Ｆａｂおよび抗体の精製および特徴付け
Ｆａｂ精製および特徴付け
Ｆａｂ分子の精製は、ｋａｐｐａＳｅｌｅｃｔ樹脂（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号１７－５４５８－１１）を使用したアフィニティークロマトグラフィー、およびＳｕｐｅｒｄｅｘ２００樹脂（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号１７－１０４３－０４）を使用した分子ふるいクロマトグラフィーから構成される２ステップのプロセスとして実施された。精製は、ＡｋｔａＥｘｐｌｏｒｅｒクロマトグラフィーシステム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号１８－１１１２－４１）を使用して行われた。アフィニティ精製工程に使用される緩衝液システムは、２０ｍＭのリン酸Ｎａ ｐＨ７．２、１５０ｍＭのＮａｃｌで構成される平衡緩衝液、１０ｍＭのギ酸ｐＨ３．５で構成される溶出緩衝液、および０．４Ｍのリン酸Ｎａ ｐＨ９．０で構成されるｐＨ調節緩衝液であった。細胞上清は、予め平衡化されたｋａｐｐａＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅカラムを調整することなく直接適用された。カラムを１０カラム容積の平衡緩衝液で洗浄し、Ｆａｂ分子を溶出緩衝液の約５カラム容積で均一濃度で溶出した。プールした画分のｐＨは、溶出直後に、記述されたｐＨ調節緩衝液を使用して中性に調節された。Ｆａｂ分子をさらに精製し、カラム内で予め包装された該ゲル濾過樹脂を用いて緩衝液を交換した。分子ふるいクロマトグラフィで使用されるランニング緩衝液は、２５ｍＭのＨＥＰＥＳおよび１５０ｍＭのＮａｃｌ、ｐＨ７．４であった。Ｆａｂ分子は、約０．５カラム容積で単一ピークとして溶出した。ピークをカバーする画分は、ＢＩＯＳｅｐ－ＳＥＣ－Ｓ３０００ ３００×７．８ｍｍカラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、カタログ番号００Ｈ－２１４６－Ｋ０）、ならびに２００ｍＭのリン酸Ｎａ ｐＨ６．９、３００ｍＭのＮａｃｌ、および１０ ％のイソプロパノールで構成されたランニング緩衝液を用いた、Ａｇｉｌｅｎｔ ＬＣ １１００／１２００システム上の分子ふるい高性能液体クロマトグラフィー（ＳＥ－ＨＰＬＣ）法を使用して分析した。この分析に基づき、画分をプールして均質なタンパク質調製を得た。最終調製物は、１ｍｌ／分の流量で約１０分の保持時間で、単一の対称ピークとして溶出した。
精製されたＦａｂ分子は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ／Ｃｏｏｍａｓｓｉｅおよび液体－クロマトグラフィー質量分析法解析を使用してさらに特徴付けられた。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ／Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ分析を、ＮｕＰａｇｅ ４－１２％ Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号ＮＰ０３２１ＢＯＸ）を用いて実施した。全てのＦａｂ分子は、予想される軽鎖および重鎖構成要素を示した。Ａｇｉｌｅｎｔ ６２１０計器および脱塩カラムＭａｓｓＰＲＥＰ（Ｗａｔｅｒｓ、カタログ番号ＵＳＲＭ１０００８６５６）における液体クロマトグラフィーエレクトロスプレーイオン化飛行時間型質量分析法のセットアップを使用して、インタクトな分子量決定を実施した。使用された緩衝液システムは、ＬＣ－ＭＳ等級－Ｈ２Ｏ中の０．１％ギ酸で構成される平衡緩衝液、およびＬＣ－ＭＳ等級－ＡＣＮ中の０．１％ギ酸で構成される溶出緩衝液であった。全てのＦａｂ分子は、配列にしたがって予想されるインタクトな分子質量を示した。最終純度は、ＳＥ－ＨＰＬＣ解析に基づいて決定された。純度推定値はすべて、異なるＦａｂ断片では９５～９９％であった。最終タンパク質濃度を決定するために、ＮａｎｏＤｒｏｐ分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を使用して２８０ｎｍでの吸光度測定を実施し、各Ｆａｂ分子の特定の吸光係数を使用して濃度を計算した。
抗体の精製および特徴付け
抗体の精製は、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ樹脂（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号１７－５４３８－０１）を用いたアフィニティークロマトグラフィで行われた。精製は、ＡｋｔａＥｘｐｌｏｒｅｒクロマトグラフィーシステム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号１８－１１１２－４１）を使用して行われた。アフィニティ精製工程に使用される緩衝液システムは、２０ｍＭのリン酸Ｎａ ｐＨ７．２、１５０ｍＭのＮａｃｌで構成される平衡緩衝液、１０ｍＭのギ酸ｐＨ３．５で構成される溶出緩衝液、および０．４Ｍのリン酸Ｎａ ｐＨ９．０で構成されるｐＨ調節緩衝液であった。細胞上清は、予め平衡化されたＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅカラムを調整することなく直接適用された。カラムを１０カラム容積の平衡緩衝液で洗浄し、抗体を溶出緩衝液の約２～５カラム容積で均一濃度で溶出した。プールした画分のｐＨは、溶出直後に、記述されたｐＨ調節緩衝液を使用して中性に調節された。
精製された抗体は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ／Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ、分子ふるい高圧液体－クロマトグラフィー（ＳＥ－ＨＰＬＣ）および液体－クロマトグラフィー質量分析法（ＬＣ－ＭＳ）解析を使用して特徴付けられた。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ／Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ分析を、ＮｕＰａｇｅ ４－１２％ Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号ＮＰ０３２１ＢＯＸ）を用いて実施した。ここで、全ての抗体は、予想される軽鎖および重鎖構成要素を示した。Ａｇｉｌｅｎｔ ６２１０計器および脱塩カラムＭａｓｓＰＲＥＰ（Ｗａｔｅｒｓ、カタログ番号ＵＳＲＭ１０００８６５６）における液体クロマトグラフィーエレクトロスプレーイオン化飛行時間型質量分析法のセットアップを使用して、インタクトな分子量決定を実施した。使用された緩衝液システムは、ＬＣ－ＭＳ等級－Ｈ２Ｏ中の０．１％ギ酸で構成される平衡緩衝液、およびＬＣ－ＭＳ等級－ＡＣＮ中の０．１％ギ酸で構成される溶出緩衝液であった。Ｎ－グリコシダーゼＦ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、カタログ番号１１３６５１７７００１）および還元剤（すなわち、メルカプトエタノールまたはＤＴＴ）を用いたり、用いなかったりして解析を行った。全ての抗体は、配列および一つの重鎖Ｎ－グリカンに従い、予想されるインタクトな分子量を示した。純度はＳＥ－ＨＰＬＣに基づいて決定された。最終タンパク質純度は、ＢＩＯＳｅｐ－ＳＥＣ－Ｓ３０００ ３００×７．８ｍｍカラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、カタログ番号００Ｈ－２１４６－Ｋ０）、ならびに２００ｍＭのリン酸Ｎａ ｐＨ ６．９、３００ｍＭのＮａｃｌ、および１０％のイソプロパノールで構成されたランニング緩衝液を用いた、Ａｇｉｌｅｎｔ ＬＣ １１００／１２００システム上のＳＥ－ＨＰＬＣ法セットアップに基づいて分析した。検出のためにＵＶ２８０および蛍光（Ｅｘ ２８０ｎｍ／Ｅｍ ３５４ｎｍ）検出器を使用した。抗体は、抗体のサイズを反映する保持時間と共に、単一の対称ピークとして溶出された。純度推定値はすべて、異なる抗体では９５～９９％であった。最終タンパク質濃度を測定するために、ＮａｎｏＤｒｏｐ分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を、各抗体の特定の吸光係数と共に使用した。
実施例４ 抗ＦＩＸａ刺激抗体の結合
ＦＸに対するＦＩＸａの酵素活性を刺激することができるとして選択された抗体は、ビニング実験で解析され、以下に記載の方法を使用して特定された抗体の結合特性を決定した。
抗体のビニング方法
ビニング実験は、抗ヒトＩｇＧセンサー（Ｐａｌｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、米国カリフォルニア州メンローパーク）を備えたＯｃｔｅｔ ｆｏｒｔｅｂｉｏシステム（ＨＴＸ、Ｒｅｄ３８４）、および８または３２チャネルモード（Ｒｅｄ３８４およびＨＴＸ）を使用して実施された。ビニングアッセイは、古典的なサンドイッチエピトープビニングの設定を使用して実施された。簡潔に述べると、（１）一次抗体は、抗ヒトＡＨＣチップ（抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ捕捉チップ（ＡＨＣ部品番号１８－５０６４）により捕捉され、（２）ＡＨＣチップ上の非ブロックＩｇＧ結合部位は、ヒトポリクローナルＩｇＧ（Ｉ４５０６ ＳＩＧＭＡ社）によってブロックされ、（３）ＦＩＸａは一次抗体に結合しており、（４）競合する抗体がチップ上の抗体－抗原複合体に提示され、二次抗体の結合が検出されない場合、抗体は同じビンに属すると評価された。
分析は、それぞれ抗体ｍＡｂ０－１８８６およびｍＡｂ１－１３０７によって定義される二つの異なるビン、ビン１および２を特定した。
抗ＦＩＸ抗体のビニング
選択された抗ＦＩＸ抗体は、互いにビニングされ、二つの異なるビン（ビン１および２）が特定された。数字はｍＡｂ番号を指し、例えば０－１９９８はｍＡｂ０－１９９８を示す。
Figure 0007366747000003
