JP7745210B2

JP7745210B2 - 細胆管増生を伴う肝細胞を検出するためのバイオマーカー

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Publication number: JP7745210B2
Application number: JP2023538491A
Authority: JP
Inventors: 元治清木; 太郎山下; 光岡田; 周一金子; 直彦越川; 伸昭舟橋
Original assignee: Kanazawa University NUC; Tokyo Institute of Technology NUC; University of Tokyo NUC; Kanagawa Prefectural Hospital Organization; Institute of Science Tokyo
Current assignee: Kanazawa University NUC; Tokyo Institute of Technology NUC; University of Tokyo NUC; Kanagawa Prefectural Hospital Organization; Institute of Science Tokyo
Priority date: 2021-07-26
Filing date: 2022-07-22
Publication date: 2025-09-29
Anticipated expiration: 2042-07-22
Also published as: US20250012812A1; JPWO2023008329A1; WO2023008329A1

Description

本発明は広く、細胆管増生を伴う肝細胞を検出するためのバイオマーカー、及びそれを用いた種々の用途を提供する。

ラミニンは、基底板中に見られる一群のヘテロ三量体タンパク質であり、基底膜の一部を形成する。これらのタンパク質は、お互いに複合してラミニン構造を形成する３つの非同一ポリペプチドに基づいて分類される。これらの３つのポリペプチドは、アルファ（α）鎖、ベータ（β）鎖及びガンマ（γ）鎖として識別され、それぞれが数種の分子種（例えば、α１－α５、β１－β３及びγ１－γ２）を有する。ラミニン３３２（ラミニン５又はＬＮ５ともいう）は、基底板中に存在し、上皮細胞と上皮細胞を裏打ちする結合組織の間に位置する基底膜において豊富であることが知られている。ラミニン３３２の構造は、α３鎖及びβ３鎖と複合した場合にラミニン３３２を形成するガンマ－２（γ２）鎖を含む構造を有する唯一のラミニンである点で、既知のラミニンの中でも独特である。生理学的に、ラミニン３３２は上皮細胞により産生され、細胞の接着、増殖、分化及び／又は遊走を促進することができることが知られている。例えば、ラミニン３３２が上皮細胞から分泌されるとき、それは（例えば、膜型１マトリックスメタロプロテアーゼ－１（ＭＴ１－ＭＭＰ）による）プロテアーゼ分解を受けやすい。ある場合においては、ラミニン３３２は、ガンマ－２鎖配列のＮ末端に向かってプロセシングされて、細胞の遊走及び浸潤の促進を含む上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）様活性を有するフラグメントを生成する（Ｋｏｓｈｉｋａｗａら、Ｊ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．（２０００）１４８：６１５－６２４頁）。

血液等の生物学的サンプルにおける増大したラミニンγ２単鎖の濃度又はレベルが、がん、結腸直腸がん及び／又は膀胱がんなどと関連していることが知られている。例えば、国際公開第２０１４／０２７７０１号では、がんを有する又はがんを有するリスクのある被検者に、診断、予後又はリスク分類を提供する方法であって、被検者由来のサンプル中のラミニンγ２単鎖濃度を、参照ラミニンγ２単鎖濃度値と比較するステップであり、参照ラミニンγ２単鎖濃度値よりも高い、サンプル中のラミニンγ２単鎖濃度が、被検者を、がんを有する又はがんを発病する増大したリスクを有すると同定する方法が開示されている。また、特開２０１１－２０９２８１号公報では、被検者から採取した尿中のラミニンγ２単鎖を測定することを特徴とする泌尿器科がんの検査方法及び検査用キットが開示されている。

国際公開第２０１４／０２７７０１号パンフレット特開２０１１－２０９２８１号公報国際公開第２０１７／０５７７７８号パンフレット

Ｋｏｓｈｉｋａｗａら、Ｊ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．、（２０００）１４８：６１５－６２４頁

本発明は、新規バイオマーカーとしてのラミニンγ２単鎖の用途を提供することを目的とする。

種々の肝疾患や肝障害では、グリソン鞘周囲に胆管構造の異常な増加が起こる。この現象は、小葉間胆管と肝細胞の間を結ぶ細い管腔構造である細胆管に類似した胆管の増生であることから、細胆管反応と呼ばれている。

