JP7545894B2 - 新規足場に基づくポリペプチド - Google Patents

Description

技術分野
本開示は、共通の足場配列に基づくポリペプチド変異体の新規集団を対象とする。これらの集団は、例えば、治療、診断又はバイオテクノロジーの用途で使用するための新規結合ポリペプチドの供給源として使用され得る。

背景
足場タンパク質
癌、感染症、免疫疾患及び炎症性疾患等の疾患の分子病理学に関する知見の増加により、目的の分子をより効率的に阻害又は結合しながら、オフターゲットの副作用を低減できる、所望の特異性を有する分子を開発するという道が開けている。抗体は、医学研究とバイオテクノロジー研究の両方で最も広く使用されている親和性リガンドであるが、その大きなサイズと組成に関する欠点に悩まされている。複数鎖抗体複合体の安定性及び機能は、正しいジスルフィド結合の形成及びグリコシル化パターンに依存するため、真核生物の発現システムでは、製造費用が高額になる。従って、抗体断片の使用並びに抗体に基づかない足場の開発は、魅力的な代替手段として挙げられている。多数の標的に対する高親和性リガンドの精製に用いられてきたより高度な足場タンパク質は、フィブロネクチン（タイプＩＩＩ）ドメイン、クニッツドメイン、ＳＨ３ドメイン、ブドウ球菌プロテインＡのＺドメイン、アンキリンリピート及びリポカインを含む。これらの足場に基づく候補ポリペプチドは、臨床研究に進んでおり、規制当局により認可された抗体に基づかない第１の分子は、遺伝性血管性浮腫の治療のためのクニッツドメインＤＸ－８８（エカランチド）であった（Vazquez-Lombardi et al, Drug Discov Today, 2015, 20(10):1271-83にてレビューされた）。

これらの比較的小さい足場タンパク質の利点は、原核生物の発現システムにおいて高い安定性と高い生産収量であることを含む。それら堅牢なフレームワークにより、特定の表面領域を調整し、足場の元の折り畳みを損なうことなく、新規結合機能を導入することが可能である。一方、サイズが小さいと、腎クリアランスが原因で血清半減期が短くなることが示唆されており、治療用途に半減期を延長する技術の使用が必要になる場合がある（Gebauer and Skerra (2009) Curr Opin Chem Biol 13(3):245-55）。

特定の足場に基づいて新規リガンドを生成する強力なツールは、コンビナトリアルプロテインエンジニアリング（ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）である。ここでは、複合体ライブラリーが設計され、構築され、続いてスクリーニングされ、所望の特性を有するリガンドが同定される。折り畳みと溶解性が維持された多数の多様なリガンドを含む多目的なタンパク質ライブラリーの作成における課題は、ランダム化する位置、ランダム化の程度、ランダム化した位置で許可されるアミノ酸、並びに特定の位置で選択するためのアミノ酸を開始点として適切なタンパク質又はタンパク質ドメインを選択することを含む。

組換えＧＡ３ドメイン変異体
連鎖球菌のタンパク質Ｇ（ＳｐＧ）株Ｇ１４８（Ｇ１４８－ＧＡ３；配列番号１５８）の～５ｋＤａ ＧＡ３ドメインは、その天然の標的アルブミンに対する親和性を改善するか、又は新規の結合特異性を導入するように設計される。Ｇ１４８－ＧＡ３の構造が決定され、３ヘリックスバンドルフォールド（ｔｈｒｅｅ－ｈｅｌｉｘ ｂｕｎｄｌｅ ｆｏｌｄ）が示され、ＧＡ３ドメイン内の４６アミノ酸モチーフがＡＢＤ（アルブミン結合ドメイン）として定義される（Kraulis et al, FEBS Lett 378:190, 1996; Johansson et al, J. Biol. Chem. 277:8114-20, 2002）。ＡＢＤ内のアルブミン結合基は、位置１８～位置４４に伸びる領域に位置しており、これは主にヘリックス２及び３、並びにそれらの接続ループが含まれる（Lejon et al, J Biol Chem., 2004, 279(41):42924-8）。

Ｒｏｚａｋ達は、異なる種の特異性及び安定性に関して選択及び研究されたＧ１４８－ＧＡ３の人工変異体の作成を報告したが（Rozak et al, Biochemistry, 2006, 45:3263-3271）、Ｊｏｎｓｓｏｎ達は、ヒト血清アルブミンに対する親和性が非常によく改善されたＧ１４８－ＧＡ３人工変異体を開発した（Jonsson et al, Prot Eng Des Sel, 2008, 21:515-27; WO2009/016043）。Ｊａｃｏｂｓ達は、Ｇ１４８－ＧＡ３をテンプレートとして使用するコンセンサス配列法に基づいて、非天然のアルブミン結合変異体を設計した。得られた変異体は、異なる種からのアルブミンに対して高い安定性及び高い親和性を示すことが報告された（Jacobs et al, Protein Eng Des Sel., 2015, 28(10):385-93; WO2013/177398）。

いくつかのＴ細胞及びＢ細胞エピトープが、ＳｐＧ株Ｇ１４８のアルブミン結合領域内で実験的に同定されており（Goetsch et al, Clin Diagn Lab Immunol, 2003, 10:125-32）、Ｇ１４８－ＧＡ３は、ヒト投与用の医薬組成物での使用にはあまり適していない。免疫刺激特性を低下させるために、潜在的なＢ細胞及びＴ細胞エピトープが少ないが、高いアルブミン結合能が保持されている新しいＡＢＤ変異体が、たとえばＷＯ２０１２／００４３８４に記載されているように開発された。

新規特異性を有する分子を開発する際の足場としてのＧ１４８－ＧＡ３の使用は、Ｍａｌｙ達のグループによって報告されている。彼らは、ＡＢＤのアミノ酸２０～４４の領域で、アルブミン結合に関与することが知られている１１の位置をランダム化し、リボソームディスプレイによるインターフェロンガンマ（Ahmad et al, Proteins, 2012, 80(3):774-89; WO2014/079399）、インターロイキン２３（ＩＬ－２３）レセプター（Kuchar et al, Proteins, 2014 82(6):975-89）及びＩＬ－２３のｐ１９（Krizova et al, Autoimmunity, 2017, 50(2):102-113）を標的とする新規リガンドを選択した。

Ｇ１４８－ＧＡ３は、二重特異性を持つリガンドを開発するためのフレームワークとしても使用されている。ヘリックス２の必須のアルブミン結合残基を保持しながら、主にヘリックス１と３に位置する位置を変えることにより、新規特異性及び保持された（しかし同時ではない）アルブミン結合能力を持つリガンドが生成された（Nilvebrant and Hober, Comput Struct Biotechnol J, 2013, 6:e201303009; WO2014/076177 and WO2014/076179）。

構造安定性
ペプチド及びタンパク質医薬品の成功の重要な要因の1つは、ペプチド又はタンパク質の安定性である。高い構造安定性を示すタンパク質は、製造中及び人体内の両方で、化学修飾及びタンパク質分解に耐え、機能を保持している可能性がある。さらに、安定性は、ペプチド又はタンパク質医薬品の有効寿命、並びに人体内のペプチド又はタンパク質医薬品の有効寿命に影響を与える。

溶解性
ほとんどの用途において、ペプチド及びタンパク質は、溶解性が高く、凝集する傾向が低いことが望ましい。このような特性は、タンパク質及びペプチド医薬品にとって特に重要である。一方では、タンパク質表面の疎水性と、他方では低い溶解度及び凝集傾向の増加との間に強い正の相関関係がある。

異なる足場は、標的分子の所望の結合エピトープでのアミノ酸のトポロジー及び特性に応じて、標的表面と相互作用する異なる能力を有し得る。安定性及び免疫原性の傾向は、異なる足場間及び同じ足場ファミリー内で異なり、これらの特性は、結合界面のアミノ酸配列に部分的に依存するためである。そのような区別は、特定の足場タイプが、特定の用途に特に適していることをさらに示唆する可能性がある。このような背景に対して、例えば、治療及び診断の新しい、効率的かつ、安全な様式の基礎を形成することが可能な新規足場の開発に対する継続的なニーズが存在する。

開示の説明
本開示の目的は、一般的な新規の足場に基づいてポリペプチド変異体の集団を提供することである。

新規の足場は、既知の足場と比較して利点を示す。さらに言うと、利点はまた、新規の足場に基づいて、本明細書に開示される集団から選択される個々の変異体ポリペプチドにも適用される。これらの利点については以下で詳細に説明するが、いくつかの例において、小さいサイズ； 単量体構造； 高い折り畳み安定性； ユニークなシステイン残基を組み込む可能性； 原核生物の宿主細胞での発現時の翻訳語修飾の欠如である。

本開示の他の目的は、開示されたポリペプチド変異体集団をコードするポリヌクレオチドの集団を提供することである。

本開示の他の目的は、ポリペプチド集団とポリヌクレオチド集団との組み合わせを提供することである。

本開示のさらなる目的は、ポリペプチドの集団から、所定の標的に対して親和性を有する所望のポリペプチドを選択及び／又は同定するための方法を提供することである。関連する目的は、そのような所定の標的に対して親和性を有する所望のポリペプチドの産生のための方法を提供することである。

他の目的は、所定の標的に対して親和性を有する所望のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを単離するための方法を提供することである。

本開示のさらなる目的は、ポリペプチドに新規の足場を提供することであり、このポリペプチドは、現在利用可能な抗体、抗体フラグメント、並びに代替の非抗体足場ポリペプチドの上記及び他の欠点を軽減する。

他の目的は、新規の足場に基づいて、そのようなポリペプチドを生成するための方法を提供することである。

開示された集団、方法及びポリペプチドは、所定の標的への特異的結合を特徴とするポリペプチドの提供を通じて、所定の標的に対する親和性を有する薬剤の提供（産生及び評価を含む）を可能にする。

開示された態様を通して、非特異的結合をほとんど又は全く示さない所定の標的に対する親和性をポリペプチドに提供することが可能である。

融合ポリペプチドの部分として容易に使用することができる、所定の標的に対する親和性を有するポリペプチドを提供することも可能である。

さらに、既存の抗体産物で発生することが知られている１つ以上の問題を解決する、所定の標的に対する親和性をポリペプチドに提供することが可能である。

さらに、治療及び／又は診断用途での使用に適した、所定の標的に対する親和性を有するポリペプチドを提供することが可能である。

化学ペプチド合成によって容易に作製される所定の標的に対する親和性を有するポリペプチドを提供することも可能である。

これらの目的及び他の目的は、本開示の異なる態様、及び添付のリストに項目化され、添付の特許請求の範囲で請求される対応する発明の概念によって充足される。

開示の第１の態様において、共通の足場に基づくポリペプチド変異体の集団であって、集団内の各ポリペプチドは足場アミノ酸配列
Ｘ_ｓｃ１ＡＥＬＤＸ_ｓｃ２Ｘ_ｓｃ３ＧＶＧ ＡＸＸＩＫＸＩＸ_ｓｃ４ＸＡ ＸＸＶＥＸＶＱＸＸＫ ＱＸＩＬＡＸ
（配列番号１６５）
（配列中、互いに独立して、
－ Ｘ_ｓｃ１が、Ｉ及びＬから選択された足場アミノ酸残基であり；
－ Ｘ_ｓｃ２が、Ｃ及びＳから選択された足場アミノ酸残基であり；
－ Ｘ_ｓｃ３が、Ｋ及びＹから選択された足場アミノ酸残基であり；
－ Ｘ_ｓｃ４が、Ｅ及びＱから選択された足場アミノ酸残基であり；及び
－ 各Ｘが、個々に、何れかのアミノ酸残基に対応する結合アミノ酸残基である）
を含むポリペプチドの集団が提供される。

一実施形態において、集団内の各ポリペプチドは、足場アミノ酸配列
ＬＡＥＡＫＥＡＡＸ_ｓｃ１Ａ ＥＬＤＸ_ｓｃ２Ｘ_ｓｃ３ＧＶＧＡＸ ＸＩＫＸＩＸ_ｓｃ４ＸＡＸＸ ＶＥＸＶＱＸＸＫＱＸ ＩＬＡＸＬＰ
（配列番号１６６）
（配列中、Ｘ_ｓｃ１、Ｘ_ｓｃ２、Ｘ_ｓｃ３、Ｘ_ｓｃ４及び各個々のＸが、上記で定義された通りである）
を含む。

上記のように、アミノ酸残基Ｘ_ｓｃ１、Ｘ_ｓｃ２、Ｘ_ｓｃ３及びＸ_ｓｃ４は、「足場アミノ酸残基」であり、固定アミノ酸残基と同じように、集団内の各変異体ポリペプチドの基本構造の一部を形成する。通常、これらは、新規標的結合特性を生成する目的、又は新規結合変異体を選択する目的でのランダム化には関与しない。本開示のこの態様による集団の一実施形態において、集団内の全ての変異体は、足場位置Ｘ_ｓｃ１、Ｘ_ｓｃ２、Ｘ_ｓｃ３及びＸ_ｓｃ４の少なくとも１つ、例えば少なくとも２つ、例えば少なくとも３つ、例えば４つの全てに同じアミノ酸残基を有する。

一実施形態において、Ｘ_ｓｃ１は、Ｉである。他の実施形態において、Ｘ_ｓｃ１は、Ｌである。

一実施形態において、Ｘ_ｓｃ２は、Ｓである。他の実施形態において、Ｘ_ｓｃ２は、Ｃである。

一実施形態において、Ｘ_ｓｃ３は、Ｋである。他の実施形態において、Ｘ_ｓｃ３は、Ｙである。

一実施形態において、Ｘ_ｓｃ４は、Ｑである。他の実施形態において、Ｘ_ｓｃ４は、Ｅである。

反対に、全て単に「Ｘ」で示される「結合アミノ酸残基」は、通常、集団内で自由に変化することが許されている、すなわち、それらは大体ランダム化されている。それらは、ポリペプチドの結合能力に望ましい変化を提供することに役立ち、新しい結合能力を備えた新しい組み合わせを見つけるために配列空間の探索を可能にする。集団内のポリペプチド変異体は、主にこれらのＸの位置に違いがあるために異なる。従って、各Ｘは、様々なアミノ酸残基に個々に対応する。すなわち、各Ｘは、配列中の他の何れかの残基の同一性に依存しない何れかのアミノ酸であり得る。開示されたアミノ酸配列の一実施形態において、異なる多様なアミノ酸Ｘは、これら２０個の天然に存在するアミノ酸残基の何れかが何れかの所定の変異体に対応するＸ位置に存在し得るように、２０個全ての天然に存在するアミノ酸残基から選択され得る。集団のメンバーがｄｅ ｎｏｖｏ合成されたペプチドである実施形態において、天然に存在しないアミノ酸残基をランダム又は疑似ランダムな様式で配列に含めることも可能であり、従って、さらなるバリエーションを提供することが可能である。

各位置のアミノ酸残基の選択は、多かれ少なかれランダム化され得る。従って、異なる多様なアミノ酸残基が選択されるグループを、可能な天然及び／又は非天然に存在するアミノ酸残基のサブグループに限定することが可能である。

一実施形態において、１つ以上の結合アミノ酸残基「Ｘ」は、システインを除くすべての天然に存在するアミノ酸残基からなる群から選択される。利用可能なランダムプールからシステインを除外する理由の1つは、そうすることで、ラベル付けの目的で、後でシステイン残基をアミノ酸配列に直接導入できるようになるためである（以下を参照）。それはまた、ポリペプチド内に形成される破壊的なジスルフィド結合のリスクを低減すると予想する。

一実施形態において、１つ以上の結合アミノ酸残基「Ｘ」は、プロリンを除く天然に存在する全てのアミノ酸残基からなる群から選択される。

一実施形態において、αヘリックス領域に対応する位置にある１つ以上の結合アミノ酸残基「Ｘ」は、プロリンを除く天然に存在する全てのアミノ酸残基からなる群から選択される。これらの領域で、利用可能なランダムプールからプロリンを除外する理由の１つは、プロリンが通常、α－ヘリックス構造を破壊するためである。

一実施形態において、配列番号１６５の位置１２、１３、１６、２５、２８、２９、３２及び３６に対応する位置の１つ以上の結合アミノ酸残基「Ｘ」は、プロリンを除く天然に存在する全てのアミノ酸残基からなる群から選択される。

一実施形態において、１つ以上の結合アミノ酸残基「Ｘ」は、システイン及びプロリンを除く天然に存在する全てのアミノ酸残基からなる群から選択される。

一実施形態において、配列番号１６５の位置１２、１３、１６、２５、２８、２９、３２及び３６に対応する位置の１つ以上の結合アミノ酸残基「Ｘ」は、システイン及びプロリンを除く天然に存在する全てのアミノ酸残基からなる群から選択される。

一実施形態において、１つ以上の結合アミノ酸残基「Ｘ」は、システインを除く天然に存在する全てのアミノ酸残基からなる群から選択され、配列番号１６５の位置１２、１３、１６、２５、２８、２９、３２及び３６に対応する位置の１つ以上の結合アミノ酸残基「Ｘ」は、プロリンを除く天然に存在する全てのアミノ酸残基からなる群から選択される。この実施形態の例において、配列番号１６５の位置１２、１３、１６、２５、２８、２９、３２及び３６に対応する位置の全ての結合アミノ酸残基「Ｘ」は、システイン及びプロリンを除く天然に存在する全てのアミノ酸残基からなる群から選択され、一方、配列番号１６５の位置１９、２１及び２２に対応する位置の結合アミノ酸残基「Ｘ」は、システインを除く天然に存在する全てのアミノ酸残基からなる群から選択される。