概要は、いくつかの抗体が、ｍＡｂ０－１８８６およびｍＡｂ０－１９９８を含む、ビン１に属することが見いだされたことを示している。ビン２は、ｍＡｂ１－１３０７に加えて、四つの抗体を含むことが見出された。二つの抗体、ｍＡｂ１－００７２およびｍＡｂ１－００７３は、ビン１および２に共通した。
本明細書に開示される親抗体（系統）の変異体は、親抗体を有するビンおよびエピトープ（ホットスポット）残基を共有する。
本実施例でデータが提供される抗体変異体は、実施例５で提供される親抗体－ＦＩＸａ複合体の結晶構造に基づいて、エピトープ認識に重要であることが示された位置にアミノ酸置換を含まないため、当業者であれば、開始点としての変異体が同じビンに属し、結合について競合し、それらが由来する抗体、すなわち、ｍＡｂ０－１９９８、ｍＡｂ０－１８８６、またはｍＡｂ１－１３０７と少なくとも同じホットスポット残基を、ＦＩＸ／ＦＩＸａエピトープ内に認識することを理解するであろう。
実施例５ Ｘ線結晶化を使用した抗ＦＩＸ／ＦＩＸａ抗体の結晶化およびエピトープマッピング
結晶化に使用されるＦＩＸａタンパク質（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｗｏｒｋｓ、プロダクトコード１０３１６）は、細菌発現の結果としてＮ末端に結合した非天然メチオニン残基を有する切断型軽鎖（配列番号１の残基８５～１４２）、および配列番号１の残基１８１～４１５を含有する重鎖で構成される。プロテアーゼの活性部位は、ＥＧＲ－クロロメチルケトンによって遮断される。
結晶化
Ｆａｂ０－７２３７：ＦＩＸａ
ＦＩＸａタンパク質と１対１モル比で混合したＦａｂ０－７２３７（ｍＡｂ０－１８８６に対応するＦａｂ断片）の結晶を、１８ °Ｃでハンギングドロップ蒸気拡散法で成長させた。２０ｍＭのＴｒｉｓ－Ｈｃｌ、ｐＨ７．４、５０ｍＭのＮａＣｌ、および２．５ｍＭのＣａＣｌ２ 中の０．８μｌ ７．５ｍｇ／ｍｌのタンパク質溶液を、等量の４Ｍギ酸ナトリウムと沈殿剤として混合し、１ｍｌの沈殿剤でインキュベートした。
Ｆａｂ０－７２３８：ＦＩＸａ
ＦＩＸａタンパク質と１対１モル比で混合したＦａｂ０－７２３８（ｍＡｂ０－１９９８に対応するＦａｂ断片）の結晶を、１８°Ｃでシッティングドロップ蒸気拡散法で成長させた。２０ｍＭのＴｒｉｓ－Ｈｃｌ、ｐＨ７．４、５０ｍＭのＮａＣｌ、および２．５ｍＭのＣａＣｌ２中の０．１μｌ ６．２ｍｇ／ｍｌのタンパク質溶液を、０．１μｌの１００ｍＭカコジル酸ナトリウム、ｐＨ ６．５および１ Ｍクエン酸三ナトリウムと沈殿剤として混合し、６０μｌの沈殿剤でインキュベートした。
Ｆａｂ０－７２３６：ＦＩＸａ
ＦＩＸａタンパク質と１対１モル比で混合したＦａｂ０－７２３６（ｍＡｂ１－１３０７に対応するＦａｂ断片）の結晶を、１８°Ｃでシッティングドロップ蒸気拡散法で成長させた。２０ｍＭのＴｒｉｓ－Ｈｃｌ、ｐＨ７．４、５０ｍＭのＮａＣｌ、および２．５ｍＭのＣａＣｌ２中の０．１μｌ ６．４ｍｇ／ｍｌのタンパク質溶液を、等量の０．２Ｍの硫酸リチウム、４０（ｖ／ｖ）％のＰＥＧ４００、および０．１ＭのＴｒｉｓ ｐＨ ８．５と沈殿剤として混合し、１ｍｌの沈殿剤でインキュベートした。
回折データ収集
Ｆａｂ０－７２３７：ＦＩＸａ
結晶は、液体窒素でフラッシュ冷却する前に、３Ｍのギ酸ナトリウム、４％のグリセロール、４％のエチレングリコール、４．５％のスクロース、および１％のグルコースからなる溶液中で凍結保護された。回折データを、ＤｅｃｔｒｉｓのＰｉｌａｔｕｓ２Ｍ画素検出器を使用して、Ｓｗｉｓｓ Ｌｉｇｈｔ ＳｏｕｒｃｅビームラインＸ０６ＤＡ（１．００００Å波長）で１００Ｋで収集した。データの自動インデックス、統合およびスケーリングは、ＸＤＳパッケージからのプログラムで実行された（回析データ統計を表１に要約する）。
Ｆａｂ０－７２３８：ＦＩＸａ
結晶は、液体窒素でフラッシュ冷却する前に、７５ｍＭのカコジル酸ナトリウム ｐＨ６．５、および０．７５Ｍのクエン酸三ナトリウム、４％のグリセロール、４％のエチレングリコール、４．５％のスクロース、および１％のグルコースからなる溶液中で凍結保護された。回折データを、ＤｅｃｔｒｉｓのＰｉｌａｔｕｓ２Ｍ画素検出器を使用して、Ｓｗｉｓｓ Ｌｉｇｈｔ ＳｏｕｒｃｅビームラインＸ０６ＤＡ（１．００００Å 波長）で１００Ｋで収集した。データの自動インデックス、統合およびスケーリングは、ＸＤＳパッケージからのプログラムで実行された（回析データ統計を表１に要約する）。
Ｆａｂ０－７２３６：ＦＩＸａ
三つの結晶は、液体窒素中のフラッシュ冷却の前に、０．１５Ｍの硫酸リチウム、３０（ｖ／ｖ）％のＰＥＧ４００、および０．０７５ＭのＴｒｉｓ ｐＨ８．５、４％のグリセロール、４％のエチレングリコール、４．５％のスクロース、および１％のグルコースからなる溶液中で凍結保護された。回折データを、ＤｅｃｔｒｉｓのＰｉｌａｔｕｓ２Ｍ画素検出器を使用して、Ｓｗｉｓｓ Ｌｉｇｈｔ ＳｏｕｒｃｅビームラインＸ０６ＤＡ（１．００００Å波長）で１００Ｋで収集した。データの自動インデックス、統合、併合およびスケーリングは、ＸＤＳパッケージからのプログラムで実行された（回析データ統計を表１に要約する）。
構造の決定と改良
Ｆａｂ０－７２３７：ＦＩＸａ
構造は、タンパク質データバンクエントリ４ＮＰ４のＨ鎖およびＬ鎖、ならびにタンパク質データバンクエントリ３ＫＣＧのＨ鎖およびＬ鎖を含むプログラムスイートＰｈｅｎｉｘで実装されたＰｈａｓｅｒを使用した分子置換によって決定された。非対称ユニットは、二つのＦａｂ：ＦＩＸａ複合体を含む。モデルは、ＣＯＯＴにおいて、Ｐｈｅｎｉｘ改良および手動再構築の工程を使用して改良された。改良統計が表１に示される。
Ｆａｂ０－７２３８：ＦＩＸａ
構造は、タンパク質データバンクエントリ４ＰＵＢのＨ鎖およびＬ鎖、ならびにタンパク質データバンクエントリ３ＫＣＧのＨ鎖およびＬ鎖を含むプログラムスイートＰｈｅｎｉｘで実装されたＰｈａｓｅｒを使用した分子置換によって決定された。非対称ユニットは、二つのＦａｂ：ＦＩＸａ複合体を含む。モデルは、ＣＯＯＴにおいて、Ｐｈｅｎｉｘ改良および手動再構築の工程を使用して改良された。改良統計が表１に示される。
Ｆａｂ０－７２３６：ＦＩＸａ
上記のＦａｂ０－７２３８：ＦＩＸａ複合体の複雑な構造のＦａｂ部分とタンパク質データバンクエントリ３ＫＣＧからのＨ鎖およびＬ鎖を含むプログラムスイートＰｈｅｎｉｘで実装されたＰｈａｓｅｒを使用した分子置換により、構造を決定した。非対称ユニットは、一つのＦａｂ：ＦＩＸａ複合体を含む。モデルは、ＣＯＯＴにおいて、Ｐｈｅｎｉｘ改良および手動再構築の工程を使用して改良された。改良統計が表１に示される。
表１－データ収集および改良統計
Figure 0007366747000004
Figure 0007366747000005
エピトープの決定
上記に基づき、ｍＡｂ０－１９９８、ｍＡｂ１－１３０７、およびｍＡｂ０－１８８６が、エピトープが抗体の重原子から３．５Åの距離内で少なくとも一つの重原子を有する残基として定義される、ＦＩＸａ上の異なるエピトープに結合することが見出された。
ｍＡｂ０－１９９８エピトープは、１７０ループに位置し、プロテアーゼドメイン内の以下の残基を含む：Ｌ３３７、Ｒ３３８、Ｓ３３９、Ｔ３４０、Ｋ３４１、およびＴ３４３。
ｍＡｂ１－１３０７エピトープは以下の残基を含む：Ｈ２５６、Ｈ２５７、Ｎ２５８、Ｋ２９３、Ｒ４０３、Ｙ４０４、Ｎ４０６、Ｗ４０７、Ｅ４１０およびＫ４１１。
ｍＡｂ０－１８８６エピトープは、１７０らせんに位置し、プロテアーゼドメイン内の以下の残基を含む：Ｋ３０１、Ｄ３３２、Ｒ３３３、Ａ３３４、Ｔ３３５、Ｒ３３８およびＮ３４６。
ｍＡｂ０－１９９８およびｍＡｂ０－１８８６のエピトープは、重複することが見いだされた。これは二つの抗体がＦＩＸ／ＦＩＸａ（実施例４）への結合をめぐって競合するという観察結果と十分に一致する。
本明細書に開示される親抗体（系統）の変異体は、親抗体を有するビンおよびエピトープ（ホットスポット）残基を共有する。
上記実施例４および以下の特定の実施例でデータが提供される抗体変異体は、本実施例で提供される親抗体－ＦＩＸａ複合体の結晶構造に基づいて、エピトープ認識に重要であることが示された位置にアミノ酸置換を含まないため、当業者であれば、開始点としての変異体が同じビンに属し、結合について競合し、それらが由来する抗体、すなわち、ｍＡｂ０－１９９８、ｍＡｂ０－１８８６、またはｍＡｂ１－１３０７と少なくとも同じホットスポット残基を、ＦＩＸ／ＦＩＸａエピトープ内に認識することを理解するであろう。
実施例６ ＦＸａ生成アッセイにおける二価抗ＦＩＸ／ＦＩＸａ抗体の活性
二価抗ＦＩＸ／ＦＩＸａ抗体のＦＸに対するＦＩＸａの酵素活性への刺激効果は、Ｓｃｈｅｉｆｌｉｎｇｅｒら、（２００８）Ｊ Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ、６：３１５－３２２により説明された原理による血液凝固リン脂質膜の存在下でＦＩＸａによるＦＸ活性化を促進する能力から決定された。Ｓｃｈｅｉｆｌｉｎｇｅｒらによって特定された抗体中で抗ＦＩＸａ抗体２２４Ｆ３の高い活性を考えると、２２４Ｆ３は、以下の実験の参照として選択された（２２４Ｆ３構造の情報のための実施例１を参照）。
ＦＸのＦＸａへのＦＩＸａ媒介活性化に対する抗ＦＩＸａ抗体の刺激効果は、３８４ウェルプレートでの自動化高処理量生化学アッセイで測定された。簡潔に述べると、ＦＩＸａを４点５倍用量反応で精製抗体と混合した。ＦＸ／リン脂質（ＰＬ）混合物を加え、ＦＸａ基質（Ｐｅｐｈａｆｏｕｒ）を追加することによってＦＸａ生成を測定し、マルチラベルリーダー（ＰｈｅｒａＳＴＡＲ）で５分間蛍光を検出することによって基質加水分解速度を測定した。ＦＩＸａの相対的刺激活性は、ＦＩＸａ－抗体複合体対ＦＩＸａ単独からのＦＸａ生成の割合として計算された。