本発明者らは、ラミニンγ２単鎖が細胆管の増生（細胆管反応）を伴う肝細胞で見られることを見出し、本発明を完成させるに至った。

即ち、本願は以下の発明を包含する。
［１］
細胆管増生を伴う肝細胞を検出するためのバイオマーカーを検出する方法であって、
検体において、当該バイオマーカーとしてラミニンγ２単鎖又はそれをコードする核酸を検出する工程を含む、方法。
［２］
細胆管増生を伴う肝細胞が、細胆管増生をきたす肝疾患を有する細胞である、［１］に記載の方法。
［３］
細胆管増生をきたす肝疾患が、原発性胆汁性胆管炎、急性肝炎、劇症肝炎、肝不全、原発性硬化性胆管炎、肝線維症、胆道閉鎖症、及び胆汁うっ滞症から成る群から選択される、［２］に記載の方法。
［４］
ラミニンγ２単鎖又はそれをコードする核酸が検出された場合、検体は、細胆管増生を伴う肝細胞、又は細胆管増生をきたす肝疾患を有する肝細胞、を含む可能性がある、［１］～［３］のいずれかに記載の方法。
［５］
ラミニンγ２単鎖又はそれをコードする核酸以外の細胆管増生関連マーカーを検出する工程を更に含む、［１］～［４］のいずれかに記載の方法。
［６］
細胆管増生関連マーカーが、ＳＯＸ９、ＡＱＰ１、ＣＫ７、ＥｐＣＡＭ及びＤｌｋ１から成る群から選択される１又は複数のマーカーである、［５］に記載の方法。
［７］
ラミニンγ２単鎖又はそれをコードする核酸の検出が経時的に行われる、［１］～［６］のいずれかに記載の方法。
［８］
検体におけるラミニンγ２単鎖又はそれをコードする核酸の量の経時的な変化が、当該検体におけるＣＫ１９又はそれをコードする核酸の量の経時的な変化と比較される、［７］に記載の方法。
［９］
検体が、細胆管増生を伴う肝細胞、又は細胆管増生をきたす肝疾患を有する肝細胞、を有することが疑われる被検者に由来する、［１］～［８］のいずれかに記載の方法。
［１０］
検体が前記被検者の血液又は尿に由来する、［９］に記載の方法。
［１１］
細胆管増生を伴う肝細胞と、細胆管増生を伴わない肝細胞とを鑑別するための方法であって、
検体において、ラミニンγ２単鎖又はそれをコードする核酸を検出する工程を含み、
ラミニンγ２単鎖又はそれをコードする核酸が検出された場合、検体は細胆管増生を伴う肝細胞を含むと判断され、
ラミニンγ２単鎖又はそれをコードする核酸が検出されなかった場合、検体は細胆管増生を伴う肝細胞を含まないと判断される、方法。
［１２］
細胆管増生を伴う肝細胞が、細胆管増生をきたす肝疾患を有する細胞である、［１１］に記載の方法。
［１３］
細胆管増生をきたす肝疾患が、原発性胆汁性胆管炎、急性肝炎、劇症肝炎、肝不全、原発性硬化性胆管炎、肝線維症、胆道閉鎖症、及び胆汁うっ滞症から成る群から選択される、［１２］に記載の方法。
［１４］
細胆管増生を伴う肝細胞を検出するためのバイオマーカーであって、ラミニンγ２単鎖又はそれをコードする核酸を含む、バイオマーカー。
［１５］
細胆管増生を伴う肝細胞が、細胆管増生をきたす肝疾患を有する細胞である、［１４］に記載のバイオマーカー。
［１６］
細胆管増生を伴う肝細胞を検出するためのキットであって、ラミニンγ２単鎖又はそれをコードする核酸を検出する試薬を含む、キット。
［１７］
細胆管増生を伴う肝細胞が、細胆管増生をきたす肝疾患を有する細胞である、［１６］に記載のキット。
［１８］
細胆管増生をきたす肝疾患が、原発性胆汁性胆管炎、急性肝炎、劇症肝炎、肝不全、原発性硬化性胆管炎、肝線維症、胆道閉鎖症、及び胆汁うっ滞症から成る群から選択される、［１７］に記載のキット。
［１９］
ＣＫ１９又はそれをコードする核酸を検出する試薬を更に含む、［１６］～［１８］のいずれかに記載のキット。

本発明の効果

本発明によれば、細胆管増生に関連する新規バイオマーカーであるラミニンγ２単鎖の検出を指標として細胆管増生をきたす肝疾患等の診断や鑑別が可能になる。

従来より、細胆管のマーカーとしてサイトケラチン１９（ＣＫ１９）が知られているが、ＣＫ１９は胆管上皮細胞に恒常的に発現するという特徴がある。一方、ラミニンγ２単鎖は胆管の成熟に伴い発現が消失し、胆管増生（幼弱な胆管の出現）により再度発現が亢進するという特徴を有する。そのため、ラミニンγ２単鎖をモニタリングすることで、胆管形成の状態など、肝細胞の経時的な変化を確認することも可能になる。

なお、国際公開第２０１７／０５７７７８号には肝がんのみならず肝硬変のバイオマーカーとしてのラミニンγ２単鎖が開示されているが、肝硬変は患部において完全に結節が形成されている状態であるのに対し、細胆管増生をきたす肝疾患の一つである肝線維症は結節が形成されていない状態である点で肝硬変とは異なる。このように、国際公開第２０１７／０５７７７８号に記載のバイオマーカーが対象とする疾患は細胆管増生をきたす肝疾患ではない。

図１は、各ラミニン鎖抗体のマウスラミニン鎖に対する免疫反応性を免疫組織染色により検証した結果であり、マウス皮膚におけるＬｎ－γ２、Ｌｎ－β３、Ｌｎ－α３の発現局在を示す。図２は、超高脂肪コリン欠乏メチオニン減量食（ＣＤＡＡ）餌食で非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）を誘導したＮＡＳＨモデルマウス肝を用いた免疫染色とヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色の結果を示す。図２Ａの上段パネルはＣＤＡＡ投与２週間後のマウス肝の染色結果であり、下段パネルはＣＤＡＡ投与４週間後のマウス肝の染色結果である。図２Ｂの上段パネルはＣＤＡＡ投与８週間後のマウス肝の染色結果であり、下段パネルはＣＤＡＡ投与１０週間後のマウス肝の染色結果である。図３は、通常食（ＮＤ）餌食投与マウス肝（コントロール肝）を用いた免疫染色とＨＥ染色の結果を示す。図４は、ＣＤＡＡ餌食誘導ＮＡＳＨモデルマウス肝を用いたアザン染色の結果を示す。図５は、高脂肪動脈硬化食（ＡｔｈｅｒｏｇｅｎｉｃｐｌｕｓＨｉｇｈ－Ｆａｔｄｉｅｔ）（Ａｔｈ＋ＨＦ）誘導ＮＡＳＨモデルマウス肝を用いた免疫染色とＨＥ染色の結果を示す。図５ＡはＡｔｈ＋ＨＦ投与から１７週間後の結果である。図５ＢはＡｔｈ＋ＨＦ投与から３０週間後の結果である。図５ＣはＡｔｈ＋ＨＦ投与から６０週間後の結果である。図６は、Ａｔｈ＋ＨＦ餌食誘導ＮＡＳＨモデルマウス肝を用いたアザン染色の結果を示す。

以下、本発明の実施の形態（以下、「本実施形態」という。）について説明するが、本発明の範囲は以下の実施形態に限定して解釈されない。

（検出方法）
第一の態様において、細胆管増生を伴う肝細胞を検出するためのバイオマーカーを検出する方法であって、
検体において、当該バイオマーカーとしてラミニンγ２単鎖又はそれをコードする核酸を検出する工程を含む、方法、が提供される。

肝内胆管系の最末梢枝である細胆管は肝小葉辺縁部の肝細胞と門脈域内の小葉間胆管を結ぶ区分である。この細胆管が反応性に富む組織成分で多くの肝胆道系疾患で増加する現象を細胆管増生という。

細胆管増生は種々の肝疾患で認められる病変であり、そのような肝疾患として、原発性胆汁性胆管炎、急性肝炎、劇症肝炎、肝不全、原発性硬化性胆管炎、肝線維症、胆道閉鎖症、胆汁うっ滞症、生活習慣病による肝障害（アルコール性肝障害、非アルコール性脂肪性肝疾患）、薬剤性肝障害等が挙げられる。