一実施形態において、１つ以上の結合アミノ酸残基「Ｘ」は、メチオニンを除く天然に存在する全てのアミノ酸残基からなる群から選択される。

言い換えると、異なる結合位置の変動性は、２０アミノ酸全てまで、ランダム化なしを意味する、１つの間で個々に調整可能である。アミノ酸のより小さなサブセットのランダムな導入は、導入されたヌクレオチド塩基の設計によって得られ得る。例えば、コドンＴ（Ａ／Ｃ）Ｃを導入して、ポリペプチド鎖の所定の位置にセリン又はチロシンの何れかをランダムに導入することができる。同様に、コドン（Ｔ／Ｃ／Ａ／Ｇ）ＣＣを導入して、ポリペプチド鎖の所定の位置にセリン、プロリン、スレオニン、及びアラニンをランダムに導入することができる。当業者には、ポリペプチド鎖の所定のＸ位置でアミノ酸の異なる組み合わせを得るのに有用な塩基の組み合わせの多くの選択肢は、周知である。ポリペプチド鎖の所定のＸ位置に現れる可能性のあるアミノ酸のセットは、一度に１つのデオキシリボヌクレオチド塩基の代わりに、オリゴヌクレオチド合成中にトリヌクレオチドを導入することによって決定することも可能である。

集団は、開示された足場アミノ酸配列を含むポリペプチド分子の多数のユニークな変異体からなる。対照的に、少なくとも１×１０^４のユニークポリペプチド分子、又は少なくとも１×１０^６、又は少なくとも１×１０^８、又は少なくとも１×１０^１０、又は少なくとも１×１０^１２、又は少なくとも１×１０^１４、又は少なくとも１×１０^１５のユニークポリペプチド分子を含む集団を意味する。多くの場合、本開示で使用される集団は、所望のサイズ、複雑さ、及び変動を提供するのに十分な大きさのグループである。本明細書に記載の「集団」は、「ライブラリー」と呼ばれることもある。本明細書で使用される場合、「ユニークポリペプチド分子」は、アミノ酸残基の特定の配列を示し、ここで、Ｘ_ｓｃ１、Ｘ_ｓｃ２、_Ｘｓｃ３、Ｘ_ｓｃ４及びＸ残基の全てが特定のアミノ酸残基を表す。従って、開示された集団が、例えば、「少なくとも１×１０^４のユニークポリペプチド分子」を含むと述べられる場合、これは、定義された配列の少なくとも１×１０^４の異なる変異体が集団に存在することを意味する。

上記の足場アミノ酸配列を含むポリペプチドは、ストレプトコッカスプロテインＧ由来のＧ１４８－ＧＡ３のアルブミン結合ドメインの変異体であると見なすことができる。このように、それらはストレプトコッカスプロテインＧに由来する。これに関連して「由来する」とは、ポリペプチド自体が、必ずしもプロテインＧに直接由来することを意味するものではない。代わりに、それは、足場が、3ヘリックスバンドルタンパク質の疎水性コアのアミノ酸が保存されているアルブミン結合ドメインに配列及び構造的に類似していることを意味する。

本開示の範囲から逸脱することなく、意図された特定の用途にポリペプチドを合わせるために、第１の態様による集団を構成するポリペプチドの異なる修飾、及び／又は付加を行うことが可能である。そのような修飾及び付加は、以下により詳細に記載され、同じポリペプチド鎖に含まれる追加のアミノ酸、又は集団を構成するポリペプチドに化学的に結合又は他の方法で結合される標識及び／又は治療薬を含み得る。いくつかの実施形態において、Ｃ末端のアミノ酸残基付加が、好ましい。いくつかの実施形態において、Ｎ末端のアミノ酸残基付加が、好ましい。いくつかの実施形態において、ポリペプチド鎖の両端での付加が、好ましい。

これらのアミノ酸残基付加は、ポリペプチドの結合において役割を果たす可能性があるが、例えば、ポリペプチドの生成、精製、安定化、カップリング又は検出のうちの１つ以上に関連する他の目的にも同様に役立つ可能性がある。そのようなアミノ酸残基付加は、化学的カップリングの目的で追加された１つ以上のアミノ酸残基を含み得る。この例は、例えば配列内の、配列の最初の位置又は配列の最後の位置でのシステイン残基の付加である。化学的カップリングに使用されるシステイン残基は、例えば、タンパク質ドメインの表面、好ましくは標的結合に関与しない表面の部分上の別のアミノ酸の置換によって導入され得る。

一実施形態において、システイン残基は、配列番号１６５の位置Ｘ_ｓｃ２に対応する位置に存在する。理論に拘束されることを望まず、祖先のＡＢＤドメインで利用可能な構造情報に基づいて、この位置は、アルブミン結合に関与しない、ＡＢＤの３ヘリックスバンドルの最初のヘリックスの終わりにある表面に露出した位置と見なされる。ＡＢＤの改変されたアルブミン結合誘導体において、Ｓはこの位置で十分に許容されることが見出されており、相同のＣも本開示との関連において十分に機能すると考えられる。この位置でのシステインの導入は、例えば、ＷＯ２０１２／００４３８４でアルブミン結合ＡＢＤ変異体について以前に開示された。

アミノ酸残基付加はまた、ポリペプチドの精製又は検出のための「タグ」、例えばヘキサヒスチジル（Ｈｉｓ_６）タグ、又はタグに特異的な抗体との相互作用のための「ｍｙｃ」タグ又は「ＦＬＡＧ」タグを含み得る。当業者にとって他の選択肢は周知である。

「アミノ酸残基付加」はまた、他の結合機能、又は金属イオンキレート機能、又は蛍光機能、又は毒性機能、又はそれらの混合等の何れかの所望の機能を有する１つ以上のポリペプチドドメインを構成し得る。例えば、そのようなポリペプチドドメインは、アルブミンに対して結合親和性を有し得る。一実施形態において、アルブミンに対する結合親和性を有する追加のドメインは、連鎖球菌プロテインＧからの天然に存在するＡＢＤ又はＧ１４８－ＧＡ３アルブミン結合ドメイン、又は保持若しくは改善されたアルブミン結合親和性を有するその改変された変異体である。企図された改変ＡＢＤ変異体の例は、以下（Rozak et al, supra; Jonsson et al, supra; WO2009/016043; Jacobs et al, supra; WO2013/177398; WO2012/004384; and WO2012/162068）に開示されている。

第２の態様において、本開示は、ポリヌクレオチドの集団を提供する。この集団の各ポリヌクレオチドは、上記のポリペプチドの集団のメンバーをコードする。

第３の態様において、本開示は、第１の態様によるポリペプチド集団と第２の態様によるポリヌクレオチド集団との組み合わせを提供し、ここで、ポリペプチド集団の各メンバーは、遺伝子型－表現型カップリングの手段を介して、そのメンバーをコードするポリヌクレオチドと物理的又は空間的に関連する。この物理的又は空間的な関連付けは、使用するシステムに応じて、多かれ少なかれ厳密である。以下は、全て当業者に周知である、遺伝子型－表現型カップリングを達成するために考えられる可能な方法の詳細な説明に続く。重要なことは、全てのシステムが、直接的な物理的相互作用の工程を含む必要がなく、代わりに、遺伝子に対応する核酸（すなわち、遺伝子型）と前記遺伝子によってコードされるポリペプチド（すなわち表現型）との間の空間に間接的な関連があり得る。この内容における「空間的」関連は、対応するものの同定を通じて対の何れかのメンバーの同定を可能にする遺伝子とポリペプチドの間の何れかの対応を指す。言い換えれば、関連付けはランダムではなく、具体的で方向性を有する。物理的又は空間的関連を通じて、ヌクレオチド配列又はアミノ酸配列の何れかの知見は、特異的に対応するポリペプチド又は遺伝子の同定を可能にする。

一実施形態において、遺伝子型－表現型カップリングのための手段は、ファージディスプレイシステムを含む。ファージディスプレイシステムは当業者によく知られており、例えば、以下の文献（Smith GP (1985) Science 228:1315-1317 and Barbas CF et al (1991) Proc Natl Acad Sci U S A 88:7978-7982）記載されている。

一実施形態において、遺伝子型－表現型カップリングの手段は、細胞表面ディスプレイシステムを含む。細胞表面ディスプレイシステムは、Ｇｒａｍ^＋細胞又はＧｒａｍ^－細胞等の真核細胞、又は酵母細胞若しくは哺乳動物細胞等の真核細胞を含み得る。原核生物システムは、例えば、以下の文献に記載される（Francisco JA et al (1993) Proc Natl Acad Sci U S A 90:10444-10448 and Lee SY et al (2003) Trends Biotechnol 21:45-52）。真核生物システムは、例えば、以下の文献に記載される（Boder ET et al (1997) Nat Biotechnol 15:553-557 and Gai SA et al (2007) Curr Opin Struct Biol 17:467-473）。

一実施形態において、遺伝子型－表現型カップリングのための手段は、無細胞ディスプレイシステムを含む。無細胞ディスプレイシステムは、リボソームディスプレイシステム、インビトロ区画化ディスプレイシステム、シスディスプレイ用のシステム、又はマイクロビーズディスプレイシステムを含み得る。リボソームディスプレイシステムは、例えば、以下の文献に記載される（Mattheakis LC et al (1994) Proc Natl Acad Sci U S A 91:9022-9026 and Zahnd C et al (2007) Nat Methods 4:269-279）。インビトロ区画化ディスプレイシステムは、例えば、以下の文献に記載される（Sepp A et al (2002) FEBS Lett 532:455-458）。シスディスプレイシステムは、例えば、以下の文献に記載される（Odegrip R et al (2004) Proc Natl Acad Sci U S A 101:2806-2810）。マイクロビーズディスプレイシステムは、例えば、以下の文献に記載される（Nord O et al (2003) J Biotechnol 106:1-13）。

さらに、遺伝子型－表現型カップリングの手段は、タンパク質フラグメント補完アッセイ（PCA）等の非ディスプレイシステムを含み得る。ＰＣＡシステムは、例えば、以下の文献に記載される（Koch H et al (2006) J Mol Biol 357:427-441）。

第４の態様において、本開示は、ポリペプチドの集団から所定の標的に対して親和性を有する所望のポリペプチドを選択するための方法を提供し、当該方法は、以下の工程を含む：
（ａ）第１の態様に従ってポリペプチドの集団を提供すること；
（ｂ）標的と標的に対する親和性を有する少なくとも１つの所望のポリペプチドの間の特異的相互作用を可能にする条件下で、ポリペプチドの集団を所定の標的と接触させること；及び
（ｃ）前記特異的相互作用に基づいて、ポリペプチドの残りの集団から少なくとも１つの所望のポリペプチドを選択すること。

この方法は、本開示によれば、「選択方法」と称される場合がある。

工程（ａ）は、第２の態様に従ってポリヌクレオチドの集団を提供し、ポリヌクレオチドの前記集団を発現させてポリペプチドの前記集団を生成する準備工程を含み得る。ポリペプチドの集団を生成するための手段は、使用されるディスプレイシステムによって異なり、そのような手段の例は、上記の遺伝子型-表現型の参考文献に見出され得る。第４の態様による選択方法で使用されるポリペプチドの前記集団の各メンバーは、遺伝子型－表現型カップリングのための手段を介して、そのメンバーをコードするポリヌクレオチドと物理的に付随し得る。遺伝子型－表現型カップリングの手段は、上記のうちの１つである可能性がある。

工程（ｂ）は、標的と、標的に対して親和性を有する少なくとも１つの所望のポリペプチドとの間の特異的相互作用を可能にする条件下で、ポリペプチドの集団を所定の標的と接触させる工程を含む。適用可能な条件の範囲は、標的の堅牢性、ディスプレイシステムの堅牢性、及び標的との相互作用の望ましい特性によって決定される。例えば、相互作用を分離する特異的な方法、例えば、所定のｐＨへの酸性化が有用であり得る。当業者にとって、適切な条件を決定するためにどのような実験が必要であるか周知である。

工程（ｃ）は、少なくとも１つのポリペプチドの選択を含む。所定の標的と標的に対する親和性を有する少なくとも１つの所望のポリペプチドとの間の特異的相互作用に基づいて、残りの集団からの所望のポリペプチドを選択する手段は、使用されるディスプレイシステムによって異なり、上記の遺伝子型－表現型の引用文献に見出され得る。例えば、ファージディスプレイシステム及びタンパク質フラグメント区画化アッセイ等のシステムとは対照的に、インビトロディスプレイ選択システムは、無細胞である。

第５の態様において、本開示は、所望の標的に対して親和性を有する所望のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを単離するための方法を提供し、当該方法は、以下を含む：
－ 第４の態様による選択方法を使用して、ポリペプチドの集団から前記所望のポリペプチド及びそれをコードするポリヌクレオチドを選択すること；及び
－ 前記所望のポリペプチドをコードするこのように分離されたヌクレオチドを単離すること。

この方法は、本開示によれば「分離方法」と称される場合がある。

ポリペプチドからのポリヌクレオチドの分離は、選択に使用されるディスプレイシステムに応じて別様に行われ得る。例えば、シスディスプレイやリボソームディスプレイ等の無細胞ディスプレイシステムにおいて、ポリヌクレオチド又は対応するｍＲＮＡは、上記の遺伝子型－表現型の参考文献に記載されている手段を使用して、ポリペプチドから効率的に溶出することによって回収される。

ポリヌクレオチドの単離は、選択に使用されるディスプレイシステムに応じて異なる方法によって行われ得る。上記の選択システムのほとんどにおいて、ポリヌクレオチドは、適切なオリゴヌクレオチドを使用する特異的ＰＣＲ増幅によって直接単離され得る。例外的に、リボソームディスプレイの場合のように、ポリヌクレオチドは、逆転写を使用して対応するｍＲＮＡから単離され得る。ポリヌクレオチドを単離するための様々な手段は、上記の遺伝子型－表現型の参考文献に見出され得る。

第６の態様において、本開示は、所定の標的に対して親和性を有する所望のポリペプチドを同定するための方法を提供し、当該方法は、以下を含む：
－ 第５の態様による単離方法を使用して、前記所望のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを単離すること；及び
－ 前記所望のポリペプチドのアミノ酸配列を推定するためにポリヌクレオチドの配列を決定すること。

ポリヌクレオチドの配列決定は、当業者に周知の標準的な手順に従って行われ得る。

第７の態様において、本開示は、ポリペプチドの集団から所定の標的に対して親和性を有する所望のポリペプチドを選択及び同定するための方法を提供し、当該方法は、以下を含む：
（ａ）別個の担体又はビーズ上で第１の態様に従ってポリペプチドの集団の各メンバーを合成すること；
（ｂ）ポリペプチドと所定の標的との相互作用に基づいて、担体又はビーズを選択又は富化すること；及び
（ｃ）タンパク質特性評価法によりポリペプチドを同定すること。

工程（ｃ）において、例えば、質量分析を使用することが可能である。

この方法は、本開示によれば、「選択及び同定方法」と称される場合がある。

第８の態様において、本開示は、所定の標的に対して親和性を有する所望のポリペプチドを産生するための方法を提供し、当該方法は、以下を含む：
－ 第４の態様による選択方法又は第７の態様による選択及び同定方法を使用して、所望のポリペプチドを選択及び同定すること；及び
－ 前記所望のポリペプチドを産生すること。

この方法は、本開示によれば、「産生方法」と称される場合がある。

この態様による産生方法において、産生は、所望のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの組換え発現を使用して実施され得る。産生はまた、ｄｅ ｎｏｖｏでの所望のポリペプチドの化学合成を用いて実行され得る。

第９の態様において、本開示は、所定の標的に対して親和性を有する所望のポリペプチドを産生するための方法を提供し、当該方法は、以下を含む：
（ａ１）第５の代用による単離方法を使用して、前記所望のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを単離すること；又は
（ａ２）第７の態様による選択及び同定方法を使用して同定されたポリペプチドを逆翻訳すること；及び
（ｂ）このように単離されたポリヌクレオチドを発現し、前記所望のポリペプチドを産生すること；
ここで、工程（ｂ）は、必要に応じて、工程（ａ１）又は（ａ２）の後に実行される。

ポリヌクレオチドの発現は、限定されないが、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞又は哺乳動物細胞等の何れかの適切な発現宿主において行われ得る。

容易に理解されるように、開示された集団又はライブラリーから選択された任意のポリペプチドは、集団内の全ての変異体又はメンバーに共通の配列定義を充足すると考えられる。それは通常、所定の標的に対して親和性を有するポリペプチドであり、その標的への結合が利用され得る何れかの用途において有用である。

従って、本開示の第１０の態様において、
Ｘ_１ＡＥＬＤＸ_６Ｘ_７ＧＶＧ ＡＸ_１２Ｘ_１３ＩＫＸ_１６ＩＸ_１８Ｘ_１９Ａ Ｘ_２１Ｘ_２２ＶＥＸ_２５ＶＱＸ_２８Ｘ_２９Ｋ ＱＸ_３２ＩＬＡＸ_３６
（配列番号１６５）
（配列中、互いに独立して、
－ Ｘ_１が、Ｉ及びＬから選択され；
－ Ｘ_６が、Ｃ及びＳから選択され；
－ Ｘ_７が、Ｋ及びＹから選択され；
－ Ｘ_１８が、Ｅ及びＱから選択され；及び
－ Ｘ_１２、Ｘ_１３、Ｘ_１６、Ｘ_１９、Ｘ_２１、Ｘ_２２、Ｘ_２５、Ｘ_２８、Ｘ_２９、Ｘ_３２及びＸ_３６の各々が、何れかのアミノ酸残基である）
に対し少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドが提供される。