各抗体は、ヒト血漿由来ＦＸ（Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ、米国）を、１５０ｎＭの濃度に加える前に、アッセイ緩衝液（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ２、０．１％（ｗ／ｖ）のＰＥＧ８０００、ｐＨ７．３＋１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ）中で、３ｎＭのヒト血漿由来ＦＩＸａ（Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ、米国）および１０μＭ ２５：７５のホスファチジルセリン：ホスファチジルコリン脂質ベシクル（Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ、米国）と共に１０分間のプレインキュベーションにより、０～２００ｎＭの濃度範囲で試験された。室温で１０分の活性化後、反応物（５０μｌ）を２５μｌの冷却緩衝液（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１００ｍＭのＮａｃｌ、６０ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％のＰＥＧ８０００、ｐＨ７．３ ＋ １ ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ）の添加によりクエンチした。次いで、２５μｌの２ｍＭ Ｓ－２７６５発色基質（Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ、スウェーデン）を添加し、マイクロプレートリーダーで４０５ｎｍの吸光度測定（ΔＯＤ／分）により発色基質変換を測定することによって、生成されるＦＸａの量を決定した。各抗体濃度でのＦＸａ生成率は、公知量のヒト血漿由来ＦＸａ（Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ、米国）で作製された標準曲線から決定された。
表２に、試験した濃度で各抗体の測定されたＦＸａ生成率を示す。ここから、２２４Ｆ３のそれと比較して観察された最大ＦＸａ生成率として、各抗体のピーク刺激活性が計算された。このデータは表３に示されており、三つのファミリー（それぞれ、０－１８８６、０－１９９８、および１－１３０７）のそれぞれに属する抗体は、２２４Ｆ３（Ｓｃｈｅｉｆｌｉｎｇｅｒら）で観測されたものよりも１０～６７倍高い活性を有することを示す。
表２－ＦＸａ生成率
示された抗ＦＩＸ／ＦＩＸａ抗体に対するｐＭ／分（平均±ＳＤ、ｎ ＝ ２）のＦＸａ生成率。各抗体は、第一のカラムに示されるように０～２００ｎＭの濃度範囲で試験された。
Figure 0007366747000006
表３－ピーク刺激活性
ＦＸａ生成アッセイでの２２４Ｆ３（Ｓｃｈｅｉｆｌｉｎｇｅｒら）に対する抗ＦＩＸ／ＦＩＸａ抗体のピーク刺激活性（平均±ＳＤ、ｎ＝２）。
Figure 0007366747000007
実施例７ 一価（ワンアームド）抗体の調製
従来的な単一特異性および二価抗体、例えば、ＦＸａ生成アッセイ（実施例８）および特定のＳＰＲ実験（実施例１４および１５）に関連する潜在的なアビディティー効果を避けるために、一価のワンアームド（ＯＡ）抗体型を使用した。Ｍａｒｔｅｎｓら。Ａ Ｎｏｖｅｌ Ｏｎｅ－Ａｒｍｅｄ Ａｎｔｉ－ｃ－Ｍｅｔ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｉｎｈｉｂｉｔｓ Ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ Ｇｒｏｗｔｈ Ｉｎ ｖｉｖｏ．Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１２、６１４４－６１５２（２００６）に記載されるように、全重鎖、切断型重鎖（Ｆａｂ領域を欠く）および軽鎖は共発現される。Ｍａｒｔｅｎｓらによって記述された三つの鎖の共発現の代わりに、本発明では、二重特異性抗体ついて記載されたＤｕｏｂｏｄｙ（登録商標）を使用して、一価抗体を調製した（実施例１０）。したがって、一価抗体は、完全単一特異性および二価抗体と、切断型重鎖二量体（正式にはＦａｂ領域を除去することにより完全な抗体に由来する）を混合することにより調製され、実施例１０に記載される同じ実験条件下で鎖の交換を進めることができた。一価抗体の形成には、実施例１０に記載されるように、抗体および切断型重鎖二量体が、ヘテロ二量体化を促進するために適切な相補的変異を持っていることが必要である、すなわち、ＩｇＧ１に対してＦ４０５Ｌ／Ｋ４０９Ｒ、およびＩｇＧ４に対してＦ４０５Ｌ＋Ｒ４０９Ｋ／ＷＴ。
ＩｇＧ１サブタイプの一価抗体の場合、重鎖の切断は、Ｎ末端からＣｙｓ２２０と上部ヒンジＣｙｓ２２６（ＥＵナンバリング）の間の位置までとすることができる。切断型ＩｇＧ１重鎖の特定の例は、残基１～２２０が切断されることである。
ＩｇＧ４サブタイプの一価抗体の場合、重鎖の切断は、Ｎ末端からＣｙｓ２００と上部ヒンジＣｙｓ２２６（ＥＵナンバリング）の間の位置までとすることができる。切断型ＩｇＧ４重鎖の特定の例は、残基１～２１４が切断されることである。
実施例８ ＦＸａ生成アッセイにおける一価抗ＦＩＸ／ＦＩＸａ抗体の活性
従来の抗体型の二価の結果として生じる潜在的なアビディティー効果を避けるために、ＦＸに対するＦＩＸａ酵素活性の抗ＦＩＸ／ＦＩＸａ抗体の刺激活性が、一価のワンアームド（ＯＡ）抗体型への再フォーマット後に決定された（実施例８参照）。試験した抗体を以下の表４に示す。実施例７でも参照される抗ＦＩＸａ抗体２２４Ｆ３（ｍＡｂ１－１５８２と表示）の一価ＯＡバージョンは、比較のために含めた。
ＯＡ抗体の刺激活性を、ホスファチジルセリン（ＰＳ）：ホスファチジルコリン（ＰＣ）脂質ベシクル（最終濃度５００μＭ、Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ、米国）および血漿由来ＦＩＸａ（最終濃度０．１７、０．５または１ｎＭ；Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ、米国）の固定濃度で、アッセイ緩衝液（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１００ｍＭのＮａｃｌ、５ｍＭのＣａＣｌ２、０．１％（ｗ／ｖ）のＰＥＧ８０００、ｐＨ７．３＋１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ）で測定した。ＦＩＸａの濃度は、基質ＦＸの１５％未満がＦＸａに変換されることを確実にするために選択された。一価ＯＡ抗体（表１に示された最終濃度）の存在下でのプレインキュベーション後、１５０ｎＭの血漿由来ＦＸを添加して、５０μｌの最終反応体積を得、室温で２０分間活性化させた。次いで反応物は、２５μｌの冷却緩衝液（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１００ｍＭのＮａＣｌ、６０ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％のＰＥＧ８０００、ｐＨ７．３＋１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ）を追加することによりクエンチし、２５μｌの２ｍＭ Ｓ－２７６５発色基質（Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ、スウェーデン）をさらに添加し、マイクロプレートリーダーで４０５ｎｍの吸光度測定（ΔＯＤ／分）により発色基質変換を測定することによって、生成されるＦＸａの量を決定した。測定された活性は、同じアッセイで測定したシグナルを減算することによってバックグラウンド活性に対して補正されたが、ＦＩＸａと抗体はアッセイ緩衝液で置き換えられ、その後、アッセイに存在するＦＩＸａ濃度にしたがって正規化された（［ＦＩＸａ］ｔｏｔａｌ）。この数値を、抗体の非存在下でのＦＸａ生成の同様に正規化された割合で割ることにより（ＡＦＩＸａ、ｎｏｒｍ）、使用される濃度の抗体によるＦＩＸａ活性の何倍かの刺激を提供する抗体刺激指数が計算された。遊離ＦＩＸａによるＦＸａの生成速度が遅いため、抗体の非存在下での活性化反応を上記のように行ったが、５、１０、または２０ｎＭのＦＩＸａが存在した。次いで、測定された活性をバックグラウンドで減算し、アッセイのＦＩＸａ濃度にしたがって正規化した。刺激指数の計算には、遊離ＦＩＸａの三つの正規化された活性の平均を使用した。
刺激指数の決定
要約すると、刺激指数の計算について以下のように説明することができる。
刺激指数＝（（ＡＦＩＸａ ＋ＯＡ － Ａｂｃｋｇ）／［ＦＩＸａ］ｔｏｔａｌ）／ＡＦＩＸａ、ｎｏｒｍ
式中、ＡＦＩＸａ＋ＯＡは、ＯＡ抗体の存在下で測定される活性であり、Ａｂｃｋｇは、ＦＩＸａおよび一価抗体の非存在下で測定されるバックグラウンド活性であり、［ＦＩＸａ］ｔｏｔａｌは、アッセイのＦＩＸａ濃度であり、ＡＦＩＸａ、ｎｏｒｍは、遊離ＦＩＸａの平均正規化活性である。
ＦＩＸａ飽和の決定
アッセイで、ＯＡ抗体で飽和したＦＩＸａの割合は、ＦＩＸａとＯＡ抗体の濃度、およびそれらの相互作用を支配する平衡解離定数（Ｋｄ）によって決定される。後者は、等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）などの当分野で公知の技術によって測定することができる。
ＦＩＸａの飽和に達するまで、ＯＡ抗体の濃度が増加するにつれて刺激指数が増加するため、アッセイ中のＯＡ抗体の濃度は、アッセイ中のＦＩＸａが少なくとも８０％飽和するように選択し、ＦＩＸａが完全に飽和した状態での刺激指数を適切に推定する必要がある。
平衡状態でＯＡ抗体に結合したＦＩＸａの画分（ｆＦＩＸａ＋ＯＡ）は、アッセイのＦＩＸａ（［ＦＩＸａ］ｔｏｔａｌ）およびＯＡ（［ＯＡ］ｔｏｔａｌ）の総濃度、および二次結合式を使用した相互作用の平衡解離定数（Ｋｄ）から計算でき、これはＫｒｉｓｈｎａｓｗａｍｙら、（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６７：２３６９６－２３７０６に記載され、以下の式１および２に詳述されている。
は、アッセイにおける平衡でのＦＩＸａ－ＯＡ抗体複合体の計算された濃度を表す。
は、アッセイにおける平衡でのＯＡ抗体に結合しているＦＩＸａの計算された割合を（パーセントで）表す。
式１．
式２．
各一価ＯＡ抗体に対する刺激指数が表４に提供されている。すべての試験された抗体について、測定された刺激指数は、一価のワンアームド２２４Ｆ３抗体（ｍＡｂ１－１５８２）に対して測定されたものよりも高いことが見いだされた。