ラミニンγ２単鎖（本明細書では「Ｌｎ－γ２ｍ」ともいう）とは、ラミニン３３２の構成要素であるγ２鎖が単量体（モノマー）として発現したものをいう。ラミニン５は、基底膜の主要な構成成分の一つであり、α３鎖、β３鎖、γ２鎖の３つのポリペプチド鎖が、コイルドコイル構造部分で会合するヘテロ三量体である。３つのポリペプチド鎖のうち、γ２鎖は、悪性のがん細胞において単量体として発現することが報告されている。本明細書では、三量体として発現しているγ２鎖を「ラミニン３３２γ２鎖」と区別するために、単量体として発現しているγ２鎖を「ラミニンγ２単鎖」又は「ラミニンγ２鎖」と呼ぶ。

ラミニンγ２単鎖は、任意の生物に由来することができ、哺乳動物を含む高等真核生物由来のアミノ酸配列を含み得る。限定することを意図するものではないが、バイオマーカーとして検出されるヒトラミニンγ２単鎖は以下の：
１）配列番号１に示すアミノ酸配列から成るタンパク質；
２）配列番号１のアミノ酸配列において１又は数個、好ましくは１００アミノ酸あたり１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個又は１０個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列から成るタンパク質であって、ラミニンγ２単鎖の機能を保持するタンパク質；
３）配列番号１と少なくとも８０％以上、好ましくは９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列から成るタンパク質であって、ラミニンγ２単鎖の機能を保持するタンパク質；
であってもよい。

本明細書で使用する場合、「１又は数個のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列」とは、配列番号によって特定されるアミノ酸配列と比較して、所望の機能を失わない範囲の数のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加された変異アミノ酸配列を意味する。アミノ酸は、天然アミノ酸及び合成アミノ酸、及び天然アミノ酸と同様に機能するアミノ酸類似体及びアミノ酸模倣体を指すことがある。アミノ酸は、Ｌ－アミノ酸又はＤ－アミノ酸のいずれであってもよい。天然アミノ酸とは、遺伝暗号によってコードされるアミノ酸、及び、胞内で翻訳後に修飾されたアミノ酸である。

置換は、保存的アミノ酸置換であることが好ましい。保存的アミノ酸置換であれば、配列番号で特定されたタンパク質と実質的に同等な構造又は性質を有する可能性が高いためである。

ラミニンγ２単鎖はその存在が検出できればどのような形態でもよく、ラミニンγ２単鎖をコードする核酸が検出されてもよい。本明細書で使用する場合、「核酸」はＤＮＡのみならずｍＲＮＡ等のＲＮＡ、あるいはそれらの塩を意味する。

限定することを意図するものではないが、ラミニンγ２単鎖をコードする核酸は：
１）配列番号２の塩基配列から成る核酸；
２）配列番号２の塩基配列に相補的な塩基配列から成る核酸とストリンジェントな条件下、好ましくは高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションすることができる核酸であって、それによりコードされるタンパク質が、ラミニンγ２単鎖の機能を保持する、核酸；
３）配列番号２の塩基配列において１又は数個の塩基、好ましくは１００塩基あたり１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個又は１０個が欠失、置換、又は付加された塩基配列から成る核酸であって、それによりコードされるタンパク質が、ラミニンγ２単鎖の機能を保持する、核酸；
４）配列番号２と少なくとも８０％以上、好ましくは９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上の配列同一性を有する塩基配列から成る核酸であって、それによりコードされるタンパク質が、ラミニンγ２単鎖の機能を保持する、核酸；
であってもよい。

ここで、ストリンジェントな条件とは、特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。ストリンジェントな条件は当業者によって容易に決定され、一般的に核酸の塩基長、洗浄温度、及び緩衝液の塩濃度に依存する経験的な実験条件である。一般に、塩基が長くなると適切なアニーリングのための温度が高くなり、塩基が短くなると温度は低くなる。ハイブリッド形成は、一般的に、相補鎖がその融点よりやや低い環境における再アニール能力に依存する。

本明細書で使用する場合、「高度にストリンジェントな条件」とは、核酸配列において高度の相補性を有するＤＮＡ鎖のハイブリダイゼーションを可能にし、そして多数のミスマッチを有意に有するＤＮＡのハイブリダイゼーションを除外するように設計された条件をいう。ストリンジェンシーは、例えば塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）の濃度によって変化しうる。例えば、ＥＣＬｄｉｒｅｃｔｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄｌａｂｅｌｉｎｇａｎｄｄｅｔｅｃｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍ（ＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ社製）のマニュアルには、ｐｒｉｍａｒｙｗａｓｈｂｕｆｆｅｒを構成する０．１×ＳＳＣを０．５０×ＳＳＣに置き換えることで高度にストリンジェントな条件となり得ることが記載されている。

ラミニンγ２単鎖又はそれをコードする核酸の検出は常法により行うことができる。例えば、タンパク質としてのラミニンγ２単鎖を測定する方法は、検体中に含まれるタンパク質の存在を検出、測定するための任意の方法を用いて行うことができ、例えば、イムノアッセイ、凝集法、比濁法、ウエスタンブロッティング法、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法等が挙げられる。

イムノアッセイは、検出可能に標識した抗ラミニンγ２単鎖抗体、又は、検出可能に標識した抗ラミニンγ２単鎖抗体に対する抗体（二次抗体）を用いる。抗体の標識法により、エンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ又はＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）、蛍光偏光イムノアッセイ（ＦＰＩＡ）、化学発光イムノアッセイ（ＣＬＩＡ）等に分類され、これらのいずれも本発明の方法に用いることができる。

ＥＬＩＳＡ法では、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ等の酵素、ＲＩＡ法では、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ、３Ｈ等の放射性物質、ＦＰＩＡ法では、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ダンシルクロリド、フィコエリトリン、テトラメチルローダミンイソチオシアネート、近赤外蛍光材料等の蛍光物質、ＣＬＩＡ法では、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、エクオリン等の発光物質で標識した抗体が用いられる。その他、金コロイド、量子ドットなどのナノ粒子で標識した抗体を検出することもできる。