この態様の一実施形態において、ポリペプチドは、
ＬＡＥＡＫＥＡＡ Ｘ_１ＡＥＬＤＸ_６Ｘ_７ＧＶＧ ＡＸ_１２Ｘ_１３ＩＫＸ_１６ＩＸ_１８Ｘ_１９Ａ Ｘ_２１Ｘ_２２ＶＥＸ_２５ＶＱＸ_２８Ｘ_２９Ｋ ＱＸ_３２ＩＬＡＸ_３６ ＬＰ（配列番号１６６）
（配列中、「Ｘ_ｎ」で示される全ての残基は、上記で定義された通りである）
に対し少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列を含む。

一実施形態において、Ｘ_１は、Ｉである。他の実施形態においてＸ_１は、Ｌである。

一実施形態において、Ｘ_６は、Ｓである。他の実施形態においてＸ_６は、Ｃである。

一実施形態において、Ｘ_７は、Ｋである。他の実施形態においてＸ_７は、Ｙである。

一実施形態において、Ｘ_１８は、Ｅである。他の実施形態においてＸ_１８は、Ｑである。

一実施形態において、１１位のアミノ酸は、Ａである。

当業者に理解されるように、本開示のこの第１０の態様のポリペプチド等の何れかのポリペプチドの機能は、その三次構造に依存する。従って、一般的な折り畳みと全体的な構造が実質的に変化しない限り、ポリペプチドの機能に影響を与えることなく、ポリペプチドのアミノ酸配列に小さな変更を加えることが可能である。本開示は、所定の標的に対する安定性及び／又は結合親和性に対する何れかの実質的な影響等、ポリペプチドの機能的特性を変化させないようなポリペプチドの修飾を包含する。

このように、本開示には、配列番号１６５又は配列番号１６６に対し、９７％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドも包含される。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、配列番号１６５又は１６６に対し、少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％、例えば１００％同一である配列を含み得る。

いくつかの実施形態において、配列番号１６５又は配列番号１６６におけるそのような変異は、本明細書に記載されるようなポリペプチドの配列の何れかの置換に見出され得る。他の実施形態において、差異は、足場アミノ酸残基にのみ見出され得る。他の実施形態において、差異は、標的結合特異性を与えるアミノ酸残基にのみ見出され得る。例えば、アミノ酸残基の特定の官能基（例えば、疎水性、親水性、極性等）に属するアミノ酸残基を、同じ官能基からの別のアミノ酸残基に交換することが可能である。

明細書全体で使用される「％同一性」という用語は、例えば以下のように計算される。クエリ配列は、ＣＬＵＳＴＡＬ Ｗアルゴリズム（Thompson et al, Nucleic Acids Research, 22: 4673-4680 (1994)）を使用して標的配列に対し、アライメントされる。アライメントされたシーケンスの１つ、例えば、最短のシーケンスに対応するウィンドウ（ｗｉｎｄｏｗ）で比較が行われる。ウィンドウは、場合によって、標的配列によって定義され得る。他の例において、ウィンドウは、クエリ配列によって定義され得る。各位置のアミノ酸残基が比較され、標的配列内で同一の対応を持つクエリ配列内の位置のパーセンテージが％同一性として報告される。

本開示による集団を構成するポリペプチドについて上記利点及び修飾はまた、本開示によるポリペプチド又は開示された方法の何れかによって得られたポリペプチドにも適用可能である。従って、第１の態様による集団に関する上記開示と同様に、この第１０の態様によるポリペプチドの修飾及び／又は付加は、本開示の範囲から逸脱することなく、採用することができる。

特に、第１０の態様によるポリペプチドはまた、第２の（及び任意にさらに）ポリペプチド部分を含み得、その結果、ポリペプチドは、第１０の態様によるポリペプチドの定義を満たす部分と、所望の機能を提供する少なくとも１つのさらなる部分（任意にそれ以上）との融合ポリペプチドである。この所望の機能は、第１０の態様によるポリペプチドによって提供される機能と同じであっても異なっていてもよく、これは通常、常にではないが、所定の標的に対する親和性に基づく結合機能である。この点に関する代替案及びその他の考慮事項は、第１の態様に関連して上記に示され、この第１０の態様にも同様に適用される。

また、第１１の態様として、第１０の態様によるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも開示される。本開示はまた、第１２の態様として、第１１の態様によるポリヌクレオチドを発現する工程を含む、第１０の態様によるポリペプチドを産生する方法を提供する。

本開示において、「所定の標的に対する結合親和性」、「所定の標的への結合」等の表現は、親和性定数、すなわち、所定の抗原濃度で会合及び会合するポリペプチドの量を決定することによって直接測定され得るポリペプチドの特性を指す。親和性定数又は他の類似のパラメータを決定するために、異なる方法を使用することができ、限定されないが、例えば、競合分析、平衡分析及びマイクロカロリメトリクス分析、及び例えば表面プラズモン共鳴相互作用（ＳＰＲ）に基づくリアルタイム相互作用分析等が挙げられる。

ＳＰＲの場合において、結合親和性は、所定の標的又はその断片が効きのセンサーチップに固定され、試験されるポリペプチド含むサンプルがチップを通過する実験で試験され得る。あるいは、試験されるポリペプチドは、機器のセンサーチップに固定化され、所定の標的又はその断片を含むサンプルがチップ上を通過する。次に、当業者は、そのような実験によって得られた結果を解釈して、所定の標的に対するポリペプチドの結合親和性の少なくとも定性的な尺度を確立することができる。定量的な測定が必要な場合、例えば、相互作用のＫ_Ｄ値を決定する場合は、表面プラズモン共鳴法を使用することもできる。結合値は、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）又はＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲ３６（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）機器で定義することができる。所定の標的は、機器のセンサーチップ上に適切に固定化され、及び親和性が決定されるポリペプチドのサンプルは、段階希釈によって調製され、ランダムな順序で注入される。次にＫ_Ｄ値は、例えば、機器製造業者によって提供されるＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ４．１ソフトウェアの１：１ラングミュア結合モデル、又は他の適切なソフトウェアを使用して結果から計算される。

本明細書で使用される「所定の標的に対する結合親和性」という用語はまた、例えばＥＬＩＳＡによって試験され得るポリペプチドの特性を指し得る。例えば、
結合親和性は、ポリペプチドのサンプルが抗体でコーティングされたＥＬＩＳＡプレートに捕捉され、ビオチン化された所定の標的又はその断片が加えられ、続いてストレプトアビジンコンジュゲート結合ＨＲＰが加えられる実験で試験され得る。ＴＭＢ基質を加え、Ｖｉｃｔｏｒ^３（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）等のマルチウェルプレートリーダーを使用して、４５０ｎｍでの吸光度を測定する。次に、当業者は、そのような実験によって得られた結果を解釈して、所定の標的に対する複合体の結合親和性の少なくとも定性的な尺度を確立することができる。定量的測定が必要な場合、例えば相互作用のＥＣ５０値（最大有効濃度の半分）を決定する場合は、ＥＬＩＳＡを使用することも可能である。所定の標的の希釈系列又はそのフラグメントに対するポリペプチドの応答は、上記のようにＥＬＩＳＡを使用して測定される。次に、当業者は、そのような実験によって得られた結果を解釈することができ、ＥＣ５０値は、例えば、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ５及び非線形回帰を使用して、結果から計算することができる。

上記のような方法は、当業者に周知であり、例えば以下（Neri D et al (1996) Tibtech 14:465-470及びJansson M et al (1997) J Biol Chem 272:8189-8197）にさらに記載される。

本開示によるポリペプチド、集団及び方法は、所定の標的への特異的結合を特徴とするポリペプチドの提供を通じて、所定の標的に対する親和性を有する薬剤の提供を可能にする。

非特異的結合をほとんど又は全く示さない所定の標的に結合するポリペプチドを提供することも可能である。

融合ポリペプチドの部分として容易に使用することができる所定の標的に結合するポリペプチドを提供することも可能である。

さらに、特にサイズが小さいために、既存の抗体試薬で発生する既知の問題の１つ以上、特にサイズが小さいことに起因する問題を解決する所定の標的に結合するポリペプチドを提供することが可能です。例えば、本開示によるポリペプチドは、好ましい組織浸透を示し、代替の投与経路及び単位重量当たりのより高いモル用量の使用を可能にすることが期待される。

本開示による小さいサイズのポリペプチドはまた、例えば、結合していないポリペプチドが迅速に除去されるため、インビボイメージング用途において親和性試薬としてそれらを使用する場合に利益を提供すると予想される。これにより、高コントラストの画像が得られることが期待される。

さらに、治療及び／又は診断用途での使用に適した所定の標的に結合するポリペプチドを提供することが可能である。

化学ペプチド合成によって容易に作製される所定の標的に結合するポリペプチドを提供することも可能である。例えば、サイズが小さいことに加えて、アスパラギン、アルギニン、アスパラギン酸、メチオニン等、一般に合成で問題を引き起こすアミノ酸残基が比較的少ない。一般に、本明細書で定義されるポリペプチドは、メチオニン、アスパラギン及びジペプチドアスパラギン-プロリン等のポリペプチド安定性の問題に関連する足場アミノ酸残基を含まない。

新規結合親和性を有する既知のＡＢＤ変異体とは対照的に、本開示によるポリペプチドは、出発点として脱免疫化変異体ＰＰ０１３（配列番号１５９）を使用して設計される。従って、例えば、開示された集団から開示された方法による選択から生じる開示されたポリペプチドは、例えば、Ｇ１４８－ＧＡ３野生型配列（配列番号１５８）に基づく同等のＡＢＤ変異体よりも少ない免疫原性エピトープを有すると予想される。

また、新規の結合親和性を有する特定の既知のＡＢＤ変異体は、アルブミンに結合する能力を保持する。様々な用途において、これは新規の親和性を妨害する可能性があり、本明細書に開示されるポリペプチドの実施形態はこの特徴を示さないと予想される。むしろ、アルブミン結合能力は、開示されたポリペプチドにおいて完全に無効にされ、及び所定の標的に対する新しい親和性によって置き換えられることが意図されている。

本開示によるポリペプチドは、検出試薬、捕捉試薬、分離試薬、インビボ又はインビトロでの診断のための診断薬として、それ自体で治療薬として、又は他の治療薬及び／又は診断薬を所定の標的に標的化するための手段として使用することができる。インビトロでポリペプチドを使用する方法は、マイクロタイタープレート、タンパク質アレイ、バイオセンサー表面、組織切片等、異なるフォーマットで実施され得る。

本開示によるポリペプチドは、細菌細胞、酵母細胞、植物細胞、昆虫細胞、全植物及びトランスジェニック動物を含む、異なる原核生物又は真核生物の宿主における化学合成又は発現を含む、何れかの既知の手段によって産生され得る。

本明細書に開示されるポリペプチド、ポリペプチドの集団、及び同定、選択、単離及び産生のための方法は、様々な例示的な態様及び実施形態を参照して説明されてきたが、本開示の範囲から逸脱することなく、様々な変更を行うことができ、その要素の代わりに同等物を使用することができることが当業者によって理解されるであろう。加えて、特定の状況又は分子を、その本質的な範囲から逸脱することなく、本開示の教示に適合させるために、多くの修正を行うことができる。従って、本開示は、企図される特定の実施形態に限定されず、添付の特許請求の範囲に含まれる全ての実施形態を含むことが意図されている。

図１は、予備ライブラリーＹｌｉｂ００１Ｎａｉｖｅ．Ｉから選択され、ＥＬＩＳＡによってそれぞれの標的分子と相互作用することが確認されたＹ変異体内の各位置のそれぞれのアミノ酸の頻度を視覚化するシーケンスロゴを示す。（Ａ）Ｃ４に結合することが確認された１８のＹ変異体に基づくロゴ；（Ｂ）ＩＬ－６に結合することが確認された１０６のＹ変異体に基づくロゴ；（Ｃ）インスリンに結合することが確認された２１のＹバリアントに基づくロゴ；及び（Ｄ）（Ａ）～（Ｃ）を含む複合シーケンスロゴ、すなわち、Ｃ４、ＩＬ－６又はインスリンに結合することが確認されたＹ変異体。 図１は、予備ライブラリーＹｌｉｂ００１Ｎａｉｖｅ．Ｉから選択され、ＥＬＩＳＡによってそれぞれの標的分子と相互作用することが確認されたＹ変異体内の各位置のそれぞれのアミノ酸の頻度を視覚化するシーケンスロゴを示す。（Ａ）Ｃ４に結合することが確認された１８のＹ変異体に基づくロゴ；（Ｂ）ＩＬ－６に結合することが確認された１０６のＹ変異体に基づくロゴ；（Ｃ）インスリンに結合することが確認された２１のＹバリアントに基づくロゴ；及び（Ｄ）（Ａ）～（Ｃ）を含む複合シーケンスロゴ、すなわち、Ｃ４、ＩＬ－６又はインスリンに結合することが確認されたＹ変異体。 図２は、Ｙｌｉｂ００１Ｎａｉｖｅ．Ｉから選択したＣ４、ＩＬ－６及びインスリン結合Ｙ変異体の２０℃で回収された円二色性（ＣＤ）スペクトルを示す。 図３は、インスリン結合Ｙ変異体Ｙ００２７４（Ａ）及びＹ００２７５（Ｂ）の可変温度測定（ＶＴＭ）の前（黒）及び後（灰色）に２０℃で回収されたＣＤスペクトルを示す。 図４は、Ｃ４結合変異体Ｙ００７９２（Ａ～Ｂ）、インスリン結合Ｙ変異体Ｙ００３０１（Ｃ～Ｄ）及びＩＬ－６結合変異体Ｙ０２４４４（Ｅ～Ｇ）について回収されたＶＴＭ及びＣＤスペクトルを示す。ＶＴＭを、図４Ａ、Ｃ及びＥに示し、ＶＴＭの前（黒）及び後（灰色）に２０℃で回収されたＣＤスペクトルを図Ｂ、Ｄ及びＦに示す。図４Ｇは、ＩＬ－６結合変異体Ｙ０２４４４の部分構造が、９０℃まで観察されることを示す。 図４は、Ｃ４結合変異体Ｙ００７９２（Ａ～Ｂ）、インスリン結合Ｙ変異体Ｙ００３０１（Ｃ～Ｄ）及びＩＬ－６結合変異体Ｙ０２４４４（Ｅ～Ｇ）について回収されたＶＴＭ及びＣＤスペクトルを示す。ＶＴＭを、図４Ａ、Ｃ及びＥに示し、ＶＴＭの前（黒）及び後（灰色）に２０℃で回収されたＣＤスペクトルを図Ｂ、Ｄ及びＦに示す。図４Ｇは、ＩＬ－６結合変異体Ｙ０２４４４の部分構造が、９０℃まで観察されることを示す。 図４は、Ｃ４結合変異体Ｙ００７９２（Ａ～Ｂ）、インスリン結合Ｙ変異体Ｙ００３０１（Ｃ～Ｄ）及びＩＬ－６結合変異体Ｙ０２４４４（Ｅ～Ｇ）について回収されたＶＴＭ及びＣＤスペクトルを示す。ＶＴＭを、図４Ａ、Ｃ及びＥに示し、ＶＴＭの前（黒）及び後（灰色）に２０℃で回収されたＣＤスペクトルを図Ｂ、Ｄ及びＦに示す。図４Ｇは、ＩＬ－６結合変異体Ｙ０２４４４の部分構造が、９０℃まで観察されることを示す。 図４は、Ｃ４結合変異体Ｙ００７９２（Ａ～Ｂ）、インスリン結合Ｙ変異体Ｙ００３０１（Ｃ～Ｄ）及びＩＬ－６結合変異体Ｙ０２４４４（Ｅ～Ｇ）について回収されたＶＴＭ及びＣＤスペクトルを示す。ＶＴＭを、図４Ａ、Ｃ及びＥに示し、ＶＴＭの前（黒）及び後（灰色）に２０℃で回収されたＣＤスペクトルを図Ｂ、Ｄ及びＦに示す。図４Ｇは、ＩＬ－６結合変異体Ｙ０２４４４の部分構造が、９０℃まで観察されることを示す。

実施例
以下の実施例は、アルブミン結合ドメインＰＰ０１３（配列番号１５９）に触発され、次にＧ１４８－ＧＡ３（配列番号１５８）のＡＢＤに由来する足場配列に基づくタンパク質ライブラリーの設計及び構築物を開示する。実施例は、高い安定性と溶解性を維持しながら、複雑度の高いライブラリーのアセンブリが成功したことを示しています。設計されたライブラリーを使用して、３つの異なる標的分子の新規リガンドを選択することに成功したことも示される。