アッセイにおいて、３２６０ｎＭのワンアームド２２４Ｆ３抗体の濃度、およびＫｅｒｓｃｈｂａｕｍｅｒら（ＵＳ７２９７３３６－Ｂ２）によって報告された０．４７７ｎＭのＦＩＸａとの相互作用のＫｄで、９５％を超えるＦＩＸａは、アッセイにおいて、ワンアームド２２４Ｆ３抗体に結合した。
表４－一価ワンアームド（ＯＡ）抗ＦＩＸａ抗体によるＦＩＸａ活性の刺激
抗ＦＩＸ ｍＡｂ ＩＤは、ＯＡ形式への再フォーマットに使用される抗体のＩＤを指す。「ＯＡ抗体濃度（ｎＭ）」および「刺激指数」と表示した列は、アッセイで使用されるＯＡ抗体（ｎＭ）の濃度および遊離ＦＩＸａに対して測定されたＦＩＸａ活性の対応する刺激を示す。
Figure 0007366747000012
実施例９ 抗ＦＸ／ＦＸａ ＦａｂおよびｍＡｂ発現プラスミドの開発
本明細書に開示される抗ＦＸ／ＦＸａ抗体は、標準抗体開発方法を使用して開発され、発現プラスミドは、抗ＦＩＸ／ＦＩＸａ ＦａｂおよびｍＡｂ発現プラスミドについて実施例１に記載されるように調製された。実施例２および３の抗ＦＩＸ／ＦＩＸａ抗体について記載されるように、抗ＦＸ／Ｘａ抗体の発現、精製および特徴付けを同様に行った。
実施例１０ インビトロアセンブリによって調製された二重特異性抗体
二重特異性抗体は、二重特異性ＩｇＧ１抗体について記載した（Ｌａｂｒｉｊｎら、ＰＮＡＳ、２０１３、ｖｏｌ．１１０、ｐｐ．５１４５－５１５０）Ｄｕｏｂｏｄｙ（登録商標）法（Ｇｅｎｍａｂ）による一次および二次抗体のインビトロアセンブリによって、以下に詳述される二重特異性ＩｇＧ４抗体のわずかに改変された変異体を使用して生成される。
ＩｇＧ１の場合、一次抗体の重鎖定常領域はＩｇＧ１ Ｋ４０９Ｒ（抗ＦＩＸ／ＦＩＸａ）であり、二次抗体の重鎖定常領域はＩｇＧ１ Ｆ４０５Ｌ（抗ＦＸ／ＦＸａ）である。ＩｇＧ１は、前述のように、エフェクター機能が低下したＩｇＧ１変異体であってもよい。
ＩｇＧ４の場合、一次抗体の重鎖定常領域はＩｇＧ４ Ｓ２２８Ｐ（抗ＦＩＸ／ＦＩＸａ）であり、二次抗体の重鎖定常領域はＩｇＧ４ Ｓ２２８Ｐ Ｆ４０５Ｌ Ｒ４０９Ｋ（抗ＦＸ）である。二つの親抗体は、実施例１～３に記載されるように産生される。Ｆａｂアーム交換反応は、７５ｍＭの２－メルカプトエチルアミン（２－ＭＥＡ）を使用した還元条件下でＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）中で実施され、３０°Ｃで３時間インキュベートされる。
実施例１１ 二重特異性抗体の血液凝固活性
抗ＦＩＸａ抗体と抗ｈＦＸ抗体との対は、上記のＤｕｏｂｏｄｙ（登録商標）技術の手段により、二重特異性抗体に作製された（実施例１０）。二重特異性抗体は、以下の段落に記載されるように、上述のＦＸａ生成アッセイ（実施例６）およびトロンビン生成試験（ＴＧＴ）などの様々なアッセイにおける血液凝固活性について試験された。
トロンビン生成試験（ＴＧＴ）アッセイ
ＴＧＴは、カオリントリガーを使用した自動化ＨＴＰ ３８４ウェルセットアップで行われた（Ｈａｅｍｏｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、＃６３００）。簡潔に述べると、抗体を１１１ｎＭの濃度で（５５ｎＭで追加されたｍＡｂ１－１３７１および１６６ｎＭで追加されたｍＡｂ１－００２１を除き）血友病Ａ（ＨＡ）プラズマ（Ｇｅｏｒｇｅ Ｋｉｎｇ）に加えた。次いで、リン脂質（Ｒｏｓｓｉｘ、＃ＰＬ６０４Ｔ）と混合したカオリンを加え、その後ＦＩＩａ基質を添加した（ＦｌｕＣａ、Ｔｈｒｏｍｂｉｎｏｓｃｏｐｅ、＃ＴＳ５０．００）。蛍光を、１分間隔で２時間、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＥｎＶｉｓｉｏｎのマルチラベルプレートリーダー上で測定した。ピークの高さは、トロンボグラムで観察された最大値として計算され、その後、参照抗ＦＩＸａおよび抗ＦＸ抗体について観察されたピークの高さに正規化した。参照には常に、ｍＡｂ１－４７０７、ｍＡｂ１－５７８８およびｍＡｂ１－４８５７で表される三つのファミリーの各々からのＦＩＸドメインと組み合わせて、抗ＦＸ抗体ｍＡｂ１－２３７５（配列番号９３および９４により識別）からの結合ドメインが含まれる。抗体を、低い（０～２４％）、＋（２４～５０％）、＋＋（５０％～７５％）および＋＋＋（＞７５％）として相対的ＴＧＴ－活性にしたがってグループ化し、＋が好ましく、＋＋がより好ましく、＋＋＋は最も好ましい。
二重特異性抗ＦＩＸａ／抗ＦＸ抗体の好ましい組み合わせの選択
三つの系統ｍＡｂ１－１３０７、ｍＡｂ０－１８８６およびｍＡｂ０－１９９８に属する抗ＦＩＸａ抗体変異体と組み合わせて、多数の抗ＦＸ抗体を二重特異性抗体として試験した。ＴＧＴアッセイにおける有意な活性を示す抗ＦＩＸａ／抗ＦＸ対の選択された組み合わせを表５に示す。
表５－二重特異性抗体の血液凝固活性
選択された抗ＦＩＸａ／抗ＦＸ二重特異性抗体の対は、ＴＧＴアッセイ中でその活性と共に示される（上述のように）。二重特異性抗体（Ｄｕｏｂｏｄｙ）は、ＩｇＧ１であったＩｇＧ１－００２１、ｍＡｂ１－１３３５、およびｍＡｂ１－０９８５を除き、ＩｇＧ４サブタイプであった。
Figure 0007366747000013
Figure 0007366747000014
 表５から明らかとなるように、二重特異性抗体によって示される活性レベルは、特定の抗ＦＩＸａ／抗ＦＸ組み合わせに依存する。例えば、抗ＦＸ抗体ｍＡｂ１－６７２３は、抗ＦＩＸａ抗体ｍＡｂ０－１９９８と組み合わせて、強い活性（＋＋＋）を示し、一方でｍＡｂ１－６７２３の活性は、ｍＡｂ０－１８８６（＋）およびｍＡｂ１－１３０７（＋）と組み合わせて低い。
実施例１２ 抗ＦＸ抗体のビニング
抗ｈＦＩＸａ抗体（実施例１１）と組み合わせた二重特異性抗体型における有意なＴＧＴ活性を示す特定の抗ＦＸ抗体は、ＦＩＸａをＦＸで置換することを除いて、抗ＦＩＸａ抗体（実施例４）について説明したものと同じセットアップを使用するＯｃｔｅｔ ｆｏｒｔｅｂｉｏ ｓｙｓｔｅｍｓを使用して、互いにビニングした。
分析は、それぞれ抗体ｍＡｂ１－１３７１、ｍＡｂ１－１３７６、ｍＡｂ１－６７２３、ｍＡｂ１－７４４７およびｍＡｂ１－７４４９によって定義される五つの異なるビンＡ～Ｅを特定した。二つのビン、ビンＡおよびビンＥはそれぞれ、単一の抗ＦＸ抗体によってのみ表される（表６参照）。
多数のクローンがビンＣでｍＡｂ１－６７２３と競合していることが確認された。
表６－抗ＦＸ抗体のビニング
選択された抗ＦＸ抗体は互いにビニングされ、五つの異なるビン（ビンＡ－Ｅ）が特定された。数字は抗体ＩＤを指し、例えば１－６７２３はｍＡｂ１－６７２３を示す。
Figure 0007366747000015
 実施例１３ Ｘ線結晶化を用いた抗ＦＸ抗体の結晶化およびエピトープマッピング
結晶化
Ｆａｂ０－８９５４（ｍＡｂ１－６７２３に対応するＦａｂ断片）をＦＸと複合体で結晶化する試みは失敗したが、活性部位阻害ＦＸａを有する良質な結晶が得られた。したがって、活性部位阻害ｄｅｓ－ｇｌａ ＦＸａ（ヒトＥＧＲ阻害因子Ｘａ ｇｌａドメインレス（野生型）細菌発現、Ｌｏｔ＃ ｈＧＤＦＸＡＥＧＲ－０２２、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ ＰｒｏｔｅｉｎＷｏｒｋｓ）と１：１モル比で混合されたＦａｂ０－８９５４の結晶は、１８℃でシッティングドロップ蒸気拡散技術を使用して成長させた。２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．４、５０ｍＭのＮａＣｌ、および２．５ｍＭのＣａＣｌ２中の、１５０ｎｌの６．７ｍｇ／ｍｌ複合体のタンパク質溶液は、沈殿剤として、５０ｎｌの０．２Ｍの酢酸マグネシウム、０．１Ｍのカコジル酸ナトリウム、ｐＨ６．５、２０％（ｗ／ｖ）のＰＥＧ ８０００と混合し、６０μｌの沈殿剤を介してインキュベートした。
回折データ収集
結晶は、液体窒素でフラッシュ冷却する前に、結晶化ドロップに２０％のエチレングリコールを加えた１μｌの沈殿剤の添加により凍結保護した。回折データを、ＤｅｃｔｒｉｓのＰｉｌａｔｕｓ２Ｍ画素検出器を使用して、Ｓｗｉｓｓ Ｌｉｇｈｔ ＳｏｕｒｃｅビームラインＸ０６ＤＡ（１．００００Å波長）で１００Ｋで収集した。データの自動インデックス、統合およびスケーリングは、ＸＤＳパッケージからのプログラムで実行された（回析データ統計を表７に要約する）。
構造の決定と改良
非対称ユニットは、Ｍａｔｔｈｅｗｓ係数解析から判断された四つのＦａｂ：ＦＸａ複合体を含む。構造は分子置換によって決定された。プログラムスイートＰｈｅｎｉｘに実装されたＰｈａｓｅｒは、四つのＦａｂを局在化する検索モデルとして、タンパク質データバンク入力５Ｉ１ＫのＨ鎖とＬ鎖と併用された。これらは、ＣＯＯＴ を使用して正しいアミノ酸配列を用いて構築され、その後Ｐｈｅｎｉｘ改良を使用して改良された。検索モデルとしてタンパク質データバンク入力１Ｇ２ＬからのＡ鎖およびＢ鎖を用いて、ＣＣＰ４スイートからＭｏｌｒｅｐで分子置換を適用しながら、改良されたＦａｂモデルは修正された。四つのＦＸａ断片が見つかった。モデルは、ＣＯＯＴにおいて、Ｐｈｅｎｉｘ改良および手動再構築の工程を使用して改良された。改良統計が表７に示される。
表７－データ収集および改良統計
Figure 0007366747000016
エピトープの決定
Ｆａｂ０－８９５４：ＦＸａ複合体の結晶構造は、非対称なユニット内に複合体の四つのコピーを持ち、これらを個別に分析して、３．５Åカットオフ距離を使用してエピトープおよびパラトープを特定した。
ユニットセル内のＦａｂ０－８９５４：ＦＸａ複合体の四つのコピーの少なくとも一つで３．５Åの距離基準を満たす場合、ｍＡｂ１－６７２３のエピトープに残基が含まれる。ｍＡｂ１－６７２３のエピトープ残基およびパラトープ残基を表８に列挙する。
表８ ｍＡｂ１－６７２３のエピトープおよびパラトープ
ＦＸ／ＦＸａ（配列番号２）のＥＧＦ－２およびプロテアーゼドメインにおけるｍＡｂ１－６７２３のエピトープ残基を、それぞれ第一および第二の列に列挙する。抗体ＶＨ（配列番号２１）およびＶＬ（配列番号２２）のパラトープ残基は、それぞれ列３および４に列挙されている。
Figure 0007366747000017