また、イムノアッセイでは、抗ラミニンγ２単鎖抗体をビオチンで標識し、酵素等で標識したアビジン又はストレプトアビジンを結合させて検出することもできる。

イムノアッセイの中でも、酵素標識を用いるＥＬＩＳＡ法は、簡便且つ迅速に抗原を測定することができて好ましい。

ＥＬＩＳＡ法には競合法とサンドイッチ法がある。競合法では、マイクロプレート等の固相担体に抗ラミニンγ２単鎖抗体を固定し、検体と酵素標識したラミニンγ２単鎖を添加して、抗原抗体反応を生じさせる。いったん洗浄した後、酵素基質と反応、発色させ、吸光度を測定する。検体中のラミニンγ２単鎖が多ければ発色は弱くなり、検体中のラミニンγ２単鎖が少なければ発色が強くなるので、検量線を用いてラミニンγ２単鎖量を求めることができる。

サンドイッチ法では、固相担体に抗ラミニンγ２単鎖抗体を固定し、検体を添加し、反応させた後、さらに酵素で標識した別のエピトープを認識する抗ラミニンγ２単鎖抗体を添加して反応させる。洗浄後、酵素基質と反応、発色させ、吸光度を測定することにより、ラミニンγ２単鎖量を求めることができる。サンドイッチ法では、固相担体に固定した抗体と検体中のラミニンγ２単鎖を反応させた後、非標識抗体（一次抗体）を添加し、この非標識抗体に対する抗体（二次抗体）を酵素標識してさらに添加してもよい。

酵素基質は、酵素がペルオキシダーゼの場合、３，３'－ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ（ＤＡＢ）、３，３'５，５'－ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ（ＴＭＢ）、ｏ－ｐｈｅｎｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ（ＯＰＤ）等を用いることができ、アルカリホスファターゼの場合、ｐ－ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＮＰＰ）等を用いることができる。

本明細書において「固相担体」は、抗体を固定できる担体であれば特に限定されず、ガラス製、金属性、樹脂製等のマイクロタイタープレート、基板、ビーズ、ニトロセルロースメンブレン、ナイロンメンブレン、ＰＶＤＦメンブレン等が挙げられ、標的は、これらの固相担体に公知の方法に従って固定することができる。

また、上記イムノアッセイの中で、微量のタンパク質を簡便に検出できる方法として凝集法も好ましい。凝集法としては、例えば、抗体にラテックス粒子を結合させたラテックス凝集法が挙げられる。

ラテックス粒子に抗ラミニンγ２単鎖抗体を結合させて検体に混合すると、ラミニンγ２単鎖が存在すれば、抗体結合ラテックス粒子が凝集する。そこで、サンプルに近赤外光を照射して、吸光度の測定（比濁法）又は散乱光の測定（比朧法）により凝集塊を定量し、抗原の濃度を求めることができる。

なお、上述の方法では、抗ラミニンγ２単鎖抗体として、ラミニン５γ２鎖、即ち三量体を構成するγ２鎖を認識する抗体を用いてもよい。また、イムノアッセイでは、またＭＭＰ等によってプロセシングを受けたラミニンγ２単鎖断片を認識する抗体を用いてもよい。

抗ラミニンγ２単鎖抗体は、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体のいずれも公知の方法に従って作製することができる。モノクローナル抗体は、例えば、ラミニンγ２単鎖又はその断片で免疫した非ヒト哺乳動物から抗体産生細胞を単離し、これを骨髄腫細胞等と融合させてハイブリドーマを作製し、このハイブリドーマが産生した抗体を精製することによって得ることができる。また、ポリクローナル抗体は、ラミニンγ２単鎖又はその断片で免疫した動物の血清から得ることができる。

抗ラミニンγ２単鎖抗体は、既存の抗体を用いてもよい。例えば、ラミニン５γ２鎖を認識せず、ラミニンγ２単鎖を特異的に認識する抗体として、１Ｈ３モノクローナル抗体（Sarosdy, M.F. et al., The Journal of Urology, 154:379-384, 1995）が挙げられる。また、ラミニン５γ２鎖及びラミニンγ２単鎖を認識する抗体としては、Ｄ４Ｂ５モノクローナル抗体（Sarosdy, M.F. et al., The Journal of Urology, 154:379-384, 1995）、２７７８ポリクローナル抗体（Koshikawa et al. Cancer Res. 68: 530. 2008）が挙げられる。

ラミニンγ２単鎖の検出は検体におけるタンパク質としてのラミニンγ２単鎖自体の存在を検出する方法に限定されず、ラミニンγ２単鎖をコードする遺伝子の発現を確認してもよい。遺伝子としてはＤＮＡのみならず、マイクロＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｍＲＮＡ、又はノンコーディングＲＮＡ等のＲＮＡが挙げられる。例えば、ラミニンγ２単鎖をコードするｍＲＮＡを定法に従って抽出し、このｍＲＮＡを鋳型としたノーザンハイブリダイゼーション法、又はＲＴ－ＰＣＲ法を実施することによってラミニンγ２単鎖の転写レベルの測定を行うことができる。ノンコーディングＲＮＡは、例えば次世代シーケンサーにより検出できる。

本明細書で使用する場合、「検体」は、広く、ラミニンγ２単鎖又はそれをコードする核酸を含む生物学的材料、好ましくは細胆管増生を伴う肝細胞、又は細胆管増生をきたす肝疾患を有する肝細胞、を有することが現在又は将来疑われる被検者に由来する生物学的材料を意味する。検体を得るために、任意の細胞、組織又は体液が利用され得る。そのような細胞、組織及び体液は、生検や剖検サンプルなどの組織の切片、組織学の目的のために採取された凍結切片、（全血などの）血液、血漿、血清、痰、便、涙、粘液、唾液、気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）液、毛、皮膚、赤血球、血小板、間質液、眼球水晶体液、脳脊髄液、汗、鼻汁、滑液、帯下、羊水、精液などを含み得る。細胞及び組織は、リンパ液、腹水、婦人科学的な液体、尿、腹腔液、脳脊髄液等を含んでもよい。これらの中でも、血液、血清、血漿は低侵襲で採取できること、そして多くの一般的な検査で使用されている検体であるため好ましい。

本明細書で使用する場合、「被検者」は、肝細胞でラミニンγ２単鎖を発現する動物であれば特に限定されず、例えばヒトや非ヒト霊長類（例えば、カニクイザル、アカゲザル、チンパンジーなどのサル）、その他の哺乳動物、例えば、ウシ、ブタ、ラクダ、ラマ、ウマ、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ハムスター、モルモット、ネコ、イヌ、ラット及びマウス）を含む、任意の脊椎動物を指す。実施形態によって、被検者はヒト又はヒト以外の動物であってよい。限定することを意図するものではないが、被検者は、細胆管増生を伴う肝細胞、又は細胆管増生をきたす肝疾患を有する肝細胞、を有することが現在又は将来疑われる被検者であることが想定される。