アプローチの重要な部分は、どの残基をランダム化し、どの残基を固定しておくかに関する決定、並びに固定された残基の同一性に関する決定であった。これに関し、分子内安定化に重要な位置でのランダム化は避ける必要があるが、同時に、最適なカバレッジと可能な代替配列の評価を提供するライブラリーの可能性は、表面に露出した残基の次善の選択によって制限される可能性がある。ランダム化を行うために適した位置を特定する過程で、ドメインＧ１４８－ＧＡ３（Kraulis et al, supra; Johansson et al、上記）及びそのアルブミン結合活性に関連する情報（Lejon et al、上記）を含む、足場タンパク質の包括的な知見が適用された。新しい足場の設計において、天然の相互作用に関与する表面積がランダム化の主な焦点であることがよくある。しかしながら、祖先ポリペプチドに結合親和性を提供するものとまったく同じ残基をランダム化することは、異なるサイズと構造を持つ様々な標的に対する新規結合物を見つけるために使用できる幅広いライブラリーを設計することを目的とする場合、最適ではない可能性がある。さらに、天然結合の結合面は、標的の中心であるだけでなく、足場のフレームワーク及び構造的安定性を維持するためにも重要である可能性がある。従って、ランダム化に最適な領域を特定するために、天然の相互作用に直接関与していない領域に焦点を当てることも同様に重要である。簡単に説明すると、以下の手順が適用された：
１）新しい結合能力を提供するためにどの位置を変えることができるかを確立し、足場の位置に柔軟性と改善を組み込むことを目的とした第１のライブラリーの設計。
２）「Ｙｌｉｂ００１ Ｎａｉｖｅ．Ｉ」で示される第１のライブラリーの作成。
３）第１の標的セットに対する選択。
４）主に結合と安定性の観点から選択されたリガンドの評価。
５）さらなる改善のための配列変異プログラム；変異リガンドの生成、産生及び評価を含む。
６）工程３）～５）の結果に基づいて、新しい結合能力を生成するためにどの結合位置を変更するか、どの足場残基を固定しておくべきか、どのアミノ酸残基に固定するかを決定する、第２のライブラリーの設計。
７）「Ｙｌｉｂ００２ Ｎａｉｖｅ．Ｉ」で示される第２のライブラリーの作成。
８）標的の第２のセットに対する選択。
９）ライブラリー及び選択された変異体の品質を検証するための、結合、安定性、生産性及び溶解性の観点から選択されたリガンドの評価。
１０）ライブラリーの微調整のための配列変異プログラム。
１１）前述の手順全体に基づく開示に従った足場の設計。

本明細書に記載の足場配列及び集団又はライブラリーは、それぞれ「Ｙ足場」及び「Ｙ集団」又は「Ｙライブラリー」と呼ばれ、それに由来する結合変異体は「Ｙ変異体」と示される。

実施例１
一般的な手順の説明

概要
この実施例は、クローニング、産生及び分析の一般的な手順を説明する。これらの一般的な手順は、それぞれの実施例で特に定めが無い限り、実施例２～８全体で使用される。

材料及び方法
標的タンパク質のビオチン化：製造元の推奨に従って、Ｎｏ－Ｗｅｉｇｈ ＥＺ－Ｌｉｎｋ Ｓｕｌｆｏ－ＮＨＳ－ＬＣ－Ｂｉｏｔｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｅｎｔｉｆｉｃ）を１０倍モル過剰で使用して標的タンパク質をビオチン化した。反応は、室温（ＲＴ）で３０分間行った。リン酸緩衝生理食塩水（１０ｍＭリン酸、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．６８ｎＭ ＫＣｌ、ｐＨ７．４）への緩衝液置換は、透析カセット（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｓｌｉｄｅ－ａ－ｌｙｚｅｒ（３５００ ＭＷＣＯ））又はｉｌｕｓｔｒａ ＮＡＰ－５脱塩カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）の何れかを使用して、製造元の指示に従って、ビオチン化後に実施した。

Ｙ変異体のクローニング：クローニングは、当該技術分野で周知の方法を使用して実施された。簡単に説明すると、以下の手順が適用された：
１）目的のＹ変異体をコードするＤＮＡは、標準のＰＣＲプロトコル及びＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄポリメラーゼ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、ライブラリーベクターｐＡＹ０３６８６から増幅された。断片は、酵素ＳａｌＩ－ＨＦ及びＢａｍＨＩ－ＨＦ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用して切断され、供給元の推奨に従ってＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して精製された。Ｎ末端Ｈｉｓ_６タグを提供する発現ベクター（Ｔ７プロモーター付き）を調製し、同じ制限酵素で消化した。ベクターは、分取用1％アガロース（ＢｉｏＮｏｒｄｉｋａ ＡＢ）ゲル電気泳動で泳動し、ＱＩＡＧＥＮ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して、供給元の推奨に従って精製した。遺伝子断片とベクターを、リガーゼ緩衝液中のＴ４ＤＮＡリガーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してライゲーションし、エレクトロコンピテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０細胞にエレクトロポレーションした。形質転換された細胞は、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを添加したＴＢＡＢプレート（３０ｇ／ｌトリプトース血液寒天ベース）に塗布し、３７℃で一晩インキュベートした。

２）目的のＹ変異体をコードするＤＮＡは、ＧｅｎｅＡｒｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）又はＴｗｉｓｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅに断片遺伝子として注文し、酵素ＢａｍＨＩ－ＨＦ及びＮｇｏＭＩＶ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用して切断された。Ｎ末端Ｈｉｓ_６タグを提供する発現ベクター（Ｔ７プロモーター付き）を調製し、同じ制限酵素で消化した。ライゲーション及び形質転換は、上記のように実施された。

３）目的のＹ変異体をコードするＤＮＡを、カスタムベクター（Ｎ末端Ｈｉｓ_６タグを提供する発現ベクター（Ｔ７プロモーター付き））で全長をクローンした遺伝子としてＧｅｎｅＡｒｔに注文した。形質転換は、上記のように実施された。

シーケンシング：目的のプラスミドを含む細菌クローンをシーケンシングのために選択した。ＰＣＲ断片は、標準的なＰＣＲプログラムと相補的なプライマーペアを使用して単一コロニーから増幅された。増幅断片のシーケンスは、ビオチン化オリゴヌクレオチドとＢｉｇＤｙｅ（登録商標）Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒｖ３．１Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、製造元のプロトコルに従って実行された。シーケンシング反応は、Ｍａｇｎａｔｒｉｘ ８０００（Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｂｉｏｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）機器を使用して磁気ストレプトアビジンコーティングビーズ（Ｄｅｔａｃｈ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｂｅａｄｓ、Ｎｏｒｄｉａｇ）に結合させることによって精製し、ＡＢＩＰＲＩＳＭ(登録商標)３１３０ｘｌＧｅｎｅｔｉｃＡｎａｌｙｚｅｒ（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で分析した。

タンパク質発現：大腸菌Ｔ７Ｅ２細胞は、それぞれのＹ変異体の遺伝子断片を含むプラスミドで形質転換された。得られた組換え株は、通常、ＥｎＰｒｅｓｓｏプロトコル（Ｅｎｐｒｅｓｓｏ ＧｍｂＨ）を使用して、５０μｇ／ｍｌカナマイシンを添加した培地で３０～３７℃、５０ｍｌスケールで培養された。タンパク質の発現を誘導するために、イソプロピル－β－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を、６００ｎｍでの光学密度（ＯＤ_６００）が約１０で、最終濃度が０．５ｍＭになるように添加した。誘導後、培養物を１６時間インキュベートした。 遠心分離により細胞を回収した。あるいは、培養を、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを添加した９８０ｍｌのＴＳＢ－ＹＥ培地（酵母エキス５ｇ／ｌを添加したトリプシン大豆ブロス３０ｇ／ｌ）、３７℃で行い、タンパク質発現をＯＤ_６００＝２で０．２ｍＭのＩＰＴＧを用い誘導し、続いて５時間インキュベートした後、遠心分離により細胞を回収した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析に基づいて、それぞれのＹ変異体の総収量並びに可溶性及び不溶性産物の割合を推定した。

Ｎ末端Ｈｉｓ_６タグによるＹ変異体の精製：細胞を、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ(登録商標)（Ｍｅｒｃｋ）を添加した結合緩衝液（２０ ｍＭリン酸ナトリウム、０．５Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．４）に再懸濁した。細胞破壊後、遠心分離により細胞破片を除去し、各上清を１ｍｌのＨｉｓＧｒａｖｉＴｒａｐ ＩＭＡＣカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にアプライした。洗浄緩衝液（２０ｍＭリン酸ナトリウム、０．５Ｍ ＮａＣｌ、６０ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．４）で洗浄して汚染物質を除去し、続いて、Ｙ変異体を溶出バッファー（２０ｍＭリン酸ナトリウム、０．５Ｍ ＮａＣｌ、５００ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．４）で溶出した。ＰＢＳへの緩衝液交換は、ＰＤ－１０脱塩カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、製造元の指示に従って実施された。

タンパク質分析及び検証：ＮａｎｏＤｒｏｐ(登録商標)ＮＤ－１０００分光光度計（Ｓａｖｅｅｎ Ｗｅｒｎｅｒ ＡＢ）を使用して、２８０ｎｍでの吸光度とそれぞれのタンパク質の吸光係数を測定することにより、タンパク質濃度を決定した。純度はクーマシーブルーで染色されたＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析され、各精製されたＹ変異体の同一性はＬＣ／ＭＳ分析を使用して確認された。

円二色性（ＣＤ）分光分析：それぞれのＹ変異体をＰＢＳで０．５ｍｇ／ｍｌに希釈した。２５０～１９５ｎｍのＣＤスペクトルが２０℃で得られた。さらに、可変温度測定（ＶＴＭ）を実行して、融解温度（Ｔｍ）を決定した。ＶＴＭでは、５℃／分の温度勾配で温度を２０℃から９０℃に上げながら、２２１ｎｍで吸光度を測定した。Ｙ変異体のリフォールディング能力を研究するために、加熱手順後２０℃で新しいＣＤスペクトルを取得した。ＣＤ測定は、Ｊａｓｃｏ Ｊ－８１０分光偏光計（Ｊａｓｃｏ Ｓｃａｎｄｉｎａｖｉａ ＡＢ）で、光路長１ｍｍのセルを使用して実施された。

表面プラズモン共鳴を使用した速度論的分析：速度定数（ｋａ及びｋｄ）及び親和性（ＫＤ）は、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００機器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用してＨｉｓ６タグ付きＹ変異体について決定された。標的タンパク質Ｃ４、ＩＬ－６、及びインスリンは、それぞれ、異なるＣＭ５チップ表面（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）のカルボキシル化デキストラン層上の別々のフローセルに固定化された。固定化は、製造元のプロトコルに従ってアミンカップリングケミストリーを使用し、ランニング緩衝液として０．１％Ｔｗｅｅｎ２０（ＰＢＳＴ ０．１％）を添加したＰＢＳ ｐＨ７．４を使用して実行された。表面のリガンド固定化レベルは、Ｃ４では３２８０－８８３０ＲＵ、ＩＬ－６では４９５－１１８４ＲＵ、インスリンでは２７０－２８２ＲＵであった。各チップの１つのフローセル表面は、分析対象物の注入中にブランクとして使用するために活性化及び脱活性化された。速度論的実験では、ＰＢＳＴ ０．１％を３０μｌ／分の流速でランニング緩衝液として使用した。分析対象物、すなわちＹ変異体は、それぞれ１０００、５００、１００、５０、及び１０ｎＭの濃度のＰＢＳＴ０．１％緩衝液で希釈し、５分間注入した後、ランニング緩衝液で３分間解離させた。解離後、３０μｌの１０ｍＭＨＣｌを１回注入して表面を再生した。速度定数は、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００評価ソフトウェア２．０（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）のＬａｎｇｍｕｉｒ １：１モデルを使用してセンサーグラムから計算された。

実施例２
ＡＢＤ変異体足場に基づくライブラリーの設計及び構築

概要
この実施例において、以下の実施例３で説明する第１の選択に使用される第１のライブラリーの設計と構築物について説明する。目的は、新規結合機能を実現するためにどの位置を変更するかを決定し、足場に柔軟性と改善を組み込むことであった。

材料及び方法
ライブラリー設計：ライブラリーは、アルブミン結合ドメインＰＰ０１３（配列番号１５９）及びＧ１４８－ＧＡ３ドメインの構造に関する情報に基づいて設計された。アルブミンへの自然な結合に関与する表面に露出したアミノ酸の位置、結合表面のごく近くの位置、並びにヘリックス１及びヘリックス１とヘリックス２の間のループの追加の位置を、斑入り（ｖａｒｉｅｇａｔｉｏｎ）の標的とした。ランダム化のために選択されたＰＰ０１３のアミノ酸位置は次の通りである：Ｎ９、Ｙ１５、Ｖ１７、Ｓ１８、Ｄ１９、Ｆ２０、Ｙ２１、Ｋ２２、Ｒ２３、Ｌ２４、Ｋ２７、Ａ２８、Ｋ２９、Ｔ３０、Ｇ３３、Ａ３６、Ｌ３７、Ａ４０、Ａ４３、及びＡ４４。各位置はランダム化され、アミノ酸残基の異なる組成を可能にした（アミノ酸Ｃ、Ｍ、及びＰを全て除く）。ライブラリーの理論上のサイズが、実際に可能なサイズを大幅に超えるため、これらの20の位置のそれぞれで完全なランダム化は不可能であった。従って、結合に関与しないと考えられる位置（すなわち「足場位置」）はより限定的にランダム化されたが、結合に関与する可能性のある位置（すなわち「結合位置」）のランダム化の程度は、１１～１７の許容されたアミノ酸残基の範囲であった。適用される制限は、Ｇ１４８－ＧＡ３ドメインの構造内の位置の性質（ヘリックス位置とループ位置）及び結合機能との予想される関連性によって異なる。いくつかの位置において、相同残基が除外された、例えば、Ｋは許容するがＲは許容しない、又はＬ及びＶは許容するがＩは許容しない。「Ｙｌｉｂ００１Ｎａｉｖｅ．Ｉ」で示される、得られたライブラリーにおけるそれぞれの位置でのアミノ酸の選択及びそれらの理論的分布を表１に示す。

スプリットプール合成を使用して、部分的にランダム化されたアミノ酸配列をコードする、１７７ｂｐの次のＤＮＡオリゴが生成された：５’－ ＡＡ ＡＴＡ ＡＡＴ ＧＧＡ ＴＣＣ ＡＧＣ ＣＴＧ ＧＣＴ ＧＡＧ ＧＣＧ ＡＡＡ ＧＡＡ ＧＣＣ ＧＣＧ ＮＮＮ ＧＣＣ ＧＡＧ ＣＴＧ ＧＡＴ ＡＧＣ ＮＮＮ ＧＧＴ ＮＮＮ ＮＮＮ ＮＮＮ ＮＮＮ ＮＮＮ ＮＮＮ ＮＮＮ ＮＮＮ ＡＴＣ ＧＡＧ ＮＮＮ ＮＮＮ ＮＮＮ ＮＮＮ ＧＴＴ ＧＡＧ ＮＮＮ ＧＴＴ ＧＡＡ ＮＮＮ ＮＮＮ ＡＡＡ ＧＡＡ ＮＮＮ ＡＴＴ ＣＴＧ ＮＮＮ ＮＮＮ ＣＴＧ ＣＣＧ ＧＣＧ ＡＧＣ ＧＧＴ ＡＧＣ ＧＴＣ ＧＡＣ ＡＴＴ ＡＴＴ ＴＡ－３’（配列番号１６３；ランダム化されたコドンは、ＮＮＮとして示される）制限酵素サイトＳａｌＩ及びＢａｍＨＩが隣接する。オリゴヌクレオチドは、Ａｔｕｍ（以前のＤＮＡ２．０）から注文された。 結果として得られる理論上のライブラリサイズは、７．８ｘ１０^１６変異体である。

ライブラリー構築物：ｐＡＹ０３６８６で示されるファージミドベクターは、ｐＵＣ１１９（Vieira and Messing Meth. Enzymol. 1987, 153:3-11）から始まり、標準的な分子生物学的手法を使用して翻訳カセットに必須部分を導入する段階的な方法で構築された。従って、得られたライブラリーベクターｐＡＹ０３６８６は、大腸菌ｌａｃプロモーターの制御下で、可変Ｙライブラリーとインフレームで大腸菌ＯｍｐＡリーダーペプチド、５８アミノ酸残基のＴａｑポリメラーゼ結合ドメイン（Ｚ０３６３９、配列番号１６０）及びＭ１３糸状ファージコートタンパク質ＩＩＩの残基２４９～４０６（Lowman et al, Biochemistry, 1991, 30:10832-10838）をコードし、その後に、アンバーストップコドンが存在する。

ライブラリーオリゴは、12サイクルのＰＣＲでＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄポリメラーゼを使用して増幅され、プールされた産物は、供給元の推奨に従ってＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ ＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔで精製された。ランダム化された断片の精製プールを制限酵素ＳａｌＩ－ＨＦ及びＢａｍＨＩ－ＨＦで消化し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ ＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔを使用して濃縮した。続いて、産物を分取用２．５％アガロース（ＮｕＳｉｅｖｅ(登録商標)ＧＴＧ(登録商標) Ａｇａｒｏｓｅ、Ｌｏｎｚａ）ゲル電気泳動で泳動し、ＱＩＡＧＥＮ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して供給元の推奨に従って精製した。

ファージミドベクターｐＡＹ０３６８６は同じ酵素で切断され、フェノール／クロロホルム抽出及びエタノール沈殿を使用して精製された。切断された断片と切断されたベクターを、モル比５：１でＴ４ ＤＮＡリガーゼとＲＴで２時間ライゲーションした後、４℃で一晩インキュベートした。ライゲーションしたＤＮＡは、フェノール／クロロホルム抽出とエタノール沈殿、続いて１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．５に溶解して回収した。従って、ベクターｐＡＹ０３６８６で得られたライブラリーは、それぞれＴａｑポリメラーゼ結合ドメイン（Ｚ０３６３９）に融合したＹ変異体をコードしていた。