本明細書に開示される親抗体（系統）の変異体は、親抗体を有するビンおよびエピトープ（ホットスポット）残基を共有する。
本明細書の実施例でデータが提供される抗体変異体は、本実施例で提供される親抗体－ＦＸａ複合体の結晶構造に基づいて、エピトープ認識に重要であることが示された位置にアミノ酸置換を含まないため、当業者であれば、開始点としての変異体が同じビンに属し、結合について競合し、それらが由来する抗体、すなわち、ｍＡｂ１－６７２３と少なくとも同じホットスポット残基を、ＦＸ／ＦＸａエピトープ内に認識することを理解するであろう。
実施例１４ ＦＸ上のホットスポット残基の特定
実施例１５に記載されるように、ｍＡｂ１－１３０７、ｍＡｂ０－１８８６およびｍＡｂ０－１９９８に対するＦＩＸ上のホットスポットエピトープ残基のマッピングと同様に、本実施例に提供されるデータは、ｍＡｂ１－６７２３のＦＸ上のホットスポットエピトープ残基を決定する。使用したＦＸ変異体は、短いＧＳリンカー（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）を介してＮ末端Ｈｉｓタグ（ＨＨＨＨＨＨ、アフィニティー精製用）が付加されている、配列番号２の残基８６～４４８に対応する、ｄｅｓＧｌａ－ｄｅｓＥＧＦ１－ＦＸの単一部位アラニン変異体（野生型のアラニンであり、アラニンからセリンへの置換が導入された位置１１８を除く）である。実施例１３に定義されるエピトープ残基をカバーする変異体を表９に列挙する。
表９－生成されたｄｅｓＧｌａ－ｄｅｓＥＧＦ１－ＦＸ変異体のリスト
Figure 0007366747000018
表９に列挙された野生型ｄｅｓＧｌａ－ｄｅｓＥＧＦ１－ＦＸおよび変異体は、ＨＥＫ２９３システムで発現され、アフィニティークロマトグラフィーで精製された。Ｌ１１７Ａ、Ｌ３０３Ａ、Ｐ３０４Ａ、およびＭ４２６Ａの変異体では、発現または低純度が観察されず、これら四つの変異体に対しては結合の評価はできなかった。
ホットスポットエピトープ残基の同定は、２５℃でＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００機器を使用して行われた。２μｇ／ｍｌのＨｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃａｐｔｕｒｅ Ｋｉｔ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号ＢＲ１００８３９）の抗ｈｌｇＧ Ｆｃ抗体は、標準アミンカップリング化学を使用してＳｅｒｉｅｓ Ｓ Ｓｅｎｓｏｒ Ｃｈｉｐ ＣＭ５（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号ＢＲ１００５３０）上で固定化した。抗ＦＸ 抗体ｍＡｂ４－６９３４（ｍＡｂ１－６７２３ の一価変異体）を、３０秒間、５μＬ／分の流量で注入し、固定化した抗ｈｌｇＧ Ｆｃ抗体により捕捉した。続いて、５μ（２倍または３倍の段階希釈）のＴ１１６Ａ、Ａ１１８Ｓ、Ｔ１２７Ａ、Ｆ２２９ＡおよびＥ２２６Ａ変異体、１０μＭ（５倍の段階希釈）のＹ２３０Ａ変異体、ならびに１０μＭ（２倍または３倍の段階希釈）のＷＴおよびＨ１０１Ａ、Ｅ１０３Ａ、Ｒ１１３Ａ、Ｓ２２７Ａ、Ｅ２２８Ａ、Ｒ２８７Ａ、Ｅ３０５Ａ、Ｌ４１９Ａ、Ｋ４２０Ａ、Ｄ４２３Ａ、Ｒ４２４Ａ、Ｋ４２７ＡおよびＴ４２８Ａ変異体を、５μＭ／分の流量で９０秒間注入し、捕捉抗ＦＸ抗体への結合を可能にし、その後、緩衝液の９０秒間の注入により、ｄｅｓＧＬＡ－ｄｅｓＥＧＦ１－ＦＸ変異体の解離を可能にした。ランニング緩衝液（抗ＦＸ抗体およびｄｅｓＧＬＡ－ｄｅｓＥＧＦ１－ｈＦＸ変異体の希釈にも使用）は、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡおよび５ｍＭのＣａＣｌ２（ｐＨ７．４）を含有した。センサーチップの再生は、１Ｍのギ酸を使用して達成された。結合データは、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ が供給するＢｉａｃｏｒｅ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ２．０の１：１モデルに従って、定常状態フィッティングを使用して解析した。結合データは、注入された５または１０μＭでの野生型ＦＸの抗ＦＸ抗体への結合と比較して、ＦＸ変異体の抗ＦＸ抗体（一価ｍＡｂ１－６７２３）への結合を％で報告し、以下の式にしたがって計算する：
結合（％）＝ １００％ × ［（Ｒｍａｘ＿ＦＸｖａｒ，Ａｂ）／（Ｒｍａｘ＿Ａｂ）］ ／ ［（Ｒｍａｘ＿ＦＸｗｔ，Ａｂ）／（Ｒｍａｘ＿Ａｂ）］
式中、Ｒｍａｘ＿Ａｂ は抗ＦＸ抗体の捕捉レベル（ＲＵ）を表し、Ｒｍａｘ＿ＦＸｖａｒ、Ａｂおよび Ｒｍａｘ＿ＦＸｗｔ、Ａｂ は捕捉抗ＦＸ抗体への同じ濃度（すべての濃度は５μＭ、Ｙ２３０Ａ変異体のみ１０μＭ）でのＦＸ変異体および野生型の結合（ＲＵ）をそれぞれ表す。結果を表１０に示す。
表１０－ＳＰＲ分析の結果
ｍＡｂ１－６７２３のエピトープ残基をカバーする選択されたＦＸ変異体へのｍＡｂ１－６７２３結合の一価変異体のＳＰＲ解析の結果。
ｍＡｂ１－６７２３のホットスポット残基
ｍＡｂ１－６７２３のホットスポット残基は、野生型残基のアラニンによる置換（またはアラニンをセリンで置換した位置１１８）が、５μＭのＷＴ（または変異体）ｄｅｓＧＬＡ－ｄｅｓＥＧＦ１－ＦＸの濃度での抗体の野生型ＦＸへの結合と比較して、抗体の結合を３０％以下に減少させる位置として定義される。
ｍＡｂ１－６７２３のホットスポット残基（一価の対応物、ｍＡｂ４－６９３４で実験的に表される）：
Ｒ１１３、Ｙ２３０、Ｋ４２０、Ｄ４２３、Ｒ４２４およびＫ４２７
実施例１５ ＦＩＸ／ＦＩＸａ 上のホットスポット残基の特定
抗ＦＩＸ／ＦＩＸａ Ａｂｓ、ｍＡｂ０－１８８６、ｍＡｂ０－１９９８およびｍＡｂ１－１３０７とＦＩＸ の間の相互作用（ホットスポットと呼ばれる）に対して重要な残基を決定するために、対応するＦａｂ断片と複合するＦＩＸａの結晶構造に基づいて、ＦＩＸ変異体一式が選択された（それぞれＦａｂ７２３７、Ｆａｂ７２３８ およびＦａｂ７２３６）。以下に詳述するように、選択されたＦＩＸ変異体は哺乳類細胞で一時的に発現され、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用してｍＡｂ０－１８８６、ｍＡｂ０－１９９８およびｍＡｂ１－１３０７の一価変異体への結合に関して、精製され、特徴付けられた。
ＦＩＸ変異体の生成
一過性哺乳類発現に適したＤＮＡプラスミドは、ヒトＦＩＸのアミノ酸残基１－４６１をコードする発現カセット（ＵＮＩＰＲＯＴナンバリングによるＴ１９４Ａ変異を除き、配列番号１のＴ１４８Ａに対応）と、それに続く六つのヒスチジン（６×Ｈｉｓ－タグ、アフィニティー精製用）で構築された。この構築物を使用して産生された分泌型の成熟ＦＩＸタンパク質鎖は、Ｃ末端Ｈｉｓ－タグの追加を除き、ヒトＦＩＸ（Ａｎｓｏｎら。ＥＭＢＯ Ｊ．１９８４ ３：１０５３－１０６０、ＭｃＧｒａｗら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１９８５ ８２：２８４７－２８５１）のＡ１４８対立遺伝子型と同一である。
構築物をテンプレートとして使用して、選択された変異をＰＣＲによって導入した。表１１に列挙した各単一点変異について、所望のアミノ酸変化を含むフォワードプライマーおよびアミノ酸変異なしのリバースプライマーが設計された。これらのプライマーを、ベクター配列全体を増幅するためのテンプレートとして、上述のベクターを用いた標準ＰＣＲ反応で使用した。ライゲーションフリークローニングを用いて、フォワードプライマーおよびリバースプライマーによって導入されたオーバーラップ配列を使用して、得られた増幅ＤＮＡ断片の末端を、環状発現プラスミドに結合した。
環状化プラスミドを、大腸菌細胞に形質転換し、選択的寒天プレート上で成長させてコロニーを形成し、コロニーを使用して液体大腸菌培養を開始した。大腸菌培養物を一晩増殖させた後、プラスミド調製を実施し、変異体をＤＮＡシーケンシングによって同定した。
組み換えタンパク質の産生は、Ｅｘｐｉ２９３ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（商標）培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号Ａ１４３５１０１）の浮遊培養で増殖するｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞を、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２９３ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号Ａ１４５２５）および所望の変異体の各々をコードするプラスミドＤＮＡならびに野生型ＦＩＸ（Ｃ末端Ｈｉｓタグ付き配列番号１に対応）を使用してトランスフェクションすることによって実施した。トランスフェクション時に、ビタミンＫを最終濃度５ ｍｇ／ｍＬまで加えた。ＥｘｐＩｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２９３ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔのトランスフェクションエンハンサー１および２を、トランスフェクションの翌日に追加した。トランスフェクションの５日後に、細胞培養物を遠心分離によって採取した。
各ＦＩＸ変異体のＣ末端Ｈｉｓタグは、マルチウェルのロボットセットアップでバッチタンパク質精製に使用された。簡潔に述べると、採取した細胞培養上清を、結合条件に調整し、Ｎｉ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ アフィニティー精製樹脂（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号１７－５３１８－０２、５０μｌの沈殿樹脂／ｍｌ細胞培養培地）と混合し、２０分間振とうしながらインキュベートした。次に、樹脂／上清混合物をフィルタープレートに移動し、液体を真空の適用によってフィルタープレートを通して吸引した。フィルタープレート内に残っている樹脂を、高イミダゾール緩衝液中で溶出する前に３回洗浄した。