検体においてラミニンγ２単鎖又はそれをコードする核酸の存在が検出された場合、検体は、細胆管増生を伴う肝細胞、又は細胆管増生をきたす肝疾患を有する肝細胞を含む可能性があるか、その可能性が高い、と判断され得る。そのため、検体におけるラミニンγ２単鎖又はそれをコードする核酸の存在の確認は、細胆管増生をきたす肝疾患の診断又はその補助に使用することができる。

ラミニンγ２単鎖又はそれをコードする核酸の検出を行う回数は特に限定されない。同じ被検者から検体を定期的に採取し、ラミニンγ２単鎖又はそれをコードする核酸の発現量を比較することで病変の経時的な変化を決定することもできる。ラミニンγ２単鎖又はそれをコードする核酸の検出と並行して、既存のマーカーであるＣＫ１９の存在を検出してもよい。

ラミニンγ２単鎖又はそれをコードする核酸に加え、細胆管増生をきたす肝疾患の公知のバイオマーカーを検出することにより診断の精度を向上させることができる。そのようなマーカーとして、細胆管増生関連マーカー、例えばＳＯＸ９（Ｓｒｙ－ｒｅｌａｔｅｄＨＭＧｂｏｘｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒ９）、ＡＱＰ１（Ａｑｕａｐｏｒｉｎ１）、ＣＫ７（Ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ７）、ＥｐＣＡＭ（Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌａｄｈｅｓｉｏｎｍｏｌｅｃｕｌｅ）、Ｄｌｋ１（Ｄｅｌｔａｌｉｋｅ１Ｈｏｍｏｌｏｇ）等が挙げられる。これらの遺伝子は胆管上皮細胞に恒常的に発現し、増生した細胆管において発現の検出が可能であるため、細胆管増生関連マーカーとなり得る。

バイオマーカーの検出と並行して、細胆管増生をきたす肝疾患の診断を医師が行ってもよい。細胆管増生をきたす肝疾患の決定は、臨床検査技師や医療機器の補助を借りて行うこともできる。

細胆管増生をきたす肝疾患を有すると診断された被検者に対しては、各疾患について当業者に知られている治療方法を適用することができる。限定することを意図するものではないが、細胆管増生をきたす肝疾患の治療方法として以下のものが知られている：
・原発性胆汁性胆管炎ウルソデオキシコール酸やベザフィブラートの投与；
・急性肝炎ウイルス性の場合には抗ウイルス薬、自己免疫性の場合にはステロイドやアザチオプリンなどの免疫抑制薬、薬剤性の場合には、薬剤中止後に経過をみて、胆汁うっ滞が遷延すればウルソデオキシコール酸を投与する。
・劇症肝炎、肝不全、原発性硬化性胆管炎肝移植；
・肝線維症低アルブミン血症に対しては分枝鎖アミノ酸製剤、高アンモニア血症に対してはラクツロースやリファキシミン、門脈圧亢進症に対してはベータブロッカーやプロトンポンプ阻害剤の投与を行う；
・胆道閉鎖症胆道再建手術；
・胆汁うっ滞症ウルソデオキシコール酸や、皮膚掻痒に対しナルフラフィン塩酸塩の投与を行う。

細胆管増生をきたす肝疾患を有すると診断された患者に対しては、各疾患を治療するための有効成分を含む医薬組成物が投与され得る。

組成物の投与経路は特に限定されず、経口的又は非経口的に投与することができる。経口投与に適する組成物としては、例えば、顆粒剤、細粒剤、散剤、硬カプセル剤、軟カプセル剤、シロップ剤、乳剤、懸濁剤、又は液剤などが挙げられる。非経口投与に適する組成物としては、例えば、静脈内投与、筋肉内投与、若しくは皮下投与用の注射剤、点滴剤、坐剤、経皮吸収剤、経粘膜吸収剤、点鼻剤、点耳剤、点眼剤、吸入剤などを挙げることができる。凍結乾燥物など乾燥粉末形態の医薬組成物として調製された製剤を用時に溶解して注射剤又は点滴剤として使用することも意図される。

組成物には、固体又は液体の製剤用添加物を含めてもよい。製剤用添加物は有機物質又は無機物質のいずれであってもよい。経口用固形製剤を製造する場合は、例えば、有効成分である上記化合物ら又はその塩、並びにそれらの水和物及びそれらの溶媒和物からなる群から選ばれる物質に賦形剤を添加し、さらに必要に応じて結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味矯臭剤などを加えた後、常法により錠剤、被覆錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤などの形態の製剤を調製することができる。

賦形剤としては、例えば、乳糖、蔗糖、白糖、ブドウ糖、コーンスターチ、デンプン、タルク、ソルビット、結晶セルロース、デキストリン、カオリン、炭酸カルシウム、二酸化ケイ素などを挙げることができる。結合剤としては、例えば、ポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、エチルセルロース、メチルセルロース、アラビアゴム、トラガント、ゼラチン、シェラック、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、クエン酸カルシウム、デキストリン、ペクチンなどを挙げることができる。滑沢剤としては、例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ポリエチレングリコール、シリカ、硬化直物油などを挙げることができる。着色剤としては、医薬品に添加することが認可されているものであればいずれも使用することができる。矯味矯臭剤としては、ココア末、ハッカ脳、芳香酸、ハッカ油、龍脳、桂皮末などを使用することができる。錠剤や顆粒剤には糖衣、ゼラチン衣、その他必要により適宜コーティングを付することができる。また、必要に応じて防腐剤、抗酸化剤などを添加してもよい。

経口投与のための液体製剤、例えば、乳剤、シロップ剤、懸濁剤、又は液剤の製造には、一般的に用いられる不活性な希釈剤、例えば水又は植物油を用いることができる。液体製剤には補助剤、例えば湿潤剤、懸濁補助剤、甘味剤、芳香剤、着色剤、又は保存剤などを添加することができる。液体製剤を調製した後、ゼラチンなどのカプセルに充填してもよい。