ライゲーション反応（約１６０ ｎｇ ＤＮＡ／形質転換）をエレクトロコンピテント大腸菌ＥＲ２７３８細胞（Ｌｕｃｉｇｅｎ）にエレクトロポレーションした。エレクトロポレーションの直後に、約１ｍｌの回収培地（大腸菌ＥＲ２７３８細胞に付属）を加えた。形質転換した細胞を３７℃で６０分間インキュベートした。力価測定及び形質転換体の数の決定のためにサンプルを採取した。その後、細胞をプールし、１０μｇ／ｍｌのテトラサイクリンと１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを添加した３ｌのＴＳＢ－ＹＥ培地で、３７℃で一晩培養した。細胞を４，０００ｇで１５分間ペレット化し、４０％グリセロール溶液に再懸濁した。細胞を分注し、８０℃で保存した。内容を検証し、構築されたライブラリーの結果をライブラリー設計と比較して評価するために、Y変異体のライブラリーからのクローンをシーケンスした。実施例１に記載のようにシーケンスを行い、アミノ酸分布を検証した。

結果
ライブラリー設計：Ｙｌｉｂ００１Ｎａｉｖｅ．Ｉと示されるライブラリーは、トリプルアルファヘリックスタンパク質のヘリックス２からヘリックス３に配置されたアルブミン結合表面を持つＧ１４８－ＧＡ３変異体ＰＰ０１３に基づいて設計された。結合表面の近くの位置と一緒にアルブミン結合に関与するアミノ酸位置を使用して、結合機能を再定義する可能性を探るためのコンビナトリアルライブラリーを作成した。加えて、ヘリックス１とヘリックス２に先行するループ内の表面露出残基のセットを変化させ、結果として、ランダム化のために標的とされた合計２０のアミノ酸位置を得た（表１）。理論的に可能な全ての組み合わせを考慮に入れると、設計されたライブラリーの理論的なサイズは７．８×１０^１６個のユニークなＹ変異体であった。

ライブラリー構築物：ｐＡＹ０３６８６で示される新しいファージミドベクターは、Ｍ１３糸状ファージコートタンパク質ＩＩＩを使用して一価ディスプレイ用に構築された。Ｙｌｉｂ００１Ｎａｉｖｅ．Ｉライブラリーは、ｐＡＹ０３６８６を使用して構築された。大腸菌ＥＲ２７３８細胞への形質転換後の力価測定によって決定されたライブラリーの実際のサイズは、１．０ｘ１０^１０の形質転換体であった。ライブラリーの品質は、１９２の形質転換体の配列決定と、それらの実際の配列を理論設計と比較することによって試験された。個々のライブラリーメンバーの配列分析により、理論設計に従ったコドンの分布が確認された。従って、新規の足場配列における潜在的なバインダーのライブラリーが、首尾よく構築された。

実施例３
第１のライブラリーからのファージディスプレイの選択とスクリーニング

概要
この実施例において、補体成分４（Ｃ４）、インターロイキン６（ＩＬ－６）及びインスリンが、Ｙ変異体のファージライブラリーを使用するファージディスプレイ選択における標的として使用された。選択されたクローンは、ＤＮＡシーケンスされ、可溶性画分として大腸菌で生成され、ＥＬＩＳＡ及びＳＰＲを使用してそれぞれの標的に対してアッセイされた。これらの選択されたY変異体のシーケンス観察と、この実施例で説明されている結果に基づいて、実施例５及び６でさらに記載するように位置２０、２１、２４、２７、２９、３０、３３、３６、３７、４０及び４４を第２のライブラリーの「結合位置」としてランダム化に供することが結論付けられた。

材料及び方法
ライブラリーファージストックの産生：ファージストックの産生は、以下のように行った。大腸菌細胞ＥＲ２７３８にファージミドライブラリーＹｌｉｂ００１Ｎａｉｖｅ．Ｉを含むグリセロールストックを、２５μｇ／ｍｌカルベニシリン、５ｍｌ／ｌの１．２１７ＭＭｇＳＯ_４及び１９ｍｌの微量元素溶液（１２９ｍＭ ＦｅＣｌ_３；３７ｍＭ ＺｎＳＯ_４；１０．６ｍＭ ＣｕＳＯ_４；７８ｍＭ ＭｎＳＯ_４；９４ｍＭ ＣａＣｌ_２、１．２Ｍ ＨＣｌに溶解）を添加した１９ｌの培養培地（２．５ｇ／ｌ（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４；５．０ｇ／ｌ酵母抽出物；３０ｇ／ｌトリプトン；２ｇ／ｌＫ_２ＨＰＯ_４；３ｇ／ｌＫＨ_２ＰＯ_４；１．２５ｇ／ｌＮａ_３Ｃ_６Ｈ_５Ｏ_７・２Ｈ_２Ｏ；０．１ｍｌ／ｌＢｒｅｏｘ ＦＭＴ３０消泡剤）に接種した。２５％ＮＨ_４ＯＨの自動添加により、ｐＨを７に維持し、空気を補充し（１９ｌ／分）、溶存酸素レベルを３０％以上に保つようにスターラーを設定した。細胞が０．５０のＯＤ_６００に達したとき、培養物に５倍モル過剰のＭ１３Ｋ０７ヘルパーファージ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用して感染させた。細胞を３０分間インキュベートした後、ＩＰＴＧを１００μＭの濃度で添加して発現を誘導させた。誘導の１時間後、培養物に２５μｇ／ｍｌカナマイシンを補充し、グルコース制限流加培養が開始され、６００ｇ／ｌのグルコース溶液が反応器に供給された（最初の２０時間は３０ｇ／ｈ、次に培養が終了するまで９０ｇ／ｈ）。ヘルパーファージの添加の24時間後に培養物を回収した。 培養物中の細胞を、遠心分離（１５，９００ｇ、５０分）により除去した。

上清中のファージ粒子を、標準的な手順を使用して、ＰＥＧ／ＮａＣｌ（２０％ポリエチレングリコール／２．５ＭＮａＣｌ塩化ナトリウム）中で２回沈殿させた。ファージストックは０．４５μｍフィルターを使用してろ過し、ＰＢＳ及びグリセロールに溶解し、使用まで－８０℃で保存した。

Ｃ４、ＩＬ－６及びインスリン結合Ｙ変異体のファージディスプレイ選択：Ｃ４（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ、カタログ番号Ａ１０５）、ＩＬ－６（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号２０６－ＩＬ－２００／ＣＦ）、及びインスリン（Ｒｏｃｈｅ、カタログ番号１３７６４９７）は、実施例１に記載されているようにビオチン化された。バクテリオファージのＹｌｉｂ００１Ｎａｉｖｅ．Ｉ定義に従ってタンパク質Ｙのランダムな変異体を表示する、この実施例に記載のファージストックを使用して、Ｃ４、ＩＬ－６、及びインスリン結合ポリペプチドを選択した。ストレプトアビジンでコーティングされた常磁性ビーズ（ＳＡビーズ）（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ(登録商標)Ｍ－２８０ストレプトアビジン；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を固体支持体として使用した。各ラウンドの前に、第１のラウンドを除いて、ＳＡ又はビーズに対する非特異的バインダーを除去するためにネガティブセレクションが実行された。ファージ粒子をビーズと共にＲＴで３０分間インキュベートし、上清を選択ラウンドのインプットとして使用した。非特異的結合を避けるために、全てのチューブ及びビーズを、ＰＢＳＴＢ（０．１％Ｔｗｅｅｎ２０及び３％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を添加したＰＢＳ）でブロックした。

選択緩衝液は、１．５μＭのヒト血清アルブミン（Ａｌｂｕｃｕｌｔ、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）を添加したＰＢＳＴＢで構成され、選択は４ラウンドで行われた。ラウンド１～３において、各ビオチン化標的へのバインダーは、別々に並びに同量の標的との混合から選択された。第１のラウンドにおいて、１００ｎＭのそれぞれの標的を使用し、ＲＴで回転させながらファージ粒子と２時間インキュベートした。ラウンド２及び３において、標的濃度が、それぞれ５０ｎＭと２５ｎＭに減少し、インキュベーション時間が、それぞれ９０分と６０分に短縮された。ラウンド４では、２５及び１２．５ｎＭの２つの別々の標的濃度を使用し、ファージ粒子をＲＴで回転させながら標的タンパク質と６０分間インキュベートした。ラウンド４において、ラウンド３の混合トラックからのアウトプットを分割し、２５ｎＭで各標的と別個にインキュベートした。ファージ－標的複合体を補足するために、ブロック済のＳＡビーズを加え、１５分間インキュベートした。ビーズを、ＰＢＳＴ０．１％で洗浄し、各ラウンドのストリンジェンシー（ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ）を高めた（ラウンド１において１回、ラウンド２において４回、ラウンド３において６回及びラウンド４において８回）。

ビーズで捕捉したファージ粒子を５００μｌの０．１Ｍグリシン－ＨＣｌ、ｐＨ２．２で１０分間溶出した後、５０μｌのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０及び４５０μｌのＰＢＳで直ちに中和した。選択されたファージ粒子は以下に記載されるように増幅され、新しいファージストックが各サイクルの間に調製された。ファージストック、すなわち選択サイクルに入るファージ、及び溶出されたファージ粒子は、各選択サイクルの後に力価測定された。

ラウンド間のファージ粒子の増幅：テトラサイクリン１０μｇ／ｍｌを添加したＴＳＢで対数増殖期まで培養した大腸菌ＸＬ１－Ｂｌｕｅ細胞（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、選択の各サイクル後、３７°Ｃで３０分間溶出ファージ粒子に感染させた。感染後にＴＳＢ培地を添加して培養量を２倍にし、アンピシリンを最終濃度１００μｇ／ｍｌになるように加えた。感染した細菌を１時間インキュベートした後、使用した溶出ファージ粒子の数と比較して１０倍の過剰量でヘルパーファージを加えた。細菌が遠心分離機でペレット化される前に、１．５時間の間に重複感染を起こさせた。細菌を１００μｇ／ｍｌアンピシリン、２５μｇ／ｍｌカナマイシン、０．１ｍＭＩＰＴＧを添加したＴＳＢ＋ＹＥに再懸濁し、３０℃で一晩増殖させた。感染に使用された細菌の量は、溶出されたファージ粒子の数と比較して１００倍過剰であった。一晩の培養を、ラウンド１については１００ｍｌで、ラウンド２及び３のそれぞれについて５０ｍｌで行った。一晩培養した培養物を遠心分離によりペレット化し、上清中のファージ粒子をＰＥＧ／ＮａＣｌ緩衝液で２回沈殿させた。最後に、次のラウンドに移行する前に、ファージを選択緩衝液に再懸濁した。最終選択サイクルにおいて、ＥＬＩＳＡスクリーニングで使用する単一コロニーを形成するために、ＥＲ２７３８細菌を感染に使用し、細菌を２００μｇ／ｍｌアンピシリンを添加したＴＢＡＢプレートに塗布した。

可溶性Ｙ変異体の産生：Ｙ変異体は、選択した単一コロニーを、ディープウェルプレート（Ｎｕｎｃ）で１００μｇ／ｍｌアンピシリンと１ｍＭＩＰＴＧを添加した１．２ｍｌＴＳＢ－ＹＥ培地に接種することによって産生された。プレートを回転させながら３７℃で２４時間インキュベートした。細胞を３３００ｇでの遠心分離によりペレット化し、１５０μｌのＰＢＳＴ０．０５％（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を添加したＰＢＳ）に再懸濁した。細菌懸濁液を２０分間８２℃に加熱して細胞を溶解した。Ｙ変異体の可溶性画分を、フィルタープレート（ＥＭＤミリポア）を使用した濾過により９６ウェルプレートで単離した。最終的な上清は、ＧＳＳ－［Ｙ＃＃＃＃＃］－ＡＳＧＳ－［Ｚ０３６３９］－ＹＶＰＧ（配列番号１７３）として表される、Ｚ０３６３９への融合としてＹ変異体を含んでいた。Ｙ＃＃＃＃＃は、個々の４６アミノ酸残基のＹ変異体を指す。

シーケンシング：ＥＬＩＳＡスクリーニングと並行して、全てのクローンを実施例１に記載されるようにシーケンスした。

配列分析：選択からのユニークな配列は、平均リンク階層的クラスタリング方法を用いて分析された。これは、各標的に対する選択からの配列、及びグループ化された異なる標的に対する選択からの配列に対して行われた。

Ｙ変異体のＥＬＩＳＡスクリーニング：Ｙ変異体のそれぞれの標的への結合をＥＬＩＳＡアッセイで分析した。ハーフエリア９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ）を、コーティング緩衝液（５０ｍＭ炭酸ナトリウム、ｐＨ９．６； Ｓｉｇｍａ）で希釈した２μｇ／ｍｌの抗Ｚ０３６３９ヤギ抗体（社内生産）で、４℃で一晩コーティングした。抗体溶液を注ぎ出し、ウェルを水で洗浄し、ＰＢＳＣ（０．５％カゼインを添加したＰＢＳ；Ｓｉｇｍａ）、ＲＴで３０分間ブロックした。ブロッキング溶液を廃棄し、次に加熱及び濾過したYタンパク質溶液をＰＢＳＴ０．０５％で８倍に希釈し、ウェルに添加し、ＲＴで１．５～２．２５時間インキュベートした。ネガティブコントロールとして、上記のように培養し、熱処理し、濾過したＥＲ２７３８大腸菌上清を加えた。上清を注ぎ出し、ウェルをＰＢＳＴ０．０５％で４回洗浄した。次いで、ＰＢＳＣ中のビオチン化標的（５０ｎＭの濃度のＣ４、１００ｎＭの濃度のＩＬ－６、又は３００ｎＭの濃度のインスリン）を、各ウェルに加えた。プレートを室温で１時間～１．２５時間インキュベートした後、上記のように洗浄した。ＰＢＳＣで１：３０，０００に希釈したストレプトアビジン結合ＨＲＰ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）をウェルに添加し、プレートを４５分間インキュベートした。上記のように洗浄した後、１ステップＵｌｔｒａ ＴＭＢ基質（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）をウェルに加え、プレートを製造元の推奨に従って処理した。ＥｎＳｐｉｒｅマルチウェルプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用して、４５０ｎｍでの吸光度を測定した。

Ｈｉｓ_６－タグを有するＹ変異体のサブセットのサブクローニング及びタンパク質産生：実施例１に記載されるように、単量体Ｙ変異体分子を構築するために、サブクローニング戦略をＥＬＩＳＡ陽性変異体のサブセットに適用した。タンパク質は、実施例１に記載の方法に従いＮ末端Ｈｉｓ_６タグを使用して発現及び精製された。Ｙ変異体遺伝子断片を発現ベクターにクローニングし、コードされた配列ＭＧＳＳＨＨＨＨＨＨＧＳＳ－［Ｙ＃＃＃＃＃］－ＡＳＧＳＶＤ（配列番号１６７）を得た。

精製されたＹ変異体のＣＤ及びＳＰＲ分析：産生されたＹ変異体は、実施例１に記載された方法に従い、ＣＤ及びＳＰＲ分析に供された。

結果
Ｃ４、ＩＬ－６及びインスリン結合Ｙ変異体のファージディスプレイ選択：ファージディスプレイの選択は、新しく設計されたライブラリー（実施例２）並びに標的タンパク質Ｃ４、ＩＬ－６及びインスリンを使用して実施された。ラウンド１～３において、ライブラリーを各標的と個別に、又は３つ全ての標的を含む混合物とインキュベートした。第４のラウンドにおいて、混合標的トラックからファージストックを分割し、各標的と別々にインキュベートした。ファージディスプレイ選択の３及び４サイクル後に個々のクローンが得られた。

シーケンシング：選択の３及び４サイクル後に得られたクローンについてシーケンシングを行った。各変異体には、ユニークな識別番号＃＃＃＃＃が割り当てられ、個々の変異体は、Ｙ＃＃＃＃＃と称される。４６個のアミノ酸残基の長いＹ変異体のアミノ酸配列の例は、それぞれ標的Ｃ４、ＩＬ－６及びインスリンについて、図１及び配列リストに配列番号１～１７、配列番号４９～６９及び配列番号９０～１０９として記載される。

配列分析：全ての変異体間の配列の類似性、並びに標的特異的な類似性を特定するために、選択から得られたクローンの配列に対してクラスタリング及びコンセンサス分析を実施した。それぞれの標的へのＥＬＩＳＡでの結合が確認されたＹ変異体に対して実施されたコンセンサス分析を図１Ａ～Ｄに示す。最もランダム化された１２の位置において、全ての結合Ｙ変異体は、標的に関係なく、位置３０、３３、３６、３７、及び４０でコンセンサスを示したが、好ましいアミノ酸は標的によって異なった。Ｃ４結合Ｙ変異体は、位置２４、２７及び４４で特定のアミノ酸に対してコンセンサスを示したが、インスリン結合Ｙ変異体は、位置２４及び４４でコンセンサスを示したが、位置２７では示さなかった。