精製タンパク質溶液の濃度測定は、検出用の抗ＦＩＸ抗体と標準曲線用の高純度組み換え野生型ＦＩＸを使用して、ＥＬＩＳＡによって実施された。
表１１－生成されたＦＩＸ変異体のリスト
Figure 0007366747000020
Figure 0007366747000021
ＦＩＸ変異体の熱安定性
ＦＩＸ変異体へのアミノ酸置換の導入が不安定化と不適切なフォールディングにつながるかどうかをテストするために、変異体の熱変性遷移の中間点（Ｔｍ）を決定した。
精製されたＦＩＸ変異体を標準毛細管（Ｐｒｏｍｅｔｈｅｕｓ ＮＴ．４８ ｎａｎｏＤＳＦ Ｇｒａｄｅ Ｓｔａｎｄａｒｄ ｃａｐｉｌｌａｒｉｅｓ、Ｎａｎｏｔｅｍｐｅｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＧｍｂＨ、ミューンヘン）にロードし、Ｐｒｏｍｅｔｈｅｕｓ ＮＴ．４８（Ｎａｎｏｔｅｍｐｅｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＧｍｂＨ、ミュンヘン）に挿入した。７０％の励起強度を使用し、１．５℃／分の加熱ランプを用いて、２０～９０℃で熱変性を追跡した。トリプトファン蛍光は、２８０ ｎｍで励起し、３３０ ｎｍおよび３５０ ｎｍで発光を記録することによって測定した。ＦＩＸ変異体のＴｍ は、３５０ ｎｍおよび３３０ ｎｍ（Ｆ３５０／Ｆ３３０）で測定した蛍光の比率から、（ＦＩＸ Ｎ１０１Ｄ、Ｈ２５６Ａ、Ｌ３３０Ａ、Ｓ３３９Ａ、Ｇ３９３Ｉ、Ｙ４０４ＡおよびＮ４０６Ｑのタンパク質濃度が２０μｇ／ｍＬ未満の場合を除く）決定することができる。すべての場合において、プログラムＰＲ．ＴｈｅｒｍｏＣｏｎｔｒｏｌ ｖ２．０．４（ＮａｎｏＴｅｍｐｅｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＧｍｂＨ、ミュンヘン）は、Ｆ３５０／Ｆ３３０展開曲線の一次導関数の最大値を判定することによって、自動的にＴｍに適合する。野生型ＦＩＸのＴｍ は５１℃であり、変異体のＴｍ は４７～５４℃の範囲であることが判明し、アミノ酸置換によって大きな不安定化が誘導されなかったことを実証した。
ＳＰＲ分析
ＦＩＸ変異体は、Ｃ末端Ｈｉｓタグを介してＦＩＸ変異体を捕捉することにより、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用したｍＡｂ０－１８８６、ｍＡｂ０－１９９８およびｍＡｂ１－１３０７への結合に関して特徴付けられた。従来の二価抗体に関連する潜在的なアビディティー効果を避けるために、すなわち、１：１相互作用を確保するために、それぞれｍＡｂ４－０６７３、ｍＡｂ４－０００４およびｍＡｂ３－３２７９と表記されるｍＡｂ０－１８８６、ｍＡｂ０－１９９８およびｍＡｂ１－１３０７の一価変異体（実施例７に記載したように調製された）を分析物として使用した。
ＳＰＲ分析は、Ｂｉａｃｏｒｅ ４０００またはＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００機器（Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン）で行った。Ｔ２００機器上の実験では、次の条件が適用され、測定は２５℃の温度で行った。２５ μｇ／ｍｌ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＭＡＢ０５０）での抗Ｈｉｓ 抗体は、標準アミンカップリング化学を使用してＣＭ５センサーチップ上で固定化された。２５ｎＭの抗ＦＩＸ変異体を１０μｌ／分の流量で１分間注入し、固定化された抗Ｈｉｓ抗体によってＨｉｓタグを介して捕捉した。続いて、ｍＡｂ４－０００４、ｍＡｂ３－３２７９およびｍＡｂ４－０６７３の２００ｎＭ（４倍の段階希釈）、１６００ｎＭ（３倍の段階希釈）、および２０００ｎＭ（３倍の連続希釈）を、それぞれ５０μｌ／分の流量で５分間注入して捕捉されたＦＩＸ変異体への結合を可能にし、その後１０分間緩衝液を注入して一価抗ＦＩＸ抗体の解離を可能にした。使用されるランニング緩衝液は、２０ｍＭのＴｒｉｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ２、０．０５％のＴｗｅｅｎ－２０、１ ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ、ｐＨ７．４であった。これは、抗ＦＩＸ抗体およびＦＩＸサンプルの希釈にも使用された。１０ｍＭのグリシンｐＨ２．０を使用してチップの再生成が達成された。結合データを、製造者（Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン）により供給されたＢｉａＥｖａｌｕａｔｉｏｎ ４．１を使用して１：１モデルにしたがって分析した。同様の実験セットアップをＢｉａｃｏｒｅ ４０００機器に使用した。
最初に、表１１にリストされているすべてのＦＩＸ変異体は、三つすべての一価抗体、ｍＡｂ４－０００４、ｍＡｂ３－３２７９およびｍＡｂ４－０６７３への結合についてＢｉａｃｏｒｅ ４０００機器を使用してスクリーニングされた。それぞれのエピトープ残基に対応する位置に変異を含むＦＩＸ変異体への抗体の結合（実施例６で概説した距離基準により定義）は、予想されるように、可変程度に攪乱された。それぞれのエピトープ残基に対応しない位置で変異を含むＦＩＸ変異体については、抗体結合に有意な影響は観察されなかった。特に、ＥＧＦ２ドメインで行われた置換は、いずれの抗体（データ非表示）への結合にも影響しなかった。
Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００機器を使用して、エピトープ残基として定義された残基について、より詳細な結合解析を行った（実施例６参照）。結果を表１２に示す。
結合データは、抗体の野生型ＦＩＸへの結合と比較して、抗体のＦＩＸ変異体への結合を％で報告し、以下の式にしたがって計算する：
結合（％）＝１００％×［（Ｒｍａｘ＿Ａｂ，ＦＩＸ＿ｖａｒ）／（Ｒｍａｘ＿ＦＩＸｖａｒ）］ ／ ［（Ｒｍａｘ＿Ａｂ，ＦＩＸ＿ｗｔ）／（Ｒｍａｘ＿ＦＩＸｗｔ）］
式中、Ｒｍａｘ＿ＦＩＸｖａｒおよびＲｍａｘ＿ＦＩＸｗｔは、ＦＩＸ変異体および野生型ＦＩＸの捕捉レベル（ＲＵ）をそれぞれ表し、またＲｍａｘ＿Ａｂ、ＦＩＸ＿ｖａｒおよびＲｍａｘ＿Ａｂ、ＦＩＸ＿ｗｔは、抗体の捕捉されたＦＩＸ変異体および野生型ＦＩＸへの結合（ＲＵ）をそれぞれ表す。結果を表１２に示す。
表１２－ＳＰＲ分析の結果
ｍＡｂ１－１３０７、ｍＡｂ０－１９９８およびｍＡｂ０－１８８６のエピトープ残基をカバーする選択されたＦＩＸ変異体へのｍＡｂ３－３２７９、ｍＡｂ４－０００４、およびｍＡｂ４－０６７３（それぞれｍＡｂ１－１３０７、ｍＡｂ０－１９９８およびｍＡｂ０－１８８６の一価変異体）の結合のＳＰＲ分析の結果。
ホットスポット残基ｍＡｂ１－１３０７、ｍＡｂ０－１９９８ および ｍＡｂ０－１８８６
ｍＡｂ１－１３０７、ｍＡｂ０－１９９８およびｍＡｂ０－１８８６のホットスポット残基は、野生型残基のアラニンによる置換が、抗体の野生型ＦＩＸへの結合と比較して、抗体の結合を３０％以下に減少させる位置として定義される。
ｍＡｂ１－１３０７のホットスポット残基（ｍＡｂ３－３２７９によって実験的に表される）：
Ｈ２５７、Ｋ２９３、およびＮ４０６
ｍＡｂ０－１９９８のホットスポット残基（ｍＡｂ４－０００４によって実験的に表される）：
Ｒ３３８およびＫ３４１
ｍＡｂ０－１８８６のホットスポット残基（ｍＡｂ４－０６７３によって実験的に表される）：
Ｄ３３２、Ｒ３３３、Ｌ３３７およびＲ３３８
ｍＡｂ０－１９９８およびｍＡｂ０－１８８６の両方について、結合にほとんど寄与する残基はＲ３３８であり、ＦＩＸでのＲ３３８のアラニン（Ｒ３３８Ａ）への置換は、抗体結合に対する最大の影響を示し、野生型ＦＩＸへの抗体結合と比較して、ｍＡｂ０－１９９８とｍＡｂ０－１８８６でそれぞれ２％と３％に大幅に減少した。
実施例１６ ＦＸａ生成アッセイにおける抗ＦＩＸ（ａ）／ＦＸ（ａ）二重特異性抗体の活性
抗ＦＩＸａ／ＦＸ二重特異性抗体の血液凝固活性は、血液凝固リン脂質膜の存在下で、ＦＩＸａによるＦＸ活性化を促進する能力に基づいて決定された。試験された二重特異性抗体（ＢｉＡｂ）を表１３に記載し、ＡＣＥ９１０は比較のために含めた。
各二重特異性抗体の血液凝固活性は、所与の抗体濃度での遊離ＦＩＸａによるＦＸ活性化に対する何倍かの刺激として報告される。二重特異性抗体は、アッセイ緩衝液（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１００ｍＭのＮａｃｌ、５ｍＭのＣａＣｌ２、０．１％（ｗ／ｖ）のＰＥＧ８０００、ｐＨ７．３ ＋ １ ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ）中で、１２５ｐＭのヒト血漿由来ＦＩＸａ（Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ、米国）および５００μＭ ２５：７５のホスファチジルセリン：ホスファチジルコリン脂質ベシクル（Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ、米国）と共に１０分間のプレインキュベーションにより、８濃度（アッセイ緩衝液での三倍段階希釈で作製）で試験された。次いで、ヒト血漿由来ＦＸ（Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ、米国）を、２５ｎＭの濃度に加えることにより、活性化が開始された。室温で１５分の活性化後、反応物（５０μｌ）を２５μｌの冷却緩衝液（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１００ｍＭのＮａｃｌ、６０ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％のＰＥＧ８０００、ｐＨ７．３＋１ ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ）の添加によりクエンチした。２５μｌの２ｍＭ Ｓ－２７６５発色基質（Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ、スウェーデン）を添加し、マイクロプレートリーダーで４０５ｎｍの吸光度測定（ΔＯＤ／分）により発色基質変換を測定することによって、生成されるＦＸａの量を決定した。同様に、遊離ＦＩＸａによるＦＸ活性化は、２５ｎＭのＦＩＸａ濃度および６０分の反応時間で決定された。