非経口投与用の医薬組成物、例えば注射剤又は坐剤等の製造に用いられる溶剤又は懸濁剤としては、例えば、水、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ベンジルアルコール、オレイン酸エチル、又はレシチンなどを挙げることができる。坐剤の製造に用いられる基剤としては、例えば、カカオ脂、乳化カカオ脂、ラウリン脂等を挙げることができる。製剤の調製方法は特に限定されず、当業界で汎用されている方法はいずれも利用可能である。

注射剤の形態の医薬組成物を調製する場合には、担体として、例えば、水、エチルアルコール、プロピレングリコールなどの希釈剤；クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、又はリン酸ナトリウムなどのpH調整剤又は緩衝剤；エチレンジアミン四酢酸、チオグリコール酸、又はチオ乳酸などの安定化剤などを使用することができる。等張性の溶液を調製するために十分な量の食塩、ブドウ糖、マンニトール、又はグリセリンなどを組成物中に配合してもよく、溶解補助剤、無痛化剤、又は局所麻酔剤などを添加することもできる。

軟膏剤、例えば、ペースト、クリーム、又はゲルの形態の医薬組成物を調製する場合には、通常使用される基剤、安定剤、湿潤剤、又は保存剤などを必要に応じて使用することができ、常法により成分を混合して医薬組成物を調製することができる。基剤としては、例えば、白色ワセリン、ポリエチレン、パラフィン、グリセリン、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコン、又はベントナイトなどを使用することができる。保存剤としては、例えば、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、又はパラオキシ安息香酸プロピルなどを使用することができる。貼付剤の形態の医薬組成物を調製する場合には、通常の支持体の表面に上記軟膏、クリーム、ゲル、又はペーストなどを常法により塗布することができる。支持体としては、例えば、綿、若しくは合成繊維からなる織布や不織布、軟質塩化ビニル、ポリエチレン、若しくはポリウレタンなどのフィルム、又は発泡体シートなどを好適に使用できる。

所望の用途に使用可能である限り組成物における有効成分の量は特に限定されず、患者の年齢、体重、性別、投与の目的、症状などに応じて適宜増減され得る。

（鑑別方法）
第二の態様において、細胆管増生を伴う肝細胞と、細胆管増生を伴わない肝細胞とを鑑別するための方法であって、
検体において、ラミニンγ２単鎖又はそれをコードする核酸を検出する工程を含み、
ラミニンγ２単鎖又はそれをコードする核酸が検出された場合、検体は細胆管増生を伴う肝細胞を含むと判断され、
ラミニンγ２単鎖又はそれをコードする核酸が検出されなかった場合、検体は細胆管増生を伴う肝細胞を含まないと判断される、方法、が提供される。

検体において、ラミニンγ２単鎖又はそれをコードする核酸を検出する工程は上述した方法にて行うことができる。

検体におけるラミニンγ２単鎖又はそれをコードする核酸の存在の有無は細胆管増生を伴う肝細胞と、細胆管増生を伴わない肝細胞とを鑑別する以外にも種々の用途に使用することができる。限定することを意図するものではないが１）肝不全の予後予測、肝移植の必要性や適応の診断（肝移植の必要性の鑑別）、２）肝線維患者の予後予測（肝移植の必要性の鑑別）、３）胆道閉鎖症の診断、４）原発性胆汁性胆管炎、原発性硬化性胆管炎の予後予測（肝移植の必要性の鑑別）、５）胆汁うっ滞症による掻痒に対する薬物療法の効果予測（レミッチの有効性の診断）、６）肝再生の鑑別等が挙げられる。

例えば、ある被験者について細胆管増生をきたす肝疾患のうち特定のもの、例えば肝不全が疑われた被験者由来の検体におけるラミニンγ２単鎖又はそれをコードする核酸を定量分析し、例えばラミニンγ２単鎖又はそれをコードする核酸が増大している場合には肝不全の予後が不良であり、減少している場合には肝不全の予後が良好であると判断することができる。

（バイオマーカー）
第三の態様において、細胆管増生を伴う肝細胞を検出するためのバイオマーカーであって、ラミニンγ２単鎖又はそれをコードする核酸を含む、バイオマーカー、が提供される。

ラミニンγ２単鎖又はそれをコードする核酸を含むバイオマーカーは、細胆管増生を伴う肝細胞の検出、ひいては細胆管増生をきたす肝疾患、例えば原発性胆汁性胆管炎、急性肝炎、劇症肝炎、肝不全、原発性硬化性胆管炎、肝線維症、胆道閉鎖症、胆汁うっ滞症等の検出に使用することができる。

（キット）
第四の態様において、細胆管増生を伴う肝細胞を検出するためのキットであって、ラミニンγ２単鎖又はそれをコードする核酸を検出する試薬を含む、キット、が提供される。

ラミニンγ２単鎖又はそれをコードする核酸を検出する試薬の例として、抗ラミニンγ２単鎖抗体が挙げられる。そのような抗体はラミニンγ２単鎖との抗原抗体反応を利用するイムノアッセイに使用することができる。キットは、ラミニンγ２単鎖量を測定するために必要なその他の試薬や装置を含んでもよい。キットは更に、ＣＫ１９又はそれをコードする核酸を検出する試薬を更に含んでもよい。

ある実施形態において、イムノアッセイに使用するキットは、マイクロタイタープレート；捕捉用の抗ラミニンγ２単鎖抗体；アルカリホスファターゼ又はペルオキシダーゼで標識した抗ラミニンγ２単鎖抗体；及び、アルカリホスファターゼ基質（ＮＰＰ等）又はペルオキシダーゼの基質（ＤＡＢ、ＴＭＢ、ＯＰＤ等）、を含んでもよい。

このようなキットでは、まず、マイクロタイタープレートに捕獲抗体を固定し、ここに検体を適宜希釈して添加した後インキュベートし、サンプルを除去して洗浄する。次に、標識した抗体を添加した後インキュベートし、基質を加えて発色させる。マイクロタイタープレートリーダー等を用いて発色を測定することにより、ラミニンγ２単鎖量を求めることができる。

検査用キットの別の実施形態において、キットは、マイクロタイタープレート；捕捉用の抗ラミニンγ２単鎖抗体；一次抗体として、抗ラミニンγ２単鎖抗体；二次抗体として、アルカリホスファターゼ又はペルオキシダーゼで標識した、抗ラミニンγ２単鎖抗体；及び、アルカリホスファターゼ（ＮＰＰ等）又はペルオキシダーゼの基質（ＤＡＢ、ＴＭＢ、ＯＰＤ等）、を含んでもよい。捕獲抗体と一次抗体は、異なるエピトープを認識する。