ＡＢＤの位置１８、２０、及び２１は、アルブミンへの自然な結合に重要であることが知られているが、これらの位置は、この研究で使用された３つの標的に対する選択で特定されたＹ変異体で強いコンセンサスを示しませんでした。しかしながら、Ｃ４及びインスリン結合Ｙ変異体の場合、Ｙ変異体の３分の１が位置２０及び２１に同じ残基を有していた。これは、これらの位置がそれぞれの標的との相互作用に関与しているが、ヘリックス３の残基と同程度ではないことを示す。より限定的にランダム化された足場位置において、標的に関係なく、位置１７ではＶが優先され、位置４３ではＡが優先された。位置２８において、Ｃ４及びインスリン結合Ｙ変異体でＡに対する強い優先度が観察されたのに対し、ＩＬ－６結合Ｙ変異体ではＧが許容された。位置９において、Ｉが、Ｎよりも頻繁に観察された。位置１５、１９、２２及び２３において、明確なコンセンサスが観察されなかった。これは、これらの位置が、変動に対してより耐性を有することを示す。

Ｙ変異体のＥＬＩＳＡスクリーニング： ３又は４サイクルの選択後に得られたクローンを、９６ウェルプレートで産生し、ＥＬＩＳＡでｂ－Ｃ４、ｂ－ＩＬ－６又はｂ－インスリン結合活性についてスクリーニングした。いくつかのユニークなＹ変異体は、５０ｎＭの濃度のｂ－Ｃ４又は１００ｎＭの濃度のｂ－ＩＬ－６に対してそれぞれ０．１５ＡＵ以上（ネガティブコントロールの少なくとも２倍に相当）の応答を示すことがわかった。ネガティブコントロールの平均応答は、ｂ－Ｃ４及びｂ－ＩＬ－６のそれぞれにおいて０．０５９ＡＵ及び０．０６７ＡＵであった。ｂ－インスリンに対するネガティブコントロールの平均応答は、０．０５７ＡＵであったが、選択したＹ変異体の応答は、３００ｎＭの濃度で０．０９３ＡＵ～０．９４５ＡＵの間（ネガティブコントロールの約２倍以上に相当）に及んだ。

精製されたＹ変異体のＣＤ及びＳＰＲ分析：産生されたＹ変異体をＣＤ及びＳＰＲ分析に供した。個々の融点及び親和性の値（Ｋ_Ｄ）を表２に示す。全ての変異体は、熱変性後にリフォールディングすることが可能であったが、α－ヘリックス含有量の程度は異なった。全体として、Ｃ４結合Ｙ変異体は高いα－ヘリックス含有量を示したが、分析された両方のＩＬ－６結合Ｙ変異体はより少ないα－ヘリックス含有量を示した。インスリン結合Ｙ変異体Ｙ０００３２及びＹ００１２５の比較は、位置９にてＹ０００３２のＩ及びＹ００１２５のＮが異なるだけであり、Ｙ００１２５と比較してＹ０００３２のα－ヘリックス含有量がかなり高いことを示した。これにより、安定性のための９位の重要性及びＮよりもＩが好ましいことを確認した。これは、ＩＬ－６結合Ｙ変異体Ｙ０００３５及びＹ０００７６の限られた能力を少なくとも部分的に説明している可能性があり、両方とも９位にＮがあり、α－ヘリックス構造内に折りたたまれている。同じ標的に結合するY変異体を比較すると、融解温度が高いほど結合親和性が高くなる。

実施例４
Ｃ４、ＩＬ－６及びインスリン結合Ｙ変異体の突然変異研究

概要
本実施例は、実施例３に記載の結果に従って結合のためにランダム化されるように決定された位置に照らして、足場の特性を最適化するために実行された一連の逐次突然変異研究を記載する。

材料及び方法
突然変異したＹ変異体のクローニング：第１の突然変異研究において、安定性及び結合能力に対するこれら突然変異の影響を評価するために、Ｙ変異体の結合が変化しない配列位置（すなわち、「足場位置」）に異なる突然変異が導入された。これは、テンプレートとして、それぞれＣ４及びインスリンに結合するＹ変異体Ｙ００００１（配列番号１）及びＹ０００３２（配列番号４）を使用して実施された。Ｙ０００３２は、α－ヘリックス構造に折りたたむ優れた能力を示したものの、４７℃という適度なＴｍにより改善が見込めるため、適切なモデル分子と見なされた。単一又は二重の突然変異は、表面に露出した足場の位置１３、１５、１７、１８、１９、２２、２３、２６、２８、３２、３５、３９及び４３に導入された。全ての変異体は、Ｎ末端Ｈｉｓ_６タグでクローン化され、構築物は、ＭＧＳＳＨＨＨＨＨＨＧＳＳ－［Ｙ＃＃＃＃＃］（配列番号１６８）のフォーマットでポリペプチドをコードした。

第２の突然変異研究において、第１の突然変異研究の結果に基づいて変異体にさらに突然変異を導入し、これらの突然変異が、主に安定性に与える影響を評価し、並びに様々な変異体での第１の研究の結果を検証した。Ｙ変異体Ｙ００２６２（配列番号１８；Ｃ４結合）及びＹ０００３２及びＹ００２７０（それぞれ配列番号９０及び配列番号１１７；インスリン結合）をテンプレートとして使用した。単一、二重又は三重の突然変異は、表面に露出した足場の位置１７、１８、１９、２２、２３、２６、３５、３９及び４３に導入された。全ての変異体は、Ｎ末端Ｈｉｓ６タグでクローン化され、ＭＧＳＳＨＨＨＨＨＨＧＳＳ－［Ｙ＃＃＃＃＃］（配列番号１６８）の形式でコードされたポリペプチドを構築する。

第３の突然変異研究において、足場位置２６の突然変異が、Ｃ４及びインスリンに結合するＹ変異体Ｙ００２８９（配列番号２６）及びＹ０００２９３（配列番号１２５）にそれぞれ導入された。加えて、異なるＮ末端及びＣ末端の伸長は、それらが安定性及び結合能力並びに発現レベルにどのように影響を及ぼしたのかに関し評価された。全ての変異体をＮ末端Ｈｉｓ６タグでクローン化し、以下のフォーマット；ＭＧＳＳＨＨＨＨＨＨＧＳＳ－［Ｙ＃＃＃＃＃］（配列番号１６８）、ＭＧＳＳＨＨＨＨＨＨＧＳＳ－［Ｙ＃＃＃＃＃］－ＡＳＹＧＳ（配列番号１６９）、ＭＧＳＳＨＨＨＨＨＨＧＳＳ－［Ｙ＃＃＃＃＃］－ＧＹＳ（配列番号：１７０）又はＭＧＳＳＨＨＨＨＨＨＴＩＤＥＷＬ－［Ｙ＃＃＃＃＃］（配列番号１７１）のうちの１つでポリペプチドをコードする構築物を得た。実施例１に記載の方法に従ってクローニングを行った。

突然変異したＹ変異体の産生及び特性評価：Ｙ変異体は、実施例１に記載されている一般的な方法に従ってクローン化され、産生され、特徴付けられた。点突然変異及び／又はＮ末端又はＣ末端伸長を有する産生されたＹ変異体を、実施例１に記載されるように、ＣＤ及びＳＰＲ分析に供した。

結果
突然変異したＹ変異体のクローニング、産生及び特性評価：突然変異研究１、２及び３のそれぞれにおいて産生されたＹ変異体は、ＣＤ及びＳＰＲ分析に供され、Ｙ変異体の安定性及び結合能力に対する点突然変異及び／又は追加のＮ末端又はＣ末端アミノ酸の影響を評価された。個々の融点及び親和性の値（Ｋ_Ｄ）を表３～５に示す。

突然変異研究１において、５つの突然変異が、１～５℃の融解温度の上昇で安定性を改善した。Ｙ０００３２の３５位と３９位に非荷電残基Ｑを導入すると、Ｔｍ及びα－ヘリックス含有量が増加した（図３）。位置２２のＩ及び位置２３のＫの組み合わせは、位置２８のＡと同様に、熱安定性に有益であることが確認された。全ての突然変異した変異体は、らせん構造を有し、９０℃に加熱した後に可逆的にリフォールディングすることが示された。さらに、インスリンを標的とする全ての突然変異したＹ変異体は、程度は異なるものの、インスリンと相互作用する能力をある程度保持していた。親和性の変化は、一般的に、安定性の変化と相関していた。

突然変異研究２において、研究１からの有望な突然変異は、Ｃ４結合Ｙ変異体Ｙ００２６２の突然変異によって確認された。３５位と３９位のＱは、単一の突然変異としても組み合わせとしてもＴｍを増加させることが示された。３５位のＱ及び３９位のＱの組み合わせは、インスリン結合変異体でもＴｍを増加させることが確認された。さらに、位置１９のＡは、熱安定性にプラスの影響を与えることが確認された。全ての突然変異した変異体は、らせん構造を有していることが示され、９０℃に加熱した後に可逆的にリフォールディングした。結果を、表４に示す。

突然変異研究３において、異なるＮ末端及びＣ末端伸長は、熱安定性にわずかに正の効果を及ぼすことが示され、Ｃ末端伸長を伴うＹ変異体は、発現レベルの増加を示した。結果を、表５に示す。

実施例５
第２のライブラリーの設計及び構築

概要
この実施例において、改変された足場を有する新規ライブラリーが、設計及び作成された。実施例２に記載されたライブラリーＹｌｉｂ００１Ｎａｉｖ．Ｉからの実施例３に記載された選択の結果は、実施例４で実施された突然変異研究とともに、新しいライブラリーの設計の基礎として使用された。ライブラリーには、約３．１ ｘ１０^１０の個別のクローンが含まれていた。

材料及び方法
ライブラリーの設計：第２のライブラリーは、実施例３及び４に記載した結果に基づいて設計された。ライブラリーにおいて、Ｙ変異体分子の１１個のアミノ酸位置がランダム化された（例えば、配列番号１５９を参照して、位置２０、２１、２４、２７、２９、３０、３３、３６、３７、４０及び４４）。ＴＲＩＭテクノロジーを使用して、４つのオリゴヌクレオチド（２つの順方向と２つの逆方向の相補的、両方のペアが相補的な３’末端を持つ）を生成した。これらのオリゴを、Ｅｌｌａ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＧｍｂＨ（Ｍａｒｔｉｎｓｒｉｅｄ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に注文した。

４つの別々のオリゴヌクレオチドによって生成されたＤＮＡは、１１７ｂｐの長さのオリゴであり、配列：５’－ ＧＡＴ ＡＧＣ ＡＡＡ ＧＧＴ ＧＴＴ ＧＧＴ ＧＣＡ ００１ ００１ ＡＴＴ ＡＡＡ ００１ ＡＴＴ ＣＡＧ ００２ ＧＣＡ ００２ ００２ ＧＴＴ ＧＡＧ ００３ ＧＴＴ ＣＡＡ ００１ ００１ ＡＡＡ ＣＡＧ ００４ ＡＴＴ ＣＴＧ ＧＣＧ ００１ ＣＴＧ ＣＣＧ ＧＣＧ ＡＧＣ ＧＧＴ ＡＧＣ ＧＴＣ－３’ （配列番号１６４）ここで、ランダム化されたコドンは、００１～００４として示される、を有するＡＢＤのヘリックス２からヘリックス３に部分的にランダム化されたアミノ酸配列をコードする。様々なランダム化戦略が対応する：００１）Ｃ及びＰを除く１８個の可能性のあるアミノ酸が、均等に分布する（各５．６％）；００２）Ｃを除く１９個全ての可能性のあるアミノ酸が均等に分布する（各５．３％）；００３）１９個の可能性のあるアミノ酸、全てＣを除く、アミノ酸Ｇの５０％及び残りは、均等に分布する（各２．６％）；００４）１９個のアミノ酸、全てＣを除く、アミノ酸Ａの５０％及び残りは均等に分布する（各２．６％）。ＴＲＩＭオリゴヌクレオチド合成中の技術的な課題により、通常、長いオリゴでは多数のエラーが発生する。従って、オリゴのオーバーラップ戦略が使用され、ランダム化された位置００３及び００４は、それぞれアミノ酸Ｇ及びＡの５０％を含んでいた。このようにして、ライブラリーは、エラーの数が少なく、必要な全ての可変位置を含む２つの別々のオリゴペアを使用して組み立てることが可能である。

オリゴをＰＣＲ増幅して、隣接する制限部位ＳａｃＩ及びＳａｌＩを導入した。結果として得られた理論上のライブラリーのサイズは、７．６ｘ１０^１３変異体であった。

ライブラリー構築：ファージミドベクターｐＡＹ０３６８６は、ヘリックス１のアミノ酸残基１～１１をコードする最初の部分と、それに続くＳａｃＩエンドヌクレアーゼ切断部位を含むように改変された。改変されたベクターは、ｐＡＹ０４２６０と表示した。

ライブラリーは、制限エンドヌクレアーゼＳａｃＩ－ＨＦ及びＳａｌＩ－ＨＦ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用して断片及び対応するｐＡＹ０４２６０ベクターを切断することを除いて、本質的に実施例２に記載されているように構築及び検証された。ライゲーション反応（約２００ｎｇＤＮＡ／形質転換）をエレクトロポレーションして、エレクトロコンピテント大腸菌ＸＬ１－Ｂｌｕｅ細胞（Ｌｕｃｉｇｅｎ）に導入した。

結果
ライブラリー設計：第２のライブラリーは、実施例３及び４に記載した調査結果に基づいて設計された。配列の足場位置で使用されるアミノ酸及び結合位置での可変アミノ酸残基の分布が定義された。合計１１個のアミノ酸位置、すなわち、配列番号１５９の位置２０、２１、２４、２７、２９、３０、３３、３６、３７、４０及び４４に対応するものをランダム化の対象とした。設計されたライブラリーの理論上のサイズは、７．６ｘ１０^１３の異なるユニークなＹ変異体であった。

ライブラリー構築：ｐＡＹ０４２６０と示される新規ファージミドベクターは、Ｍ１３糸状ファージコートタンパク質ＩＩＩを使用して一価ディスプレイ用に構築された。新しく構築されたベクターは、Ｙ変異体の最初の１１個のアミノ酸をコードするＤＮＡを含み、ライブラリーの構築に使用された。ライブラリー又は集団は、「Ｙｌｉｂ００２Ｎａｉｖｅ．Ｉ」と表記された。大腸菌ＸＬ１－Ｂｌｕｅ細胞への形質転換後の力価測定によって決定されたライブラリーの実際のサイズは、３．１×１０^１０形質転換体であった。ライブラリーの品質は、１９２の形質転換体のシーケンシングと、それらの実際の配列を理論設計と比較することによって試験された。個々のライブラリーメンバーの配列分析により、理論設計に従ったコドンの分布が検証された。従って、新規足場における潜在的なバインダーのライブラリーが、首尾よく構築された。

実施例６
第２のライブラリーからのファージディスプレイの選択及びスクリーニング

概要
この実施例において、Ｃ４、ＩＬ－６及びインスリンが、Ｙ変異体の第２のファージライブラリーを使用するファージディスプレイ選択における標的として使用された。選択されたクローンは、ＤＮＡ配列決定され、可溶性タンパク質画分として大腸菌で生成され、ＥＬＩＳＡ及びＳＰＲを使用してそれぞれの標的に対してアッセイされた。

材料及び方法
ファージストックの産生：ファージストックの産生は、以下のように行われた。大腸菌細胞ＸＬ１ＢｌｕｅにファージミドライブラリーＹｌｉｂ００２Ｎａｉｖｅ．Ｉを含むグリセロールストックを２０ｌの発酵槽培養培地（３０ｇ／ｌトリプシンソイブロス；５ｇ／ｌ酵母抽出物；１０ｇ／ｌグルコース；１００μｇ／ｍｌカルベニシリン；１０μｇ／ｍｌ塩酸テトラサイクリン）に接種した。培養物を３７°Ｃでインキュベートし、空気を補充し（１０ｌ／分）、溶存酸素レベルを３０％以上に保つようにスターラーを設定した。ＯＤ_６００が０．５に達したとき、１６リットルの培養液を廃棄した。残りの４リットルの培養物は、１０倍モル過剰のＭ１３Ｋ０７ヘルパーファージを使用して感染させた。１００μｇ／ｍｌ カルベニシリン、３．２ｍｌ／ｌ １．２１７Ｍ ＭｇＳＯ_４、０．９ｍｌ／ｌ ２５％ＮＨ_４ＯＨ、及び１μｌ／ｍｌ 微量元素溶液（１９４ｍＭ ＦｅＣｌ_３；５５ｍＭ ＺｎＳＯ_４；１０．６ｍＭ ＣｕＳＯ_４；６２ｍＭ ＭｎＳＯ_４；４７ｍＭ ＣａＣｌ_２、１．２Ｍ ＨＣｌに溶解）、０．２ｍＭチアミン、及び０．６５μｌ／ｍｌビタミン溶液（２．１ｍＭ パントテン酸；３．６ｍＭ塩化コリン；１．１ｍＭ葉酸；５．５ｍＭミオイノシトール；４．１ｍＭ ナイアシンアミド；０．１３ｍＭリボフラビン；１．５ｍＭチアミン）を補充した１６リットルの新しい培養培地（３．０５ｇ／ｌ （ＮＨ_４）_２ＳＯ_４；６．１ｇ／ｌ 酵母抽出物；３．６６ｇ／ｌＫ_２ＨＰＯ_４；５．４８ｇ／ｌ ＫＨ_２ＰＯ_４；２．２９ｇ／ｌ Ｎａ_３Ｃ_６Ｈ_５Ｏ_７・２Ｈ_２Ｏ）を追加した。６０分間のインキュベーション後、カナマイシンを５０μｇ／ｍｌの濃度で添加し、ＩＰＴＧを１００μＭの濃度で添加することにより発現を誘導した。培養温度を３０℃に下げ、０．１５ｍｌ／ｌの消泡剤（ＢｒｅｏｘＦＭＴ３０）を加えた。２５％ＮＨ_４ＯＨの自動添加により、ｐＨを７に維持し、グルコース制限流加培養を開始し、６００ｇ／ｌのグルコース溶液を反応器に供給した（最初の２０時間は１５ｇ／ｈ、次に７５ｇ／ｈ培養収量まで）。ヘルパーファージ粒子の添加の２２時間後に培養物を回収した。培養物中の細胞を遠心分離（１５，９００ｇ、５０分）により除去した。上清中のファージ粒子は、標準的な手順を使用してＰＥＧ／ＮａＣｌで２回沈殿させた。ファージストックは０．４５μｍフィルターを使用してろ過し、ＰＢＳとグリセロールに溶解し、使用前まで－８０℃で保存した。