測定された活性は、アッセイに存在するＦＩＸａの濃度および反応時間にしたがって正規化された。この数を、抗体の非存在下での同様に正規化されたＦＸａ生成の割合で割ることにより、所与の濃度での抗体による何倍かの刺激を計算した。
要約すると、ｂｉＡｂ刺激の計算は以下のように説明することができる。
ＢｉＡｂ刺激＝（ＡＦＩＸａ＋ｂｉＡｂ／（［ＦＩＸａ］ａｓｓａｙ×ｔｒｅａｃｔｉｏｎ））／ＡＦＩＸａ、ｎｏｒｍ
式中、ＡＦＩＸａ＋ｂｉＡｂは、二重特異性抗体の存在下で測定された活性であり、［ＦＩＸａ］ａｓｓａｙは、アッセイ中のＦＩＸａ濃度であり、ｔｒｅａｃｔｉｏｎは、反応時間であり、ＡＦＩＸａ、ｎｏｒｍは、遊離ＦＩＸａの正規化活性である。
表１３は、試験された８つの抗体濃度の間の各二重特異性抗体に対して決定された最大刺激とともに、最大刺激が観察された濃度を示す。すべての試験された二重特異性抗体について、最大刺激は、０～１５３００ｎＭの濃度間隔で試験されたＡＣＥ９１０で測定されたものよりも高いことがわかった。
表１３－二重特異性抗ＦＩＸａ／ＦＸ抗体による最大刺激
Figure 0007366747000023
実施例１７ ヒト血友病Ａの乏血小板および多血小板模倣血漿におけるトロンビン生成試験（ＴＧＴ）における二重特異性抗ＦＩＸ（ａ）／ＦＸ（ａ）抗体の活性
二重特異性抗体ｍＡｂ４－７７６１、ｍＡｂ４－７７６２、ｍＡｂ４－７７８９、ｍＡｂ５－００５７、およびｍＡｂ５－１４０９（表１４ を参照）の血液凝固活性は、血液凝固合成リン脂質膜または血小板のいずれかの存在下でのトロンビン生成を促進する能力に基づいて決定され、これはＨｅｍｋｅｒらにより説明された原理による（Ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌ Ｈａｅｍｏｓｔ Ｔｈｒｏｍｂ、２００２；３２：２４９－２５３）。ＡＣＥ９１０は比較のために含めた。各抗体（試験化合物）は、プールされた血友病Ａ（ＨＡ）患者の乏血小板血漿（ＨＡ－ＰＰＰ）および／またはＨＡ誘発ヒト多血小板血漿（ＨＡ－ＰＲＰ）でトロンビン生成試験（ＴＧＴ）を試験した。
表１４－二重特異性抗ＦＩＸ（ａ）／ＦＸ（ａ）抗体
Figure 0007366747000024
血友病Ａ誘発ヒト多血小板血漿（ＨＡ－ＰＲＰ）
血液は、静脈穿刺によって健康的な同意ドナーから得た。６容量の血液を１容量のクエン酸デキストロース（ＡＣＤ；８５ｍＭのクエン酸ナトリウム、１１０ｍＭのデキストロース、６２．３ｍＭのクエン酸、ｐＨ４．９）最終ｐＨ６．５に収集し、室温（ＲＴ）で２２０ｇで２０分間遠心分離した。多血小板血漿（ＰＲＰ）を採取し、Ｍｅｄｏｎｉｃ ＣＡ ６２０血液分析器（Ｂｏｕｌｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＡＢ、ＳｐÅｎｇａ、スウェーデン）を用いて血小板濃度を決定した。血漿部分を含有する赤血球を、室温で６００ｇでさらに１０分間遠心分離した。乏血小板血漿（ＰＰＰ）を採取し、３００，０００血小板／μｌに希釈したＰＲＰに使用した。ＨＡ条件は、最終濃度０．１ｍｇ／ｍｌにＦＶＩＩＩ－中和抗ヒトＦＶＩＩＩ 抗体（ヒツジ抗ヒト第ＶＩＩＩ因子－５ｍｇ、Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＶＴ、米国）を添加することによって誘発され、室温で３０分間、２ｒｐｍで穏やかに回転された。
トロンビン生成テスト
ＨＡ－ＰＲＰおよびＨＡ－ＰＰＰ（Ｇｅｏｒｇｅ Ｋｉｎｇ Ｂｉｏ－Ｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｃ、ＫＳ、米国）のトロンビン生成試験（ＴＧＴ）を、９６ウェルプレート蛍光光度計（Ｆｌｕｏｒｏｓｃａｎ Ａｓｃｅｎｔ ＦＬ、Ｔｈｅｒｍｏｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ、Ｈｅｌｓｉｎｋｉ、フィンランド）を使用して、標準較正自動化されたトロンボグラフィーにより実施した。反応混合物は、７０μｌ ＨＡ－ＰＲＰ（３００，０００血小板／μｌ）またはＨＡ－ＰＰＰ、１０ μｌの試験化合物希釈（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１４０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４、２％のＢＳＡｍに希釈）、組織因子（ＴＦ）を含む２０μｌのＣＡＴ試薬（ＰＲＰ試薬；合成リン脂質を含まないＴＦ、ＰＰＰ試薬ＬＯＷ；合成リン脂質を含むＴＦ、１ｐＭのＴＦ最終、Ｔｈｒｏｍｂｉｎｏｓｃｏｐｅ ＢＶ、Ｍａａｓｔｒｉｃｈｔ、オランダ）またはＴｈｒｏｍｂｉｎ Ｃａｌｉｂｒａｔｏｒ（Ｔｈｒｏｍｂｉｎｏｓｃｏｐｅ ＢＶ）、ならびに蛍光標識されたトロンビン基質ｚ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ａｒｇ－ＡＭＣ（３ ｍＭ）およびＣａＣｌ２（９０ ｍＭ）（Ｔｈｒｏｍｂｉｎｏｓｃｏｐｅ ＢＶ）を含む２０μｌの混合物を含む。ＴＧＴは、最大８濃度の試験化合物（０．３、１．０、３、１０、３０、１００、３００、および９００ｎＭ、最終血漿濃度）または追加緩衝液（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１４０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４、２％のＢＳＡ）のみ（ＨＡ対照を表す）で実施された。濃度範囲は、ＨＡ－ＰＰＰにおける少なくとも三つの独立した実験で、同じストックから、または異なる四人のドナーからの血液中で試験された。ＴＧＴ中の正常な対照レベルを、未処理のヒトＰＲＰまたはＣＲＹＯｃｈｅｃｋ（商標）でプールした正常ヒトＰＰＰ血漿（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃ Ｉｎｃ．、Ｄａｒｔｍｏｕｔｈ、カナダ）を添加した緩衝液（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１４０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４、２％のＢＳＡ）のみを使用して測定した。ＴＧＴを合計９０分間進行させ、ＴＧＴパラメーターのピークトロンビン高さ（ｎＭ）をＴｈｒｏｍｂｉｎｏｓｃｏｐｅソフトウェア（Ｔｈｒｏｍｂｉｎｏｓｃｏｐｅ ＢＶ）で解析した。
図２／表１５は、ＨＡ－ＰＰＰで試験された濃度の各二重特異性抗体に対する測定されたピークトロンビン生成率を示す。データは、すべての試験化合物が、抗体の非存在化下で観察されたレベルを超えてトロンビン形成のピークを増加させることを示し、すなわち、血液凝固活性を示す。さらに、ｍＡｂ４－７７６１、ｍＡｂ４－７７６２、ｍＡｂ４－７７８９、ｍＡｂ５－００５７、およびｍＡｂ５－１４０９に対して３０～３００ ｎＭの間のトロンビン生成レベルは、ＡＣＥ９１０に観察されたものよりも高く、優れた効力を示す。さらに、３００～９００ｎＭのｍＡｂ５－００５７およびｍＡｂ５－１４０９におけるトロンビン生成レベルは、９００ｎＭのＡＣＥ９１０で観察されたものよりも高く、ＡＣＥ９１０と比較してこれらの化合物の高い効力および有効性を示す。
図３／表１６は、ＨＡ－ＰＲＰで試験した濃度でのｍＡｂ５－００５７およびｍＡｂ５－１４０９の測定されたピークトロンビン生成レベルを示す。これらの条件下では、ｍＡｂ５－００５７およびｍＡｂ５－１４０９も、ＡＣＥ９１０と比較してより良好な効力および有効性を示す。
表１５－ 二重特異性抗体ｍＡｂ４－７７６１、ｍＡｂ４－７７６２、ｍＡｂ４－７７８９、ｍＡｂ５－００５７、ｍＡｂ５－１４０９およびＡＣＥ９１０のトロンビン生成試験（ＴＧＴ）
ヒト組織因子活性化血友病Ａ乏血小板血漿（ＰＰＰ）における二重特異性抗体ｍＡｂ４－７７６１、ｍＡｂ４－７７６２、ｍＡｂ４－７７８９、ｍＡｂ５－００５７、ｍＡｂ５－１４０９、およびＡＣＥ９１０のトロンビン生成試験（ＴＧＴ）。ＨＡ－ＰＰＰの少なくとも三つの独立した実験で、試験された各化合物濃度で測定した平均ピークトロンビン生成レベル±標準偏差。実験Ａ～Ｄは、図２の凡例に記載された独立した実験を意味する。
Figure 0007366747000025
表１６－二重特異性抗体ｍＡｂ５－００５７、ｍＡｂ５－１４０９およびＡＣＥ９１０のトロンビン生成試験（ＴＧＴ）
ヒト組織因子活性化血友病Ａ多血小板血漿（ＰＲＰ）の二重特異性抗体ｍＡｂ５－００５７、ｍＡｂ５－１４０９、およびＡＣＥ９１０のトロンビン生成試験（ＴＧＴ）。ＨＡ－ＰＲＰの四つの独立した実験から試験された各化合物濃度での平均ピークトロンビン生成±標準偏差。
Figure 0007366747000026
実施例１８ ヒト血友病Ａ乏血小板血漿におけるトロンビン生成試験（ＴＧＴ）での一価ワンアームド（ＯＡ）抗ＦＩＸ／ＦＩＸａ抗体の活性