このようなキットでは、まず、マイクロタイタープレートに捕獲抗体を固定し、ここに検体を適宜希釈して添加した後インキュベートし、サンプルを除去して洗浄する。続いて、一次抗体を添加してインキュベート及び洗浄を行い、さらに酵素標識した二次抗体を添加してインキュベートを行った後、基質を加えて発色させる。マイクロタイタープレートリーダー等を用いて発色を測定することにより、ラミニンγ２単鎖量を求めることができる。二次抗体を用いることにより、反応が増幅され検出感度を高めることができる。

各キットは、さらに、必要な緩衝液、酵素反応停止液、マイクロプレートリーダー等を含むことも好ましい。

標識抗体は、酵素標識した抗体に限定されず、放射性物質（２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ、３Ｈ等）、蛍光物質（フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ダンシルクロリド、フィコエリトリン、テトラメチルローダミンイソチオシアネート、近赤外蛍光材料等）、発光物質（ルシフェラーゼ、ルシフェリン、エクオリン等）、ナノ粒子（金コロイド、量子ドット）等で標識した抗体であってもよい。また標識抗体としてビオチン化抗体を用い、キットに標識したアビジン又はストレプトアビジンを加えることもできる。

以下に実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

[材料と方法]
動物とNASH誘導餌食によるモデルマウス作製
C57BL6/J 雄性の8週齢をNINOXから購入した。2週間飼育後、高脂肪食（HFD、D12492、リサーチダイエット）、高脂肪動脈硬化食（Ath＋HFD、D06061403、リサーチダイエット）、超高脂肪コリン欠乏メチオニン減量食（CDAA、A06071302、リサーチダイエット）をそれぞれ投与した。投与2、4、8、10週間後の肝組織を摘出した。摘出後肝組織を10％ホルマリンによって固定した。

免疫組織染色（IHC）
マウスの肝組織を摘出後、10%ホルムアルデヒドで固定し、パラフィンブロック（FFPE）を作製し、連続薄切切片を作製した。FFPE切片を脱パラフィン処理し、抗原賦活化のために、0.05% proteinase 24 (sigma-aldrich：P8038) で1分間反応、あるいは抗原賦活化液pH9 (ニチレイバイオサイエンス：415201)で95℃、10分間反応させた。内在性ペルオキシダーゼ活性を阻害するために、3％H₂O₂を室温で15分間反応させた。非特異的結合を抑制するために、モノクローナル抗体使用時に、ニチレイマウスステインキット（ニチレイバイオサイエンス: 414322）を用いた。それらの切片を抗ヒトラミニンγ2（Ln-γ2）ウサギIgG（10 mg/mL、S3、本発明者らが作製）、サイトケラチン19 (CK19)（1：100、ab133496、Abcam）、抗ヒトラミニンα3（Ln-α3）ウサギIgG（10 mg/mL、bs-1969R、Bioss）のポリクローナル抗体と抗ヒトラミニンβ3（Ln-β3）マウスIgG（20 mg/mL、8A、横浜市立大学・宮崎香教授より恵与）のモノクローナル抗体を用いて、4℃、一晩でインキュベートした。すべての抗体の希釈には、SignalStain Antibody Diluent (Cell signaling: #8112)を用いた。FFPE切片をPBS-Tを用いて洗浄後、2次抗体にはヒストンファインシンプルステインマウスMAX-PO(R)（ニチレイバイオサイエンス: 414341）あるいはヒストンファインシンプルステインマウスMAX-PO(M)（ニチレイバイオサイエンス: 414322）を用いて、室温で10分間反応させた。それらの切片をPBS-Tによる洗浄後、シンプルステインDAB溶液（ニチレイバイオサイエンス: 415174）を1分30秒間あるいは10分間反応させ、各抗原は茶褐色に検出した。対比染色には、ヘマトキシリンを用いた。それらの切片を脱水、封入後、染色組織像をAperio ScanScope CS2（Leica）を用いたバーチャルスライドに取り込み観察した。

[結果]
1．各ラミニン鎖抗体のIHCによる反応性の確認
非アルコール性脂肪肝炎（NASH）肝におけるラミニン-γ2 （Ln-γ2）鎖の発現・局在を明らかとするため、異なる2系統のNASHモデルマウス肝を用いた免疫組織染色（IHC）を行った。まず、Ln-γ2、ラミニン-α3 (Ln-α3)、ラミニン-β3 (Ln-β3)の各ヒトラミニン鎖抗体のマウスラミニン鎖に対する免疫反応性を確認するため、マウス皮膚FFPE切片用いてIHCを行った。その結果、基底膜に発現するラミニン-332（Ln-α3、β3、γ2鎖で構成されるヘテロ3量体）の各ラミニン鎖を検出し、各抗体の反応性を確認した（図1）。

2．超高脂肪コリン欠乏メチオニン減量食（CDAA）誘導NASHモデルマウス
まずアグレッシブにNASHを発症するモデルマウスを作製するために、生後2週齢より、超高脂肪コリン欠乏メチオニン減量食（CDAA）を2、4、8、10週間投与した。各期間で安楽死させたマウスから摘出した肝臓のFFPE切片を作製し、肝組織におけるLn-γ2鎖、サイトケラチン19 (CK19)、Ln-β3鎖、Ln-α3鎖の発現、局在をIHCで検討した。CDAA投与2週間後のマウス肝において、異所性脂肪蓄積が確認されたことから、脂肪肝を発症したことが示唆された（図2A、上段パネル）。また、CDAA投与2、4週間後の肝において、門脈近傍の胆管やそれら周囲にCK19陽性を示す胆管上皮様細胞が見られ、Ln-γ2鎖が微弱に共発現していた（図2A、上段パネル、矢印）。さらに、CDAA投与8、10週間後の肝組織では、CK19陽性の細胆管が無数に増生し、それらの胆管上皮様細胞にLn-γ2鎖が共局在することを見出した（図2B）。また、一部の胆管上皮様細胞ではLn-α3鎖の発現が見られたが、Ln-β3鎖発現が見られないことから、Ln-α3鎖はラミニンの他鎖と会合している可能性が、また、Ln-γ2鎖はLn-α3、Ln-β3鎖以外とは会合しないため、単鎖として発現すると考えられる。