Ｙｌｉｂ００２Ｎａｉｖｅ．ＩからのＣ４、ＩＬ－６及びインスリン結合Ｙ変異体のファージディスプレイ選択：Ｃ４（Ｌｅｅ Ｂｉｏｓｏｌｕｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ，カタログ番号１９４－４１）、ＩＬ－６（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号２０６－ＩＬ－２００／ＣＦ）及びインスリン（Ｒｏｃｈｅ、カタログ番号１３７６４９７）を実施例１に記載したようにビオチン化した。バクテリオファージ上のライブラリー配列のランダムな変異体を表示する、この実施例に記載のファージストックを使用して、Ｃ４、ＩＬ－６、及びインスリン結合ポリペプチドを選択した。以下の例外を除いて、選択は基本的に実施例３に記載されているように実施された。選択は、標的のみを使用して個別に実施された（混合なし）。インスリンに対し４ラウンドを使用し、Ｃ４及びＩＬ－６のそれぞれに対し５ラウンドを使用した。表６に従って、標的濃度及び洗浄工程を実施した。

選択及び溶出されたファージ粒子が、以下に記載されるように増幅され、新規ファージストックが各サイクルの間に調製された。ファージストック、すなわち、選択サイクルに入るファージ粒子、及び溶出されたファージ粒子は、各選択サイクルの後に力価測定された。

ラウンド間のファージ粒子の増幅：培養中にアンピシリンの代わりにカルベニシリンを１００μｇ／ｍｌの濃度で使用したことを除いて、ラウンド間のファージ粒子の増幅を実施例３に記載したように実施した。感染に使用された細菌の量は、溶出されたファージ粒子の数と比較して約１００～２００倍過剰であった。選択サイクル４（全ての標的）及び選択サイクル５（Ｃ４及びＩＬ－６）において、ＥＲ２７３８細菌（Ｃ４）又はＸＬ１－Ｂｌｕｅ（ＩＬ－６及びインスリン）を感染に使用し、ＥＬＩＳＡスクリーニングで使用する単一コロニーを形成するために、２００μｇ／ｍｌのアンピシリンを加えたＴＢＡＢプレートに細菌を塗布した。

可溶性Ｙ変異体の上清の産生及びシーケンシング：Ｙ変異体は、実施例３に記載されるように可溶性タンパク質として産生された。ＥＬＩＳＡスクリーニングと並行して、全てのクローンを実施例１に記載されているように配列決定した。

ＥＬＩＳＡ及びＳＰＲを使用したＹ変異体のスクリーニング：Ｙ変異体のＩＬ－６及びインスリンへの結合は、それぞれ、実施例３に記載されているように、３００ｎＭのＩＬ－６又はインスリンを使用して、ＥＬＩＳＡアッセイで分析された。

Ｃ４及びインスリンから産生されたＹ変異体は、Ｂｉａｃｏｒｅ ８Ｋ機器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して標的結合についてスクリーニングされた。抗Ｚ０３６３９ヤギ抗体は、アミンカップリングによってＣＭ－５チップの表面のカルボキシル化デキストラン層に１４５００～１７５００ＲＵのレベルで固定化された。調製した上清をＨＢＳ－ＥＰ＋で１０倍に希釈し、１０μｌ／分の流速で５分間注入した後、単一濃度の標的タンパク質（５０ｎＭのＣ４及び３００ｎＭのインスリン）を５分間で注入した。標的の解離を７分間モニターし、その後、３０μｌのグリシン－ＨＣＬ ｐＨ２．５を２回注入して表面を再生した。速度論的分析を実行する前に、ヤギ抗Ｚを含むがＹサンプルを含まない参照表面上に注入されたターゲットからの信号を、標的に結合するＹ＃＃＃＃－Ｚ０３６３９のセンサーグラムから差し引いた。標的結合分析は、Ｂｉａｃｏｒｅ８Ｋ評価ソフトウェアを使用して実行された。最も遅いオフレートを示す結合クローンを、さらなる分析のために選択した。

Ｈｉｓ_６－タグを有するＹ変異体のサブセットのサブクローニング及びタンパク質産生：サブクローニング戦略を、実施例１に記載の方法に従って単量体Ｙ変異体分子を構築するためのＥＬＩＳＡ及び／又はＳＰＲ陽性変異体のサブセットに適用した。タンパク質は、実施例１に記載の方法に従って、Ｎ末端Ｈｉｓ_６－タグを使用して発現及び精製された。Y変異遺伝子断片を発現ベクターにサブクローニングし、コードされた配列ＭＧＳＳＨＨＨＨＨＨＧＳＳ－［Ｙ＃＃＃＃＃］－Ａ（配列番号１７２）を得た。

クローン化及び精製されたＹ変異体のＣＤ及びＳＰＲ分析：産生されたＹ変異体は、実施例１に記載された方法に従って、ＣＤ及びＳＰＲ分析に供された。加えて、選択されたＩＬ－６結合変異体のＣＤスペクトルも、６０、７０、８０及び９０℃で記録された。

結果
Ｙｌｉｂ００２Ｎａｉｖｅ．ＩからのＣ４、ＩＬ－６及びインスリン結合Ｙ変異体のファージディスプレイ選択：ファージディスプレイの選択は、標的タンパク質Ｃ４、ＩＬ－６、及びインスリンに対して新しく設計されたライブラリー（実施例５）を使用して実施された。個々のクローンは、ファージディスプレイ選択４及び５サイクル後に得られた。

シーケンシング：選択の４及び５サイクル後に得られたクローンについてシーケンシングを行った。各変異体には、ユニークな識別番号＃＃＃＃＃が割り当てられ、個々の変異体は、Ｙ＃＃＃＃＃と称される。Ｙ変異体のアミノ酸配列は、図１にリスト化されており、配列リストには、標的Ｃ４、ＩＬ－６及びインスリンについてそれぞれ、配列番号３２～３９、配列番号７０～８０及び配列番号１３２～１４５としてリストされている。

ＥＬＩＳＡ及びＳＰＲを使用したＹ変異体のスクリーニング：選択の４又は５サイクル後に得られたクローンは、可溶性タンパク質として９６ウェルプレートで産生された。Ｙ変異体は、ＥＬＩＳＡでｂ－ＩＬ－６又はｂ－インスリン結合活性についてスクリーニングされた。いくつかのユニークなＹ変異体は、それぞれ３００ｎＭの濃度のｂ－ＩＬ－６又はｂ－インスリンに対して約２倍以上の陰性コントロールに対する応答を与えることが見出された。陰性対照の平均反応は、ｂ－ＩＬ－６及びインスリンでそれぞれ０．０８３ＡＵと０．０５４ＡＵであった。

Ｃ４及びインスリン結合Ｙ変異体の選択は、実施例１に記載されているように、Ｂｉａｃｏｒｅ ８Ｋを使用する速度論的スクリーニングに提示された。単一濃度のＣ４（５０ｎＭ）又はインスリン（３００ｎＭ）を、抗Ｚ０３６３９抗体を含むセンサーチップ表面の可溶性抽出物から捕捉した各Ｙ＃＃＃＃＃－Ｚ０３６３９に注入した。ＥＬＩＳＡで陽性反応を示すか、ＳＰＲ分析で最も遅いオフレート曲線を示すＹ変異体をサブクローニングのために選択した。

精製されたＹ変異体のＣＤ及びＳＰＲ分析：産生されたＹ変異体は、ＣＤ及びＳＰＲ分析に供された。計算された速度論的パラメータ、親和性、Ｔｍ値、及び可溶性産物として表されるタンパク質の推定パーセンテージを表７に示す。ＶＴＭの前後に記録されたＣＤスペクトルと同様に融解曲線の例は、Ｃ４結合Ｙ変異体Ｙ００７９２（図４Ａ～Ｂ）、インスリン結合変異体Ｙ００３０１（図４Ｃ～Ｄ）及びＩＬ－６結合変異体Ｙ０２４４４（図４Ｅ～Ｆ）のための図４に示されている。ＩＬ－６結合変異体の場合、これらの変異体は、図４ＧのＹ０２４４４に示されるように、完全に展開していないように見えるが、９０℃までの温度においても部分的な安定な構造を示したため、信頼できるＴｍを決定することができなかった。

実施例７
第２のライブラリーからのＣ４、ＩＬ－６及びインスリン結合Ｙ変異体の突然変異研究

概要
この実施例は、Ｙ変異体の広範な範囲にわたり高い熱耐性及び結合能力を維持しながら、主に高い生産収率及び高い溶解性の観点から、集団の配列の特性をされに最適化するために実施された２つの追加の配列突然変異研究のセットを記載する。

材料及び方法
突然変異したＹ変異体のクローニング：第４の突然変異研究において、タンパク質発現に対するこれら突然変異の影響を評価するために、Ｙ変異体に様々な変異が導入された。これは、インスリン結合Ｙ変異体Ｙ００３５６（配列番号１４０）をテンプレートとして使用して実施された。突然変異は、足場の位置９（Ｘ_ｓｃ１）、１５（Ｘ_ｓｃ３）、及び２６（Ｘ_ｓｃ４）、より正確には、突然変異Ｉ９Ｌ、Ｋ１５Ｙ、及びＱ２６Ｅに導入された。全ての変異体は、Ｎ末端Ｈｉｓ_６タグでクローン化され、遺伝子構築物は、ＭＧＳＳＨＨＨＨＨＨＧＳＳ－［Ｙ＃＃＃＃＃］（配列番号１６８）のフォーマットでコードされたポリペプチドを得た。実施例１に記載の方法に従ってクローニングを行った。

第５の突然変異研究において、突然変異Ｉ９Ｌ、Ｋ１５Ｙ、及びＱ２６Ｅを、さらなるＹ変異体を使用してタンパク質の発現及び安定性に対する潜在的な影響に関してさらに評価した。突然変異Ｋ１５Ｙ及びＱ２６Ｅも組み合わせて評価された。位置１５にチロシンを保持すると、芳香族残基の存在を保証することができ、これは、標的結合位置に芳香族残基が欠如している選択された結合ポリペプチドの分析に便利である。当該研究は、Ｃ４結合Ｙ変異体Ｙ００７９２（配列番号３２）、Ｙ０２３０９（配列番号３５）及びＹ０２３３０（配列番号３７）、ＩＬ－６結合Ｙ変異体Ｙ０２３７４（配列番号７２）、Ｙ０２４１５（配列番号７４）及びＹ００２４４４（配列番号７５）及びインスリン結合Ｙ変異体Ｙ００３０１（配列番号１３３）、Ｙ００３１０（配列番号１３５）及びＹ００３５８（配列番号１４２）をテンプレートとして使用し実施された。全ての変異体は、Ｎ末端Ｈｉｓ_６－タグでクローン化され、遺伝子構築物は、ＭＧＳＳＨＨＨＨＨＨＧＳＳ－［Ｙ＃＃＃＃＃］－Ａ（配列番号１７２）のフォーマットでコードされたポリペプチドを得た。実施例１に記載の方法に従ってクローニングを行った。

突然変異したＹ変異体の産生及び特性評価：Ｙ変異体は、実施例１に記載されている一般的な方法に従ってクローン化され、産生され、特徴付けられた。点突然変異を伴う生成されたＹ変異体は、実施例１に記載されるように、ＣＤ及びＳＰＲ分析に供された。さらに、ＩＬ－６結合変異体のＣＤスペクトルも、６０、７０、８０及び９０℃で記録された。

結果
突然変異したＹ変異体の産生及び特性評価：突然変異研究４及び５から生成されたＹ変異体は、Ｙ変異体の安定性と結合能力に対するさまざまな点突然変異の影響を評価するためにＳＰＲ及び／又はＣＤ分析に供された。さらに、タンパク質発現レベル及び可溶性産物の割合をモニターした。分析されたそれぞれのＹ変異体の発現レベル、溶解度、融点、速度論的パラメータ及び親和性値（Ｋ_Ｄ）は、それぞれ第４及び第５の突然変異研究について表８及び９にまとめる。

第４の突然変異研究において、突然変異Ｋ１５Ｙ及びＱ２６Ｅはそれぞれ、発現レベルをほぼ２倍にすることが示されたが、変異Ｉ９Ｌは、発現中の溶解度を増加させた。

第５の突然変異研究において、単一及び二重突然変異Ｙ変異体が、可溶性タンパク質として正常に発現されたが、発現レベルは、変化した。全ての変異体は、９０℃に加熱した後に可逆的にリフォールディングした。ＩＬ－６結合変異体は、９０℃でも部分構造を示した。位置９のＩは、Ｌよりも優先されることが示された。位置１５のＫ対Ｙ及び位置２６のＱ対Ｅの優先度は、Ｙ変異体によって異なる。

実施例８
アルブミン結合ドメインに融合したY変異体の生成及び分析

概要
この実施例は、Ｙ変異体のインビボ半減期を延長するのに有利であるアルブミン結合ドメインと融合したＹ変異体のクローニング及び産生を説明する。

材料及び方法
ＰＰ０１３と融合したＹ変異体のクローニング：クローニングは、当該技術分野で知られている方法を使用して実施された。簡単に説明すると、Ｙ変異体及びＡＢＤ変異体ＰＰ０１３をコードするＤＮＡは、Ｔｗｉｓｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅに断片遺伝子として注文し、酵素ＮｄｅＩ及びＮｏｔＩ－ＨＦ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用して制限酵素処理された。発現ベクター（Ｔ７プロモーターを含む）を調製し、同じ制限酵素で消化した。ライゲーション、形質転換、及びシーケンシングは、実施例１に記載されているように実施された。発現ベクターによってコードされた構築物は、ＧＳＳ－［Ｙ＃＃＃＃＃］－Ｇ４Ｓ－ＰＰ０１３又はＧＳＳ－ＰＰ０１３－Ｇ４Ｓ－［Ｙ＃＃＃＃＃］であった。各構築物の一例は、それぞれ配列番号１６１及び配列番号１６２として配列表に記載されている。

ＰＰ０１３との融合におけるＹ変異体の産生：融合タンパク質の発現は、本質的に実施例１に記載されているように実施された。発現したタンパク質を含む細胞ペレットをＴＳＴバッファー（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２００ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ ８．０）に再懸濁し、細胞を溶解する。清澄化した上清を、抗ＰＰ０１３リガンドで固定化したアガロースにアプライする（ＷＯ２０１４／０６４２３７に記載）。ＴＳＴバッファー及び５ｍＭ ＮＨ４Ａｃ ｐＨ５．５バッファーで洗浄した後、ＰＰ０１３融合Ｙ変異体を０．１Ｍ ＨＡｃで溶出する。ＲＰＣ－ＨＰＬＣを使用してさらに精製を行うことが可能である。それぞれの精製タンパク質の正しい同一性は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びＬＣ／ＭＳ分析を使用して確認される。

結合分析：融合タンパク質のＹ変異体部分の標的タンパク質への結合、ならびにアルブミン結合部分によるアルブミンへの結合の検証は、本質的に実施例１に記載されているようにＢｉａｃｏｒｅ分析を実施することによって実施される。

薬物動態分析：ＰＰ０１３融合Ｙ変異体の血清半減期をマウスで調べた。それぞれの融合タンパク質は、ＮＭＲＩマウス（チャールズリバー）に～１００ｎｍｏｌ／ｋｇ体重の用量で静脈内（ｉ．ｖ．）投与される。３匹のマウスの群からの血清は、投与後０．０８、６、１８、７８、１２０、１６８及び２４０時間で得られる。それぞれの融合タンパク質の濃度は、ＥＬＩＳＡによって決定される。

結果
結合分析の結果は、Ｙ変異体の標的及びアルブミンの両方への結合を示すと予想される。さらに、ＰＰ０１３及び他のアルブミン結合ドメイン変異体への融合は、インビボ半減期の延長をもたらすと予想される。

実施形態の項目別リスト
１．共通の足場に基づくポリペプチド変異体の集団であって、集団内の各ポリペプチドが、以下の足場アミノ酸配列：
Ｘ_ｓｃ１ＡＥＬＤＸ_ｓｃ２Ｘ_ｓｃ３ＧＶＧ ＡＸＸＩＫＸＩＸ_ｓｃ４ＸＡ ＸＸＶＥＸＶＱＸＸＫ ＱＸＩＬＡＸ（配列番号１６５）
（配列中、互いに独立して、
－ Ｘ_ｓｃ１が、Ｉ及びＬから選択された足場アミノ酸残基であり；
－ Ｘ_ｓｃ２が、Ｃ及びＳから選択された足場アミノ酸残基であり；
－ Ｘ_ｓｃ３が、Ｋ及びＹから選択された足場アミノ酸残基であり；
－ Ｘ_ｓｃ４が、Ｅ及びＱから選択された足場アミノ酸残基であり；及び
－ 各Ｘが、独立に、何れかのアミノ酸残基に対応する結合アミノ酸残基である）
を含む、ポリペプチドの集団。