ｍＡｂ１－９０１６の一価ワンアームド（ＯＡ）バージョンの血液凝固活性は、血液凝固リン酸脂質膜の存在下でのトロンビン生成を促進する能力に基づいて決定され、これはＨｅｍｋｅｒらにより説明された原理による（２００２）Ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌ Ｈａｅｍｏｓｔ Ｔｈｒｏｍｂ、３２：２４９－２５３。２２４Ｆ３抗体（ｍＡｂ１－１５８２）のワンアームドバージョンを、比較のために含めた。各抗体（試験化合物）は、９６ウェルプレート蛍光光度計（Ｆｌｕｏｒｏｓｃａｎ Ａｓｃｅｎｔ ＦＬ、Ｔｈｅｒｍｏｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ、Ｈｅｌｓｉｎｋｉ、フィンランド）を使用して、標準較正自動化されたトロンボグラフィーにより、プールされた血友病Ａ（ＨＡ）患者の乏血小板血漿（ＨＡ－ＰＰＰ）（Ｇｅｏｒｇｅ Ｋｉｎｇ Ｂｉｏ－Ｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｃ、ＫＳ、米国）でトロンビン生成試験（ＴＧＴ）を試験した。反応混合物は、７０μｌのＨＡ－ＰＰＰ、１０μｌの試験化合物（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１４０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４、２％のＢＳＡｍに希釈）、活性化ヒト血漿由来第ＸＩ因子（ｈＦＸＩａ、８．３ ｍＵ／ｍＬ最終）（Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＩＮ、米国）含有の２０μｌのＰＲＰ試薬（合成リン脂質、Ｔｈｒｏｍｂｉｎｏｓｃｏｐｅ ＢＶ、Ｍａａｓｔｒｉｃｈｔ、オランダ）またはＴｈｒｏｍｂｉｎ Ｃａｌｉｂｒａｔｏｒ（Ｔｈｒｏｍｂｉｎｏｓｃｏｐｅ ＢＶ）、ならびに蛍光標識されたトロンビン基質Ｚ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ａｒｇ－ＡＭＣ（３ ｍＭ）およびＣａＣｌ２（９０ ｍＭ）（Ｔｈｒｏｍｂｉｎｏｓｃｏｐｅ ＢＶ）を含む２０μｌの混合物を含む。ＴＧＴは、５濃度の試験化合物（３０、１００、３００、６００および９００ｎＭ、最終血漿濃度）または追加緩衝液（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１４０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４、２％のＢＳＡ）のみ（ＨＡ対照を表す）で実施された。濃度範囲は、同じストックからのＨＡ－ＰＰＰで、二つの独立した実験で試験された。ＴＧＴを合計９０分間進行させ、ＴＧＴパラメーターのピークトロンビン高さ（ｎＭ）をＴｈｒｏｍｂｉｎｏｓｃｏｐｅソフトウェア（Ｔｈｒｏｍｂｉｎｏｓｃｏｐｅ ＢＶ）で解析した。図４および表１７は、試験された濃度の各一価ワンアームド抗体に対する測定されたピークトロンビン生成率を示す／列挙する。データは、ｍＡｂ１－９０１６のＯＡ抗体バージョンが、抗体の非存在化下で観察されたレベルを超えてトロンビン形成のピークを増加させることを示し、すなわち、血液凝固活性を示す。さらに、ｍＡｂ１－９０１６のＯＡ抗体バージョンによって誘発されるトロンビン生成は、２２４Ｆ３抗体（ｍＡｂ１－１５８２）の一価ＯＡバージョンで観察されたものよりも高い。
表１７－試験された濃度の各一価ワンアームド抗体に対する測定されたピークトロンビン生成率 リストは、ＨＡ－ＰＰＰの二つの独立した実験の平均ピークトロンビン±標準偏差である。
Figure 0007366747000027
実施例１９ 等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）によって決定される結合親和性
ＦＩＸ／ＦＩＸａおよびＦＸ／ＦＸａに結合する抗ＦＩＸ／ＦＩＸａ抗体および抗ＦＸ／ＦＸａ抗体の結合親和性は、それぞれＰＥＡＱ－ＩＴＣ熱量計（Ｍａｌｖｅｒｎ、英国）を使用して、等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）によって測定される。実験は、２５ｍＭのＴｒｉｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ２（Ｔｒｉｓ－緩衝液）を使用して、３７℃およびｐＨ７．４で行われる。サンプルセル（２００μｌ）には、ＦＩＸ、ＦＩＸａ、ＦＸ、またはＦＸａのいずれかが含まれ、抗ＦＩＸ／ＦＩＸａおよび抗ＦＸ／ＦＸａ抗体がシリンジを介して注入される。一致した緩衝液条件を確保するために、測定前にすべてのタンパク質をＴｒｉｓ緩衝液中で広範囲に透析する。熱平衡工程に続いて６０秒の遅延があり、その後、抗体の最初の０．２μｌの注入、その後１２０秒間隔で２．５μｌの抗体の注入を１４回行った。攪拌速度は７５０ｒｐｍで維持され、参照電力は５～１０μｃａｌ／秒で一定に保たれる。抗体の各注入に伴う熱を統合し、リガンドと高分子のモル比に対してプロットする。得られた等温線は、製造業者によって提供されるソフトウェアを使用して、親和性（ＫＤ）、化学量論（ｎ）、および相互作用のエンタルピー（ΔＨ）を得るために、一部位結合モデルに適合される。実験は二重または三重で実施された。
本明細書では本発明の特定の特徴を例示および説明してきたが、多くの修正、置換、変更、および同等物が当業者に思い浮かぶであろう。したがって、添付の特許請求の範囲は、本発明の真の精神の範囲内にあるそのようなすべての修正および変更を網羅することを意図していることが理解されるべきである。

Claims (10)

  1. ＦＩＸ（配列番号１）および／またはその活性型（ＦＩＸａ）に結合することができる第一の抗原結合部位、ならびにＦＸ（配列番号２）および／またはその活性型（ＦＸａ）に結合することができる第二の抗原結合部位を含む、ＦＸに対するＦＩＸａの酵素活性を刺激することができる多重特異性抗体またはその抗原結合性断片であって、
    前記第一の抗原結合部位が、ＦＩＸ／ＦＩＸａのアミノ酸残基Ｒ３３８およびＫ３４１を含むエピトープに結合することができ、
    前記第二の抗原結合部位が、ＦＸ／ＦＸａのアミノ酸残基Ｒ１１３、Ｙ２３０、Ｋ４２０、Ｄ４２３、Ｒ４２４およびＫ４２７を含むエピトープに結合することができる、多重特異性抗体またはその抗原結合性断片。
  2. 前記第一の抗原結合部位が、ＦＩＸ／ＦＩＸａのアミノ酸残基Ｌ３３７、Ｒ３３８、Ｓ３３９、Ｔ３４０、Ｋ３４１およびＴ３４３を含むエピトープに結合することができる、請求項１に記載の多重特異性抗体またはその抗原結合性断片。
  3. 前記第二の抗原結合部位が、ＦＸ／ＦＸａのアミノ酸残基Ｈ１０１、Ｅ１０３、Ｔ１１６、Ｌ１１７、Ａ１１８、Ｔ１２７、Ｓ２２７、Ｅ２２８、Ｆ２２９、Ｅ２６６、Ｒ２８７、Ｌ３０３、Ｐ３０４、Ｅ３０５、Ｌ４１９、Ｍ４２６およびＴ４２８のうちの一つまたは複数を更に含むエピトープに結合することができる、請求項１または２に記載の多重特異性抗体またはその抗原結合性断片。
  4. 前記多重特異性抗体またはその抗原結合性断片が、ＦＩＸ／ＦＩＸａへの結合について参照抗体と競合し、前記参照抗体が、
    ａ）配列番号１５に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン、および配列番号１６に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメイン、または
    ｂ）配列番号１７に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン、および配列番号１８に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメイン、または
    ｃ）配列番号１９に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン、および配列番号２０に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインを含む、請求項１に記載の多重特異性抗体またはその抗原結合性断片。
  5. 前記多重特異性抗体またはその抗原結合性断片が、ＦＸ／ＦＸａへの結合について参照抗体と競合し、前記参照抗体が、配列番号１７９に示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン、および配列番号１８０に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインを含む、請求項１または４に記載の多重特異性抗体またはその抗原結合性断片。
  6. ＦＩＸ（配列番号１）および／またはその活性型（ＦＩＸａ）に結合することができる第一の抗原結合部位、ならびにＦＸ（配列番号２）および／またはその活性型（ＦＸａ）に結合することができる第二の抗原結合部位を含む、ＦＸに対するＦＩＸａの酵素活性を刺激することができる多重特異性抗体またはその抗原結合性断片であって、
    ａ．配列番号１７７に示されるアミノ酸配列を有する抗ＦＩＸ／ＦＩＸａ抗体重鎖可変ドメインのＣＤＲ配列と、配列番号１７８に示されるアミノ酸配列を有する抗ＦＩＸ／ＦＩＸａ抗体軽鎖可変ドメインのＣＤＲ配列と、配列番号１７９に示されるアミノ酸配列を有する抗ＦＸ／ＦＸａ抗体重鎖可変ドメインのＣＤＲ配列と、配列番号１８０に示されるアミノ酸配列を有する抗ＦＸ／ＦＸａ抗体軽鎖可変ドメインのＣＤＲ配列と、
    ｂ．配列番号１８１に示されるアミノ酸配列を有する抗ＦＩＸ／ＦＩＸａ抗体重鎖可変ドメインのＣＤＲ配列と、配列番号１８２に示されるアミノ酸配列を有する抗ＦＩＸ／ＦＩＸａ抗体軽鎖可変ドメインのＣＤＲ配列と、配列番号１８３に示されるアミノ酸配列を有する抗ＦＸ／ＦＸａ抗体重鎖可変ドメインのＣＤＲ配列と、配列番号１８４に示されるアミノ酸配列を有する抗ＦＸ／ＦＸａ抗体軽鎖可変ドメインのＣＤＲ配列のＣＤＲ配列と、または
    ｃ．配列番号１８７に示されるアミノ酸配列を有する抗ＦＩＸ／ＦＩＸａ抗体重鎖可変ドメインのＣＤＲ配列と、配列番号１８８に示されるアミノ酸配列を有する抗ＦＩＸ／ＦＩＸａ抗体軽鎖可変ドメインのＣＤＲ配列と、配列番号１８５に示されるアミノ酸配列を有する抗ＦＸ／ＦＸａ抗体重鎖可変ドメインのＣＤＲ配列と、配列番号１８６示されるアミノ酸配列を有する抗ＦＸ／ＦＸａ抗体軽鎖可変ドメインのＣＤＲ配列とを含む、多重特異性抗体またはその抗原結合性断片。
  7. 前記多重特異性抗体またはその抗原結合性断片が二重特異性抗体である、請求項１～６のいずれかに記載の多重特異性抗体またはその抗原結合性断片。
  8. 阻害物質を有する血友病Ａまたは阻害物質を有しない血友病Ａの治療のための、請求項１～７のいずれかに記載の多重特異性抗体またはその抗原結合性断片。
  9. 請求項１～７のいずれかに記載の多重特異性抗体またはその抗原結合性断片および薬学的に許容可能な担体を含む、医薬組成物。
  10. 阻害物質を有する血友病Ａまたは阻害物質を有しない血友病Ａの治療のための、請求項１～７のいずれかに記載の多重特異性抗体またはその抗原結合性断片を含む、医薬組成物。
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