一方、通常食（Normal diet: ND）を2、20週間投与したマウス肝（Control肝）を用いて、Control肝における各分子の発現をIHCで検討した。ND投与2週間の肝において、CK19陽性の門脈近傍の胆管上皮様細胞において、微弱なLn-γ2鎖の発現が検出されたが、ラミニンα3、β3鎖の発現は検出できなかった（図3、上段パネル、矢尻）。さらに、Control肝のLn-γ2単鎖の発現は20週齢では低下傾向を示した（図3、下段パネル、矢尻）。以上より、Ln-γ2鎖が単鎖状態でControl肝の胆管上皮細胞に発現することを見いだした。さらに、肝組織が成熟するに伴いその発現が低下することから、Ln-γ2単鎖が肝発生に何らかの役割を担っている可能性を示唆している。

さらに、CDAAを2、4、8、10週間投与したマウス肝の線維化状態を検討するために、Azan染色による検討を行った。結果を図4に示す。すべてのマウス肝の中心静脈周囲ではアニリンブルー陽性の膠原線維蛋白質が蓄積していた。これらは血管壁を形成するエラスチン、コラーゲン等の膠原線維蛋白質と考えられる。一方、CDAAを2、4週間投与した肝は、脂肪滴は見られるが、膠原線維蛋白質の蓄積は検出できなかった。さらに、CDAA投与8、10週間では、肝細胞中にコラーゲンなどの膠原線維蛋白質の蓄積が見られ、肝線維化が進んでいることが示唆される。一方、Controlマウス（20週）において、門脈周囲に膠原線維蛋白質が発現しているが、肝組織では顕著な膠原線維蛋白質の蓄積は見られなかった。

3．高脂肪動脈硬化食（Ath+HF）誘導NASHモデルマウス
次に、上記のNASHモデルマウスで得られた結果の再現性を検証するために、高脂肪動脈硬化食（Ath+HF）誘導NASHモデルマウス肝を用いた検討を行った。結果を図5A-Cに示す。このモデルはCDAA誘導モデルに比較して緩やかにNASHの発症が起こるために、Ath+HF投与17、30、60週間の肝を用いてLn-γ2、CK19、Ln-β3鎖、Ln-α3鎖の発現・局在をIHCによって検討した。

その結果、Ath+HF投与17週間で、肝細胞の異所性脂肪蓄積が見られた。また、Control肝、NASH肝ともに門脈周囲の胆管上皮細胞でCK19、Ln-γ2鎖発現が検出された。さらに、NASH肝は門脈から離れた部位にCK19陽性の幼弱な細胆管増生が高頻度に検出されたが、Control肝では細胆管増生は見られない。このとき、CK19陽性の一部の細胆管上皮細胞は非常に弱いLn-γ2鎖を発現するが、Ln-β3鎖の発現は検出されない（図5A、上段パネル、矢印）。

Ath+HF投与30、60週間後では、Ln-γ2鎖、CK19の発現が週齢と共に亢進することを見いだした（図5B, 5C）。特に、Ath+HF投与60週齢後、ほぼすべてのCK19陽性の細胆管上皮細胞および胆管上皮細胞はLn-γ2単鎖を発現していることが示された（図5C）。門脈近傍の胆管および細胆管上皮細胞ではLn-γ2鎖、CK19発現を確認したが、Ln-β3鎖発現は見られなかった（図5B、5C）。

次に、Ath+HF投与マウス肝の線維化状態をAzan染色で検討した。その結果、Ath+HFを30週間投与した肝において、門脈周囲の膠原線維蛋白質が観察され、肝組織に弱い膠原線維蛋白質の蓄積が見られた。さらにAth+HF投与60週間後では、肝組織の膠原線維蛋白質の蓄積が30週間と比較して、顕著に増加しており、肝線維化が進んでいることが明らかとなった（図6）。一方、Control肝を同様にAzan染色したところ、中心静脈および門脈の周囲で膠原線維蛋白質が検出されるが肝組織ではその蓄積は見られなかった（図6）。
これらの2つのNASHモデルを用いた免疫組織染色により、マウスのNASHの病態が進行するに伴い、CK19陽性の細胆管増生が起こり、細胆管上皮細胞ではLn-γ2鎖が単鎖として共発現することが明らかとなった。

また、週齢の若いマウス肝の胆管上皮細胞では、Ln-γ2単鎖の弱い発現が見られたが、加齢と共にその発現は低下することが見いだされた。正常組織からのLn-γ2単鎖の発現は初めての報告となる。このことは、Ln-γ2単鎖がマウス肝の発生、分化等に影響を与えている可能性が考えられる。

Claims

細胆管増生を伴う肝細胞と、細胆管増生を伴わない肝細胞とを鑑別するための方法であって、
検体としての肝組織において、ラミニンγ２単鎖又はそれをコードする核酸を検出する工程と、
検体に含まれる肝組織の線維化状態を確認する工程と、
を含み、
肝組織が線維化されていない検体において、ラミニンγ２単鎖又はそれをコードする核酸が検出された場合、検体は細胆管増生を伴う肝細胞を含むと判断され、
ラミニンγ２単鎖又はそれをコードする核酸が検出されなかった場合、検体は細胆管増生を伴う肝細胞を含まないと判断される、方法。
細胆管増生を伴う肝細胞が、原発性胆汁性胆管炎、急性肝炎、劇症肝炎、肝不全、原発性硬化性胆管炎、胆道閉鎖症、及び胆汁うっ滞症から成る群から選択される肝疾患に罹患しているとの診断の補助に使用される、請求項１に記載の方法。
細胆管増生を伴う肝細胞が、細胆管増生をきたす肝疾患を有する細胞である、請求項１又は２に記載の方法。
細胆管増生関連マーカーを検出する工程を更に含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
細胆管増生関連マーカーが、ＳＯＸ９、ＡＱＰ１、ＣＫ７、ＥｐＣＡＭ及びＤｌｋ１から成る群から選択される１又は複数のマーカーである、請求項４に記載の方法。
ラミニンγ２単鎖又はそれをコードする核酸の検出が経時的に行われる、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
検体におけるラミニンγ２単鎖又はそれをコードする核酸の量の経時的な変化が、当該検体におけるＣＫ１９又はそれをコードする核酸の量の経時的な変化と比較される、請求項６に記載の方法。
検体が、細胆管増生を伴う肝細胞、又は細胆管増生をきたす肝疾患を有する肝細胞、を有することが疑われる被検者に由来する、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。