２．各ポリペプチドが、以下の足場アミノ酸配列を含む、項目１に記載の集団：
ＬＡＥＡＫＥＡＡＸ_ｓｃ１Ａ ＥＬＤＸ_ｓｃ２Ｘ_ｓｃ３ＧＶＧＡＸ ＸＩＫＸＩＸ_ｓｃ４ＸＡＸＸ ＶＥＸＶＱＸＸＫＱＸ ＩＬＡＸＬＰ（配列番号１６６）
（配列中、
Ｘ_ｓｃ１、Ｘ_ｓｃ２、Ｘ_ｓｃ３、Ｘ_ｓｃ４及び個々のＸは、項目１で定義されている通りである）。

３．Ｘ_ｓｃ１が、Ｉである上記何れかの項目に記載の集団。

４．Ｘ_ｓｃ１が、Ｌである上記何れかの項目に記載の集団。

５．Ｘ_ｓｃ２が、Ｓである上記何れかの項目に記載の集団。

６．Ｘ_ｓｃ２が、Ｃである上記何れかの項目に記載の集団。

７．Ｘ_ｓｃ３が、Ｋである上記何れかの項目に記載の集団。

８．Ｘ_ｓｃ３が、Ｙである上記何れかの項目に記載の集団。

９．Ｘ_ｓｃ４が、Ｑである上記何れかの項目に記載の集団。

１０．Ｘ_ｓｃ４が、Ｅである上記何れかの項目に記載の集団。

１１．少なくとも１×１０^４個のユニークなポリペプチド分子を含む、上記何れかの項目に記載の集団。

１２．少なくとも１×１０^６個のユニークなポリペプチド分子を含む、項目１１に記載の集団。

１３．少なくとも１×１０^８個のユニークなポリペプチド分子を含む、項目１２に記載の集団。

１４．少なくとも１×１０^１０個のユニークなポリペプチド分子を含む、項目１３に記載の集団。

１５．少なくとも１×１０^１２個のユニークなポリペプチド分子を含む、項目１４に記載の集団。

１６．少なくとも１×１０^１４個のユニークなポリペプチド分子を含む、項目１５に記載の集団。

１７．少なくとも１×１０^１５個のユニークなポリペプチド分子を含む、項目１６に記載の集団。

１８．ポリヌクレオチドの集団であって、その各メンバーが、項目１～１７の何れかに記載されるポリペプチドの集団のメンバーをコードすることを特徴とする、ポリヌクレオチドの集団。

１９．項目１～１７の何れか１項目に記載のポリペプチドの集団と項目１８に記載のポリヌクレオチドの集団の組み合わせであって、ポリペプチドの前記集団の各メンバーが、遺伝子型－表現型カップリングのための手段を介して、そのメンバーをコードするポリヌクレオチドと物理的又は空間的に関連する、組み合わせ。

２０．遺伝子型－表現型カップリングのための前記手段が、ファージディスプレイシステムを含む、項目１９に記載の組み合わせ。

２１．遺伝子型－表現型カップリングのための前記手段が、細胞表面選択ディスプレイシステムを含む、項目１９に記載の組み合わせ。

２２．前記細胞表面ディスプレイシステムが、原核細胞を含む、項目２１に記載の組み合わせ。

２３．前記原核細胞が、グラム^＋細胞である、項目２２に記載の組み合わせ。

２４．前記細胞表面ディスプレイシステムが、真核細胞を含む、項目２１に記載の組み合わせ。

２５．前記真核細胞が、酵母細胞である、項目２４に記載の組み合わせ。

２６．遺伝子型－表現型カップリングのための前記手段が、無細胞ディスプレイシステムを含む、項目１９に記載の組み合わせ。

２７．前記無細胞ディスプレイシステムが、リボソームディスプレイシステムを含む、項目２６に記載の組み合わせ。

２８．前記無細胞ディスプレイシステムが、インビトロ区画化ディスプレイシステムを含む、項目２６に記載の組み合わせ。

２９．前記無細胞ディスプレイシステムが、シスディスプレイシステムを含む、項目２６に記載の組み合わせ。

３０．前記無細胞ディスプレイシステムが、マイクロビーズディスプレイシステムを含む、項目２６に記載の組み合わせ。

３１．遺伝子型－表現型カップリングのための前記手段が、非ディスプレイシステムを含む、項目１９に記載の組み合わせ。

３２．前記非ディスプレイシステムが、タンパク質－断片補完アッセイである、項目３１に記載の組み合わせ。

３３．ポリペプチドの集団から所定の標的に対する親和性を有する所望のポリペプチドを選択するための方法であって、以下の工程：
（ａ）項目１～１７の何れか１項目に記載のポリペプチドの集団を提供すること；
（ｂ）標的と標的に対する親和性を有する少なくとも１つの所望のポリペプチドの間の特異的相互作用を可能にする条件下で、ポリペプチドの集団を所定の標的と接触させること；及び
（ｃ）前記特異的相互作用に基づいて、ポリペプチドの残りの集団から少なくとも１つの所望のポリペプチドを選択すること、
を含む方法。

３４．工程（ａ）が、項目１８に記載のポリヌクレオチドの集団を提供し、前記ポリヌクレオチドの集団を発現して、前記ポリペプチドの集団を産生する準備工程を含む、項目３３に記載の方法。

３５．ポリペプチドの前記集団の各メンバーが、遺伝子型－表現型カップリングのための手段を介して、そのメンバーをコードするポリヌクレオチドと物理的又は空間的に関連する、項目３４に記載の方法。

３６．遺伝子型－表現型カップリングの前記手段が、項目２０～３２の何れか１項目に記載の１つで定義される通りである、項目３５に記載の方法。

３７．所定の標的に対する親和性を有する所望のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを単離するための方法であって、以下の工程：
－ 項目３５に記載の方法を使用して、ポリペプチドの集団から前記所望のポリペプチド及びそれをコードするポリヌクレオチドを選択すること；及び
－ 前記所望のポリペプチドをコードするこのように分離されたポリヌクレオチドを単離すること、
を含む方法。

３８．所定の標的に対して親和性を有する所望のポリペプチドを同定するための方法であって、以下の工程：
－ 項目３７に記載の方法を使用して、前記所望のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを単離すること；及び
－ ポリヌクレオチドをシーケンシングし、前記所望のポリペプチドのアミノ酸配列を推定することによって確立すること、
を含む方法。

３９．ポリペプチドの集団から所定の標的に対する親和性を有する所望のポリペプチドを選択及び同定するための方法であって、以下の工程：
（ａ）別個の担体又はビーズ上で項目１～１７の何れか１項目に記載のポリペプチドの集団の各メンバーを合成すること；
（ｂ）ポリペプチドと所定の標的との相互作用に基づいて、担体又はビーズを選択又は富化すること；及び
（ｃ）タンパク質特性評価法によりポリペプチドを同定すること、
を含む方法。

４０．工程（ｃ）で使用されるタンパク質特性評価法が、質量分析である、項目３９に記載の方法。

４１．所定の標的に対する親和性を有する所望のポリペプチドを産生するための方法であって、以下の工程：
－ 項目３８に記載の方法を使用して所望のポリペプチドを単離及び同定する、又は項目３９若しくは４０に記載の方法を使用して所望のポリペプチドを選択及び同定すること；及び
－ 前記所望のポリペプチドを産生すること、
を含む方法。

４２．前記産生が、ｄｅ ｎｏｖｏでの所望のポリペプチドの化学合成を用いて実施される、項目４１に記載の方法。

４３．前記産生が、所望のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの組換え発現を使用して実施される、項目４１に記載の方法。

４４．所定の標的に対する親和性を有する所望のポリペプチドを産生するための方法であって、以下の工程：
（ａ１）項目３７に記載の方法を使用して、前記所望のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを単離すること；又は
（ａ２）項目３９又は４０に記載の選択及び同定方法を使用して同定されたポリペプチドを逆翻訳すること；及び
（ｂ）（ａ１）又は（ａ２）の何れかに続いて、このように単離されたポリヌクレオチドを発現し、前記所望のポリペプチドを産生すること、
を含む方法。

４５．以下の配列と少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド：
Ｘ_１ＡＥＬＤＸ_６Ｘ_７ＧＶＧ ＡＸ_１２Ｘ_１３ＩＫＸ_１６ＩＸ_１８Ｘ_１９Ａ Ｘ_２１Ｘ_２２ＶＥＸ_２５ＶＱＸ_２８Ｘ_２９Ｋ ＱＸ_３２ＩＬＡＸ_３６（配列番号１６５）
（配列中、互いに独立して、
－ Ｘ_１が、Ｉ及びＬから選択され；
－ Ｘ_６が、Ｃ及びＳから選択され；
－ Ｘ_７が、Ｋ及びＹから選択され；
－ Ｘ_１８が、Ｅ及びＱから選択され；及び
－ Ｘ_１２、Ｘ_１３、Ｘ_１６、Ｘ_１９、Ｘ_２１、Ｘ_２２、Ｘ_２５、Ｘ_２８、Ｘ_２９、Ｘ_３２及びＸ_３６の各々が、何れかのアミノ酸残基である）。

４６．以下の配列と少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列を含む、項目４５に記載のポリペプチド：
ＬＡＥＡＫＥＡＡ Ｘ_１ＡＥＬＤＸ_６Ｘ_７ＧＶＧ ＡＸ_１２Ｘ_１３ＩＫＸ_１６ＩＸ_１８Ｘ_１９Ａ Ｘ_２１Ｘ_２２ＶＥＸ_２５ＶＱＸ_２８Ｘ_２９Ｋ ＱＸ_３２ＩＬＡＸ_３６ ＬＰ（配列番号１６６）
（配列中、
Ｘで示される全てのアミノ酸残基は、項目４５で定義される通りである）。

４７．Ｘ_１が、Ｉである、項目４５～４６の何れか１つに記載のポリペプチド。

４８．Ｘ_１が、Ｌである、項目４５～４６の何れか１つに記載のポリペプチド。

４９．Ｘ_６が、Ｓである、項目４５～４８の何れか１つに記載のポリペプチド。

５０．Ｘ_６が、Ｃである、項目４５～４８の何れか１つに記載のポリペプチド。

５１．Ｘ_７が、Ｋである、項目４５～５０の何れか１つに記載のポリペプチド。

５２．Ｘ_７が、Ｙである、項目４５～５０の何れか１つに記載のポリペプチド。

５３．Ｘ_１８が、Ｅである、項目４５～５２の何れか１つに記載のポリペプチド。

５４．Ｘ_１８が、Ｑである、項目４５～５２の何れか１つに記載のポリペプチド。

５５．１１位のアミノ酸残基がＡである、項目４５～５４の何れか１つに記載のポリペプチド。

５６．第２のポリペプチド部分をさらに含む、項目４５～５５の何れか１つの項目に記載のポリペプチドであって、以下を含む融合ポリペプチドであるようなポリペプチド：
－ 項目４５～５５の何れか１つの項目に記載の配列定義を満たす第１の部分、及び
－ 所望の機能を有する第２の部分。

５７．前記第２の部分が、アルブミンに対して結合親和性を有するポリペプチドドメインである、項目５６に記載のポリペプチド。

５８．アルブミンに対する結合親和性を有する前記ポリペプチドドメインが、連鎖球菌プロテインＧ由来の天然に存在するアルブミン結合ドメイン、又は保持又は改善されたアルブミン結合親和性を有するその改変された変異体である、項目５７に記載のポリペプチド。

５９．項目４５～５８の何れか１つに記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。

６０．項目５９に記載のポリヌクレオチドを発現する工程を含む、項目４５～５８の何れか１つに記載のポリペプチドを産生するための方法。

Claims (13)

1. 共通の足場に基づくポリペプチド変異体の集団であって、集団内の各ポリペプチドが、以下の足場アミノ酸配列：
   Ｘ_ｓｃ１ＡＥＬＤＸ_ｓｃ２Ｘ_ｓｃ３ＧＶＧ ＡＸＸＩＫＸＩＸ_ｓｃ４ＸＡ ＸＸＶＥＸＶＱＸＸＫ ＱＸＩＬＡＸ（配列番号１６５）
   （配列中、互いに独立して、
   － Ｘ_ｓｃ１が、Ｉ及びＬから選択された足場アミノ酸残基であり；
   － Ｘ_ｓｃ２が、Ｃ及びＳから選択された足場アミノ酸残基であり；
   － Ｘ_ｓｃ３が、Ｋ及びＹから選択された足場アミノ酸残基であり；
   － Ｘ_ｓｃ４が、Ｅ及びＱから選択された足場アミノ酸残基であり；及び
   － 各Ｘが、個々に、何れかのアミノ酸残基に対応する結合アミノ酸残基である）
   を含む、集団。
2. 各ポリペプチドが、以下の足場アミノ酸配列を含む：
   ＬＡＥＡＫＥＡＡＸ_ｓｃ１Ａ ＥＬＤＸ_ｓｃ２Ｘ_ｓｃ３ＧＶＧＡＸ ＸＩＫＸＩＸ_ｓｃ４ＸＡＸＸ ＶＥＸＶＱＸＸＫＱＸ ＩＬＡＸＬＰ（配列番号１６６）
   （配列中、
   Ｘ_ｓｃ１、Ｘ_ｓｃ２、Ｘ_ｓｃ３、Ｘ_ｓｃ４及び個々の各Ｘは、請求項１で定義されている通りである）、
   請求項１に記載の集団。
3. 少なくとも１×１０^４個の固有のポリペプチド分子を含む、請求項１又は２に記載の集団。
4. ポリヌクレオチドの集団であって、その各メンバーが、請求項１～３の何れか１項に記載のポリペプチドの集団のメンバーをコードすることを特徴とする、ポリヌクレオチドの集団。
5. 請求項１～３の何れか１項に記載のポリペプチドの集団と請求項４に記載のポリヌクレオチドの集団の組み合わせであって、ポリペプチドの前記集団の各メンバーが、遺伝子型－表現型カップリングのための手段を介して、そのメンバーをコードするポリヌクレオチドと物理的又は空間的に関連する、組み合わせ。
6. ポリペプチドの集団から所定の標的に対する親和性を有する所望のポリペプチドを選択するための方法であって、以下の工程：
   （ａ）請求項１～３の何れか１項に記載のポリペプチドの集団を提供すること；
   （ｂ）標的と標的に対する親和性を有する少なくとも１つの所望のポリペプチドとの間の特異的相互作用を可能にする条件下で、ポリペプチドの集団を所定の標的と接触させること；及び
   （ｃ）前記特異的相互作用に基づいて、前記ポリペプチドの残りの集団から少なくとも１つの所望のポリペプチドを選択すること、
   を含む方法。
7. 工程（ａ）が、請求項４に記載のポリヌクレオチドの集団を提供し、前記ポリヌクレオチドの集団を発現して、前記ポリペプチドの集団を産生する準備工程を含む、請求項６に記載の方法。
8. ポリペプチドの前記集団の各メンバーが、遺伝子型－表現型カップリングのための手段を介して、そのメンバーをコードするポリヌクレオチドと物理的又は空間的に関連する、請求項７に記載の方法。
9. 所定の標的に対する親和性を有する所望のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを単離するための方法であって、以下の工程：
   － 請求項６に記載の方法を使用して、ポリペプチドの集団から前記所望のポリペプチド及びそれをコードするポリヌクレオチドを選択すること；及び
   － 前記所望のポリペプチドをコードするこのように分離されたポリヌクレオチドを単離すること、
   を含む方法。
10. 所定の標的に対して親和性を有する所望のポリペプチドを同定するための方法であって、以下の工程：
    － 請求項９に記載の方法を使用して、前記所望のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを単離すること；及び
    － 前記ポリヌクレオチドをシーケンシングし、前記所望のポリペプチドのアミノ酸配列を推定することによって確立すること、
    を含む方法。
11. ポリペプチドの集団から所定の標的に対する親和性を有する所望のポリペプチドを選択及び同定するための方法であって、以下の工程：
    （ａ）別個の担体又はビーズ上で請求項１～３の何れか１項に記載のポリペプチドの集団の各メンバーを合成すること；
    （ｂ）前記ポリペプチドと前記所定の標的との相互作用に基づいて、前記担体又はビーズを選択又は富化すること；及び
    （ｃ）タンパク質特性評価法により前記ポリペプチドを同定すること、
    を含む方法。
12. 所定の標的に対する親和性を有する所望のポリペプチドを産生するための方法であって、以下の工程：
    － 請求項１０に記載の方法を使用して所望のポリペプチドを単離及び同定する、又は請求項１１に記載の方法を使用して所望のポリペプチドを選択及び同定すること；及び
    － 前記所望のポリペプチドを産生すること、
    を含む方法。
13. 所定の標的に対する親和性を有する所望のポリペプチドを産生するための方法であって、以下の工程：
    （ａ１）請求項９に記載の方法を使用して、前記所望のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを単離すること；又は
    （ａ２）請求項１１に記載の選択及び同定方法を使用して同定されたポリペプチドを逆翻訳すること；及び
    （ｂ）（ａ１）又は（ａ２）の何れかに続いて、このように単離されたポリヌクレオチドを発現し、前記所望のポリペプチドを産生すること、
    を含む方法。

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